JP2020517737A

JP2020517737A - 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびチェックポイント阻害剤の併用療法

Info

Publication number: JP2020517737A
Application number: JP2020507513A
Authority: JP
Inventors: チャンキム，; ホンジェジョン，; ウンサンムン，; スンクォンチ，; ジウォンサラチェ，; ジョン−グジュン，; ジュングペ，
Original assignee: シルラゼン，インコーポレイテッド
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2020-06-18
Also published as: US20200085891A1; CN110678192A; AU2018254626A1; BR112019022009A2; JP2023087093A; EP3612201A1; AU2024201848A1; EP4286009A2; KR20190137911A; CA3060516A1; WO2018195552A1; AU2018254626B2; EP3612201B1; EP4286009A3

Abstract

（ｉ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび（ｉｉ）免疫チェックポイントタンパク質阻害剤を含む薬剤の組み合わせが提供され、ならびに当該薬剤の組み合わせを含むキット、ならびに癌を治療する方法および／または阻害する方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下に、２０１７年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／４８８，６２３号明細書および２０１７年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／５５０，４８６号明細書の利益を主張するものであり、これらの出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は概して、ウイルス学および医学に関連する。特定の態様において、本発明は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび免疫調節物質を含有する治療剤の組み合わせに関連する。

正常組織のホメオスタシスは、細胞増殖と細胞死の高度に制御されたプロセスである。細胞増殖または細胞死のいずれかの不均衡により、癌性の状態へと進展する可能性がある。例えば子宮頚部、腎臓、肺、膵臓、大腸および脳の癌は、もたらされる可能性がある多くの癌のうちの数例にすぎない。事実、癌の発生は非常に多く、癌による死者は米国だけでも毎年５０万人を越える。

複製−選択的な腫瘍溶解性ウイルスは、癌の治療法として有望である。これらのウイルスは直接的な複製依存性の腫瘍溶解効果および／またはウイルス遺伝子発現依存性の腫瘍溶解効果を通して、腫瘍細胞の死をもたらすことができる。しかしながら腫瘍による免疫抑制とウイルスの早過ぎるクリアランスによって、多くの場合、弱い腫瘍特異的免疫応答しか生じず、癌治療剤としてのこれらのウイルスの可能性は限定されている。

同様に、免疫チェックポイント阻害剤は、特定の癌の治療においていくらかの効果を発揮したが、限られた割合の患者にしか客観的な臨床応答を得られていない。癌治療の改善には未だニーズが存在する。

本発明者らは、臨床的に関連性のある癌モデルに対し、免疫チェックポイント阻害剤と、腫瘍内投与される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを並行投与することにより、相乗的な抗腫瘍効果が生じることを見出した。この並行投与で、これらの剤は、最初の投与で、そして好ましくは複数回の連続投与で同時に投与される。ゆえに、いくつかの実施形態において、本出願は、哺乳類における癌、および／もしくは転移の確立の治療ならびに／または予防における使用のための併用療法を提供するものであり、当該併用療法は、（ｉ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害剤を当該哺乳類に並行投与することを含み、当該腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、当該哺乳類に、腫瘍内投与される。特定の態様において、薬剤の組み合わせパートナーを哺乳類へ並行投与することは、いずれか治療の単独と比較して、強化された、さらには相乗的な抗腫瘍免疫を提供する。

一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内に、静脈内に、動脈内に、または腹腔内に投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍中の免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、腫瘍は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の前に、免疫チェックポイントタンパク質を発現していないか、または比較的低いレベルで免疫チェックポイントタンパク質を発現している。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片であり、好ましくはモノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせである。

一部の実施形態では、本組み合わせの免疫チェックポイント阻害剤は、細胞障害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ−４：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ−４）、プログラム化細胞死タンパク質１（ＰＤ−１：ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｐｒｏｔｅｉｎ１）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＥＭ３：Ｔ−ｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ３）、ガレクチン９（ＧＡＬ９：ｇａｌｅｃｔｉｎ９）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３：ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｇｅｎｅ３）、Ｔ細胞活性化のＶドメインイムノグロブリン（Ｉｇ）−含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ：Ｖ−ｄｏｍａｉｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｉｇ）−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆＴ−ｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、キラー細胞イムノグロブリン様受容体（ＫＩＲ：Ｋｉｌｌｅｒ−ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ：ＢａｎｄＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するT細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ：Ｔ−ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｗｉｔｈＩｇａｎｄＩＴＩＭｄｏｍａｉｎｓ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ：ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３ −ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質を阻害する。さらなる態様では、チェックポイント阻害剤は、限定されないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、またはそれらの組み合わせを含むチェックポイントタンパク質のリガンドと相互作用する。好ましい実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質またはそのリガンドに特異的に結合する抗体（例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体）、抗体断片、または融合タンパク質である。

一部の好ましい実施形態では、本組み合わせの免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３またはＣＴＬＡ４に特異的に結合する（そして阻害する）抗体またはその抗原結合断片である。非限定的な例として、哺乳類において癌を治療および／または予防する方法が提供され、当該方法は、（ｉ）腫瘍内注射による複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ならびに（ｉｉ）ＣＴＬＡ４阻害剤および／またはＰＤ−１阻害剤、の有効量を並行して対象に投与することを含む。

一部の好ましい実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合するモノクローナル抗体であり、好ましくは、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）およびランブロリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４に選択的に結合するモノクローナル抗体であり、好ましくは、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）およびトレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、複数のチェックポイント阻害剤が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと並行して対象に投与される。一部の実施形態では、対象は、（ａ）ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス；（ｂ）ＣＴＬＡ４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス；（ｃ）ＰＤ−１阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス；または（ｄ）ＰＤ−１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス；（ｅ）ＬＡＧ３阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス；または（ｆ）ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、を並行して投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｗｙｅｔｈ株、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｌｉｓｔｅｒ株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株である。一部の実施形態では、ワクシニアウイルスは、癌細胞に対するウイルスの選択性を高める遺伝子改変を１つまたは複数含み、好ましくはウイルスは、機能性のチミジンキナーゼを欠くように、および／または機能性のワクシニア増殖因子を欠くように操作される。一部の実施形態では、ワクシニアウイルスは、機能性の１４Ｌ遺伝子および／またはＦ４Ｌ遺伝子を含む。

一部の実施形態では、ワクシニアウイルスは、癌細胞に対するワクシニアウイルスの選択性を高める、例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子および／またはワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子の不活化などの遺伝子改変を１つまたは複数有するＷｙｅｔｈ株、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｌｉｓｔｅｒ株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株である。関連する実施形態では、ワクシニアウイルスは、例えば、限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２４、ＩＦＮ−γ、および／またはＴＮＦ−αなどのサイトカイン、好ましくはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２から選択されるサイトカインを発現するよう操作される。他の関連実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、例えば、限定されないが、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＣＥＡ、ＡＩＭ２、ＣＤＫ４、ＢＭＩ１、ＣＯＸ−２、ＭＵＭ−１、ＭＵＣ−１、ＴＲＰ−１ＴＲＰ−２、ＧＰ１００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＺＨ２、ＬＩＣＡＭ、Ｌｉｖｉｎ、Ｌｉｖｉｎβ、ＭＲＰ−３、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ２、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、ヒトパピローマウイルス−Ｅ７、ＡＲＴｌ、ＡＲＴ４、ＳＡＲＴｌ、ＳＡＲＴ２、ＳＡＲＴ３、Ｂ−サイクリン（Ｂ−ｃｙｃｌｉｎ）、β−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｇｌｉ１、Ｃａｖ−１、カテプシンＢ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ）、ＣＤ７４、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＥｐｈＡ２／Ｅｃｋ、Ｆｒａ−１／Ｆｏｓｌ１、ガングリオシド／ＧＤ２（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ／ＧＤ２）、ＧｎＴ−Ｖ、β１，６−Ν、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７、Ｋｕ７０／８０、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＰＲＯＸ１、ＰＳＣＡ、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、カスパーゼ−８、ＵＰＡＲ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ｐｌ８５ＨＥＲ２、ＣＤ５、ＩＬ−２Ｒ、Ｆａｐ−α、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、メラノーマ関連抗原ｐ９７（ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｐ９７）、ＷＴ−１、Ｇタンパク質シグナリング５の調節因子（ＲＧＳ５：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇ５）、サバイビン（Ｓｕｒｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５＝ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｇ５（バキュロウイルスアポトーシス阻害タンパク質リピート５））、インスリン様増殖因子−結合タンパク質３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ３：ＩＧＦ−ＢＰ３）、チミジル酸合成酵素（ＴＹＭＳ）、低酸素誘導タンパク質２、低酸素誘導脂肪滴関連タンパク質（ｈｙｐｏｘｉａｌｉｎｄｕｃｉｂｌｅｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）（ＨＩＧ２）、マトリクスメタロペプチダーゼ７（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ７：ＭＭＰ７）、ｐｒｕｎｅホモログ２（ＰＲＵＮＥ２：ｐｒｕｎｅｈｏｍｏｌｏｇ２）、ＲｅｃＱタンパク質様（ＤＮＡヘリカーゼＱｌ様：ＲＥＣＱＬ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ：ｌｅｐｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害剤１（ＥＲＲＦＩｌ）、リソソームタンパク質膜貫通型４アルファ（ｌｙｓｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ４ａｌｐｈａ：ＬＡＰＴＭ４Ａ）；ＲＡＢ１Ｂ、ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＳｏｎｃｏｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ：ＲＡＢＩＢ）、ＣＤ２４、ホモサピエンスサイモシンベータ４、Ｘリンク（ＴＭＳＢ４Ｘ：ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｔｈｙｍｏｓｉｎｂｅｔａ４，Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ）、ホモサピエンスＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６（ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＳ１００ｃａｌｃｉｕｍｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＡ６：Ｓ１００Ａ６）、ホモサピエンスアデノシンＡ２受容体（ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓａｄｅｎｏｓｉｎｅＡ２ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＡＤＯＲＡ２Ｂ）、染色体１６オープンリーディングフレーム６１（Ｃ１６ｏｒｆ６１）、ＲＯＤ１分化の調節遺伝子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１（ＲＯＤ１）、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン２（ＳＩＲ２Ｌ）、チューブリンアルファ１ｃ（ＴＵＢＡ１Ｃ（ｔｕｂｕｌｉｎａｌｐｈａ１ｃ））、ＡＴＰａｓｅ阻害因子１（ＡＴＰＩＦｌ）、ストローマ抗体２（ＳＴＡＧ２：ｓｔｒｏｍａｌａｎｔｉｇｅｎ２）、核カゼインキナーゼ、およびサイクリン依存性基質１（ｎｕｃｌｅａｒｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅａｎｄｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｕｂｓｔｒａｔｅ１：ＮＵＣＫＳ１）などの腫瘍抗原を発現するよう操作される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、腎細胞の癌性腫瘍抗原である。一部の実施形態では、腎細胞の癌性腫瘍抗原は、Ｇタンパク質シグナリング５の調節因子（ＲＧＳ５：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇ５）、サバイビン（Ｓｕｒｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５＝ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｇ５（バキュロウイルスアポトーシス阻害タンパク質リピート５））、インスリン様増殖因子−結合タンパク質３（ＩＧＦ−ＢＰ３）、チミジル酸合成酵素（ＴＹＭＳ）、低酸素誘導タンパク質２、低酸素誘導脂肪滴関連タンパク質（ＨＩＧ２）、マトリクスメタロペプチダーゼ７（ＭＭＰ７）、ｐｒｕｎｅホモログ２（ＰＲＵＮＥ２）、ＲｅｃＱタンパク質様（ＤＮＡヘリカーゼＱｌ様：ＲＥＣＱＬ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害剤１（ＥＲＲＦＩｌ）、リソソームタンパク質膜貫通型４アルファ（ＬＡＰＴＭ４Ａ）；ＲＡＢ１Ｂ、ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢＩＢ）、ＣＤ２４、ホモサピエンスサイモシンベータ４、Ｘリンク（ＴＭＳＢ４Ｘ）、ホモサピエンスＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６（Ｓ１００Ａ６）、ホモサピエンスアデノシンＡ２受容体（ＡＤＯＲＡ２Ｂ）、染色体１６オープンリーディングフレーム６１（Ｃ１６ｏｒｆ６１）、ＲＯＤ１分化の調節遺伝子１（ＲＯＤ１）、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン２（ＳＩＲ２Ｌ）、チューブリンアルファ１ｃ（ＴＵＢＡ１Ｃ）、ＡＴＰａｓｅ阻害因子１（ＡＴＰＩＦｌ）、ストローマ抗体２（ＳＴＡＧ２）、ならびに核カゼインキナーゼおよびサイクリン依存性基質１（ＮＵＣＫＳ１）からなる群から選択される。

一部の実施形態では、ワクシニアウイルスは、約１０^７〜約１０^１１ｐｆｕの量、好ましくは約１０^８〜１０^１０ｐｆｕの量、より好ましくは約１０^９〜１０^１０ｐｆｕの量で投与される。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、約２ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、哺乳類の癌を治療および／または予防するために哺乳類に投与される。一部の実施形態では、癌は、固形腫瘍型の癌である。一部の実施形態では、癌は、メラノーマ、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱癌、頭頚部癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、中皮腫、消化管癌、白血病、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、胃癌、食道癌、中皮腫、大腸癌、肉腫、または甲状腺癌からなる群から選択される。他の好ましい実施形態では、薬剤の組み合わせは、転移を治療するために哺乳類に投与される。一部の実施形態では、対象は、腎細胞癌を有する。

好ましい実施形態では、薬剤の組み合わせを用いて治療される哺乳類は、ヒト対象である。関連する態様では、治療の必要のある対象は、１つまたは複数の化学療法剤を用いた治療に対して不応性（または抵抗性）の癌、および／または１つまたは複数の抗体を用いた治療に対して不応性の癌を有するヒトである。特定の実施形態では、当該ヒトは、免疫チェックポイント阻害剤を含む治療に対して不応性（または抵抗性）であり、かつ場合によっては、１つまたは複数の化学療法剤を用いた治療に対しても不応性である癌（例えば大腸癌）を有する。他の実施形態では、治療の必要のあるヒトは、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療の候補として特定されたヒトである。

一部の実施形態では、対象は、過去に少なくとも１つの化学療法または免疫療法に失敗している。一部の実施形態では、対象は、免疫チェックポイント阻害剤療法に対して不応性の癌を有し、好ましくは当該癌は、抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いた治療に対して抵抗性である。一部の実施形態では、対象は、免疫チェックポイント阻害剤治療の候補として特定される。一部の実施形態では、方法は、化学療法（アルキル化剤、ヌクレオシドアナログ、細胞骨格改変剤、細胞分裂阻害剤）および放射線療法から選択される追加的療法を対象に与えることを含む。一部の実施形態では、方法は、追加的な腫瘍溶解性ウイルス療法（例えばラブドウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳｅｍｌｉｋｉＦｏｒｅｓｔＶｉｒｕｓ））を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの第一の用量、および免疫チェックポイント阻害剤の第一の用量は同時に対象に投与され、次いで対象に、ウイルスとチェックポイント阻害剤の少なくとも１回のその後の連続的同時投与が行われる。一部の実施形態では、方法は、対象への、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の少なくとも第一、第二、および第三の連続的同時投与を含む。一部の実施形態では、方法は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の少なくとも第一、第二、第三、および第四の対象への連続的同時投与を含む。一部の実施形態では、対象への、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの第一の用量、および免疫チェックポイント阻害剤の第一の用量の同時投与、およびウイルスとチェックポイント阻害剤の少なくとも１回のその後の連続的同時投与の後、対象への少なくとも１用量のチェックポイント阻害剤単独の投与が行われる。一部の実施形態では、方法は、剤の連続的同時投与の間に１〜３週間の間隔を含み、好ましくは約１週、約２週、または約３週の間隔を含む。

本出願は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍内投与が、（ｉ）宿主の免疫細胞（例えば腫瘍浸潤Ｔ細胞）を腫瘍へと惹きつけること、および（ｉｉ）腫瘍細胞においてＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴを含むいくつかのチェックポイントタンパク質の発現を誘導し、それにより腫瘍細胞を、チェックポイントタンパク質の阻害剤を用いた並行療法に対して感受性化させることを実証する。

ゆえに一部の態様において、その発現レベルに基づきヒト癌患者が本明細書に記載される併用療法を用いた治療に選択するために、これらのチェックポイントタンパク質のうちの１つまたは複数の発現レベルはバイオマーカーとして使用する。一部の実施形態では、発現は、タンパク質レベルの測定用の任意のアッセイを使用して測定することができる。一部の実施形態では、タンパク質発現を、例えばＦＡＣＳまたはＮａｎｏｔｒｉｎｇアッセイなどのアッセイを使用して測定することができる。

関連実施形態では、治療の必要のあるヒトは、チェックポイントタンパク質を発現していない腫瘍を有するヒト（例えばチェックポイント阻害剤に不応性の対象）、または比較的低レベルでチェックポイントタンパク質を発現する腫瘍を有するヒトであり、この場合、併用療法の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの構成成分が、チェックポイントタンパク質（例えばＰＤ−Ｌ１）の発現を誘導することにより、本組み合わせの免疫チェックポイント阻害剤に対して腫瘍を感受性化させるために有効な量で投与される。一部の実施形態では、ヒトは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３および／もしくはＴＩＧＩＴを発現しない、またはこれらのチェックポイントタンパク質のうちの１つまたは複数を比較的低レベルで発現する腫瘍を有してもよく、また腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３および／またはＴＩＧＩＴの阻害剤に対し、腫瘍を感受性化させるのに有効な量で投与される。他の関連実施形態では、チェックポイントタンパク質のレベルは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の併用療法の投与前に、腫瘍中で測定され、そして併用療法は、腫瘍中でチェックポイントタンパク質が発現していない、または比較的低レベルで発現していることが決定された場合に対象に投与される。他の関連実施形態では、チェックポイント阻害剤に対して腫瘍を感受性化させる方法が提供され、当該方法は、腫瘍を有するヒトに対し、腫瘍においてチェックポイントタンパク質の発現を誘導するために有効な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの量を投与し、それと並行してチェックポイント阻害剤を当該ヒトに対して投与することを含む。一部の態様では、チェックポイントタンパク質を発現しない、またはチェックポイントタンパク質を比較的低レベルで発現する腫瘍とは、腫瘍サンプルの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって評価したときに、チェックポイントタンパク質が陽性の腫瘍細胞株の５０％未満、２５％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．５％未満であることを意味する。例えば、Ｉｌｉｅｅｔａｌ．，ＶｉｒｃｈｏｗｓＡｒｃｈ，４６８（５）：５１１−５２５（２０１６）を参照のこと。一部の態様では、ヒトは、非小細胞肺癌、胃癌、腎細胞癌、膵臓癌、または大腸癌を有する。

さらに他の関連実施形態では、治療の必要のあるヒトは、免疫学的に「冷たい（ｃｏｌｄ）」腫瘍を有するヒトであり、これはその腫瘍が、腫瘍微小環境において免疫細胞が本質的に、または比較的に存在しないことを意味する。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた治療は、免疫細胞（例えばＴ細胞）を腫瘍へと惹きつけ、かつ並行投与されたチェックポイント阻害剤と相乗的に作用して、腫瘍を治療する。「冷たい（ｃｏｌｄ）」腫瘍は、当分野に公知の方法により特定されてもよく、そのような方法としては、限定されないが、腫瘍中心および浸潤辺縁での例えばＣＤ３およびＣＤ８などの免疫マーカーに対する単一系統またはマルチプレックスな免疫組織化学法（ＩＨＣ）、表現型決定のためのフローサイトメトリー法、腫瘍組織の遺伝子解析、腫瘍組織のＲＮＡプロファイリング、および／または血清中のサイトカインプロファイリングが挙げられる。

本組み合わせの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤は、並行して（例えば同時に）投与され、そしてそれらは同じ製剤の一部として、または異なる製剤中で、投与されてもよい。同時（または並行）投与とは、組み合わせパートナーの各々の第一の用量が、同時に、またはほぼ同時に（相互に対して２４時間以内、好ましくは相互に対して１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２時間以内、または１時間以内に）投与されることを意味し、そして組み合わせパートナーの各々のうちの少なくとも１つのその後の用量は、同時に、またはほぼ同時に投与されることが好ましい。ゆえに１つの態様では、本明細書に記載される併用療法は、チェックポイント阻害剤の第一の用量と同時投与される、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの第一の用量を含み（例えば、併用療法を用いた対象の治療は必然的に少なくとも第一の投与を含み、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤は対象に同時に投与される）、そして腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の少なくとも１、２、３、４回またはそれ以上の追加の連続的な同時投与をさらに含むことが好ましい。ゆえに薬剤の組み合わせを用いた並行治療レジメンは、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、またはそれ以上の連続的な同時投与される剤の用量を含んでもよい。好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の連続的に同時投与される用量の間隔は、約１日〜約３週、またはその間の任意の間隔の範囲であり、例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、または２１日である。いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の連続的に同時投与される用量の間隔は、約１週または約２週である。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤の用量の少なくとも１回の最初の同時投与の後、１つまたは複数の用量のチェックポイント阻害剤単独が対象に投与されてもよい。

さらに他の態様では、本発明は、活性剤として本明細書に記載される腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせを、本明細書に記載される癌の治療および／または予防における同時使用のための説明書とともに含有する商用パッケージを提供する。好ましい態様では、商用パッケージは、活性剤としてＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｗｙｅｔｈ株またはＬｉｓｔｅｒ株のワクシニアウイルスと、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴまたはＣＴＬＡ４の阻害剤との組み合わせを含む。

一部の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて腫瘍を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、（ａ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および（ｂ）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤を含む組み合わせを当該ヒトに並行投与することを含む。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、静脈内投与を介して投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、動脈内投与を介して投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、腹腔内投与を介して投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内投与を介してのみ送達される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは静脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは動脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍中の免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導するのに有効な量で投与される。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴから選択される。一部の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて腫瘍を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、（ａ）腫瘍中の免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導するのに有効な量の複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および（ｂ）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤、を含む組み合わせを当該ヒトに並行投与することを含む。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＩＶ投与される。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴから選択される。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−Ｌ１である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＬＡＧ３である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＴＩＧＩＴである。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＴＩＭ３である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、固形癌である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、大腸癌である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、腎細胞癌である。

２重組み合わせ治療の方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合するモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合するモノクローナル抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびランブロリズマブからなる群から選択される。

２重組み合わせ治療の方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、ＣＴＬＡ−４に選択的に結合するモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４に選択的に結合するモノクローナル抗体は、イピリムマブおよびトレメリムマブからなる群から選択される。

２重組み合わせ治療の方法の一部の実施形態では、腫瘍は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の前に、免疫チェックポイントタンパク質を発現していないか、または比較的低いレベルで免疫チェックポイントタンパク質を発現している。

２重組み合わせ治療の方法の一部の実施形態では、当該方法は、その組み合わせの投与前に、腫瘍における免疫チェックポイントタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む。

一部の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて腫瘍を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、（ａ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、（ｂ）ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、ならびに（ｃ）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤、を含む組み合わせを当該ヒトに並行投与することを含む。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、静脈内投与を介して投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、動脈内投与を介して投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、腹腔内投与を介して投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内投与を介してのみ送達される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは静脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは動脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて腫瘍を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、（ａ）腫瘍中の免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導するのに有効な量の複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、（ｂ）ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、ならびに（ｃ）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤、を含む組み合わせを当該ヒトに並行投与することを含み、当該複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内に投与される。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴから選択される。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＬＡＧ３である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＴＩＧＩＴである。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＴＩＭ３である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、固形癌である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、大腸癌である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、腎細胞癌である。

３重組み合わせ治療の方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合するモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合するモノクローナル抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびランブロリズマブからなる群から選択される。

３重組み合わせ治療の方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、ＣＴＬＡ−４に選択的に結合するモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４に選択的に結合するモノクローナル抗体は、イピリムマブおよびトレメリムマブからなる群から選択される。

３重組み合わせ治療の方法の一部の実施形態では、腫瘍は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の前に、免疫チェックポイントタンパク質を発現していないか、または比較的低いレベルで免疫チェックポイントタンパク質を発現している。

３重組み合わせ治療の方法の一部の実施形態では、当該方法は、その組み合わせの投与前に、腫瘍におけるチェックポイントタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む。

本発明の他の実施形態は、本出願全体を通して検討される。本発明の１つの態様に関して検討される実施形態はすべて、本発明の他の態様にも同様に適用されるものであり、逆もまた然りである。実施例の項における実施形態は、本発明のすべての態様に適用可能な本発明の実施形態であると理解される。

以下の図面は本出願の一部を成しており、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態に関する詳細な説明と併せてこれらの図面のうちの１つまたは複数を参照することにより、さらに理解され得る。

図１Ａ：ｍＪＸ−５９４の腫瘍内（ＩＴ）注射と、腹腔内投与される抗ＰＤ−１チェックポイント阻害抗体を用いた並行併用治療レジメンを図示するチャートである。８週齢のＢＡＬＢ／ｃの免疫能力があるマウスに、５×１０^５個のＲｅｎｃａ（腎癌）細胞を注射した。腫瘍のサイズが５０ｍｍ^３以上になった時点（０日目）で、マウスは、ＰＢＳ（対照、０、３、６および９日目）、抗ＰＤ−１抗体単独（０、３、６および９日目）、ｍＪＸ−５９４単独（０、２および４日目）、または抗ＰＤ−１とｍＪＸ−５９４の並行送達（０、２および４日目にそれらの剤を同時投与した後に、６日目に抗ＰＤ−１単独投与し、そしてｍＪＸ−５９４は１×１０^７ｐｆｕで腫瘍内（ＩＴ）投与され、抗ＰＤ−１は１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ＩＰ）投与された）を用いて治療された。図１Ｂ：８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＲＥＮＣＡ細胞（２×１０^６個の細胞）を１００μｌのＰＢＳ中で、左腎の被膜下に注射した。移植後１０日目に、Ｒｅｎｃａ腫瘍（ＩＶＩＳ（登録商標）スペクトラムインビボイメージングシステムを用いて可視化されたときに５０ｍｍ^３〜１００ｍｍ^３）を担持するマウスに、示されるレジメンに従い、（ｉ）ＰＢＳ（対照）、（ｉｉ）ワクシニアウイルス（ＪＸ−９２９）単剤療法（６×１０^７ＰＦＵを移植後１０、１１および１２日目に合計３用量）、（ｉｉｉ）抗ＰＤ１単剤療法（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社（ニューハンプシャー州ＷｅｓｔＬｅｂａｎｏｎ）、１００μｌ）（移植後１０、１１および１２日目に合計３用量）、または（ｉｖ）ＪＸ９２９＋抗ＰＤ１の並行治療（それぞれ移植後１０、１１および１２日目に投与され、ＪＸ−９２９は午前に投与され、ＩＣＩは同じ日の午後に９時間の間隔で投与された）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ）で治療を行った。図１Ｃ：５０ｍｍ^３を越えるＲｅｎｃａ腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃマウスに、示される治療レジメンに従い、ｍＪＸ５９４（０、３、６および９日目のそれぞれで１×１０^７）またはＰＢＳ対照の４用量を腫瘍内で治療された。

図２Ａ：腫瘍体積に対する、図１Ａに記載される治療レジメンの効果を示すグラフ。並行組み合わせ治療（ＰＤ１＋ｍＪＸ５９４）は、他のすべての治療群と比較して、腫瘍増殖を有意に抑制した（移植後１８日の後）。図２Ｂ：図１Ａに記載される各治療群における腫瘍重量を示す写真とグラフ。並行組み合わせ治療（ＰＤ１＋ｍＪＸ５９４）は相乗的に効果を発揮して、いずれの単剤療法と比較しても著しく腫瘍体積を減少させた。

ＩＴｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１を用いた並行組み合わせ治療は、対照およびいずれの剤を用いた単独治療と比較しても腫瘍内Ｔ細胞浸潤を著しく増加させた。マウスは図１に示される投与レジメンに従い治療された。図３Ａ：対照群および単剤療法群と比較して、並行組み合わせ治療群において、腫瘍周辺領域および腫瘍内領域の両方においてＣＤ８Ｔ細胞浸潤が著しく増加していることを示す画像。図３Ｂ：対照群およびいずれの単剤療法群と比較しても、並行組み合わせ治療群において、腫瘍周辺および腫瘍内のＣＤ８Ｔ細胞浸潤が著しく増加していることを示すグラフ。

ＩＴｍＪＸ−５９４および抗ＰＤ−１を用いた並行組み合わせ治療は、腫瘍内のＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートする。マウスは図１に示される投与レジメンに従い治療された。図４Ａ：対照群およびいずれの単剤療法群と比較しても、並行組み合わせ治療群において、腫瘍周辺領域および腫瘍中心領域の両方でＰＤ−Ｌ１の発現レベルが著しく増加していることを示す画像（ＰＤ−Ｌ１染色）。図４Ｂ：対照群およびいずれの単剤療法群と比較しても、並行組み合わせ治療群において、腫瘍内のアポトーシスが著しく増加していることを示す画像。

ＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が、対照群と比較して、並行組み合わせ治療群において増加している。図５Ａ：各治療群の腫瘍におけるＣＤ８およびＧｒ−１に対して陽性を示すフローサイトメトリーのグラフである。いずれの単剤療法群と比較しても、並行組み合わせ治療群の腫瘍は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加が示されている。ＭＤＳＣの増加も、いずれかの単剤療法と比較して示されている。図５Ｂ：棒グラフは、フローサイトメトリーの結果を示す。同上。

ｍＪＸ−５９４のＩＴ注射と、腹腔内送達される抗ＰＤ１（＋／−抗ＣＴＬＡ４）チェックポイント阻害抗体を用いた組み合わせ治療レジメンを図示するチャートである。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に、５×１０^５個のＲｅｎｃａ細胞を皮下注射した。腫瘍のサイズが５０〜１００ｍｍ^３に達した時点（０日目）で、治療を開始した。０日目、マウス（Ｒｅｎｃａ腫瘍を担持する）は、ＰＢＳ（対照）、連続送達されるｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ−１抗体の組み合わせ、並行送達されるｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ−１の組み合わせ、および並行送達されるｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ−１＋抗ＣＴＬＡ４の３重の組み合わせを用いて治療された。ｍＪＸ−５９４は１×１０^７ｐｆｕでＩＴ投与され、抗ＰＤ−１は１０ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与され、そして抗ＣＴＬＡ４は４ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与された。

腫瘍体積に対する、図６に記載される治療レジメンの効果を示すグラフ。αＰＤ１＋ｍＪＸ５９４およびαＰＤ１＋ｍＪＸ５９４＋αＣＴＬＡ４を用いた並行組み合わせ治療は、すべての他の治療群と比較して、（治療後）６日目から有意に腫瘍増殖を抑制した。並行組み合わせ治療群は両方とも、対照群および連続組み合わせ治療群（ｍＪＸ５９４→αＰＤ１）と比較して著しく腫瘍増殖を遅延させ、これでは腫瘍退縮は、１２日目から観察された。

ｍＪＸ−５９４のＩＴ注射と、腹腔内送達される抗ＣＴＬＡ４チェックポイント阻害抗体を用いた組み合わせ治療レジメンを図示するチャートである。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に、５×１０^５個のＲｅｎｃａ細胞を皮下注射した。腫瘍のサイズが５０〜１００ｍｍ^３に達した時点（０日目）で、治療を開始した。０日目、マウス（Ｒｅｎｃａ腫瘍を担持する）は、ＰＢＳ（対照）、抗ＣＴＬＡ単独、ｍＪＸ−５９４単独、連続送達されるｍＪＸ−５９４＋ＣＴＬＡ４の組み合わせ、および並行送達されるｍＪＸ−５９４＋ＣＴＬＡ４の組み合わせを用いて治療された。ｍＪＸ−５９４は１×１０ｐｆｕでＩＴ投与され、抗ＣＴＬＡ４は４ｍｇ／ｋｇで投与された。

腫瘍体積に対する、図８に記載される治療レジメンの効果を示すグラフ。ｍＪＸ５９４＋αＣＴＬＡ４を用いた並行組み合わせ治療は、ｍＪＸ５９４＋αＣＴＬＡ４を用いた連続組み合わせ治療およびいずれの単剤療法と比較して著しく腫瘍増殖を遅延させた。

ＩＴｍＪＸ５９４および抗ＣＴＬＡ４の並行的な組み合わせは、連続的な組み合わせ、およびいずれの単剤療法と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を著しく増加させ、ＭＤＳＣレベルを減少させた。図１０Ａ：各治療群の腫瘍におけるＣＤ８およびＧｒ−１に対する陽性を示すフローサイトメトリーのグラフである。連続治療群、およびいずれの単剤療法群と比較して、並行組み合わせ治療群の腫瘍は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加と、ＭＤＳＣの有意な減少が示されている。図１０Ｂ：棒グラフは、フローサイトメトリーの結果を示す。同上。

ｍＪＸ−５９４の静脈内（ＩＶ）注射と、腹腔内送達される抗ＰＤ１チェックポイント阻害抗体を用いた組み合わせ治療レジメンを図示するチャートである。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に、５×１０^５個のＲｅｎｃａ細胞を皮下注射した。腫瘍のサイズが５０〜１００ｍｍ^３に達した時点（０日目）で、治療を開始した。０日目、マウス（Ｒｅｎｃａ腫瘍を担持する）は、ＰＢＳ（対照）、抗ＰＤ１単独、ｍＪＸ−５９４単独、または並行送達されるｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ１を用いて治療された。ｍＪＸ−５９４は２×１０^７ｐｆｕでＩＶ投与され、抗ＰＤ１は１０ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与された。

腫瘍体積に対する、図１１に記載される治療レジメンの効果を示すグラフ。ｍＪＸ５９４ＩＶ＋αＰＤ１を用いた並行組み合わせ治療は、ｍＪＸ５９４単独を用いた治療よりも劣っており、αＰＤ１単独での治療と同じであった。

３日ごとに投与される１×１０^７ｐｆｕのｍＪＸ５９４ｍＪＸ５９４（ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の破壊と、マウスＧＭ−ＣＳＦの挿入を含むように操作されたＷｙｅｔｈワクシニアウイルス）の４つの用量を用いて腫瘍内で治療されたＲｅｎｃａ腫瘍担持マウスにおける免疫チェックポイントタンパク質の倍数変化（治療前レベルに対する）を示すチャート。

ｍＪＸ５９４注射の回数と、腫瘍増殖阻害に関するデータを提示する。ｍＪＸ５９４を用いた最適な免疫療法を見出すために、Ｒｅｎｃａ腎癌において様々な用量数を検証した。腫瘍増殖は、ｍＪＸ５９４の用量数が増加するにつれ減少した。

ｍＪＸ５９４治療後のＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍内リクルートを示す画像。

ｍＪＸ５９４治療後のＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍内リクルートを示す画像。ｍＪＸ５９４治療された腫瘍において、リンパ濾胞と類似したＣＤ８＋リンパ細胞の凝集が観察された。

ｍＪＸ５９４は腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させ、エフェクター機能を強化させることを示すデータ。ＣＤ８＋Ｔ細胞と制御性Ｔ細胞の比率は、ｍＪＸ５９４治療後に上昇した。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＣＯＳおよびグランザイムＢの発現は、ｍＪＸ５９４治療後に増加した。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の数はリンパ細胞分画において同時に拡大されたが、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞と制御性Ｔ細胞の比率は、対照と比較してさらに上昇した。さらに共刺激およびＴ細胞活性化のマーカーであるＩＣＯＳおよびグランザイムＢ（ＧｚＢ）の発現もＣＤ８＋Ｔ細胞において増加した。

ｍＪＸ５９４治療は、骨髄細胞（Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋↑、Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃｉｎｔ↓）を再分極させたことを示すデータ。ｍＪＸ５９４は、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋単球性骨髄細胞を増加させ、またＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃｉｎｔ顆粒球性骨髄細胞を減少させる。骨髄細胞分画のサブセット解析において、本発明者らは、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋単球性骨髄細胞の増加と、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃｉｎｔの顆粒球性骨髄細胞の減少を見出した。これは、ｍＪＸ５９４投与により単球性細胞と顆粒球性細胞の比率が大きく増加したことを示唆する。

枯渇抗体実験を伴う治療の概略を示すデータ。免疫系のどの構成要素がｍＪＸ５９４治療後の治療効果をもたらしているかを解明するために、腫瘍増殖と抗癌免疫におけるＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＧＭ−ＣＳＦの枯渇の影響を検証した。

Ｔ細胞またはＧＭ−ＣＳＦを枯渇させることで、ｍＪＸ５９４の抗癌効果が大きく無効化されたことを示すデータ。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方とも、ｍＪＸ５９４治療の抗癌効果において必須のメディエーターであり、ＧＭ−ＣＳＦも免疫療法の利益をもたらし得る。ｍＪＸ５９４の単剤治療でも効率的な腫瘍阻害が検出されたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかの枯渇は、治療効果の消滅をもたらした。

ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＧＭ−ＣＳＦの枯渇が、ｍＪＸ５９４後の腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を減少させることを示すデータ。ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇が、腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞を減少させたことから、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に関与していたことが示唆される。ＧＭ−ＣＳＦの枯渇は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を減少させた。ｍＪＸ５９４注射を伴うＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は、腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞を減少させたことから、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に関与していたことが示唆される。対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇はＣＤ４＋Ｔ細胞に有意な変化を誘導しなかった。このことから、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に影響を与えなかったことが示唆される。これらのデータから、ｍＪＸ５９４を用いた治療は、抗癌免疫の指標であるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のプライミングを誘導したことが示される。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤は、抗癌効果の指標である。

ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１、およびαＣＴＬＡ−４の３重組み合わせ治療に関する実験の概要。ｍＪＸ５９４

ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１、およびαＣＴＬＡ−４の３重組み合わせが、腫瘍増殖を著しく遅延させたことを示すデータ。注目すべきは、ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１およびαＣＴＬＡ−４の３重組み合わせが一部のマウス（３７．５％）においてＲｅｎｃａ腫瘍の完全退縮をもたらした点である。対照と比較して、αＰＤ−１とαＣＴＬＡ−４の２重組み合わせは１４．５％だけ腫瘍増殖を遅延させ、ｍＪＸ５９４の単剤療法は３６．９％だけ腫瘍増殖を阻害し、３重組み合わせは７６．５％の腫瘍増殖阻害を示した。注目すべきは、ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１およびαＣＴＬＡ−４の３重組み合わせは、完全腫瘍退縮（完全奏効率：３７．５％）をもたらした点であり、いずれの２重組み合わせまたはｍＪＸ５９４単剤療法で治療された腫瘍でも完全腫瘍退縮は観察されなかった。

ｍＪＸ５９４、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４の３重組み合わせ免疫療法が、全体的な生存を延長させることを示すデータ。３重併用療法で治療されたマウスは、著しい抗癌治療効果を示した。さらに、３重併用療法により誘導されたこれらの強力な抗癌効果を、長期間の生存利益に変換することができたのかどうかを確認するために、腫瘍担持マウスの生存解析を実施した。３重併用療法で治療されたマウスは、単剤療法または２重組み合わせ免疫療法と比較して生存利益を示した。

ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１、およびαＬＡＧ３の３重組み合わせ治療に関する実験の概要。

ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１、およびαＬＡＧ３の３重組み合わせが、腫瘍増殖を中程度に遅延させたことを示すデータ。この実験において、３重組み合わせは、ｍＪＸ５９４とαＰＤ−１の２重組み合わせと比較して統計的に有意な差を示さなかった。対照と比較して、ｍＪＸ５９４とαＰＤ−１の２重組み合わせは４１．９％まで腫瘍増殖を遅延させ、αＬＡＧ３の単剤療法は５．７％まで腫瘍増殖を阻害した。３重組み合わせは、３０．１％の腫瘍増殖阻害を示した。

ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１、およびαＬＡＧ３の３重組み合わせが、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を増加させたことを示すデータ。リンパ細胞分画のサブセット解析により、２重組み合わせ治療および３重組み合わせ治療で腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数が増加したことが明らかとなった。

ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１、およびαＴＩＧＩＴの３重組み合わせ治療に関する実験の概要。

ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１、およびαＴＩＧＩＴの３重組み合わせが、腫瘍増殖を中程度に遅延させたことを示すデータ。３重組み合わせは、Ｒｅｎｃａ腫瘍においてｍＪＸ５９４とαＰＤ−１の２重組み合わせと比較して有意な差を示さなかった。

ｍＪＸ５９４、αＰＤ−１、およびαＴＩＧＩＴの３重組み合わせが、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させたことを示すデータ。リンパ細胞分画のサブセット解析により、２重組み合わせ治療および３重組み合わせ治療で腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数が増加したことが明らかとなった。

ｍＪＸ５９４が、抗ＰＤ１治療と相乗効果を発揮して、結腸癌の増殖を遅延させたことを示すデータ。ＩＣＩ単剤療法に対する抵抗性を克服するために、ＣＴ２６結腸癌モデルにおいてｍＪＸ５９４と免疫チェックポイント遮断剤の組み合わせ効果を評価した。このモデルにおいて、αＰＤ−１単剤療法は腫瘍増殖に対してほとんど効果を示さず、ｍＪＸ５９４単剤療法は中程度の腫瘍増殖阻害を示した。しかしながらｍＪＸ５９４とαＰＤ−１抗体の２重療法は腫瘍増殖を著しく遅延させた。

ｍＪＸ５９４と抗ＰＤ１治療の組み合わせが、腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させたことを示すデータ。腫瘍増殖阻害とともに、顕微鏡解析では、併用療法で治療された腫瘍の周辺領域および中心領域の両方においてＣＤ８＋Ｔ細胞の著しいリクルートが示された。

ｍＪＸ５９４（ＪＸ）は、免疫抑制性のＴＭＥにおいて免疫関連遺伝子の動的な変化を生じさせる。Ｒｅｎｃａ腫瘍をＢＡＬＢ／ｃマウスにｓ．ｃ．移植し、腫瘍が５０ｍｍ^３を越えたときに１×１０^７ｐｆｕのｍＪＸ−５９４の単回ｉ．ｔ．注射で治療した。（Ａ）ＪＸで治療されたＲｅｎｃａ腫瘍の代表的な画像。ワクシニアウイルス（ＶＶ）、ＣＤ３１、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、およびＰＤ−Ｌ１で染色された腫瘍。（Ｂ）ワクシニアウイルス^＋、ＣＤ３１^＋血管、ＣＤ８^＋細胞障害性Ｔ細胞、ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞、およびＰＤ−Ｌ１^＋細胞の発現の定量。（Ｃ）ＪＸ治療後の腫瘍微小環境におけるＶＶ、ＣＤ８およびＰＤ−Ｌ１の経時的変化。（Ｄ）ＪＸ治療後のＴＭＥ内の様々な細胞型（緑）においてアップレギュレートされたＰＤ−Ｌ１発現（赤）を示す画像。ＰＤ−Ｌ１の発現は主にＰａｎ−ＣＫ^＋腫瘍細胞（矢頭）で観察されたが、一部のＣＤ１１ｂ^＋骨髄細胞（矢頭）も稀にＰＤ−Ｌ１を発現していた一方で、ＣＤ３^＋Ｔ細胞は発現しなかった事に注意されたい。（Ｅ）ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ免疫関連遺伝子発現のヒートマップ。赤色および緑色はそれぞれアップレギュレートとダウンレギュレートを表す。（Ｆ）ＪＸ治療された腫瘍における遺伝子発現を示すＶｏｌｃａｎｏプロット。免疫刺激に関連する遺伝子が示されている。赤線はｐ＜０．０５を示す。（Ｇ）阻害性免疫チェックポイント（ＩＣ）、アゴニスト性ＩＣ、Ｔｈ１反応、Ｔｈ２反応、ＴＭＥ、および骨髄細胞に関連する遺伝子発現の比較。別段の指定が無ければ、各群に対し、ｎ＝５である。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。スケールバーは、５０μｍ。一部のデータは図１３にも示されている。

ＪＸは腫瘍増殖を抑制し、Ｔ細胞浸潤の増加と骨髄細胞の変調があった。Ｒｅｎｃａ腫瘍を担持するマウスに、ＰＢＳまたは１×１０^７ｐｆｕのＪＸを用いて１〜３回、ｉ．ｔ．治療した。（Ａ〜Ｂ）ＪＸで治療されたマウスにおける腫瘍増殖の比較。経時的な平均（Ａ）および個体ごと（Ｂ）の腫瘍増殖曲線。（Ｃ〜Ｄ）ＪＸで１〜３回治療された腫瘍の腫瘍周辺領域または腫瘍内領域におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の代表的な画像（Ｃ）および比較（Ｄ）。（Ｅ）腫瘍中のＣＤ８^＋Ｔ細胞分画およびＣＤ４^＋Ｔ細胞分画を示す代表的なフローサイトメトリーのプロット。（Ｆ）フローサイトメトリーから算出された、腫瘍１グラム当たりのＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の絶対数。（Ｇ）ＪＸの３重投与で治療された腫瘍中のＣＤ４５^＋、ＣＤ８^＋、およびＣＤ４^＋の分画の比較。（Ｈ〜Ｊ）腫瘍中のＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ２５^＋（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率、ＣＤ８^＋ＩＣＯＳ^＋、およびＣＤ８^＋ＧｚＢ^＋の分画の比較。（Ｋ）腫瘍中のＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^＋骨髄細胞分画の比較。（Ｌ）腫瘍中のＣＤ１１ｂ^＋骨髄細胞分画を示す代表的なフローサイトメトリーのプロット。（Ｍ）腫瘍中のＣＤ１１ｂ^＋に対する、Ｌｙ６Ｇ⁻Ｌｙ６Ｃ^＋単球性骨髄細胞の分画、Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｉｎｔ顆粒球性骨髄細胞、および単球性／顆粒球性の比率の比較。別段の指定が無ければ、各群に対し、ｎ＝５〜６である。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ＪＸｘＩに対して^＃ｐ＜０．０５；ＪＸｘ２に対して^＄ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。スケールバーは、１００μｍ。一部のデータは図１９〜２１にも示されている。

ＪＸの腫瘍内注射は、局所および離れた腫瘍の両方においてＣＤ８＋リンパ細胞浸潤を誘導する。マウスの右脇腹にＲｅｎｃａ腫瘍をｓ．ｃ．注射し、左わき腹にＲｅｎｃａ腫瘍またはＣＴ２６腫瘍をｓ．ｃ．注射した。矢印はｉ．ｔ．ＪＸ治療を示す。（Ａ）腫瘍移植と治療の模式図。およびＪＸ注射されたＲｅｎｃａ腫瘍と、注射されていないＲｅｎｃａ腫瘍の増殖曲線。（Ｂ〜Ｃ）ＪＸ注射された腫瘍と注射されていない腫瘍におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞（緑）の代表的な画像（Ｂ）および比較（Ｃ）。（Ｄ）移植と治療の模式図。およびＪＸ注射されたＲｅｎｃａ腫瘍と、注射されていないＣＴ２６腫瘍の増殖曲線。（Ｅ〜Ｆ）ＪＸ注射された、離れた腫瘍におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞（緑）の代表的な画像（Ｅ）および比較（Ｆ）。別段の指定が無ければ、各群に対し、ｎ＝５である。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。スケールバーは、５０μｍ。

抗腫瘍免疫は、ＪＸの治療効果全体において重要な役割を果たしている。マウスにＲｅｎｃａをｓ．ｃ．移植し、そしてｉ．ｔ．ＪＸで治療し、またはＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞もしくはマウスＧＭ−ＣＳＦに対するｉ．ｐ．枯渇抗体（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ）で治療した。（Ａ）治療スキーム。（Ｂ〜Ｃ）ＪＸまたは枯渇抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖の比較。経時的な平均（Ｂ）および個体ごと（Ｃ）の腫瘍増殖曲線。対照に対して^＊ｐ＜０．０５。αＧＭ−ＣＳＦに対して^＄ｐ＜０．０５。（Ｄ〜Ｅ）ＪＸおよび免疫細胞枯渇抗体で治療された腫瘍１グラム当たりのＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｄ）およびＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｅ）の絶対数。別段の指定が無ければ、各群に対し、ｎ＝７〜８である。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ＶＸに対して^＃ｐ＜０．０５；αＧＭ−ＣＳＦに対して^＄ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。

ＪＸとαＰＤ−１の併用療法は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞介在性腫瘍免疫を相乗的に惹起させる。Ｒｅｎｃａ腫瘍担持マウスを、ＰＢＳ、ＪＸ、αＰＤ−１抗体、またはＪＸ＋αＰＤ−１抗体のいずれかで治療した。（Ａ〜Ｂ）ＪＸおよび／またはαＰＤ−１抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖の比較。経時的な平均（Ａ）および個体ごと（Ｂ）の腫瘍増殖曲線。（Ｃ〜Ｄ）ＪＸおよび／またはαＰＤ−１抗体で治療された腫瘍における、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ３１^＋血管、活性化カスパーゼ３（Ｃａｓｐ３）^＋アポトーシス細胞、およびＰＤ−Ｌ１^＋細胞の代表的な画像（Ｃ）ならびに比較（Ｄ）。（Ｅ）ＪＸとαＰＤ−１遮断剤の併用療法による免疫抑制性ＴＭＥの克服を表す略図。別段の指定が無ければ、各群に対し、ｎ＝７である。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ＪＸに対して^＃ｐ＜０．０５；αＰＤ−１に対して^＄ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。スケールバーは、１００μｍ。一部のデータは図１９〜２１にも示されている。

腫瘍内ＪＸおよび全身性ＩＣＩを用いた組み合わせ免疫療法の効果は、治療スケジュールにほとんど影響を受けない。マウスにＲｅｎｃａ腫瘍をｓ．ｃ．移植し、様々なスケジュールでＪＸ＋ＩＣＩを用いて治療した。（Ａ）様々な治療スケジュールを示す略図。矢印はＪＸのｉ．ｔ．送達（赤い矢印）または免疫チェックポイント遮断剤の全身送達（青い矢印）のいずれかを用いた治療を示す。（Ｂ〜Ｃ）異なるタイムスケジュールを使用してＪＸおよびαＰＤ−１抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖の比較。経時的な平均（Ｂ）および個体ごと（Ｃ）の腫瘍増殖曲線。（Ｄ）腫瘍に浸潤しているＣＤ８^＋Ｔ細胞分画およびＣＤ４^＋Ｔ細胞分画を示す代表的なフローサイトメトリーのプロット。（Ｅ〜Ｆ）腫瘍１グラム当たりのＣＤ８^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋ＩＣＯＳ^＋、およびＣＤ８^＋ＧｚＢ^＋の細胞の絶対数の比較。別段の指定が無ければ、各群に対し、ｎ＝７である。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。

ＪＸ、αＰＤ−１、およびαＣＴＬＡ−４抗体の３重組み合わせにより、完全退縮と、生存全体の改善がもたらされる。マウスにＲｅｎｃａ腫瘍をｓ．ｃ．移植し、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４に対する免疫チェックポイント遮断剤の存在下、または非存在下で、ＪＸを用いて治療した。（Ａ〜Ｂ）ＪＸおよび／または免疫チェックポイント遮断剤を用いて治療されたマウスにおける腫瘍増殖の比較。経時的な平均（Ａ）および個体ごと（Ｂ）の腫瘍増殖曲線。（Ｃ）腫瘍サイズにおける、基準値からの最大パーセント変化を示すウォーターフォールプロット。（Ｄ）生存全体に対するカプランマイヤープロット。（Ｅ）腫瘍が完全退縮したマウスにおける、Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞の再チャレンジ後の腫瘍サイズの比較。別段の指定が無ければ、各群に対し、ｎ＝８である。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ＪＸに対して^＃ｐ＜０．０５；αＰＤ−１＋αＣＴＬＡ−４に対して^＄ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。一部のデータは図２３〜２４にも示されている。

自然発生的乳癌モデルにおいて、３重併用療法は腫瘍増殖と転移を遅延させる。ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの誕生後９週から始まる自然発生的乳腺腫瘍において、腫瘍増殖を毎週解析した。サンプルは誕生後１３週に採取した。（Ａ）治療スケジュールを示す略図。矢印は、ＪＸのｉ．ｔ．送達、またはαＰＤ−１抗体とαＣＴＬＡ−４抗体の全身送達のいずれかを用いた治療を示す。（Ｂ）腫瘍の肉眼所見を示す代表的な画像。点線の円は触診可能な乳腺腫瘍結節の境界を定めている。（Ｃ）総腫瘍担持量の比較。腫瘍担持量は、マウス１匹当たりの各腫瘍結節の量を合計することにより算出された。（Ｄ）触診可能な腫瘍結節の数の比較。（Ｅ）各腫瘍結節の体積の比較。ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの各腫瘍結節は、個々のドットとしてプロットされた。（Ｆ）生存全体に対するカプランマイヤー曲線。（Ｇ）腫瘍内領域を示すＨ＆Ｅの腫瘍切片。ＪＸ群およびＪＸ＋Ｐ＋Ｃ群の腺房構造は、早期の浸潤性の低い病変（Ｅａ）であり、周辺乳腺脂肪組織（Ａｄｉ）を伴う明白な境界を示している。一方で、対照群およびＰ＋Ｃ群の浸潤性乳管癌性領域（Ｃａ）は周辺組織を大きく侵し、腫瘍細胞の固形状のシートを形成し、腺房構造は残っていなかった。スケールバーは、２００μｍ。（Ｈ〜Ｊ）腫瘍中のＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＨおよびＩ）およびＣＤ３１^＋腫瘍血管（ＨおよびＪ）の代表的な画像ならびに比較。（Ｋ）Ｈ＆Ｅで染色された代表的な肺切片。矢印は転移病巣を示す。スケールバーは、２００μｍ。（Ｌ）肺切片１つ当たりの転移コロニー数の比較。別段の指定が無ければ、各群に対し、ｎ＝６〜７である。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ＪＸに対して^＃ｐ＜０．０５；αＰＤ−１＋αＣＴＬＡ−４に対して^＄ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。スケールバーは、１００μｍ。

ワクシニアウイルスは離れた腫瘍では検出されない。強固なワクシニアウイルス（ＶＶ）の複製（緑）が右側の注入された腫瘍において観察可能である一方で、ワクシニアウイルスは左側の注入されていない腫瘍では検出されなかった。スケールバーは、１００μｍ。

ＪＸと^ΛＣＴＬＡ−４の併用療法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞介在性腫瘍免疫を相乗的に惹起させる。Ｒｅｎｃａ腫瘍担持マウスを、ＰＢＳ、ＪＸ、αＣＴＬＡ−４抗体、またはＪＸ＋αＣＴＬＡ−４抗体のいずれかで治療した。（Ａ〜Ｂ）ＪＸおよび／またはαＣＴＬＡ−４抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖の比較。経時的な平均（Ａ）および個体ごと（Ｂ）の腫瘍増殖曲線。（Ｃ〜Ｅ）腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣおよびＤ）およびＣＤ３１＋血管（ＣおよびＥ）の画像と比較。（Ｆ〜Ｈ）ＪＸおよび／またはαＣＴＬＡ−４抗体で治療された腫瘍１グラム当たりのＣＤ４５＋免疫細胞（Ｆ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｇ）およびＣＤ４＋細胞（Ｈ）の絶対数。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ＪＸに対して＃ｐ＜０．０５；αＣＴＬＡ−４に対して＄ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。スケールバーは、１００μｍ。

ＪＸは、治療スケジュールに関わらず、^ΛＣＴＬＡ−４の免疫応答を伴う抗癌効果を強化する。（Ａ〜Ｂ）異なるタイミングスキームを使用してＪＸとαＣＴＬＡ−４抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖の比較。経時的な平均（Ａ）および個体ごと（Ｂ）の腫瘍増殖曲線。（Ｃ）腫瘍中の腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞分画およびＣＤ４＋Ｔ細胞分画を示す代表的なフローサイトメトリーのプロット。（Ｄ〜Ｅ）ＪＸおよびαＣＴＬＡ−４抗体で治療された腫瘍１グラム当たりのＣＤ８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ＩＣＯＳ＋、およびＣＤ８＋ＧｚＢ＋の細胞の絶対数。値は平均±ＳＥＭである。対照に対して＊ｐ＜０．０５。ｎｓは有意ではない。一部のデータは図３８にも示されている。

Ｉ．選択された定義
「阻害すること」、「減少すること」、または「予防」という用語、またはこれらの用語のすべての変化形は、特許請求の範囲および／または明細書中で使用される場合、所望の結果を実現する任意の計測可能な低下または完全な阻害を含む。

本明細書において使用される場合、「組み合わせ」という用語は、抗癌剤、すなわち腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および免疫チェックポイント阻害剤の組み合わされた投与を意味し、これらを個別に投与することができ、または区別された量の組み合わせパートナーを用いた異なる固定された組み合わせを使用して投与することができる。「組み合わせ」という用語はまた、同時に投与される組み合わせパートナーを含む「キット」を規定する。好ましくは、組み合わせパートナーの連続的な同時投与の間の時間間隔は、剤の組み合わせが相乗効果を示すように選択される。本明細書において使用される場合、「相乗的な」または「相乗効果」という用語は、本発明に包含される抗癌剤の組み合わせで実現された効果が、抗癌剤、すなわち腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤を単剤療法として使用した場合に生じる効果の合計よりも高いことを意味する。そのような相乗効果は、同じ用量でより高い効果を提供し、かつ／または多剤耐性の確立を予防もしくは遅延させるという点で有益である。

本明細書において使用される場合、「不応性癌」という用語は、抗新生物治療に対し良好に反応し損ねた癌、あるいは抗新生物治療に対し良好に反応した後で再発またはぶり返した癌を指す。したがって本明細書において使用される場合、「治療に不応性の癌」とは、治療に対し良好に反応し損ねた癌、または治療に抵抗性の癌、あるいは治療に対し良好に反応した後で再発もしくはぶり返した癌を意味する。例えばそのような過去の治療は化学療法レジメンである場合があり、またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１もしくはＣＴＬＡ４に特異的に結合するモノクローナル抗体の投与を含む免疫療法レジメンである場合がある。

「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と併せて使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは２以上」という意味とも矛盾しない。

本明細書に置いて検討されるあらゆる実施形態は、本発明の任意の方法および組成に関して実施することができ、そして逆もまた然りであることが意図される。さらに本発明の組成物およびキットを使用して、本発明方法を実施することができる。

本明細書全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために採用されたデバイスまたは方法に関する誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すために明白に示されている場合を除き、または選択肢が相互排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみを指す、ならびに「および／または」を指す定義を支持するものである。

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含むことの任意の形態）、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」（および例えば「有する（ｈａｖｅ、ｈａｓ）」などの有することの任意の形態）、「含むこと（ｉｎｌｕｄｉｎｇ）」（および例えば「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含むことの任意の形態）または「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および例えば「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ，ｃｏｎｔａｉｎ）」などの包含することの任意の形態）という単語は、包括的およびオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法の工程を除外しない。

本発明の他の目的、特性および利点は、以下の詳細な説明から明白となるであろう。しかし当然のことながら詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の特定の実施形態を示してはいるが、例示の目的に対してのみ提供されている。これは本発明の主旨および範囲内での様々な変更および修正がこの詳細な説明から当分野の当業者には明白となるはずだからである。

腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の併用療法が、癌治療において予想外の改善をもたらすことが見出された。剤が並行投与され、そして腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが投与されたとき、それら剤は共同的に、さらには相乗作用的にさえ相互作用し、いずれの剤の単剤投与と比較しても著しく改善された抗腫瘍効果を提供する。驚くべきことにこれらの効果は連続的にこれらの剤が投与された場合は顕著には観察されない。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内に投与されるとき、併用療法は相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスが静脈内投与を介して投与されるとき、併用療法は相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスが腹腔内投与を介して投与されるとき、併用療法は相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、そのとき、腫瘍内投与のみを介して送達される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、そのとき、動脈内投与のみを介して送達される。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内に投与され、チェックポイント阻害剤が全身投与されるとき、併用療法は相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内に投与され、チェックポイント阻害剤が全身投与されるとき、併用療法は相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスが腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤が全身投与されるとき、併用療法は相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスが動脈内投与され、チェックポイント阻害剤が全身投与されるとき、併用療法は相乗効果をもたらす。

腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、およびＴＩＧＩＴなどのチェックポイントタンパク質の発現をヒト腫瘍においてアップレギュレートし、それによりその腫瘍をチェックポイント阻害剤を用いた治療に対して感受性化させ、かつ本併用療法が、本組み合わせのチェックポイント阻害剤を発現する腫瘍を有する患者のみならず、本組み合わせのチェックポイント阻害剤を発現しない腫瘍、またはチェックポイント阻害剤を比較的低レベルで発現する腫瘍を有する患者にも有用であることを支持することがさらに判明した。

いくつかの実施形態において、哺乳類（好ましくはヒト）における癌および／もしくは転移の確立の治療ならびに／または予防における使用のための併用療法が提供され、当該併用療法は、（ｉ）複製能力を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および（ｉｉ）１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を当該哺乳類に並行投与することを含む。一部の実施形態では、複製能力のある腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、複製能力のある腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、静脈内に投与される。一部の実施形態では、複製能力のある腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内でのみ投与される。一部の実施形態では、複製能力のある腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、動脈内でのみ投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスが腹腔内投与を介して投与されるとき、併用療法は相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは動脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。
ＩＩ．腫瘍溶解性ワクシニアウイルス

ワクシニアウイルスは約１９０Ｋｂｐの直線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、かつおよそ２５０個の遺伝子をコードする巨大で複雑なエンベロープ型ウイルスである。ワクシニアは天然痘を根絶させたワクチンとしての役割が有名である。天然痘の根絶後、科学者らは、生物組織への遺伝子送達用ツール（遺伝子療法および遺伝子操作）としてのワクシニアの用途を探索してきた。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質中でのみ複製するのでＤＮＡウイルスの中でもユニークである。それゆえ、その巨大なゲノムはウイルスＤＮＡの複製に必要な様々な酵素とタンパク質をコードする必要がある。複製を行う間、ワクシニアは外膜が異なる以下の数種の感染型を産生する：細胞内成熟型ビリオン（ＩＭＶ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｕｒｅｖｉｒｉｏｎ）、細胞内エンベロープ型ビリオン（ＩＥＶ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｖｅｌｏｐｅｄｖｉｒｉｏｎ）、細胞結合性エンベロープ型ビリオン（ＣＥＶ：ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｅｎｖｅｌｏｐｅｄｖｉｒｉｏｎ）および細胞外エンベロープ型ビリオン（ＥＥＶ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｖｅｌｏｐｅｄｖｉｒｉｏｎ）。ＩＭＶは最も多い感染型であり、宿主間での感染拡大の原因であると考えられている。他方でＣＥＶは細胞から細胞への感染拡大に役割を果たしていると考えられており、ＥＥＶは宿主生体内での長期で広範な播種に重要であると考えられている。

ワクシニアウイルスの任意の公知の腫瘍溶解性株が、本明細書に記載される方法に従いチェックポイント阻害剤とともに並行投与され得る。好ましい実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｌｉｓｔｅｒ株またはＷｙｅｔｈ株であり、最も好ましくはＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株またはＷｙｅｔｈ株である。ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニア株のゲノムは、配列解析されている（アクセッション番号ＡＹ２４３３１２）。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株である。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株である。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｌｉｓｔｅｒ株である。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｗｙｅｔｈ株である。

複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ウイルスの癌選択性を高めるために１つまたは複数の機能性遺伝子を欠くように操作され得る。一部の好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を欠くように操作される。ＴＫ欠損ワクシニアウイルスは、ＤＮＡ合成にチミジン三リン酸塩を必要としており、これにより分裂細胞（特に癌細胞）での優先的な複製がもたらされる。別の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）を欠くように操作され得る。この分泌タンパク質は、感染プロセスの初期に産生され、周辺細胞への感染の下準備をさせるマイトジェンとして作用する。別の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＶＦＧとＴＫ活性の両方を欠くように操作され得る。他の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、宿主インターフェロン（ＩＦＮ）反応の回避に関与する１つまたは複数の遺伝子（Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｂ１８Ｒ、またはＢ８Ｒなど）を欠くように操作され得る。一部の好ましい実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｌｉｓｔｅｒ株またはＷｙｅｔｈ株であり、機能性ＴＫ遺伝子を欠いている。他の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性のＢ１８Ｒ遺伝子および／またはＢ８Ｒ遺伝子を欠くＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｌｉｓｔｅｒ株またはＷｙｅｔｈ株である。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｌｉｓｔｅｒ株またはＷｙｅｔｈ株であり、機能性ＴＫ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株であり、機能性ＴＫ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株であり、機能性ＴＫ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｌｉｓｔｅｒ株であり、機能性ＴＫ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｗｙｅｔｈ株であり、機能性ＴＫ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性Ｂ１８Ｒ遺伝子および／またはＢ８Ｒ遺伝子を欠くＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｌｉｓｔｅｒ株またはＷｙｅｔｈ株である。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性Ｂ１８Ｒ遺伝子および／またはＢ８Ｒ遺伝子を欠くＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株である。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性Ｂ１８Ｒ遺伝子および／またはＢ８Ｒ遺伝子を欠くＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株である。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性Ｂ１８Ｒ遺伝子および／またはＢ８Ｒ遺伝子を欠くＬｉｓｔｅｒ株である。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性Ｂ１８Ｒ遺伝子および／またはＢ８Ｒ遺伝子を欠くＷｙｅｔｈ株である。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｌｉｓｔｅｒ株またはＷｙｅｔｈ株であり、機能性ＴＫ遺伝子を欠き、ならびに機能性Ｂ１８Ｒ遺伝子および／またはＢ８Ｒ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性の１４Ｌ遺伝子および／またはＦ４Ｌ遺伝子を含む。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ケモカインを発現しない（例えばワクシニアウイルスは、ＣＸＣＬ−１１を発現しない）。

一部の実施形態では、本組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性の１４Ｌ遺伝子および／またはＦ４Ｌ遺伝子を含む。

他の実施形態では、本組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ケモカインを発現しない（例えばワクシニアウイルスは、ＣＸＣＬ−１１を発現しない）。

異種配列（例えばサイトカインおよび／または腫瘍抗原をコードする）を、ワクシニアウイルスプロモーターの制御下に置き、かつワクシニアウイルスのゲノムの中へと統合させることができる。あるいは異種配列の発現は、例えばＣｕｒｒｅｎｔＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．）Ｕｎｉｔ１６．１７．４（１９９８）の表１に見出されるものなどのシャトルベクターまたはプラスミドをトランスフェクトすることにより達成することができる。それらはワクシニアウイルスに感染した細胞内にワクシニアプロモーター制御配列を含み、相同組換えにより異種配列を導入する。高レベルの発現が望ましい場合には強力な後期ワクシニアウイルスプロモーターが好ましい。初期段階および中期段階のプロモーターも使用することができる。一部の実施形態では、異種配列は、早期および後期のプロモーターエレメントを含むワクシニアウイルスプロモーターの制御下に置かれる。適切な早期プロモーターとしては限定されないが、４２Ｋ、１９Ｋまたは２５Ｋのポリペプチドをコードするワクシニアウイルス遺伝子のプロモーターが挙げられる。適切な早期後期プロモーターとしては限定されないが、７．５Ｋのポリペプチドをコードするワクシニアウイルス遺伝子のプロモーターが挙げられる。適切な後期プロモーターとしては限定されないが、１１Ｋまたは２８Ｋのポリペプチドをコードするワクシニアウイルス遺伝子のプロモーターが挙げられる。関連実施形態では、異種配列は、ＴＫ配列および／またはＶＧＦ配列を不活性化するためにＴＫ配列および／またはＶＧＦ配列内に挿入される。

一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて腫瘍内投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて静脈内（ＩＶ、または血管内）投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて腹腔内（ＩＰ）投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて動脈内投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内投与を介してのみ送達される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは静脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは動脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。腫瘍内投与は概して、腫瘍塊内への注射または腫瘍関連の脈管系内への注射を伴う。ある態様では、腫瘍は、ウイルス投与の前、またはウイルス投与中に撮像される。血管内投与は概して、血管系への注射を伴い、かつ全身投与の形態である。腹腔内投与は概して、腹腔内（体腔）への注射を伴う。一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて投与され、両方とも例えばＩＶ投与により全身投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて投与され、当該複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内投与され、当該１つまたは複数のチェックポイント阻害剤は例えばＩＶ投与により全身投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて投与され、当該複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腹腔内投与され、当該１つまたは複数のチェックポイント阻害剤は例えばＩＶ投与により全身投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤と組み合わされて投与され、当該複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは動脈内投与され、当該１つまたは複数のチェックポイント阻害剤は例えばＩＶ投与により全身投与される。

本明細書に記載の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、単回投与または複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８回またはそれ以上）で投与され得る。ウイルスは、１×１０^５プラーク形成単位（ＰＦＵ）、５×１０^５ＰＦＵ、１×１０^６ＰＦＵ、少なくとも１×１０^６ＰＦＵ、５×１０^６または約５×１０^６ＰＦＵ、１×１０^７、少なくとも１×１０^７ＰＦＵ、１×１０^８または約１×１０^８ＰＦＵ、少なくとも１×１０^８ＰＦＵ、約または少なくとも５×１０^８ＰＦＵ、１×１０^９または少なくとも１×１０^９ＰＦＵ、５×１０^９または少なくとも５×１０^９ＰＦＵ、１×１０^１０ＰＦＵまたは少なくとも１×１０^１０ＰＦＵ、５×１０^１０または少なくとも５×１０^１０ＰＦＵ、１×１０^１１または少なくとも１×１０^１１、１×１０^１２または少なくとも１×１０^１２、１×１０^１３または少なくとも１×１０^１３の投与量で投与され得る。例えばウイルスは、約１０^６〜１０^１３ｐｆｕ、約１０^７〜１０^１３ｐｆｕ、約１０^８〜１０^１３ｐｆｕ、約１０^９〜１０^１２ｐｆｕ、約１０^８〜１０^１２ｐｆｕ、約１０^７〜１０^１２ｐｆｕ、約１０^６〜１０^１２ｐｆｕ、約１０^６〜１０^９ｐｆｕ、約１０^６〜１０^８ｐｆｕ、約１０^７〜１０^１０ｐｆｕ、約１０^７〜１０^９ｐｆｕ、約１０^８〜１０^１０ｐｆｕ、または約１０^８〜１０^９ｐｆｕの投与量で投与され得る。好ましくはウイルスは、少なくとも１０^７ｐｆｕ、１０^７〜１０^１０ｐｆｕ、１０^７〜１０^９ｐｆｕ、１０^７〜１０^８ｐｆｕ、１０^８〜１０^１０ｐｆｕ、１０^８〜１０^９ｐｆｕまたは１０^９〜１０^１０ｐｆｕの投与量で投与される。

ウイルスの単回用量とは、０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、または２４時間（これらの間のすべての値を含む）にわたり、対象または腫瘍に投与される量を指すことが意図される。用量は経時的に分散されてもよく、または別個の注射によって分散されてもよい。典型的には、複数回用量は、例えば腫瘍の近傍など、概して同一の標的領域に投与される。ある態様では、ウイルス用量は、シリンジまたはシングルポート針もしくは単一針のマルチポートもしくはシリンジに連結されたマルチプロング、またはそれらの組み合わせを備えた注入装置により送達される。ワクシニアウイルスの単回用量が投与されてもよく、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週またはそれ以上を含み得る治療期間にわたり複数回用量が投与されてもよい。例えばワクシニアウイルスは、１、２、３、４、５、６か月またはそれ以上の期間、１日おき、週に１回、１週おき、３週おきに投与されてもよい。

ワクシニアウイルスは、ＥａｒｌａｎｄＭｏｓｓｉｎＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ，１９９４に記載される方法、または国際特許出願公開公報第２０１３／０２２７６４号に記載される方法を使用して増殖されてもよい。これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる。
ＩＩＩ．免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ：ＩｍｍｕｎｅＣｈｅｃｋｐｏｉｎｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）

免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞内にシグナルを送り、Ｔ細胞機能を阻害する特定のリガンドと相互作用する。癌細胞は、その表面上にチェックポイントタンパク質を高レベルに発現させることでこれを活用し、これにより抗癌免疫応答を抑制する。

本明細書に記載の薬剤の組み合わせにおける使用のための免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩとも呼称される）は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害することができる任意の化合物である。阻害には、機能低下ならびに完全遮断が含まれる。特に免疫チェックポイントタンパク質はヒトのチェックポイントタンパク質である。ゆえに免疫チェックポイント阻害剤は、ヒト免疫チェックポイントの阻害剤であることが好ましい。

チェックポイントタンパク質としては限定されないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１（ならびにそのリガンドのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴおよび／またはＩＤＯが挙げられる。ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３およびＫＩＲを含む経路は当分野において、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１依存性の経路に類似した免疫チェックポイント経路を構成すると認識されている（例えばＰａｒｄｏｌｌ，２０１２，ＮａｔｕｒｅＲｅｖＣａｎｃｅｒ１２：２５２−２６４；Ｍｅｌｌｍａｎｅｔａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ４８０：４８０−４８９を参照のこと）。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１（ならびにそのリガンドのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴおよび／またはＩＤＯの阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴおよび／またはＴＩＭ３の阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１の阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１の阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４の阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＧＩＴの阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３の阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ３の阻害剤である。

一部の実施形態では、本組み合わせの免疫チェックポイント阻害剤は、抗体である。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、天然抗体および操作された抗体、ならびに全長抗体、または例えば標的の免疫チェックポイントもしくはエピトープなどに結合することができるその機能性断片もしくはアナログ（例えば抗原結合部分を保持している）を包含する。本明細書に記載の方法に従う使用のための抗体は、限定されないが、ヒト、ヒト化、動物またはキメラを含む任意の起源由来のものであってもよく、そして任意のアイソタイプのものであってもよく、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４のアイソタイプであり、さらにグリコシル化されていても、非グリコシル化されていてもよい。抗体という用語は、その抗体が本明細書に記載の結合特異性を呈する限りにおいて、二特異性抗体または多特異性抗体も含む。

ヒト化抗体とは、そのタンパク質配列が、ヒト抗体との類似性を高めるように改変された、非ヒト（例えばマウス、ラットなど）の抗体を指す。キメラ抗体とは、１つの種の１つまたは複数のエレメントと、別の種の１つまたは複数のエレメントを備えた抗体を指し、例えばヒトイムノグロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を備えた非ヒト抗体などがある。

多くの抗体の型を、本発明の組み合わせにおける使用のために操作することができ、その代表的な例としては、Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨＩドメインからなる一価断片）、Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域で少なくとも１つのジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を備えた二価断片）、Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨＩドメインからなる）、Ｆｖ断片（抗体の１つのアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる）、ｄＡｂ断片（単一可変ドメイン断片（ＶＨまたはＶＬドメイン）からなる）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（ＶＬおよびＶＨの２つのドメインのＦｖ断片を備え、それらは共に融合され、最後に単一タンパク質鎖を形成するためのリンカーを含む）が挙げられる。

一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤（ＩＣＩとも呼称される）は、以下からなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片である：ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ。特に好ましい実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３またはＴＩＧＩＴと少なくとも部分的に拮抗することができるモノクローナル抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、Ｂ７−Ｈ４に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＴＩＭ３に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＧＡＬ９に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＫＩＲに特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＢＴＬＡに特異的に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本併用療法の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体またはその断片である。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、およびＣＴＬＡ−４阻害剤、好ましくはＣＴＬＡ−４に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体を含む。完全ヒトＣＴＬＡ−４核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＬＩ５００６に見出すことができる。ＣＴＬＡ４に特異的に結合するモノクローナル抗体としては限定されないが、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）；ＢＭＳ社）およびトレメリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ社）、ならびにそれらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２０１９９４号、同第２００２／００３９５８１号および同第２００２／０８６０１４号に開示される抗体、およびそれらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、同第６，９８４，７２０号、同第６，６８２，７３６号、同第６，２０７，１５６号、同第５，９７７，３１８号、同第６，６８２，７３６号、同第７，１０９，００３号、同第７，１３２，２８１号および同第８，４９１，８９５号に開示される抗体、またはこれらの抗体のうちのいずれかの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体が挙げられる。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、およびＰＤ−１阻害剤、好ましくはＰＤ−１に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体を含む。ヒトＰＤ−１の完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｕ６４８６３およびＮＰ＿００５００９．２の下に見出すことができる。ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体としては限定されないが、ラムブロリズマブ（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５４，５０９号においてｈＰＤ１０９Ａとして開示されるもの、ならびにそのヒト化誘導体であるｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示されるニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ社；コード名称ＢＭＳ−９３６５５８）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびピジリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：４０９−４１８（２０１１）に開示されている）、またはこれらの抗体の重鎖および軽鎖の領域を含む抗体が挙げられる。他の抗ＰＤ−１抗体は、例えば国際特許出願公開公報第２００４／００４７７１号、同第２００４／０５６８７５号、同第２００６／１２１１６８号、同第２００８／１５６７１２号、同第２００９／０１４７０８号、同第２００９／１１４３３５号、同第２０１３／０４３５６９号および同第２０１４／０４７３５０号に記載されている。関連する実施形態では、薬剤の組み合わせのチェックポイント阻害剤は、例えばＡＭＰ−２２４（ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域から構成される）などの抗ＰＤ−１融合タンパク質である。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、およびＰＤ−Ｌ１阻害剤、好ましくはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体を含む。ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体としては限定されないが、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、国際特許出願公開公報第２００９／１１４３３５号に開示されている）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２１７，１４９号に開示されているアテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社；ＭＰＤＬ３３２８０Ａ）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号に開示されているデュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ社；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手可能（１６．５９８３．８２））およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；ＭｅｒｃｋＫＧａＡ社）またはこれらの抗体のうちのいずれかの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体が挙げられる。関連する実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、例えばＡＭＰ−２２４（ＭｋｒｉｔｃｈｙａｎＭ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８９：２３３８−４７（２０１０）に開示されている）として公知のＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質などの抗ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質である。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、例えばＭＩＨ１８（Ｐｆｉｓｔｅｒｓｈａｍｍｅｒｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．３６：１１０４−１１１３（２００６）に開示されている）などのＰＤ−Ｌ２阻害剤を含む。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、例えば可溶性ＬＡＧ３（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１−０００８３３１号、およびＢｒｉｇｎｏｎｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１５：６２２５−６２３１（２００９）に開示されているＩＭＰ３２１またはＬＡＧ３−Ｉｇ）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−０２３３１８３号、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７７３，５７８号に開示されているＩＭＰ７０１もしくはヒトＬＡＧ３を遮断する他のヒト化抗体、または参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１−０１５０８９２号に開示されているＢＭＳ−９８６０１６もしくはＬＡＧ３を遮断する他の完全ヒト抗体などのＬＡＧ３阻害剤を含む。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５６３，６９４号に開示されている抗体４Ｃ７などのＢＬＴＡ阻害剤を含む。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２９４８６１号に開示される抗体などのＢ７Ｈ４チェックポイント阻害剤、または例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０１７７６４５号に開示されるＢ７Ｈ４の可溶性組換え型を含む。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、ＢＲＣＡ８４Ｄとして開示される抗体ＭＧＡ２７１、または例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０２９４７９６号に開示される誘導体などのＢ７−Ｈ３チェックポイント阻害剤を含む。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８４１，４１８号に開示されている抗体などのＴＩＭ３チェックポイント阻害剤、またはＪｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５（１２）：２７６３−７９（２００８）により開示される抗ヒトＴＩＭ３遮断抗体Ｆ３８−２Ｅ２などのＴＩＭ３チェックポイント阻害剤を含む。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、例えばリリルマブ抗体（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）（Ｒｏｍａｇｎｅｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１４（１３）：２６６７−２６７７（２００９）に開示される）などのＫＩＲチェックポイント阻害剤を含む。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、ＴＩＧＩＴ阻害剤を含む。ＴＩＧＩＴチェックポイント阻害剤は、ポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）とＴＩＧＩＴの相互作用を阻害するものが好ましく、限定されないが、例えば米国特許第９，４９９，５９６号（参照により本明細書に組み込まれる）、および米国特許出願公開第２０１６０３５５５８９号、同第２０１６０１７６９６３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどのヒトＴＩＧＩＴを標的とする抗体、ならびに米国特許第９，３２７，０１４号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどのポリオウイルス受容体バリアントが挙げられる。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、ＩＤＯ阻害剤を含む。ＩＤＯは免疫チェックポイントタンパク質として認識されており、腫瘍細胞においてその発現はエフェクターＴ細胞を機能停止させることにより、免疫寛容に寄与する。ＩＤＯは、抗ＣＴＬＡ−４療法の抵抗性に寄与すると考えられている。本明細書に記載される方法に従う使用のためのＩＤＯ阻害剤としては限定されないが、例えばＤ−１ＭＴ（１−メチル−ＤＬ−トリプトファン（ＭＴ）のＤアイソフォーム）、Ｌ−１ＭＴ（ＭＴのＬアイソフォーム）、ＭＴＨ−Ｔｒｐ（メチルチオヒダントイン−ｄｌ−トリプトファン；ＩＤＯの転写抑制物質）、およびβ−カルボリンなどのトリプトファン模倣体、例えばナフトキノン系の剤、Ｓ−アリル−ブラシニン、Ｓ−ベンジル−ブラシニン、５−ブロモ−ブラシニンなどのインドール模倣体、ならびにフェニルイミダゾール系の剤、４−フェニルイミダゾール、エキシグアミンＡ、エパカドスタット、ロスマリン酸、ノルハルマン（ｎｏｒｈａｒｍａｎｅ）およびＮＳＣ４０１３６６が挙げられる。好ましいＩＤＯ阻害剤としては、ＩＮＣＢ０２４３６０（エパカドスタット（ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ）；ｌ，２，５−オキサジアゾール−３−カルボキシイミダミド、４−（（２−（（アミノスルホニル）アミノ）エチル）アミノ）−Ｎ−（３−ブロモ−４−フルオロフェニル）−Ｎ’−ヒドロキシ−、（Ｃ（Ｚ））− ；Ｉｎｃｙｔｅ社）、インドキシモド（ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ）（ＮＬＧ２１０１；Ｄ−１ＭＴ；ＮｅｗＬｉｎｋＧｅｎｅｔｉｃｓ社）、ＩＤＯペプチドワクチン（コペンハーゲン大学）およびＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋＧｅｎｅｔｉｃｓ社）が挙げられる。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、ＰＤ−１阻害剤、好ましくはＰＤ−１に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体、そしてＣＴＬＡ−４阻害剤、好ましくはＣＴＬＡ−４に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体を含む。ヒトＰＤ−１の完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｕ６４８６３およびＮＰ＿００５００９．２に見出すことができる。ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体としては限定されないが、ラムブロリズマブ（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５４，５０９号においてｈＰＤ１０９Ａとして開示されるもの、ならびにそのヒト化誘導体であるｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示されるニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ社；コード名称ＢＭＳ−９３６５５８）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびピジリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：４０９−４１８（２０１１）に開示されている）、またはこれらの抗体の重鎖および軽鎖の領域を含む抗体が挙げられる。他の抗ＰＤ−１抗体は、例えば国際特許出願公開公報第２００４／００４７７１号、同第２００４／０５６８７５号、同第２００６／１２１１６８号、同第２００８／１５６７１２号、同第２００９／０１４７０８号、同第２００９／１１４３３５号、同第２０１３／０４３５６９号および同第２０１４／０４７３５０号に記載されている。関連する実施形態では、薬剤の組み合わせのチェックポイント阻害剤は、例えばＡＭＰ−２２４（ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域から構成される）などの抗ＰＤ−１融合タンパク質である。完全ヒトＣＴＬＡ−４核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＬＩ５００６に見出すことができる。ＣＴＬＡ４に特異的に結合するモノクローナル抗体としては限定されないが、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）；ＢＭＳ社）およびトレメリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ社）、ならびにそれらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２０１９９４号、同第２００２／００３９５８１号および同第２００２／０８６０１４号に開示される抗体、ならびにそれらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、同第６，９８４，７２０号、同第６，６８２，７３６号、同第６，２０７，１５６号、同第５，９７７，３１８号、同第６，６８２，７３６号、同第７，１０９，００３号、同第７，１３２，２８１号および同第８，４９１，８９５号に開示される抗体、またはこれらの抗体のうちのいずれかの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体が挙げられる。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、好ましくはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体、そしてＣＴＬＡ−４阻害剤、好ましくはＣＴＬＡ−４に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体を含む。ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体としては限定されないが、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、国際特許出願公開公報第２００９／１１４３３５号に開示されている）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２１７，１４９号に開示されているアテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社；ＰＤＬ３３２８０Ａ）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号に開示されているデュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ社；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手可能（１６．５９８３．８２））およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；ＭｅｒｃｋＫＧａＡ社）またはこれらの抗体のうちのいずれかの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体が挙げられる。関連する実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、例えばＡＭＰ−２２４（ＭｋｒｉｔｃｈｙａｎＭ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８９：２３３８−４７（２０１０）に開示されている）として公知のＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質などの抗ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質である。完全ヒトＣＴＬＡ−４核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＬＩ５００６に見出すことができる。ＣＴＬＡ４に特異的に結合するモノクローナル抗体としては限定されないが、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）；ＢＭＳ社）およびトレメリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ社）、ならびにそれらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２０１９９４号、同第２００２／００３９５８１号および同第２００２／０８６０１４号に開示される抗体、ならびにそれらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、同第６，９８４，７２０号、同第６，６８２，７３６号、同第６，２０７，１５６号、同第５，９７７，３１８号、同第６，６８２，７３６号、同第７，１０９，００３号、同第７，１３２，２８１号および同第８，４９１，８９５号に開示される抗体、またはこれらの抗体のうちのいずれかの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体が挙げられる。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、ＰＤ−１阻害剤、好ましくはＰＤ−１に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体、そして例えば可溶性ＬＡＧ３（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１−０００８３３１号、およびＢｒｉｇｎｏｎｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１５：６２２５−６２３１（２００９）に開示されているＩＭＰ３２１またはＬＡＧ３−Ｉｇ）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−０２３３１８３号、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７７３，５７８号に開示されているＩＭＰ７０１もしくはヒトＬＡＧ３を遮断する他のヒト化抗体、または参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１−０１５０８９２号に開示されているＢＭＳ−９８６０１６もしくはＬＡＧ３を遮断する他の完全ヒト抗体などのＬＡＧ３阻害剤を含む。ヒトＰＤ−１の完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｕ６４８６３およびＮＰ＿００５００９．２に見出すことができる。ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体としては限定されないが、ラムブロリズマブ（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５４，５０９号においてｈＰＤ１０９Ａとして開示されるもの、ならびにそのヒト化誘導体であるｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示されるニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ社；コード名称ＢＭＳ−９３６５５８）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびピジリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：４０９−４１８（２０１１）に開示されている）、またはこれらの抗体の重鎖および軽鎖の領域を含む抗体が挙げられる。他の抗ＰＤ−１抗体は、例えば国際特許出願公開公報第２００４／００４７７１号、同第２００４／０５６８７５号、同第２００６／１２１１６８号、同第２００８／１５６７１２号、同第２００９／０１４７０８号、同第２００９／１１４３３５号、同第２０１３／０４３５６９号および同第２０１４／０４７３５０号に記載されている。関連する実施形態では、薬剤の組み合わせのチェックポイント阻害剤は、例えばＡＭＰ−２２４（ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域から構成される）などの抗ＰＤ−１融合タンパク質である。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、好ましくはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体、そして例えば可溶性ＬＡＧ３（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１−０００８３３１号、およびＢｒｉｇｎｏｎｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１５：６２２５−６２３１（２００９）に開示されているＩＭＰ３２１またはＬＡＧ３−Ｉｇ）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−０２３３１８３号、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７７３，５７８号に開示されているＩＭＰ７０１もしくはヒトＬＡＧ３を遮断する他のヒト化抗体、または参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１−０１５０８９２号に開示されているＢＭＳ−９８６０１６もしくはＬＡＧ３を遮断する他の完全ヒト抗体などのＬＡＧ３阻害剤を含む。ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体としては限定されないが、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、国際特許出願公開公報第２００９／１１４３３５号に開示されている）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２１７，１４９号に開示されているアテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社；ＭＰＤＬ３３２８０Ａ）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号に開示されているデュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ社；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手可能（１６．５９８３．８２））およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；ＭｅｒｃｋＫＧａＡ社）またはこれらの抗体のうちのいずれかの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体が挙げられる。関連する実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、例えばＡＭＰ−２２４（ＭｋｒｉｔｃｈｙａｎＭ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８９：２３３８−４７（２０１０）に開示されている）として公知のＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質などの抗ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質である。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、ＰＤ−１阻害剤、好ましくはＰＤ−１に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体、そして例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８４１，４１８号に開示されている抗体などのＴＩＭ３チェックポイント阻害剤、またはＪｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５（１２）：２７６３−７９（２００８）により開示される抗ヒトＴＩＭ３遮断抗体Ｆ３８−２Ｅ２などのＴＩＭ３チェックポイント阻害剤を含む。ヒトＰＤ−１の完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｕ６４８６３およびＮＰ＿００５００９．２に見出すことができる。ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体としては限定されないが、ラムブロリズマブ（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５４，５０９号においてｈＰＤ１０９Ａとして開示されるもの、ならびにそのヒト化誘導体であるｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示されるニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ社；コード名称ＢＭＳ−９３６５５８）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびピジリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：４０９−４１８（２０１１）に開示されている）、またはこれらの抗体の重鎖および軽鎖の領域を含む抗体が挙げられる。他の抗ＰＤ−１抗体は、例えば国際特許出願公開公報第２００４／００４７７１号、同第２００４／０５６８７５号、同第２００６／１２１１６８号、同第２００８／１５６７１２号、同第２００９／０１４７０８号、同第２００９／１１４３３５号、同第２０１３／０４３５６９号および同第２０１４／０４７３５０号に記載されている。関連する実施形態では、薬剤の組み合わせのチェックポイント阻害剤は、例えばＡＭＰ−２２４（ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域から構成される）などの抗ＰＤ−１融合タンパク質である。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、好ましくはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する（そして阻害する）モノクローナル抗体、そして例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８４１，４１８号に開示されている抗体などのＴＩＭ３チェックポイント阻害剤、またはＪｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５（１２）：２７６３−７９（２００８）により開示される抗ヒトＴＩＭ３遮断抗体Ｆ３８−２Ｅ２などのＴＩＭ３チェックポイント阻害剤を含む。ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体としては限定されないが、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、国際特許出願公開公報第２００９／１１４３３５号に開示されている）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２１７，１４９号に開示されているアテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社；ＭＰＤＬ３３２８０Ａ）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号に開示されているデュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ社；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手可能（１６．５９８３．８２））およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；ＭｅｒｃｋＫＧａＡ社）またはこれらの抗体のうちのいずれかの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体が挙げられる。関連する実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、例えばＡＭＰ−２２４（ＭｋｒｉｔｃｈｙａｎＭ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８９：２３３８−４７（２０１０）に開示されている）として公知のＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質などの抗ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質である。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、ＴＩＧＩＴ阻害剤を含む。ＴＩＧＩＴチェックポイント阻害剤は、ポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）とＴＩＧＩＴの相互作用を阻害するものが好ましく、ＴＩＧＩＴチェックポイント阻害剤としては、限定されないが、例えば米国特許第９，４９９，５９６号（参照により本明細書に組み込まれる）、および米国特許出願公開第２０１６０３５５５８９号、同第２０１６０１７６９６３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどのヒトＴＩＧＩＴを標的とする抗体、ならびに米国特許第９，３２７，０１４号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどのポリオウイルス受容体バリアントが挙げられる。

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈワクシニアウイルス株、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス株と、ＩＤＯ阻害剤（インドールアミン−ピロール２，３−ジオキシゲナーゼ）を含む。ＩＤＯ阻害剤としては、代謝阻害剤が挙げられ、好ましくは代謝経路を阻害するものであり、限定されないが、ノルハルマン（ＣｈｉａｒｕｇｉＡ，ｅｔａｌ，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅａｎｄｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅｍｏｄｕｌａｔｅｓｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｒｅｌｅａｓｅｂｙｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ”，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌｏｇｙ．６８（２）：２６０−６．（２０００）を参照）、ロスマリン酸（ＬｅｅＨＪ，ｅｔａｌ，“Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃａｃｉｄｉｎｈｉｂｉｔｓｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｕｒｉｎｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ”，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．７３（９）：１４１２−２１（２００７）を参照）、ＣＯＸ−２阻害剤（ＣｅｓａｒｉｏＡ，ｅｔａｌ．，“Ｔｈｅｉｎｔｅｒｐｌａｙｂｅｔｗｅｅｎｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ１（ＩＤＯｌ）ａｎｄｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＣＯＸ）−２ｉｎｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｃａｎｃｅｒ”，ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．１８（１５）：２２６３−７１（２０１１）を参照）、１−メチルトリプトファン（ＨｏｕＤＹ，ｅｔａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｂｙｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓｏｆ１−ｍｅｔｈｙｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈａｎｔｉｔｕｍｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ．６７（２）：７９２−８０１（２００７）およびＣｈａｕｈａｎＮ，ｅｔａｌ．，（Ａｐｒｉｌ２００９）．“Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｔｈｅｈｅｍｅｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ”．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ．１３１（１２）：４１８６−７（２００９））が挙げられ、例えば特異的ラセマー（ｒａｃｅｍｅｒ）の１−メチル−Ｄ−トリプトファン（インドキシモドとしての知られる）（臨床試験候補）、エパカドスタット（ＩＮＣＢ２４３６０）、ナボキシモド（ｎａｖｏｘｉｍｏｄ）（ＧＤＣ−０９１９）（ＪｏｃｈｅｍｓＣ，ｅｔａｌ．，“ＴｈｅＩＤＯｌｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｐａｃａｄｏｓｔａｔｅｎｈａｎｃｅｓｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｌｙｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｕｍｏｒａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＴｃｅｌｌｓ”，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．７（２５）：３７７６２−３７７７２．（２０１６）を参照）、および、またはＢＭＳ−９８６２０５が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、ノルハルマン、ロスマリン酸、ＣＯＸ−２阻害剤、１−メチルトリプトファン、インドキシモド、エパカドスタット（ＩＮＣＢ２４３６０）、ナボキシモド（ＧＤＣ−０９１９）および／またはＢＭＳ−９８６２０５からなる群から選択される。

当業者には公知であるように、代替の、および／または同等の名称が、上述の特定の抗体に対して使用されている場合がある。そのような代替の、および／または同等の名称は、本発明の文脈において相互交換可能である。

一部の態様では、本明細書に記載される薬剤の組み合わせは、（ｉ）２種以上の免疫チェックポイント阻害剤、および（ｉｉ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む。好ましい実施形態では、ＰＤ−１阻害剤およびＣＴＬＡ−４阻害剤は、ワクシニアウイルスと並行して投与される。他の例としては、限定されないが、ＬＡＧ３阻害剤およびＰＤ−１阻害剤のワクシニアウイルスとの並行投与、またはＬＡＧ３阻害剤およびＰＤ−Ｌ１阻害剤の並行投与が挙げられる。他の例としては、ＩＤＯ阻害剤ならびにＣＴＬＡ−４阻害剤および／またはＰＤ−１阻害剤の並行投与が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、ノルハルマン、ロスマリン酸、ＣＯＸ−２阻害剤、１−メチルトリプトファン、インドキシモド、エパカドスタット（ＩＮＣＢ２４３６０）、ナボキシモド（ＧＤＣ−０９１９）および／またはＢＭＳ−９８６２０５からなる群から選択される。
ＩＶ．サイトカイン

一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、サイトカインをコードする異種配列を含み、当該サイトカインはウイルスにより発現される。

一部の実施形態では、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２４（ＩＬ−２４）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択されるサイトカインを発現するよう操作された複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが提供される。特に好ましい実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｗｙｅｔｈ株、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、またはＬｉｓｔｅｒ株である。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−５（ＩＬ−５）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−７（ＩＬ−７）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、インターロイキン−２４（ＩＬ−２４）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を発現するよう操作される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはｍＪＸ５９４であり、ＧＭ−ＣＳＦを発現するよう操作される。
Ｖ．腫瘍抗原

いくつかの実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍抗原、および任意でサイトカインをコードする異種核酸配列を含み、当該腫瘍抗原および任意でサイトカインは、ウイルスに感染した細胞中、好ましくは腫瘍細胞中で発現される。腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原を包含する。複製能力を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、全長腫瘍抗原、またはその免疫原性ペプチドを発現し得る。一部の実施形態では、サイトカインは、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに感染した細胞中で発現される。一部の実施形態では、ウイルスに感染した細胞中で発現される。一部の実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。

一部の実施形態では、腫瘍抗原としては限定されないが、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ−１５、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ＣＤ２０、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、表皮増殖因子受容体、ＭＵＣ−１、カスパーゼ−８、ＣＤ５、ムチン−１、Ｌｅｗｉｓｘ、ＣＡ−１２５、ｐｌ８５ＨＥＲ２、ＩＬ−２Ｒ、Ｆａｐ−ａ、テネイシン、メタロプロテアーゼに関連した抗原、ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＲＣＣ：Ｇタンパク質シグナリング５の調節因子（ＲＧＳ５）、サバイビン（Ｓｕｒｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５＝バキュロウイルスアポトーシス阻害タンパク質リピート５）、インスリン様増殖因子−結合タンパク質３（ＩＧＦ−ＢＰ３）、チミジル酸合成酵素（ＴＹＭＳ）、低酸素誘導タンパク質２、低酸素誘導脂肪滴関連タンパク質（ＨＩＧ２）、マトリクスメタロペプチダーゼ７（ＭＭＰ７）、ｐｒｕｎｅホモログ２（ＰＲＵＮＥ２）、ＲｅｃＱタンパク質様（ＤＮＡヘリカーゼＱｌ様：ＲＥＣＱＬ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害剤１（ＥＲＲＦＩｌ）、リソソームタンパク質膜貫通型４アルファ（ＬＡＰＴＭ４Ａ）；ＲＡＢ１Ｂ、ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢＩＢ）、ＣＤ２４、ホモサピエンスサイモシンベータ４、Ｘリンク（ＴＭＳＢ４Ｘ）、ホモサピエンスＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６（Ｓ１００Ａ６）、ホモサピエンスアデノシンＡ２受容体（ＡＤＯＲＡ２Ｂ）、染色体１６オープンリーディングフレーム６１（Ｃ１６ｏｒｆ６１）、ＲＯＤ１分化の調節遺伝子１（ＲＯＤ１）、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン２（ＳＩＲ２Ｌ）、チューブリンアルファ１ｃ（ＴＵＢＡ１Ｃ）、ＡＴＰａｓｅ阻害因子１（ＡＴＰＩＦｌ）、ストローマ抗体２（ＳＴＡＧ２）、ならびに核カゼインキナーゼおよびサイクリン依存性基質１（ＮＵＣＫＳ１）が挙げられる。一部の実施形態では、抗原は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる米国特許第９，９１９，０４７号に列記される抗原である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、腎細胞の癌性腫瘍抗原である。一部の実施形態では、腎細胞の癌性腫瘍抗原は、Ｇタンパク質シグナリング５の調節因子（ＲＧＳ５）、サバイビン（Ｓｕｒｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５＝バキュロウイルスアポトーシス阻害タンパク質リピート５）、インスリン様増殖因子−結合タンパク質３（ＩＧＦ−ＢＰ３）、チミジル酸合成酵素（ＴＹＭＳ）、低酸素誘導タンパク質２、低酸素誘導脂肪滴関連タンパク質（ＨＩＧ２）、マトリクスメタロペプチダーゼ７（ＭＭＰ７）、ｐｒｕｎｅホモログ２（ＰＲＵＮＥ２）、ＲｅｃＱタンパク質様（ＤＮＡヘリカーゼＱｌ様：ＲＥＣＱＬ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害剤１（ＥＲＲＦＩｌ）、リソソームタンパク質膜貫通型４アルファ（ＬＡＰＴＭ４Ａ）；ＲＡＢ１Ｂ、ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢＩＢ）、ＣＤ２４、ホモサピエンスサイモシンベータ４、Ｘリンク（ＴＭＳＢ４Ｘ）、ホモサピエンスＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６（Ｓ１００Ａ６）、ホモサピエンスアデノシンＡ２受容体（ＡＤＯＲＡ２Ｂ）、染色体１６オープンリーディングフレーム６１（Ｃ１６ｏｒｆ６１）、ＲＯＤ１分化の調節遺伝子１（ＲＯＤ１）、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン２（ＳＩＲ２Ｌ）、チューブリンアルファ１ｃ（ＴＵＢＡ１Ｃ）、ＡＴＰａｓｅ阻害因子１（ＡＴＰＩＦｌ）、ストローマ抗体２（ＳＴＡＧ２）、ならびに核カゼインキナーゼおよびサイクリン依存性基質１（ＮＵＣＫＳ１）からなる群から選択される。一部の実施形態では、腫瘍抗原としては限定されないが、ＫＳ１／４汎癌性抗原、卵巣癌性抗原（ＣＡ１２５）、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、メラノーマ関連抗原ｐ９７、メラノーマ抗原ｇｐ７５、高分子量メラノーマ抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ：ｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ）、前立腺特異的膜抗原、ＣＥＡ、多形上皮ムチン抗原、乳脂肪球抗原、大腸腫瘍関連抗原（例えばＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＩＣＡ１９−９、ＣＴＡ−１およびＬＥＡ）、バーキットリンパ腫抗原−３８．１３、ＣＤ１９、Ｂリンパ腫抗原−ＣＤ２０、ＣＤ３３、メラノーマ特異的抗原（例えばガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＧＭ３）、腫瘍特異性移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ：ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｔｙｐｅｏｆｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ）（例えばＤＮＡ腫瘍ウイルスのＴ抗原、およびＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘導型腫瘍抗原）、癌胎児性抗原−α−胎児タンパク質、例えば結腸のＣＥＡ、膀胱腫瘍癌胎児性抗原、分化抗原（例えばヒト肺癌抗原Ｌ６およびＬ２０）、繊維肉腫の抗原、白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳癌抗原（例えばＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）ＨＥＲ２抗原（ｐｌ８５^ＨＥＲ２）およびＨＥＲ２ｎｅｕエピトープ）、多形上皮ムチン（ＰＥＭ：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｕｃｉｎ）、悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１、分化抗原（例えば胎児赤血球中、一次内胚葉に存在するＩ抗原、成人赤血球、着床前胚に存在するＩ抗原、胃腺癌中に存在するＩ（Ｍａ）、乳房上皮中に存在するＭｌ８、Ｍ３９、骨髄細胞中に存在するＳＳＥＡ−１、大腸癌中に存在するＶＥＰ８、ＶＥＰ９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ−Ｄ５、Ｄ_１５６−２２、結腸腺癌中に存在するＴＲＡ−１−８５（血液群Ｈ）、Ｃ１４、肺腺癌中に存在するＦ３、胃癌中に存在するＡＨ６、胚性癌細胞中に存在するＹハプテン、Ｌｅ^ｙ、Ａ４３１細胞中に存在するＴＬ５（血液群Ａ）、ＥＧＦ受容体、膵臓癌中に存在するＥ_１シリーズ（血液群Ｂ）、胚性癌細胞中に存在するＦＣ１０．２、腺癌中に存在する胃腺癌抗原、ＣＯ−５１４（血液群Ｌｅ^ａ）、腺癌中に存在するＮＳ−１０、Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体中に存在するＣＯ−４３（血液群Ｌｅ^ｂ）、Ｇ４９、結腸腺癌中に存在するＭＨ２（血液群ＡＬｅ^ｂ／Ｌｅ^ｙ）、結腸癌中に存在する１９．９、胃癌ムチン、骨髄細胞中に存在するＴ_５Ａ_７、メラノーマ中に存在するＲ_２４、胚性癌細胞中に存在する４．２、Ｇ_Ｄ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、Ｇ_Ｍ２、ＯＦＡ−２、Ｇ_Ｄ２およびＭｌ：２２：２５：８、ならびに４〜８細胞期の胚中に存在するＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４）、皮膚型Ｔ細胞リンパ腫からのＴ細胞受容体誘導型ペプチド、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、癌抗原−５０（ＣＡ−５０）、乳癌関連癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、癌抗原−１９（ＣＡ−１９）および消化管癌関連癌抗原−２４２、癌関連抗原（ＣＡＡ）、クロモグラニンＡ、上皮性ムチン抗原（ＭＣ５）、ヒト上皮特異的抗原（ＥｌＡ）、ルイス（ａ）抗原、メラノーマ抗原、メラノーマ関連抗原１００、２５および１５０、ムチン様癌関連抗原、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰｍ６）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ４１）、Ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質（Ｃ−ｅｒｂＢ−２）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、Ｐ−糖たんぱく質（ｍｄｒｌ遺伝子産物）、多剤耐性関連抗原、ｐ１７０、多剤耐性関連抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ５６およびＮＣＡＭが挙げられる。

一部の実施形態では、他の腫瘍抗原としては限定されないが、ＡＩＭ２（メラノーマ２が不在）、ＢＭＩ１（ＢＭＩ１ポリコームリングフィンガー癌遺伝子）、ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ）、ＥＺＨ２（エンハンサーオブゼストホモログ２）、ＬＩＣＡＭ（ヒトＬＩ細胞接着分子）、Ｌｉｖｉｎ、Ｌｉｖｉｎβ、ＭＲＰ−３（多剤耐性タンパク質３）、Ｎｅｓｔｉｎ、ＯＬＩＧ２（乏突起膠細胞転写因子）、ＳＯＸ２（ＳＲＹ関連ＨＭＧ−ボックス２）、ＡＲＴ１（Ｔ細胞認識抗原１）、ＡＲＴ４（Ｔ細胞認識抗原４）、ＳＡＲＴｌ（Ｔ細胞認識扁平上皮細胞癌抗原１（Ｔ細胞認識扁平上皮癌抗１））、ＳＡＲＴ２、ＳＡＲＴ３、Ｂ−サイクリン、Ｇｌｉ１（グリオーマ関連癌遺伝子ホモログ１）、Ｃａｖ−１（カベオリン−１）、カテプシンＢ、ＣＤ７４（分化抗原群７４）、Ｅ−カドヘリン（上皮カルシウム依存性付着）、ＥｐｈＡ２／Ｅｃｋ（ＥＰＨ受容体Ａ２／上皮キナーゼ）、Ｆｒａ−ｌ／Ｆｏｓｌ１（ｆｏｓ関連抗原１）、Ｋｉ６７（抗体Ｋｉ６７の核増殖関連抗原）、Ｋｕ７０／８０（ヒトＫｕヘテロ二量体タンパク質サブユニット）、ＩＬ−１３Ｒａ２（インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平細胞癌１）、ＰＲＯＸ１（プロスペロホメオボックスタンパク質１）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＳＯＸ１０（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス１０）、ＳＯＸ１１、サバイビン、ＵＰＡＲ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体）、およびＷＴ−１（ウィルムス腫瘍タンパク質１）が挙げられる。
ＶＩ．治療レジメンおよび薬剤製剤

薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび免疫チェックポイント阻害剤は同時に投与され、当該腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内投与により送達される。同時投与は、例えばこれらの剤を含む１つの固定された組み合わせの形態で行われてもよく、または独立した製剤中の各剤を同時に投与することにより行われてもよい。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤は、同時に投与される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＣＴＬＡ−４免疫チェックポイント阻害剤は、同時に投与される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＴＩＧＩＴ免疫チェックポイント阻害剤は、同時に投与される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤、およびＣＴＬＡ−４免疫チェックポイント阻害剤は、同時に投与される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤、およびＴＩＧＩＴ免疫チェックポイント阻害剤は、同時に投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、静脈内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、動脈内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与によってのみ投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは静脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは動脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍抗原、および任意でサイトカインをコードする異種核酸配列を含み、当該腫瘍抗原および任意でサイトカインは、ウイルスに感染した細胞中、好ましくは腫瘍細胞中で発現される。

一部の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて腫瘍を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、（ａ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および（ｂ）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤を含む組み合わせを当該ヒトに並行投与することを含む。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴから選択される。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−Ｌ１である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＬＡＧ３である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＴＩＧＩＴである。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＴＩＭ３である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、固形癌である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、大腸癌である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、腎細胞癌である。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与、ＩＶ投与、および／または腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＩＶ投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、動脈内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与によってのみ投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは静脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは動脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍抗原、および任意でサイトカインをコードする異種核酸配列を含み、当該腫瘍抗原および任意のサイトカインは、ウイルスに感染した細胞中、好ましくは腫瘍細胞中で発現される。

一部の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて腫瘍を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、（ａ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、（ｂ）ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、ならびに（ｃ）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤、を含む組み合わせを当該ヒトに並行投与することを含む。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴから選択される。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＬＡＧ３である。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＴＩＧＩＴである。治療方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＴＩＭ３である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、固形癌である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、大腸癌である。治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、腎細胞癌である。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与、ＩＶ投与、および／または腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＩＶ投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与によってのみ投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは静脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは動脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍抗原、および任意でサイトカインをコードする異種核酸配列を含み、当該腫瘍抗原および任意でサイトカインは、ウイルスに感染した細胞中、好ましくは腫瘍細胞中で発現される。

治療方法の一部の実施形態では、腫瘍は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の前に、免疫チェックポイントタンパク質を発現していないか、または比較的低いレベルで免疫チェックポイントタンパク質を発現している。一部の実施形態では、高レベルは、５０％以上の腫瘍比例スコア（ｔｕｍｏｒｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｓｃｏｒｅ）により示される。一部の実施形態では、高レベルは、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、約９９％、または約１００％の腫瘍比例スコアにより示される。一部の実施形態では、過去の治療された腫瘍に対する高レベルは、１％超の腫瘍比例スコアにより示される。一部の実施形態では、高レベルは、５０％以上のＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞により示される（例えば５０％を超える腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１を発現する）。一部の実施形態では、高レベルは、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、約９９％、または約１００％のＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞により示される。一部の実施形態では、過去に治療された腫瘍に対する高レベルは、１％超のＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞により示される（例えば１％を超える腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１を発現する）。一部の実施形態では、任意のＰＤ−Ｌ１診断検査を採用して、ＰＤ−Ｌ１発現を測定することができる。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１チェックポイントが測定されるとき、ＰＤ−Ｌ１ＤａＫｏＣｏｍｐａｎｉｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ検査を採用して、ＰＤ−Ｌ１のレベルを測定する。

治療方法の一部の実施形態では、当該方法は、その組み合わせの投与前に、腫瘍におけるチェックポイントタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む。

腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤の投与は、もしあれば治療に関する毒性を考慮にいれて、各々の特定の治療法の投与に関する一般的なプロトコールに従う。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予測される。また、本発明の併用療法に加えて様々な標準治療ならびに外科的介入が適用され得ることも意図される。

治療レジメンは変化し得るものであり、多くの場合、腫瘍のタイプ、腫瘍の位置、疾患の進行、そして患者の健康状態と年齢に依存する。特定のタイプの腫瘍は、より積極的な治療を必要とする。しかし同時に特定の患者は、より骨の折れるプロトコールは容認できない。

特定の実施形態では、治療される腫瘍は、少なくとも当初は切除可能ではない場合がある。本発明の併用療法を用いた治療は、境界部分で縮小することにより、またはある特定の浸潤部分を排除することにより、腫瘍の切除可能性を高める場合がある。治療後、切除が可能になる場合がある。切除後の追加的治療は、腫瘍部位の顕微鏡クラスの残留病変を除去するのに役立つことになろう。

１つまたは複数の要素間の相乗的相互作用の決定、効果に対する最適範囲、および効果に対する各要素の絶対的な用量範囲は、治療の必要のある患者に対し、異なるｗ／ｗ比の範囲および用量で当該要素を投与することにより、断定的に測定され得る。ヒトに関しては、患者に臨床試験を実施することの複雑さとコストがあるため、相乗効果に関する一次モデルとしてこの形態の試験を行うことは現実的でないことになる。しかしながらある種での相乗効果を観察することで、他の種における効果を予測することができる。本明細書に記載されるように、相乗効果を測定するための動物モデルは存在しており、その研究結果を使用して、薬物動態／薬力学的方法を適用することによって他種で必要とされる有効用量、および血漿濃度比率範囲、および絶対的な用量、および血漿濃度を予測することもできる。腫瘍モデルとヒトで見られる効果の間の確立された相関関係は、動物での相乗効果が、例えばヒト異種移植片腫瘍モデルにおいて実証され得ることを示唆する。

一部の実施形態では、組み合わせを使用して、哺乳類の癌を治療および／または予防する。一部の実施形態では、癌としては限定されないが、脳腫瘍、頭頚部の癌、食道癌、皮膚癌、肺癌、胸腺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、腎癌、精巣癌、直腸癌、乳癌、および膵臓癌が挙げられる。一部の実施形態では、癌は、脳腫瘍、頭頚部の癌、食道癌、皮膚癌、肺癌、胸腺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、腎癌、精巣癌、直腸癌、乳癌、および膵臓癌からなる群から選択される。好ましい実施形態では、組み合わせを使用して、転移を治療および／または予防する。他の好ましい実施形態では、組み合わせを使用して、限定されないが、肝細胞癌、大腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、胃癌、食道癌、肉腫、中皮腫、メラノーマ、膵臓癌、頭頚部癌、卵巣癌、子宮頸癌および肝癌を含む癌が治療される。一部の実施形態では、組み合わせを使用して、肝細胞癌、大腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、胃癌、食道癌、肉腫、中皮腫、メラノーマ、膵臓癌、頭頚部癌、卵巣癌、子宮頸癌および肝癌からなる群から選択される癌が治療される。一部の実施形態では、組み合わせを使用して、大腸癌、特に転移性大腸癌が治療される。一部の実施形態では、治療される哺乳類は、ヒトである。別の好ましい実施形態では、組み合わせを使用して、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対し抵抗性の癌が治療される（例えば癌は、ＰＤ−１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、および／またはＴＩＧＩＴ阻害剤を用いた免疫療法に対し抵抗性である）。一部の実施形態では、癌は、固形癌または固形腫瘍である。

方法は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤の治療有効量を並行投与することを含む。腫瘍溶解性ウイルスの治療有効量は、腫瘍溶解、つまり癌細胞の破壊または溶解を誘導するのに充分な量として定義される。好ましくは腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤は、相乗効果を発揮する量で投与される。当該用語は、腫瘍の増殖もしくはサイズを減速させる、阻害する、または低下させることを含み、またある例では腫瘍の消滅を含む。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの有効量は、腫瘍、例えば注射されていない腫瘍の感染に対し、治療用ウイルスの全身的な播種を生じさせる。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの有効量は、腫瘍溶解、つまり癌細胞の破壊または溶解を誘導するのに充分な量である。

一部の実施形態では、癌の治療および／または予防とは、治療後の腫瘍のサイズおよび／または存在において、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％の低下および／または減少を示すものである。一部の実施形態では、癌の治療および／または予防とは、治療後に完全な腫瘍の退縮を示すものである。一部の実施形態では、癌の治療および／または予防とは、治療後に完全な腫瘍の寛解を示すものである。一部の実施形態では、癌は、免疫チェックポイント阻害剤の治療に対し不応性または抵抗性である。一部の実施形態では、癌は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いた治療に対し不応性または抵抗性である。一部の実施形態では、癌は、抗ＰＤ−１抗体を用いた治療に対し抵抗性である。一部の実施形態では、癌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いた治療に対し抵抗性である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与することを含む。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴおよび／またはＴＩＭ３の阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、またはＴＩＭ３阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−１阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−１阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−１阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＧＩＴ阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＧＩＴ阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−１阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ３阻害剤である。一部の実施形態では、治療は、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、当該免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ３阻害剤である。

一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与、ＩＶ投与、および／または腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＩＶ投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、動脈内投与により投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与によってのみ投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与によってのみ投与される。

本明細書に開示されるチェックポイント阻害剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、関節包内、腹腔内、直腸内、嚢内、腫瘍内、脈管内、皮内など経口または非経口を含む様々な経路で投与されることができ、または例えば皮膚パッチもしくは経皮イオントフォレーシスなどをそれぞれ使用して皮膚を通過させ、受動的な吸収または吸収促進を行うことにより投与されることができる。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、全身投与される。またチェックポイント阻害剤は、病的状態の部位に、例えば腫瘍に供給を行う血管内へ例えば静脈内投与または動脈内投与されることもできる。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴおよび／またはＴＩＭ３の阻害剤である。

一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは静脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは腹腔内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。一部の実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは動脈内投与され、チェックポイント阻害剤は全身投与される。

本発明方法の実施で投与される剤の総量は、単回用量として、ボーラスまたは点滴のいずれかにより、比較的短期間で対象に投与されることができ、または分割された治療プロトコールを使用して投与されることができ、そのプロトコール中では複数の用量が、長期間にわたり投与される。当業者であれば、対象における病的状態を治療するための組成物の量は、対象の年齢および一般健康状態ならびに投与経路および与えられる治療の数をはじめとする多くの因子に依存することを知っていることになる。これらの因子を鑑み、当業者は必要に応じて特定の用量を調節するとになる。概して、組成物の処方、投与経路および投与頻度は、第Ｉ相臨床試験および第ＩＩ相臨床試験を使用して初期に決定される。

特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２〜０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜３ｍｇ／ｋｇ、３〜４ｍｇ／ｋｇ、４〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜６ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、８〜９ｍｇ／ｋｇ、９〜１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、またはそれらの任意の組み合わせの用量で投与される。チェックポイント阻害剤の適切な投与量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、少なくとも週に１回、週に少なくとも２回、週に少なくとも３回、２週ごとに少なくとも１回、または１か月ごともしくは複数月ごとに少なくとも１回、投与される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、１つの用量として、２つの用量として、３つの用量として、４つの用量として、５つの用量として、または６つ以上の用量として投与される。好ましくはチェックポイント阻害剤は、静脈内（例えば静脈内の点滴または注射）または腫瘍内に投与される。非限定的な例として、イピリムマブは、３週ごとに３ｍｇ／ｋｇの用量、合計で４用量で静脈内点滴により投与されることが好ましい。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴおよび／またはＴＩＭ３の阻害剤である。
Ａ．追加の抗癌治療

１つまたは複数の追加の化学療法剤を、本発明の組み合わせとともに投与してもよく、そのような追加的化学療法剤としては限定されないが、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、フォリン酸（ＦＡ）（またはロイコボリン）、メトトレキサート、カペシタビン（ゼローダ；５−ＦＵの経口プロドラッグ）、オキサリプラチン（エロキサチン）、ベバシズマブ（アバスチン）、セツキシマブ（アービタックス）、およびパニツムマブ（ベクティビックス）の任意の組み合わせが挙げられる。これらの剤は公知の治療プロトコールに従い投与され得る。概して、追加的化学療法剤は、静脈内投与されるが、経口用製剤であるカペシタビンは例外である。

他の態様では、本発明の方法は、例えば放射線療法、ホルモン療法、外科手術およびそれらの組み合わせなどの追加的癌治療法を与えることをさらに含む。

放射線療法としては限定されないが、ガンマ線、Ｘ線、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の定方向伝達が挙げられる。例えばマイクロ波およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子もまた意図される。これらの因子のすべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡ前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の組み立ておよび維持に対して広範な損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週）の間の５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回照射の範囲である。放射性同位体の線量範囲は広範に変化し、同位体の半減期、放出される放射能の強度とタイプ、そして新生細胞による取り込みに依存する。

癌を有するおよそ６０％の人々が、予防的、診断的または病期決定的、治癒的ならびに緩和的な外科手術を含む何らかのタイプの外科手術を受ける。治癒的な外科手術は、例えば本発明の治療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法および／または代替療法などの他の治療法と併せて使用され得る癌の治療法である。

治癒的外科手術には摘出が含まれ、この手術において癌性組織のすべてまたは一部が物理的に除去され、切除され、かつ／または破壊される。腫瘍の摘出とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍の摘出に加えて、外科手術による治療には、レーザー手術、冷凍外科手術、電気外科手術および顕微鏡制御下外科手術（モース術）が含まれる。本発明は、表層の癌、前癌、または偶発的な量の正常組織の除去と併せて使用され得ることがさらに意図される。

癌性の細胞、組織または腫瘍の一部またはすべてを切除することで、身体には空洞が形成され得る。治療は、追加的な抗癌療法を用いて当該領域にかん流、直接注入または局所適用することで実現され得る。そのような治療は例えば１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１、２、３、４および５週ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２か月ごとに繰り返され得る。これらの治療も同様に用量が変化し得る。

本発明方法と併せて使用するための治療法の別の形態として温熱療法が挙げられる。当該療法は、患者の組織を高温（最大１０６°Ｆ（約４１℃））に暴露する方法である。外部加熱デバイスまたは内部加熱デバイスが、局所、局部または全身の温熱療法の適用に関与する。局所の温熱療法には、小さな領域、例えば腫瘍に熱を適用することを含む。熱は、腫瘍を標的とする身体の外側にあるデバイスからの高周波で外部から生じさせてもよい。内部加熱には、薄い加熱されたワイヤ、または温水で満たされた中空管、移植マイクロ波アンテナ、または高周波電極を含む滅菌プローブが関与する。

患者の臓器または四肢は、局所療法で加熱される。これは例えば磁石などの高エネルギーを生み出すデバイスを使用して実現される。あるいは患者の血液の一部が取り出され、加熱された後に、内部加熱される領域の中へとかん流される。癌が全身に拡がった症例では全身加熱も実施され得る。温水ブランケット、ホットワックス、誘導コイル、および保温チャンバーを本目的に対して使用してもよい。

ホルモン療法もまた本発明と併せて使用してもよく、または上述の任意の他の癌療法と組み合わせて使用してもよい。ホルモンの使用は、例えばテストステロンまたはエストロゲンなどの特定のホルモンレベルを低下させ、またはホルモンの作用を遮断するために、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌などの特定の癌の治療で採用される場合がある。
Ｂ．組成物および製剤

薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、癌を治療するために投与され、かつ／または腫瘍細胞に直接投与される。したがって、本開示の医薬組成物は、所望される投与経路用に製剤化される（例えば腫瘍内注射、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与）。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与による投与用に製剤化される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与による投与用に製剤化される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、静脈内投与による投与用に製剤化される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、動脈内投与用に製剤化される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腹腔内投与による投与用に製剤化される。一部の実施形態では、薬剤の組み合わせの複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与のみによる投与用に製剤化される。

腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍内注射は、発現構築物が、注射に必要とされる特定のゲージの針を通過することができる限りにおいて、シリンジまたは溶液注射用に使用される任意の他の方法により行われてもよい。新たな無針注射システムが最近報告された（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４６，２３３号）。このシステムは、溶液を保持するアンプルチャンバーを規定するノズルと、ノズルから送達部位へと溶液を押し出すためのエネルギーデバイスを有する。任意の深度で所定量の溶液を正確に複数回注射することが可能な、遺伝子治療での使用のためのシリンジシステムも記載されている（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４６，２２５号）

遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を用いて適切に混合された水中に調製され得る。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物での分散溶液、およびその油中の混合液も調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。注射用途に適した剤型としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液もしくは分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる（その全体で参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許第５，４６６，４６８号）。全ての場合で、剤型は、滅菌されていなければならず、そして注射針通過性が在る程度に液体でなければならない。製造および保存の条件下で安定的でなければならず、そして例えば細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒もしくは分散媒、それらの適切な混合物、および／または植物油であり得る。例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持されていてもよい。微生物の影響の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの事例では、例えば糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいことになる。注射用組成物の持続的吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる剤の組成物を使用することによりもたらすことができる。

水溶液の腫瘍内注射については、例えば溶液は、必要な場合には適切に緩衝されてもよく、そして液体希釈剤は最初に充分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にされてもよい。この関連において、採用され得る滅菌水性媒は、本開示を考慮した当分野の当業者には公知であろう。例えば１回投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解させ、そしてそれを１０００ｍｌの皮下注入用の液体に加えるか、または提唱される点滴部位に注射してもよい（例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ１０３５−１０３８ａｎｄ１５７０−１５８０を参照のこと）。投与量における何らかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生するであろう。投与に関して責任を負う人物は、いずれの場合でも、個々の対象に対して適切な用量を決定するであろう。さらにヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡ生物標準局により要求される滅菌性、発熱性、一般的安全性、および純度標準を満たすべきである。

滅菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物に、必要に応じて上に列記される様々な他の成分を組み込むことにより調製される。概して、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、塩基性分散媒を含有する滅菌ビヒクル、および上に列記される物質の必要とされる他の成分の中へに組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥技法および凍結乾燥技法であり、これらの技法により、従前に滅菌ろ過された溶液から活性成分に任意の追加的な望ましい成分を加えた粉末が得られる。

本明細書に開示される組成物は、中性または塩の形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が挙げられ、それらは例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸、およびこれに類するものを用いて形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩も、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基から、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基、およびこれに類するものから誘導することができる。製剤化に伴い、溶液は、剤型に適合した方法で、および治療有効な量で投与されることになる。製剤は、例
ば注射溶液、薬剤放出カプセル、およびこれに類するものなどの様々な剤型で容易に投与される。

本明細書において使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質に対する、そのような媒体および剤の使用は、当分野で周知である。任意の従来的な媒体または剤が、活性成分と不適合である場合を除き、治療組成物中でのその使用が意図される。補足的な活性成分も、組成物の中へと組み込まれてもよい。

「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」という文言は、ヒトに投与されたときに、アレルギー反応または類似予期しない反応を生じない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製も、当分野において良く理解されている。典型的には、そのような組成物は、液状溶液または懸濁液のいずれかの注射用物質として調製される。注射の前に液体中の溶液または液体中の懸濁液に適する固体の形態も調製され得る。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられるものであり、いかなる形でも本発明を限定することを意味しない。当業者であれば、本発明は、本目的を実行するため、ならびに上述の目標および利点、ならびに本明細書に内在する目的、目標および利点を得るために良好に適合されることを容易に理解するであろう。本実施例は、本明細書に記載される方法とともに、現在の好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲に対する限定は意図されていない。その中の変更、および特許請求の範囲により規定される本発明の主旨の内に包含される他の用途を、当業者は気付くであろう。
実施例１

転移性腎細胞癌（Ｒｅｎｃａ）の同系マウスモデルにおいて、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤を用いた組み合わせ治療が腫瘍を退縮させる能力を評価した。この腫瘍の増殖パターンは、ヒトの成人腎細胞癌を、特に肺および肝臓への自然発生的な転移に関して正確に模倣している。このＲｅｎｃａモデルは、血管過剰増生状態であり、抗ＰＤ−１抗体免疫療法に対して抵抗性であり、免疫応答性である。組織の起源が感染とは無関係であるため、このＲｅｎｃａモデルは全ての癌に関連がある。
材料と方法

マウスおよび細胞株−特定病原体未感染のオスのＢＡＬＢ／ｃマウスをフィルター付きのケージ内に飼育し、１２時間の逆昼夜サイクルで水と食料を供給した。全てのマウスは、麻酔の組み合わせ（８０ｍｇ／ｋｇのケタミンと１２ｍｇ／ｋｇのキシラジン）の筋肉内注射により麻酔され、その後に殺処分された。Ｒｅｎｃａ腎癌細胞株およびＣＴ２６結腸癌細胞株はＡＴＣＣから取得され、１０％ＦＢＳと１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ_２で培養された。
ウイルス増幅−

ｍＪＸ５９４は、ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の破壊と、合成早期後期プロモーターの制御下にあるマウスＧＭＣＳＦ−ＧＦＰ（ｍＧＭＣＳＦ−ＧＦＰ）の挿入を含有するよう操作されたＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルスである。１００％コンフルエンシーレベルのＨｅＬａＳ３細胞に、感染多重度（ｍｏｉ）＝１〜３のｍＪＸ５９４を感染させ、１．５時間、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に置き、その後、２．５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを加え、４８〜７２時間インキュベートした。遠心分離により細胞を集め、上清を破棄した。細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９．０中で再懸濁させ、Ｄａｕｎｃｅホモジナイザーで均質化し、遠心分離した。細胞沈殿物を１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９．０中で再懸濁させ、遠心分離し、そして上清を最初の上清と組み合わせた。上清を最初の上清と組み合わせた。超音波破砕させた溶解物を３６％スクロースの上に置き、３２，９００×ｇで８０分間、４℃で遠心分離した。その後沈殿物を１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９．０中で再懸濁させ、−６０℃未満で保存した。
ＩＣＩ阻害剤（本明細書では免疫チェックポイント阻害剤とも呼称される）−

ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１に対する抗体は、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社から購入した。９Ｄ９モノクローナル抗体はマウスＣＴＬＡ−４と反応する。アイソタイプ：マウスＩｇＧ２ｂ。Ｊ４３モノクローナル抗体はマウスＰＤ−１と反応する。アイソタイプ：アルメニアハムスターＩｇＧ。
腫瘍モデルおよび治療スケジュール−

臨床的に関連性のある腎腫瘍モデルを創出するために、Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞（腎癌、同系）の懸濁液（５×１０^５細胞／１００μｌ）を、８〜１０週齢の免疫能力のあるオスのＢａｌｂ／ｃマウスの右背面の脇腹に皮下注射した。平均腫瘍体積が５０ｍｍ^３を越えたとき、マウスを無作為化して、以下に記載される治療レジメンを施した。

腫瘍サイズは、デジタル式のノギスを用いて全群において３日ごとに測定された。腫瘍体積は、式０．５×Ａ×Ｂ^２に従い算出され、式中、Ａは腫瘍の最も大きな直径であり、Ｂはその直角に交わる直径である。その後の指定日に、マウスはＣＯ_２により殺処分され、さらなる解析のために組織を採取した。
組織学的解析−

免疫蛍光研究のために、サンプルは１％ＰＦＡに固定され、２０％スクロース溶液中で一晩脱水され、そして組織凍結培地（Ｌｅｉｃａ社）内に包埋された。凍結ブロックを５０μｍの切片に切り出した。サンプルはＰＢＳＴ（０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液）中、５％ヤギ（またはロバ）血清でブロッキングされ、その後、以下の一次抗体とともに室温（ＲＴ）で３時間インキュベートされた：抗ＧＦＰ（ウサギ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、抗ＣＤ３１（ハムスター、クローン２Ｈ８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、抗ＶＥＧＦＲ２（ウサギ、Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＣＤ８ａ（ラット、ＢＤｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗ＣＤ１１ｂ（ラット、ＢＤｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗ＦｏｘＰ３（ラット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗カスパーゼ３（ウサギ、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗ワクシニア（ウサギ、Ａｂｃａｍ社）、および抗ＰＤ−Ｌ１（ラット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。数回洗浄を行った後、サンプルは、以下の２次抗体とともに室温で２時間インキュベートされた：ＦＩＴＣ−、Ｃｙ３−、またはＣｙ５−結合抗ハムスターＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、ＦＩＴＣまたはＣｙ３−結合抗ウサギＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、Ｃｙ３−結合抗ラットＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、またはＣｙ３−結合抗マウスＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）。核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色された。その後サンプルは、蛍光標本培地（ＤＡＫＯ社）を用いて標本化され、免疫蛍光画像は、ＺｅｉｓｓＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社）を使用して取得された。
形態学的解析−

血管、ＣＤ８Ｔ細胞、またはアポトーシス領域の密度測定は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を用いて実施された。無作為の０．４２ｍｍ^２の面積当たりのＣＤ３１、ＣＤ８、またはカスパーゼ３^＋の面積が、腫瘍周辺領域よおび腫瘍内領域で測定された。全ての測定は、１匹のマウス当たり、少なくとも５つの異なる視野で行われた。
フローサイトメトリー法

採取された腫瘍組織は細かく刻まれ、コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ社）およびＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中、１％ＦＢＳ）中、振とう水槽において１〜２時間、３７℃でインキュベートされた。消化された細胞は４０μｍのナイロンメッシュでろ過され、細胞塊が除去された。ＡＣＫ溶解緩衝液中で細胞懸濁液を５分間、ＲＴでインキュベートすることによりＲＢＣは除去された。得られた単一細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液中、以下の抗体とともに３０分間インキュベートされた：ＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５−結合抗マウスＣＤ４５（ラット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＡＰＣ−結合抗マウスＣＤ３ｅ（ハムスター、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＦＩＴＣ−結合抗マウスＣＤ４（ラット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＰＥ−結合抗ＣＤ８ａ（ラット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＦＩＴＣ−結合抗マウスＣＤ１１ｂ（ラット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＡＰＣ−結合抗マウスＧｒ１（ラット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、およびＡＰＣ−結合抗マウスＣＤ１１ｃ（ハムスター、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。
統計解析−

値は、平均±標準偏差として表されている。平均間の統計的差異は、独立スチューデントｔ検定、または一元配置分散分析の後にスチューデント−ニューマン−コイルス検定を行うことで決定された。統計的有意性は、ｐ＜０．０５で設定された。
結果
ワクシニアウイルス＋抗ＰＤ−１の併用療法の抗腫瘍効果

抗ＰＤ−１とｍＪＸ−５９４を用いた併用療法については、５×１０^５個のＲｅｎｃａ腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの右背側脇腹に注射し、腫瘍サイズが５０〜１００ｍｍ^３に達したときに治療を開始した（０日目）。マウスは４つの治療群に無作為化された：（ｉ）対照群：ＰＢＳを３日ごとに腫瘍内注射；（ｉｉ）ｍＪＸ−５９４単剤療法群：１×１０^７ｐｆｕのｍＪＸ−５９４を２日ごとに、０日目、２日目および４日目に合計３回の腫瘍内注射；（ｉｉｉ）抗ＰＤ−１単剤療法群：１０ｍｇ／ｋｇの抗体を３日ごとに、０日目、３日目、６日目および９日目の合計４回の腹腔内注射；（ｉｖ）ｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ−１の組み合わせ群：ｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１を並行して投与された。ｍＪＸ−５９４は２日ごと、０日目、２日目および４日目に合計３回、腫瘍内注射され、また抗ＰＤ−１は０日目、２日目、４日目、６日目および９日目に合計５回、腹腔内注射で投与された（図１Ａを参照）。

腫瘍増殖抑制は、対照と比較して、ｍＪＸ−５９４単剤療法群と、ｍＪＸ−５９４／抗ＰＤ−１の組み合わせ群（組み合わせ群）において観察された（図２Ａを参照）。腫瘍増殖抑制は組み合わせ群においてより顕著であった（図２Ａを参照。「ｍＪＸ５９４」および「ＰＤ１」と、「ＰＤ１＋ｍＪＸ５９４」を比較）。腫瘍増殖抑制は、抗ＰＤ−１の単剤療法群では観察されなかった（図２Ａを参照。「対照」と「ＰＤ１」を比較）。腫瘍の重量は、ｍＪＸ−５９４単剤療法群において低下したことが示された（図２Ｂを参照）。腫瘍重量における顕著な低下は、組み合わせ群で観察され、ｍＪＸ−５９４単剤療法群で観察された低下よりも大幅に大きいものであった（図２Ｂを参照）。ゆえにｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１の並行投与は、いずれの単剤療法と比較しても腫瘍の重量と体積において著しい低下をもたらした。

腫瘍周辺領域および腫瘍内領域の両方において、ＣＤ８Ｔ細胞の浸潤が、ＰＤ−１単剤療法群、ｍＪＸ−５９４単剤療法群、および並行組み合わせ群において増加していた。（図３Ａを参照）。抗ＰＤ−１単剤療法群では、中心領域よりも周辺領域でＣＤ８Ｔ細胞浸潤が増加していた一方で、ｍＪＸ−５９４群は、中心領域と周辺領域の両方でより多くの数のＣＤ８Ｔ細胞の浸潤を示した。（図３Ｂを参照）。ｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１抗体の並行投与は、対照およびいずれの剤単独の単剤療法と比較しても、腫瘍周辺および腫瘍内のＣＤ８＋染色で測定した場合に腫瘍内Ｔ細胞浸潤を著しく増加させた。（図３Ｂを参照）。血管密度の低下も、対照と比較して治療群において観察された（図３Ｂを参照）。

周辺腫瘍領域および中心腫瘍領域の両方のＰＤ−Ｌ１の発現レベルは、対照群と比較して、抗ＰＤ−１単剤療法群、ｍＪＸ−５９４単剤療法群、および並行組み合わせ群において増加していた。（図４Ａを参照）。抗ＰＤ−１単剤療法群が、中心領域よりも周辺領域で増加したＰＤ−Ｌ１発現レベルを示した一方で、ｍＪＸ−５９４単剤療法群は、周辺領域および中心領域の両方においてＰＤ−Ｌ１発現レベルの同等の増加を示した（図４Ａを参照）。ＪＸ−５９５と抗ＰＤ−１抗体の並行投与は、いずれかの剤単独の単剤療法と比較して腫瘍内ＰＤ−Ｌ１の発現を増加させた（図４Ａを参照）。Ｒｅｎｃａ腫瘍は、抗ＰＤ１免疫療法に対して抵抗性である。並行組み合わせ治療群における腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現の増加は、これらの腫瘍が、腫瘍内へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を伴って抗ＰＤ−１療法に対して感受性化したことを反映しており、治療効果の指標である。これらのパターンから、基準時ではＴ細胞は免疫抑制され、腫瘍微小環境に浸潤することができないことが示唆される。ｍＪＸ−５９４は炎症と血管拡張を生じさせ、Ｔ細胞が抗腫瘍効果を発揮できるようにしている。ｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１抗体の並行投与は、Ｔ細胞の活性化と腫瘍中心領域内へのＴ細胞の浸潤をもたらす。

カスパーゼ３染色により測定したところ、対照と比較してＰＤ−１単剤療法群、ｍＪＸ−５９４単剤療法群、および並行組み合わせ群において腫瘍内アポトーシスが増加したことが観察された（図４Ｂを参照）。いずれの単剤療法群と比較しても、並行組み合わせ群において、腫瘍内のアポトーシスの著しい増加が確認された（図４Ｂを参照）。並行組み合わせ群におけるアポトーシスと抗血管作用（図３Ｂに示す）を併せると、並行組み合わせ群における大規模な腫瘍壊死が示唆される。

ｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１抗体の並行後の免疫微小環境における変化が、ＣＤ４およびＣＤ１１ｂにより測定された場合に、対照およびいずれかの剤を用いた単剤療法と比較して観察された。（図５Ａを参照）。重要なことは、ＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍浸潤は、並行組み合わせ群において最も高かったことである。抗ＣＤ８抗体を使用してＣＤ８＋細胞を枯渇させたところ、腫瘍増殖阻害が低下したことから、抗腫瘍効果におけるこれらの細胞の役割が確認された（データは示さず）。骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が、対照群と比較して、ｍＪＸ−５９４群および並行組み合わせ群において増加していた。従来、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は単純に免疫抑制性の細胞とみなされていた。しかし近年の結果から、これらの細胞はそれほど単純には規定できないことが実証されており、αＰＤ１を用いた並行組み合わせ群で観察されたＭＤＳＣの相対的増加と、αＣＴＬＡ４を用いた並行組み合わせ群で観察されたＭＤＳＣの減少は対照的である（図１０Ａ〜１０Ｂ）。

ｍＪＸ−５９４と、ＰＤ−１±ＣＴＬＡ４の連続的な共投与と、並行的な共投与の腫瘍増殖に対する効果を評価した。５×１０^５個のＲｅｎｃａ（腎癌、同系）細胞を、８週齢の免疫能力があるＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍のサイズが５０ｍｍ^３に達した時点で、治療を開始した（０日目）。

マウスは４つの治療群に分けられた：（ｉ）対照群：０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目および１５日目にＰＢＳを注射した；（ｉｉ）ｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ−１の連続組み合わせ群：ｍＪＸ−５９４を０日目、３日目、６日目および９日目に腫瘍内注射し、抗ＰＤ−１を６日目、９日目、１２日目および１５日目に腹腔内注射した（ｉｉｉ）ｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１の並行組み合わせ群：ｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１が並行投与された。ｍＪＸ−５９４は０日目、３日目、６日目および９日目に腫瘍内注射され、抗ＰＤ−１は、０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目および１５日目に腹腔内投与された；（ｉｖ）ｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ−１＋抗ＣＴＬＡ４の３重並行組み合わせ群：ｍＪＸ−５９４は０日目、３日目、６日目および９日目に腫瘍内注射され、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ４は、０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目および１５日目に腹腔内注射された（図６を参照）。

腫瘍増殖は、対照と比較して、ｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ−１の連続投与群および並行投与群、ならびにｍＪＸ−５９４＋抗ＰＤ−１＋抗ＣＴＬＡ４の３重並行投与群で抑制された（図７を参照）。驚くべきことに、ｍＪＸ−５９４と抗ＰＤ−１の並行投与は、これらの剤の連続投与よりも腫瘍増殖をさらに大幅に抑制（遅延）させた（図７を参照）。３重並行投与群（「組み合わせ（ｍＪＸ−５９４＋αＰＤ１＋αＣＴＬＡ４）））では、さらなる腫瘍増殖の遅延が観察された。（図７を参照）。

各マウスの腫瘍サイズを治療群間で比較したところ、対照と比較して組み合わせ群で腫瘍退縮が確認された。腫瘍退縮は連続組み合わせ群では１２日目から観察されたが、並行組み合わせ群および３重並行組み合わせ群では６日目から腫瘍は退縮傾向にあった。

驚くべきことに、これらの結果は、投与レジメンと潜在的には投与経路が、併用療法の抗腫瘍効果に大きな影響を与えることができるということを示唆する。特に、ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４）が並行投与された場合、ワクシニアウイルスはチェックポイント阻害剤と相乗効果を発揮して強力な抗腫瘍免疫応答を誘導する。一部の事例では、ワクシニアウイルスが並行投与の一部として腫瘍内投与されたときに、強力な抗腫瘍免疫反応があった。ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の並行投与で観察された相乗的な抗腫瘍効果は特に驚くべきことであった。その理由は、当分野では免疫チェックポイント阻害剤は例えばワクシニアなどの腫瘍溶解性ウイルスの複製を阻害すると理解されているからである（Ｒｏｊａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９２（１Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：１４２．３（２０１４））。
ワクシニアウイルス＋抗ＣＴＬＡ４

５×１０^５個のＲｅｎｃａ（腎癌）細胞を、８週齢の免疫能力のあるＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍のサイズが５０〜１００ｍｍ^３に達した時点で、治療を開始した（０日目）。

マウスは５つの治療群に無作為化された：（ｉ）対照群：０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目および１５日目にＰＢＳを腫瘍内注射した；（ｉｉ）ｍＪＸ−５９４単剤療法群：１×１０^７ｐｆｕのｍＪＸ−５９４を０日目、３日目、６日目および９日目に腫瘍内注射した；（ｉｉｉ）抗ＣＴＬＡ４単剤療法群：４ｍｇ／ｋｇの抗体を０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目および１５日目に腹腔内注射した；（ｉｖ）ｍＪＸ−５９４＋抗ＣＴＬＡ４の連続組み合わせ群：ｍＪＸ−５９４と抗ＣＴＬＡ４は連続して投与された。ｍＪＸ−５９４は０日目、３日目、６日目および９日目に腫瘍内注射され、抗ＣＴＬＡ４は６日目、９日目、１２日目および１５日目に腹腔内注射された；（ｖ）ｍＪＸ−５９４と抗ＣＴＬＡ４の同時組み合わせ群：ｍＪＸ−５９４と抗ＣＴＬＡ４は連続的に投与された。ｍＪＸ−５９４は０日目、３日目、６日目および９日目に腫瘍内注射され、抗ＣＴＬＡ４は０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目および１５日目に腹腔内注射された（図８を参照）。

腫瘍サイズは全群で３日ごとに計測された。観察が完了したとき（１６日目）にマウスをＣＯ_２により殺処分し、腫瘍を取り出して、フローサイトメトリー解析にかけた（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣ）。

腫瘍増殖は対照と比較して全ての治療群で抑制されたことが確認された。（図９を参照）。組み合わせ治療群では著しくより多くの腫瘍増殖が抑制されたことが観察された。最も大きな腫瘍増殖抑制は、並行投与群で観察された（図９を参照）。

各マウスの腫瘍サイズを治療群間で比較したところ、単剤療法群および対照群と比較して、組み合わせ群で腫瘍退縮が確認された。対照と比較して、全ての治療群でＣＤ８Ｔ細胞の浸潤増加が観察された。（図１０Ａを参照）。対照と比較してｍＪＸ−５９４単剤療法群でＭＤＳＣのレベルが増加していた一方で、連続的組み合わせ治療群では有意な変化は観察されず、並行組み合わせ治療群ではＭＤＳＣレベルの低下が観察された（図１０Ｂを参照）。
ＪＸ９２９と免疫チェックポイント阻害剤の並行投与

腹腔内投与されたＰＤ−１チェックポイント阻害剤と並行してＩＴ投与されたＪＸ９２９（６×１０^７ｐｆｕ）に関する、上述のマウスＲｅｎｃａモデルにおける抗腫瘍効果を試験した。ＪＸ９２９は、ウイルスのＴＫ遺伝子とＶＧＦ遺伝子が破壊されたＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルス（ＴＫ⁻／ＧＦ⁻表現型）であり、ＧＭ−ＣＳＦを発現しない。
細胞株−

マウスＲＥＮＣＡ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養し、５％ＣＯ_２、３７℃で維持した。
インビボ実験−

８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｌのＰＢＳ中のＲＥＮＣＡ細胞（２×１０^６個の細胞）を、左腎の被膜下へと注射した。移植後１０日目に、Ｒｅｎｃａ腫瘍を担持するマウス（ＩＶＩＳ（登録商標）スペクトラムインビボイメージングシステムを用いて可視化されたときに５０ｍｍ^３〜１００ｍｍ^３）に、図１Ｂ示されるレジメンに従い、（ｉ）ＰＢＳ（対照）、（ｉｉ）ワクシニアウイルス（ＪＸ−９２９）単剤療法（６×１０^７ＰＦＵを移植後１０、１１および１２日目に合計３用量）、（ｉｉｉ）抗ＰＤ１単剤療法（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社、ニューハンプシャー州ＷｅｓｔＬｅｂａｎｏｎ、１００μｌ）（移植後１０、１１および１２日目に合計３用量）、または（ｉｖ）ＪＸ９２９＋抗ＰＤ１の並行治療（それぞれ移植後１０、１１および１２日目に投与された。ＪＸ−９２９は午前に投与され、ＩＣＩは同じ日の午後に９時間の間隔で投与された）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ）で治療を行った。

さらなる組織学的解析およびフローサイトメトリー解析のために、最後の治療の２日後にマウスを殺処分した。
フローサイトメトリー−

末梢血サンプルを採取し、赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解させた。１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、その後、モノクローナルマウス抗ＣＤ８抗体、ウサギ抗ＣＤ４抗体、ウサギ抗ＣＤ３抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国カリフォルニア州）で染色した。４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギ抗体またはヤギＡＰＣ結合抗マウス抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）とともにインキュベートした。各サンプルに対し、１０，０００個の細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州）を使用して解析した。
組織学的解析−

マウスを安楽死させ、腫瘍を担持した腎臓および肺を含む生体臓器を得て、１０％中性化ホルマリン（ＢＢＣＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社、米国ワシントン州）で固定した。組織をパラフィン中に包埋し、切片（４μｍの厚さ）を基本的な組織学的解析のためにヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。免疫蛍光法および免疫組織化学的方法のために、切片を、ＣＤ８に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国カリフォルニア州）を使用した標準的な方法により染色した。次いで切片を、免疫蛍光法用のＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、またはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）ＥｌｉｔｅＡＢＣ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−キット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国カリフォルニア州）のいずれかとともにインキュベートし、免疫組織化学的方法用にＶｅｃｔｏｒＳＧ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で可視化した。各治療群から採取した腫瘍の重量と体積を測定し、比較した。
ＥＬＩＳｐｏｔＡｓｓａｙ−

ＩＦＮγ分泌細胞を、製造者のプロトコールに従いＥＬＩＳｐｏｔマウスＩＦＮγキット（Ｍａｂｔｅｃｈ社、オハイオ州Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ）を使用して評価した。脾臓を単離し、単一細胞懸濁液として調製した。ＲＥＮＣＡ腫瘍細胞またはワクシニアウイルスに感染したマウスの脾臓細胞と、脾臓細胞を５：１の比率で混合し、２４時間、３７℃でインキュベートした。特異的スポットの強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して分析した。
統計解析−

全ての値は、平均±標準偏差（ＳＤ）として表された。統計解析はＩｎｓｔａｔ３（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ社、米国カリフォルニア州）を使用して実施された。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と対応有りのボンフェローニポストホック対比較検定を使用して多重比較を分析した。
ｍＪＸ５９４治療は、チェックポイントタンパク質の発現を誘導する。

５０ｍｍ^３を越えるＲｅｎｃａ腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃマウスに、図１Ｃに示される治療レジメンに従い、ｍＪＸ５９４（０、３、６および９日目の各々に１×１０^７）の腫瘍内用量を４回投与し、またはＰＢＳ対照とした。

対照動物およびｍＪＸ−５９４治療動物の腫瘍中の免疫チェックポイントタンパク質のレベルは、０日目（治療前）および１２日目の殺処分時に測定された。図１３は、対照マウスと比較した、ｍＪＸ−５９４治療マウスにおける治療後のチェックポイントタンパク質の倍数変化を図示する。図１３に示されるように、ｍＪＸ５９４治療は、ＰＤ−１（４倍増加）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４（２倍を超える増加）、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３（３倍を超える増加）およびＴＩＧＩＴ（２倍を超える増加）を含む、チェックポイントタンパク質の発現を誘導する。複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた治療は、チェックポイントタンパク質のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３およびＴＩＧＩＴにおける著しい増加を含む、腫瘍免疫微小環境の動的な変化をもたらし、それにより、それぞれのチェックポイント阻害剤を用いたこれらのチェックポイントタンパク質の各々の遮断に対し、腫瘍を感受性化させた。臨床試験により、腫瘍浸潤細胞およびチェックポイントタンパク質（例えばＰＤ−Ｌ１）発現が、チェックポイント阻害剤を用いた治療（例えば抗ＰＤ−Ｌ１治療）に対する可能性の指標であることが実証されており、特定のチェックポイントタンパク質を発現する腫瘍を有する患者においてのみならず、特定のチェックポイントタンパク質を低レベルで発現する（または発現していない）腫瘍を有する患者においても、本明細書に記載される併用療法の有効性が支持される。
実施例２

腫瘍内の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる腫瘍微小環境の再構築が、免疫チェックポイント遮断剤の有効性が強化する
要約

癌免疫療法は、強力で持続的な治療方法であるが、その臨床上の利益は未だ普遍的ではない。本明細書において、本発明者らは、標的化され、かつＧＭ−ＣＳＦで武装強化された腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＶＶ）であるｍＪＸ−５９４を、移植腎癌、結腸癌、および自発性乳癌を有するマウスにおいて免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の組み合わせパートナーとして採用した。ＶＶの腫瘍内注射により、腫瘍微小環境の広範囲な再構築が誘導され、非Ｔ細胞非炎症性腫瘍から、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数の増加とエフェクター機能の強化を伴うＴ細胞炎症性腫瘍へと、腫瘍が変化した。さらにＶＶとＩＣＩの併用療法は、生存率の改善と抗転移の効果とともに、腫瘍退縮を誘導することができた。本発明者らの発見から、ＶＶが、ＩＣＩとの組み合わせで強固な抗癌免疫を惹起させ、免疫療法抵抗性が克服されたことが示される。
イントロダクション

ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４を標的とする免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を用いた癌免疫療法は、強力で持続的な治療有効性を実証しており、癌との闘争における新たな武器として浮上してきた（Ｈｅｇｄｅｅｔａｌ．，２０１６；Ｔｏｐａｌｉａｎｅｔａｌ．，２０１５；ＷｏｌｃｈｏｋａｎｄＣｈａｎ，２０１４）。しかしながらＩＣＩの臨床上の有効性は、Ｔ細胞炎症性の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を有する腫瘍に限定されている（Ｇａｊｅｗｓｋｉ，２０１５；Ｔｏｐａｌｉａｎｅｔａｌ．，２０１６）。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）がわずかしかない、免疫原性の乏しい腫瘍では、ＴＭＥはＩ型インターフェロンの特徴と、Ｔ細胞リクルートのためのケモカインを欠いている（Ｇａｊｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，２０１３）。さらに腫瘍の脈管系と間質成分は、Ｔ細胞の腫瘍内輸送と、腫瘍細胞に対するそれらのエフェクター機能に対し障壁を生じさせる場合がある（ＤｅＰａｌｍａａｎｄＪａｉｎ，２０１７；ＲｉｖｅｒａａｎｄＢｅｒｇｅｒｓ，２０１５；Ｓｈａｒｍａｅｔａｌ．，２０１７）。ゆえに、これらの非Ｔ細胞炎症性腫瘍に対し、ＴＭＥを適切に再構築して、これらの腫瘍をＩＣＩ治療に対してより感受性のあるものにするための追加的な治療介入が必要とされている。

腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、抗癌療法の新規なクラスとして提唱されており、異なる骨格と導入遺伝子を有するＯＶが現在臨床試験で評価されている（Ｂｅｌｌ，２０１４；Ｌｉｃｈｔｙｅｔａｌ．，２０１４）。ＯＶの成功は、過去十年間の当初、その素早い複製と強化された腫瘍溶解能力により評価されていたが、現在ではＯＶは免疫療法として認識され始めている。その理由は、腫瘍溶解性ウイルス療法を行った後の最も強力で持続的な応答は、腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞とメモリーＴ細胞の増加を伴う、抗腫瘍免疫の誘導の成功と結びつけられたためである（Ｂｅｌｌ，２０１４；ＣｈｉｏｃｃａａｎｄＲａｂｋｉｎ，２０１４；Ｔｈｏｒｎｅ，２０１４）。とはいえ、ＯＶの治療有効性は、免疫抑制性のＴＭＥにより大きく阻害されるため、免疫システムのブレーキを開放することが、ＯＶの免疫療法的有効性を最大化するために極めて重要である（ＢｅｌｌａｎｄＩｌｋｏｗ，２０１７；Ｈｏｕｅｔａｌ．，２０１６；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１７）。ゆえに、ＯＶとＩＣＩの組み合わせは、乏しい免疫原性と免疫抑制性ＴＭＥを克服する合理的で好ましい戦略である。

ＪＸ−５９４（ペキサスチモジンデバシレプベク、Ｐｅｘａ−ｖｅｃ）は、免疫活性化導入遺伝子であるＧＭ−ＣＳＦを発現するよう操作され、かつウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子が破壊された腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＶＶ）である（ＫｉｒｎａｎｄＴｈｏｒｎｅ，２００９）。ＪＸ−５９４は、目覚ましい抗癌活性を示し、前臨床試験および臨床試験では低毒性であり、そして臨床開発において最も実現可能で有望なＯＶプラットフォームの内の１つとなった（Ｂｒｅｉｔｂａｃｈｅｔａｌ．，２０１１ａ；Ｃｒｉｐｅｅｔａｌ．，２０１５；Ｈｅｏｅｔａｌ．，２０１３；Ｐａｒｋｅｔａｌ．，２００８）。その腫瘍溶解性と血管破壊活性とは別に、ＪＸ−５９４は、ｉｎｓｉｔｕの癌ワクチン効果を呈すると提唱されている。その理由は、選択的な腫瘍破壊と、それに引き続く追加的な腫瘍抗原の放出のために、腫瘍抗原に対する適応免疫応答を惹起することができるためである（Ｂｒｅｉｔｂａｃｈｅｔａｌ．，２０１１ｂ；Ｂｒｅｉｔｂａｃｈｅｔａｌ．，２０１５ａ）。現在、ＪＸは−５９４には、進行性肝細胞癌における第ＩＩＩ相無作為化臨床試験が行われている（Ａｂｏｕ−Ａｌｆａｅｔａｌ．，２０１６）。しかしほとんどの研究は、ＪＸ−５９４治療後の原発性ＴＭＥならびに離れた病変部位におけるその免疫調節機能を特徴化することができていない（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２０１８）。さらに、例えばＩＣＩなどの免疫療法とＪＸ−５９４の最適な組み合わせは未だ追跡中であり、検証中である。

本明細書において、本発明者らは、ＪＸ−５９４のマウスバリアント（ｍＪＸ−５９４、ＷＲ．ＴＫ⁻ｍＧＭ−ＣＳＦ）を用いたＴＭＥの動的な再構築を包括的に分析し、その免疫療法的な潜在力を調査して、免疫原性が劣る腫瘍モデルにおけるＩＣＩを用いた合理的な組み合わせ戦略を提供する。
結果
ｍＪＸ−５９４は、免疫抑制性の非炎症性腫瘍を、炎症性腫瘍へと転換する

腫瘍溶解性ウイルスであるｍＪＸ−５９４の免疫調節能力を決定するために、本発明者らは、免疫原性が劣るＲｅｎｃａ腫瘍における単回ｍＪＸ−５９４注射後の腫瘍微小環境の経時的な変化を検証した。ｍＪＸ−５９４のレベルは注射後１日目ですでに高く、３日目にピークを迎え、７日目にはほぼ検出不可能となった（図３３Ａおよび３３Ｂ）。対照的に、腫瘍血管系は、ウイルスレベルに対して反対の応答を示した。腫瘍血管密度は注射後１日目〜３日目の間は著しく減少したが、７日目以降には回復した（図３３Ａおよび３３Ｂ）。このことから、ｍＪＸ−５９４は強力ではあるが一過性の腫瘍血管破壊を誘導したことが示唆される。注記すべきは、抗癌免疫の最も重大な側面を担う腫瘍内領域中のＣＤ８^＋細胞障害性Ｔ細胞群は、注射後５日目で際立って増加を開始し、７日目でピークを迎え、２週間目でも高密度を維持していた（図３３Ａおよび３３Ｂ）。このことから、ｍＪＸ−５９４によって非炎症性腫瘍からＴ細胞炎症性腫瘍への明白で長期的な転換がはっきりと実証される。比較として、ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞（ＤＣ）は３日目で一過性に出現したが、その後は減少した（図３３Ａおよび３３Ｂ）。ＰＤ−Ｌ１発現のレベルは０日目で最低であり、ｍＪＸ−５９４治療後はアップレギュレートされた（図１Ａおよび１Ｂ）。興味深いことに、ＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションのタイミングは、ＣＤ８^＋ＴＩＬの膨大な流入の直後であり（図１Ｃ）、このことから、Ｔ細胞介在性免疫を抑制しようとする負のフィードバック経路の活性化が示唆される。ＰＤ−Ｌ１発現細胞のほとんどはサイトケラチン^＋腫瘍細胞であり、一部のＣＤ１１ｂ^＋骨髄細胞もＰＤ−Ｌ１を発現する。一方でＴ細胞は発現しなかった（図１Ｄ）。ゆえにｍＪＸ−５９４は強力で持続的な抗癌免疫のエンハンサーであり、細胞障害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を冷たい腫瘍へ、そして一過性の腫瘍血管系破壊物質へとリクルートする。

ｍＪＸ−５９４により調節される癌免疫経路を解明するために、本発明者らは７５０個の免疫関連遺伝子のｍＪＸ−５９４単剤療法後の発現レベルの変化を、ＰａｎＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｅＰｒｏｆｉｌｉｎｇパネルを使用して包括的に分析した。結果から、免疫特性に関連した遺伝子において、対照腫瘍とｍＪＸ−５９４治療された腫瘍の間には際立った違いが示された（図３３Ｅ）。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の活性化、ＤＣ成熟およびＴ細胞活性化に関与する遺伝子を含む、およそ１００個の免疫調節性遺伝子が、その発現レベルにおいて統計的に有意な変化を呈していた（図３３Ｆ）。特に本発明者らは、ＴＭＥにおいて、対照と比較して阻害性（Ｐｄ−１、Ｐｄ−ｌ１、Ｃｔｌａ−４、およびＬａｇ−３）およびアゴニスト性（Ｉｃｏｓ、ＧｉｔｒおよびＣｄ２７を含む）の両方の免疫チェックポイント分子の発現が全体的により高いことを観察した（図３３Ｇ）。さらにＴＭＥを分析したところ、Ｔｈ１およびＴｈ２の応答に関連した遺伝子の増加が明らかとなり、このことから、ｍＪＸ−５９４単剤療法による免疫調節が示唆される（図３３Ｇ）。また本発明者らは、ＴＭＥと骨髄細胞に関与するいくつかの遺伝子が著しく上昇したことも見出した（図３３Ｇ）。特にＮｏｓ２とＣｄ８６の発現増加は、骨髄細胞がＭ１マクロファージへと分極したことを表す。これらの結果から、ｍＪＸ−５９４はＴＭＥの動的な変化を通して長期的な免疫活性化を惹起し、非炎症性腫瘍を、免疫チェックポイント遮断剤に応答することができるＴ細胞炎症性腫瘍へと再構築することが示される。
ｍＪＸ−５９４はＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内浸潤を増大させ、骨髄細胞の再分極を誘導する

ｍＪＸ−５９４誘導性の腫瘍増殖遅延は、用量依存性であった（図３４Ａおよび３４Ｂ）。並行して、腫瘍周辺領域および腫瘍内領域の両方におけるｍＪＸ−５９４誘導性のＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤の増加も用量依存性であった（図３４Ｃおよび３４Ｄ）。実際のところ、リンパ細胞分画のフローサイトメトリーサブセット解析でも、ｍＪＸ−５９４誘導性の腫瘍内ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の絶対数の増加が用量依存性であったことが明らかとなった（図３４Ｅおよび３４Ｇ）。ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ２５^＋の制御性Ｔ細胞数もｍＪＸ−５９４の３重投与の後に増加している（図３４Ｈ）が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞と制御性Ｔ細胞の比率は、対照治療群のものと比較して５．３倍高く（図３４Ｉ）、このことから、ｍＪＸ−５９４治療による、ＴＭＥにおけるＴ細胞エフェクター機能の全体的な上昇が示唆される。さらに、共刺激マーカーおよびＴ細胞活性化のマーカーであるＩＣＯＳおよびグランザイムＢ（ＧｚＢ）の発現も、ｍＪＸ−５９４治療後にＣＤ８^＋Ｔ細胞において増加した（図３４Ｊ）。骨髄細胞分画のさらなるサブセット解析を行うことにより、ｍＪＸ−５９４治療を用いて治療された腫瘍において、ＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^＋骨髄細胞分画に有意な変化はなかったことが明らかとなった（図３４Ｋ）。しかしながらＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ⁻Ｌｙ６Ｃ^＋単球骨髄細胞分画は増加しており、一方でＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｉｎｔ顆粒球骨髄細胞分画は減少していた。このことからｍＪＸ−５９４投与後の骨髄細胞の分極が示唆される（図３４Ｌおよび３４Ｍ）。これらの発見から、ｍＪＸ−５９４の反復投与により抗癌免疫が強化され、活性化Ｔ細胞の浸潤増加と、骨髄細胞の再分極がもたらされることが実証される。
ｍＪＸ−５９４の腫瘍内注射により、全身性で癌特異的な免疫応答が生じる

ｍＪＸ−５９４の局所注射が、注射されていない離れた腫瘍においても全身性の免疫応答を誘導することが可能であることを決定するために、本発明者らはＲｅｎｃａ腫瘍を両側の脇腹へと移植した後、右側の腫瘍内にｍＪＸ−５９４を投与した。この治療により、右側と左側（反対側であり、注射されていない部位）の両方のＲｅｎｃａ腫瘍の増殖が抑制された（図３５Ａ）。両側部位での腫瘍増殖阻害と一致して、腫瘍内領域でのＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤も、右側と左側の両方のＲｅｎｃａ腫瘍で７．９倍および５．５倍増加しており（図３５Ｂおよび３５Ｃ）、このことから、局所的なｍＪＸ−５９４ウイルス療法が、全身性の抗癌免疫を強力に活性化できることが示唆される。

次に、局所的なウイルス療法の後に、全身循環を通じて、離れた腫瘍へと直接ウイルスが拡散した可能性を排除するために、本発明者らは、左側の注射されていないＲｅｎｃａ腫瘍におけるウイルス複製を検証し、左側の腫瘍には検出可能なワクシニアウイルスが存在しなかったことを見出した（図４１）。このことから、ｍＪＸ−５９４の抗癌活性は免疫介在性であり、全身性のウイルス拡散の結果ではなかったことが示唆される。

観察された全身性の免疫応答が腫瘍特異的であるかどうかを評価するために、本発明者らは、右脇腹にＲｅｎｃａ腫瘍が移植され、左脇腹にＣＴ２６腫瘍が移植されたマウスを使用した類似実験を実施した。ｍＪＸ−５９４を用いて右側のＲｅｎｃａ腫瘍を腫瘍内治療したところ、注射された腫瘍の増殖が著しく減少した。一方で左側の治療されていないＣＴ２６腫瘍の増殖は影響を受けなかった（図３５Ｄ）。顕微鏡解析でも一致した結果が示されており、ＲｅｎｃａにはＣＤ８＋Ｔ細胞が蓄積されていたが、ＣＴ２６腫瘍には蓄積していなかった（図３５Ｅおよび３５Ｆ）。このことからｍＪＸ−５９４ウイルス療法は、腫瘍特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞反応を誘導したことが示唆される。ゆえにこれらの結果から、局所的なｍＪＸ−５９４治療は全身的な抗癌免疫を惹起させ、離れた腫瘍においてさえも腫瘍特異的なリンパ球浸潤を発生させ得ることが示唆される。
抗癌免疫は、ＪＸの全治療有効性において重要な役割を果たす

免疫系のどの構成要素がｍＪＸ−５９４の治療有効性に寄与しているのかを決定するために、本発明者らは、ＣＤ８、ＣＤ４またはＧＭ−ＣＳＦに対する中和抗体を用いて処理されたマウスにおける、腫瘍に対するその効果を検証した（図３６Ａ）。特筆すべきは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞のいずれかを枯渇させると、ｍＪＸ−５９４単剤療法による腫瘍増殖の効果的な阻害が無効化されたことである（図３６Ｂおよび３６Ｃ）。このことから、ｍＪＸ−５９４誘導性の腫瘍阻害において、直接的な腫瘍溶解よりも免疫介在性の機序の重要性が強調される。驚くべきことに、ｍＪＸ−５９４注射時にＣＤ４^＋Ｔ細胞を枯渇させると、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内浸潤が減少した（図３６Ｄ）。このことから、ＴＭＥにおけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化およびリクルートにＣＤ４^＋Ｔ細胞が関与していることが示唆される。しかしながらＣＤ８^＋Ｔ細胞枯渇はＣＤ４^＋Ｔ細胞の浸潤をそれほど変化させなかった（図３６Ｅ）。このことから、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＴＭＥ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞に影響を与えなかったことが示される。これらのデータから、ｍＪＸ−５９４の腫瘍内治療は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞のプライミングを誘導し、これらが互いに相互作用して抗癌免疫を介在し得ることが示される。ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスを基にした過去のウイルス療法では、ＧＭ−ＣＳＦを、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をリクルートおよび活性化させて、その後にＴ細胞応答をトリガさせる免疫活性化用の導入遺伝子として利用していた。しかしながらＧＭ−ＣＳＦの使用は議論の的となっており、その理由は、例えば骨髄由来抑制性細胞（ＭＤＳＣ：ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｃｅｌｌｓ）の増殖の誘導など、腫瘍進行におけるその潜在的な免疫抑制的な役割があるためである（Ｔｈｏｒｎｅ，２０１４）。その結果、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦがｍＪＸ−５９４の治療効果に必要か否かを調査した。興味深いことにＧＭ−ＣＳＦを枯渇させることでｍＪＸ−５９４の抗腫瘍効果が無効化されてしまい、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方のレベルが減少したことから、ＧＭ−ＣＳＦはｍＪＸ−５９４の免疫治療的有効性には重要であることが提唱される（図３６Ｃ〜３６Ｅ）。ゆえにＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方ともが、ｍＪＸ−５９４の抗癌効果において必須のメディエーターであり、ＧＭ−ＣＳＦは免疫療法の利益をもたらし得る。
ｍＪＸ−５９４と免疫チェックポイント遮断剤の組み合わせは相乗的な抗癌効果を惹起し、腫瘍内へのＴリンパ球の浸潤を強化する。

ＩＣＩ単剤療法に対する抵抗性を克服するために、本発明者らは、ｍＪＸ−５９４とＩＣＩの組み合わせの利益を評価した。治療後１２日目において、αＰＤ−１およびｍＪＸ−５９４のそれぞれの単剤療法が、２２．８％および４４％だけ腫瘍増殖を遅延させた一方で、αＰＤ−１とｍＪＸ−５９４の組み合わせは腫瘍増殖を７０％だけ低下させた。（図３７Ａおよび３７Ｂ）。これらの発見を補強するために顕微鏡解析を行ったところ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のリクルートは、対照と比較して、併用療法で治療された腫瘍の腫瘍周辺領域（１８．８倍）および腫瘍内領域（２１．４倍）の両方において著しく増加していたことが判明した（図３７Ｃおよび３７Ｄ）。ＣＤ３１^＋腫瘍血管は、これらの領域において有意義な程度にまで低下していた（それぞれ１．８倍および２．６倍。図３７Ｃおよび３７Ｄ）。これに加えて、対照と比較し、併用療法で治療された腫瘍において、より多くの腫瘍アポトーシスが指摘された（図５Ｃおよび５Ｄ）。ＰＤ−Ｌ１の発現は対照腫瘍では最小限であったが、ｍＪＸ−５９４治療の後では高度にアップレギュレートされている（図３７Ｃおよび３７Ｄ）。この発見は、ＴＭＥで誘導されたＰＤ−Ｌ１発現は、腫瘍溶解性ウイルス療法後の抗癌免疫を抑制する適応的な負のフィードバック機構であることを示唆し、それゆえに、ｍＪＸ−５９４の免疫療法効果を強化するためのｍＪＸ−５９４とＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断剤の併用療法の合理性を提供するものである（図３７Ｅ）。

全体として、これらの結果は、併用療法は、ｍＪＸ５９４またはαＰＤ−１単剤療法に対する抵抗性を、ＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤の増加を介して抗癌免疫を強化することによって克服することができるということを示唆するものである。

同様に、αＣＴＬＡ−４とｍＪＸ−５９４を用いた組み合わせ治療も相乗的であった。腫瘍増殖はｍＪＸ−５９４（４２．０％）またはαＣＴＬＡ−４（２０．０％）のいずれかの単剤療法でも多少は阻害されていたが、併用療法を用いることでより強力な阻害（５７．６％）が観察された（図４２Ａおよび４２Ｂ）。これに加えて、併用療法を行った後、対照と比較して、腫瘍の周辺領域（２７．０倍）および中心領域（２６．４倍）の両方においてＣＤ８^＋Ｔ細胞のより高度な蓄積が観察された（図４２Ｃおよび４２Ｄ）。腫瘍内ＣＤ８^＋Ｔ細胞レベルの増加とともに、周辺領域および中心領域の両方において対照と比較してＣＤ３１^＋血管も著しく破壊された（それぞれ２．１倍、３．８倍の低下。図４２Ｃおよび４２Ｅ）。さらにフローサイトメトリーから、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の腫瘍内浸潤も、ｍＪＸ−５９４およびαＣＴＬＡ−４の併用療法により増加したことが明らかとなった（図４２Ｆ〜４２Ｈ）。

まとめると、これらの結果から、ｍＪＸ−５９４とＩＣＩを使用した併用療法は、免疫抑制性のＴＭＥにおける免疫療法抵抗性を克服することができ、それにより相乗的な抗癌効果をもたらすことが示される。
腫瘍内ｍＪＸ−５９４とＩＣＩを用いた組み合わせ免疫療法の有効性は、治療スケジュールに大きい影響を与えない

ＩＣＩはウイルス複製に負の影響を与え、早過ぎるＯＶのクリアランスをもたらす可能性があることから、いくつかの研究は全身性腫瘍溶解性ウイルス療法とＩＣＩの組み合わせを使用する最適な治療スケジュールを探索しており、一部の併用スケジュールが治療有効性に拮抗を誘発する可能性があることが報告されている（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１７；Ｒｏｊａｓｅｔａｌ．，２０１５）。しかしながら局所的な腫瘍溶解性ウイルス療法を検証する同様の研究は報告されていない。腫瘍内ｍＪＸ−５９４とＩＣＩの最適な併用スケジュールを確立させるために、本発明者らは、以下を比較した：（１）ｍＪＸ−５９４とＩＣＩの同時投与（スケジュールＩ）、（２）ｍＪＸ−５９４の投与の３日後にＩＣＩを開始（スケジュールＩＩ）、および（３）ＩＣＩ開始の３日後にｍＪＸ−５９４の投与（スケジュールＩＩＩ）（図３８Ａ）。全ての併用スケジュールが、腫瘍増殖を約４０％まで遅延させた（図３８Ｂおよび３８Ｃ）。同様に、腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞のレベルも、それぞれ８倍超および４．０倍超だけ増加しており、ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＩＣＯＳとＧｚＢの発現レベルの著しい増加も示す（図３８Ｄ〜３８Ｆ）。

ｍＪＸ−５９４とαＰＤ−１を用いた併用療法と同様に、ｍＪＸ−５９４とαＣＴＬＡ−４の組み合わせも、治療スケジュールにかかわらず約４０％だけ腫瘍増殖を阻害した（図４３Ａおよび４３Ｂ）。さらにＣＤ８^＋Ｔリンパ球とＣＤ４^＋Ｔリンパ球の腫瘍内浸潤（それぞれ７倍超および７倍超の増加）ならびにＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＧｚＢおよびＩＣＯＳの発現も、治療スケジュールにかかわらずより高かった（図４３Ｃ〜４３Ｅ）。

これらをまとめると、ｍＪＸ−５９４の腫瘍内注射と、全身的な免疫チェックポイント遮断剤を用いた併用療法は、治療スケジュールと関係なく、有効な抗癌免疫応答を生じさせるものであり、ｍＪＸ−５９４の腫瘍内投与はＩＣＩ投与のスケジュールを変化させても著しい影響は受けないことが示唆される。
ｍＪＸ−５９４、αＰＤ１、およびαＣＴＬＡ４の３重組み合わせは移植腎癌において完全な腫瘍退縮を誘導することができ、長期間の生存利益を提供する

ｍＪＸ−５９４とＩＣＩの２重組み合わせが完全な腫瘍退縮を誘導しなかったことから、本発明者らは、ｍＪＸ−５９４、αＰＤ−１およびαＣＴＬＡ−４の３重併用療法を調査した。αＰＤ−１とαＣＴＬＡ−４の２重組み合わせは１４．５％だけ腫瘍増殖を遅延させ、ｍＪＸ５９４の単剤療法は３６．９％だけ腫瘍増殖を阻害し、３重組み合わせは７６．５％だけ腫瘍増殖を阻害した（図３９Ａおよび３９Ｂ）。特にこの３重組み合わせ群の一部（約４０％）が、完全腫瘍退縮をもたらした。この現象は他のいずれの群でも観察されなかった（図３９Ｃ）。

３重併用療法により誘導されたこの強力な抗癌効果の結果として、長期間の生存利益がもたらされたのかどうかを確認するために、本発明者らは腫瘍担持マウスの生存解析を実施した。実際に、３重併用療法で治療されたマウスは、他の治療と比較して著しい生存利益を呈した（図３９Ｄ）。さらに完全に腫瘍退縮したマウスは、治療終了後１２週を越える間無腫瘍であり、腫瘍細胞の再チャレンジに対しても完全に防御されたことから、効果的で長期的な免疫記憶が確立されたことが示唆される（図３９Ｅ）。

これらの発見は、３重組み合わせ免疫療法が、完全な腫瘍退縮と長期的な生存を誘導する可能性を有することを実証する。
３重併用療法は、自然発生的な乳癌モデルにおいて抗癌免疫応答を強化する。

免疫抵抗性腫瘍における３重併用療法の長期的な免疫療法効果を厳密に立証するために、本発明者らはＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニックマウスモデルを採用した。このモデルは癌免疫療法に対する内因性の抵抗性を有する自然発生的乳癌モデルである（Ｓｃｈｍｉｔｔｎａｅｇｅｌｅｔａｌ．，２０１７）。治療の４週間後、ｍＪＸ−５９４、αＰＤ−１およびαＣＴＬＡ−４の３重組み合わせを用いて治療されたマウスは、対照マウスと比較して、３８．７％だけの全腫瘍担持量の著しい低下と、触診可能な乳腺腫瘍結節数の著しい低下を呈した（図４０Ａ〜４０Ｄ）。さらに３重併用療法は、他の治療法と比較して、各腫瘍結節の平均サイズにおいて４８．１％の低下をもたらし、全体的な生存率を改善した（図４０Ｅ〜４０Ｆ）。組織学的解析（図４０Ｇ、詳細な説明に関しては凡例を参照）から、３重組み合わせ群において浸潤癌はより少なく、腫瘍辺縁は良好に維持されていたことが明らかとなった。このことから３重組み合わせが腫瘍の進行と浸潤を効果的に遅延させたことが示される。他方で、αＰＤ−１とαＣＴＬＡ−４の２重組み合わせで治療された腫瘍は、対照群と同等の浸潤癌の表現型を示しており、周辺組織への浸潤と、腫瘍細胞の固形シートを形成していた。その結果、３重併用療法後、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内リクルートは、他のあらゆる治療法と比較して５０倍超にまで著しく増加していた（図４０Ｈおよび４０Ｉ）。しかしながら腫瘍血管密度は、治療群間で同等であった（図４０Ｊ）。これらの発見から、血管破壊の効果ではなく、抗癌免疫の強化が、ｍＪＸ−５９４とＩＣＩを用いた３重組み合わせ免疫療法の長期的な治療有効性に重要であることが示される。最後に、血行性の肺転移の数が、３重組み合わせ群で著しく低下していた（図４０Ｋおよび４０Ｌ）ことから、３重併用療法による効果的な抗転移効果を示す。

まとめると、これらの結果から、ｍＪＸ−５９４とＩＣＩを用いた３重組み合わせ免疫療法が、免疫原性が劣る自然発生的乳癌モデルにおいてさえも強固な抗癌免疫応答を惹起することができることが実証された。
考察

本明細書において、本発明者らは、ｍＪＸ−５９４とＩＣＩを用いた併用療法が、免疫抵抗性の腫瘍に対する効果的な治療戦略であることを実証した。併用療法により免疫学的な「沸点」を生じさせ、この沸点で、冷たく、非炎症性の腫瘍が充分に炎症化されて、宿主の免疫系が腫瘍細胞を除去することができるようになる。最も強力な効果は、ｍＪＸ−５９４、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ４を用いた３重免疫療法で観察され、この療法によって、免疫療法に対して最も抵抗性の同系腫瘍の１つであるＲｅｎｃａ腫瘍の約４０％で完全退縮が誘導された。この強力な相乗効果は、ＯＶとＩＣＩの相互補完的な協力関係により説明することができる。

ＪＸ−５９４は、臨床試験で最も進行した段階にあるＯＶであり、様々な機序を介して作用することが知られている（Ａｂｏｕ−Ａｌｆａｅｔａｌ．，２０１６）。ＪＸ−５９４は素早く直接的な腫瘍溶解と腫瘍中の血管の破壊を誘導することができるが、これらの効果は一過性であり、注射の１週間以内にほとんどが消滅する。それ以降はＣＤ８^＋Ｔ細胞が大規模に腫瘍を浸潤し、抗癌免疫応答を開始させる。しかしながらそれと同時に腫瘍は、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４などの免疫阻害性チェックポイント分子をＴＭＥにおいてアップレギュレートすることで、免疫介在性の排除を回避するよう進化し始める。ＯＶの最も強力で持続的な抗癌効果は、抗腫瘍免疫の順調な導入と維持が連動したときに実現されるため、ＩＣＩとＯＶを組み合わせて、ＯＶ誘導性の抗癌免疫の早期シャットダウンを防止することは合理的である。

ＩＣＩ単剤療法は癌治療の情勢に革命をもたらしたが、その劇的な治療応答は、患者の一部に限定されている。このことから、免疫学的に「熱い」腫瘍または「冷たい」腫瘍という概念が形成された。熱い腫瘍は、ＴＩＬで免疫学的に炎症化され、ＰＤ−Ｌ１が高発現するため、ＩＣＩに良好に応答する。一方で冷たい腫瘍は、ＣＤ８^＋ＴＩＬが乏しく、免疫抑制性のＴＭＥがあるために、ＩＣＩに対して不応性である（ＢｅｌｌａｎｄＩｌｋｏｗ，２０１７；Ｇａｊｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，２０１３）。ゆえに現在は免疫学的に冷たい腫瘍を熱い腫瘍へと転換させることで、ＩＣＩに対する抵抗性を克服することに研究の焦点が置かれている。この態勢において、本発明者らの結果は、ＩＣＩに対する理想的な組み合わせパートナーとしてのｍＪＸ−５９４を提示する。ｍＪＸ−５９４は選択的に腫瘍細胞中で複製して、腫瘍細胞を破壊し、そして腫瘍抗原を放出させて、宿主の免疫系を刺激することができる。さらに本発明者らの研究により、腫瘍内の炎症性反応、すなわちＴｈ１応答の誘導、Ｔ細胞の活性化とリクルート、ＰＤ−Ｌ１のアップレギュレート、および抗腫瘍活性へと向かう骨髄細胞の分極化を誘導することで、ＴＭＥを冷たい状態から熱い状態へと劇的に転換できることが示された。興味深いことに、ＯＶの複製と拡散は、冷たい腫瘍においてより活性であることが知られている。冷たい腫瘍ではＯＶを排除する免疫細胞がわずかしか存在せず、一方で豊富な在留ＴＩＬを有する熱い腫瘍は、早過ぎるＯＶのクリアランスを誘導し、その治療効果を減弱させてしまう可能性がある（ＢｅｌｌａｎｄＩｌｋｏｗ，２０１７）。ゆえに、本研究の結果とまとめると、ｍＪＸ−５９４は、ＩＣＩにとって、特に内因的に免疫療法に抵抗性の冷たい非炎症性腫瘍にとって、最適な組み合わせパートナーである。

ＧＭ−ＣＳＦは、最も普遍的に使用されているＯＶの治療用遺伝子搭載物である。最も進行した臨床試験段階にある２つのＯＶはＴ−ＶｅｃとＰｅｘａ−Ｖｅｃ（ＪＸ−５９４）であり、それら両方ともがＧＭ−ＣＳＦを搭載している。ＧＭ−ＣＳＦは一般的に例えばＤＣなどの様々な免疫細胞の増殖を誘導することが知られているが、例えばＭＤＳＣなどの免疫抑制性細胞の望ましくない増殖に関する懸念がある（Ｈｏｕｅｔａｌ．，２０１６）。本研究において本発明者らは、ｍＪＸ−５９４が腫瘍内のＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^＋細胞の分画を著しくは変化させないことを明らかにした。これに加えて、ＧＭ−ＣＳＦの中和はｍＪＸ−５９４の治療効果を消滅させた。これは部分的にはＣＤ８^＋ＴＩＬの減少によるものであったことから、ＧＭ−ＣＳＦがｍＪＸ−５９４により惹起される癌免疫において必須の役割を果たしていることが示される。

過去の研究において、ＯＶとＩＣＩの組み合わせで目覚ましい免疫応答が惹起されたが、その治療効果は投与経路と投与スケジュールに大きく影響され得ることが報告された。特にＯＶとＩＣＩの両方が同時に全身投与されたとき、ＩＣＩが誘導する抗ウイルス免疫によって、ウイルスの早過ぎるクリアランスを促進することができるために、この組み合わせは拮抗してしまう可能性があった。このことから、ＯＶに対する治療と抗癌免疫の誘導の成功との間の適切な時間のずれが重要であると示唆されている。本研究において、ｍＪＸ−５９４の局所注射は一貫して抗癌免疫を誘導し、投与スケジュールに大きな影響は受けなかった。このことについて、本発明者らは、ＯＶがＴＭＥを炎症化させるための充分な時間のずれが腫瘍内注射によってもたらされ、その後に全身的な抗ウイルス免疫によって除去されたためであると推測している。ゆえに、ＩＣＩとＯＶの組み合わせに関する臨床試験を設計するにあたって、腫瘍内ＯＶ療法は、投与スケジュールという観点で全身的なＯＶ療法と比較し、より現実的である可能性がある。

ｍＪＸ−５９４とＩＣＩの組み合わせを用いた本発明者らの有望な結果に加えて、いくつかの臨床試験が既に進行中であり、肝癌、腎癌および結腸癌を含む様々な固形癌を標的としたαＰＤ−１、αＣＴＬＡ−４またはαＰＤ−Ｌ１と組み合わされたＪＸ−５９４の有効性が調査されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０３０７１０９４、ＮＣＴ０２９７７１５６、ＮＣＴ０３２９４０８３およびＮＣＴ０３２０６０７３）。ゆえに本発明者らは、近い将来、臨床現場において本研究の発見を立証することができるであろう。

結論として、本研究は、ｍＪＸ−９５４の腫瘍内注射が、冷たい状態から熱い状態へと、ＴＭＥの大規模な再構築を誘導し、そしてＩＣＩとの組み合わせで強固な抗癌免疫を惹起させ、免疫療法抵抗性を克服することを示した。
実験手順
マウスおよび細胞株

６〜８週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＯｒｉｅｎｔＢｉｏＩｎｃ．（韓国、京畿道城南市）から購入した。メスのＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニックマウス（ＦＶＢ／Ｎ）は、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社（米国メーン州ＢａｒＨａｒｂｏｒ、＃００２３７４）から購入した。マウスはＣＨＡ大学（韓国、京畿道城南市）の特定病原体未感染動物施設で飼育された。全ての動物実験は、ＣＨＡ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ、＃１７００２５）により承認を受け、承認されたプロトコールに従い実行された。Ｒｅｎｃａマウス腎癌細胞株およびＣＴ２６マウス結腸癌細胞株は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、＃ＣＲＬ−２９４７）およびＫｏｒｅａｎＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ（韓国ソウル、＃８０００９）から取得された。これらの細胞はＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持された。各培地には、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充された。細胞は、インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートされた。
ウイルスの作製および定量

ｍＪＸ−５９４はＳｉｌｌａｊｅｎ，Ｉｎｃ．（韓国、ソウル）から提供され、ｐ７．５プロモーターの制御下にあるワクシニアチミジンキナーゼ遺伝子座位中にマウスＧＭ−ＣＳＦをコードするワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株であり、本研究を通じて使用された。このウイルスは、ＨｅＬａＳ３細胞中で増幅され、その後に精製された。簡潔に述べると、ＨｅＬａＳ３細胞に組み換えワクシニアウイルスを３日間感染させ、遠心分離により集め、その後ホモジナイズして、もう１度遠心分離した。ウイルスを含有する上清を、３６％スクロースクッション上に重ねて、３２，９００ｇで遠心分離し、精製されたウイルスペレットを１ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ９．０中で再懸濁させた。ウイルス力価を決定するために、無血清ＤＭＥＭ中で連続希釈されたウイルスを２時間、Ｕ−２ＯＳ細胞の単層上に撒き、その後２％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中の、１．５％カルボキシメチルセルロースを添加した。７２時間後、細胞を、０．１％クリスタルバイオレットで染色し、プラークを計数した。
腫瘍モデルおよび治療レジメン

腫瘍は、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に２×１０^５個のＲｅｎｃａ細胞を皮下注射することにより移植された。腫瘍が５０ｍｍ^３を越えた時、マウスに３日ごとに腫瘍内注射にてＰＢＳまたは１×１０^７プラーク形成単位（ｐｆｕ）のｍＪＸ−５９４のいずれかで治療を行った。両側腫瘍モデルに関しては、２×１０^５個のＲｅｎｃａ細胞を右脇腹に皮下移植し、４日後に１×１０^５個のＲｅｎｃａ細胞またはＣＴ２６細胞を左脇腹に皮下移植した。細胞枯渇実験に関しては、ＣＤ４（２００μｇ、クローンＧＫ１．５、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）、ＣＤ８（２００μｇ、クローン５３−６．７２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）またはＧＭ−ＣＳＦ（２００μｇ、クローンＭＰ１−２２Ｅ９、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）に対する抗体を、ｍＪＸ−５９４とともに腹腔内注射した。免疫チェックポイント遮断剤に関しては、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、クローンＪ４３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体（４ｍｇ／ｋｇ、クローン９Ｄ９、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）を、投与スケジュールに応じて３日ごとに、ｍＪＸ−５９４とともに、またはｍＪＸ−５９４を伴わずに腹腔内注射した。腫瘍は、デジタルノギスを使用して２日ごとまたは３日ごとに計測した。腫瘍体積は修正楕円公式（１／２×（長さ×幅^２））を使用して算出した。５０日目に、完全腫瘍退縮した生存マウスの左脇腹に２×１０^５個のＲｅｎｃａ細胞を再チャレンジし、腫瘍増殖と生存を監視した。マウスは、腫瘍が直径１．５ｃｍに到達した時点、またはマウスが瀕死状態になった時点で安楽死させた。

メスのＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニックマウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。９週齢で、全ての触診可能な腫瘍結節（＞２０ｍｍ^３）の体積を計測した。１つにまとめた全腫瘍の総体積を使用して、マウス１匹当たりの腫瘍担持量を算出した。ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスは、それらの初期腫瘍担持量に従い無作為化され、指定された時点で免疫チェックポイント阻害剤のＰＤ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）もしくはＣＴＬＡ−４（４ｍｇ／ｋｇ）の存在下または非存在下で、１×１０^７ｐｆｕのｍＪＸ−５９４を用いて治療された。治療の４週間後、マウスに麻酔をかけ、さらなる解析のために組織を採取した。ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴの解析は、従前に報告されている通りに実施された（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２０１４；Ｐａｒｋｅｔａｌ．，２０１６）。
組織学的解析

ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色に関しては、腫瘍は４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定された。標準的な手順を使用して組織を処理した後、サンプルはパラフィン包埋され、３μｍの切片に切り出され、次いでＨ＆Ｅ染色が行われた。凍結組織切片に対して免疫蛍光法を実施した。腫瘍は室温で１％ＰＦＡ中に固定され、ＰＢＳで数回リンスされ、３０％スクロースで浸潤され、ＯＣＴ化合物中で凍結された。凍結切片（５０μｍの厚さ）を、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％トリトンＸ−１００のＰＢＳ溶液）中、５％正常ヤギ血清中でブロッキングし、次いで一晩、以下の一次抗体とともにインキュベートした：抗ワクシニアウイルス（ウサギ、Ａｂｃａｍ社）、抗ＣＤ３１（ハムスター、クローン２Ｈ８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ウサギ、Ａｂｃａｍ社）、抗ＣＤ８（ラット、クローン５３−６．７、ＢＤｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗ＣＤ１１ｃ（ハムスター、クローンＨＬ３、ＢＤｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗ＰＤ−Ｌ１（ウサギ、クローン２８−８、Ａｂｃａｍ社）、抗カスパーゼ３（ウサギ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）、抗汎サイトケラチン（マウス、クローンＡＥ１／ＡＥ３、ＤＡＫＯ社）、抗ＣＤ１１ｂ（ラット、クローンＭｌ／７０、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）または抗ＣＤ３ｅ（ハムスター、クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）。数回洗浄を行った後、サンプルは、以下の２次抗体とともに室温で２時間インキュベートされた：ＦＩＴＣ−、Ｃｙ３−、またはＣｙ５−結合抗ウサギＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、ＦＩＴＣ−結合抗ラットＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、ＦＩＴＣ−またはＣｙ３−結合抗ハムスターＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、またはＦＩＴＣ−結合抗マウスＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）。細胞核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で対抗染色された。最後にサンプルは蛍光標本培地（ＤＡＫＯ社）を用いて標本化され、画像は、ＺｅｉｓｓＬＳＭ８８０顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社）を用いて取得された。
形態学的解析

ワクシニアウイルス、血管、Ｔリンパ球および樹状細胞の密度計測、ならびに骨髄細胞領域の測定は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を使用して行われた。ワクシニアウイルス感染のレベルを決定するために、腫瘍切片中の無作為の０．４９ｍｍ^２の視野当たりのＶＶ^＋面積を算出した。血管密度に関しては、腫瘍周辺領域および腫瘍内領域中の無作為の０．４９ｍｍ^２の視野当たりのＣＤ３１＋面積を算出した。細胞障害性Ｔリンパ球浸潤の程度は、腫瘍周辺領域および腫瘍内領域中の無作為の０．４９ｍｍ^２の視野当たりのＣＤ８＋面積の割合として表された。樹状細胞のレベルは、無作為の０．４９ｍｍ^２の視野中のＣＤ１１ｃ＋面積の割合を算出することで計測された。アポトーシスの程度は、無作為の０．４９ｍｍ^２の視野当たりのカスパーゼ３＋面積の割合として表された。ＰＤ−Ｌ１＋細胞を規定するために、Ｐａｎ−ＣＫ＋、ＣＤ１１ｂ＋、およびＣＤ３＋と、ＰＤ−Ｌ１＋の共局在を無作為の０．０１ｍｍ^２の視野において特定した。ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスにおける肺転移は、直径１００μｍを越える腫瘍コロニーの測定により定量された。全ての測定は、１匹のマウス当たり、少なくとも５つの視野で行われた。
腫瘍浸潤免疫細胞のフローサイトメトリー解析

各治療群の腫瘍を細かく刻み、その後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ社）およびＤＮａｓｅＩ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ社）の存在下で振とうしながら１時間、３７℃でインキュベートした。細胞懸濁液は、ピペッティングを反復し、その後、７０μｍのセルストレイナーを通してろ過し、溶解させて赤血球を取り除くことによって作製された。ＰＢＳで洗浄した後、再懸濁された細胞を、ナイロンメッシュを通してろ過した。腫瘍組織からの単一細胞懸濁液を、ＣＤ１６／３２に対する抗体（クローン２．４Ｇ２、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）でブロッキングし、そして固定化生存色素（ｅＦｌｏｕｏｒ４５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色して、生細胞を識別した。表面マーカーの解析に関しては、細胞を、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で、ＣＤ４５（３０−Ｆ１１、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＣＤ４（ＲＭ４−５、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＣＤ８（５３−６．７、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＣＤ３（１７Ａ２または１４５−２Ｃ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＩＣＯＳ（７Ｅ．１７Ｇ９または１５Ｆ９、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤｌｌｂ（Ｍｌ／７０、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｆ４／８０（ＢＭ８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８−Ｌｙ６ｇまたはＲＢ６−８Ｃ５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）またはＣＤ２０６（ＭＲ５Ｄ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を標的とする抗体とともに氷上で３０分間、染色させた。さらに細胞を、ＦｏｘＰ３固定と透過化キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して透過化させ、ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ−１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣＤ２５（ＰＣ６１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）またはＧｒａｎｚｙｍｅＢ（ＮＧＺＢ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に対して染色した。標識細胞は、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリー（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）を使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒＩｎｃ．、オレゴン州Ａｓｈｌａｎｄ）を使用して解析された。
ＲＮＡ単離およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現解析

総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して全腫瘍溶解物から抽出され、エタノールで精製された。ＲＮＡの質は、ＦｒａｇｍｅｎｔＡｎａｌｙｚｅｒ装置（ＡｄｖａｎｃｅｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国アイオワ州）を使用して確認された。免疫プロファイリングは、デジタルマルチプレックス化ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇｎＣｏｕｎｔｅｒＰａｎＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｅＰｒｏｆｉｌｉｎｇマウスパネル（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、腫瘍組織から単離された１００ｎｇの総ＲＮＡを使用して実施された。ハイブリダイゼーションは、５μｌの各ＲＮＡサンプルと、８μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中のｎＣｏｕｎｔｅｒＲｅｐｏｒｔｅｒプローブ、および２μｌのｎＣｏｕｎｔｅｒＣａｐｔｕｒｅプローブ、合計で１５μｌの反応体積を組み合わせることにより、１６〜３０時間、６５℃で行われた。過剰量のプローブは、ｎＣｏｕｎｔｅｒＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し２工程の磁気ビーズを基にした精製により除去された。特定の標的分子の存在量は、個々の蛍光バーコードを計数し、対応する標的分子を評価することにより、ｎＣｏｕｎｔｅｒＤｉｇｉｔａｌＡｎａｌｙｚｅｒを用いて定量化された。各アッセイに対し、２８０の視野を包含する高密度スキャンを実施した。データは、ＣＣＤカメラを用いてサンプルカートリッジ中の固定された蛍光レポーターの画像を取得した後に、ｎＣｏｕｎｔｅｒＤｉｇｉｔａｌＡｎａｌｙｚｅｒを使用して集められた。データ解析は、ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して実施された。ｍＲＮＡプロファイリングデータは、ハウスキーピング遺伝子に対して標準化され、Ｒソフトウェア（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用して解析された。
統計解析

統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州ＬａＪｏｌｌａ）およびＰＡＳＷｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ１８（ＳＰＳＳ）を使用して実施された。値は、別段の示唆が無い限り、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。平均間の統計的差異は、独立スチューデントｔ検定を使用して試験された。生存曲線はカプランマイヤー法を使用して作成され、曲線間の統計的差異はログランク検定を使用して分析された。統計的有意性のレベルは、ｐ＜０．０５で設定された。

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Ｐａｒｋ，Ｂ．Ｈ．，Ｈｗａｎｇ，Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｔ．Ｃ，Ｓｚｅ，Ｄ．Ｙ，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．，Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｃ，Ｏｈ，Ｓ．Ｙ，Ｈａｎ，Ｓ．Ｙ，Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔａｌ．（２００８）．Ｕｓｅｏｆａｔａｒｇｅｔｅｄｏｎｃｏｌｙｔｉｃｐｏｘｖｉｒｕｓ，ｍＪＸ−５９４，ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｐｒｉｍａｒｙｏｒｍｅｔａｓｔａｔｉｃｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ：ａｐｈａｓｅＩｔｒｉａｌ．ＴｈｅＬａｎｃｅｔＯｎｃｏｌｏｇｙ９，５３３−５４２．
Ｐａｒｋ，Ｊ．−Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｉ．−Ｋ．，Ｈａｎ，Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｉ，Ｋｉｍ，Ｃ，Ｂａｅ，Ｊ．，Ｏｈ，Ｓ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄＷｏｏ，Ｄ．−Ｃ．（２０１６）．ＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｖｅｓｓｅｌｓｂｙＴｉｅ２ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＡｎｇ２ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｓｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｅｓａｆａｖｏｒａｂｌｅｔｕｍｏｒｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ３０，９５３−９６７．
Ｒｉｖｅｒａ，Ｌ．Ｂ．，ａｎｄＢｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．（２０１５）．Ｉｎｔｅｒｔｗｉｎｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙｂｙｍｙｅｌｏｉｄｃｅｌｌｓ．Ｔｒｅｎｄｓｉｎｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３６，２４０−２４９．
Ｒｏｊａｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｍｐａｔｈ，Ｐ．，Ｈｏｕ，Ｗ．，ａｎｄＴｈｏｒｎｅ，Ｓ．Ｈ．（２０１５）．ＤｅｆｉｎｉｎｇＥｆｆｅｃｔｉｖｅＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆＩｍｍｕｎｅＣｈｅｃｋｐｏｉｎｔＢｌｏｃｋａｄｅａｎｄＯｎｃｏｌｙｔｉｃＶｉｒｏｔｈｅｒａｐｙＣｌｉｎｉｃａｌｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎｏｆｆｉｃｉａｌｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２１，５５４３−５５５１．
Ｓｃｈｍｉｔｔｎａｅｇｅｌ，Ｍ．，Ｒｉｇａｍｏｎｔｉ，Ｎ．，Ｋａｄｉｏｇｌｕ，Ｅ．，Ｃａｓｓａｒａ，Ａ．，Ｒｍｉｌｉ，Ｃ．Ｗ．，Ｋｉｉａｌａｉｎｅｎ，Ａ．，Ｋｉｅｎａｓｔ，Ｙ，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｈ．−Ｊ．，Ｏｏｉ，Ｃ．−Ｈ．，ａｎｄＬａｏｕｉ，Ｄ．（２０１７）．Ｄｕａｌａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２ａｎｄＶＥＧＦＡｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｌｉｃｉｔｓａｎｔｉｔｕｍｏｒｉｍｍｕｎｉｔｙｔｈａｔｉｓｅｎｈａｎｃｅｄｂｙＰＤ−１ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ９，ｅａａｋ９６７０．
Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．，Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ，Ｓ．，Ｗａｒｇｏ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄＲｉｂａｓ，Ａ．（２０１７）．Ｐｒｉｍａｒｙ，ａｄａｐｔｉｖｅ，ａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ１６８，７０７−７２３．
Ｔｈｏｒｎｅ，Ｓ．Ｈ．（２０１４）．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｏｎｃｏｌｙｔｉｃｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｏｎｃｏｌｏｇｙ４，１５５．
Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄＰａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．（２０１５）．Ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｂｌｏｃｋａｄｅ：ａ
ｃｏｍｍｏｎｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒａｐｐｒｏａｃｈｔｏｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ２７，４５０−４６１．
Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔａｕｂｅ，Ｊ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄＰａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．（２０１６）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ−ｄｒｉｖｅｎｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｔｏｇｕｉｄｅｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｂｌｏｃｋａｄｅｉｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ１６，２７５．
Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄＣｈａｎ，Ｔ．Ａ．（２０１４）．Ｃａｎｃｅｒ：Ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒｉｍｍｕｎｉｔｙｇｅｔｓａｂｏｏｓｔ．Ｎａｔｕｒｅ５７５，４９６．

本明細書に開示され、かつ特許請求される組成物および／または方法のすべては、本開示を考慮することで、過度の実験を行うことなく作製することができ、また実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、当業者であれば、本明細書に記載される組成物および／または方法に、ならびに本明細書に記載される方法の工程または工程の順序に、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱することなく変形を適用することができることが明白であろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連性のある特定の剤を、本明細書に記載される剤と置き換えても、同一または類似の結果が得られることになることが明白であろう。当業者にとって明白な、そのような類似の代替および修正のすべてが添付の特許請求の範囲に規定される本発明の概念、主旨および範囲の内にあるとみなされる。

上記の実施例は、当業者に、本発明の組成物、システムおよび方法の実施形態の完全な開示、ならびにこの実施形態をどのように作製および使用するかの説明を与えるために提供されており、本発明者らが自身の発明であるとみなす範囲を限定することは意図されていない。当業者にとって明白な、本発明の実施に関する上述の様式の修正は、以下の特許請求の範囲の中にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許および公表文献は、本発明が属する分野の当業者の技能のレベルの指標である。本開示に引用される全ての参照文献は、各参照文献がその全体を個々に参照により組み込まれるのと同程度に、参照により組み込まれる。

すべての見出しおよび節の指定は、明確性および参照の目的でのみ使用されるものであり、決して限定とみなされるものではない。例えば当業者であれば、本明細書に記載される本発明の主旨および範囲に従い適宜に異なる見出しおよび節の様々な態様を組み合わせることの有用性を認識するであろう。

本明細書に引用される全ての参照文献は、それぞれ個々の公表文献または特許または特許出願が具体的かつ個別に全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれると示されているのと同程度にまで、全ての目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込まれる。

当業者には明らかであろうように、本出願の多くの出願形態および変形形態が、その主旨および範囲から逸脱することなく実行可能である。本明細書に記載される具体的な実施形態および実施例は、例示の目的でのみ提示されているものであり、本出願は、特許請求の範囲に権利付与される均等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の条件によってのみ限定される。

Claims

かかる治療の必要のある対象において癌を治療および／または予防する方法であって、（ａ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および（ｂ）１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤、を含む組み合わせの有効量を、前記対象に並行投与することを含む、前記方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内に、静脈内に、動脈内に、または腹腔内に投与される、請求項１に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内に投与される、請求項２に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍中の免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導するのに有効な量で投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記腫瘍が、前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の前に、前記免疫チェックポイントタンパク質を発現していないか、または比較的低いレベルで前記免疫チェックポイントタンパク質を発現している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤が、前記免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片であり、好ましくはモノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、細胞障害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ４：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ−４）、プログラム化細胞死タンパク質１（ＰＤ−１：ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ：ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｎｔｒｙｍｅｄｉａｔｏｒ）、Ｔ細胞膜タンパク質−ｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ３（ＴＥＭ３：Ｔ−ｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ３）、ガレクチン９（ＧＡＬ９：ｇａｌｅｃｔｉｎ９）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３：ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｇｅｎｅ３）、Ｔ細胞活性化のＶドメインイムノグロブリン（Ｉｇ）−含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ：Ｖ−ｄｏｍａｉｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｉｇ）−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆＴ−ｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、キラー細胞イムノグロブリン様受容体（ＫＩＲ：Ｋｉｌｌｅｒ−ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ：ＢａｎｄＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するT細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ：Ｔ−ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｗｉｔｈＩｇａｎｄＩＴＩＭｄｏｍａｉｎｓ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ：ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３ −ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合するモノクローナル抗体であり、好ましくは、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）およびランブロリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ４に選択的に結合するモノクローナル抗体であり、好ましくは、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）およびトレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
前記複数のチェックポイント阻害剤が、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと並行して前記対象に投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、
（ａ）ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、
（ｂ）ＣＴＬＡ４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、
（ｃ）ＰＤ−１阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、または
（ｄ）ＰＤ−１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、
（ｅ）ＬＡＧ３阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、または
（ｆ）ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、および複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、を並行投与される、請求項１０に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Ｗｙｅｔｈ株、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株、Ｌｉｓｔｅｒ株、またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクシニアウイルスが、癌細胞に対する前記ウイルスの選択性を高める遺伝子改変を１つまたは複数含み、好ましくは前記ウイルスが、機能性のチミジンキナーゼを欠くように、および／または機能性のワクシニア増殖因子を欠くように操作される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクシニアウイルスが、機能性の１４Ｌ遺伝子および／またはＦ４Ｌ遺伝子を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクシニアウイルスは、（ｉ）好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αから選択されるサイトカイン、および／または（ｉｉ）好ましくはＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＣＥＡ、ＡＩＭ２、ＣＤＫ４、ＢＭＩ１、ＣＯＸ−２、ＭＵＭ−１、ＭＵＣ−１、ＴＲＰ−１ＴＲＰ−２、ＧＰ１００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＺＨ２、ＬＩＣＡＭ、Ｌｉｖｉｎ、Ｌｉｖｉｎβ、ＭＲＰ−３、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ２、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、ヒトパピローマウイルス−Ｅ７、ＡＲＴｌ、ＡＲＴ４、ＳＡＲＴｌ、ＳＡＲＴ２、ＳＡＲＴ３、Ｂ−サイクリン（Ｂ−ｃｙｃｌｉｎ）、β−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｇｌｉ１、Ｃａｖ−１、カテプシンＢ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ）、ＣＤ７４、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＥｐｈＡ２／Ｅｃｋ、Ｆｒａ−１／Ｆｏｓｌ１、ガングリオシド／ＧＤ２（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ／ＧＤ２）、ＧｎＴ−Ｖ、β１，６−Ν、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７、Ｋｕ７０／８０、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＰＲＯＸ１、ＰＳＣＡ、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、カスパーゼ−８、ＵＰＡＲ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ｐｌ８５ＨＥＲ２、ＣＤ５、ＩＬ−２Ｒ、Ｆａｐ−α、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、メラノーマ関連抗原ｐ９７（ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｐ９７）、およびＷＴ−１、Ｇタンパク質シグナリング５の調節因子（ＲＧＳ５：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇ５）、サバイビンＳｕｒｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５＝バキュロウイルスアポトーシス阻害タンパク質リピート５）、インスリン様増殖因子−結合タンパク質３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ３：ＩＧＦ−ＢＰ３）、チミジル酸合成酵素（ＴＹＭＳ）、低酸素誘導タンパク質２、低酸素誘導脂肪滴関連タンパク質（ＨＩＧ２：ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎ２，ｈｙｐｏｘｉａｌｉｎｄｕｃｉｂｌｅｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、マトリクスメタロペプチダーゼ７（ＭＭＰ７）、ｐｒｕｎｅホモログ２（ＰＲＵＮＥ２）、ＲｅｃＱタンパク質様（ＤＮＡヘリカーゼＱｌ様：ＲＥＣＱＬ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害剤１（ＥＲＲＦＩｌ）、リソソームタンパク質膜貫通型４アルファ（ＬＡＰＴＭ４Ａ）；ＲＡＢ１Ｂ、ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢＩＢ）、ＣＤ２４、ホモサピエンスサイモシンベータ４、Ｘリンク（ＴＭＳＢ４Ｘ）、ホモサピエンスＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６（Ｓ１００Ａ６）、ホモサピエンスアデノシンＡ２受容体（ＡＤＯＲＡ２Ｂ）、染色体１６オープンリーディングフレーム６１（Ｃ１６ｏｒｆ６１）、ＲＯＤ１分化の調節遺伝子１（ＲＯＤ１）、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン２（ＳＩＲ２Ｌ）、チューブリンアルファ１ｃ（ＴＵＢＡ１Ｃ）、ＡＴＰａｓｅ阻害因子１（ＡＴＰＩＦｌ）、ストローマ抗体２（ＳＴＡＧ２）、核カゼインキナーゼおよびサイクリン依存性基質１（ＮＵＣＫＳ１）から選択される腫瘍抗原、を発現するよう操作される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
前記ワクシニアウイルスが、約１０^７〜約１０^１１ｐｆｕの量、好ましくは約１０^８〜１０^１０ｐｆｕの量、より好ましくは約１０^９〜１０^１０ｐｆｕの量で投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、約２ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、肝細胞癌、大腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、胃癌、食道癌、肉腫、中皮腫、メラノーマ、膵臓癌、頭頚部癌、卵巣癌、子宮頸癌および肝癌から選択される癌を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
前記対象は、腎細胞癌を有する、請求項１８に記載の方法。
前記対象は、過去に少なくとも１つの化学療法または免疫療法に失敗している、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、免疫チェックポイント阻害剤療法に対して不応性の癌を有し、好ましくは前記癌が、抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いた治療に対して抵抗性である、請求項２０に記載の方法。
前記対象が、免疫チェックポイント阻害剤療法の候補として特定される、請求項２１に記載の方法。
化学療法（アルキル化剤、ヌクレオシドアナログ、細胞骨格改変剤、細胞分裂阻害剤）および放射線療法から選択される追加的療法を前記対象に与えることを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
追加的な腫瘍溶解性ウイルス療法（例えばラブドウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳｅｍｌｉｋｉＦｏｒｅｓｔＶｉｒｕｓ））を対象に投与することを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、ヒトである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの第一の用量、および前記免疫チェックポイント阻害剤の第一の用量が同時に前記対象に投与され、次いで前記対象に、前記ウイルスと前記チェックポイント阻害剤の少なくとも１回のその後の連続的同時投与が行われる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
前記対象への、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の少なくとも第一、第二、および第三の連続的同時投与を含む、請求項２６に記載の方法。
前記対象への、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとチェックポイント阻害剤の少なくとも第一、第二、第三、および第四の連続的同時投与を含む、請求項２７に記載の方法。
前記対象への、複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの第一の用量、および免疫チェックポイント阻害剤の第一の用量の同時投与、および前記ウイルスとチェックポイント阻害剤の少なくとも１回のその後の連続的同時投与の後、前記対象への少なくとも１用量のチェックポイント阻害剤単独の投与が行われる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
前記剤の連続的同時投与の間に１〜３週間の間隔を含む、好ましくは約１週、約２週、または約３週の間隔を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
ヒトにおいて腫瘍を治療する方法であって、（ａ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および（ｂ）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤、を含有する組み合わせを前記ヒトに並行投与することを含む、前記方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内に、静脈内に、動脈内に、または腹腔内に投与される、請求項３１に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内に投与される、請求項３１に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍中の免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導するのに有効な量で投与される、請求項３１に記載の方法。
前記腫瘍が、前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の前に、前記免疫チェックポイントタンパク質を発現していないか、または比較的低いレベルで前記免疫チェックポイントタンパク質を発現している、請求項３１に記載の方法。
前記組み合わせを投与する前に、前記腫瘍における前記免疫チェックポイントタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴから選択される、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＣＴＬＡ−４である、請求項３１に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＰＤ−Ｌ１である、請求項３１に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＬＡＧ３である、請求項３１に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＴＩＧＩＴである、請求項３１に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＰＤ−１である、請求項３１に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＴＩＭ３である、請求項３１に記載の方法。
前記腫瘍が、固形癌である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
前記腫瘍が、大腸癌である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
前記腫瘍が、腎細胞癌である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質の前記阻害剤が、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合するモノクローナル抗体であり、好ましくはＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびランブロリズマブからなる群から選択される、請求項３９または４２に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤が、ＣＴＬＡ−４に選択的に結合するモノクローナル抗体であり、好ましくは、イピリムマブおよびトレメリムマブからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
ヒトにおいて腫瘍を治療する方法であって、（ａ）複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、（ｂ）ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、ならびに（ｃ）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤、を含む組み合わせを前記ヒトに並行投与することを含む、前記方法。
前記腫瘍が、前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の前に、前記免疫チェックポイントタンパク質を発現していないか、または比較的低いレベルで前記免疫チェックポイントタンパク質を発現している、請求項４９に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内に、静脈内に、動脈内に、または腹腔内に投与される、請求項４９に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内に投与される、請求項４９に記載の方法。
前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍中の免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導するのに有効な量で投与される、請求項４９に記載の方法。
前記腫瘍が、前記複製可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の前に、前記免疫チェックポイントタンパク質を発現していないか、または比較的低いレベルで前記免疫チェックポイントタンパク質を発現している、請求項４９に記載の方法。
前記組み合わせを投与する前に、前記腫瘍における前記チェックポイントタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴから選択される、請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＣＴＬＡ−４である、請求項５６に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＬＡＧ３である、請求項５６に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＴＩＧＩＴである、請求項５６に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＴＩＭ３である、請求項５６に記載の方法。
前記腫瘍が、固形癌である、請求項４９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
前記腫瘍が、大腸癌である、請求項４９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
前記腫瘍が、腎細胞癌である、請求項４９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤が、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合するモノクローナル抗体であり、好ましくはＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびランブロリズマブからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
前記免疫チェックポイントタンパク質の前記阻害剤が、ＣＴＬＡ−４に選択的に結合するモノクローナル抗体であり、好ましくは、イピリムマブおよびトレメリムマブからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。