CN110678192A - 溶瘤痘苗病毒与免疫检查点抑制剂联合疗法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种包含(i)复制性溶瘤痘苗病毒和(ii)免疫检查点蛋白抑制剂的药物组合物，以及一种包含该药物组合物的试剂盒和用于治疗和/或预防癌症的方法。

Description

溶瘤痘苗病毒与免疫检查点抑制剂联合疗法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年4月21日提交的美国临时申请第62/488,623号和2017年8月25日提交的美国临时申请第62/550,486号的优先权，这些申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及病毒学和医学。在某些方面，本发明涉及一种包含复制性溶瘤痘苗病毒和免疫调节剂的治疗组合物。
背景技术
正常组织内稳态是细胞增殖和细胞死亡的高度调控过程。细胞增殖或细胞死亡的失衡可发展成癌态。例如，子宫颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和脑癌仅仅是可导致的多种癌症的其中几个例子。实际上，癌症的发生率如此之高，以至于仅在美国，每年就有500000多人死于癌症。
复制选择性溶瘤病毒有望用于癌症治疗。这些病毒可通过直接复制依赖性和/或病毒基因表达依赖性溶瘤作用引起肿瘤细胞死亡。然而，肿瘤对免疫的抑制和病毒的过早清除通常仅引起较弱的肿瘤特异性免疫反应，从而限制了这些病毒作为癌症治疗剂的潜力。
同样，免疫检查点抑制剂已显示出在治疗某些癌症中的一些前景，但只有有限比例的患者实现了客观的临床反应。仍然需要改进癌症疗法。
发明内容
本发明人发现，将免疫检查点抑制剂和肿瘤内施用的复制性溶瘤痘苗病毒同时施用至临床相关的癌症模型中产生协同的抗肿瘤效果，在该癌症模型中，该药剂第一次并且优选多次连续同时施用。因此，在一些实施方案中，本申请提供了一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防癌症和/或建立转移的联合疗法，其包括同时向哺乳动物施用(i)复制性溶瘤痘苗病毒和(ii)免疫检查点抑制剂，其中将溶瘤痘苗病毒肿瘤内施用给哺乳动物。在某些方面，与单独的任何一种治疗相比，同时向哺乳动物施用药物组合伴侣提供了增强的甚至协同的抗肿瘤免疫力。
在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒在肿瘤内、静脉内、动脉内或腹膜内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒在肿瘤内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒以有效诱导肿瘤中免疫检查点蛋白表达的量施用。在一些实施方案中，在施用复制性溶瘤痘苗病毒之前，肿瘤不表达免疫检查点蛋白或以相对较低的水平表达免疫检查点蛋白。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为特异性结合免疫检查点蛋白的抗体或其片段，优选为单克隆抗体、人源化抗体、全人源抗体、融合蛋白或其组合。
在一些实施方案中，组合物的免疫检查点抑制剂抑制选自由以下项组成的群组的免疫检查点蛋白：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4或CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、B7-H3、B7-H4、T细胞膜蛋白3(TIM3)、半乳糖凝集素9(GAL9)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、含V结构域免疫球蛋白(Ig)的T细胞活化抑制剂(VISTA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、具有Ig和Π′IΜ结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)或其组合。在另一方面，检查点抑制剂与检查点蛋白的配体相互作用，该检查点蛋白包括但不限于CTLA-4、PD-1、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、BTLA、TIGIT或其组合。在优选的实施方案中，免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合免疫检查点蛋白或其配体的抗体(例如，单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体)、抗体片段或融合蛋白。
在一些优选的实施方案中，组合物的免疫检查点抑制剂为抗体或其抗原结合片段，其特异性结合(并抑制)PD-1、PD-L1、PD-L2、TIGIT、TIM3、LAG3或CTLA4。作为非限制性实例，提供一种在哺乳动物中治疗和/或预防癌症的方法，其包括向受试者同时施用有效量的(i)通过肿瘤内注射的复制性溶瘤痘苗病毒和(ii)CTLA4和/或PD-1抑制剂。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为选择性结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体，优选选自由BMS-936559、阿特珠单抗、度伐单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、纳武单抗、派姆单抗(pembrolizumab)和兰罗利珠单抗(lambrolizumab)组成的群组。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为选择性结合CTLA4的单克隆抗体，优选地选自由伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)组成的群组。在一些实施方案中，将多种检查点抑制剂与溶瘤痘苗病毒同时施用于受试者。在一些实施方案中，向受试者同时施用：(a)CTLA4抑制剂、PD-1抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；(b)CTLA4抑制剂、IDO抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；(c)PD-1抑制剂、IDO抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；(d)PD-1抑制剂、CTLA4抑制剂、IDO抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；(e)LAG3抑制剂、PD-1抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；(f)TIGIT抑制剂、PD-1抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Wyeth株、Western Reserve Strain株、Lister株或Copenhagen株。在一些实施方案中，痘苗病毒包含一种或多种遗传修饰以增加该病毒对癌细胞的选择性，优选地该病毒被工程改造以缺乏功能性胸苷激酶和/或缺乏功能性痘苗生长因子。在一些实施方案中，痘苗病毒包含功能性14L和/或F4L基因。
在一些实施方案中，痘苗病毒为具有一种或多种遗传修饰以增加痘苗病毒对癌细胞的选择性(如胸苷激酶(TK)和/或痘苗病毒生长因子(VGF)基因的失活)的Wyeth株、Western Reserve株、Lister株或Copenhagen株。在相关的实施方案中，痘苗病毒经工程改造以表达细胞因子，例如但不限于GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-24、IFN-γ和/或TNF-α，优选地选自IFN-γ、TNF-α、IL-2、GM-CSF和IL-12。在其他相关的实施方案中，复制型溶瘤痘苗病毒经工程改造以表达肿瘤抗原，例如但不限于BAGE、GAGE-1、GAGE-2、CEA、AIM2、CDK4、BMI1、COX-2、MUM-1、MUC-1、TRP-1、TRP-2、GP100、EGFRvIII、EZH2、LICAM、Livin、Livinβ、MRP-3、巢蛋白、OLIG2、SOX2、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7、ART1、ART4、SART1、SART2、SART3、B-细胞周期蛋白、β-连环蛋白、Glil、Cav-1、组织蛋白酶B、CD74、E-钙粘蛋白、EphA2/Eck、Fra-1/Fosl 1、神经节苷脂/GD2、GnT-V、β1,6-N、Her2/neu、Ki67、Ku70/80、IL-13Ra2、MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-1、MART-1、PROX1、PSCA、SOX10、SOX11、生存素、半胱天冬酶-8、UPAR、CA-125、PSA、p185HER2、CD5、IL-2R、Fap-a、腱生蛋白、黑素瘤相关抗原p97、WT-1、G蛋白信号传导调节剂5(RGS5)、Surivin(BIRC5＝含重复凋亡结构杆状病毒抑制剂5)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGF-BP3)、胸苷酸合成酶(TYMS)、低氧诱导蛋白2、低氧诱导性脂滴相关蛋白(HIG2)、基质金属肽酶7(MMP7)、prune同源蛋白2(PRUNE2)、RecQ蛋白样(DNA解旋酶Q1样蛋白)(RECQL)、瘦素受体(LEPR)、ERBB受体反馈抑制剂1(ERRFI1)、溶酶体蛋白跨膜蛋白4α(LAPTM4A)、RAB1B、RAS癌基因家族(RABIB)、CD24、智人胸腺素beta 4、X-linked(TMSB4X)蛋白、智人S100钙结合蛋白A6(S100A6)、智人腺苷A2受体(ADORA2B)、16号染色体开放阅读框61抗体(C16orf61)、ROD1分化调节剂1(ROD1)、NAD依赖性脱乙酰基酶去乙酰化酶sirtuin-2(SIR2L)、微管蛋白α1c(TUBA1C)、ATP酶抑制因子1(ATPIF1)、基质抗原2(STAG2)、核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性底物1(NUCKS1)。在一些实施方案中，肿瘤抗原为肾细胞癌肿瘤抗原。在一些实施方案中，肾细胞癌肿瘤抗原选自由以下项组成的群组：G蛋白信号传导调节剂5(RGS5)、Surivin(BIRC5＝含重复凋亡结构杆状病毒抑制剂5)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGF-BP3)、胸苷酸合成酶(TYMS)、低氧诱导蛋白2、低氧诱导脂滴相关蛋白(HIG2)、基质金属肽酶7(MMP7)、prune同源蛋白2(PRUNE2)、RecQ蛋白样(DNA解旋酶Q1样蛋白)(RECQL)、瘦素受体(LEPR)、ERBB受体反馈抑制剂1(ERRFI1)、溶酶体蛋白跨膜蛋白4α(LAPTM4A)、RAB1B、RAS癌基因家族(RABIB)、CD24、智人胸腺素beta 4、X-linked(TMSB4X)蛋白、智人S100钙结合蛋白A6(S100A6)、智人腺苷A2受体(ADORA2B)、16号染色体开放阅读框61抗体(C16orf61)、ROD1分化调节剂1(ROD1)、NAD依赖性脱乙酰基酶sirtuin-2(SIR2L)、微管蛋白α1c(TUBA1C)、ATP酶抑制因子1(ATPIF1)、基质抗原2(STAG2)、以及核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性底物1(NUCKS1)。
在一些实施方案中，痘苗病毒以约107至约1011pfu，优选约108-1010pfu，更优选约109-1010pfu的量施用。在一些实施方案中，检查点抑制剂以约2mg/kg至15mg/kg的量施用。
在一些实施方案中，将药物组合物施用于哺乳动物以治疗和/或预防哺乳动物的癌症。在一些实施方案中，该癌症为实体瘤类型的癌症。在一些实施方案中，该癌症选自由以下项组成的群组选自由以下项组成的群组：黑素瘤、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱癌、头颈癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、间皮瘤、胃肠道癌、白血病、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胃癌、食道癌、间皮瘤、结肠直肠癌、肉瘤或甲状腺癌。在其他优选的实施方案中，将药物组合物施用于哺乳动物以治疗转移。在一些实施方案中，受试者患有肾细胞癌。
在优选的实施方案中，将要用药物组合物治疗的哺乳动物为人类受试者。在相关方面，需要治疗的受试者为患有对一种或多种化学治疗剂难治(或耐药)和/或对一种或多种抗体治疗难治的癌症的人。在特定的实施方案中，该人患有的癌症(例如结肠直肠癌)对包含免疫检查点抑制剂的治疗是难治(或耐药)的，并且任选地对于一种或多种化学治疗剂的治疗也是难治的。在其他实施方案中，需要治疗的人是被鉴定为使用一种或多种免疫检查点抑制剂进行治疗的候选者的人。
在一些实施方案中，对受试者的至少一种先前的化疗或免疫疗法治疗失败。在一些实施方案中，受试者患有免疫检查点抑制剂疗法难治的癌症，优选地，该癌症对用抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体治疗具有抗性。在一些实施方案中，受试者被鉴定为免疫检查点抑制剂疗法的候选者。在一些实施方案中，该方法包含向受试者施用选自选自化疗(烷化剂、核苷类似物、细胞骨架修饰剂、细胞抑制剂)和放疗的其他疗法。在一些实施方案中，该方法包含向受试者施用其他的溶瘤病毒治疗剂(例如，弹状病毒、塞姆利基森林病毒)。在一些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，将第一剂量的复制性溶瘤痘苗病毒和第一剂量的免疫检查点抑制剂同时施用于受试者，然后将该病毒和检查点抑制剂至少一次连续同时施用于受试者。在一些实施方案中，该方法包含将复制性溶瘤痘苗病毒和检查点抑制剂至少第一、第二和第三次连续同时施用于受试者。在一些实施方案中，该方法包含将复制性溶瘤痘苗病毒和检查点抑制剂至少第一、第二、第三和第四次连续同时施用于受试者。在一些实施方案中，将第一剂量的复制性溶瘤性痘苗病毒和第一剂量的免疫检查点抑制剂同时施用，随后将该病毒和检查点抑制剂至少一次连续同时施用于受试者，然后向受试者单独施用至少一剂检查点抑制剂。在一些实施方案中，该方法包含在药剂的连续同时施用之间的1-3周的间隔，优选包含约1周、约2周或约3周的间隔。
本申请证明，复制性溶瘤痘苗病毒的肿瘤内施用(i)将宿主免疫细胞(例如肿瘤浸润性T细胞)吸引至肿瘤，并且(ii)在肿瘤细胞中诱导多种检查点蛋白(包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT)的表达，从而使肿瘤细胞对同时用(一种或多种)检查点蛋白抑制剂治疗敏感。
因此，在一些方面，这些检查点蛋白中的一种或多种的表达水平用作生物标志物，以基于其表达水平选择人类癌症患者以本文所述的联合疗法进行治疗。在一些实施方案中，可以使用用于测量蛋白质水平的任何测定法来测量该表达。在一些实施方案中，可以使用诸如FACS或Nanotring试验的测定法来测量该蛋白质表达。
在相关的实施方案中，需要治疗的人为患有不表达检查点蛋白(例如，检查点抑制剂难治性受试者)或以相对较低水平表达检查点蛋白的肿瘤的人，在这种情况下，联合疗法的溶瘤痘苗病毒组分以通过诱导检查点蛋白(例如PD-L1)的表达，有效地使肿瘤对组合物的免疫检查点抑制剂敏感的量施用。在一些实施方案中，该人可患有不表达PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM3和/或TIGIT或以相对较低水平表达这些检查点蛋白中的一种或多种的肿瘤，并且溶瘤痘苗病毒以有效地使肿瘤对PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM3和/或TIGIT抑制剂敏感的量施用。在其他相关的实施方案中，在施用溶瘤牛痘病毒和检查点抑制剂联合疗法之前在肿瘤中测量检查点蛋白的水平，并且如果确定检查点蛋白在肿瘤中不被表达或以相对较低的水平表达，则将联合疗法施用于受试者。在其他相关的实施方案中，提供一种使肿瘤对检查点抑制剂敏感的方法，其包括向患有肿瘤的人以有效诱导检查点蛋白在肿瘤中的表达的量施用溶瘤痘苗病毒，并同时向该人施用该检查点抑制剂。在一些方面，不表达检查点蛋白或以相对较低的水平表达检查点蛋白的肿瘤是指根据肿瘤样本的免疫组织化学(IHC)评估，少于50％、少于25％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％或少于0.5％的肿瘤细胞对检查点蛋白染色呈阳性。参见例如IIie等人,《菲尔绍文献(Virchows Arch)》,468(5):511-525(2016)。在一些方面，该人患有非小细胞肺癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌或结肠直肠癌。
在其他相关的实施方案中，需要治疗的人为具有免疫学上“冷”肿瘤的人，这是指该肿瘤在肿瘤微环境中基本上或相对无免疫细胞。利用溶瘤痘苗病毒的治疗将免疫细胞(例如T细胞)吸引至肿瘤中，并与同时施用的检查点抑制剂协同以治疗肿瘤。可以通过本领域已知的方法来鉴定“冷”肿瘤，包括但不限于针对肿瘤中心和侵入边缘的免疫标记(如CD3和CD8)的单一染色或多重免疫组织化学(IHC)、用于表型分析的流式细胞计量术、肿瘤组织的基因组分析、肿瘤组织的RNA分析和/或血清中的细胞因子分析。
组合物的溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂同时(concurrently)(例如，同时(simultaneously))施用，并且可以作为相同制剂的一部分或以不同制剂的形式施用。同时(simultaneous)(或同时(concurrent))施用，是指在相同时间或大约相同时间(彼此在24小时内，优选彼此在12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2小时内或彼此在1小时之内)施用第一剂量的每种组合伴侣，并且优选在相同时间或大约相同的时间施用至少一个后续剂量的每种组合伴侣。因此，一方面，本文所述的联合疗法包含与第一剂量的检查点抑制剂同时施用的第一剂量的复制性溶瘤痘苗病毒(例如，联合疗法对受试者的治疗需要至少第一次施用，其中将溶瘤痘苗病毒和检查点抑制剂同时施用于受试者)，并且优选进一步包含溶瘤痘苗病毒和检查点抑制剂的至少一次、两次、三次、四次或更多次另外的连续同时给药。因此，药物组合物的同时治疗方案可包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个的连续同时施用剂量的药剂。在优选的实施方案中，连续同时给药剂量的溶瘤痘苗病毒和检查点抑制剂之间的间隔范围为约1天至约3周，或其之间的任何间隔，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。在一些优选的实施方案中，连续同时给药剂量的溶瘤痘苗病毒与检查点抑制剂之间的间隔为约1周或约2周。在同时施用至少一次初始剂量的溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂之后，可向受试者单独施用一个或多个剂量的检查点抑制剂。
在其他方面，本发明提供了一种商业包装，其包含如本文所述的溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂的组合物作为活性剂，以及如本文所述的同时用于治疗和/或预防癌症的说明书。在一个优选的方面，该商业包装包含作为活性剂的Western Reserve、Copenhagen、Wyeth或Lister株痘苗病毒和PD-1、PD-L1、TIGIT或CTLA4抑制剂的组合物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗人的肿瘤的方法，其包含向该人同时施用一种组合物，该组合物包含(a)复制性溶瘤痘苗病毒和(b)免疫检查点蛋白的抑制剂。在一些实施方案中，该复制性溶瘤病毒是肿瘤内施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒仅通过肿瘤内施用递送。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是在肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒以有效诱导免疫检查点蛋白在肿瘤中的表达的量施用。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗人的肿瘤的方法，其包含向该人同时施用一种组合物，该组合物包含(a)有效诱导免疫检查点蛋白在肿瘤中的表达的量的复制性溶瘤痘苗病毒和(b)免疫检查点蛋白的抑制剂。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒在肿瘤内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过IV施用。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为CTLA-4。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为PD-L1。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为LAG3。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为TIGIT。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为PD-1。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为TIM3。在治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为实体癌。在治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为结肠直肠癌。在治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为肾细胞癌。
在双联治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白的抑制剂为选择性结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体。在一些实施方案中，选择性结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体选自由以下项组成的群组：BMS-936559、阿特珠单抗、度伐单抗、阿维鲁单抗、纳武单抗、派姆单抗和兰罗利珠单抗。
在双联治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白的抑制剂为选择性结合CTLA-4的单克隆抗体。在一些实施方案中，选择性结合CTLA-4的单克隆抗体选自由兰罗利珠单抗和替西木单抗组成的群组。
在双联治疗方法的一些实施方案中，在施用复制性溶瘤痘苗病毒之前，肿瘤不表达免疫检查点蛋白或以相对较低的水平表达免疫检查点蛋白。
在双联治疗方法的一些实施方案中，该方法包含在施用组合物之前测量肿瘤中免疫检查点蛋白的表达水平的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗人的肿瘤的方法，其包含向该人同时施用一种组合物，该组合物包含(a)复制性溶瘤痘苗病毒、(b)PD-1和/或PD-L1的抑制剂，以及(c)免疫检查点蛋白的抑制剂。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒以有效诱导免疫检查点蛋白的表达的量施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是肿瘤内施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒仅通过肿瘤内施用递送。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是在肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗人的肿瘤的方法，其包含向该人同时施用一种组合物，该组合物包含(a)有效诱导免疫检查点蛋白在肿瘤中的表达的量的复制性溶瘤痘苗病毒、(b)PD-1和/或PD-L1的抑制剂，以及(c)免疫检查点蛋白的抑制剂，其中该复制性溶瘤痘苗病毒在肿瘤内施用。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白选自CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为CTLA-4。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为LAG3。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为TIGIT。在治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为TIM3。在治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为实体癌。在治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为结肠直肠癌。在治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为肾细胞癌。
在三联治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白的抑制剂为选择性结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体。在一些实施方案中，选择性结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体选自由以下项组成的群组：BMS-936559、阿特珠单抗、度伐单抗、阿维鲁单抗、纳武单抗、派姆单抗和兰罗利珠单抗。
在三联治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白的抑制剂为选择性结合CTLA-4的单克隆抗体。在一些实施方案中，选择性结合CTLA-4的单克隆抗体选自由兰罗利珠单抗和替西木单抗组成的群组。
在三联治疗方法的一些实施方案中，在施用复制性溶瘤痘苗病毒之前，肿瘤不表达免疫检查点蛋白或以相对较低的水平表达免疫检查点蛋白。
在三联治疗方法的一些实施方案中，该方法包含在施用组合物之前测量肿瘤中免疫检查点蛋白的表达水平的步骤。
在整个本申请中讨论了本发明的其他实施方案。关于本发明的一个方面讨论的任何实施例也适用于本发明的其他方面，反之亦然。应将实施例部分中的实施方案理解为是适用于本发明所有方面的本发明实施方案。
附图说明
以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合在本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-1C。图1A：描绘了肿瘤内(IT)注射mJX-594和腹膜内施用抗PD-1检查点抑制剂抗体的同时联合治疗方案的图。向8周龄的BALB/c免疫感受态的小鼠注射5×105个Renca(肾癌)细胞。一旦肿瘤大小达到≥50mm3，用PBS(对照，第0、3、6和9天)、单独的抗PD-1抗体(第0、3、6和9天)、单独的mJX-594(第0、2和4天)或同时递送的抗PD-1和mJX-594(药剂在第0、2和4天同时施用，然后在第6天单独施用抗PD-1，mJX-594以1x107 pfu肿瘤内(IT)施用，抗PD-1以10mg/kg腹膜内(IP)施用)治疗小鼠。图1B：向八周龄的雌性BALB/c小鼠注射在100μl PBS中的RENCA细胞(2×106个细胞)至左肾的子包膜中。在植入后的第10天，根据所示方案，通过(i)PBS(对照)、(ii)痘苗病毒(JX-929)单药治疗(植入后的第10、11和12天，6x107PFU，共3剂)、(iii)抗PD1单药治疗(BioXcell，West Lebanon，NH，100μl)(植入后的第10、11和12天，共3剂)或(iv)同时进行JX929+抗PD1治疗(各自在植入后的第10、11和12天施用，其中JX-929在早晨施用，ICI在当天下午施用，间隔9小时)腹腔内(i.p)治疗携带Renca肿瘤(50mm3-100mm3，通过
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Spectrum体内成像系统可视化)的小鼠。图1C：根据所示的治疗方案，向携带超过50mm3的Renca肿瘤的Balb/c小鼠施用四个肿瘤内剂量的mJX594(在第0、3、6和9天，每天1x107)或PBS对照。
图2A-2B。图2A：描绘图1A中描述的治疗方案对肿瘤体积的影响的图。与所有其他治疗组相比，同时联合治疗(PD1+mJX594)显著抑制了肿瘤的生长(在植入后的第18天以后)。图2B：描绘图1A中描述的每个治疗组中的肿瘤重量的照片和曲线图。相对于任一单药治疗，同时联合治疗(PD1+mJX594)协同作用以显著减小肿瘤体积。
图3A-3B。与对照和单药治疗相比，使用IT mJX-594和抗PD-1的同时联合治疗显著增加了肿瘤内T细胞浸润。根据图1所示的施用方案对小鼠进行治疗。图3A：显示与对照和单药治疗组相比，在同时联合治疗组中，在肿瘤周围和肿瘤内区域中CD8 T细胞浸润显著增加的图像。图3B：显示与对照和任一单药治疗相比，同时联合组的肿瘤周围和肿瘤内CD8 T细胞浸润明显增加的图。
图4A-4B。使用IT mJX-594和抗PD-1的同时联合治疗上调肿瘤内PD-L1的表达。根据图1所示的施用方案对小鼠进行治疗。图4A：显示与对照和任一单药治疗(PD-L1染色)相比，在同时联合治疗组中，在外周和中心肿瘤区域中PD-L1表达水平显著增加的图像。图4B：显示与对照和任一单药治疗组相比，在同时联合治疗组中肿瘤内细胞凋亡显著增加的图像。
图5A-5B。与对照相比，同时联合治疗组中的CD8 T细胞和CD11b+Grl+髓源性抑制细胞(MDSC)增加。图5A：流式细胞仪图，其显示了来自各治疗组的肿瘤中CD8和Gr-1的阳性，与任一单药治疗相比，同时联合组的肿瘤的CD8+T细胞显著增加。还显示了MDSC相对于任一单药治疗的增加。图5B：描绘流式细胞术结果的条形图。
图6。描绘使用IT注射的mJX-594和腹膜内递送的抗PD1(+/-抗CTLA4)检查点抑制剂抗体的联合治疗方案的图。将5×105个Renca细胞皮下注射到8周龄BALB/c小鼠的右侧腹中。当肿瘤大小达到50-100mm3时，开始治疗(第0天)。在第0天，对(携带Renca肿瘤的)小鼠用PBS(对照)、依次递送的mJX-594+抗PD1的组合物、同时递送的mJX-594+抗PD-1的组合物和同时递送的mJX-594+抗PD-1+抗CTLA4的三联组合物进行治疗。mJX-594以1x107 pfu IT施用，抗PD1以10mg/kg IP施用，并且抗CTLA4以4mg/kg IP施用。
图7。描述图6中描述的治疗方案对肿瘤体积的影响的图。与所有其他治疗组相比，从第6天起(治疗后)，使用αPD 1+mJX594和αPD1+mJX594+αCTLA4的同时联合治疗显著抑制了肿瘤的生长，并且与对照和序贯联合治疗组(mJX594→αPDl)相比，两个同时联合治疗组均显著延迟了肿瘤的生长，其中从第12天开始观察到肿瘤消退。
图8。描述使用IT注射的mJX-594和腹膜内递送的抗CTLA4检查点抑制剂抗体的联合治疗方案的图。将5×105个Renca细胞皮下注射到8周龄的BALB/c小鼠的右侧腹中。当肿瘤大小达到50-100mm3时，开始治疗(第0天)。在第0天，将(携带Renca肿瘤的)小鼠用PBS(对照)、单独的抗CTLA4、单独的mJX-594、序贯递送的mJX-594+CTLA4的组合物和同时递送的mJX-594+CTLA4的组合物。mJX-594以1x107 pfu IT施用，并且抗CTLA4以4mg/kg施用。
图9。描绘图8中描述的治疗方案对肿瘤体积的影响的图。与使用mJX594+αCTLA4的序贯联合治疗和任一单药治疗相比，使用mJX594+αCTLA4的同时联合治疗显著延迟了肿瘤的生长。
图10A-10B。与序贯联合治疗和任一单药治疗相比，IT施用的mJX594和抗CTLA4的同时联合显著增加了CD8+T细胞肿瘤浸润并降低MDSC水平。图10A：流式细胞仪图，其显示每个治疗组的肿瘤中CD8和Gr-1的阳性，与序贯治疗组和任一单药治疗相比，同时联合组的肿瘤中CD8+T细胞显著增加，MDSC显著减少。图10B：描绘流式细胞术结果的条形图。
图11。描述通过静脉内(IV)注射mJX-594和腹膜内递送的抗PD1检查点抑制剂抗体的联合治疗方案的图。将5×105个Renca细胞皮下注射到8周龄的BALB/c小鼠的右侧腹中。当肿瘤大小达到50-100mm3时，开始治疗(第0天)。在第0天，对(携带Renca肿瘤的)小鼠用PBS(对照)、单独的抗PD1、单独的mJX-594、或同时递送的mJX-594+抗PD1进行治疗。mJX-594以2×107pfu IV施用，抗PD1以10mg/kg IP施用。
图12。描绘图11中描述的治疗方案对肿瘤体积的影响的图。使用mJX594IV+αPD1的同时联合治疗不如单独使用mJX594的治疗，也没有比单独使用αPD1的治疗更好。
图13：显示了通过每三天施用四个1×107pfu剂量的mJX594 mJX594(被工程改造为含有病毒胸苷激酶基因破坏和鼠GM-CSF插入的Wyeth痘苗病毒)肿瘤内治疗的，携带Renca肿瘤的小鼠中免疫检查点蛋白的倍数变化(相对于治疗前水平)。
图14。提供有关mJX594注射次数和肿瘤生长抑制的数据。为了发现使用mJX594的最佳免疫疗法，对Renca肾癌的各种剂量进行了测试。肿瘤生长减少了，这取决于mJX594剂量的增加。
图15。显示了mJX594治疗后肿瘤内CD8+T细胞的募集的图像。
图16。显示了mJX594治疗后CD8+T细胞的肿瘤内募集的图像。在经mJX594治疗的肿瘤中，观察到CD8+淋巴样细胞的聚集体，其类似于淋巴滤泡。
图17。显示mJX594增加肿瘤内CD8+T细胞的数目和效应子功能的数据。在mJX594治疗后，CD8+T细胞与调节性T细胞的比率逐渐升高。在mJX594治疗后，CD8+T细胞中ICOS和颗粒酶B的表达增加。尽管CD4+Foxp3+CD25+调节性T细胞以及CD8+和CD4+T细胞的数量在淋巴样细胞区室中同时增加，与对照相比，CD8+效应T细胞与调节性T细胞的比例增加了。此外，在CD8+T细胞中，ICOS和颗粒酶B(GzB)的表达(T细胞的共同刺激和激活标记)增加了。
图18。显示mJX594治疗使髓样细胞(Ly6G-Ly6C+↑，Ly6G+Ly6Cint↓)复极化的数据。mJX594增加CD11b+Ly6G-Ly6C+单核髓样细胞，并减少CD11b+Ly6G+Ly6Cint粒细胞性髓样细胞。在髓样细胞区室的亚组分析中，我们发现了CD11b+Ly6G-Ly6C+单核髓样细胞的增加以及具有CD11b+Ly6G+Ly6Cint的粒细胞性髓样细胞的减少，表明通过施用mJX594，单核细胞与粒细胞的比率显著增加。
图19。显示用耗竭抗体实验处理的示意图的数据。为了确定免疫系统的哪些成分对mJX594治疗后的治疗效果负责，研究了CD8+T细胞、CD4+T细胞和GM-CSF耗竭对肿瘤生长和抗癌免疫中的作用。
图20。表明T细胞或GM-CSF的耗竭显著消除了mJX594的抗癌作用的数据。CD8+和CD4+T细胞在mJX594治疗的抗癌作用中都是必不可少的介质，而GM-CSF也可以提供免疫治疗益处。尽管用mJX594单药治疗检测到高效的肿瘤抑制，但CD8+或CD4+T细胞的耗竭导致治疗效果的消除。
图21。显示mJX594后CD4+T细胞或GM-CSF的耗竭减弱了肿瘤内的CD8+T细胞浸润的数据。CD4+T细胞的耗竭减少了肿瘤内的CD8+T细胞，提示CD4+T细胞参与了CD8+T细胞的活化。GM-CSF的耗竭减少了CD8+和CD4+T细胞两者。使用mJX594注射对CD4+T细胞进行的耗竭减少了肿瘤内的CD8+T细胞，提示CD4+T细胞参与了CD8+T细胞的活化。相反，CD8+T细胞的耗竭并没有诱导CD4+T细胞的显著变化，表明CD8+T细胞不影响CD4+T细胞。这些数据表明，使用mJX594的治疗诱导了CD8+和CD4+T细胞的启动，其指示了抗癌免疫力。CD8+和CD4+T细胞的浸润表明了抗癌作用。
图22。mJX594、αPD-1和αCTLA-4的三联疗法的实验的示意图。mJX594
图23。显示mJX594、αPD-1和αCTLA-4的三联组合物明显延迟了肿瘤生长的数据。值得注意的是，mJX594、αPD-1和αCTLA-4的三联组合物在某些小鼠(37.5％)中引起了Renca肿瘤的完全消退。尽管与对照相比，αPD-1和αCTLA-4的双联组合物使肿瘤生长延迟了14.5％，mJX594单药治疗抑制了36.9％的肿瘤生长，但三联组合物显示了76.5％的肿瘤生长抑制率。值得注意的是，mJX594、αPD-1和αCTLA-4的三联组合物可产生肿瘤的完全消退(完全反应率：37.5％)，这在使用双重组合物或mJX594单药治疗的肿瘤中均未观察到。
图24。显示mJX594、PD-1和CTLA-4的三联免疫疗法延长总生存期的数据。使用三联疗法治疗的小鼠显示出显著的抗癌治疗效果。此外，为了证实由三联疗法引起的这些有效的抗癌作用是否可以转化为长期存活益处，对荷瘤小鼠进行了存活分析。与单药治疗或双联免疫疗法相比，使用三联疗法治疗的小鼠显示出存活益处。
图25。mJX594、αPD-1和αLAG3三联疗法的实验的示意图。
图26。显示mJX594、αPD-1和αLAG3的三联组合物适度延迟肿瘤生长的数据。在该实验中，与mJX594和αPD-1的双联组合物相比，三联组合物未显示出统计学上显著的差异。与对照相比，mJX594和αPD-1的双联组合物将肿瘤生长延迟41.9％，αLAG3单药疗法抑制肿瘤生长5.7％。三联组合物显示出30.1％的肿瘤生长抑制率。
图27。显示mJX594、αPD-1和αLAG3的三联组合物增加了CD8+和CD4+T细胞的数据。对淋巴样细胞区室的亚组分析显示，双联和三联治疗使肿瘤内CD8+和CD4+T细胞的绝对数目增加。
图28。mJX594、αPD-1和αTIGIT三联疗法的实验的示意图。
图29。显示mJX594、αPD-1和αTIGIT的三联组合物适度延迟肿瘤生长的数据。与mJX594和αPD-1的双联组合物相比，在Renca肿瘤中，三联组合物未显示出显著差异。
图30。显示mJX594、αPD-1和αTIGIT三联组合物增加了CD8+和CD4+T细胞的数据。对淋巴样细胞区室的亚组分析显示，双联和三联治疗使肿瘤内CD8+和CD4+T细胞的绝对数目增加。
图31。显示mJX594与抗PD1治疗协同作用以延迟结肠癌生长的数据。为了克服对ICI单药治疗的抗性，评估了mJX594和免疫检查点阻断剂在CT26结肠癌模型中的联合疗效。在该模型中，αPD-1单药治疗对肿瘤生长的影响很小，而mJX594单药治疗适度抑制肿瘤的生长。然而，mJX594和αPD-1组合物的抗体双联疗法明显阻碍了肿瘤的生长。
图32：显示mJX594和抗PD1治疗的组合增加了肿瘤内的CD8+T细胞的数据。除抑制肿瘤生长外，显微分析显示，在使用联合疗法治疗后的肿瘤周围和中心区域都明显募集了CD8+T细胞。
图33A-33G。mJX594(JX)引发免疫抑制性TME中免疫相关基因的动态变化。将Renca肿瘤通过皮下(s.c.)植入BALB/c小鼠中，当肿瘤达到>50mm3时，通过单次i.t.注射1×107pfu的mJX-594进行治疗。(A)用JX治疗的Renca肿瘤的代表性图像。肿瘤用痘苗病毒(VV)、CD31、CD8、CD11c和PD-L1染色。(B)对痘苗病毒+、CD31+血管、CD8+细胞毒性T细胞、CD11c+树突状细胞和PD-L1+细胞的表达的定量。(C)JX治疗后肿瘤微环境中VV、CD8和PD-L1的时间变化。(D)显示JX治疗后TME中各种细胞类型(绿色)中PD-L1表达上调(红色)的图像。注意，PD-L1的表达主要在Pan-CK+肿瘤细胞(箭头)中观察到，但是一些CD11b+髓样细胞(箭头)也偶尔表达PD-L1，而CD3+T细胞则不表达。(E)NanoString免疫相关基因表达热图。红色和绿色分别代表上调和下调。(F)显示在JX治疗的肿瘤中的基因表达的火山图。指出了与免疫刺激有关的基因。红线表示p<0.05。(G)与抑制性免疫检查点(IC)、激动性IC、Th1应答、Th2应答、TME和髓样细胞有关的基因表达的对比。除非另有说明，否则每组n＝5。数值为平均值±SEM。*相对于对照，p<0.05。比例尺，50μm。一些数据也显示于图13中。
图34A-34M。JX通过增加T细胞浸润和调节髓样细胞来抑制肿瘤生长。对携带Renca肿瘤小鼠用PBS或1x107 pfu的JX通过i.t.治疗1-3次。(A-B)使用JX治疗的小鼠中肿瘤生长的对比。随时间变化的平均(A)和单个(B)肿瘤生长曲线。(C-D)使用JX治疗1-3次的肿瘤的周围或肿瘤内区域的CD8+T细胞的代表性图像(C)和对比(D)。(E)显示了肿瘤中的CD8+和CD4+T细胞部分的代表性流式细胞仪图。(F)由流式细胞术计算的每克肿瘤中CD8+和CD4+T细胞的绝对数目。(G)三次施用JX治疗的肿瘤中CD45+、CD8+和CD4+的分数的对比。(H-J)肿瘤中CD4+Foxx3+CD25+(Treg)的分数、CD8/Treg比率、CD8+ICOS+和CD8+GzB+的对比。(K)肿瘤中CD11b+Grl+髓样细胞的分数的对比。(L)显示了肿瘤中的CD11b+髓样细胞部分的代表性流式细胞仪图。(M)关于肿瘤中的CD11b+的Ly6G-Ly6C+单核髓样细胞、Ly6G+Ly6Cint粒细胞性髓样细胞的分数以及单核/粒细胞的比率的对比。除非另有说明，否则每组n＝5-6。数值为平均值±SEM。*相对于对照，p<0.05；#相对于JXx1，p＜0.05；$相对于JXx2，p＜0.05。ns，不显著。比例尺，100μm。一些数据也显示在图19-21中。
图35A-35E。肿瘤内注射JX在局部和远处肿瘤中均诱导CD8+淋巴细胞浸润。小鼠在右侧腹通过s.c.注射Renca，在左侧腹皮下注射Renca或CT26肿瘤。箭头指示肿瘤内(i.t.)的JX治疗。(A)注射的JX的Renca肿瘤和未注射的Renca肿瘤的肿瘤植入和治疗示意图以及生长曲线。(B-C)在注射的JX和未注射的肿瘤中CD8+T细胞(绿色)的代表性图像(B)和对比(C)。(D)注射JX的Renca肿瘤和未注射的CT26肿瘤的植入和治疗示意图以及生长曲线。(E-F)注射JX的和远处的肿瘤中的CD8+T细胞(绿色)的代表性图像(E)和对比(F)。除非另有说明，否则每组n＝5。数值为平均值±SEM。*相对于对照，p<0.05，ns，不显著。比例尺，50μm。
图36A-36D。抗肿瘤免疫在JX的总体疗效中起着重要作用。对小鼠通过s.c.植入Renca，并通过i.t.施用JX或通过i.p.施用耗竭抗体治疗CD8+、CD4+T细胞或小鼠GM-CSF。(A)治疗方案。(B-C)使用JX或耗竭抗体治疗的小鼠中的肿瘤生长的对比。随时间变化的平均(B)和个体(C)肿瘤生长曲线。*相对于对照p＜0.05；$相对于aGM-CSF，p＜0.05。(D-E)每克使用JX和免疫细胞耗竭抗体治疗的肿瘤中CD8+(D)和CD4+(E)T细胞的绝对数目。除非另有说明，否则每个组的n＝7-8。数值为平均值±SEM。*相对于对照，p＜0.05；#相对于VX，p＜0.05；$相对于aGM-CSF，p＜0.05。ns，不显著。
图37A-37E。JX和αPD-1的联合治疗协同引发CD8+T细胞介导的肿瘤免疫。用PBS、JX、αPD-1抗体或JX+αPD-1抗体治疗携带Renca肿瘤的小鼠。(A-B)使用JX和/或αPD-1抗体治疗的小鼠中肿瘤生长的对比。随时间变化的平均(A)和单个(B)肿瘤生长曲线。(C-D)使用JX和/或αPD-1抗体治疗的肿瘤中CD8+T细胞、CD31+血管、活化的半胱天冬酶3(Casp3)+凋亡细胞和PD-L1+细胞的代表性图像(C)和对比(D)。(E)描述通过JX和αPD-1阻断剂联合治疗克服免疫抑制性TME的图。除非另有说明，否则每组n＝7。数值为平均值±SEM。*相对于对照，p＜0.05；#相对于JX，p＜0.05；$相对于αPD-1，p＜0.05。ns，不显著。比例尺，100μm。一些数据也显示于图19-21中。
图38A-38F。肿瘤内施用JX和全身施用ICI联合免疫疗法的疗效在很大程度上不受治疗方案的影响。对小鼠通过s.c.植入Renca肿瘤，并按各种时间表用JX+ICI治疗。(A)描述各种治疗方案的图。箭头指示i.t.递送JX(红色箭头)或全身递送免疫检查点阻断剂(蓝色箭头)进行治疗。(B-C)使用不同的时间表经JX和αPD-1抗体治疗的小鼠中肿瘤生长的对比。随时间变化的平均(B)和个体(C)肿瘤生长曲线。(D)显示了肿瘤浸润的CD8+和CD4+T细胞部分的代表性流式细胞仪图。(E-F)每克肿瘤中CD8+、CD4+、CD8+ICOS+和CD8+GzB+细胞的绝对数目的对比。除非另有说明，否则每组n＝7。数值为平均值±SEM。*相对于对照，p<0.05，ns，不显著。
图39A-39E。JX、αPD-1和αCTLA-4抗体的三联组合物引起完全消退并改善总存活率。在有或无针对PD-1和CTLA-4的免疫检查点阻断剂下，对小鼠通过s.c.植入Renca肿瘤并使用JX进行治疗。(A-B)使用JX和/或免疫检查点阻断剂治疗的小鼠中肿瘤生长的对比。随时间变化的平均(A)和单个(B)肿瘤生长曲线。(C)显示了肿瘤大小相对于基线的最大百分比变化的瀑布图。(D)总存活率的Kaplan-Meier图。(E)完全肿瘤消退的小鼠中，Renca肿瘤细胞重新攻击后的肿瘤大小的对比。除非另有说明，否则每组n＝8。*相对于对照，p＜0.05；#相对于JX，p＜0.05；$相对于αPD-1+αCTLA-4，p＜0.05。ns，不显著。一些数据也显示于图23和24中。
图40A-40L。三联疗法延缓了自发乳腺癌模型的肿瘤生长和转移。从出生后9周开始，每周分析MMTV-PyMT小鼠的自发性乳腺肿瘤的肿瘤生长。出生后13周收集样本。(A)描绘治疗时间表的图。箭头指示通过i.t.递送JX或全身递送αPD-1和αCTLA-4抗体的治疗。(B)显示肿瘤总体外观的代表性图像。虚线圆圈划定可触知的乳腺肿瘤结节。(C)总肿瘤负荷的对比。通过累加每只小鼠的每个肿瘤结节的体积来计算肿瘤负荷。(D)可触知的肿瘤结节数目的对比。(E)每个肿瘤结节的体积的对比。将MMTV-PyMT小鼠中的每个肿瘤结节绘制为单个点。(F)总存活率的Kaplan-Meier曲线。(G)带H&E的肿瘤切片，其显示肿瘤内区域。JX和JX+P+C组的腺泡结构是早期的、侵入性较小的病变(Ea)，其显示与周围的乳腺脂肪组织(Adi)有明显的边界。而Cont和P+C的浸润性导管癌区域(Ca)已大量侵入周围组织并形成了无残留腺泡结构的肿瘤细胞实体片(solid sheet)。比例尺，200μm。(H-J)肿瘤中CD8+T细胞(H和I)和CD31+肿瘤血管(H和J)的代表性图像和对比。(K)H&E染色的代表性肺切片。箭头指示转移灶。比例尺，200μm。(L)每个肺切片的转移灶数目的对比。除非另有说明，否则每个组的n＝6-7。数值为平均值±SEM。*与对照相比，p＜0.05；#与JX相比，p＜0.05；与$αPD-1+αCTLA-4相比，p＜0.05。ns，不显著。比例尺，100μm。
图41。在远处的肿瘤中未检测到痘苗病毒。尽管在右侧经注射的肿瘤中可以观察到痘苗病毒(VV)的强力复制(绿色)，但在左侧未经注射的肿瘤中未检测到痘苗病毒。比例尺，100μm。
图42A-42H。JX和∧CTLA-4的联合治疗可协同引发CD8+T细胞介导的肿瘤免疫。对携带Renca肿瘤的小鼠用PB、JX、αCTLA-4抗体或JX+αCTLA-4抗体进行治疗。(A-B)在用JX和/或αCTLA-4抗体治疗的小鼠中肿瘤生长的对比。随时间变化的平均(A)和单个(B)肿瘤生长曲线。(C-E)肿瘤中CD8+T细胞(C和D)和CD31+血管(C和E)的图像和对比。(F-H)每克经JX和/或αCTLA-4抗体治疗的肿瘤中CD45+免疫细胞(F)、CD8+T细胞(G)和CD4+细胞(H)的绝对数目。数值为平均值±SEM。*与对照相比，p<0.05；#与JX相比，p<0.05；与αCTLA-4相比，$p＜0.05。ns，不显著。比例尺，100μm。
图43A-43E。无论治疗方案如何，JX都可通过∧CTLA-4的免疫反应增强抗癌功效。(A-B)使用不同的时间方案用JX和αCTLA-4抗体治疗的小鼠中肿瘤生长情况的对比。随时间变化的平均(A)和单个(B)肿瘤生长曲线。(C)显示了肿瘤中肿瘤浸润的CD8+和CD4+T细胞部分的代表性的流式细胞仪图。(D-E)每克使用JX和αCTLA-4抗体治疗的肿瘤中CD8+、CD4+、CD8+ICOS+和CD8+GzB+细胞的绝对数目。数值为平均值±SEM。*与对照相比，p<0.05，ns，不显著。一些数据也显示于图38中。
具体实施方式
I.选择定义
当在权利要求书和/或说明书中使用时，术语“抑制”、“减少”或“预防”或这些术语的任何变体包括任何可测量的降低或完全抑制以达到期望的结果。
如本文所用，术语“组合(combination)”是指抗癌剂，即溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂的联合施用，其可以独立给药或通过不同量的组合伴侣的不同固定组合施用。术语“组合”还定义了一种“试剂盒”，其包含要同时施用的组合伴侣。优选地，选择连续同时施用组合伴侣之间的时间间隔，以使药剂的组合表现出协同作用。如本文所用，术语“协同的”或“协同”是指用本发明所涵盖的抗癌剂组合所达到的效果大于使用抗癌剂(即溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂)作为单药治疗所产生的效果之和。有利的是，这种协同在相同剂量下提供了更大的功效，和/或防止或延迟了多药耐药性的形成。
如本文所用的术语“难治性癌症”是指对抗肿瘤治疗不能有利地反应的癌症，或者对抗肿瘤治疗有利反应后复发(recur或relapse)的癌症。因此，本文所用的“难以治疗的癌症”是指对抗肿瘤治疗不能有利地反应或有抗性的癌症，或者对治疗有利反应后复发(recur或relapse)的癌症。例如，这种先前的治疗可以是化疗方案，或者可以是免疫治疗方案(包括施用特异性结合PD-1、PD-L1或CTLA4的单克隆抗体)。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，词语“一个/一种(“a”或“an”)”的使用可能表示“一个”，但是也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
可以预期的是，可以针对本发明的任何方法或组合物来实现本文所讨论的任何实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用来实现本发明的方法。
在整个申请中，术语“约”用来表示数值，其包括用于确定该数值的装置或方法的误差的标准偏差。
除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是互斥的，否则在权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，尽管本公开内容支持仅提及替代和“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含，如“comprise”和“comprises”)，“具有(having)”(以及任何形式的具有，如“have”和“has”)，“包括(including)”(以及任何形式的包括，例如“includes”和“include”)或“含有(containing)”(以及任何形式的含有，例如“contains”和“contain”)是包括性的或开放式的，并且不排除其他未列举的元素或方法步骤。
通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，尽管详细描述和特定实施例指示了本发明的特定实施方式，但是它们仅以说明的方式给出，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
已经发现，利用溶瘤痘苗病毒和检查点抑制剂的联合治疗可在癌症治疗中产生出乎意料的改善。当同时施用该药剂并施用溶瘤痘苗病毒时，与单一施用任何一种药剂相比，这些药剂相互作用甚至协同作用来提供显著改善的抗肿瘤作用。出人意料的是，如果按序贯施用药剂，则不会显著观察到这些作用。在一些实施方案中，当通过肿瘤内施用复制性溶瘤病毒时，联合疗法产生协同作用。在一些实施例中，当通过静脉内施用复制性溶瘤病毒时，联合疗法产生协同作用。在一些实施例中，当通过腹膜内施用复制性溶瘤病毒时，联合疗法产生协同作用。在一些实施例中，当复制性溶瘤病毒仅通过肿瘤内施用递送。在一些实施例中，当复制性溶瘤病毒仅通过动脉内施用递送。在一些实施例中，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施例中，当复制性溶瘤病毒通过肿瘤内施用，并且检查点抑制剂通过全身施用时，联合疗法产生协同作用。在一些实施例中，当复制性溶瘤病毒通过肿瘤内施用，并且检查点抑制剂通过全身施用时，联合疗法产生协同作用。在一些实施例中，当复制性溶瘤病毒通过腹膜内施用，并且检查点抑制剂通过全身施用时，联合疗法产生协同作用。在一些实施例中，当复制性溶瘤病毒通过动脉内施用，并且检查点抑制剂通过全身施用时，联合疗法产生协同作用
进一步发现溶瘤痘苗病毒上调人肿瘤中检查点蛋白如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、LAG3和TIGIT的表达，从而使肿瘤对用检查点抑制剂的治疗敏感，不仅在患有表达组合物的检查点抑制剂的肿瘤的患者中而且在患有不表达组合物的检查点抑制剂或表达相对较低水平的检查点抑制剂的肿瘤的患者中均支持本联合疗法。
在一些实施例中，提供了一种用于在哺乳动物(优选人)中治疗和/或预防癌症和/或建立转移的联合疗法，其包含同时向哺乳动物施用(i)具有复制能力的溶瘤痘苗病毒和(ii)一种或多种免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，具有复制能力的溶瘤痘苗病毒在肿瘤内施用。在一些实施例中，具有复制能力的溶瘤痘苗病毒通过静脉内施用。在一些实施例中，具有复制能力的溶瘤痘苗病毒仅在肿瘤内施用。在一些实施例中，具有复制能力的溶瘤痘苗病毒仅在动脉内施用。在一些实施例中，当通过腹膜内施用复制性溶瘤病毒时，联合疗法产生协同作用。在一些实施例中，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施例中，复制性溶瘤病毒是在肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施例中，复制性溶瘤病毒是在肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施例中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施例中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。
Ⅱ.溶瘤痘苗病毒
痘苗病毒是一种大型、复杂的包膜病毒，其具有约190K bp的线性双链DNA基因组，并编码大约250个基因。牛痘因其作为根除天花的疫苗而闻名。天花根除后，科学家们一直在探索牛痘作为将基因传递到生物组织中的工具的用途(基因治疗和基因工程)。痘苗病毒在DNA病毒中是独特的，因为它仅在宿主细胞的细胞质中复制。因此，需要大基因组来编码病毒DNA复制所需的各种酶和蛋白质。在复制过程中，牛痘产生外膜不同的数种感染形式：细胞内成熟病毒体(EVIV)、细胞内包膜病毒体(TEV)、细胞相关包膜病毒体(CEV)和细胞外包膜病毒体(EEV)。EVIV为最丰富的感染形式，并且被认为是造成宿主之间传播的原因。另一方面，CEV被认为在细胞间传播中起作用，而EEV被认为对于在宿主生物体内的远程传播很重要。
任何已知的痘苗病毒溶瘤株可以根据本文所述的方法与检查点抑制剂同时施用。在优选的实施例中，复制性溶瘤痘苗病毒为Copenhagen株、Western Reserve株、Lister株或Wyeth株，最优选为Western Reserve株或Wyeth株。对Western Reserve痘苗疫苗株的基因组已进行了测序(登录号AY243312)。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Copenhagen株。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Western Reserve株。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Lister株。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Wyeth株。
复制性溶瘤痘苗病毒可以被工程改造为缺乏一种或多种功能基因，以提高该病毒的癌症选择性。在一些优选的实施方案中，溶瘤痘苗病毒被工程改造成缺乏胸苷激酶(TK)活性。TK缺陷型痘苗病毒需要三磷酸胸苷进行DNA合成，从而使得在分裂细胞(特别是癌细胞)中优先复制。在另一方面，溶瘤痘苗病毒可以被工程改造为缺乏痘苗病毒生长因子(VGF)。这种分泌的蛋白质是在感染过程的早期产生的，可作为有丝分裂原引发周围细胞的感染。在另一方面，溶瘤痘苗病毒可以被工程改造为缺乏VFG和TK活性。在其他方面，溶瘤牛痘病毒可以被工程改造为缺乏一种或多种参与逃避宿主干扰素(IFN)应答的基因，例如E3L、K3L、B18R或B8R。在一些优选的实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Western Reserve株、Copenhagen株、Lister株或Wyeth株，并且缺乏功能性TK基因。在其他实施方案中，溶瘤痘苗病毒为缺乏功能性B18R和/或B8R基因的Western Reserve株、Copenhagen株、Lister株或Wyeth株。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Western Reserve株、Copenhagen株、Lister株或Wyeth株，并且缺乏功能性TK基因。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Western Reserve株，并且缺乏功能性TK基因。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Copenhagen株，并且缺乏功能性TK基因。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Lister株，并且缺乏功能性TK基因。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Wyeth株，并且缺乏功能性TK基因。在一些实施方案中，溶瘤痘苗病毒为缺乏功能性B18R和/或B8R基因的Western Reserve株、Copenhagen株、Lister株或Wyeth株。在一些实施方案中，溶瘤痘苗病毒为缺乏功能性B18R和/或B8R基因的Western Reserve株。在一些实施方案中，溶瘤痘苗病毒为缺乏功能性B18R和/或B8R基因的Copenhagen株。在一些实施方案中，溶瘤痘苗病毒为缺乏功能性B18R和/或B8R基因的Lister株。在一些实施方案中，溶瘤痘苗病毒为缺乏功能性B18R和/或B8R基因的Wyeth株。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为WesternReserve株、Copenhagen株、Lister株或Wyeth株，并且缺乏功能性TK基因以及缺乏功能性B18R和/或B8R基因。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒包含功能性14L和/或F4L基因。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒不表达趋化因子(例如，痘苗病毒不表达CXCL-11)。
在一些实施方案中，组合物的复制性溶瘤痘苗病毒包含功能性14L和/或F4L基因。
在其他实施方案中，组合物的复制性溶瘤痘苗病毒不表达趋化因子(例如痘苗病毒不表达CXCL-11)。
异源序列(例如编码细胞因子和/或肿瘤抗原)可以置于痘苗病毒启动子的控制下并整合至痘苗病毒的基因组中。或者，异源序列的表达可通过将含有痘苗启动子控制序列的穿梭载体或质粒(如在《分子生物学当前技术(Current Techniques in MolecularBiology)》(Ed.Ausubel等人)单元16.17.4(1998)的表1中的那些)转染到已被痘苗病毒感染的细胞中并通过同源重组导入异源序列来实现。当需要高水平的表达时，优选强的晚期痘苗病毒启动子。也可以使用早期和中期启动子。在一些实施方案中，异源序列在含有早期和晚期启动子元件的痘苗病毒启动子的控制下。合适的早期启动子包括但不限于编码42K、19K或25K多肽的痘苗病毒基因的启动子。合适的早期晚期启动子包括但不限于编码7.5K多肽的痘苗病毒基因的启动子。合适的晚期启动子包括但不限于编码11K或28K多肽的痘苗病毒基因的启动子。在相关的实施方案中，将异源序列插入TK和/或VGF序列以使TK和/或VGF序列失活。
在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂联合施用。在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂联合通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂联合经静脉内(IV；或血管内)施用。在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂联合经腹膜内(IP)施用。在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂联合经动脉内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒仅通过肿瘤内施用递送。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是在肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。肿瘤内施用通常需要注射到肿瘤块或与肿瘤相关的脉管系统中。在某些方面，在施用病毒之前或期间对肿瘤进行成像。血管内施用通常需要注射到血管系统中，并且是全身施用的一种形式。腹膜内施用通常需要注射到腹膜(例如体腔)中。在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂组合施用，并且两者均全身施用，例如，通过IV施用。在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂联合施用，其中复制性溶瘤痘苗病毒在肿瘤内施用，而一种或多种检查点抑制剂是全身施用的，例如，通过IV施用。在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂联合施用，其中复制性溶瘤痘苗病毒是腹膜内施用的，而一种或多种检查点抑制剂是全身施用的，例如，通过IV施用。在一些实施方案中，本文所述的复制性溶瘤痘苗病毒与一种或多种检查点抑制剂联合施用，其中复制性溶瘤痘苗病毒是动脉内施用的，而一种或多种检查点抑制剂是全身施用的，例如，通过IV施用。
本文所述的溶瘤痘苗病毒可以单次或多次(例如2、3、4、5、6、7、8次或更多次)施用。该病毒可以以1×105噬菌斑形成单位(PFU)、5×105PFU、1×106PFU、至少1×106PFU、5×106或约5×106PFU、1×107、至少1×107PFU、1×108或约1×108PFU、至少1×108PFU、约或至少5x108PFU、1x109PFU或至少1x109PFU、5x109PFU或至少5x109PFU、1x1010PFU或至少1x1010PFU、5x1010PFU或至少5x1010PFU、1×1011或至少1×1011、1×1012或至少1×1012、1×1013或至少1×1013的剂量施用。例如，该病毒可以以约106-1013pfu、约107-1013pfu、约108-1013pfu、约109-1012pfu、约108-1012pfu、约107-1012pfu、约106-1012pfu、约106-109pfu、约106-108pfu、约107-1010pfu、约107-109pfu、约108-1010pfu、或约108-109pfu的剂量施用。优选地，该病毒以至少107pfu、107-1010pfu、107-109pfu、107-108pfu、108-1010pfu、108-109pfu或109-1010pfu的剂量施用。
预期病毒的单剂量是指在0.1、0.5、1、2、5、10、15、20或24小时内(包括其间的所有值)施用于受试者或肿瘤的量。剂量可以随时间分布或通过单独注射进行。通常，将多个剂量施用于相同的一般靶区域，例如在肿瘤附近。在某些方面，通过注射装置递送病毒剂量，该注射装置包括注射器或单端口针头或单针中的多个端口或连接到注射器的多个尖头，或其组合。可以在包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周数的治疗期间内施用单剂量的痘苗病毒或施用多剂量。例如，痘苗病毒可以每隔一天、每周、每隔一周、每三周施用一次，持续1、2、3、4、5、6个月或更多个月。
痘苗病毒可用Earl和Moss在Ausubel等人，1994中描述的方法或WIPO公开号WO2013/022764所描述的方法(二者均通过引用并入本文)来繁殖。
III.免疫检查点抑制剂(lCI)
免疫检查点蛋白与向T细胞发送抑制T细胞功能的信号的特异性配体相互作用。癌细胞通过驱动检查点蛋白在其表面上的高水平表达从而抑制抗癌免疫反应来利用这一点。
用于本文所述药物组合的免疫检查点抑制剂(也被称为ICI)是能够抑制免疫检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能降低以及完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白为人检查点蛋白。因此，免疫检查点抑制剂优选为人免疫检查点的抑制剂。
检查点蛋白包括但不限于CTLA-4、PD-1(及其配体PD-L1和PD-L2)、B7-H3、B7-H4、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、BTLA、TIGIT和/或IDO。涉及LAG3、BTLA、B7-H3、B7-H4、TIM3和KIR的通路为本领域公认的构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性通路的免疫检查点通路(参见例如Pardoll，2012，《自然综述癌症(Nature Rev Cancer)》12:252-264；Mellman等人，2011，《自然(Nature)》480:480-489)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为CTLA-4、PD-1(及其配体PD-L1和PD-L2)、B7-H3、B7-H4、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、BTLA、TIGIT和/或IDO的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIGIT和/或TIM3的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为TIGIT的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为LAG3的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为TIM3的抑制剂。
在一些实施方案中，组合物的免疫检查点抑制剂为抗体。如本文所用的术语“抗体”包括天然存在的和经工程改造的抗体以及全长抗体或其功能片段或类似物，其能够结合例如靶免疫检查点或表位(例如，保留抗原结合部分)。根据本文所述方法使用的抗体可以来自任何来源，包括但不限于人、人源化、动物或嵌合抗体，并且可以是任何同种型，优选IgG1或IgG4同种型，并且还可以是糖基化或非糖基化的。术语抗体还包括双特异性或多特异性抗体，只要该抗体显示本文所述的结合特异性即可。
人源化抗体是指非人(例如小鼠、大鼠等)抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加与人抗体的相似性。嵌合抗体是指包含一种物种的一种或多种元素和另一种物种的一种或多种元素的抗体，例如包含人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分的非人抗体。
可以对多种形式的抗体进行工程改造以用于本发明的组合物，其代表性实例包括Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)、F(ab')2片段(包含两个通过铰链区的至少一个二硫键连接的Fab片段的二价片段)、Fd片段(由VH和CHI结构域组成)、Fv片段(由抗体单臂的VL和VH结构域组成)、dAb片段(由单个可变域片段(VH或VL结构域组成))、单链Fv(scFv)(包含Fv片段的两个结构域(VL和VH，其融合在一起，最终与连接子形成单链蛋白))。
在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂(也被称为ICI)为特异性结合免疫检查点蛋白的抗体或其片段，该免疫检查点蛋白选自由以下项组成的群组：CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、BTLA和TIGIT。在特别优选的实施方案中，免疫检查点抑制剂是能够至少部分拮抗CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、LAG3或TIGIT的单克隆抗体、完全人尖抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合CTLA4的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合PD-1的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合PD-L1的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合PD-L2的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合B7-H3的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合B7-H4的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合TIM3的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合GAL9的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合LAG3的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合VISTA的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合KIR的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合BTLA的抗体或其片段。在一些实施方案中，联合疗法的免疫检查点蛋白抑制剂为特异性结合TIGIT的抗体或其片段。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和CTLA-4抑制剂，优选特异性结合(和抑制)CTLA-4的单克隆抗体。完整的人CTLA-4核酸序列可以根据GenBank登录号LI 5006找到。特异性结合CTLA4的单克隆抗体包括但不限于伊匹单抗(
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BMS)和替西木单抗(AstraZeneca/Medlmmune)以及美国专利申请公开第2005/0201994号、第2002/0039581号和第2002/086014号(其各自的内容通过引用并入本文)中公开的抗体和美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号、第6,984,720号、第6,682,736号、第6,207,156号、第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号、第7,132,281号和第8,491,895号中公开的抗体(其各自的内容通过引用并入本文)，或包含这些抗体中的任何一种的重链和轻链可变区的抗体。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和PD-1抑制剂，优选特异性结合(和抑制)PD-1的单克隆抗体。人PD-1的完整核苷酸和氨基酸序列可以根据GenBank登录号U64863和NP_005009.2找到。抗PD-1的单克隆抗体包括但不限于兰罗利珠单抗(例如在美国专利第8,354,509号中被公开为hPD109A及其人源化衍生物h409A1、h409A16和h409A17，其通过引用并入本文)、纳武单抗(Bristol-Myers Squibb；代码名称BMS-936558)公开于美国专利第8,008,449号中，其通过引用并入本文,派姆单抗
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和皮地珠单抗(Pidilizumab)(CT-011；公开于Rosenblatt等人，《免疫疗法(Immunother)》.34:409-418(2011))或包含这些抗体的重链区和轻链区的抗体。其它抗PD-1抗体描述于例如，WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006/121168、WO2008/156712、WO2009/014708、WO2009/114335、WO2013/043569和WO2014/047350。在相关的实施方案中，药物组合物的检查点抑制剂为抗PD-1融合蛋白，如AMP-224(由PD-L2的细胞外结构域和人IgG1的Fc区组成)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和PD-L1抑制剂，优选特异性结合(和抑制)PD-L1的单克隆抗体。抗PD-L1的单克隆抗体包括但不限于派姆单抗(MK-3475，公开于WO2009/114335))、BMS-936559(MDX-1105)、阿特朱单抗(Genentech/Roche；MPDL33280A，公开于美国专利第8,217,149号中，其内容通过引用并入本文，度伐单抗(AstraZeneca/Medlmmune；MEDI4736)，公开于美国专利第8,779,108号，其内容通过引用并入本文，MIH1(可通过eBioscience(16.5983.82)获得的Affymetrix)和阿维鲁单抗(MSB0010718C；Merck KGaA)或包含这些抗体中的任何一种的重链和轻链可变区的抗体。在相关的实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗PD-L1融合蛋白，如被称为AMP-224的PD-L2-Fc融合蛋白(公开于Mkritchyan M.等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，189:2338-47(2010)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和PD-L2抑制剂(如MIH18(描述于Pfistershammer等人，《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)》，36:1104-1113(2006))。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和LAG3抑制剂，该LAG3抑制剂例如可溶性LAG3(IMP321或LAG3-Ig，公开于美国专利申请公开第2011-0008331号(通过引用并入本文)，以及公开于Brignon等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》15:6225-6231(2009)中)、IMP701或其他阻断人LAG3的人源化抗体(描述于美国专利申请公开第2010-0233183号(通过引用并入本文)、美国专利号第5,773,578号(通过引用并入本文))，或BMS-986016或其他阻断LAG3的完全人类抗体(描述于美国专利申请公开第2011-0150892号(通过引用并入本文))
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和BLTA抑制剂(如美国专利第8,563,694号(通过引用并入本文)中公开的抗体4C7。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和B7H4检查点抑制剂(如美国专利申请公开第2014/0294861号(通过引用并入本文)中公开的抗体或如美国专利申请公开第20120177645号(通过引用并入本文)中公开的B7H4的可溶性重组形式。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和B7-H3检查点抑制剂(如被公开为BRCA84D的抗体MGA271或公开于美国专利申请公开第20120294796号(通过引用并入本文)中的衍生物)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和TIM3检查点抑制剂(如美国专利第8,841,418号(通过引用并入本文)中公开的抗体或Jones等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，205(12):2763-79(2008)中公开的抗人TIM3阻断抗体F38-2E2。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和KIR检查点抑制剂(如抗体Liriumab(描述于Romag等人，《血液(Blood)》，114(13):2667-2677(2009))。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和TIGIT抑制剂。TIGIT检查点抑制剂优选抑制TIGIT与脊髓灰质炎病毒受体(CD155)的相互作用，并且包括但不限于靶向人TIGIT的抗体(如在美国专利第9,499,596号(通过引用并入本文)和美国专利申请公开第20160355589号、第20160176963号(通过引用并入本文)中公开的那些)以及脊髓灰质炎病毒受体变异体(如在美国专利第9,327,014号(通过引用并入本文)中公开的那些)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和IDO抑制剂。IDO被认为是一种免疫检查点蛋白其在肿瘤细胞中的表达通过关闭效应T细胞而有助于免疫耐受。IDO被认为有助于抗CLTA-4疗法的抗性。根据本文所述方法使用的IDO抑制剂包括但不限于色氨酸模拟物，如D-1MT(1-甲基-DL-色氨酸(MT)的D异构型)、L-1MT(MT的L异构型)、MTH-Trp(甲基硫代乙内酰脲-dl-色氨酸；IDO的转录抑制剂)和β-咔啉，吲哚模拟物，如基于萘醌的药剂，S-烯丙基-芸苔宁、S-苄基-芸苔宁、5-溴-芸苔宁，以及基于苯基咪唑的药剂，4-苯基咪唑、Exiguamine A、依帕妥司他(epacadostat)、迷迭香酸、去甲哈尔满和NSC401366。优选的IDO抑制剂包括INCB 024360(依帕妥司他；1,2,5-恶二唑-3-羧酰亚胺，4-((2-(氨基磺酰基)氨基)乙基)氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N'-羟基-，(C(Z))-；Incyte)、indoximod(LG2101；D-1MT；NewLinkGenetics)、IDO肽疫苗(哥本哈根大学)和NLG919(NewLink Genetics)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株、PD-1抑制剂(优选特异性结合(和抑制)PD-1的单克隆抗体)和CTLA-4抑制剂(优选特异性结合(和抑制)CTLA-4的单克隆抗体)。人PD-1的完整核苷酸和氨基酸序列可以根据GenBank登录号U64863和NP_005009.2找到。抗PD-1的单克隆抗体包括但不限于兰罗利珠单抗(例如，在美国专利第8,354,509号(通过引用并入本文)中被公开为hPD109A及其人源化衍生物h409All、h409A16和h409A17)、纳武单抗(Bristol-Myers Squib；代码名称BMS-936558，公开于美国专利第8,008,449号(通过引用并入本文))、派姆单抗
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和皮地珠单抗(CT-011；公开于Rosenblatt等人，《免疫疗法(Immunother)》34:409-418(2011))或包含这些抗体的重链和轻链区的抗体。其他抗PD-1抗体描述于例如WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006/121168、WO2008/156712、WO2009/014708、WO2009/114335、WO2013/043569和WO2014/047350。在一个相关的实施方案中，药物组合物的检查点抑制剂为抗PD-1融合蛋白，如AMP-224(由PD-L2的胞外结构域和人IgG1的Fc区组成)。完整的人CTLA-4核酸序列可以根据GenBank登录号LI5006找到。特异性结合CTLA4的单克隆抗体包括但不限于伊匹单抗(
Figure BDA0002291550330000283
BMS)和替西木单抗(AstraZeneca/Medlmmune)以及美国专利申请公开第2005/0201994号、第2002/0039581号和第2002/086014号(其各自的内容通过引用并入本文)公开的抗体和美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号、第6,984,720号、第6,682,736号、第6,207,156号、第5,977,318号、第6,682,736号、第7109,003号、第7,132,281号和第8,491,895号(其各自的内容通过引用并入本文)中公开的抗体，或包含这些抗体中的任何一种的重链和轻链可变区的抗体。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株、PD-L1抑制剂(优选特异性结合(和抑制)PD-L1的单克隆抗体)和CTLA-4抑制剂(优选特异性结合(和抑制)CTLA-4的单克隆抗体)。抗PD-L1的单克隆抗体包括但不限于派姆单抗(MK-3475，公开于WO2009/114335))、BMS-936559(MDX-1105)、阿特珠单抗(Genentech/Roche；MPDL33280A，公开于美国专利第8,217,149号(其内容通过引用并入本文)、度伐单抗(AstraZeneca/Medlmmune；MEDI4736，公开于美国专利第8,779,108号(通过引用并入本文)、MIH1(可通过eBioscience(16.5983.82)获得的Affymetrix)和阿维鲁单抗(MSB0010718C；Merck KGaA)或包含这些抗体中的任何一种的重链和轻链可变区的抗体。在相关的实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗PD-L1融合蛋白，如被称为AMP-224的PD-L2-Fc融合蛋白(公开于Mkritchyan M.等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，189:2338-47(2010)。完整的人CTLA-4核酸序列可以根据GenBank登录号LI 5006找到。特异性结合CTLA4的单克隆抗体包括但不限于伊匹单抗(
Figure BDA0002291550330000293
BMS)和替西木单抗(AstraZeneca/Medlmmune)、以及美国专利申请公开第2005/0201994号、第2002/0039581和第2002/086014号(其各自的内容通过引用并入本文)公开的抗体和美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号、第6,984,720号、第6,682,736号、第6,207,156号、第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号、第7,132,281号和第8,491,895号(其各自的内容通过引用并入本文)中公开的抗体，或包含这些抗体中的任何一种的重链和轻链可变区的抗体。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株、PD-1抑制剂(优选特异性结合(和抑制)PD-1的单克隆抗体)和LAG3抑制剂(如可溶性LAG3(IMP321或LAG3-Ig，公开于美国专利申请公开第2011-0008331号(通过引用并入本文)和Brignon等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》15:6225-6231(2009)中)、IMP701或其他阻断人LAG3的人源化抗体(描述于美国专利申请公开第2010-0233183号(通过引用并入本文)、美国专利第5,773,578号(通过引用并入本文))，或BMS-986016或其他阻断LAG3的完全人类抗体(描述于美国专利申请公开第2011-0150892号(通过引用并入本文))。人PD-1的完整核苷酸和氨基酸序列可以根据GenBank登录号U64863和NP 005009.2找到。抗PD-1的单克隆抗体包括但不限于兰罗利珠单抗(例如，在美国专利第8,354,509号(通过引用并入本文)中被公开为hPD109A及其人源化衍生物h409A1、h409A16和h409A17)、纳武单抗(
Figure BDA0002291550330000291
Bristol-Myers Squibb；代码名称BMS-936558)，公开于美国专利第8,008,449号(通过引用并入本文)，派姆单抗
Figure BDA0002291550330000292
和皮地珠单抗(CT-011；在Rosenblatt等人，《免疫疗法(Immunother)》.34:409-418(2011)中公开)或包含这些抗体的重链和轻链区的抗体。其它抗PD-1抗体描述于例如WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006/121168、WO2008/156712、WO2009/014708、WO2009/114335、WO2013/043569和WO2014/047350。在一个相关的实施方案中，药物组合物的检查点抑制剂为抗PD-1融合蛋白，如AMP-224(由PD-L2的胞外结构域和人IgG1的Fc区组成)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株、PD-L1抑制剂(优选特异性结合(和抑制)PD-L1的单克隆抗体)和LAG3抑制剂(如可溶性LAG3(IMP321或LAG3-Ig，公开于美国专利申请公开第2011-0008331号(通过引用并入本文)和Brignon等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》15:6225-6231(2009))、IΜΡ701或其他阻断人LAG3的人源化抗体(描述于美国专利申请公开第2010-0233183号(通过引用并入本文)、美国专利第5,773,578号(通过引用并入本文))或BMS-986016或其他阻断LAG3的完全人类抗体(描述于美国专利申请公开号2011-0150892(通过引用并入本文))。抗PD-L1的单克隆抗体包括但不限于派姆单抗(MK-3475，公开于WO2009/114335))、BMS-936559(MDX-1105)、阿特珠单抗(Genentech/Roche；MPDL33280A)，公开于美国专利第8,217,149号(其内容通过引用并入本文)，度伐单抗(AstraZeneca/Medlmmune；MEDI4736)，公开于美国专利第8,779,108号(通过引用并入本文)、MIH1(可通过eBioscience(16.5983.82)获得的Affymetrix)和阿维鲁单抗(MSB0010718C；Merck KGaA)或包含这些抗体中的任何一种的重链和轻链可变区的抗体。在相关的实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗PD-L1融合蛋白，如被称为AMP-224的PD-L2-Fc融合蛋白(公开于Mkritchyan M.等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，189:2338-47(2010)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株、PD-1抑制剂(优选特异性结合(和抑制)PD-1的单克隆抗体)和TIM3检查点抑制剂(如美国专利第8,841,418号(通过引用并入本文)中公开的抗体或Jones等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，205(12):2763-79(2008)中公开的抗人TIM3阻断抗体F38-2E2)。人PD-1的完整核苷酸和氨基酸序列可以根据GenBank登录号U64863和NP005009.2找到。抗PD-1的单克隆抗体包括但不限于兰罗利珠单抗(例如，在美国专利第8,354,509号(通过引用并入本文)中被公开为hPD109A及其人源化衍生物h409A1、h409A16和h409A17)、纳武单抗(
Figure BDA0002291550330000301
Bristol-Myers Squibb；代码名称BMS-936558)，公开于美国专利第8,008,449号(通过引用并入本文)、派姆单抗
Figure BDA0002291550330000302
和皮地珠单抗(CT-011；公开于Rosenblatt等人，《免疫疗法(Immunother)》34:409-418(2011))或包含这些抗体的重链和轻链区的抗体。其它抗PD-1抗体描述于例如WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006/121168、WO2008/156712、WO2009/014708、WO2009/114335、WO2013/043569和WO2014/047350。在一个相关的实施方案中，药物组合物的检查点抑制剂为抗PD-1融合蛋白，如AMP-224(由PD-L2的胞外结构域和人IgG1的Fc区组成)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株、PD-L1抑制剂(优选特异性结合(和抑制)PD-L1的单克隆抗体)和TIM3检查点抑制剂(如美国专利第8,841,418号(通过引用并入本文)中公开的抗体或Jones等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，205(12):2763-79(2008)中公开的抗人TIM3阻断抗体F38-2E2)。抗PD-L1的单克隆抗体包括但不限于派姆单抗(MK-3475，公开于WO2009/114335))、BMS-936559(MDX-1105)、阿特珠单抗(Genentech/Roche；MPDL33280A)，公开于美国专利第8,217,149号(其内容通过引用并入本文)、度伐单抗(AstraZeneca/Medlmmune；MEDI4736)，公开于美国专利第8,779,108号(通过引用并入本文)、MIH1(可通过eBioscience(16.5983.82)获得的Affymetrix)和阿维鲁单抗(MSB0010718C；Merck KGaA)或包含这些抗体中的任何一种的重链和轻链可变区的抗体。在一个相关的实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗PD-L1融合蛋白，如被称为AMP-224的PD-L2-Fc融合蛋白(公开于Mkritchyan M.等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，189:2338-47(2010))。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和TIGIT抑制剂。TIGIT检查点抑制剂优选抑制TIGIT与脊髓灰质炎病毒受体(CD155)的相互作用，包括但不限于靶向人TIGIT的抗体(如美国专利第9,499,596号(通过引用并入本文)和美国专利申请公开第20160355589号、第20160176963号中公开的那些抗体)和脊髓灰质炎病毒受体变异体(如在美国专利第9,327,014号(通过引用并入本文)中公开的那些)。
在一些实施方案中，药物组合物包含Western Reserve、Wyeth、Lister或Copenhagen痘苗病毒株和IDO抑制剂(吲哚胺-吡咯2,3-二氧化酶)。IDO抑制剂包括代谢抑制剂，优选抑制代谢途径的抑制剂，包括但不限于Norharmane(参见Chiarugi A等人，“吲哚胺2,3-双加氧酶和一氧化氮合酶的联合抑制作用调节干扰素-γ-活化巨噬细胞释放神经毒素的能力(Combined inhibition of indolamine 2,3-dioxygenase and nitric oxidesynthase modulatesneurotoxin release by interferon-gamma-activatedmacrophages)”，《白细胞生物学杂志(Journal of Leukocyte Biology)》.68(2):260-6.(2000))、迷迭香酸(参见Lee HJ等人，“迷迭香酸抑制小鼠树突状细胞中吲哚胺2,3-二加氧酶的表达(Rosmarinic acid inhibits indoleamine 2,3-dioxygenase expression inmurine dendritic cells)”，《生化药理学(Biochemical Pharmacology)》.73(9):1412-21(2007))、COX-2抑制剂(参见Cesario A等人，“吲哚胺2,3-二加氧酶1(IDOl)和环氧合酶(COX)-2在慢性炎症和癌症中的相互作用(The interplay between indoleamine 2,3-dioxygenase 1(IDOl)and cyclooxygenase(COX)-2in chronic inflammation andcancer)”，《现代药物化学(Current Medicinal Chemistry)》.18(15):2263-71(2011))、1-甲基色氨酸(Hou DY等人，“1-甲基色氨酸的立体异构体抑制树突状细胞中吲哚胺2,3-二加氧酶与抗肿瘤反应有关(Inhibition of indoleamine 2,3-di oxygenase in dendriticcells by stereoisomers of 1-methyl-tryptophan correlates with antitumorresponses)”.《癌症研究(Cancer Research)》.67(2):792-801(2007)和Chauhan N等人，(2009年4月)。“对血红素二氧化酶中的反应机理的重新评估(Reassessment of thereaction mechanism in the heme dioxygenases)”.《美国化学学会杂志(Journal ofthe American Chemical Society)》.131(12):4186-7(2009)，包括例如特定的消旋体1-甲基-D-色氨酸(被称为indoximod)(临床试验候选药物)、依帕妥司他(INCB24360)、navoximod(GDC-0919)(参见Jochems C等人，“IDO1选择性抑制剂依帕妥司他增强树突状细胞的免疫原性和肿瘤抗原特异性T细胞的溶解能力(The IDO1selective inhibitorepacadostat enhances dendritic cell immunogenicity and lytic ability of tumorantigen-specific T cells)”，《肿瘤靶标(Oncotarget)》.7(25):37762-37772.(2016))和或BMS-986205。在一些实施方案中，IDO抑制剂选自由以下项组成的群组：去甲哈尔满、迷迭香酸、COX-2抑制剂、1-甲基色氨酸、Indoximod、依帕妥司他(INCB24360)、navoximod(GDC-0919)和/或BMS-986205。
本领域技术人员将知晓，对于上述某些抗体可以使用替代和/或等同的名称。这样的替代和/或等同的名称在本发明的上下文中是可互换的。
在一些方面，本文所述的药物组合物包括(i)多于一种的免疫检查点抑制剂和(ii)复制性溶瘤痘苗病毒。在优选的实施方案中，PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂与痘苗病毒同时施用。其它实例包括但不限于与痘苗病毒同时施用LAG3抑制剂和PD-1抑制剂，或同时施用LAG3抑制剂和PD-L1抑制剂。其它实例包括同时施用IDO抑制剂和CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂。在一些实施方案中，IDO抑制剂选自由以下项组成的群组：去甲哈尔满、迷迭香酸、COX-2抑制剂、1-甲基色氨酸、Indoximod、依帕妥司他(INCB24360)、Navoximod(GDC-0919)和/或BMS-986205。
Ⅳ.细胞因子
在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒包含编码细胞因子的异源序列，其中该细胞因子由病毒表达。
在一些实施方案中，提供了一种复制性溶瘤痘苗病毒，其被工程改造以表达细胞因子，该细胞因子选自由以下项组成的群组：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、白介素-21(IL-21)、白介素-24(IL-24)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。在特别优选的实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Wyeth、Western Reserve、Copenhagen或Lister株。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达GM-CSF。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-2(IL-2)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-4(IL-4)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-5(IL-5)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-7(IL-7)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-12(IL-12)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-15(IL-15)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-18(IL-18)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-21(IL-21)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达白介素-24(IL-24)、干扰素-γ(IFN-γ)。在一些实施方案中，工程改造复制性溶瘤痘苗病毒以表达肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为mJX594，其被工程改造以表达GM-CSF。
V.肿瘤抗原
在几个实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒包含编码肿瘤抗原和任选细胞因子的异源核酸序列，其中该肿瘤抗原和任选细胞因子在感染病毒的细胞(优选肿瘤细胞)中表达。肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。具有复制能力的溶瘤痘苗病毒可以表达全长肿瘤抗原或其免疫原性肽。在一些实施方案中，细胞因子在用复制性溶瘤痘苗病毒感染的细胞中表达。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒包含编码肿瘤抗原和细胞因子的异源核酸序列，其中肿瘤抗原和细胞因子在感染复制性溶瘤痘苗病毒的细胞中表达。在一些实施方案中，该细胞为肿瘤细胞。
在一些实施方案中，肿瘤抗原可以包括但不限于MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙酰氨基葡糖转移酶-V、p-15、gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、TRP-2、酪氨酸酶、细胞周期蛋白依赖性激酶4、β-连环蛋白、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人乳头瘤病毒-E6、人乳头瘤病毒E7、CD20、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体、MUC-1、半胱天冬酶-8、CD5、粘蛋白-1、Lewisx、CA-125、p185HER2、IL-2R、Fap-a、腱生蛋白、与金属蛋白酶相关的抗原、CAMPATH-1、RCC：G蛋白信号传导调节剂5(RGS5)、Surivin(BIRC5＝含重复凋亡结构杆状病毒抑制剂5)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGF-BP3)、胸苷酸合成酶(TYMS)、低氧诱导蛋白2、低氧诱导脂滴相关蛋白(HIG2)、基质金属肽酶7(MMP7)、prune同源蛋白2(PRUNE2)，RecQ蛋白样(DNA解旋酶Q1样蛋白)(RecQ1)、瘦素受体(LEPR)、ERBB受体反馈抑制剂1(ERRFII)、溶酶体蛋白跨膜蛋白4α(LAPTM4A)、RABIB、RAS癌基因家族(RABIB)、cd24、智人胸腺素β4、X-linked(TMSB4X)蛋白、智人S100钙结合蛋白A6(S100A6)、智人腺苷A2受体(ADORA2B)、16号染色体开放阅读框61抗体(C16orf61)、ROD1分化调节剂1(ROD1)、NAD依赖性脱乙酰基酶去乙酰化酶sirtuin-2(SIR2L)、微管蛋白α1c(TUBA1C)、ATP酶抑制因子1(ATPIF1)、基质抗原2(STAG2)以及核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性底物1(NUCKS1)。在一些实施方案中，该抗原为美国专利第9,919,047号(通过引用并入本文)中列出的抗原)。在一些实施方案中，肿瘤抗原为肾细胞癌肿瘤抗原。在一些实施方案中，该肾细胞癌肿瘤抗原选自由以下项组成的群组：G-蛋白信号转导调节剂5(RGS5)、Surivin(BIRC5＝含重复凋亡结构杆状病毒抑制剂5)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGF-BP3)、胸苷酸合成酶(TYMS)、低氧诱导蛋白2、低氧诱导脂滴相关蛋白(HIG2)、基质金属肽酶7(MMP7)、prune同源蛋白2(PRUNE2)、RecQ蛋白样(DNA解旋酶Q1样蛋白)(RECQL)、瘦素受体(LEPR)、ERBB受体反馈抑制剂1(ERRFII)、溶酶体蛋白跨膜蛋白4α(LAPTM4A)、RABIB、RAS癌基因家族(RAB1B)、CD24、智人胸腺素β4、X-linked(TMSB4X)蛋白、智人S100钙结合蛋白A6(S100A6)、智人腺苷A2受体(ADORA2B)、16号染色体开放阅读框61抗体(C16orf61)、ROD1分化调节剂1(ROD1)、NAD依赖性脱乙酰基酶去乙酰化酶sirtuin-2(SIR2L)、微管蛋白α1c(TUBA1C)、ATP酶抑制因子1(ATPIF1)、基质抗原2(STAG2)以及核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性底物1(NUCKS1)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原包括但不限于KS1/4泛癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸磷酸盐(prostaticacid phosphate)、前列腺特异性抗原、黑素瘤相关抗原p97、黑素瘤抗原gp75、高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特异性膜抗原、CEA、多态上皮粘蛋白抗原、乳脂小球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原(如：CEA、TAG-72、C017-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA)、Burkitt's淋巴瘤抗原-38.13、CD19、B-淋巴瘤抗原-CD20、CD33、黑素瘤特异性抗原(如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂GM3)、肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)(如病毒诱导的肿瘤抗原，包括T抗原DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原)、癌胚抗原-甲胎蛋白(如结肠的CEA)、膀胱肿瘤癌胚抗原、分化抗原(如人肺癌抗原L6和L20)、纤维肉瘤抗原、白血病T细胞抗原-Gp37、拟糖蛋白、鞘脂、乳腺癌抗原(如EGFR(表皮生长因子受体))、HER2抗原(p185HER2)和HER2 neu表位)、多态性上皮粘蛋白(PEM)、恶性人淋巴细胞抗原-APO-1、分化抗原(如在胎儿红细胞、原代内胚层中发现的I抗原，在成年红细胞、植入前胚胎中发现的I抗原，在胃腺癌中发现的I(Ma)，在乳腺上皮中发现的M18、M39，在髓样细胞中发现的SSEA-1，在结直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22，TRA-1-85(血型H)，在结肠腺癌中发现的C14，在肺腺癌中发现的F3，在胃癌中发现的AH6，Y半抗原，在胚胎癌细胞中发现的Ley，TL5(血型A)，在A431细胞中发现的EGF受体，在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)，在胚胎癌细胞中发现的FC10.2，胃腺癌抗原，在腺癌中发现的CO-514(血型Lea)，在腺癌中发现的NS-10，CO-43(血型Leb)，在A431细胞的EGF受体中发现的G49，在结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)，在结肠癌、胃癌黏蛋白中发现的19.9，在髓样细胞中发现的T5A7，在黑色素瘤中发现的R24，4.2，GD3，D1.1，OFA-1，GM2，OFA-2，GD2，以及在胚胎癌细胞中发现的Ml:22:25:8，和在4至8个细胞阶段的胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4)、来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽、C-反应蛋白(CRP)、癌抗原-50(CA-50)、与乳腺癌相关的癌抗原15-3(CA15-3)、与胃肠癌相关的癌抗原-19(CA-19)和癌抗原-242、瘤相关抗原(CAA)、嗜铬粒蛋白A、上皮粘蛋白抗原(MC5)、人上皮特异性抗原(E1A)、Lewis(a)抗原、黑素瘤抗原、黑素瘤相关抗原100、25和150、粘蛋白样瘤相关抗原、多药耐药相关蛋白(MRPm6)、多药耐药相关蛋白(MRP41)、Neu癌基因蛋白(C-erbB-2)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、P-糖蛋白(mdr1基因产物)、多药耐药相关抗原、p170、多药耐药相关抗原、前列腺特异性抗原(PSA)、CD56和NCAM。
在一些实施方案中，其它肿瘤抗原包括但不限于AIM2(黑素瘤2中不存在)、BMI1(BMI1 polycomb无名指致癌基因)、COX-2(环氧合酶-2)、EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)、EZH2(Zeste同源物2的增强子)、LICAM(人L1细胞粘附分子)、Livin、Livinβ、MRP-3(多药耐药蛋白3)、巢蛋白、OLIG2(少突胶质细胞转录因子)、SOX2(SRY相关HMG-box2)、ART1(被T细胞1识别的抗原)、ART4(被T细胞4识别的抗原)、SART1(被T细胞1识别的鳞状细胞癌抗原)、SART2、SART3、B细胞周期蛋白、Glil(神经胶质瘤相关的癌基因同源物1)、Cav-1(微囊蛋白(caveolin)-1)、组织蛋白酶B、CD74(分化簇74)、E-钙粘蛋白(上皮钙依赖性粘附)、EphA2/Eck(EPH受体A2/上皮激酶)、Fra-1/Fosl 1(Fos相关抗原1)、Ki67(抗体Ki67的核增殖相关抗原)、Ku70/80(人Ku异二聚体蛋白亚基)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚基α-2)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌1)、PROX1(Breasto Homebox蛋白1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、SOX10(SRY-相关HMG-box10)、SOX11、Survivin、UPAR(尿激酶型纤溶酶原激活物受体)和WT-1(Wilms肿瘤蛋白1)。
VI.治疗方案和药物制剂
药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂被同时施用，其中溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内施用递送。同时施用可以例如以包含这些药剂的一种固定组合的形式进行，或者通过以独立制剂的形式同时施用每种药剂来进行。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒和PD-1或PD-L1免疫检查点抑制剂被同时施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒和CTLA-4免疫检查点抑制剂被同时施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒和TIGIT免疫检查点抑制剂被同时施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒、PD-1或PD-L1免疫检查点抑制剂和CTLA-4免疫检查点抑制剂被同时施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒、PD-1或PD-L1免疫检查点抑制剂和TIGIT免疫检查点抑制剂被同时施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内、静脉内、动脉内和/或腹膜内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过静脉内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过腹膜内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过动脉内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒仅通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤牛痘病毒包含编码肿瘤抗原和任选地细胞因子的异源核酸序列，其中该肿瘤抗原和任选地细胞因子在被病毒感染的细胞(优选肿瘤细胞)中表达。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗人的肿瘤的方法，其包含向该人同时施用一种组合物，该组合物包含(a)复制性溶瘤痘苗病毒和(b)免疫检查点蛋白的抑制剂。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为CTLA-4。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为PD-L1。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为LAG3。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为TIGIT。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为PD-1。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为TIM3。在该治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为实体癌。在该治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为结肠直肠癌。在该治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为肾细胞癌。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内、IV和/或腹膜内施用来施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过IV施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过腹膜内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过动脉内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒仅通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤牛痘病毒包含编码肿瘤抗原和任选地细胞因子的异源核酸序列，其中该肿瘤抗原和任选地细胞因子在被病毒感染的细胞(优选肿瘤细胞)中表达。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗人的肿瘤的方法，其包含向该人同时施用一种组合物，该组合物包含(a)复制性溶瘤痘苗病毒、(b)PD-1和/或PD-L1的抑制剂和(c)免疫检查点蛋白的抑制剂。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白选自CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为CTLA-4。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为LAG3。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为TIGIT。在该治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点蛋白为TIM3。在该治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为实体癌。在该治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为结肠直肠癌。在该治疗方法的一些实施方案中，肿瘤为肾细胞癌。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内、IV和/或腹膜内施用来施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过IV施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过腹膜内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒仅通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的，检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤牛痘病毒包含编码肿瘤抗原和任选地细胞因子的异源核酸序列，其中该肿瘤抗原和任选地细胞因子在被病毒感染的细胞(优选肿瘤细胞)中表达。
在治疗方法的一些实施方案中，在施用复制性溶瘤痘苗病毒之前，肿瘤不表达免疫检查点蛋白或以相对较低的水平表达免疫检查点蛋白。在一些实施方案中，高水平由等于或大于50％的肿瘤比例分数表示。在一些实施方案中，高水平由大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、约99％或约100％的肿瘤比例分数表示。在一些实施方案中，先前治疗的肿瘤的高水平由大于1％的肿瘤比例分数表示。在一些实施方案中，高水平由表达PD-L1的肿瘤细胞等于或大于50％表示(例如，超过50％的肿瘤细胞表达PD-L1)。在一些实施方案中，高水平由表达PD-L1的肿瘤细胞高于60％、高于70％、高于80％、高于90％、高于95％、约为99％或约为100％表示。在一些实施方案中，先前治疗的肿瘤的高水平由表达PD-L1的肿瘤细胞大于1％表示(例如，超过1％的肿瘤细胞表达PD-L1)。在一些实施方案中，可以采用任何PD-L1诊断测试来测量PD-L1表达。在一些实施方案中，当测量PD-L1检查点时，采用PD-L1 DaKo Companion诊断测试来测量PD-L1水平。
在治疗方法的一些实施方案中，该方法包含在施用组合物之前测量肿瘤中检查点蛋白的表达水平的步骤。
考虑到治疗的毒性(如果有的话)，溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂的施用将遵循一般方案进行每种特定疗法的施用。预期将根据需要重复治疗周期。还可以预期，除了本发明的联合疗法之外，还可以应用各种标准疗法以及手术治疗。
治疗方案可能会有所不同，并且通常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进展以及患者的健康和年龄。某些类型的肿瘤将需要更积极的治疗，而同时，某些患者不能耐受更繁重的治疗方案。
在某些实施方案中，所治疗的肿瘤可能至少在最初不可切除。使用本发明的联合疗法的治疗可以增加肿瘤的可切除性，这是由于在边缘处收缩或通过消除某些特别侵入性的部分。治疗后，切除是可能的。切除后的其它治疗将用来消除肿瘤部位的微小残留疾病。
确定一种或多种组分之间的协同相互作用，可以通过向需要治疗的患者施用不同w/w比范围和剂量的组分，最终确定效果的最佳范围和对于效果每种成分的绝对剂量范围。对于人类而言，对患者进行临床研究的复杂性和成本使得使用这种形式的测试作为协同作用的主要模型变得不切实际。然而，在一种物种中观察到的协同作用可以预测在其它物种中的作用，并且如本文所述，存在动物模型以测量协同作用，并且这些研究的结果还可用于通过应用药代动力学/药效学方法预测有效剂量和血浆浓度比率范围以及其他物种所需的绝对剂量和血浆浓度。在肿瘤模型和人中观察到的效果之间建立的相关性表明，动物中的协同作用可例如在人异种移植肿瘤模型中得到证实。
在一些实施方案中，该组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的癌症。在一些实施方案中，癌症包括但不限于脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、肺癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、肾癌、睾丸癌、直肠癌、乳腺癌和胰腺癌。在一些实施方案中，癌症选自由以下项组成的群组：脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、肺癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、肾癌、睾丸癌、直肠癌、乳腺癌和胰腺癌。在优选的实施方案中，该组合物用于治疗和/或预防转移。在其它优选的实施方案中，该组合物用于治疗癌症，包括但不限于肝细胞癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胃癌、食道癌、肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、子宫颈癌和肝癌。在一些实施方案中，该组合物用于治疗选自由以下项组成的群组的癌症：肝细胞癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胃癌、食道癌、肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、子宫颈癌和肝癌。在一些实施方案中，该组合物用于治疗结肠直肠癌，特别是转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，待治疗的哺乳动物为人。在另一个优选的方面，该组合物用于治疗对一种或多种免疫检查点抑制剂有抗性的癌症(例如，该癌症对使用PD-1、CTLA-4、LAG3和/或TIGIT抑制剂的免疫治疗有抗性)。在一些实施方案中，癌症为实体癌或实体肿瘤。
该方法包括同时施用治疗有效量的复制性溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂。溶瘤病毒的治疗有效量定义为足以诱导溶瘤-癌细胞的破坏或溶解的量。优选地，溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂以协同有效量施用。该术语包括减缓、抑制或减少肿瘤的生长或大小，并且在某些情况下包括根除肿瘤。在一些实施方案中，有效量的溶瘤痘苗病毒使治疗性病毒全身传播至肿瘤，例如感染未注射的肿瘤。在一些实施方案中，溶瘤痘苗病毒的有效量是足以诱导溶瘤-癌细胞的破坏或溶解的量。
在一些实施方案中，癌症治疗和/或预防表示治疗后肿瘤大小和/或存在减少(reduction)和/或下降(decrease)至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，癌症治疗和/或预防表明治疗后肿瘤完全消退。在一些实施方案中，癌症治疗和/或预防表明治疗后肿瘤完全缓解。在一些实施方案中，癌症对免疫检查点抑制剂疗法是难治性的或有抗性的。在一些实施方案中，癌症对使用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体的治疗是难治性的或有抗性的。在一些实施方案中，癌症对使用抗PD-1抗体的治疗具有抗性。在一些实施方案中，癌症对使用抗CTLA-4抗体的治疗具有抗性。在一些实施方案中，治疗包含施用复制性溶瘤痘苗病毒。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIGIT和/或TIM3的抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒、PD-1或PD-L1抑制剂和免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒、PD-1或PD-L1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为CTLA-4抑制剂、LAG3抑制剂、TIGIT抑制剂或TIM3抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒，PD-1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制型溶瘤痘苗病毒，PD-L1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒、PD-1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为LAG3抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒、PD-L1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为LAG3抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒、PD-1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为TIGIT抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒、PD-L1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为TIGIT抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒、PD-1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为TIM3抑制剂。在一些实施方案中，治疗包括施用复制性溶瘤痘苗病毒、PD-L1抑制剂和免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂为TIM3抑制剂。
在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内、IV和/或腹膜内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过IV施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过腹膜内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒通过动脉内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒仅通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒仅通过肿瘤内施用。
本文公开的检查点抑制剂可以通过各种途径施用，包括例如口服或非肠道施用，如静脉内、肌内、皮下、眶内、囊内、腹膜内、直肠内、脑池内、肿瘤内、血管内、皮内施用或分别使用例如皮肤贴剂或经皮离子电渗疗法通过皮肤被动吸收或促进吸收。在一些实施方案中，检查点抑制剂是全身施用的。检查点抑制剂还可以施用于病理状况的部位，例如静脉内或动脉内施用于供应肿瘤的血管中。在一些实施方案中，检查点抑制剂为PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIGIT和/或TIM3的抑制剂。
在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是肿瘤内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是静脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是腹膜内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。在一些实施方案中，复制性溶瘤病毒是动脉内施用的，而检查点抑制剂是全身施用的。
在实施本发明的方法中要施用的药剂的总量可以作为单一剂量施用给受试者，或者以大剂量或通过输注的方式在相对较短的时间段内施用给受试者，或者可以使用分级治疗方案施用，其中在延长的时间段内施用多个剂量。本领域技术人员会知晓，用于治疗受试者病理状况的组合物的量取决于多种因素，包括受试者的年龄和总体健康状况以及施用途径和待施用的治疗次数。考虑到这些因素，本领域技术人员将根据需要调节具体剂量。通常，最初使用I期和II期临床试验确定组合物的制剂以及施用途径和频率。
在某些实施方案中，检查点抑制剂以0.01-0.05mg/kg、0.05-0.1mg/kg、0.1-0.2mg/kg、0.2-0.3mg/kg、0.3-0.5mg/kg、0.5-0.7mg/kg、0.7-1mg/kg、1-2mg/kg、2-3mg/kg、3-4mg/kg、4-5mg/kg、5-6mg/kg、6-7mg/kg、7-8mg/kg、8-9mg/kg、9-10mg/kg、至少10mg/kg、或其任何组合的剂量施用。检查点抑制剂的合适剂量范围为约0.5mg/kg至25mg/kg，优选约1mg/kg至约20mg/kg，更优选约2mg/kg至约15mg/kg。在某些实施方案中，检查点抑制剂每周至少一次、每周至少两次、每周至少三次、每两周至少一次、或每月至少一次或数月至少一次施用。在某些实施方案中，检查点抑制剂以单剂量、两剂、三剂、四剂、五剂或6剂或更多剂的形式施用。优选地，检查点抑制剂通过静脉内施用(例如通过静脉内输注或注射)或肿瘤内施用。作为非限制性实例，优选以每三周3mg/kg的剂量静脉内输注施用伊匹单抗，总共四个剂量。在一些实施方案中，检查点抑制剂为PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIGIT和/或TIM3的抑制剂。
A.其他抗癌治疗
可以将一种或多种其他化疗剂与本发明的组合物一起施用，包括但不限于5-氟尿嘧啶(FU)、叶酸(FA)(或甲酰四氢叶酸)、甲氨蝶呤、卡培他滨(Xeloda；5-FU的口服前药)、奥沙利铂(Eloxatin)、贝伐单抗(Avastin)、西妥昔单抗(Erbitux)和帕尼单抗(Vectibix)，为任意组合形式。这些药剂可以根据已知的治疗方案来施用。通常，除了卡培他滨是口服制剂外，其他的化疗剂是静脉内施用的。
在其它方面，本发明的方法还包含施用其他癌症疗法，如放疗、激素疗法、手术及其组合。
放疗包括但不限于γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也考虑其他形式的DNA破坏因素，如微波和UV辐射。所有这些因素最有可能对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围从每天50到200伦琴，持续时间延长(3到4wk)到单次剂量2000到6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
大约60％的癌症患者将接受某些类型的手术，包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性手术。根治性手术是可以与其他疗法(如本发明的疗法、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法和/或替代疗法)结合使用的癌症疗法。
根治性手术包括切除，其中全部或部分癌组织被物理去除、切除和/或破坏。肿瘤切除是指物理切除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除之外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(莫氏手术)。还预期本发明可与浅表癌、癌前病变或偶然量的正常组织的去除结合使用。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤时，体内可能会形成空腔。可以通过对该区域进行灌注、直接注射或局部应用其他抗癌疗法来完成治疗。可以例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4、5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这种治疗。这些治疗也可以具有不同的剂量。
与当前方法结合使用的另一种治疗形式包括热疗，这是将患者组织暴露于高温(高达106°F)的过程。外部或内部加热装置可涉及局部、区域性或全身热疗的应用。局部热疗涉及对小区域(如肿瘤)施加热。可以利用来自体外的装置的，瞄准肿瘤的高频波在外部产生热量。内部加热可涉及无菌探针，其包括细的加热丝或填充有温水的中空管、植入的微波天线或射频电极。
患者的器官或肢体被加热用于区域性治疗，这通过使用产生高能量的装置(如磁体)来实现。或者，在灌注到将被内部加热的区域中之前，一些患者的血液可以被取出并加热。如果癌症扩散至全身，也可以进行全身加热。温水毯、热蜡、感应线圈和热室可用于此目的。
激素疗法也可与本发明联合使用或与前述任何其他癌症疗法联合使用。激素的使用可用于治疗某些癌症，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌，以降低某些激素(如睾丸激素或雌激素)的水平或阻断其作用。
B.组合物和制剂
施用药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒以治疗癌症和/或直接向肿瘤细胞施用，因此，本文公开的药物组合物被配制用于期望的施用途径(例如通过肿瘤内注射、静脉内、动脉内和/或腹膜内施用)。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒被配制用于通过肿瘤内、静脉内、动脉内和/或腹膜内施用途径施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒被配制以用于通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒被配制以用于通过静脉内施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒被配制以用于通过动脉内施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒被配制以用于通过腹膜内施用。在一些实施方案中，药物组合物的复制性溶瘤痘苗病毒被配制以用于仅通过肿瘤内施用。
溶瘤痘苗病毒的肿瘤内注射可通过注射器或用于注射溶液的任何其它方法进行，只要表达构建体可以通过注射所需的特定针头规格即可。最近已经描述了一种新颖的无针注射系统(美国专利5,846,233，其通过引用并入本文)，该系统具有限定用于容纳溶液的安瓿室的喷嘴和用于将溶液从喷嘴推出到递送位置的能量装置。还描述了在基因治疗中使用的注射器系统，其允许精确地在任何深度多次注射预定量的溶液(美国专利5,846,225，其通过引用并入本文)。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在水中适当地与表面活性剂(如羟丙基纤维素)混合而制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利5,466,468，通过引用并入本文)。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是流动性的，以达到易于注射的程度。其在生产和储存条件下必须是稳定的，并且其保藏必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染。载体可以为溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可以延长对可注射组合物的吸收。
例如，对于水溶液中的肿瘤内注射，如果需要，可以适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。就此而言，根据本公开内容，本领域技术人员将知晓可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一剂溶解在1ml等渗NaCl溶液中，或者加入1000ml皮下注射液中或在所建议的输注部位注射(参见例如《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第15版，1035-1038和1570-1580页)。取决于治疗对象的状况，必然会发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责给药的人员均应确定适合个体受试者的剂量。此外，对于人类给药，制剂应符合美国食品及药物管理局生物学办公室(FDAOffice of Biologies)标准所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
根据需要，通过将所需量的活性化合物与上述列举的各种其他成分掺入到合适的溶剂中来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的所需其他成分。至于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
本文公开的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并与无机酸(如，例如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸)等形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，如，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效量施用。制剂易于以各种剂型(如可注射溶液、药物释放胶囊等)施用。
如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物。补充的活性成分也可以掺入到组合物中。
短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于人时不产生变态反应或类似不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备是本领域所熟知的。通常，这样的组合物被制备成可注射的，或液体溶液或悬浮液；也可以制备适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
实施例
给出以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式，而不是以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易理解，本发明很好地适于实现所述目的并获得所述目标和优点，以及本文固有的那些目的(object)、目标(end)和优点。本发明的实施例以及本文所述的方法目前是优选实施方案的代表，是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员可以想到包含在由权利要求书的范围限定的，本发明的精神内的，其中的变化和其它用途。
实施例1
评价了使用溶瘤痘苗病毒和检查点抑制剂的联合治疗退化转移性肾细胞癌(Renca)同基因小鼠模型中的肿瘤的能力。该肿瘤的生长模式准确地模拟了成人肾细胞癌的生长模式，特别是在自发转移至肺和肝方面。该RenCa模型为多血管性，对抗PD-1免疫疗法有抗性，并且具有免疫反应性。由于感染与来源组织无关，所以该Renca模型与所有癌症有关。
材料和方法
小鼠和细胞系-将无特定病原体的BALB/c雄性小鼠圈养在装有滤水器的笼子中，水和食物按昼夜周期相反的12小时提供。在处死所有小鼠前，对其通过肌内注射麻醉剂的组合物(80mg/kg氯胺酮和12mg/kg甲苯噻嗪)麻醉。Renca肾癌细胞系和CT26结肠癌细胞系获自ATCC，并在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素抗生素的RPMI-1640培养基中在37℃和5％CO2下培养。
病毒扩增-
mJX594为经工程改造含有破坏病毒胸苷激酶基因并在合成的早期晚期启动子控制下插入鼠GMCSF-GFP(mGMSCF-GFP)的Western Reserve痘苗病毒。用感染复数(moi)＝1-3的mJX594感染100％融合水平的HeLaS3细胞，并将其置于37℃的CO2培养箱中1.5小时，然后使用含2.5％FBS的DMEM孵育48至72小时。离心收集细胞，弃去上清液。将细胞重悬于pH9.0的10mM Tris-Cl中，在Dounce匀浆器中匀浆并离心。将细胞沉淀重悬于pH9.0的10mM Tris-Cl中，离心，并将上清液与第一上清液合并。将上清液与第一上清液合并。将经超声处理的裂解物置于36％蔗糖上，并在4℃下以32900x g离心80分钟。然后将沉淀重悬于pH9.0的10mM Tris-Cl中，低于-60℃储存。
ICI抑制剂(本文也称为免疫检查点抑制剂)-
抗CTLA-4和PD-1的抗体购自BioxCell。9D9单克隆抗体与小鼠CTLA-4反应。同种型：小鼠IgG2b。J43单克隆抗体与小鼠PD-1反应。同种型：Armenian仓鼠IgG。
肿瘤模型和治疗方案-
为了产生临床相关的肾肿瘤模型，将Renca肿瘤细胞(肾癌，同基因的)(100μ1中有5×105个细胞)的悬浮液皮下注射到8至10周龄的免疫感受态Balb/c雄性小鼠的右背侧。当平均肿瘤体积超过50mm3时，将小鼠随机排列并接受下述治疗方案。
在所有组中每3天用数字卡尺测量肿瘤大小。根据公式0.5×A×B2计算肿瘤体积，其中A为肿瘤的最大直径，B是其垂直直径。在指示的天数后，通过CO2处死小鼠并收集组织用于进一步分析。
组织学分析-
对于免疫荧光研究，将样本固定在1％PFA中，在20％蔗糖溶液中脱水过夜，并包埋在组织冷冻培养基(Leica)中。将冷冻块切成50μm的切片。用PBST中的5％山羊(或驴)血清(PBS中的0.03％Triton X-100)封闭样本，然后在室温(RT)下与下列初级抗体温育3小时：抗GFP(兔，Millipore)、抗CD31(仓鼠，克隆2H8，Millipore)、抗VEGFR2(兔，细胞信号传导)、抗CD8a(大鼠，BD PharMingen)、抗CD11b(大鼠，BD PharMingen)、抗FoxP3(大鼠，eBioscience)、抗半胱天冬酶3(兔，R&D系统)、抗牛痘(兔，Abcam)和抗PD-L1(大鼠，eBioscience)。洗涤数次后，将样本与下列次级抗体在室温下温育2小时：FITC、Cy3或Cy5缀合的抗仓鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)、FITC或Cy3缀合的抗兔IgG(JacksonImmunoResearch)、Cy3缀合的抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)或Cy3缀合的抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Invitrogen)染色。然后用荧光安装培养基(DAKO)安装样本，使用Zeiss LSM880共焦显微镜(Carl Zeiss)获得免疫荧光图像。
形态测定分析-
使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij)进行血管、CD8 T细胞或凋亡区域的密度测量。在肿瘤周围和肿瘤内区域中，测量每随机0.42mm2区域的CD31、CD8或半胱天冬酶3+面积。每只小鼠至少进行五个不同视野的所有测量。
流式细胞术-
将收集的肿瘤组织切碎并在含有胶原酶D(Roche)和DNase I(Roche)的FACS缓冲液(PBS中的1％FBS)中于37℃在振荡水浴中温育1-2小时。消化的细胞用40μm尼龙网过滤以除去细胞团块。通过在RT下在ACK裂解缓冲液中温育细胞悬浮液5分钟来除去RBC。将所得单细胞与下列抗体在FACS缓冲液中温育30分钟：PerCP-cy5.5缀合的抗小鼠CD45(大鼠，eBioscience)、APC缀合的抗小鼠CD3e(仓鼠，eBioscience)、FITC缀合的抗小鼠CD4(大鼠，eBioscience)、PE缀合的抗CD8a(大鼠，eBioscience)、FITC缀合的抗小鼠CD11b(大鼠，eBioscience)、APC缀合的抗小鼠Gr1(大鼠，eBioscience)和APC缀合的抗小鼠CD11c(仓鼠，eBioscience)。
统计分析-
将数值表示为平均值±标准偏差。平均值之间的统计学差异通过不成对Studentt-检验或单向方差分析，接着通过Student-Newman-Keuls检验确定。统计学显著性设定为p<0.05。
结果
痘苗病毒+抗PD-1联合治疗的抗肿瘤作用
对于使用抗PD-1和mJX-594的联合治疗，将5×105个Renca肿瘤细胞注射到BALB/c小鼠的右背侧腹，并且当肿瘤大小达到50-100mm3时，开始治疗(第0天)。将小鼠随机分为4个治疗组：(i)对照组：每三天肿瘤内注射PBS；(ii)mJX-594单药治疗组：在第0、2和4天，每2天肿瘤内注射1×107pfu的mJX-594，共注射3次；(iii)抗PD-1单药治疗组：第0、3、6、9天，每3天腹膜内注射10mg/kg抗体，共4次；(iv)mJX-594+抗PD-1联合组：mJX-594和抗PD-1同时施用，其中mJX-594在第0、2和4天每两天肿瘤内注射，共注射三次，而抗PD-1在第0、2、4、6和9天腹膜内注射，共注射五次(参见图1A)。
与对照相比，在mJX-594单药治疗组和mJX-594/抗PD-1联合组(“联合组”)中观察到肿瘤生长抑制(参见图2A)。联合组中肿瘤生长的抑制更显著(参见图2A，将“PD1+mJX594”与“mJX594”和“PD1”进行对比)。在抗PD-1单药治疗组中未观察到肿瘤生长抑制(图2A，对比“PD1”与“对照”)。在mJX-594单药治疗组中显示降低了肿瘤重量(参见图2B)。在联合组中观察到肿瘤重量的显著降低，其充分大于在mJX-594单药治疗组中观察到的降低(参见图2B)。因此，与任一单药疗法相比，同时施用mJX-594和抗PD-1使肿瘤重量和体积显著降低。
在PD-1单药治疗组、mJX-594单药治疗组和同时联合治疗组中，肿瘤周围和肿瘤内区域的CD8 T细胞浸润均增加。(参见图3A)。在抗PD-1单药治疗组中，CD8 T细胞浸润在外周区域而不是在中心区域增加，而mJX-594组在中心和外周区域均显示较高的CD8 T细胞浸润数目。(参见图3B)。与对照和单独用任一药剂进行单药治疗相比，通过肿瘤周围和肿瘤内CD8+染色测量，同时施用的mJX-594和抗PD-1抗体显著增加了肿瘤内T细胞浸润(参见图3B)。与对照相比，观察到治疗组的血管密度也降低了(参见图3B)。
在抗PD-1单药治疗组、mJX-594单药治疗组和同时联合治疗组中，外周和中心的肿瘤区域的PD-L1表达水平均高于对照组。(参见图4A)。尽管抗PD-1单药治疗组在外周区域而不是中心区域显示PD-L1表达水平升高，mJX-594单药治疗组在外周和中心区域均显示相似的PD-L1表达水平升高(参见图4A)。与单独使用任何一种药剂的单药治疗相比，同时施用JX-595和抗PD-1抗体使肿瘤内PD-L1表达增加(参见图4A)。Renca肿瘤对抗PD1免疫治疗有抗性。肿瘤PD-L1表达在同时联合治疗组中的增加反映了这些肿瘤对伴随CD8+T细胞浸润至肿瘤的抗PD-1治疗的敏感性，并且是治疗功效的指标。这些模式表明，在基线时，T细胞被免疫抑制并且不能渗透肿瘤微环境。mJX-594引起炎症和血管舒张，使T细胞发挥抗肿瘤作用。同时施用mJX-594和抗PD-1抗体使T细胞活化并浸润至中心肿瘤区域。
通过半胱天冬酶3染色测定，与对照相比，在PD-1单药治疗组、mJX-594单药治疗组和同时联合组中均观察到肿瘤内细胞凋亡增加(参见图4B)。与任一单药治疗组相比，在同时联合组中证实肿瘤内细胞凋亡显著增加(参见图4B)。同时联合组中的抗血管作用(图3B所示)与细胞凋亡的组合表明同时联合组中显著的肿瘤坏死。
通过CD4和CD11b测定，与对照和使用任一药剂的单药治疗相比，观察到同时的mJX-594和抗PD-1抗体后免疫微环境的变化。(见图5A)。重要的是，CD8 T细胞的肿瘤浸润率在同时联合组中最高。使用抗CD8抗体耗竭CD8+细胞导致肿瘤生长抑制降低，证实这些细胞在抗肿瘤作用中的作用(数据未显示)。与对照相比，mJX-594和同时联合组中髓源性抑制细胞(MDSC)增加。传统上，CD11b+Gr1+细胞被简单地认为是免疫抑制细胞；然而，最近的证据已经证明，不能如此简单地定义这些细胞(将在使用αPD1的同时联合组中观察到的MDSC的相对增加与在使用O.CTLA4的同时联合组中观察到的MDSC的减少进行对比)(图10A-10B)。
评价序贯或同时共同施用mJX-594和PD-1±CTLA4对肿瘤生长的影响。将5x 105个Renca(肾癌，同基因)细胞皮下注射到8周龄的BALB/c免疫感受态小鼠的右侧腹。当肿瘤尺寸达到50mm3时开始治疗(第0天)
将小鼠分成四个治疗组：(i)对照组：第0、3、6、9、12、15天注射PBS；(ii)mJX-594+抗PD-1序贯联合组：第0、3、6、9天肿瘤内注射mJX-594，第6、9、12、15天腹膜内注射抗PD-1(iii)mJX-594+抗PD-1同时联合组：同时施用mJX-594和抗PD-1，在第0、3、6和9天肿瘤内注射mJX-594，在第0、3、6、9、12和15天腹膜内施用抗PD-1；(iv)mJX-594+抗PD-1+抗CTLA4三联同时组：第0、3、6、9天肿瘤内注射mJX-594；在第0、3、6、9、12和15天腹膜内注射抗PD-1和CTLA4(参见图6)。
与对照相比，mJX-594+抗PD-1序贯施用组和同时施用组以及mJX-594+抗PD-1+抗CTLA4三联同时施用组中的肿瘤生长被抑制(参见图7)。出乎意料的是，与序贯施用mJX-594和抗PD-1相比，同时施用这些药剂产生更显著的肿瘤生长抑制(延迟)(见图7)。在三联同时施用组(“Combi(mJX-594+αPD1+αCTLA4”))中中观察到肿瘤生长的进一步延迟(见图7)。
当在治疗组之间比较每只小鼠的肿瘤大小时，与对照相比，在联合组中证实了肿瘤消退。虽然在序贯中从第12天起观察到肿瘤消退，但是在同时和三联同时联合组中肿瘤倾向于从第6天开始消退。
这些结果令人惊奇地表明，给药方案和可能的给药途径可以显著影响联合疗法的抗肿瘤作用。特别地，如果同时施用痘苗病毒和检查点抑制剂，痘苗病毒与检查点抑制剂(抗PD-1、CTLA-4)协同作用以诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。在一些情况下，当痘苗病毒作为同时施用的一部分肿瘤内施用时，存在强烈的抗肿瘤免疫反应。在同时施用痘苗病毒和关卡抑制剂时观察到的协同抗肿瘤作用是特别令人惊讶的，因为免疫检查点抑制剂在本领域中被认为可以抑制溶瘤病毒(如痘苗病毒)的复制(Rojas等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，192(1增补):142.3(2014))。
痘苗病毒+抗CTLA4
将5×105个Renca(肾癌)细胞皮下注射到8周龄的BALB/c免疫感受态小鼠的右侧腹。当肿瘤尺寸达到50-100mm3时，开始治疗(第0天)。
将小鼠随机分成5个治疗组：(i)对照组：第0、3、6、9、12、15天肿瘤内注射PBS；(ii)mJX-594单药治疗组：在第0、3、6和9天肿瘤内注射1×107pfu的mJX-594；(iii)抗CTLA4单药治疗组：第0、3、6、9、12、15天腹腔内注射4mg/kg抗体；(iv)mJX-594+抗CTLA4序贯联合组：mJX-594和抗CTLA4序贯施用，第0、3、6、9天肿瘤内注射mJX-594，第6、9、12、15天腹膜内施用抗CTLA4；(v)mJX-594和抗CTLA4同时联合组：mJX-594和抗CTLA4序贯施用，第0、3、6和9天肿瘤内注射mJX-594，第0、3、6、9、12和15天腹膜内注射抗CTLA4(参见图8)。
在所有组中每3天测量肿瘤大小。观察完毕(第16天)时，通过CO2处死小鼠，取出肿瘤并进行流式细胞术分析(CD4+和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，Gr1+/CD11b+MDSC)。
证实与对照相比，在所有治疗组中肿瘤生长均被抑制。(参见图9)。在联合治疗组中观察到明显更多的肿瘤生长抑制，在同时施用组中观察到最大的肿瘤生长抑制(参见图9)。
当在治疗组之间对比每只小鼠的肿瘤大小时，与单药治疗组和对照组相比，在联合组中证实了肿瘤消退。与对照相比，在所有治疗组中均观察到CD8T细胞浸润增加。(见图10A)。与对照相比，mJX-594单药治疗组中MDSC水平升高，而在序贯联合治疗组中未观察到显著变化，而在同时联合治疗组中观察到MDSC水平降低(参见图10B)。
同时施用JX929和免疫检查点抑制剂
在上述小鼠Renca模型中，IT施用JX929(6×107pfu)，同时腹膜内施用PD-1检查点抑制剂，测试抗肿瘤作用。JX929是一种具有破坏病毒TK和VGF基因(TK-/VGF-表型)并且不表达GM-CSF的Western Reserve痘苗病毒株。
细胞系-
将鼠RENCA细胞(ATCC)在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素的RPMI1640中培养，并在37℃和5％CO2下维持。
体内研究-
对8周龄的雌性BALB/c小鼠用100μl PBS中的RENCA细胞(2×106个细胞)注射至左肾的包膜中。在植入后第10天，根据图1B所示的方案，用(i)PBS(对照)(ii)痘苗病毒(JX-929)单药治疗(植入后第10、11和12天，60x107PFU，共3剂)(iii)抗PD1单药治疗(BioXcell，West Lebanon，NH，100μl)(植入后第10、11和12天，共3剂)或(iv)JX929+抗PD1同时治疗(每个在植入后第10、11和12天施用，JX-929在早晨施用，ICI在当天下午施用，间隔9小时)腹腔内(i.p)治疗携带Renca肿瘤(50mm3-100mm3，通过Spectrum体内成像系统可视化)的小鼠。
在最终治疗后2天，处死小鼠用于进一步的组织学和流式细胞术分析。
流式细胞术-
收集外周血样本并用RBC裂解缓冲液裂解红细胞。用含有1％FBS的PBS洗涤细胞，然后用单克隆小鼠抗CD8、兔抗CD4、兔抗CD3抗体(美国加州的Santa Cruz生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))染色。用4％多聚甲醛固定细胞，然后与FITC缀合的山羊抗兔或山羊APC缀合的抗小鼠抗体(Santa Cruz生物技术公司)一起温育。对于每个样本，使用FACS Calibur仪器(美国加州的BD生物科学公司(BD Biosciences))分析10,000个细胞。
组织学分析-
对小鼠实施安乐死，并获得重要的器官，包括荷瘤的肾和肺，并用10％中性福尔马林固定(BBC Biochemical，WA，USA)。将组织包埋在石蜡中，并用苏木精和曙红对切片(4μμm厚)染色以进行基本组织学分析。对于免疫荧光和免疫组织化学，使用对CD8有特异性的小鼠单克隆抗体(美国加州的Santa Cruz生物技术公司)通过标准方法对切片进行染色。然后将切片与FITC缀合的山羊抗小鼠抗体(Santa Cruz生物技术公司)温育用于免疫荧光，或与
Figure BDA0002291550330000512
Elite ABC-过氧化物酶试剂盒(美国加州的Vector Laboratories)温育并通过Vector SG(Vector Laboratories)进行可视化以用于免疫组织化学。测量并对比从每个治疗组收获的肿瘤的重量和体积。
ELISpot测定-
根据制造商的方案，使用ELISpot小鼠IFNγ试剂盒(俄亥俄州辛辛那提市的Mabtech公司)评估分泌IFNγ的细胞。分离脾并制备成单细胞悬浮液。将脾细胞与RENCA肿瘤细胞或来自用痘苗病毒感染的小鼠的脾细胞以5:1的比例混合，在37℃下温育24小时。使用ImageJ软件(NTH)分析特定斑点的强度。
统计分析-
将所有数值表示为平均值±标准偏差(SD)。使用Instat3(美国加州的GraphPad软件公司(GraphPad Software))进行统计学分析。使用单向方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后配对对比试验对多重对比进行分析。
mJX594治疗诱导检查点蛋白的表达
根据图1C所示的治疗方案，向携带超过50mm3的Renca肿瘤的Balb/c小鼠施用四剂肿瘤内剂量的mJX594(在第0、3、6和9天，每一天1×107)或PBS对照。
在第0天(治疗前)和处死后的第12天测量对照和mJX594治疗的动物的肿瘤中免疫检查点蛋白的水平。图13显示了经mJX594治疗的小鼠中相对于对照小鼠治疗后检查点蛋白的倍数变化。如图13所示，mJX594治疗诱导检查点蛋白的表达，包括PD-1(4倍增加)、PD-L1、PD-L2、CTLA4(超过2倍增加)、LAG3、TIM3(超过3倍增加)和TIGIT(超过2倍增加)。使用复制性溶瘤痘苗病毒治疗产生肿瘤免疫微环境的动态变化，包括检查点蛋白PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT的显著增加，从而用它们各自的检查点抑制剂使肿瘤对这些检查点蛋白中的每一种的阻断敏感。临床试验已经证明，肿瘤浸润细胞和检查点蛋白(例如PD-L1)表达是用检查点抑制剂(例如抗PD-L1治疗)治疗的潜力的指标，这支持了本文所述的联合治疗不仅在患有表达特定检查点蛋白的肿瘤的患者中的效力，而且在患有以较低水平表达(或不表达)特定检查点蛋白的肿瘤的患者中的效力。
实施例2
肿瘤内溶瘤痘苗病毒对肿瘤微环境的改造增强了免疫检查点阻断剂的效果
概要
癌症免疫治疗是一种有效和持久的治疗方式，但其临床益处仍然不普遍。这里，我们使用mJX-594(一种被靶向的和GM-CSF武装的溶瘤痘苗病毒(VV))作为移植肾癌、结肠癌和自发性乳腺癌小鼠中免疫检查点抑制剂(ICI)的组合伴侣。瘤内注射VV诱导肿瘤微环境的深度重塑，将肿瘤从非T细胞-非炎症转变为T细胞-炎症肿瘤，CD8+T细胞的数量增加且效应子功能增强。此外，VV和ICI的联合治疗能够诱导肿瘤消退，并且具有改善的存活率和抗转移作用。我们的发现表明，VV与ICI联合引起强烈的抗癌免疫，从而克服了免疫治疗的耐药性。
介绍
使用靶向PD-1或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(ICI)的癌症免疫治疗已显示出有效且持久的治疗功效，并且作为抗癌战争中的新武器出现(Hegde等人，2016；Topalian等人，2015；Wolchok和Chan，2014)。然而，ICI的临床功效仅限于T细胞炎症性肿瘤微环境(TME)的肿瘤(Gajewski，2015；Topalian等人，2016)。在免疫原性差、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)少的肿瘤中，TME缺乏I型干扰素签名和T细胞募集的趋化因子(Gajewski等人，2013)。此外，肿瘤血管系统和基质组分可对T细胞的肿瘤内运输及其对肿瘤细胞的效应子功能形成障碍(DePalma和Jain，2017；Rivera和Bergers，2015；Sharma等人，2017)。因此，对这些非T细胞炎性肿瘤，需要额外的治疗干预以适当地重塑TME，从而使这些肿瘤对ICI治疗更加敏感。
溶瘤病毒(OV)被认为是一类新型的抗癌疗法，目前正在临床试验中评估具有不同骨架和转基因的OV(Bell，2014；Lichty等人，2014)。尽管最初通过在过去十年中复制速度更快和溶瘤能力增强来评估OV的成功，但由于溶瘤病毒治疗后最强和最持久的反应以及成功诱导的抗肿瘤免疫以及增加的肿瘤特异性效应子和记忆T细胞，它们已开始被认为是一种免疫治疗剂(Bell，2014；Chiocca和Rabkin，2014；Thorne，2014)。然而，由于免疫抑制性TME极大地阻碍了OV的治疗功效，因此释放免疫系统的制动对于最大化OV的免疫治疗功效至关重要(Bell和Ilkow，2017；Hou等人，2016；Liu等人，2017)。因此，OV和ICI的组合是克服免疫原性和免疫抑制性差的TME的合理且有吸引力的策略。
JX-594(pexastimogene devacirepvec，Pexa-vec)是溶瘤痘苗病毒(VV)，其经工程改造可表达免疫活化转基因GM-CSF，且病毒胸苷激酶基因被破坏(Kirn和Thorne，2009)。JX-594在临床前和临床研究中显示出令人印象深刻的抗癌活性和低毒性，并成为临床开发中最可行和最具前景的OV平台之一(Breitbach等人，2011a；Cripe等人，2015；Heo等人，2013；Park等人，2008)。除了具有溶瘤和血管破坏活性之外，JX-594还具有原位癌症疫苗接种效果，因为它可以引发针对肿瘤抗原的适应性免疫反应，从而选择性破坏肿并随后释放其他肿瘤抗原(Breitbach等人，2011b；Breitbach等人，2015a)。尽管JX-594现在正在进行晚期肝细胞癌的III期随机临床试验(Abou-Alfa等人，2016)，但是很少有研究表征其在原发性TME中的免疫调节功能以及JX-594治疗后的远处病变(Kim等人，2018)。此外，JX-594与诸如ICI的免疫治疗剂的最佳组合尚未得到寻求和验证。
在这里，我们全面剖析了JX-594(mJX-594，WR.TK mGM-CSF)小鼠变体对TME的动态重塑，并研究了其免疫治疗潜力，可为免疫原性差的肿瘤模型中的ICI提供合理的组合策略。
结果
mJX-594将免疫抑制性非炎性肿瘤转化为炎性肿瘤
为了确定溶瘤病毒mJX-594的免疫调节潜力，我们检测了在单次mJX-594注射后在低免疫原性Renca肿瘤中肿瘤微环境的时间变化。mJX-594的水平在注射后的第1天已经很高，在第3天达到峰值，并且在第7天几乎检测不到(图33A和33B)。相反，肿瘤血管对病毒水平的反应相反；在第1天和第3天之间，肿瘤血管密度显著降低，但在注射后第7天和此后恢复(图33A和33B)，表明mJX-594诱导有效但瞬时的肿瘤血管破坏。值得注意的是，肿瘤内区域内的CD8+细胞毒性T细胞群体(其包括抗癌免疫的最关键方面)在第5天开始显著升高，在第7天达到峰值，并且在注射后2周保持高密度(图33A和33B)，清楚地证明了mJX-594将非炎症肿瘤明显且持久地转化为T细胞炎性肿瘤。相比之下，CD11c+树突细胞(DC)在第3天瞬时出现并随后减少(图33A和33B)。PD-L1表达水平在第0天最小，并且在mJX-594治疗后上调(图1A和1B)。有趣的是，PD-L1上调的时间紧随CD8+TIL大量涌入之后(图1C)，这表明试图抑制T细胞介导的免疫的负反馈途径的激活。大多数表达PD-L1的细胞为细胞角蛋白+肿瘤细胞，且一些CD11b+髓样细胞也表达PD-L1，而T细胞不表达(图1D)。因此，mJX-594是一种有效且持久的抗癌免疫增强剂，其通过将细胞毒性CD8+T细胞募集到冷肿瘤以及瞬时肿瘤血管破坏物中。
为了阐明由mJX-594调节的癌症免疫途径，我们使用Pancancer免疫分析组综合分析了mJX-594单药治疗后750个免疫相关基因表达水平的变化。结果显示，在对照和mJX-594治疗的肿瘤之间，基因相关免疫标记存在显著差异(图33E)。大约100个免疫调节基因在其表达水平上显示出统计学上的显著变化，包括涉及I型IFN信号传导激活、DC成熟和T细胞活化的那些(图33F)。特别是，我们观察到，与对照相比，TME中抑制性(包括Pd-1、Pd-11、Ctla-4和Lag-3)和激动性(包括Icos、Gitr和Cd27)免疫检查点分子的表达普遍更高(图33G)。此外，对TME的进一步分析显示Th1和Th2应答相关基因增加，这表明mJX-594单药治疗的免疫调节(图33G)。我们还发现，参与TME和髓样细胞的几个基因显著增加(图33G)。值得注意的是，Nos2和Cd86表达的增加代表髓样细胞向M1巨噬细胞的极化。这些结果表明，mJX-594通过TME的动态变化引发长期免疫激活，从而将非炎性肿瘤重塑为可响应免疫检查点阻断剂的T细胞炎性肿瘤。
mJX-594增强CD8+T细胞的肿瘤内浸润并诱导髓样细胞复极化
mJX-594诱导的肿瘤生长延迟是剂量依赖性的(图34A和34B)。同时，mJX-594诱导的CD8+T细胞在肿瘤周围和肿瘤内区域的浸润增加也是剂量依赖性的(图34C和34D)。实际上，淋巴样细胞区室的流式细胞术亚组分析也揭示了mJX-594诱导的肿瘤内CD8+和CD4+T细胞的绝对数目增加是剂量依赖性的(图34E和34G)。尽管在三次施用mJX-594后CD4+Foxp3+CD25+调节性T细胞的数目也增加了(图34H)，但是CD8+T细胞与调节性T细胞的比率比对照治疗高5.3倍(图34I)，这意味着通过mJX-594治疗，TME中T细胞效应子功能总体增加。此外，在mJX-594治疗后，作为共刺激和T细胞活化标记的ICOS和颗粒酶B(GzB)的表达在CD8+T细胞中增加(图34J)。对髓样细胞区室的进一步亚组分析表明，在使用mJX-594治疗的肿瘤中CD11b+Gr1+髓样细胞分数无显著变化(图34K)。但是，CD11b+Ly6G-Ly6C+单核髓样细胞分数增加，而CD11b+Ly6G+Ly6Cint粒细胞性髓样细胞分数减少，表明施用mJX-594后髓样细胞的极化(图34L和34M)。这些发现证明重复施用mJX-594增强了抗癌免疫，产生了活化T细胞的浸润增加和髓样细胞的复极化。
mJX-594的肿瘤内注射引起全身性和癌症特异性免疫反应
为了确定局部注射mJX-594是否能在未注射的远处肿瘤中诱导全身免疫反应，我们在将Renca肿瘤植入两侧侧腹后将mJX-594施用至右侧肿瘤。这种治疗抑制了左右(相反的未注射侧)Renca肿瘤的生长(图35A)。与双侧肿瘤生长抑制一致，CD8+T细胞在肿瘤内区域的浸润在右侧和左侧Renca肿瘤中分别增加了7.9倍和5.5倍(图35B和35C)，表明局部mJX-594病毒疗法能够强烈激活全身抗癌免疫。
接下来，为了排除局部病毒治疗后通过全身循环将病毒直接扩散至远处肿瘤的可能性，我们检查了左侧未注射的Renca肿瘤中的病毒复制，在左侧肿瘤中未发现可检测到的痘苗病毒(图41)，表明mJX-594的抗癌活性是免疫介导的，而不是全身性病毒扩散的结果。
为了评价观察到的全身免疫反应是否是肿瘤特异性的，我们使用在右侧腹植入Renca肿瘤和在左侧腹植入CT26肿瘤的小鼠进行了类似的实验。用mJX-594对右侧Renca肿瘤的瘤内治疗显著降低了注射肿瘤的生长，而左侧未经治疗的CT26肿瘤的生长未受影响(图35D)。显微镜分析提供了一致的结果，即CD8+T细胞在Renca中积累，但在CT26肿瘤中不积累(图35E和35F)，表明mJX-594病毒疗法诱导肿瘤特异性CD8+T细胞应答。因此，这些结果表明，局部mJX-594治疗可引起全身性抗癌免疫，甚至在远处肿瘤中也具有肿瘤特异性淋巴细胞浸润。
抗癌免疫在JX的总体疗效中起至关重要的作用
为了确定免疫系统的哪些组分负责mJX-594的治疗功效，我们检查了其对使用抗CD8、CD4或GM-CSF的中和抗体治疗的小鼠中的肿瘤的影响(图36A)。特别值得注意的是，CD8+或CD4+T细胞的耗竭消除了mJX-594单药治疗对肿瘤生长的有效抑制(图36B和36C)，强调了免疫介导机制而非直接溶瘤在mJX-594诱导的肿瘤抑制中的重要性。有趣的是，在mJX-594注射时，CD4+T细胞的耗竭令人感兴趣地减少了CD8+T细胞的肿瘤内浸润(图36D)，表明CD4+T细胞参与TME中CD8+T细胞的活化和募集。然而，CD8+T细胞的耗竭没有明显改变CD4+T细胞的浸润(图36E)，表明CD8+T细胞不影响TME中的CD4+T细胞。这些数据表明，mJX-594的肿瘤内治疗诱导CD8+和CD4+T细胞的启动，其可以彼此相互作用以介导抗癌免疫。以前基于疱疹病毒和痘苗病毒的病毒疗法利用GM-CSF作为免疫激活转基因，其募集并激活随后引发T细胞应答的抗原呈递细胞(APC)。然而，GM-CSF的使用仍然存在争议，因为其在肿瘤进展中具有潜在的免疫抑制作用，例如诱导髓源性抑制细胞(MDSC)的增殖(Thorne，2014)。因此，我们研究了mJX-594的治疗效果是否需要GM-CSF。有趣的是，GM-CSF的耗竭抵消了mJX-594的抗肿瘤作用，并降低了CD8+和CD4+T细胞的水平，表明GM-CSF对于mJX-594的免疫治疗功效很重要(图36C-36E)。因此，CD8+和CD4+T细胞都是mJX-594抗癌作用的不可缺少的介质，而GM-CSF可以提供免疫治疗益处。
mJX-594与免疫检查点阻断剂的组合物产生协同抗癌作用，增强T淋巴细胞向肿瘤的浸润
为了克服对ICI单药治疗的抗性，我们评价了mJX-594与ICI联合的益处。αPD-1和mJX-594的组合物使肿瘤生长减少70％，而每种αPD-1和mJX-594单药治疗在治疗后12天将肿瘤生长延迟22.8％和44％(图37A和37B)。为了支持这些发现，显微镜分析发现，与对照相比，在使用联合疗法治疗的肿瘤的肿瘤周围(18.8倍)和肿瘤内(21.4倍)区域中CD8+T细胞募集显著增加(图37C和37D)。CD31+肿瘤血管在这些区域显著减少(分别为1.8倍和2.6倍；图37C和37D)。此外，与对照相比，在使用联合疗法治疗的肿瘤中观察到更广泛的肿瘤细胞凋亡(图5C和5D)。尽管PD-L1表达在对照肿瘤中是最小的，但是其在mJX-594治疗后被高度上调(图37C和37D)。这一发现表明，TME中诱导的PD-L1表达是一种在溶瘤病毒治疗后抑制抗癌免疫的适应性负反馈机制，因此为mJX-594和PD-1/PD-L1阻断剂的联合治疗以增强mJX-594的免疫治疗效果提供了合理性(图37E)。
总之，这些结果表明联合疗法可以通过增加CD8+T细胞浸润增强抗癌免疫来克服对mJX594或αPD-1单药治疗的抗性。
类似地，使用αCTLA-4和mJX-594的联合治疗也是协同的。尽管mJX-594(42.0％)或αCTLA-4(20.0％)单药治疗适度抑制了肿瘤的生长，但联合疗法观察到了更强的抑制作用(57.6％)(图42A和42B)。此外，在联合治疗后，与对照相比，在肿瘤的外周(27.0倍增加)和中心(26.4倍增加)区域都观察到了CD8+T细胞的更高积累(图42C和42D)。随着肿瘤内CD8+T细胞水平的增加，与对照相比，CD31+血管在外周和中心区域也被显著破坏(分别减少2.1倍和3.8倍；图42C和42E)。此外，流式细胞术显示，mJX-594和αCTLA-4联合治疗也增加了CD8+和CD4+T细胞的肿瘤内浸润(图42F-42H)。
总之，这些结果表明使用mJX-594和ICI的联合治疗可以克服免疫抑制性TME中的免疫疗法抗性，从而产生协同抗癌作用。
肿瘤内mJX-594和ICI联合免疫疗法的疗效在很大程度上不受治疗方案的影响
由于ICI可以对病毒复制产生负面影响并导致OV的过早清除，因此有几项研究探索了使用全身性溶瘤病毒疗法和ICI的联合治疗的最佳治疗方案，并且报道了一些组合方案可以诱导拮抗治疗效果(Liu等人，2017；Rojas等人，2015)。然而，还没有报道检查局部溶瘤病毒疗法的类似研究。为了建立用于肿瘤内mJX-594和ICI的最佳组合方案，我们对比了以下各项：(1)同时施用mJX-594和ICI(方案I)；(2)在施用mJX-594后3天开始ICI(方案II)；和(3)在ICI开始后3天施用mJX-594(方案III；图38A)。所有联合方案均将肿瘤生长延迟了大概40％(图38B和38C)。同样地，肿瘤浸润的CD8+和CD4+T细胞的水平分别增加了>8倍和>4.0倍，这也表明在CD8+T细胞中ICOS和GzB表达水平显著增加(图38D-38F)。
类似于使用mJX-594和αPD-1的联合治疗，无论治疗方案如何，mJX-594和αCTLA-4的组合物均可抑制肿瘤生长到大概40％(图43A和43B)。此外，不管治疗方案如何，CD8+和CD4+T淋巴细胞的肿瘤内浸润(分别增加>7倍和>7倍)以及CD8+T细胞中GzB和ICOS表达都更大(图43C-43E)。
总之，肿瘤内注射mJX-594和全身免疫检查点阻断剂的联合治疗产生有效的抗癌免疫反应，而与治疗方案无关，这表明肿瘤内施用mJX-594不受ICI施用方案变化的显著影响。
mJX-594、αPD1和αCTLA4的三联组合物可诱导肿瘤完全消退，并在植入的肾癌中提供长期存活益处
由于mJX-594和ICI的双联组合物不能诱导肿瘤完全消退，所以我们探索了使用mJX-594、αPD-1和αCTLA-4的三联治疗。αPD-1和αCTLA-4的双联组合物使肿瘤生长延迟14.5％，mJX-594单药治疗抑制了36.9％的肿瘤生长，而三联组合物抑制了76.5％的肿瘤生长(图39A和39B)。值得注意的是，该三联组中的少数(大概40％)导致肿瘤完全消退，这在任何其它组中均未观察到(图39C)。
为了证实三联治疗诱导的有效抗癌作用是否能够转化为长期存活益处，我们对荷瘤小鼠进行了存活分析。实际上，与其它治疗相比，使用三联疗法治疗的小鼠显示出显著的存活益处(图39D)。此外，具有完全肿瘤消退的小鼠在治疗结束后无肿瘤超过12周，并且受到充分保护，免受肿瘤细胞的再次攻击，表明建立了有效的长期免疫记忆(图39E)。
这些发现证明了三联免疫治疗具有诱导完全肿瘤消退和长期存活的潜力。
三联疗法增强了自发性乳腺癌模型中的抗癌免疫反应
为了明确证实三联疗法在免疫耐受肿瘤中的长期免疫治疗效果，我们使用了MMTV-PyMT转基因小鼠模型，这是一种对癌症免疫治疗具有内在抗性的自发性乳腺癌模型(Schmittnaegel等人，2017)。治疗4周后，与对照小鼠相比，用mJX-594、αPD-1和αCTLA-4的三联治疗的小鼠表现出38.7％的总肿瘤负荷，可触知乳腺肿瘤结节数目显著减少(图40A-40D)。此外，与其它疗法相比，三联疗法可使每个肿瘤结节的平均大小减小48.1％，并改善总存活率(图40E-40F)。组织学分析(图40G，详细解释请见图例)显示，三联组的浸润性癌较少，肿瘤边缘保留良好，表明三联组合物有效地延迟了肿瘤的进展和侵袭。另一方面，用αPD-1和αCTLA-4的双联治疗的肿瘤显示出与对照组相当的浸润性癌表型，其已侵入周围组织并形成肿瘤细胞的实体片。因此，在三联疗法后，与任何其他疗法相比，CD8+T细胞的肿瘤内募集显著增加了>50倍(图40H和40I)。然而，治疗组之间的肿瘤血管密度相似(图40J)。这些发现表明，增强的抗癌免疫，而不是血管破坏作用，对于使用mJX-594和ICI的三联免疫疗法的长期疗效至关重要。最后，在三联治疗组中，血源性肺转移的数量明显减少(图40K和40L)，表明三联疗法具有有效的抗转移作用。
总之，这些结果证明，即使在免疫原性很差的自发性乳腺癌模型中，使用mJX-594和ICI的三联免疫疗法也可以引发强大的抗癌免疫反应。
讨论
在此，我们证明了mJX-594和ICI的联合治疗是用于免疫抵抗肿瘤的有效治疗策略。联合治疗产生免疫学“沸点”，其中冷的、非炎性肿瘤被充分燃烧，使得宿主免疫系统能够根除肿瘤细胞。mJX-594、抗PD-1和抗CTLA4三联免疫治疗的效果最显著，其在大概40％的Renca肿瘤(对免疫治疗最有抗性的同源肿瘤之一)中引起了完全消退。这种强大的协同作用可以通过OV和ICI的互补合作来解释。
JX-594是处于临床试验的最先进阶段中的OV，已知其通过各种机制起作用(Abou-Alfa等人，2016)。尽管它可以快速诱导肿瘤中的直接溶瘤和血管破坏，但是这些作用是短暂的，并且大部分在注射1周内减少。此后，CD8+T细胞广泛地浸润肿瘤以引发抗癌免疫反应。然而，与时同时，通过上调TME中的免疫抑制检查点分子(如PD-1、PD-L1或CTLA-4)，肿瘤开始发展以避免免疫介导的消除。由于OV在成功诱导和维持抗肿瘤免疫的同时获得了最有效且持久的抗癌作用，因此合理地将ICI与OV组合以防止OV诱导的抗癌免疫的早期关闭。
尽管ICI单药疗法革新了癌症的治疗方式，但其显著的治疗反应仅限于部分患者。这产生了免疫学上“热”或“冷”肿瘤的概念；热肿瘤对ICI反应良好，因为它们被TIL免疫发炎并具有高表达的PD-L1，而冷肿瘤由于CD8+TIL和免疫抑制性TME的缺乏而对ICI是难治性的(Bell和Ilkow，2017；Gajewski等人，2013)。因此，目前的努力集中在通过将免疫学上冷的肿瘤转化为热肿瘤来克服对ICI的抗性。在这方面，我们的结果表明mJX-594是ICI的理想组合伙伴。它可以选择性地在肿瘤细胞中复制，破坏它们，并释放肿瘤抗原以刺激宿主免疫系统。此外，我们的研究表明，通过诱导瘤内炎症反应：Th1反应的诱导、T细胞的活化和募集、PD-L1的上调和髓样细胞向抗肿瘤活性的极化，可以将TME从冷状态显著转化为热状态。有趣的是，已知OV的复制和扩散在冷肿瘤中更有活性，在冷肿瘤中几乎没有免疫细胞来消除OV，而具有充足驻留TIL的热肿瘤可诱导OV的过早清除并减弱其治疗效果(Bell和Ilkow，2017)。因此，与本研究的结果一起，mJX-594是ICI的最佳组合伴侣，特别是对于对免疫治疗具有内在抗性的，非炎性的冷肿瘤。
GM-CSF是OV最常用的治疗性遗传有效载荷。T-Vec和Pexa-Vec(JX-594)这两个处于临床试验最先进阶段的OV均配备了GM-CSF。尽管通常已知GM-CSF诱导各种免疫细胞(如DC)的增殖，但人们仍担心免疫抑制细胞(如MDSC)的有害增殖(Hou等人，2016)。在本研究中，我们揭示了mJX-594没有显著改变肿瘤内CD11b+Gr1+细胞的分数。此外，GM-CSF的中和消除了mJX-594的治疗功效，这部分是由于CD8+TIL的减少，表明GM-CSF在mJX-594引起的癌症免疫中具有不可或缺的作用。
以前的研究报道，尽管OV和ICI的组合引起了令人印象深刻的免疫反应，但其治疗效果可能在很大程度上受到给药途径和治疗方案的影响。特别地，当OV和ICI同时全身给药时，由于ICI诱导的抗病毒免疫可以促进病毒的过早清除，因此该组合可能是拮抗性的，这表明在OV治疗之间要有足够的时间间隔以诱导成功的抗癌免疫的重要性。在本研究中，局部注射mJX-594持续诱导抗癌免疫而不受给药顺序的显著影响。我们推测这是因为肿瘤内注射为OV提供了足够的时间使TME发炎，然后才被全身性抗病毒免疫消除。因此，在设计ICI和OV联合治疗的临床试验中，就给药方案而言，肿瘤内OV治疗比全身OV治疗可能更为可行。
除了我们对mJX-594和ICI的组合物的令人鼓舞的结果之外，已经在进行若干临床试验，以研究JX-594与αPD-1、αCTLA-4或αPD-L1联合靶向各种实体癌(包括肝癌、肾癌和结肠癌)的疗效(ClinicalTrials.GoV：NCT03071094、NCT02977156、NCT03294083和NCT03206073)。因此，我们能够在不久的将来在临床环境中验证这项研究的发现。
总之，这项研究表明，肿瘤内注射mJX-954可以诱导TME从冷状态转变为热状态，并与ICI结合引发强大的抗癌免疫力，从而克服对免疫疗法的抗性。
实验程序
小鼠和细胞系
6-8周龄的雄性BALB/c小鼠购自Orient Bio Inc.(韩国京畿道城南市)以及雌性MMTV-PyMT转基因小鼠(FVB/N)购自Jackson Laboratory(美国缅因州巴港，#002374)。将小鼠饲养在CHA大学(韩国京畿道城南市)的无特异性病原体的动物设施中。所有动物实验由CHA大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC，#170025)批准，并根据批准的方案进行。Renca鼠肾癌细胞系和CT26鼠结肠癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯，#CRL-2947)和韩国细胞系库(韩国首尔，#80009)。将这些细胞保持在RoswellPark Memorial Institute(RPMI)1640培养基或Dulbecco的改良的Eagle培养基(DMEM)中，每种培养基补充有10％的胎牛血清(FBS)和1％的青霉素/链霉素，并在37℃下在培养箱内的5％CO2中温育。
病毒的产生和定量
由Sillajen,Inc.(韩国首尔)提供的mJX-594是在p7.5启动子控制下的痘苗胸苷激酶基因座中编码鼠GM-CSF的痘苗病毒的Western Reserve(WR)株，并在整个研究中使用。该病毒在纯化前在HeLaS3细胞中扩增。简言之，用重组痘苗病毒感染HeLaS3细胞3天，离心收集，然后匀浆并再次离心。将含有病毒的上清液铺在36％的蔗糖垫上，以32900g离心，并将纯化的病毒沉淀重悬于pH9.0的1mM Tris中。为了测定病毒滴度，将在无血清DMEM中连续稀释的病毒应用至U-2OS细胞单层上持续2小时，然后加入在DMEM中1.5％的羧甲基纤维素，其中补充有2％的FBS。72小时后，用0.1％结晶紫染色细胞并计数噬菌斑。
肿瘤模型和治疗方案
通过皮下注射2×105个Renca细胞，将肿瘤植入野生型BALB/c小鼠的右侧腹。当肿瘤达到>50mm3时，通过每3天瘤内注射用PBS或1×107噬菌斑形成单位(pfu)的mJX-594治疗小鼠。对于双侧肿瘤模型，将2×105个Renca细胞皮下植入右侧腹，并在4天后将1×105个Renca或CT26细胞皮下植入左侧腹。对于细胞耗竭研究，将抗CD4(200μg，克隆GK1.5，BioxCell)、CD8(200μg，克隆53-6.72，BioxCell)或GM-CSF(200μg，克隆MP1-22E9，BioxCell)的抗体与mJX-594一起腹膜内注射。对于免疫检查点阻断剂，根据给药方案，每3天腹膜内注射抗PD-1(10mg/kg，克隆J43，BioxCell)和/或抗CTLA-4(4mg/kg，克隆9D9，BioxCell)抗体，其中含或不含mJX-594。使用数字卡尺每2或3天测量一次肿瘤，并使用改进的椭圆体公式(1/2×(长度×宽度2))计算肿瘤体积。在第50天，用左侧腹的2×105个Renca细胞再次攻击肿瘤完全消退的存活小鼠，并监测肿瘤的生长和存活。当肿瘤直径达到1.5cm或当小鼠濒死时，对小鼠实施安乐死。
雌性MMTV-PyMT转基因小鼠购自Jackson Laboratory。出生后9周，测量每个可触知的肿瘤结节(>20mm3)的体积，并将合并的所有肿瘤的总体积用于计算每只小鼠的肿瘤负荷。根据MMTV-PyMT小鼠的初始肿瘤负荷对该小鼠进行随机分组，并在指定的时间点，在存在或不存在免疫检查点抑制剂PD-1(10mg/kg)或CTLA-4(4mg/kg)的情况下用1×107pfu的mJX-594治疗。治疗4周后，麻醉小鼠，并收集组织用于进一步分析。如先前所述进行MMTV-PyMT分析(Kim等人，2014；Park等人，2016)。
组织学分析
对于苏木精和曙红(H&E)染色，将肿瘤在4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜。使用标准程序进行组织处理后，将样本包埋在石蜡中并切成3μm切片，随后进行H&E染色。在冷冻组织切片上进行免疫荧光检查。在室温下将肿瘤固定在1％PFA中并用PBS冲洗数次，用30％蔗糖浸润，并在OCT化合物中冷冻。将冷冻切片(50μm厚)用5％正常山羊血清的PBS-T溶液(PBS中的0.1％Triton X-100)封闭，然后与下列一抗温育过夜：抗痘苗病毒(兔，Abcam)、抗CD31(仓鼠，克隆2H8，Millipore；兔，Abcam)、抗CD8(大鼠，克隆53-6.7，BD Pharmingen)、抗CD11c(仓鼠，克隆HL3，BD Pharmingen)、抗PD-L1(兔，克隆28-8，Abcam)、抗半胱天冬酶3(兔，R&D Systems)、抗泛细胞角蛋白(小鼠，克隆AE1/AE3，DAKO)、抗CD11b(大鼠，克隆M1/70，BD Pharmingen)或抗CD3e(Hamster，克隆145-2C11，BD Pharmingen)。洗涤数次后，将样本与下列二抗在室温下温育2小时：FITC、Cy3或Cy5缀合的抗兔IgG(JacksonImmunoResearch)、FITC缀合的抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)、FITC或Cy3缀合的抗仓鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)、或FITC缀合的抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)。对细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Invitrogen)复染。最后，用荧光固定介质(DAKO)固定样本，并用Zeiss LSM 880显微镜(Carl Zeiss)采集图像。
形态测定分析
使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij)进行痘苗病毒、血管、T淋巴细胞和树突状细胞的密度测量以及髓样细胞面积的测量。为了测定痘苗病毒感染的水平，在肿瘤切片中计算每随机0.49mm2视野的VV+面积。对于血管密度，在肿瘤周围和肿瘤内区域中计算每随机0.49mm2的CD31+面积。细胞毒性T淋巴细胞浸润的程度被表示为肿瘤周围和肿瘤内区域中每随机0.49mm2的CD8+面积百分比。通过计算随机0.49mm2中CD11c+面积的百分比来测量树突状细胞的水平。凋亡的程度被表示为每随机0.49mm2的视野中半胱天冬酶3+面积的百分比。为了定义PD-L1+细胞，在随机0.01mm2的视野中鉴定PD-L1+与Pan-CK+、CD11b+和CD3+的共定位。通过测量直径>100μm的肿瘤灶来定量MMTV-PyMT小鼠的肺转移。对每只小鼠至少在5个视野中进行所有测量。
肿瘤浸润免疫细胞的流式细胞分析
在胶原酶D(20mg/ml，Roche)和DNase I(2mg/ml，Roche)的存在下，在37℃下振荡温育1小时之前，将来自每个治疗组的肿瘤切碎。通过反复移液产生细胞悬浮液，然后通过70μm细胞滤器过滤并裂解以去除红细胞。用PBS洗涤后，通过尼龙网过滤重悬的细胞。用抗CD 16/32的抗体(克隆2.4G2，BD Pharmingen)封闭来自肿瘤组织的单细胞悬液，并用可固定存活染料(eFlouor450，eBioscience)染色以区分活细胞。为了分析表面标记，将细胞在含1％FBS的PBS中用针对CD45(30-F11，BD Pharmingen)、CD4(RM4-5，BD Pharmingen)、CD8(53-6.7，BD Pharmingen)、CD3(17A2或145-2C11，eBioscience)，ICOS(7E.17G9或15F9，eBioscience)、CD11b(M1/70，BD Pharmingen)、F4/80(BM8，eBioscience)，MHC II(M5/114.15.2，eBioscience)、Ly6C(HK1.4，eBioscience)、Ly6G(1A8-Ly6g或RB6-8C5，eBioscience)或CD206(MR5D3，eBioscience)的抗体在冰上染色30分钟。使用FoxP3固定和透化试剂盒(eBioscience)进一步透化细胞，并对FoxP3(FJK-16s，eBioscience)、CD25(PC61.5，eBioscience)或颗粒酶B(NGZB，eBioscience)染色。使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)获取标记的细胞，并使用FlowJo软件(俄勒冈州亚什兰集团的TreeStar Inc.公司)进行分析。
RNA分离和NanoString基因表达分析
使用TRIzol(Invitrogen)从整个肿瘤裂解物中提取总RNA，并用乙醇纯化；使用片段分析仪(美国爱荷华州的先进分析技术公司(Advanced Analytical Technologies))确认RNA质量。使用从肿瘤组织分离的100ng总RNA，用数字多重NanoString nCounterPancancer免疫分析小鼠组(NanoString技术公司(NanoString Technologies))进行免疫分析。通过将5μl的每种RNA样本与杂交缓冲液中的8μl nCounter Reporter探针和2μlnCounter Capture探针合并，在65℃进行杂交16-30小时，总反应体积为15μl。使用nCounter Prep Station(NanoString技术公司)通过基于磁珠的两步纯化将多余的探针去除。使用nCounter数字分析仪通过对单个荧光条形码进行计数并评估相应的目标分子来定量特定目标分子的丰度。对于每种测定，均进行包括280个视野的高密度扫描。在用CCD照相机采集样本盒中固定的荧光报告分子的图像后，使用nCounter数字分析仪收集数据。使用nSolver软件(NanoString技术公司)进行数据分析。将mRNA分析数据标准化为管家基因(housekeeping gene)并使用R软件(www.r-project.org)进行分析。
统计分析
使用GraphPad Prism7.0软件(加利福尼亚州拉霍亚的GraphPad软件公司)和PASWstatistics 18(SPSS)进行统计分析。除非另有说明，否则将数值表示为平均值+/-平均值的标准误差(SEM)。对平均值之间的统计差异采用非配对的学生t检验进行检验。使用Kaplan-Meier方法产生存活曲线，使用对数秩检验分析曲线之间的统计学差异。将统计学显著性水平设定为p<0.05。
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根据本公开，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以在没有过度实验的情况下制备和实施。尽管已经根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，将显而易见的是，化学和生理相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替换和修改被认为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (65)

1.一种在需要治疗癌症的受试者中治疗和/或预防癌症的方法，其包含同时给予所述受试者有效量的组合物，所述组合物包含(a)复制性溶瘤痘苗病毒和(b)一种或多种免疫检查点抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒在肿瘤内、静脉内、动脉内或腹膜内施用。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒在肿瘤内施用。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒以有效诱导所述肿瘤中免疫检查点蛋白表达的量施用。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在施用所述复制性溶瘤痘苗病毒之前，所述肿瘤不表达所述免疫检查点蛋白或以相对较低水平表达所述免疫检查点蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为特异性结合所述免疫检查点蛋白的抗体或其片段，优选为单克隆抗体、人源化抗体、全人源抗体、融合蛋白或其组合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述检查点抑制剂抑制选自由以下项组成的群组的免疫检查点蛋白：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、疮疹病毒侵入介体(HVEM)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、半乳糖凝集素9(GAL9)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、含V结构域免疫球蛋白(Ig)的T细胞活化抑制剂(VISTA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、具有Ig和Π′IΜ结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)或其组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是选择性地结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体，优选地选自由BMS-936559、阿特朱单抗、度伐单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、纳武单抗、派姆单抗(pembrolizumab)和兰洛利珠单抗(lambrolizumab)组成的群组。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为选择性结合CTLA4的单克隆抗体，优选地选自由伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)组成的群组。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中将多种检查点抑制剂与所述溶瘤痘苗病毒同时施用于所述受试者。
11.根据权利要求10所述的方法，其中向所述受试者同时施用：
(a)CTLA4抑制剂、PD-1抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；
(b)CTLA4抑制剂、IDO抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；
(c)PD-1抑制剂、IDO抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；或者
(d)PD-1抑制剂、CTLA4抑制剂、IDO抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；
(e)LAG3抑制剂、PD-1抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒；或者
(f)TIGIT抑制剂、PD-1抑制剂和复制性溶瘤痘苗病毒。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒为Wyeth株、West Reserve株、Lister株或Copenhagen株。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述痘苗病毒包含一个或多个遗传修饰以增加所述病毒对癌细胞的选择性，优选地所述病毒被工程改造以缺乏功能性胸苷激酶和/或缺乏功能性痘苗生长因子。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述痘苗病毒包含功能性14L和/或F4L基因。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述痘苗病毒经工程改造以表达(i)细胞因子，其优选地选自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-24、IFN-γ、TNF-α，和/或(ii)肿瘤抗原，其优选地选自BAGE、GAGE-1、GAGE-2、CEA、AIM2、CDK4、BMI1、COX-2、MUM-1、MUC-1、TRP-1、TRP-2、GP100、EGFRvIII、EZH2、LICAM、Livin、Livinβ、MRP-3、巢蛋白、OLIG2、SOX2、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7、ART1、ART4、SART1、SART2、SART3、B-细胞周期蛋白、β-连环蛋白、Glil、Cav-1、组织蛋白酶B、CD74、E-钙粘蛋白、EphA2/Eck、Fra-1/Fosl 1、神经节苷脂/GD2、GnT-V、β1,6-N、Her2/neu、Ki67、Ku70/80、IL-13Ra2、MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-1、MART-1、PROX1、PSCA、SOX10、SOX11、生存素、半胱天冬酶-8、UPAR、CA-125、PSA、p185HER2、CD5、IL-2R、Fap-α、腱生蛋白、黑素瘤相关抗原p97，以及WT-1、G蛋白信号传导调节剂5(RGS5)、Surivin(BIRC5＝含重复凋亡结构杆状病毒抑制剂5)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGF-BP3)、胸苷酸合成酶(TYMS)、低氧诱导蛋白2、低氧诱导性脂滴相关蛋白(HIG2)、基质金属肽酶7(MMP7)、prune同源蛋白2(PRUNE2)、RecQ蛋白样(DNA解旋酶Q1样蛋白)(RECQL)、瘦素受体(LEPR)、ERBB受体反馈抑制剂1(ERRFI1)、溶酶体蛋白跨膜蛋白4α(LAPTM4A)、RAB1B、RAS癌基因家族(RABIB)、CD24、智人胸腺素beta 4、X-linked(TMSB4X)蛋白、智人S100钙结合蛋白A6(S100A6)、智人腺苷A2受体(ADORA2B)、16号染色体开放阅读框61抗体(C16orf61)、ROD1分化调节剂1(ROD1)、NAD依赖性脱乙酰基酶去乙酰化酶sirtuin-2(SIR2L)、微管蛋白α1c(TUBA1C)、ATP酶抑制因子1(ATPIF1)、基质抗原2(STAG2)、核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性底物1(NUCKS1)。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述痘苗病毒约107至约1011pfu，优选约108-1010pfu，更优选约109-1010pfu的量施用。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述检查点抑制剂以约2mg/kg至15mg/kg的量施用。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自肝细胞癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胃癌、食道癌、肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、子宫颈癌和肝癌的癌症。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者患有肾细胞癌。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中对所述受试者的至少一种先前的化疗或免疫疗法治疗失败。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者患有免疫检查点抑制剂疗法难治的癌症，优选所述癌症对用抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体的治疗具有抗性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者被鉴定为免疫检查点抑制剂疗法的候选者。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，所述方法包含向所述受试者施用选自化疗(烷化剂、核苷类似物、细胞骨架调节剂、细胞抑制剂)和放疗的其他疗法。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其包含向所述受试者施用其他溶瘤病毒疗法(例如弹状病毒、塞姆利基森林病毒)。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中将第一剂量的所述复制性溶瘤痘苗病毒和第一剂量的所述免疫检查点抑制剂同时施用于所述受试者，然后将所述病毒和所述检查点抑制剂至少一次连续同时施用于所述受试者。
27.根据权利要求26所述的方法，其包含将所述复制性溶瘤痘苗病毒和所述检查点抑制剂至少第一、第二和第三次连续同时施用于所述受试者。
28.根据权利要求27所述的方法，其包含将所述复制性溶瘤痘苗病毒和所述检查点抑制剂至少第一、第二、第三和第四次连续同时施用于所述受试者。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中将所述第一剂量的复制性溶瘤痘苗病毒和所述第一剂量的免疫检查点抑制剂同时施用，随后将所述病毒和所述检查点抑制剂至少一次连续同时施用于所述受试者，然后向所述受试者单独施用至少一剂检查点抑制剂。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其包含在药剂的连续同时施用之间的1-3周的间隔，优选包含约1周、约2周或约3周的间隔。
31.一种治疗人的肿瘤的方法，其包含向所述人同时施用一种组合物，所述组合物包含(a)复制性溶瘤痘苗病毒和(b)免疫检查点蛋白的抑制剂。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒是肿瘤内、静脉内、动脉内或腹膜内施用的。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒是肿瘤内施用的。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒以有效诱导所述肿瘤中免疫检查点蛋白表达的量施用。
35.根据权利要求31所述的方法，其中在施用所述复制性溶瘤痘苗病毒之前，所述肿瘤不表达所述免疫检查点蛋白或以相对较低水平表达所述免疫检查点蛋白。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其包含在施用所述组合物之前测量所述肿瘤中所述免疫检查点蛋白的表达水平的步骤。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TM3和TIGIT。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为CTLA-4。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为PD-L1。
40.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为LAG3。
41.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为TIGIT。
42.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为PD-1。
43.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为TIM3。
44.根据权利要求31-43中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为实体癌。
45.根据权利要求31-43中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为结肠直肠癌。
46.根据权利要求31-43中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为肾细胞癌。
47.根据权利要求39或42所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白的抑制剂为选择性结合PD-1或PD-LL的单克隆抗体，优选地选自由BMS-936559、阿特朱单抗、度伐单抗、阿维鲁单抗、纳武单抗、派姆单抗和兰洛利珠单抗组成的群组。
48.根据权利要求38所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白的所述抑制剂为选择性结合CTLA-4的单克隆抗体，优选地选自由伊匹单抗和替西木单抗组成的群组。
49.一种治疗人的肿瘤的方法，其包含向所述人同时施用一种组合物，所述组合物包含(a)复制性溶瘤痘苗病毒、(b)PD-1和/或PD-L1的抑制剂，以及(c)免疫检查点蛋白的抑制剂。
50.根据权利要求49所述的方法，其中在施用所述复制性溶瘤痘苗病毒之前，所述肿瘤不表达所述免疫检查点蛋白或以相对较低水平表达所述免疫检查点蛋白。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒是肿瘤内、静脉内、动脉内或腹膜内施用的。
52.根据权利要求49所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒是肿瘤内施用的。
53.根据权利要求49所述的方法，其中所述复制性溶瘤痘苗病毒以有效诱导所述肿瘤中免疫检查点蛋白表达的量施用。
54.根据权利要求49所述的方法，其中在施用所述复制性溶瘤痘苗病毒之前，所述肿瘤不表达所述所述免疫检查点蛋白或以相对较低水平表达所述免疫检查点蛋白。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其包含在施用所述组合物之前测量所述肿瘤中所述检查点蛋白的表达水平的步骤。
56.根据权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白选自CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为CTLA-4。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为LAG3。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为TIGIT。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白为T1M3。
61.根据权利要求49-60中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为实体癌。
62.根据权利要求49-61中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为结肠直肠癌。
63.根据权利要求49-62中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为肾细胞癌。
64.根据权利要求49所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白的所述抑制剂为选择性结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体，优选地选自由BMS-936559、阿特朱单抗、度伐单抗、阿维鲁单抗、纳武单抗、派姆单抗和兰洛利珠单抗组成的群组。
65.根据权利要求57所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白的所述抑制剂为选择性结合CTL.A-4的单克隆抗体，优选地选自由伊匹单抗和替西木单抗组成的群组。
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