KR20200046065A - 암을 치료하기 위한 병용 면역 요법 및 사이토카인 조절 요법 - Google Patents

암을 치료하기 위한 병용 면역 요법 및 사이토카인 조절 요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조성물, CAR T-세포 요법을 시술받는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍 발생을 저해 또는 감소시키기 위한 상기 조성물의 이용 방법, 개체에게 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물을 투여하는, 암 또는 종양의 치료 방법, 종양 부하를 감소시키는 방법, 암 또는 종양의 크기 또는 증식율을 감소시키는 방법, 및 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존을 연장하는 방법을 개시한다. 조성물 및 이의 이용 방법은 CAR T-세포 암 요법의 효능을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 개체에서 사이토카인의 생산을 줄이거나 또는 저해하기 위한 조성물 및 이의 이용 방법을 개시한다. 일부 경우에, 조성물은 부가적인 화학치료제 또는 면역조절제를 포함할 수 있다.

Description

암을 치료하기 위한 병용 면역 요법 및 사이토카인 조절 요법
본 발명은 CAR T-세포 암 요법을 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발생을 저해하거나 또는 낮추기 위한 조성물 및 그 방법을 개시한다. 또한, 본 발명은 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 겪고 있는 개체에서 사이토카인의 생산을 줄이거나 또는 저해하기 위한 조성물 및 그 방법을 개시한다. 또한, 본원에 개시된 조성물은 개체에서 암 또는 종양의 증식을 치료, 예방, 저해하거나 또는 발병을 줄이는데 사용할 수 있다. 조성물은 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존성을 높이는데 사용할 수 있다. 조성물은 단독으로 또는 다른 화학요법과 병용하여 투여할 수 있다. 본 발명은 세포자살 세포 또는 세포자살 세포 상층액을 단독으로 또는 CAR T-세포 요법과 조합하여 투여하는 것을 포함하는 방법을 개시한다.
암의 표준 치료는 수술, 화학요법 및 방사선 요법이지만, 타겟화된 면역 요법과 같은 개선된 방법들이 현재 개발 및 실험 중에 있다. 한가지 유망한 기법은, 종양을 인지 및 공격하도록 면역 세포를 변형하는 입양 세포 이식 (adoptive cell transfer, ACT)을 이용한다. ACT의 일 예는 환자 자신의 세포독성 T-세포 또는 공여자의 T-세포가 종양 세포의 표면에 발현되는 종양 특이적인 항원을 타겟팅하는 키메라 항원 수용체 (CAR T-세포)를 발현하도록 조작하는 것이다. 이들 CAR T-세포는 종양 특이적인 항원을 발현하는 세포에만 세포독성을 나타낸다. 임상 실험에서, CAR T-세포 요법이 특히 진행된 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 및 림프종을 통제하는데 상당한 잠재력을 가진 것으로, 입증되어 있다.
그러나, CAR T-세포 요법 및 기타 면역 요법을 시술 중인 일부 환자는, 주입된 활성화된 T-세포가 사이토카인을 급속하게 다량으로 혈류로 방출시켜 저혈압, 고열 및 오한을 위험하게 야기하는 전신성 염증 반응을 발생시키는, 사이토카인 방출 증후군 (CRS)이라고 하는 위험하고, 때로는 생명을 위협하는 부작용을 겪게 된다.
중증 CRS 사례에서는, 환자는 사이토카인과 백혈구 세포 간에 양의 피드백이 존재하고 사이토카인의 수준이 고도로 증가되는, 사이토카인 폭풍 (사이토카인 케스케이드 또는 고사이토카인혈증 (hypercytokinemia)이라고도 함)을 겪게 된다. 이는 심부전, 성인 호흡 곤란 증후군, 신경 독성, 신부전 및/또는 간부전, 폐 부종 및 파종성 혈관내 응고 등의 잠재적으로 생명을 위협하는 합병증으로 이어질 수 있다.
예를 들어, 최근 I상 실험에서, T-세포 상의 CD28 수용체에 결합하는 단일클론 항체 TGN1412를 투여받은 환자 6명에서 심각한 사이토카인 폭풍 및 다발성 장기 부전 병증이 발생하였다. 이는, TGN1412 투여량이 동물에서 안전한 것으로 확인된 수준 보다 500배나 낮았음에도 불구하고 발생하였다 (St. Clair EW: The calm after the cytokine storm: Lessons from the TGN1412 trial. J Clin Invest 118: 1344-1347, 2008).
지금까지, 항-IL6 요법 및 항-염증성 약물과 같은 생물학적 요법인 코르티코스테로이드는 CAR T-세포 요법을 시술받는 환자에서 사이토카인 방출 증후군을 제어하기 위해 실험 중에 있다. 그러나, 스테로이드는 CAR T-세포의 활성 및/또는 증식에 영향을 미칠 수 있으며, 환자를 패혈증 및 기회 감염 위험에 노출시킬 수 있다. 항-염증성 약물은, 사이토카인 폭풍이 상당히 많은 수의 사이토카인을 포함하기 때문에, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 제어하는데 효과적이지 않을 수 있으며, 항-염증성 약물의 환자 주입 용량도 제한적이다. 잠재적인 CAR T-세포 요법을 구현하기 위해, 사이토카인 방출 증후군, 특히 사이토카인 폭풍을 제어하기 위한 새로운 전략들이 요구되고 있다.
사이토카인 폭풍은 또한 기타 감염성 및 비-감염성 자극 후에도 문제가 된다. 사이토카인 폭풍시, 다수의 전-염증성 사이토카인, 예를 들어, 인터루킨-1 (IL-1), IL-6, g-인터페론 (g-IFN), 및 종양 괴사 인자-α (TNFα)가 방출되어, 저혈압, 출혈, 그리고 궁극적으로 다발성 장기 부전을 야기한다. 1918 H1N1 인플루엔자 유행 및 최근 조류 독감 H5N1 감염에서, 아마도 건강한 면역 시스템을 가진 젊은 사람들에서의 상대적으로 높은 사망률은 사이토카인 폭풍으로 인한 것이다. 이 증후군은 또한 중증 급성 호흡 증후군 (SARS), 엡스타인-바르 바이러스-관련 적혈구포식성 림프조직구증 (Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis), 그람-음성 패혈증, 말라리아 및 에볼라 감염 등의 다수의 기타 감염성 질환의 진행성 또는 말기 병례들에서 발생하는 것으로 알려져 있다.
또한, 사이토카인 폭풍은 급성 췌장염, 중증 화상 또는 외상, 또는 급성 호흡 곤란 증후군과 같은 비-감염성 병인으로도 유발될 수 있다. 따라서, 사이토카인 방출 증후군, 특히 사이토카인 폭풍을 제어하기 위한 새로운 전략이 요구되고 있다.
암은 하나 이상의 세포 집단의 통제되지 않은 증식이 정상적인 생물학적 기능을 방해하는 비정상적인 상태이다. 증식성 변화는 통상적으로 덜 분화된, 발생학적으로 보다 원시 상태로의 회귀를 비롯하여, 기타 세포 특성 변화를 동반한다. 암의 시험관내 연관성 (correlate)을 세포성 형질변환 (cellular transformation)이라고 한다. 형질변환된 세포는 일반적으로 다음과 같은 특성을 몇가지 또는 전부 나타낸다: 구상 형태, 태아성 항원의 발현, 증식 인자 비의존성, 접촉 저해의 결핍, 고정-비의존성 (anchorage-independence) 및 고밀도 증식.
폐암 및 피부암과 같은 악성 질환으로 인한 사망의 일차적인 요인은 전이성 확산으로 생긴다. 다수 사례들에서, 암은 종종 진단 시점에 이르면 전이성이어서 전이성 질환의 개시를 예방할 수 없으며, 암이 이 단계 이전에 진단된 경우이더라도 궁극적으로 전이성이 될 수 있는 원발성 병변 조직을 완전히 외과적으로 제거하거나 또는 파괴하기가 어려울 수 있다. 전이성 질환은, 전이성 병변이 작거나 및/또는 이의 존재를 확실하게 예측하기 위한 신뢰할만한 마커가 원발성 병변에 없기 때문에, 초기 단계에서는 진단하기 불가능할 수 있다. 이러한 병변은 접근하기 어렵거나, 파종성이거나 및/또는 거의 국소적이지 않기 때문에, 절제 방법을 통한 치료가 어렵거나 또는 불가능할 수 있다. 일부 전이성 암을 치료하기 위해 선택되는 현행 방법인 화학요법/방사성 요법은 종종 효과가 없거나 또는 최상의 효과를 발휘하지 못하며, 특히 유해하거나 및/또는 잠재적으로 치명적인 부작용이 연관되는 상당한 문제점을 가지고 있다.
항원 제시 세포 (APC)의 백신 접종을 포함하는 방법과 같이, 면역요법에 의한 암 치료 방법은 접근하기 어렵거나, 파종성이거나, 매우 작거나, 재발성이거나 및/또는 거의 국소적이지 않은 암 병변을 치료하는데 최적으로 유효할 가능성이 있다. 한가지 유망한 면역요법은 수지상 세포 (DC)와 같은 특수 APC를 사용해 전신 항암 면역을 유발하는 것이다.
수지상 세포는 항원 물질을 처리해 이를 세포 표면 상에서 면역 시스템의 T-세포에 제시함으로써, 신생 항원과 기억 항원 모두에 대해 T-세포를 감작화할 수 있는, 포유류 면역 시스템의 항원-생산 및 제시 세포이다. DC는 선천 면역 시스템과 후천적인 면역 시스템 간의 메신저로서 작용하는 가장 강력한 항원-생산 세포이다. DC 세포를 이용해, 종양을 공격 및 용해하는 작동자 세포를 생산함으로써 특이적인 항-종양 면역을 구축할 수 있다.
세포자살성 세포 (apoptotic cell)는 인지, 면역 반응 및 제거 과정을 포함하는 일련의 항상성 분자 기전을 유발하는 세포자살을 통해 가장 흔히 발생하는 생리학적 세포 사멸의 한가지 경로를 나타낸다. 또한, 세포자살성 세포는 수지상 세포 및 대식세포에 대해 면역 관용을 직간접적으로 유발할 수 있는 면역조절 세포이다. 세포자살성 세포는 수지상 세포 및 대식세포를 조정하고, 이들에 관용성을 부여하여, 전-염증성 사이토카인의 분비 및 공동-자극 분자의 발현 등의 전-염증성 활동을 저해하는 것으로, 입증되어 있다.
개체에서 암 또는 종양의 증식을 치료, 예방, 저해하거나 또는 발병을 낮추기 위한 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 충족되지 않은 채 남아있다. 본 발명에서 후술한 세포자살성 세포 조제물 (apoptotic cell preparation), 이의 조성물 및 용도는, 개체에서 암 또는 종양의 증식을 치료, 예방, 저해하거나 또는 발병을 줄이기 위해 사용될 수 있는 초기 세포자살성 세포의 집단을 제공함으로써, 이러한 요구를 해결한다. 나아가, 본원에 기술된 이용 방법은 암 또는 종양의 관해 증가 등의 암 및 종양을 앓고 있는 개체의 생존성을 증가시키고자 하는 요구를 해소시킨다.
일 측면에서, 본 발명은, 초기 세포자살성 세포 집단 (early apoptotic cell population)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 또는 종양을 치료하거나, 예방하거나, 증식을 저해하거나, 질환의 진행을 지연하거나, 종양 부하를 줄이거나, 발병을 낮추거나 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 방법을 개시하며, 이러한 방법은 초기 세포자살성 세포 집단을 비-투여 개체와 비교해, 개체에서 암 또는 종양을 치료하거나, 예방하거나, 증식을 저해하거나, 질환의 진행을 지연하거나, 종양 부하를 줄이거나, 발병을 낮추거나 또는 이들의 임의 조합을 달성한다.
관련 측면에서, 암 또는 종양의 크기 또는 증식율이 감소된다. 다른 관련 측면에서, 개체의 생존성이 증가된다.
관련 측면에서, 초기 세포자살성 세포 집단은 단핵구 농화된 세포 집단 (mononuclear enriched cell population) 또는 24시간 이상 동안 안정적인 세포자살성 집단, 또는 세포 응집이 없는 세포자살성 집단, 또는 세포자살 유도 후 방사선 처리된 세포자살성 집단, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 초기 세포자살성 세포 집단은 초기 세포자살성 세포 집단 풀 (pooled population of early apoptotic cell)을 포함한다.
관련 측면에서, 개체는 인간 개체이다.
관련 측면에서, 암 또는 종양은 고형 종양 또는 비-고형 종양을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 비-고형 암 또는 종양은 혈액암 (hematopoietic malignancy), 혈액 세포암, 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종 (형질세포 골수종), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 형질세포성 백혈병을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 고형 종양은 육종 또는 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종 (lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종, 중피종, 유잉 종양 (Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 췌장 종양 종양, 유방암, 유방 종양, 난소암 또는 난소 종양, 전립선암 또는 전립성 종양, 편평 세포암, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭성암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모암, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 자궁경부 종양, 자궁암 또는 자궁 종양, 고환암 또는 고환 종양, 폐 암종, 소 세포성 폐암, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 신경초종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 또는 망막모세포종을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 종양 또는 암은 종양 또는 암의 전이를 포함한다.
관련 측면에서, 투여는 초기 세포자살성 세포 집단의 1회 주입 (single infusion)을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 투여는 세포자살성 세포 집단의 다회 주입 (multiple infusions)을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 방법은 부가적인 면역 요법, 화학치료제 또는 면역조절제 (immune modulator), 또는 이들의 임의 조합을 개체에 투여하는 것을 더 포함한다. 다른 관련 측면에서, 부가적인 면역 요법, 화학치료제 또는 면역조절제는 초기 세포자살성 세포의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여된다. 다른 관련 측면에서, 면역 요법은 CAR T-세포의 투여를 포함한다. 다른 관련 측면에서, 면역조절제는 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 항체 또는 이의 기능성 단편은 리툭시맵 (rituximab)　(RtX) 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함한다.
관련 측면에서, 본 방법은 CAR T-세포 투여 및 초기 세포자살성 세포 비-투여 개체와 비교해, CAR T-세포의 효능을 증가시킨다.
관련 측면에서, 본 방법은 1차 요법 (first-line therapy)을 포함한다.
관련 측면에서, 본 방법은 보조 요법을 포함한다.
관련 측면에서, 본 방법은 미세 잔존 질환 (minimal residual disease)을 감소시키고, 관해를 증가시키고, 관해 지속 기간을 증가시키고, 종양 재발율을 감소시키고, 종양 또는 암의 전이를 예방하고, 또는 암 또는 종양의 전이율을 낮추고, 또는 이들의 임의 조합을 달성한다.
일 측면에서, 본 발명은, 단핵구 세포자살성 세포 집단이 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포 (non-quiescent non-apoptotic viable cell)의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 초기 세포자살성 상태에 있는 단핵구 세포를 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단을 개시한다.
관련 측면에서, 감소된 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 비율은 10% 미만이다. 다른 관련 측면에서, 단핵구 세포자살성 세포 집단은 생존가능한 비-세포자살성 세포를 포함하지 않는다.
관련 측면에서, 단핵구 세포 집단은 림프구, 단구 (monocyte), 수지상 세포 및 자연 살상 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관련 측면에서, 단핵구 세포자살성 세포 집단은 초기 세포자살성 세포를 구축한 다음 방사선 조사된다. 다른 관련 측면에서, 방사선 조사는 감마 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 다른 관련 측면에서, 방사선 처리된 (irradiated) 세포 집단은 방사선 비-처리된 세포자살성 세포 집단과 비교해 집단별 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율이 감소된다.
일 측면에서, 본 발명은, 초기 세포자살성 상태의 단핵구 세포를 포함하고; 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 단핵구 세포자살성 세포 집단 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 개시한다.
일 측면에서, 본 발명은, 하기 단계들을 포함하는, 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단의 제조 방법으로서,
말초혈로부터 단핵구-농화된 세포 집단을 수득하는 단계;
항-응집제를 포함하는 동결 매질에서 단핵구-농화된 세포 집단을 동결하는 단계;
단핵구-농화된 세포 집단을 해동하는 단계;
메틸프레드니솔론을 최종 농도 약 10-100 ㎍/mL로 포함하고, 그리고 항-응집제를 포함하는 세포자살 유도 인큐베이션 매질에서 단핵구-농화된 세포 집단을 인큐베이션하는 단계;
세포자살성 세포 집단을 투여 매질에 현탁하는 단계; 및
단핵구-농화된 집단을 불활화하는 단계로서, 불활화는 단계 (e) 다음에 이루어지는, 단계,
상기 방법이, 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단을 생산하는, 단핵구 세포자살성 세포 집단의 제조 방법을 개시한다.
관련 측면에서, 불활화 단계는 단핵구 세포자살성 세포 제조 중에 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율 감소, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율은 약 10%로 감소된다. 다른 관련 측면에서, 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율은 약 0%로 감소된다.
관련 측면에서, 단핵구-농화된 세포 집단은 림프구, 단구 (monocyte), 수지상 세포 및 자연 살상 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관련 측면에서, 인큐베이션은 약 2-12시간 동안 이루어진다.
관련 측면에서, 단핵구-농화된 집단을 불활화하는 단계 (f)는 세포의 면역 반응의 억제 또는 소거, 세포의 교차-반응성 억제 또는 소거, 또는 T-세포 수용체 활성의 감소 또는 소거를 포함하며, 상기 집단은 살아있는 비-세포자살성 세포의 비율 감소, 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 불활화하는 단계 (f)는 단계 (e)에서 구축된 단핵구-농화된 세포자살성 세포 집단에 방사선을 처리하는 것을 포함한다. 다른 관련 측면에서, 방사선 처리는 감마 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 다른 관련 측면에서, 방사선 처리는 약 25-50 Gy (Grey unit)를 포함한다.
본원에 개시된 내용은 명세서의 결론 부분에서 구체적으로 지적되고 명확하게 청구된다. 그러나, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 둘다 작동 방법 및 구성과 관련하여, 이의 목적, 특징 및 이점과 더불어, 후술한 상세한 설명을 참고하여 첨부된 도면과 함께 읽을 때 가장 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1A-1B. 표준적인 CAR T-세포 요법 (도 1A)과 환자 자신의 세포 (자가)를 이용하여 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 제조하는 안전하고 효과적인 CAR T-세포 암 요법 (도 1B)에 대한 구현예를 나타낸 개략도.
도 2. 세포자살성 세포 또는 세포자살성 상층액을 제조하기 위해 공여자 세포를 이용하는, 환자에서 안전하고 효과적인 CAR T-세포 암 요법에 대한 구현예를 나타낸 개략도.
도 3. 항-응집제가 공정에 사용되는 초기 세포자살성 세포 집단의 제조 공정의 단계들을 나타낸 흐름도.
도 4A - 4J. 암 환경에서 대식세포 활성화 증후군의 LPC-결핍 모델 (LPS-Sterile model)로부터 유도한 시험관내 사이토카인 폭풍 모델에서 세포자살성 세포는 사이토카인 폭풍을 방지한다. 도 4A는 대식세포/단구:Apocell 비율 1:8 및 1:16로 Apocell를 투여한 후 2가지 기간 (6시간 및 24시간) 동안 암 존재하 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 IL-10 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4B는 암 및 CAR-19 존재하 대식세포/단구:Apocell 비율 1:8 및 1:16로 Apocell를 투여한 후 2가지 기간 (6시간 및 24시간) 동안 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 IL-6 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4C는 대식세포/단구:Apocell 비율 1:8 및 1:16로 Apocell를 투여한 후 2가지 기간 (6시간 및 24시간) 동안 암 및 CAR-19 존재하 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 MIP-1α 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4D는 대식세포/단구:Apocell 비율 1:8 및 1:16로 Apocell를 투여한 후 2가지 기간 (6시간 및 24시간) 동안 암 및 CAR-19 존재하 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 IL-8 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4E는 대식세포/단구:Apocell 비율 1:8 및 1:16로 Apocell를 투여한 후 2가지 기간 (6시간 및 24시간) 동안 암 및 CAR-19 존재하 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 TNF-α 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4F는 대식세포/단구:Apocell 비율 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 및 1:64로 Apocell를 투여한 후 24시간 경과시 암 및 CAR-19 존재하 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 MIP-1β 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4G는 대식세포/단구:Apocell 비율 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 및 1:64로 Apocell를 투여한 후 24시간 경과시 암 및 CAR-19 존재하 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 MCP-1 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4H는 대식세포/단구:Apocell 비율 1:8 및 1:16으로 Apocell를 투여한 후 2가지 기간 (6시간 및 24시간) 동안 암 및 CAR-19 존재하 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 IL-9 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4I는 대식세포/단구:Apocell 비율 :4, 1:8, 1:16, 1:32 및 1:64로 Apocell를 투여한 후 24시간 경과시 암 및 CAR-19 존재하 대식세포 활성화 증후군 모델에서 LPS 유도성 IL-2R 수준이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 4J는 세포자살성 세포가 세포로부터 IL-2의 분비를 하향 조절하지 않는다는 것을 나타낸 것이다. 세포자살성 세포를 암 및 CAR-19의 존재하 24시간 동안 세포자살성 세포의 용량을 증가시키면서 대식세포/단구와 인큐베이션하였다 (n=3). 빈 막대 (윤곽선만 있음) - 2.5 x 106 세포자살성 세포수/웰; 검정색 막대 - 5 x 106 세포자살성 세포수/웰; 회색 막대 - 10 x106 세포자살성 세포수/웰.
도 5. 형질도입된 T4+ CAR-T-세포의 항-CD124 유세포 측정 분석 결과를 나타낸 T-세포의 형질도입 검증.
도 6. T4+CAR T-세포는 SKOV3-luc 난소 선암종 세포의 증식을 감소시킨다. SKOV3-luc 세포 단일층을 비-형질도입된 T-세포 또는 T4+ CAR-T-세포에 의해 배양한, 세포독성 분석 결과를 막대 그래프로 나타낸다.
도 7. 세포자살성 세포는 T4+ CAR-T-세포의 항-종양 활성을 무력화하지 않는다. 결과는, SKOV3-luc 세포 단일층을 비-형질도입된 T-세포 또는 T4+ CAR-T-세포와 함께, 비히클 (하트만 용액), 또는 세포자살성 세포 (Apocell), 또는 세포자살성 세포 상층액 (ApoSup), 또는 단구/대식세포의 공-배양물의 상층액 (ApoMon Sup)의 존재하에 배양한, 세포독성 분석을, 토대로 한다.
도 8. 세포독성시 고 농도로 분비되는 IL-6는 세포자살성 세포에 의해 하향 조절된다. 도시된 결과는, SKOV3-luc 및 인간 단구/대식세포의 공-배양물의, 세포자살성 세포 (ApoCell), 또는 ApoCell 상층액 (ApoSup), 또는 세포자살성 세포와 단구/대식세포의 공-배양물 (ApoMon Sup)에의 노출 효과를 보여준다.
도 9. CAR-T-세포 요법에서 LPS 노출 후 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 세포자살성 세포와 단구의 공-배양물의 효과. 리포폴리사카라이드 (LPS)를 세포독성 분석에 첨가하였을 때 IL-6가 극히 높은 수준으로 분비되었다. 결과는, 세포자살성 세포 (Apocell), 또는 세포자살성 세포 상층액 (ApoSup), 또는 단구/대식세포의 공-배양물의 상층액 (ApoMon Sup)에 노출시 IL-6가 하향 조절되고 허용가능한 수준까지 감소됨을, 보여준다.
도 10. CAR T-세포 임상 요법을 모방한 CAR T-세포 치료에서, LPS 노출 후 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 세포자살성 세포와 단구의 공-배양물의 효과. 리포폴리사카라이드 (LPS)를 세포독성 분석에 첨가하였을 때 IL-6가 극히 높은 수준으로 분비되었다. 결과는, 세포자살성 세포 (Apocell), 또는 세포자살성 세포의 상층액 (ApoSup), 또는 단구/대식세포의 공-배양물의 상층액 (ApoMon Sup)에 노출시 IL-6가 하향 조절되고 허용가능한 수준까지 감소됨을, 보여준다.
도 11A-11B. 마우스의 도태 (culling) 시점의 체중 및 종양 크기. 도 11A는 실험 기간 동안의 체중 변화를 나타낸다. 청색 - 4.5x106 SKOV3-luc 세포 비-투여 대조군. 적색 - 0.5x106 SKOV3-luc 세포. 녹색 -1.0x106 SKOV3-luc 세포. 보라색 - 4.5x106 SKOV3-luc 세포. 도 11B는 주입 후 39일째, 4.5x106 SKOV3-luc 세포 투여 마우스에서의 대표적인 SKOV3-luc 종양을 나타낸 것이다.
도 12. SKOV3-luc 종양 증식. 대조군 (PBS) 및 0.5x106, 1x106 및 4.5x106 SKOV3-luc 세포 접종 군들 간의 차이를 보여주는, 생발광 사진 (BLI)으로 촬영한 SKOV3-luc 종양을 가진 마우스 사진이다.
도 13A-13D. SKOV3-luc 종양 부담 (tumor burden)). 생체내 SKOV3-luc 종양의 생발광 (BLI) 정량 결과 (도 12 참조). 제조사의 지침에 따라 600 광자 카운트 컷오프를 수행하였다. 도 13A, 0.5x106 SKOV3-luc 접종 마우스. 도 13B, 1x106 SKOV3-luc 접종 마우스. 도 13C, 4.5x106 SKOV3-luc 접종 마우스. 도 13D, 평균 SKOV3-luc 종양 증식.
도 14. Raji 버킷 림프종 세포에 대한 세포독성 캘리브레이션. Raji 세포를 다양한 세포 밀도로 접종하였으며, 세포용해 후 즉시 원심분리하였다. 결과는 492 nm (y축)에서의 흡광도 대비 Raji 세포수 (x축)로 나타낸다. 모든 세포수는 비-세포용해 카운터파트와 비교해 유의한 흡광도를 나타내었다.
도 15. 초기 세포자살성 세포 첨가가 CAR T-세포의 항-종양 활성에 영향을 미치진 않는다. E/T 비율은 CD19+CAR T-세포 : HeLa 세포의 비율이다. CD19+ 종양 세포의 생존성. ● CD19+ Hela; △ CD19+ Hela + 나이브 T-세포; ▲ CD19+ Hela + CAR T-CD19; ○ CD19+ Hela + CAR T-CD19 + ApoCell.
도 16. 세포자살성 세포의 존재 및 부재하 Raji 버킷 림프종 세포에 대한 사이토카인 분석 (GM-CSF). 막대 그래프는, 나이브 T-세포 (Raji + 나이브 T), CD19+ CAR T-세포 (Raji + CAR T), CAR T-세포:ApoCell 비율 1:8 (Raji + CAR T+ApoCell 1:8)의 CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell), CAR T-세포:ApoCell 비율 1:32 (Raji + CAR T+ApoCell 1:32)의 CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell), 및 CAR T-세포:ApoCell 비율 1:64 (Raji + CAR T+ApoCell 1:64)의 CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell)의 첨가 후, 단구 및 LPS의 존재하에 배양한 Raji 세포의 배양 상층액에서 확인된 사이토카인 GM-CSF (pg/ml)의 농도 측정값을 나타낸다.
도 17. 세포자살성 세포의 존재 및 부재하 Raji 버킷 림프종 세포에 대한 사이토카인 분석 결과 (TNF-alpha). 막대 그래프는, 나이브 T-세포 (Raji + 나이브 T), CD19+ CAR T-세포 (Raji + CAR T), CAR T-세포:ApoCell 비율 1:8 (Raji + CAR T+ApoCell 1:8)의 CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell), CAR T-세포:ApoCell 비율 1:32 (Raji + CAR T+ApoCell 1:32)의 CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell), 및 CAR T-세포:ApoCell 비율 1:64 (Raji + CAR T+ApoCell 1:64)의 CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell)의 첨가 후, 단구 및 LPS의 존재하에 배양한 Raji 세포의 배양 상층액에서 확인된 사이토카인 TNF-alpha (TNFα)(pg/ml)의 농도 측정값을 나타낸다.
도 18A 및 18B. 실험 계략도. 도 18A는 CAR T-세포 요법에서 세포자살성 세포의 효과를 분석하기 위한 실험 계획을 도시한 것이다. SCID 마우스에 Raji 암 세포를 1일에 주사한 후 6일에 CAR T-CD19 세포 (CAR T-세포 요법) 및 세포자살성 세포를 투여하였다. 도 18B는 CAR T-세포 요법이 ApoCell의 공동-투여에 의해 부정적으로 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸 것이다. 생존 곡선: SCID 마우스에 CD19+ Raji 세포를 초기 세포자살성 세포와 함께 또는 단독으로 주사하였다.
도 19A, 19B 및 19C. 생체내 고형 종양 모델에서 종양으로부터 전-염증성 사이토카인의 분비 증가. 도 19A는 BALB/c 및 SCID 마우스의 복막에 존재하는 고형 종양으로부터 IL-6 분비가 약간 증가됨을 나타낸 것으로, IL-6 분비는 HeLa CAR-CD-19 CAR T-세포의 존재시 현저하게 증가한다. 마찬가지로, 도 19B는 BALB/c 및 SCID 마우스의 복막에 존재하는 고형 종양으로부터 IP-10 분비가 약간 증가됨을 나타낸 것으로, IP-10 분비는 HeLa CAR-CD-19 CAR T-세포의 존재시 현저하게 증가하며, 도 19C는 놀랍게도 TNF-α 분비 역시 HeLa CAR-CD-19 CAR T-세포의 존재시 증가한다는 것을 보여준다.
도 20A 및 20B. HeLaCD19 (백혈병)의 IP 모델에서, ApoCell 존재 또는 부재시 CD19-CAR-T-세포의 효과 검사. HeLa-CD19 - 청색; HeLaCD19+Mock - 녹색; HeLaCD19 + CAR-T - 보라색; HeLaCD19 + CAR-T + ApoCell - 오렌지색. 도 20A는 0.5 x106 CAR-T 양성 세포이다. 도 20B는 2.2 x 106 CAR-T 양성 세포이다.
도 21. SCID 마우스 모델의 생체내 미만성 종양의 생존 곡선. 곡선은 초기 세포자살성 세포 (APO: 긴 점선 ―――)의 투여가 세포자살성 세포 비-투여 마우스 (NO APD: 점선 ‥‥)와 비교해 생존을 연장시킴을 보여주며, 대조군 SCID 마우스는 생존성이 100%이다 (실선 ──).
도 22A-22D. 세포자살성 세포의 주입이 백혈병 마우스의 수명을 연장시키고, 완전 관해를 달성하는 마우스의 수를 증가시킨다. 코호트: 백혈병 없음 (대조군 줄무늬 패턴); 백혈병 + 초기 세포자살성 세포 (점 패턴); 백혈병 단독 (회색 막대). 총 n=51 (p<0.001). 도 22A. 세포자살성 세포의 주입은 백혈병 유도 후 기대 수명동안의 마우스 생존율 %를 증가시킨다. 도 22B. 세포자살성 세포의 주입은 백혈병 유도 후 기대 수명의 최대 12%까지 생존하는 마우스의 %를 증가시킨다. 도 22C. 세포자살성 세포의 주입은 백혈병 유도 후 기대 수명의 최대 30%까지 생존하는 마우스의 %를 증가시킨다. 도 22D. 세포자살성 세포의 주입은 백혈병 유도 후 기대 수명의 최대 100%까지 생존하고 완전 관해를 달성하는 마우스의 %를 증가시킨다.
도 23A-23E. 세포자살성 세포의 주입은 백혈병 마우스의 수명을 증가시키고, 완전 관해를 달성하는 마우스의 수를 증가시키며, 항-CD20 단일클론 항체 (mAb)의 치료학적 효과를 강화한다. 코호트: 백혈병 단독 (회색 막대); 백혈병 + 초기 세포자살성 세포 (줄무늬); 백혈병 + 항-CD20 mAb (체크무늬); 백혈병 + 항-CD20 + 초기 세포자살성 세포 (점무늬). 총 n=28 (p<0.002) 도 23A. Raji 세포를 이용한 백혈병 유도 후 마우스 기대 수명 생존율 (%)을 나타낸다. 도 23B. 백혈병 유도 후 기대 수명 보다 최대 25% 이상 길게 생존한 마우스의 (%)를 나타낸다. 도 23C. 세포자살성 세포의 주입은 백혈병 유도 후 기대 수명 보다 최대 59% 이상 길게 생존하는 마우스의 (%)를 증가시키며, 백혈병 마우스의 수명에 대한 항-CD20 mAb 효과를 강화한다. 도 23D. 세포자살성 세포의 주입은 백혈병 유도 후 기대 수명 보다 최대 76% 이상 길게 생존하는 마우스의 (%)를 증가시키며, 백혈병 마우스의 수명에 대한 항-CD20 mAb 효과를 강화한다. 도 23E. 세포자살성 세포 주입은 완전 관해를 달성하는 마우스의 %를 증가시킨다.
도 24. ApoCell이 투여된 Raji 백혈병/림프종 SCID-Bg 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. (RPMI 군, n = 15; Raji 군, n = 23; Raji + ApoCell 군, n = 24) RPMI (대조군) - 검정색; Raji 단독 - 오렌지색; Raji + ApoCell - 청색.
도 25A-25C. 카플란-마이어 생존 곡선. 도 25A는 7주령의 암컷 SCID-Bg 마우스 (ENVIGO, Jerusalem, Israel)에 마우스 당 Raji 세포 0.1x106개를 IV 주사한 실험의 데이터를 나타낸다 (n = 10마리/군, 3개의 군). 마우스에 ApoCell 30x106개를 3번 IV 투여하였다 (5일, 8일 및 11일) (RPMI - 연청색; Raji - 오렌지색; 및 Raji + ApoCell - 진청색). 도 25B는 7주령의 암컷 SCID-Bg 마우스 (ENVIGO, Jerusalem, Israel)에 마우스 당 Raji 세포 0.1x106개를 IV 주사한 실험의 데이터를 나타낸다 (n = 10 /군, 3개의 군). 마우스에 ApoCell 30x106개를 3번 IV 투여하였다 (5일, 8일 및 11일). (RPMI - 검정색; Raji - 오렌지색; 및 Raji + ApoCell - 진청색). 도 25C는 8-9주령의 암컷 SCID-Bg 마우스 (ENVIGO, Jerusalem, Israel)에 마우스 당 Raji 세포 0.1x106개를 IV 주사한 실험의 데이터를 나타낸다 (n=10 /그룹, 2개의 군 마우스에 ApoCell 30x106개를 3번 IV 투여하였다 (5일, 8일 및 12일). (Raji - 오렌지색; 및 Raji + ApoCell - 진청색).
도 26. RtX 및 ApoCell이 투여된 Raji 백혈병/림프종 SCID-Bg 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. (Raji 단독 - 오렌지색; Raji + ApoCell - 청색; Raji + RtX 2mg - 녹색; Raji + RtX 2mg + ApoCell - 노란색; Raji + RtX 5mg - 보라색; Raji + RtX 5mg + ApoCell - 녹색).
도 27. RtX 및 ApoCell이 투여된 Raji 백혈병/림프종 SCID-Bg 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. (Raji 단독 - 오렌지색; Raji + ApoCell - 청색; Raji + RtX 2mg - 녹색; Raji + RtX 2mg + ApoCell - 노란색).
도 28. ApoCell 풀 조제물 (pooled apocell preparation)의 효과. 도 28은 다중 개별 공여자 (multiple individual donors)로부터 유래된 세포자살성 세포 조제물 1회 주사가 생존성에 명확한 효과 (p<0.01)를 나타냄을 보여주는 그래프 (청색)를 도시한다. 제시된 그래프는 다중 개별 공여자로부터 유래된 방사선 처리된 세포자살성 세포 풀 조제물을 1회 투여한 GvHD 마우스 모델에서의 카플란-마이어 생존 곡선이다.
도 29. ApoCell 풀 조제물의 효과. 도 29는 다중 개별 공여자로부터 유래된 세포자살성 세포 조제물 1회 주사가 2개의 비교군에서 체중 감소 %에 명확한 효과 (p<0.01)를 나타냄을 보여주는 그래프 (청색)를 도시한다.
도 30. 단일 공여자 (single-donor) vs ApoCell 풀 조제물의 비교. 도 30은 단일-공여자 및 다중-공여자 세포자살성 세포 조제물 +/- 방사선 처리물의 1회 투여시 유도성 GvHD 마우스 모델을 이용한 생존성 %를 비교한 그래프를 도시한 것이다.
도 31A-31B. 효력 (potency) 검사. 도 31A-31B는 HLA-DR의 발현에 의해 측정한, 세포자살성 세포와의 상호작용 후 수지상 세포 (DC)의 성숙화 저해를 보여주는 효력 검사 결과이다. 도 31A. HLA DR은 신선한 최종 산물 A (t0)의 형광성을 의미한다. 도 31B. HLA DR은 2-8℃에서 24시간 보관한 최종 산물 A의 형광성을 의미한다.
도 32A-32B. 효력 검사. 도 32A-32B는 CD86의 발현을 통해 측정한, 세포자살성 세포와의 상호작용 후 수지상 세포 (DC)의 성숙화 저해를 보여주는 효력 검사 결과이다. 도 32A. CD86은 신선한 최종 산물 A (t0)의 형광성을 의미한다. 도 32B. CD86은 2-8℃에서 24시간 보관한 최종 산물 A의 형광성을 의미한다.
후술한 상세한 설명에서, 여러가지 구체적인 상세 내용들이 본원에 기술된 방법에 대한 충분한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자라면 이들 방법이 이러한 구체적인 상세 내용 없이도 실시할 수 있음을 알 것이다. 다른 예로, 잘 알려진 방법, 절차 및 성분은 본원에 기술된 방법이 모호해지지 않도록 구체적으로 기술하진 않는다.
면역 세포의 유전자 변형은 암에 대한 면역-세포 요법의 전략으로서 잘 알려져 있다. 이들 면역-세포 요법은 자가 (autologous) 또는 동종이계 (allogeneic) 면역 세포를 조작하여 필요한 개체에게 투여하는 것을 기초로 한다. 면역-세포 기반의 요법은 자연 살상 세포 요법, 수지상 세포 요법 및 나이브 (naive) T-세포, T-헬퍼 세포로도 알려진 작동자 T-세포, 세포독성 T-세포 및 조절성 T-세포 (Treg) 등의 T-세포 면역요법을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 CD4+ T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 CD8+ T-세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 자연 살상 (NK) 세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 수지상 세포이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 세포독성 T 림프구 (CTL 세포)이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 조절성 T-세포 (Treg)이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 유전자 변형된 T-세포 수용체 (TCR) 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포 및 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포 및 세포자살성 세포로부터 유래된 상층액을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 T-세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 자연 살상 (NK) 세포이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 세포독성 T 림프구 (CTL 세포)이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 조절성 T 림프구 (Treg 세포)이다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 (apoptotic cell supernatant)을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하고, T-세포 암 요법 시술 중이나 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액은 비-투여되는 개체와 비교해 개체에서 증식율이 유지 또는 증가되는, CAR T-세포 암 요법 중에 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포)의 증식율을 유지 또는 증가시키는 방법을 개시한다.
관련 구현예에서, 본 방법은 CAR T-세포 암 요법의 효과를 감소시키거나 또는 저해하지 않는다. 관련 구현예에서, 본 방법은 CAR T-세포 암 요법의 효과를 개선한다. 다른 관련 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병이 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 비-투여 개체와 비교해 저해되거나 또는 감소된다.
일부 구현예에서, CRS는 자발적으로 발생한다. 다른 구현예에서, CRS는 LPS에 반응하여 발생한다. 다른 구현예에서, CRS는 IFN-γ에 반응하여 발생한다.
일부 구현예에서, 본 발명은, CAR T-세포; 및 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 부가적인 물질을 투여하는 단계를 포함하고, CAR T-세포의 효과가 CAR T-세포 암 요법 시술 중이나 부가적인 물질 비-투여 개체와 비교해 개체에서 증가되는, 키메라 항원 수용체 T-세포 (CAR T-세포) 암 요법의 효능을 증가시키는 방법을 개시한다. 관련 구현예에서, 하나 이상의 전-염증성 사이토카인의 생산 수준이, CAR T-세포 암 요법 투여 및 상기한 물질을 포함하는 조성물의 비-투여 개체에서의 전-염증성 사이토카인의 수준과 비교해, 감소된다. 다른 관련 구현예에서, 전-염증성 사이토카인은 IL-6를 포함한다.
관련 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 투여하는 경우, 상기한 방법은 CAR T-세포 암 요법 시술 중이나 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액의 비-투여 개체와 비교해 개체에서 IL-2의 수준을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 투여하는 경우, 상기한 방법은 CAR T-세포 암 요법 시술 중이나 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액의 비-투여 개체와 비교해 개체에서 IL-2의 수준을 유지시킨다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 투여하는 경우, 상기한 방법은 CAR T-세포 암 요법 시술 중이나 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액의 비-투여 개체와 비교해 개체에서 IL-2의 수준을 유지 또는 증가시킨다. 다른 관련 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발생이 부가적인 물질의 비-투여 개체와 비교해 저해 또는 감소된다.
관련 구현예에서, CAR T-세포; 및 상기한 부가적인 물질 또는 이들의 임의 조합이 단일 조성물에 포함된다. 다른 관련 구현예에서, 상기한 CAR T-세포; 및 상기한 부가적인 물질 또는 이들의 임의 조합은 2 이상의 조성물에 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 및 부가적인 물질을 투여하는 단계를 포함하고, 상기한 부가적인 물질이 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액 또는 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하고, CAR T-세포 투여 및 부가적인 물질의 비-투여 개체와 비교해 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 완화 또는 개선하는, 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 완화 또는 개선 방법을 개시한다.
관련 구현예에서, 상기한 방법은, CAR T-세포 투여 및 부가적인 물질의 비-투여 개체와 비교해, 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화 또는 개선하는 증가된 효능을 가진다.
다른 관련 구현예에서, 하나 이상의 전-염증성 사이토카인의 생산 수준이 CAR T-세포 및 상기한 물질을 포함하는 조성물의 비-투여 개체에서의 전-염증성 사이토카인의 수준과 비교해 감소된다. 다른 관련 구현예에서, 상기한 전-염증성 사이토카인은 IL-6를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 상기한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하고, 상기한 방법은 CAR T-세포 투여 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액의 비-투여 개체와 비교해 개체에서 IL-2의 수준을 증가시킨다. 다른 관련 구현예에서, 상기한 CAR T-세포 및 상기한 부가적인 물질 또는 이들의 임의 조합은 단일 조성물에 포함된다. 또 다른 관련 구현예에서, CAR T-세포 및 상기한 부가적인 물질 또는 이들의 임의 조합은 2 이상의 조성물에 포함된다.
관련 구현예에서, 상기한 부가적인 물질의 투여는 CAR T-세포의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후 이루어진다. 다른 관련 구현예에서, 상기한 세포자살성 세포는 초기 세포자살성 상태의 세포자살성 세포를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 상기한 세포자살성 세포는 개체에 자가 세포이거나, 또는 제3자 공여 세포 풀 (pooled third-party donor cells)이다.
관련 구현예에서, 상기한 세포자살성 세포 상층액은, (a) 세포자살성 세포를 제공하는 단계, (b) 단계 (a)의 세포를 배양하는 단계, 및 (c) 세포로부터 상층액을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다. 다른 관련 구현예에서, 상기한 세포자살성 세포 상층액은 세포자살성 세포-백혈구 세포의 상층액이고, 상기한 방법은 (d) 백혈구 세포를 제공하는 단계, (e) 선택적으로, 세포자살성 세포 및 백혈구 세포를 세척하는 단계, (f) 세포자살성 세포 및 백혈구 세포를 공-배양하는 단계를 더 포함하고, 단계 (d)-(f)가 단계 (b)를 대체한다. 다른 관련 구현예에서, 제공되는 백혈구 세포는 식세포, 대식세포, 수지상 세포, 단구, B 세포, T-세포 및 NK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액은 세포자살성 세포를 대식세포와 함께 배양함으로써 생성되는 상층액을 포함하며, 대식세포는 세포자살성 세포를 포식하며, 이러한 공-배양으로부터 생성되는 상층액을 사용한다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액은 세포자살성 세포를 배양함으로써 생성되는 상층액을 포함하고, 상층액은 세포자살성 세포에 의해 분비되는 물질들로부터 생성된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 초기 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 초기 세포자살성 세포를 부가적인 물질과 조합하여 포함하는 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 부가적인 물질은 CAR T-세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 부가적인 물질은 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 리툭시맵 (rituximab) 또는 이의 기능성 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포의 조성물은 초기 세포자살성 상태의 단핵구 세포를 포함하는 단핵구 세포자살성 세포의 집단을 포함하되, 단핵구 세포자살성 세포 집단은 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 T-세포 및 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 T-세포 및 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 유전자 변형된 T-세포 수용체 (genetically modified T-cell receptor, TCR) 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 CAR T-세포 및 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 T-세포 수용체 (TCR) 세포 및 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 CAR T-세포 및 세포자살성 세포 유래 상층액을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 T-세포 수용체 (TCR) 세포 및 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물을 개시한다.
특정 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액은 단일 조성물에 포함된다. 다른 구현예들에서, 유전자 변형된 면역 세포 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액은 별개의 조성물들에 포함된다.
본 발명은, 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 상태의 단핵구 세포를 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물을 제공하며, 이러한 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 개별 단핵구 세포 집단 풀을 포함하고, 이러한 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 살아있는 비-세포자살성 세포의 비율 감소, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀은 방사선 처리된 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 일부 구현예에서, 헌혈액으로부터 수득된 백혈구 세포 분획 (WBC)을 이용하는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물을 제공한다. 종종 이러한 WBC 분획은 혈액 은행에서 폐기되거나 또는 연구 목적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 불활화된다. 다른 구현예에서, 불활화는 방사선 조사를 포함한다. 다른 구현예에서, 불활화는 T-세포 수용체 불활화 (T-cell receptor inactivation)를 포함한다. 다른 구현예에서, 불활화는 조제물에서 면역 반응 억제 또는 소거를 포함한다. 다른 구현예에서, 불활화는 조제물에 포함된 다중 개별 집단들 간의 교차-반응성의 억제 또는 소거를 포함한다. 다른 구현예에서, 불활화는 조제물에 포함된 다중 개별 집단들 간의 T-세포 수용체 활성의 감소 또는 소거를 포함한다. 다른 구현예에서, 불활화된 세포 집단은 조제물에 포함된 다중 개별 집단들 간의 T-세포 수용체의 활성 감소 또는 소거를 포함한다. 다른 구현예에서, 불활화된 세포 조제물은 살아있는 비-세포자살성 세포의 비율 감소, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 불활화된 세포 집단은 방사선 비-처리된 세포 조제물 (non-radiated cell preparation)과 비교해 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 수적 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 불활화된 세포 집단은 살아있는 비-세포자살성 세포를 50 퍼센트(%)로 포함한다. 일부 구현예에서, 불활화된 세포 집단은 살아있는 비-세포자살성 세포를 40%로 포함한다. 일부 구현예에서, 불활화된 세포 집단은 살아있는 비-세포자살성 세포를 30%로 포함한다. 일부 구현예에서, 불활화된 세포 집단은 살아있는 비-세포자살성 세포를 20%로 포함한다. 일부 구현예에서, 불활화된 세포 집단은 살아있는 비-세포자살성 세포를 100%로 포함한다. 일부 구현예에서, 불활화된 세포 집단은 살아있는 비-세포자살성 세포를 0%로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 불활화된 초기 세포자살성 세포 집단의 제조 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단의 제조 방법을 개시하며, 이 방법은 다음의 단계,
말초혈로부터 단핵구-농화된 세포 집단을 수득하는 단계;
항-응집제를 포함하는 동결 매질에서 단핵구-농화된 세포 집단을 동결하는 단계;
단핵구-농화된 세포 집단을 해동하는 단계;
메틸프레드니솔론을 최종 농도 약 10-100 ㎍/mL로 포함하고, 항-응집제를 포함하는, 세포자살 유도 인큐베이션 매질에서 단핵구-농화된 세포 집단을 인큐베이션하는 단계;
세포자살성 세포 집단을 투여 매질에 재현탁하는 단계; 및
단핵구-농화된 집단을 불활화하는 단계로서, 불활화가 유도 후 이루어지는 단계를 포함하며,
이 방법으로 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 또는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단이 제조된다.
다른 구현예에서, 방사선 처리는 감마 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방사선 처리된 조제물은 방사선 비-처리된 세포 조제물과 비교해 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 수가 감소된다.
다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀은 T-세포 수용체의 불활화가 진행된 것이다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀은 T-세포 수용체 편집 (T-cell receptor editing)이 이행된 것이다.
일부 구현예에서, 혈액 풀은 수용자에 대해 HLA 매칭 또는 비-매칭 소스로부터 유래된 제3자 혈액을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 비-제한적인 예로, CAR T-세포; 및 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 부가적인 물질을 포함하는 조성물을 개시한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 초기 세포자살성 상태의 개별 단핵구 세포 집단 풀을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기한 조성물은 살아있는 비-세포자살성 세포의 비율 감소, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화가 억제된 조제물, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식이 감소된 조제물 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은 초기 세포자살성 상태의 개별 단핵구 세포 집단 풀을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기한 조성물은 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율 감소를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 초기 세포자살성 세포 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 또는 종양의 치료, 예방, 증식 저해, 발병 감소 또는 이들의 임의 조합을 달성하는 방법을 개시하며, 이러한 방법으로 개체에서 암 또는 종양의 치료, 예방, 증식 저해, 발병 감소 또는 이들의 임의 조합이 달성된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 초기 세포자살성 세포 집단을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 또는 종양의 치료, 예방, 증식 저해, 질환의 진행 지연, 종양 부하 감소, 또는 발병 감소 방법, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 개체에게 부가적인 면역 요법, 화학치료제, 면역조절제 또는 이들의 임의 조합을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 부가적인 면역 요법, 화학치료제 또는 면역조절제는 초기 세포자살성 세포의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 초기 세포자살성 세포 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 이러한 방법으로 개체의 생존성이 증가되는, 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존성을 증가시키는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 방법은 개체에게 부가적인 면역 요법, 화학치료제, 면역조절제 또는 이들의 임의 조합을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 부가적인 면역 요법, 화학치료제 또는 면역조절제는 초기 세포자살성 세포의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 초기 세포자살성 세포 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 이러한 방법으로 크기가 줄어들거나 또는 증식율이 감소되는, 개체에서 암 또는 종양의 크기 저하 또는 증식율 저하, 또는 이들의 조합을 달성하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 개체에게 부가적인 면역 요법, 화학치료제, 면역조절제 또는 이들의 임의 조합을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 부가적인 면역 요법, 화학치료제 또는 면역조절제는 초기 세포자살성 세포의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화, 종양 부하 감소 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능에 영향을 미치진 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화, 종양 부하 감소 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 약 5% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화, 종양 부하 감소 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 약 10% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화, 종양 부하 감소 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 약 15% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화, 종양 부하 감소 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 약 20% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 CAR T-세포의 효능을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 CAR T-세포의 효능을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45% 또는 적어도 50%까지 증가시킨다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 약 5% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 약 10% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 약 15% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 약 20% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능에 영향을 미치지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 감소, 완화 또는 개선하기 위한 CAR T-세포의 효능을 감소시키지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인의 생산을 감소시키거나 또는 방지함으로써, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시킨다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 본원에 개시된 방법은 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 암 요법이 시술 중인 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인의 생산을 저해 또는 감소시키는 본원에 개시된 방법은 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 암 요법이 시술 중인 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능에 영향을 미치지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능을 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능을 약 5% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능을 약 10% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능을 약 15% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능을 약 20% 보다 높은 수준으로 감소시키지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 본원에 개시된 세포자살성 세포 상층액 또는 상기한 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 개체 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약한 개체에서 사이토카인의 생산을 감소 또는 저해하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액은 세포자살성 세포-식세포 상층액 (apoptotic cell-phagocyte supernatant)을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인의 생산을 감소 또는 저해하는 본원에 개시된 방법은 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물을 암 요법이 시술 중인 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능에 영향을 미치지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능을 감소시키지 않는다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 감소 또는 저해하는 방법은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 감소 또는 저해하는 방법은 개체에서 하나 이상의 전-염증성 사이토카인의 생산을 감소시키거나 또는 저해한다.
다른 구현예에서, 본 방법은, 필요한 개체에서 면역 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 사이토카인 방출 증후군 (CRS), 사이토카인 폭풍 또는 불임을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 발병 감소시키기 위한, 본원에 기술된, 초기 세포자살성 상태의 단핵구 세포를 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물의 이용 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 이러한 세포 조제물의 사용시, 특정 구현예에서, 공여자와 수용자 간의 HLA 타입 매칭이 필요없는, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물을 개시한다.
유전자 변형된 면역 세포
면역 세포의 유전자 변형은 암에 대한 면역-세포 요법의 전략으로서 잘 알려져 있다. 이들 면역-세포 요법은 자가 또는 동종이계 면역 세포를 조작하여 필요한 개체에게 투여하는 것을 기초로 한다. 면역-세포 기반의 요법은 자연 살상 세포 요법, 수지상 세포 요법 및 나이브 T-세포, T-헬퍼 세포로도 알려진 작동자 T-세포, 세포독성 T-세포 및 조절성 T-세포 (Treg)를 이용하는 등의 T-세포 면역요법을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 CD4+ T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 CD8+ T-세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 자연 살상 (NK) 세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 수지상 세포이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 세포독성 T 림프구 (CTL 세포)이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 조절성 T-세포 (Treg)이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 유전자 변형된 T-세포 수용체 (TCR) 세포이다.
일 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포; 및 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 부가적인 물질을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포, 세포자살성 세포, 및 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 부가적인 물질을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포, 세포자살성 세포 상층액, 및 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 부가적인 물질을 포함하는 조성물을 개시한다.
일 구현예에서, 면역 세포는 세포독성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 유전자 변형을 위한 세포독성 세포는 개체의 (자가) 골수 또는 공여자의 (동종이계) 골수로부터 수득할 수 있다. 다른 경우, 세포는 줄기 세포로부터 수득된다. 예를 들어, 세포독성 세포는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 유도된 만능성 T-세포와 같은 인간 만능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 유도된 만능성 줄기 세포 (IPSC)의 경우, 이러한 만능성 T-세포는 유전자 변형된 세포독성 세포가 제공될 개체의 체세포를 이용해 수득할 수 있다. 일 구현예에서, 면역 세포는 정맥천자 (venipuncture)에 의한 세포 회수, 성분채집술 방법, 화이트 세포 동원 (white cell mobilization) 및 이후의 성분채집술 또는 정맥천자에 의해, 또는 골수 천자에 의해 개체 또는 공여자로부터 수득할 수 있다.
일 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어 T-세포는 생체내 특이적인 인자의 존재에 의해 구축 및 증폭된다. 다른 구현예에서, T-세포의 구축 및 유지는 생체내 사이토카인에 의해 영향을 받는다. 다른 구현예에서, 생체내 T-헬퍼 세포의 구축 및 유지에 영향을 미치는 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-21, IL-23, IL-25, IL-33 및 TGFβ를 포함한다. 다른 구현예에서, Treg 세포는 생체내 사이토카인 유도에 의해 나이브 T-세포로부터 구축된다. 또 다른 구현예에서, TGF-β 및/또는 IL-2는 나이브 T-세포가 Treg 세포로 분화하는데 역할을 한다.
다른 구현예에서, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-21, IL-23, IL-25, IL-33 및 TGFβ를 포함하는 군으로부터 선택되는 사이토카인의 존재는, T-세포의 생체내 증식율을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 이 둘다를 달성한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 IL-2 및/또는 TGFβ의 존재는 T-세포의 생체내 증식율을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 이 둘다를 달성한다. 다른 구현예에서, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-21, IL-23, IL-25, IL-33 및 TGFβ를 포함하는 군으로부터 선택되는 사이토카인의 존재는 CAR T-세포의 생체내 증식율을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 이 둘다를 달성한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 IL-2 및/또는 TGFβ의 존재는 CAR T-세포의 생체내 증식율을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 이 둘다를 달성한다. 다른 구현예에서, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-21, IL-23, IL-25, IL-33 및 TGFβ를 포함하는 군으로부터 선택되는 사이토카인의 존재는 TCR T-세포의 생체내 증식율을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 이 둘다를 달성한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 IL-2 및/또는 TGFβ의 존재는, TCR T-세포의 생체내 증식율을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 이 둘다를 달성한다. 다른 구현예에서, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-21, IL-23, IL-25, IL-33 및 TGFβ를 포함하는 군으로부터 선택되는 사이토카인의 존재는 T-reg 세포의 생체내 증식율을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 이 둘다를 달성한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 IL-2 및/또는 TGFβ의 존재는 T-reg 세포의 생체내 증식율을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 이 둘다를 달성한다.
일 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질 또는 BACH2 코딩 단백질의 발현 또는 형태가 변형된 T-세포는 장기간 유지되거나, 증가된 증식율을 가지거나 또는 이 둘다를 달성한다. 다른 구현예에서, 상기한 발현 변형은 STAT5B 폴리펩타이드의 발현을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 상기한 발현 변형은 BACH2 폴리펩타이드의 발현을 증가시킨다.
다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다.
다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 1년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 2년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 3년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 4년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 5년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 10년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 20년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다.
다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 1년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 2년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 3년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 4년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 5년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 10년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 T-세포는 20년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다.
다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 1년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 2년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 3년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 4년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 5년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 10년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 20년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다.
다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 1년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 2년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 3년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 4년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 5년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 10년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 T-세포는 20년보다 긴 기간 동안 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다.
다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 CAR T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 CAR T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 CAR T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 CAR T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다.
다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 TCR T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 TCR T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 TCR T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 TCR T-세포는 생체내에서 장기간 유지되거나 또는 증가된 증식율을 가진다.
다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 발현이 변형된 Treg-세포는 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 발현이 변형된 Treg-세포는 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, STAT5B 코딩 단백질의 형태가 변형된 Treg-세포는 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다. 다른 구현예에서, BACH2 코딩 단백질의 형태가 변형된 Treg-세포는 생체내에서 자신의 증식율을 유지하거나 또는 증가된다.
일 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 투여하는 단계를 포함하는 유전자 변형된 면역 세포의 증식율을 유지 또는 증가시키는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 부가적인 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 변형된 면역 세포의 효능을 증가시키는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 암 또는 종양의 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화 방법은 유전자 변형된 면역 세포 및 부가적인 물질의 투여를 포함하며, 상기한 부가적인 물질은 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
키메 라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포)
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체 (CAR)는, 세포외 종양-결합 모이어티가 융합된 세포내 T-세포 신호전달 도메인, 가장 통상적으로는 단일클론 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편 (scFv)으로 구성된 항원-타겟화된 수용체의 일종이다. CAR은 MHC-매개 제시와 독립적으로 세포 표면 항원을 직접 인지하여, 모든 환자들에서 임의의 주어진 항원에 특이적인 단일한 수용체 구조체의 사용을 허용한다. 초기 CAR은 T-세포 수용체(TCR) 복합체의 CD3ζ 활성화 쇄에 항원-인지 도메인이 융합된 형태였다. 이들 제1 세대 CAR은 시험관내에서 T-세포 작동자 기능을 유도하지만, 생체내에서는 항종양 효과의 부족으로 인해 상당히 제한적이었다. 이후 새로운 CAR은, CD28 또는 다양한 TNF 수용체 패밀리 분자, 예를 들어 4-1BB (CD137) 및 OX40 (CD134) 유래의 세포내 도메인을 비롯하여, CD3ζ와 동시에 (in tandem) 제2 공동-자극 신호를 포함하게 되었다. 나아가, 제3 세대 수용체는 CD3ζ와 더불어, 가장 통상적으로는 CD28 및 4-1BB로부터 유래되는 2개의 공동-자극 신호를 포함한다. 제2 및 제3 세대 CAR은 항-종양 효능이 극적으로 개선되었으며, 일부 경우 진행성 암에 걸린 환자에서 완전 관해를 유도하였다.
일부 구현예에서, CAR T-세포는, 수용체가 이의 항원에 결합되었을 때 활성화되는, 항원 수용체를 포함하는 면역반응성 세포 (immunoresponsive cell)이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T-세포는 제1 세대 CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T-세포는 제2 세대 CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T-세포는 제3 세대 CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T-세포는 제4 세대 CAR T-세포이다. 일부 구현예에서, 각 세대의 CAR T-세포는 이전 세대의 CAR T-세포보다 더 강력하다.
일부 구현예에서, 제1-세대 CAR은 하나의 신호전달 도메인, 전형적으로는 CD3 TCRζ 쇄의 세포질 신호전달 도메인 (cytoplasmic signaling domain)을 가진다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T-세포는 제2 세대 CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T-세포는 3중 (tripartite) 키메라 수용체 (TPCR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T-세포는 공동-자극과 독립적인 방식으로 나이브 T-세포를 활성화하는 하나 이상의 신호전달 모이어티를 포함한다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 하나 이상의 구성원을 추가로 코딩하며, 이는 일부 구현예에서 CD27, 4-1BB (CD137) 또는 OX40 (CD134), 또는 이들의 조합이다.
제3 세대 CAR T-세포는 2가지 공동-자극 도메인: 일 구현예에서, CD28 도메인 및 그 뒤에 위치한 4-1BB 또는 OX-40 신호전달 도메인의 신호전달 잠재성을 이용하고자 하였다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T-세포는 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 코딩하며, 이는 일부 구현예에서 CD28이다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3ζ-쇄, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB, CD28 신호전달 도메인 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 텔로미어 길이 및 복제능 (replicative capacity)은 입양 이식된 T-세포주 (adoptively transferred T-cell line)의 생착력 (engraftment efficiency) 및 항-종양 효과와 연관되어 있다. 일부 구현예에서, CD28 자극은 T-세포에서 텔로미어 길이를 유지시킨다.
일부 구현예에서, CAR-변형된 T-세포 효력은 증식성 사이토카인 (즉, IL-12) 또는 공동-자극 리간드 (즉, 4-1BBL)를 코딩하는 등의 부가적인 유전자의 도입을 통해 추가로 강화할 수 있으며, 이로써 "무장된 (armored)" 제4 세대 CAR-변형된 T-세포를 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, "무장된 CAR T-세포"는 저해성 종양 미세환경 (inhibitory tumor microenvironment)으로부터 보호되는 CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, "무장된" CAR 기술은, 전신 부작용을 최소화할 목적으로 종양 미세환경 내에서 면역 반응을 증폭하기 위해, 용해성 신호전달 단백질의 국소 분비를 통합한다. 일부 구현예에서, 신호전달 단백질 신호는 IL-12이며, 이는 T-세포 활성화 및 동원을 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, "무장된" CAR 기술은, 미세환경 및 강력한 면역억제 기전이 견고한 항종양 반응의 확립을 더 어렵게 만들 가능성이 존재하는, 고형 종양 적응증에 특히 유용하다.
일부 구현예에서, CAR T-세포는 세포자살의 방지, 종양 미세환경의 재형성, 항상성 증식 (homeostatic proliferation)의 유도 및 지시된 T-세포의 복귀 (homing)를 촉진하는 케모카인 수용체에 참여하는 분자를 코딩하도록 유전자 변형된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T-세포 요법은 사이토카인 전이유전자의 발현, 소분자 저해제와의 병용 요법 또는 단일클론 항체를 이용해 강화된다. 다른 구현예에서, 종양 세포를 더욱 특이적으로 표적화하기 위해 듀얼 CAR 및 케모카인 수용체를 이용하는 등의, CAR T-세포 요법을 개선하기 위한 또 다른 전략이 본원에 개시된 CAR T-세포 요법 및 CAR T-세포의 일부로 고려된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법의 CAR T-세포는, 정상 세포 대비 암 세포에 대한 CAR T-세포의 특이성을 높이기 위해, 저해 신호 또는 증폭 신호를 유도할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, CAR T-세포는 한가지 표적 단백질의 존재시 촉발되도록 조작될 수 있지만, 제2 단백질이 존재할 경우, 이는 저해될 것이다. 다른 예로, 2가지 타겟 단백질이 최대 활성화에 필요하도록 조작될 수도 있다. 이러한 접근 방식이 정상 조직과 비교해 종양에 대한 CAR의 특이성을 높일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T-세포는 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif)로 구성된 신호 변환 모듈을 코딩하는 세포질 도메인 및 항체-기반의 외부 수용체 구조를 코딩한다.
일부 구현예에서, CAR T-세포는 면역억제 활성을 가진 폴리펩타이드에 결합하는 단쇄 가변 단편 (scFv)을 추가로 코딩한다. 다른 구현예에서, 면역억제 활성을 가진 폴리펩타이드는 CD47, PD-1, CTLA-4 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, CAR T-세포는 면역자극 활성을 가진 폴리펩타이드에 결합하는 단쇄 가변 단편 (scFv)을 추가로 코딩한다. 다른 구현예에서, 면역자극 활성을 가진 폴리펩타이드는 CD28, OX-40, 4-1 BB 또는 이들의 조합이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD40 리간드 (CD40L)를 추가로 코딩하며, 이는 일 구현예에서 항원의 면역자극 활성을 강화한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 세포독성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 유전자 변형하기 위한 세포독성 세포는 개체 (자가) 또는 공여자 (동종이계)의 골수로부터 수득할 수 있다. 다른 경우에, 세포는 줄기 세포로부터 수득된다. 예를 들어, 세포독성 세포는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 유도된 만능성 T-세포와 같은 인간 만능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 유도된 만능성 줄기 세포 (IPSC)의 경우, 이러한 만능성 T-세포는 유전자 변형된 세포독성 세포가 제공될 개체로부터 유래된 체세포를 이용해 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 정맥천자 (venipuncture)에 의해, 성분채집술 (apheresis)에 의해, 백혈구 동원과 이후의 성분채집술 또는 정맥천자에 의해, 또는 골수 천자 (bone marrow aspiration)에 의해 개체 또는 공여자로부터 수득할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 개체로부터 면역 세포를 수득하는 단계, 키메라 항원 수용체를 발현하도록 면역 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 개체로부터 면역 세포를 수득하는 단계, 키메라 항원 수용체를 발현하도록 면역 세포를 유전자 조작하는 단계 및 세포자살성 세포 집단과 조합하는 단계를 포함하며, 이로써 개체에서 사이토카인 생산을 감소시키지만 세포자살성 세포 집단이 비-투여된 CAR 발현성 면역 세포에 비해 실질적으로 영향을 미치지 않는 세포 독성이 형성된다 (도 1A-1B 및 2). 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 개체로부터 면역 세포를 수득하는 단계, 키메라 항원 수용체를 발현하도록 면역 세포를 유전자 변형하는 단계 및 세포자살성 세포 상층액 또는 이러한 상층액을 포함하는 조성물과 조합하는 단계를 포함하며, 이로써 개체에서 사이토카인 생산을 감소시키지만 세포자살성 세포 집단 비-투여된 CAR 발현성 면역 세포에 비해 실질적으로 영향을 미치지 않는 세포 독성이 형성된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포의 효능을 감소시키지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 면역 세포, 일부 구현예에서, T-세포가 개체에 자가인 CAR T-세포를 개시한다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 개체에 이종이다. 일부 구현예에서, CAR T-세포는 동종이계이다. 일부 구현예에서, CAR T-세포는 유니버셜 동종이계 CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 자가 또는 동종이계이거나 또는 조작된 전구 세포 (progenitor) 또는 줄기 세포로부터 시험관내 유래될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T-세포 및 세포자살성 세포는 둘다 동일한 소스로부터 유래된다. 추가적인 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T-세포 및 세포자살성 세포는 둘다 개체로부터 유래된다 (도 1). 대안적인 구현예에서, 본원에 기술된 CAR T-세포 및 세포자살성 세포는 서로 다른 소스로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, CAR T-세포는 자가 세포이고, 본원에 기술된 세포자살성 세포는 동종이계 세포이다 (도 2). 당해 기술 분야의 당업자라면, 마찬가지로, 세포자살성 세포 상층액이, 일 구현예에서, 자가 세포일 수 있는 CAR T-세포와 동일한 소스로부터 유래되는 세포로부터 제조될 수 있거나, 또는 세포자살성 세포 상층액이 CAR T-세포의 소스와는 다른 소스로부터 제조될 수 있음을, 알 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "이종"이 다른 유기체로부터 유래되는 조직, 세포, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 포괄할 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 이종의 단백질은, 일차적으로 다른 T-세포 타입 또는 수용자와는 다른 종으로부터 클로닝 또는 유래되지만, 세포로부터 수득되는 샘플 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 단백질이다.
이에, 본원에 개시된 일 구현예는, 세포가 자신의 세포독성 기능을 유지하는, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 세포독성 면역 세포 (예, NK 세포 또는 T-세포)에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T-세포에 대해 외인성이다. 다른 구현예에서, CAR은 재조합에 의해 발현된다. 다른 구현예에서, CAR은 벡터로부터 발현된다.
일부 구현예에서, CAR T-세포를 생산하기 위해 사용되는 T-세포는 나이브 CD4+ T-세포이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포를 생산하기 위해 사용되는 T-세포는 나이브 CD8+ T-세포이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포를 생산하기 위해 사용되는 T-세포는 작동자 T-세포이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포를 생산하기 위해 사용되는 T-세포는 조절성 T-세포 (Treg)이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포를 생산하기 위해 사용되는 T-세포는 세포독성 T-세포이다.
유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 T-세포의 소스는 문헌들에 널리 기술되어 있으며, 예를 들어 Themelli et al. (2015) New Cell Sources for T Cell Engineering and Adoptive Immunotherapy. Cell Stem Cell 16: 357-366; Han et al. (2013) Journal of Hematology & Oncology 6:47-53; Wilkie et al. (2010) J Bio Chem 285(33):25538-25544; 및 van der Stegen et al. (2013) J. Immunol 191: 4589-4598을 참조한다. CAR T-세포는, 키메라 항원 수용체 (CAR)에 대한 맞춤 제작 및 생산 서비스를 공급하고 또한 사전 제조된 CAR 구조체 스톡을 공급하는, Creative Biolabs (NY USA)와 같은 시판 공급사에서 주문하여 이용가능하며, 재조합 아데노바이러스 백신에 의해 코딩되는 보호 면역을 유도할 수 있다. 주문 제작된 CAR T-세포는 또한 특수 설계된 CAR T-세포를 공급할 수 있는 Promab Biotechnologies (CA USA)로부터 입수할 수 있다.
T-세포 수용체 (TCR) 세포
일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은, CAR T-세포와 더불어, 또는 그 대신 디자이너 T-세포 수용체 (TCR) 세포를 이용한다. TCR은 T-세포의 항원-특이적인 활성화를 매개하는 멀티-서브유닛 막관통 복합체 (multi-subunit transmembrane complex)이다. TCR는 2종의 서로 다른 폴리펩타이드 체인으로 구성된다. TCR은, 타겟 세포, 예를 들어 종양 또는 암 세포 상의 항원 에피토프를 인지함으로써, T-세포에 항원 특이성을 부여한다. T-세포는, 종양 또는 암 세포에 존재하는 항원과 접촉한 후, 증식하여, 암 또는 종양 세포의 제거를 허용하는 표현형 및 기능을 획득한다.
일 구현예에서, TCR T-세포 요법은 대상 단백질의 에피토프에 특이적인 T-세포 수용체 (TCR)를 T-세포에 도입하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 대상 단백질은 종양-관련 항원이다. 다른 구현예에서, 유전자 조작된 TCR은 T-세포 활성화 도메인과 더불어 종양 세포 상에 주 조직적합성 복합체 (MHC)에 의해 제시된 종양 항원 에피토프를 인지한다. 다른 구현예에서, T-세포 수용체는 이의 세포내 또는 막 국지화와 상관없이 항원을 인지한다. 다른 구현예에서, TCR은 종양 관련 항원을 세포내에서 발현하는 종양 세포를 인지한다. 일 구현예에서, TCR은 내부 항원을 인지한다. 다른 구현예에서, TCR은 혈관신생 인자를 인지한다. 다른 구현예에서, 혈관신생 인자는 새로운 혈관 형성에 관여하는 분자이다. 다양한 유전자 변형된 T-세포 수용체 및 이의 제조 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
일 구현예에서, TCR T-세포 요법을 이용해 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 완화, 발병을 저하 또는 완화한다. 일 구현예에서, TCR T-세포 요법을 이용해, 혈액성 (림프종 및 백혈병) 및 고형 종양 (불응성 흑색종, 육종) 등의, 진행성 전이 질환을 치료, 예방, 저해, 완화, 발병을 저하 또는 완화한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 TCR T-세포 요법은 Sadelain et al., (Cancer Discov. 2013 Apr; 3(4): 388-398)의 표 1에 열거된 악성 종양을 치료한다.
다른 구현예에서, T-세포 수용체는 NY-ESO-1 에피토프에 결합하도록 유전자 변형되며, TCR-조작된 T-세포는 항-NY-ESO-1이다. 다른 구현예에서, T-세포 수용체는 HPV-16 E6 에피토프에 결합하도록 유전자 변형되며, TCR-조작된 T-세포는 항-HPV-16 E6이다. 다른 구현예에서, T-세포 수용체는 HPV-16 E7 에피토프에 결합하도록 유전자 변형되며, TCR-조작된 T-세포는 항-HPV-16 E7이다. 다른 구현예에서, T-세포 수용체는 MAGE A3/A6 에피토프에 결합하도록 유전자 변형되며, TCR-조작된 T-세포는 항-MAGE A3/A6이다. 다른 구현예에서, T-세포 수용체는 MAGE A3 에피토프에 결합하도록 유전자 변형되며, TCR-조작된 T-세포는 항-MAGE A3이다. 다른 구현예에서, T-세포 수용체는 SSX2 에피토프에 결합하도록 유전자 변형되며, TCR-조작된 T-세포는 항-SSX2이다. 다른 구현예에서, T-세포 수용체는 본원에 기술된 타겟 항원에 결합하도록 유전자 변형된다. 당해 기술 분야에 잘 알려진 툴을 이용해, 당업자라면, T-세포 수용체가 암 또는 종양 세포 상에 존재하는 타겟 항원에 결합하도록 유전자 변형될 수 있음을 알 것이며, TCR-조작된 T-세포는 항-종양 또는 항-암 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 개체로부터 면역 세포를 수득하는 단계 및 재조합 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 면역 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 개체로부터 면역 세포를 수득하는 단계, 재조합 TCR을 발현하도록 면역 세포를 유전자 변형하는 단계 및 부가적인 물질과 조합하는 단계를 포함하며, 부가적인 물질은 세포자살성 세포 집단, 세포자살성 세포의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, TCR T-세포를 구축하기 위해 사용되는 T-세포는 나이브 CD4+ T-세포이다. 다른 구현예에서, TCR T-세포를 구축하기 위해 사용되는 T-세포는 나이브 CD8+ T-세포이다. 다른 구현예에서, TCR T-세포를 구축하기 위해 사용되는 T-세포는 작동자 T-세포이다. 다른 구현예에서, TCR T-세포를 구축하기 위해 사용되는 T-세포는 조절성 T-세포 (Treg)이다. 다른 구현예에서, TCR T-세포를 구축하기 위해 사용되는 T-세포는 세포독성 T-세포이다.
TCR T-세포는 문헌에 광범위하게 기술되어 있으며, 예를 들어 Sharpe and Mount (2015) ibid.; Essand M, Loskog ASI (2013) Genetically engineered T cells for the treatment of cancer (Review). J Intern Med 273: 166-181; 및 Kershaw et al. (2014) Clinical application of genetically modified T cells in cancer therapy. Clinical & Translational Immunology　3:1-7을 참조한다.
항원 타겟팅
일부 구현예에서, CAR은 항원에 대한 항체 또는 항체 단편을 통해 항원의 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는 다클론 항체이다. 다른 구현예에서, 항체 단편은 단쇄 가변성 단편 (scFv)이다.
일 구현예에서, TCR은 유전자 변형된 T-세포 수용체를 통해 항원의 에피토프에 결합한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물의 CAR T-세포는 종양 관련 항원 (TAA)에 결합한다. 다른 구현예에서, 이러한 종양 관련 항원은 Mucin 1, 세포 표면 관련 (MUC1) 또는 다형성 상피 뮤신 (polymorphic epithelial mucin, PEM), Armet (Arginine-rich, mutated in early stage tumor), 열 충격 단백질 60 (HSP60), 칼넥신 (calnexin, CANX), 메틸렌테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나제 (NADP+ 의존형) 2, 메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로하이드롤라제 (MTHFD2), 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 매트릭스 메탈로펩티다제 (MMP6), B 흑색종 항원-1 (BAGE-1), N-아세틸 글루코사미닐 트랜스퍼라제 V의 비정상적인 전사체 (GnTV), Q5H943, 암태아성 항원 (CEA), Pmel, 칼리크레인-4, 맘마글로빈-1 (Mammaglobin-1), MART-1, GPR143-OA1, 전립선 특이 항원 (PSA), TRP1, 티로시나제, FGP-5, NEU 프로토-온코진, Aft, MMP-2, 전립선 특이적인 막 항원 (PSMA), 텔로머라제-관련 단백질-2, 전립선산 포스파타제 (Prostatic acid phosphatase, PAP), 우로플라킨 II (Uroplakin II) 또는 프로테아제 3이다.
다른 구현예에서, CAR은, 백혈병에서와 같이 B 세포를 파괴할 가능성이 있는 경우에, B 세포를 타겟팅하기 위해 CD19 또는 CD20에 결합한다. CD19는 프로-B 세포에서 초기 형질세포에 이르기까지 광범위하게 발현되는 B 세포 계열의 특이적인 표면 수용체이므로, B 세포 악성 종양에 대한 면역요법의 매력적인 타겟이 된다. 다른 구현예에서, CAR은 ROR1, CD22 또는 GD2에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 NY-ESO-1에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 MAGE 패밀리 단백질에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 메소텔린 (mesothelin)에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 c-erbB2에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 BRAFV600E 돌연변이 및 BCR-ABL 전위 (translocation)와 같이 종양 특이적인 돌연변이 항원에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 HD의 경우 EBV, 자궁경부암의 경우 HPV, 메켈 암의 경우 폴리오마바이러스와 같이 종양 특이적인 바이러스 항원에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 Her2/neu에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 EGFRvIII에 결합한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포는 CD19 항원에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD22 항원에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 alpha 폴레이트 수용체에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CAIX에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD20에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD23에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD24에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD30에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD33에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD38에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD44v6에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD44v7/8에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD123에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD171에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 암태아성 항원 (CEA)에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 EGFRvIII에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 EGP-2에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 EGP-40에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 EphA2에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 Erb-B2에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 Erb-B 2,3,4에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 Erb-B3/4에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 FBP에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 태아성 아세틸콜린 수용체 (fetal acetylcholine receptor)에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 GD2에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 GD3에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 HER2에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 HMW-MAA에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 IL-11Rα에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 IL-13Rα1에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 KDR에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 카파-경쇄에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 Lewis Y에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 L1-세포 유착 분자에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 MAGE-A1에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 메소텔린에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CMV 감염 세포에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 MUC1에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 MUC16에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 NKG2D 리간드에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 NY-ESO-1 (아미노산 157-165)에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 태아종양성 (oncofetal) 항원 (h5T4)에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 PSCA에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 PSMA에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 ROR1에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 TAG-72에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 VEGF-R2 또는 기타 VEGF 수용체에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 B7-H6에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CA9에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 αvβ6 인테그린에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 8H9에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 NCAM에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 태아성 아세틸콜린 수용체에 결합한다.
다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포는 CD19 항원을 타겟팅하며, B 세포 악성 종양, ALL, 소포성 림프종, CLL 및 림프종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD22 항원을 타겟팅하며, B 세포 악성 종양을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 alpha 폴레이트 수용체 또는 폴레이트 수용체 alpha를 타겟팅하며, 난소암 또는 상피 암을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CAIX 또는 G250/CAIX를 타겟팅하며, 신장 세포 암종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD20을 타겟팅하며, 림프종, B 세포 악성 종양, B 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종 및 무통성 B 세포 림프종 (indolent B-cell lymphomas)을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD23을 타겟팅하며, CLL을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD24를 타겟팅하며, 췌장 선암종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD30을 타겟팅하며, 림프종 또는 호지킨 림프종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD33을 타겟팅하며, AML을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD38을 타겟팅하며, 비-호지킨 림프종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD44v6를 타겟팅하며, 수종의 악성 종양을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD44v7/8을 타겟팅하며, 자궁경부 암종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD123을 타겟팅하며, 골수성 악성을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CEA를 타겟팅하며, 결장직장암을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 EGFRvIII를 타겟팅하며, 교모세포종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 EGP-2를 타겟팅하며, 다발성 악성을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 EGP-40를 타겟팅하며, 결장직장암을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 EphA2를 타겟팅하며, 교모세포종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 Erb-B2 또는 ErbB3/4를 타겟팅하며, 유방암 및 기타, 전립선암, 대장암, 다양한 종양을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 Erb-B 2,3,4를 타겟팅하며, 유방암 및 기타 질환을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 FBP를 타겟팅하며, 난소암을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 태아성 아세틸콜린 수용체를 타겟팅하며, 횡문근육종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 GD2를 타겟팅하며, 신경모세포종, 흑색종 또는 유잉 육종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 GD3를 타겟팅하며, 흑색종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 HER2를 타겟팅하며, 수모세포종, 췌장 선암종, 교모세포종, 골육종 또는 난소암을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 HMW-MAA를 타겟팅하며, 흑색종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 IL-11Rα를 타겟팅하며, 골육종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 IL-13Rα1을 타겟팅하며, 신경교종, 교모세포종 또는 수모세포종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 IL-13 수용체 alpha2를 타겟팅하며, 수종의 악성 종양을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 KDR을 타겟팅하며, 종양 신혈관 (tumor neovasculature)을 타겟팅함으로써 종양을 가진 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 κ-경쇄를 타겟팅하며, B 세포 악성 종양 (B-NHL, CLL)을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 Lewis Y를 타겟팅하며, 다양한 암종 또는 상피-유래 종양을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 L1-세포 유착 분자를 타겟팅하며, 신경모세포종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 MAGE-A1 또는 HLA-A1 MAGE A1을 타겟팅하며, 흑색종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 메소텔린을 타겟팅하며, 중피종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CMV 감염 세포를 타겟팅하며, CMV를 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 MUC1을 타겟팅하며, 유방암 또는 난소암을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 MUC16을 타겟팅하며, 난소암을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 NKG2D 리간드를 타겟팅하며, 골수종, 난소 종양 및 기타 종양을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 NY-ESO-1 (157-165) 또는 HLA-A2 NY-ESO-1을 타겟팅하며, 다발성 골수종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 태아종양성 항원 (h5T4)을 타겟팅하며, 다양한 종양을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 PSCA를 타겟팅하며, 전립선 암종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 PSMA를 타겟팅하며, 전립선 암/종양 혈관 (tumor vasculature)을 가진 개체에서 치료학적인 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 ROR1을 타겟팅하며, B-CLL 및 맨틀 세포 림프종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 TAG-72를 타겟팅하며, 선암종 또는 위장암을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 VEGF-R2 또는 기타 VEGF 수용체를 타겟팅하며, 종양 신생혈관을 타겟팅함으로써 종양을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CA9을 타겟팅하며, 신장 세포 암종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 CD171을 타겟팅하며, 신장 신경모세포종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 NCAM을 타겟팅하며, 신경모세포종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 태아성 아세틸콜린 수용체를 타겟팅하며, 횡문근육종을 앓고 있는 개체에서 치료학적 효과를 가진다. 다른 구현예에서, CAR은 Sadelain et al. (Cancer Discov. 2013 Apr; 3(4): 388-398)의 표 1에 열거된 타겟 항원들 중 하나이며, 상기 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 탄수화물 또는 당지질 구조에 결합한다.
일 구현예에서, CAR T-세포는 혈관신생 인자에 결합하고, 그에 따라 종양 맥관구조를 표적으로 한다. 일 구현예에서, 혈관신생 인자는 VEGFR2이다. 다른 구현예에서, 혈관신생 인자는 엔도글린 (endoglin)이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 혈관신생 인자는 안지오제닌 (Angiogenin); 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1); Del-1; 섬유모세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF); 폴리스타틴 (Follistatin); 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF); 간세포 성장 인자 (HGF)/스캐터 인자 (scatter factor, SF); 인터루킨-8 (IL-8); 렙틴; 미드카인; 태반 성장 인자; 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF); 혈소판-유래 성장 인자-BB (PDGF-BB); 플레이오트로핀 (Pleiotrophin, PTN); 프로그래뉼린 (Progranulin); 프롤리페린 (Proliferin); 형질전환 성장 인자-α (TGF-α); 형질전환 성장 인자-β (TGF-β); 종양 괴사 인자-α (TNF-α); 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)/혈관 투과성 인자 (VPF)이다. 다른 구현예에서, 혈관신생 인자는 혈관신생 단백질이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈관신생 단백질이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시되는 조성물 및 방법에 사용하기 위한 혈관신생 단백질은 섬유모세포 성장 인자 (FGF); VEGF; VEGFR 및 뉴로필린 1 (NRP-1); 안지오포이에틴 1 (Ang1) 및 Tie2; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF; BB-호모다이머) 및 PDGFR; 형질전환 성장 인자-β (TGF-β), 엔도글린 및 TGF-β 수용체; 단구 화학주성 단백질-1 (MCP-1); 인테그린 αVβ3, αVβ5 및 α5β1; VE-카드헤린 및 CD31; 에프린; 플라스미노겐 활성화인자; 플라스미노겐 활성화인자 저해제-1; 산화질소 합성효소 (NOS) 및 COX-2; AC133; 또는 Id1/Id3이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 혈관신생 단백질은 안지오포이에틴이며, 이는 일 구현예에서 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 3, 안지오포이에틴 4 또는 안지오포이에틴 6이다. 일부 구현예에서, 엔도글린은 또한 CD105; EDG; HHT1; OR; 또는 OR1으로도 알려져 있다. 일부 구현예에서, 엔도글린은 TGFβ 공동-수용체이다.
다른 구현예에서, CAR T-세포는 감염성 물질과 관련된 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 감염성 물질은 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)이다. 일부 구현예에서, 상기 마이코박테리움 투버쿨로시스 관련 항원은 항원 85B, 리포단백질 IpqH, 추정의 ATP 의존적인 헬리카제, 특정할 수 없는 (uncharacterized) 단백질 Rv0476/MTO4941 전구체 또는 특정할 수 없는 단백질 Rv1334/MT1376 전구체이다.
다른 구현예에서, CAR T-세포는 항체에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR T-세포는 "항체-커플링된 T-세포 수용체" (ACTR)이다. 이러한 구현예에 있어서, CAR T-세포는 유니버셜 CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, 항체 수용체를 가진 CAR T-세포는 항체가 투여되기 전, 투여 후 또는 투여와 동시에 투여된 후 항체에 결합하여, T-세포를 종양 또는 암에 가까이 위치시킨다. 다른 구현예에서, 항체는 종양 세포 항원에 대한 것이다. 다른 구현예에서, 항체는 CD20에 대한 것이다. 다른 구현예에서, 항체는 리툭시맵 (rituximab)이다.
다른 구현예에서, 항체는 트라스투주맵 (trastuzumab) (헤르셉틴 (herceptin); Genentech): ERBB2를 겨냥하는 인간화된 IgG1이다. 다른 구현예에서, 항체는 베박시주맵 (bevacizumab) (아바스틴 (avastin); Genentech/Roche): VEGF를 겨냥하는 인간화된 IgG1이다. 다른 구현예에서, 항체는 세투시맵 (cetuximab) (에르비툭스 (erbitux); Bristol-Myers Squibb): EGFR을 겨냥하는 키메라 인간-뮤라인 IgG1이다. 다른 구현예에서, 항체는 파니투무맵 (panitumumab) (Vectibix; Amgen): EGFR을 겨냥하는 인간 IgG2이다. 다른 구현예에서, 항체는 이필리무맵 (ipilimumab) (Yervoy; Bristol-Myers Squibb): CTLA4를 겨냥하는 IgG1이다.
다른 구현예에서, 항체는 알렘투주맵 (alemtuzumab) (Campath; Genzyme): CD52를 겨냥하는 인간화된 IgG1이다. 다른 구현예에서, 항체는 오파투무맵 (Ofatumumab) (Arzerra; Genmab): CD20을 겨냥하는 인간 IgG1이다. 다른 구현예에서, 항체는 겜투주맵 오조가미신 (gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg; Wyeth): CD33을 겨냥하는 인간화된 IgG4이다. 다른 구현예에서, 항체는 브렌툭시맵 베도틴 (Brentuximab vedotin) (Adcetris; Seattle Genetics): CD30을 겨냥하는 키메라 IgG1이다. 다른 구현예에서, 항체는 90Y-표지된 이브리투모맵 티우세탄 (ibritumomab tiuxetan) (Zevalin; IDEC Pharmaceuticals): CD20을 겨냥하는 뮤라인 IgG1이다. 다른 구현예에서, 항체는 131I-표지된 토시투모맵 (tositumomab) (Bexxar; GlaxoSmithKline): CD20을 겨냥하는 뮤라인 IgG2이다.
다른 구현예에서, 항체는 혈관 내피 성장인자 수용체-2 (VEGFR-2)를 겨냥하는 라무시루맵 (Ramucirumab)이다. 다른 구현예에서, 항체는 라무시루맵 (ramucirumab) (Cyramza Injection, Eli Lilly and Company), 블린나투모맵 (blinatumomab) (BLINCYTO, Amgen Inc.), 펨브롤리주맵 (pembrolizumab) (KEYTRUDA, Merck Sharp & Dohme Corp.), 오비누투주맵 (obinutuzumab) (GAZYVA, Genentech, Inc.; 종래에 GA101), 퍼투주맵 (pertuzumab) 주사제 (PERJETA, Genentech, Inc.) 또는 데노수맵 (denosumab) (Xgeva, Amgen Inc.)이다. 다른 구현예에서, 항체는 바실리시맵 (Basiliximab) (Simulect; Novartis)이다. 다른 구현예에서, 항체는 다클리주맵 (daclizumab) (Zenapax; Roche)이다.
다른 구현예에서, CAR T-세포가 커플링되는 항체는, 본원에 기술되거나 및/또는 당해 기술 분야에 공지된, 종양 또는 암 항원 또는 이의 단편에 대한 것이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포가 커플링되는 항체는 종양-관련 항원에 대한 것이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포가 커플링되는 항체는 혈관신생 인자인 종양-관련 항원 또는 이의 단편에 대한 것이다.
다른 구현예에서, CAR T-세포가 커플링되는 항체는, 본원에 기술되거나 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 종양 또는 암 항원 또는 그 단편에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 본원에 기술된 조성물, 비-제한적인 예로 CAR-T 세포 또는 초기 세포자살성 세포, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 조성물과 조합하여 사용될 수 있다.
사이토카인 폭풍 및 사이토카인 방출 증후군
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은, 개체에서 발생할 수 있는 독성 사이토카인 방출 또는 "사이토카인 방출 증후군" (CBS) 또는 "중증 사이토카인 방출 증후군 (sCRS) 또는 "사이토카인 폭풍"을 줄이기 위해, 적어도 부가적인 물질과 함께, 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR T-세포)를 포함하는 NK 세포, 수지상 세포, TCR T-세포 또는 T-세포와 같은 면역 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, CRS, sCRS 또는 사이토카인 폭풍은 면역 세포의 투여 결과로서 발생한다. 다른 구현예에서, CRS, sCRS 또는 사이토카인 폭풍은 면역 세포와의 별개의 자극원, 상태 또는 증후군의 결과이다 (하기 참조). 다른 구현예에서, 사이토카인 방출 증후군의 보다 중증인 형태는 사이토카인 폭풍, 사이토카인 케스케이드 또는 고사이토카인혈증 (hypercytokinemia)이다.
일 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포를 포함하는 조성물 또는 세포자살성 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포의 상층액 또는 상기 상층액을 포함하는 조성물을 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 CTLA-4 차단제를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물, 및 CTLA-4 차단제를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물, 및 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 텔루륨계 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물, 및 텔루륨계 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 면역조절제를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물, 및 면역조절제를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 Treg 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물, 및 Treg 세포를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 독성 사이토카인 방출 또는 독성 사이토카인 수준의 저하가 개체에서 독성 사이토카인 수준의 생산 감소 또는 저해, 또는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 발생 저해 또는 감소를 포함함을 알 것이다. 다른 구현예에서, 독성 사이토카인 수준은 CRS 또는 사이토카인 폭풍 중에 감소된다. 다른 구현예에서, 독성 사이토카인 수준의 생산 감소 또는 저해는 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 치료를 포함한다. 다른 구현예에서, 독성 사이토카인 수준의 생산 감소 또는 저해는 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 예방을 포함한다. 다른 구현예에서, 독성 사이토카인 수준의 생산 감소 또는 저해는 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 완화를 포함한다. 다른 구현예에서, 독성 사이토카인 수준의 생산 감소 또는 저해는 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 개선을 포함한다. 다른 구현예에서, 독성 사이토카인은 전-염증성 사이토카인을 포함한다. 다른 구현예에서, 전-염증성 사이토카인은 IL-6를 포함한다. 다른 구현예에서, 전-염증성 사이토카인은 IL-1β를 포함한다. 다른 구현예에서, 전-염증성 사이토카인은 TNF-α를 포함한다, 다른 구현예에서, 전-염증성 사이토카인 IL-6, IL-1β 또는 TNF-α, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 사이토카인 방출 증후군은 개체에서 수종의 염증성 사이토카인의 수준 증가 및 저혈압, 고열 및 오한과 같은 신체 부작용을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 염증성 사이토카인은 IL-6, IL-1β 및 TNF-α를 포함한다. 다른 구현예에서, CRS는 IL-6, IL-1β 또는 TNF-α, 또는 이들의 임의 조합의 수준 증가를 특징으로 한다. 다른 구현예에서, CRS는 IL-8 또는 IL-13, 또는 이들의 임의 조합의 수준 증가를 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 폭풍은 TNF-alpha, IFN-gamma, IL-1beta, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, IL-5, 프렉탈카인 (fracktalkine), 또는 이들의 조합 또는 이의 서브세트의 증가를 특징으로 한다. 또 다른 구현예에서, IL-6는 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 마커를 포함한다.
다른 구현예에서, 인간 및 마우스의 경우, CRS 또는 사이토카인 폭풍에서 증가되는 사이토카인은 아래 표 1 및 2에 열거된 사이토카인들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
표 1: 인간 및/또는 마우스에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍시 증가되는 사이토카인 패널
사이토카인 (분석물) 인간 모델 (임상 실험) 마우스 모델 (전임상) 사이토카인 방출 세포 메모/기타
CAR-T
(H)
기원 		마우스
기원 		불특정
Flt-3L * DC(?)
Fractalkine * APC, 내피 세포 (?) = CX3CL1, Neurotactin (마우스)
M-CSF = CSF1
GM-CSF * * (시험관내) T-세포, MØ
IFN-α * T-세포, MØ, 단구
IFN-β ? ? T-세포, MØ, 단구
IFN-γ * * * (시험관내) 세포독성 T-세포, 헬퍼 T-세포, NK 세포, MØ, 단구, DC
IL- 1 α * 단구, MØ, 상피세포
IL- 1 β * * 대식세포, DC, 섬유모세포, 내피 세포, 간세포
IL- 1 Rα *
IL- 2 * * * (시험관내) T-세포
IL- 2Rα * 림프구
IL- 4 * * * (시험관내) Th2 세포
IL- 5 * * * T-세포
IL- 6 * * * 단구/ 대식세포, 수지상 세포, T-세포, 섬유모세포, 각질 형성 세포, 내피 세포, 지방세포, 근세포, 혈관사이 세포, 및 조골세포
IL- 7 * * 시험관내 BM에 의한 기질 세포
IL- 8 * 대식세포, 단구
IL - 9 * * T-세포, T 헬퍼 세포
IL- 10 * * * * (시험관내) 단구, 대식세포, 비만세포, B 세포, 조절성 T-세포 및 헬퍼 T-세포
IL- 12 * * MØ, 단구, DC, 활성화된 림프구, 호중구 = p70 (p40+p35)
IL- 13 * * T-세포
일부 구현예에서, 표 1의 사이토카인 Flt-3L, 프렉탈카인, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-2Rα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 및 IL-13은 CRS 또는 사이토카인 폭풍에서 유의한 것으로 간주된다. 다른 구현예에서, 표 1의 IFN-α, IFN-β, IL-1 및 IL-1Rα는 CRS 또는 사이토카인 폭풍에서 중요한 것으로 보인다. 다른 구현예에서, M-CSF는 알려지지 않은 중요성을 가진다. 다른 구현예에서, 표 1에 열거된 임의 사이토카인 또는 이들의 조합은 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 마커로서 사용될 수 있다.
표 2: 인간 및/또는 마우스에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍시 증가되는 사이토카인 패널
사이토카인 (분석물) 인간 모델 (임상 실험) 마우스 모델 (전임상) 사이토카인을 방출하는 세포 메모/기타
CAR-T 기원 마우스 기원 불특정
IL- 15 * 섬유모세포, 단구 (?) 22
IL- 17 * * T-세포
IL- 18 대식세포
IL- 21 * T 헬퍼 세포, NK 세포
IL- 22 * 활성화된 DC 및 T-세포
IL- 23
IL- 25 예방?
IL- 27 * APC
IP-10 * 단구 (?)
MCP-1 * 내피세포, 섬유모세포, 상피세포, 단구 = CXCL10
MCP-3 * PBMC, MØ (?) = CCL2
MIP-1α * * (시험관내) T-세포 = CXCL9
MIP-1β * T-세포 = CCL3
PAF ? 혈소판, 내피 세포, 호중구, 단구 대식세포, 혈관사이 세포 = CCL4
PGE2 * * 위장 점막 등
RANTES * 단구
TGF-β * * MØ, 림프구, 내피세포, 혈소판... = CCL5
TNF-α * * * * (시험관내) 대식세포, NK 세포, T-세포
TNF-αR1 *
HGF
MIG * T-세포 화학주성인자, IFN-γ에 의해 유도됨
일 구현예에서, 표 2의 IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 TNF-α는 CRS 또는 사이토카인 폭풍에서 유의한 것으로 간주된다. 다른 구현예에서, 표 2의 IL-27, MCP-3, PGE2, RANTES, TGF-β, TNF-αR1 및 MIG는 CRS 또는 사이토카인 폭풍에서 중요한 것으로 보인다. 다른 구현예에서, IL-23 및 IL-25는 알려지지 않은 중요성을 가진다. 다른 구현예에서, 표 2에 열거된 임의의 사이토카인 또는 이들의 조합은 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 마커로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 마우스 사이토카인 IL-10, IL-1β, IL-2, IP-10, IL-4, IL-5, IL-6, IFNα, IL-9, IL-13, IFN-γ, IL-12p70, GM-CSF, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β, IL-17A, IL-15/IL-15R 및 IL-7은 CRS 또는 사이토카인 폭풍에서 중요한 것으로 보인다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "사이토카인"이 사이토카인 (예, 인터페론 gamma (IFN-γ), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자 alpha), 케모카인 (예, MIP 1 alpha, MIP 1 beta, RANTES), 및 반응성 산소 종 및 산화질소와 같은 염증의 기타 가용성 매개인자를 포괄할 수 있음을 인지할 것이다.
일 구현예에서, 특정 사이토카인의 방출 증가는, 유의하거나, 중대하거나 또는 알려지지 않은 중요성을 가지든지 간에, 특정 사이토카인이 사이토카인 폭풍의 일부임을 의미하는, 선험적 의미 (priori mean)가 아니다. 일 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 증가는 사이토카인 폭풍 또는 CRS의 결과가 아니다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 특정 사이토카인 또는 사이토카인들 일군의 수준 증가의 소스일 수 있다.
다른 구현예에서, 사이토카인 방출 증후군은 다음과 같은 증상들 중 임의 증상 또는 전체를 특징으로 한다: 오한을 동반하거나 또는 동반하지 않는 발열, 병감 (malaise), 피로, 식욕부진, 근육통, 관절통, 구역질, 구토, 두통 피부 발진, 오심, 구토, 설사, 빈호흡, 저산소혈증, 심혈관 빈맥, 확장된 맥박압, 저혈압, 증가된 심박출 (초기), 잠재적으로 감소된 심박출 (후기), 증가된 D-다이머, 출혈성 또는 비-출혈성 저피브리노겐혈증 (hypofibrinogenemia), 질소혈증 (Azotemia), 간 트랜스아미니티스 (Hepatic Transaminitis), 고빌리루빈혈증 (hyperbilirubinemia), 두통, 정신 상태 변화, 혼란, 섬망, 단어 찾기 장애 또는 완전 실어증 (frank aphasia), 환각, 진전, 운동거리조절이상 (dymetria), 보행 이상 (altered gait), 발작. 다른 구현예에서, 사이토카인 폭풍은 IL-2 방출 및 림프구증식 (lymphoproliferation)을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 폭풍은 CAR T-세포에 의해 방출되는 사이토카인의 증가를 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 폭풍은 CAR T-세포 이외의 세포에 의해 방출되는 사이토카인의 증가를 특징으로 한다.
다른 구현예에서, 사이토카인 폭풍은 심장 기능장애, 성인 호흡 곤란 증후군, 신경 독성, 신장 및/또는 간 부전, 및 파종성 혈관내 응고를 비롯하여, 잠재적으로 생명을 위협하는 합병증을 유도한다.
당해 기술 분야의 당업자라면 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 특징이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 촉발 후 수 일 내지 수 주일간 발생하는 것으로 추정됨을 알 것이다. 일 구현예에서, CAR T-세포는 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 촉발 인자이다. 다른 구현예에서, CRS 또는 사이토카인 폭풍의 촉발 인자는 CAR T-세포가 아니다.
일 구현예에서, 사이토카인 폭풍의 지표로서 사이토카인 수준 또는 농도의 측정치는 사이토카인 수준 또는 농도의 ~배 증가, 백분율(%) 증가, 순(net) 증가 또는 변화율로서 표현될 수 있다. 다른 구현예에서, 절대 사이토카인 수준 또는 농도가 특정 수준 또는 농도 보다 높다는 것은 사이토카인 폭풍을 겪는 중이거나 또는 경험하게 될 개체임을 의미하는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 절대 사이토카인 수준 또는 농도가 특정 수준 또는 농도, 예를 들어 CAR-T-세포 요법을 시술받지 않은 대조군 개체에서 정상적으로 확인되는 수준 또는 농도라는 것은 CAR T-세포 시술 중인 개체에서 사이토카인 폭풍의 발생을 저해 또는 감소시키는 방법임을 의미하는 것일 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자는, 용어 "사이토카인 수준"이 농도의 측정치, 배수 변화의 측정치, 백분율(%) 변화의 측정치, 또는 비율 변화의 측정치를 포괄할 수 있음을 알 것이다. 또한, 혈액, 타액, 혈청, 뇨 및 혈장에서 사이토카인을 측정하기 위한 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
일 구현예에서, 사이토카인 폭풍이 몇 가지 염증성 사이토카인의 증가와 관련있다는 인식에도 불구하고, IL-6 수준은 사이토카인 폭풍의 통상적인 척도로서, 및/또는 사이토카인 폭풍에 대한 치료 유효성의 통상적 척도로서 사용될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 다른 사이토카인, 예를 들어 TNF-α, IB-1α, IL-8, IL-13 또는 INF-γ가 사이토카인 폭풍의 마커로서 사용될 수 있음을 알 것이다. 나아가, 사이토카인을 측정하기 위한 분석 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 사이토카인 폭풍에 영향을 미칠 수 있는 방법이 사이토카인 방출 증후군 (CRS)에도 유사하게 영향을 줄 수 있음을 알 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 개체에서 사이토카인 생산을 감소 또는 저해하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하기 쉬운 개체에서 사이토카인 생산을 감소 또는 저해하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 개체에서 사이토카인의 생산을 감소 또는 저해하며, 여기서 표 1 및/또는 2에 열거된 임의의 사이토카인 또는 일군의 사이토카인의 생산이 감소 또는 저해된다. 다른 구현예에서, 사이토카인 IL-6 생산이 감소 또는 저해된다. 다른 구현예에서, 사이토카인 IL-β1 생산이 감소 또는 저해된다. 다른 구현예에서, 사이토카인 IL-8 생산이 감소 또는 저해된다. 다른 구현예에서, 사이토카인 IL-13 생산이 감소 또는 저해된다. 다른 구현예에서, 사이토카인 TNF-α 생산이 감소 또는 저해된다. 다른 구현예에서는, 사이토카인 IL-6 생산, IL-1β 생산 또는 TNF-α 생산 또는 이들의 임의 조합이 감소 또는 저해된다.
일 구현예에서, 사이토카인 방출 증후군은 병기 (grade)로 분류된다. 다른 구현예에서, 병기 1기는 증상이 생명을 위협하지 않으며, 증상, 예를 들어 발열, 구역질, 피로, 두통, 근육통, 병감에 대한 치료만 필요한, 사이토카인 방출 증후군이다. 다른 구현예에서, 2기의 증상은 산소, 수액 또는 저혈압에 대한 승압제와 같은 중등도의 개입이 요하며, 이에 반응한다. 다른 구현예에서, 3기의 증상은 적극적인 개입을 요하며, 이에 반응한다. 다른 구현예에서, 4기의 증상은 생명을 위협하는 증상이며, 산소 호흡기가 필요하고, 환자에서 장기 독성이 나타난다.
다른 구현예에서, 사이토카인 폭풍은 IL-6 및 인터페론 γ 방출을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 폭풍은 표 1 및 2에 열거된 임의의 사이토카인 또는 이들의 조합의 방출을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 폭풍은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 사이토카인 또는 이의 조합의 방출을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 증상의 개시는 주입 개시 후 수 분 내지 수 시간에 시작된다. 다른 구현예에서, 증상은 사이토카인 피크 수준과 동시에 발생한다.
일 구현예에서, CAR T-세포 항암요법을 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물이 CAR T-세포 요법을 보조할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병 저해 또는 감소에 일조할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물은 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 치료에 일조할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물은 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 예방에 일조할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 개선에 일조할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 완화에 일조할 수 있다.
일 구현예에서, CAR T-세포 암 요법을 시술 중이고 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물을 투여 중인 개체에서, 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은, 부가적인 물질의 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CAR T-세포 요법을 보조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 낮추는데 일조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍을 치료하는데 일조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍을 예방하는데 일조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍을 개선하는데 일조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍을 완화하는데 일조할 수 있다.
일 구현예에서, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 부가적인 물질을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CAR T-세포 요법을 보조할 수 있다. 일 구현예에서, TCR T-세포 암 요법을 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 부가적인 물질을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 TCR T-세포 요법을 보조할 수 있다. 일 구현예에서, 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 부가적인 물질을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 보조할 수 있다. 일 구현예에서, NK 세포 요법을 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 부가적인 물질을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 NK 세포 요법을 보조할 수 있다.
다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병 저해 또는 저하를 보조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 치료를 보조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 예방을 보조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 개선을 보조할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질이 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 완화를 보조할 수 있다.
일 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 상층액 또는 상기한 상층액을 포함하는 조성물을 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 CTLA-4 차단제를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물, 및 CTLA-4 차단제를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물, 및 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 텔루륨계 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물, 및 텔루륨계 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 면역 조절제를 포함한다. 다른 구현예에서, 유해한 사이토카인의 방출을 줄이기 위한 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물, 및 면역 조절제를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 CAR T-세포와 하나 이상의 CTLA-4-차단제, 예를 들어 이필리무맵 (ipilimumab)을 이용한 병용 요법 (combination therapy)을 이용한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 세포자살성 세포, CAR T-세포 및 하나 이상의 CTLA-4-차단제를 포함하는 병용 요법을 이용한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 TCR T-세포와 하나 이상의 CTLA-4-차단제, 예를 들어 이필리무맵의 병용 요법을 이용한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 세포자살성 세포, TCR T-세포, 및 하나 이상의 CTLA-4-차단제를 포함하는 병용 요법을 이용한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 수지상 세포 및 하나 이상의 CTLA-4-차단제, 예를 들어 이필리무맵의 병용 요법을 이용한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법 세포자살성 세포, 수지상 세포, 및 하나 이상의 CTLA-4-차단제를 포함하는 병용 요법을 이용한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 NK 세포와 하나 이상의 CTLA-4-차단제, 예를 들어 이필리무맵의 병용 요법을 이용한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 세포자살성 세포, NK 세포 및 하나 이상의 CTLA-4-차단제를 포함하는 병용 요법을 이용한다.
다른 구현예에서, CTLA-4는 자기-관용 (self-tolerance)을 유지하는데 일조하는 T-세포 활성화의 강력한 저해제이다. 다른 구현예에서, 항-CTLA-4 차단제, 다른 구현예에서, 항체의 투여는 T-세포를 활성화하는 순 효과 (net effect)를 발휘한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 의해 치료, 예방, 저해, 개선, 발병 저하 또는 완화될 수 있는, CAR T-세포, TCR T-세포, 수지상 세포 또는 NK 세포의 투여로 유발되는 그외 독성으로는, B 세포 무형성증 또는 종양 용해 증후군 (TLS)을 포함한다.
일 구현예에서, CAR T-세포 암 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능에 영향을 미치지 않는다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법을 받고 있는 개체에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 5% 이상으로 감소시킨다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법을 받고 있는 개체에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 10% 이상으로 감소시킨다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법을 받고 있는 개체에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 15% 이상으로 감소시킨다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법을 받고 있는 개체에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 20% 이상으로 감소시킨다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 5% 이상으로 증가시킨다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 10% 이상으로 증가시킨다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 15% 이상으로 증가시킨다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법은 CAR T-세포 요법의 효능을 약 20% 이상으로 증가시킨다.
세포독성을 정량하는 임의의 적절한 방법을 사용해 CAR을 발현하도록 변형된 면역 세포에서 활성이 실질적으로 변화없이 유지되는 지를 확인할 수 있다. 예를 들어, 세포독성은 실시예에 기술된 세포독성 분석과 같은 세포 배양에 기반한 분석을 사용하여 정량할 수 있다. 세포독성 분석은 사멸 세포의 DNA를 우선적으로 염색하는 염료를 이용할 수 있다. 다른 경우, 세포 집단에서 생존 세포와 사멸 세포의 상대 개수를 측정하는 형광 및 발광 분석을 이용할 수 있다. 이러한 분석에서, 프로테아제 활성은 세포 생존성 및 세포 독성에 대한 마커로서 이용되며, 표지된 세포 투과성 펩타이드는 샘플 내 생존 세포의 수에 비례하여 형광 신호를 발생한다. 예를 들어, 세포독성 분석은 유세포 측정 분석에서 7-AAD를 이용할 수 있다. 다양한 세포독성 분석을 위한 키트들은 Promega, Abcam 및 Life Technologies와 같은 제조사로부터 상업적으로 입수가능하다.
다른 구현예에서, 세포독성의 측정은 정성적일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포독성의 측정은 정량적일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포독성의 측정은 세포독성 사이토카인의 발현 변화와 관련있을 수 있다. 다른 구현예에서, 세포독성의 측정은 골수 및 간 내 종양 부하 및 생존 곡선에 의해 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 동종이계 공여 세포의 거부를 극복하는데 유용한 추가 단계를 포함한다. 일 구현예에서 이 방법은, 일 구현예에서 동종이계 CAR T-세포인, CAR T-세포의 투여 전에 완전한 또는 부분적인 림프구고갈 (lymphodepletion) 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 림프구고갈은, 동종이계 T-세포가 지정된 종양 공격을 허용하기 위한 충분한 기간 동안, 그러나 골수 이식에 의해 숙주 면역 시스템을 복원 (rescue)하기에는 부족한 정도로 숙주 편대 이식 반응을 지연시키도록, 조정된다. 다른 구현예에서, 림프절에서 동종이계 T-세포의 퇴출 (egression)을 지연시키는 물질, 예를 들어, 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]프로판-1,3-다이올 (FTY720), 5-[4-페닐-5-(트리플루오로메틸)티오펜-2-일]-3-[3-(트리플루오로메틸)페닐]1,2,4-옥사다이아졸 (SEW2871), 3-(2-(헥실페닐아미노)-2-옥소에틸아미노)프로판산 (W123), 2-암모니오-4-(2-클로로-4-(3-페녹시페닐티오)페닐)-2-(하이드록시메틸)부틸 하이드로겐 포스페이트 (KRP-203 포스페이트) 또는 당해 기술 분야에 알려진 기타 물질은, 동종이계 CAR T-세포를 이식 편대 숙주 질환의 개시 없이 효과적으로 사용하기 위한 본원에 개시된 조성물 및 방법의 일부로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 동종이계 T-세포에 의한 MHC 발현은 동종이계 세포의 거부 반응을 줄이기 위해 침묵된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 동종이계 세포의 거부 반응을 방지한다.
CAR T-세포 요법과 관련된 사이토카인 방출
일 구현예에서, 사이토카인 방출은 CAR T-세포 요법과 같은 면역 요법의 투여 후 수 일 내지 2주 사이에 발생한다. 일 구현예에서, 저혈압 및 기타 증상이 사이토카인 방출 후 뒤따르며, 즉 수 일 내지 수 주 사이에 뒤따른다. 따라서, 일 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 예방으로서 면역 요법과 동시에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한 후 2 내지 3일 후 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한 지 7일 후 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한 지 10일 후 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한 지 14일 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한 지 2-14일 후에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 면역요법을 투여한지 2-3시간 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 면역요법을 투여한지 7시간 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 면역요법을 투여한지 10시간 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 면역요법을 투여한지 14시간 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 면역요법을 투여한지 2-14시간 후에 개체에 투여된다.
대안적인 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 예방으로서 면역 요법 이전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 1일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 2-3일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 7일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 10일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 14일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 2-14일 전에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 면역 요법을 투여하기 2-3시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 7시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 10시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 14시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 2-14시간 전에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은, 사이토카인 방출 증후군이 발생하였을 때, 치료학적으로 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은, 사이토카인 방출 증후군의 개시에까지 이르거나 또는 개시를 증명하는 사이토카인 방출이 검출되면, 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 증가된 사이토카인 수준 또는 사이토카인 방출 증후군을 종료시킬 수 있으며, 이의 후유증을 회피할 수 있다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 여러 시점에 치료학적으로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 본원에 기술된 적어도 2가지 시점에 이루어진다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 본원에 기술된 적어도 3가지 시점에 이루어진다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 CRS 또는 사이토카인 폭풍 이전에, 그리고 사이토카인 방출 증후군의 발병시, 및 이들의 임의 조합 시기에 이루어진다.
일 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법 및 세포자살성 세포 요법 또는 상층액은 함께 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 요법은 세포자살성 세포 요법 또는 상층액 이후에 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 요법은 세포자살성 세포 요법 또는 상층액 이전에 투여된다. 이러한 측면 및 일 구현예에서, 세포자살성 세포 요법 또는 상층액은 CAR T-세포 요법 후 약 2-3주에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 요법 또는 상층액은 CAR T-세포 요법 후 약 6-7주에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 요법 또는 상층액은 CAR T-세포 요법 후 약 9주에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 요법은 CAR T-세포 요법 후 최대 수개월 후에 투여된다.
따라서, 일 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 예방으로서 면역 요법과 동시에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 2-3일 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 7일 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 10일 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 14일 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 2-14일 후에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 면역 요법을 투여한지 2-3시간 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 7시간 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 10시간 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 14시간 후에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여한지 2-14시간 후에 개체에 투여된다.
대안적인 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 예방으로서 면역 요법 이전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 1일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 2-3일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 7일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 10일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 14일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 2-14일 전에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 면역 요법을 투여하기 2-3시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 7시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 10시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 14시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 면역 요법을 투여하기 2-14시간 전에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은, 사이토카인 방출 증후군이 발생하였을 때, 치료학적으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은, 사이토카인 방출 증후군의 개시에까지 이르거나 또는 개시를 증명하는 사이토카인 방출이 검출되면, 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액은 증가된 사이토카인 수준 또는 사이토카인 방출 증후군을 종결시킬 수 있으며, 이의 후유증을 회피할 수 있다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액은 여러 시점에 치료학적으로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 본원에 기술된 적어도 2가지 시점에 이루어진다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 본원에 기술된 적어도 3가지 시점에 이루어진다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 CRS 또는 사이토카인 폭풍 전에, 그리고 사이토카인 방출 증후군 발병시, 및 이들의 임의 조합 시기에 이루어진다.
일 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법 및 세포자살성 세포 요법 또는 상층액이 함께 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 요법은 세포자살성 세포 요법 또는 상층액 이후에 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 요법은 세포자살성 세포 요법 또는 상층액 이전에 투여된다. 이러한 측면 및 일 구현예에서, 세포자살성 세포 요법 또는 상층액은 CAR T-세포 요법 후 약 2-3주에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 요법 또는 상층액은 CAR T-세포 요법 후 약 6-7주에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 요법 또는 상층액은 CAR T-세포 요법 후 약 9주에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 요법은 CAR T-세포 요법 후 최대 수개월 후에 투여된다.
다른 구현예들에서, 부가적인 물질이 예방으로서 면역 요법과 동시에 개체에 투여된다. 일 구현예에서, 부가적인 물질은 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 텔루륨계 화합물, 또는 면역-조절 화합물, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 2-3일에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 7일에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 10일에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 14일에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 2-14일에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 2-3시간에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 7시간에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 10시간에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 14시간에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법 투여 후 2-14시간에 개체에 투여된다.
대안적인 구현예에서, 부가적인 물질이 예방으로서 면역 요법 이전에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 1일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 2-3일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 7일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 10일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 14일 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 2-14일 전에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 2-3시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 7시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 10시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 14시간 전에 개체에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 면역 요법을 투여하기 2-14시간 전에 개체에 투여된다.
다른 구현예에서, 부가적인 물질은, 사이토카인 방출 증후군이 발생하면, 치료학적으로 투여된다. 일 구현예에서, 부가적인 물질은, 사이토카인 방출 증후군의 개시에까지 이르거나 또는 개시를 증명하는 사이토카인 방출이 검출되면, 투여된다. 일 구현예에서, 부가적인 물질은 증가된 사이토카인 수준 또는 사이토카인 방출 증후군을 종료시킬 수 있으며, 이의 후유증을 회피할 수 있다.
다른 구현예에서, 부가적인 물질은 여러 시점에 치료학적으로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질의 투여는 본원에 기술된 적어도 2가지 시점에 이루어진다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질의 투여는 본원에 기술된 적어도 3가지 시점에 이루어진다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질의 투여는 CRS 또는 사이토카인 폭풍 이전에, 그리고 사이토카인 방출 증후군의 발병시, 및 이들의 임의 조합 시기에 이루어진다.
일 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법 및 부가적인 물질이 함께 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 요법은 부가적인 물질 이후에 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 요법은 부가적인 물질 이전에 투여된다. 이러한 측면 및 일 구현예에서, 부가적인 물질은 CAR T-세포 요법 후 약 2-3주 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 CAR T-세포 요법 후 약 6-7주 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 CAR T-세포 요법 후 약 9주 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 CAR T-세포 요법 후 최대 수개월 후 투여된다.
일 구현예에서, CAR T-세포는 개체에 이종의 것이다. 일 구현예에서, CAR T-세포는 하나 이상의 공여자로부터 유래된다. 일 구현예에서, CAR T-세포는 하나 이상의 골수 공여자로부터 유래된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 하나 이상의 혈액 은행 기증물로부터 유래된다. 일 구현예에서, 공여자는 매칭되는 (matched) 공여자이다. 일 구현예에서, CAR T-세포는 유니버셜 동종이계 CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 동종이계 (syngeneic) CAR T-세포이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 매칭되지 않은 제3자 공여자로부터 유래된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 조합한 제3자 공여 T-세포로부터 유래된다. 일 구현예에서, 공여자는 골수 공여자이다. 다른 구현예에서, 공여자는 혈액 은행 공여자이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법의 CAR T-세포는 하나 이상의 MHC 비-한정 종양-특이 키메라 수용체 (MHC unrestricted tumor-directed chimeric receptor)를 포함한다. 일 구현예에서, 비-자가 T-세포는, 미국 특허 출원번호 20130156794에 기술된 바와 같이, 자가면역 반응을 방지 또는 최소화하기 위해 당해 기술 분야에 공지된 프로토콜에 따라 조작 또는 투여될 수 있으며, 상기 특허는 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 구현예에서, CAR T-세포는 개체의 자가의 것이다. 일 구현예에서, 환자 자신의 세포가 사용된다. 이러한 구현예에서, 환자 자신의 세포가 사용될 경우, CAR T-세포 요법은 세포자살성 세포 요법 이후에 투여된다.
일 구현예에서, 세포자살성 세포는 개체에 이종의 것이다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포는 하나 이상의 공여자로부터 유래된다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포는 하나 이상의 골수 공여자로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 하나 이상의 혈액 은행 기증물로부터 유래된다. 일 구현예에서, 공여자는 매칭되는 (matched) 공여자이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 매칭되지 않은 제3자 공여자로부터 유래된다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포는 유니버셜 동종이계 세포자살성 세포이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 동종이계 공여자로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 조합한 제3자 공여 세포로부터 유래된다. 일 구현예에서, 공여자는 골수 공여자이다. 다른 구현예에서, 공여자는 혈액 은행 공여자이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 개체 자가의 것이다. 이러한 구현예에서, 환자 자신의 세포가 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 단핵구-농화된 치료학적 세포 조제물 (therapeutic mononuclear-enriched cell preparation) 또는 세포자살성 세포의 상층액이 개체에 전신으로 투여된다. 다른 구현예에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 다른 예로, 단핵구 농화된 치료학적 세포 또는 상층액은, 비-제한적인 예로, 비경구, 복막내, 관절내, 근육내 및 피하 경로 등의, 다양한 다른 경로에 의해 개체에 투여될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 단핵구-농화된 치료학적 세포 조제물 또는 부가적인 물질이 개체에 전신으로 투여된다. 다른 구현예에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 다른 예로, 단핵구 농화된 치료학적 세포 또는 부가적인 물질이, 비-제한적인 예로, 비경구, 복막내, 관절내, 근육내 및 피하 경로 등의, 다양한 다른 경로로 개체에 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 조제물은 전신 방식 보다는 국소 방식으로, 예를 들어, 환자 신체의 특정 영역으로 직접 조제물의 주사를 통해 투여된다. 다른 구현예에서, 특정 영역은 종양 또는 암을 포함한다.
다른 구현예에서, 단핵구 농화된 치료학적 세포 또는 상층액은, 비-제한적인 예로, 식염수, PBS, HBSS 등과 같은 적절한 생리 완충액에 현탁되어 개체에 투여된다. 또한, 현탁 매질은 세포의 생존성을 유지하는 데 도움이 되는 보충제를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은, 비-제한적인 예로, 식염수, PBS, HBSS 등과 같은 적절한 생리 완충액에 현탁되어 개체에 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 약학적 조성물은 1회 (single dose) 투여된다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 다회 (multiple doses)로 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 약학적 조성물은 2회 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 약학적 조성물은 3회 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 약학적 조성물은 4회 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 약학적 조성물은 5회 이상 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내 주사용으로 제형화된다.
일 구현예에서, 변형된 CAR-발현성 면역 세포를 개체에 공급하는 임의의 적절한 방법은 본원에 개시된 방법에 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 개체에 세포를 공급하는 방법은 조혈 세포 이식 (hematopoietic cell transplantation, HCT), 공여자-유래 NK 세포의 암 환자로의 주입 또는 이의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 개체에 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법을, 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 개체에 세포자살성 세포-식세포의 상층액과 같은 세포자살성 세포의 상층액을 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법을, 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 개체에게 하나 이상의 부가적인 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법을, 개시한다.
특정 구현예에서, CAR T-세포 요법은 CAR T-세포; 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액 중 하나, 또는 본원에 개시된 다른 부가적인 물질 또는 부가적인 물질의 조합을 포함하는 본원에 개시된 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 대안적인 구현예에서, CAR T-세포 요법은 CAR T-세포를 포함하는 본원에 기술된 조성물; 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액 중 하나, 또는 본원에 개시된 부가적인 물질 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
non-CAR T-세포 이용과 관련된 사이토카인 방출
일 구현예에서, 본 발명은, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 투여로 개체에서 사이토카인 생산이 저하 또는 저해되는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약한 개체에서 사이토카인 생산을 감소시키거나 또는 저해하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 생산의 저하 또는 저해는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약하나 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액을 투여받지 않은 개체와 비교된다. 다른 구현예에서, 사이토카인 생산의 저하 또는 저해 방법은 전-염증성 사이토카인의 생산을 감소시키거나 또는 저해한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 생산의 저하 또는 저해 방법은 하나 이상의 전-염증성 사이토카인의 생산을 감소시키거나 또는 저해한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 생산의 저하 또는 저해 방법은 적어도 사이토카인 IL-6의 생산을 감소시키거나 또는 저해한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 생산의 저하 또는 저해 방법은 적어도 사이토카인 IL-1beta의 생산을 감소시키거나 또는 저해한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 생산의 저하 또는 저해 방법은 적어도 사이토카인 TNF-alpha의 생산을 감소시키거나 또는 저해한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 생산을 감소시키거나 또는 저해하는 본원에 개시된 방법은, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약하나 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액을 투여받지 않은 개체와 비교해, 개체에서, 사이토카인 IL-6, IL-1β 또는 TNF-α, 또는 이들의 조합의 생산 감소 또는 저해를 달성한다.
또한, 암 또는 종양은 전-염증성 사이토카인 등의 사이토카인의 절대 수준에 영향을 미칠 수 있다. 개체의 종양 부담 (tumor burden) 수준은 사이토카인 수준, 특히 전-염증성 사이토카인의 수준에 영향을 미칠 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, "감소시키거나 또는 저해한다"라는 표현 또는 이의 문법적 변형된 표현은 사이토카인 생산의 배수 감소 또는 저해, 또는 사이토카인 생산의 순 감소 또는 저해, 또는 백분율 (%) 감소 또는 저해를 포함할 수 있거나, 또는 사이토카인 생산의 감소 또는 저해의 변화율을 포함할 수 있음을, 알 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약한 개체에서 사이토카인 생산을 감소시키거나 또는 저해하는 방법을, 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 세포자살성 세포-식세포의 상층액과 같은 세포자살성 세포의 상층액, 또는 상기 상층액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약한 개체에서 사이토카인 생산을 감소시키거나 또는 저해하는 방법을, 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 세포자살성 세포의 상층액, 예를 들어, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 텔루륨계 화합물 또는 면역조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 부가적인 물질, 또는 상기한 상층액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약한 개체에서 사이토카인 생산을 감소시키거나 또는 저해하는 방법을, 개시한다.
일 구현예에서, 감염이 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 유발한다. 일 구현예에서, 감염은 인플루엔자 감염이다. 일 구현예에서, 인플루엔자 감염은 H1N1이다. 다른 구현예에서, 인플루엔자 감염은 H5N1 조류 독감이다. 다른 구현예에서, 감염은 중증의 급성 호흡기 증후군 (SARS)이다. 다른 구현예에서, 개체는 엡스타인-바르 바이러스-관련 혈구포식성 림프조직구증 (HLH)을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예에서, 감염은 패혈증이다. 일 구현예에서, 패혈증은 그람-음성이다. 다른 구현예에서, 감염은 말라리아이다. 다른 구현예에서, 감염은 에볼라 바이러스 감염이다. 다른 구현예에서, 감염은 천연두 바이러스이다. 다른 구현예에서, 감염은 전신성 그람-음성 박테리아 감염이다. 다른 구현예에서, 감염은 야리슈-헤리크스하이머 (Jarisch-Herxheimer) 증후군이다.
일 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 혈구포식성 림프조직구증 (hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH)이다. 다른 구현예에서, HLH는 특발성 HLH이다. 다른 구현예에서, HLH는 대식세포 활성화 증후군 (macrophage activation syndrome, MAS)이다. 다른 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 MAS이다.
일 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 만성 관절염이다. 다른 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 스틸병 (Still's Disease)으로 알려져 있는 전신성 소아 특발성 관절염 (systemic Juvenile Idiopathic Arthritis, sJIA)이다.
일 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 크리오피린-관련 주기 증후군 (Cryopyrin-associated Periodic Syndrome, CAPS)이다. 다른 구현예에서, CAPS는 가족성 한냉 두드러기 (Familial Cold Urticaria, FCU)로도 알려진 가족성 한냉 자가-염증성 증후군 (Familial Cold Auto-inflammatory Syndrome, FCAS)을 포함한다. 다른 구현예에서, CAPS는 머클-웰 증후군 (Muckle-Well Syndrome, MWS)을 포함한다. 다른 구현예에서, CAPS는 만성 영아 신경 피부 관절 (Chronic Infantile Neurological Cutaneous and Articular, CINCA) 증후군을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CAPS는 FCAS, FCU, MWS 또는 CINCA 증후군, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 FCAS이다. 다른 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 FCU이다. 다른 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 MWS이다. 다른 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 CINCA 증후군이다. 또 다른 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 FCAS, FCU, MWS 또는 CINCA 증후군, 또는 이들의 임의 조합이다.
다른 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은, CIASI 유전자로 알려진 NLRP3 유전자 내 기능적 돌연변이의 유전적 또는 신규 획득을 포함하는 크리오피린증 (cryopyrinopathy)이다.
일 구현예에서, 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 원인은 유전성 자가-염증 장애이다.
일 구현예에서, 염증성 사이토카인 방출의 촉발 인자는 리포폴리사카라이드 (LPS), 그람-양성 독소, 진균 독소, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 또는 RIG-1 유전자 발현의 조정이다.
다른 구현예에서, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 개체는 감염성 질환을 앓고 있지 않는 개체이다. 일 구현예에서, 개체는 급성 췌장염을 앓고 있다. 다른 구현예에서, 개체는, 일 구현예에서, 증증 화상 또는 외상인, 조직 손상을 가진 개체이다. 다른 구현예에서, 개체는 급성 호흡 곤란 증후군을 앓는 개체이다. 다른 구현예에서, 개체는 약물 사용에 따른 부차적인 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예에서, 개체는 독소 흡입에 따른 부차적인 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 앓는 개체이다.
다른 구현예에서, 개체는, 일 구현예에서, 과작용성 (superagonistic) CD28-특이 단일클론 항체 (CD28SA)를 이용한 면역요법인, 면역요법 투여에 따른 부차적인 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 앓는 개체이다. 일 구현예에서, CD28SA는 TGN1412이다. 다른 구현예에서, 면역요법은 CAR T-세포 요법이다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액 또는 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 텔루륨계 화합물 또는 면역조절제 또는 이들의 임의 조합은, 약학적 조성물의 투여로 유발되는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 제어 (control)하기 위해, 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 시타라빈 (cytarabine), 레날리도미드 (lenalidomide) 또는 이들의 조합이다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 상층액 또는 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합은, 항체의 투여로 유발되는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 제어하기 위해, 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는 다클론 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 리툭시맵이다. 다른 구현예에서, 항체는 오르토클론 (Orthoclone) KT3 (무로모납 (muromonab)-CD3)이다. 다른 구현예에서, 항체는 알렘투주맵 (alemtuzumab), 토시투주맵 (tosituzumab), CP-870,893, LO-CD2a/BTI-322 또는 TGN1412이다.
다른 구현예에서, 염증성 사이토카인 생산을 제어하는 것이 유익할 수 있는 질환의 예로는, 암, 알레르기, 임의 타입의 감염, 독소성 충격 증후군 (toxic shock syndrome), 패혈증, 임의 타입의 자가면역 질환, 관절염, 크론병, 루푸스, 건선, 또는 홀마크 특징이 개체에 유해한 작용을 야기하는 독성 사이토카인 방출인 임의의 다른 질환 등이 있다.
α-1-항-트립신 (AAT)
α-1-항-트립신 (AAT)은 주로 간에서 생산되는 순환성 52 kDa 당단백질이다. AAT는 원래 세린 프로테아제 저해제로 알려져 있으며, 유전자 SERPINA1에 의해 코딩된다. AAT는 호중구 엘라스타제를 저해하며, 순환성 AAT의 유전성 결함 (inherited deficiency)은 폐-조직 악화 및 간 질환을 유발한다. 건강한 개체에서 혈청 AAT 농도는 염증시 2배 증가한다.
AAT 수준과 몇몇 염증성 질환의 중증도 간에는 음의 관계가 존재한다. 예를 들어, AAT의 수준 또는 활성의 감소는 HIV 감염, 진성 당뇨병, C형 간염-유도성 만성 간 질환 및 여러가지 유형의 혈관염을 앓고 있는 환자들에서 언급된 바 있다.
인간 혈청 유래의 α-1-항-트립신 (AAT)이 전-염증성 사이토카인의 생산을 감소시키고, 항-염증성 사이토카인을 유도하며, 또한 수지상 세포의 성숙을 방해한다는 증거들이 증가하고 있다.
실제, 인간 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)에 AAT의 첨가는 LPS 유도성 TNF-α 및 IL-1β의 방출은 저해하지만, IL-1 수용체 길항제 (IL-1Ra) 및 IL-10의 생산은 증가시킨다.
AAT는 시험관내 IL-1β-매개의 췌장 섬 독성을 낮추며, AAT 단일요법 (monotherapy)은 섬 동종이식편 (islet allograft)의 생존을 연장시키고, 마우스에서 항원-특이적인 면역 관용을 촉진하고, 비-비만성 당뇨병 (NOD) 마우스에서 당뇨병의 발병을 지연시킨다. AAT는 실험 모델에서 LPS-유도성 급성 폐 손상을 저해하는 것으로 입증되었다. 최근, AAT는 마우스의 급성 심근 허혈증-재관류 손상 모델에서 심부전의 중증도와 경색의 크기를 감소시키는 것으로 입증되었다.
임상-등급의 인간 AAT (hAAT)를 이용한 단일요법은 순환성 전-염증성 사이토카인을 감소시키고, 이식 편대 숙주 질환 (GvHD)의 중증도를 약화시키며, 실험적인 동종이계 골수 전이 후 동물의 생존성을 연장시켰다 (Tawara et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 10;109 (2):564-9, 문헌은 참조에 의해 본 명세서에 포함됨). AAT 처치는 동종반응성 T 작동자 세포의 증폭을 저하하였으나 조절성 T-세포 (Treg)의 회수를 강화하여, 조절성 T-세포에 대한 공여 T 작동자의 비율이 병리적 과정을 줄이는데 유리하게 변형되었다. 시험관내 AAT는 TNF-α 및 IL-1β 등의 전-염증성 사이토카인의 LPS-유발성 시험관내 분비를 억제하고, 항-염증성 사이토카인 IL-10의 생산을 강화하고, 숙주의 수지상 세포에서 NF-κβ 전위를 손상시켰다. Marcondes, Blood. 2014 (Oct 30;124 (18):2881-91)에 따르면, AAT의 처리는 GvHD를 개선할 뿐만 아니라 이식 편대 백혈병 (GVL) 효과를 유지하고, 아마도 심지어 강화하였으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 및 α-1-항-트립신 (AAT)을 포함하는 조성물을, 개시한다. 다른 구현예에서, CAR T-세포와 α-1-항-트립신 (AAT)은 별개의 조성물로 존재한다. 다른 구현예에서, AAT는 전장 AAT 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, AA는 전장 AAT의 유사체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, AAT를 포함하는 조성물은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액을 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, α-1-항-트립신 (AAT)을 포함하는 조성물 및 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 완화 또는 개선하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 이 방법은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액을 더 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, α-1-항-트립신 (AAT)을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법을, 개시한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 치료하는 방법은, 상기 개체에 α-1-항-트립신 (AAT)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 예방하는 방법은, 상기 개체에 α-1-항-트립신 (AAT)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 개선하는 방법은, 상기 개체에 α-1-항-트립신 (AAT)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 완화하는 방법은, 상기 개체에 α-1-항-트립신 (AAT)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 개체에 α-1-항-트립신 (AAT)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약한 개체에서 사이토카인 생산을 감소시키거나 또는 저해하는 방법을, 개시한다.
일 구현예에서, AAT는 사이토카인 방출을 제어하기 위해 단독으로 투여된다. 다른 구현예에서, AAT, 및 세포자살성 세포 또는 이의 조성물 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물은 둘다 사이토카인 방출을 제어하기 위해 투여된다.
면역조절제
당해 기술 분야의 당업자는, 면역조절제가 세포외 매개인자, 수용체, 세포내 신호전달 경로의 매개인자, 및 번역 및 전사의 조절인자뿐만 아니라 면역 세포를 망라할 수 있음을, 알 것이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 부가적인 물질은 당해 기술 분야에 공지된 면역조절제이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서 면역조절제의 사용은 하나 이상의 사이토카인의 수준을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서 면역조절제의 사용은 CRS 또는 사이토카인 폭풍을 감소시키거나 또는 저해한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서 면역조절제의 사용은 종양 또는 암의 치료, 예방, 증식 저해, 질환의 진행 지연, 종양 부하 감소 또는 발병 감소 또는 이들의 임의 조합을 위한 것이다. 일부 구현예에서, 면역조절제는 본원에 개시된 다른 조성물, 비-제한적인 예로, 초기 세포자살성 세포 또는 CAR T-세포를 포함하는 조성물과 조합하여 사용된다.
일 구현예에서, 면역조절제는 사이토카인 또는 케모카인의 방출을 차단, 저해 또는 감소시키는 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 IL-21 또는 IL-23, 또는 이들의 조합의 방출을 차단, 저해 또는 감소시키는 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 케모카인 수용체-5 (CCR5) 수용체 길항제 계열의 항-레트로바이러스제, 예를 들어 마라비록 (maraviroc)을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 항-DNAM-1 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 헤파린 설페이트, ATP 및 요산, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 손상/병원체-관련 분자 (DAMP/PAMP)를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 시알산 결합성 Ig-유사 렉틴 (Siglecs)을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 세포 관용 매개인자, 예를 들어 조절성 CD4+ CD25+ T-세포 (Treg) 또는 불변성 자연 살상 T-세포 (iNK T-세포)를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 수지상 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 단구를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 대식세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 룩솔리티닙 (ruxolitinib) 및 토파시티닙 (tofacitinib)을 포함하는 군으로부터 선택되는 JAK2 또는 JAK3 저해제를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 비장 티로신 키나제 (Syk)의 저해제, 예를 들어 포스타마티닙 (fostamatinib)을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 히스톤 데아세틸라제 저해제 보리노스타트 (vorinostat) 아세틸화된 STAT3를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 네딜화 (neddylation) 저해제, 예를 들어 MLN4924를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 miR-142 길항제를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 시티딘의 화학적 유사체, 예를 들어 아자시티딘을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 히스톤 데아세틸라제의 저해제, 예를 들어 보리노스타트를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 히스톤 메틸화의 저해제를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 리툭시맵 (RtX)이다.
텔루 륨계 화합물
텔루륨은 인체에서 발견되는 미량 원소이다. 다양한 텔루륨 화합물들이 면역-조절 특성을 가지고 있으며, 다양한 전임상 및 임상 연구들에서 유익한 효과를 가진 것으로 입증된 바 있다. 특히 효과적인 텔루륨-함유 화합물 패밀리는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,752,614; 4,761,490; 4,764,461 및 4,929,739에 기술되어 있다. 이러한 유형의 텔루륨-함유 화합물의 면역조절 특성은, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,962,207, 5,093,135, 5,102,908 및 5,213,899에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 본원에 전체 기술된 바와 같이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
유망한 한가지 화합물은 암모늄 트리클로로(다이옥시에틸렌-O,O')텔루레이트이며, 이는 본원 및 당해 기술 분야에서 AS101로 지칭된다. 전술한 텔루륨-함유 화합물 패밀리의 대표적인 예로서 AS101은 항바이러스 활성 (Nat. Immun. Cell Growth Regul. 7(3):163-8, 1988; AIDS Res Hum Retroviruses. 8(5):613-23, 1992) 및 종양파괴 활성 (Nature 330(6144):173-6, 1987; J. Clin. Oncol. 13(9):2342-53, 1995; J. Immunol. 161(7):3536-42, 1998)을 가진다. 나아가, AS101은 저 독성을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 텔루륨-함유 면역조절제 화합물을 포함하는 조성물이 본원에 개시된 방법에 사용가능할 수 있으며, 이때 텔루륨계 화합물은 선천성 및 후천성 면역 반응을 자극한다. 예를 들어, AS101은 마우스 (J. Natl. Cancer Inst. 88(18):1276-84, 1996) 및 인간 (Nat. Immun. Cell Growth Regul. 9(3):182-90, 1990; Immunology 70(4):473-7, 1990; J. Natl. Cancer Inst. 88(18):1276-84, 1996)에서 강력한 인터페론 (IFN) 활성인자인 것으로 입증된 바 있다.
다른 구현예에서, 텔루륨계 화합물은 IL-1α, IL-6 및 TNF-α와 같은 다양한 사이토카인의 방출을 유도한다.
다른 구현예에서, 텔루륨계 화합물은 면역조절성을 가지는 것으로 당해 기술 분야에 공지된 텔루륨계 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 텔루륨계 화합물은 암모늄 트리클로로(다이옥시에틸렌-O,O')텔루레이트를 포함한다.
일 구현예에서, 텔루륨계 화합물은 하나 이상의 사이토카인의 분비를 저해한다. 다른 구현예에서, 텔루륨계 화합물은 하나 이상의 사이토카인의 분비를 감소시킨다. 다른 구현예에서, 텔루륨계 화합물은 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍을 저해하거나 또는 감소시킨다.
일 구현예에서, 본 발명은, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 및 텔루륨계 화합물을 포함하는, 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 및 텔루륨계 화합물은 별개의 조성물로 존재한다. 다른 구현예에서, AAT는 전장 AAT 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, AA는 전장 AAT의 유사체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 텔루륨계 화합물을 포함하는 조성물 및 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 완화 또는 개선하는 방법을 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 텔루륨계 화합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 발병을 저해하거나 또는 감소시키는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 치료하는 방법은 텔루륨계 화합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 예방하는 방법은, 텔루륨계 화합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 개선하는 방법은, 텔루륨계 화합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 요법을 받고 있는 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 완화하는 방법은, 텔루륨계 화합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 텔루륨계 화합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약한 개체에서 사이토카인 생산을 감소시키거나 또는 저해하는 방법을 개시한다.
일 구현예에서, 텔루륨계 화합물은 사이토카인 방출을 제어하기 위해 단독으로 투여된다. 다른 구현예에서, 텔루륨계 화합물, 및 세포자살성 세포 또는 이의 조성물 또는 세포자살성 세포의 상층액 또는 이의 조성물 둘다 사이토카인 방출을 제어하기 위해 투여된다.
수지상 세포
일 구현예에서, 수지상 세포 (DC)는, 항원 물질을 가공하여 세포 표면 상에서 면역 시스템의 T-세포에 이를 제시하고, 그에 따라 새로운 항원 및 리콜 (recall) 항원 둘다에 대해 T-세포를 감작화할 수 있는, 포유류 면역 시스템의 항원-생성 및 제시 세포이다. 다른 구현예에서, DC는 선천성 면역 시스템 및 후천성 면역 시스템 간의 메신저로서 작용하는 가장 강력한 항원-생성 세포이다. DC 세포는, 일 구현예에서, 종양을 공격하여 용해시키는 작동자 세포 구축을 통해 특이적인 항종양 면역을 촉발하기 위해, 사용될 수 있다.
수지상 세포는 피부와 같은 외부 환경 및 코, 폐, 위 및 장의 이너 라이닝과 접촉되는 조직 (랑게르한스 세포로 지칭되는 특수 수지상 세포 타입이 존재함)에 존재한다. 또한, 혈중 미성숙 상태로 발견될 수 있다. 수지상 세포는 활성화되면, 림프절로 이동하여 T-세포 및 B 세포와 상호작용하여 후천성 면역 반응을 개시 및 구축하게 된다. 수지상 세포는, 특정 발생 단계에서, 분지 돌출기 (branched projection), 즉 세포의 이름이 되는 수지돌기를 생장시킨다. 수지상 세포는 특정 종양 항원을 발현하도록 조작될 수 있다.
T-세포 활성화에 필요한 신호 3가지는, (i) 자기 MHC 분자에 동족 항원의 제시; (ii) 막-결합형 수용체-리간드 쌍에 의한 공동-자극; 및 (iii) 후속적인 면역 반응의 분극화 (polarization)를 지시하는 가용성 인자이다. 수지상 세포 (DC)는 T-세포 활성화에 필요한 신호 3가지를 모두 제공할 수 있어, 우수한 암 백신 플랫폼이 된다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은, 수지상 세포 및 부가적인 물질을 포함하며, 부가적인 물질이 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 텔루륨계 화합물 또는 면역조절제 또는 이들의 임의 조합물을 포함하는, 조성물을 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 부가적인 물질을 포함하는 조성물과 수지상 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 부가적인 물질이 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 텔루륨계 화합물 또는 면역조절제 또는 이들의 임의 조합물을 포함하는, 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병을 저하, 완화 또는 개선하는 방법을 개시한다.
유전자 변형
일부 구현예에서, T-세포, 수지상 세포, 및/또는 세포자살성 세포의 유전자 변형은 RNA, DNA, 재조합 바이러스 또는 이들의 조합을 이용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 감마 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로부터 유래되는 벡터가 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용된다. 다른 구현예에서, 이들 벡터는 숙주 게놈에 병합되어 전이유전자 (transgene)를 잠재적인 영구적으로 발현하며, 본질적인 (intrinsic) 면역원성이 낮다. 다른 구현예에서, 숙주 게놈에 병합되거나 및/또는 본질적인 면역원성이 낮은 다른 벡터가, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 비-바이러스성 벡터-매개의 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템 (non-viral-vector-mediated sleeping beauty transposon system)을 사용해, CAR 및 다른 유전자를 T-세포에 삽입한다. 다른 구현예에서, "자살 유전자"는, 프로-세포자살 유전자의 발현이 전신으로 전달된 약물에 반응성인, 유도가능한 프로모터의 조절 하에 배치되게, T-세포에 병합된다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 일시적일 수 있다. 다른 구현예에서, 유전자 변형은 메신저 RNA (mRNA)를 이용할 수 있다. 다른 구현예에서, 많은 수의 세포를 일시적으로 조작된 T-세포, 예를 들어 mRNA-형질감염된 T-세포 형태로 여러번 주입할 수 있다. 다른 구현예에서, 시험관내-전사된 mRNA를 이용한 림프구의 RNA-기반의 전기천공법 (electroporation)은 약 1주일간 단백질의 일시적 발현을 매개하고, 바이러스 벡터의 병합 위험성을 제거한다. 다른 구현예에서, mRNA-형질전이된 수지상 세포 또는 mRNA-전기천공된 T 및 NK 림프구가 사용된다.
유전자 변형된 T-세포는 부작용 없이 10년 넘게 입양 전이 후 존속할 수 있다는 것이 입증되어 있는 바, 이는 유전자 변형된 인간 T-세포가 기본적으로 안전하다는 것을 의미한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 유전자 변형은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법일 수 있다.
세포자살성 세포
본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 세포자살성 세포 (ApoCell)의 제조는 WO 2014/087408에 기술되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되며, 간략하게 아래 실시예 1에서 기술된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 세포자살성 세포는 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법으로 제조된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 세포자살성 세포는 요법을 시술 중인 개체의 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 세포자살성 세포는 요법을 시술 중인 개체의 동종이계 세포이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 본원에 기술된 또는 당해 기술 분야에 공지된 세포자살성 세포이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "자가"가 공여자 및 수용자가 동일한 사람에서의 조직, 세포, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 포괄할 수 있음을 알 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "동종이계"가 동일 종의 다른 개체로부터 유래되는 조직, 세포, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 포괄할 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 동종이계 공여자 세포는 수용자와 유전자 측면에서 구분된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 제조 방법에 따른 단핵구-농화된 세포 조성물의 수득은 백혈구성분채집술 (leukapheresis) 공정에 의해 구현된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "백혈구성분채집술"이 공여 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 성분채집술 (apheresis) 공정을 포함할 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 공여자의 혈액에 대해 백혈구성분채집술을 진행하고, 따라서 단핵구-농화된 세포 조성물을 본원에 개시된 제조 방법에 따라 수득한다. 백혈구성분채집술 과정 중에 하나 이상의 항-응집제가, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 채집한 세포의 응집을 방지하기 위해 사용되어야 함에, 유념한다.
일부 구현예에서, 백혈구성분채집술 공정은 본원에 개시된 제조 방법에 따라 단핵구-농화된 세포 조성물을 수집할 수 있도록 구성된다. 일부 구현예에서, 백혈구성분채집술에 의해 수득된 세포 수집물은 본원에 개시된 단핵구 세포를 적어도 65%로 포함한다. 다른 구현예들에서, 본원에 개시된 단핵구 세포를 적어도 70% 또는 적어도 80%로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제조 방법에서, 세포-공여자의 혈액 혈장을 단핵구-농화된 세포 조성물의 수득과 병행하여 수집한다. 일부 구현예에서, 세포-공여자로부터 혈액 혈장 약 300-600 ml을 본원에 개시된 제조 방법에 따른 단핵구-농화된 세포 조성물의 수득과 병행하여 수집한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제조 방법에 따른 단핵구-농화된 세포 조성물의 수득과 병행하여 수집된 혈액 혈장은 동결 매질 및/또는 인큐베이션 매질의 일부로서 사용한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 세포자살성 세포의 농화된 집단을 수득하는 방법에 대한 추가적인 상세 내용은 WO 2014/087408에서 찾아볼 수 있으며, 이는 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 초기 세포자살성 세포는 단핵구 세포를 적어도 85%로 포함한다. 추가적인 구현예들에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 초기 세포자살성 세포는 단핵구 세포를 적어도 85%로, 90%로 또는 90% 보다 높은 수준으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 초기 세포자살성 세포는 단핵구 세포를 적어도 90%로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 초기 세포자살성 세포는 단핵구 세포를 적어도 95%로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 수집시 단핵구-농화된 세포 조제물이 단핵구 세포를 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%로 포함하지만, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 초기 세포자살성 세포의 제조 방법 후 최종 약학적 집단이 단핵구 세포를 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%로 포함함에, 유념한다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 초기 세포자살성 세포의 조성물 제조에 사용되는 단핵구-농화된 세포 집단은 세포 수집시 단핵구 세포를 적어도 50%로 포함한다. 특정 구현예에서, 본원은 공여자의 말초혈로부터 단핵구-농화된 세포 조제물을 수득하는 단계를 포함하며, 단핵구-농화된 세포 조제물이 단핵구 세포를 적어도 50%로 포함하는, 약학적 집단의 제조 방법을 개시한다. 특정 구현예에서, 본원은 단핵구 세포를 적어도 50%로 포함하는 단핵구-농화된 세포 조제물을 동결시키는 것을 포함하는 약학적 집단의 제조 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 세포 조제물은 단핵구 세포를 적어도 85%로 포함하며, 제조물 내 세포들 중 적어도 40%가 초기 세포자살성 상태이고, 조제물 내 세포들 중 적어도 85%가 생존 세포이다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 조제물은 CD15high 발현성 세포를 15% 이하로 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "초기-세포자살성 상태"가 세포자살의 초기 신호를 나타내나 세포자살의 후기 신호는 없는 세포를 포괄할 수 있음을 알 것이다. 세포에서 세포자살의 초기 신호의 예로는 포스파티딜세린 (PS) 노출 및 미토콘드리아 막 전위 상실 (mitochondrial membrane potential) 등이 있다. 후기 현상의 예로는 세포내 프로피듐 아이오다이드 (PI) 유입 (admission) 및 최종 DNA 절단 등이 있다. 세포가 "초기 세포자살성" 상태인지를 입증하기 위해, 일부 구현예에서, 아넥신 V 및 PI 염색에 의한 PS 노출 검출을 사용하며, 아넥신 V로는 염색되지만 PI로 염색되지 않는 세포는 "초기 세포자살성 세포"로 간주된다. 다른 구현예에서, 아넥신 V FITC 및 PI 둘다로 염색되는 세포는 "후기 세포자살성 세포"로 간주된다. 다른 구현예에서, 아넥신 V 또는 PI 어느 것에도 염색되지 않는 세포는 비-세포자살성 생존 세포로 간주된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 일부 구현예에서, 용어 "초기 세포자살성 세포", "세포자살성 세포", 및 "ApoCell" 및 이의 문법상 변형어들은 상호 호환적으로 사용되며, 모두 동일한 특성과 의미임을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 기술된 조성물 및 방법이, 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 포함함을 알 것이다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 초기 세포자살성 상태의 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 초기 세포자살성 상태의 세포가 90% 이상인 세포들을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 초기 세포자살성 상태의 세포가 80% 이상인 세포들을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 초기 세포자살성 상태의 세포가 70% 이상인 세포들을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 초기 세포자살성 상태의 세포가 60% 이상인 세포들을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 초기 세포자살성 상태의 세포가 50% 이상인 세포들을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항-응집제를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 안정적이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 일부 구현예에서, 안정성이, 시간 경과에 따른 초기 세포자살성 세포의 유지, 예를 들어 약 2-8℃에서 보관시 초기 세포자살성 세포의 특징 유지를 포함함을 알 것이다. 일부 구현예에서, 안정성은 동결 온도에서, 예를 들어 0℃ 이하의 온도에서 보관시 초기 세포자살성 세포 특징을 유지하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 개시된 방법에 사용하기 위한 초기 세포자살성 세포의 제조 방법에 따라 수득된 단핵구-농화된 세포 집단은 동결 매질 중에서의 냉동된다. 일부 구현예에서, 동결은 점진적이다. 일부 구현예에서, 세포 수집 후 세포는 동결시까지 실온에서 유지된다. 일부 구현예에서, 세포 조제물은 세포-수집 후 동결 전 세척 매질에서 1회 이상의 세척 단계를 거친다.
본원에서, 용어 "세포 수득" 및 "세포 수집"은 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 조제물의 세포는 수집 후 3-6시간 이내에 동결된다. 일부 구현예에서, 세포 조제물은 세포 수집 후 최대 6시간 이내에 동결된다. 일부 구현예에서, 세포 조제물의 세포는 수집 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8시간 이내에 동결된다. 다른 구현예들에서, 세포 조제물의 세포는 수집 후 최대 8, 12, 24, 48, 72시간 안에 동결된다. 다른 구현예들에서, 세포 수집 후 동결시까지 2-8℃에서 유지된다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조에 따른 동결은, 세포 조제물의 약 -18℃ 내지 -25℃에서의 동결 후 약 -80℃에서 세포 조제물의 동결, 그리고 마지막으로 해동시까지 액체 질소에서 세포 조제물의 동결을 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조에 따른 동결은 세포 조제물의 약 -18℃ 내지 -25℃에서 2시간 이상 동결, 세포 조제물의 약 -80℃에서 2시간 이상 동결, 그리고 마지막으로 세포 조제물의 해동시까지 액체 질소에서의 동결을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 해동 전까지 적어도 8, 10 또는 12시간 동안 액체 질소내에 유지된다. 일부 구현예에서, 세포 조제물의 세포는 해동 및 세포자살-유도성 인큐베이션 매질을 이용한 인큐베이션 전까지 액체 질소내에 유지된다. 일부 구현예에서, 세포 조제물의 세포는 조혈 줄기 세포 이식일까지 액체 질소내에 유지된다. 비-제한적인 예에서, 세포 수집 및 동결에서부터 최종 집단의 제조시까지의 시간은 1-50일, 다른 예로 6-30일일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 조제물은 적어도 수개월과 같이 장기간 액체 질소내에 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조에 따른 동결은 세포 조제물의 약 -18℃ 내지 -25℃에서 적어도 0.5, 1, 2, 4시간 동안의 동결을 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조에 따른 동결은 세포 조제물의 약 -18℃ 내지 -25℃에서 약 2시간의 동결을 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조에 따른 동결은 세포 조제물을 약 -80℃에서 적어도 0.5, 1, 2, 4, 12시간 동안 동결하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20개월 동안 동결 상태로 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5년간 동결 상태로 유지될 수 있다. 특정 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 적어도 20개월 동안 동결 상태로 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 적어도 8, 10, 12, 18, 24시간 동안 동결된다. 특정 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 적어도 8시간 동안 동결된다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 적어도 약 10시간 동안 동결된다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 적어도 약 12시간 동안 동결된다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 약 12시간 동안 동결된다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물 (약 -18℃ 내지 -25℃에서, 약 -80℃ 및 액체 질소내에서)의 총 동결 기간은 적어도 8, 10, 12, 18, 24시간이다.
일부 구현예에서, 동결이 적어도 부분적으로 단핵구-농화된 세포 조성물의 세포에서 초기 세포자살성 상태를 유도한다. 일부 구현예에서, 동결 매질은 L-글루타민, Hepes, Hes, 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 및 혈장을 포함하는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 배지내 혈장은 집단의 단핵구-농화된 세포로 지칭되는 공여자의 자가 혈장이다. 일부 구현예에서, 동결 매질은 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes, 5% Hes, 10% 다이메틸 설폭사이드 및 20% v/v 혈장을 포함하는 RPMI 1640 배지를 포함한다.
일부 구현예에서, 동결 매질은 항-응집제를 포함한다. 특정 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단 제조시 사용되는 매질들 중 적어도 일부, 예를 들어, 동결 배지, 인큐베이션 매질 및 세척 매질은 항-응집제를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-응집제를 포함하는 초기 세포자살성 세포 집단의 제조시 사용되는 모든 매질은 항-응집제를 동일한 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 항-응집제는 세포 집단의 최종 현탁 매질에 첨가되지 않는다.
일부 구현예에서, 동결 배지에 적어도 항-응집제의 첨가가 세포 조제물의 수율을 개선한다. 다른 구현예들에서, 동결 배지에 항-응집제의 첨가는 트리글리세라이드 고 농도 (high triglyceride level)의 존재 하 세포 조제물의 수율을 개선한다. 본원에서, 세포 조제물의 수율 개선은 동결된 세포의 생존 세포 비율, 생존 세포의 초기 세포자살성 상태인 세포의 비율 및 이들의 조합 중 하나 이상의 개선과 관련있다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 적어도 24시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 24시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 24시간 보다 장기간 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 적어도 36시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 48시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 적어도 36시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 36시간 보다 장기간 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 적어도 48시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 48시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 적어도 48시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 48시간 보다 장기간 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 적어도 72시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 72시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 초기 세포자살성 세포는 72시간 보다 장기간 안정적이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "안정적인"이 PS-양성 (포스파티딜세린-양성) 상태이자 매우 적은 %가 PI-양성 (프로피듐 아이오다이드-양성)인 세포자살성 세포를 포함함을 알 것이다. PI-양성 세포는 막 안정성의 지표를 제공하는데, PI-양성 세포는 세포내 유입을 허용하는 것으로, 이는 막 안정성이 좋지 않다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 안정적인 초기 세포자살성 세포는 초기 세포자살 상태를 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간 또는 적어도 72시간 동안 유지한다. 다른 구현예에서, 안정적인 초기 세포자살성 세포는 초기 세포자살 상태를 24시간, 36시간, 48시간 또는 72시간 동안 유지한다. 다른 구현예에서, 안정적인 초기 세포자살성 세포는 초기 세포자살 상태를 24시간 보다 장기간, 36시간 보다 장기간, 48시간 보다 장기간 또는 72시간 보다 장기간 유지한다. 다른 구현예에서, 안정적인 초기 세포자살성 세포는 연장된 기간 동안 그 상태를 유지한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포 집단에는 세포 응집체 (cell aggregate)가 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 집단에는 큰 세포 응집체가 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 집단은, 공여자로부터 세포 수집 (백혈구성분채집술) 이외의 단계에서 항-응집제 비-첨가 세포자살성 세포 집단과 비교해, 세포 응집체 수가 적다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 집단 또는 이의 조성물은 항-응집제를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포에는 세포 응집체가 없으며, 이러한 세포자살성 세포는 혈중 트리글리세라이드 수준이 높은 개체로부터 수득된 것이다. 일부 구현예에서, 개체의 혈중 트리글리세라이드 수준은 150 mg/dL 보다 높다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 집단에는 세포 응집체가 없으며, 이러한 세포자살성 세포 집단은 혈중 트리글리세라이드 수준이 정상인 개체로부터 수득된 세포로부터 제조된 것이다. 일부 구현예에서, 개체의 혈중 트리글리세라이드 수준은 150 mg/dL 이하이다. 일부 구현예에서, 세포 응집체는 세포자살성 세포 제조 방법시 세포 감소를 유발하지 않는다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "응집체" 또는 "세포 응집체"가 저 전단력 (low shear forces) 하 또는 정체 (stasis)시 혈액 세포의 가역적인 클럼핑 (clumping)을 포괄할 수 있음을 알 것이다. 세포 응집체가 세포자살성 세포 제조의 인큐베이션 단계 중에 시각적으로 관찰될 수 있다. 세포 응집은 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해, 예를 들어 광 현미경으로 샘플을 가시적으로 촬영함으로써 또는 유세포 측정을 이용해 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 항-응집제는 헤파린, ACD (acid citrate dextrose) 포뮬러 A 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항-응집제는 헤파린, ACD 포뮬러 A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
초기 세포자살성 세포 집단 및 이의 조성물의 제조 방법에 대한 일부 구현예에서, 집단의 제조시 사용되는 하나 이상의 매질에 항-응집제가 첨가된다. 일부 구현예에서, 집단 제조시 사용되는 하나 이상의 매질은 동결 매질, 세척 매질, 세포자살 유도 인큐베이션 매질 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항-응집제는 헤파린, ACD 포뮬러 A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 당해 기술 분야에 공지된 다른 항-응집제, 비-제한적인 예로, Fondaparinaux, Bivalirudin 및 Argatroban이 사용될 수 있음에 유념하여야 한다.
일부 구현예에서, 집단의 제조시 사용되는 하나 이상의 매질은 10 U/ml 헤파린을 포함하는 5% ACD 포뮬러 A 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-응집제는 세포 집단의 최종 현탁 매질에 첨가되지 않는다. 본원에서, 용어 "최종 현탁 매질" 및 "투여 매질"은 상호 호환적으로 사용되며, 동일한 특성 및 의미를 가진다.
일부 구현예에서, 집단 제조시 사용되는 하나 이상의 매질은 헤파린을 0.1-2.5 U/ml 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 집단 제조시 사용되는 하나 이상의 매질은 ACD 포뮬러 A를 1% 내지 15% v/v 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 매질은 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 매질과 인큐베이션 매질 둘다 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-응집제는 헤파린, ACD 포뮬러 A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 동결 매질 내 헤파린은 0.1-2.5 U/ml 농도이다. 일부 구현예에서, 동결 매질 내 ACD 포뮬러 A는 1%-15% v/v 농도이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 헤파린은 0.1-2.5 U/ml 농도이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 ACD 포뮬러 A는 1%-15% v/v 농도이다. 일부 구현예에서, 항-응집제는 산성-사이트레이트-덱스트로스 (ACD) 포뮬러 A의 용액이다. 일부 구현예에서, 집단 제조시 사용되는 하나 이상의 매질에 첨가되는 항-응집제는 헤파린을 10 U/ml 농도로 함유하는 ACD 포뮬러 A이다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조에 사용되는 세포자살 유도성 인큐베이션 매질은 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조에 사용되는 동결 매질 및 세포자살 유도성 인큐베이션 매질 둘다 항-응집제를 포함한다. 임의 이론 또는 기전으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 여러가지 세포 조성물에서 안정적이고 높은 세포 수율을 유지하기 위해, 세포 수집 프로토콜과 무관하게, 일부 구현예에서, 항-응집제 첨가는, 세포자살성 세포 집단의 제조시 동결 매질 및 세포자살 유도성 인큐베이션 매질 둘다에 항-응집제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 높고 안정적인 세포 수율은, 세포자살 유도를 위해 사용되는 초기 세포 집단을 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 전형적으로 적어도 50%의 세포 수율로 포함한다.
일부 구현예에서, 동결 매질 및 인큐베이션 매질 둘다 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 및 동결 매질 둘다에 항-응집제 첨가시, 비-제한적인 예로, 세포 수집시 첨가되는 항-응집제의 타입 및/또는 시기 등의, 세포 수집 조건과 무관하게, 여러 집단 조제물들에서 높고 안정적인 세포 수율이 달성된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 및 동결 매질 둘다에 항-응집제 첨가시, 백혈구성분채집술시 첨가되는 항-응집제의 타입 및/또는 시기와 무관하게, 세포 조제물의 높고 안정적인 수율이 달성된다. 일부 구현예에서, 고 농도의 트리글리세라이드 존재하에 세포 조제물 제조시, 여러가지 제조물들에서 낮거나 및/또는 불안정적인 세포 수율이 달성된다. 일부 구현예에서, 트리글리세라이드 수치가 높은 공여자의 혈액으로부터 세포 조제물을 제조하면, 세포 조제물의 낮거나 및/또는 불안정한 세포 수율이 달성된다. 일부 구현예에서, 용어 "고 트리글리세라이드 수준"은 트리글리세라이드 수준이 동일 성별 및 연령의 건강한 개체의 정상 수준보다 높은 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 용어 "고 트리글리세라이드 수준"은 트리글리세라이드 수준이 약 1.7 milimole/L 보다 높은 것을 의미한다. 본원에서, 높고 안정적인 수율은 개체 투여시 치료학적 효과를 나타낼 투여량을 준비할 수 있을 만큼 충분히 높은, 집단의 세포 수율을 의미한다. 일부 구현예에서, 치료학적 효과는 면역 질환, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 개체에서 치료, 예방 또는 개선하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, 높고 안정적인 세포 수율은 처음 동결된 세포 집단에서 30% 이상, 가능하게는 40% 이상, 전형적으로 50% 이상의 세포 수율이다.
일부 구현예에서, 세포 조제물을 트리글리세라이드 수준이 높은 공여자로부터 수득하는 경우, 공여자는 기증 (donation)하기 전 트리글리세라이드-강하제 복용, 비-제한적인 예로, 스타틴 및/또는 베자피브레이트 (bezafibrate) 복용, 기증하기 전 적어도 8, 10 및 12시간 동안 금식, 기증 전 적어도 24, 48, 72시간 동안 혈중 트리글리세라이드 수치를 줄이기 위한 적절한 식이 섭취 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 조치 (measure)를 취할 것이다.
일부 구현예에서, 집단의 세포 수율은 세포자살 유도를 겪은 세포의 초기 세포수 이외의 조성물내 세포수와 관련있다. 본원에서, 용어 "초기 세포자살 상태 유도" 및 "세포자살 유도"는 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 동결 및 해동 후 인큐베이션 매질 내에서 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 해동 및 인큐베이션 사이에 하나 이상의 세척 단계가 존재한다. 본원에서, 용어 "인큐베이션 매질" 및 "세포자살 유도성 인큐베이션 매질"은 상호 호환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 L-글루타민, Hepes, 메틸프레드니솔론 및 혈장이 첨가된 RPMI 1640 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 매질은 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes 및 10% v/v 혈장을 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질에서 혈장은 세포 조제물의 세포가 기원한 동일 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 혈장은 인큐베이션 당일에 인큐베이션 매질에 첨가된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 37℃ 및 5% CO2에서 수행된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 메틸프레드니솔론은 단핵구-농화된 세포 조성물내 세포가 초기 세포자살성 상태에 진입하도록 추가적으로 유도한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물내 세포는 메틸프레드니솔론의 존재하 동결 및 인큐베이션에 의해 초기 세포자살성 상태에 진입하도록 유도된다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조는 유리하게는 세포괴사 유도없이 실질적으로 초기 세포자살 상태로의 유도를 허용하며, 세포는 제조 후 약 24시간 동안 이러한 초기-세포자살 상태에서 안정적으로 유지된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 메틸프레드니솔론을 약 10-100 ㎍/ml 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 메틸프레드니솔론을 농도 약 40-60 ㎍/ml로, 다른 예로 약 45-55 ㎍/ml로 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 메틸프레드니솔론을 농도 50 ㎍/ml로 포함한다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 약 2-12시간, 가능하게는 4-8시간, 전형적으로 약 5-7시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 약 6시간 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 적어도 6시간 동안 이루어진다. 바람직한 구현예에서, 인큐베이션은 6시간 동안 이루어진다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질에 항-응집제의 첨가는 세포 조제물의 수율을 개선한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 항-응집제는 동결 매질에서와 동일한 농도이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 헤파린, ACD 포뮬러 A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질에 사용되는 항-응집제는 헤파린을 10 U/ml 농도로 함유하는 ACD 포뮬러 A이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 헤파린을 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 헤파린은 농도 0.1-2.5 U/ml이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 헤파린은 농도 0.1-2.5 U/ml, 가능하게는 0.3-0.7 U/ml, 전형적으로 약 0.5 U/ml이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 헤파린은 농도 약 0.5 U/ml이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 매질은 ACD 포뮬러 A를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 1%-15% v/v이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 1%-15% v/v, 가능하게는 4%-7% v/v, 전형적으로 약 5% v/v이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 약 5% v/v이다.
일부 구현예에서, 세포 조제물의 수율 개선은 조제물을 제조하는 동결된 세포수 대비 조제물의 초기 세포자살성 생존 세포의 수적 개선을 포함한다.
일부 구현예에서, 동결 매질에 항-응집제의 첨가는 여러가지 약학적 집단 제조물들 간의 높고 안정적인 수율에 기여한다. 바람직한 구현예에서, 적어도 동결 매질 및 인큐베이션 매질에 항-응집제 첨가시, 사용되는 세포 수집 프로토콜과 무관하게 약학적 조성물의 여러 조제물들에서 높고 안정적인 수율이 달성된다.
일부 구현예에서, 동결 매질은 헤파린, ACD 포뮬러 A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 매질에 사용되는 항-응집제는 헤파린을 10 U/ml 농도로 함유한 ACD 포뮬러 A이다. 일부 구현예에서, 동결 매질은 헤파린을 10 U/ml 농도로 함유한 5% v/v ACD 포뮬러 A 용액을 포함한다.
일부 구현예에서, 동결 매질은 헤파린을 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 매질 내 헤파린은 농도 0.1-2.5 U/ml이다. 일부 구현예에서, 동결 매질 내 헤파린은 농도 0.1-2.5 U/ml, 가능하게는 0.3-0.7 U/ml, 전형적으로 약 0.5 U/ml이다. 특정 구현예에서, 동결 매질 내 헤파린은 농도 약 0.5 U/ml이다.
일부 구현예에서, 동결 매질은 ACD 포뮬러 A를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 1%-15% v/v이다. 일부 구현예에서, 동결 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 1%-15% v/v, 가능하게는 4%-7% v/v, 전형적으로 약 5% v/v이다. 일부 구현예에서, 동결 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 약 5% v/v이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 및/또는 동결 매질에 항-응집제 첨가시, 공여자의 혈중 트리글리세라이드 수치와 무관하게 집단에서 높고 안정적인 세포 수율이 달성된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 매질 및/또는 동결 매질에 항-응집제 첨가시, 트리글리세라이드 수치가 정상이거나 높은 공여자의 혈액으로부터 수득하였을 경우 본 발명의 조성물 내 높고 안정적인 세포 수율이 달성된다. 일부 구현예에서, 적어도 인큐베이션 매질에 항-응집제 첨가시, 공여자의 혈중 트리글리세라이드 수준과 무관하게 조성물에서 높고 안정적인 세포 수율이 달성된다. 일부 구현예에서, 동결 매질 및 인큐베이션 매질에 항-응집제 첨가시, 공여자의 혈중 트리글리세라이드 수준과 무관하게 조성물에서 높고 안정적인 세포 수율이 달성된다.
일부 구현예에서, 동결 매질 및/또는 인큐베이션 매질 및/또는 세척 매질은 헤파린을 적어도 0.1 U/ml, 가능하게는 적어도 0.3 U/ml, 전형적으로 적어도 0.5 U/ml 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 매질 및/또는 인큐베이션 매질 및/또는 세척 매질은 ACD 포뮬러 A를 적어도 1% v/v, 가능하게는 적어도 3% v/v, 전형적으로 적어도 5% v/v 농도로 포함한다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은, 세포 수집 후, 그리고 동결 매질에 재현탁 및 동결 전, 하나 이상의 세척 단계를 거친다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 동결 및 해동 후 하나 이상의 세척 단계를 거친다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 단핵구-농화된 세포 조성물의 원심분리와, 후속적인 상층액 추출 및 세척 매질내 재현탁을 포함한다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 초기 세포자살성 세포 집단의 각 제조 단계들 사이에 하나 이상의 세척 단계를 거친다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조시 모든 세척 단계 동안에 항-응집제가 세척 매질에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 인큐베이션 후 하나 이상의 세척 단계를 거친다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 인큐베이션 후 PBS를 이용한 하나 이상의 세척 단계를 거친다. 일부 구현예에서, 투여 매질에 세포 조제물을 재현탁하기 전 최종 세척 단계에서는 항-응집제가 첨가되지 않는다. 일부 구현예에서, 투여 매질에 세포 조제물을 재현탁하기 전 최종 세척 단계에 사용되는 PBS에는 항-응집제가 첨가되지 않는다. 특정 구현예에서, 항-응집제는 투여 매질에 첨가되지 않는다.
일부 구현예에서, 인큐베이션시 세포 농도는 약 5x106 세포/ml이다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 동결, 해동 및 인큐베이션 후 투여 매질에 현탁되며, 따라서 약학적 집단이 구축된다. 일부 구현예에서, 투여 매질은 적절한 생리학적 완충제를 포함한다. 적합한 생리학적 완충제에 대한 비-제한적인 예는 식염수 (saline solution), PBS (Phoshpate Buffered Saline), HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) 등이다. 일부 구현예에서, 투여 매질은 PBS를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 매질은 세포 생존성을 유지하는데 유용한 보충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 투여 전 여과 처리된다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 투여 전 적어도 200 ㎛의 필터를 이용해 여과 처리된다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 집단은, 투여 매질에, 제조되는 세포 조제물의 최종 부피 100-1000 ml, 가능하게는 200-800 ml, 전형적으로 300-600 ml이 달성되도록, 재현탁된다.
일부 구현예에서, 세포 수집은 단핵구-농화된 세포 조성물을 수득하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단의 제조시 수행되는 세척 단계는 세척 매질 내에서 수행된다. 특정 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단 제조에서부터 인큐베이션 단계까지 수행되는 세척 단계는 세척 매질 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 매질은 L-글루타민 및 Hepes 첨가된 RPMI 1640 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 매질은 2 mM L-글루타민 및 10 mM Hepes가 첨가된 RPMI 1640 배지를 포함한다.
일부 구현예에서, 세척 매질은 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 매질은 헤파린, ACD 포뮬러 A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-응집제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 매질 내 항-응집제의 농도는 동결 매질에서와 동일한 농도이다. 일부 구현예에서, 세척 매질 내 항-응집제의 농도는 인큐베이션 매질에서와 동일한 농도이다. 일부 구현예에서, 세척 매질에 사용되는 항-응집제는 헤파린을 농도 10 U/ml로 함유하는 ACD 포뮬러 A이다.
일부 구현예에서, 세척 매질은 헤파린을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 매질 내 헤파린은 농도 0.1-2.5 U/ml이다. 일부 구현예에서, 세척 매질 내 헤파린은 농도 0.1-2.5 U/ml, 가능하게는 0.3-0.7 U/ml, 전형적으로 약 0.5 U/ml이다. 특정 구현예에서, 세척 매질 내 헤파린은 농도 약 0.5 U/ml이다.
일부 구현예에서, 세척 매질은 ACD 포뮬러 A를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 1%-15% v/v이다. 일부 구현예에서, 세척 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 1%-15% v/v, 가능하게는 4%-7% v/v, 전형적으로 약 5% v/v이다. 일부 구현예에서, 세척 매질 내 ACD 포뮬러 A는 농도 약 5% v/v이다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 개체에 집단을 계획 투여하기 수시간 전에 해동한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 약 33℃-39℃에서 해동한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 약 30-240초, 바람직하게는 40-180초, 가장 바람직하게는 50-120초 동안 해동한다.
일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 집단을 계획 투여하기 적어도 10시간 전에, 다른 예로 집단의 계획 투여하기 적어도 20, 30, 40 또는 50시간 전에 해동한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 집단의 계획 투여하기 적어도 15-24시간 전에 해동한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 집단의 계획 투여하기 적어도 약 24시간 전에 해동한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 집단의 계획 투여하기 적어도 20시간 전에 해동한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 집단의 계획 투여하기 30시간 전에 해동한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성은 집단의 계획 투여하기 적어도 24시간 전에 해동한다. 일부 구현예에서, 단핵구-농화된 세포 조성물은 해동 전 및/또는 해동 후 세척 매질에서 1회 이상의 세척 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 조성물은 메틸프레드니솔론을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 메틸프레드니솔론의 농도는 30 ㎍/ml을 초과하지 않는다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 고 용량 (high dose)으로 사용된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 고 농도로 사용된다. 일부 구현예에서, 인간 세포자살성 다형핵 호중구 (PMN)가 사용된다. 일부 구현예에서, 50%가 세포자살성 세포인 세포 군이 사용된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 May-Giemsa 염색된 cytopreps에 의해 검증한다. 일부 구현예에서, 세포 생존성은 트리판 블루 배제 (trypan blue exclusion)에 의해 분석한다. 일부 구현예에서, 세포의 세포자살성 및 세포괴사 상태는 아넥신 V/프로피듐 아이오다이드 염색에 의해 검증하며, FACS에 의해 검출한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포자살성 세포는 괴사성 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포자살성 세포는 괴사성 세포를 1% 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포자살성 세포는 괴사성 세포를 2% 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포자살성 세포는 괴사성 세포를 3% 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포자살성 세포는 괴사성 세포를 4% 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포자살성 세포는 괴사성 세포를 5% 미만으로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 140 x 106 - 210 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 10-100 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 20 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 30 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 40 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 50 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포가 60 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 60 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 70 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 80 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 90 x 106으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 1-15 x 107으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 10 x 107으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 약 15 x 107으로 투여된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 106으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 107으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 108으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 109으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 1010으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 1011으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 1012으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 105으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 104으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 103으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 10 x 102으로 투여된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 고 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 35 x 106으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 210 x 106으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 70 x 106으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 140 x 106으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 용량 35-210 x 106으로 투여된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 1회 (single dose) 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 다회 (multiple doses) 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 3회 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 4회 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 5회 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 6회 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 7회 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 8회 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 9회 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 9회 보다 많은 횟수로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 다회 투여된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 비-제한적인 예로 정맥내, 피하, 결절내 (intranodal), 종양내, 척추강내, 흉막내, 복막내 및 흉선으로의 직접 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해 투여할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 세포자살성 세포를 투여받을 개체 이외의 개체로부터 수득된 세포로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은, 미국 특허 출원 20130156794에 기술된 하나 이상의 단계를 포함하여, 동종이계 공여 세포의 거부 반응을 해결하는데 유용한 부가적인 단계를 포함하며, 상기 미국 특허는 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에서, 방법은 일부 구현예에서, 동종이계 세포자살성 세포인 세포자살성 세포를 투여하기 전에 완전한 또는 부분적인 림프구 고갈 (lymphodepletion) 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈은 동종이계 세포자살성 세포가 사이토카인 분비를 조절할 수 있는 충분한 기간 동안 숙주 편대 이식 반응을 지연하도록, 조정된다. 일부 구현예에서, 방법은, 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]프로판-1,3-다이올 (FTY720), 5-[4-페닐-5-(트리플루오로메틸)티오펜-2-일]-3-[3-(트리플루오로메틸)페닐]1,2,4-옥사다이아졸 (SEW2871), 3-(2-(-헥실페닐아미노)-2-옥소에틸아미노)프로판산 (W123), 2-암모니오-4-(2-클로로-4-(3-페녹시페닐티오)페닐)-2-(하이드록시메틸)부트-일 하이드로겐 포스페이트 (KRP-203 포스페이트) 또는 당해 기술 분야에 공지된 기타 물질 등의, 림프절로부터 동종이계 세포자살성 T 세포의 퇴출 (egression)을 지연하는 물질을 투여하는 단계를 포함하며, 이는 이식 편대 숙주 질환의 개시 결핍 및 효과를 가진 동종이계 세포자살성 세포를 사용을 허용하기 위한 본원에 개시된 조성물 및 방법의 일부로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 동종이계 세포자살성 T 세포에 의한 MHC 발현은, 동종이계 세포의 거부 반응을 줄이기 위해, 침묵된다.
일부 구현예에서, 본 방법은, 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 또는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단을 제조하는 단계를 포함하며, 이 방법은 다음 단계, 즉 말초혈로부터 단핵구-농화된 세포 집단을 수득하는 단계; 항-응집제를 포함하는 동결 매질에서 단핵구-농화된 세포 집단을 동결하는 단계; 단핵구-농화된 세포 집단을 해동하는 단계; 메틸프레드니솔론을 최종 농도 약 10-100 ㎍/mL로 포함하고, 그리고 항-응집제를 포함하는 세포자살 유발성 인큐베이션 매질에서 단핵구-농화된 세포 집단을 인큐베이션하는 단계; 세포자살성 세포 집단을 투여 매질에 재현탁하는 단계; 및 단핵구-농화된 집단을 불활화하는 단계를 포함하며, 불활화는 세포자살 유도 후 발생하며, 이 방법으로 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율 감소; 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 또는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단이 제조된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포자살성 세포 집단을 동일 개체 (자가 ApoCell)에 투여하기 전 개체로부터 유래된 세포자살성 세포 집단에 방사선 처리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포자살성 세포 집단을 수용자 (동종이계 ApoCell)에 투여하기 전 개체로부터 유래된 세포자살성 세포에 방사선 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포자살성 세포 집단에서 잔류 생존 세포의 증식 및/또는 활성화를 감소시키는 방식으로 방사선 처리된다. 일부 구현예에서, 세포는 집단에서 살아있는 비-세포자살성 세포의 퍼센트를 낮추는 방식으로 방사선 처리된다. 일부 구현예에서, 불활화된 초기 세포자살성 세포 집단에서 살아있는 비-세포자살성 세포의 퍼센트는 집단의 50% 미만으로 감소한다. 일부 구현예에서, 불활화된 초기 세포자살성 세포 집단에서 살아있는 비-세포자살성 세포의 퍼센트는 집단의 40% 미만으로 감소한다. 일부 구현예에서, 불활화된 초기 세포자살성 세포 집단에서 살아있는 비-세포자살성 세포의 퍼센트는 집단의 30% 미만으로 감소한다. 일부 구현예에서, 불활화된 초기 세포자살성 세포 집단에서 살아있는 비-세포자살성 세포의 퍼센트는 집단의 20% 미만으로 감소한다. 일부 구현예에서, 불활화된 초기 세포자살성 세포 집단에서 살아있는 비-세포자살성 세포의 퍼센트는 집단의 10% 미만으로 감소한다. 일부 구현예에서, 불활화된 초기 세포자살성 세포 집단에서 살아있는 비-세포자살성 세포의 퍼센트는 집단의 0%로 감소한다.
다른 구현예에서, 방사선 처리된 세포자살성 세포는 이의 모든 초기 세포자살성-, 면역 조절-, 안정성-특성을 보존한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사 단계는 UV 조사를 이용한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사 단계는 감마 조사를 이용한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는, 살아있는 비-세포자살성 세포를 감소된 퍼센트로 포함하거나, 세포자살성 세포 조제물에 존재하는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화가 억제된 조제물을 포함하거나, 또는 세포자살성 세포 조제물에 존재하는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식이 감소된 조제물을 포함하거나, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사선 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 1%보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 2%보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 3% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 4% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사선 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 5% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 6% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 7% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 8% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 9% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 10% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 15% 보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 방사성 조사는 방사선 비-조사된 세포자살성 세포와 비교해 사멸 세포 (PI+) 집단을 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%보다 높은 수준으로 증가시키지 않는다.
일부 구현예에서, 살아있는 비-세포자살성 세포를 감소된 비율로 포함하거나 또는 포함하지 않는 세포 집단은, 일부 구현예에서, 임의의 살아있는/생존 세포가 없는 단핵구 초기 세포자살성 세포 집단을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 살아있는 비-세포자살성 세포를 감소된 비율로 포함하거나 또는 포함하지 않는 세포 집단은, 일 구현예에서, 수용자에서 GVHD를 유발하지 않는 단핵구 세포자살성 세포 집단을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 방사선 처리된 ApoCell의 사용은 (생존 세포를 적은 비율로 포함하는) 세포자살성 집단의 사용으로 유발될 수 있는 이식 편대 백혈병 발병 (graft versus leukemia effect) 가능성을 제거하며, 이는 실시예 (실시예 8 참조)에서 확인된 효과들은 세포자살성 세포로부터 기인한 것이고, 세포자살성 세포 집단에 존재하는 세포 활성을 가진 세포의 살아있는 증식성 집단으로부터 기원하지 않는다는 것을 나타낸다.
다른 구현예에서, 본 방법은 수용자에 투여 전 공여자 WBC로부터 유래된 세포자살성 세포에 방사선 처리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 세포자살성 세포 집단내 잔류하는 생존 세포의 증식 및/또는 활성화를 방지하는 방식으로 방사선 처리된다. 다른 구현예에서, 방사선 처리된 세포자살성 세포는 모든 초기 세포자살성-, 면역조절-, 안정성-특성을 보존한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사 단계는 X선 조사를 사용한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사 단계는 감사 조사를 이용한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 살아있는 비-세포자살성 세포를 감소된 비율로 포함하거나, 세포자살성 세포 조제물에 존재하는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화가 억제된 조제물을 포함하거나, 또는 세포자살성 세포 조제물에 존재하는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식이 감소된 조제물을 포함하거나, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물 (pooled mononuclear apoptotic cell preparation)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 초기 세포자살 상태의 단핵구 세포를 포함하며, 이때 단핵구 세포자살성 세포 풀은 살아있는 비-세포자살성 세포의 비율 감소, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화가 억제된 조제물, 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식이 감소된 조제물 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀은 방사선 처리된 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 일부 구현예에서, 헌혈액으로부터 수득된 백혈구 분획 (WBC)로부터 기원하는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물을 개시한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포 조제물은 방사선 처리된 것이다. 다른 구현예에서, 방사선 처리는 감마 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방사선 처리된 조제물은 방사선 비-처리된 세포자살성 세포 조제물과 비교해 비-세포자살성 세포가 수적으로 감소된 것이다. 다른 구현예에서, 방사선 처리된 조제물은 방사선 비-처리된 세포자살성 세포 조제물과 비교해 증식성 세포가 수적으로 감소된 것이다. 다른 구현예에서, 방사선 처리된 조제물은 방사선 비-처리된 세포자살성 세포 집단과 비교해 잠재적으로 면역 활성 세포가 수적으로 감소된 것이다.
일부 구현예에서, 혈액 풀은 공여자 및 수용자가 매칭되지 않는 제3자 혈액을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "풀 (pool)"이 복수의 공여자로부터 수집 및 준비되고, 잠재적으로는 향후 사용을 위해 보관된 혈액을 포함할 수 있음을 알 것이다. 이러한 혈액의 조합된 풀을 가공 처리하여, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물을 제조할 수 있다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은, 쉽게 이용할 수 있는 단핵구 세포자살성 세포를 공급가능하게 한다. 다른 구현예에서, 세포는, 세포자살을 유도하는 인큐베이션 단계 직전에 풀링된다 (pooling). 다른 구현예에서, 세포는 인큐베이션 단계 후 재현탁 단계에서 풀링된다. 다른 구현예에서, 세포는 방사선 처리 단계 직전에 풀링된다. 다른 구현예에서, 세포는 방사선 처리 단계 이후에 풀링된다. 다른 구현예에서, 세포는 제조 방법의 임의 단계에서 풀링된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포 풀 조제물은 혈액 유닛 (unit) 2-25개에 존재하는 세포들로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 풀 조제물은 혈액 유닛 약 2-5, 2-10, 2-15, 2-20, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 10-15, 10-20, 10-25, 6-13 또는 6-25개에 존재하는 세포들로 구성된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 풀 조제물은 혈액 유닛 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개에 존재하는 세포들로 구성된다. 필요한 혈액 유닛의 개수는 또한 혈액에서의 WBC 회수율에 따라 결정된다. 예를 들어, WBC 회수율이 낮으면 유닛들이 더 많이 필요할 것이며, WBC 회수율이 높으면 필요한 유닛의 개수는 적어질 것이다. 일부 구현예에서, 각 유닛은 혈액 한 팩 (bag)이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 풀 조제물은 혈액 유닛 25개 이상, 50개 이상 또는 100개 이상에 존재하는 세포들로 구성된다.
일부 구현예에서, 혈액의 유닛은 헌혈액으로부터 유래된 백혈구 (WBC) 분획을 포함한다. 다른 구현예에서, 헌혈액은 혈액 센터 또는 혈액 은행으로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 헌혈액은 세포자살성 세포 풀 조제물을 준비하는 시점에 모집된 병원내 공여자로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 복수의 공여자로부터 유래된 WBC를 포함하는 혈액 유닛들은, 본원에 개시된 조성물 및 그 방법을 위해 구축된 독립적인 혈액 은행에서 저장 및 보존된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 그 방법을 목적으로 개발된 혈액 은행으로부터 복수의 공여자로부터 유래된 WBC를 포함하는 혈액 유닛을 공급받을 수 있으며, 백혈구성분채집 유닛 (leukapheresis unit)을 포함한다.
일부 구현예에서, WBC 풀 유닛들은 HLA 매칭에 의해 제한되지 않는다. 따라서, 수득된 세포자살성 세포 풀 조제물은 HLA 매칭에 의해 제한되지 않는 세포 집단들을 포함한다. 이에, 특정 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 동종이계 세포를 포함한다.
HLA 매칭에 의해 제한되지 않은 WBC 풀로부터 유래되는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물의 이점은 WBC가 쉽게 이용할 수 있는 소스이고, WBC 제조 비용의 절약되는 것이다.
일부 구현예에서, 혈액 풀은 HLA 매칭과 독립적인 복수의 공여자로부터 유래된 혈액을 포함한다. 다른 구현예에서, 혈액 풀은, 수용자와의 HLA 매칭이 고려된, 복수의 공여자 유래의 혈액을 포함한다. 예를 들어, 공여자와 수용자 간에 HLA 대립유전자 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개가 매칭된다. 다른 구현예에서, 복수의 공여자들은 일부 매칭되며, 예를 들어, 공여자들 중 일부가 HLA 매칭되고, HLA 대립유전자 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개가 일부 공여자와 수용자 간에 매칭된다. 각각의 가능성이 본원에 개시되는 구현예를 구성한다.
특정 구현예들에서, 일부 생존가능한 비-세포자살성 세포 (세포자살 내성)는 후술한 세포자살 유도 단계 이후에 유지될 수 있다 (실시예 1). 이들 생존가능한 비-세포자살성 세포의 존재는, 일부 구현예에서, 방사선 조사 단계 이전에 관찰된다. 이들 생존가능한 비-세포자살성 세포는 증식 또는 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 공여자로부터 유래되는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 숙주에 대해 활성화되거나, 서로에 대해 활성화되거나, 또는 둘다일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방사선 처리된 세포 조제물은 방사선 처리되지 않은 세포 조제물과 비교해 억제된 세포 활성화 및 감소된 증식을 가진다. 다른 구현예에서, 방사선 처리는 감마 조사 또는 UV 조사를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 처리된 세포 조제물은 방사선 처리되지 않은 세포 조제물과 비교해 비-세포자살성 세포의 수가 적다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 15 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 20 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 25 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 30 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 35 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 40 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 45 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 50 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 55 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 60 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 약 65 Gy (Grey unit)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방사선 조사는 최대 2500 Gy이다. 다른 구현예에서, 방사선 처리된 세포자살성 세포 풀 조제물은 방사선 비-처리된 세포자살성 세포 풀 조제물과 동일하거나 또는 비슷한 세포자살 프로파일, 안정성 및 효능을 유지한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 최대 24시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 적어도 24시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 24시간 보다 장기간 안정적이다. 또 다른 구현예, 본원에 개시된 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 최대 36시간 동안 안정적이다. 또 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 적어도 36시간 동안 안정적이다. 또 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 36시간 보다 장기간 안정적이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 최대 48시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 적어도 48시간 동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 48시간 보다 장기간 안정적이다.
일부 구현예에서, 방사선 처리 단계를 포함하는 세포 풀 조제물의 제조 방법은, 방사선 처리 단계를 포함하지 않을 수 있는, 한 명의 매칭되는 공여자로부터 유래된 세포자살성 조제물에서 관찰되는 초기 세포자살성 특성, 면역 조절 특성 및 안정성 특성을 보존한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물은 이식 편대 숙주 질환 (GVHD) 반응을 유발하지 않는다.
세포 조제물의 방사선 처리는 당해 기술 분야에서 안전한 것으로 간주된다. 방사선 처리 절차는 현재 WBC에 대한 반응을 방지하도록 헌혈된 혈액에 대해 통상적인 방식으로 수행된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물 내 세포자살성 세포의 %는 100%에 가까우며, 즉 세포 조제물 내 살아있는 비-세포자살성 세포의 비율 (fraction)이 낮다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 %는 적어도 40%이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 %는 적어도 50%이다. 또 다른 구현예, 세포자살성 세포의 %는 적어도 60%이다. 또 다른 구현예, 세포자살성 세포의 %는 적어도 70%이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 %는 적어도 80%이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 %는 적어도 90%이다. 또 다른 구현예, 세포자살성 세포의 %는 적어도 99%이다. 따라서, 살아있는 비-세포자살성 세포의 비율이 감소되거나 또는 없는 세포 조제물은, 일 구현예에서, 수용자에서 GVHD를 유발하지 않는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물을 제공할 수 있다. 각각의 가능성이 본원에 개시되는 구현예를 구성한다.
다른 예로, 다른 구현예에서, 살아있는 비-세포자살성 WBC의 %는 살아있는 세포 집단을 특이적으로 제거함으로써, 예를 들어, 타겟화된 침강 (targeted precipitation)에 의해 낮춘다. 다른 구현예에서, 살아있는 비-세포자살성 세포의 %는 포스파티딜세린에 결합하는 자기 비드를 사용해 줄일 수 있다. 다른 구현예에서, 살아있는 비-세포자살성 세포의 %는 세포자살성 세포가 아닌 비-세포자살성 세포의 세포 표면 상의 마커에 결합하는 자기 비드를 사용해 줄일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 비-세포자살성 세포가 아닌 세포자살성 세포의 세포 표면 상의 마커에 결합하는 자기 비드를 사용해 추가적인 조제물로 선별할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 살아있는 비-세포자살성 WBC의 %는 초음파를 사용함으로써 줄인다.
일 구현예에서, 세포자살성 세포는 제3자 공여자 풀로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 세포 풀 조제물은 림프구, 단구 및 자연 살상 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 타입을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 풀 조제물은 단핵구 세포 (mononuclear cell)가 농화된 집단을 포함한다. 일 구현예에서, 단핵구 풀은 림프구, 단구 및 자연 살상 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 타입을 포함하는 단핵구 농화된 세포 집단이다. 다른 구현예에서, 단핵구 농화된 세포 조제물은, 과립구 (즉, 호중구, 호염구 및 호산구)로 알려진, 다형핵 백혈구를 15% 이하로, 또는 10% 이하로, 전형적으로 5% 이하로 포함한다. 다른 구현예에서, 단핵구 세포 풀 조제물에는 과립구가 존재하지 않는다.
다른 구현예에서, 단핵구 농화된 세포 풀 조제물은 CD15고 발현성 세포를 15% 이하로, 또는 10% 이하로, 전형적으로 5% 이하로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 풀 조제물은 CD15고 발현성 세포를 15% 미만으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 단핵구 농화된 세포 풀 조제물은 단핵구 세포를 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%로 포함하며, 각각의 가능성은 본원에 개시되는 별개의 구현예를 구성한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 단핵구 농화된 세포 풀 조제물은 단핵구 세포를 적어도 85%로 포함한다.
다른 구현예에서, 최종 단핵구 세포 풀의 %가 80% 이상인 임의의 세포 풀 조제물이 본원에 개시된 단핵구 농화된 세포 풀 조제물로 간주된다. 즉, 다형핵 세포 (PMN)가 증가된 세포 조제물을 단핵구 세포 비율이 높은 조제물과 합하여 단핵구 세포가 80% 이상인, 제조되는 "풀 (pool)"은 본원에 개시된 조제물로서 포함된다. 일부 구현예에서, 단핵구 세포는 림프구 및 단구를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "단핵구 세포"가 하나의 핵 (one lobed nucleus)을 가진 백혈구를 포괄할 수 있음을, 알 것이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 세포자살성 세포 풀 조제물은 다형핵 백혈구를 5% 미만으로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 T 세포이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 CAR T 세포와 동일한 제3자 공여자 T 세포 풀로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 CAR T 세포 집단으로부터 유래된다.
놀랍게도, 세포자살성 세포는, CAR T 세포 요법의 효능을 유지하면서, 사이토카인 폭풍과 관련된 사이토카인, 비-제한적인 예로, IL-6 및 인터페론-gamma (IFN-γ)의 단독 또는 조합된 형태의 생산을 감소시킨다 (실시예 2). 일 구현예에서, 세포자살성 세포는 대식세포에서 사이토카인 발현 수준에 영향을 미친다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 대식세포에서 사이토카인 발현 수준을 감소시킨다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포는 대식세포에서 사이토카인 발현 수준을 억제한다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포는 대식세포에서 사이토카인 발현 수준을 저해한다. 일 구현예에서, 세포자살성 세포는 CAR T 세포의 투여 전에 존재하는 수준과 일치 또는 거의 일치되는 수준으로 IFN-γ의 수준을 유지한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 대식세포에서 사이토카인 발현 수준에 영향을 미치지만, CAR T 세포의 사이토카인 발현 수준에는 영향을 미치지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 DC에서 사이토카인 발현 수준에 영향을 미치지만, CAR T 세포의 사이토카인 발현 수준에는 영향을 미치지 않는다. 즉, 세포자살성 세포가 CAR T 세포 요법의 효능 유지에 유용할 것이라고는, 예상하지 못하였다.
다른 구현예에서, 대식세포, DC 또는 이들의 조합에서 사이토카인 발현 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과는 CRS의 감소로 나타난다. 다른 구현예에서, 대식세포, DC 또는 이들의 조합에서 사이토카인 발현 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과는 중증의 CRS 완화로 나타난다. 다른 구현예에서, 대식세포, DC 또는 이들의 조합에서 사이토카인 발현 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과는 CRS 억제로 나타난다. 다른 구현예에서, 대식세포, DC 또는 이들의 조합에서 사이토카인 발현 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과는 중증의 CRS 억제로 나타난다. 다른 구현예에서, 대식세포, DC 또는 이들의 조합에서 사이토카인 발현 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과는 CRS 저해로 나타난다. 다른 구현예에서, 대식세포, DC 또는 이들의 조합에서 사이토카인 발현 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과는 중증의 CRS 저해로 나타난다. 다른 구현예에서, 대식세포, DC 또는 이들의 조합에서 사이토카인 발현 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과는 CRS를 예방한다. 다른 구현예에서, 대식세포, DC 또는 이들의 조합에서 사이토카인 발현 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과는 중증의 CRS를 예방한다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 T 세포의 사멸을 촉발하지만, 사이토카인의 발현 수준에 대한 변화를 통해 이루어지는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 대식세포 및 수지상 세포를 자극하여 사이토카인 폭풍을 증폭시키는 사이토카인의 방출을 길항한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 Treg를 증가시켜 염증 반응을 억제하거나 및/또는 사이토카인의 과다 방출을 방지한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 하나 이상의 전-염증성 사이토카인을 저해한다. 일부 구현예에서, 전-염증성 사이토카인은 IL-1beta, IL-6, TNF-alpha, IFN-gamma 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 하나 이상의 항-염증성 사이토카인의 방출을 촉진한다. 일부 구현예에서, 항-염증성 사이토카인은 TGF-beta, IL10, PGE2 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 TLR 리간드에 노출된 후 수지상 세포의 성숙화를 저해한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 잠재적으로 관용성인 (tolerogenic) 수지상 세포, 일부 구현예에서, 이동 (migration)할 수 있는 수지상 세포를 구축하며, 일 구현예에서, 이동은 CCR7으로 인한 것이다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 다양한 신호전달 현상, 일 구현예에서, TAM 수용체 신호전달 (Tyro3, Axl 및 Mer)을 야기하며, 일부 구현예에서, 항원 제시 세포에서 염증을 저해한다.
일부 구현예에서, Tyro-3, Axl 및 Mer은 키나제 도메인 및 유착 분자-유사 세포외 도메인 내 보존된 서열을 특징으로 하는 TAM 수용체 티로신 키나제 (RTK) 패밀리를 구성한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 MerTK를 통한 신호전달을 활성화한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)/AKT 경로를 활성화하며, 일부 구현예에서 이는 NF-κB를 저해하는 방식으로 (negatively) 조절한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 인플라솜 (inflammasome)을 저해하는 방식으로 조절하며, 일 구현예에서, 이는 전-염증성 사이토카인의 방출, DC 성숙화 또는 이들의 조합의 저해를 유발한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 Nr4a, Thbs1 또는 이들의 조합과 같은 항-염증성 유전자의 발현을 상향 조절한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 AMP를 높은 수준으로 유도하며, 일부 구현예에서 이는 Pannexin 1-의존적인 방식으로 축적된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 투여는 염증을 억제한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 초기 세포자살성 세포의 이용 방법은, 초기 세포자살성 세포 또는 이의 조성물을 항체와 조합하여 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 종양 세포 항원에 대한 것이다. 다른 구현예에서, 항체는 CD20에 대한 것이다. 다른 구현예에서, 항체는 리툭시맵 (Rtx)에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 및 항체는 동일한 조성물에 포함된다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 및 항체는 서로 다른 조성물에 포함된다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 및 항체의 조합 투여 또는 이들의 조성물(들)의 투여는 동시적이다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 및 항체의 조합 투여 또는 이들의 조성물(들)의 투여는 항체의 투여 전 세포자살성 세포 또는 이의 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 및 항체의 조합 투여 또는 이들의 조성물(들)의 투여는 항체 투여 후 세포자살성 세포 또는 이의 조성물의 투여를 포함한다.
다른 구현예에서, 항체는 ERBB2에 대한 인간화된 IgG1인 트라스투주맵 (Trastuzumab) (헤르셉틴 (herceptin); Genentech)이다. 다른 구현예에서, 항체는 VEGF에 대한 인간화된 IgG1인 베박시주맵 (Bevacizumab) (아바스틴 (avastin); Genentech/Roche)이다. 다른 구현예에서, 항체는 EGFR에 대한 키메라 인간-뮤라인 IgG1인 세툭시맵 (Cetuximab) (Erbitux; Bristol-Myers Squibb)이다. 다른 구현예에서, 항체는 EGFR에 대한 인간 IgG2인 파니투무맵 (Panitumumab) (Vectibix; Amgen)이다. 다른 구현예에서, 항체는 CTLA4에 대한 IgG1인 이필리무맵 (Ipilimumab) (Yervoy; Bristol-Myers Squibb)이다.
다른 구현예에서, 항체는 CD52에 대한 인간화된 IgG1인 알렘투주맵 (Alemtuzumab) (Campath; Genzyme)이다. 다른 구현예에서, 항체는 CD20에 대한 인간 IgG1인 오파투무맵 (Ofatumumab) (Arzerra; Genmab)이다. 다른 구현예에서, 항체는 CD33에 대한 인간화된 IgG4인 겜투주맵 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg; Wyeth)이다. 다른 구현예에서, 항체는 CD30에 대한 키메라 IgG1인 브렌투시맵 베도틴 (Brentuximab vedotin) (Adcetris; Seattle Genetics)이다. 다른 구현예에서, 항체는 CD20에 대한 뮤라인 IgG1인 90Y-표지된 이브리투모맵 티우세탄 (ibritumomab tiuxetan) (Zevalin; IDEC Pharmaceuticals)이다. 다른 구현예에서, 항체는 CD20에 대한 뮤라인 IgG2인 131I-표지된 토시투모맵 (tositumomab) (Bexxar; GlaxoSmithKline)이다.
다른 구현예에서, 항체는 혈관 내피 성장인자 수용체-2 (VEGFR-2)에 대한 것인 라무시루맵 (Ramucirumab)이다. 다른 구현예에서, 항체는 라무시루맵 (ramucirumab) (Cyramza Injection, Eli Lilly and Company), 블리나투모맵 (blinatumomab) (BLINCYTO, Amgen Inc.), 펨브롤리주맵 (pembrolizumab) (KEYTRUDA, Merck Sharp & Dohme Corp.), 오비누투주맵 (obinutuzumab) (GAZYVA, Genentech, Inc.; 종래에 GA101), 퍼투주맵 (pertuzumab) 주사 (PERJETA, Genentech, Inc.) 또는 데노수맵 (denosumab) (Xgeva, Amgen Inc.)이다. 다른 구현예에서, 항체는 바실리시맵 (Basiliximab) (Simulect; Novartis)이다. 다른 구현예에서, 항체는 다클리주맵 (Daclizumab) (Zenapax; Roche)이다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포와 조합하여 투여되는 항체는 본원에 기술되거나 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 종양 또는 암 항원 또는 이의 단편에 대한 것이다. 다른 구현예에서, 항체는 종양-관련 항원에 대한 것이다. 다른 구현예에서, 항체는 혈관신생 인자인 종양-관련 항원 또는 이의 단편에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 본원에 기술된 조성물, 비-제한적인 예를 들어 초기 세포자살성 세포를 포함하는 조성물과 조합하여 사용할 수 있다.
세포자살성 세포의 상층액 (ApoSup 및 ApoSup Mon)
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 치료에 사용하기 위한 조성물은 본원에 개시된 세포자살성 세포의 상층액을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은 a) 세포자살성 세포를 제공하는 단계, b) 단계 a)의 세포자살성 세포를 배양하는 단계, 및 c) 세포로부터 상층액을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포자살성 세포의 상층액을 만드는 데 사용하기 위한 세포자살성 세포는 요법을 받는 개체의 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 세포자살성 세포의 상층액을 만드는 데 사용하기 위한 세포자살성 세포는 요법 시술 중인 개체에 대해 동종이계 세포이다.
세포자살성 세포의 상층액이 수득되는 "세포자살성 세포"는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 세포자살 유도 방법에 의해 달성되는, 개체의 임의의 세포 타입으로부터 선택되는 세포이거나, 또는 상업적으로 이용가능한 임의의 세포주일 수 있다. 세포자살을 유도하는 방법은 저산소, 오존, 열, 방사선, 화학제, 삼투압, pH 변화, X선 조사, 감마-선 조사, UV 조사, 혈청 고갈 (serum deprivation), 코르티코이드 또는 이들의 조합일 수 있거나, 또는 본원에 기술되거나 당해 기술 분야에 공지된 임의의 다른 방법일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포자살을 유도하는 방법은 세포자살성 세포를 초기 세포자살 상태로 제조한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 백혈구이다.
일 구현예에서, 상기 세포자살성 백혈구는 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 상기 백혈구는 제3자 공여자 풀로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 상기 백혈구는 동종이계이다.
일부 구현예에 있어서, 세포자살성 세포는 비-부착성 백혈구를 선별하고 이에 대해 세포자살 유도를 진행한 후 배양 배지에서의 세포 배양 단계에 의해 제공된다. 세포자살성 세포-식세포의 상층액을 만드는 데 사용되는 "백혈구"는, 비-제한적인 예로, 수지상 세포, 대식세포, 비만 세포, 호염구, 조혈 줄기세포, 골수 세포, 자연 살상 세포 등의, 면역 시스템 및/또는 조혈 시스템의 유핵 세포의 임의 계통 또는 서브-계통으로부터 유래될 수 있다. 백혈구는 용도 및 목적, 원하는 백혈구 계통 등에 따라, 임의의 다양한 통상적으로 실시되는 방법에 따라, 임의의 다양한 적절한 해부학적 구획 (anatomical compartment)으로부터 임의의 다양한 적절한 방법을 통해 유래 또는 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 백혈구의 공급원은 일차 백혈구이다. 다른 구현예에서, 백혈구 공급원은 일차 말초혈 백혈구이다.
일차 백혈구 및 단구는 말초혈으로부터 편리하게 유래될 수 있다. 말초혈 백혈구는 림프구 70-95% 및 단구 5-25%를 포함한다.
혈액으로부터 특정 유형의 백혈구 공급원을 수득하는 방법은 통상적인 방식으로 수행된다. 림프구 및/또는 단구 공급원의 수득은, 예를 들어, 헤파린 또는 사이트레이트와 같은 항-응집제의 존재 하에 혈액을 채혈함으로써 달성될 수 있다. 채혈한 혈액은 이후 Ficoll 쿠션 위에서 원심분리하여, 농도 구배 계면에서 림프구와 단구를, 그리고 펠릿에서 호중구와 적혈구를 분리한다.
백혈구는 표준적인 면역자기 선택 또는 면역형광 유세포 측정 기법을 통해 이들의 특이적인 표면 마커에 따라, 또는 원심분리 세정 (centrifugal elutriation)을 통해 서로 분리할 수 있다. 예를 들어, 단구는 CD14+ 분획으로서 선별할 수 있으며, T-림프구는 CD3+ 분획으로서 선별할 수 있으며, B-림프구는 CD19+ 분획으로서, 대식세포는 CD206+ 분획으로서 선별할 수 있다.
림프구 및 단구는, 조직 배양물-처리된 배양 수용기에서의 정치 배양과 같이, 세포를 기판-부착 조건 하에 투입하고, 그로 인해 단구는 세포-부착 기판에 선택적으로 부착되지만 림프구는 부착되지 않음으로, 서로 분리할 수 있다.
백혈구는 또한 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)로부터 수득할 수 있으며, 이는 본원에 기술된 바와 같이 분리할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자는 본원에 개시된 배양된 백혈구 공급원을 원하는 수준의 양으로 생산하기 위해 일차 백혈구를 적절히 배양하는데 필요한 전문 기술을 가지고 있을 것이며, 이러한 배양 방법을 실시하기 위한 충분한 지침은 당해 기술 분야의 문헌들로부터 입수가능하다.
당해 기술 분야의 당업자는 세포자살성 백혈구가 유래되는 적절한 확립된 백혈구 세포주를 확립, 구입 또는 수득하는 데 필요한 전문 기술을 추가로 가지고 있을 것이다. 적절한 백혈구 세포주는 American Tissue Type Collection (ATCC)와 같은 상업적인 공급업체로부터 수득할 수 있다. 세포자살성 백혈구 제조 성능을 현저하게 간섭하는 기법으로는 백혈구 공급원을 수득할 수 없음은 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 세포자살성 림프구일 수 있다. 일차 림프구와 같은 림프구의 세포자살은 일차 림프구를 혈청 고갈, 코르티코스테로이드, 또는 방사선 조사로 처리함으로써 유도될 수 있다. 다른 구현예에서, 코르티코스테로이드 처리를 통한 일차 림프구의 세포자살 유도는 일차 림프구에 덱사메타손을 처리함으로써, 다른 구현예에서, 덱사메타손을 약 1 마이크로몰의 농도로 처리함으로써 달성된다. 다른 구현예에서, 방사선 조사를 통한 일차 림프구의 세포자살 유도는 일차 림프구에 감마-방사선을 조사함으로써, 다른 구현예에서, 약 66 rad로 조사함으로써, 달성된다. 이러한 처리로 식세포와의 공-배양 단계에 적합한 세포자살성 림프구가 형성된다.
추가의 구현예에서, 세포자살성 세포는 일차 단구 (primary monocyte)와 같은 세포자살성 단구일 수 있다. 세포자살성 단구를 구축하기 위해, 단구를 혈청 고갈 조건 하에 시험관내 기판/표면-부착 조건 하에 둔다. 이러한 처리로 식세포와의 공-배양 단계에 적합한 비-전-염증성 세포자살성 단구 (non-pro-inflammatory apoptotic monocyte)가 생성된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포는 동종이계 세포자살성 세포, 제3자 세포자살성 세포 및 세포자살성 세포 풀 등의, 본원에 개시된 임의의 세포자살성 세포일 수 있다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은 세포자살성 세포를 다른 세포와 공-배양함으로써 수득할 수 있다.
이에, 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은 a) 세포자살성 세포를 제공하는 단계, b) 다른 세포를 제공하는 단계, c) 선택적으로, 단계 a) 및 b)의 세포를 세척하는 단계, d) 단계 a) 및 b)의 세포를 공-배양하는 단계, 및 선택적으로, e) 세포로부터 상층액을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 세포자살성 세포의 상층액이다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포와 공-배양되는 다른 세포는 백혈구 세포이다.
이에, 일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은, a) 세포자살성 세포를 제공하는 단계, b) 백혈구 세포를 제공하는 단계, c) 선택적으로, 단계 a) 및 b)의 세포를 세척하는 단계, d) 단계 a) 및 b)의 세포를 공-배양하는 단계, 및 선택적으로, e) 세포로부터 상층액을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는, 세포자살성 세포-백혈구 세포의 상층액이다.
일부 구현예에서, 백혈구 세포는 대식세포, 단구 또는 수지상 세포와 같은 식세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 백혈구 세포는 B 세포, T-세포 또는 자연 살상 세포 (NK 세포)일 수 있다.
이에, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 처리에 사용하기 위한 조성물은 WO 2014/106666에 기술된 바와 같이 세포자살성 세포-식세포의 상층액을 포함하며, 상기 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 세포자살성 세포-식세포의 상층액은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은 식세포와 세포자살성 세포의 공-배양물로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포-식세포의 상층액은, a) 식세포를 제공하는 단계, b) 세포자살성 세포를 제공하는 단계, c) 선택적으로, 단계 a) 및 b)의 세포를 세척하는 단계, d) 단계 a) 및 b)의 세포를 공-배양하는 단계, 및 선택적으로, e) 세포로부터 상층액을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다.
용어 "식세포"는 유해한 외부 입자, 박테리아, 및 사멸 세포 또는 사멸 중인 세포를 탐식 (포식작용)함으로써 신체를 보호하는 세포를 의미한다. 식세포로는, 예를 들어 호중구, 단구, 대식세포, 수지상 세포 및 비만 T-세포, 주로 수지상 세포 및 단구/대식세포로 지칭되는 세포 등이 있다. 식세포는 수지상 세포 (CD4+ HLA-DR+ 계통- BDCA1 /BDCA3+), 대식세포 (CD14+ CD206+ HLA-DR+)일 수 있거나, 또는 단구 (CD14+)로부터 유래될 수 있다. 이들 여러가지 식세포를 구분하기 위한 기법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다.
일 구현예에서, 단구는 플라스틱 부착 단계에 의해 수득된다. 상기 단구는 마커 CD14+에 의해 B 세포 및 T-세포와 구분할 수 있는데, 원치 않는 B 세포는 CD19+를 발현하고 T-세포는 CD3+를 발현한다. 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 유도성 성숙화 후 수득되는 대식세포는, 일부 구현예에서 마커 CD14+, CD206+, HLA-DR+에 양성을 나타낸다.
일 구현예에서, 상기 식세포는 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)로부터 유래된다.
식세포는 당해 기술 분야에 공지된 식세포를 수득하기 위한 임의의 방법에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 식세포는 개체로부터 직접 분리하거나, 또는 성숙 단계에 의해 전구 세포로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 대식세포는 개체의 복강에서 직접 분리하여, RPMI 완전 배지에서 배양할 수 있다. 대식세포는 또한 비장으로부터 분리할 수 있다.
식세포는 또한 말초혈 단구로부터 수득가능하다. 이러한 예에서, 배양시, 비-제한적인 예로, 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 세포 배양 배지에 첨가하여, 단구-유래 대식세포로부터 단구를 분화시킨다.
예를 들어, 식세포는 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, PBMC는, 개체로부터, 세포성분채집 백에서 Ficoll 농도 구배 원심분리를 통해 분리할 수 있으며, RPMI 완전 배양 배지 (10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 접종하여 90분간 세포-부착 단계로 배양할 수 있다. 플라스틱 부착 단계에 의해 비-부착성 T-세포를 제거하고, 부착성 T-세포를 재조합 인간 M-CSF가 첨가된 RPMI 완전 환경에서 배양한다. 배양 기간이 끝난 후 단구-유래 대식세포를 수득한다.
식세포는 세포-부착 단계를 통해 선별할 수 있다. "세포 부착 단계"는 식세포로 성숙될 수 있는 세포 또는 식세포를, 배양된 세포가 표면, 세포 부착 표면 (예를 들어, 적절한 타입의 나일론 또는 플라스틱을 포함하는 조직 배양 디쉬, 매트릭스, 주머니 또는 백)에 부착할 수 있는 배양 조건을 통해 선별하는 것을 의미한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "세포 부착 표면"이 친수성의 음으로 하전된 표면을 망라할 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 다양한 방법으로, 다른 구현예에서, 예를 들어 코로나 방전 또는 가스-플라스마를 이용해 폴리스티렌 표면을 개질함으로써, 수득할 수 있음을 알 것이다. 이러한 과정은, 표면이 친수성의 음으로 하전되도록, 표면에 폴리스티렌 사슬을 그래프팅하는 높은 에너지의 산소 이온을 만들다. 세포-부착을 용이하게 하도록 고안된 배양 수용기는 다양한 시판업체 (예, Corning, Perkin-Elmer, Fisher Scientific, Evergreen Scientific, Nunc, 등)로부터 입수 가능하다.
B 세포, T-세포 및 NK 세포는 당해 기술 분야에 공지된 이러한 세포를 수득하기 위한 임의의 방법을 통해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, B 세포, T-세포 또는 NK 세포는 개체로부터 직접적으로 분리하거나, 또는 성숙 단계에 의해 전구 세포로부터 유래할 수 있다. 다른 구현예에서, B 세포, T-세포 또는 NK 세포는 B 세포, T-세포 또는 NK 세포주로부터 유래할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는, 적절하게 확립된 B 세포, T-세포 및 NK 세포주를 확립, 구입, 또는 수득하기 위한 필요한 전문 기술을 가지고 있을 것이다. 적절한 세포주는 American Tissue Type Collection (ATCC)와 같은 시판업체로부터 수득할 수 있다.
일 구현예에서, 상기한 세포자살성 세포 및 백혈구 세포, 예를 들어 식세포, B 세포, T-세포 또는 NK 세포는 공-배양 단계 d) 전에 각각 배양된다.
식세포의 세포 성숙화는 세포 배양시, 예를 들어 배지에 성숙 인자의 첨가에 의해 이루어진다. 일 구현예에서, 성숙 인자는 M-CSF이며, 이를 이용해 예를 들어 단구-유래 대식세포를 수득할 수 있다.
식세포의 성숙화 또는 선택을 위해 사용되는 배양 단계는 수 시간 내지 수 일이 소요될 것이다. 다른 구현예에서, 미-성숙 식세포는 적절한 배양 배지에서 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58시간 동안 배양한다.
식세포의 배양 배지는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 비-제한적인 예로, RPMI, DMEM, X-vivo 및 Ultraculture milieus일 수 있다.
일 구현예에서, 세포자살성 세포와 식세포의 공-배양은 생리학적 용액에서 이루어진다.
이러한 "공-배양"에 앞서, 세포에 대해 세척 단계를 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 백혈구 세포 (예, 식세포) 및 세포자살성 세포는 공-배양 단계 이전에 세척한다. 다른 구현예에서, 세포는 PBS로 세척한다.
공-배양시, 백혈구 세포 (예, 대식세포, 단구, 또는 식세포와 같은 식세포, 또는 B 세포, T-세포 또는 NK 세포) 및 세포자살성 세포는 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 또는 1:1의 비율로, 또는 (백혈구:세포자살성 세포) 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10의 비율로 혼합할 수 있다. 일 예로, 백혈구 세포 대 세포자살성 세포의 비율은 1:5이다.
세포의 공-배양은 수 시간 내지 수 일간 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52시간 동안 배양한다. 당해 기술 분야의 당업자는, 항-염증성 화합물의 존재, 백혈구 세포의 생존가능한 수준 (viable amount) 및 아직까지 제거되지 않은 세포자살성 세포의 양을 측정함으로써, 공-배양의 최적 시간을 평가할 수 있다. 식세포에 의한 세포자살성 세포의 제거는 세포자살성 세포의 소거로 인해 광 현미경에서 관찰가능하다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 배양, 예를 들어 백혈구 세포 (예, 식세포, 예를 들어 대식세포, 단구, 또는 식세포, 또는 B 세포, T-세포 또는 NK 세포)와의 공-배양은, 배양 배지에서, 및/또는 투여시, 예를 들어 개체에 대한 주사시, 혼용가능한 생리학적 용액에서 이루어진다.
당해 기술 분야의 당업자라면, "생리학적 용액"이 배양 기간 동안 백혈구 세포의 사멸을 유도하지 않는 용액을 망라할 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 생리학적 용액은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52시간, 다른 구현예에서 48시간, 또는 30시간 동안 사멸을 유도하지 않는다.
일부 구현예에서, 백혈구 세포 (예, 식세포, 예를 들어, 대식세포, 단구 또는 식세포 또는 B 세포, T-세포 또는 NK 세포) 및 세포자살성 세포는 생리학적 용액에서 적어도 30분간 배양한다. 이러한 배양 기간 동안에는, 식세포 작용의 개시 및 사이토카인 및 기타 유익한 물질의 분비가 허용된다.
일 구현예에서, 이러한 생리학적 용액은 백혈구-유래 대식세포에 의한 세포자살성 백혈구의 제거를 저해하지 않는다.
배양 또는 공-배양 단계 종료 후, 선택적으로 배양된 세포자살성 세포 또는 공-배양된 세포로부터 상층액을 분리한다. 세포로부터 상층액을 분리하는 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상층액을 수집 및/또는 여과 및/또는 원심분리하여, 세포 및 파편을 제거할 수 있다. 예를 들어, 세포로부터 분리하기 위해, 상층액을 3000 rpm으로 15분간 실온에서 원심분리할 수 있다.
상층액은, 사용전, 예를 들어 방사선 조사에 의해, "불활화"될 수 있다. 따라서, 세포자살성 세포의 상층액을 제조하는 방법은 선택적인 추가적인 방사선 처리 단계 f)를 포함할 수 있다. "방사선 처리" 단계는, 혈액 산물을 불활성화하기 위해 일반적으로 수행되는 바와 같이, 미생물을 사멸시키기에 충분한 수준으로 X선 조사 (25 내지 45 Gy)를 적용하는 살균 방법으로 간주될 수 있다.
상층액의 방사선 처리는 당해 기술 분야에서 안전한 것으로 간주된다. 방사선 처리 절차는 WBC에 대한 반응을 방지하기 위한 헌혈액에 대한 일반적인 절차로서 현재 수행되고 있다.
일 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은 본원에 구체적으로 기술된 바와 같이, 개체에 투여하기 적합한 약학적 조성물로 제형화된다.
일부 구현예에서, 최종 산물은 +4℃에서 보관된다. 다른 구현예에서, 최종 산물은 이후 48시간내에 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액, 예를 들어 세포자살성 세포-식세포의 상층액 또는 상기한 상층액을 포함하는 약학적 조성물은, 예를 들어 -80℃에서 보관하기 위해 동결건조될 수 있다.
일 특정 구현예에서, WO 2014/106666의 실시예 1에 기술된 바와 같이, 세포자살성 세포-식세포의 상층액은 세포자살성 세포로서 흉선 세포를 이용해 제조할 수 있다. 흉선 세포를, 분리 후, 방사선 처리 (예, 35 X-Gray 조사)하고, DMEM 완전 배양 배지에서, 예를 들어 6시간 동안 세포자살이 이루어지도록 배양한다. 이와 병행하여, 대식세포를 복강에서 분리 및 세척한 후 RPMI 완전 배지 (10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, EAA, Hepes, NaP 및 2-머캅토에탄올)에서 배양한다. 그런 후, 대식세포와 세포자살성 세포를 세척한 다음 페놀-비함유성 X-vivo 배지에서 1/5 대식세포/세포자살성 세포 비율로 48시간 동안 공-배양한다. 그 후, 상층액을 수집하고, 원심분리하여 파편을 제거한 다음 보존을 위해 냉동 또는 동결건조할 수 있다. 대식세포의 농화는 FACS에 의한 F4/80 양성 염색을 사용하여 검증할 수 있다. 세포자살은 아넥신-V 및 7AAD 배제 (exclusion)에 대한 양성 염색을 이용해 FACS에 의해 검증할 수 있다.
일 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은, 분리 배양한 대식세포 또는 세포자살성 세포에서 수득한 상층액과 비교해, 활성형 및 잠복형 (latent form) TGF-β의 TGF-β 수준 측면에서, 농화된다. 일 구현예에서, IL-10 수준 역시 대식세포 단독 배양과 비교하여 증가되며, 세포자살성 세포 단독 배양과 비교해 극적으로 증가된다. 다른 구현예에서, IL-6와 같은 염증성 사이토카인은 검출가능하지 않으며, IL-1β 및 TNF는 검출되지 않거나 또는 매우 낮은 수준이다.
일 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은, 단독 배양된 대식세포 또는 단독 배양된 세포자살성 세포로부터 유래된 상층액과 비교해, TGF-β 및 IL-10과 더불어, 상층액의 면역관용 역할에 관여하여 염증을 조절할 수 있는, IL-1ra, TIMP-1, CXCL1/KC 및 CCL2/JE/MCP1을 증가된 수준으로 가진다.
다른 특정 구현예에서, WO 2014/106666의 실시예 3에 기술된 바와 같이, 인간 세포자살성 세포-식세포의 상층액은 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)로부터 유래된 대식세포와 세포자살성 PBMC의 공-배양으로부터 제조할 수 있다. 따라서, 건강한 지원자로부터, 예를 들어 Ficoll 농도 구배 원심분리를 통해, 세포성분채집 백으로부터 PBMC를 분리한다. 그런 후, PBMC를 90분간 완전 RPMI 배양 배지 (10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 접종한다. 그 후, 비-부착성 T-세포를 분리하여, 예를 들어 35 Gy 조사량으로 X선을 조사하여 세포자살로 진행되게 하고, 완전 RPMI 환경에서 4일간 세포자살이 이루어지도록 배양한다 (처음 48시간 동안 배양한 후 세포를 세척함). 이와 병행하여, 부착성 T-세포를 재조합 인간 M-CSF가 50 ㎍/mL로 첨가된 완전 RPMI 환경에서 4일간 배양하고, 처음 48시간 동안 배양한 후 세포를 세척한다. 4일간의 배양이 끝나면, 단핵구-유래 대식세포 및 세포자살성 세포를 세척하고, X-vivo 배지에서 대식세포/세포자살성 세포 1/5의 비율로 다시 48시간 함께 배양한다. 그런 후, 이 배양물로부터의 상층액을 수집하고, 원심분리하여 세포 및 파편을 제거한 다음, 보존 및 향후 사용을 위해 냉동시키거나 또는 동결건조할 수 있다.
일 구현예에서, WO 2014/106666에 기술된 바와 같이, 인간 세포자살성 세포-식세포의 상층액은 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)로부터 6일내에 수득할 수 있다. 배지에 M-CSF를 첨가하여 4일간 배양하여 PBMC-유래 대식세포를 수득하고, PBMC-유래 대식세포를 0일에 분리된 비-부착성 PBMC인 세포자살성 세포와 2일간 공-배양한다.
일 구현예에서, WO 2014/106666에 기술된 바와 같이, 표준화된 인간 세포자살성 세포-식세포의 상층액은 공여자 또는 PBMC의 공급원 (세포성분채집술 또는 백혈구 연층 (buffy coat))과는 독립적으로 수득할 수 있다. 플라스틱-부착 단계 (plastic-adherence step)는 유의한 개시 집단으로서 농화된 단핵구 (플라스틱 배양 접시에 부착 후 CD14+ 세포 20%에서 93%)를 수득하는데 충분하다. 또한, 이러한 부착성 T-세포에는 B 세포 및 T-세포의 비율이 매우 낮다 (CD19+ B 세포 1.0% 및 CD3+ T-세포 12.8%). M-CSF의 존재하에 부착성 T-세포를 4일간 배양하면, 단핵구-유래 대식세포의 비율은 CD14+CD206+HLA-DR+ 대식세포가 0.1%에서 77.7%로 상당히 증가한다. 이때, 단핵구-유래 대식세포를 48시간 동안 세포자살성 비-부착 PBMC (아넥신 V 염색 및 7AAD 배제에 확인되는 바와 같이, 세포자살성 세포 47.6%)와 공-배양하여, 세포자살성 세포-식세포의 상층액을 제조할 수 있다.
일 구현예에서, 수집된 세포자살성 세포-식세포의 상층액은, 단핵구-유래 대식세포 단독 또는 염증 조건 (+ LPS) 하에 처리된 단핵구-유래 대식세포의 배양 상층액과 비교해, 잠재성 (latent) TGF를 현저하게 더 많이 포함하며, IL-1β 또는 TNF와 같은 염증성 사이토카인은 단지 미량 또는 소량 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은 항-응집제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항-응집제는 헤파린, 산 사이트레이트 덱스트로스 (ACD) 포뮬러 A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 항-응집제는 세포자살성 세포의 제조 공정 중에 첨가된다. 다른 구현예에서, 첨가되는 항-응집제는 ACD 및 헤파린, 또는 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, ACD는 1%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 2%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 3%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 4%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 5%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 6%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 7%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 8%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 9%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 10%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 약 1-10%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 약 2-8 %의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 약 3-7%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 약 1-5%의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 약 5-10%의 농도이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.5 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 약 0.1 U/ml-1.0 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 약 0.2 U/ml-0.9 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 약 0.3 U/ml-0.7 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 약 0. 1 U/ml-0.5 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 약 0.5 U/ml-1.0 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 약 0.01 U/ml-1.0 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.1 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.2 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.3 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.4 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.5 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.6 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.7 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.8 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 0.9 U/ml이다. 다른 구현예에서, 헤파린은 최종 농도 1.0 U/ml의 농도이다. 다른 구현예에서, ACD는 5%의 농도이고, 헤파린은 최종 농도 0.5 U/ml이다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 메틸프레드니솔론을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 메틸프레드니솔론의 농도는 30 ㎍/ml을 초과하지 않는다.
일부 구현예에서, 조성물은, 체중 (70 kg 개체의 경우) kg 당 세포 약 2억개에 해당되는, 세포성분채집술에 의해 수득된 CD45+ 세포 약 14 x 109개의 공-배양으로부터 유래되는 세포자살성 세포의 상층액을 총 용량 (total dose) 또는 분액 (aliquot)으로 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 상기한 총 용량은 체중 1 kg 당 세포 약 1억개로부터 유래되는 상층액이 단위 용량 (unit dose)으로서 투여되거나 또는 매주 간격으로 단위 용량으로서 투여되거나 또는 다른 구현예에서 이 둘다이다. 이러한 구현예에 따른 적절한 총 용량은 체중 1 kg 당 세포 약 천만개 내지 약 40억개로부터 유래되는 상층액을 총 용량으로 포함한다. 다른 구현예에서, 상층액은 체중 1 kg 당 세포 약 4천만개 내지 약 10억개로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 상층액은 체중 1 kg 당 세포 약 8천만개 내지 약 5억개로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 상층액은 체중 1 kg 당 세포 약 1억 6천만개 내지 약 2억 5천만개로부터 유래된다. 본 구현예에 따른 적절한 단위 용량은 체중 1 kg 당 세포 약 4백만개 내지 약 4천만개로부터 유래되는 상층액을 단위 용량으로 포함한다. 다른 구현예에서, 상층액은 체중 1 kg 당 세포 약 8백만개 내지 약 2천만개로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 상층액은 체중 1 kg 당 세포 약 1천 6백만개 내지 약 1억개로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 상층액은 체중 1 kg 당 세포 약 3천2백만개 내지 약 5천만개로부터 유래된다.
다른 구현예에서, 약 10 x 106개의 세포자살성 세포의 공-배양물로부터 유래되는 세포자살성 세포 상층액이 용량 (dose)으로 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 107개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 108개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 109개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 1010개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 1011개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 1012개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 105개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 104개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 103개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다. 다른 구현예에서, 10 x 102개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 용량이 투여된다.
일부 구현예에서, 35 x 106개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 세포자살성 세포 상층액이 용량으로 투여된다. 다른 구현예에서, 210 x 106 개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 세포자살성 세포 상층액이 용량으로 투여된다. 다른 구현예에서, 70 x 106개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 세포자살성 세포 상층액이 용량으로 투여된다. 다른 구현예에서, 140 x 106개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 세포자살성 세포 상층액이 용량으로 투여된다. 다른 구현예에서, 35-210 x 106개의 세포자살성 세포로부터 유래되는 세포자살성 세포 상층액이 용량으로 투여된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액 또는 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은, 본원에서 구체적으로 후술한 바와 같이, 비-제한적인 예로, 정맥내, 피하, 결절내, 종양내, 척추강내, 흉막내, 복막내 및 흉선에의 직접 투여를 비롯하여, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다.
놀랍게도, 세포자살성 세포-식세포의 상층액과 같은 세포자살성 세포의 상층액은, 사이토카인 폭풍과 관련있는 사이토카인, 예를 들어 IL-6의 생산을 감소시킨다. 다른 사이토카인 IL-2가 DC 및 대식세포에 의해 소량으로 분비되긴 하지만, 사이토카인 방출 증후군에 관여하진 않는다. 그러나, IL-2는 CAR-T-세포의 생존 및 증식에 필요하며, 주로 이들 T-세포에 의해 생산된다. 예상치 못하게, 세포자살성 세포-식세포의 상층액과 같은 세포자살성 세포의 상층액은 CAR T-세포의 생존에 부정적으로 영향을 줄 만큼 충분히 IL-2 수준을 감소시키는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포-식세포의 상층액과 같은 세포자살성 세포의 상층액은 대식세포 및 DC에서 사이토카인의 발현 수준에 영향을 미치지만, T-세포 자신의 사이토카인 발현 수준에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 세포자살성 세포의 상층액이 CAR T-세포 요법 또는 수지상 세포 요법을 강화하는 데 유용할 것이라는 것은 예상되지 않았다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은 T-세포의 사멸을 촉발하지만, 사이토카인의 발현 수준의 변화를 통해 이루어지는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포-식세포의 상층액과 같은 세포자살성 세포의 상층액은, 대식세포 및 수지상 세포가 사이토카인 폭풍을 증폭시키는 사이토카인을 분비하도록 자극하는 촉발성에 대해 길항성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액은 Treg를 증가시켜, 염증 반응을 억제하거나 및/또는 사이토카인의 과도한 분비를 방지한다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포-식세포의 상층액과 같은 세포자살성 세포의 상층액은 하나 이상의 전-염증성 사이토카인을 저해한다. 일부 구현예에서, 전-염증성 사이토카인은 IL-1β, IL-6, TNF-α 또는 IFN-γ 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 하나 이상의 항-염증성 사이토카인의 분비를 촉진한다. 일부 구현예에서, 항-염증성 사이토카인은 TGF-β, IL10 또는 PGE2, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포-식세포의 상층액과 같은 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 TLR 리간드에의 노출된 이후의 수지상 세포의 성숙화를 저해한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는, 일 구현예에서, 이동할 수 있고, 일 구현예에서, 이동이 CCR7에 기인하는, 잠재적으로 관용성 수지상 세포를 구축한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는, 일 구현예에서 항원-제시 세포에서 염증을 저해하는, 일 구현예에서, TAM 수용체 신호전달 (Tyro3, Axl 및 Mer)인, 다양한 신호전달 이벤트를 유발한다. 일부 구현예에서, Tyro-3, Axl 및 Mer는 키나제 도메인 및 부착 분자-유사 세포외 도메인에 보존된 서열을 특징으로 하는 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 TAM 패밀리를 구성한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 MerTK를 통한 신호전달을 활성화한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는, 일 구현예에서, NF-κB를 저해 조절하는, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)/AKT 경로를 활성화한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는, 일 구현예에서, 전-염증성 사이토카인의 분비, DC의 성숙화 또는 이들의 조합에 대해 저해를 유도하는 인플라마솜을 저해 조절한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 Nr4a, Thbs1 또는 이들의 조합과 같은 항-염증성 유전자의 발현을 상향 조절한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는, 일부 구현예에서, 파넥신1-의존성 방식으로 축적되는 높은 수준의 AMP를 유도한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액의 투여는 염증을 억제한다.
조성물
본원에서, 용어 "조성물" 및 "약학적 조성물"은, 일부 구현예에서, 동일한 특징 및 의미를 가지며 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 개시한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 약학적 조성물은 유전자 변형된 면역 세포의 증식율을 유지하거나 또는 증가시키기 위한 것이다. 추가적인 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포의 증식율을 유지하거나 또는 증가시키기 위한 방법은 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발생을 낮추거나 또는 저해하는 것을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 세포 요법의 효능을 높이기 위한 약학적 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 면역 세포 요법의 효능을 높이기 위한 방법에 사용되는 조성물은 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발생을 낮추거나 또는 저해하는 것을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 개체에서 암 또는 종양의 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법을 위한 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 발병 저하, 개선 또는 완화하기 위한 방법에 사용되는 조성물은 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발생을 낮추거나 또는 저해하는 것을 더 포함한다.
다른 구현예에서, 약학적 조성물은 유전자 변형된 면역 세포 또는 이의 유전자 변형된 수용체를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 T-세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 키메라 항원 수용체 CAR T-세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 키메라 항원 수용체 TCR T-세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 세포독성 T 림프구를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 수지상 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 자연 살상 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 수용체는 유전자 변형된 T-세포 수용체를 포함한다.
다른 구현예에서, 약학적 조성물은 초기 세포자살성 세포 집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 세포자살성 세포 상층액을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 유전자 변형된 면역 세포 또는 이의 유전자 변형된 수용체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 유효량의 CAR T-세포 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 유효량의 TCR T-세포 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 유효량의 세포독성 T-세포 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 유효량의 유전자 변형된 수지상 세포 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 유효량의 유전자 변형된 자연 살상 세포 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 유효량의 유전자 변형된 T-세포 수용체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 유효량의 초기 세포자살성 세포 집단을 약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 본원에 기술된 유효량의 세포자살성 세포 상층액을 약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 병태 또는 질환은 종양 또는 암이다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 바와 같이 대상 단백질 또는 펩타이드에 결합하는, 유전자 변형된 면역 세포 또는 이의 수용체, 예를 들어 CAR T 세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 바와 같이 대상 단백질 또는 펩타이드를 인지하여 결합하는, 유전자 변형된 면역 세포 또는 이의 수용체, 예를 들어 TCR T-세포를 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구현예에서, 대상 단백질 또는 펩타이드는 종양 항원 또는 이의 단편을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시되고 본원에 개시된 방법에 사용되는 조성물은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은, 본원에 개시된 방법에, 예를 들어 개체에서 암 또는 종양 치료, 예방, 증식 저해, 질환 진행 지연, 종양 부하 감소 또는 발병 저하, 또는 이들의 임의 조합 방법에 사용된다.
다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포 또는 이의 유전자 변형된 수용체를 유효량으로 포함하는 조성물은, 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물과 동일한 조성물일 수 있다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 또는 TCR T-세포 또는 세포독성 T-세포 또는 유전자 변형된 수지상 세포 또는 유전자 변형된 자연 살상 세포를 유효량으로 포함하는 조성물은 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물과 동일한 조성물일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포 수용체를 유효량으로 포함하는 조성물은 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물과 동일한 조성물일 수 있다. 다른 구현예에서, CAR T-세포, TCR T-세포, 세포독성 T-세포, 자연 살상 세포 또는 수지상 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 유전자 변형된 면역 세포를 유효량으로 포함하는 조성물은 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물과 동일한 조성물이 아닐 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포), 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 중 어느 하나, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 유전자 변형된 T-세포 수용체를 발현하는 T-세포 (TCR T-세포)와 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포 수용체를 유효량으로 포함하는 조성물은 세포자살성 세포 집단 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물과 동일한 조성물이 아니다.
다른 구현예에서, 조성물에 포함된 세포자살성 세포는 세포자살성 세포를 초기 세포자살성 상태로 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물에 포함된 세포자살성 세포는 제3자 공여자 세포 풀이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물에 포함되는 세포자살성 세포의 상층액은 초기 세포자살성 세포로부터 수집된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물에 포함되는 세포자살성 세포의 상층액은 제3자 공여자 세포 풀로부터 수집된다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T-세포를 포함하는 조성물은, 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T-세포, 및 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T-세포 및 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 TCR T-세포를 포함하는 조성물은 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 TCR T-세포 및 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 TCR T-세포 및 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은, 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 수지상 세포를 포함하는 조성물은, 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 수지상 세포 및 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은, 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 수지상 세포 및 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은, 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 NK 세포를 포함하는 조성물은, 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 NK 세포, 및 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은, 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 NK 세포, 및 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은, 사이토카인 방출 증후군을 앓고 있거나 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 환자에서 사이토카인 방출을 예방, 억제 또는 조절하기 위한 부가적인 약학적 조성물을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 부가적인 약학적 조성물은 CTLA-4 차단제, 일 구현예에서, 이필리무맵 (ipilimumab)을 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 약학적 조성물은 본원에 개시된 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체를 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 약학적 조성물은 본원에 개시된 텔루륨계 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 약학적 조성물은 본원에 개시된 면역조절제를 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 약학적 조성물은 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 텔루륨계 화합물, 또는 면역 조절 화합물, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T-세포를 포함하는 조성물, 및 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 또는 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물 또는 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은, 단일 조성물을 구성한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T-세포를 포함하는 조성물, 및 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 또는 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은 복수의 조성물을 구성하며, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, CAR T-세포, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 또는 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 각각이 별개의 조성물을 구성한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, CAR T-세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은 복수의 조성물을 구성하며, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, CAR T-세포, CTLA-4 차단제, 또는 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합, 또는 이들의 임의 조합은 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T-세포 조성물에 존재하고, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액은 별개의 조성물을 구성한다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 TCR T-세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액, 텔루륨계 화합물 또는 면역조절제 중 임의의 하나를 포함하는 약학적 조성물은, 단일 조성물을 구성한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 TCR T-세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액, 텔루륨계 화합물 또는 면역조절제 또는 이들의 임의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 약학적 조성물은, 복수의 조성물들을 구성하며, 각각의 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, TCR T-세포, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, 텔루륨계 화합물 또는 면역조절제 또는 이들의 임의 조합은 별개의 조성물을 구성한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, TCR T-세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은 복수의 조성물을 구성하며, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, TCR T-세포, CTLA-4 차단제, 또는 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합, 또는 이들의 임의 조합은 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 TCR T-세포 조성물에 존재하고, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액은 별개의 조성물에 포함된다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들 수지상 세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 또는 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 또는 면역 조절제 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은 단일 조성물을 구성한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 수지상 세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 또는 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은, 복수의 조성물들을 구성하며, 각각의 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, 수지상 세포, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합은 별개의 조성물을 구성한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, 수지상 세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은, 복수의 조성물들을 구성하며, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, 수지상 세포, CTLA-4 차단제, 또는 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합, 또는 이들의 임의 조합은 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 수지상 세포 조성물에 존재하고, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액은 별개의 조성물에 포함된다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 NK 세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 또는 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 또는 면역 조절제 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은 단일한 조성물을 구성한다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 NK 세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 또는 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은, 복수의 조성물들을 구성하며, 각각의 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, NK 세포, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합은 별개의 조성물을 구성한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, NK 세포를 포함하는 조성물과, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포 상층액, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물은, 복수의 조성물들을 구성하며, 유전자 변형된 면역 세포, 일 구현예에서, NK 세포, CTLA-4 차단제, 또는 α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합, 또는 이들의 임의 조합은 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 NK 세포 조성물에 존재하고, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액은 별개의 조성물에 포함된다.
일부 구현예에서, 조성물은 세포자살성 세포 및 부가적인 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 세포자살성 세포 및 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 세포자살성 세포 및 RtX 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포, 및 항체 또는 이의 기능성 단편은 별개의 조성물에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포, 및 항체 또는 이의 기능성 단편은 동일한 조성물에 포함될 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, "약학적 조성물"이 본원에 기술되는 하나 이상의 활성 성분의 조제물을 생리학적으로 적절한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 물질과 함께 포함할 수 있음을 알 것이다. 약학적 조성물의 목적은 화합물의 유기체로의 투여를 용이하게 하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 종양 또는 암을 치료, 예방, 증식 저해 또는 발병을 감소시키기 위한 약학적 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존성을 높이기 위한 약학적 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 종양 또는 암의 크기를 줄이거나 또는 증식율을 낮추기 위한 약학적 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 암 또는 종양을 앓고 있는 개체에서 종양 부하를 감소시키기 위한 약학적 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 암 또는 종양을 앓고 있는 개체에서 질환의 진행을 지연하기 위한 약학적 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 암 또는 종양을 앓고 있는 개체에서 암 또는 종양의 발병을 감소시키기 위한 약학적 조성물을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 암 또는 종양을 앓고 있는 개체에서 암 또는 종양의 크기를 줄이거나 및/또는 증식율을 낮추기 위한 약학적 조성물을 개시한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 기술된 초기 세포자살성 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 기술된 초기 세포자살성 세포 집단과 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, "생리학적으로 허용가능한 담체", "약제학적으로 허용가능한 담체", "생리학적으로 허용가능한 부형제", 및 "약제학적으로 허용가능한 부형제"라는 표현이 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 유기체에 유의한 자극을 유발하지 않으며 투여되는 활성 성분의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 포괄할 수 있음을, 알 것이다
당해 기술 분야의 당업자라면, "부형제"가 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 포괄할 수 있음을 알 것이다. 일 구현예에서, 부형제는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당류, 다양한 타입의 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
약물의 제형화 및 투여 기법은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA 최신판에서 확인되며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 조성물들은 동시에 투여된다. 대안적인 구현예에서, 조성물들은 서로 다른 시기에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 유전자 변형된 면역 세포 또는 이의 수용체를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 CAR-T-세포를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 세포독성 T-세포를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 자연 살상 세포를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 수지상 세포를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 유전자 변형된 T-세포 수용체를 주입하기 전에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은 유전자 변형된 면역 세포 또는 이의 수용체의 주입 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은 CAR-T-세포를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은 세포독성 T-세포를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은 자연 살상 세포를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은 수지상 세포를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물은 유전자 변형된 T-세포 수용체를 주입하기 전에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 유전자 변형된 면역 세포 또는 그 수용체를 주입하기 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 유전자 변형된 면역 세포 또는 그 수용체를 주입하기 약 24시간 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 CAR T-세포, 또는 세포독성 T-세포, 또는 자연 살상 세포, 또는 수지상 세포 또는 유전자 변형된 T-세포 수용체를 주입하기 약 24시간 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 CAR T-세포 또는 세포독성 T-세포, 또는 자연 살상 세포, 또는 수지상 세포 또는 유전자 변형된 T-세포 수용체를 주입하기 약 24시간 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 조성물들은 동시에 투여된다. 대안적인 구현예에서, 조성물들은 서로 다른 시점에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항체 또는 그 단편, 또는 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물을 투여하기 전에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은, 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여하기 전, 약 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간 20시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여하기 전, 약 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간 20시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 전에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물을 투여하기 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물을 투여하기 약 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주 전에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 주입 후 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물 다음으로 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 투여 후 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물의 투여 후 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물 다음으로 약 24시간 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여한 후 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여한지 약 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간 20시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여한지 약 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간 20시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 후에 투여된다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물 다음으로 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 14일 또는 15일 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물은 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물 다음으로 약 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 CAR T-세포와 독립적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물은 부가적인 물질과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 부가적인 물질은 항체이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 치료학적 조성물 (therapeutic composition)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 치료학적 효능 (therapeutic efficacy)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 2회 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 3회 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 4회 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 4회 이상 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 4회 보다 많은 횟수로 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T-세포는 1회 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 2회 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 3회 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 4회 투여된다. 다른 구현예에서, CAR T-세포는 4회 이상 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 4회 보다 많은 횟수로 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 치료학적 조성물이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 치료학적 효능을 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명은, CAR T-세포를 단독으로 포함하는 조성물과 비교해 염증성 사이토카인 또는 케모카인 방출 감소를 제공하지만, CAR T-세포를 단독으로 포함하는 조성물과 비슷한 세포독성을 가진, 조성물을 개시한다.
제형
초기 세포자살성 세포 집단을 포함하는 본원에 개시된 약학적 조성물은, 선택된 pH로 완충될 수 있는, 무균성 (sterile) 액체 제제, 예를 들어 등장성 수성 용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 편리하게 제공될 수 있으며, 액체 제제가 겔제, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 일반적으로 조제하기 더 용이하다. 또한, 액체 조성물은, 특히 주사에 의해, 투여하기 좀 더 편리하다. 반면, 점성 조성물은 특정 조직과 더 긴 접촉 기간을 제공하도록 적절한 점도 범위로 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어, 물, 염수, 포스페이트 완충화된 염수, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유한, 용매 또는 분산 매질일 수 있는, 담체를 포함할 수 있다.
무균성 주사 용액은 본원에 개시된 방법을 실시하는데 이용되는 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 집단을, 필수량의 적절한 용매 중에, 필요에 따라 다양한 함량의 다른 성분들을 첨가하여 투입함으로써, 제조할 수 있다. 이러한 조성물은 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로스 등과 같은 적절한 담체, 희석제 또는 부형제와의 혼합물일 수 있다. 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 조성물은 투여 경로, 그리고 원하는 제제에 따라, 습윤제, 분산제 또는 유화제 (예, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화제 또는 점성 강화 첨가제, 보존제, 착향제, 착색제 등과 같은 보조 성분을 포함할 수 있다. "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985와 같은 표준 문헌을 과도한 실험 없이도 적절한 제제를 제조하기 위해 참조할 수 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제 등의, 조성물의 안정성 및 무균성을 강화하는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 확보할 수 있다. 주사용 약학적 형태의 장기간 흡수 (prolonged absorption)는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 달성할 수 있다. 그러나, 본원에 따르면, 사용되는 임의의 비히클, 희석제 또는 첨가제는 유전자 변형된 면역반응성 세포 또는 이의 전구 세포와 혼용가능하여야 할 것이다.
본원에 기술된 조성물 또는 제형은 등장성일 수 있으며, 즉 이는 혈액 및 눈물과 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 본원에 개시된 조성물의 바람직한 등장성은 염화나트륨 또는 기타 약제학적으로 허용가능한 물질, 예를 들어, 덱스트로스, 붕산, 주석산나트륨, 프로필렌글리콜 또는 기타 무기 또는 유기 용질을 사용하여 달성할 수 있다. 나트륨 이온을 포함하는 완충액의 경우 염화나트륨이 특히 바람직할 수 있다.
조성물의 점성은, 필요에 따라, 약제학적으로 허용가능한 증점제를 사용하여 선택된 수준으로 유지시킬 수 있다. 메틸셀룰로스가 쉽고 경제적으로 이용가능하며 취급이 용이하기 때문에 바람직할 수 있다.
다른 적절한 증점제로는, 예를 들어, 잔탄검, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 카보머 등을 포함한다. 증점제의 바람직한 농도는 선택 물질에 따라 결정될 것이다. 중요한 점은 선택된 점도를 달성할 정도의 양을 사용하여야 한다는 것이다. 명백하게도, 적절한 담체 및 기타 첨가제의 선택은 실제 투여 경로 및 구체적인 투약 형태의 특성, 예를 들어, 액체 투약 형태 (예, 조성물이 용액, 현탁액, 겔 또는 기타 액체 형태, 예를 들어 경시적인 방출 형태 (time release form) 또는 액체-충진된 형태로 제형화되는지 여부)에 따라 결정될 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위해, 조성물 또는 제형의 구성 성분들이 화학적으로 불활성이도록 선택되어야 하며, 본원에 기술된 초기 세포자살성 세포 집단의 효능 또는 생존성에 영향을 미치지 않을 것임을 인지할 것이다. 또한, 이는 화학적 및 약학적 원리에 익숙한 당업자에게 어떠한 문제도 되지 않거나, 또는 본원 또는 본원에 인용된 문헌으로부터 단순한 실험 (과도한 실험을 수반하지 않음)에 의해 또는 표준 문헌을 참조하여 문제를 쉽게 회피할 수 있을 것이다.
본원에 개시된 유전자 변형된 면역반응성 세포의 치료학적 용도와 관련된 한가지 고려 사항은 최적의 효과를 달성하기 위해 필요한 세포의 양이다. 세포의 투여량은 치료되는 개체에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 유전자 변형된 면역반응성 세포 104 내지 1010, 105 내지 109 또는 106 내지 108개가 인간 개체에 투여된다. 보다 효과적인 세포는 훨씬 더 적은 수로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 유전자 변형된 면역반응성 세포 적어도 약 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108 및 5 x l08개가 인간 개체에 투여된다. 유효량에 고려되는 정확한 결정은 특정 개체의 신체 크기, 연령, 성별, 체중 및 상태 등의 개체별 인자에 기초할 수 있다. 투여량은 본원 및 당해 기술 분야의 지식으로부터 당해 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 특정될 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면 조성물 내, 그리고 본원에 개시된 방법에서 투여될 세포 및 선택 첨가제, 비히클 및/또는 담체의 양을 용이하게 결정할 수 있다. 전형적으로, 임의의 첨가제 (활성 세포(들) 및/또는 물질(들)에 추가하여)는 포스페이트 완충화된 염수 중의 0.001 내지 50% (중량) 용액으로 존재하며, 활성 성분은 약 0.0001 내지 약 5 wt%, 다른 구현예에서 약 0.0001 내지 약 1 wt%, 또 다른 구현예에서 약 0.0001 내지 약 0.05 wt% 또는 약 0.001 내지 약 20 wt%, 추가의 구현예에서, 약 0.01 내지 약 10 wt%, 다른 구현예에서, 약 0.05 내지 약 5 wt%와 같이, 수 ㎍ 내지 mg 수준으로 존재한다. 물론, 동물 또는 인간에 투여할 임의의 조성물 및 임의의 구체적인 투여 방법의 경우, 이는 다음과 같은 인자들에 의해 결정하는 것이 바람직하다: 적절한 동물 모델, 예를 들어, 마우스와 같은 설치류에서 치사량 (LD) 및 LD50 결정에 따른, 독성; 그리고 적절한 반응을 이끌어내는 조성물 (들)의 용량, 조성물 내 성분의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기. 이러한 결정은 당해 기술 분야의 당업자의 지식, 본 발명의 내용 및 본원에 인용된 문헌으로부터 과도한 실험없이 이루어진다. 그리고, 과도한 실험없이 순차적 투여 시기를 특정할 수 있다.
핵산 서열, 벡터, 세포
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 본원에 기술된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 서열을 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 개시한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 본원에 기술된 유전자 변형된 T-세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 단리된 핵산 서열을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 유전자 변형된 T-세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 개시한다.
면역반응성 세포 (예, T-세포, CTL 세포, NK 세포)의 유전자 변형은 실질적으로 동종의 세포 조성에 재조합 DNA 구조체를 형질도입함으로써 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 구조체를 세포에 도입하기 위해 레트로바이러스 벡터 (감마-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 중 어느 하나)를 사용한다. 예를 들어, 항원 (예, 종양 항원, 또는 이의 변이체 또는 단편)에 결합하는 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 레트로바이러스 벡터에 클로닝할 수 있으며, 이의 내인성 프로모터로부터, 레트로바이러스의 긴 말단 반복체로부터 또는 대상 타겟 T-세포 타입에 특이적인 프로모터로부터 발현을 유도할 수 있다. 비-바이러스성 벡터도 물론 사용할 수 있다.
비-바이러스성 방식 역시 세포에서 단백질을 발현시키기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 핵산을 리포펙틴의 존재 하에 (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al, Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al, Methods in Enzymology 101 :512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드-폴리라이신 접합체 (asialoorosomucoid-polylysine conjugation)의 존재 하에 (Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263: 14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989) 투여하거나, 또는 외과적 조건 하의 미세 주입 (Wolff et al., Science 247: 1465, 1990)에 의해, 핵산 분자를 세포에 도입할 수 있다. 유전자를 전달하기 위한 또 다른 비-바이러스성 수단으로는 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기천공 및 원형질 융합을 이용한 시험관내 형질감염 등이 있다. 또한, 세포내 DNA를 전달하는데 리포솜이 잠재적으로 유익할 수 있다. 또한, 정상 유전자를 개체의 환부 조직으로 이식하는 것 역시, 생체외 배양가능한 세포 타입 (예, 자가 또는 이종의 일차 세포 또는 이의 자손)에 정상 핵산을 전달한 다음, 세포 (또는 이의 자손)를 타겟 조직에 주사하거나 또는 전신 주사함으로써, 달성할 수 있다. 재조합 수용체도 트랜스포자제 (transposase) 또는 타겟 뉴클레아제 (예, 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease), 메가뉴클레아제 또는 TALE 뉴클레아제)를 사용하여 유래하거나 또는 수득할 수 있다. 일시적 발현은 RNA 전기천공에 의해 달성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 요법에 사용하기 위한 cDNA 발현은 임의의 적절한 프로모터 (예, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 40 (SV40) 또는 메탈로티오네인 프로모터)로부터 지시될 수 있으며, 임의의 적절한 포유류 조절 인자 또는 인트론 (예, 연장 인자 la 인핸서/프로모터/인트론 구조)에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 필요에 따라, 특정 세포 타입에서 유전자 발현을 우선적으로 지시하는 것으로 알려진 인핸서를 사용해 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 사용되는 인핸서는, 비-제한적인 예로, 조직- 또는 세포-특이적인 인핸서로서 특정되는 것을 포함할 수 있다. 다른 예로, 게놈 클론을 치료학적 구조체로 사용할 경우, 조절은 동족 (cognate) 조절 서열에 의해, 또는 필요에 따라, 전술한 임의의 프로모터 또는 조절 인자 등의, 이종의 소스로부터 유래되는 조절 서열에 의해 매개될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 개시한다.
이용 방법
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 개체에서 암 또는 종양을 치료, 예방, 증식 저해, 질환의 진행 지연, 종양 부하 감소 또는 발병 저하, 또는 이들의 임의 조합을 달성하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 종양 또는 암의 크기 또는 증식율을 감소시키는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 종양 또는 암을 앓고 있는 개체의 생존성을 높이는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 이의 조성물의 사용은 유전자 변형된 면역 세포 요법, 예를 들어 비-제한적인 예로, CAR T 세포 요법의 효능을 강화한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법으로서, 부가적인 물질을 포함하는 조성물 및 유전자 변형된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 부가적인 물질이 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하고, 이러한 방법으로 유전자 변형된 면역 세포 투여 및 부가적인 물질 비-투여 개체와 비교해 개체에서 암 또는 종양이 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화되는, 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 상기한 유전자 변형된 면역 세포는 유전자 변형된 T-세포, 세포독성 T-세포, Treg 세포, 작동자 T-세포, 헬퍼 T-세포, NK 세포 또는 수지상 세포를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 부가적인 물질을 포함하는 조성물 및 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포)를 투여하는 단계를 포함하며, 상기한 부가적인 물질이 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 유전자 변형된 면역 세포 투여 및 부가적인 물질 비-투여 개체와 비교해, 개체에서 암 또는 종양이 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 완화 또는 개선되는, 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법을 개시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 부가적인 물질을 포함하는 조성물 및 유전자 변형된 T-세포 수용체 세포 (TCR T-세포)를 투여하는 단계를 포함하고, 상기한 부가적인 물질이 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하며, 유전자 변형된 면역 세포 투여 및 부가적인 물질 비-투여 개체와 비교해 개체에서 암 또는 종양이 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 완화 또는 개선되는, 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법을 개시한다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물의 투여는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포의 투여에 의한 암 또는 종양의 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화 효능을 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 부가적인 물질, 또는 이의 조성물의 투여는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포의 투여에 의한 암 또는 종양의 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화 효능을 감소시키지 않는다.
다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물의 투여는 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포의 투여에 의한 암 또는 종양의 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화 효능을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 부가적인 물질, 또는 이의 조성물의 투여는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포의 투여에 의한 암 또는 종양의 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화 효능을 증가시킨다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포 암 요법의 효능을 증가시키는 방법은 유전자 변형된 면역 세포; 및 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 부가적인 물질, 또는 이의 조성물들을 투여하는 것을 포함하며, 효능은 부가적인 물질의 비-투여 개체와 비교해 증가된다. 다른 구현예에서, 상기한 유전자 변형된 면역 세포는 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 CD4+ T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 T-세포이다. 다른 구현예에서, T-세포는 나이브 CD8+ T-세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 자연 살상 (NK) 세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포는 수지상 세포이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 세포독성 T 림프구 (CTL 세포)이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 조절성 T-세포 (Treg)이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포이다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T-세포는 유전자 변형된 T-세포 수용체 세포 (TCR T-세포)이다. 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법의 효능을 증가시키는 방법은 유전자 변형된 면역 세포; 및 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 부가적인 물질, 또는 이들의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 효능이 부가적인 물질의 비-투여 개체와 비교해 증가된다.
다른 구현예에서, 본원의 방법은, 면역 암 요법 투여 및 부가적인 물질 비-투여 개체에서의 전-염증성 사이토카인의 수준과 비교해, 하나 이상의 전-염증성 사이토카인의 생산 수준을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 본원의 방법은, 유전자 변형된 면역 세포 암 요법 투여 및 부가적인 물질 비-투여 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 발생을 낮추거나 또는 저해한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 IL-6를 감소시킨다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 면역 암 요법을 시술 중이나 부가적인 물질을 투여하지 않은 개체에서의 사이토카인의 수준과 비교해 하나 이상의 사이토카인의 생산을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 부가적인 물질은 세포자살성 세포이다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 세포자살성 세포의 상층액이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 IL-2를 증가시킨다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에서 사이토카인에 대한 용어 "생산"은 사이토카인의 발현뿐 아니라 세포로부터 사이토카인의 방출을 포괄할 수 있음을 알 것이다. 일 구현예에서, 사이토카인 생산 증가는 세포로부터 사이토카인의 방출 증가로 이어진다. 다른 구현예에서, 사이토카인의 생산 감소는 세포로부터 사이토카인의 방출 감소로 이어진다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 하나 이상의 사이토카인의 방출을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 IL-6의 방출을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 하나 이상의 사이토카인의 방출을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 IL-2의 방출을 증가시킨다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 종양 세포이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 T-세포이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 면역 세포이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 대식세포이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 B 세포 림프구이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 비만 세포이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 내피 세포이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 섬유모세포이다.　다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 방출하는 세포는 기질 세포 (stromal cell)이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 사이토카인의 수준이 세포 주변 환경에 따라 사이토카인 방출성 세포에서 증가 또는 감소될 수 있음을 알 것이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 하나 이상의 사이토카인의 방출을 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 하나 이상의 사이토카인의 방출을 유지시킨다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 하나 이상의 사이토카인의 방출을 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 IL-2의 방출을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 IL-2R의 방출을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 IL-2의 방출 수준을 유지시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 IL-2R의 방출 수준을 유지시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 IL-2R의 방출 수준을 감소시키지 않는다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 IL-2의 방출 수준을 유지시키거나 또는 증가시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 IL-2R의 방출 수준을 유지 또는 증가시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 부가적인 물질은 IL-2R의 방출 수준을 감소시키지 않는다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 부가적인 물질은 IL-6의 방출을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 부가적인 물질은 IL-2의 방출 수준을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 감소시키지 않으며, IL-6의 방출은 감소시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 부가적인 물질은 IL-2R의 방출 수준을 유지시키거나, 증가시키거나 또는 감소시키지 않으며, IL-6의 방출은 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T 세포 암 요법의 효능을 높이는 방법은 개체에서 IL-6의 수준을 감소시키는 것을 포함하며, 이는 CAR T 세포와, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 부가적인 물질, 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 효능이 부가적인 물질 비-투여 개체와 비교해 증가된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T 세포 암 요법의 효능을 높이는 방법은 개체에서 IL-2의 수준을 증가시키는 것을 포함하며, 이는 CAR T 세포와, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 부가적인 물질, 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 효능이 부가적인 물질 비-투여 개체와 비교해 증가된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T 세포 암 요법의 효능을 높이는 방법은 CAR T 세포의 증식을 증가시키는 것을 포함하며, 이는 CAR T 세포와, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포로부터의 상층액, CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 부가적인 물질, 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, CAR T 세포의 증식 및 효능이 부가적인 물질 비-투여 개체와 비교해 증가된다.
일 구현예에서, CAR T 세포 암 요법의 효능을 높이는 방법은 개체에서 사이토카인의 생산을 낮추거나 또는 저해하며, 이러한 방법은 CAR T 세포를 포함하는 조성물 및 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역조절제 또는 이들의 임의 조합, 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법은 CAR T 세포를 포함하는 조성물 및 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역 조절제 또는 이들의 임의 조합, 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 CAR T 세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 치료하는 방법을 개시한다.
다른 구현예에서, 암 또는 종양을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 완화 또는 개선하는 방법은 개체에서 사이토카인의 생산을 낮추거나 또는 저해하며, 이 방법은 CAR T 세포를 포함하는 조성물 및 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역조절제 또는 이들의 임의 조합, 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 또는 종양의 치료 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 또는 종양의 예방 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 또는 종양의 저해 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 또는 종양의 감소시키는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 또는 종양의 개선 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 또는 종양을 완화하는 방법을 개시한다.
일 구현예에서, 본 발명은 면역요법 중에 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법 중에 유전자 변형된 면역 세포의 증식율을 유지하거나 또는 높이는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 이러한 유전자 변형된 면역 세포는 T-세포, 나이브 T-세포, 나이브 CD4+ T-세포, 나이브 CD8+ T-세포, 자연 살상 (NK) 세포, 수지상 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL 세포), 조절성 T 세포 (Treg), 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 또는 유전자 변형된 T 세포 수용체 (TCR) 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 면역요법 중에 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법 중에 CAR T 세포의 증식율을 유지하거나 또는 높이는 방법을 개시한다.
다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포의 증식율을 유지하거나 또는 높이는 방법은 면역요법의 효능을 낮추거나 또는 저해하지 않는다. 예를 들어, 다른 구현예에서, CAR T 세포의 증식율을 유지 또는 높이는 방법은 CAR T 세포 암 요법의 효능을 낮추거나 또는 저해하지 않는다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T 세포의 증식을 유지 또는 높이는 방법은 개체에서 사이토카인 생산을 낮추거나 또는 저해하지 않는다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 본원에 기술된 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액, 및 하나 이상의 CTLA-4-차단제, 예를 들어 이필리무맵의 병용 요법을 이용한다. 일 구현예에서, CTLA-4는 자기-관용을 유지하는데 도움이 되는 T-세포 활성화에 대한 강력한 저해제이다. 일 구현예에서, 항-CTLA-4 차단제, 다른 구현예에서, 항체의 투여는 T-세포 활성화에 대한 순 효과 (net effect)를 발생시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 세포자살성 세포, CAR T 세포 및 하나 이상의 CTLA-4-차단제를 포함하는 병용 요법을 이용한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법의, 그리고 이에 사용하기 위한 폴리펩타이드는 비-변형된 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 보존적인 아미노산 치환을 포함한다. 다른 경우에, 폴리펩타이드는 비-보존적인 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 경우에, 상기한 변형을 가진 폴리펩타이드는 아미노산 치환이 없는 폴리펩타이드와 비교해 증가된 안정성 또는 긴 반감기를 나타낸다.
일부 구현예에서, "치료하는"은 치료학적 처리 (therapeutic treatment)를 포함하며, "예방하는"은 예방학적 또는 방지 조치를 포함하며, 목적은 본원에 전술한 타겟화된 병리적 상태 또는 장애를 방지 또는 완화하기 위한 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 치료는 질환, 장애 또는 병태와 관련된 증상들에 대해 직접 영향을 미치거나 또는 치유하거나, 억제, 저해, 방지, 중증도 저하, 발병 지연, 경감, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, "치료", "개선" 및 "완화"는 특히 진행을 지연, 관해를 촉진, 관해를 유도, 관해를 증진, 회복을 가속화, 대체 치료제의 효능 증가 또는 이에 대한 내성 저하, 또는 이들의 조합을 의미한다. 일부 구현예에서, "예방"은, 특히, 증상의 개시를 지연, 질환의 재발 방지, 재발 에피소드의 횟수 또는 빈도 저하, 증상성 에피소드 사이의 잠복기 연장, 또는 이들의 조합을 의미한다. 일부 구현예에서, "억제" 또는 "저해"는, 특히, 증상의 중증도 저하, 급성 에피소드의 중증도 저하, 증상의 개수 감소, 질환-관련 증상의 발병 저하, 증상의 잠복성 저하, 증상 개선, 2차 증상 저하, 2차 감염 저하, 환자의 생존 연장 또는 이들의 조합을 의미한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "항원 인지 수용체"가 항원 결합에 반응하여 면역 세포 (예를 들어, T-세포)를 활성화할 수 있는 수용체를 포괄할 수 있음을 알 것이다. 예시적인 항원 인지 수용체는, 종양 항원-결합성 도메인이 면역 세포 (예, T 세포)를 활성화할 수 있는 세포내 신호전달 도메인과 융합된, 키메라 항원 수용체 또는 천연 또는 내인성 T 세포 수용체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존성을 높이며, 개체에 초기 세포자살성 세포 집단을 투여하는 것을 포함하며, 이 방법은 개체의 생존성을 높인다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "질환"이 세포, 조직 또는 장기의 정상 기능을 방해하거나 또는 해치는 임의의 병태 또는 장애를 포괄함을 알 것이다. 질환의 예로는 신생물증 또는 세포의 병원체 감염 등이 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "유효량"이 치료학적 효과를 가지기에 충분한 양을 포함함을 알 것이다. 일부 구현예에서, "유효량"은 신생물의 지속적인 증식, 생장 또는 전이 (예, 침습 또는 이동)를 저지, 개선 또는 저해하기에 충분한 양이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "신생물"이 세포 또는 조직의 병리학적 증식과 이후의 다른 조직 또는 장기로의 이동 또는 침습을 특징으로 하는 질환을 포괄함을 알 것이다. 신생물 증식은 전형적으로 비-통제성 및 진행성이며, 정상 세포의 증폭을 유도하지 않거나 또는 중단을 유발할 수 있는 조건에서 발생한다. 신생물은 다양한 세포 타입, 조직 또는 장기, 비-제한적인 예로, 방광, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 교세포, 식도, 난관, 담낭, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관지, 비뇨생식기, 요관, 요도, 자궁 및 질로 이루어진 군으로부터 선택되는 장기 또는 이들의 조직 또는 세포 타입에 영향을 미칠 수 있다. 신생물로는 육종, 암종 또는 형질세포종 (형질 세포의 악성 종양)과 같은 암 등이 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "병원체"가 질환을 유발할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 또는 원생동물을 망라할 수 있음을 알 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "종양 항원" 또는 "종양 관련 항원"이 정상적인 또는 비-IS 신생물 세포와 비교해, 종양 세포에서 유일하게 또는 차별적으로 발현되는 항원 (예, 폴리펩타이드)을 망라할 수 있음을 알 것이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법과 관련하여, 종양 항원은 항원 인지 수용체 (예, CD19, MUCI)를 통해 면역 반응을 활성화 또는 유도할 수 있거나, 또는 수용체-리간드 결합 (예, CD47, PD-L1/L2, B7.1/2)을 통해 면역 반응을 억제할 수 있는, 종양에 의해 발현되는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "바이러스 항원"이 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스에 의해 발현되는 폴리펩타이드를 포괄할 수 있음을 알 것이다.
용어 "포함하다 (comprise)", "포함하는 (comprising)"은 미국 특허법에서 이들 용어로 간주되는 광의의 의미를 가지는 것으로 의도되며, "등이 있다 (include)", "를 비롯하여 (including)" 등을 의미할 수 있다. 마찬가지로, 용어 "로 구성되는" 및 "필수적으로 구성되는"은 미국 특허법에서 이들 용어로 간주되는 의미를 가진다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 활성 성분 또는 특정 단계를 포함하거나, 활성 성분 또는 특정 단계로 구성되거나, 또는 활성 성분 또는 특정 단계로 필수적으로 구성되는 것으로 간주된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "치료"가 치료 중인 개체 또는 세포의 질환 코스를 변형시키기 위한 시도로서 임상적인 개입을 포괄할 수 있으며, 예방을 위해 또는 임상적인 병리 코스 중에 수행될 수 있음을 알 것이다. 치료의 치료학적 효과로는, 비-제한적인 예로, 질환의 발병 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 경과 감소, 전이 방지, 질환의 진행 속도 저하, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 관해 또는 예후 개선 등이 있다. 치료는, 질환 또는 장애의 진행을 방지함으로써, 병에 걸렸거나 또는 진단받은 개체 또는 장애가 의심되는 개체에서 장애로 인한 쇠약을 예방할 수 있으며, 또한 치료는 장애 위험이 있거나 또는 장애가 의심되는 개체에서 장애의 증상 또는 장애의 개시를 방지할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "개체"가 척추동물, 일부 구현예에서, 포유류, 일부 구현예에서, 인간을 포함할 수 있음을 알 것이다. 개체는 또한, 일부 구현예에서 소, 양, 말, 고양이, 개 및 실험 동물, 예를 들어, 마우스, 랫, 게르빌루스쥐, 햄스터 등을 의미할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 CAR이 대상 펩타이드에 대한 것인 CAR T 세포를 개시한다. 일부 구현예에서, CAR은 대상 펩타이드에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 대상 펩타이드를 타겟팅한다. 다른 구현예에서, CAR은 대상 펩타이드를 활성화한다. 다른 구현예에서, CAR은 대상 펩타이드의 리간드이다. 다른 구현예에서, 대상 펩타이드는 CAR의 리간드이다. 이들 구현예들 각각은 본원에 기술된 일부로서 간주된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 개시된 면역 세포는 T-세포가 아니다. 다른 구현예에서, 본 발명에 개시된 면역 세포는 NK 세포가 아니다. 다른 구현예에서, 본 발명에 개시된 면역 세포는 CTL이 아니다. 다른 구현예에서, 본 발명에 개시된 면역 세포는 조절성 T-세포가 아니다. 다른 구현예에서, 면역 세포는 인간 배아 줄기 세포가 아니다. 다른 구현예에서, 면역 세포는 림프계 세포가 분화될 수 있는 만능성 줄기 세포가 아니다.
한가지 면역요법 접근법은 환자 자신의 면역 세포를 조작하여 종양을 인지 및 공격할 유전자 변형된 면역 세포를 구축하는 것을 수반한다. 본원에 기술된 바와 같이, 면역 세포를 수집하여, 유전자 변형시켜, 예를 들어, 면역 세포, 예를 들어 T 세포가 종양 또는 암 세포 상의 특이적인 단백질 항원을 인지할 수 있게 하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 세포 표면 상에 형성한다. 그런 후, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T 세포의 증폭된 집단 (expanded population)을 환자에게 투여한다. 일부 구현예에서, 투여되는 세포는 환자 체내에서 증폭되고, 표면에 항원을 가진 암 및 종양 세포를 인지 및 살상한다. 다른 구현예에서, 투여된 세포는 환자 체내에서 증폭되고, 암 및 종양 세포의 사멸을 유도하는 종양-관련 항원을 인지하고 살상한다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍의 발생을 저해하거나 또는 감소시키는 방법, 및 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하는 개체에서 사이토카인의 생산을 감소시키거나 또는 저해하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 치료하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 예방하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 완화하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 CAR T-세포 암 요법이 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 개선하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물의 투여는 CAR T-세포 요법의 효능을 감소시키지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 세포자살성 세포를 포함하는 조성물 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포) 암 요법을 시술 중인 개체에서 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발생을 저해하거나 또는 감소시키는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 발생 저해 또는 저하는, 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 암 요법 시술 중 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 투여 중인 개체에서, 사이토카인의 수준을 측정함으로써, 확인한다. 다른 구현예에서, 사이토카인의 농도 측정값은 CAR T-세포 암 요법 비-실시 개체에서의 사이토카인 수준과 비교된다. 다른 구현예에서, 사이토카인의 농도 측정값은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 비-투여 개체에서의 사이토카인 수준과 비교된다. 또 다른 구현예에서, 사이토카인 농도 측정값은 대조군 개체와 비교된다.
다른 구현예에서, 개체에서 전-염증성 사이토카인의 수준이, CAR T-세포 암 요법 시술 중이나 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물의 비-투여 개체와 비교해, 감소된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은, CAR T-세포 암 요법 시술 중이나 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액 또는 이의 조성물의 비-투여 개체와 비교해, 하나 이상의 전-염증성 사이토카인의 생산 수준을 감소시키거나 또는 저해한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 부가적인 물질을 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 다른 예로, 본원에 개시된 방법은 부가적인 물질의 투여 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액의 비-투여를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 CAR T-세포 암 요법을 강화하거나, 개선하거나 또는 이의 조합을 달성하는 화합물 또는 조성물일 수 있다. 또 다른 구현예에서, CAR T-세포 암 요법을 강화 또는 개선하는 부가적인 물질은 CTLA-4 차단제, α-1 항-트립신 또는 이의 기능성 단편 또는 유사체, 텔루륨계 화합물, 면역조절제 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 부가적인 물질은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 부가적인 물질의 투여는 CAR T-세포 암 요법 전에, 동시에 또는 이후에 이루어진다.
일부 구현예에서, IL-6 수용체 길항제, 일부 구현예에서 톡실리주맵 (tocilizumab)이 본원에 개시된 조성물 및 방법에 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 입양 이식된 T 세포 (adoptively transferred T-cell)는 림프구감소성 숙주 (lymphopenic host)에서 더 효과적으로 생착 및 증식한다. 따라서, 일부 구현예에서, 개체는 CAR T 세포 또는 기타 변형된 면역 세포의 이식 전에 림프구고갈 처리된다. 다른 구현예에서, CAR T 세포를 투여받는 개체는 T 세포-지지성 사이토카인 (T-cell-supportive cytokine)을 공급받는다.
일부 구현예에서, T 세포는 작동자 T 세포이다. 다른 구현예에서, T 세포는 나이브 T 세포이다. 다른 구현예에서, T 세포는 중심 기억 (TCM) T 세포이다. 다른 구현예에서, T 세포는 Th17 세포이다. 다른 구현예에서, T 세포는 T 줄기 기억 세포이다. 다른 구현예에서, T 세포는 높은 복제력 (replicative capacity)을 가진다. 다른 구현예에서, T 세포 증폭 (T-cell expansion)은 환자 체내에서 이루어진다. 다른 구현예에서, 환자에 적은 수의 세포를 이식할 수 있다. 다른 구현예에서, T 세포 증폭은 시험관내에서 이루어진다. 다른 구현예에서, 많은 수의 세포를 환자에게 이식하거나, 세포 및/또는 상층액을 환자에 여러번 이식하거나, 또는 이 둘다일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR T 세포의 이점은, 세포-표면 분자에 특이적이기 때문에, MHC-제한된 TCR 인지 제한 (constraint of MHC-restricted TCR recognition)을 극복하고, 항원 제시 또는 인간 백혈구 항원 발현에의 결함을 통해 종양 도피 (tumor escape)를 회피한다는 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양 부담을 줄이는 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 종양 부담 감소는 개체에서 종양 세포의 수적 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 부담 감소는 개체에서 종양의 크기 축소를 포함한다. 다른 구현예에서, 종양 부담 감소는 개체에서 종양의 근절을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양 세포의 사멸을 유도하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 개체에서 종양 세포의 사멸을 유도하는 방법은, 적어도 개체에서 유독한 사이토카인 방출 또는 "사이토카인 방출 증후군" (CRS) 또는 "중증 사이토카인 방출 증후군" (sCRS) 또는 "사이토카인 폭풍"을 줄이기 위해, 조작된 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역 세포, 예를 들어 NK 세포 또는 T 세포를 적어도 부가적인 물질과 함께 투여하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신생물증을 앓고 있는 개체에서 생존성을 높이거나 또는 연장하는 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 개체의 생존성을 높이거나 또는 연장하는 방법은, 개체에서 유독한 사이토카인 방출 또는 "사이토카인 방출 증후군" (CRS) 또는 "중증 사이토카인 방출 증후군" (sCRS) 또는 "사이토카인 폭풍"을 줄이기 위해, 조작된 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역 세포, 예를 들어 NK 세포 또는 T 세포를 적어도 부가적인 물질과 함께 투여하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신생물증을 앓고 있는 개체에서 생존성을 높이거나 또는 연장하는 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물 또는 조성물들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암 진행을 지연하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물 또는 조성물들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 백혈병 또는 림프종의 진행을 지연하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물 또는 조성물들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존성을 높이거나, 연장하거나 또는 늘리는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물 또는 조성물들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 백혈병 또는 림프종을 앓고 있는 개체의 생존성을 높이거나, 연장하거나 또는 늘리는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물 또는 조성물들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 종양 세포 부담을 줄이는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 종양 부담은 간 및 골수에서 감소된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물 또는 조성물들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 신생물증을 예방하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 신생물증은 혈액암, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 난소암 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료가 필요한 개체에서 혈액암을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 혈액암은 B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프성 백혈병 및 비-호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 투여는 CAR T-세포를 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 초기 세포자살성 세포를 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 초기 세포자살성 세포로부터 수득되는 상층액을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 본원에 기술된 조성물들의 조합의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 CAR T-세포 및 세포자살성 세포를 동일한 조성물로 또는 다른 조성물로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 CAR T-세포를 본원에 기술된 부가적인 물질과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 세포자살성 세포 및 항체 또는 이의 단편을 동일한 조성물로 또는 다른 조성물로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 병용 요법은 상승적인 효과 (synergistic effect)를 제공한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 CAR T-세포와 조합하여 이용하는 방법은 CAR T-세포 단독 사용과 비교해 CAR T-세포의 효능을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 CAR T-세포와 조합하여 이용하는 방법은 CAR T-세포 단독 사용과 비교해 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존 시간을 연장한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 CAR T-세포와 조합하여 이용하는 방법은 CAR T-세포 단독 사용과 비교해 림프종 또는 백혈병을 앓고 있는 개체의 생존 시간을 연장한다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 암 발병 또는 종양의 출현을 지연시킨다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 암의 진행을 지연한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 종양의 증식을 지연한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존 시간을 연장한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 림프종 또는 백혈병을 앓고 있는 개체의 생존 시간을 연장한다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 RtX를 포함하는 항체 또는 이의 단편과 조합하여 투여하는 것을 포함하는 사용 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 암의 개시 또는 종양의 출현을 지연시킨다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 RtX를 포함하는 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 암의 진행을 지연시킨다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 RtX를 포함하는 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 종양의 증식을 지연시킨다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 RtX를 포함하는 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 암 또는 종양을 앓고 있는 개체의 생존 시간을 연장한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 RtX를 포함하는 항체 또는 이의 단편과 조합하여 사용하는 방법은 세포자살성 세포 또는 항체 단독 사용과 비교해 림프종 또는 백혈병을 앓고 있는 개체의 생존 시간을 연장한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 사용 방법은 종양 부하를 감소시킨다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "종양 부하 (tumor load)"가 체내 암 세포의 수, 종양의 크기 또는 암의 양을 의미할 수 있음을 알 것이다. 용어 "종양 부하"가 용어 "종양 부담"과 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 모두 동일한 의미와 특징을 가진다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포의 투여를 포함하는 사용 방법은, 세포자살성 세포 비-투여 개체와 비교해, 개체에서 암 세포 수를 줄이거나, 개체에서 종양의 크기를 줄이거나, 개체 체내에서 암의 양을 줄이거나 또는 이들의 임의 조합을 달성한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 항체 또는 이의 단편과 조합하여 투여하는 것을 포함하는 사용 방법은, 세포자살성 세포 비-투여 또는 항체 비-투여 또는 이의 조합 개체와 비교해, 개체에서 암 세포의 수를 줄이거나, 개체에서 종양의 크기를 줄이거나, 개체 체내에서 암의 양을 줄이거나 또는 이들의 임의 조합을 달성한다. 일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포를 RtX 항체 또는 이의 단편과 조합하여 투여하는 것을 포함하는 사용 방법은, 세포자살성 세포, RtX 항체 또는 이의 조합의 비-투여 개체와 비교해, 개체에서 암 세포 수를 줄이거나, 개체에서 종양의 크기를 줄이거나, 개체 체내에서 암의 양을 줄이거나 또는 이들의 임의 조합을 달성한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이, 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 경험하거나 또는 사이토카인 방출 증후군 또는 사이토카인 폭풍에 취약한 개체에서 사이토카인 생산을 줄이거나 저해하는 방법은, 사이토카인의 생산을 감소시키거나 또는 저해한다. 다른 구현예에서, 방법은 전-염증성 사이토카인의 생산을 감소시키거나 또는 저해한다. 추가의 구현예에서, 방법은 하나 이상의 전-염증성 사이토카인을 감소시키거 또는 저해한다. 다른 구현예에서, 상기한 개체는 CAR T 세포 암 요법이 시술 중이며, 상기한 방법은 CAR T 세포 요법의 효능을 감소시키지 않는다.
본원에 제공되는 방법은 본원에 개시된 T-세포, NK 세포 또는 CTL 세포를 원하는 효과, 기존 증상의 완화 또는 재발 방지를 달성하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 치료하는 경우, 투여되는 양은 원하는 효과를 발생시키기에 효과적인 양이다. 유효량은 1회 투여 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 유효량은 볼루스 또는 연속 주입 (continuous perfusion)에 의해 제공될 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, "유효량" (또는 "치료학적인 유효량")이 치료시 유익하거나 또는 원하는 임상적인 결과를 나타내는데 충분한 양을 포함할 수 있음을 알 것이다. 유효량은 개체에 1회 이상으로 투여될 수 있다. 치료 관점에서, 유효량은 질병을 완화, 개선, 안정화, 역전 또는 진행을 서행시키거나, 또는 질병의 병리학적 결과를 경감하는데 충분한 양이다. 유효량은 일반적으로 사례별로 의사에 의해 결정되며, 당해 기술 분야의 당업자의 능력 내에 속한다. 유효량에 도달하기 위한 적절한 투여량을 결정할 때 전형적으로 몇 가지 인자가 고려된다. 이들 인자로는 개체의 나이, 성별 및 체중, 치료 중인 병태, 병태의 중증도 및 투여되는 항원-결합 단편의 형태 및 유효 농도 등이 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은, 단일 조성물로 구성된, 유전자 변형된 세포를 포함하는 조성물, 및 부가적인 물질 또는 이의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은, 단일 조성물로 구성된, CAR T 세포를 포함하는 조성물, 및 부가적인 물질 또는 이의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은, 단일 조성물로 구성된, TCR T 세포를 포함하는 조성물, 및 부가적인 물질 또는 이의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은, 2종 이상의 조성물로 구성된, 유전자 변형된 세포를 포함하는 조성물, 및 부가적인 물질 또는 이의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은, 2종 이상의 조성물로 구성된, CAR T 세포를 포함하는 조성물, 및 부가적인 물질 또는 이의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은, 2종 이상의 조성물로 구성된, TCR T 세포를 포함하는 조성물, 및 부가적인 물질 또는 이의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
항원-특이적인 T 세포, 예를 들어 CAR T 세포를 이용한 입양 면역요법 (adoptive immunotherapy)의 경우, 세포 106 내지 1010 (예, 109)개의 범위가 용량으로 전형적으로 주입된다. 숙주에 유전자 변형된 세포가 투여되어 후속적으로 분화되면, 특정 항원을 특이적으로 겨냥하는 T 세포가 유도된다. T 세포의 "유도"는 결손 또는 아네르기 (anergy)에 의해서와 같이 항원-특이적인 T 세포의 불활성화를 포함할 수 있다. 불활성화는 자가면역 장애에서와 같이 관용을 확립 또는 재확립하는데 특히 유용하다. 변형된 세포는, 비-제한적인 예로, 정맥내, 피하, 결절내 (intranodal), 종양내, 척추강내, 흉막내, 복막내 및 흉선에의 직접 투여 등의, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 복막내로 투여되지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포는 종양으로 투여된다.
본원에 개시된 유전자 변형된 면역반응성 세포 (예, T-세포, N 세포, CTL 세포 또는 이의 전구 세포)를 포함하는 조성물은, 신생물, 병원체 감염 또는 감염성 질환을 치료하기 위해 개체에 직접 또는 전신으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포는 대상 장기 (예, 신생물이 생긴 장기)에 직접 주사된다. 다른 예로, 유전자 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 대상 장기에 간접적으로, 예를 들어, 순환계 (예, 종양 맥관 구조) 투여에 의해 제공된다. 시험관내 또는 생체내에서 T-세포, NK 세포 또는 CTL 세포의 생산을 증가시키기 위해, 세포 투여 전에, 투여 중에 또는 투여 후에, 증폭 물질 및 분화 물질이 제공될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본원에 개시된 방법에서, 부가적인 물질을 포함하는 조성물은 유전자 변형된 면역 세포를 투여하기 전에, 투여와 동시에 또는 투여한 후 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서, 본원에 개시된 부가적인 물질 이전에 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T 세포를 투여한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서, 본원에 개시된 부가적인 물질과 동시에 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T 세포를 투여한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서, 부가적인 물질을 투여한 이후에 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR T 세포를 투여한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 세포자살성 세포를 포함하는 조성물을 투여한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물을 투여한다.
변형된 세포는, 그 세포가 재생 및 분화하기에 적절한 부위 (예, 흉선)를 찾을 수 있는 다른 편리한 부위 또는 뼈로 도입될 수도 있지만, 임의의 생리학적으로 허용가능한 비히클 중에, 일반적으로 혈관내로 투여될 수 있다. 통상적으로, 적어도 1 x 105개의 세포가 투여될 것이며, 궁극적으로 1 x 1010개 이상에 도달하게 될 것이다. 본원에 개시된 유전자 변형된 면역반응성 세포는 정제된 세포 집단을 포함할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 집단 내 유전자 변형된 면역반응성 세포의 %를 다양한 널리 공지된 방법, 예를 들어, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용해 쉽게 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 집단에서 순도 범위는 약 50 내지 약 55%, 약 55 내지 약 60% 및 약 65 내지 약 70%이다. 다른 구현예들에서, 순도는 약 70 내지 약 75%, 약 75 내지 약 80%, 약 80 내지 약 85%이다. 추가적인 구현예들에서, 순도는 약 85 내지 약 90%, 약 90 내지 약 95%, 약 95 내지 약 100%이다. 투여량은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다 (예, 순도가 낮으면 용량을 높여야 할 수 있음). 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 필요에 따라, 비-제한적인 예로, 인터루킨, 예를 들어, IL-2, IL-3, IL-6, IL-11, IL7, IL12, ILIS, IL21뿐만 아니라 기타 인터루킨, 콜로니 자극 인자, 예를 들어 G-, M- 및 GM-CSF, 인터페론, 예를 들어, 감마-인터페론 및 에리트로포이에틴 등의 인자가 포함될 수 있다.
조성물은 유전자 변형된 면역반응성 세포 또는 이들의 전구 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 투여는 자가 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 세포 또는 전구 세포는 한명의 개체로부터 수득할 수 있으며, 동일 개체 또는 다른 적합한 개체에 투여할 수 있다. 본원에 개시된 말초혈 유래 면역반응성 세포 또는 이들의 후대 (예, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)을, 카테터 투여 등의 국소 주사를 통해, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수 있다. 본원에 개시된 치료학적 조성물 (예, 유전자 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 약학적 조성물)을 투여하는 경우, 일반적으로 단위 용량 주사 형태 (unit dosage injectable form) (용액제, 현탁액, 에멀젼)로 제형화될 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 대상 항원에 결합하는 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 T 세포 또는 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 CAR T 세포 또는 다른 면역 세포, 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액을 포함하는 조성물의 제조 방법을 개시한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 CAR T 세포 또는 기타 면역 세포를 포함하는 조성물은, 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물과 별개의 조성물이다.
일 구현예에서, 본 발명은, 키메라 항원 수용체-발현성 T 세포 (CAR T 세포) 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 (malignancy)을 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법을 개시한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 유전자 변형된 면역 세포, 예를 들어 CAR-변형 T 세포에 의해 유발되는 항-종양 면역 반응이 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있음을 알 것이다. 또한, CAR 매개의 면역 반응이 CAR-변형된 T 세포가 CAR에서 항원 결합성 모이어티에 특이적인 면역 반응을 유도하는 입양 면역요법 접근법의 일부일 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 면역치료가 암 세포를 타겟팅하여 파괴하는 면역 작동자 세포 및 분자의 사용을 포괄할 수 있음을 알 것이다. 면역 작동자는, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 요법의 작동자로서 이용할 수 있거나, 또는 실제 세포 사멸을 달성하기 위해 다른 세포를 동원할 수 있다. 또한, 항체는 약물 또는 독소 (화학치료제, 방사성 핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)와 접합되어, 주로 타겟팅 물질로서 이용할 수 있다. 다른 예로, 작동자는, 타겟 종양 세포와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 보유한 림프구일 수 있다. 다양한 작동자 세포로는 세포독성 T 세포 및 NK 세포 등이 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이, 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 혈액 종양을 치료하거나, 예방하거나, 증식을 저해하거나 또는 발병을 낮추기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 미만성 (diffuse) 암, 예를 들어, 비-제한적인 예로 고형 종양이 유방에 형성되지 않은 미만성 유방암을 치료하거나, 예방하거나, 증식을 저해하거나 또는 발병을 감소시키기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 혈액 종양의 생존 기간을 연장하기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 미만성 암, 예를 들어, 비-제한적인 예로 고형 종양이 유방에 형성되지 않은 미만성 유방암의 생존 기간을 연장하기 위해 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 혈액 종양을 앓고 있는 개체의 생존성을 높이기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 미만성 암, 예를 들어, 비-제한적인 예로 고형 종양이 유방에 형성되지 않은 미만성 유방암을 앓고 있는 개체의 생존성을 높이기 위해 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 혈액 종양의 증식율을 낮추기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 미만성 암, 예를 들어, 비-제한적인 예로 고형 종양이 유방에 형성되지 않은 미만성 유방암의 증식율을 낮추기 위해 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 중인 종양 또는 암은 종양 또는 암의 전이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 사용 방법은 종양 또는 암의 전이를 예방 또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원의 사용 방법은 증식을 저해하거나 또는 전이 발생을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 개체는 인간 개체이다. 일부 구현예에서, 개체는 어린 개체다. 일부 구현예에서, 개체는 성체이다. 일부 구현예에서, 개체는 동물 포유류이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 전술한 바와 같이 단핵구 농화된 세포 집단을 포함하는 초기 세포자살성 세포 집단을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 24시간 이상 안정적인 집단 세포를 포함하는 초기 세포자살성 세포 집단을 포함한다. 초기 세포자살성 세포의 안정적인 집단은 상기에 설명되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 세포 응집이 없는 세포 집단을 포함하는 초기 세포자살성 세포 집단을 투여하는 것을 포함한다. 응집이 없는 초기 세포자살성 세포 집단 및 이의 제조 방법은 상기에서 상세히 설명하였다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 필요한 개체에 자가 초기 세포자살성 세포 집단을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 필요한 개체에 동종이계 초기 세포자살성 세포 집단을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단 또는 이의 조성물을 투여하는 방법은 세포자살성 세포 집단 또는 이의 조성물의 1회 주입 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 1회 주입은 암 또는 종양 위험성이 있는 것으로 사전 결정된 개체에게 예방학적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 주입은 대상 치료학적 치료의 일부로서 정기적으로 암 또는 종양을 가진 개체에게 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 주입은 전이 암을 예방하거나, 위험성을 낮추거나 또는 출현을 지연하기 위해 암 또는 종양을 가진 개체에게 예방학적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 초기 세포자살성 세포 집단 또는 이의 조성물을 투여하는 방법은 세포자살성 세포 집단 또는 이의 조성물의 다회 주입 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 암 또는 종양 위험성이 있는 것으로 사전 결정된 개체에게 예방학적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 대상 치료학적 치료의 일부로서 정기적으로 암 또는 종양을 가진 개체에게 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 전이암을 예방하거나, 위험성을 낮추거나 또는 출현을 지연하기 위해 암 또는 종양을 가진 개체에게 예방학적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 다회 주입은 2회 이상의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 2회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 2회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 적어도 3회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 3회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 3회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 적어도 4회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 4회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 4회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 적어도 5회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 5회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 5회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 적어도 6회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 6회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 6회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 적어도 7회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 7회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 7회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 적어도 8회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 8회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 8회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 적어도 9회 주입을 포함한한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 9회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 9회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 적어도 10회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 10회 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 10회 보다 많은 횟수의 주입을 포함한다.
일부 구현예에서, 다회 주입은 초기 세포자살성 세포를 더 적은 양으로 포함하며, 투여되는 세포의 총 투여량이 주입 총량 (sum of the infusion)이다.
일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 수일 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 시간에 걸쳐 투여되며, 주입 간격은 12시간 이상이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 24시간 이상이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 적어도 1일이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은은 적어도 2일이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 적어도 3일이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 적어도 4일이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 적어도 5일이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 적어도 6일이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 적어도 7일이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 적어도 1주일이다. 일부 구현예에서, 다회 주입은 일정 기간 동안 투여되며, 주입 간격은 적어도 2주이다.
일부 구현예에서, 다회 주입시 세포의 양은 각 회당 서로 기본적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 다회 주입시 세포 양은 각 회당 다르다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 개체에게 부가적인 화학치료제 또는 면역 조절제를 투여하는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 부가적인 화학치료제 또는 면역 조절제는 초기 세포자살성 세포와 동시에 또는 본질적으로 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 부가적인 화학치료제 또는 면역 조절제는 초기 세포자살성 세포와 동일한 조성물에 포함된다. 일부 구현예에서, 부가적인 화학치료제 또는 면역 조절제는 초기 세포자살성 세포와 다른 조성물에 포함된다.
일부 구현예에서, 부가적인 화학치료제 또는 면역 조절제는 초기 세포자살성 세포의 투여 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 부가적인 화학치료제 또는 면역 조절제는 초기 세포자살성 세포의 투여 후 투여된다.
일부 구현예에서, 화학치료제는 알킬화제, 니트로겐 머스타드 (nitrogen mustard), 니트로소우레아, 테트라진, 아지리딘 (aziridine), 시스플라틴 (cisplatin) 및 유도체, 비-고전적인 알킬화제, 메클로르에타민 (mechlorethamine), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 클로람부실 (chlorambucil), 이포스파미드 (ifosfamide), 부설판 (busulfan), N-니트로소-N-메틸우레아 (MNU), 카르무스틴 (carmustine) (BCNU), 로무스틴 (lomustine) (CCNU), 세무스틴 (semustine) (MeCCNU), 포테무스틴 (fotemustine), 스트렙토조톡신 (streptozotocin), 다카르바진 (dacarbazine), 미토졸로미드 (mitozolomide), 테모졸로미드, 티오테파, 미토마이신 (mitomycin), 다이아지쿠온 (diaziquone) (AZQ), 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 프로카바진 (procarbazine), 헥사메틸멜라민, 항-대사산물제, 항-폴레이트, 메토트렉세이트 (methotrexate), 페메트렉세드 (pemetrexed), 플루오로피리미딘, 플루오로우라실, 카페시타빈 (capecitabine), 데옥시뉴클레오시드 유사체, 시타라빈 (cytarabine), 겜시타빈 (gemcitabine), 데시타빈 (decitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 플루다라빈 (fludarabine), 넬라라빈 (nelarabine), 클라드리빈 (cladribine), 클로파라빈 (clofarabine), 및 펜토스타틴 (pentostatin), 티오퓨린, 티오구아닌, 머캅토퓨린, 항-미소관제 (anti-microtubule agent), 빈카 알칼로이드, 탁산, 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 반-합성 빈카 알칼로이드, 비노렐빈 (vinorelbine), 빈데신 (vindesine), 빈플루닌 (vinflunine), 파클리탁셀, 도세탁셀 (docetaxel), 포도필로톡신 (podophyllotoxin), 에토포시드 (etoposide), 테니포시드 (teniposide), 토포이소머라제 저해제, 이리노테칸 (irinotecan), 토포테칸 (topotecan), 캄프토테신 (camptothecin), 에토포시드 (etoposide), 독소루비신, 미톡산트론 (mitoxantrone), 테니포시드 (teniposide), 촉매 저해제, 노보비오신 (novobiocin), 머바론 (merbarone), 어클라루비신 (aclarubicin), 세포독성 항생제, 안트라사이클린, 블레오마이신 (bleomycin)s, 미토마이신 (mitomycin) C, 미톡산트론 (mitoxantrone), 액티노마이신 (actinomycin), 독소루비신, 다우노루비신 (daunorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 안트라사이클린, 피라루비신 (pirarubicin), 어클라루비신 (aclarubicin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 블레오마이신 (bleomycin), 미토마이신 (mitomycin), 타겟화된 요법 (targeted therapies), 단일클론 항체, 네이키드 (naked) 단일클론 항체, 접합된 단일클론 항체, 화학표지된 항체, 2중 특이성 단일클론 항체, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 기능성 단편은 단일클론 항체, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 본원에 기술된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 도메인 중 어느 하나의 활성 단편을 개시한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "단편"이 아미노산을 적어도 5, 10, 13 또는 15개 포함할 수 있음을 알 것이다. 다른 구현예에서, 단편은 20개 이상의 인접한 아미노산으로 구성된다. 본원에 개시된 단편은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 제조하거나, 또는 정상적인 단백질 가공 (예, 초기 (nascent) 폴리펩타이드에서 생물학적 활성에 필요없는 아미노산 제거 또는 얼터너티브 mRNA 스플라이싱 또는 얼터너티브 단백질 가공 이벤트에 의한 아미노산의 제거)을 통해 수득할 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호 호환적으로 사용되며, 구체적으로는 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항체의 결합 활성을 가진 이들의 임의 단편을 의미한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 용어 "항체"는 본원에 기술된 바람직한 타겟과 특이적으로 상호작용할 수 있는, 예를 들어 식세포에 결합할 수 있는, Fab, F(ab')2 및 Fv와 같은, 온전한 분자 및 이의 기능성 단편을 의미한다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 하기를 포함한다:
(1) Fab, 완전 항체를 파파인 효소로 소화하여 온전한 경쇄와 중쇄 하나의 일부를 수득함으로써 제조할 수 있는, 항체 분자의 1가 항원 결합 단편을 포함하는, 단편;
(2) Fab', 완전 항체에 펩신을 처리한 다음 환원시켜 온전한 경쇄와 중쇄 일부를 수득함으로써 수득할 수 있는 항체 분자의 단편; 항체 분자 당 2개의 Fab' 단편이 수득됨;
(3) (Fab')2, 완전 항체를 효소 펩신으로 처리하지만 환원 처리하지 않고 수득할 수 있는 항체의 단편; F(ab')2는 이황화 결합 2개에 의해 홀딩된 Fab' 단편 2개로 된 다이머;
(4) Fv, 2개의 체인으로 발현되는 경쇄의 가변부와 중쇄의 가변부를 포함하는 유전자 조작된 단편; 및
(5) 단쇄 항체 ("SCA"), 경쇄의 가변부와 중쇄의 가변부가 유전자 융합된 단쇄 분자로서 적절한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 유전자 조작된 분자.
이들 단편의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988을 참조하며, 이 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
일부 구현예에서, 항체 단편은 항체를 단백질분해에 의해 가수분해하거나 또는 단편을 코딩하는 DNA를 E. coli 또는 포유류 세포 (예, 중국 햄스터 난소 세포 배양물 또는 그외 단백질 발현 시스템)에서 발현함으로써 제조할 수 있다.
항체 단편은, 일부 구현예에서, 완전 항체를 통상적인 방법으로 펩신 또는 파파인으로 분해하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 항체를 펩신으로 효소 분해하여 F(ab')2로 표시되는 5S 단편을 제공함으로써 제조할 수 있다. 이 단편은 티올 환원제 및 선택적으로 이황화 결합 절단으로 생긴 설프하이드릴 기에 대한 차단기를 사용해 추가적으로 절단하여, 3.5S Fab' 1가 단편을 제조할 수 있다. 다른 예로, 펩신을 사용해 효소 절단하여 1가 Fab' 단편 2개와 Fc 단편을 직접 제조한다. 이 방법은, 예를 들어, Goldenberg, 미국 특허 4,036,945 및 4,331,647과 이에 포함된 참조문헌에 기술되어 있으며, 이들 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, Porter, R. R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959를 참조한다. 중쇄를 절단하여 1가 경쇄-중쇄 단편을 제조하고, 단편을 추가적으로 절단하거나 또는 기타 효소적, 화학적 또는 유전자 기법 등의 항체를 절단하는 다른 방법들 역시, 단편이 무손상 항체에 의해 인지되는 항원에 결합하는 한, 사용할 수 있다.
Fv 단편은 VH 및 VL 체인의 결합을 포함한다. 이 결합은 Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62, 1972에 기술된 바와 같이 비-공유 결합일 수 있다. 다른 예로, 가변성 체인들을 분자간 이황화 결합에 의해 연결하거나 또는 글루타르알데하이드와 같은 화학제에 의해 가교할 수 있다. 바람직하게는, Fv 단편은 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 체인들을 포함한다. 이들 단쇄 항원 결합 단백질 (sFv)은, 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구축함으로써, 제조한다. 발현 벡터에 구조 유전자를 삽입한 다음 E. coli와 같은 숙주 세포에 도입한다. 재조합 숙주 세포는 2개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩타이드를 이용해 단일한 폴리펩타이드 체인을 합성한다. sFv 제조 방법은, 예를 들어, Whitlow and Filpula, Methods, 2: 97-105, 1991; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77, 1993; 및 Ladner et al., 미국 특허 4,946,778에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
항체 단편의 다른 형태는 싱글 상보성-결정 영역 (CDR)을 코딩하는 펩타이드이다. CDR 펩타이드 ("최소 인지 단위")는 대상 항체의 CDR을 코딩하는 유전자를 구축함으로써 수득할 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응을 이용해 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변부를 합성함으로써 제조한다. 예를 들어, Larrick and Fry, Methods, 2: 106-10, 1991을 참조한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 단편은 항체의 "인간화된 형태"를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "항체의 인간화된 형태"는 비-인간 (예, 뮤라인) 항체를 지칭하며, 이는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 면역글로불린의 키메라 분자, 면역글로불린 체인 또는 이의 단편 (예, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 그외 항원-결합 서브서열)이다. 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 가진 마우스, 랫 또는 토끼와 같은 비-인간 종의 CDR (공여 항체)의 잔기로 치환된, 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프래임워크 잔기는 대응되는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 유입된 CDR 또는 프래임워크 서열에서도 찾을 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 CDR에 대응되고, FR 영역 모두 또는 실질적으로 모두가 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR인, 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변성 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로는 면역글로불린 불변부 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린을 일정 부분 이상 포함할 것이다 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 소스로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 유입 가변성 도메인으로부터 취해지는 유입 잔기 (import residues)로서 종종 지칭된다. 인간화는 설치류 CDR들 또는 CDR 서열로 대응되는 인간 항체 서열을 치환함으로써 기본적으로 윈터 및 동료에 의한 방법에 따라 수행할 수 있다 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]. 즉, 이러한 인간화된 항체는, 온전한 인간 가변성 도메인 보다 실질적으로 작은 부분이 비-인간 종 유래의 대응되는 서열로 치환된, 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터 유래된 잔기로 치환된 인간 항체이다.
또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., Mol. Biol., 222:581 (1991)] 등의 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법을 이용해 제조할 수 있다. Cole et al. 및 Boerner et al.의 기법들 역시 인간 단일클론 항체를 제조하는데 이용할 수 있다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 마찬가지로, 인간 면역글로불린 유전자 좌를 형질전환 동물, 예를 들어, 마우스에 도입함으로써, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활화된, 인간 항체를 만들 수 있다. 챌린지시, 인간 항체 생산이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 조립 및 항체 레페토리 등의 모든 측면에서 인간에서 관찰되는 바와 매우 비슷하다. 이러한 방식은 예를 들어, 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 이하 과학 간행물: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 면역 조절제는 항-CD20 단일클론 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD20 단일클론 항체는 리툭시맵이다. 리툭시맵은 상업적으로 이용가능하며, Biogen 사와 Genentech USA, Inc가 공동으로 시판하는 상품명 Rituxan®으로 판매되고 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 1차 요법을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "1차 요법"이 질환에 대해 제공되는 첫번째 치료를 포함할 수 있음을 알 것이다. 이는, 종종, 수술 후 화학요법 및 방사선 조사와 같은 표준 치료 세트의 일부이다. 1차 요법은 그 자체로 사용될 경우, 최선의 치료로서 인정되는 요법이다. 이 방법이 질환을 치유하지 못하거나 또는 심각한 부작용을 유발한다면, 다른 치료를 추가하거나 또는 대체하여 사용할 수 있다. 유도 요법, 일차 요법 및 일차 치료로 또한 지칭된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 보조 요법을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "보조 요법"이 일차 또는 첫 치료와 더불어 제공되는 치료를 포괄할 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 보조 요법은 추가적인 치료 준비시 일차 치료 전에 제공되는 부가적인 암 치료를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 보조 요법은 암 재발 위험성을 낮추기 위해 일차 치료 후 제공되는 부가적인 암 치료를 포함할 수 있다. 보조 요법은 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 타겟 요법 또는 생물학적 요법을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 미세 잔존 질환을 감소시키거나, 관해를 증가시키거나, 관해 기간을 늘이거나, 종양 재발율을 낮추거나, 종양의 크기를 줄이거나, 종양 또는 암의 증식율을 낮추거나, 종양 또는 암의 전이를 예방하거나, 종양 또는 암의 전이율을 낮추거나 또는 이들의 임의 조합을 달성한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "미세 잔존 질환 (minimal residual disease)"이 환자에서 질환의 증상 또는 징후가 나타나지 않을 때 치료 중에 또는 치료 후에 환자에 남아있는 적은 수의 암 세포를 포괄할 수 있음을 알 것이다.
아울러, 용어 "관해"는 암이 여전히 체내에 존재할 수 있더라도 암의 징후 및 증상이 감소 또는 없어진 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 관해는 암의 징후 및 증상이 전체가 아닌 일부가 소거된 부분 관해를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 관해는 암이 여전히 체내에 존재할 수 있더라도 암의 징후 및 증상이 모두 사라진 완전 관해를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은, 초기 세포자살성 세포 또는 이의 조성물을 이용한 첫 치료가 암의 징후 또는 증상을 줄이거나 또는 없어지게 하는, 관해 유도 요법을 포함할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "재발"이 개선 기간 이후에 질환의 징후 및 증상 또는 질환의 재발을 포괄할 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 사용되는 방법은 재발없는 생존 (relapse-free survival)을 유도하며, 재발없는 생존은 일차 암 치료 후 환자가 암의 어떠한 징후 또는 증상없이 생존하는 기간을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "전이"가 최초 형성된 부위에서 신체 다른 부위로 암 세포가 전파되는 것을 포함함을 알 것이다. 전이시, 암 세포는 기원 (원발성) 종양으로부터 떨어져 나와 혈액 또는 림프계를 통해 이동하여, 신체의 다른 장기 또는 조직에서 새로운 종양을 형성한다. 일부 구현예에서, 새로운, 전이성 종양은 원발성 종양과 동일한 타입의 암이다. 예를 들어, 유방암이 폐에 전파된다면, 폐의 암 세포는 폐암 세포가 아닌 유방암 세포이다.
악성 종양
일부 구현예에서, CAR T 세포는, 키메라 항원 수용체-발현성 T 세포 (CAR T 세포)를 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양의 치료, 예방, 저해, 발병 저하, 개선 또는 완화하는 방법에, 사용된다. 본원에 기술된 바와 같이, 이들 방법은 CRS 또는 사이토카인 폭풍의 발생을 저해하거나 또는 낮추고자 하는 시도로 부가적인 물질을 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 개체의 생존성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명은 초기 세포자살성 세포 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 개체의 생존성이 증가되는, 미만성 암을 가진 개체의 생존성을 증가시키거나 또는 늘리는 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 암은 B 세포 악성 종양 종양이다. 일 구현예에서, B 세포 악성 종양 종양은 백혈병이다. 다른 구현예에서, B 세포 악성 종양 종양은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)이다. 다른 구현예에서, B 세포 악성 종양 종양은 만성 림프성 백혈병이다.
일부 구현예에서, 암은 백혈병이다. 일부 구현예에서, 암은 림프종이다. 일부 구현예에서, 림프종은 거대 B-세포 림프종 (large B-cell lymphoma)이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 암 또는 종양의 크기 또는 증식율을 감소시키며, 개체에 초기 세포자살성 세포 집단을 투여하는 것을 포함하며, 이러한 방법은 암 또는 종양의 크기 또는 증식율을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명은 개체에 초기 세포자살성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 암의 증식율을 낮추는, 미만성 암의 증식율을 낮추는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 개체에 초기 세포자살성 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 고형 암 또는 종양의 크기 또는 증식율을 감소시키는, 고형 암 또는 종양의 크기 또는 증식율을 감소시키는 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 암은 고형 종양을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 일반적으로 낭포 또는 액포 영역을 함유하지 않는 비-정상적인 조직 덩어리를 포함한다. 고형 종양은 양성 (암이 아님) 또는 악성 (암)일 수 있다. 고형 종양의 여러가지 타입들은 이를 형성하는 세포 타입에 따라 명명된다. 고형 종양의 예로는 육종, 암종 및 림프종이 있다. 백혈병 (혈액암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 육종 또는 암종을 포함한다.
일부 구현예에서, 고형 종양은 혈액, 골수 또는 림프계 세포 이외의 다른 신체 조직 세포의 비-정상적인 증식에 의해 형성된 신생물 (세포의 신생 증식) 또는 병변 (해부학적 구조 손상 또는 생리학적 기능 파괴)이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은, 간, 대장, 유방 또는 폐와 같은 여러가지 조직 타입으로부터 기원할 수 있으며 세포 기원 장기에서 먼저 증식하는, 비정상적인 세포 덩어리로 구성된다. 그러나, 이러한 암은 질환의 진행된 단계에서 전이성 종양 증식을 통해 다른 장기로 퍼질 수 있다.
일부 구현예에서, 고형 종양의 예는 육종, 암종 및 림프종을 포함한다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 육종 또는 암종을 포함한다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 복막내 종양이다.
일부 구현예에서, 고형 종양은, 비-제한적으로, 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 자궁경부암, 두경부암, 방광암, 간암 및 피부암을 포함한다.　일부 구현예에서, 고형 종양은 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피세포육종, 림프관육종, 림프관내피세포육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암 또는 췌장 종양, 유방암 또는 유방 종양, 난소암 또는 난소 종양, 전립선암 또는 전립선 종양, 편평 세포암, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭성암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간 종양, 담관 암종, 융모암, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암 또는 종양, 자궁암, 자궁 종양, 고환암, 고환 종양, 폐 암종, 소 세포성 폐암, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 신경초종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 또는 망막모세포종을 포함한다.
일부 구현예에서, 고형 종양은 부신피질 종양 (선종 및 암종), 암종, 결장직장 암종, 데스모이드 종양, 결합조직성 소원형 세포 종양 (Desmoplastic Small Round Cell Tumor), 내분비 종양, 유잉 육종 (Ewing Sarcoma), 생식세포종, 간모세포종, 간세포 암종, 흑색종, 신경모세포종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 횡문근육종 이외의 연조직 육종 및 빌름스 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 유방 종양이다. 다른 구현예에서, 고형 종양은 전립선암이다. 다른 구현예에서, 고형 종양은 결장암이다. 일 구현예에서, 종양은 뇌종양이다. 다른 구현예에서, 종양은 췌장 종양이다. 다른 구현예에서, 종양은 결장직장 종양이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 또는 이의 조성물은, 암 또는 종양, 예를 들어 육종 및 암종 (예, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피세포육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포암, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭성암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모암, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐 암종, 소-세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 신경초종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종)에 대해 치료학적 및/또는 예방학적 효과를 가진다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의 고형 종양을 치료, 예방, 증식 저해 또는 발병을 감소시키기 위해 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 고형 종양을 가진 개체의 생존성을 높이기 위해 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 고형 종양의 크기 또는 증식율을 감소시키기 위해 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 암은, 암이 넓게 퍼진, 국소적 또는 국부적이지 않은, 미만성 암일 수 있다. 일부 구현예에서, 미만성 암은 비-고형 종양을 포함한다. 미만성 암의 예로는 백혈병이 있다. 백혈병은, 혈액-형성 조직, 예를 들어 골수로부터 시작해 비-정상적인 혈액 세포를 다량 만들어 혈류로 유입시키는 암을 포함한다.
일부 구현예에서, 미만성 암은 B-세포 악성 종양 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 미만성 암은 백혈병을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 림프종이다. 일부 구현예에서, 림프종은 거대 B 세포 림프종이다.
일부 구현예에서, 미만성 암 또는 종양은 혈액 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈액 종양은 혈액, 골수 및 림프절에 발병하는 암 타입이다. 혈액 종양은 두 가지 주요 혈액 세포 계통: 골수성 및 림프성 세포주 중 하나로부터 유래될 수 있다. 골수 세포주는 정상적으로 과립구, 적혈구, 혈소판 (thrombocyte), 대식세포 및 비만 세포를 생성하는 반면, 림프계 세포주는 B 세포, T 세포, NK 세포 및 형질세포 (plasma cell)를 생성한다. 림프종 (예, 호지킨 림프종), 림프성 백혈병 및 골수종은 림프계 세포주로부터 유래되고, 급성 및 만성 골수성 백혈병 (AML, CML), 골수이형성 증후군 및 골수증식성 질환은 골수 기원이다.
일부 구현예에서, 비-고형 (미만성) 암 또는 종양은 혈액암, 혈액 세포암, 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종 (형질세포 골수종), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 형질세포성 백혈병을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이, 초기 세포자살성 세포 및 이의 조성물은 미만성 암, 비-제한적인 예로, 백혈병 (예, 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병), 진성 적혈구 증가증, 림프종 (호지킨 질환, 비-호지킨 질환), 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환 (heavy chain disease)에 대해 치료학적 및/또는 예방학적 효과를 가진다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 혈액 종양을 치료, 예방, 저해, 개선, 발병 저하 또는 완화하기 위해 사용할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 명세서 전체에서 용어 "포함하는"의 사용이, 특정 구현예에서 용어 "로 필수적으로 구성되는" 또는 "로 구성되는"으로 치환될 수 있음을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "포함하는"은 시스템이 언급된 요소들을 포함하지만 최적일 수 있는 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하는 의도임을 알 것이다. 예를 들어, 초기 세포자살성 세포를 포함하는 조성물, 비-제한적으로, 세포의 이러한 집단. 나아가, 용어 "로 필수적으로 구성되는"은 언급된 요소들, 예를 들어, 초기 세포자살성 세포로 필수적으로 구성되는 조성물을 포함하는 방법을 포괄할 수 있지만, 방법의 수행에 본질적으로 유의한 효과를 미칠 수 있는 다른 요소들은 배제할 수 있다. 따라서, 이러한 조성물은 암 치료에 본질적인 활성을 포함하지 않는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 여전히 포함할 수 있다. 또한, "로 구성되는"은 미량 이상의 기타 요소들을 배제하는 것을 포함한다. 따라서, 초기 세포자살성 세포로 이루어진 조성물은 본원에 개시된 미량 이상의 다른 요소를 포함하진 않을 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 기술된 다양한 치료학적 및 예방학적 목적으로 본원에 기술된 조성물의 용도로서, 또는 다른 예로 본원에 기술된 다양한 치료학적 및 예방학적 목적의 조성물 또는 치료학적 조성물 또는 의약제의 제조에 있어 본원에 기술된 조성물의 용도로서 제시될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 다양한 구성 성분 또는 단계들을 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 다양한 구성 성분 또는 단계들로 필수적으로 구성되며, 기타 구성 성분 또는 단계들이 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 다양한 구성 성분 또는 단계들로 구성된다.
일부 구현예에서, 용어 "포함한다"는 당해 기술 분야에 공지될 수 있는 조성물의 효능에 영향을 미치는 조성물의 다른 성분의 포함을 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "로 필수적으로 구성되는"은 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포), 및 세포자살성 세포 또는 임의의 세포자살성 세포 상층액을 가진 조성물을 포함한다. 그러나, 조성물의 유용성에 직접 관여하지 않는 다른 성분도 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "이루어진"은 본원에 기술된 임의의 형태 또는 구현예에서 본원에 개시된 키메라 항원 수용체-발현성 T-세포 (CAR T-세포), 및 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 상층액을 가진 조성물을 포괄한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "약"이 지정된 수 또는 수치 범위로부터 0.0001 내지 5%의 편차를 포함할 수 있음을 알 것이다. 나아가, 이는 지정된 수 또는 수치 범위로부터 1 내지 10%의 편차를 포함할 수 있다. 또한, 이는 지정된 수 또는 수치 범위로부터 최대 25%의 편차를 포함할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")가 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 언급을 포함함을 알 것이다. 예를 들어, 용어 "물질" 또는 "적어도 물질"은 이의 혼합물을 비롯하여 복수의 물질들을 포함할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 본원에 개시된 다양한 구현예들은 범위 형식 (range format)으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기술은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위에 대한 엄격한 제한으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 범위의 기술은 이 범위 내에 있는 개개 수치 값뿐 아니라 모든 가능한 하위 범위를 구체적으로 기술하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐 아니라, 이 범위 내에 있는 개개 수치, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 기술하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
본원에 수치 범위가 언급되는 경우, 임의의 언급된 범위 내에 있는 모든 인용된 수치 (분수 또는 정수)를 포함하는 의미이다. 첫번째 언급된 수치 내지 2번째 언급된 수치에 이르는 "범위" 및 첫번째 언급된 수치에서 2번째 언급된 수치까지의 "사이 범위"라는 표현들은 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 첫번째 언급된 수치와 2번째 언급된 수치를 포함하며, 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 의미이다.
아래 실시예들은 본원에 개시된 구현예들을 보다 충분히 설명하기 위해 제시된다. 그러나, 실시예들은 어떠한 방식으로도 본원의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 세포자살성 세포 제조
목적: 초기 세포자살성 세포 제조.
방법: 초기-세포자살성 세포 집단을 제조하는 방법은 국제 특허 공개번호 2014/087408 및 미국 특허 출원 공개번호 US2015/0275175-A1, 예를 들어, 실시예 서두에 있는 방법 섹션 "초기 세포자살성 세포 집단 제조" 및 "세포자살성 세포의 제조" (단락 [0223] - [0288]) 및 실시예 11, 12, 13 및 14에 잘 기술되어 있으며, 이들 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 1에 제시된 흐름도는 항-응집제가 해동 및 세포자살 유도 단계에 사용된 초기 세포자살성 세포 집단의 제조 공정의 단계들에 대한 일 구현예를 개괄적으로 도시한 것이다. 국제 특허 출원 공개번호 2014/087408 및 미국 특허 출원 공개번호 US2015/0275175-A1의 실시예 14에 상세히 기술된 바와 같이, 항-응집제를 동결, 인큐베이션 또는 동결과 인큐베이션 시점에 첨가하여 초기 세포자살성 세포 집단을 준비하였다. 사용된 항-응집제는 산 사이트레이트 덱스트로스이며, NIH 포뮬러 A (ACD 포뮬러 A)에 총 부피에 대해 최종 농도 5% ACD 및 0.5 U/ml 헤파린이 되도록 10 U/ml 헤파린을 첨가하였다.
간략하게는: 세포를 수집한 다음, 동결 매질에 5% 항-응집제 사이트레이트 덱스트로스 포뮬러 A 및 10 U/ml 헤파린 (ACDhep)을 첨가하여 동결시켰다. 이후 해동, 5% ACDhep가 포함된 세포자살 유도 매질에서의 인큐베이션 및 최종 산물 제조는 밀폐된 시스템에서 수행하였다.
세포자살 및 생존성 분석, 효력 분석 및 세포 집단 특징 규명을 각 실험에서 수행하였다. 초기 세포자살성 세포 산물의 생산의 일관성을 확립하기 위해, 세포자살성 세포의 일차 배치의 최종 산물 (FP)을 2-8℃에서 보관하였으며, t0, t24h, t48h 및 t72h에 검사하였다. 각 시점에 세포자살 분석, 간단한 효력 분석 (Applicants CD14+ 동결 세포), 트리판 블루 측정 및 세포 집단 특징 규명을 수행하였다. FP는 보관 중의 평균 세포 감소, 세포자살 및 생존성 분석을 측정하기 위해 세포 계수 검사를 수행하였다.
전술한 방법 및 국제 특허 출원 공개번호 2014/087408 및 미국 특허 출원 공개번호 US2015/0275175-A1의 실시예 11은 항-응집제를 사용하지 않고 세포자살성 세포 집단을 제조하는 다른 구현예에 대한 상세 내용을 제공하며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
방사선 처리된 세포자살성 세포의 제조 방법: 단핵구 초기 세포자살성 세포 집단이 비-휴지기 비-세포자살성 세포를 감소된 %로 포함하거나, 또는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화가 억제된 집단, 또는 임의의 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식이 감소된 세포 집단, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 불활화된 세포자살성 세포 집단을 제조하기 위해, 유사한 방법을 이용하였다.
간략하게는, 농화된 단핵구 세포 분획을 건강한 적격 공여자로부터 백혈구성분채집술을 통해 수집하였다. 성분채집술 완료 후, 세포를 5% 항-응집제 사이트레이트 덱스트로스 용액-포뮬러 A (ACD-A) 및 0.5U/ml 헤파린을 포함하는 동결 매질로 세척 및 재현탁하였다. 그런 후, 세포를 점진적으로 동결시켜, 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮겼다.
방사선 처리된 ApoCell을 제조하기 위해, 동결보존된 세포를 해동하고, 5% ACD-A, 0.5 U/ml 헤파린 소듐 및 50 ㎍/ml 메틸프레드니솔론이 포함된 세포자살 유도 매질로 세척 및 재현탁하였다. 그런 후, 세포를 6시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, 세포 프로세싱 시스템 (Fresenius Kabi, Germany)을 사용해 하트만 용액 중에 세포를 수집하여, 세척 및 재현탁하였다. 준비가 끝나면, ApoCell은 방사선요법 시설, Hadassah Ein Kerem에서 g-camera를 사용해 4000 cGy으로 방사선을 조사하고, 아넥신 V 및 PI (MBL, MA, USA) 염색 (각각 ≥ 40% 및 ≤ 15%)을 통해 ApoCell의 생존성을 유세포 측정기로 측정하였다. 결과는 FCS 익스프레스 소프트웨어로 분석하였다.
방사선 처리된 ApoCell 집단은, 존재하는 임의의 생존 세포가 세포 활성이 억제되고 증식 능력이 감소 또는 전혀 없는, 초기 세포자살성 세포를 포함하는 것으로 간주하였다. 일부 경우에, ApoCell 집단에 살아있는 비-세포자살성 세포가 존재하지 않았다.
결과:
동결 및 인큐베이션 (세포자살 유도)시 항-응집제를 첨가하고 이후 2-8℃에서 보관하여 준비한 FP의 안정성을 아래 표 3에 나타낸다.
표 3: 세포 카운트*- MICROS 60 혈액 분석기를 사용해 수행.
FP 시간대 세포 농도 (x106세포/ml) 세포 감소 %
t0 20.8 NA
t24h 20.0 -3.85
t48h 20.0 -3.85
t72h 19.7 -5.3
*6 (육회) 실험의 결과.
유도 매질에 항-응집제를 첨가하지 않고 세포를 준비한 경우, 세포는 24시간 동안 안정적이었지만, 이후에는 불안정하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 항-응집제의 사용은 예상치 못하게도 세포자살성 세포 집단의 안정성을 적어도 72시간 연장하였다.
표 4: 트리판 블루 측정
FP 시간대 트리판 블루 양성 세포 (%)
t0 3.0
t24h 5.9
t48h 5.2
t72h 6.5
표 4의 결과는 FP가 적어도 72시간 동안 높은 생존성을 유지함을 보여준다.
표 5: 세포자살 분석 - (AnPI 염색) 유세포 측정을 이용하여 수행
FP 시간대 1.5mM Ca
An-PI- (%) An+PI- (%) An+PI+ (%)
t0 44.3 50.9 4.8
t24h 39.0 55.9 5.1
t48h 34.8 60.1 5.1
t72h 33.4 60.5 6.1
표 5의 결과는, 세포자살성 세포의 %가 괴사성 세포와 비교해 세포 준비 후 적어도 72시간 동안의 연장된 기간 동안 초기 세포자살성 세포 %를 유지함을, 보여준다.
동결시 및 세포자살 유도시 항-응집제를 첨가한 결과, 안정적인 초기-세포자살성 세포가 고 수율로 매우 일정하게 수득되었다 (초기 세포자살성 세포의 평균 수율 61.3±2.6% % 대 48.4±5.0%, 여기서 100% 수율은 동결 시점의 세포 수를 기준으로 함). 이러한 높은 수율은 2-8℃에서 24시간 보관한 이후에도 유지되었다.
다음으로, 동결시, 해동시 또는 이 둘다에 항-응집제를 포함시킨 경우를 비교하였으며, 이때 회수 퍼센트(%)와 안정성을 측정하였다. 항-응집제를 모든 집단의 세포자살성 인큐베이션 믹스에 포함시켰다. 표 6은 이들 실험의 결과를 나타낸다.
표 6: 동결 ("F") 및 해동 ("Tha")시 항-응집제를 첨가 ("+") 또는 비-첨가 ("-")하여 수집한 세포로부터 준비된 최종 산물 (FP)에 대한 수율 및 안정성 비교
공여자 ID 수집 세포 #
(x109, 100%)		 수집 세포의 최종 산물의 세포 회수%
FP t0 FP t24h*
F-/Tha- F-/Tha+ F+/Tha+ F+/Tha- F-/Tha- F-/Tha+ F+/Tha+ F+/Tha-
1 13.3 52.1 53.4 62.5 62 52.1 48.9 62.5 62
2 13.6 50.5 36.7 53.5 63.5 47.6 36.7 53.1 59.7
3 15.0 42.7 42 53.6 58.4 42.7 41.7 53.6 57.8
Avg 14.0 48.4±5.0 44.0±8.5 56.5±5.2 61.3±2.6 47.5±4.7 42.4±6.1 56.4±5.3 59.8±2.1
항-응집제를 첨가 및 비-첨가하여 준비한 초기 세포자살성 세포 집단 (세포 배치)에 대한 추가적인 집단 비교 분석에서도, 일관된 결과가 나타났다.
표 7: 항-응집제 첨가 및 비-첨가 조건에서 준비된 배치들 간의 세포 집단 분석 비교
Figure pct00001
항-응집제 존재 및 부재시 최종 산물 세포 % (수율). 표 3에 나타낸 결과와 마찬가지로, 표 6에 제시된 데이터는, 항-응집제의 존재 하에 동결시킨 세포로부터 준비된 초기 세포자살성 세포가 신선한 최종 산물 (FP t0)의 평균 수율에 있어 항-응집제 무첨가 동결 세포와 비교해 더 유익한 효과가 있음을, 보여준다. 유익한 효과는, 항-응집제를 동결시에만 사용하였을 때 (61.3±2.6% vs 48.4±5.0%), 또는 동결 및 해동시 둘다에 사용한 경우에 (56.5±5.2% vs 48.4±5.0%) 관찰되었다. 유익한 효과는, 해동시에만 항-응집제를 사용한 경우에는 유의성이 떨어졌다 (44.0±8.5% vs 48.4±5.0%). 이들은 non-고 트리글리세라이드 (non-high triglyceride) 샘플이다.
응집에 대한 항-응집제 효과. 3종의 non-고 트리글리세라이드 샘플 또는 21종의 추가적인 샘플에서는 세포 응집이 관찰되지 않았다 (데이터 도시 안함). 그러나, 항-응집제를 사용하지 않고 준비한 다른 non-고 트리글리세라이드 샘플 41종에서는 (데이터 도시 안함), 경미한 응집이 10종 (24.4%)에서, 상당한 응집이 5종 (12.2%)에서 관찰되었는 바; 즉, 항-응집제는 세포 응집을 완전히 방지한다.
안정성에 대한 항-응집제 효과. 항-응집제를 첨가 또는 비-첨가하여 준비한 신선한 FP들을 24시간 동안 2-8℃에 보관하여, 제조 공정에 ACDhep의 첨가가 FP 안정성을 손상시키는지를 확인하였다. 24시간 보관 후 세포를 샘플링하고, 세포 카운트로 수율을 계산하였다. 표 3에 나타낸 연장된 시간 동안 (최대 72시간)의 결과와 마찬가지로, 표 6에서, 항-응집제를 동결시에만 사용한 경우 (59.8±2.1% vs 47.5±4.7%), 또는 동결 및 해동시 둘다에 사용한 경우에 (56.4±5.3% vs 47.5±4.7%), 유익한 효과가 유지 및 관찰되었다. 유익한 효과는, 해동시에만 항-응집제를 사용한 경우에는 거의 유의하지 않았다 (42.4±6.1% vs 47.5±4.7%). 이들은 모두 non-고 트리글리세라이드 샘플이다. 이러한 결과들은, 모든 처리에서 FP 24시간 보관 후 세포 손실이 최소화되고, 동결 및 해동 둘다에 항-응집제 처리된 세포에서 특히 유익함을 보여준다. 동결시에만 항-응집제 처리된 세포의 평균 손실은 항-응집제 비-첨가 1.9±3.3% 대비 2.3±3.2%이었으며, 해동시에만 항-응집제 처리된 세포의 평균 손실은 항-응집제 비-첨가 1.9±3.3% 대비 3.0±4.7%, 그리고 동결 및 해동 둘다에 ACDhep 처리된 세포의 경우에는 항-응집제 비-첨가 1.9±3.3% 대비 0.2±0.4%이었다. 요컨대, 수율에 대한 항-응집제의 유익한 효과는 적어도 24시간 유지되었다.
FP의 대표적인 세포 집단의 특징을 아래 표 8에 나타낸다.
표 8: 동결 ("F") 및 해동 ("Tha")시 항-응집제를 첨가 ("+") 또는 비-첨가 ("-")하여 수집한 세포로부터 준비된 신선한 (t0) FP의 세포 집단 특징*
Figure pct00002
*세포자살 유도는 모든 배치들에서 항-응집제 함유 매질을 사용해 수행하였다.
표 8의 결과는 동결 및 해동시 항-응집제 첨가 또는 비-첨가하여 준비된 초종 산물 (FP)의 세포 특징을 보여준다. 배치를 샘플링하여, 단핵구 마커를 염색한 다음 유세포 측정으로 분석하여 항-응집제의 첨가가 세포 집단에 영향을 미치는지를 조사하고 각 샘플에서 세포 분포를 확인하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 동결 또는 해동시 항-응집제를 첨가 또는 비-첨가하여 준비한 세포 집단에서는 유의한 차이가 검출되지 않았다. 신선한 FP에서 평균 T 집단 (CD3+ 세포)은 동결 전 62.9±1.1% 대비 62.3±1.2%이었으며; 평균 B 세포 집단 (CD19+ 세포)은 동결 전 3.1±0.8% 대비 8.3±2.5%이었으며; 평균 자연 살상 세포 집단 (CD56+ 세포)은 동결 전 12.9±0.5% 대비 9.5±0.7%이었으며; 평균 단구 세포 집단 (CD14+ 세포)은 동결 전 17.5±0.3% 대비 13.8±0.5%이었으며; 평균 과립구 집단 (CD15+ 세포)은 동결시 0.35±0.2% 대비 신선한 FP에서 0.0%이었다.
또한, 초기 세포자살성 집단의 효력을 조사하였다.
표 9: 동결 ("F") 및 해동 ("Tha") 공정 중에 항-응집제를 첨가 ("+") 또는 비-첨가 ("-")하여 수집한 세포로부터 준비된 신선한 (t0) FP의 효력 분석.
공여자 ID #
처리 		FP t0
F-/Tha- F-/Tha+ F+/Tha+ F+/Tha-
매질 형광 DR CD86 DR CD86 DR CD86 DR CD86
DC 1: 2 초기 세포자살성 세포 집단 +LPS 3% 28% LPS로부터 최대 4% 24% 5% 24% 9% 15%
DC 1: 4 초기 세포자살성 세포 집단 +LPS 4% 38% 6% 35% 6% 34% 6% 24%
DC 1: 8 초기 세포자살성 세포 집단 +LPS 13% 비-실시 10% 45% 15% 54% 8% 48%
각 최종 산물이 (LPS) 자극 후 미성숙 수지상 세포 (iDC)에서 관용 상태를 강화하는 능력을 확인하기 위해 수행한 효력 분석의 결과를 표 9에 나타낸다. 관용 효과는 초기 세포자살성 세포 집단과의 상호작용 및 LPS 상향 조절을 유도하는 여러가지 처리 후 iDC에서의 CD86 발현 및 공동-자극 분자 HLA-DR의 하향 조절을 분석함으로써, 측정하였다. 분석은 DCsign+ 세포에 대해 수행하였다. 초기 세포자살성 세포 집단과의 상호작용 후, 그리고 LPS 첨가 대 LPS-유도 성숙화 후, 성숙화 지연 % 결과를 나타낸다. 항-응집제 첨가 또는 비-첨가하여 준비한 신선한 FP (t0)의 효력 실험을 수행하였다. 표 9에 나타낸 결과는, 항-응집제 첨가 또는 비-첨가하여 준비한 세포자살성 세포가 용량-의존적인 방식으로 공동-자극 마커 둘다에 대해 관용 효과를 강화함을 보여준다.
본원에서 제조된 초기 세포자살성 세포는 non-고 트리글리세라이드 샘플로부터 유래된 것이었다. 안정적인 초기 세포자살성 세포의 일정한 높은 수율은, 공여 혈장에 트리글리세라이드 농도가 높은 경우에도, 달성되었다 (예, 국제 특허 출원 공개번호 2014/087408 및 미국 특허 출원 공개번호 US2015/0275175-A1의 실시예 12 및 13 참조). 초기-세포자살성 세포의 주입용 최종 투여 제형 제조에 사용되는 PBS 매질에는 항-응집제를 첨가하지 않았다.
요약
실험의 목적은 안정적인 고 수율의 초기 세포자살성 세포 집단을 생산하는 것이었다. 항-응집제의 사용에 대한 합리적인 근거는 고-트리글리세라이드 환자에서 응집체가 처음에 관찰되었지만, 이후 다른 환자들에서도 상당 비율로 관찰되었다는 것이다. 이러한 우려는 항-응집제의 사용이 세포자살을 방지한다는 미국 특허 6,489,311의 개시 내용이다.
간략하게는, 항-응집제를 첨가하였을 때, 최종 산물에서 수집된 세포수 (수율)는 적어도 10-20% 현저하게 개선되었으며, 세포의 조성, 생존성, 안정성 및 세포자살 특성에 대한 영향은 최소 수준이었다. 본 실험에서, 수율 최대 13% 증가가 관찰되었으며, 이는 통제된 조건에서 수율 26.8% 증가이지만, 이후 1회 수집으로 제조할 수 있는 실제 GMP 조건에서는 세포 수 최대 33% 이상의 증가이다. 이러한 효과는, 공여자로부터 2차 성분채집술을 수행할 필요성을 없앨 수 있기 때문에, 매우 중요하다.
이러한 효과는, 예상된 영향이 경미한 응집체의 용해일 것으로 예상되므로, 놀라운 일이다. 항-응집제를 첨가한 세포 해동이 응집체의 양적 감소를 유도한다는 가설을 확립하였다. 응집체는, 형성되면, 최종적으로 상당한 세포 손실을 유발한다. 항-응집제를 사용하기 않고 수집 및 동결한 세포는, 세척 후 즉각적으로, 해동시 응집체가 형성되었다. 또한, 항-응집제 비-첨가 동결 및 항-응집제 함유 매질 내 재현탁 세포에서도 다량의 응집체가 검출되었다. 항-응집제 함유 매질에서 동결 및 재현탁을 모두 실시한 세포에서는 응집체가 관찰되지 않았다. 요컨대, 동결 및 세포자살 유도시 항-응집제 첨가가 매우 중요하며, 세포 집단에서 초기 세포자살을 유도하는데 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 결론내렸다.
초기 세포자살성 세포의 회수를, 예를 들어, 안정성 목적으로, 2-8℃에서 24시간 보관한 후 조사하였으며, 이 기간 동안 평균 세포 손실은 제조 조건과 무관하게 3-4.7%로 측정되었으며, 항-응집제 함유 매질을 사용해 동결 및 용해한 세포에서 우호적인 결과 (FP 24시간 보관 후 세포 손실 0.2±0.4%)가 관찰되었는데, 이는 항-응집제의 첨가가 동결 및 해동시 중요하며, 최종적으로 제형화시 초기 세포자살성 세포 집단이 안정적이라는 것을 시사한다. 연장된 시간 실험에서 이의 안정성은 적어도 72시간인 것으로 관찰되었다.
FP 산물의 세포자살 및 생존성뿐 아니라 세포 조성은, 동결 및/또는 해동시 항-응집제의 첨가에 현저하게 영향을 받지 않았다. 매우 다양한 특징들로부터 측정된 값들은 비슷하였으며, 이는 ACDhep가 초기 세포자살성 세포 특징을 변형시키지 않으며, 최종 산물이 세포자살성 세포 ≥40%인 허용 기준을 충족시킨다는 것을 의미한다.
세포자살성 세포 효력을 검사하기 위해 사용한 분석은 식세포 작용, 항원 제시 및 사이토카인 생산과 같은 기능으로 특정되는 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 기반으로 한다.
HLA-DR (MHC 클래스 II) 막 분자 및 공동-자극 분자 CD86을, 항원 제시 세포 (APC)의 관용 효과를 검출하기 위한 마커로 선택하였다. 유세포 측정을 이용해, iDC 상의 HLA-DR 및 CD86 발현 변화를 LPS 자극 후 측정하였으며, 그리고 항-응집제 첨가 또는 비-첨가하여 준비하고 LPS로 자극한 초기 세포자살성 세포 집단의 존재 하에 측정하였다. 초기 세포자살성 세포 집단은 DC에 iDC : 초기 세포자살성 세포 집단 1:2, 1:4, 및 1:8의 비율로 제공하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 초기 세포자살성 세포 집단은 용량-의존적인 방식으로 자극된 DC에 대해 관용 효과를 강화하는 것으로 입증되었으며, 동결 및 세포자살 유도시 항-응집제를 첨가하여 준비한 초기 세포자살성 세포 집단에서는 좀더 나은 결과가 나타났다.
요컨대, 동결 및 세포자살 매질 둘다에 항-응집제의 첨가가, 세포 회수 증가 및 응집으로 인한 대규모 세포 손실 방지에 중요하고, 다수 경우에 공여자로부터 2차 성분채집을 수행할 필요가 없다는데 중요하다는 결론을 내렸다. 모든 세포들이 검증된 FP의 허용 기준에 부합되며, 항-응집제의 첨가가 FP를 손상시키지 않는 것으로 입증되었다.
실시예 2: 시험관내 사이토카인 폭풍 모델에서 사이토카인 방출에 대한 세포자살성 세포의 효과
목적: 대식세포 활성화 증후군의 LPS-Sterile 모델에서 유도된 사이토카인 폭풍에서 사이토카인 폭풍 마커 (사이토카인 IL-6, IL-10, MIP-1α, IL-8, TNF-α, MIP-1β, MCP-1 및 IL-9) 수준에 대한 세포자살성 세포의 효과 검사
방법:
세포주 및 배양 시약
인간 림프종 세포주 Raji (eCACC, UK, access no. 85011429), 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa (ATCC, USA, number: CCL-2) 및 HeLa-CD19 (ProMab, USA, cat. no. PM-Hela-CD19)는, 10% FBS (Gibco, ThermoFisher Scietific, South America, cat. no. 12657-029), 2 mM GlutaMAX (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 35050-038) 및 100 U/ml 페니실린 + 100 U/ml 스트렙토마이신 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 15140-122)이 첨가된, RPMI 1640 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 31870-025)에서 배양하였으며, 이는 "완전 배지"로 지칭된다. HeLa-CD19 배지에는 표준 배양시 선택 항생제로서 1 ㎍/ml 푸로마이신 (puromycin) (Sigma-Aldrich, USA, cat. no. P9620)이 추가로 첨가되었다.
세포들 모두 서브-컨플루언트 상태로 유지시켰다. Raji 세포는 0.3 x 106 - 2 x 106 세포/ml의 농도 범위로 유지시켰다. HeLa 및 HeLa-CD19 세포가 용기에서 90% 컨플루언스에 도달하면, 계대 배양하였다.
채혈액 연층에서 일차 단구를 분리하였다 (Sheba Medical Center, Israel). 먼저, 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)를 피콜 밀도 구배 (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare, UK, cat. no. 17-1440-03)로 분리하였다. 이를 원심분리 (800x g, 2-8℃, 20분, 브레이크 0)하여, PBMC가 함유된 계면을 새로운 시험관으로 옮기고, 2 mM L-글루타민 (Lonza, Switzerland, cat. no. BE17-605E) 및 10 mM Hepes (Lonza, Switzerland, cat. no. BE17-737B)이 첨가된 RPMI-1640 (Lonza, Switzerland, cat. no. BE12-918F)으로 헹구었으며, 이를 "세척 배지"라 하며, 이후 이를 원심분리하였다 (650x g, 2-8℃, 10분). 펠릿화된 세포를 "세척 배지"에 15 x 106 세포/ml 농도로 재현탁하였다. 세포를 35 mm 플레이트 (Corning, USA, cat. no. 430165)의 중앙에 0.9 ml 액적으로 접종하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터에서 1.5시간 배양하여 (37℃, 5% CO2), 단구가 부착되게 둔 후, 미리 데운 PBS (Lonza, Switzerland, cat. no. BE17-516F)로 3번 세척하여 다른 타입의 세포를 제거하였다. 세척 후, 세포를 "완전 배지"로 지칭되는 10% FBS (Gibco, ThermoFisher Scietific, South America, cat. no. 12657-029), 2 mM GlutaMAX (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 35050-038) 및 100 U/ml 페니실린 + 100 U/ml 스트렙토마이신 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 15140-122)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 31870-025) 2 ml에서 배양하였다.
세포주들 모두 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였다.
간략하게는, 하기 제조사의 지침에 따라, 타겟 세포 (HeLa 또는 HeLa-CD19)를 단독으로 또는 단구와 함께 배양하였다. 타겟 세포를 플레이트에 부착시킨 후 (6h-밤새), 배양물을 1시간 동안 y x 106 ApoCell 세포에 노출시킨 다음 이들 세포를 RPMI로 4-5회 세척하여 제거하였다. ApoCell 세포의 제거는 광학 현미경으로 가시적으로 검증하였다. 공-배양물에 10 ng/ml LPS (Sigma-Aldrich, USA, cat. no. L4391)를 첨가하여, 1시간 배양하였다. 배양 후, RPMI로 3-5회 세척 사이클을 수행하여 LPS를 제거하였다. 살아있는 CD19-CAR T-세포 또는 naive T-세포를 지정된 E/T 비율(들)로 첨가하여, 4시간 배양하였다. 배지를 수집하기 위해, 플레이트를 250x g로 2-25℃에서 4분간 원심분리 (Centrifuge 5810 R, Eppendorf, Germany)하여, 세포를 침전시켰다. 각 웰에서 상층액 배지 50 ㎕를 취하여 새로운 바닥이 평평한 96웰 마이크로플레이트 웰 (Corning, USA, cat. no. 3596)로 이동시키고, 각 웰에 CytoTox 96 시약 50 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 암 조건 하 실온에서 30분간 인큐베이션한 후, 웰 당 정지 용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. Infinite F50 (Tecan, Switzerland)을 사용해 492 nm에서 흡광도를 측정하고, Magellan F50 소프트웨어를 사용해 포착하였다. 데이터 분석과 그래프 생성은 Microsoft Excel 2010을 사용해 수행하였다.
사이토카인 방출 분석을, 세포자살성 세포와 배양하거나 또는 세포자살성 세포의 상층액과 배양한 후, Liminex 기법을 이용해 수행하였다.
결과 : 도 4a - 4h에 따르면, 대식세포 활성화 증후군의 시험관내 모델에서, LPS에 의해 유도된, 사이토카인 폭풍 마커 IL-10, IL-6, MIP-1α, IL-8, TNF-α, MIP-1β, MCP-1 및 IL-9의 수준이 현저하게 감소되었다. ApoCell을 대식세포:Apocell 비율 1:8로 투여하였을 경우, 배지로 방출되는 IL-10, IL-6, MIP-1α, IL-8, TNF-α, MIP-1β, MCP-1 및 IL-9의 수준에 현저한 감소가 발생하였으며 (도 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H), ApoCell을 대식세포:Apocell 비율 1:16으로 투여하였을 경우, 이 모델에서 사이토카인 IL-10, IL-6, MIP-1α, IL-8, TNF-α, MIP-1β, MCP-1 및 IL-9 방출 수준이 실제 저해되거나 또는 거의 저해되었다.
세포자살성 세포의 첨가는, 대식세포 활성화시 유도되는 20종 이상의 전-염증성 사이토카인과 케모카인의 저해를 야기하였으며, 이러한 결과의 일 예를 도 4A-4H에 나타낸다. 전-염증성 사이토카인 및 케모카인 방출의 공통 기전은 NF-κB의 저해이다.
전-염증성 사이토카인 및 케모카인의 방출 저해는, 비슷한 조건에서 사이토카인 IL-2R (IL-2 수용체) 수준에 대한 실험에서, IL-2R 방출 수준이 전-염증성 사이토카인들에 동일한 방식으로 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 바, 특이적인 것으로 보인다 (도 4I). 세포자살성 세포 첨가시, 1:4 및 1:8 비율에서, IL-2R의 방출이 증가되었다. 나아가, 도 4J에 따르면, 세포자살성 세포는 24시간 동안 IL-2의 방출에 영향을 미치지 않는다. IL-2 수용체의 활성화는 관용 등의 면역계의 주요 기능에 필연적인 역할을 하는 것으로 보인다.
결론 : 대식세포 활성화 증후군의 사이토카인 폭풍 모델에서, 암 및 CAR-19의 존재 하에 초기-세포자살성 세포를 첨가하면, 전-염증성 사이토카인, 예를 들어 IL-10, IL-6, MIP-1α, IL-8, TNF-α, MIP-1β, MCP-1 및 IL-9이 현저하게 감소되었으며, 놀랍게도 심지어 방지되었지만, 사이토카인 IL-2R 수준은 증가되거나 또는 영향이 없었다. 즉, 이러한 결과는, 전-염증성 사이토카인들이 세포자살성 세포와의 인큐베이션에 의해 감소되지만, IL-2 및 IL-2R은 초기-세포자살성 세포의 배양과 동일한 방식으로 영향을 받지 않는다는 것을, 보여준다. 따라서, T-세포 관련 사이토카인은 CAR T-세포 요법 + 세포자살성 세포에 의해 영향을 받지 않지만, 선천적인 면역 사이토카인, 예를 들어 단구, 대식세포 및 수지상 세포로부터 방출되는 사이토카인은 영향을 받는다.
실시예 3: CAR-T-세포 효능에 부정적인 영향을 미치지 않는 세포자살성 세포의 사이토카인 폭풍에 대한 효과
목표 : 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포로부터 유래된 상층액의, 사이토카인 폭풍 마커 사이토카인 및 CAR T-세포의 종양 세포에 대한 효능에 대한 효과 검사.
방법 :
T4+ CAR T-세포
마우스에서 사이토카인 폭풍을 유도하는 것으로 보고된 고형 종양 모델 (van der Stegen et al., 2013 ibid)을 이용하였다. 이 모델에서, 두경부 종양 및 난소암과 같은 특정 고형 종양에서 종종 고도로 상향-조절되는, 특정 ErbB 이량체 (T4+ CAR-T-세포)를 타겟팅하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 가지도록 T-세포를 조작하였다. CD3 마이크로-비드를 사용하여 말초혈에서 분리된 PBMC로부터 T-세포를 단리하였다. 키메라 T4+ 수용체를 포함하는 벡터를 구축하고, 단리된 T-세포에 형질도입하여, T4+ CAR T-세포를 제조하였다. 본원에서 수행된 실험에서, T4+ CAR T-세포는 Creative Biolabs (NY USA) 또는 Promab Biotechnologies (CA USA) 사에서 구입하였다. 도 5는 유세포 측정 그래프로서, 항-CD124 단일클론 항체를 사용하여 T4+ CAR T-세포 상의 4αβ 키메라 수용체의 표면 발현을 검증한 것이다 (Wilkie et al., ibid). 또한, PCR 절차를 수행하여 형질도입된 T-세포에서 벡터의 존재를 검증하였다.
SKOV3-luc 세포
SKOV3-luc 난소 선암종 조직 배양 세포를 Cell BioLabs (cat. #AKR-232) 사에서 구입하였다. SKOV3-luc는 ErbB 수용체를 고도로 발현하며, T4+ CAR-T-세포의 타겟이다 (van der Stegen et al., 2013, ibid). 이 세포를, 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 구성적으로 발현하도록 조작하여, 시험관내 세포 증식과 생체내 종양 증식과 감퇴를 추적할 수 있게 하였다.
세포자살성 세포
세포자살성 세포는 실시예 1에 따라 준비하였다.
세포자살성 세포의 상층액
12웰 플레이트에 세포자살성 세포를 웰 당 팔(8)백만개 접종하였다. 24시간 후 세포를 원심분리하였다 (290 g, 4℃, 10분). 상층액을 수집하여, 사용 시까지 -80℃에서 분액하여 냉동시켰다. 세포를 다양한 수로 사용해 상층액을 준비하였다. 일부 분액은 농축된 상층액을 포함한다.
단구 분리
건강한 적격의 공여자로부터 수득한 말초혈/연층으로부터 Ficoll (GE healthcare, United Kingdom)을 이용해 PBMC를 분리하였다. 세포를 RPMI1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에 15 x 106 세포/mL의 농도로, 35 mm 플레이트 (Corning, NY, USA)의 중앙에 0.9 mL 액적으로 접종하였다. 그런 후, 플레이트를 37℃에서 5% CO2 중에 1시간 배양하였다. 배양 종료 후, 세포를 PBS (Biological industries, Beit Haemek, Israel)로 3번 세척하고, 광학 현미경으로 부착을 확인하였다. 이후, 세포를 완전 배지 (RPMI1640 + 10% 열 불활성화된 FBS + 1% Glutamax + 1% PenStrep, 모두 Gibco로부터 입수)에서 배양하였다.
인간 단핵구 세포를 밀도 구배 원심분리에 의해 헤파린 처리된 말초혈로부터 분리하는 또 다른 단구 분리 방법을 사용하였다. 단리된 단핵구 세포를 단구, B-세포 및 T-세포 집단으로 분리하였으며, 단구는 자기 비드 분리 (Miltenyi Biotec., Auburn, CA, USA)에 의해 CD14+ 분획 양성으로 선별하고, B-세포는 CD22+ 분획 양성으로, T-세포는 CD14-CD22-분획 음성으로 선별하였다. 단구의 경우 순도가 >95%이었다.
대식세포의 분화를 위해, 부착의 종료 후, 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 RPMI1640 + 1% Glutamax + 1% PenStrep 및 10% 열 불활화된 인간 AB 혈청 (Sigma, MO, USA)을 첨가하여 배양하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 7-9일간 배양하였으며, 3일 및 6일에 배지를 교체하였다. 분화는 광학 현미경을 통해 형태적으로 확인하였다.
apo+ 단구 유래 상층액
CD14+ 단구를 상기와 같이 준비한 세포자살성 세포와 함께 1:16의 비율로 24시간 배양하였다. 단구의 개수는 12웰 플레이트에서 웰 당 세포 오십만개였으며, 세포자살성 세포의 개수는 12웰 플레이트에서 웰 당 세포 8백만개였다. 24시간 배양 후, 세포를 원심분리하였다 (290 g, 4℃, 10분). 상층액을 수집하여, 사용할 때까지 -80℃에서 분액하여 냉동시켰다. 여러가지 비율의 단구:세포자살성 세포로, 및/또는 대식세포 및 수지상 세포와 같은 다른 세포 공급원을 사용하여, 비슷한 공정들을 수행할 수 있었다.
시험관내 배양 조건
일차 실험은, SKOV3-luc 암 세포를 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액과 함께 1시간 배양한 후, T4+ CAR T-세포 (+/- 단구-대식세포)와 함께 48시간 공-배양함으로써, 수행하였다.
생체내 조건을 시뮬레이션하기 위해, 1 x 105 THP-1 세포/ml (HTCC USA), 또는 단구 또는 대식세포 또는 수지상 세포를 72시간 동안 200 nM (123.4 ng/ml) 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA)를 사용해 분화시킨 후, PMA 첨가없이 완전 배지에서 다시 24시간 배양하였다. 그런 후, 암 또는 종양 세포 - 예, SKOV3-luc 세포를 24웰 플레이트에 5 x 105 SKOV3-luc 세포/웰로 분화된 THP-1 세포 상에 접종하였다. 암 또는 종양 세포를 일차 배양한 후, 4 x 105 - 8 x 105개의 세포자살성 세포 (ApoCell)를 배양물에 1-3시간 첨가하여 면역관용 환경을 유도하였다. 암 세포 : ApoCell의 비율을 각 세포 타입에 따라 최적화하였다. 세척 후, 공-배양물에 10 ng/ml LPS를 처리한 다음, 1 x 106 T4+ CAR T-세포 (또는 작동자/타겟 (E/T) 비율 그래프에 의해 결정된 양)를 첨가하였다. 각 종양 또는 암 세포 타입들에 대한 작동자/타겟 (E/T) 비율 그래프를 구하기 위해, 종양 세포 및 T4+ CAR T-세포의 비율에 변화를 주었다.
SKOV3 암 세포의 세포독성을 분석하기 위해, 세포용해물을 준비하고, 48시간 인큐베이션한 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 추가적인 실험을 수행하여, 다른 암 세포 타입에 대한 암 또는 종양 세포 세포독성을 배양 시간 48시간 동안 일정 간격으로 분석하였다. 다른 예로, Promega 사의 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, cat #G1780)을 사용하였다.
세포용해물 제조
SKOV3-luc 단층을 PBS로 세척하여 남아있는 혈청을 제거한 후 x1 CCLR 세포용해 완충제 70 ㎕/웰 (24웰 플레이트)을 첨가하여, SKOV3-luc 세포 용해물을 준비하였다. 웰 바닥부를 물리적으로 긁어 더욱 탈착시켰다. 15초간 볼텍싱한 후, 세포용해물을 2분간 4℃에서 12,000g로 원심분리하였다. 상층액을 수집하여 -80℃에서 보관하였다.
시험관내 루시퍼라제 활성
배양 중인 SKOV3-luc 세포에서 루시퍼라제 활성을 검출하기 위해, Luciferase Assay System (Promega, cat. #E1501)을 이용하였다. 루미노미터 리더 (Core Facility, Faculty of Medicine, Ein Kerem, Hebrew University of Jerusalem)를 이용한 키트의 보정은 QuantiLum 재조합 루시퍼라제 (Promega, cat. #E170A)로 수행하였다. 검출 범위를 결정하기 위해 612 ag - 61.2 ㎍ (10-20-10-9 몰)을 사용하였으며, 다음과 같이 제조사의 가이드에 따라 수행하였다. 간략하게는, 각 루시퍼라제 양을 20 ㎕ 부피로 구성하여 블랙 96웰 플레이트 (Nunc)의 웰에 넣었다. 각각의 양에 대해 3세트로 수행하였다. 각 웰에 LAR (Luciferase Assay System kit의 루시페린 기질) 100 ㎕를 첨가하고, 10초 노출한 후 즉시 판독하였다.
루시퍼라제 활성을 판독하기 위해, 세포용해물을 얼음 위에서 해동하고, 샘플 20 ㎕를 블랙 96웰 플레이트 (Nunc)에 넣었다. 각 샘플은 2세트로 사용하여 측정하였다. LAR 100 ㎕를 첨가하고, 10초 노출시킨 다음 2.5분 간격으로 25분간, 그리고 이후 10분간 40초 간격으로 발광성을 판독하였다.
사이토카인 분석
IL-2, IL-2 수용체 (IL-2R), IL-6, IL-1α, IL-4, IL-2, TNF-α에 대한 일차 분석을 수행하였다. IL-2, IL-2 수용체 (IL-2R), IL-6, IL-1α, IL-4, IL-2, TNF-α 뿐만 아니라 다른 사이토카인의 사이토카인 방출 감소를 분석하기 위해, 상층액을 수집하여, Luminex MagPix reader 및 ELISA 분석을 이용해 선택 사이토카인에 대한 실험을 수행하였다.
결과 :
SKOV3-luc 증식
추가적인 실험에서 타겟 SKOV3-luc 세포 수를 측정하기 위해, 지표로서 루시퍼라제 활성을 이용해 SKOV3-luc 증식을 추적하였다. SKOV3-luc 세포를 3.8 x 104-3.8 x 105 개/웰로 24웰 플레이트 (Corning)에 접종하고, 3일간 매일 루시퍼라제 활성을 모니터링하였다. 접종한 세포는 1.9 x 105 개/웰 또는 그 이상의 컨플루언스에 도달하였으며, 접종 후 2일째 루시퍼라제 활성에 의해 증식 포화가 확인되었다 (도 6). 접종 3일 후 SKOV3-luc 세포 3.8 x 104-1.1 x 105 개/웰은 여전히 선형 또는 지수기 증식 단계이었다 (도 6, 오렌지색, 청록색 및 보라색으로 표시됨). 음성 대조군 (3.8 x 105 SKOV3-luc 세포, LAR 기질 무첨가)은 백그라운드 수준만 나타내므로, SKOV3-luc 세포의 생발광 판독값이 루시퍼라제 활성의 결과임을 입증해준다.
SKOV3-luc 종양 세포에 대한 T4 + CAR-T-세포의 활성 검증
T4+ CAR-T-세포 활성을 입증하기 위해, 단층의 SKOV3-luc을 1,000,000 (백만)개의 T4+ CAR-T-세포 또는 1,000,000 (백만)개의 비-형질도입된 T-세포 중 하나에 노출시켰다. 24시간 배양한 후, T4+ CAR-T-세포는 비-형질도입된 T-세포 대조군과 비교해 SKOV3-luc 증식을 30% 감소시켰으며 (도 7), 이는 T4+ CAR-T-세포의 항-종양 활성을 입증해준다.
SKOV3-luc 종양 세포에 대한 독립형 (stand-alone) T4+ CAR-T-세포의 활성을 세포자살성 세포에 노출한 이후의 활성과 비교하였다
세포자살성 세포 (ApoCell) 및 세포자살성 세포의 상층액 (ApoSup 및 ApoMon Sup)을, T4+ CAR-T-세포 항-종양 활성을 방해하는지를 확인하기 위해, 검사하였다. SKOV3-luc 종양 세포를 세포자살성 세포와 함께 1시간 배양한 다음, T4+ CAR-T-세포 (500,000, 오십만개) 또는 T4+ 비-형질도입된 T-세포 (500,000, 오십만개) (T4+ CAR-T-세포 대 세포자살성 세포 비율 1:2)를 첨가하였다. 종양 세포/세포자살성 세포/T4+ CAR T-세포를 48시간 공-배양하였다. 대조군 SKOV3-luc 종양 세포는 T4+ CAR-T-세포 및 하트만 (Hartman) 용액 (세포자살성 세포의 비히클)과 함께, 세포자살성 세포없이, 48시간 동안 공-배양하였다.
그 결과, 48시간 배양 후, T4+ CAR-T-세포의 항-종양 활성은 비-형질도입된 T-세포와의 배양에 비해 우수하였다. 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액을 사용해 동일하게 배양을 수행하였다. 놀랍게도, T4+ CAR T-세포의 항-종양 활성은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액에 노출된 경우 또는 노출되지 않은 경우 비슷하였다 (도 8).
CAR-T 처치로 인한 사이토카인 폭풍을 개선, 감소 또는 저해하는 세포자살성 세포의 효과
세포자살성 세포의 사이토카인 폭풍 저하 효과를 이후 조사하였다. IL-6는 사이토카인 폭풍에서 방출되는 프로토타입의 전-염증성 사이토카인으로 (Lee DW et al. (2014) Blood 124 (2): 188-195), 사이토카인 폭풍 반응의 마커로서 종종 이용된다.
생체내 CAR T-세포 요법의 환경을 모방하기 위한 배양을 확립하였다. SKOV3-luc 종양 세포를 인간 단구-대식세포 및 T4+ CAR T-세포의 존재 하에 배양하였다. 배양 배지에서 측정된 IL-6의 농도는 대략 500-600 pg/mL이었다. 이러한 농도의 IL-6는 사이토카인 폭풍을 의미한다.
예상치 못하게, 종양 세포를 미리 세포자살성 세포와 함께 1시간 배양한 (T4+ CAR-T-세포 대 세포자살성 세포의 비율 1:2), SKOV3-luc 종양 세포, 인간 단구-대식세포, T4+ CAR-T-세포의 배양 배지에서 측정한 IL-6 수준이, 극적으로 감소하였다. 마찬가지로, 종양 세포를 미리 세포자살성 세포의 상층액과 함께 1시간 배양한, SKOV3-luc 종양 세포, 인간 단구-대식세포, T4+ CAR-T-세포의 배양 배지에서 측정한 IL-6 수준 역시 극적으로 감소하였다. 이러한 IL-6 농도 감소는 사이토카인 폭풍의 저하를 의미한다 (도 9).
예상치 못하게, 세포자살성 세포 및 세포자살성 세포의 상층액이 종양 세포 증식에 대한 CAR-T-세포의 효과를 무력화하진 않지만, 동시에 질병을 유발하는 주요 사이토카인으로 기술된 IL-6와 같은 전-염증성 사이토카인을 하향 조절하는 것으로 판단되었다.
광범위 사이토카인 분석
인간 사이토카인 폭풍 발생시 임상 환경에서는 나타나지만, 실험시에는 관찰되지 않은 가능한 더 넓은 범주 및 수준의 사이토카인에 대한 효과를 추가로 분석하기 위해, LPS (10 ng/mL)를 전술한 SKOV3-luc 배양 조건에 첨가하였다. LPS의 첨가는 사이토카인 폭풍 수준을 지수적으로 증가시킬 것으로 예상된다. 예상한 바와 같이, LPS의 첨가는 사이토카인 폭풍 효과를 증가시켰으며, 그 결과 IL-6 수준이 대략 30,000 pg/mL까지 증가하였다. 사이토카인 폭풍 발생시 높은 수준으로 발현되는 것으로 알려진 다른 사이토카인도 증가된 수준으로 관찰되었다. 예: TNF-α (250 내지 300 pg/mL), IL-10 (200 내지 300 pg/mL), IL1-α (40 내지 50 pg/mL) 및 IL-18 (4 내지 5 pg/mLl). 도 10에 나타낸 바와 같이, 세포자살성 세포에 노출되면, IL-6의 수준은 사이토카인 폭풍의 지수기에도 임상 상황에서 볼 수 있는 거의 정상 수준으로까지 급격하게 감소하였으며, 이는 CAR T-세포를 이용한 실험 공정에서 늘 관찰되지 않는다. 이러한 효과는 다른 전-염증성 사이토카인 TNF-α, IL-10, IL1-α, IL-1β 및 IL-18에서도 비슷하였으며, 20-90%의 감소가 관찰되었다. 비슷한 결과는 세포자살성 세포 대신 세포자살성 세포의 상층액을 사용한 경우에도 관찰되었다.
세포자살성 세포의 IL-2 및 IL-2R에 대한 효과
SKOV3-luc 세포를 T4+ CAR T-세포와 함께 배양한 후 배양 상층액에서 측정한 IL-2의 농도는 1084 pg/ml이었다. SKOC3-luc 세포를 먼저 세포자살성 세포와 함께 배양한 다음 T4+ CAR T-세포와 배양한 경우, 놀랍게도, IL-2의 농도가 1190 pg/ml로 증가하였다. 마찬가지로, SKOV3-luc 세포를 T4+ CAR T-세포와 함께 배양한 후 배양 상층액에서 측정한 IL-2R의 농도는 3817 pg/ml이었다. SKOC3-luc 세포를 먼저 세포자살성 세포와 함께 배양한 다음 T4+ CAR T-세포와 배양한 경우, IL-2R의 농도는 놀랍게도 4580 pg/ml로 증가하였다. SKOV3-luc 단독의 경우, IL-2의 농도는 3.2 pg/ml이었으며, 세포자살성 세포 첨가시 그 농도는 10.6 pg/ml이었다. SKOV3-luc 단독의 경우, IL-2R의 농도는 26.3 pg/ml이었고, 세포자살성 세포 첨가시 그 농도는 24.7 pg/ml이었다.
결론
CAR-T-세포 요법은 상당수의 환자들에서 사이토카인 폭풍을 유발하는 것으로 입증되어 있다. 본원의 결과는, 세포자살성 세포 및 세포자살성 세포의 상층액이 놀랍게도 CAR-T-세포의 종양 세포에 대한 효과에는 영향을 미치지 않으면서도 사이토카인 폭풍의 사이토카인 마커들을 감소시킴을 입증해준다. 또한, 세포자살성 세포는 사이토카인 IL-2를 증가시키므로, CAR T-세포 증식을 유지 또는 증가시킴으로써 CAR T-세포 요법의 기간 (duration)을 증가시킬 수 있는 것으로 보인다.
실시예 4: 세포자살성 세포 요법은 CAR T-세포 요법을 투여한 마우스에서 사이토카인 폭풍을 방지한다
목적: T4+ CAR T-세포 효과와 사이토카인 폭풍 마커인 사이토카인의 수준을 확인하기 위한, 고형 종양 모델 (SKOV3 난소 선암종)에서의 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액의 생체내 효과 검사.
재료 및 방법
시험관내 실험
전술한 제조, 배양 및 결과 분석 방법을 비롯한 시험관내 방법 및 ErbB 타겟 항원 (본원에서 "T4+ CAR T-세포"로 지칭됨)을 인지하는 T4+ CAR T-세포, SKOV3-luc 세포, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, 단구, 대식세포 및 관련 분석의 이용과 관련된 방법들 모두 실시예 1에서 기술되었다. 동일한 방법을 여기서 적용하였다.
생체내 실험
마우 스
7-8주령의 SCID-beige 마우스 및 NSGS 마우스를 Harlan (Israel)에서 구입하여, 샤레트 연구소의 SPF 동물시설에서 사육하였다.
SKOV3-luc 종양 세포 (1 x 106 또는 2 x 106)를 SCID beige 마우스 또는 NSGS 마우스에 PBS 중의 i.p.로, 또는 200 ml Matrigel (BD Biosciences) 중의 s.c.로 투여하였다. 주사 후 약 14-18일에 생발광 이미지 촬영 (BLI)을 통해 종양의 생착을 검증하고, 마우스를 T-세포 투여하기 전 비슷한 신호 강도에 따라 그룹으로 분류하였다.
마우스에 30 x 106개의 세포자살성 세포를 T4+ CAR T-세포 투여하기 24시간 전, 또는 T4+ CAR T-세포 (10-30 x 106 T4+ CAR T-세포)의 투여와 동시에 투여하였다. 종양의 증식은 생발광 이미지 촬영 (BLI)을 통해 검증하고, 순환성 사이토카인의 수준을 Luminex로 측정하였다.
생체내 루시퍼라제 분석
종양의 증식을 반딧불이의 루시퍼라제 활성을 통해 매주 모니터링하였다. 간략하게는, D-루시페린 (E1605. Promega, USA) 3 mg/마우스 (100 ㎕, 30 mg/ml D-루시페린)을 이소플루란-마취 마우스에 i.p.로 주사하고, 주사한 지 10분 후 IVIS Imaging System 및 Live Image image capture software (둘다 Perkin Elmer, USA)를 사용해 복부 사진을 촬영하였다.
SKOV3-luc 세포가 0.5 x 106/마우스로 투여된 마우스를, D-루시페린 주사 후 5분에, "오토" 옵션으로 촬영함으로써, 각 이미지 세션에 대한 이미지 획득 파라미터를 정하였다. 캡처 파라미터는 24x 렌즈를 사용해 binning 4, F/stop 1.2 및 노출 2-4분으로 설정하였다. 데이터 분석 및 정량화는 Live Image software로 수행하였으며, 마이크로소프트의 엑셀 프로그램으로 그래프를 작성하였다.
생체내 세포독성
T-세포의 생체내 독성을 조사하기 위해, 마우스에서 장기를 수집하여, 포르말린으로 고정한 다음 조직병리학적 분석을 수행하였다.
사이토카인 분석
Luminex MagPix reader 및/또는 ELISA 키트, 세포측정 비드 분석 (Th1/Th2/Th17; BD Biosciences)을 제조사에서 공지한 바와 같이 사용해 상층액과 혈청을 분석하였다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 표 1 및 2에 열거된 또는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 사이토카인을 본원에서 분석할 수 있지만, 전-염증성 사이토카인, 일 예로 IL-6를 분석할 수 있다.
결과
생체내 SKOV3-luc 종양 캘리브레이션
SCID beige 마우스에 SKOV3-luc 세포 0.5 x 106, 1 x 106 또는 4.5 x 106개를 i.p.로 주사하고, 종양 증식을 추적하기 위해 방법에 기술된 바와 같이 생발광 이미지 (BLI)를 매주 촬영하였다 (데이터 도시 안됨).
마우 스의 임상 스코어
처음 4주간 마우스에서 임상 증상은 나타나지 않았다. 그러나, SKOV3-luc 주사 후 28일에, 고 용량으로 투여한 마우스 (4.5 x 106; 보라색 선)에서는 꾸준한 체중 감소가 관찰되기 시작하였으며 (도 11A), 마우스의 전체적인 증상이 악화되어, 무기력, 비정상적인 걸음 및 전체적인 활동 저하가 관찰되었다. 39일에 이 그룹을 추출하고, 복부 부검을 수행하여 종양 모양과 크기를 노출시켰다 (도 11B). SKOV3-luc 종양은 크고, 고형이며, 혈관 구조를 가지고 있으며, 백색을 띠는 빛나는 외양을 나타내었다. 복강내 미측 (caudal) 또는 문측 (rostral)의 주사 부위 (좌)에서 큰 종양이 현저하였다. 이 종양은 복강의 약 25-75%를 차지하였으며, 장을 명확하게 압박 및 방해하였다. 더 작은 병변들은 복강내 여러 부위에서 관찰되었다. 전체 마우스들에서 종양은 복강내에 존재하였고, 다른 신체 부위에서는 종양이 관찰되지 않았다. SKOV3-luc를 저 용량 (0.5 x 106) 또는 중간 용량 (1 x 106)으로 투여한 마우스에서는, SKOV3-luc 주사 후 40일에 체중 증가가 중단되었고 서서히 체중이 감소되기 시작하였다. 실험은 SKOV3-luc 주사 후 50일째에 완료하였다.
SKOV3-luc 종양 카이네틱스
SKOV3-luc 세포에 대한 대조군에는 PBS를 주사하였으며, 이들 마우스에서는 실험내내 루시퍼라제 활성이 관찰되지 않았다 (도 12, 좌측 패널). 종양 검출 및 증식은 용량-의존적이었다. 저 용량 (0.5 x 106 SKOV3-luc 세포)의 경우, 주사 후 25일에 종양이 생기기 시작하였으며 (동물 5마리 중 4마리), 중간 용량 (1 x 106)으로 주사한 경우에는 주사 후 18일에 종양이 관찰되었고 (동물 5마리 중 4마리), 고 용량 (4.5 x 106)의 경우 동물 5마리 중 3마리에서 주사 후 11일에 일찍 종양이 검출되었으며, 18일까지 모든 동물들에서 잘-확립된 종양이 검출되었다 (도 12 및 도 13A-13D).
CAR T-세포 요법은 사이토카인 방출 증후군을 유도한다
종양 비-함유 마우스 및 종양을 가진 마우스들로 구성된 3개의 군에, T4+ CAR T-세포 (3 x 106, 10 x 106 또는 30 x 106)를 용량 증가식으로 투여하였다 (i.p. 또는 종양에 직접 투여). 최고 용량에서, 종양 비-함유 마우스 및 종양 함유 마우스에서 24시간 이내에 억눌린 거동 (subdued behavior), 털세움 (piloerection) 및 운동성 저하가 관찰되었고, 급작스러운 체중 감소가 동반되었으며, 48시간 이내에 사망하였다. CAR T-세포가 최고 용량으로 투여된 마우스의 혈액 샘플에서 적어도 인간 인터페론-gamma 및 마우스 IL-6를 검출할 수 있었다. 다른 종양 항원을 겨냥하는 CAR T-세포를 고 용량으로 투여한 마우스에서는 체중 감소 또는 거동 변화는 관찰되지 않았다.
세포자살성 세포의 투여는 CAR T-세포 요법에 의해 유발되는 사이토카인 방출 증후군의 발병을 저해하거나 또는 감소시킨다
CAR T-세포를 최고 용량으로 투여한 마우스 그룹에, 세포자살성 세포를 기존에 안전하고 효과적인 용량인 것으로 입증된 2.10 x 108/kg으로 동시에 투여하였다. 인간 CAR T + 세포자살성 세포가 투여된 마우스에서는, 마우스 IL-6 수준, 체중 감소 및 사망이 현저하게 감소되었다.
실시예 5: 시험관내 미만성 종양 모델에 대한 조합 면역 요법의 효과
목적: 암 세포 및 사이토카인 폭풍 마커 사이토카인의 수준에 대한 CAR T-세포의 효과를 확인하기 위한, 암이 널리 퍼져있고 국지적이거나 한정되지 않은 미만성 종양 모델에서 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포 유래의 상층액의 효과 검사.
방법:
CD19+ T4+ CAR T-세포 ("CD19+ CAR T-세포")
CD19-특이적인 CAR-T-세포를 ProMab (Lot # 012916) 사에서 구입하였다. 이들 T-세포는 CAR에 30% 양성이었다 (제조사의 FACS 데이터에 기초함 - Fab 염색). 간략하게는, 세포를 AimV + 5% 열-불활성화된 FBS에서 해동하고, 원심분리 (300g, 5분, 실온)한 다음 AimV에 재현탁하였다. 실험 6일에, 마우스 1마리 당 세포 20 x 106개를 IV로 주사하였다 (70% 아넥신 PI 음성, 30% CAR 양성).
CD19을 발현하는 재조합 HeLa 세포는 CD19를 세포 표면 상에 또한 발현하는 대조군 세포 타입으로서 사용한다.
CD123+ CAR T-세포
또한, T4+ CAR T-세포를 CD123 에피토프를 타겟팅하는 CAR을 가지도록 조작하였다 (본원에서 "CD123+ CAR T-세포"로 지칭됨).
Raji 세포, CD19 발현성 HeLa 세포 및 CD123 발현성 백혈병 세포
Raji 세포는 ECACC (Cat. #: 85011429)에서 구입하여, 완전 배지 (RPMI-1640 + 10% H.I. FBS, 1% Glutamax, 1% 페니실린 / 스트렙토마이신)에서 통상적으로 배양하고, 3 x 105 - 3 x 106 세포/ml의 농도로 유지시켰다. 실험 1일에, 마우스 당 세포 0.1 x 106개를 IV로 주사하였다.
마찬가지로, CD19 발현성 HeLa 세포를 실험실에서 구축하여, CD19+ CAR T-세포에 대한 타겟으로 사용하였다. CD123 발현성 백혈병 세포는 CD123+ CAR T-세포에 대한 타겟으로 사용하였다. 아울러, 원발성 암 세포를 CAR T-세포의 타겟으로 사용하였다.
CD19을 발현하는 HeLa 세포를 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 제조하였다. 세포는 당해 기술 분야에 잘 공지된 바와 같이 배양하였다.
CD123은 혈액암의 막 바이오마커이자, 치료학적 타겟이다. CD123을 발현하는 백혈병 세포, 예를 들어, 백혈병 모세포 및 백혈병 줄기 세포를 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 배양하였다.
세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액 및 단구는 실시예 1에 언급된 바와 같이 분리하였다. 제조된 초기-세포자살성 세포는 50% 이상이 아넥신 V-양성이고, 5% 미만이 PI-양성이다.
대식세포는 부착에 의해 CD14 양성 세포로부터 구축하였다.
수지상 세포는 IL4 및 GMCSF의 존재 하에 CD14 유래 증식시켰다.
유세포 측정. 다음과 같은 항체를 사용하였다: hCD19-PE (eBiosciences, Cat. # 12-0198-42); mIgG1-PE (eBiosciences, Cat. # 12-0198-42); hCD3-FITC (eBiosciences, Cat. # 11-0037-42); mIgG2a-FITC (eBiosciences, Cat. # 11-4724-82). FACS Calibur, BD를 사용해 데이터를 획득하였다.
나이브 T-세포. 나이브 T-세포를 자기 비드 (BD)를 사용해 연층으로부터 단리하고, 90% 인간 AB 혈청 및 10% DMSO 중에 냉동보존하였다. 해동 및 주사는 CAR T-세포와 동일하다.
시험관내 배양 조건
세포주 및 배양 시약
인간 림프종 세포주 Raji (eCACC, UK, access no. 85011429), 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa (ATCC, USA, number: CCL-2) 및 HeLa-CD19 (ProMab, USA, cat. no. PM-Hela-CD19)는, 본원에서 "완전 배지"로 지칭되는, 10% FBS (Gibco, ThermoFisher Scietific, South America, cat. no. 12657-029), 2 mM GlutaMAX (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 35050-038) 및 100 U/ml 페니실린 + 100 U/ml 스트렙토마이신 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 15140-122)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 31870-025)에서 배양하였다. HeLa-CD19 배지에는 표준 배양시 선별 항생제로서 1 ㎍/ml 푸로마이신 (Sigma-Aldrich, USA, cat. no. P9620)을 추가하였다.
세포들 모두 서브-컨플루언트 상태로 유지시켰다. Raji 세포는 0.3 x 106-2 x 106 세포/ml의 농도 범위에서 유지시켰다. HeLa 및 HeLa-CD19 세포는 90% 컨플루언스로 용기에 충진되면, 계대 배양하였다.
채혈액 연층에서 일차 단구를 분리하였다 (Sheba Medical Center, Israel). 먼저, 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)를 피콜 밀도 구배 (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare, UK, cat. no. 17-1440-03)로 분리하였다. 이를 원심분리 (800x g, 2-8℃, 20분, 브레이크 0)하여, PBMC가 함유된 계면을 새로운 시험관으로 옮기고, 2 mM L-글루타민 (Lonza, Switzerland, cat. no. BE17-605E) 및 10 mM Hepes (Lonza, Switzerland, cat. no. BE17-737B)가 첨가된 RPMI-1640 (Lonza, Switzerland, cat. no. BE12-918F)으로 헹구었으며, 이를 "세척 배지"라 하며, 이후 이를 원심분리하였다 (650x g, 2-8℃, 10분). 펠릿화된 세포를 "세척 배지"에 15 x 106 세포/ml 농도로 재현탁하였다. 세포를 35mm 플레이트 (Corning, USA, cat. no. 430165)의 중앙에 0.9 ml 액적으로 접종하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터에서 1.5시간 배양하여 (37℃, 5% CO2), 단구가 부착되게 둔 후, 미리 데운 PBS (Lonza, Switzerland, cat. no. BE17-516F)로 3번 세척하여 다른 타입의 세포를 제거하였다. 세척 후, 세포를 "완전 배지"로 지칭되는 10% FBS (Gibco, ThermoFisher Scietific, South America, cat. no. 12657-029), 2 mM GlutaMAX (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 35050-038) 및 100 U/ml 페니실린 + 100 U/ml 스트렙토마이신 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 15140-122)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 31870-025) 2 ml에서 배양하였다.
세포주들 모두 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였다.
CD19-CAR T-세포 (ProMab, USA, cat. no. FMC63)를 AIM-V 배지로 옮기거나 또는 냉동시켰다. 냉동보존된 CAR T-세포는 시험관내 실험을 위해 실험 당일에 35-38℃ 조에서 해동시키고, 5% FBS (Gibco, South America, cat. no. 12657-029)가 첨가된 미리-데운 AIM V 배지 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 12055-091)에 즉시 침지하였다. 세포를 원심분리하고 (300x g, 실온, 5분), 이를 미리-데운 AIM V 배지에 재현탁하여 DMSO를 제거하였다. CD19-CAR+ 세포 집단의 농도 및 생존성을 anti-FLAG (BioLegend, USA, cat. no. 637310) 염색과 Annexin V 및 PI 염색 (MEBCYTO Apoptosis kit, MBL, USA, cat. no. 4700)으로 측정하고, FACSCalibur 유세포 측정기 (BD, USA)로 판독하였다.
나이브 T-세포를 단리하기 위해, 하다사 의학 센터 (Ein Kerem Campus, Jerusalem, Israel)에서 사전 동의를 구한 적절한 공여자로부터 채혈한 백혈구성분채집 분획으로부터 Cobe SpectraTM 성분채집술 장치 (Gambro BCT, USA)를 Leaukapheresis Unit의 SOP에 따라 사용해 추출하거나, 또는 피콜 밀도 구배 상에 로딩된 연층 (Sheba Medical Center, Israel)으로부터 추출하고, 800x g로 2-8℃에서 20분간 원심분리하였다. MagniSort Human CD3 Positive Selection Kit (eBioscience, USA, cat. no. 8802-6830-74)를 제조사의 지침에 따라 사용해 양성 분획으로부터 T-세포를 단리하였다. T-세포는 추가적인 20% FBS (Gibco, ThermoFisher Scietific, South America, cat. no. 12657-029) 및 5% DMSO (CryoSure-DMSO, WAK-Chemie Medical GmbH, Germany, cat. no. WAK-DMSO-70)가 첨가된 (상기한) "완전 배지" 중에 냉동보존하고, 실험 당일에 CD19-CAR T-세포와 병행하여 해동하였다.
LDH 세포독성 분석
안정적인 세포질 효소인 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)는 세포용해시 세포에서 연동되는 방식으로 방출된다. 그래서, 배지내 LDH 수준을 이용해 세포독성 활성을 정량할 수 있다. CytoTox 96 비-방사성 세포독성 분석 (Promega, USA, cat. no. G1780)은 배지 내 LDH 수준을 정량하기 위한 비색 분석법 (colorimetric assay)이다. 테트라졸륨 염 기질 (요오도니트로-테트라졸륨 바이올렛, INT)을 배지에 과량으로 첨가하면, LDH가 이 기질을 레드 포르마잔 산물로 변환한다. 생성된 적색 산물의 양은 세포용해된 세포의 개수와 정비례한다.
간략하게는, 제조사의 하기 지침에 따라, 타겟 세포 (HeLa 또는 HeLa-CD19)를 단독으로 또는 단구와 함께 배양하였다. 타겟 세포를 플레이트에 부착시킨 후 (6h-밤새), 배양물을 1시간 동안 y x106 ApoCell 세포에 노출한 다음 이들 세포를 RPMI로 4-5회 세척하여 제거하였다. ApoCell 세포의 제거는 광학 현미경으로 가시적으로 검증하였다. 공-배양물에 10 ng/ml LPS (Sigma-Aldrich, USA, cat. no. L4391)를 첨가하여, 1시간 배양하였다. 배양 후, RPMI로 3-5회 세척 사이클을 수행하여 LPS를 제거하였다. 살아있는 CD19-CAR T-세포 또는 naive T-세포를 지정된 E/T 비율(들)로 첨가하여, 4시간 배양하였다. 배지를 수집하기 위해, 플레이트를 250x g로 2-25℃에서 4분간 원심분리 (Centrifuge 5810 R, Eppendorf, Germany)하여, 세포를 침전시켰다. 각 웰에서 상층액 배지 50 ㎕를 취하여 바닥이 평평한 새로운 96웰 마이크로플레이트 웰 (Corning, USA, cat. no. 3596)로 이동시키고, 각 웰에 CytoTox 96 시약 50 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 암 조건 하 실온에서 30분간 인큐베이션한 후, 웰 당 정지 용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. Infinite F50 (Tecan, Switzerland)을 사용해 492 nm에서 흡광도를 측정하고, Magellan F50 소프트웨어를 사용해 포착하였다. 데이터 분석과 그래프 생성은 Microsoft Excel 2010을 사용해 수행하였다.
유세포 측정 세포독성 분석
HeLa-CD19 (타겟) 및 HeLa (대조군) 세포를 5 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Life Technologies, USA, cat. no. C1157)로 사전 염색하고, 혼합하여, 단리된 일차 단구가 증식된 플레이트 또는 신규 플레이트에 접종하였다. 타겟 세포를 플레이트에 부착시킨 후 (6h-밤새), 배양물을 1시간 동안 y x 106 ApoCell 세포에 노출시켰다. 플레이트를 RPMI로 3-5회 헹군 다음 현탁된 ApoCell 세포의 제거를 가시적으로 검증하였다. 공-배양물에 10 ng/ml LPS를 첨가하여 1시간 배양한 후, RPMI로 3-5회 세척 사이클을 수행하여 LPS를 제거하였다. 그런 후, 생존 CD19-CAR T-세포를 공-배양물에 특정 E/T 비율(들)로 첨가하여 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 다음 트립신-EDTA (Biological Industries, Israel, cat. no. 03-052-1B)를 첨가하여 37℃에서 4분 인큐베이션하여 세포를 회수하였다. 효소 활성을 중단시키기 위해, "완전 배지"를 2-4배 부피로 첨가하였다. 세포를 수집하여, 5분간 실온에서 200x g로 원심분리한 다음 RPMI (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 15140-122) 100 ㎕에 재현탁하였다. anti-CD19 (eBioscience, USA, cat. no. 12-0198-42)로 일차 염색한 후 실온에서 30분간 암 조건 하에 인큐베이션하였다. 이를 원심분리 (290x g, 1분, 2-8℃)하여, 300 ㎕ RPMI에 재현탁한 다음 세포를 anti-7AAD (eBioscience, USA, cat. no. 00-6993-50)로 염색하였다. 7ADD-음성 세포 (살아있는 세포)에서 게이팅하여 분석하였으며, 이때 살아있는 타겟 세포 (HeLa-CD19)와 살아있는 대조군 세포 (HeLa)를 계산하였다. 생존성 %를 살아있는 타겟 세포의 %를 살아있는 대조군 세포의 %로 나누어 계산하였다. 출발 세포 수 및 자발적인 타겟 세포 사멸의 편차를 보정하기 위해, 타겟 세포 %를 작동자 세포 (CD19-CAR T-세포)없이 배양한 대조군 세포 %로 나누어 생존성 %를 구하였다. 마지막으로, 세포독성 %는 보정한 생존성 %를 100%에서 제하여 계산하였다2.
초기 실험들은, 타겟 Raji 암 세포에 대한 CD19+ CAR T-세포의 최적 비율을 정하기 위해, Raji 암 세포를 CD19+ CAR T-세포 (+/- 단구-대식세포)와 함께 48시간 배양함으로써 수행하였으며, 96웰 플레이트에서 Raji 세포 5 x 104개/웰로 시작하였다. 작동자/타겟 (E/T) 비율 플레이트는 결과에 기초하여 구성하였다.
Raji 암 세포를 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액과 함께 1시간 배양한 다음 CD19+ CAR T-세포 (+/- 단구-대식세포)와 48시간 배양하여, 조합 면역요법 실험을 수행하였다.
생체내 환경을 시뮬레이션하기 위해, THP-1 세포 1 x 105개/ml을 72시간 동안 200 nM (123.4 ng/ml) 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA)를 사용해 분화시킨 다음, PMA를 첨가하지 않고 완전 배지에서 다시 24시간 배양하였다. 그런 후, Raji 암 세포를 24웰 플레이트에 분화된 THP-1 세포 상에 Raji 세포 5 x 105개/웰로 접종하였다.
Raji 암 세포를 일차 배양한 후, 세포자살성 세포 (ApoCell) 4 x 105-8 x 105개를 배양물에 첨가하여 1-3시간 두어 면역관용 환경을 유도하였다. 각 세포 타입에 대해 암 세포 : ApoCell 비율을 최적화하였다. 공-배양물을 세척한 후, E/T 비율 그래프에 기초하여 미리 정해진 개수의 CD19+ CAR-T-세포를 처리하였다. 일부 실험에서는, CD19+ CAR T-세포를 첨가하기 전에 배양 배지에 10 ng/ml LPS를 첨가하였다. 또 다른 실험에서는 CD19+ CAR T-세포를 첨가하기 전에 배양 배지에 인터페론 γ (IFN-γ)를 첨가하였다. LPS 또는 IFN-γ의 첨가는 사이토카인 폭풍 수준을 지수적으로 증가시킬 것으로 예상되었다.
Raji 암 세포의 세포독성을 분석하기 위해, 세포용해물을 준비하고, 48시간 배양 기간 후 생존성을 구하였다. 추가적인 실험을 수행하여, 48시간의 배양 동안 일정 간격으로 Raji 세포의 세포독성을 분석하였다. 다른 예로, Promega의 CytoTox 96 비-방사성 세포독성 분석 (Promega, cat #G1780)을 이용한다.
비슷한 실험을 CD19를 발현하는 HeLA 세포 및 CD19+ CAR T-세포를 사용해 수행하였다.
비슷한 실험을 CD123을 발현하는 백혈구 세포 및 CD123+ CAR T-세포를 사용해 수행하였다.
사이토카인 분석
일차 사이토카인 분석으로, 배양 상층액 내 MIP1a, IL-4, IL-2, IL-2R, IL-6, IL8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, INF-γ, GMCSF, TNF-α의 수준을 조사하였다.
추가적인 사이토카인 분석으로, 사이토카인 IL-10, IL-1β, IL-2, IP-10, IL-4, IL-5, IL-6, IFNα, IL-9, IL-13, IFN-γ, IL-12p70, GM-CSF, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β, IL-17A, IL-15/IL-15R, IL-7 또는 이들의 임의 조합의 수준을 조사하였다.
생체내 CAR T-세포 요법의 환경을 모방하도록 배양물을 확립하였다. Raji 버킷 림프종 세포를 인간 단구-대식세포, LPS 및 CD19+ CAR T-세포의 존재 하에, 세포자살성 세포를 첨가하거나 첨가하지 않고 배양하였다.
Raji 세포를 단구 및 LPS의 존재 하에 배양한 다음, naive T-세포 (Raji + Naive T), CD19+ CAR T-세포 (Raji + CAR T), CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell)를 CAR T-세포:ApoCell (Raji + CAR T + ApoCell 1:8) 1:8의 비율로, CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell)를 CAR T-세포:ApoCell (Raji + CAR T + ApoCell 1:32) 1:32의 비율로, 그리고 CD19+ CAR T-세포 및 세포자살성 세포 (ApoCell)를 CAR T-세포:ApoCell (Raji + CAR T + ApoCell 1:64) 1:64의 비율로 첨가하였다. 그런 후, GM-CSF 및 TNF-α (TNF-α) 농도를 측정하였다.
IL-6, IL-8 및 IL-13 뿐만 아니라 기타 사이토카인의 사이토카인 방출 감소를 분석하기 위해, 상층액을 수집하고, Luminex MagPix 리더 및 ELISA 분석을 이용해 선택 사이토카인을 조사하였다. (마우스 또는 인간) 사이토카인은 MAPIX 시스템 분석기 (Mereck Millipore) 및 MILIPLEX 분석 소프트웨어 (Merek Millipore)를 사용해 Luminex 기법으로 분석할 수 있었다. 마우스 IL-6Rα, MIG (CXCL9) 및 TGF-β1을 Quantikine ELISA (R&D systems)로 분석하였다.
조직 분석
유세포 측정 및 면역조직화학법으로 골수 및 간을 조사하였다. 안락사시켜, 간 및 골수를 조직병리학적 분석을 위해 수집하였다. 조직을 실온에서 48시간 동안 4% 포르말린으로 고정한 다음 가공 처리를 위해 히브리 대학의 동물 시설에 제공하였다. 가공 처리 전, 뼈를 탈회 처리 (decalcification)하였다. 파라핀 조직 단편을 헤마톡실린 및 에오신, 그리고 CD19로 염색하였다.
IFN-γ 효과
IFN-γ 효과를 STAT1 인산화 및 생물학적 산물에 의해 평가하였다.
결과:
세포독성 분석을 위한 세포 수 보정
시험관내 모델에서 사용할 Raji 세포의 수를 결정하기 위해, 세포독성 분석의 민감도 한계를 분석하였다. Raji 세포를 96웰 플레이트에 5 x 104-20 x 104개/웰로 접종하였으며, 4세트로 수행하였다. 4세트 중 한 세트에서 세포용해를 수행하여, 아직 완전히 살아있는 세포와 비교하였다. 부분적인 세포의 세포독성을 시뮬레이션하기 위해 원심분리 직전에 세포용해 용액을 첨가하였으며, 세포용해가 순간적으로 이루어졌다. 실제, 전체 세포의 양은 살아있는 세포 보다 더 높은 판독값을 나타내었으며, 세포 수 5 x 104개에서 상대적으로 최고 판독값이 나타났다 (도 14; 데이터의 외삽 추정). 따라서, 실험 설계상 필요하지 않은 한, 이후 실험에서는 이 세포 수를 디폴트로 사용한다.
Raji 버킷 림프종 세포에 대한 CD19+ CAR-T-세포의 활성 검증
CD19+ CAR T-세포 활성을 입증하기 위해, Raji 암 세포로 된 단일층을 CD19+ CAR-T-세포 1,000,000 (백만)개 또는 비-형질도입된 T-세포 1,000,000 (백만)개에 노출시켰다. 24시간 인큐베이션한 후, CD19+ CAR-T-세포는 Raji 암 세포의 증식을 감소시켰으며, 이는 CD19+ CAR-T-세포의 항-종양 활성을 의미한다.
Raji 버킷 림프종 세포에 대한 독립형 CD19+ CAR-T-세포의 활성을 세포자살성 세포에 노출시킨 이후의 활성과 비교하였다
세포자살성 세포 (ApoCell) 및 세포자살성 세포의 상층액 (ApoSup 및 ApoMon Sup)을, CD19+ CAR-T-세포 항-종양 활성을 방해하는지를 확인하기 위해, 검사하였다. Raji 버킷 림프종 세포를 세포자살성 세포와 함께 1시간 배양한 다음, CD19+ CAR-T-세포 (500,000, 오십만개) 또는 CD19+ 비-형질도입된 T-세포 (500,000, 오십만개) (CD19+ CAR-T-세포 대 세포자살성 세포 비율 1:2)를 첨가하였다. 종양 세포/세포자살성 세포/CD19+ CAR T-세포를 48시간 공-배양하였다. 대조군 Raji 버킷 림프종 세포는 CD19+ CAR-T-세포 및 하트만 (Hartman) 용액 (세포자살성 세포의 비히클)과 함께, 세포자살성 세포없이, 48시간 동안 공-배양하였다.
그 결과, 48시간 배양 후, CD19+ CAR-T-세포의 항-종양 활성이 비-형질도입된 T-세포와의 배양에 비해 우수하였다. 세포자살성 세포의 상층액을 사용해 유사하게 배양을 수행하였다. 놀랍게도, CD19+ CAR T-세포의 항-종양 활성은 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액에 노출된 경우 또는 노출되지 않은 경우와 비슷하였다.
시험관내에서 CD19에 대한 CAR-변형된 T-세포에 대한 세포자살성 세포의 부정적인 효과는, 세포자살성 세포의 존재 또는 부재 하의 CAR T-세포의 비슷한 E/T 비율 결과들에서, 관찰되지 않았다.
HeLa 백혈병 세포에 대한 CD19+ CAR-T-세포의 활성 검증
HeLa 세포는, CAR CD19+ T-세포 활성에 민감하게 만드는, 특이적인 CD19 발현성 세포이다. 또한, 비-부착성 세포주인 Raji 세포와는 대조적으로, HeLa 세포는 부착성 세포이다.
CD19+ CAR T-세포 활성을 입증하기 위해, HeLa 암 세포로 된 단일층을 CD19+ CAR-T-세포 1,000,000 (백만)개 또는 비-형질도입된 T-세포 1,000,000 (백만)개에 노출시켰다. 24시간 인큐베이션한 후, CD19+ CAR-T-세포는 HeLa 암 세포의 증식을 감소시켰으며, 이는 CD19+ CAR-T-세포의 항-종양 활성을 의미한다 (도 15 CD19+ + RPMI 및 CD19+ + CAR T-19 세포).
CD19+HeLa 세포에 대한 독립형 CD19+ CAR-T-세포의 활성을 세포자살성 세포에 노출시킨 이후의 활성과 비교하였다
세포자살성 세포 (ApoCell)를 대상으로 CD19+ CAR-T-세포의 항-종양 활성의 방해 여부를 검사하였다. HeLa 세포를 세포자살성 세포와 함께 1시간 배양한 다음, CD19+ CAR-T-세포 (500,000, 오십만개) 또는 CD19+ 비-형질도입된 T-세포 (Naive T-세포; 500,000, 오십만개) (CD19+ CAR-T-세포 대 세포자살성 세포 비율 1:2)를 첨가하였다. 종양 세포/세포자살성 세포/CD19+ CAR T-세포를 48시간 공-배양하였다. 대조군 HeLa 세포를 CD19+ CAR-T-세포 및 RPMI 용액 (세포자살성 세포의 비히클)과 함께, 세포자살성 세포없이, 48시간 동안 공-배양하였다. CD19+CAR-T-세포 : HeLa 세포의 비 (E/T 비율)는 5-20 범위였다 (도 15).
도 15에 나타낸 바와 같이, 48시간 인큐베이션한 후, CD19+ CAR-T-세포의 항종양 활성은 비-형질도입된 T-세포 (Naive 세포) 또는 완충제 단독과 인큐베이션한 경우와 비교해 우수하였다. 이와 유사하게, 세포자살성 세포를 사용해 인큐베이션하였다. 놀랍게도, CD19+ CAR T-세포의 항종양 활성은 세포자살성 세포에 노출한 경우 또는 노출하지 않은 경우와 비슷하였다. 비슷한 실험을 세포자살성 세포의 상층액을 사용해 수행하였다. 도 15는 ApoCell 첨가 또는 비-첨가시 CAR T-CD19 요법의 시험관내 세포독성 효과가 동일하다는 것을 보여준다.
CD19+HeLa 세포를 겨냥하는 CAR-변형된 T-세포에 대한 세포자살성 세포의 부정적인 효과는 세포자살성 세포의 존재 또는 부재시 상응하는 E/T 비율들에서 관찰되지 않았다.
따라서, 초기-세포자살성 세포를 첨가한 경우 또는 비-첨가한 경우, CD19+CAR T-세포에 대해 동일한 시험관내 세포독성 효과가 관찰되었다.
세포자살성 세포의, CAR T 처치로 유발되는 사이토카인 폭풍의 개선, 저하 또는 저해 효과
사이토카인 IL-8 및 IL-13을, CD19+ CAR T-세포 첨가하기 전과 첨가한 이후에, 배양 배지에서 측정하였으며, 사이토카인 폭풍에 해당되는 농도임을 확인하였다. 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포의 상층액의 첨가가 배지내 IL-8 및 IL-3의 농도를 감소시키는 것으로 보인다.
더 넓은 범위의 사이토카인을 이용한 분석
인간 사이토카인 폭풍 발생시 임상 환경에서는 나타나지만, 실험 중에 관찰되지 않는 가능한 더 넓은 범주 및 수준의 사이토카인에 대한 효과를 추가로 분석하기 위해, LPS (10 ng/mL)를 암 및 CAR-19의 존재 하에 전술한 Raji 세포 배양 조건에 첨가하였다. LPS의 첨가는 사이토카인 폭풍 수준을 지수적으로 증가시킬 것으로 예상되었다. 세포자살성 세포에 노출되면 사이토카인의 수준이 급격하게 감소되었다. 도 16 및 도 17의 결과에 따르면, CD19+ CAR T-세포를 첨가하면 배양 배지 내 GM-CSF 및 TNF-α 사이토카인 농도 (pg/ml)가 크게 증가하지만, 세포자살성 세포의 존재 하에는 GM-CSF와 TNF-α 둘다 현저하게 감소되었다. 사이토카인의 농도 감소는 CAR T-세포 대 세포자살성 세포의 세포 비율에 대해 농도 의존적이다.
결론:
세포자살성 세포는 CAR T-세포 임상 시술과 관련된 사이토카인 폭풍의 사이토카인 마커들을 하향 조절할 수 있었다. 유의하게도, 세포자살성 세포는 CAR T-세포의 종양 활성에는 영향을 미치지 않았다. 세포자살성 세포는 선천적인 면역에서 기원한 전-염증성 사이토카인을 감소시키며, IFN-γ의 효과를 저해하고, IFN-γ 수준과 CAR-T-세포독성에는 유해한 영향을 미치지 않는다.
실시예 6: 세포자살성 세포 요법은 CAR T-세포 요법을 시술받은 생체내 미만성 암 모델에서 사이토카인 폭풍을 예방한다
목적 : 사이토카인 폭풍 마커인 사이토카인의 수준 및 암 세포에 대한 CAR T-세포의 효과를 확인하기 위한, 미만성 종양 모델에서 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포로부터 유래된 상층액의 생체내 효과 조사
재료 및 방법
시험관내 연구
시험관내 실험은 실시예 5에 기술된 방법을 참조한다.
세포 및 세포 배양
Raji Burkitt 림프종 세포 (Sigma-Aldrich cat. # 85011429)는 제조사의 지침에 따라 배양하였다. CD19+ CAR T-세포, 세포 배양물, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, 단구 단리 및 시험관내 측정은 상기 실시예에 기술되어 있다. 제조된 초기-세포자살성 세포는 50% 이상이 아넥신 V-양성이고, 5% 미만이 PI-양성이다.
생체내 연구
마우 스
7-8주령의 SCID beige 마우스를 Envigo (기존 Harlan)에서 구입하였다. 마우스는 IACUC 기관의 지침에 따라 SPF 프리 동물 시설에서 사육하였다. 실험 기간 동안, 마우스를 매일 모니터링하고, 주당 3번 체중을 측정하였다. 하지 마비가 관찰되는 마우스는 안락사시켰다. 안락사 후 골수 및 간을 FACS 분석 및 조직학적 처리를 위해 수집하고, 혈청은 사이토카인 프로파일링을 위해 -80℃에서 냉동시켰다.
생체내 실험
SCID beige 마우스 (C.B-17/IcrHsd-Prkdc-SCID-Lyst-bg, Harlan, Israel)를 예루살렘 히브리 대학 (Ein Kerem Campus, Israel)의 AAF (The Authority for Animal Facilities)에서 SPF 조건 하에 AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)에 따라 사육하였다. 실험은 동물 실험에 대한 히브리 대학의 윤리 위원회로부터 승인받았으며, 동물 고통을 가능한 최소화하였다.
(도 18A) 종양 모델을 확립하기 위해, 7-8주령의 암컷 SCID beige 마우스에 마우스 당 RPMI (Gibco, , ThermoFisher Scientific, USA, cat. no. 15140-122) 200 ㎕에 현탁된 Raji 세포 1 x 105개를 i.v.로 주사하였다 (1일). 6일에, 해당 그룹의 마우스에 마우스 1마리 당 하트만 용액, 즉 젖산 링거액 (Teva Medical, Israel, cat. no. AWN2324) 200 ㎕ 중의 ApoCell 30 x 106개를 i.v.로 접종하였다. 6일에, 해당 그룹의 마우스에 마우스 1마리 당 AIM V 200 ㎕ 중의 살아있는 CD19-CAR T-세포 또는 naive T-세포 10 x 106개를 i.v.로 접종하였다. 대조군 마우스에는 각 처리군과 동일한 부피로 RPMI를 투여하였다.
마우스에서 임상 증상을 검사하고, 매주 2번 체중을 측정하였으며, 하지 마비가 나타나면 안락사시켰다. 뼈와 간의 병리학적 샘플은 예루살렘 히브리 대학의 동물 시설에서 준비하고, 인간 CD20 (Cell Marque, USA, clone L26, cat. no. 120M-84)으로 염색하여 Raji 세포를 검출하고, 인간 CD3 (Cell Signaling Technology, USA, cat. no. 85061)으로 염색하여 인간 T-세포를 검출하였다.
특정 실험에서는, CD19+ CAR T-세포를 투여하기 전에 동물 개체에 LPS를 투여하였다. 또 다른 실험에서는 CD19+ CAR T-세포를 첨가하기 전에 인터페론-γ (IFN-γ)를 투여하였다. LPS 또는 IFN-γ의 투여가 사이토카인 폭풍 수준을 지수적으로 증가시킬 것으로 예상되었다.
사이토카인 분석은 비-제한적인 예로, IL-10, IL-1β, IL-2, IP-10, IL-4, IL-5, IL-6, IFNα, IL-9, IL-13, IFN-γ, IL-12p70, GM-CSF, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β, IL-17A, IL-15/IL-15R, IL-7 또는 이들의 임의 조합 등의 사이토카인의 수준을 검사하였다. 사이토카인 (인간 또는 마우스)은 MAPIX 시스템 분석기 (Mereck Millipore)와 MILIPLEX 분석 소프트웨어 (Merek Millipore)를 이용한 Luminex 기법으로 평가하였다. 마우스 IL-6Rα, MIG (CXCL9) 및 TGF-β1은 Quantikine ELISA (R&D systems)로 분석하였다.
조직 분석
유세포 측정 및 면역조직화학법을 사용해 골수 및 간을 검사하였다. 안락사 후 간 및 골수를 조직병리학적 분석을 위해 수집하였다. 조직을 실온에서 48시간 동안 4% 포르말린에서 고정한 다음 가공 처리를 위해 히브리 대학의 동물 시설로 이송하였다. 가공 처리하기 전에 뼈를 탈회 처리하였다. 파라핀 조직 단편을 헤마톡실린 및 에오신, 그리고 CD19에 대해 염색하였다.
IFN-γ 효과
STAT1 인산화 및 생물학적 산물에 의해 IFN-γ 효과를 평가하였다.
결과
CAR T-세포 요법은 사이토카인 방출 증후군을 유발한다
무-종양성 마우스 및 종양을 가진 마우스들로 구성된 3개의 군에, CD19+ CAR T-세포 (3 x 106, 10 x 106 또는 30 x 106)를 용량을 증가시키면서 투여하였다 (i.p. 또는 종양에 직접 투여). 최고 용량에서, 무-종양성 마우스 및 종양 마우스에서 24시간 이내에 억눌린 거동, 털세움 및 운동성 저하가 관찰되었으며 급작스러운 체중 감소가 동반되었으며, 48시간 이내에 사망하였다. CD19+ CAR T-세포가 최고 용량으로 투여된 마우스의 혈액 샘플에서는 인간 인터페론-gamma 및 마우스 IL-6, IL-8 및 IL-13가 검출가능하였다. 다른 종양 항원을 겨냥하는 CD19+ CAR T-세포가 고 용량으로 투여된 마우스에서는 체중 감소 또는 거동 변화가 관찰되지 않았다.
세포자살성 세포의 투여는 CAR T-세포 요법에 의해 유발되는 사이토카인 방출 증후군의 발병을 저해하거나 또는 감소시킨다
CD19+ CAR T-세포가 최고 용량으로 투여된 마우스 그룹에, 세포자살성 세포를 이전에 안전하고 효과적인 용량인 것으로 입증된 2.10 x 108/kg으로 동시에 투여하였다. 인간 CD19+ CAR T + 세포자살성 세포가 투여된 마우스의 경우, 마우스 전-염증성 사이토카인 수준, 체중 감소 및 사망율이 현저하게 감소되었다.
CAR T-세포 투여와 조합에 의한 세포자살성 세포의 투여는 CAR T-세포의 항종양 활성에 영향을 미치지 않았다
도 18B는, CD19+CAR T-세포를 투여하지 않고 CD19+ Raji 세포를 주사한 SCID 마우스에서 예상된 사망일은 18-21일이었음을 보여준다. CD19+CAR T-세포를 투여받은 마우스들 중 사십 % (40%)가 적어도 30일까지 생존하였다 (도 18 ―·― 및 ―‥―). 생존 동물의 %는 세포자살성 세포의 첨가와 무관하였다 (도 18). 생존 마우스는 30일에 안락사시켰다.
결론: 생체내에서 CD19를 겨냥하는 CAR-변형된 T-세포에 대해 세포자살성 세포는 부정적인 효과를 발휘하지 않으며, 비슷한 생존성을 나타내었다.
IL-6, IP-10, TNF-a, MIP-1α, MIP-1β 등의 전-염증성 사이토카인의 유의한 하향 조절 (p<0.01)이 확인되었다. IFN-γ는 하향 조절되진 않았지만, 대식세포 및 수지상 세포에 대한 이의 효과가 인산화된 STAT1의 수준 및 IFN-γ-유도성 CXCL10 및 CXCL9 발현 수준에서 모두 저해되었다.
결론:
세포자살성 세포는 선천적인 면역에서 기원한 전-염증성 사이토카인을 감소시키고 IFN-γ의 효과를 저해하지만, IFN-γ 수준과 CAR-T-세포독성에는 유해하게 작용하지 않는다.
실시예 7: 세포자살성 세포 요법은 CAR T-세포 요법을 시술받은 생체내 고형 종양 모델에서 사이토카인 폭풍을 예방한다
목적 : 사이토카인 폭풍 마커인 사이토카인의 수준 및 암 세포에 대한 CAR T-세포의 효과를 확인하기 위한, 고형 종양 모델에서 세포자살성 세포 또는 세포자살성 세포로부터 유래된 상층액의 생체내 효과 조사
재료 및 방법
시험관내 연구
세포 및 세포 배양
CD19+ CAR T-세포, 즉 TMCD28을 함유한 2세대 CAR-T-CD19 세포를 사용하였으며, 세포 배양물, 세포자살성 세포, 세포자살성 세포의 상층액, 단구 단리 및 시험관내 측정은 실시예 2 & 4 & 6에 기술되어 있다. 제조된 초기-세포자살성 세포는 실시예 1에 상세히 나타낸 바와 같이 50% 이상의 annexin V-양성, 5% 미만의 PI-양성을 나타내었다.
생체내 연구
마우 스
7-8주령의 SCID beige 마우스 및 NSGS 마우스를 Harlan (이스라엘)에서 구입하고, 샤레트 연구소의 SPF 동물 시설에서 사육하였다.
SCID beige 마우스 또는 NSGS 마우스에, 복막에 붙을 수 있는, CD19를 발현하는 HeLa 세포를 접종하여, 복막내 고형 종양을 형성시켰다. T-세포를 투여하기 전에 마우스를 그룹으로 나누었다.
i.v. 접종한 지 6일 후, 5일에 프리컨디셔닝화하고 마우스에 세포자살성 세포 (ApoCell)와 함께 또는 없이 CD19+ CAR T-세포 10 x 106개를 투여하였다. 프리컨디셔닝화한 마우스에 ApoCell 5 x 106 또는 30 x 106개를 투여하였다. 종양을 매주 관찰하고, 순환성 사이토카인의 수준을 매주 모니터링하며 Luminex 시스템으로 측정하였다. 마우스 사이토카인 25종과 인간 사이토카인 32종을 Luminex 기법으로 분석하였다. 실험이 끝나면, 마우스를 안락사시키고, 장기 (골수, 간 및 비장)에서 종양 존재/크기를 (FACS 및 면역조직화학적 방법에 의해) 조사하였다.
사이토카인 분석은 비-제한적인 예로, GM-CSF, IFNγ, IL-1β, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, MIP-1α, TNFα, MIP-1β, IFNα 및 IP-10 등의 사이토카인의 수준을 조사하였다. 사이토카인 (인간 또는 마우스)은 MAPIX 시스템 분석기 (Mereck Millipore)와 MILIPLEX 분석 소프트웨어 (Merek Millipore)를 이용한 Luminex 기법으로 평가하였다. 마우스 IL-6Rα, MIG (CXCL9) 및 TGF-β1은 Quantikine ELISA (R&D systems)로 분석하였다.
조직 분석
유세포 측정 및 면역조직화학법을 사용해 골수 및 간을 검사하였다.
IFN-γ 효과
STAT1 인산화 및 생물학적 산물을 이용해 IFN-γ 효과를 평가하였다.
결과
CAR T-세포 요법은 사이토카인 방출 증후군을 유발한다
무-종양성 마우스와 종양을 가진 마우스들로 구성된 3개의 군에, CD19+ CAR T-세포 (3 x 106, 10 x 106 또는 30 x 106)를 용량을 증가시키면서 투여하였다 (i.p. 또는 종양에 직접 투여). 최고 용량에서, 무-종양성 마우스 및 종양 마우스에서 24시간 이내에 억눌린 거동, 털세움 및 운동성 저하가 관찰되었고, 급작스러운 체중 감소가 동반되었으며, 48시간 이내에 사망하였다.
도 19A-19C는, 종양으로부터, 심지어 CAR T-세포의 존재 이전에도, IL-6, IP-10, 놀랍게도 심지어 TNF-α가 증가된 수준으로 방출됨을 그래프로 도시한 것이다. 도 19A-19C에 나타낸 바와 같이, 예상치 못하게도, IL-6, IP-10 및 TNF-α는, 심지어 CAR T-세포 요법을 투여하지 않은 경우에도, 암 세포의 존재에 의해 증가되었다. CAR T-세포 요법 (Hela-CAR T-세포 CD-19)을 시술한 경우, 사이토카인의 방출이 현저하게 증가되었다. 이러한 결과는, 종양 스스로 전-염증성 사이토카인을 방출한다는 것을, 보여준다.
초기 세포자살성 세포를 첨가하는 경우의 이점을 조사하기 위해, 사이토카인 GM-CSF, IFNγ, IL-1β, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, MIP-1α, TNFα, MIP-1β, IFNα 및 IP-10을 3가지 실험에서 측정하였으며, 그 결과 대식세포 관련 사이토카인은 ApoCell 투여시 하향 조절된 반면, T-세포 관련 사이토카인은 그 수준이 현저하게 달라지지 않았다 (표 10).
표 10: CD19를 발현하는 HeLa 세포를 가진 생체내 복막내 모델, 고형 종양, +/- CAR T-세포 CD19 요법 및 +/- ApoCell에 따른 사이토카인 수준
Figure pct00003
표 10은 CAR T-세포 투여 +/- ApoCell 후 스물네(24)시간 경과시 사이토카인 측정값을 보여준다. CAR T-세포 요법으로 인한 세포독성은 GM-CSF, IL-10, IL-12p70, IL-6, MIP-1α, TNFα, MIP-1β 및 IP-10 등의 사이토카인을 증가시켰으며, 그 수준은 ApoCell의 존재 시 현저하게 하향 조절되었다 (p<0.05-0.0001). 이들 사이토카인은 대식세포와 주로 관련된 것이다. 이와는 대조적으로, IL-2, IL-4, IL-13 및 IL-15와 같이 T-세포와 관련된 사이토카인의 수준은 현저하게 변하지 않았다.
도 19A-C 및 표 10에 나타낸 결과들은, 암 및 CAR와 관련하여 CRS가 몇가지 요소들을 가진다는 것을 보여준다: 사이토카인을 방출할 수 있는 종양; 종양 및 CAR, 그리고 기타 인자들에 반응하는 선천적인 면역성; 및 사이토카인을 방출하는 CAR T-세포는 선천적인 면역에 영향을 미치는 사망을 유발함. ApoCell은 선천적인 면역, 주로 대식세포, 단구 및 수지상 세포와 상호작용하여, 이들 대식세포, 단구 및 수지상 세포의 반응을 하향 조절하지만, T-세포 또는 CAR T-세포와는 상호작용하지 않는다.
여러가지 종양 항원을 겨냥하는 CD19+ CAR T-세포가 고 용량으로 투여된 동물에서는 체중 감소 또는 거동 변화가 관찰되지 않았다.
세포자살성 세포의 투여는 CAR T-세포 요법에 의해 유발된 사이토카인 방출 증후군의 발병을 저해하거나 또는 감소시킨다
CD19+ CAR T-세포가 고 용량으로 투여된 마우스 일군에, 세포자살성 세포를 이전에 안전하고 효과적인 용량인 것으로 입증된 2.10 x 108/kg으로 동시에 투여하였다. 세포자살성 세포는 CD19에 대한 특이성을 가진 CAR-변형된 T-세포에 대해 시험관내 또는 생체내에서 부정적인 효과를 나타내지 않았다. 시험관내 세포자살성 세포의 존재/부재시 CAR T-세포에 대한 E/T 비율들, 그리고 생체내 생존 곡선들은 비슷하였다 (데이터는 나타내지 않음).
인간 CD19+ CAR T + 세포자살성 세포가 투여된 마우스는 하나 이상의 마우스 전-염증성 사이토카인, 체중 감소 및 사망율에서 현저한 감소를 나타내었다.
세포자살성 세포의 존재 또는 부재시 CAR T-세포의 E/T 비율 결과들이 비슷하였으며, 생체내 생존 곡선이 비슷하여, 생체내에서 CD19를 겨냥하는 CAR-변형된 T-세포에 대한 세포자살성 세포의 부정적인 효과가 관찰되지 않았다.
IL-6, IP-10, TNF-a, MIP-1α, MIP-1β 등의 전-염증성 사이토카인의 현저한 하향 조절 (p<0.01)이 확인되었다 (데이터는 나타내지 않음). IFN-γ는 하향 조절되진 않았지만, 대식세포 및 수지상 세포에 대한 이의 효과는 인산화된 STAT1의 수준 및 IFN-γ-유도성 CXCL10 및 CXCL9 발현 수준에서 모두 저해되었다 (데이터는 나타내지 않음).
결론:
CRS는 종양 생물학, 단구/대식세포/수지상 세포와의 상호작용 및 CAR T-세포 작용 및 증폭 반응과 같이 여러가지 요인으로 발생한다. 세포자살성 세포는 선천성 면역으로부터 기원하는 전-염증성 사이토카인을 감소시키고, 단구/대식세포/수지상 세포에 대한 IFN-γ의 작용을 저해하지만, IFN-γ 수준 또는 CAR-T-세포독성에는 유해한 효과를 나타내지 않는다. 즉, 세포자살성 세포는 선천성 면역으로부터 기원하는 전-염증성 사이토카인을 감소시키고, IFN-γ의 작용을 저해하지만, IFN-γ 수준 또는 CAR-T-세포독성에는 유해한 영향을 미치지 않는다. 이러한 결과들은, CAR T-세포 요법을 이용한 임상 연구에서 CRS를 예방하기 위한 ApoCell 안전한 사용을 뒷받침해준다.
실시예 8: 세포자살성 세포는 사이토카인 방출 증후군 (CRS)를 하향 조절하고, CAR -T-세포 요법을 강화한다.
목적: 연장된 기간 동안 사이토카인 및 CAR T-세포의 세포독성에 대한 초기 세포자살성 세포의 효과 조사. CD19-CAR T-세포의 생체내 효능 확인. 초기 세포자살성 세포 및 CD19-CAR T-세포의 상승 작용 입증.
방법: CD19-발현성 HeLa 세포 (ProMab)를 단독으로 사용하거나, 또는 시험관내에서 인간 대식세포와 공-배양한 후 마우스에서 복막내 실험을 수행하였다. 백혈병을 유도하기 위해 생체내에서 Raji를 사용하였다. LPS 및 IFN-g를 사용해 부가적인 사이토카인 방출을 촉발하였다. CD19-보유 세포에 대한 항-종양 효과를 위해 제2 세대, CD28-보유한 CD19-특이적인 CAR-변형 세포를 사용하였다 (ProMab 또는 레트로넥틴 제조 프로토콜 또는 폴리브렌 제조 프로토콜을 이용해 제조). 세포독성 분석을 생체내 (7-AAD 유세포 측정) 및 시험관내 (생존 곡선; 골수 및 간의 종양 부하, 유세포 측정 및 면역조직화학)에서 수행하였다. CRS는 자발적으로 발생하거나 또는 LPS 및 IFN-g에 반응하여 발생한다. 마우스 IL-10, IL-1ß, IL-2, IP-10, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-a, IL-9, IL-13, IFN-g, IL-12p70, GM-CSF, TNFα, MIP-1a, MIP-1ß, IL-17A, IL-15/IL-15R, IL-7 및 인간 사이토카인 32종을 조사하였다 (Luminex technology, MAPIX system; MILLIPLEX Analyst, Merck Millipore). 마우스 IL-6Ra, MIG (CXCL9) 및 TGF-β1을 조사하였다 (Quantikine ELISA, R&D systems). IFN-γ 효과를 평가하였다 (STAT1 인산화, 생물학적 산물). 인간 대식세포 및 수지상 세포를 단구로부터 구축하였다. 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 초기 세포자살성 세포를 제조하였다; 세포 ≥40% 아넥신 V-양성; ≤15% PI-양성.
마우 스: SCID-Bg 마우스 (암컷, 7-8주령)에 0.25 x 106 HeLa-CD19 세포를 실험 1일 및 2일에 복막내 (i.p) 연속 2회 주사하였다. 9일에, 마우스에 10 x 106 4000-rad (cGy) 방사선 처리된 ApoCell (세포 프로세싱 시스템 사용)을 i.p.로 투여하고, 다음날 0.5 x 106 CAR-T 양성 세포 또는 2.2 x 106 CAR-T 양성 세포를 포함하는 10 x 106 CAR-T 집단을 i.p.로 투여하였다. 대조군으로서, 마우스에 10 x 106 활성화된 단핵구 세포 또는 Mock-T 세포를 투여하였다. 마우스는 IACUC 위원회의 지침에 맞게 SPF 동물 시설에서 사육하였다. 마우스는 매주 2회 체중을 측정하고, 매일 임상 신호와 복막염을 모니터링하였다. 엔드 포인트는 팽창 및 긴장된 복부로 나타나는 중증 복막염, 혼수, 움직임 저하 또는 호흡 노력 (respiratory effort) 증가로서 정의하였다. 생존 분석을 카플란-마이어 방법에 따라 수행하였다.
결과: IL-6, IP-10, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β 등의 전-염증성 사이토카인의 현저한 하향 조절 (p<0.01)이 확인되었다 (데이터 도시 안함). IFN-γ는 하향 조절되지 않았지만, 대식세포 및 수지상 세포에 대한 효과는 인산화된 STAT1 수준에서 저해되었다 (데이터 도시 안함). 대식세포에서 IFN-γ 유도성 CXCL10 및 CXCL9의 발현은 감소되었다 (데이터 도시 안함).
CAR-T 양성 세포 0.5 x 106개를 사용한 실험에서, 그룹 당 마우스 2마리를 17일과 21일에 희생시켰다. HeLa-CD19 처리 마우스에서는 복막내 혈액 축적 (blood accumulation)으로 나타난 복막염, 비대해진 비장 및 종양 병소가 관찰되었다 (데이터 도시 안함). 대조군 MNC 처리 마우스에서는 복막내 출혈이 매우 적었으며, 종양 병소도 더 적었다. CAR-T 또는 CAR-T 및 방사선 처리된 ApoCell로 처리된 마우스에서는 복막염 신호는 관찰되지 않았다. 이러한 관찰 결과는 도 20A에 제시된 생존 곡선과 관련있다.
CAR-T 양성 세포 2.2 x 106개를 사용한 실험에서는, CAR T-세포를 4배 적게 사용하였을 때와 동일한 패턴의 효과가 관찰되었다 (도 20B). CAR-T 처리는 복막내 HeLa-CD19 투여 마우스의 생존을 연장하였다 (p=0.0002). 이러한 효과는 본 실험에서 더욱 현저하였으며, 이는 아마도 주입된 CAR T 세포의 세포수가 더 많기 때문이다 (CAR-T 양성 세포 2.2 vs 0.5 x 106). 초기 세포자살성 세포는, 보다 현저하고 연장된 효과와 더불어, 상승적인 효과 및 연장된 생존성을 나타내었다 (p= 0.0032). CAR T애 대한 E/T 비율은 시험관내 세포자살성 세포의 존재/부재시 비슷하였다. 놀랍게도, 세포자살성 세포의 존재 하에 제공된 CAR T 세포 요법은 마우스의 생존을 개선하여, CAR 요법 단독과 비교해 유의하고 재현가능하게 12일 이상 연장하였다 (p<0.0032, 도 20A 및 20B).
결론: CAR-T 세포 처리는 복막내 HeLa-CD19 마우스의 생존을 연장하였다. CAR-T 투여 전날 방사선 처리된 초기 세포자살성 세포를 투여한 경우 상승적인 작용이 나타났으며, CAR T-세포 단독 처리와 비교해 마우스의 생존이 10일 넘게 연장되었다 (p<0.044, 로그-순위법 검사).
방사선 처리된 세포자살성 세포의 주입이, SCID 마우스에서 CD19-보유 Hela 세포 처리에 있어 CD19-특이적인 CAR T 세포에, 급격한 상승적인 작용을 발휘하였다. 본 실시예에서, 실시예 5 및 6에 나타난 결과와 비슷한 결과가 관찰되었다. 본 실시예에서 방사선 처리된 세포자살성 세포를 사용함으로써, 실시예 5 및 6과 비교해, "이식 편대 백혈병 효과 (graft versus leukemia effect)" 가능성이 제거되었다. 따라서, 이러한 놀라운 상승 작용은 제공된 방사선 처리된 세포자살성 세포에 의해 매개되는 것으로 보인다.
CRS는 종양 생물학, 단구/대식세포/수지상 세포와의 상호작용 및 CAR T 세포 작용 및 증폭에 대한 반응 등의 여러가지 요인으로 발생한다. 세포자살성 세포는 선천성 면역으로부터 기원한 전-염증성 사이토카인을 감소시키고, 단구/대식세포/수지상 세포에 대한 IFN-γ 효과를 저해하지만, CAR-T 세포독성 또는 IFN-γ 수준은 손상시키지 않으며, CAR-T 세포 효과를 현저하게 증가시킨다. 예상치 못하게도, 방사성 처리된 세포자살성 세포를 이용한 치료는 CAR-T 세포 요법을 보완하여, CAR-T 세포 요법에 대한 항암 효과를 효과적으로 연장한다.
실시예 9: 비-고형 종양 모델에서의 세포자살성 세포 처리 효과
목적: 암에서 세포자살성 세포의 생존에 미치는 효과를 결정하기 위한, 암이 광범위하게 퍼져 있으며 국소 또는 국부적이지 않은 비-고형 종양 모델에 대한 세포자살성 세포의 효과 조사
방법:
Raji 세포
Raji 세포를 ECACC (Cat. #: 85011429)에서 입수하여, 완전 배지 (10% H.I. FBS, 1% GlutaMAX, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640)에서 통례적으로 배양하였으며, 농도 3 x 105 - 3 x 106 세포/ml로 유지하였다.
세포자살성 세포는 실시예 1에서와 같이 준비하였다. 준비된 초기 세포자살성 세포는 아넥신 V 양성 50% 이상 및 PI-양성 세포 5% 미만이었다.
비-고형 (미만성) 종양 모델
실험 1일에, SCID 마우스에 Raji 세포 105개를 IV로 1회 주사하였다. SCID 대조군 마우스에는 식염수를 1회 IV 주사하였다 (3 코호트를 조사하였으며; Raji 세포를 사용해 2 코호트에서 백혈병을 유발하였고, 1 코호트는 대조군으로 사용하였다).
고형 종양 모델
실험 1일에, SCID 마우스에 Raji 세포 105개를 IP로 1회 주사하고, 대조군에는 식염수를 1회 IP 주사한다.
세포자살성 세포 처리
예비 실험으로, Raji 세포 주입 후 6일째에 초기 세포자살성 세포를 마우스에 주입하였다. 이후 실험에서, 상기 백혈병 코호트들 중 하나의 코호트의 마우스에 Raji 세포 주입 후 6일부터 시작하여 초기 세포자살성 세포 (30 x 106 세포)를 3회 주입하였다.
결과
SCID 마우스에는 T 세포가 없으므로, 치료없이는 백혈병으로부터 회복할 수 없다.
놀랍게도, 예비 실험 및 도 21에 나타낸 바와 같이, Raji 주입 후 6일에 세포자살성 세포 주입 (APO)이, 세포자살성 세포 비-주입 (NO APO) 마우스와 비교해, CD19+ Raji 주사한 SCID에서 종양-프리 사멸 (tumor free death)을 현저하게 연장하였다.
백혈병 (NO APO) 코호트에서, Raji 세포 투여 마우스들 중 70%가 자신의 수명 동안 생존한 반면, Raji 세포 및 세포자살성 세포를 투여받은 마우스는 94%가 생존하였다 (동물 총 수 n=51, p<0.001). 예상한 바와 같이, 대조군 마우스는 기대 수명 동안 100% 생존하였다 (도 22A). 백혈병 코호트에서, Raji 세포 투여 및 세포자살성 세포 비-투여 마우스의 경우 9%가 기대 수명 보다 최대 12%까지 생존한 반면, Raji 세포 및 세포자살성 세포 투여 마우스의 경우에는 47%이었다 (도 22B). Raji 세포 투여 및 세포자살성 세포 비-투여 마우스는 기대 수명의 30% 이상까지 생존하지 못하였으며, Raji 세포 및 세포자살성 세포 투여 마우스의 경우에는 41%까지 생존하였다 (도 22C). Raji 세포 투여 및 세포자살성 세포 비-투여 마우스는 완전 관해를 획득하지 못하였으며, Raji 세포 및 세포자살성 세포 투여 마우스의 경우에는 10%가 완전 관해를 획득하였다 (도 22D).
결론:
세포자살성 세포를 투여하면, 백혈병 마우스의 수명이 유지 및 증가되었으며, 일부 경우에 초기 세포자살성 세포가 투여된 마우스에서 완전 관해가 획득되었다 (도 2 및 3A-3D).
실시예 10: 미만성 종양 모델에서 세포자살성 세포와 항-CD20 mAb의 조합 처리 효과
목적: 병용 요법의 생존 효과를 확인하기 위한, 암이 넓게 퍼져있으며 국소 또는 국부적이지 않은 미만성 (비-고형) 종양 모델에 대한 초기 세포자살성 세포 및 항-CD20 mAb의 조합 투여 효과 조사.
Raji 세포, 세포자살성 세포, 비-고형 (미만성) 종양 모델, 고형 종양 모델 및 세포자살성 세포 처리는 전술한 실시예 1 및 9에 기술되어 있다.
항-CD20 mAb
상업적으로 입수가능한 항-CD20 mAb를 Roche 사에서 구입하였다.
항-CD20 mAb 처리
마우스에 항-CD20 mAb 5 mg을 IV로 주입하였다.
세포자살성 세포 및 항-CD20 mAb의 조합 처리
Raji 세포 투여 후 6일부터 시작해, 마우스에 세포자살성 세포 각각 30 x 106개를 IV로 3회 주입하였다. 또한, 마우스에 항-CD20 mAb 5 mg을 IV 주입으로 투여하였다.
결과
Raji 세포, Raji 세포 + 항-CD20 mAb 및 Raji 세포 + antiCD20 + 세포자살성 세포 투여 마우스들 100%가 백혈병 마우스의 기대 수명 내내 생존한데 반해, Raji 세포 및 세포자살성 세포 투여 마우스는 86%가 생존하였다 (마우스 총 수 n=28, p<0.0002) (도 23A). 기대 수명 보다 24% 보다 길게 생존한 경우는, Raji 세포 투여 마우스에서는 없었으며, Raji 세포 + 세포자살성 세포 투여 마우스는 29%가, Raji 세포 + 항-CD20 mAb 또는 Raji 세포 + antiCD20 + 세포자살성 세포 투여 마우스는 100%가 생존하였다 (도 22B). 기대 수명 보다 59% 이상 생존한 경우는, Raji 세포 투여 마우스에서는 없었으며, Raji 세포 + 세포자살성 세포 투여 마우스는 29%, Raji 세포 + 항-CD20 mAb 투여 마우스는 57%, Raji 세포 + antiCD20 + 세포자살성 세포 투여 마우스는 100%이었다 (도 23C). 기대 수명 보다 76% 이상 생존한 경우는, Raji 세포 투여 마우스에서는 없었으며, Raji 세포 + 세포자살성 세포 투여 마우스는 29%, Raji 세포 + 항-CD20 mAb 투여 마우스는 14%, Raji 세포 + antiCD20 + 세포자살성 세포 투여 마우스는 85%이었다 (도 23D). 기대 수명 보다 100% 이상 생존한 경우는, Raji 세포 투여 마우스 또는 Raji 세포 + 항-CD20 mAb 투여 마우스에서는 없었으며, Raji 세포 + 세포자살성 세포 투여 마우스 또는 Raji 세포 + antiCD20 + 세포자살성 세포 투여 마우스는 29%이었다 (도 23E).
결론:
세포자살성 세포 주입은 백혈병 마우스의 수명을 연장하고, 완전 관해를 획득하는 마우스의 수를 증가시켰으며, 항-CD20 mAb의 치료 효과를 강화하였다 (도 23A-23E).
실시예 11: 백혈병/림프종에 대한 ApoCell (초기 세포자살성 세포) 효과
목적: 본 실험의 목적은 3가지이다: (1) 백혈병-림프종 마우스 모델에서 질환의 개시, 진행 및 이로 인한 사망에 대한 ApoCell 효과 분석; (2) ApoCell 처리 후 백혈병-림프종 마우스 모델에서 종양 세포의 분포 분석; 및 (3) SCID-Bg 마우스에서 백혈병-림프종 치료시 ApoCell과 리툭시맵 (RtX)의 가능한 상승 작용 분석. 이러한 목적에 맞는 실험의 일부로서, ApoCell 투여 후 백혈병 마우스의 생존 결과를 측정하였다. 물론, 종양 세포의 분포를 ApoCell 처리 후 측정하였다.
방법:
마우 스. 7주령의 암컷 SCID-Bg 마우스 (ENVIGO, Jerusalem, Israel)에 마우스 당 Raji 세포 0.1 x 106개를 정맥내 주사하였다. 실험 5일, 8일 및 11일에 ApoCell 30 x 106개를 정맥내로 3번 마우스에 투여하였다. 병용 요법의 경우, ApoCell 투여 후 1.5시간에, RtX (2 또는 5 mg/kg; Mabthera, Roche, Basel, Switzerland)를 1회 (8일) 마우스에 투여하였다.
마우스를 매일 추적하였으며, 주당 2회 체중을 측정하였다. 엔드포인트는 사망, 또는 다음과 같은 증상의 발병으로 인한 희생으로서 정의하였다: 대마비 (하체 마비), 마우스 최초 체중으로부터 감소율 20%, 무기력, 움직임 저하 또는 호흡 노력 증가.
생존 분석을 카플란-마이어 방법에 따라 수행하였다. 마우스를 IACUC (institutional Animal Care and Use Committee) 가이드라인에 따라 SPF (specific-pathogen-free) 동물 시설에서 사육하였다.
Raji 세포주. 이 인간 버킷 림프종 세포주는 European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC, Cat. #: 85011429)에서 구입하여, 완전 배지 (10% 열 불활화된 FBS, 1% GlutaMAX, 1% 페니실린/스트렙토마이신 첨가된 RPMI-1640)에서 통례적으로 배양하였다.
ApoCell. 기본적으로, 실시예 1에 기술된 바와 동일함. 간략하게는, 농화된 단핵구 세포 분획을 건강한 적격 공여자로부터 백혈구성분채집술을 통해 수집하였다. 성분채집술 완료 후, 세포를 PlasmaLyte A pH 7.4, 5% 인간 혈청 알부민, 10% 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 5% 항-응집제 사이트레이트 덱스트로스 용액 포뮬러 A (ACD-A) 및 0.5U/ml 헤파린으로 구성된 동결 매질로 세척 및 재현탁하였다. 그런 후, 세포를 점진적으로 동결시켜, 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮겼다.
ApoCell을 준비하기 위해, 동결보존된 세포를 해동하고, 2 mM L-글루타민 및 10 mM hepes가 첨가된 RPMI 1640, 10% 자가 혈장, 5% ACD-A, 0.5 U/ml 헤파린 소듐 및 50 ㎍/ml 메틸프레드니솔론로 구성된 세포자살 유도 매질로 세척 및 재현탁하였다. 그런 후, 세포를 6시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, 세포 프로세싱 시스템 (Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany)을 사용해 하트만 용액 중에 세포를 수집하여, 세척 및 재현탁하였다. ApoCell을 10분간 2-8℃에서 290g로 원심분리하고, 주사용 하트만 용액에 재현탁하였다. ApoCell의 세포자살 및 생존성을 아넥신 V 및 프로피듐 아이오다이드 (PI, Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan)를 사용해 FCS 익스프레스 소프트웨어로 측정하였다.
유세포 측정. (전술한 바와 같이, 임상 신호 악화에 따라) 희생시킨 마우스로부터 마우스 비장, 간 및 골수를 수집하고, 유세포 측정 (FACSCalibur, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 의해 Raji 종양 (항-CD20)의 존재를 분석하였다.
결과:
파트 A: ApoCell은 백혈병 마우스에서 질환 개시 및 이로 인한 사망을 지연시킨다.
도 24는 3가지 개별 실험을 나타낸 카플란-마이어 생존 곡선이다 (RPMI 그룹, n = 15; Raji 그룹, n = 23; Raji + ApoCell 그룹, n = 24). 각 실험에서, 암컷 SCID-Bg 마우스 (7-8주령)에 Raji 세포 0.1 x 106개를 정맥내 주사하였으며, 대조군에는 RPMI를 주사하였다. 다음으로, 5일, 8일 및 11일에, 마우스에 ApoCell 30 x 106개를 3회 정맥내 (IV) 투여하였다. 마우스를 매일 추적하였으며, 주당 2회 체중을 측정하였다. 엔드포인트는 사망, 또는 다음과 같은 증상의 발병으로 인한 희생으로서 정의하였다: 대마비 (하체 마비), 마우스 최초 체중으로부터 감소율 20%, 무기력, 움직임 저하 또는 호흡 노력 증가. 실험의 상세 내용은 표 11에 나타낸다. ApoCell에 의한 현저한 유익한 효과가 관찰되었다 (p=0.002, 로그-순위 (Mantel-Cox) 검사).
표 11: 도 A 플롯의 실험 상세 내용
그룹 마우스 수 구체적인 생존 결과 메모
평균 희생 일 범위 (일수)
RPMI 15 마우스 전체에서 DFS*가 관찰됨
Raji 23 22 21 - 25
Raji + ApoCell 24 28 19 - >53 (실험 종료) 53일/60일에 DFS* 마우스 2마리
* DFS = 무병 생존
개별 실험들의 데이타는 도 25A-25C에 나타낸다.
전술한 바와 같이, Raji 세포 투여 후 ApoCell을 3회 처리한 마우스에서 느린 질병 진행이 관찰되었으며, 비처리 마우스 보다 유의하게 늦게 사망하였다 (p=0.0020).
ApoCell 처리된 백혈병 마우스는 증상 개시가 현저하게 지연되었으며, 질환 진행이 더 느렸으며, 비처리 대조군 마우스 보다 늦게 사망하였다. 흥미롭게도, Raji 세포 및 ApoCell 투여 마우스들 중 약 10%는 백혈병/림프종 모델에서 예상되는 증상 특징들 중 어떠한 증상도 발현하지 않았으며, 실험 종료시까지 건강하게 남아있었다 (53일 또는 60일).
ApoCell은 백혈병 마우스에서 종양 부하를 감소시킨다
전술한 바와 같이 임상 증상의 악화로 인해 희생시키고, 대상 장기, 즉 간, 비장 및 골수를 분석을 위해 수집하였다. 이들 타겟 장기의 세포를 인간 종양 세포의 존재에 대해 유세포 측정으로 분석하였다 (Raji 세포는 CD20에 양성임).
아래 데이터 (표 12)는 전술한 3가지 실험에서 희생된 마우스의 타겟 장기에서 평균 세포 집단 %를 나타낸다; 각 실험에서 각 마우스의 값은 아래 표 13-18에서 확인할 수 있다.
표 12: 비장, 골수 및 간에서의 평균 종양 집단 % (유세포 측정)
조직 처리 마우스 # CD20 + 세포 % (평균 ± SD)
비장 RPMI 5 0
Raji 10 0
Raji + ApoCell 8 1.1 ±3
골수 RPMI 5 0
Raji 10 16.5 ±8.8
Raji + ApoCell 8 6.8 ±9.2 (P=0.02, t-검정)
간 RPMI 5 0
Raji 10 11.2 ±12
Raji + ApoCell 8 4.5 ±7.5 (P=0.06, t-검정)
생체내 실험 011
골수, 비장 및 간에서 CD20+ 세포에 대한 FACS 분석:
ApoCell를 3회 투여한 마우스 1마리는 60일 희생 시점에 건강하였다.
간, 비장 및 골수 세포를 수집하고, 인간 CD20-FITC (Biolegend, Cat. # 302206); mIgG1-FITC (Biolegend, Cat. # 400110)의 존재에 대해 유세포 측정 (FACSCalibur, BD)으로 분석하였다.
생체내 실험 019
골수, 비장 및 간에서 종양 세포의 FACS 분석:
마우스 비장, 간 및 골수 세포를 (방법에 정의된 바와 같이) 임상 악화로 인해 희생시킨 마우스로부터 수집하고, 인간 CD20 (FITC)의 존재를 유세포 측정 (FACSCalibur, BD)으로 분석하였다.
비장, 골수 및 간에 대한 분석 결과는 아래 표 13-15에 나타낸다.
표 13: 비장
비장
마우스 처리 희생 일 CD20+
A1 RPMI 0
A2 0
A3 0
B2 Raji 22 0
B3 22 0
B5 22 0
B6 22 0
B2 (020) 25 0
B3 (020) 25 0
C1 Raji + ApoCell 28 0
C2 53 (건강한 개체) 8.7
C4 22 0
C6 22 0
C7 28 0
표 14: 골수
골수
마우스 처리 희생 일 CD20+
A1 RPMI 0
A2 0
A3 0
B2 Raji 22 18.7
B3 22 11.3
B5 22 10.5
B6 22 14.5
B2 (020) 25 21
B3 (020) 25 0
C1 Raji + ApoCell 28 1
C2 53 (건강한 개체) 0.5
C4 22 0.6
C6 22 17.5
C7 28 1.4
표 15: 간
간
마우스 처리 희생 일 CD20+
A1 RPMI 0
A2 0
A3 0
B2 Raji 22 4.4
B3 22 6.5
B5 22 1.7
B6 22 5.4
B2 (020) 25 26.4
B3 (020) 25 5.9
C1 Raji + ApoCell 28 9.8
C2 53 (건강한 개체) 0.5
C4 22 3
C6 22 5
C7 28 22.7
생체내 실험 023
유세포 측정에 의해 결정된, 비장, 골수 및 간에서 CD20 종양 세포의 발현 (%). 마우스 비장, 간 및 골수를 (방법에 정의된 바와 같이 임상 악화에 따라) 희생시킨 마우스로부터 수집하고, 인간 CD20 (FITC) 존재에 대해 유세포 측정 (FACSCalibur, BD)으로 분석하였다. 각 마우스의 비장, 골수 및 간에서의 결과는 아래 표 16-18에 나타낸다.
표 16: 비장
비장
처리 마우스 희생 일 CD20+
Raji B1 22 0
B2 25 0
B3 22 0
B4 22 0.2
Raji + ApoCell C1 22 0.2
C4 22 0.3
C5 41 0.1
C6 47 0
Raji + RtX 2mg/kg E1 32 0
E2 32 0.7
E6 32 0
Raji + RtX 2mg/kg + ApoCell F1 40 0
F2 43 0.1
F4 35 0
F5 32 0
F6 35 0
F7 57 0.4
Raji + RtX 5mg/kg G1 34 0
G3 34 0.1
G4 43 0
G5 40 0
G7 40 0.1
Raji + RtX 5mg/kg + ApoCell H1 40 0.4
H3 36
H4 36
H5 40 0
H6 40 0
H7 53 0
표 17: 골수
골수
처리 마우스 희생 일 CD20+
Raji B1 22 18
B2 25 22.5
B3 22 33.6
B4 22 14.9
Raji + ApoCell C1 22 24.3
C4 22 1.8
C5 41 7.8
C6 47 0
Raji + RtX 2mg/kg E1 32 0.8
E2 32 3.1
E6 32 3
Raji + RtX 2mg/kg + ApoCell F1 40 4.1
F2 43 0.4
F4 35 0.2
F5 32 0.8
F6 35 0.2
F7 57 0.4
Raji + RtX 5mg/kg G1 34 2.1
G3 34 0.5
G4 43 4.3
G5 40 2.2
G7 40 2.6
Raji + RtX 5mg/kg + ApoCell H1 40 0.9
H3 36 0
H4 36 0
H5 40 1.6
H6 40 1.3
H7 53 1.8
표 18: 간
간
처리 마우스 희생 일 CD20+
Raji B1 22 6.4
B2 25 42.6
B3 22 5
B4 22 8.1
Raji + ApoCell C1 22 2.5
C4 22 2.2
C5 41 0.4
C6 47 0
Raji + RtX 2mg/kg E1 32 2.1
E2 32 1.2
E6 32 0.4
Raji + RtX 2mg/kg + ApoCell F1 40 0
F2 43
F4 35 0
F5 32 7.3
F6 35 5
F7 57 0
Raji + RtX 5mg/kg G1 34 1
G3 34 7.3
G4 43 1.4
G5 40 0.9
G7 40 5.7
Raji + RtX 5mg/kg + ApoCell H1 40 0.8
H3 36 0.1
H4 36 0
H5 40 0.5
H6 40 25.1
H7 53 3.4
예비 실험 결론: 결론적으로, 마우스 장기 내 종양 분포는 생존 곡선에서 나타난 유익한 효과와 연관 있으며, 치료 마우스의 골수 및 간에서 현저하게 감소하였다.
파트 B: 백혈병/림프종 치료에 대한 ApoCell 및 리툭시맵 (RtX)의 상승 작용
다음으로, 백혈병 마우스에 대한 RtX 및 ApoCell의 조합 효과를 2가지 실험으로 평가하여, ApoCell 처리가 백혈병/림프종의 다른 통상적인 치료와 상승 작용하는 지를 조사하였다.
목적: rtx 및 ApoCell 투여 후 백혈병 마우스의 생존성 측정 및 백혈병 마우스에서 골수, 간 및 비장에서 종양 세포 검출
방법: 다음 작업은 병용 요법 실험 (ApoCell 및 rtx)에서 수득된 결과를 대표적으로 설명한다. 간략하게는, 암컷 SCID-Beige 마우스에 Raji 세포 0.1 x 106개를 정맥내 주사하였다 (모든 그룹 n = 7). 마우스에는 5일, 8일 및 12일에 ApoCell 30 x 106개를 정맥내 3회 투여하였다. 8일에, ApoCell 주사 후 1.5시간에 RtX 2 또는 5 mg/kg을 1회 IV로 투여하였다. 마우스를 매일 추적하였으며, 주당 2회 체중을 측정하였다. 엔드포인트는 사망, 또는 다음과 같은 증상의 발병으로 인한 희생으로서 정의하였다: 대마비 (하체 마비), 마우스 최초 체중으로부터 감소율 20%, 무기력, 움직임 저하 또는 호흡 노력 증가.
결과:
도 26에 나타낸 바와 같이, ApoCell은 도 24에 제시된 결과를 뒷받침하는 유익한 효과를 나타내었다. 리툭산 (RtX) 단독은 2 mg 및 5 mg 용량 둘다에서 ApoCell 비해 우수한 효과를 나타내었고, 5 mg에서 관찰된 상승적인 작용이 통계학적으로 유의한 수준에 도달하진 않았음에도 불구하고 ApoCell과 리툭산 조합은 2 mg (p=0.104) 및 5 mg 용량에서 상승적인 효과를 발휘하였다. 마우스 장기 내 종양 분포는 유익한 효과와 연관성을 가진다 (표 19).
표 19: 생존 분포에 대한 통계학적 분석 (로그-순위 (Mantel-Cox) 검정)
비교 그룹 통계 검사 (P 값)
그룹 1 그룹 2 로그-순위 (Mantel-Cox) 검정
Raji Raji + rtx (2mg/Kg) 0.0002
Raji Raji + rtx (2mg/Kg) + ApoCell 0.0002
Raji Raji + rtx (5mg/Kg) 0.0002
Raji Raji + rtx (5mg/Kg) + ApoCell 0.0002
Raji + 리툭산 (2mg/Kg) Raji + 리툭산 (2mg/Kg) + ApoCell 0.0104
실험 종료 - 57일
실험 종료시, 마우스 1마리 (Raji + RtX 2mg/kg + ApoCell)는 질병이 없는 것으로 인정되었다.
부가적인 실험에서 2 mg RtX 1회 투여시 상승 작용이 관찰되었다. 본 실험에서 명확하게 나타난 바와 같이 (도 27), ApoCell와 RtX의 상승 작용은 유의한 것으로 검증되었다 (p=0.01).
표 20에 나타낸 바와 같이, 비장에는 종양 세포가 증식하지 않았으며 (0.1-0.3은 백그라운드 염색임), 대조군으로 사용하였다. 반면, 골수 및 간이 종양의 타겟이었다. ApoCell 및 RtX의 개별 처리 후 골수 및 간에서 종양 집단이 감소하였으며 (Raji 세포, CD20 마커를 사용해 측정함), 이 2가지를 조합하였을 때 효과가 증가하였다; Raji + rtx (2mg/Kg) + ApoCell의 경우 p= 0.0034 (**), Raji + rtx (5mg/Kg) + ApoCell 경우 p= 0.0031 (**)(T-검정). 예상한 바와 같이, RtX는 백혈병 마우스의 타겟 장기에서 종양 부담을 현저하게 감소시킨다. 흥미롭게도, ApoCell 단독 처리는, 통상적인 RtX 요법을 이용한 처리와 비슷한 수준으로 장기 내 종양 세포를 감소시켰다.
표 20: 비장, 골수 및 간에서 평균 종양 세포 집단 (유세포 측정)
Figure pct00004
결론: 요컨대, 생존 곡선 (도 24, 도 26 및 도 27)은 ApoCell 및 Rtx의 유익한 효과뿐 아니라 ApoCell 및 RtX 조합의 상승적인 작용을 명확하게 보여준다. 특히, 통상적인 RtX 치료를 ApoCell와 조합하였을 때, RtX 투여량과 무관하게 생존성이 현저하게 증가하였으며, 이는 2가지 요법의 강력한 상승 작용을 의미한다. 이를 뒷받침하는 임상 결과는 골수 및 간에서 종양 세포 집단의 감소였다 (표 12).
놀랍게도, ApoCell 조제물은 백혈병 마우스 모델에서, 임의의 다른 치료와는 독립적으로 질환 진행 및 생존성에 대해 현저하게 유익한 효과를 나타내었다. 카플란-마이어 분석에서 마우스들 중 10-20%가 생존 연장하였으며 (도 24, 도 26 및 도 27), 종양 세포 부담도 간 및 골수에서 감소되었다. 또한, ApoCell 및 RtX를 조합하여 투여한 경우 현저한 상승 작용이 나타났으며, 이는 질환 개시 및 진행을 추가적으로 지연하고, 생존성을 개선하였다.
실시예 12: GVHD 백혈병/림프종 모델에서 세포자살성 세포 풀 조제불의 용도
아래 예비 실험에서, GvHD 백혈병/림프종 모델에서 동일한 주입 효과를 조사하였다. 골수 이식 (BMT)을 시술하는 마우스에서 급성 GvHD의 예방에 있어 방사선 처리된 다중 공여자 단일 세포자살성 세포 주입 (방사선 처리된 단핵구 세포자살성 세포 조제물의 풀)의 안정성 및 효능을 조사하였다. 이 모델에서, BMT는 방사선 조사된 마우스를 회복시켰다 (80-100%).
이식편대 백혈병 (GvL) 효과는 중증의 GVHD와 관련있는 것으로 확인되어 있어, 이러한 효과 제거 가능성에 대한 의문이 고 등급의 aGVHD를 잠재적으로 회피하는 모든 성공한 치료에서 발생하였다.
방법
세포자살성 세포를 상기 실시예 1에서와 같이 제조하였으며, 단 본 실험에서는 4명의 공여자로부터 동시에 제조하였다. 4명의 공여자로부터 제조한 후, 세포 조제물을 마지막 단계에서 (방사선 처리 전) 조합하고, 즉시 방사선 처리한 다음 방사선 처리 직후 주사하였다. 방사선은 25 Gy로 조사하였다.
결과
도 28 및 도 29에 제시된 그래프 2개는, 다중 개별 공여자 (점선)로부터 유래된 세포자살성 세포의 1회 주사가 생종성 및 체중 감소에 명확한 효과를 나타냄을 보여준다 (p<0.01). 도 28은 다중 개별 공여자로부터 유래된 방사선 처리된 세포자살성 세포를 1회 처리한 GvHD 마우스 모델의 카플란-마이어 생존 곡선으로서, 생존성이 유의하게 개선되었다. 도 29는 도 28의 결과를 뒷따르며 이와 관련있는 2개의 비교군의 체중 감소 %이다.
요컨대, 다중 공여자 유래 방사선 처리된 세포자살성 세포를 1회 주입하면 GvHD 마우스 모델에서 기대 수명이 성공적으로 현저하게 개선되었다.
실시예 13: 다중 개별 공여자 유래 세포자살성 세포에 대한 안정성 기준
본 실험의 목적은 다중 개별 공여자 (multiple individual donors) 유래 세포자살성 세포에 대한 안정성 기준을, 방사선 비-처리된 HLA-매칭 세포자살성 세포에 대한 비교 실험을 통해 개발하는 것이다 (Mevorach et al. (2014) Biology of Blood and Marrow Transplantation 20(1): 58-65; Mevorach et al. (2015) Biology of Blood and Marrow Transplantation 21(2): S339-S340).
최종 세포자살성 세포 산물 조제물에 대해, 8, 24, 48 및 60시간 동안 2-8℃에서 보관한 후 각각의 시점에 샘플을 취하여, 세포수, 생존성, 세포자살 표현형 및 효력에 대해 평가하였다. 최종 세포자살성 세포 산물 lot을 표준 조작 공정 (SOP)에 따라 제조하고 (실시예 1; 실시예 5), 배치 기록하였다 (BR; 즉 특수 제조 공정. 효력 평가를 위해, 초기 세포자살성 세포 조제물의 최종 산물 lot의 샘플에서, 미성숙 수지상 세포 (시간대 0-24h) 또는 단구 (시간대 0-6)에서 리포폴리사카라이드 (LPS) 유도성 MHC-II 발현의 상향 조절이 저해되는 것을 검사하고, SOP에 따라 수행하고, BR에 기록하였다. 이러한 일련의 검사를, 다중 개별 공여자 및 단일 공여자로부터 각각 기원한 조제물 풀 산물 및 풀링하지 않은 풀에서 수행하였다.
또한, CD3 (T-세포), CD19 (B-세포), CD14 (단구), CD15high (과립구) 및 CD56 (NK 세포)의 유세포 측정 분석을 수행하였다. 이들 실험의 목적은 한정된 결과 범위에서 일관성을 입증하는 것이다. 예비 실험 결과는 이들 목적에 부합하며, SOP에서 편차는 없으며, 기술적인 문제도 없었다. 그러나, 효과적인 치료 범위 및 안정성을 확립하기 위해 추가적인 실험이 필요하였다. 예비 실험 결과 이들 파라미터 전체에서 동일하게 나타났다. 또한, 단일 공여자 안정성 실험에서 적어도 48시간 동안 안정성을 나타내었다 (실시예 1 참조).
실시예 14: 급성 이식 편대 숙주 질환에 대한 예방제로서 다중 공여자 방사선 처리된 세포자살성 세포의 안전성 및 효능
목적: 동종이계 HLA-매칭되는 조혈 줄기 세포 이식을 시술받은 인간 백혈구 항원-매칭된, 관련 및 비관련 환자를 대상으로, 혈액암에서 이식 편대 숙주 질환을 예방하기 위한, 다중-, 비매치-공여자 유래 방사선 처리된 세포자살성 세포의 1회 투여에 대한 안전성, 관용성 및 예비 실험 효능을 평가하는, 1/2a 상, 다기관, 오픈-라벨 실험.
1차 목적: 방사선 처리된 세포자살성 세포 치료에 대한 안전성 및 관용성 평가.
2차 목적: 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 시술이 계획된 혈액암 환자에서 급성 GVHD (aGVHD)에 대한 예방적 조치로서 다중 개별 공여자 유래 방사선 처리된 세포자살성 세포의 효능 평가. 본 실험의 목적에서, HSCT는 골수 이식 (BMT) 또는 말초혈 줄기 세포 이식 (PBSCT)일 수 있다.
치료 적응증: 인간 백혈구 항원 (HLA)-매칭된 관련 및 비-관련 환자들에서, 혈액암에서 이식 후 이식 편대 숙주 질환 (GVHD)
실험 설계: 본 실험은, HLA-매칭되는 관련 또는 비-관련 공여자로부터 HSCT (골수 이식 또는 말초혈 줄기 세포 이식) 이식이 계획된 혈액암 진단 환자들에서, 완전한 골수 파괴성 또는 강도 저하된 골수파괴성 컨디셔닝 용법을 추적하는, 오픈 라벨의 다기관, 1/2a 상 실험이다.
이식 환자에서 고지에 입각한 동의를 구하고, 공여자 스크리닝 기간이 끝나고 세포를 수집한 후, 컨디셔닝 용법을 개시하기 전에, 적합한 이식 환자는, HSCT 이식하기 12-36시간 전에 정맥내 (IV) 주사하기 위해, 예방적 처리 및 관련 대 비-관련 이식 공여자 1:1의 비율로 할당 (계층화)한다.
조사 영역: 포스페이트 완충제 용액 (PBS) 중의, 방사선 처리된 초기 세포자살성 세포/(체중)kg으로서, 다중 개별 공여자 유래 세포 140 x 106 ±20% 개/kg 1회 투여.
환자들 모두 표준 관리 위원회 (institutional standard of care, SOC)의 면역억제 용법에 따라 치료한다: 완전한 골수절제 (myeloablation)의 경우 사이클로스포린/메토트렉세이트 또는 타크롤리무스/메토트렉세이트, 및 낮은 강도의 경우 미코페놀레이트/사이클로스포린 또는 미코페놀레이트/타클로리누스. 환자들은 의학적 처방에 따라 입원한다.
환자를 최대 180일간 2차 효능 엔드포인트 및 1년간 1차 효능 엔드포인트 및 3차 효능 엔드포인트를 추적한다. 실험에 참여한 환자의 방문 횟수는 증상에 따라 환자에 일반적인 수준과 비슷할 것이다. 공여자의 경우, 스크리닝 기간 중에 성분채집술 공정을 위해 특별히 방문한다.
이들 환자는 다수의 기저 의학 질환을 가지고 있고 aGVHD에 상응하는 증상을 경험할 수 있으므로, 독성이 세포자살성 세포와 관련있는지를 완전히 결정하기 어려울 수 있거나, 또는 기본적인 데이터가 GvHD를 예방하기 위해 세포자살성 세포를 이용한 이전의 1-2a 상 실험에서 도출됨에도 불구하고 그렇지 않을 수 있다 (Mevorach et al. (2014) Biology of Blood and Marrow Transplantation 20(1): 58-65, Single Infusion of Donor Mononuclear Early Apoptotic Cells as Prophylaxis for Graft-versus-Host Disease in Myeloablative HLA-Matched Allogeneic Bone Marrow Transplantation: A Phase I/IIa Clinical Trial. BBMT 20(1)58-65).
데이터 안전성 모니터링 보드 (DSMB)는 안전성 문제가 이전에 제기되지 않은 것으로 가정하여, 계획된 중간 분석 시기 (180일)를 비롯하여 DSMB 차트에 명시된 바를 충족할 것이다.
실험 절차:
본 실험은 스크리닝, 치료 및 추적 기간으로 구성될 것이다.
1. 스크리닝 기간 (-60일부터 -2일까지)
잠재적인 수용 환자는 임의의 실험 관련 절차를 진행하기 전에 고지에 입각한 동의서에 사인한다. 승인 전 표준 평가는 스크리닝 기간 동안에 공여자에 대해 이식 센터에서 수행되며, 일반적으로 인구통계 데이터, 병력, HLA 매칭 상태 검증 (매칭되어야 하는 것은 아님), 신체 검사, 키 및 체중, 활력 징후, 임신 검사 (모든 여성), 혈액, 혈액 화학, 감염성 질환 스크리닝, ECG 및 뇨 분석을 포함한다.
수용자 (실험 환자)는 스크리닝 기간 동안 다음과 같은 평가를 받게 된다: 인구통계 데이터, 병력, 카르노프스키 (Karnofsky) 성능 상태, HLA 매칭 검증, 신체 검사, 키 및 체중, 활력 징후, 임신 검사 (모든 여성), ECG, 폐 기능 검사, 혈액, 혈액 화학, 응고 마커 (coagulation marker), 감염성 질환 스크리닝 및 뇨 분석.
1차 스크리닝 평가 후, 수용자가 실험 참여에 적합하다면, 다중 공여자 세포자살성 세포를 140 x 106±20% 세포/kg로 1회 IV 주사하기 위해, 수용자 환자를 컨디셔닝 용법 첫날에 할당한다. 세포자살성 세포 주입 전날 또는 당일에 종료되는 컨디셔닝 용법은 실험 -1일로 계획된다.
세포자살성 세포 용량은 각 수용자 환자에 대해 계산되며, 아마도 그에 따라 성분채집술 콜렉션 수 및 공여자의 수가 결정될 것이다.
말초 줄기 세포 이식 공여자: -6일부터 -1일 사이에, 전구 세포를 동원하기 위해 G-CSF를 매일 1회 이상 투여하고, 0일에 이식용 공여 조혈 줄기 세포를 제조하기 위해 성분채집술을 수행한다. 골수 이식용 조혈 줄기 세포 제조는 훈련된 병원 관계자에 의해 센터의 표준 실무에 따라 수행한다. HSCT용 조혈 줄기 세포는 투여 전 조작되지 않거나 또는 T-세포 고갈 처리되지 않는다.
골수 이식 공여자: 골수를 회수하여, 센터의 표준 실무에 따라 처리하며, 달리 조작 처리되지 않는다.
2. 치료일 (-1일)
-1일 (HSCT 수행 전 12-36시간)에, 적합한 환자에게 다중 개별 공여자 방사선 처리된 초기 세포자살성 세포를 140 x 106 ±20% 세포/kg으로 1회 IV 주입한다. 주입하는 동안에 활력 징후를 매시간 모니터링하고, 그 이후에는 처음 24시간 동안 4시간 마다 모니터링한다. 주입 직후 치료 관련 AE를 평가한다.
0일에, 환자에게 지역 위원회의 가이드라인에 따라 조혈 줄기 세포를 이식한다.
3. 단기 추적 기간 (0일부터 180일까지)
1차 엔드포인트 안정성 및 관용성, 그리고 2차 및 3차 엔드포인트를 평가하기 위해 환자를 최대 180일간 추적한다: aGVHD 등급 II 내지 IV의 누적 발생률 (Przepiorka et al cumulative incidence of any grade and high grade aGVHD에 기반한 "수정된 글룩스버그 (modified Glucksberg)" 컨센서스, 즉 aGVHD의 발병까지의 소요 시간, 등급 II-IV; GVHD에 대한 임의의 전신 치료, 및 cGVHD의 발병).
단기간 추적 방문은 이식을 위한 입원 중에는 (일반적으로 적어도 -1일부터 +14일 이상까지) 매일이고, 퇴원한 후에는 처음 7주간 매주 방문: +7일, +14일, +21일, +28일, +35일, +42일, 그리고 이후 60일, 100일, 140일 및 180일이다. 방문 윈도우는 각각의 매주 방문 (처음 7주간)시에는 ±5일일 것이고, 이후 180일까지의 추적 기간에는 2주 또는 그 이상의 간격의 경우 ±5일 것이다.
혈액 샘플은 1, 3, 7, +7, +28, +42, 60, 100, 140 및 180일에 수득하여, 생착, 면역학적 회복, 혈장 및 혈청 바이오마커 ("Michigan") 및 세포 하위집단을 조사한다.
4. 장기간 추적 기간 (181일부터 365일/1년까지)
HSCT 시술 후 1년 동안 장기간 2차 엔드포인트에 대해 환자를 추적한다: 비재발 사망률 및 전체 생존 (OS), 재발 발생률, 백혈병 비-발병 생존 (LFS) 및 만성 GVHD. 2번 이상의 장기간 추적 방문을 행하고, 마지막 방문은 HSCT 시술 후 12±1개월일 것이다.
연구 기간: 각각의 참여 환자에 대한 연구 기간은 다음과 같이 최대 14개월이다:
스크리닝 최대 60일(2개월)
치료 1일
추적 하기로 이루어진 365일(12개월)
단기 180일
장기 +180일
연구 집단: 센터 표준 실무에 따른, 골수제거 또는 감소된 강도의 컨디셔닝 용법 후, 적어도 15명의 비-관련 공여자를 이용한, HSCT (골수 이식 또는 말초혈 줄기 세포 이식) 시술이 계획된 혈액암으로 진단된 환자 총 25명이 실험에 포함되고, 병력 대조군 (historical control)과 비교한다.
포함/제외 기준:
수용자 환자 제외 기준
1. 환자, 연령 > 18, 악성 종양으로 동종이계 HSCT 시술 자격이 되는 자:
급성 골수성 또는 미분화되거나 또는 이중표현형 (biphenotypic), 백혈병, 완전한 관해 (임의의 관해) 또는 그 이상이나 골수내 형태에 따른 모세포가 <5%임.
골수이형성증후군(MDS)으로부터 발생한 경우, 완전한 관해 상태의 급성 골수성 백혈병 (AML) (급성 골수성 백혈병으로 진단되기 적어도 3개월 전에 MDS로 진단되어야 함). 또는 진성 적혈구 증가증 또는 특발성 혈소판 증가증 (essential thrombocytosis)로부터 발생됨.
완전 관해 (임의의 관해) 상태이고, 골수내 형태학적으로 모세포가 <5%인, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL).
만성이거나 또는 가속기 (accelerated phase) 상태의 만성 골수성 백혈병 (CML).
골수이형성 증후군 - 다계열 형성장애 (multilineage dysplasia)를 동반한 불응성 혈구 감소증 (refractory cytopenia, RCMD), RA (불응성 빈혈), 환상 철적혈모구 (ringed sideroblast)를 동반한 RA (RARS; 모두 모세포 <5%), 과량의 모세포를 동반한 RA (RAEB; 모세포 5 내지 20%).
이식 공여자 및 수용자 환자는 적어도 HLA A, B, C, DQ 및 DR 유전자 좌에서 8/8 HLA 매칭되어야 하며, 항원 또는 대립유전자 미스매치는 없어야 한다. 그러나, 세포자살성 세포 형성을 위한 백혈구 공여자(들)는 HLA 매칭에 의해 제한되지 않는다.
스크리닝 방문시 성능 상태 스코어 70% 이상 (성인의 경우 카르노프스키, 16세 미만의 수용자의 경우 란스키).
컨디셔닝 개시 4주 이내에 성인의 경우 심장 좌심실 박출 계수 (ejection fraction) ≥ 40%; 안트라사이클린 노출 전 또는 병력 전인 경우에는 MUGA 스캔 또는 심장 ECHO가 요구됨.
DLCO1, FEV1(강제 호기량) 및 FVC (강제 폐활량)를 이용한 폐 기능 검사에서 ≥60%로 예상됨. (1일산화탄소 폐 확산 능력)
실내 공기 중에서 산소 포화도 90% 이상.
환자는 반드시 하기 정의된 바와 같은 적절한 장기 기능을 가져야 한다:
AST (SGOT)/ALT (SGPT) < 정상 상한 (ULN)의 3 x.
혈청 크레아티닌 < 2.0 ㎎/dL (성인, >16세) 또는 < 0.8 (1-2세), < 1 (3-4세), < 1.2 (5-9세), <1.6 (10-13세), 및 1.8 (14-15세).
길버트병 또는 용혈으로 인한 것이 아닌 한, 혈청 빌리루빈 < 3 mg/dL.
환자 또는 일부는 보호자가 실험에 독립적으로 참여하기 위한 사전 고지에 의한 동의에 서명.
실험의 요건을 충족시키기 위한 자격.
4주간 (-1일부터), 여성 및 남성은 모두 하기에 동의하여야 한다:
BMT 관련 제한이 존재하는 경우, 첫 1달 또는 그 이상 동안 허용가능한 피임 방법을 사용하거나 또는 외과적인 피임 사용.
임신 가능성과 무관하게 임신 검사 결과 음성.
수용자 환자 제외 기준
제외 기준에 명시되지 않은 HSCT 시술이 적합한 모든 질환.
스크리닝 방문 30일 이내에 중재 조사 실험 (interventional investigational trial)에 참여.
공격적인 또는 난치성 악성 종양을 가짐.
BMT 계획에 T-세포 고갈된 동종이식이 포함된 경우.
이식 후 GVHD를 예방하기 위해, 면역억제 용법의 일부로서 BMT 계획에 항-흉선세포 글로불린 (ATG) 또는 알렘투주맵, 또는 고 용량의 사이클로포스파미드 요법이 포함된 경우.
스크리닝 방문 2주 이내에 패혈증, 저산소혈증을 동반한 폐렴, 지속적인 균혈증 또는 수막염 등의 통제되지 않는 감염.
HBV 또는 HCV로 인한 현재 확인된 활성 급성 또는 만성 감염.
확인된 인간 면역결핍 바이러스(HTV) 감염.
산소 호흡기가 필요한 중증 또는 증상성 제한적 (symptomatic restrictive) 또는 폐색성 폐 질환 또는 호흡 부전을 보이는 환자.
연구 참여를 어렵게 할 수 있는 다른 동시적인 중증 및/또는 통제되지 않는 의학적 상태 (즉, 활성 감염, 통제되지 않는 당뇨병, 통제되지 않는 고혈압, 출혈성 심부전, 불안정 협심증, 심실 부정맥, 활성 허혈성 심장 질환, 6개월 이내 심근 경색, 만성 간 또는 신장 질환, 활성형 위장관 상부 궤양)를 나타내는 환자.
조사 산물의 효과를 조사하는데 방해가 될 수 있는 모든 만성 또는 급성 병태.
연구자의 판단에 따라, 연구 수행에 방해가 될 수 있는, 임의의 형태의 약물 남용 (약물 또는 알코올 중독 포함), 정신 질환 또는 임의의 만성 병태.
장기 동종이식 또는 이전의 줄기 세포 이식 병력 (단 동종이계).
수유 중인 가임기 여성.
실험 동안에 비-순응성 또는 비-협력적일 가능성이 있는 환자.
시험 제품 경로 및 투여 형태
세포자살성 세포는 방사선 처리된 다중 공여자 세포자살성 세포 산물을 140 x 106 ± 20% 세포/kg으로 IV 주입으로서 HSCT 시술하기 12-36시간 전에 투여한다.
세포자살성 세포는 다중 개별 공여자 세포자살성 세포로 구성되는 세포성 치료제이다. 이 제품은 초기 세포자살성 세포가 40% 이상인 액체 현탁물 형태의 동종이계 공여자 단핵구 농화된 세포를 포함한다. 현탁물은 GMP 규정에 따라 PBS 용액을 사용해 다중 개별 공여자로부터 준비하고, 주입시까지 2-8℃에서 보관하여야 한다. 최종 제품은 총 부피가 300-600 mL이고 불투명 이송 팩 안에 수용되며, 제조 후 25 Gy로 방사선 처리된다. 시험 제품은 제조 공정 완료 후 48시간 이내에 환자에게 투여되어야 한다.
안전성 결과/효능 엔드포인트/결과 측정
1차 :
안전성 및 관용성 엔드포인트는 생착하기까지의 시간과, 180일 및 360일 (1년)에 부작용, 동반 약물 및 안전성을 확인하기 위한 신체 검사를 포함한다. 아울러, 방사선 처리된 세포자살성 세포 풀 조제물은 시험관내 및 생체내 세포 증식 결핍 및 생체내 활성화 결핍을 나타낼 것으로 예상된다. 이러한 확인으로 세포자살성 세포 풀 조제물이 사용하기에 안전한 것으로 검증한다.
2차:
180일에, (Rowlings et al. 1997) IBMTR Severity Index for grading acute graft-versus-host disease: retrospective comparison with　Glucksberg　grade. Br J Haematol.　1997 Jun;97(4):855-64)에 기반한 "수정된 글룩스버그" 컨센서스에 따른, aGVHD 등급 II-IV의 누적 발생률
1년 비-재발성 사망률 및 전체 생존 (OS)
1년 재발성 발생률
1년 백혈병 비-발병 생존 (LFS)
처음 180일 이내의 최고 등급의 aGVFID
등급 III-IV aGVFID의 누적 발생률
180 및 360일 (1년) 경과시 Jagasia et al., 2015에 따른 만성 GVHD 발생률
20일부터 180일까지 aGvHD를 치료하기 위해 코르티코스테로이드를 포함한 (둘다 사용 또는 비-사용, 누적 투여량)를 임의의 "전신 치료"
+28일, 100일, 180일 및 360일(1년) 경과시 T, B, NK 및 단구 관련 면역 재구성 및 기능
180일 및 1년 경과시, 주요 감염 비율 (폐 침투, CMV 재활성화 및 입원이 필요한 임의의 기타 감염 포함).
3차/탐색
위험성이 있는 총 일수 또는 살아있는 있으며 퇴원한 총 일수에 대한 입원 일수의 퍼센트. 또는 이식 후 처음 퇴원까지의 총 입원 일수.
장기 특이적인 GVHD
180일 경과시, T reg, CD4 Tcon, CD8, NK 및 B 세포 수준
통계 분석:
실험 결과는 상응하는 베이스라인 특징을 가진 개체의 병력 대조군과 비교한다.
기술 통계학을 사용해 결과 측정값 및 베이스라인 특징을 요약한다. 이러한 분석에서 모든 이용가능한 데이터는 어떠한 누락 데이터에 대한 데이터 대체 (imputation) 없이 제시된다. 개체들은 철회 또는 연구 완료 또는 사망의 시점까지 이용가능한 데이터를 제공한다. 기술 통계학, 예를 들면, 평균, 중앙값, 표준 편차, 최소 및 최대를 사용해 연속 변수를 요약하여 나타낸다. 세포자살성 세포가 주입된 모든 개체들이 안전성 분석에 포함된다. 또한 HSCT를 이식받은 개체는 효능 분석에 포함된다. 이러한 연구는 사실상 탐색 목적이므로, ad hoc 분석이 계획된다.
샘플 크기 고려
환자 총 25명이 포함되며, 적어도 15명이 비-관련 매칭 환자로 등록된다. 새포자살성 세포 (모두 활성형으로 제공됨, GVHD 예방 용법에 따른 분류, 및 관련 대 비-관련 이식 공여자).
집단 분석 정의
모든 효능 분석은 치료 의향 (Intent-to-Treat)(ITT) 집단에 대해 수행하며, 적절한 병력 대조군과 비교한다. 안전성 집단은 실험 약물이 소정량으로 투여된 모든 환자들로 정의된다.
통계 방법
환자, 질환 및 이식 특징은 적절한 경우 빈도 및 백분율 또는 중앙값(범위)으로 기술된다.
안전성 분석
기술 통계학을 사용해, 실험 치료제 주입에서 HSCT 시술 (24-40시간 범위)까지 보고된 AE에 초점을 맞추어 안전성 결과를 요약 기술한다. 샘플 크기 조정 등의 실험 수행 변경은 DSMB 리뷰의 결과에 포함시키지 않는다. 이와 같이, 중간 분석의 결과로서 전체 유형 I 오류에서 페널티 조정이 필요한 것은 아니다.
2차 엔드포인트 분석
등급 II 내지 IV aGVHD는 경쟁적인 이벤트로서 aGVHD 이전에 사망한 누적 발생률 추정치를 사용해 기술한다.
호중구 및 혈소판 회복, 등급 III 내지 IV aGVHD, 만성 GVHD, 감염, 재발 및 이식 관련 사망률은, TRM에 대하여 경쟁적인 이벤트로서 재발 누적 발생률 및 그외 모든 경우에 대한 경쟁적인 이벤트로서 사망 누적 발생률로 기술한다. 전체 생존성 및 백혈병 비-발병 생존성은 카플란-마이어 추정치를 사용하여 기술한다. 처음 180일 내에 최고 등급의 aGVHD 및 180일째 스테로이드 필요성은 각각 만-휘트니 (Mann-Whitney) U-검정 및 카이 제곱 (chi-square) 검정을 사용해 기술한다. 각각의 세포 서브세트의 면역 회복 및 TREG는 중앙값 및 범위 만-휘트니 검정을 이용해 각 시간대에 대해 나타낸다.
실시예 15: GVHD 백혈병/림프종 모델에서 세포자살성 세포 풀 조제물 대 단일 공여자 세포자살성 세포 조제물의 비교
목적: GvHD 뮤라인 모델에서 GvHD의 중증도에 대한 단일 공여자로부터 수득된 인간 초기 세포자살성 세포의 유리한 임상적인 효과를, GvHD 뮤라인 모델에서 GvHD 중증도에 대한 다중 개별 공여자로부터 수득된 인간 초기 세포자살성 세포의, 만약에 존재한다면, 임상적인 효과와 비교함. 이때 다중 개별 공여자는 HLA 비-매칭되는 이종의 공여자임.
실시예 12는 다중 개별 공여자들로부터 폴링한 방사선 처리된 세포자살성 세포의 유익한 효과를 보여준다. 도 28 및 도 29에 도시된 결과에 따르면, 놀랍게도 당해 기술 분야의 당업자는, 비-매칭되는 세포에 대한 복수의 소스로 세포의 항원성 다양성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 임상적인 작용에서 현저한 감소가 예상됨을 이해할 수 있다. 예상외로, GvHD 중증도의 감소에 대한 초기 세포자살성 세포의 공지된, 유익한 효과, 따라서 사망까지의 일수의 연장 역시, 공지된 바와 같이 복수의 비-매칭 소스 세포 풀로 인해 항원성이 증가된, 비-매칭되는 초기 세포자살성 세포 풀에 의해 개선되었다 (도 28).
추가적인 목적은 방사선 처리된 초기 세포자살성 세포의 사용과 방사선 비-처리된 세포자살성 세포의 사용 간에 차이가 있는 지를 확인하는 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 비-매칭되는 방사선 처리 세포가 APC 기전에 의해, 그래서 이것이 주입된 숙주의 T-세포에 의해 인지되는 항원 프로파일을 유지함을 알 것이다. 이에, 세포들로 구성된 이종의 비-매칭 집단들을 풀링하는 경우의 문제는, 풀링되는 개별 집단들 간의 교차 반응성, 풀링된 집단들의 혼합 세포 림프 반응, 또는 세포를 감소 또는 소거할 수 있는 풀링된 집단들 간의 T-세포 면역 반응 또는 이들의 조합을 포함한다는 것이다.
방법
마우 스 모델: 비-매칭 GVHD 모델에서, 7-9주령의 BALB/c 암컷 마우스 (H-2d)를 수용자로서, 8-9주령의 C57BL/6 암컷 마우스(H-2b)를 공여자로 사용하였다. 수용자는 골수 및 비장 세포 이식하기 24시간 전에 850 cGy로 전신에 방사선 조사하였다. 공여자 골수 세포를 골수 재구성에 사용하였다. 골수 세포를 RPMI 1640을 사용해 대퇴골과 경골에서 추출하였다. 적혈구를 세포용해 후 PBS로 세척 및 재현탁하였다. 트리판 블루 염료 배제를 사용해 생존성을 평가하였다 (생존성 >90%). 공여 비장세포를 GVHD 유도에 사용하였다. 비장을 적출하여 균질화한 다음 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 적혈구를 세포용해하고, 비장세포를 PBS에 재현탁하였다. 트리판 블루 염료를 이용한 분석에서 세포 생존성 90% 이상이 측정되었다.
초기 세포자살성 세포: 세포자살성 세포를 실시예 1과 유사한 방식으로 건강한 공여자로부터 단핵구 농화된 세포 분획 성분채집술에 의해 준비하였다. 간략하게는,
단핵구 세포 (MNC)의 농화 분획을 건강한, 적격 공여자로부터 백혈구성분채집술 공정을 통해 수득하였다. Spectra OPTIA® 성분채집술 시스템을 통해, 자가 혈장 400 내지 600 ㎖와 더불어, 혈액 12 L로부터 세포를 수집하였다. 공여자 유래의 농화된 닥핵구 세포의 추정 수율은 세포 약 1.2 내지 1.5 x 1010개로 예상되었다. 백혈구성분채집술 공정에 앞서, 공여자를 검사하고, 하기 바이러스 벡터에 음성인지를 확인하였다:
1. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 1형 및 2형;
2. B형 간염 바이러스 (HBV);
3. C형 간염 바이러스 (HCV);
4. 사이토메갈로바이러스 (CMV);
5. 트레포네마 팔라듐 (Treponema pallidum) (매독);
6. 인간 T-림프친화성 바이러스 (Human T-lymphotropic virus, HTLV), I형 및 II형.
세포 수집 후, 세포를 RPMI로 세척하고 다음과 같이 냉동하였다. 냉동 제형은 주사용 플라스마라이트 A pH 7.4, 10% DMSO, 5% 인간 혈청 알부민 및 10 U/㎖ 헤파린이 첨가된 5% 항-응집제 사이트레이트 덱스트로스 용액으로 구성된다.
냉동 매질을 백 안에 넣어 제조하고, 냉동 과정을 폐쇄된 시스템에서 cGMP 조건하에 수행하였다.
백혈구성분채집술 공정을 완료한 후, 농화된 MNC 분획을 플라스마라이트 A로 세척하고, 빙랭한 동결 매질에 50 내지 65 x 106 세포/㎖ 농도로 재현탁하였다. 그 다음, 세포를 냉동 백으로 옮기고, 백을 미리 냉동한 알루미늄 카세트로 이동시킨 다음 카세트를 즉시 -18 내지 (-25)℃로 옮겨 2시간 동안 두었다.
2시간 후, 카세트를 -80℃로 옮겨 다시 2시간 둔 다음 장기 보관을 위해 액체 질소 (>-135℃)에 넣었다.
자가 혈장을 50 gr 분취액으로 나누었다. 혈장 분액을 -80℃로 이동시켜 2시간 둔 다음 장기 보관을 위해 -18 내지 (-25)℃에 두었다.
세포자살 유도 세포를 해동하고, 10 mM Hepes 완충제, 2 mM L-글루타민 및 10 U/㎖ 헤파린 첨가된 5% 항-응집제 사이트레이트 덱스트로스 용액을 함유한 미리 데운 RPMI1640으로 세척하였다. 상층액을 추출한 후, 10% 자가 혈장 및 50 ㎍/㎖ 메틸 프레드니솔론 및 10U/㎖ 헤파린이 첨가된 5% 항-응집제 사이트레이트 덱스트로스 용액을 첨가하여, 10 mM Hepes, 2 mM L-글루타민이 첨가된 RPMI 1640에 세포를 최종 농도 5 x 106/㎖로 재현탁하였다. 그런 후, 세포를 세포 배양 백으로 옮기고, 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2 조건하에 6시간 배양하여 세포자살을 안정화하였다.
배양 세포를 회수한 후, PBS로 세척하고, PBS에 재현탁하였다.
초기 세포자살성 세포 산물을, 단일 공여자 또는 10명의 서로 다른 개별 공여자 조합으로부터 제조하였으며, 이때 세포는 방사선 처리 직전에 조합하였다. 다중 공여자 산물에서 구성성분들 간에, 예를 들어 살아있는 비-세포자살성 세포들 간에 간섭이 발생할 수 있어, 초기 세포자살성 세포 산물을 나누었으며, 생체내 검사할 초기 세포자살성 세포의 샘플은 투여하기 전에 2500 cGy로 방사선 조사 (하기 샘플 F)한 다음 투여시까지 2 내지 8℃에서 보관하였다. 실시예 6의 표 3은 아넥신 V 양성/프로피듐 아이오다이드 음성 비율과 초기 세포자살성 세포 산물의 세포 표면 마커들에 대한 상세 내용을 제시하며, 이는 마우스에 투여된 세포자살성 세포의 일관성 (consistency)이 유지됨을 보여준다. 최종 산물은 2 내지 8℃에서 48시간 동안 안정적이었다.
이식 당일에, 다음과 같은 실험 설계에 따라 마우스에 골수 세포 5 x 106개, 비장 세포 3 x 106개, 및 단일- 또는 다중-공여자 초기 세포자살성 세포 산물 30 x 106개를 투여하였다:
방사선 조사 대조군
재구성 대조군 - 방사선 조사 + 골수 이식 (BM)
GVHD 대조군 - 방사선 조사 + 골수 및 비장 세포 이식
단일 공여자, 방사선 조사 - 방사선 조사 + 골수 및 비장 세포 이식 + 단일 공여자로부터 유래된 방사선 조사된 초기 세포자살성 세포 산물
단일 공여자, 방사선 비-조사 - 방사선 조사 + 골수 및 비장 세포 이식 + 단일 공여자로부터 유래된 방사선 비-조사된 초기 세포자살성 세포 산물
다중 공여자, 방사선 조사 - 방사선 조사 + 골수 및 비장 세포 이식 + 다중 공여자로부터 유래된 방사선 조사된 초기 세포자살성 세포 산물
다중 공여자, 방사선 비-조사 - 방사선 조사 + 골수 및 비장 세포 이식 + 다중 개별 공여자로부터 유래된 방사선 비-조사된 초기 세포자살성 세포 산물
모니터링 - 이식 마우스를 태깅하고 생존을 모니터링하였다. 체중을 실험 첫 2주간 2일 마다, 이후에는 매일 평가하였다. 초기 체중으로부터 35% 감소를 1차 엔드포인트로서 측정하였으며, 마우스를 희생시키고, 생존 곡선을 그에 따라 업데이트하였다. 체중 결과를 실시예 12 도 29에서 관찰된 결과와 비교하였다.
GVHD의 중증도를 5개의 임상 파라미터: 체중 감소, 자세 (구부림), 활동, 털 감촉 및 피부 완전성 (skin integrity)을 포함하는 공지된 점수 평가 시스템 (Cooke KR, et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation. I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 1996; 8:3230-3239)을 사용하여 평가하였다. 마우스를 분석하여, 각 척도에 대해 0 내지 2로 점수를 매겼다. 5가지의 임상 점수를 합하여, 임상 지표 값을 구하였다 (지표 수치는 GVHD 중증도에 따라 증가함).
결과
여러 마우스 집단들에서 생존성 (%)을 도 30에 도식적으로 나타낸다. 골수 재구성을 투여받지 않은 마우스에서 예상되는 바와 같이, 방사선 처리된 대조군 마우스만 8일 - 12일 (n=13) 사이에 사망하였다. 대부분의 GVHD 대조군 마우스 (골수 및 비장 이식)는 6일 - 27일 사이에 사망하였다. 마우스 1마리는 사망하지 않았다 (n=18). 골수 재구성 대조군 (BM)의 경우, 마우스 7마리 중 3마리가 6일 - 8일 사이에 사망하였다. 나머지 마우스에서는, 공여 골수에 의해 골수가 재구성되었으며, 마우스가 생존한 채 유지되었다 (>50일).
단일 공여자 유래의 방사선 비-처리된 마우스는 15일 - 36일 사이에 사망하였다. 따라서, 앞서 확인된 바와 같이, 단일 공여자 유래의 방사선 비-처리된 초기 세포자살성 세포는 유익한 효과를 나타내었으며, 생존이 연장되었다 (p < 0.01).
단일 공여자 유래의 방사선 처리된 마우스는 7일 - 35일 사이에 사망하였으며, 마우스 1마리가 질환 없이 생존하였다 (>50일). 이는, 단일 공여자 유래의 방사선 처리된 세포자살성 세포가 또한 GVHD에 유익한 효과를 제공한다는 것을 입증해준다. 따라서, 방사선 조사는 초기 세포자살성 세포의 면역조절 효과에 유해하지 않았다. 모두 GVHD 대조군에 비해 GVHD 뮤라인 모델에서 생존에 유익한 효과를 발휘하였다 (p < 0.01).
방사선 비-처리된 다중 공여자 유래 치료는 GVHD 대조군 (n=11)에 비해 유익한 효과를 제공하지 못하였다. 생존 패턴은 GVHD 대조군과 유사하였으며, 마우스는 6일 - 28일 사이에 사망하였다 (p=NS-유의미하지 않음). 놀랍게도, 방사선 비-처리된 세포자살성 세포와는 대조적으로, 방사선 처리된 다중 개체 공여자 유래 세포자살성 세포 (치료 F)(n=10)는 GVHD 대조군과 비교해 단일 공여자 유래 치료와 유사한 유익한 효과를 발휘하였다. GVHD 증상들이 이후에 현저하게 발생하였으며, 마우스는 18일 - 34일 사이에 사망하였다 (p < 0.01).
방사선 처리된-다중 개별 공여자 (n=10), 방사선 처리 단일 공여자 (n=10) 및 방사선 비-처리된 단일 공여자 (n=10) 유래 치료에서 비슷한 생존성 패턴이 나타났으며, 이들 3가지 치료군들 간에 생존성 효과에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
이들 실험은 GVHD 유도된 마우스에서 세포자살성 세포 주입의 명확한 효과를 보여준다. 방사선 처리된 다중 개별 공여자 및 방사선 처리된- 및 비-처리된 단일 공여자 유래 세포자살성 세포의 치료는 유의한 생존 연장 효과를 나타내었다.
다중 공여자 치료는, 마우스에 투여하기 전 방사선 처리되지 않은 경우에, 마우스의 생존을 연장시키지 못하였으며, 방사선 처리된 세포자살성 세포 산물의 경우에는 단일-공여자 치료에 가까운 생존 패턴을 나타내었다.
전술한 바와 같이, 도 30은 복수의 비-매칭 공여자로부터 수득한 방사선 비-처리된 세포자살성 세포가, (1) 단일 비-매칭 공여자로부터 수득된 방사선 비-처리된 세포자살성 세포; (2) 단일 비-매칭 공여자로부터 수득된 방사선 처리된 세포자살성 세포; 및 (3) 다중 비-매칭 공여자로부터 수득된 방사선 처리된 세포자살성 세포와 비교해, GvHD 및 사망률 (생존 %)을 낮추는데, 유의하게 낮은 긍정적인 임상 효과를 발휘함을 보여준다. 또한, 이들 3종 모두 (방사선 비-처리된 초기 세포자살성 세포, 단일 공여자 유래; 방사선 처리된 초기 세포자살성 세포, 단일 공여자 유래; 및 방사선 처리된 초기 세포자살성 세포, 다중 개별 공여자 유래) 비슷한 효과를 나타낸다.
이들 데이터는, 다중 개별 공여자로부터 수득된 방사선 비-처리된 세포자살성 세포의 항원성이 다중 개별 공여자로부터 수득된 방사선 처리된 세포자살성 세포가, 둘다 이식된 골수에 대해 비슷한 적대적인 항원 반응을 나타내고 GvHD 및 사망율을 감소시킬지 못하기 때문에, 비슷할 것으로 예상되었기에, 매우 놀라운 결과이다.
항원성이 남아있는 주요 문제라면, 단일 공여자로부터 수득된 방사선 비-처리된 세포자살성 세포와 단일 공여자로부터 수득된 방사선 처리된 세포자살성 세포 간의 임상적인 효과 차이를 예상할 수 있었다. 그러나, 데이터에서 이러한 차이가 관찰되지 않았다.
한가지 가능성은, 다중 개별 공여자로부터 제조된 방사선 비-처리된 세포자살성 세포 풀 조제물의 효능 결핍이 풀 조제물에 존재하는 개별 단핵구 집단들 간의 교차 상호작용으로 인한 것이라는 것이다. 방사선 처리된 세포는 그 항원성을 유지하지만 방사선 비-처리된 세포와는 현저하게 다른 효능을 가지므로, 이러한 상호작용이 숙주에 대한 항원성에 직접 기여하진 않는 것으로 보인다. 따라서, 방사선 처리된 초기 세포자살성 세포 풀 조제물은 교차-상호작용이 예상치 못하게도 제거되고, 숙주가 투여된 세포에 잘 반응하는 것으로 보인다.
확인된 바와 같이, 방사선 처리된 풀 공여자는 방사선 비-처리된 단일 공여자와 기본적으로 동일한 효과를 나타내었다.
실시예 16: 최종 세포자살성 세포 산물의 방사선 처리 효과
세포자살성 세포는 이의 고유한 면역조절 및 항-염증성 특성으로 인해 새로운 치료 전략에서의 사용이 점차 증가하고 있다. 초기 세포자살성 세포 조제물은 생존 세포를 (PS 노출 결핍 및 PI 유입 불가에 의해 측정; 아넥신 V 음성 및 프로피듐 아이오다이드 음성) 20-40%로 함유할 수 있으며, 이중 일부는 이식 후 세포자살성이 되지만, 일부는 생존한 채 유지된다. 매칭되는 공여자로부터 골수 이식한 경우, 수용자는 실제 이식시 더 많은 생존 세포를 이미 투여받았기 때문에, 생존 세포는 임상적인 문제를 나타내지 않는다. 그러나, 제3자 이식의 경우 (또는 단핵구 세포자살성 세포 풀 조제물에서 제시될 수 있는 제4자 이상), 생존 세포를 함유한 세포자살성 세포 집단의 사용이 제2 GvHD 유발인자를 도입할 수 있다. 또한, 초기 세포자살성 세포의 면역조절 잠재성에 대한 방사선 조사 효과는 아직까지 조사된 바 없다. 당해 기술 분야의 당업자는, 초기 세포자살성 세포 집단에 대한 부가적인 방사선 처리가 세포를 세포자살 후기 단계 또는 괴사로 진행되게 할 수 있음을 고려할 수 있다. 이는 특히 임상 적용과 관련된 문제이므로, 이하 실험에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 설계하였으며, 하나 이상의 목적은 기능성 세포자살성 세포의 생물안전성을 개선하는 것이다.
이에, 본 목적은, 세포자살성 세포의 효력이 이식된 세포의 생착이 아닌 방관자 효과에 의존할 수 있는, 다수의 적응증에서 세포자살성 세포의 임상적인 이용을 촉진하고자 하는 것이었다.
목적: 세포자살 유도 후 방사선 처리하는, 초기 세포자살성 세포의 방사선 처리 효과 조사.
방법 (간략하게): 세포를 기본적으로 실시예 5에 기술된 바와 같이 수집하고, 초기 세포자살성 세포를 그에 따라 제조하였다.
개별 초기 세포자살성 세포 배치 3종을 서로 다른 데이터로 준비하였다 (콜렌션 404-1, 0044-1 및 0043-1).
각각의 최종 산물을 3개의 군으로 분류하였다:
비-처리
2500 rad
4000 rad.
방사선 처리 후, 즉시 초기 세포자살성 세포에서 세포수, 아넥신 V 양성-PI 음성 염색, 세포 표면 마커 (여러가지 세포 타입의 집단 %) 및 효력 (수지상 세포 (DC))를 조사하였다 (t0). t0 시험 후, 초기 세포자살성 세포를 2-8℃에서 24시간 보관하고, 다음날 동일한 검사 패널을 조사하였다 (t24h) (세포수, 아넥신 V 양성-PI 음성 염색, 세포 표면 마커 및 효력).
앞서, 공여자 단핵구 초기 세포자살성 세포 (초기 세포자살성 세포)의 관용성 유도 능력을 조사하는, 방출-후 효력 분석 (post-release potency assay)을 개발하였다 (Mevorach et al, BBMT 2014 ibid). 이 분석은 LPS에 노출된 후 iDC 막에서의 MHC-클래스 II 분자 (HLA-DR) 및 공동-자극성 분자 (CD86) 발현을 유세포 측정으로 분석하는 방법을 기초로 한다. 앞서 반복적으로 기술한 바와 같이, 세포자살성 세포와의 상호작용시 관용성 DC (tolerogenic DC)를 구축할 수 있으며 (Verbovetsky et al., J Exp Med 2002, Krispin et al., Blood 2006), LPS-처리된 DC의 성숙화 저해 (DR 및 CD86 발현 저해)는 용량 의존적인 방식으로 이루어진다.
초기 세포자살성 세포 임상 실험 1/2a 상에서, 각 배치의 관용성 유도 능력을 평가하기 위해, 방출-후 효력 분석을 각각의 초기 세포자살성 세포 배치에 대해 수행하였다 (전체 결과 n=13)(결과는 도 1에 나타냄, Mevorach et al.(2014) Biology of Blood and Marrow Transplantation 20(1): 58-65).
미정의 비-관련 건강한 공여자로부터 수집한 신선한 연층으로부터 유래된 각각의 초기 세포자살성 세포 배치에서 DC를 구축하였으며, 이를 초기 세포자살성 세포와 여러가지 비율 (1:2, 1:4 및 1:8 DC:초기 세포자살성 세포, 각각)로 조합하였다. 초기 세포자살성 세포와 배양하고 LPS에 노출한 후, DC:초기 세포자살성 세포 비율 한가지 이상에서, DC 막에서의 HLA DR 또는 CD86 발현의 하향 조절에 기초하여, 효력을 확인하였다. 총 13가지의 분석에서, 초기 세포자살성 세포는 관용성 효과를 나타내었으며, 이는 DC:초기 세포자살성 세포 비율 대부분에서 확인되었고, 이들 2가지 마커는 용량 의존적인 방식으로 관찰되었다.
건강한 공여자의 말초혈 PBMC로부터 단구를 분리하고 미성숙 DC (iDC)를 구축하였으며, 이를 1% 자가 혈장, G-CSF 및 IL-4의 존재하에 배양하였다. 그런 후, iDC를 신선하게 제조된 최종 산물로서 또는 2-8℃에서 24시간 보관된 최종 산물로서의 세포자살성 세포와, 2시간 동안, 1:2, 1:4 및 1:8 비율로 함께 예비 배양하였다. 저장이 세포자살성 세포의 효력에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해, 이들 2종의 최종 산물을 동시에 조사하였다. 배양 후, LPS를 지정된 웰에 첨가하고, 다시 24시간 동안 두었다. 배양 종료 후, iDC를 수집하여 세척한 다음 DC-sign 및 HLA-DR 또는 CD86으로 염색하여, 발현 변화를 확인하였다. 유세포 측정기로 세포를 분석하였으며, 분석은 DC 단독 분석을 확보하기 위해 DC-sign 양성 세포 게이트에서 FCS-익스프레스 소프트웨어를 사용하여 분석하여 수행하였다.
도 31A 및 31B 및 도 32A 및 32B는 방사선 처리된 세포자살성 세포 풀에 대한 효력 검사 결과를 방사선 비-처리된 단일 공여자 세포와 비교하여 보여준다.
결과:
단일 공여자 조제물
표 21은 방사선 비-처리된 및 방사선 처리된 세포자살성 세포의 비교 결과들을 나타낸다; 24시간 경과시 평균 세포 감소율 (%); 0 및 24시간 경과시 아넥신 양성(+) 프로피듐 아이오다이드 (PI) 음성 (-) % (초기 세포자살성 세포에 대한 %); 0 및 24시간 경과시 아넥신 양성 (+) 프로피듐 아이오다이드 (PI) 양성 (+) % (푸기 세포자살성 세포에 대한 %); 0 및 24시간 경과시 세포 표면 항원 CD3 (T 세포), CD19 (B 세포), CD56 (NK 세포), CD14 (단구) 및 CD15high (과립구)의 존재.
표 21:
최종 산물에 대한 설명 세포자살성 세포 세포자살성 세포
2500rad		 세포자살성 세포
4000rad
An + PI - t0(%)
범위(최소-최대)		 59.2
(52.6-66.1)		 59.6
(51.6-68.7)		 58.4
(50.4-65.1)
An + PI - t24(%)
범위(최소-최대)		 62.6
(53.6-76.3)		 68.1
(52.0-81.3)		 66.7
(52.9-77.1)
An + PI + t0(%)
범위(최소-최대)		 4.9
(3.2-7.0)		 6.0
(5.2-7.4)		 6.1
(4.0-9.1)
An + PI + t24(%)
범위(최소-최대)		 7.3
(5.0-11.8)		 8.6
(6.4-11.8)		 9.0
(6.0-14.9)
CD3+ t0(%)
범위(최소-최대)		 56.9
(47.4-66.3)		 58.3
(48.8-67.7)		 57.5
(48.6-66.4)
CD3+ t24(%)
범위(최소-최대)		 56.8
(49.6-64.0)		 57.1
(48.0-66.1)		 56.6
(49.7-63.4)
CD19+ t0(%)
범위(최소-최대)		 10.6
(10.1-11.0)		 9.5
(7.7-11.3)		 9.6
(8.5-10.7)
CD19+ t24(%)
범위(최소-최대)		 11.8
(10.2-13.4)		 9.2
(6.9-11.5)		 8.8
(7.5-10.1)
CD56+ t0(%)
범위(최소-최대)		 12.2
(7.0-17.3)		 13.0
(7.6-18.4)		 14.4
(21.2-7.6)
CD56+ t24(%)
범위(최소-최대)		 12.9
(8.8-13.4)		 14.1
(10.4-17.8)		 17.1
(10.0-24.1)
CD14+ t0(%)
범위(최소-최대)		 23.1
(13.1-33.1)		 25.2
(13.8-36.5)		 24.6
(14.0-35.2)
CD14+ t24(%)
범위(최소-최대)		 21.9
(13.8-30.0)		 23.7
(13.8-33.6)		 24.4
(15.4-33.4)
CD15 high t0(%)
범위(최소-최대)		 0.0 0.0 0.01
(0.0-0.02)
CD15 high t24(%)
범위(최소-최대)		 0.0 0.0 0.01
(0.0-0.02)
표 21의 결과는, 방사선 비-처리된 세포자살성 세포 및 방사선 처리된 세포자살성 세포 둘다 초기 (2열 및 3열) 및 후기 (4열 및 5열) 세포자살성 세포의 비율이 비슷함을 보여준다. 즉, 25 또는 40 Gy 조사는 감마선을 높은 조사량으로 조사하기 전에 유도된 세포자살성 또는 괴사 과정을 가속화하지 않는다. 또한, 세포 타입들에 대해 방사선 처리된 세포 집단 대 방사선 비-처리된 대조군 집단들 간에 일관성이 존재하였다.
도 31A 내지 도 31B (HLA-DR 발현) 및 도 32A 내지 도 32B (CD86 발현)에 제시된 효력 분석의 결과는, 방사선 비-처리된 세포자살성 세포와 비교해, 신선한 (도 32A, 도 32A) 및 24시간-보관 (도 31B, 도 32B)한 방사선 처리된 세포자살성 세포의 면역조절 능력에 변동이 없다는 것을 보여준다.
도 31A-31B 및 도 32A-32B에서, 성숙화 물질 LPS에 노출된 후 HLA-DR 및 CD86 발현이 둘다 명확하게 상향 조절되었다. 이들 2종의 공동-자극성 마커들의 유의한 (p<0.01) 용량-의존적인 하향 조절이, 단일 공여자 또는 방사선 처리된 공여자 풀로부터 유래된 신선하게 준비된 세포자살성 세포의 존재시, 관찰되었다. 또한, 이들 마커의 용량-의존적인 하향 조절은 2-8℃에서 24시간 저장한 세포자살성 세포의 존재하에서도 유지되었으며, 이는 24시간 저장 후에도 최종 산물의 안정성 및 효력이 유지됨을 의미한다.
수지상 세포에 대한 효과. 세포자살성 세포의 면역조절 능력을 조사하기 위해, 방출-후 효력 분석 (post release potency assay)을 이용하였다 (Mevorach et al., (2014) BBMT, ibid). 수지상 세포에 대한 면역조절 분석에서 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 도시 안함).
혼합 림프구 반응 (MLR)에 대한 효과. 면역조절 효과를 추가적으로 검사하기 위해, 표준화된 MLR 분석을 확립하였다. 자극제 및 반응 세포, 즉, MLR을 공-배양한 결과, 강력하고 신뢰성 있는 증식이 달성되었다. 방사선 비-처리된 세포자살성 세포를 MLR에 첨가하면, 림프구 증식이 > 5배까지 유의하게 감소하였으며, 이는 세포의 증식 저해를 명확하게 보여준다. 방사선 처리된 세포자살성 세포에 의해 매개되는 MLR 존재 하의 림프구 증식 저해는 완전히 비슷하였다 (데이터 도시 안함).
다음 단계는 완전한 미스매칭 마우스 모델에서 방사선 처리된 및 방사선 비-처리된 세포자살성 세포를 생체내에서 조사하는 것이다. 도 28 및 29에 나타낸 바와 같이, 방사선 처리된 및 방사선 비-처리된 초기 세포자살성 세포 조제물은 생체내에서 비슷한 유익한 효과를 나타내었다.
단일 공여자 조제물 결론:
결론적으로, 25 Gy 또는 40 Gy 방사선 조사는 세포자살성 세포 집단에서 세포자살 또는 유도된 괴사를 유의하게 가속화하지 않는다. 유의하게도, 이들 집단은 시험관내 및 생체내에서 세포자살성 세포의 면역조절 효과를 유지하였다.
다중 공여자 조제물
다음으로, 단일 공여자에서 관찰된 현상이, 다중 제3자 공여자에 대한 제3자 조제물에도 해당되는 지를 검증하기 위해 실험을 수행하였다. 예상치 못하게도, 개별 공여자 세포자살성 세포 풀 조제물을 이용한 경우, 단일 비-매칭 공여자의 유익한 효과가 사라졌다 (도 30). 이는, 각 공여자의 유익한 효과가 각각 유지되기 때문에, GvHD가 원인이 아니었다 (실험 결과는 나타내지 않음). 한 가지 가능성은 초기 세포자살성 세포 조제물의 유익한 효과가 자체 개별 공여 세포들 간의 상호작용으로 인해 소실되었다는 것이다. 이러한 서로 다른 공여자들 간의 상호작용 가능성이 감마 방사선 조사에 의해 방지될 수 있는지를 추가적으로 조사하였다.
도 30에 나타낸 바와 같이, 단일 공여자의 유익한 효과는 감마선 조사 이후에 완전히 복구되었으며, 방사선 처리된 다중 공여자 조제물 및 단일 공여자 조제물 (방사선 처리 또는 비-처리)은 비슷한 생존 패턴을 나타내었다.
결론:
놀랍게도 방사선 조사 (및 가능하게는 T-세포 수용체 저해를 야기하는 임의의 방법)가 T-세포의 원치 않는 증식 및 활성화를 방지할 뿐만 아니라 다중 공여자 제3자 세포자살성 세포 조제물을 이용할 경우 유익한 면역 조절 효과를 허용할 수 있음을 본원에서 최초로 입증하였다.
본원에 개시된 일부 특징들이 본원에 예시 및 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 수많은 수정, 치환, 변경 및 균등물을 생각할 수 있을 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본원에 개시된 진정한 사상 내에서 이러한 모든 수정 및 변경을 망라하는 것으로 의도된다.

Claims (39)

  1. 개체에서 암 또는 종양을 치료하거나, 예방하거나, 증식을 저해하거나, 질환의 진행을 지연하거나, 종양 부하 (tumor load)를 낮추거나, 발생을 감소시키거나, 또는 이의 조합을 포함하는 방법으로서,
    초기 세포자살성 세포 집단 (early apoptotic cell population)을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 방법이, 상기 초기 세포자살성 세포 집단의 비-투여 개체와 비교해, 상기 개체에서 암 또는 종양을 치료하거나, 예방하거나, 증식을 저해하거나, 질환의 진행을 지연하거나, 종양 부하를 낮추거나, 발생을 감소시키거나 또는 이의 조합을 달성하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암 또는 종양의 크기 또는 증식율이 감소되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 개체의 생존율이 증가되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 초기 세포자살성 세포 집단이,
    a. 단핵구 농화된 세포 집단 (mononuclear enriched cell population); 또는
    b. 24시간 이상 안정적인 세포자살성 집단; 또는
    c. 세포 응집이 없는 세포자살성 집단; 또는
    d. 비-휴지기 비-세포자살성 세포 (non-quiescent non-apoptotic cell)의 감소, 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제, 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소 또는 이들의 조합을 포함하는, 단핵구 세포자살성 세포 집단; 또는
    이들의 조합
    을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 초기 세포자살성 세포 집단이 초기 세포자살성 세포의 집단 풀 (pooled population of early apoptotic cell)을 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 개체가 인간 개체인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 암 또는 종양이 고형 종양 또는 비-고형 종양을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 비-고형 암 또는 종양이 혈액암 (hematopoietic malignancy), 혈액 세포암, 백혈병, 골수이형성 증후군, 림프종, 다발성 골수종 (형질세포 골수종), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 형질세포성 백혈병을 포함하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 고형 종양이 육종 또는 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피세포육종 (lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 췌장종양, 유방암, 유방 종양, 난소암, 난소 종양, 전립선암, 전립선 종양, 편평 세포암, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭성암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모암, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 자궁경부 종양, 자궁암, 자궁 종양, 고환암, 고환 종양, 폐 암종, 소 세포성 폐암, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 신경초종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 또는 망막모세포종을 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 종양 또는 암이 종양 또는 암의 전이를 포함하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 투여가 상기 초기 세포자살성 세포 집단의 1회 주입 (single infusion)을 포함하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 투여가 상기 초기 세포자살성 세포 집단의 다회 주입 (multiple infusion)을 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 개체에 부가적인 면역요법, 화학치료제, 면역 조절제 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 부가적인 면역 요법, 화학치료제 또는 면역조절제가 상기 초기 세포자살성 세포의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되는, 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 면역요법이 CAR T 세포의 투여를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 방법이, CAR T 세포 투여 및 초기 세포자살성 세포 비-투여 개체 (subject administered CAR T-cells and not administered early apoptotic cell)와 비교해, 상기 CAR T 세포의 효능을 높이는, 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 면역 조절제가 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 기능성 단편이 리툭시맵 (rituximab)(RtX) 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 1차 요법 (first-line therapy)을 포함하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 보조 요법 (adjuvant therapy)을 포함하는, 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 미세 잔존 질환 (minimal residual disease)을 감소시키거나, 상기 종양 또는 암의 관해를 증가시키거나, 관해 기간을 늘리거나, 종양 재발율을 낮추거나, 전이를 예방하거나 또는 상기 종양 또는 암의 전이율을 낮추거나 또는 이의 조합을 달성하는, 방법.
  22. 초기 세포자살성 상태의 단핵구 세포를 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단 (population of mononuclear apoptotic cell)으로서,
    상기 단핵구 세포자살성 세포 집단이
    (a) 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 비율 감소;
    (b) 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제;
    (c) 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 억제; 또는
    이들의 조합
    을 포함하는, 집단.
  23. 제22항에 있어서,
    비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 감소된 비율이 10% 미만인, 집단.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 단핵구 세포자살성 세포 집단이 살아있는 비-세포자살성 세포를 포함하지 않는, 집단.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 단핵구 세포 집단이 림프구, 단구 (monocyte), 수지상 세포 및 자연 살상 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 집단.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 단핵구 세포자살성 세포 집단이 초기 세포자살성 세포 형성 후 방사선 처리되는, 집단.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 방사선 처리가 감마 조사 또는 UV 조사를 포함하는, 집단.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 방사선 처리된 세포 집단이, 방사선 비-조사된 세포자살성 세포 집단과 비교해, 집단별 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율 감소를 포함하는, 집단.
  29. 제22항의 집단 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  30. 비-휴지기 비-세포자살성 생존 세포의 비율 감소; 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 조합을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단의 제조 방법으로서,
    (a) 말초혈로부터 단핵구-농화된 세포 집단을 수득하는 단계;
    (b) 항-응집제를 포함하는 동결 매질에서 단핵구-농화된 세포 집단을 동결하는 단계;
    (c) 상기 단핵구-농화된 세포 집단을 해동하는 단계;
    (d) 메틸프레드니솔론 (prednisolone)을 최종 농도 약 10-100 ㎍/mL로 포함하고 항-응집제를 포함하는 세포자살 유발성 인큐베이션 매질에서 상기 단핵구-농화된 세포 집단을 인큐베이션하는 단계;
    (e) 상기 세포자살성 세포 집단을 투여 매질에 재현탁하는 단계; 및
    (f) 단핵구-농화된 집단을 불활화하는 단계를 포함하며,
    상기 불활화는 단계 (e) 이후에 수행되며,
    상기 방법이, 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율 감소; 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제; 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소; 또는 이들의 조합을 포함하는 단핵구 세포자살성 세포 집단을 제조하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 불활화 단계가 단핵구 세포자살성 세포의 제조 중에 비-휴지기 비-세포자살성 세포의 비율 감소, 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제, 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소 또는 이들의 조합을 달성하는 것을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 비-휴지기 비-세포자살성의 비율이 약 10%로 감소되는, 방법.
  33. 제31항에 있어서,
    상기 비-휴지기 비-세포자살성의 비율이 약 0%로 감소되는, 방법.
  34. 제30항에 있어서,
    상기 단핵구-농화된 세포 집단이 림프구, 단구, 수지상 세포 및 자연 살상 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제30항에 있어서,
    상기 인큐베이션이 약 2-12시간 동안 이루어지는, 방법.
  36. 제30항에 있어서,
    상기 단핵구-농화된 집단을 불활화하는 단계 (f)가 면역 반응의 억제 또는 제거, 세포의 교차-반응성 억제 또는 제거, 또는 T 세포 수용체 활성의 감소 또는 제거를 포함하고,
    상기 집단이 살아있는 비-세포자살성 세포의 비율 감소, 살아있는 비-세포자살성 세포의 세포 활성화 억제, 살아있는 비-세포자살성 세포의 증식 감소 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  37. 제30항에 있어서,
    상기 불활화하는 단계 (f)가 단계 (e)에서 제조된 상기 단핵구-농화된 세포자살성 세포 집단에 방사선을 조사하는 것을 포함하는, 방법
  38. 제37항에 있어서,
    상기 방사선 조사가 감마 조사 또는 UV 조사를 포함하는, 방법.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 방사선 조사가 약 25-50 Gy (Grey unit)를 포함하는, 방법.
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