CN111467494B - 对cars的抗肿瘤活性的毒性管理 - Google Patents

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Abstract

本发明的发明名称是对CARS的抗肿瘤活性的毒性管理。本发明提供了用于治疗患者中的癌症的组合物和方法。在一个实施方式中，该方法包括第一线治疗，该第一线治疗包括给予对其有需要的患者表达CAR的遗传修饰的T细胞，其中CAR包括抗原结合域、跨膜结构域、共刺激信号传递区、和CD3ζ信号传导域，并且监测T细胞输注后患者中的细胞因子水平，以根据患者中CAR T细胞的存在的结果，确定适合治疗患者的第二线治疗的类型。

Description

对CARS的抗肿瘤活性的毒性管理
本申请是分案申请，原申请的申请日为2013年7月12日、申请号为201380037301.5(PCT/US2013/050267)、发明名称为“对CARS的抗肿瘤活性的毒性管理”。
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月13日提交的美国临时专利申请号61/671,482和2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/782,982的优先权，各案通过引用以其全文并入于此。
发明背景
患有复发的并且化疗难治的急性淋巴细胞白血病(ALL)的患者具有不良的预后，尽管使用了积极治疗，例如异源造血干细胞移植(Barrett(巴雷特)等人，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)331:1253-8；Gokbuget(格克比盖特)等人，2012，Blood(血液)120:2032-41)和双特异性CD19抗体片段(Bargou(巴戈)等人，2008，Science(科学)321:974-7)。已经报道，在患有CLL和B细胞淋巴瘤的成年人中，靶向种系特异性抗原CD19和CD20的嵌合抗原受体修饰的T细胞是有效的(Till(提尔)等人，2008，Blood(血液)112:2261-71；Kochenderfer(考琴德佛)等人，2010，Blood(血液)116:4099-102；Brentjens(布伦蒂安斯)等人，2011，Blood(血液)118:4817-28；Porter(波特)等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)365:725-33；Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73；Savoldo(萨沃尔托)等人，2011，J Clin Invest(临床研究杂志)121:1822-5)。然而，仍未充分研究，CAR T细胞对ALL母细胞，一种具有更快速进展的更不成熟的白血病的作用。
已经报道，肿瘤溶解综合征的延迟发作和细胞因子分泌，与有力的体内嵌合抗原受体T细胞扩张组合(Porter(波特)等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)365:725-33；Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)。然而，仍未充分研究，细胞因子分泌的作用和与体内嵌合抗原受体T细胞扩张关联的失调。
因此，在本领域中，对用于使用CAR治疗癌症并且解决CAR的毒性的组合物和方法存在迫切需要。本发明解决了这一需要。
发明概述
本发明提供了治疗患有与提高的肿瘤抗原表达关联的疾病、失调或病症的患者的方法。在一个实施方式中，该方法包括给予对其有需要的患者第一线治疗和第二线治疗，其中该第一线治疗包括给予患者有效量的遗传修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合域、跨膜结构域、和细胞内信号传导域。
在一个实施方式中，在给予第一线治疗后，监测患者中的细胞因子水平，以确定待给予至患者的第二线治疗的适当类型，并且给予对其有需要的患者适当的第二线治疗。
在一个实施方式中，细胞因子水平的增加鉴定待给予至对其有需要的患者的细胞因子抑制治疗的类型。
在一个实施方式中，细胞因子选自IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、TNFα、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、铁蛋白、以及它们的任何组合。
在一个实施方式中，细胞因子抑制治疗选自小干扰RNA(siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负性突变体的表达载体、抗体、肽、小分子、细胞因子抑制药物、以及它们的任何组合。
在一个实施方式中，通过检测来自患者的生物样品中的细胞因子的蛋白水平来监测细胞因子水平。
在一个实施方式中，通过检测来自患者的生物样品中的细胞因子的核酸水平来监测细胞因子水平。
本发明提供了减少或避免与给予遗传修饰以表达CAR的细胞关联的不良作用的方法，其中CAR包括抗原结合域、跨膜结构域、以及细胞内信号传导域，该方法包括监测患者中细胞因子的水平以确定待给予至患者的细胞因子治疗的适当类型并且给予适当的细胞因子治疗至患者。
在一个实施方式中，细胞因子水平的增加鉴定待给予至患者的细胞因子抑制治疗的类型。
在一个实施方式中，细胞因子选自IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、TNFα、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、铁蛋白、以及它们的任何组合。
在一个实施方式中，细胞因子抑制治疗选自小干扰RNA(siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负性突变体的表达载体、细胞内抗体、肽、小分子、细胞因子抑制药物、以及它们的任何组合。
在一个实施方式中，通过检测来自患者的生物样品中的细胞因子的蛋白水平来监测细胞因子水平。
在一个实施方式中，通过检测来自患者的生物样品中的细胞因子的核酸水平来监测细胞因子水平。
附图简述
当结合附图进行阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细说明。出于说明本发明的目的，在附图中示出的是目前优选的实施方式。然而，应当理解的是，本发明并不局限于附图中示出的实施方式的精确安排和机构。
图1是证明四个不同患者中的血清细胞因子水平的图。所有的患者显示细胞因子释放，包括IL-6。
图2是描绘了代表性患者中标绘的的血清细胞因子的图。患者在第5至7天病危，并且仅在塔西单抗给予之后开始改善。
图3是如对T细胞活性标记(穿孔素和IFN-γ)进行测量，证明抗体干预并不影响CART 19细胞功能性的图。
图4，包括图4A直至4C，是描绘了临床反应的一系列图。图4A示出了用CTL019细胞治疗的、在第0天输注的患有多次复发的化疗难治的CD19+B细胞前体急性成淋巴细胞白血病的两个儿童。在CTL019输注后，血清乳酸脱氢酶(LDH)和体温的改变，其中用圆圈区分每24小时时期的最高温度。给予CHOP-100，在第5天以2mg/kg/天开始甲泼尼龙，在第12天之前逐渐变少至消失。在第7天早晨，给予依那西普0.8mg/kg x 1。在第7天晚上6pm，给予塔西单抗8mg/kg x 1。在CHOP-100中，在第5天给予皮质激素下，发生发热的短暂改善，其中在第8天，在给予由依那西普和塔西单抗组成的细胞因子定向治疗后，发生发热的完全解决。图4B示出了在CTL019输注后，在频繁的时间点测量的血清细胞因子和炎症标记。使用具有来自基线的倍数变化的半对数图示出了细胞因子值。针对每个分析物的基线(输注之前的第0天)值(pg/ml血清)为(CHOP-100,CHOP-101):IL1-β:(0.9,0.2)；IL-6:(4.3,1.9)；TNF-α:(1.5,0.4)；IL2Rα:(418.8,205.7)；IL-2:(0.7,0.4)；IL-10(9.9,2.3)；IL1Rα:(43.9,27.9)。两个患者在多个细胞因子和细胞因子受体——包括可溶白细胞介素1A和2受体(IL-1RA和IL-2R)，白细胞介素2、6和10(IL-2、IL-6和IL-10)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，和干扰素-γ(INF-γ)——方面出现显著升高。图4C示出了循环绝对中性粒细胞计数(ANC)、绝对淋巴细胞计数(ALC)和白细胞(WBC)计数的改变。值得注意的是，ALC的增加主要由激活的CT019T淋巴细胞组成。
图5，包括图5A直至5D，是描绘了在周围血液、骨髓和CSF中CTL019细胞的扩张和可视化的一系列图。图5A示出了用抗体染色的周围血液的流式细胞术分析，以检测CD3和抗-CD19 CAR。描绘的是在CHOP-100和CHOP-101中，表达CAR的CD3细胞的百分比。图5B示出了通过实时定量PCR，CTL019 T细胞在周围血液、骨髓和CSF中的存在。从在CTL019输注之前和之后连续时间点收集的全血、骨髓抽出物和CSF分离基因组DNA。图5C示出了在从CHOP-100和CHOP-101收集的CSF中CTL019细胞的流式细胞检测。图5D示出了在周围血液的Wright(赖特)染色涂片和CSF的细胞涂片中激活的大颗粒淋巴细胞的图。
图6是示出了在CHOP-101中，在基线和在复发时的CD19表达的图。在CTL019输注之前，以及在复发2个月以后，从CHOP-101获得骨髓样品。分离自骨髓的单核细胞被染色CD45、CD34和CD19，并且在Accuri C6流式细胞仪上进行分析。在活细胞上门控后，在CD34+细胞上对母细胞门(blast gate)(CD45+SSC低)子门控(subgated)，并且对于CD19表达产生频率曲线。分划线表示针对同种型对照上的相同门控的阈值。治疗前母细胞具有一个范围的CD19分布，其中一小群非常暗的染色细胞被视为X轴上，在102，左侧频率曲线的尾部。复发样品并不具有任何CD19阳性母细胞。处理前母细胞群体上CD19表达的分析揭示，小群体的CD19暗或者是阴性细胞。这一小群体的细胞的平均荧光强度(MFI)为187(左侧小图)，类似于抗-CD19-染色的复发的母细胞的MFI(201，右侧小图)。治疗前骨髓样品是细胞减少的，具有10％母细胞，并且复发骨髓样品是正常细胞的，具有68％母细胞，导致可供用于采样的事件中的差异。
图7是示出在CTL019输注后，在第+23天，在CHOP-101中，骨髓中缓和的诱导的图。在基线(顶部小图)和在第+23天(底部小图)，对CHOP-101的临床免疫分型报道。细胞染色CD10、CD19、CD20、CD34、CD38和CD58。在溶解红细胞后，进行流式细胞术。在第+23天的报道表明白细胞由以下组成：42.0％淋巴细胞、6.0％单核细胞、50.3％脊髓型、0.17％脊髓母细胞以及没有活的淋巴祖细胞。通过流式细胞术，不存在残余的前体B细胞淋巴性白血病/淋巴瘤的令人信服的免疫表型证据。鉴定了基本上没有活的B细胞。
图8是描绘在血液中CTL019细胞的体内扩张和持久性的图。针对CHOP-100和CHOP-101，示出了血液中的白细胞(WBC)、CD3+T细胞、和CTL019细胞的个数。在一个半对数图上示出了细胞个数。
图9，包括图9A和9B，是证明了在CTL019输注1个月内，受试者在骨髓和血液中，具有CD19阳性细胞的消除的一系列图。图9A示出了CHOP-100中，持久性的B细胞发育不全。顶部小图示出了在第+6天，在从表达CD19和CD20的CHOP-100抽出的骨髓中，白血病母细胞的优势群体。在第+23和6个月，这一群体缺失。图9B示出在CHOP-101中，B细胞发育不全和CD19逃逸变体细胞的出现。用抽出自抗-CD45、CD34和CD19染色的CHOP-101的骨髓的流式细胞术分析。在底端行中，侧向散射的和CD45暗的阳性细胞用来鉴定在底线表达可变量的CD34和CD19的白血病细胞。在第64天检测到仅有CD19阴性母细胞。在顶部小图中的数值表示每个象限中表示的总白细胞的分数。在下部小图中的数值表示来自在CD45暗/SS低门中表示的总白细胞的百分数。
图10是描绘了在接受CAR T细胞后，在患者中呈现的铁蛋白的水平的图。
图11是描绘了在接受CAR T细胞后，在患者中呈现的肌红蛋白的水平的图。
图12是描绘了在接受CAR T细胞后，在患者中呈现的纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的水平的图。
详细说明
本发明涉及用于治疗癌症，包括但不局限于血液系统恶性肿瘤和实体瘤的组合物和方法。本发明还涵盖了治疗和预防某些类型的癌症，包括原发性癌症和转移性癌症，连同难治的或抗常规化疗的癌症的方法。这些方法包括给予对此类治疗和预防有需要的患者一个治疗上或预防上有效量的T细胞，该T细胞被转导以表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR是将用于希望的抗原(例如肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与T细胞受体激活细胞内结构域组合，以产生显示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
作为整体治疗方案的一部分，本发明涵盖通过评价在T细胞输注后的患者中的可溶性因子谱(profile)，而管理某些癌症(例如预防或拖延它们的复发，或延长缓和的时间)的方法。优选地，可溶性因子谱包括细胞因子谱的评价。当细胞因子谱表明与T细胞输注前相比，T细胞输注后具体细胞因子的增加，则熟练的技术人员可以选择给予对此类管理有需要的患者有效量的细胞因子抑制化合物或它的一种药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物、或前药，以管理T细胞输注后提高的水平的细胞因子。
本发明部分基于以下发现：从基线的调制或在基线的现存水平的因子的独特组合的鉴定可以帮助追踪CAR T细胞输注后的T细胞激活、靶活性、以及潜在有害副作用，以帮助管理癌症的治疗。示例性因子包括但不局限于IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、TNFα、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、铁蛋白、等。
本发明涉及转导的表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继细胞转移与毒性管理组合的策略，，其中产生来自T细胞输注后患者的可溶性因子谱，并且进行针对提高的可溶性因子的治疗，以便治疗癌症。例如，产生实时可溶性因子谱允许用适当抑制剂干预提高的可溶性因子，以便将水平下降至正常水平。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有靶向希望的抗原的抗原识别域的胞外域、跨膜结构域、和胞浆域。本发明并不局限于一个特定的CAR。而是，靶向希望的抗原的任何CAR都可以用于本发明。在PCT/US11/64191中已经描述了制备CAR的组合物和方法，将其通过引用以其全文并入于此。
在任何以上方法的一些实施方式中，这些方法导致肿瘤尺寸或疾病或疾病进展的证据的可测量的减少、完全反应、部分反应、稳定的疾病、无进展存活的增加或延长、总体存活期的增加或延长、或毒性的减小。
定义
除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与在此描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可以用于实施或测试本发明，但在此描述了优选的材料和方法。在描述和要求本发明时，将使用以下术语。
还应理解在此使用术语的目的仅在于描述具体实施方式，并不意味着限制。
在此处使用的冠词“一个”和“一种”(“a”和“an”)是指一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元素”是指一个元素或超过一个元素。
如在此使用，当指一个可测量的值，例如一个量、一个时距等时，“约”是指涵盖从指定值的±20％或±10％的变化，在一些实例中是±5％，在一些实例中是±1％，并且在一些实例中是±0.1％，只要此类变化适合进行披露的方法。
如在此使用，“激活”是指已经充分刺激T细胞的状态，能诱导可检测的细胞增殖。激活可以与诱导的细胞因子产生、和可检测的效应子功能关联。除其他事项之外，术语“激活的T细胞”是指经历细胞分裂的T细胞。
在此使用可溶性因子的“激活剂”或“激动剂”来指能够激活或增加可溶性因子的水平的药剂的分子。激活剂是增加、促进、诱导激活，激活或上调可溶性因子的活性或表达的化合物，例如激动剂。用于检测激活剂的测定包括例如在体外、在细胞中、或细胞膜中表达可溶性因子，施用推定的激动剂化合物，并且然后确定对可溶性因子活性的功能效应，如在本文的其他地方所描述。
如在此使用，术语“抗体”是指特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。通常抗体是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以按多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2连同单链抗体和人源化抗体(Harlow(哈洛)等人，1999，在以下中：Using Antibodies:A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，纽约州；Harlow(哈洛)等人，1989，在以下中：Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，冷泉港，纽约；Houston(休斯敦)等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)85:5879-5883；Bird(伯德)等人，1988，Science(科学)242:423-426)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的示例包括但不局限于Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段、线性抗体；scFv抗体；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
如在此使用，术语“抗原”被定义为引起免疫反应的分子。这一免疫反应可以涉及抗体产生、抑或特定免疫活性细胞的激活，或二者。熟练的技术人员将理解，任何大分子，几乎包括所有蛋白或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组的或基因组的DNA。熟练的技术人员将理解，如在此使用了那一术语，包括编码引起免疫反应的蛋白的核苷酸序列或一部分核苷酸序列的任何任何DNA，因此编码了“抗原”。此外，本领域普通技术人员将理解，并不唯一地由基因的全长核苷酸序列编码了抗原。容易明白的是，本发明包括但不局限于多于一个基因的部分核苷酸序列的使用，以及按不同组合安排这些核苷酸序列，以引起希望的免疫反应。此外，熟练的技术人员将理解，根本不需要由“基因”来编码抗原。容易明白的是，可以合成而产生抗原，并且抗原可以源自生物样品。此类生物样品可以包括但不局限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。
根据本发明，术语“自身抗原”是指由免疫系统识别的任何自体抗原，就像它是外源的一样。自身抗原包括但不局限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
如在此使用，术语“自身免疫性疾病”被定义为由自身免疫反应引起的失调。自身免疫性疾病是由于对自体抗原的不适当的并且过度的反应。除了别的之外，自身免疫性疾病的示例包括但不局限于：阿狄森氏病、严重脱发、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯氏病、格-巴综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑性狼疮、多重峰硬化、重症肌无力、寻常型天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合症、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎。
如在此使用，术语“自体同源的”是指源自与它稍后要重新引入的个体相同的个体的任何材料。
“异源的”是指源自同一物种的不同动物的移植物。
“异种异体移植”是指源自不同物种的动物的移植物。
如在此使用，术语“癌症”被定义为特征在于异常细胞的迅速并且失控的生长的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统而扩展至身体的其他部分。不同癌症的示例包括但不局限于乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
如在此使用，“联合治疗”是指结合其他药剂给予第一药剂。“结合”是指除了另一治疗方式，给予一种治疗方式。像这样，“结合”是指在递送其他治疗方式至个体之前、之中、或之后给予一种治疗方式。此类联合可以被认为是单个治疗方案或制度的一部分。
如在此使用，术语“并行给予”是指在联合治疗中，第一治疗的给予和第二治疗的给予彼此重叠。
作为术语在此使用，“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的同类共刺激分子的抗原递呈细胞(APC、树突细胞、B细胞、等)上的分子，由此提供除了通过以下而提供的原始信号的信号，例如TCR/CD3复合物与加载有肽的MHC分子的结合，介导了T细胞反应，包括但局限于增殖、激活、分化、等。共刺激配体可以包括但不局限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴细胞毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、以及特异性结合B7-H3的配体。在其他事物之外，共刺激配体还涵盖特异性结合T细胞上存在的共刺激分子——例如，但不局限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3——的抗体，以及特异性结合CD83的配体。
“共刺激分子”是指特异性结合共刺激配体的T细胞上的同源结合配偶体，由此介导通过T细胞的共刺激反应，例如但不局限于增殖。共刺激分子包括但不局限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如在此使用，“共刺激信号”是指与原始信号组合的信号，例如TCR/CD3配接，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
“疾病”是指其中动物不能维持内环境稳定的动物的健康状态，并且如果疾病不能改善，则动物的健康就继续恶化。相比之下，“失调”是其中动物不能维持内环境稳定的健康状态，但是其中与它将没有该失调相比，动物的健康状态是更不可取的。保持不治疗的话，失调并不一定引起动物的健康状态中的另外的疾病。
如在此使用，“有效量”是指提供治疗的或预防的益处的量。
如在此使用，“内源的”是指来自，或产生在有机体、细胞、组织或系统内的任何材料。
如在此使用，术语“外源的”是指产生在有机体、细胞、组织或系统外的被引入有机体、细胞、组织或系统中的任何材料。
如在此使用，术语“表达”被定义为由启动子驱动的具体核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括用于表达的充足的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞供应或存在于体外体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的那些的，例如合并了重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体内)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、和腺病毒伴随病毒)。
“同源的”是指两个多肽之间的或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。当全部两个比较的序列中的一个位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如两个DNA分子的每一个中的一个位置都被腺嘌呤占据，则这些分子在那一位置是同源的。两个序列之间的同源性的百分比是由两个序列共享的匹配位置数或同源位置数除以比较的位置数X100的一个函数。例如，如果两个序列中的位置中10个有6个是匹配的或同源的，则两个序列是60％同源的。通过举例，DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50％同源性。一般而言，当两个序列对齐时做出比较，以给出最大同源性。
如在此使用，术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为发挥抗体的作用的一类蛋白。B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在这一类蛋白中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD、和IgE。IgA是身体分泌物(例如唾液、眼泪、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和生殖泌尿道的黏液分泌物)中存在的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数受试者体内，在初次免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合、和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在针对细菌和病毒的防御中是重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但是可以用作抗原受体。IgE是当暴露于变应原时，通过引起介质从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
如在此使用，术语“免疫反应”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫反应。示例性免疫反应包括T细胞反应，例如细胞因子产生和细胞的细胞毒性。此外，术语免疫反应包括通过T细胞激活而间接发挥作用的免疫反应，例如抗体产生(体液反应)和细胞因子应答细胞(例如巨噬细胞)的激活。在免疫反应中涉及的免疫细胞包括淋巴细胞，例如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Th1和Th2细胞)；抗原呈递细胞(例如专职性抗原提呈细胞(例如树突细巨噬细胞、B淋巴细胞、朗格汉斯细胞)，和非专职性抗原提呈细胞，例如角化细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、和粒细胞。
在此使用可溶性因子的“抑制剂”或“拮抗剂”来指能够抑制、灭活或减少可溶性因子的水平的药剂的分子。抑制剂是例如结合、部分或完全阻断活性、降低、防止、延迟激活、灭活、脱敏、或下调可溶性因子的活性或表达的化合物，例如拮抗剂。抑制剂包括多肽抑制剂(例如抗体、可溶性受体等)，连同核酸抑制剂(例如siRNA或反义RNA)，可溶性因子的遗传修饰的版本，例如具有改变的活性的版本，连同天然发生的和合成的可溶性因子拮抗剂，小化学分子等。用于检测抑制剂的测定包括例如在体外、在细胞中、或细胞膜中表达可溶性因子，施用推定的拮抗剂化合物，并且然后确定对可溶性因子活性的功能效应，如在本文的其他地方所描述。
如在此使用，“指导材料”包括可以用于与本发明的组合物和方法的有用性进行交流的出版物、记录、图表、或任何其他表达介质。例如，本发明的试剂盒的指导材料可以被附加至包含本发明的核酸、肽、和/或组合物的容器上，或者与包含核酸、肽、和/或组合物的容器一起发货。可选地，指导材料可以有意与容器分开发货，这样由接收者协作性地使用指导材料和化合物。
“隔离的”是指从天然状态加以改变或远离天然状态。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽并不是“隔离的”，但是从其天然状态的共存材料部分地或完全地分离的相同和酸或肽是“隔离的”。隔离的核酸或蛋白可以按基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如像存在于宿主细胞中。
如在此使用，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。在逆转录病毒中，慢病毒是独特的，在于能够感染非分裂细胞；它们可以递送显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA中，所以它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的示例。源自慢病毒的载体提供了用来达到体内显著水平的基因转移的工具。
如在此使用，生物样品中，短语“可溶性因子的水平”典型地是指在生物样品中存在的可溶性因子的蛋白的、蛋白片段的或肽的水平的量。“可溶性因子的水平”不需要量化，而是可以简单地检测，例如由一个人主观视觉检测，与或不与来自对照样品的的水平，或对照样品的预期水平进行比较。
如在此使用，术语“调制”是指与未经治疗或未使用化合物的受试者中的反应水平相比，和/或与在其他方面相同但是未治疗的受试者中的反应水平相比，介导受试者中反应水平中的可检测增加或降低。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或反应，由此介导受试者(优选是人)中的有益治疗反应。
免疫原性组合物的“非消化道”给药包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、或胸骨内注射或输注技术。
在此可互换地使用术语“患者”、“受试者”、“个体”，并且是指无论体外还是原位，都服从在此描述的方法的任何动物、或它们的细胞。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。
如在此使用，术语“同时给药”是指以不超过约15分钟的时间间隔，例如不超过约10、5、或1分钟里的任何时间，给予联合治疗中的第一治疗和第二治疗。当同时给予第一和第二治疗时，第一和第二治疗可以包含在同一组合物中(例如包含第一和第二治疗这二者的组合物)或在分开的组合物中(例如第一治疗在一个组合物中，并且第二治疗包含在另一组合物中)。
如在此使用，术语“同时给药”是指以不超过约15分钟的时间间隔，例如不超过约10、5、或1分钟里的任何时间，给予联合治疗中的第一治疗和第二治疗。当同时给予第一和第二治疗时，第一和第二治疗可以包含在同一组合物中(例如包含第一和第二治疗这二者的组合物)或在分开的组合物中(例如第一治疗在一个组合物中，并且第二治疗包含在另一组合物中)。
如在此使用，关于一种抗体，术语“特异性结合”是指识别特异性抗原、但是基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体还可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是此类种间交叉反应性自身并不改变作为特异性的抗体的分类。在另一个示例中，特异性结合抗原的抗体还可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，此类交叉反应性自身并不改变作为特异性的抗体的分类。在一些实例中，术语“特异性结合”(specific binding或specifically binding)可以关于抗体、蛋白或肽与第二化学物种的相互作用进行使用，是指该相互作用取决于化学物种上的具体结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并且结合特定蛋白结构，而不是一般地结合蛋白。如果抗体特异性针对表位“A”，则在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少结合至抗体的标记的A的量。
术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与它的同源配体结合而诱导的初次反应，由此介导信号转导事件，例如但不局限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调，和/或细胞骨架结构的识别，等。
作为术语在此使用，“刺激分子”是指与抗原递呈细胞上存在的同源刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
如在此使用，“刺激配体”是指当存在于抗原递呈细胞(例如APC、树突细胞、B细胞、等)上时，配体可以与T细胞上的同源结合配偶体(在此称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导通过T细胞的初次反应，包括但不局限于激活、免疫反应的引发、增殖、等。刺激配体是本领域熟知的，并且在其他事物之外，涵盖加载有肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗CD-28抗体、和超激动剂抗-CD2抗体的MHC I类分子。
术语“受试者”旨在包括其中可以引起免疫反应的活的有机体(例如哺乳动物)。受试者的示例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、和它们的转基因物种。
如在此使用，“基本上纯化的”细胞是本质上不含有其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞是指已经从在其天然发生的状态下与其正常关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些实例中，一群基本上纯化的细胞是指一个同源的群的细胞。在其他实例中，这一术语简单地是指已经从在它们的天然状态下与其正常关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，在体外培养这些细胞。在其他实施方式中，不在体外培养这些细胞。
如在此使用，术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓和、或根除疾病状态，获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指将引起研究者、兽医、医师或其他临床医生正寻找的组织、系统、或受试者的生物学或医学反应的受试者化合物的量。术语“治疗有效量”包括当给予时，足够预防所治疗的失调或疾病的一种或多种病征或症状的发展或在一定程度上缓解该病征或疾病的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物，疾病和它的严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重、等而变化。
如在此使用，术语“移植物”是指引入个体的细胞、组织、或器官。移植材料的来源可以是培养的细胞、来自另一个体的细胞、或来自同一个体的细胞(例如在体外培养这些细胞后)。示例性器官移植物是肾脏、肝脏、心脏、肺、和胰脏。
作为术语在此使用，“治疗”疾病是指减少受试者经历的疾病或失调的至少一个病征或症状的频率或严重程度。
如在此使用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指一个过程，通过该过程，外源核酸被移入或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经转染了、转化了或转导了外源核酸的细胞。该细胞包括原代受试者细胞和它的后代。
范围：贯穿本披露，可以按一个范围格式呈现本发明的不同方面。应当理解的是，处于范围格式的说明仅为了方便和简洁，不应被解释为对本发明的范围的不变的限制。因此，范围的说明应被认为是已经确切地披露了所有可能的子范围连同该范围内的单独数值。例如，一个范围的说明，例如从1至6，应被认为是已经确切披露了多个子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，连同该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。这一应用无论该范围的宽度如何。
说明
本发明提供了用于治疗患者中的癌症的组合物和方法。在一个实施方式中，该治疗方法包括一线的治疗，该一线的治疗包括给予本发明的CAR至患者中，用来诱导抗肿瘤免疫反应并且监测T细胞输注后患者中的可溶性因子的水平，以便根据第一线的治疗的结果，确定适合治疗该患者的第二线的治疗的类型。
在一个实施方式中，该第二线的治疗包括在接受适当的CAR T的输注后(在本文的其他地方称为“T细胞输注后”)，评价患者中的可溶性因子谱，其中当该可溶性因子谱表明与T细胞输注前相比，T细胞输注后具体的可溶性因子中的增加时，熟练的技术人员可以选择给予有需要的患者有效量的可溶性因子抑制化合物，以管理T细胞输注后，提高的水平的可溶性因子。因此，在一个实施方式中，第二线的治疗包括给予一个类型的可溶性因子抑制治疗，以管理提高的水平的生成自使用CAR T细胞的第一线的治疗的某一可溶性因子。
仍在另一个实施方式中，涉及给予可溶性因子抑制化合物至患者的第二线的治疗可以与用于治疗、预防或管理与不希望的血管生成关联的或特征在于不希望的血管生成的疾病或失调的其他常规治疗组合。此类常规治疗的示例包括但不局限于外科手术、化疗、放射治疗、激素治疗、生物治疗和免疫治疗。
在一个实施方式中，可以将本发明的CAR工程化，以包括具有靶向融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的细胞内信号传导域的肿瘤抗原的抗原结合域的胞外域。示例性肿瘤抗原B细胞抗原是CD19，因为在恶性B细胞上表达这一抗原。然而，本发明并不局限于靶向CD19。而是，本发明包括任何肿瘤抗原结合部分。抗原结合部分优选与来自一个或多个共刺激分子和一个ζ链的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合部分与选自下组的一个或多个细胞内结构域融合，该组由以下各项组成：CD137(4-1BB)信号传导域、CD28信号传导域、CD3ζ信号域、和它们的任何组合。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括CD137(4-1BB)信号传导域。这是因为本发明部分基于以下发现：可以用添加共刺激域进一步增强CAR-介导的T-细胞反应。例如，与未工程化以表达CD137(4-1BB)的其他方面相同的CAR T细胞相比，包含CD137(4-1BB)信号传导域显著增加了CAR介导的活性和CAR T细胞的体外持久性。然而，本发明并不局限于一个特定的CAR。而是，靶向肿瘤抗原的任何CAR都可以用于本发明。在PCT/US11/64191中已经描述了制作和使用CAR的组合物和方法，将其通过引用以其全文并入于此。
方法
本发明的治疗方案导致肿瘤尺寸或疾病或疾病进展的证据的可测量的减少、完全反应、部分反应、稳定的疾病、无进展存活的增加或延长、总体存活期的增加或延长、或毒性的减小。
作为完整治疗方案的一部分，本发明涵盖第一线治疗和第二线治疗，其中第一线治疗包括给予本发明的CAR T细胞至对其有需要的患者。本发明的治疗方案允许通过评价T细胞输注后，患者中的可溶性因子谱，而管理癌症和它的治疗。适当的第二线治疗包括给予适当的可溶性因子抑制剂至患者，以减少提高的水平的生成自第一线治疗的可溶性因子。在一些实例中，适当的第二线治疗包括给予适当的可溶性因子激活剂至患者，以增加抑制的水平的生成自第一线治疗的可溶性因子。
在一个实施方式中，适当的第二线治疗包括给予适当的细胞因子抑制剂至患者，以减少提高的水平的生成自第一线治疗的细胞因子。在一些实例中，适当的第二线治疗包括给予适当的细胞因子激活剂至患者，以增加抑制的水平的生成自第一线治疗的细胞因子。
在一个实施方式中，差示水平是与正常的或对照的细胞、给定的患者群体的表达水平，或与内参相比，过表达(高表达)或表达不足(低表达)。在一些实例中，水平是在患者和正常个体之间、T细胞输注后的患者和T细胞输注前的患者之间、或在第一时间点的T细胞输注后的患者和第二时间点的T细胞输注后的患者之间进行比较。
在一个实施方式中，本发明包括评价一个或多个细胞因子的差示水平，以产生T细胞输注后的患者中的细胞因子谱，以便出于将细胞因子水平调回正常水平的目的，确定待施用至患者的细胞因子治疗的类型。因此，可以施用本发明，以鉴定由于在患者中本发明的CAR T细胞的存在而提高的细胞因子水平，这允许用细胞因子抑制剂的患者的专门化治疗，以降低提高的水平的细胞因子。在另一个实施方式中，可以施用本发明，以鉴定由于在患者中本发明的CAR T细胞的存在而降低的细胞因子水平，这允许用细胞因子激动剂的患者的专门化治疗，以增加减弱的水平的细胞因子。
在一个实施方式中，由于接受CAR T细胞输注而提高的细胞因子水平包括但不局限于IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、TNFα、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、铁蛋白、等。然而，本发明不应局限于这些列出的细胞因子。而是，本发明包括被鉴定为由于接受CAR T细胞输注，在患者中提高的任何细胞因子。
在一个实施方式中，由于接受CAR T细胞输注而降低的细胞因子水平包括但不局限于IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、TNFα、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、铁蛋白、等。然而，本发明不应局限于这些列出的细胞因子。而是，本发明包括被鉴定为由于接受CAR T细胞输注，在患者中降低的任何细胞因子。
检测细胞因子和它的治疗
虽然这一部分描述了作为第二线治疗的一部分的细胞因子检测和它的治疗，但是本发明涵盖了作为第二线治疗的一部分的任何可溶性因子的检测和它的治疗。因此，在上下文中，“细胞因子”的描述可以同样适合“可溶性因子”。
在一个实施方式中，作为第二线治疗的一部分，本发明包括检测已接受本发明的CAR T细胞的输注的患者中的细胞因子水平。在一些实施方式中，细胞因子的存在或水平可以用来选择候选治疗。在一些其他实施方式中，细胞因子的存在或水平可以用来确定在第一线治疗、第二线治疗或第一线治疗和第二线治疗者二者的过程期间或之后的成功。
其中可以检测到细胞因子的生物样品包括例如血清。在一些实施方式中，生物样品包括可以具有或可以不具有液体组分的组织活检。
免疫测定可以用来定性地或定量地分析生物样品中的细胞因子水平。可以在多个容易地可获得的手册中发现可应用技术的总体概述，这些手册例如是Harlow(哈洛)&Lane(莱恩)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，UsingAntibodies:A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)(1999)。
除了使用免疫测定来检测来自患者的生物样品中的细胞因子水平之外，可以基于具体细胞因子的基因表达水平作出细胞因子表达和水平的评定。用于确定mRNA表达的存在和/或水平的RNA杂交技术是本领域普通技术人员熟知的，并且可以用来评定感兴趣的细胞因子的基因表达的存在或水平。
在一些实施方式中，本发明的方法利用细胞因子的选择性结合配偶体来鉴定生物样品中细胞因子的存在或确定细胞因子的水平。可以与本发明的方法和试剂盒一起使用的选择性结合配偶体可以例如是抗体。在一些方面，可以使用针对具体细胞因子的单克隆抗体。在一些其他方面，针对具体细胞因子的多克隆抗体可以用来实践这些方法并且在本发明的试剂盒中。
针对细胞因子的商业抗体是可获得的，并且可以与本发明的方法和试剂盒一起使用。本领域普通技术人员熟知的是，鉴于其中使用抗体的测定，待使用的抗体的类型、来源和其他方面是要加以考虑的。在一些实例中，在蛋白印迹法上将识别其抗原靶的抗体可能适用于ELISA、ELISpot测定，并且反之亦然。
在一些实施方式中，可以使用用于生产本领域熟知的单克隆抗体或多克隆抗体的技术来生产要用于本发明的测定的抗体(参见例如Coligan(科利根)，Current Protocolsin Immunology(免疫学实验室指南)(1991)；Harlow(哈洛)&Lane(莱恩)，同上；Goding(戈丁)，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)(第二版，1986)；以及Kohler(科勒)&Milstein(米尔斯坦)，Nature(自然)256:495-497(1975)。此类技术包括通过在噬菌体或类似载体中，从重组抗体文库选择抗体的抗体制备，连同通过使兔或小鼠免疫的多克隆抗体和单克隆抗体的制备(参见例如Huse(休斯)等人，Science(科学)246:1275-1281(1989)；Ward(沃德)等人，Nature(自然)341:544-546(1989))。此类抗体可以用于治疗应用和诊断应用，例如在治疗和/或检测与在此描述的疾病或病症关联的任何特定细胞因子。
采用免疫测定的任何检测方法都特别适合在患者护理点的实践。此类方法允许患者的即时诊断和/或预测评价。护理点诊断系统描述于例如美国专利号6,267,722中，将其通过引用结合于此。其他免疫测定方式也是可供使用的，这样使得可以进行生物样品的评价而不必需发送样品至用于评价的实验室。典型地，这些测定被格式化为固体测定，其中使用一种试剂，例如抗体来检测细胞因子。描述了适合与免疫测定(例如本发明的测定)一起使用的示例性测试装置，例如在美国专利号7,189,522；6,818,455和6,656,745中。
在一些方面，本发明提供了用于检测编码生物样品中的细胞因子的多核苷酸序列的方法。如以上指出，“生物样品”是指来自患者的一个细胞或一群细胞或一定量的组织或流体。最通常的，已经从患者取出样品，但是术语“生物样品”还是可以指在体内分析的细胞或组织，即未从该患者取出。典型地，“生物样品”将包含来自患者的细胞，但是该术语还可以指非细胞的生物材料。
在一个实施方式中，基于扩增的测定被用来测量希望的细胞因子的水平。在这样一个测定中，希望的细胞因子的核酸序列充当扩增反应(例如聚合酶链式反应，或PCR)中的模板。在定量扩增中，扩增产物的量将与原始样品中的模板的量成比例。与适当的对照的比较提供了细胞因子关联基因的拷贝数的量度。定量扩增的多种方法是本领域普通技术人员熟知的。提供了用于定量PCR的详细实验方案，例如在Innis(英尼斯)等人(1990)PCRProtocols,A Guide to Methods and Applications(PCR实验方案，方法和应用的向导)，Academic Press,Inc.(学术出版社)纽约州)。RT-PCR是普通技术人员熟知的(参见例如Ausubel(奥苏贝尔)等人，同上)。在一些实施方式中，使用定量RT-PCR，例如TaqManTM测定，由此允许样品中的mRNA水平与对照样品或值进行比较。用于希望的细胞因子的已知核酸序列足以使一个技术人员能够例行地选择引物，来扩增基因的任何部分。可以使用本领域熟知的原理来设计用于扩增特定序列的适合引物(参见例如Dieffenfach(迪芬巴赫)&Dveksler(德维克斯勒)，PCR Primer:A Laboratory Manual(PCR引物：实验室手册)(1995))。
在一些实施方式中，基于杂交的测定可以用于检测生物样品的细胞中希望的细胞因子的量。此类测定包括RNA的斑点印迹分析连同其他测定，例如在包含细胞的样品上进行的荧光原位杂交。其他杂交测定是本领域容易地可获得的。
在本发明的多个实施方式中，将在生物样品中检测细胞因子多核苷酸或多肽的水平和/或存在，由此检测细胞因子的差示表达，用来与对照生物样品相比，从源自输注了本发明的CAR T细胞的患者的生物样品产生细胞因子谱。
在生物样品中检测到的细胞因子多核苷酸或多肽的量表明了细胞因子的存在，用来出于将患者分类，以便适当的细胞因子治疗的目的，产生细胞因子谱。例如，当细胞因子谱表明与对照(例如T细胞输注前)相比，T细胞输注后具体细胞因子增加时，则熟练的技术人员可以选择给予对此类管理有需要的患者有效量的细胞因子抑制化合物。可选地，当细胞因子谱表明与对照(例如T细胞输注前)相比，T细胞输注后具体细胞因子降低时，则熟练的技术人员可以选择给予对此类管理有需要的患者有效量的细胞因子激动剂化合物。
在一些实施方式中，T细胞输注后样品和对照样品之间的细胞因子水平中的差异在约0.5、1.0、1.5、2、5、10、100、200、500、1000倍。
本发明的方法还可以用于评定疗程的功效。例如，在包含提高的量的细胞因子IL-6的T细胞输注后患者中，可以通过随时间监测IL-6，来评定抗-IL-6治疗的功效。例如，与取自在治疗之前或在治疗早期的哺乳动物的样品中的水平相比，在取自治疗后的患者的生物样品中IL-6多核苷酸或多肽水平中的减少表明了有效的治疗。
在一个实施方式中，治疗方案可以基于中和提高的细胞因子。例如可以选择细胞因子的拮抗剂用于治疗。抗体是适合的拮抗剂的示例并且包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、和人抗体或它们的片段。嵌合抗体是已经典型地通过基因工程，从属于不同物种的免疫球蛋白基因区段构建了它的轻链和重链基因的抗体，(参见例如Boyce(博伊斯)等人，Annals of Oncology(肿瘤学年报)14:520-535(2003))。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变(V)区段可以连接至人恒定(C)区段。因此，典型的嵌合抗体是由来自小鼠抗体的V或抗原结合域和来自人抗体的C或效应子区域组成的杂蛋白。
人源化抗体具有基本上来自人抗体(称为受体抗体)的可变区框架残基和基本上来自小鼠抗体(称为供体免疫球蛋白)的互补决定区。参见Queen(昆)等人Proc.NatL.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)86:10029-10033(1989)和WO90/07861、美国专利号5,693,762、美国专利号5,693,761、美国专利号5,585,089、美国专利号5,530,101以及Winter(温特)，美国专利号5,225,539。如果存在，这一个或多个恒定区还基本上或完全来自人免疫球蛋白。除了其他来源，可以使用具有人免疫系统的转基因小鼠(Lonberg(朗伯格)等人，WO 93/12227(1993))，通过常规杂交瘤方法、噬菌体展示(参见例如Dower(道尔)等人，WO 91/17271和McCafferty(麦卡弗蒂)等人，WO 92/01047)获得抗体。编码免疫球蛋白链的核酸可以获得自产生抗体的杂交瘤或细胞系，或基于公开的文献中的免疫球蛋白核酸或氨基酸序列。
希望的细胞因子的其他拮抗剂还可以用于治疗目标。例如，可以用于本发明的目标的一类拮抗剂是细胞因子受体的可溶形式。仅出于说明性目的，IL-6拮抗剂是特异性结合IL-6的抗-IL-6抗体。特异性抗体具有全身地抑制或对抗IL-6的作用的能力。在一些实施方式中，抗体结合IL-6并且防止它与它的受体(例如IL-6Rα或IL-6Rβ)相互作用或激活这些受体。在一些实施方式中，可以通过使用针对白介素-6受体(IL-6R)的拮抗剂来对抗IL-6的活性。美国申请号2006251653描述了用于治疗白介素-6相关疾病的方法并且披露了多个白介素-6拮抗剂，包括例如人源化抗-IL-6R抗体和嵌合抗-IL-6R抗体。在一些实施方式中，IL-6或IL-6R衍生物可以用于阻断并且对抗IL-6/IL-6R之间的相互作用。
本发明并不局限于在此描述的这些细胞因子和它们的对应的激动剂和抑制剂。而是，本发明包括使用任何用于本领域的细胞因子激动剂和/或抑制剂，以调制细胞因子。这是因为本发明基于在接受本发明的CAR T细胞输注的患者中管理癌症治疗，其中输注的CART细胞导致增加和降低水平的不同细胞因子。本领域普通技术人员基于在此呈现的披露内容：与对照样品相比，T细胞输注后样品中细胞因子的差示表达水平可以被靶向用于治疗，以便使细胞因子水平增加或降低至正常水平。
治疗应用
本发明涵盖转导了慢病毒载体(LV)的细胞(例如T细胞)。例如，LV编码组合特异性抗体的抗原识别域与CD3-ζ、CD28、4-1BB或它们的任何组合的细胞内结构域的CAR。因此，在一些实例中，转导的T细胞可以引起CAR介导的T-细胞反应。
本发明提供了CAR用来将初始T细胞的特异性重新定向至肿瘤抗原的用途。因此，本发明还提供了用于刺激T细胞-介导的免疫反应，用来在哺乳动物中靶向细胞群体或组织的方法，该方法包括将表达CAR的T细胞给予至哺乳动物的步骤，其中CAR包括与预先确定的靶特异性相互作用的结合部分、包括例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分、和共刺激信号传递区。
在一个实施方式中，本发明包括一个类型的细胞治疗，其中遗传修饰T细胞，以表达CAR，并且将CAR T细胞输注到对其有需要的接受者中。输注的细胞能够杀死接受者中的肿瘤细胞。不像抗体治疗，CAR T细胞能够在体内复制，导致长期的持久性，该持久性导致持续的肿瘤控制。
在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可以经历在体内强大的T细胞表达，并且可以持续延长量的时间。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞演化为特异性记忆T细胞，这些特异性记忆T细胞可以再激活，以抑制任何额外的肿瘤形成或生长。例如，出乎意料的是，本发明的CART19细胞可以经历体内强大的T细胞扩张，并且在血液和骨髓中以高水平持续延长量的时间，并且形成特异性记忆T细胞。不希望受任何具体理论约束，当遇到并且随后消除表达替代抗原的靶细胞时，CAR T细胞可以在体内分化为中心记忆样状态。
不希望受任何具体理论约束，由CAR-修饰的T细胞引起的抗肿瘤免疫反应可以是主动的或被动的免疫反应。此外，CAR介导的免疫反应可以是过继性免疫治疗方法，其中CAR-修饰的T细胞诱导特异性针对CAR中的抗原结合部分的免疫反应。例如，CART19细胞引起特异性针对表达CD19的细胞的免疫反应。
尽管在此披露的数据确切地披露了包含源自FMC63鼠单克隆抗体的抗-CD19scFv、人CD8α铰链和跨膜结构域、以及人4-1BB和CD3ζ信号传导域的慢病毒载体，但是本发明不应被解释为包括针对如在本文的其他地方描述的构建体的多个组分的每一个的任何数量的变化。即，本发明包括使用CAR中任何抗原结合部分，以产生特异性针对该抗原结合部分的CAR-介导的T-细胞反应。例如，出于治疗癌症的目的，本发明的CAR中的抗原结合部分可以靶向肿瘤抗原。
可以治疗的癌症包括未血管化的、或基本上仍未血管化的肿瘤，连同血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。要用本发明的CAR治疗的癌症的类型包括但不局限于恶性肿瘤(carcinoma)、母细胞瘤、和肉瘤，以及某些白血病或淋巴的恶性肿瘤(malignancies)，良性的和恶性的肿瘤，以及恶性肿瘤(malignancies)，例如肉瘤、恶性肿瘤(carcinomas)和黑色素瘤。还包括成体肿瘤/癌症和幼体肿瘤/癌症。
血液学癌症是血液或骨髓的癌症。血液学的(或血源性的)癌症包括白血病，白血病包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、单核细胞性白血病以及红白血病)，慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞的)白血病、慢性骨髓性白血病、和慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金氏病，非何杰金氏淋巴瘤(顽固并且高级的形式)，多发性骨髓瘤，沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症，重链病，骨髓增生异常综合症，多毛细胞白血病以及骨髓增生异常。
实体瘤是通常并不包含囊肿或液体区域的组织的异常包块。实体瘤可以是良性的或恶性的。针对形成它们的细胞类型，命名了不同类型的实体瘤(例如肉瘤、恶性肿瘤(carcinomas)、和淋巴瘤)。实体瘤(例如肉瘤和恶性肿瘤(carcinomas))的示例包括纤维肉瘤，含有粘液瘤组织的肉瘤，脂肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤，皮脂腺癌，乳头状癌，睾丸网乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，维尔姆斯氏肿瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤，以及CNS肿瘤(例如神经胶质瘤(例如脑干胶质瘤和混合型胶质瘤)，成神经胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形胶质细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，髓膜瘤，成神经细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移)。
在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分的部分被设计为用来治疗具体的癌症。例如，被设计为靶向CD19的CAR可以用来治疗癌症和失调，这些癌症和失调包括但不局限于前体B ALL(幼体适应症)、成体ALL、套细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、抢救后异基因骨髓移植、等。
在另一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向CD22，以治疗弥散性大B细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，癌症和失调包括但不局限于前体-B ALL(幼体适应症)、成体ALL、套细胞淋巴瘤、弥散性大B-细胞淋巴瘤、抢救后异基因骨髓移、等，可以使用靶向CD19、CD20、CD22的CAR和ROR1的组合对它们进行治疗。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向间皮素，以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向CD33/IL3Ra，以治疗急性骨髓性白血病等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向c-Met，以治疗三阴性乳癌、非小细胞肺癌、等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向PSMA，以治疗前列腺癌等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向糖脂F77，以治疗前列腺癌等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向EGFRvIII，以治疗成胶质细胞瘤等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向GD-2，以治疗成神经细胞瘤、黑色素瘤、等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向NY-ESO-1TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤、等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向MAGE A3 TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤、等。
然而，本发明不应被解释为仅局限于在此披露的抗原靶和疾病。而是，本发明应被解释为包括与一种疾病关联的任何抗原性靶，其中CAR可以被用来治疗该疾病。
本发明的CAR介导的T细胞还可以用作一个类型的疫苗，用于哺乳动物中的先体外后体内免疫和/或体内治疗。优选地，该哺乳动物是人。
关于离体免疫，在给予细胞进入哺乳动物之前，在体外发生以下项中的至少一个：i)这些细胞的扩张，ii)将编码CAR的核酸引入这些细胞，和/或iii)这些细胞的冷冻保存。
离体程序是本领域熟知的，并且将在以下更充分地讨论。简要地，从哺乳动物(优选是人)分离细胞，并且用表达在此披露的CAR的载体进行遗传修饰(即体外转导或转染)。可以将CAR-修饰的细胞给予至哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人，并且CAR-修饰的细胞可以相对于该接受者是自体的。可选地，这些细胞相对于该接受者是异源的、同系的或异种的。
用于造血干细胞和祖细胞的离体扩张的程序描述于美国专利号5,199,942中，通过引用将其结合于此，可以适用于本发明的细胞。其他适合的方法是本领域已知的，并且因此本发明并不局限于细胞的离体扩张的任何具体方法。简要地，T细胞的离体培养和扩张包括：(1)从哺乳动物，从周围血液收集物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩张此类细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子，其他因子，例如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体可以被用于培养和扩张这些细胞。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗，本发明还提供了用于体内免疫的组合物和方法，以引起针对患者中的抗原的免疫反应。
一般而言，如在此所述激活并且扩张的细胞可以用于治疗和预防免疫受损的个体中出现的疾病。具体地，本发明的CAR-修饰的T细胞被用于治疗CCL。在某些实施方式中，本发明的细胞被用于治疗具有发展CCL的风险的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防CCL的方法，该方法包括对其有需要的受试者一个治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
可以单独给予本发明的CAR-修饰的T细胞，或与稀释剂和/或与其他组分，例如IL-2或其他细胞因子或细胞群体组合，作为药物组合物给予本发明的CAR-修饰的T细胞。简要地，本发明的药物组合物可以包括如在此所述的靶细胞群体，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包括缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；辅助剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。优选配制本发明的组合物用于静脉给予。
可以按适合待治疗的(或待预防的)疾病的方式，给予本发明的药物组合物。给予的量和频率将由以下因素决定，例如患者的病症、患者的疾病的类型和严重程度，虽然可以通过临床试验确定适当的剂量。
当表明“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”、或“治疗量”时，可以由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度、和病症的个体差异，确定待给予的本发明的组合物的明确的量。可以大体上阐明的是，可以按以下剂量：104至109个细胞/kg体重、优选105至106个细胞/kg体重(包括那些范围内的整数值)，给予包含在此所述的T细胞的药物组合物。还可以按这些剂量，多次给予T细胞组合物。可以通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术，可以这些细胞(参见例如Rosenberg(罗森伯格)等人，NewEng.J.of Med.(新英格兰医学杂志)319:1676，1988)。可以通过监测患者的疾病病征并且因此调整治疗，由医药领域的普通技术人员容易地确定用于具体患者的最佳剂量和治疗方案。
在某些实施方式中，可能希望给予激活的T细胞至受试者，并且随后重新抽血(或进行血液成分分离)，根据本发明激活其中的T细胞，并且用这些激活并且扩张的T细胞重新输注患者。可以每数个星期，进行这一过程多次。在某些实施方式中，可以从10cc至400cc的抽取血液中激活T细胞。在某些实施方式中，可以从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc的抽取血液中激活T细胞。不受理论约束，使用这一多次抽血/多次重新输注实验方案可以用于选择出某些群体的T细胞。
可以按任何方便的方式进行受试者组合物的给予，包括通过喷雾、注射、摄食、输液、植入或移植。可以将在此描述的组合物皮下地、皮内地、瘤内地、结内地、髓内地、肌内地、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内地给予至患者。在一个实施方式中，通过皮内注射或皮下注射，将本发明的T细胞组合物给予至患者。在另一个实施方式中，优选通过i.v.注射，给予本发明的T细胞组合物。可以将T细胞组合物直接注射进肿瘤、淋巴结、或感染部位。
在本发明的某些实施方式中，使用在此描述的方法，或本领域已知的其他方法激活和扩张细胞，其中扩张T细胞至治疗水平，并且结合(例如在之前、同时或之后)任何数量的相关治疗方式给予至患者，这些相关治疗方式包括但不局限于用药剂治疗，例如抗病毒治疗、西多福韦和白介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或用于MS患者的那他珠单抗治疗或用于银屑病患者的依法珠单抗治疗或用于PML患者的其他治疗。在另外的实施方式中，可以与化疗，放射，免疫抑制剂(例如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)，抗体或其他免疫消融药剂(例如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体治疗)，细胞毒素，氟达拉滨，环孢霉素，FK506，拉珀霉素，霉酚酸，甾类，FR901228，细胞因子，以及辐射组合，使用本发明的T细胞。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶calcineurin(钙调神经磷酸酶)(环孢霉素和FK506)，抑或抑制对于生长因子诱导的信号传递而言重要的p70S6激酶(拉珀霉素)(Liu(刘)等人，Cell(细胞)66:807-815，1991；Henderson(亨德森)等人，Immun.(免疫学)73:316-321，1991；Bierer(比勒)等人，Curr.Opin.Immun.(免疫学新观点)5:763-773，1993)。在另外的实施方式中，结合(例如在之前、同时或之后)骨髓移植、使用任一化疗剂(例如氟达拉滨)的T细胞消融治疗、外束放射治疗(XRT)、环磷酰胺、或抗体(例如OKT3或CAMPATH)，将本发明的细胞组合物给予至患者。在另一个实施方式中，在B-细胞消融治疗，例如与CD20反应的药剂，例如美罗华之后，给予本发明的细胞组合物。例如，在一个实施方式中，受试者可以经历标准治疗，其中高剂量化疗之后是外周血干细胞移植。在某些实施方式中，在移植后，受试者接受本发明的扩张的免疫细胞的输注。在一个额外的实施方式中，在外科手术之前或之后给予扩张的细胞。
待给予至患者的以上治疗的剂量将随正治疗的病症的明确性质和治疗的接受者而变化。可以根据本领域习惯做法进行用于人类给予的剂量的缩放。例如对于成体患者，CAMPATH的剂量一般在1至约100mg的范围内，通常每天给予，持续1和30天之间的一个时期。优选的每天剂量是每天1至10mg，虽然在一些实例中，可以使用高达40mg每天的更大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。
细胞因子释放综合征(CRS)的治疗
本发明部分基于以下发现：CART19细胞的体内增殖和与其关联的强力抗肿瘤活性还与导致嗜血细胞性淋巴组织增生症(HLH)(也称为巨噬细胞活化综合征(MAS))的CRS关联。不希望受任何具体理论约束，认为MAS/HLH是与CART19强力抗肿瘤活性关联的并且可能是该活性所需的独特生物标记。
因此，本发明提供了包括给予本发明的CAR进入患者的第一线的治疗，和包括给予一个类型的治疗的第二线的治疗，以管理生成自使用CAR T细胞的第一线的治疗的提高的水平的某些可溶性因子。
在一个实施方式中，第二线的治疗包括用于治疗CRS的组合物和方法。CRS的症状包括高烧、恶心、暂时的低血压、低氧、等。本发明基于以下观察：CART19细胞诱导患者中提高水平的可溶性因子，包括但不局限于IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6。因此，第二线的治疗包括针对生成自给予CART19细胞的提高的细胞因子，用于中和这些作用的化合物和方法。在一个实施方式中，中和剂能够抵消细胞因子表达/活性的不希望的一致爆发，并且因此对预防、改善和治疗与CART19治疗关联的CRS是有用的。
在一个实施方式中，在CART19细胞输注后约第10-12天进行CRS的治疗。
在一个实施方式中，第二线的治疗包括给予一种甾体至患者。在另一个实施方式中，第二线的治疗包括给予更多的甾体、TNFα的抑制剂、和IL-6的抑制剂中的一种或多种。TNFα抑制剂的示例是依那西普。IL-6抑制剂的示例是塔西单抗(toc)。
实验实施例
进一步参考以下实验实施例来详细描述本发明。仅出于说明的目的提供这些实施例，并不旨在是限制性的，除非另外说明。因此，本发明绝不应理解为局限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于在此提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。
不做进一步描述，认为本领域普通技术人员可以使用以上描述和以下说明性实施例，制造并且利用本发明的化合物并且实践所要求的方法。因此，以下工作实施例确切地指出了本发明的优选实施方式，并且不被解释为以任何方式限制本披露的剩余部分。
实施例1：与CAR T细胞输注组合的细胞因子治疗
在此呈现的结果证明，在输注CAR T细胞后，患者显示出差示表达水平的不同细胞因子。在一些实例中，提高水平的一些细胞因子是由于输注的CAR T细胞的毒性(图1)。观察到塔西单抗(抗-IL6)可以改善多个CAR的毒性，并且表面上地保护了2个患者中全部2人中的抗肿瘤作用(图2)。不希望受任何具体理论约束，认为阿那白滞素和阻断IL-1的其他试剂在这方面也可以是有用的。在此呈现的数据还证明IL-1在患者中提高，并且这会导致稍后IL-6升高。阿那白滞素是与IL1受体结合的并且阻断IL-1α和β信号传递这二者的IL-1Ra重组蛋白。阿那白滞素具有短的1/2寿命。有利的是使用阿那白滞素来开始治疗患者，因为IL-1α和β都会被阻断，并且还减轻了细胞因子风暴，并且保持抗肿瘤作用。
还观察到，如通过穿孔素和IFN-γ测量，抗体干预并不赋予CART19细胞功能性(图3)。
实施例2：CD19-重定向的嵌合抗原受体T(CART19)细胞诱导细胞因子释放综合征 (CRS)以及可以由IL-6拮抗剂塔西单抗(toc)管理的可治疗的巨噬细胞活化综合征(MAS)的 诱导
CART19细胞的输注导致体内100至100,000x的增殖，肿瘤溶解综合征，随后是持久的抗肿瘤活性，以及在患有B细胞肿瘤的患者中的延长的持久性。在此呈现的这些结果证明，CART19细胞的体内增殖和由此而来的强力抗肿瘤活性与导致嗜血细胞性淋巴组织增生症(HLH)(也称为MAS)的CRS关联。不希望受任何具体理论约束，认为MAS/HLH是与强力抗肿瘤活性关联的并且可能是该活性所需的独特生物标记。
将由抗CD19 scFv/4-1BB/CD3-ζ组成的CAR用慢病毒转导自体的T细胞，将这些T细胞用抗-CD3/抗CD28珠粒离体激活/扩张，并且然后在2-8次先前治疗后，用这些T细胞输注进患有持久的疾病的ALL或CLL患者。还在具有高水平的人ALL/人T细胞移植的异种移植小鼠模型中将CART19抗ALL活性建模，并且使用2色生物发光成像同时检测CAR T细胞和ALL。
在此呈现的结果提供了接受CART19细胞的10个患者的更新结果，这10个患者包括9个患有CLL的患者和患有复发难治的ALL的1个幼体患者。6/9的可评价患者具有完全恢复(CR)或部分恢复(PR)，包括4个持续的CR。尽管不存在急性输注毒性，但是所有响应的患者还是发展了CRS。都患有高烧，连同3或4级的低血压/低氧。CRS之后是CART19细胞的峰值血液表达，并且然后是强度增加，直至CART19细胞峰值(输注后D10-31)。ALL患者经历了最显著的毒性，具有4级低血压和呼吸衰竭。在D6的甾体治疗并未导致改善。在D9，TNFα和IL-6的值得注意的高水平(基线上方的峰值增加：IFNγ在6040x；IL-6在988x；IL-2R在56x，IL-2在163x和TNFα在17x)，给予TNFα和IL-6拮抗剂(依那西普和toc)。这导致在12hr内发烧和低血压的解决，以及从呼吸机支持迅速切断至房间空气。这些干预对CART19细胞表达或功效：发生在D11上的CAR T峰值(2539个CAR+细胞/uL；通过流动77％的CD3细胞)没有明显影响，并且与示出65％母细胞的她的初始研究骨髓相比，D23骨髓示出具有阴性最小残留疾病(MRD)的CR。虽然她没有CNS ALL病史，但是脊液示出可检测的CART19细胞(21个淋巴细胞/mcL；78％CAR+)。在输注后4mo，这一患者仍然在CR中，其中在血液中是17个CART19细胞/uL，并且在骨髓中是31％CAR+CD3细胞。
随后的响应患者的临床评定示出都具有MAS/HLH的证据，包括铁蛋白的提高和HLH的组织学证据。峰值铁蛋白水平范围是从44,00至605,000，之后并且继续是峰值T细胞增殖。其他一致的发现包括与疾病和中度DIC无关的迅速发作的肝脾肿大。
随后地，3个CLL患者还已经用toc治疗，还快速并且惊人地解决了高烧、低血压和低氧。一个患者在D10接受了toc，并且伴随CART19扩张，达到了CR。另一个患者在第9天的toc给予后，迅速解决了CRS，并且对反应的随访太短。第三个CLL患者在D3接受了toc，针对早期发烧，并且不具有CART-19增殖，也没有反应。
为了给细胞因子的阻断的时间测量建模，建立了使用生物发光原发性幼体ALL的异种移植物，并且然后用来自临床制造的另外的细胞进行治疗。CART19细胞增殖并且导致延长的存活。在T细胞输注前，用toc进行了细胞因子阻断，和/或依那西普用输注的CART19细胞的更少体内增殖消除了疾病对照，证实了在给予早期toc(D3)的一个患者中看到的结果。
CART19 T细胞可以产生大量体内扩张、长期持久性、以及抗肿瘤功效，但是还诱导了具有暗示迅速响应细胞因子阻断的MAS/HLH的特征的显著CRS。在显著CART19增殖的启动前给予，TNFα和/或IL-6的阻断可以干扰增殖和效应子功能，但是如果在细胞增殖进行中的一个点给予，则toc可以改善已经观察到与强大的临床反应关联的症状。
实施例3用嵌合抗原受体表达T细胞缓和ALL：
在此呈现的结果证明，在急性淋巴细胞白血病中(ALL)，CAR T细胞具有临床活性。简要地，用转导了抗CD19抗体和T-细胞信号传递分子的106至107个/kg的T细胞(CTL019 CART细胞；也称为CART19)治疗患有复发并且难治的前体-B细胞ALL的两个幼体患者。在全部两个患者中，CTL019 T细胞扩张了多于1000倍，并且送至骨髓。此外，CAR T细胞能够跨越血脑屏障，并且如在脑脊液中测量，以高水平持续至少6个月。注意到八个严重的不良事件。全部两个患者都发展了细胞因子释放综合征(CRS)和B细胞发育不全。在一个儿童中，CRS是严重的，并且在逆转该综合征中，用依那西普和塔西单抗的细胞因子阻断是有效的，并且仍未阻止CAR T细胞扩张和抗白血病功效。在全部两个患者中都观察到完全缓和，并且在治疗后9个月时，在一个患者中病情不间断。在治疗后约2个月，另一个患者复发，其中母细胞不再表达CD19。
在此呈现的结果证明，CAR修饰的T细胞能够在体内杀死甚至侵犯性的难治性急性白血病细胞。不再表达靶的肿瘤细胞的出现表明，在一些患有ALL的患者中，除了CD19，需要靶向其他分子。
如已经报道(Porter(波特)等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)365:725-33；Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)，在患有CLL的3个患者中，CTL019(CART19)细胞的体内表达和强大的抗白血病作用。CTL019是包括CD137(4-1BB)信号传导域的CAR，并且使用慢病毒载体技术对其进行表达(Milone(米龙)等人，1009，Mol Ther(分子治疗)17:1453-64)。在此呈现的结果证明，在2个患有难治并且复发的ALL的幼体患者中，CTL019的用途。全部两个患者都具有白血病的缓和，伴随送至骨髓和CNS的体内CTL019的强大表达。抗白血病作用是强力的，因为患者患有化疗难治的疾病，阻碍了异源供体干细胞移植，并且另一个患者在异源脐带血移植后复发，并且对blinatumomab(一种药物)(嵌合的双特异性抗-CD3和抗-CD19)治疗有抗性。
现在描述在这些实验中采用的材料和方法。
材料和方法
CART19
先前已经报道了CTL019(CART19)生产(Porter(波特)等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)365:725-33；Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science TranslationalMedicine(科学转化医学)3:95ra73)。如先前报道，在患者样本中检测并且量化CTL019(Porter(波特)等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)365:725-33；Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)。
样品抽取和加工
在淡紫色顶部vacutainer管(K2EDTA)或红色顶部(无添加剂)vacutainer管(Becton Dickinson公司)中收集样品(周围血液、骨髓)。在加工前，本质上如所述(Olson(奥尔森)等人，2011，J Transl Med(转化医学杂志)9:26)，在抽取的2小时内将淡紫色顶部管递送至实验室，或在保温容器中，在室温下发货过夜。根据建立的实验室SOP，在30分钟内加工样品。如所述(Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)，对周围血液和骨髓单核细胞进行纯化、加工，并且储存在液氮中。在抽取2小时内(包括凝固时间)加工红色顶部管；通过离心分离血清，分装为单次使用的100μL的等分部分，并且储存在-80℃。在抽吸30分钟内将CSF递送至实验室，并且通过CSF流体的离心收集CSF中的细胞，并且对这些细胞进行加工，用于DNA和流式细胞术。
Q-PCR分析
在淡紫色顶部BD vacutainer管(K2EDTA)(Becton Dickinson公司)中收集全血和骨髓样品。如所述(Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)，从全血直接分离基因组DNA，针对周围血液和骨髓样品，每个时间点使用200ng基因组DNA，并且针对CSF样品，每个时间点使用18-21.7ng基因组DNA，使用ABITaqman技术和经验证测定，大量进行关于基因组DNA样品的Q-PCR分析，以检测整合的CD19CAR转基因序列。为了确定每单位DNA的拷贝数，产生8个点的标准曲线，由插入100ng的非转导的对照基因组DNA的5至106个拷贝的CTL019慢病毒质粒组成。对于所有可量化的值，用小于0.95％的％CV一式三份评价每个数据点(样品、标准曲线)，在3/3个重复中，具有正的Ct值。如所述(Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)，使用来自周围血液和骨髓的20ng输入基因组DNA(对于CSF样品是2-4.3ng)，以及特异性针对CDKN1A基因上有的非转录基因组序列的引物/探针组合，进行平行扩增反应，以控制研究的DNA的质量。这些扩增反应产生了校正因子(CF)，以校正计算的DNA输入对比实际的DNA输入。根据以下公式计算每微克DNA的转基因的拷贝数：从每输入DNA(ng)的CTL019标准曲线计算的拷贝数x CF x 1000ng。由通过Q-PCR，量化输注的细胞产物的标记的能力，确定这一测定的准确度。对于CHOP-100，这些盲确定分别产生了11.1％和11.6％的Q-PCR值和流动标记值，以及分别是20.0％和14.4％，是CHOP-101输注产物的标记。
可溶性因子分析
在红色(无添加剂)BD vacutainer管(Becton Dickinson公司)中收集全血，使用建立的实验室SOP加工以获得血清，分装用于单次使用，并且储存在-80℃。使用Luminex珠粒测定技术，和从Life technologies公司(Invitrogen公司)购买的试剂盒，进行可溶性细胞因子的因子的量化。按制造商实验方案，使用3倍稀释系列产生9点标准曲线，用该标准曲线进行测定。一式两份评价2个外部标准点，并且5个内部标准按照单倍；以1:2稀释，一式两份评价所有样品；针对两份测量的计算的％CV小于15％。用百分比表示FlexMAP-3D上获得的数据，并且使用XPonent 4.0软件和5-参数逻辑回归分析进行分析。由80％-120％(观察值/期望值)范围确定标准曲线量化范围。报告的值包括在标准曲线范围内的那些和通过逻辑回归分析计算的那些。
抗体试剂
以下抗体用于这些研究：MDA-CAR(Jena(耶拿)和Cooper(库珀)，2013，L.针对CD19的抗独特型抗体。PlosONE(公共科学图书馆期刊)2013；印刷中)，针对共轭至Alexa647的CD19 CAR的鼠抗体。针对多参数免疫分型的抗体：T细胞检测组：抗-CD3-FITC、抗-CD8-PE、抗-CD14-PE-Cy7、抗-CD16-PE-Cy7、抗-CD19-PE-Cy7、抗-CD16-PE-Cy7。B细胞检测组：抗-CD20-FITC、抗-CD45-PE、抗-CD45-APC、抗-CD19-PE-Cy7、抗-CD19-PE、抗-CD34-PCP-e710和抗CD34-APC，都购买自e-Biosciences公司。
多参数流式细胞术
在菲可帕克加工后，直接通过流式细胞术评价细胞，除了在冷冻保存的样品的溶解后立即评价的CHOP-101基线样品。如在本文中所述，使用每个病症约0.2-0.5x 106个总细胞(取决于样品中的细胞产率)，并且针对CSF样品，使用痕量的在CSF流体的离心后收集的细胞，并且使用荧光扣除对照(FMO)染色，进行针对周围血液和骨髓样品的多参数免疫分型。使用制造商推荐的抗体和试剂浓度，在冰上，在100μL PBS中染色细胞30分钟，洗涤，并且再悬浮在0.5％多聚甲醛中，并且使用装备有蓝色(488)和红色(633nm)激光的Accuri C6流式细胞分析仪进行获取。以FCS文件格式输出Accuri文件，并且使用FlowJo软件(版本9.5.3，Treestar)进行分析。使用单抗体染色和BD补偿珠粒(Becton Dickinson公司)建立补偿值，并且通过软件进行计算。对T细胞的门控策略如下：活细胞(FSC/SSC)>dump通道(CD14+CD16+CD19-PECy7)对比CD3+>CD3+。对B细胞的门控策略如下：活细胞(FSC/SSC)>SSC低事件>CD19+。在单独的图中描述了针对CHOP-100和CHOP-101样品的更多门控细节。
分子MRD分析
由Adaptive Biotechnologies公司(西雅图，华盛顿州)和使用基于IlluminaHiSeq/MiSeq平台的免疫SEQ测定的BCR IGH CDR3区的高通量下一代测序进行分子MRD分析(Larimore(拉里莫尔)等人，2012，J Immunol(免疫学杂志)189:3221-30)。对于这些分析，701-6,000ng(约111,000-950,000基因组当量)的分离自获得自患者的全血或骨髓样品的基因组DNA经受组合的多重PCR和测序，随后是算法分析，以量化样品中单独的IGH CDR3序列。进行每个样品中TCRB CDR3区的平行扩增和测序(Robins(罗宾斯)等人，2009，Blood(血液)114:4099-107)以评定DNA样品的质量。对于每个患者，使用EMBL-EBI多重序列比对工具对测定自不同时间点的样品的IGH CDR3核苷酸序列进行比对(Goujon(古戎)等人，2010，Nucleic Acids Res(核酸研究)38:W695-9；Sievers(西弗斯)等人，2011，Mol Syst Biol(分子系统生物学)7:539)。跨越在以下时间点样品中测定的IGH CDR3序列在生物信息学上追踪来自最早时间点样品的优势克隆，以鉴定具有95％或更大逐对序列一致性的序列的存在。对于每个时间点，报告了对类似于优势克隆的那些序列的总测序读数。
现在描述实验的结果。
病例报告
CHOP-100是处于她的ALL的第二次复发中的7岁女孩。她在2年前确诊，并且达到了最小残留疾病(MRD)的阴性缓和，在确诊后17个月复发。她在再诱导化疗后重新进入缓和，但是在4个月后复发，此后她并不响应furtheclofaribine(一种药物)/依托泊苷/环磷酰胺。她在基线的核型为48,XX,del(9)(p21.3),+11,del(14)(q2？q24),+16/46,XX[4]。通过在强化疗之前的血液成分分离获得外周血单核细胞(PBMC)，预期可能存在不足的循环T细胞可供用于此类强治疗后的细胞制造。如以前所述(Porter(波特)等人，2011，N Engl JMed(新英格兰医学杂志)365:725-33；Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science TranslationalMedicine(科学转化医学)3:95ra73)，按经3个连续天给予的3.8x 108个细胞/kg(1.2x 107个CTL019细胞/kg)的总剂量，这一患者输注有已经进行抗CD3/CD28扩张并且慢病毒转导以表达抗CD19 CAR的CTL019细胞。在她的CTL019输注前，她并没有接受淋巴细胞消耗性化疗，其中在CTL019输注前6轴，给予了最近的细胞毒性治疗。注意到没有立即的输注毒性，但是她因为在第4天前进展为高烧的低级别发烧而住院，并且在第5天，患者转移至儿科ICU(CHOP-100，图4A)。这随后是迅速进展至显著的呼吸和心血管危害，需要机械通气和血压支持。
第二个ALL个患者是10岁女孩(CHOP-101)，她在确诊后28个月和CTL019输注前10个月，已经经历了4/6配对的非亲缘性脐带移植后的第二次复发。她在她的移植后，已经经历了移植物抗宿主疾病(GVHD)，用治疗解决了这一疾病；她在她的复发时，摆脱了免疫抑制。尽管进行了多次细胞毒性的和生物的治疗，她并没有随后重新进入缓和。她的基线核型为46XX,del(1)(p13),t(2；9)(q？21；q？21),t(3；17)(p24；q23),del(6)(q16q21),del(9)(q13q22),der(16)t(1；？；16)(p13；？p13.3)[9],//46,Xy[1]。在PBMC收集前，用两个周期的blinatumomab(一种药物)对她进行治疗(Bargou(巴戈)等人，2008，Science(科学)321:974-7)，没有反应。在PBMC收集时，她的周围血液细胞的68％是供体来源的。在前一周给予依托泊苷/环磷酰胺化疗用于淋巴细胞消耗后，制造CTL019 T细胞并且按单次剂量中107个细胞/kg(1.4x 106个CTL019细胞/kg)的总剂量进行输注。在CTL019输注前一天，它的骨髓被取代为一群CD19+/CD34+ALL细胞，通过标准临床流式细胞术(图7)，这些细胞具有CD19的可变表达。她没有立即的输注毒性，但是在D+6天发烧，并且住院。她没有经历心肺毒性，并且并没有接受糖皮质激素类或抗细胞因子治疗。CHOP-101经历了未知原因的发烧，怀疑是由于细胞因子释放(图4B)，肌痛，以及自发解决的两天的精神错乱(3级)。在输注CTL019细胞后，她没有GVHD的证据。虽然已经从患者收集这些细胞，但是它们仍很大程度上是供体(脐带血)来源的。
全部两个受试者中的缓和的诱导
如描绘总WBC、ALC和ANC相对于CTL019输注的时间测量的图所示，在CTL019输注后2周内，全部两个受试者都具有循环的淋巴细胞和中性粒细胞的增加(图4C)。在图5中更详细地示出，多数淋巴细胞由表达嵌合抗原受体的T细胞组成(图8)。在全部两个受试者中，记录了高级非传染性发烧，随后是LDH的提高(图4A)。LDH的提高和高级发烧类似于在CTL019输注后，CLL患者中先前描述的那些(Porter(波特)等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)365:725-33；Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)。输注后约一个月，在全部两个受试者中都达到了白血病的MRD阴性(<0.01％)形态学缓和(表1)。
CHOP-100中的临床缓和与截止2013年1月的已经持续至少9个月的深度分子缓和关联(表1)。IGH基因座的高流量DNA测序揭示，在CHOP-100的血液和骨髓中，在D+23天，总IGH读数的显著降低。在D+180天测序的多于1百万个细胞当量中，在血液和骨髓中未检测到恶性克隆。相比之下，在血液和骨髓中容易地检测到T细胞受体序列，表明在所有时间点测试的DNA的完整性。
表1：CHOP-100和101的血液和骨髓中分子缓和的诱导
Figure BDA0002393935440000291
Figure BDA0002393935440000301
对分离自全血或骨髓的DNA进行最小残留疾病的分子分析
CTL019的毒性
在表2中总结了3级和4级不良事件。在全部两个患者中都观察到急性毒性，其组成为发烧，以及演化为巨噬细胞活化综合征(MAS)的细胞因子释放综合征(CRS)。监测全部两个患者并且给予针对肿瘤溶解综合征的预防。两个患者都经历LDH的实质性提高，它的原因可能是多因素的，但是可能不包括肿瘤溶解综合征。CHOP-100中的每个尿酸值都低于正常抑或处于正常范围内，并且她仅在第5-6天接受了别嘌呤醇。CHOP-101在第0-14天接受了预防的别嘌呤醇，并且在第8-10天具有异常尿酸值4.8-5.7，与轻度肿瘤溶解综合征一致。
表2：CHOP-100和CHOP-101中的不良事件(3和4级)
Figure BDA0002393935440000302
Figure BDA0002393935440000311
Figure BDA0002393935440000312
根据针对不良事件3.0的常用技术标准，将不良事件分级
在CHOP-100中，在第D+5天给予糖皮质激素类，具有在发烧曲线中的简短反应，而没有低血压的缓和。在第D+8天给予由依那西普和塔西单抗组成的抗细胞因子治疗的一个单疗程，并且随后是迅速的临床作用：在数小时内，她退烧，切断了作用于血管的药疗法和通气支持，因为她的临床的和放射的ARDS解决了。她并不具有肿瘤溶解综合征的实验室证据；然而，在第D+11天，注意到MAS的生物化学证据伴随铁蛋白提高至45,529ng/dl，凝血障碍伴随提高的d-二聚体和血纤维蛋白原过少、肝脾肿大、转氨酶的提高、提高的LDH(图4)，以及提高的甘油三酸酯，连同与MAS一致的细胞因子谱。在第D+26天前，她的铁蛋白降低至2,368，并且MAS的临床的和实验室的异常解决了。
在CHOP-101中，虽然除了发烧和LDH中的变化，不存在肿瘤溶解综合征的直接证据(图4C)，但是她还发展了MAS的以下特征：其中在第D+7天，铁蛋白提高至33,360，峰值是在第11天的74,899，达到4级的转氨酶，持续1天，以及血清中提高的d-二聚体。这些生物化学变化是可逆的，如在第D+21天前，转氨酶改进至1级并且铁蛋白降低至3,894。她在第D+16天出院。
全部两个受试者在血清中的细胞因子和细胞因子受体的数量方面都发展了突出的提高(图1B)。在全部两个患者中，干扰素-γ和IL-6的提高是最突出的。这些观察类似于先前在患有CLL的患者中观察到的模式，这些CLL患者在CTL019输注后经历了白血病的缓和(Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)。峰值细胞因子提高暂时关联如通过核心体温变化而判断的全身性炎症(图4C)。
在患有ALL的患者中的CTL019的体内扩张
在循环中的CTL019 T细胞的分数在体内逐渐增加至T细胞的72％(CHOP-100)和34％(CHOP-101)(图5A)。在CHOP-100和-101中输注的T细胞里，初始转导效率分别为11.6％和14.4％。给定在全部两个患者中ALC基本上增加(图4C)，并且给定在体内CTL019细胞的频率逐渐从基线频率增加(图8)，在全部两个患者中存在CTL019细胞的强大的并且选择性的扩张。在全部两个患者中表达CTL019的T细胞中的选择性增加与涉及CD19驱动的扩张的抗白血病机制抑制，并且与在全部两个患者中表达CD19的细胞的随后消除一致(图6和图9)。
在第D+23天获得CHOP-100中的周围血液和骨髓样品中的TCR的分子深度序列分析，当通过流式细胞术示出周围血液和骨髓中>65％的CD3+细胞是CTL019+时，揭示了在任一区间优势T细胞TCR克隆型的缺失，其中在骨髓中，10种最丰富的T细胞以0.18％-0.7％的频率存在，并且在周围血液中以0.19％至0.8％的频率存在。10个优势克隆中的六个在这两个区间之间共享。此外，存在CD4和CD8 CAR T细胞。因此，在CD19刺激的扩张后，CAR T似乎增殖，并且并不用TCR信号或克隆特异性事件，例如通过慢病毒的整合的激活。
在骨髓和CNS中CTL019 CAR T细胞的运输和形态学
在周围血液和骨髓中，CTL019细胞扩张了多于1000倍(图5)。在全部两个受试者中，在第D+20天前，CTL019细胞的频率增加至多于循环的T细胞的10％，其中CTL019扩张的绝对量级类似于在患有CLL的患者中观察到的情况(Kalos(卡洛斯)等人，2011，ScienceTranslational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)。出乎意料地，CSF中的细胞还示出高度的CTL019基因标记，并且还以高频率持续直至6个月(图5B)。CTL019细胞至CSF的运输是令人惊讶的，因为在输注时或在治疗评价后1个月时，没有患者具有通过细胞涂片可检测的CNS白血病。另外，针对B细胞癌变的CAR治疗的先前报道并未观察到CAR T细胞运输至CNS(Till(提尔)等人，2008，Blood(血液)112:2261-71；Brentjens(布伦蒂安斯)等人，2011，Blood(血液)118:4817-28；Savoldo(萨沃尔托)等人，2011，J Clin Invest(临床研究杂志)121:1822-5；Jensen(延森)等人，2010，Biol Blood Marrow Transplant(血液与骨髓移植生物学)16:1245-56；Till(提尔)等人，2012，Blood(血液)119:3940-50；Kochenderfer(考琴德佛)等人，2012，Blood(血液)119:2709-20)。在图5D中，针对CHOP-100和101，示出了血液和CSF中淋巴细胞的形态学。因为在第D+10天，在循环中>70％的淋巴细胞为CTL019细胞(图5A和5B)，在图5D的左侧小图中示出的多数大颗粒淋巴细胞可能是CTL019细胞。类似地，因为在第D+23天，获得自CHOP-101的CSF中的很多淋巴细胞是CTL019细胞(体5B和5C)，所以图5D中CSF淋巴细胞的细胞涂片最可能表示已经送至CNS的体内的CTL019细胞的形态学。
B细胞发育不全的诱导
在CTL019输注后1个月内，在骨髓和血液中，全部两个受试者都已经消除了CD19阳性细胞(图6，和图9)。在CHOP-100中，在输注后第D+6天，剩余在骨髓中的大群细胞是CD19+CD20+白血病母细胞。在第D+23天前，这群细胞是不可检测的，在这一患者中，作用维持了超过9个月(图9A)。给定CHOP-100在CTL019输注之前6周内并未进行化疗，这表明CTL019细胞足以消除这一病例中的正常的和白血病的B细胞。
在CHOP-101中出现了CD19逃逸变体
在CTL019输注后2个月时，CHOP-101经历了在周围血液中明显的临床复发，因为证据是循环中母细胞的再现。这些细胞是CD45dim阳性的、CD34阳性的，并且并不表达CD19(图6)。原来优势的CD34dim+CD34+CD19dim+细胞的缺失与针对CD19的CTL019 CAR T细胞的强力抗白血病选择压力一致(图9B)。深度IGH测序揭示，最早在第D+23天，在周围血液和骨髓中存在恶性克隆(表1)，尽管在这一时间点(图7)，通过流式细胞术，MRD的临床评定是阴性的。此外，在临床复发时获得的材料的深度测序揭示，D45dimCD34+CD19-细胞克隆地关系到初始优势CD45dim+CD34+CD19dim+细胞，因为它们共享同一IGH序列。
用嵌合抗原受体表达T细胞缓和ALL
在此呈现的结果证明，在此实验方案上治疗的首批两个患者中，复发并且难治的白血病的缓和的诱导。由于在另一个受试者中出现了CD19阴性母细胞，已经在一个受试者中持续了缓和并且伴随复发。在全部两个患者中，以高水平将遗传修饰的CTL019细胞送至CNS。在全部两个受试者中，观察到针对靶的细胞因子提高，可逆、并且暂时地伴随表达CD19的母细胞的消除。在输注CAR T细胞后，在难治的CD19阳性ALL中完全缓和的诱导是令人鼓舞的，具体地给定在并不表达CAR的异源供体淋巴细胞输注的输注后的低频率的缓和(Kolb(科尔布)等人，1995，Blood(血液)86:2041-50；Collins(柯林斯)等人，1997，J Clin Oncol(临床肿瘤学杂志)15:433-44；Collins(柯林斯)等人，2000，Bone Marrow Transplant(骨髓移植)26(5):511-6)。深度测序技术表明，在CHOP-100中，CTL019 CAR输注与恶性B细胞的频率中的持续的5-log减少关联，进一步表明在化疗难治的白血病中的强力抗肿瘤作用。
在一个受试者中CD19阴性母细胞的不幸出现与记录了在一些ALL病例中CD19阴性前体细胞的出现的先前报道一致(Hotfilder(霍特菲尔德)等人，2005，Cancer Research(癌症研究)65:1442-9；le Viseur(勒威舍)等人，2008，Cancer Cell(癌细胞)14:47-58)。可能的是，重定向至除了CD19的新颖特异性的CAR T细胞的共输注可能降低这一事件的可能性。迄今为止，已经观察不到，用CTL019治疗后，在患有CLL的成体中，具有CD19阴性逃逸细胞的复发(Kalos(卡洛斯)等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化医学)3:95ra73)，提示这一问题可能特异性针对一个子集的急性白血病。CHOP-100中缓和的诱导并不要求伴随性的化疗，并且与在化疗后，示出CLL中缓和可能可能延迟若干周的先前报道一致(Porter(波特)等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)365:725-33)。因此，对于CAR介导的抗肿瘤作用，细胞毒性的化疗的伴随性给予可能不是必需的。
全部两个幼体ALL患者都经历了CTL019输注后的实质性毒性。观察到B细胞发育不全的诱导，并且表明CAR T细胞可以在复发的急性白血病的环境中发挥功能。在输注的一周内，全部两个患者要已经发展了细胞因子释放综合征和巨噬细胞活化综合征的临床的和实验室的证据。在这些患者中观察到的细胞因子谱类似于在患有噬红细胞作用和巨噬细胞活化综合征或嗜血细胞性淋巴组织增生症的儿童中的细胞因子模式的现有报道(Tang(唐)等人，2008，Br J Haematol(英国血液学杂志)143:84-91；Behrens(贝伦斯)等人，2011，JClin Invest(临床研究杂志)121(6):2264-77)。巨噬细胞活化综合征特征在于具有延长的发烧、肝脾肿大、以及血细胞减少症的过度炎症。这一综合征的实验室发现特征是提高的铁蛋白、甘油三酸酯、转氨酶、胆红素(主要是共轭的)和可溶性白介素-2受体α-链，以及降低的血纤蛋白原(Janka(詹卡)等人，2012，Annu Rev Med(医学年鉴)63:233-46)。最近研究表明，塔西单抗(抗IL6)具有针对糖皮质激素抗性GVHD的巨大希望(Drobyski(德罗比斯基)等人，2011，Biol Blood Marrow Transplant(血液与骨髓移植生物学)17(12):1862-8；LeHuu(勒胡)等人，2012，J Invest Dermatol(皮肤病学研究期刊)132(12):2752-61；Tawara(田原)等人，2011，Clinical Cancer Research(临床癌症研究)17:77-88)，并且在此呈现的结果与这些数据一致。
CTL019的有力的体内扩张、持久的B细胞发育不全和突出的抗白血病活性意味着在患有晚期ALL的幼体患者中，CTL019细胞的实质性的和持续的效应子功能。CAR T细胞至CNS的运输的高效率是令人鼓舞的，因为在逃避部位，例如CNS中，用于监视以防止复发的机制(Pullen(普伦)等人，1993，J Clin Oncol(临床肿瘤学杂志)11(5):839-49)，并且支持针对CNS淋巴瘤和原发性CNS恶性肿瘤(malignancies)的CAR T细胞导向的治疗的测试。除了B细胞发育不全之外，它的持续期是目前未定义的，认为与用作针对多数病例的幼体白血病的目前护理标准的高剂量的化疗和放射相比，基于免疫的治疗(例如CTL019)的使用会具有长期不良作用的有利简况(Garcia(加西亚)-Manero(马利龙)和Thomas(托马斯)，2011，Hematol Oncol Clin North Am(北美血液学与肿瘤学临床)15(1):163-205)。,
通过嵌合抗原受体表达T细胞的ALL的完全缓和的诱导
塔西单抗(抗IL6)具有针对糖皮质激素抗性GVHD的巨大希望，并且在此呈现的结果与这些数据一致。另外，令人感兴趣地注意到，在CHOP 100中，显现为高烧、低血压和多器官衰竭的CRS对细胞因子导向的治疗之前，经先前两天给予的高剂量的糖皮质激素类有抗性。最终，在CHOP-100中，在图4B中示出的IL-1β、IL-1RA和IL-2中的双相变化可能已经关系到用依那西普和塔西单抗的细胞因子导向的治疗。
在对于blinatumomab(一种药物)治疗是难治的患者中的缓和的诱导进一步凸显CTL019细胞的潜力。CAR T细胞至CNS的运输的高效率是令人鼓舞的，因为在逃避部位，例如CNS中，用于监视以防止复发的机制，并且支持针对CNS淋巴瘤和原发性CNS恶性肿瘤(malignancies)的CAR T细胞导向的治疗的测试。患者都未经历可能归因于T细胞至CNS的运输的认知效果。
实施例4：概述信息
在接受CAR T细胞的患者中测量不同的标记。作为一个非限制性示例，测量了铁蛋白、肌红蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)；分别参见图10、11和12。提高的水平的这些标记关联到结果。指定为-01、-03、-09、-100和-101的患者被分类为完全反应者。指定为-02、-05、-10(第二次输注并且在D70附近反应)和-12的患者被分类为部分反应者。指定为-06、-07和-14的患者被分类为非反应者。
在此引用的每一个(each和every)专利、专利申请、和出版物的披露内容都通过引用以其全文并入于此。尽管已经参考特定实施方式披露的本发明，但是明显的是，本领域其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方式和变化，而不偏离本发明的真实精神和范围。所附权利要求书旨在解释为包括所有此类是手臂里和等效的变化。

Claims (16)

1.细胞因子抑制剂在制备用于管理由向患有癌症的患者给予被转导以表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)引起的毒性的药物中的应用，其中所述CAR T细胞被用于治疗所述患者中的所述癌症，其中所述患者中的IL-6水平由于所述CART细胞的给予而升高，其中所述细胞因子抑制剂是IL-6抑制剂，其中所述IL-6抑制剂是塔西单抗，并且其中所述毒性是细胞因子释放综合征。
2.细胞因子抑制剂在制备用于管理由向患有癌症的患者给予被转导以表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)引起的毒性的药物中的应用，其中所述CAR T细胞被用于治疗所述患者中的所述癌症，其中所述细胞因子抑制剂是IL-1抑制剂，其中所述IL-1抑制剂是阿那白滞素，并且其中所述毒性是细胞因子释放综合征。
3.权利要求1所述的应用，其中所述塔西单抗以8mg/kg的剂量给予。
4.权利要求1或权利要求2所述的应用，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包括具有靶向肿瘤抗原的抗原结合结构域的胞外结构域；跨膜结构域；和细胞内结构域。
5.权利要求4所述的应用，其中所述肿瘤抗原是选自CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、和IL3Ra的至少一种。
6.权利要求4所述的应用，其中所述肿瘤抗原是CD19。
7.权利要求4所述的应用，其中所述细胞内结构域包括CD137信号传导域、CD28信号传导域、CD3ζ信号域、或其任意组合。
8.权利要求1或权利要求2所述的应用，其中所述细胞因子释放综合征导致嗜血细胞性淋巴组织增生症/巨噬细胞活化综合征。
9.权利要求1或权利要求2所述的应用，其中所述癌症是：
(i)血液学癌症，其选自急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病骨髓增生异常综合症；
(ii)实体瘤；
(iii)原发性癌症或转移性癌症；和/或
(iv)难治的或抗常规化疗的癌症。
10.权利要求1或2所述的应用，其中所述癌症选自前体-B ALL、成体ALL、套细胞淋巴瘤和弥散性大B-细胞淋巴瘤。
11.权利要求10所述的应用，其中所述嵌合抗原受体靶向CD19。
12.权利要求10所述的应用，其中所述CAR T细胞是在体外用表达所述CAR的载体转导的人T细胞，并且所述CAR T细胞对于所述患者是自体的。
13.权利要求12所述的应用，其中所述CAR T细胞作为药物组合物与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合给予。
14.权利要求10所述的应用，进一步包括给所述患者给予皮质激素。
15.权利要求14所述的应用，其中所述皮质激素是甲泼尼龙。
16.权利要求9所述的应用，其中：
(i)所述急性白血病选自急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病、成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、单核细胞性白血病以及红白血病；
(ii)所述慢性白血病选自多毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病；和/或
(iii)所述淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤，以及所述非何杰金氏淋巴瘤是顽固或高级的形式。
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