ES2859522T3 - Control de la toxicidad para la actividad antitumoral de CAR - Google Patents

Control de la toxicidad para la actividad antitumoral de CAR Download PDF

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Abstract

Célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), en la que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización 4-1BB, para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición asociado a un nivel elevado de expresión de un antígeno tumoral, en el que el método comprende la administración de una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea en un paciente que lo necesita, en el que la terapia de primera línea comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de dichas células T modificadas genéticamente, en las que la terapia de segunda línea apropiada comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citoquinas a fin de controlar la toxicidad resultante de la administración de las células T modificadas genéticamente en el paciente, en el que la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL- 1, p.ej., IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-α, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, eotaxina, EGF, HGF, FGF-β, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
Control de la toxicidad para la actividad antitumoral de CAR
Antecedentes de la invención
Los pacientes con leucemia linfocítica aguda (LLA) recidivante y refractario a la quimioterapia presentan un mal pronóstico a pesar de la utilización de terapias agresivas tales como el trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas (Barrett et al., N. Engl. J. Med. 331:1253-8, 1994; Gokbuget et al., Blood 120:2032-41,2012) y fragmentos biespecíficos de anticuerpo de CD19 (Bargou et al., Science 321:974-7, 2008). Las células T de receptor de antígeno quimérico modificado con diana en los antígenos específicos de linaje CD19 y CD20 se ha informado de que resultan eficaces en adultos con LLC y linfomas de células B (Till et al., Blood 112:2261-71, 2008; Kochenderfer et al., Blood 116:4099-102, 2010; Brentjens et al., Blood 118:4817-28, 2011; Porter etal., N. Engl. J. Med. 365:725-33, 2011; Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011; Savoldo et al., J. Clin. Invest. 121:1822-5, 2011). Knochenderfer et al., Blood, 119:2709-2720, 2011 da a conocer un ensayo clínico que utiliza células T transducidas anti-CD19 para el tratamiento de neoplasias malignas de células B con la administración acompañante de IL-2. Brentjens et al., Molecular Therapy, 18:666-668, 2010 dan a conocer niveles elevados de suero antes de la infusión de células T CAR y post-mórtem. Yanik et al., Blood, 112:3073-3081, 2008 se refiere a la utilización de un inhibidor de TNFa utilizado en combinación con corticoesteorides para tratar el síndrome de la neumonía idiopática (SNI).
Sin embargo, los efectos de las células T CAR sobre los blastos de LLA, una leucemia más inmadura con una progresión más rápida, no se han investigado a fondo.
El inicio retardado del síndrome de lisis tumoral y la secreción de citoquinas, en combinación con la expansión in vivo vigorosa de células T de antígenos quiméricos (Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33, 2011; Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011). Sin embargo, los efectos de la secreción de citoquinas y los trastornos asociados a la expansión in vivo de células T de antígenos quiméricos in vivo no se ha investigado a fondo.
De esta manera, existe una necesidad urgente en la técnica de composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer utilizando los CAR y que consideren la toxicidad de los mismos. La presente invención satisface dicha necesidad.
Descripción resumida de la invención
La materia objeto de la invención se explica en las reivindicaciones adjuntas.
La invención proporciona una célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), en la que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización 4-1BB, para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición asociado a un nivel expresado de un antígeno tumoral, en el que el método comprende la administración de una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea en un paciente que lo necesita, en el que la terapia de primera línea comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de dichas células T modificadas genéticamente, en las que la terapia de segunda línea apropiada comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citoquinas a fin de controlar la toxicidad resultante de la administración de las células T modificadas genéticamente en el paciente, en el que las citoquinas se seleccionan del grupo que consiste en IL-1, p.ej., IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-1p, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXINA, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, tras la administración de la terapia de primera línea, se monitorizan los niveles de citoquinas en el paciente a fin de determinar el tipo apropiado de terapia de segunda línea que debe administrarse en el paciente y se administra la terapia de segunda línea apropiada en el paciente que lo requiere.
En una realización, un incremento del nivel de una citoquina identifica el tipo de terapia inhibidora de citoquinas que debe administrarse en el paciente que la requiere.
En una realización, la terapia inhibidora de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en ARN interfiriente pequeño (ARNip), un microARN, un ácido nucleico antisentido, un ribozima, un vector de expresión que codifica un mutante negativo transdominante, un anticuerpo, un péptido, una molécula pequeña, un fármaco inhibidor de citoquinas y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, se monitorizan los niveles de citoquinas mediante la detección del nivel proteico de las citoquinas en una muestra biológica del paciente.
En una realización, se monitorizan los niveles de citoquinas mediante la detección del nivel de ácidos nucleicos de las citoquinas en una muestra biológica del paciente.
La invención proporciona además un inhibidor o activador de citoquinas para la utilización en un método de reducción o evitación de un efecto adverso asociado a la administración de una célula T modificada genéticamente para expresar un CAR, en el que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización 4-1BB, en el que el método comprende monitorizar los niveles de una citoquina en un paciente, y (a) en el caso de que dichos niveles de citoquinas se encuentren elevados, la administración de una cantidad eficaz de un inhibidor de citoquinas en el paciente a fin de reducir los niveles elevados de citoquinas que resultan de la administración de las células T modificadas genéticamente, o (b) en el caso de que dichos niveles de citoquinas se encuentren suprimidos, la administración de una cantidad eficaz de un activador de citoquinas en el paciente a fin de incrementar los niveles suprimidos de citoquinas que resultan de la administración de las células T modificadas genéticamente, en el que las citoquinas se seleccionan del grupo que consiste en IL-1, p.ej., IL-ip, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, M lP-la, MIP-ip, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, eotaxina, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, un incremento del nivel de una citoquina identifica el tipo de terapia inhibidora de citoquinas que debe administrarse en el paciente.
En una realización, la terapia inhibidora de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en ARN interfiriente pequeño (ARNip), un microARN, un ácido nucleico antisentido, un ribozima, un vector de expresión que codifica un mutante negativo transdominante, un anticuerpo intracelular, un péptido, una molécula pequeña, un fármaco inhibidor de citoquinas y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, se monitorizan los niveles de citoquinas mediante la detección del nivel proteico de las citoquinas en una muestra biológica del paciente.
En una realización, se monitorizan los niveles de citoquinas mediante la detección del nivel de ácidos nucleicos de las citoquinas en una muestra biológica del paciente.
En la célula T modificada genéticamente para la utilización según la invención, el dominio de unión a antígeno con diana en un antígeno tumoral puede fusionarse con un dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo receptor de antígeno de células T, en el que dominio de unión a antígeno preferentemente presenta como diana CD19. El CAR puede comprender además un dominio de señal de CD3zeta.
La enfermedad, trastorno o condición que debe tratarse de acuerdo con las células T modificadas genéticamente de la invención puede ser un cáncer, preferentemente una neoplasia maligna hematológica o un tumor sólido.
La neoplasia maligna hematológica puede seleccionarse del grupo que consiste en leucemia aguda (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemia crónica (tal como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (indolente y formas de grado elevado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.
La terapia de segunda línea puede ser un inhibidor de IL-6, preferentemente tocilizumab.
El inhibidor o activador de citoquinas para la utilización según la invención puede ser un inhibidor de IL-6, preferentemente tocilizumab.
Breve descripción de los dibujos
La descripción detallada siguiente de la invención se entenderá mejor leída junto con los dibujos adjuntos. Para el propósito de ilustrar la invención, en los dibujos se muestran realizaciones actualmente preferentes. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se encuentra limitada a las configuraciones e instrumentos precisos de las realizaciones mostradas en los dibujos.
La figura 1 es una imagen que muestra los niveles séricos de citoquinas en cuatro pacientes diferentes. Todos los pacientes mostraban liberación de citoquinas, incluyendo IL-6.
La figura 2 es una imagen que ilustra los niveles séricos de citoquinas en un paciente representativo. El paciente se encontraba críticamente enfermo los días 5 a 7 y sólo empezó a mejorar tras la administración de tocilizumab. La figura 3 es una imagen que muestra que las intervenciones de anticuerpos no impactan en la funcionalidad celular de CAR 19 según mediciones de marcadores de actividad de las células T (perforina e IFN-y).
La figura 4, que comprende las figuras 4A a 4C, es una serie de imágenes que ilustra las respuestas clínicas. La figura 4A muestra dos niños con leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B CD19+ de múltiples recaídas refractaria a la quimioterapia que fueron tratados con células CTL019, infusionadas el día 0. Cambios en la lactato deshidrogenasa (LDH) sérica y la temperatura corporal después de la infusión de CTL019, con la temperatura máxima en cada periodo de 24 horas señalada con un círculo. Se administró metilprednisolona en CHOP-100 desde el día 5 a una dosis de 2 mg/kg/día, reduciendo gradualmente la dosis hasta cero el día 12. La mañana del día 7 se administró etanercept, 0,8 mg/kg x 1. A las 6 de la tarde del día 7, se administró tocilizumab, 8 mg/kg x 1. Se produjo una mejora transitoria con la administración de corticoesteroides el día 5 en CHP-100, con resolución completa de la fiebre tras la administración de terapia dirigida a citoquinas consistente en etanercept y tocilizumab el día 8. La figura 4B muestra las citoquinas séricas y marcadores inflamatorios medidos en puntos temporales frecuentes tras la infusión de CTL019. Se muestran los valores de las citoquinas utilizando un gráfico semilogarítmico con factor de cambio respecto a la línea base. Los valores de línea base (día 0 preinfusión) (pg/ml de suero) para cada analito eran (CHOP-100, CHOP-101): IL1-0: (0,9, 0,2); IL-6: (4,3, 1,9); TNF-a: (1,5, 0,4); IL2Ra: (418,8, 205,7); IL-2: (0,7, 0,4); IL-10 (9,9, 2,3); IL1Ra: (43,9, 27,9). Ambos pacientes desarrollaron elevaciones pronunciadas en varias citoquinas y receptores de citoquinas, incluyendo receptores solubles de interleuquina 1A y 2 (IL-1RA e IL-2R), interleuquinas 2, 6 y 10 (IL-2, IL-6 e IL-10), factor a de necrosis tumoral (TNF-a) e interferón-Y (INF-y). La figura 4C muestra los cambios en el recuento de neutrófilos absolutos circulantes (NAC), el recuento de linfocitos absolutos (RLA) y el recuento de glóbulos blancos (RGB). Cabe señalar que el incremento de RLA estaba compuesto principalmente de linfocitos T CT019 activados.
La figura 5, que comprende las figuras 5A a 5D, es una serie de imágenes que ilustra la expansión y visualización de las células CTL019 en sangre periférica, médula ósea y LCR. La figura 5A muestra el análisis de citometría de flujo de sangre periférica teñida con anticuerpos para la detección de CD3 y el CAR anti-CD19. Se ilustra el porcentaje de células CD3 que expresan CAR en CHOP-100 y CHOP-101. La figura 5B muestra la presencia de células T CTL019 en sangre periférica, médula ósea y LCR mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Se aisló el ADN genómico a partir de sangre completa, aspirados de médula ósea y LCR recogido en puntos temporales seriados antes y después de la infusión de CTL019. La figura 5C muestra la detección de citometría de flujo de células CTL019 en LCR recogido de CHOP-100 y CHO-101. La figura 5D muestra imágenes de linfocitos granulares grandes activados en frotis con tinción de Wright de la sangre periférica y citocentrifugados del LCR. La figura 6 es una imagen que muestra la expresión de CD19 en la línea base y en la recaída en CHOP-101. Se obtuvieron muestras de médula ósea de CHOP-101 antes de la infusión de CTL019 y en el tiempo de la recaída, 2 meses después. Se tiñeron células mononucleares aisladas a partir de muestras de médula, para CD45, CD34 y CD19, y se analizaron en un citómetro de flujo Accuri C6. Tras seleccionar las células vivas, de la puerta de blastos (CD45+ SSC low) se seleccionaron las células CD34+ y se generaron histogramas para la expresión de CD19. La línea de división representa el umbral para la misma selección en controles de isotipo. Los blastos pre­ terapia presentan un abanico de distribución de CD19 con una pequeña población de células de tinción muy leve, que se observa como la cola del histograma a la izquierda en 102 en el eje X. La muestra de recaída no presentaba ningún blasto positivo para CD19. El análisis de la expresión de CD19 en la población de blastos pretratamiento reveló una pequeña población de células con tinción leve o negativa para CD19. La intensidad media de fluorescencia (IMF) de dicha población pequeña de células era 187 (panel izquierdo), similar a la IMF de los blastocitos de recaída teñidos para anti-CD19 (201, panel derecho). La muestra de médula pre-terapia era hipocelular con 10% de blastos y la muestra de médula de recaída era normocelular con 68% de blastos, explicando las diferencias en sucesos disponibles para la adquisición.
La figura 7 es una imagen que muestra la inducción de remisión en médula ósea en CHOP-101 el día 23 después de la infusión de CTL019. Informe de inmunofenotipado clínico para CHOP-101 en la línea base (panel superior) y el día 23 (panel inferior). Las células se tiñeron para CD10, CD19, CD20, CD34, CD38 y CD58. Se llevó a cabo la citometría de flujo tras la lisis de los glóbulos rojos. El informe del día 23 indicó que los glóbulos blancos consistían en 42,0% de linfocitos, 6,0% de monocitos, 50,3% de formas mieloides, 0,17% de blastos mieloides y ningún progenitor linfoide viable. No se encontró evidencia inmunofenotípica convincente de leucemia/linfoma linfoblástico de precursores de células B residual mediante la citometría de flujo. Esencialmente no se identificó ninguna célula B viable.
La figura 8 es una imagen que ilustra la expansión y persistencia in vivo de las células CTL019 en la sangre. El número de leucocitos (RGB), células T CD3+ y células CTL019 en sangre se muestra para CHOP-100 y CHOP-101. El número de células se muestra en un gráfico semilogarítmico.
La figura 9, que comprende las figuras 9A y 9B, es una serie de imágenes que muestra que se habían eliminado las células positivas para CD19 en médula ósea y sangre en el mes posterior a la infusión de CTL019. La figura 9A muestra aplasia de células B persistente en CHOP-100. El panel superior muestra una población predominante de blastocitos leucémicos en médula ósea aspirada de CHOP-100 que expresan CD19 y CD20 el día 6. Dicha población se encontraba ausente el día 23 y a los 6 meses. La figura 9 muestra aplasia de células B y emergencia de células variantes de escape de CD19 en CHOP-101. El análisis de citometría de flujo de aspirados de médula ósea de CHOP-101 se teñía para anti-CD45, CD34 y CD19. En la fila inferior, se utilizó la dispersión lateral y las células positivas para CD45 dim para identificar las células leucémicas que expresan cantidades variables de CD34 y CD19 en la línea base. Sólo se detectaron blastos negativos para CD19 el día 64. Los valores numéricos en el panel superior representan la fracción de leucocitos totales representada en cada cuadrante. Los valores numéricos en el panel inferior representan el porcentaje de leucocitos totales representado en la puerta CD45dim/SS low.
La figura 10 es un gráfico que ilustra los niveles de ferritina presentes en el paciente tras recibir células T CAR.
La figura 11 es un gráfico que ilustra los niveles de mioglobina presentes en el paciente tras recibir células T CAR. La figura 12 es un gráfico que ilustra los niveles de inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1) presentes en el paciente tras recibir células T CAR.
Descripción detallada
La invención se refiere a células T modificadas genéticamente para la utilización en métodos de tratamiento del cáncer tal como se define en la presente memoria, incluyendo, aunque sin limitación, neoplasias malignas hematológicas y tumores sólidos. El cáncer incluye cáncer primario y metastásico, así como cánceres que son refractarios o resistentes a la quimioterapia convencional. Los métodos comprenden administrar en el paciente que requiere de dicho tratamiento o prevención, una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una célula T transducida para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR). Los CAR son moléculas que combinan especificidad basada en anticuerpos para un antígeno diana (p.ej., un antígeno tumoral) con un dominio intracelular activador de receptor de células T para generar una proteína quimérica que manifiesta una actividad inmune celular específica antitumoral.
Como parte del régimen de tratamiento global, la invención comprende una célula T modificada genéticamente tal como ha explicado anteriormente para la utilización en métodos de control de determinados cánceres (p.ej., la prevención o retraso de su recurrencia, o el alargamiento del tiempo de remisión) mediante la evaluación del perfil de citoquinas. En el caso de que el perfil de citoquinas indique un incremento de una citoquina particular después de la infusión de células T en comparación con pre-infusión de células T, el experto en la materia puede optar por administrar en el paciente que necesita dicho control una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citoquinas o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, clatrato o profármaco de los mismos farmacéuticamente aceptable para controlar los niveles elevados de la citoquina después de la infusión de células T.
La presente invención se basa en parte en el resultado de que la identidad de una única combinación de factores cuya modulación respecto de la línea base o de niveles preexistentes en la línea base puede ayudar a realizar un seguimiento de la activación de las células T, de la actividad de la diana y de potenciales efectos secundarios perjudiciales después de la infusión de células T CAR, a fin de ayudar a controlar el tratamiento del cáncer. Entre los factores ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, IL-1, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-1P, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXIN, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y similares.
La presente exposición se refiere a una estrategia de transferencia celular adoptiva de células T transducidas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) en combinación con control de la toxicidad, en el que se genera un perfil de citoquinas de un paciente después de la infusión de células T y se dirige una terapia contra las citoquinas elevadas a fin de tratar el cáncer. Por ejemplo, la generación de un perfil de citoquinas en tiempo real permite la intervención de las citoquinas elevadas con el inhibidor apropiado a fin de bajar los niveles hasta los niveles normales.
El CAR para la utilización como se especifica en la invención comprende un dominio extracelular que presenta un dominio de reconocimiento de antígeno con diana en un antígeno deseado, un dominio transmembranal y un dominio intracelular que comprende 4-1BB. La invención no se encuentra limitada a la utilización de un CAR específico. Por el contrario, en la presente invención puede utilizarse cualquier CAR con diana en un antígeno deseado. Las composiciones y métodos de generación de CAR han sido descritos en el documento n° WO 2012/079000.
En algunas realizaciones de la célula T modificada genéticamente para la utilización según la invención, anteriormente, las células T tal como se utilizan resultan en una reducción medible del tamaño tumoral o de la evidencia de enfermedad o progresión de la enfermedad, respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable, incremento o alargamiento de la supervivencia libre de progresión, incremento o prolongación de la supervivencia global, o reducción de la toxicidad.
Definiciones
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, en la presente memoria se describen los métodos y materiales preferentes. En la descripción y reivindicación de la presente invención, se utiliza la terminología siguiente.
También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria presenta el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y que no pretende ser limitativa.
Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para referirse a uno o a más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A título de ejemplo, "un elemento" se refiere a un elemento o a más de un elemento.
El término "aproximadamente" tal como se utiliza en la presente memoria en referencia a un valor medible, tal como una cantidad, una duración temporal y similar, pretende comprender variaciones de ±20% o ±10%, en algunos casos de ±5%, en algunos casos de±1% y en algunos casos de ±0,1% respecto al valor especificado, ya que dichas variaciones resultan apropiadas para llevar a cabo los métodos dados a conocer.
El término “activación” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al estado de una célula T en que ha sido suficientemente estimulada para inducir proliferación celular detectable. La activación puede encontrarse asociada además a la producción inducida de citoquinas y a funciones efectoras detectables. La expresión “células T activadas” se refiere, entre otras cosas, a células T que están experimentando división celular.
El término "activadores" o "agonistas" de un factor soluble tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a moléculas de agentes capaces de activar o incrementar los niveles del factor soluble. Los activadores son compuestos que incrementan, estimulan, inducen la activación, activan o regulan positivamente la actividad o expresión de un factor soluble, p.ej., agonistas. Entre los ensayos para detectar activadores se incluyen, p.ej., expresar el factor soluble in vitro, en células o membranas celulares, aplicar los compuestos agonistas putativos y después determinar los efectos funcionales sobre la actividad del factor soluble tal como se indica en otros sitios de la presente memoria.
El término “anticuerpo”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos con frecuencia son tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en una diversidad de formas, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y (F(ab)2, así como anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos humanizados (Harlow et al., en: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1999; Harlow et al., en: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989; Houston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; Bird et al., Science 242:423-426, 1988).
La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicos de un anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El término "antígeno" o "Ag" tal como se utiliza en la presente memoria se define como una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Dicha respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunitariamente competentes específicas, o ambas. El experto en la materia entenderá que cualquier macromolécula, incluyendo virtualmente todas las proteínas o péptidos, puede actuar de antígeno. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. El experto en la materia entenderá que cualquier ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos o una secuencia parcial de nucleótidos codificante de una proteína que induce una respuesta inmunitaria codifica por lo tanto un “antígeno” tal como se utiliza este término en la presente memoria. Además, el experto en la materia entenderá que un antígeno no necesariamente está codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Resulta fácilmente evidente que la presente invención incluye, aunque sin limitación, la utilización de secuencias parciales de nucleótidos de más de un gen y que dichas secuencias de nucleótidos están dispuestas en diversas combinaciones para inducir la respuesta inmunitaria deseada. Además, el experto en la materia entenderá que el antígeno no necesariamente se encuentra codificado por un “gen” en absoluto. Resulta fácilmente evidente que el antígeno puede generarse mediante síntesis o puede derivarse de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, aunque sin limitación, una muestra de tejido, una muestra tumoral, una célula o un fluido biológico.
El término “autoantígeno” se refiere, según la presente invención, a cualquier autoantígeno que resulte reconocido por el sistema inmunitario como foráneo. Los autoantígenos comprenden, aunque sin limitarse a ellos, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de superficie celular, lípidos celulares, ácidos nucleicos, glucoproteínas, incluyendo receptores de superficie celular.
La expresión "enfermedad autoinmunitaria" tal como se utiliza en la presente memoria se define como un trastorno que resulta de una respuesta autoinmunitaria. Una enfermedad autoinmune es el resultado de una respuesta inapropiada y excesiva a un autoantígeno. Entre los ejemplos de enfermedades autoinmunes se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo I), epidermolisis distrófica bullosa, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barr, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo vulgar, soriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa, entre otras.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “autólogo” pretende referirse a cualquier material derivado del mismo individuo en el que posteriormente se reintroduce.
El término “alogénico” se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie.
El término “xenogénico” se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.
El término “cáncer” tal como se utiliza en la presente memoria se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células de cáncer pueden extenderse localmente o mediante el torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Entre los ejemplos de diversos cánceres se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer cervical, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer cerebral, linfoma, leucemia, cáncer pulmonar y similares.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "terapia de combinación" se refiere a que se administra un primer agente junto con otro agente. La expresión "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. De esta manera, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento en el individuo. Dichas combinaciones se consideran parte de un régimen de tratamiento único.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "administración concurrente" se refiere a que la administración de la primera terapia y la de una segunda terapia en una terapia de combinación se solapan una con la otra.
La expresión “ ligando coestimulador”, tal como se utiliza la expresión en la presente memoria, incluye una molécula sobre una célula presentadora de antígeno (p.ej., una aAPC, célula dendrítica, célula B y similar) que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín sobre una célula T, proporcionando de esta manera una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 a una molécula de CMH cargada con péptido, media en una respuesta de células T, incluyendo, aunque sin limitación, la proliferación, activación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, aunque sin limitación, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, p D-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intracelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, un agonista o anticuerpo que se une al receptor de ligando de tipo Toll y un ligando que se une específicamente a B7-H3. Un ligando coestimulador comprende, además, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente sobre una célula T, tal como, aunque sin limitarse a ellas, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente a CD83.
Una "molécula coestimuladora" se refiere a la pareja de unión afín sobre una célula T que se une específicamente a un ligando coestimulador, mediando de esta manera en una respuesta coestimuladora de la célula T, tal como, aunque sin limitarse a ella, la proliferación. Entre las moléculas coestimuladoras se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, una molécula de CMH de clase I, BTLA y un receptor de ligando de tipo Toll.
Una "señal coestimuladora", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una señal que, en combinación con una señal primaria, tal como la ligación de TCR/CD3, conduce a la proliferación de las células T y/o la regulación positiva o negativa de moléculas clave.
Una "enfermedad" es un estado de salud de un animal en el que el animal no puede mantener la homeostasis y en el que, en el caso de que la enfermedad no mejore, la salud del animal continúa deteriorándose. En contraste, un “trastorno” en un animal es un estado de salud en el que el animal es capaz de mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable del que sería en ausencia del trastorno. Sin tratar, un trastorno no necesariamente causa una reducción adicional del estado de salud del animal.
Una “cantidad eficaz”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “endógeno” se refiere a cualquier material procedente de, o producido dentro de, un organismo, célula, tejido o sistema.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “exógeno” se refiere a cualquier material introducido en un organismo, célula, tejido o sistema que ha sido producido fuera del organismo, célula, tejido o sistema.
El término "expresión" tal como se utiliza en la presente memoria se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia particular de nucleótidos controlada por su promotor.
"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión operablemente ligadas a una secuencia de nucleótidos que debe expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción en cis para la expresión; la célula huésped puede suministrar otros elementos para la expresión o suministrarse en un sistema de expresión in vitro. Entre los vectores de expresión se incluyen los conocidos de la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (p.ej., desnudos o contenidos en liposomas) y virus (p.ej., lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.
El término "homólogo" se refiere a la similitud de las secuencias o la identidad de las secuencias entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácidos nucleicos. En el caso de que una posición en las dos secuencias comparadas esté ocupada por la misma base o la misma subunidad monomérica de aminoácido, p.ej., en el caso de que una posición en cada una de las dos moléculas de ADN se encuentre ocupada por adenina, las moléculas serán homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartido por las dos secuencias, dividido por el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, en el caso de que 6 de 10 posiciones en dos secuencias sean coincidentes u homólogas, las dos secuencias son 60% homólogas. A título de ejemplo, las secuencias de ADN ATTGCC y TATGGC comparten una homóloga de 50%. Generalmente, se realiza una comparación una vez las dos secuencias han sido alineadas para proporcionar la máxima homología.
El término "inmunoglobulina" o "Ig", tal como se utiliza en la presente memoria, se define como una clase de proteínas que funcionan como anticuerpos. Los anticuerpos expresados por las células B en ocasiones se denominadas BCR (por sus siglas en inglés, receptor de células B) o receptor de antígeno. Los cinco elementos incluidos en dicha clase de proteínas son IgA, IgG, IgM, IgD e IgE. IgA es el anticuerpo primario que se encuentra presente en secreciones corporales, tales como saliva, lágrimas, leche materna, secreciones gastrointestinales y secreciones mucosas de los tractos respiratorio y genitourinario. IgG es el anticuerpo circulante más común. IgM es la inmunoglobulina principal producida en la respuesta inmunitaria primaria en la mayoría de sujetos. Es la inmunoglobulina más eficiente en aglutinación, fijación del complemento y otras respuestas de anticuerpos, y resulta importante en la defensa contra bacterias y virus. IgD es la inmunoglobulina que no presenta ninguna función de anticuerpo conocida, aunque podría servir de receptor de antígeno. IgE es la inmunoglobulina que media en la hipersensibilidad inmediata causando la liberación de mediadores procedentes de mastocitos y basófilos tras la exposición a un alérgeno.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “respuesta inmunitaria” incluye respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o mediadas por células B. Entre las respuestas inmunitarias ejemplares se incluyen las respuestas de células T, p.ej., la producción de citoquinas y la citotoxicidad celular. Además, la expresión respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias que son realizadas indirectamente por la activación de las células T, p.ej., la producción de anticuerpos (respuestas humorales) y la activación de células sensibles a citoquinas, p.ej., macrófagos. Entre las células inmunitarias implicadas en la respuesta inmunitaria se incluyen linfocitos, tales como células B y células T (células CD4+, CD8+, Th1 y Th2), células presentadoras de antígenos (p.ej., células presentadoras de antígenos profesionales, tales como células dendríticas, macrófagos, linfocitos B, células de Langerhans y células presentadoras de antígenos no profesionales, tales como queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos), células asesinas naturales, células mieloides, tales como macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.
El término "inhibidores" o "antagonistas" de un factor soluble tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a agentes capaces de inhibir, inactivar o reducir los niveles del factor soluble. Los inhibidores son compuestos que, p.ej., se unen, bloquean parcial o totalmente la actividad, reducen, bloquean, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente la activación o expresión de un factor soluble, p.ej., antagonistas. Entre los inhibidores se incluyen inhibidores de polipéptidos, tales como anticuerpos, receptores solubles y similares, así como inhibidores de ácidos nucleicos, tales como ARNip o ARN antisentido, versiones modificadas genéticamente del factor soluble, p.ej., versiones con actividad alterada, así como antagonistas de factor soluble naturales y sintéticas, moléculas químicas pequeñas y similares. Entre los ensayos para detectar inhibidores se incluyen, p.ej., expresar el factor soluble in vitro, en células o membranas celulares, aplicar los compuestos agonistas putativos y después determinar los efectos funcionales sobre la actividad del factor soluble tal como se indica en otros sitios de la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un “material didáctico” incluye una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda utilizarse para comunicar la utilidad de las composiciones y métodos de la invención. El material didáctico del kit de la invención puede, por ejemplo, fijarse a un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición de la invención o enviarse junto con un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición. Alternativamente, el material didáctico puede enviarse por separado del recipiente con la intención de que el material didáctico y el compuesto sean utilizados cooperativamente por el receptor.
El término "aislado" se refiere a alterado o separado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido naturalmente presente en un animal vivo no se encuentra “aislado”, aunque el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de estado natural se encuentra “aislado”. Un ácido nucleico o proteína aislado puede existir en forma sustancialmente purificada, o puede existir en un medio no nativo, tal como, por ejemplo, una célula huésped.
Un "lentivirus" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus en que son capaces de infectar las células que no están en división; puede insertarse una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula huésped, por lo que es uno de los métodos más eficientes de vector de inserción génica. VIH, VIS y VIF son todos ejemplos de lentivirus. Los vectores derivados de lentivirus ofrecen los medios de conseguir niveles significativos de transferencia génica in vivo.
La expresión "nivel de un factor soluble" en una muestra biológica tal como se utiliza en la presente memoria típicamente se refiere a la cantidad de proteína, fragmento de proteína o niveles peptídicos del factor soluble que se encuentra presente en una muestra biológica. Un "nivel de un factor soluble" no necesita cuantificarse, aunque puede simplemente detectarse, p.ej. una detección visual subjetiva de un ser humano, con o sin comparación respecto a un nivel de una muestra de control o un nivel esperado de una muestra de control.
El término "modulación", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a mediar en un incremento o reducción detectable del nivel de una respuesta en un sujeto en comparación con el nivel de respuesta en el sujeto en ausencia de un tratamiento o compuesto, y/o en comparación con el nivel de una respuesta en un sujeto de otro modo idéntico, aunque no tratado. El término comprende perturbar y/o afectar a una señal o respuesta nativa, mediando de esta manera en una respuesta terapéutica beneficiosa en un sujeto, preferentemente un ser humano.
La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, p.ej., las técnicas de inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, o de infusión.
Los términos “paciente”, “sujeto”, “ individuo” y similares se utilizan intercambiablemente en la presente memoria, y se refieren a cualquier animal, o células del mismo, sea in vitro o in situ, en las que pueden aplicarse los métodos indicados en la presente memoria. En determinadas realizaciones no limitativas, el paciente, sujeto o individuo es un ser humano.
La expresión "administración simultánea", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a que una primera terapia y una segunda terapia en una terapia de combinación se administran con una separación de tiempo no superior a aproximadamente 15 minutos, tal como no superior a aproximadamente cualquiera de 10, 5 o 1 minuto. En el caso de que la primera y segunda terapias se administren simultáneamente, la primera y segunda terapias pueden encontrarse contenidas en la misma composición (p.ej., una composición que comprende tanto una primera como una segunda terapia) o en composiciones separadas (p.ej., una primera terapia en una composición y una segunda terapia se encuentra contenida en otra composición).
La expresión "administración simultánea", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a que una primera terapia y una segunda terapia en una terapia de combinación se administran con una separación de tiempo no superior a aproximadamente 15 minutos, tal como no superior a aproximadamente cualquiera de 10, 5 o 1 minuto. En el caso de que la primera y segunda terapias se administren simultáneamente, la primera y segunda terapias pueden encontrarse contenidas en la misma composición (p.ej., una composición que comprende tanto una primera como una segunda terapia) o en composiciones separadas (p.ej., una primera terapia en una composición y una segunda terapia se encuentra contenida en otra composición).
La expresión “se une específicamente” tal como se utiliza en la presente memoria con respecto a un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que reconoce un antígeno específico, aunque no reconoce o se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de una especie puede unirse además al antígeno de una o más especies. Sin embargo, dicha reactividad cruzada entre especies por sí misma no altera la clasificación de un anticuerpo como específico. En otro ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno también puede unirse a diferentes formas alélicas del antígeno. Sin embargo, dicha reactividad cruzada entre especies por sí misma no altera la clasificación de un anticuerpo como específico. En algunos casos, la expresión “unión específica” o “que se une específicamente” puede utilizarse en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido a una segunda especie química, refiriéndose a que la interacción es dependiente de la presencia de una estructura particular (p.ej., un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica y no a las proteínas en general. En el caso de que un anticuerpo sea específico para el epítopo “A”, la presencia de una molécula que contiene epítopo A (o A no marcado, libre) en una reacción que contiene “A” marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado que está unido al anticuerpo.
El término “estimulación” se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (p.ej., un complejo TCR/CD3) con su ligando afín, mediando de esta manera en un suceso de transducción de señales, tal como, aunque sin limitación, una transducción de señal mediante el complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar en la expresión alterada de determinadas moléculas, tal como la regulación negativa de TGF-p, y/o la reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.
Una “molécula estimuladora”, tal como se utiliza la expresión en la presente memoria, se refiere a una molécula en una célula T que se une específicamente a un ligando estimulador afín presente sobre una célula presentadora de antígeno.
Un “ ligando estimulador”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un ligando que, en el caso de encontrarse presente sobre una célula presentadora de antígeno (p.ej., una aAPC, una célula dendrítica, una célula B y similar) puede unirse específicamente a una pareja de unión afín (a la que se hace referencia en la presente memoria como “molécula estimuladora”) sobre una célula T, mediando de esta manera en una respuesta primaria por la célula T, incluyendo, aunque sin limitación, la activación, el inicio de una respuesta inmunitaria, la proliferación y similares. Los ligandos estimuladores son bien conocidos de la técnica y comprenden, entre otros, una molécula de CMH de clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 superagonista y un anticuerpo anti-CD2 superagonista.
El término “sujeto” pretende incluir organismos vivos en los que puede inducirse una respuesta inmunitaria (p.ej., mamíferos). Entre los ejemplos de sujetos se incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una célula “sustancialmente purificada” es una célula que se encuentra esencialmente libre de otros tipos celulares. Una célula sustancialmente purificada se refiere además a una célula que ha sido separada de otros tipos celulares con los que se encuentra asociada normalmente en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificada se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, dicha expresión se refiere simplemente a una célula que ha sido separada de otras células con las que se encuentra naturalmente asociada en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivan in vitro. En otras realizaciones, las células no se cultivan in vitro.
El término “terapéutico” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tratamiento y/o a la profilaxis. Se obtiene un efecto terapéutico mediante supresión, remisión o erradicación de un estado de enfermedad.
La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad del compuesto de la invención que inducirá la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema o sujeto que busca el investigador, veterinario, médico u otro responsable clínico. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” pretende incluir la cantidad de un compuesto que, tras su administración, resulta suficiente para evitar el desarrollo, o el alivio en cierto grado, de uno o más de los síntomas del trastorno o enfermedad bajo tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc. del mamífero que debe tratarse.
Un “trasplante”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a células, tejidos o un órgano que se introduce en un individuo. La fuente del material trasplantado pueden ser células en cultivo, células de otro individuo o células del mismo individuo (p.ej., después del cultivo de las células in vitro). Son trasplantes de órganos ejemplares, los de riñón, hígado, corazón, pulmón y páncreas.
El “tratamiento” de una enfermedad tal como se utiliza el término en la presente memoria se refiere a reducir la frecuencia o severidad de por lo menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un sujeto.
El término “transfectado” o “transformado” o “transducido” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un proceso por el que ácido nucleico exógeno se transfiere o se introduce en la célula huésped. Una célula “transfectada” o “transformada” o “transducida” es una que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula del sujeto primaria y su progenie.
Intervalos: en toda la presente exposición, los diversos aspectos de la invención pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo se proporciona meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. De acuerdo con lo anterior, la descripción de un intervalo debe considerarse que ha dado a conocer específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuos dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo, tal como de 1 a 6, debe considerarse que ha dado a conocer específicamente subintervalos tales como 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 2 a 4, 2 a 6, 3 a 6, etc., así como los números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 2,7, 3, 4,5, 5,3 y 6. Lo anterior se aplica con independencia de la amplitud del intervalo.
Descripción
La presente invención proporciona una célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), en la que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular, para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición asociado a un nivel expresado de un antígeno tumoral, en el que el método comprende la administración de una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea en un paciente que lo necesita, en el que la terapia de primera línea comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de dichas células T modificadas genéticamente, en las que, tras la administración de la terapia de primera línea, se monitorizan los niveles de citoquinas en el paciente a fin de determinar el tipo apropiado de terapia de segunda línea para la administración en el paciente, y en el que la terapia de segunda línea apropiada comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citoquinas, en el que la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-1P, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXINA, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, la terapia de segunda línea comprende la monitorización de los niveles de citoquinas en un paciente tras la recepción de una infusión de un CAR T (al que se hace referencia en otros sitios en la presente memoria como "post-infusión de células T") en el que un nivel incrementado de una citoquina identifica un tipo de terapia inhibidora de citoquinas para la administración en el paciente que requiere de una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citoquinas a fin de controlar los niveles elevados de la citoquina post-infusión de células T. De acuerdo con lo anterior, la terapia de segunda línea en una realización incluye la administración de un tipo de terapia de inhibición de citoquinas para controlar los niveles elevados de determinadas citoquinas que resultan de la terapia de primera línea que utiliza células T CAR.
En todavía otro caso de la exposición, la terapia de segunda línea relacionada con la administración de un compuesto inhibidor de citoquinas en el paciente puede combinarse con otras terapias convencionales utilizadas para tratar, prevenir o controlar enfermedades o trastornos asociados o caracterizados por angiogénesis no deseada. Entre los ejemplos de dichas terapias convencionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, cirugía, quimioterapia, terapia de radiación, terapia hormonal, terapia biológica e inmunoterapia.
El CAR para la utilización según la invención se manipula para que comprenda un dominio extracelular que presenta un dominio de unión a antígeno con diana en un antígeno tumoral fusionado con un dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo de receptor de antígeno de célula T (p.ej., CD3 zeta). Un antígeno tumoral de célula B ejemplar es CD19 debido a que este antígeno se expresa sobre las células B malignas. Sin embargo, la invención no se encuentra limitada a la utilización de CD19 como diana. Por el contrario, la invención incluye cualquier fracción de unión a antígeno tumoral. La fracción de unión a antígeno se fusiona con un dominio intracelular que comprende 4-1BB y opcionalmente una cadena zeta de complejo de receptor de antígeno de célula T. Preferentemente, la fracción de unión a antígeno se fusiona con un dominio de señalización de CD3zeta.
El CAR para la utilización según la invención comprende un dominio de señalización CD137 (4-1BB). Lo anterior se debe a que la presente invención se basa en parte en el resultado de que las respuestas de células T mediadas por CAR pueden potenciarse adicionalmente con la adición de dominios coestimuladores. La inclusión del dominio de señalización CD137 (4-1BB) incrementó significativamente la actividad mediada por CAR y la persistencia in vivo de las células T CAR en comparación con células T CAR de otro modo idénticas no manipuladas para expresar CD137 (4-1BB). Sin embargo, la invención no se encuentra limitada a la utilización de un CAR específico. Por el contrario, en la presente invención puede utilizarse cualquier CAR con diana en un antígeno tumoral. Las composiciones y métodos de generación y utilización de CAR han sido descritos en el documento n° WO 2012/079000.
Métodos
Las células T para la utilización en un régimen de tratamiento según la invención indicadas anteriormente resultan en una reducción medible del tamaño tumoral o de la evidencia de enfermedad o progresión de la enfermedad, respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable, incremento o alargamiento de la supervivencia libre de progresión, incremento o prolongación de la supervivencia global, o reducción de la toxicidad.
Parte del régimen de tratamiento global, en el que la célula T especificada anteriormente debe utilizarse según la invención, comprende una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea, en la que la terapia de primera línea comprende la administración de una célula T CAR tal como se ha especificado anteriormente en el paciente que lo necesita. La célula T CAR para la utilización en el régimen de tratamiento según la invención señalado anteriormente permite el control del cáncer y el tratamiento del mismo; dicho régimen de tratamiento incluye evaluar el perfil de factores solubles en los pacientes después de la infusión de las células T.
Una terapia de segunda línea apropiada comprende la administración de un inhibidor de citoquinas apropiado en el paciente a fin de reducir los niveles elevados de la citoquina que resultan de la terapia de primera línea. En algunos casos, la terapia de segunda línea apropiada comprende la administración de un inhibidor de citoquinas apropiado en el paciente a fin de incrementar los niveles suprimidos de la citoquina que resultan de la terapia de primera línea.
En un caso, los niveles diferentes de sobreexpresión (expresión elevada) o de infraexpresión (expresión baja) en comparación con el nivel de expresión de una célula normal o de control, de una población de pacientes dada, o con un control interno. En algunos casos, los niveles se comparan entre el paciente y un individuo normal, entre el paciente después de la infusión de células T y antes de la infusión de células T, o entre el paciente después de la infusión de células T en un primer punto temporal y en un segundo punto temporal.
En un caso, la exposición incluye evaluar los diferentes niveles de una o más citoquinas para generar un perfil de citoquinas en un paciente después de la infusión de células T a fin de determinar el tipo de terapia de citoquinas que debe aplicarse en el paciente con el fin de regular el nivel de citoquinas de vuelta a los niveles normales. Por lo tanto, la invención puede aplicarse a identificar niveles de citoquina elevados como resultado de la presencia de las células T CAR de la invención en el paciente, lo que permite el tratamiento especializado del paciente con inhibidores de citoquinas para reducir los niveles elevados de la citoquina. En otro caso, la exposición puede aplicarse a la identificación de los niveles de citoquina reducidos como resultado de la presencia de las células T CAR de la invención en el paciente, lo que permite el tratamiento especializado del paciente con activadores de citoquinas para reducir los niveles disminuidos de la citoquina.
Entre los niveles de citoquinas que se encuentran elevados como resultado de recibir una infusión de células T CAR se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, IL-1, IL-1a, IL-ip, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-IRa, IL-2R, IFN-a, IFN-y, M lP-la, MIP-1p, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, eotaxina, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y similares. Sin embargo, la invención no debería limitarse a dichas citoquinas listadas. Por el contrario, la invención incluye cualquier citoquina que se haya identificado que se encuentra elevada en el paciente como resultado de recibir una infusión de células T CAR.
Entre los niveles de citoquinas que se encuentran reducidos como resultado de recibir una infusión de células T CAR se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, IL-1, IL-1a, IL-ip, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-IRa, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-1p, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXINA, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y similares.
Detección de citoquinas y tratamiento de las mismas
La presente sección describe la detección de una citoquina y el tratamiento de las mismas como parte de la terapia de segunda línea.
En un caso, como parte de la terapia de segunda línea, el método en el que las células T CAR tal como se han especificado anteriormente deben utilizarse según la exposición incluye métodos de detección de los niveles de una citoquina en el paciente que ha recibido infusión de dichas células T CAR. En algunos casos, la presencia o el nivel de una citoquina puede utilizarse para seleccionar un tratamiento candidato. En algunos otros casos, la presencia o los niveles de la citoquina pueden utilizarse para determinar el éxito durante el curso o después del tratamiento de las terapias de primera línea, segunda línea o ambas.
Entre las muestras biológicas en las que puede detectarse la citoquina se incluye, por ejemplo, el suero. En algunos casos, entre las muestras biológicas se incluye una biopsia de tejido que puede presentar o no un componente líquido.
Los inmunoensayos pueden utilizarse para analizar cualitativa o cuantitativamente los niveles de citoquinas en una muestra biológica. Puede encontrarse una vista general de la tecnología aplicable en varios manuales fácilmente disponibles, p.ej., Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Using Antibodies: A Laboratory Manual (1999).
Además de utilizar inmunoensayos para detectar los niveles de citoquinas en una muestra biológica de un paciente, puede realizarse una evaluación de la expresión y niveles de las citoquinas basándose en el nivel de expresión génica de las citoquinas particulares. Las técnicas de hibridación de ARN para determinar la presencia y/o el nivel de expresión de ARNm son bien conocidas por el experto en la materia y pueden utilizarse para evaluar la presencia o el nivel de expresión génica de la citoquina de interés.
En algunos casos, los métodos en los que deben utilizarse las células T CAR tal como se han especificado anteriormente según la presente exposición utilizan parejas de unión selectivas de la citoquina para identificar la presencia o para determinar los niveles de la citoquina en la muestra biológica. La pareja de unión selectiva que debe utilizarse con los métodos y kits de la presente exposición puede ser, por ejemplo, un anticuerpo. En algunos casos, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales de la citoquina particular. En algunos otros casos, pueden utilizarse anticuerpos policlonales de la citoquina particular para la puesta en práctica de los métodos y en los kits de la presente exposición.
Los anticuerpos comerciales de la citoquina se encuentran disponibles y pueden utilizarse con los métodos y kits de la presente exposición. Es bien conocido por el experto en la materia que el tipo, fuente y otros aspectos de un anticuerpo para la utilización son consideraciones a realizar a la luz del ensayo en el que se utilice el anticuerpo. En algunos casos, los anticuerpos que reconocerán su diana antígeno en una transferencia western podrían no ser aplicables a un ensayo de ELISA o ELISpot, y viceversa.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que deben utilizarse para los ensayos indicados anteriormente pueden producirse utilizando técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales que son bien conocidos de la técnica (ver, p.ej., Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow y Lane, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2a ed., 1986, y Kohler y Milstein, Nature 256:495-497, 1975. Entre dichas técnicas se incluyen la preparación de anticuerpos mediante selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales mediante inmunización de conejos o ratones (ver, p.ej., Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Ward et al., Nature 341:544-546, 1989). Dichos anticuerpos pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas y diagnósticas, p.ej., en el tratamiento y/o detección de cualquiera de las enfermedades o condiciones asociadas a citoquinas específicas indicadas en la presente memoria.
Los métodos de detección que utilizan inmunoensayos resultan particularmente adecuados para la práctica en el punto de atención al paciente. Dichos métodos permiten el diagnóstico inmediato y la evaluación pronóstica del paciente. Los sistemas diagnósticos de punto de cuidado se describen en, p.ej., la patente US n° 6.267.722. También se encuentran disponibles otros formatos de inmunoensayo, de manera que puede llevarse a cabo una evaluación de la muestra biológica sin necesidad de enviar la muestra a un laboratorio para la evaluación. Típicamente, el formato de dichos ensayos es de un ensayo sólido en el que se utiliza un reactivo, p.ej., un anticuerpo, para detectar la citoquina. Se describen dispositivos de ensayo ejemplares para la utilización con inmunoensayos, tales como ensayos de la presente invención, en, por ejemplo, las patentes Us n° 7.189.522, n° 6.818.455 y n° 6.656.745.
Los métodos de detección pueden utilizar secuencias polinucleótidas que codifican para la citoquina en una muestra biológica. Tal como se ha indicado anteriormente, una "muestra biológica" se refiere a una célula o población de células o a una cantidad de tejido o líquido de un paciente. Con frecuencia, se ha extraído la muestra del paciente, aunque la expresión "muestra biológica" también puede referirse a células o tejidos analizados in vivo, es decir, sin extracción del paciente. Típicamente, una "muestra biológica" contendrá células del paciente, aunque la expresión también puede referirse a material biológico no celular.
En un caso, se utilizan ensayos basados en la amplificación para medir el nivel de una citoquina deseada. En dicho ensayo, las secuencias de ácidos nucleicos de la citoquina deseada actúan como un molde en una reacción de amplificación (p.ej., reacción en cadena de la polimerasa, o PCR). En una amplificación cuantitativa, la cantidad de producto de amplificación será proporcional a la cantidad de molde en la muestra original. La comparación con controles apropiados proporciona una medida del número de copia del gen asociado a citoquina. Los métodos de amplificación cuantitativa son bien conocidos por el experto en la materia. Se proporcionan protocolos detallados para la PCR cuantitativa en, p.ej., Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y, 1990). Los métodos de RT-PCR son bien conocidos por el experto en la materia (ver, p.ej., Ausubel et al., supra). En algunos casos, se utiliza RT-PCR cuantitativa, p.ej., un ensayo TaqMan™, permitiendo de esta manera la comparación del nivel de ARNm en la muestra con una muestra o valor de control. Las secuencias de ácidos nucleicos conocidas para una citoquina deseada resultan suficientes para permitir que el experto en la materia seleccione rutinariamente cebadores para amplificar cualquier parte del gen. Pueden diseñarse cebadores adecuados para la amplificación de secuencias específicas utilizando principios bien conocidos de la técnica (ver, p.ej., Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995).
En algunos casos, pueden utilizarse ensayos a base de hibridación para detectar la cantidad de una citoquina deseada en las células de una muestra biológica. Entre dichos ensayos se incluyen el análisis de transferencia de puntos de ARN, así como otros ensayos, p.ej., la hibridación in situ fluorescente, que se lleva a cabo en muestras que comprenden células. Otros ensayos de hibridación se encuentran fácilmente disponibles en la técnica.
En numerosos casos de la presente exposición, el nivel y/o la presencia de un polinucleótido o polipéptido de citoquina se detectará en la muestra biológica, detectando de esta manera la expresión diferencial de la citoquina para generar un perfil de citoquinas a partir de una muestra biológica derivada de un paciente en el que se han infusionado células T CAR de la exposición en comparación con la muestra biológica de control.
La cantidad de un polinucleótido o polipéptido de citoquina detectado en la muestra biológica indica la presencia de una citoquina para generar un perfil de citoquina con el propósito de clasificar el paciente para el tratamiento apropiado de citoquinas. Por ejemplo, en el caso de que el perfil de citoquinas indique un incremento de una citoquina particular post-infusión de células T en comparación con el control (p.ej., pre-infusión de células T), el experto en la materia podrá optar por administrar en el paciente que necesite dicho control, una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de la citoquina. Alternativamente, en el caso de que el perfil de citoquinas indique un incremento de una citoquina particular post-infusión de células T en comparación con el control (p.ej., pre-infusión de células T), el experto en la materia podrá optar por administrar en el paciente que necesite dicho control, una cantidad eficaz de un compuesto activador de la citoquina.
En algunos casos, la diferencia en los niveles de citoquinas entre la muestra post-infusión de células T y la muestra de control puede ser de por lo menos aproximadamente 0,5, 10, 1,5, 2, 5, 10, 100, 200, 500 o 1000 veces.
Los presentes métodos en los que debe utilizarse la célula T CAR tal como se ha especificado anteriormente según la invención también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de un curso de tratamiento. Por ejemplo, en un paciente después de la infusión de células T que contiene una cantidad elevada de la citoquina IL-6, la eficacia de un tratamiento anti-IL-6 puede evaluarse mediante monitorización durante el tiempo de IL-6. Por ejemplo, la reducción de los niveles de polinucleótido o polipéptido de IL-6 en una muestra biológica obtenida de un paciente después de un tratamiento, en comparación con el nivel en una muestra obtenida del mamífero antes del tratamiento, o antes durante el tratamiento, indica un tratamiento eficaz.
En un caso, el régimen de tratamiento puede basarse en la neutralización de la citoquina elevada. Por ejemplo, pueden seleccionarse antagonistas de la citoquina para el tratamiento. Los anticuerpos son un ejemplo de un antagonista adecuado y entre ellos se incluyen anticuerpos de ratón, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, típicamente mediante ingeniería genética, a partir de segmentos génicos de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies (ver, p.ej., Boyce et al., Annals of Oncology 14:520-535, 2003). Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes (C) humanos. De esta manera, un anticuerpo quimérico típico es una proteína híbrida que consiste en el dominio V o de unión a antígeno de un anticuerpo de ratón y las regiones C o efectoras de un anticuerpo humano.
Los anticuerpos humanizados presentan residuos de marco de región variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de complementariedad sustancialmente de un anticuerpo de ratón (denominado inmunoglobulina donante). Ver Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989, y documento n°WO 90/07861, patente US n° 5.693.762, patente US n° 5.693.761, patente US n° 5.585.089, patente US n° 5.530.101 y Winter, patente US n° 5.225.539. La región o regiones constantes, en caso de estar presentes, también son sustancial o enteramente de una inmunoglobulina humana. Pueden obtenerse anticuerpos mediante enfoques convencionales de hibridoma, expresión fágica (ver, p.ej., Dower et al., documento n° WO 91/17271 y McCafferty et al., documento n° WO 92/01047), utilización de ratones transgénicos con sistemas inmunitarios humanos (Lonberg et al., documento n° WO93/12227, 1993), entre otras fuentes. Pueden obtenerse ácidos nucleicos codificantes de cadenas de inmunoglobulina a partir de hibridomas o líneas celulares productoras de anticuerpos, o basadas en secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de inmunoglobulinas en la literatura publicada.
También pueden utilizarse otros antagonistas de una citoquina deseada con fines de tratamiento. Por ejemplo, una clase de antagonistas que pueden utilizarse para los fines de la presente invención son las formas solubles de los receptores de la citoquina. A título meramente ilustrativo, un antagonista de IL-6 es un anticuerpo anti-IL-6 que se une específicamente a IL-6. Un anticuerpo específico presenta la capacidad de inhibir o antagonizar la acción de IL-6 sistémicamente. En algunos casos, el anticuerpo se une a IL-6 y evita que interactúe con sus receptores o los active (p.ej., IL-6Ra o IL-6Rp). En algunos casos, la actividad de IL-6 puede antagonizarse mediante la utilización de un antagonista de los receptores de interleuquina-6 (IL-6R). La solicitud de patente US número 2006251653 describe métodos de tratamiento de una enfermedad relacionada con la interleuquina-6 y da a conocer varios antagonistas de la interleuquina-6 incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-6R humanizados y anticuerpos anti-IL-6R quiméricos. En algunos casos, puede utilizarse un derivado de IL-6 o IL-6R para bloquear y antagonizar la interacción de IL-6/L-6R.
La invención no se encuentra limitada a las citoquinas y sus activadores e inhibidores correspondientes indicados en la presente memoria. Por el contrario, la invención incluye la utilización de cualquier activador y/o inhibidor de citoquina que se utilice en la técnica para la modulación de la citoquina. Lo anterior se debe a que la invención se basa en el control del tratamiento del cáncer en un paciente que recibe la infusión de células T CAR de la invención, en el que las células T CAR infusionados resultan en niveles incrementados y reducidos de diversas citoquinas. El experto en la materia basándose en la exposición presentada en la presente memoria podrá entender que los niveles de expreisón diferenciales de una citoquina en una muestra post-infusión de células T en comparación con una muestra de control puede ser la diana de tratamiento para incrementar o reducir el nivel de citoquinas a niveles normales.
Aplicación terapéutica
La presente exposición comprende una célula T transducida con un vector lentivírico (VL) tal como se indica en la presente memoria. Por ejemplo, el VL codifica un CAR que combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un dominio intracelular de CD3-zeta, CD28, 4-1BB o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, en algunos casos, la célula T transducida puede incluir una respuesta de células T mediada por CAR.
La exposición proporciona un CAR para la utilización en un método de redirección de la especificidad de una célula T primaria a un antígeno tumoral. De esta manera, la presente exposición proporciona una célula T CAR para la utilización en un método para estimular una respuesta inmunitaria mediada por células T a una población o tejido de células diana en un mamífero, que comprende la etapa de administrar en el mamífero unas células T que expresan un CAR, en el que el CAR comprende una fracción de unión a antígeno que interactúa específicamente con una diana predeterminada, una parte de cadena zeta que comprende, por ejemplo, el dominio intracelular de CD3zeta humano y una región de señalización coestimuladora.
En un caso, la presente exposición incluye una célula T CAR para la utilización en un tipo de terapia celular en la que las células T se modifican genéticamente para expresar un CAR y las células T CAR se infusionan en un receptor que las necesita. Las células infusionadas son capaces de eliminar las células tumorales en el receptor. Al contrario que las terapias de anticuerpos, las células T CAR son capaces de replicarse in vivo, resultando en persistencia a largo plazo que puede conducir a un control sostenido del tumor.
En un caso, las células T CAR para la utilización tal como se ha indicado en la presente memoria, pueden experimentar una robusta expansión in vivo de las células T y pueden persistir durante un periodo de tiempo prolongado. En otro caso, las células T CAR para la utilización tal como se indica en la presente memoria evolucionan convirtiéndose en células T de memoria específicas que pueden reactivarse para inhibir cualquier formación o crecimiento tumoral adicional. Por ejemplo, resultó inesperado que las células CART19 para la utilización según la invención pueden experimentar una robusta expansión in vivo de las células T y persistir a niveles elevados durante un periodo de tiempo prolongado en sangre y médula ósea y formar células T de memoria específicas. Sin deseo de restringirse a ninguna teoría en particular, las células T CAR podrían diferenciarse in vivo en un estado de tipo memoria central tras el encuentro y posterior eliminación de las células diana que expresan el antígeno sustitutivo.
Sin deseo de restringirse a ninguna teoría en particular, la respuesta inmunitaria antitumoral inducida por las células T modificadas con CAR puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva. Además, la respuesta inmunitaria mediada por CAR puede ser parte de un enfoque de inmunoterapia adoptiva en el que las células T modificadas con CAR inducen una respuesta inmunitaria específica de la fracción de unión a antígeno en el CAR. Por ejemplo, una célula CART19 induce una respuesta inmunitaria específica contra células que expresan CD19.
Aunque los datos dados a conocer en la presente memoria dan a conocer específicamente un vector lentivírico que comprende scFv anti-CD19 derivado del anticuerpo monoclonal murino FMC63, el dominio bisagra CD8a y transmembranal humano y los dominios de señalización 4-1BB y CD3zeta humanos, la invención debe interpretarse que incluye cualquier número de variaciones de cada uno de los componentes del constructo tal como se indica en otros sitios de la presente memoria. Es decir, la invención incluye la utilización de cualquier fracción de unión a antígeno en el CAR para generar una respuesta de células T mediada por CAR específica de la fracción de unión a antígeno. Por ejemplo, la fracción de unión a antígeno en el CAR para la utilización según la invención puede presentar como diana un antígeno tumoral para los fines del tratamiento del cáncer.
Entre los cánceres que pueden tratarse se incluyen tumores que no están vascularizados, o no están todavía sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Entre los tipos de cánceres para el tratamiento con los CAR de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carcinoma, blastoma y sarcoma, y determinadas neoplasias malignas de leucemia o linfoides, tumores benignos y malignos, y neoplasias malignas, p.ej., sarcomas, carcinomas y melanomas. También se encuentran incluidos los tumores/cánceres adultos y los tumores/cánceres pediátricos.
Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o médula ósea. Entre los ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) se incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemia crónica (tal como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (indolente y formas de grado elevado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.
Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que habitualmente no contienen quistes o zonas de líquido. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Diferentes tipos de tumor sólido se denominan para el tipo de células que los forman (tales como sarcomas, carcinomas y linfomas). Entre los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, se incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia maligna linfoide, cáncer pancreático, cáncer de mama, cánceres pulmonares, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de tiroide medular, carcinoma de tiroides papilar, feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (tales como glioma (tal como el glioma de tallo cerebral y los gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme), astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, schwanoma, craniofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales.
En un caso, la parte de fracción de unión a antígeno del CAR para la utilización según la invención está diseñada para la utilización en un método de tratamiento de un cáncer particular. Por ejemplo, el CAR diseñado para la utilización en un método de utilización como diana de CD19 puede utilizarse en un método de tratamiento de cánceres y trastornos, incluyendo, aunque sin limitación, LLA pre-B (indicación pediátrica), LLA adulto, linfoma de células del manto, linfoma de células B grandes difusas, trasplante de médula ósea post-alogénica de salvamento, y similares.
En otro caso, el CAR puede diseñarse para presentar como diana CD22 en el tratamiento del linfoma de células B grandes difusas.
En un caso, entre los cánceres y trastornos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, LLA pre-B (indicación pediátrica), LLA adulta, linfoma de células del manto, linfoma de células B grandes difusas, trasplante de médula ósea postalogénica de salvamento y similares, que pueden tratarse mediante la utilización de una combinación de CAR con diana en CD19, CD20, CD22 y ROR1.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana la mesotelina en un método de tratamiento de mesotelioma, cáncer pancreático, cáncer ovárico y similar.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana CD33/IL3Ra para la utilización en un método de tratamiento de leucemia mielógena aguda y similar.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana c-Met para la utilización en un método de tratamiento de cáncer de mama triple negativo, cáncer pulmonar de células no pequeñas y similares.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana PSMA en un método de tratamiento de cáncer de próstata y similar.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana el glicolípido F77 para la utilización en un método de tratamiento de cáncer de próstata y similar.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana EGFRvIII para la utilización en un método de tratamiento del glioblastoma y similar.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana GD-2 para la utilización en un método de tratamiento del neuroblastoma, el melanoma y similar.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana NY-ESO-1 TCR para la utilización en un método de tratamiento del mieloma, sarcoma, melanoma y similar.
En un caso, el CAR para la utilización según la exposición puede diseñarse para presentar como diana MAGE A3 TCR para la utilización en un método de tratamiento del mieloma, sarcoma, melanoma y similar.
Sin embargo, la invención no debe interpretarse como limitada a únicamente las dianas antígenos y las enfermedades dadas a conocer en la presente memoria. Por el contrario, la invención debe interpretarse que incluye cualquier diana antigénica que esté asociada a una enfermedad, trastorno o condición asociada a una expresión elevada de un antígeno tumoral, en el que puede utilizarse un CAR para la utilización en un método de tratamiento de la enfermedad. Las células T modificadas con CAR para la utilización según la invención también pueden servir como un tipo de vacuna para la inmunización ex vivo y/o la terapia in vivo en un mamífero. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.
Con respecto a la inmunización ex vivo, se produce por lo menos uno de los siguientes in vitro antes de la administración de la célula en un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico codificante de un CAR en las células y/o iii) crioconservación de las células.
Los procedimientos ex vivo son bien conocidos de la técnica y se comentan más completamente después. Brevemente, se aíslan células de un mamífero (preferentemente un ser humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducir o se transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAR dado a conocer en la presente memoria. Las células modificadas con CAR pueden administrarse en el receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un ser humano y la célula modificada con CAR puede ser autóloga con respecto al receptor. Alternativamente, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.
El procedimiento para la expansión ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas se describe en la patente US n° 5.199.942, y puede aplicarse en las células para la utilización según la presente invención. Se conocen de la técnica otros métodos adecuados, por lo tanto la presente invención no se encuentra limitada a ningún método particular de expansión ex vivo de las células. Brevemente, el cultivo y expansión ex vivo de las células T comprende: (1) recoger células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ de un mamífero a partir de la recolección de sangre periférica o explantes de médula ósea, y (2) expandir dichas células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular indicados en la patente US n° 5.199.942, pueden utilizarse otros factores, tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, para el cultivo y expansión de las células.
Además de utilizar una vacuna a base de células en términos de inmunización ex vivo, la presente exposición proporciona además composiciones, células T modificadas con CAR y un inhibidor o activador de citoquinas para la utilización en métodos de inmunización in vivo a fin de inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno en un paciente.
Generalmente, las células activadas y expandidas tal como se indica en la presente memoria pueden utilizarse en el tratamiento y prevención de enfermedades que aparecen en individuos que se encuentran inmunocomprometidos. En particular, las células T modificadas con CAR inventivas son para la utilización en un método de tratamiento de LLC. En determinadas realizaciones, las células de la invención están destinadas a la utilización en un método de tratamiento de pacientes en riesgo de desarrollar LLC. De esta manera, la presente exposición proporciona células T CAR para la utilización en métodos para el tratamiento o la prevención de la LLC, que comprende administrar en el sujeto que lo necesita, una cantidad terapéuticamente eficaz de las células T modificadas con CAR de la exposición.
Las células T modificadas con CAR para la utilización según la presente invención pueden administrarse solas o en forma de una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes, tales como IL-2 u otras citoquinas o poblaciones celulares. Brevemente, las composiciones farmacéuticas pueden comprender una población celular diana tal como se indica en la presente memoria, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones, tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos, tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, y manitol; proteínas, polipéptidos o aminoácidos, tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (p.ej., hidróxido de aluminio), y conservantes. Las composiciones de la presente invención preferentemente se formulan para la administración intravenosa.
Dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse de una manera apropiada a la enfermedad que debe tratarse (o prevenirse). La cantidad y frecuencia de administración vendrá determinada por factores tales como la condición del paciente, y el tipo y severidad de la enfermedad del paciente, aunque pueden determinarse dosis apropiadas mediante ensayos clínicos.
En el caso de que esté indicada una "cantidad inmunitariamente eficaz", "una cantidad eficazmente antitumoral", "una cantidad eficazmente inhibidora tumoral" o una "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones que deben administrarse podrá ser determinada por el médico en consideración a las diferencias individuales de edad, peso, tamaño tumoral, grado de infección o metástasis, y la condición del paciente (sujeto). Puede indicarse generalmente que una composición farmacéutica que comprende las células T indicadas en la presente memoria puede administrarse a una dosis de entre 104y 109 células/kg de peso corporal, preferentemente de entre 105y 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de dichos intervalos. Las composiciones de células T también pueden administrarse múltiples veces a dichas dosis. Las células pueden administrarse mediante la utilización de técnicas de infusión que son conocidas comúnmente en la inmunoterapia (ver, p.ej., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). La dosis y régimen de tratamiento óptimos para el paciente particular pueden ser fácilmente determinados por el experto en medicina mediante la monitorización del paciente para signos de enfermedad y el ajuste del tratamiento de acuerdo con ellos.
Puede desearse la administración de células T activadas en el sujeto, seguido de la nueva extracción de sangre (o la realización de una aféresis), la activación de células T de la misma y la reinfusión en el paciente con dichas células T activadas y expandidas. Dicho procedimiento puede llevarse a cabo múltiples veces cada pocas semanas. Las células T pueden activarse a partir de extracciones de sangre de entre 10 cm3 y 400 cm3. Las células T se activan a partir de extracciones de 20 cm3, 30 cm3, 40 cm3, 50 cm3, 60 cm3, 70 cm3, 80 cm3, 90 cm3 o 100 cm3 de sangre. Sin respaldo teórico, la utilización de dicho protocolo de múltiples extracciones de sangre/múltiples reinfusiones puede servir para seleccionar determinadas poblaciones de células T.
La administración de las composiciones de la invención puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante la inhalación de aerosol, la inyección, la ingestión, la transfusión, la implantación o el trasplante. Las composiciones indicadas en la presente memoria pueden administrarse en el paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, inyección intravenosa (i.v.) o porvía intraperitoneal. En una realización, las composiciones de células T se administran en el paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En otra realización, las composiciones de células T se administran preferentemente mediante inyección i.v. Las composiciones de células T pueden inyectarse directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.
En determinados casos de la presente exposición, las células para la utilización según la invención, en la que las células se activan y expanden utilizando métodos indicados en la presente memoria, u otros métodos conocidos de la técnica en los que las células T se expanden hasta niveles terapéuticos, se administran en el paciente junto con (p.ej., antes, simultáneamente o después) cualesquiera modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, aunque sin limitación, el tratamiento con agentes tales como la terapia antivírica, el ciclofovir y la interleuquina-2, la citarabina (también conocida como ARA-C) o el tratamiento de natalizumab para pacientes de Em o el tratamiento de efalizumab para los pacientes de soriasis u otros tratamientos para los pacientes de LMP. En casos adicionales, las células T para la utilización según la invención pueden utilizarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y anticuerpos FK506, u otros agentes inmunoablativos, tales como CAM, PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas y radiación. Dichos fármacos inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente del calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la p7026 quinasa, que resulta importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En un caso adicional, las composiciones celulares se administran en el paciente junto con (p.ej., antes, simultáneamente o después) del trasplante de médula ósea, la terapia ablativa de células T utilizando agentes quimioterapéuticos, tales como fludarabina, terapia de radiación de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos, tales como OKT3 o CAMPATH. En otro caso, las composiciones celulares también pueden administrarse tras la terapia ablativa de células B, tales como agentes que reaccionan con CD20, p.ej., el Rituxan. Por ejemplo, en un caso, los sujetos pueden someterse a tratamiento estándar con quimioterapia de dosis elevada seguido del trasplante de células madre de sangre periférica. En determinados casos, tras el trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En un caso adicional, las células expandidas se administran antes o después de una cirugía.
La dosis de los tratamientos anteriormente indicados que debe administrarse en el paciente variará con la naturaleza precisa de la condición bajo tratamiento y el receptor del tratamiento. El escalado de las dosis para la administración humana puede llevarse a cabo según prácticas aceptadas en la técnica. La dosis de CAMPATH, por ejemplo, generalmente se encontrará comprendida en el Intervalo de entre 1 y aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, habitualmente administrados diariamente durante un periodo de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferente es de entre 1 y 10 mg al día, aunque en algunos casos pueden utilizarse dosis más grandes, de hasta 40 mg al día (descritos en la patente US n° 6.120.766).
Tratamiento del síndrome de liberación de citoquinas (SLC)
La invención se basa en parte en el resultado de que la proliferación in vivo de células CART19 y la potente actividad antitumoral asociada con la misma también está asociada a SLC, que conduce a linfohistiocitosis hemofagocítica (LHH), también denominado síndrome de activación de los macrófagos (SAM). Sin deseo de restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que el SAM/LHH es un biomarcador único que está asociado y resulta necesario para una potente actividad antitumoral de CART19.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la invención proporciona una célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), en la que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende 4-1BB, para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición asociado a un nivel expresado de un antígeno tumoral, en el que el método comprende la administración de una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea en un paciente que lo necesita, en el que la terapia de primera línea comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de dichas células T modificadas genéticamente, en las que, tras la administración de la terapia de primera línea, se monitorizan los niveles de citoquinas en el paciente a fin de determinar el tipo apropiado de terapia de segunda línea para la administración en el paciente, y en el que la terapia de segunda línea apropiada comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citoquinas, en el que la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-1p, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXINA, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos. La terapia de primera línea es una en la que las células T CAR tal como se han especificado anteriormente debe utilizarse según la invención y la terapia de segunda línea comprende la administración de un compuesto inhibidor de citoquinas para controlar los niveles elevados de citoquinas que resultan de la terapia de primera línea, de utilización de células T CAR.
En un caso, la terapia de segunda línea comprende composiciones y métodos para el tratamiento del SLC. Entre los síntomas de SLC se incluyen fiebres altas, náusea, hipotensión transitoria, hipoxia y similares. La presente invención se basa en la observación de que las células CART19 indujeron niveles elevados de factores solubles en el paciente, incluyendo, aunque sin limitación, IFN-y, TNFa, IL-2 e IL-6. Por lo tanto, la terapia de segunda línea comprende compuestos y métodos para neutralizar los efectos contra los niveles elevados de citoquinas que resultan de la administración de las células CART19. En un caso, los agentes neutralizantes son capaces de contrarrestar el estallido concertado no deseado de expresión/actividad de citoquinas y, de esta manera, resultan útiles en la prevención, mejora y tratamiento de SLC asociado a la terapia de CART19.
En un caso, el tratamiento del SLC se lleva a cabo en torno al día 10 a 12 post-infusión de células CART19.
En un caso, la terapia de segunda línea comprende la administración de un esteroide en el paciente. En otra realización, la terapia de segunda línea comprende la administración de uno o más de un esteroide y un inhibidor de IL-6. Un ejemplo de un inhibidor de IL-6 es el tocilizumab (toc).
Ejemplos experimentales
La invención se describe en mayor detalle en referencia a los ejemplos experimentales siguientes. Los presentes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos únicamnete y no pretenden ser limitativos, a menos que se especifique lo contrario. De esta manera, la invención no debe interpretarse en modo alguno como limitada a los ejemplos siguientes, sino, por el contrario, debe interpretarse que comprende todas y cada una de las variaciones que resultarán evidentes como consecuencia de la enseñanza proporcionada en la presente memoria.
Sin descripción adicional, se cree que un experto ordinario en la materia puede, utilizando la descripción anterior y los ejemplos ilustrativos a continuación, producir y utilizar los compuestos de la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Los ejemplos de trabajo siguientes, por lo tanto, señalan específicamente realizaciones preferentes de la presente invención, y no deben interpretarse como limitativas en modo alguno del resto de la exposición.
Ejemplo 1: terapia de citoquinas en combinación con la infusión de células T CAR
Los resultados presentados en la presente memoria demuestran que los pacientes, tras la infusión de células T CAR, muestran niveles de expresión diferentes de diversas citoquinas. En algunos casos, los niveles elevados de algunas citoquinas son el resultado de la toxicidad de las células T CAR infusionadas (figura 1). Se ha observado que el tocilizumab (anti-IL6) puede mejorar la toxicidad de los CAR y aparentemente preservar efectos antitumorales en 2 de 2 pacientes (figura 2). Sin deseo de restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que Anakinra y otros reactivos que bloquean IL-1 también podrían resultar útiles a este respecto. Los datos presentados en la presente memoria también demuestran que IL-1 se encuentra elevado en los pacientes y ello podría conducir a un posterior incremento de IL-6. Anakinra es una proteína recombinante IL-1Ra que se une a los receptores de IL-1 y bloquea la señalización de tanto IL-1alfa como beta. Anakinra presenta una semivida corta. Existe la ventaja en la utilización de Anakinra para iniciar el tratamiento de los pacientes de que resultarían bloqueados tanto IL-1alfa como beta, y también se aliviaría la tormenta de citoquinas y se mantendría el efecto antitumoral.
Se ha observado además que las intervenciones de anticuerpos no proporcionan funcionalidad celular de CART19, según medición de la perforina y la IFN-y (figura 3).
Ejemplo 2: las células T de receptor de antígeno quimérico redirigidas a CD19 (CART 19) inducen un síndrome de liberación de citoquinas (SLC) y la inducción de síndrome de activación de macrófagos (SAM) tratable que pueden controlarse con el antagonista de IL-6 tocilizumab (toc)
La infusión de células CART19 resulta en 100 a 100.000x la proliferación in vivo, síndrome de lisis tumoral, seguido de actividad antitumoral duradera y persistencia prolongada en pacientes con tumores de células B. Los resultados presentados en la presente memoria muestran que la proliferación in vivo de células CART19 y la potente actividad antitumoral de las mismas están asociados a SLC que conduce a linfohistocitosis hemofagocítica (LHH), también denominada SAM. Sin deseo de restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que el SAM/LHH es un biomarcador único que está asociado y resulta necesario para una potente actividad antitumoral.
Las células T autólogas se transdujeron lentivíricamente con un CAR compuesto de scFv anti-CD19/4-1BB/CD3-zeta, activadas/expandidas ex vivo con perlas anti-CD3/anti-CD28 y después se infusionaron en pacientes de LLA o LLC con enfermedad persistente tras 2 a 8 tratamientos anteriores. Se modeló además la actividad anti-LLA de CART19 en un modelo de xenoinjerto en el ratón con un nivel elevado de injertación de LLA humana/células T humanas y detección simultánea de células T CAR y LLA utilizando imágenes bioluminiscentes de 2 colores.
Los resultados presentados en la presente memoria proporcionan resultados actualizados de 10 pacientes que recibieron células CART19, incluyendo 9 pacientes con LLC y 1 paciente pediátrico con LLA refractario recidivante. De los pacientes evaluables, 6/9 presentaron una recuperación completa (RC) o una recuperación parcial (RP), incluyendo 4 RC sostenidas. Aunque no se produjo ningún caso de toxicidad infusional aguda, todos los pacientes respondedores también desarrollaron SLC. Todos presentaron fiebre alta, así como hipotensión/hipoxia de grado 3 o 4. El SLC precedió el pico de expresión sanguínea de células CART19 y después se incrementó en intensidad hasta el pico de células CART19 (D10-31 tras la infusión). El paciente de LLA experimentó la toxicidad más significativa, con hipotensión de grado 4 e insuficiencia respiratoria. La terapia de esteroides en D6 no resultó en ninguna mejoría. En D9, al observar niveles elevados de TNFa e IL-6 (incrementos de pico sobre la línea base: IFNy: 6040x; IL-6: 988x; IL-2R: 56x, IL-2: 163x y TNFa: 17x), se administraron antagonistas de TNFa e IL-6 (entanercept y toc). Lo anterior resultó en la resolución de la fiebre y la hipotensión dentro de las 12 h siguientes y un rápido destete ventilatorio a aire ambiente. Dichas intervenciones no presentaron ningún impacto aparente sobre la expansión o eficacia de las células CART19: el pico de células T CAR (2539 células CAR+/|jl, 77% de células CD3 en flujo) se produjo en D11 y la médula ósea en D23 mostró una RC con enfermedad residual mínima (ERM) negativa en comparación con su médula inicial en el estudio, que había mostrado 65% de blastos. Aunque no presentaba ninguna historia de LLA del SNC, el líquido espinal mostraba células CART19 detectables (21 linfocitos/mcl, 78% de CAR+). A los 4 meses de la infusión, dicho paciente se mantuvo en RC con 17 células CART19/|jl en la sangre y 31% de células CD3 CAR+ en la médula.
La evaluación clínica de pacientes respondedores posteriores mostró que todos manifestaban SAM/LHH, incluyendo elevaciones drásticas de la ferritina y evidencia histológica de LHH. Los niveles pico de ferritina eran de entre 44.000 y 605.000, precedidos y seguidos de una proliferación pico de las células T. Entre otros resultados consistentes se incluyen hepatoesplenomegalia de aparición rápida no relacionada con la enfermedad y DIC moderada.
Posteriormente, también se trataron 3 pacientes de LLC con toc, también con una rápida e inesperada resolución de la fiebre alta, hipotensión e hipoxia. Un paciente recibió toc en D10 y consiguió una RC acompañada de expansión de CART19. Otro paciente presentó una resolución rápida del SLC tras la administración de toc el día 9 y el seguimiento de la respuesta es excesivamente corto. Un tercer paciente de LLC recibió toc en D2 para fiebre temprana y no presentó proliferación de CART-19 ni respuesta.
Para modelar los tiempos del bloqueo de las citoquinas, se establecieron xenoinjertos utilizando LLA pediátrica primaria bioluminiscente y después se trataron con células adicionales preparadas en la clínica. Las células CART19 proliferaron y resultaron en una supervivencia prolongada. El bloqueo de las citoquinas antes de la infusión de células T con toc y/o etanercept anuló el control de la enfermedad, con menor proliferación in vivo de las células CART19 infusionadas, confirmando el resultado observado en el paciente individuo que había recibido tempranamente toc (D3).
Las células T CART19 pueden producir una expansión in vivo masiva, persistencia a largo plazo y eficacia antitumoral, aunque también inducen un SLC significativo con características sugerentes de SAM/LHH que responde rápidamente al bloqueo de las citoquinas. Administradas antes del inicio de una proliferación significativa de CART19, el bloqueo de TNFa y/o IL-6 podría interferir con la proliferación y función efectora, aunque en el caso de que se proporcionen en un punto en el que se esté produciendo la proliferación celular, toc podría aliviar los síntomas que se han observado correlacionados con robustas respuestas clínicas.
Ejemplo 3: remisión de LLA con células T expresantes de receptor de antígeno quimérico:
Los resultados presentados en la presente memoria demuestran que las células T CAR presentan actividad clínica en la leucemia linfocítica aguda (LLA). Brevemente, dos pacientes pediátricos con LLA de células pre-B refractario recidivante fueron tratados con 106 a 107 células T/kg transducidas con anticuerpo anti-CD19 y una molécula de señalización de células T (células T CAR CTL019, también denominadas CART19). Las células T CTL019 se expandieron más de 1000 veces en ambos pacientes y se trasladaron a la médula ósea. Además, las células T CAR eran capaces de cruzar la barrera hematoencefálica y persistieron a niveles elevados durante por lo menos 6 meses, según medición en el líquido cefalorraquídeo. Se registraron ocho sucesos adversos severos. Ambos pacientes desarrollaron un síndrome de liberación de citoquinas (SLC) y aplasia de células B. En un niño, el SLC era severo y el bloqueo de las citoquinas con etanercept y tocilizumab resultó eficaz en la reversión del síndrome y sin embargo no bloqueó la expansión de las células T c A r ni la eficacia antileucémica. Se observó la remisión completa en ambos pacientes y se mantiene en n paciente 9 meses después del tratamiento. El otro paciente presentó una recaída con blastocitos que ya no expresan CD19 aproximadamente 2 meses después del tratamiento.
Los resultados presentados en la presente memoria demuestran que las células T modificadas con CAR son capaces de eliminar in vivo células de leucemia aguda refractarias al tratamiento incluso agresivo. La aparición de células tumorales que ya no expresan la diana indica la necesidad de utilizar como diana otras moléculas además de CD19 en algunos pacientes con LLA.
Se ha informado de la expansión in vivo y robustos efectos antileucémicos de las células CTL019 (CART19) en 3 pacientes con LLC (Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33, 2011; Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011). CTL019 es un CAR que incluye un dominio de señalización de CD137 (4-1BB) y se expresó utilizando tecnología de vectores lentivíricos (Milone et al., Mol. Ther. 17:1453-64, 2009). Los resultados presentados en la presente memoria muestran la utilización de CTL019 en 2 pacientes pediátricos con LLA refractaria y recidivante. Ambos pacientes mostraron remisión de la leucemia, acompañada de una expansión robusta de CTL019 in vivo con tráfico a la médula y al SNC. Los efectos antileucémicos eran potentes, ya que un paciente mostró enfermedad refractaria a la quimioterapia, impidiendo el trasplante alogénico de células madre de un donante, mientras que el otro paciente mostró recaída tras el trasplante alogénico de sangre del cordón y era resistente a la terapia con blinatumomab (biespecífico anti-CD3 y anti-CD19).
A continuación, se describen los materiales y métodos utilizados en dichos experimentos.
Materiales y métodos:
CART 19
Se ha informado anteriormente de la producción de CTL019 (CART19) (Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33, 2011; Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011). Se detectó y cuantificó CTL019 en especímenes del paciente tal como se ha informado anteriormente (Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33, 2011; Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011).
Extracciones y procesamiento de muestras
Se recogieron muestras (sangre periférica y médula ósea) en tubos Vacutainer de tapón lavanda (K2EDTA) o tapón rojo (sin aditivo) (Becton Dickinson). Se enviaron tubos con tapón lavanda al laboratorio dentro de las 2 horas posteriores a la extracción o se transportaron durante la noche a temperatura ambiente en recipientes aislados esencialmente tal como se ha descrito (Olson et al., J. Transí. Med. 9:26, 2011) previamente al procesamiento. Las muestras se procesaron dentro de 30 minutos posteriores a la recepción según procedimientos operativos estándar (POE) de laboratorio establecidos. Se purificaron, procesaron y almacenaron en nitrógeno líquido sangre periférica y células mononucleares de médula y se almacenaron en nitrógeno líquido tal como se ha descrito (Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011). Se procesaron los tubos de tapón rojo dentro de las 2 horas siguientes a la extracción, incluyendo el tiempo de coagulación; se aisló el suero mediante centrifugación, se dividió en alícuotas en alícuotas monouso de 100 pl y se almacenaron a -80°C. Se envió el líquido cefalorraquídeo (LCR) al laboratorio dentro de los 30 minutos posteriores a la aspiración y las células en el LCR se recogieron mediante centrifugación del líquido LCR y se procesaron para el ADN y citometría de flujo.
Análisis de Q-PCR
Se recogieron muestras de sangre completa o de médula en tubos Vacutainer de tapón lavanda (K2EDTA) (Becton Dickinson). Se aisló el ADN genómico directamente a partir de la sangre completa y se llevó a cabo el análisis de Q-PCR de las muestras de ADN genómico en masa utilizando tecnología ABI Taqman y un ensayo validado para detectar la secuencia integrada del transgén de CAR de CD19 tal como se ha descrito (Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73), utilizando 200 ng de ADN genómico por cada punto temporal para las muestras de sangre periférica y médula y 18 a 21,7 ng de ADN genómico por cada punto temporal para las muestras de LCR. Con el fin de determinar el número de copia por unidad de ADN, se generó una curva patrón de 8 puntos que consistía en 5 a 106 copias de plásmido de lentivirus de CTL019 con adición de 100 ng de a Dn genómico de control no transducido. Cada punto de datos (muestra, curva patrón) se evaluó por triplicado con un valor de Ct positivo en 3/3 réplicas con % de VC inferior a 0,95% para todos los valores cuantificables. Se llevó a cabo una reacción de amplificación en paralelo para controlar la calidad del ADN interrogado utilizando 20 ng de ADN genómico de entrada procedente de sangre periférica y médula (2 a 4,3 ng para las muestras de LCR) y una combinación de cebador/sonda específica para la secuencia genómica no transcrita cadena arriba del gen CDKN1A, tal como se ha descrito (Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011) Dichas reacciones de amplificación generaron un factor de corrección (FC) para corregir para la entrada calculada frente a la entrada real de ADN. Se calcularon las copias de transgén por microgramo de ADN según la fórmula: copias calculadas a partir de la curva patrón de CTL019 por ADN de entrada (ng) x FC x 1000 ng. Se determinó la exactitud de dicho ensayo a partir de la capacidad de cuantificar el marcado del producto de células infusionadas mediante Q-PCR. Dichas determinaciones en ciego generaron valores de Q-PCR y de marcaje de flujo de 11,1% y 11,6%, respectivamente, para los productos de infusión de CHOP-100 y de 20,0% y 14,4%, respectivamente, para CHOP-101.
Análisis de factores solubles
Se recogió sangre completa en tubos Vacutainer de tapón rojo (sin aditivo) (Becton Dickinson), se procesaron par aobtener suero utilizando POE de laboratorio establecidas, ses dividieron en alícuotas para el uso individual y se almacenaron a -80°C. La cuantificación de los factores de citoquina soluble se llevó a cabo utilizando tecnología de matriz de perlas Luminex y kits adquiridos de Life Technologies (Invitrogen). Los ensayos se llevaron a cabo según el protocolo del fabricante con una curva patrón de 9 puntos generada utilizando una serie de dilución de 3 veces. Los 2 puntos de patrón externos se evaluaron por duplicado y se evaluaron 5 patrones internos por separado; todas las muestras se evaluaron por duplicado a una dilución 1:2; los valores de Vc en % calculados para las medidas por duplicado eran inferiores a 15%. Los datos se adquirieron en un FlexMAP-3D en porcentaje y se analizaron utilizando el software XPonent 4.0 y análisis de regresión logística de 5 parámetros. Se determinaron los intervalos de cuantificación de la curva patrón mediante el intervalo de 80% a 120% (valor observado/valor esperado). Los valores informados incluían aquellos dentro del intervalo de la curva patrón y los calculados mediante el análisis de regresión logística.
Reactivos de anticuerpos
Se utilizaron los anticuerpos siguientes para estos estudios: MDA-CAR (Jena y Cooper, L. Anti-idiotype antibody for CD19. PlosONE 2013; en prensa, 2013), un anticuerpo murino de CAR CD19 conjugado con Alexa647. Anticuerpos para el inmunofenotipado multiparamétrico: paneles de detección de células T: anti-CD3-FITC, anti-CD8-PE, anti-CD14-PE-Cy7, anti-CD16-PE-Cy7, anti-CD19-PE-Cy7 y anti-CD16-PE-Cy7. paneles de detección de células B: anti-CD20-FITC, anti-CD45-PE, anti-CD45-APC, anti-CD19-PE-Cy7, anti-CD 19-PE, anti-CD34-PCP-e710 y anti CD34-APC obtenidos de e-Biosciences.
Citometría de flujo multiparamétrica
Las células se evaluaron mediante citometría de flujo directamente tras el procesamiento con Ficoll-Paque, con la excepción de la muestra de línea base de CHoP-101, que se evaluó inmediatamente después de la congelación de la muestra crioconservada. Se llevó a cabo el inmunofenotipado multiparamétrico de muestras de sangre periférica y médula utilizando aproximadamente 0,2-0,5 x106 células en total por condición (dependiendo del rendimiento celular de las muestras) y para las muestras de LCR, utilizando cantidades traza de células recogidas tras la centrifugación del líquido LCR y utilizando tinciones de fluorescencia menos uno (FMO, por sus siglas en inglés), tal como se indica en el texto. Las células se tiñeron en 100 |jl de PBS durante 30 minutos sobre hielo utilizando las concentraciones de anticuerpos y reactivos recomendadas por el fabricante; se lavaron y se resuspendieron en paraformaldehído al 0,5% y se adquirieron utilizando un citómetro Accuri C6 dotado de un láser azul (488) y un láser rojo (633 nm). Los archivos Accuri se exportaron en formato de archivo FCS y se analizaron utilizando software FlowJo (versión 9.5.3. Treestar). Se establecieron los valores de compensación utilizando tinciones de anticuerpos individuales y perlas de compensación BD (Becton Dickinson) y se calcularon con el software. La estrategia de clasificación para las células T fue la siguiente: células vivas (FSc /Ss C) > canal de descarte (CD14+CD16+CD19-PECy7) vs Cd 3+ > CD3+. La estrategia de clasificación general para las células B fue la siguiente: Células vivas (FSC/s Sc ) > sucesos SSC low > CD19+. Se indican más datos de clasificación para las muestras de CHOP-100 y CHOP-101 en las figuras individuales.
Análisis de MRD molecular
El análisis de MRD molecular se llevó a cabo en Adaptive Biotechnologies (Seattle, WA) y secuenciación de nueva generación de alto rendimiento de la región CDR3 IGH BCR utilizando el ensayo ImmunoSEQ basado en la plataforma HiSeq/MiSeq de Illumina (Larimore et al., J. Immunol. 189:3221-30, 2012). Para estos análisis, se sometieron 701 a 6.000 ng (aproximadamente 111.000 a 950.000 equivalentes genómicos) de ADN genómico aislado a partir de muestras de sangre completa o médula obtenidas de pacientes, a PCR multiplex y secuenciación, seguido de análisis algorítmicos para cuantificar las secuencias individuales de CDR3 IGH en las muestras. Se llevaron a cabo amplificaciones y secuenciación en paralelo de la región CDR3 TCRB (Robins et al., Blood 114:4099-107, 2009) en cada muestra a fin de evaluar la calidad de las muestras de ADN. Para cada paciente las secuencias de nucleótidos de CDR3 IGH sometidas a ensayo de muestras de diferentes puntos temporales se alinearon utilizando la herramienta de alineación de múltiples secuencias EMBL-EBI (Goujon et al., Nucleic Acids Res. 38:W695-9, 2010; Sievers et al., Mol. Syst. Biol. 7:539, 2011). El clon dominante de la muestra del punto temporal más temporano se rastreó bioinformáticamente en las secuencias de CDR3 IGH sometidas a ensayo en las muestras de los puntos temporales siguientes a fin de identificar la presencia de secuencias con una identidad de secuencia por pares de 95% o superior. Las lecturas de secuenciación total de dichas secuencias similares al clon dominante se informan para cada punto temporal.
A continuación, se proporcionan los resultados de los experimentos.
Informes de caso
CHOP-100 era una niña de 7 años en su segunda recaída de LLA. Se le diagnosticó 2 años antes y consiguió una remisión negativa de enfermedad residual mínima (ERM), con recaída 17 meses después del diagnóstico. Nuevamente remitió tras quimioterapia de reinducción, aunque recidivó 4 meses después, seguido de una falta de respuesta a furtheclofaribine/etopósido/ciclofosfamida. Su cariotipo en la línea base era 48,XX,del(9)(p21.3), 11,del(14)(q2?q24),+16/46,XX[4]. Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) mediante aféresis antes de quimioterapia intensiva, previendo la insuficiente disponibilidad de células T circulantes para la producción celular después de dicho tratamiento intensivo. En el paciente se infusionaron células CTL019 que habían sido expandidas con anti-CD3/CD28 y se transdujeron lentivíricamente para expresar el CAR anti-CD19 en una dosis total de 3,8x108 células/kg (1,2x107 células CTL019/kg) administradas en 3 días consecutivos, tal como se ha indicado anteriormente (Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33, 2011; Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011). No recibió quimioterapia productora de linfopenia antes de las infusiones de CTL019, administrando la terapia citotóxica más reciente 6 semanas antes de la infusión de CTL019. No se observaron toxicidades infusionales inmediatas, aunque fue hospitalizada para fiebre de grado bajo que progresó a fiebre alta el día 4 y el día 5 el paciente fue transferido a la UCI pediátrica (CHOP-100, figura 4A). A lo anterior siguió una rápida progresión a compromiso respiratorio y cardiovascular significativo que requirió ventilación mecánica y respaldo para la presión arterial.
El segundo paciente de LLA era una niña de 10 años (CHOP-101) que había experimentado una segunda recaída tras un trasplante de cordón umbilical no relacionado histocompatible 4/6 28 meses después del diagnóstico y 10 meses antes de la infusión de CTL019. Había experimentado enfermedad de injerto contra el huésped (EICH) después del trasplante, que se resolvió con el tratamiento; no se encontraba bajo inmunosupresión en el momento de la recaída. Posteriormente no reinició la remisión a pesar de múltiples terapias citotóxicas y biológicas. Su cariotipo de línea base era 46 XX, del(1)(p13), t(2;9)(q?21;q?21), t(3;17)(p24;q23), del(6)(q16q21), del(9)(q13q22), der(16)t(1;?;16)(p13;?p13.3)[9],//46, Xy[1]. Antes de la recolección de Pb MC, fue tratada con dos ciclos de blinatumomab (Bargou et al., Science 321:974-7, 2008) sin respuesta. Sus células de sangre periférica eran en un 68% originadas del donante en el momento de la recolección de PBMC. Las células CTL019 se produjeron e infusionaron a una dosis total de 107 células/kg (1,4x106 células CTL019/kg) en una única dosis, tras administrar quimioterapia de etopósido/ciclofosfamida para la linfopenia la semana anterior. Se sustituyó su médula ósea el día antes de la infusión de CTL019 por una población de células de LLA CD19+/CD34+, con expresión variable de CD19 mediante citometría de flujo clínica estándar (figura 7). No manifestó toxicidades infusionales inmediatas, aunque desarrolló fiebre en D+6 y fue hospitalizada. No experimentó toxicidades cardiopulmonares y no recibió glucocorticoides ni terapia anticitoquinas. CHOP-101 experimentaba fiebre de origen desconocido, aunque se sospechaba que se debía a la liberación de citoquinas (figura 4B); mialgias y dos días de confusión (grado 3) que se resolvieron espontáneamente. No mostró evidencia de EICH tras la infusión de las células CTL019. Aunque dichas células fueron recogidas del paciente, eran mayoritariamente originadas en el donante (sangre de cordón).
Inducción de remisión en ambos sujetos
Ambos sujetos mostraron un incremento de los linfocitos y neutrófilos circulantes en las 2 semanas siguientes a la infusión de CTL019, tal como muestran los gráficos que ilustran RGB totales, recuento absoluto de linfocitos (CAL) y recuento absoluto de neutrófilos (CAN) respecto al momento de inicio de la infusión de CTL019 (figura 4C). La mayoría de los linfocitos comprendía células T que expresaban el receptor de antígeno quimérico (figura 8), mostrado en detalle en la figura 5. En ambos sujetos se documentaron fiebres no infecciosas de grado alto, seguido de elevaciones de LDH (figura 4A). Las elevaciones de LDH y las fiebres de grado alto eran similares a las previamente descritas en pacientes de l Lc tras la infusión de CTL019 (Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33, 20l1; Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011). Aproximadamente un mes después de la infusión, se consiguió la remisión morfológica de ERM negativa (<0,01%) de la leucemia en ambos sujetos (Tabla 1).
La remisión clínica en CHOP-100 se asoció a una profunda remisión molecular que ha persistido durante por lo menos 9 meses (observación de enero 2013) (Tabla 1). La secuenciación de ADN de alto rendimiento del locus IGH reveló una reducción acusada de las lecturas totales de IGH en D+23 en sangre y médula de CHOP-100. No se detectó el clon maligno en la sangre o médula en más de 1 millón de equivalentes celulares que se secuenciaron en D+180. En contraste, las secuencias de receptor de células T eran fácilmente detectables en sangre y médula, indicando la integridad del ADN sometido a ensayo en todos los puntos temporales.
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El análisis molecular de la enfermedad residual mínima se llevó a cabo en ADN aislado a partir de sangre completa o médula.
Toxicidad de CTL019
Los sucesos adversos de grados 3 y 4 se resumen en la Tabla 2. Se observó toxicidad aguda en ambos pacientes, que consistía en fiebre y un síndrome de liberación de citoquinas (SLC) que evolucionó a un síndrome de activación de los macrófagos (SAM). Ambos pacientes fueron monitorizados y recibieron profilaxis para el síndrome de lisis tumoral. Ambos experimentaron elevaciones sustanciales de LDH, las causas de las cuales son probablemente multifactoriales, aunque podrían incluir el síndrome de lisis tumoral. Todos los valores de ácido úrico en CHOP-100 eran inferiores a la normalidad o en el rango normal y recibió alopurinol únicamente los días 5-6. CHOP-101 recibió alopurinol profiláctico los días 0 a 14 y presentaba valores de ácido úrico anormales de 4,8 a 5,7 los días 8 a 10, consistente con un síndrome leve de lisis tumoral.
Tabla 2: sucesos adversos (grados 3 y 4) en CHOP-100 y CHOP-101
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Los sucesos adversos de clasificaron según Criterios de terminología comunes de eventos adversos 3.0.
En CHOP-100 se administraron glucocorticoides en D+5, con una breve respuesta en la curva de la fiebre, aunque sin remisión de la hipotensión. Se administró un curso único de terapia anticitoquinas consistente en etanercept y tocilizumab en D+8, al que siguieron rápidos efectos clínicos: defervescencia en horas; se destetó de la medicación vasoactiva y asistencia ventilatoria al resolverse su SDRA clínico y radiológico. No mostró evidencia de laboratorio de síndrome de lisis tumoral; sin embargo, se observó evidencia bioquímica de SAM, con elevación de la ferritina a 45,529 ng/dl en D+11, coagulopatía con d-dímero elevado e hipofibrinogenemia, hepatoesplenomegalia, elevación de las transaminasas, LDH elevado (figura 4C) y triglicéridos elevados, así como un perfil de citoquinas consistente con SAM. La ferritina se redujo a 2,368 en D+26 y se resolvieron las anormalidades clínicas y de laboratorio del SAM.
En CHOP-101, aunque no se obtuvo evidencia directa de un síndrome de lisis tumoral aparte de la fiebre y los cambios de LDH (figura 4C), también desarrollo características de SAM, con elevaciones de la ferritina a 33.360 en D+7, alcanzando un pico de 74.899 el día 11; las transaminasas habían alcanzado el grado 4 durante 1 día y d-dímero elevado en suero. Estos cambios bioquímicos eran reversibles, ya que las transaminasas habían mejorado a grado 1 y la ferritina se había reducido a 3.894 en D+21. Recibió el alta hospitalaria el día D+16.
Ambos sujetos desarrollaron elevaciones acusadas del número de citoquinas y receptores de citoquinas en el suero (figura 1B). En ambos pacientes, las elevaciones de interferón-Y e IL-6 fueron muy acusadas. Estas observaciones son similares al patrón observado anteriormente en pacientes con LLC que también experimentaron remisión de la leucemia tras la infusión de CTL019 (Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011). Las elevaciones pico de citoquinas se correlacionaron temporalmente con la inflamación sistémica, juzgada a partir de los cambios de la temperatura corporal central (figura 4C).
Expansión in vivo de CTL019 en pacientes con LLA
La fracción de células T CtL019 en circulación se incrementó progresivamente in vivo a 72% (CHOP-100) y a 34% (CHOP-101) de las células T (figura 5A). La eficiencia inicial de transducción fue de 11,6% y 14,4% en las células T infusionadas en CHOP-100 y CHOP-101, respectivamente. Dado que el CAL total se había incrementado sustancialmente en ambos pacientes (figura 4C) y que la frecuencia de células CTL019 se había incrementado progresivamente in vivo desde la frecuencia basal (figura 8), se produjo una expansión robusta y selectiva de las células CTL019 en ambos pacientes. El incremento selectivo de las células T que expresaban CTL019 en ambos pacientes era consistente con el mecanismo antileucémico que implicaba la expansión controlada por CD19 y con la posterior eliminación de las células que expresaban CD19 en ambos pacientes (figura 6 y figura 9).
El análisis de la secuencia molecular profunda de los TCR en muestras de sangre periférica y de médula en CHOP-100 obtenidas en D+23, en el que se observó que >65% de las células CD3+ en sangre periférica y médula eran CTL019+ mediante citometría de flujo, reveló la ausencia de un clonotipo dominante de TCR de las células T en ninguno de los compartimientos, con presencia de las 10 células T más abundantes a frecuencias de entre 0,18% y 0,7% en médula ósea y de entre 0,19% y 0,8% en sangre periférica. Seis de los 10 clones dominantes estaban compartidos en los dos compartimientos. Además, se encontraban presentes ambas células T CAR, CD4 y CD8. De esta manera, aparentemente las células T CAR proliferan después de la expansión estimulada por CD19 y no por señales de TCR o sucesos específicos de clon, tales como la activación por integración del lentivirus.
Tráfico y morfología de células T CAR CTL019 en médula y SNC
Las células CTL019 se expandieron más de 1000 veces en la sangre periférica y en la médula ósea (figura 5). La frecuencia de las células CTL019 se incrementó a más de 10% de las células T circulantes en D+20 en ambos sujetos (figura 8), con una magnitud absoluta de la expansión de CTL019 similar a la observada en los pacientes con LLC (Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011). Inesperadamente, las células en el LCR también mostraron un grado elevado de marcado génico de CTL019 y también persistieron a frecuencia elevada hasta los 6 meses (figura 5B). El tráfico de células CTL019 al LCR resultó inesperado, dado que ninguno de los pacientes presentaba leucemia del SNC detectable en el citocentrifugado en el momento de la infusión o en la evaluación 1 mes después del tratamiento. Además, informes anteriores de terapia de CAR para neoplasias malignas de células B no han observado tráfico de células T CAR hasta el SNC (Till et al., Blood 112:2261-71, 2008; Brentjens et al., Blood 118:4817-28, 2011; Savoldo et al., J. Clin. Invest. 121:1822-5, 2011; Jensen et al., Biol. Blood Marrow Transplant 16:1245-56, 2010; Till et al., Blood 119:3940-50, 2012; Kochenderfer et al., Blood 119:2709-20, 2012). La morfología de los linfocitos en sangre y LCR se muestra para CHOP-100 y CHOP-101 en la figura 5D. Debido a que >70% de los linfocitos en circulación en D+10 eran células CTL019 (figuras 5A y 5B), la mayor parte de los linfocitos granulares grandes mostrados en el panel izquierdo de la figura 5D probablemente son células CTL019. De manera similar, debido a que muchos linfocitos en el LCR obtenido de CHOP-101 en D+23 eran células CTL019 (figuras 5B y 5C), el citocentrifugado de los linfocitos del LCR en la figura 5D muy probablemente representa la morfología de células CTL019 in vivo que se han desplazado hasta el SNC.
Inducción de aplasia de células B
Ambos sujetos mostraron eliminación de células positivas para CD19 en médula ósea y sangre dentro del mes posterior a la infusión de CTL019 (figura 6 y figura 9). En CHOP-100, una gran proporción de células remanentes en la médula en D+6 después de la infusión eran blastocitos leucémicos CD19+ CD20+. Dicha población de células no era detectable en D+23, un efecto que se mantuvo más allá de los 9 meses en este paciente (figura 9A). Dado que CHOP-100 no fue sometida a quimioterapia en las 6 semanas precedentes a la infusión de CTL019, ello indica que las células CTL019 resultaron suficientes para anular las células B normales y leucémicas en este caso.
Aparición de variante de escape de CD19 en CHOP-101
CHOP-101 experimentó una recaída clínica aparente en la sangre periférica a los 2 meses de la infusión de CTL019, tal como pone de manifiesto la reaparición de blastocitos en la circulación. Dichas células eran positivas para CD45dim, positivas para CD34 y no expresaban CD19 (figura 6). La ausencia de las células CD34dim+CD34+CD19dim+ dominantes originales es consistente con una potente presión selectiva antileucémica de las células T CAR CTL019 dirigida a CD19 (figura 9B). La secuenciación de IGH profunda reveló la presencia del clon maligno en sangre periférica y médula tan pronto como D+23 (Tabla 1), a pesar de la evaluación clínica de negatividad de ERM mediante citometría de flujo en este punto temporal (figura 7). Además, la secuenciación profunda del material obtenido en la recaída clínica reveló que las células CD45dimCD34+CD19- estaban clonalmente relacionadas con las células CD45dim+CD34+CD19dim+ dominantes iniciales, ya que comparten la misma secuencia de IGH.
Remisión de LLA con células T expresantes de receptor de antígeno quimérico
Los resultados presentados en la presente memoria demuestran la inducción de remisión de leucemia refractaria y recidivante en los primeros dos pacientes tratados en este protocolo. La remisión ha sido sostenida en un sujeto y se vio acompañada de recaída debido a la aparición de blastos negativos para CD19 en el otro sujeto. Las células CTL019 modificadas genéticamente se desplazaron al SNC a niveles elevados en ambos pacientes. Se observaron elevaciones de citoquinas que se encontraban en la diana, eran reversibles y se vieron temporalmente acompañadas de la eliminación de los blastocitos que expresaban CD19 en ambos sujetos. La inducción de remisión completa en LLA positiva para CD19 refractaria tras la infusión de células T CAR resulta prometedora, particularmente dada la baja frecuencia de remisiones tras la infusión de linfocitos de donante alogénico que no expresan CAR (Kolb et al., Blood 86:2041-50, 1995; Collins et al., J. Clin. Oncol. 15:433-44, 1997; Collins et al., Bone Marrow Transplant 26(5):511-6, 2000). La tecnología de secuenciación profunda indica que la infusión de CAR CTL019 estaba asociada a una reducción de 5-log sostenida en la frecuencia de células B malignas en CHOP-100, indicando adicionalmente potentes efectos antitumorales en la leucemia refractaria a quimioterapia.
La desafortunada aparición de blastocitos negativos para CD19 en un sujeto es consistente con informes anteriores que documentan la existencia de células precursoras negativas para CD19 en algunos casos de LLA (Hotfilder et al., Cancer Research 65:1442-9, 2005; le Viseur et al., Cancer Cell 14:47-58, 2008). Resulta posible que la co-infusión de células T CAR redirigidas a nuevas especificidades además de CD19 podría reducir la probabilidad de dicho suceso. Hasta ahora, no se han observado recaídas con células de escape negativas para CD19 en adultos con LLC tras el tratamiento con células CTL019 (Kalos et al., Science Translational Medicine 3:95ra73, 2011), sugiriendo que este problema podría ser específico de un subgrupo de leucemias agudas. La inducción de remisión en CHOP-100 no requirió quimioterapia concomitante y es consistente con un informe anterior que muestra que las remisiones en LLC pudieron retrasarse en varias semanas después de la quimioterapia (Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33, 2011). De esta manera, la administración concomitante de quimioterapia citotóxica podría no resultar necesaria para efectos antitumorales mediados por CAR.
Ambos pacientes de LLA pediátricos experimentaron toxicidad sustancial tras la infusión de CTL019. Se observó inducción de aplasia de células B, e indica que las células T CAR pueden funcionar en el contexto de la leucemia aguda recidivante. Ambos pacientes también desarrollaron evidencia clínica y de laboratorio de síndrome de liberación de citoquinas y síndrome de activación de los macrófagos dentro de la semana posterior a la infusión. El perfil de citoquinas observado en estos pacientes es similar a informes anteriores de patrones de citoquinas en niños con hemafagocitosis y síndrome de activación de los macrófagos o linfohistiocitosis hemofagocítica (Tang et al., Br. J. Haematol. 143:84-91, 2008; Behrens et al., J. Clin. Invest. 121(6):2264-77, 2011). El síndrome de activación de los macrófagos se caracteriza por hiperinflamación con fiebre prolongada, hepatoesplenomegalia y citopenias. Los resutlados de laboratorio característicos de dicho síndrome son niveles elevados de ferritina, triglicéridos, transaminasas, bilirrubina (mayoritariamente conjugada) y cadena a de receptor de interleuquina-2 soluble y nivel reducido de fibrinógeno (Janka et al., Annu. Rev. Med. 63:233-46, 2012). Estudios recientes indican que eltocilizumab (anti-IL6) resulta prometedor para el EICH resistente a glucocorticoides (Drobyski et al., Biol. Blood Marrow Transplant 17(12):1862-8, 2011; Le Huu et al., J. Invest. Dermatol. 132(12):2752-61, 2012; Tawara et al., Clinical Cancer Research 17:77-88, 2011), y los resultados presentados en la presente memoria son consistentes con estos datos.
La vigorosa expansión in vivo de CTL019, aplasia de células B persistente y acusa actividad antileucémica implican funciones efectoras sustanciales y sostenidas de las células CTL019 en pacientes pediátricos con LLA avanzada. La elevada eficiencia del tráfico de las células T CAR hasta el SNC resulta prometedora como mecanismo de vigilancia para evitar la recaída en un sitio santuario tal como el SNC (Pullen et al., J. Clin. Oncol. 11(5):839-49, 1993), y apoya los ensayos de terapias dirigidas por células T CAR para linfomas del SNC y neoplasias malignas primarias del SNC. Con la excepción de la aplasia de células B, la duración de la cual actualmente no está definida, se cree que la utilización de terapias de base inmunitaria, tal como CTL019, podría presentar un perfil favorable de efectos adversos a largo plazo en comparación con las dosis elevadas de quimioterapia y radiación que se utilizan como el estándar de cuidado actual para la mayor parte de casos de leucemia pediátrica (Garcia-Manero y Thomas, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 15(1):163-205, 2001).
Inducción de remisiones completas de LLA con células T expresantes de receptor de antígeno quimérico
El tocilizumab (anti-IL6) resulta prometedor para el EICH resistente a glucocorticoides y los resultados presentados en la presente memoria son consistentes con estos datos. Además, resulta interesante indicar que en CHOP-100, el SLC que se manifestaba como fiebre alta, hipotensión y fallo multiorgánico era resistente a las dosis altas de glucocorticoides administradas en los 2 días anteriores antes de la terapia dirigida a citoquinas. Finalmente, en CHOP-100, los cambios bifásicos en IL-1p, IL-1RA e IL-2 mostrados en la figura 4B se han relacionado con terapia dirigida a citoquinas con etanercept y tocilizumab.
La inducción de remisión en un paciente refractario a la terapia de blinatumomab subraya adicionalmente la potencia de las células CTL019. La elevada eficiencia del desplazamiento de las células T CAR hasta el SNC resulta prometedora para la vigilancia de prevención de las recaídas en un sitio santuario tal como el SNC y apoya los ensayos de terapias dirigidas a células T CAR para linternas del SNC y neoplasias malignas primarias del SNC. Ninguno de los pacientes ha experimentado efectos cognitivos que puedan atribuirse al desplazamiento de células T al SNC.
Ejemplo 4: información de resumen
Se midieron diversos marcadores en pacientes receptores de células T CAR. A título de ejemplo no limitativo, los presentes inventores midieron la ferritina, la mioglobina y el inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1); ver las figuras 10, 11 y 12, respectivamente. Los niveles elevados de dichos marcadores se correlacionaban con el resultado. Los pacientes designados como -01, -03, -09, -100 y -101 se clasificaron como respondedores completos. Los pacientes designados como -02, -05, -10 (segunda infusión y respuesta aproximadamente en D70) y -12 se clasificaron como respondedores parciales. Los pacientes designados como -06, -07 y -14 se clasificaron como no respondedores.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), en la que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización 4-1BB, para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición asociado a un nivel elevado de expresión de un antígeno tumoral, en el que el método comprende la administración de una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea en un paciente que lo necesita, en el que la terapia de primera línea comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de dichas células T modificadas genéticamente, en las que la terapia de segunda línea apropiada comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citoquinas a fin de controlar la toxicidad resultante de la administración de las células T modificadas genéticamente en el paciente, en el que la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL-1, p.ej., IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-IRa, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MlP-la, MIP-1p, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, eotaxina, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos.
  2. 2. Célula T modificada genéticamente para la utilización según la reivindicación 1, en la que, tras la administración de la terapia de primera línea, se monitorizan los niveles de citoquinas en el paciente para determinar el tipo apropiado de terapia de segunda línea para la administración en el paciente.
  3. 3. Célula T modificada genéticamente para la utilización según la reivindicación 2, en la que dicha monitorización indica un incremento del nivel de dicha citoquina.
  4. 4. Célula T modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la terapia inhibidora de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en ARN interfiriente pequeño (ARNip), un microARN, un ácido nucleico antisentido, un ribozima, un vector de expresión que codifica un mutante negativo transdominante, un anticuerpo, un péptido, una molécula pequeña, un fármaco inhibidor de citoquinas y cualquier combinación de los mismos.
  5. 5. Célula T modificada genéticamente para la utilización según la reivindicación 2, en la que se monitorizan los niveles de citoquinas mediante la detección del nivel proteico de las citoquinas en una muestra biológica del paciente.
  6. 6. Célula T modificada genéticamente para la utilización según la reivindicación 2, en la que se monitorizan los niveles de citoquinas mediante la detección del nivel de ácidos nucleicos de las citoquinas en una muestra biológica del paciente.
  7. 7. Inhibidor o activador de citoquinas para la utilización en un método de reducción o evitación de un efecto adverso asociado a la administración de una célula T modificada genéticamente para expresar un CAR, en el que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización 4-1BB, en el que el método comprende monitorizar los niveles de una citoquina en un paciente, y en el caso de que dichos niveles de citoquinas se encuentren elevados, la administración de una cantidad eficaz de un inhibidor de citoquinas en el paciente a fin de reducir los niveles elevados de citoquinas que resultan de la administración de las células T modificadas genéticamente, o en el caso de que dichos niveles de citoquinas se encuentren suprimidos, la administración de una cantidad eficaz de un activador de citoquinas en el paciente a fin de incrementar los niveles suprimidos de citoquinas que resultan de la administración de las células T modificadas genéticamente,
    en el que la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL-1 (p.ej., IL-1p), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-1p, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, eotaxina, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos.
  8. 8. Inhibidor o activador de citoquinas para la utilización según la reivindicación 7, en el que el inhibidor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en ARN interfiriente pequeño (ARNip), un microARN, un ácido nucleico antisentido, un ribozima, un vector de expresión que codifica un mutante negativo transdominante, un anticuerpo intracelular, un péptido, una molécula pequeña, un fármaco inhibidor de citoquinas y cualquier combinación de los mismos.
  9. 9. Inhibidor o activador de citoquinas para la utilización según la reivindicación 7, en el que se monitorizan los niveles de citoquinas mediante la detección del nivel proteico de las citoquinas en una muestra biológica del paciente.
  10. 10. Inhibidor o activador de citoquinas para la utilización según la reivindicación 7, en el que se monitorizan los niveles de citoquinas mediante la detección del nivel de ácidos nucleicos de las citoquinas en una muestra biológica del paciente.
  11. 11. Célula T modificada genéticamente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el dominio de unión a antígeno con diana en un antígeno tumoral puede fusionarse con un dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo receptor de antígeno de células T, en el que dominio de unión a antígeno preferentemente presenta como diana CD19.
  12. 12. Célula T modificada genéticamente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el CAR comprende además un dominio de señalización CD3zeta.
  13. 13. Célula T modificada genéticamente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la enfermedad, trastorno o condición es un cáncer, preferentemente una neoplasia maligna hematológica o un tumor sólido.
  14. 14. Célula T modificada genéticamente para la utilización según la reivindicación 13, en la que la neoplasia maligna hematológica se selecciona del grupo que consiste en leucemia aguda (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemia crónica (tal como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (indolente y formas de grado elevado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.
  15. 15. Célula T modificada genéticamente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 11 a 14, en la que la terapia de segunda línea es un inhibidor de IL-6, preferentemente tocilizumab.
  16. 16. Inhibidor o activador de citoquinas para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el inhibidor de citoquinas es un inhibidor de IL-6, preferentemente tocilizumab.
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