CN112292138A - Car t细胞的使用方法 - Google Patents

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詹姆斯·马泰
菲利普·S·洛
楚海燕
英娟·J·陆
克里斯托弗·P·莱蒙
勒罗伊·W·惠勒二世
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Abstract

本公开内容涉及通过向患者给予包含CAR T细胞的组合物以及向所述患者给予通过接头连接至靶向部分的小分子来治疗患有癌症的患者的方法，其中，所述CAR T细胞包含CAR并且所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。本公开内容还涉及用于此类方法的组合物。

Description

CAR T细胞的使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月26日提交的标题为“METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”的美国临时专利申请No.62/736,727、2018年9月24日提交的标题为“METHODS OF USE FORCAR T CELLS”的美国临时专利申请No.62/735,627、2018年8月29日提交的标题为“METHODSOF USE FOR CAR T CELLS”的美国临时专利申请No.62/724,171、2018年4月11日提交的标题为“METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”的美国临时专利申请No.62/656,233、2018年1月23日提交的标题为“METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”的美国临时专利申请No.62/620,706、以及2018年1月22日提交的标题为“METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”的美国临时专利申请No.62/620,414的优先权，以引用的方式将其各自以其整体并入。
对序列表的引用
将本申请与电子格式的序列表一起提交。将序列表作为标题为SCRI200WOSEQLIST的文件(创建于2019年1月14日，大小约为26kb)提供。以引用的方式将电子格式的序列表中的信息以其整体并入本文。
技术领域
本公开内容涉及通过向患者给予包含CAR T细胞的组合物以及向患者给予通过接头连接至靶向部分的小分子来治疗患有癌症的患者的方法，其中，所述CAR T细胞包含CAR，并且所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。本公开内容还涉及用于此类方法的组合物。
背景技术
基于向患者中过继转移淋巴细胞(例如T细胞)的免疫疗法是治疗癌症和其它疾病的有价值的疗法。在基于淋巴细胞的过继转移的免疫疗法的开发中已经取得了许多重要的进展。在许多不同类型的免疫治疗剂中，正在开发的最有前途的免疫治疗剂之一是表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)。嵌合抗原受体(CAR)是经基因工程化的受体，所述受体被设计为靶向特定的抗原(例如肿瘤抗原)。这种靶向可以导致针对肿瘤的细胞毒性，例如，使得表达CAR的CAR T细胞能够通过特定的肿瘤抗原来靶向并杀死肿瘤。
第一代CAR由识别区域(例如由抗体衍生而来的单链可变区片段(scFv)，用于识别并结合至肿瘤表达的抗原)和激活信号传导结构域(例如T细胞的CD3ζ链可以在CAR中充当T细胞激活信号)组成。尽管CAR T细胞已在体外显示出积极结果，但在临床试验中，它们在消除疾病(例如癌症)中的成功有限。一个问题是不能在体内延长激活并扩增CAR T细胞群体。
为了解决这个问题，在第二代CAR中包含了共刺激结构域(例如，CD137、CD28或CD134)，以实现体内T细胞的延长激活。共刺激结构域的添加增强了含有CAR的T细胞的体内增殖和存活，并且初始临床数据已显示，此类构建体是在疾病(如癌症)治疗中有希望的治疗剂。
尽管已经在CAR T细胞疗法中进行了改进，但是仍然存在一些问题。首先，由于正常细胞表达CAR T细胞靶向的抗原(例如，肿瘤相关抗原)，可能产生“脱靶”毒性。其次，在CAR T细胞迅速且不受控制地消除患病细胞(例如癌细胞)诱导一系列代谢紊乱(称为肿瘤溶解综合征或细胞因子释放综合征(CRS))的情况下，可能发现不受调控的CAR T细胞激活，这对患者可能致命。肿瘤溶解综合征和CRS可由于给予的CAR T细胞无法容易地调节并且激活不受控而导致。因此，尽管CAR T细胞作为疾病(如癌症)治疗中的工具显示出很大希望，仍需要额外的CAR T细胞疗法，以提供降低的脱靶毒性，并更精确地控制CAR T细胞的激活。
发明内容
本发明人发现了减少脱靶毒性、并更精确地控制CAR T细胞激活的方法，提供了CAR T细胞疗法中的重要进展。在本文所述的各种实施方式中，通过接头与靶向部分连接的小分子配体用作癌症与表达CAR的CAR T细胞之间的桥梁，其中，CAR包含E2抗荧光素抗体片段。该桥梁将表达包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的CAR T细胞引导至癌症，以改善癌症。在一个实施方式中，“小分子配体”可以是例如叶酸样化合物(folate)、DUPA、NK-1R配体、CAIX配体、γ谷氨酰转肽酶的配体、NKG2D配体或CCK2R配体，它们各自为特异性结合癌细胞的小分子配体(即与正常组织相比，这些配体的受体在癌症中过表达)。
在一个实施方式中，“小分子配体”连接至“靶向部分”，所述“靶向部分”结合至由CAR T细胞表达的CAR。在各种实施方式中，“靶向部分”可以选自例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS和/或荧光素。
“靶向部分”结合至基因工程化的CAR的识别区域，所述CAR表达E2抗荧光素抗体片段。因此，CAR的识别区域(例如，E2抗荧光素抗体片段的单链可变区(scFv)、Fab、Fv、Fc、(Fab')2片段等)定向至“靶向部分”。因此，通过接头连接至靶向部分的小分子配体充当癌症和表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞之间的桥梁，将CAR T细胞引导至癌症以改善癌症。
在一个实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予第一剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予第二剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；以及ii)向所述患者给予CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，并且其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞和未转化的T细胞的混合物。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团(folate)的缀合物或抑制CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中，向所述患者给予至少第一剂量和第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第一剂量和第二剂量不同，其中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约15000倍；以及ii)向所述患者给予包含CART细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一说明性实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予至少第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约50％；以及iii)向所述患者给予一定剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，并且其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约2500nmole/kg患者体重的剂量来给予；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，并且其中，所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约1500万个CAR T细胞。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者连续给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)终止所述化合物或其药学上可接受的盐的连续给予，以抑制或防止所述患者中的细胞因子释放综合征。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，并且每周向所述患者给予一次所述化合物或其药学上可接受的盐；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，并且其中，在给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物之前向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR；ii)然后向所述患者给予一定剂量的所述CAR T细胞组合物；以及iii)然后向所述患者给予第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
还通过以下列举的条目描述了额外的实施方式。还在考虑之列的是以下实施方式与本专利申请的发明内容部分、具体实施方式部分、实施例部分或权利要求中描述的任何适用的实施方式组合的任一种。
1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予第一剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予第二剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
2.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；以及ii)向所述患者给予CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，并且其中，所述CAR T细胞组合物包含所述CAR T细胞和未转化的T细胞的混合物。
3.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物或抑制所述CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
4.如条目3所述的方法，其中，步骤iii包括给予叶酸样化合物。
5.如条目3或4中任一项所述的方法，其中，步骤iii包括给予叶酸或醛氢叶酸。
6.如条目3所述的方法，其中，步骤iii包括给予所述包含叶酸样基团的缀合物。
7.如条目6所述的方法，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物包含连接至一个或多个氨基酸的叶酸样化合物。
8.如条目7所述的方法，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物具有下式
Figure BDA0002689264240000071
9.如条目3-8中任一项所述的方法，其中，所述叶酸样化合物具有下式
Figure BDA0002689264240000072
其中，X1和Y1各自独立地选自于由卤素、R2、OR2、SR3和NR4R5所组成的组；U、V和W代表各自独立地选自于由-(R6a)C＝、-N＝、-(R6a)C(R7a)-和-N(R4a)-所组成的组的二价部分；Q选自于由C和CH所组成的组；T选自于由S、O、N和-C＝C-所组成的组；X2和X3各自独立地选自于由如下所组成的组：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烃基和C1-C12烯氧基(alkyeneoxy)，其中Z为氧或硫；R1选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b和R7b各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基(alkanoyl)、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷氨基)羰基所组成的组；R6和R7各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6和R7一起形成羰基基团；R6a和R7a各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6a和R7a一起形成羰基基团；p、r、s和t各自独立地为0或1；以及*表示与所述缀合物其余部分的共价键。
10.如条目3所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述抑制CAR T细胞激活的试剂选自于由如下所组成的组：淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、IL-2诱导型T细胞激酶抑制剂、JAK抑制剂、BTK抑制剂、EC2319以及阻断CAR T细胞结合至所述化合物或其药学上可接受的盐但不结合至所述癌症的试剂。
11.如条目10所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述试剂是淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
12.如条目11所述的方法，其中，所述淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼。
13.如条目10所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述试剂是PI3激酶抑制剂。
14.如条目13所述的方法，其中，所述PI3激酶抑制剂是GDC0980。
15.如条目10所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述试剂是IL-2诱导型T细胞激酶抑制剂。
16.如条目15所述的方法，其中，所述IL-2诱导型T细胞激酶抑制剂是BMS-509744。
17.如条目10所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述抑制CAR T细胞激活的试剂是阻断CAR T细胞结合至所述化合物或其药学上可接受的盐但不结合至癌症的试剂。
18.如条目17所述的方法，其中，所述试剂是荧光素胺、FITC或荧光素钠。
19.如条目18所述的方法，其中，所述试剂是FITC。
20.如条目18所述的方法，其中，所述试剂是荧光素钠。
21.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.01umole/kg患者体重至约300umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
22.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约100umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
23.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约90umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
24.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约80umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
25.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约70umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
26.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约60umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
27.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约50umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
28.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约40umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
29.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约30umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
30.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约20umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
31.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约10umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
32.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约8umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
33.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约6umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
34.如条目3-33中任一项所述的方法，其中，向所述患者给予多于一个剂量的所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
35.如条目3-34中任一项所述的方法，其中，在所述化合物或其药学上可接受的盐之前和/或之后向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
36.如条目3-35中任一项所述的方法，其中，所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂的给予引起所述患者中细胞因子水平降低，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
37.如条目36所述的方法，其中，在向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂后约3小时内发生细胞因子水平的降低，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
38.如条目36所述的方法，其中，在向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂后约6小时内发生细胞因子水平的降低，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
39.如条目36-38中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子水平的降低是关于未治疗的患者中的细胞因子水平的降低。
40.如条目3-39中任一项所述的方法，其中，在所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂的给予之前和后面给予所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
41.如条目3-40中任一项所述的方法，其中，在给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂后，即使所述患者中的细胞因子水平降低，所述患者血液中的CAR T细胞数量增加，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
42.如条目3-41中任一项所述的方法，其中，在给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂后，即使经治疗的患者中的细胞因子水平降低，但相对于未用挽救试剂治疗的患者，CAR T细胞激活增强或维持，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
43.如条目3-42中任一项所述的方法，其中，所述癌症包括肿瘤，并且当向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂时，所述患者中的肿瘤尺寸不增加，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
44.如条目43所述的方法，其中，获得对肿瘤的完全应答。
45.如条目3-44中任一项所述的方法，其中，当CRS等级达到1、2、3或4时，向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
46.如条目45所述的方法，其中，当CRS等级达到3或4时，向所述患者给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
47.如条目3-46中任一项所述的方法，其中，肺水肿减轻。
48.如条目1-47中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约2500nmole/kg患者体重的剂量给予；并且所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约1500万个CAR T细胞。
49.如条目48所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约100nmole/kg患者体重的剂量给予。
50.如条目48-49中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约50nmole/kg患者体重的剂量给予。
51.如条目48-50中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约20nmole/kg患者体重的剂量给予。
52.如条目48所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重的剂量给予。
53.如条目48所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约200nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重的剂量给予。
54.如条目48所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约400nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重的剂量给予。
55.如条目48-54中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约1250万个CAR T细胞。
56.如条目48-55中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约700万个CAR T细胞。
57.如条目48-56中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约500万个CAR T细胞。
58.如条目48-57中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的剂量为约200万个CAR T细胞至约500万个CAR T细胞。
59.如条目1-58中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：终止所述化合物或其药学上可接受的盐的连续给予，以抑制或防止所述患者中的细胞因子释放综合征。
60.如条目1-59中任一项所述的方法，其中，向所述患者连续给予所述化合物或其药学上可接受的盐至少一小时。
61.如条目1-59中任一项所述的方法，其中，向所述患者连续给予所述化合物或其药学上可接受的盐至少四小时。
62.如条目1-59中任一项所述的方法，其中，向所述患者连续给予所述化合物或其药学上可接受的盐至少六小时。
63.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，每隔一天向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
64.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，每周三次向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
65.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，每周两次向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
66.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，每周一次向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
67.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，向所述患者给予化合物或其药学上可接受的盐，直到发生患者体重不可接受地减轻、发烧、血压下降或肺水肿。
68.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中，向所述患者给予至少第一剂量和第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第一剂量和所述第二剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约15000倍；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
69.如条目68所述的方法，其中，向所述患者给予至少第一剂量、第二剂量和第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第一剂量、所述第二剂量和所述第三剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约750倍，并且其中，第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约800倍至约10000倍。
70.如条目68所述的方法，其中，向所述患者给予至少第一剂量、第二剂量、第三剂量和第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第一剂量、所述第二剂量、所述第三剂量和所述第四剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约750倍，其中，第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约800倍至约7500倍，并且其中，第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约8000倍至约15000倍。
71.如条目70所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约100倍，其中，第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约1000倍，并且其中，第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约10000倍。
72.如条目68所述的方法，其中，向所述患者给予至少第一剂量和第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第一剂量和所述第二剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约15000倍。
73.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予至少第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约50％；以及iii)向所述患者给予一定剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
74.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约60％。
75.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约70％。
76.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约80％。
77.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约90％。
78.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约95％。
79.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约96％。
80.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约97％。
81.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约98％。
82.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约99％。
83.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约99.5％。
84.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约1000nmole/kg患者体重。
85.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约900nmole/kg患者体重。
86.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约800nmole/kg患者体重。
87.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约700nmole/kg患者体重。
88.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重。
89.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约200nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重。
90.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约400nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重。
91.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约500nmole/kg患者体重。
92.如条目84所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约500nmole/kg患者体重。
93.如条目85所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约450nmole/kg患者体重。
94.如条目86所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约400nmole/kg患者体重。
95.如条目87所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约350nmole/kg患者体重。
96.如条目88所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约300nmole/kg患者体重。
97.如条目89所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约1nmole/kg患者体重至约300nmole/kg患者体重。
98.如条目90所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约2nmole/kg患者体重至约300nmole/kg患者体重。
99.如条目91所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约2nmole/kg患者体重至约250nmole/kg患者体重。
100.如条目92-99中任一项所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约5nmole/kg患者体重至约40nmole/kg患者体重。
101.如条目92-99中任一项所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约40nmole/kg患者体重至约150nmole/kg患者体重。
102.如条目73-101中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐与第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐相同。
103.如条目102所述的方法，所述方法进一步包括给予第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐与第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐和第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐相同。
104.如条目73-103中任一项所述的方法，其中，相对于第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，在第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐之后给予的所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量维持对癌症生长的抑制。
105.如条目73-104中任一项所述的方法，其中，以约100万个CAR T细胞至约4000万个CAR T细胞的剂量给予所述CAR T细胞。
106.如条目73-105中任一项所述的方法，其中，每周给予一次在第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐之后给予的所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量。
107.如条目73-105中任一项所述的方法，其中，每周两次给予所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量。
108.如条目1-107中任一项所述的方法，其中，所述CAR进一步包含IgG4铰链结构域、CD3ζ激活结构域和4-1BB共刺激结构域。
109.如条目1-108中任一项所述的方法，其中，所述E2抗荧光素抗体片段是scFv片段。
110.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR蛋白序列与SEQ ID NO：2具有至少约90％同一性。
111.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR蛋白序列与SEQ ID NO：2具有至少约95％同一性。
112.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR蛋白序列与SEQ ID NO：2具有至少约98％同一性。
113.如条目1-112中任一项所述的方法，其中，所述CAR结合荧光素。
114.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR蛋白序列具有至多约50个保守氨基酸置换，并且其中，所述CAR结合荧光素。
115.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR由与SEQ ID NO：1具有至少约90％同一性的多核苷酸编码。
116.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR由与SEQ ID NO：1具有至少约95％同一性的多核苷酸编码。
117.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR由与SEQ ID NO：1具有至少约98％同一性的多核苷酸编码。
118.如条目115-117中任一项所述的方法，其中，所述CAR结合荧光素。
119.如条目1-118中任一项所述的方法，其中，所述CAR由在高度严格条件下与具有SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且其中，所述CAR结合荧光素。
120.如条目1-119中任一项所述的方法，其中，所述CAR由具有SEQ ID NO：1的多核苷酸编码或由SEQ ID NO：1的简并变体编码。
121.如条目1-120中任一项所述的方法，其中，所述配体选自于由叶酸样化合物、DUPA、NK-1R配体、CAIX配体、γ-谷氨酰转肽酶的配体、NKG2D配体和CCK2R配体所组成的组。
122.如条目1-121中任一项所述的方法，其中，所述靶向部分是荧光素或其药学上可接受的盐。
123.如条目1-122中任一项所述的方法，其中，所述接头包括聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、普朗尼克F-127或它们的组合。
124.如条目1-123中任一项所述的方法，其中，所述接头包括PEG。
125.如条目1-124中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
B—L—T，
其中，B代表所述小分子配体，L代表所述接头，T代表所述靶向部分，并且其中，L包括具有下式的结构：
Figure BDA0002689264240000191
其中，n是0至200的整数。
126.如条目1-125中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自于由如下所组成的组：肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部癌、颈部癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜的癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、急性髓细胞白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、髓系白血病、粒单核细胞白血病、毛细胞白血病、粒单核细胞白血病、毛细胞白血病、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤和胃食管连接处的腺癌。
127.如条目1-126中任一项所述的方法，其中，所述癌症是表达叶酸受体(folatereceptor)的癌症。
128.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是子宫内膜癌。
129.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是非小细胞肺癌。
130.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是卵巢癌。
131.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是三阴乳腺癌。
132.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是急性髓细胞白血病。
133.如条目132所述的方法，其中，所述癌症表达叶酸受体-β。
134.如条目1-133中任一项所述的方法，其中，给予多剂量的所述CAR T细胞组合物。
135.如条目1-134中任一项所述的方法，其中，给予至少两剂量的所述CAR T细胞组合物。
136.如条目1-135中任一项所述的方法，其中，在给予所述化合物或其药学上可接受的盐之前或在给予所述CAR T细胞组合物之前对所述患者进行成像。
137.如条目1-136中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，并且不包含抗体的片段。
138.如条目1-137中任一项所述的方法，其中，所述靶向部分不包含肽表位。
139.如条目1-138中任一项所述的方法，其中，所述患者中不发生引起脱靶毒性的细胞因子释放，并且其中，发生对癌症的CAR T细胞毒性。
140.如条目1-138中任一项所述的方法，其中，所述患者中不发生脱靶组织毒性，并且其中，发生对癌症的CAR T细胞毒性。
141.如条目1-138中任一项所述的方法，其中，所述癌症包括肿瘤，其中，所述患者中的肿瘤尺寸减小，并且其中，不发生脱靶毒性。
142.如条目1-141中任一项所述的方法，其中，减少或防止CRS，并且所述方法引起所述患者中肿瘤体积的降低。
143.如条目1-142中任一项所述的方法，其中，减少或防止由于CRS引起的体重减轻。
144.如条目59-67中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述患者再给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
145.如条目144所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐的后续给予引起所述患者中CAR T细胞激活以及细胞因子水平的增加。
146.如条目1-145中任一项所述的方法，其中，所述癌症包括肿瘤，并且其中，获得针对所述肿瘤的完全应答。
147.如条目1-146中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞具有中央记忆/效应记忆表型。
148.如条目1-147中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的CD8:CD4比为约1:1。
额外的替代方式包括以下。
149.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述核酸包含：与SEQ ID NO：1或SEQID NO：4具有至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的核酸，其中，所述核酸编码抗荧光素scFv；或具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示序列的核酸；其中，任选地，(a)或(b)的所述核酸进一步包含编码IgG4铰链结构域、CD3ζ激活结构域和4-1BB共刺激结构域的核酸。
150.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的多肽，所述多肽包含：与SEQ ID NO：2或SEQID NO：3具有至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的多肽，其中，所述多肽编码抗荧光素scFv；或具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示序列的多肽，其中，所述多肽编码抗荧光素scFv，并且其中，任选地，(a)或(b)的所述多肽进一步包含编码IgG4铰链结构域、CD3ζ激活结构域和4-1BB共刺激结构域的多肽。
151.包含替代方式149所述的核酸的载体。
152.如替代方式151所述的载体，其中，所述载体是慢病毒载体。
153.包含替代方式149、151或152中任一项所述的核酸或载体的细胞。
154.如替代方式153所述的细胞，其中，所述细胞是T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞。
155.如替代方式150所述的多肽，其中，所述多肽包含人源化或人氨基酸序列或由人源化或人氨基酸序列组成。
156.包含替代方式150或155所述的多肽的细胞。
157.如替代方式156所述的细胞，其中，所述细胞是T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞。
158.一种改善或治疗患者中癌症的方法，所述方法包括：用具有异硫氰酸荧光素(FITC)部分的小分子配体标记所述患者中的癌症；以及向所述患者给予嵌合抗原受体(CAR)T细胞组合物，所述CAR T细胞组合物包含替代方式153、154或157所述的细胞、T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞。
159.如替代方式158所述的方法，其中，在用具有FITC部分的小分子配体标记癌症之前给予所述CAR T细胞组合物。
160.如替代方式158或159所述的方法，其中，所述CAR T细胞组合物包含自体细胞。
附图说明
图1图解性地示出了E2构建体与4M5.3构建体，并且示出了E2构建体的图谱。
图2示出了EC17固定剂量和剂量降阶方案。
图3A和图3B示出了具有EC17剂量降阶的E2-CAR-T抗肿瘤活性(3000万个细胞)和体重变化。如图所示，NaFL挽救后维持抗肿瘤活性。
图4A和图4B示出了具有EC17剂量降阶的4M5.3-CAR-T抗肿瘤活性(3000万个细胞)和体重变化。如图所示，4M5.3-CAR-T的活性低于E2-CAR-T。此外，观测到EC17剂量依赖性抗肿瘤活性和体重减轻。
图5A和图5B示出了在固定的EC17用药方案(500nmol/kg，SIW)下的E2-CAR-T抗肿瘤活性(1000万个和2000万个细胞)和体重变化。如图所示，NaFL挽救后维持抗肿瘤活性。
图6A和图6B示出了在固定的EC17用药方案(500nmol/kg，SIW)下的4M5.3-CAR-T抗肿瘤活性(1000万个和2000万个细胞)和体重变化。如图所示，4M5.3-CAR-T的活性低于E2-CAR-T。
图7A和图7B示出了在输注入NSG小鼠之前E2 CAR T细胞的表型特征。
图8A和图8B示出了在包含E2-CAR-T细胞和4M5.3-CAR-T细胞以及GFP+4M5.3 CAR-T细胞的不同制剂中CAR-T分化表型的比较。
图9A和图9B示出了DIG标记的E2-IgG与FITC的结合。
图10A和图10B示出了在FITC标记的KB细胞上DIG标记的E2抗体的IHC染色。
图11示出了在正常人器官组织肾上腺中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图12示出了在正常人器官组织骨髓中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图13示出了在正常人器官组织乳腺中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图14示出了在正常人器官组织小脑组织中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图15示出了在正常人器官组织宫颈中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图16示出了在正常人器官组织结肠中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图17示出了在正常人器官组织食道中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图18示出了在正常人器官组织眼中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图19示出了在正常人器官组织心脏中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图20示出了在正常人器官组织垂体中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图21示出了在正常人器官组织肾中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图22示出了在正常人器官组织喉中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图23示出了在正常人器官组织脾中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图24示出了在正常人器官组织肝中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图25示出了在正常人器官组织肺中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图26示出了在正常人器官组织淋巴结中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图27示出了在正常人器官组织神经中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图28示出了在正常人器官组织卵巢中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图29示出了在正常人器官组织胰腺中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图30示出了在正常人器官组织前列腺中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图31示出了在正常人器官组织皮肤中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图32示出了在正常人器官组织小肠中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图33示出了在正常人器官组织胃中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图34示出了在正常人器官组织横纹肌中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图35示出了在正常人器官组织睾丸中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图36示出了在正常人器官组织胸腺中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图37示出了在正常人器官组织舌中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图38示出了在正常人器官组织子宫中所结合的DIG-E2抗体的IHC染色。子图A：与DIG-E2抗体预孵育的试验组织切片；子图B：未与DIG-E2抗体预孵育的对照组织切片。
图39是示出在与各种靶标细胞共培养一天中T细胞激活的图表。将一天共培养后激活的E2 CAR T细胞的百分比(y轴)与测定时靶标细胞的FR表达水平(x轴)作图。(▼)OV90细胞；(◆)SKOV3细胞；(▲)IGROV1细胞；(■)HOS-Frα细胞；(●)MDA-MB-231细胞。
图40是示出在三种不同条件下与5种不同细胞类型(OV90细胞；SKOV3细胞；IGROV1细胞；HOS-Frα细胞；MDA-MB-231细胞)共培养2天的靶标细胞凋亡的图。对于每种细胞类型，条件如下：左条形为单独的靶标细胞+EC17；中条形为无EC17预处理的CAR T加靶标细胞共培养；右条形为CAR T加经EC17预处理的靶细胞。
图41是示出5种不同细胞类型(OV90细胞；SKOV3细胞；IGROV1细胞；HOS-Frα细胞；MDA-MB-231细胞)中功能性叶酸受体表达水平的图表。
图42是示出了荷瘤小鼠和未试验过的小鼠的实验时间表的漫画。
图43(左图)是示出未试验过的小鼠和荷瘤小鼠二者中细胞因子IFN-γ的水平是EC-17依赖性的图表，并且与荷有MDA-MB-231肿瘤的小鼠相比，未试验过的小鼠中IFN-γ的增加要低得多(低23倍)。图43(右图)是示出FACS分析在荷有MDA-MB-231肿瘤的小鼠中CAR-T扩增、而在未试验过的小鼠中无可检测到的CAR-T细胞扩增的图表。
图44(上图)是示出以下的图表：与阳性对照细胞系K562-OKT3共培养时，空白对照T细胞和抗FLCAR T细胞的细胞因子(IL-2)生产在量上处于相似水平(左侧条形对，其中，空白对照为左侧条形，而抗FLCAR T20细胞为右侧条形)；与K562共培养时，空白对照或抗FLCAR T细胞均不产生细胞因子(中)；抗FLCAR T细胞是仅有的能够引发细胞因子IL-2分泌的细胞，但仅在EC-17预处理的情况下(右侧，其中仅抗FLCAR T细胞显示结果)。图44(中图)是示出如下的图表：与阳性对照细胞系K562-OKT3共培养时，空白对照T细胞和抗FLCAR T细胞的细胞因子(IFN-γ)生产在量上处于相似水平(左侧条形对，其中，空白对照为左侧条形，而抗FLCAR T细胞为右侧条形)；与K562共培养时，空白对照或抗FLCAR T细胞均不产生细胞因子(中)；而抗FLCAR T细胞是仅有的能够引起细胞因子IFN-γ分泌的细胞，但仅在EC-17预处理的情况下(右侧，仅抗FLCAR T细胞显示结果)。图44(下图)是示出如下的图表：与阳性对照细胞系K562-OKT3共培养时，空白对照T细胞和抗FLCAR T细胞的细胞因子(TNF-α)生产在量上处于相似水平(左侧条形对，其中，空白对照为左侧条形，而抗FLCAR T细胞为右侧条形)；与K562共培养时，空白对照或抗FLCAR T细胞均不产生细胞因子(中)；抗FLCART细胞是仅有能够引发细胞因子TNF-α分泌的细胞，但仅在EC-17预处理的情况下(右侧，其中，仅抗FLCAR T细胞显示结果)。图45(左上)是示出将CD8+空白对照T细胞和抗FLCAR T细胞与阴性对照K562细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比例共培养时的裂解百分比的图表。
图45(右上)是示出将CD8+空白对照T细胞和抗FLCAR T细胞与K562+OKT3靶标细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比例共培养时的裂解百分比的图表。图45(左下)是示出将CD8+空白对照T细胞和抗FLCAR T细胞与未标记的MDA-MB-231细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比例共培养时的裂解百分比的图表。图45(右下)是示出将CD8+空白对照T细胞和抗FLCAR T细胞与EC17标记的MDA-MB-231细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比例共培养时的裂解百分比的图表。在所有图表中，(×)CD8+空白对照T细胞；(○)抗FLCAR T细胞。图46(上图)示出了FITC-叶酸的化学结构。
图46(下图)是示出关于FITC-叶酸的剂量反应曲线的图表。图47(上图)示出了FITC-DUPA的化学结构。
图47(下图)是示出关于FITC-DUPA的剂量反应曲线的图表。图48(上图)示出了FITC-CA9的化学结构。
图48(下图)是示出关于FITC-CA9的剂量反应曲线的图。图49(上图)示出了FITC-NK1R的化学结构。
图49(下图)是示出关于FITC-NK1R的剂量反应曲线的图表。
图50示出了(通过FACS分析)桥梁与体内模型中使用的肿瘤细胞的结合以及对应于桥梁的小分子配体的受体的表达。
图51示出了EC17诱导通过CAR T细胞的强有力的FR依赖性肿瘤细胞杀伤。
图52示出了CAR T细胞的细胞溶解活性与肿瘤细胞上功能性FR水平的相关性。
图53示出了EC17/FR依赖性CAR T细胞的激活和耗竭。示出了在与用EC17或未用EC17预加载(100nM，37℃下30min脉冲)的FR+肿瘤细胞靶标共培养(E/T＝1:1)的CAR-T细胞上检测到的早期(CD69)、中期(CD137)和晚期(PD1)T细胞激活标志物的表达。前两个空心条表示无靶标细胞而仅有CAR-T和空白对照转导的T细胞。
图54示出了EC17/FR依赖性CAR T细胞的耗竭谱。上排：有色饼状图，表示第0-3天无靶标细胞的培养中CAR-T细胞分化状态的变化。下排：四组有色饼状图，代表用EC17或未用EC17预加载(0.1nM或10nM，在37℃下30min脉冲)的FR+(MDA-MB-231、THP-1FRb、HOS-FRa、KB)和FR阴性(THP1-FG12、HOS-143b)肿瘤细胞共培养3天(E/T＝1:2)后CAR-T细胞的分化状态。
图55示出了由抗FITC scFv(克隆E2)、全长IgG4间隔区(Fc衍生的铰链-CH2(L235D,N297Q)-CH3)、CD28tm跨膜结构域、4-1BB/CD3ζ细胞质激活结构域和表皮生长因子受体(EGFRt)的无功能截短的细胞表面多肽所组成的完全人CAR构建体。下图：CD4/CD8 T细胞表型分析的实例通过流式细胞术对EGFRt分选的(左饼图)CAR-T细胞制剂和未分选的“临床复制本”(右饼图)进行。颜色图例如图所示。
图56，子图A：在37℃孵育2小时后，FR+靶标细胞摄取的3H-EC17的Kd值(根据每个细胞结合的分子数计算)。子图B：在室温下孵育2小时后，E2-CAR-T细胞(～24％EGFRt+，～95:5CD8/CD4比)摄取3H-EC17的Kd值(根据与细胞相关的总放射性DPM计算)。
图57(子图A和子图B)示出了荷有HOS-FRa肿瘤的小鼠中CRS分级量表和应用于荧光素钠挽救的实验条件。所示出的是有或没有挽救的由T细胞衍生而来的细胞因子的变化。p值通过学生t检验计算得出。
图58示出了通过基于3H-FA(叶酸)的结合测定(100nM，37℃下1小时)测量的肿瘤细胞上的功能性FR水平。
图59示出了(子图A)在以1:1E/T(效应物/靶标)比与EGFRt分选的CAR-T细胞共培养24小时的5种FR(叶酸受体)+肿瘤细胞系的特异性裂解(％)中的全范围EC17剂量反应；(子图B)从拟合至100nM的剂量反应曲线获得最大裂解(％)和EC50值。
图60示出了CAR-T细胞活性与FR水平和肿瘤细胞的天然敏感性之间的相关性。子图A：在10nM EC17存在下共培养16小时或48小时后，FR+(MDA-MB-231、KB、THP1-FRb、OV90、HOS-FRa)和FR阴性(HOS-143b)细胞系中不同E/T比的特异性裂解动力学(％)。子图B：相对于线性标度的E/T比绘制靶标细胞的特异性裂解(％)。高的FR+KB细胞表明在16小时时的早期耐受，而FR阴性的HOS-143b未有应答。子图C：不包括KB细胞，在共培养16小时时的特异性裂解(％)与肿瘤细胞的功能性FR水平之间建立了半对数相关性。子图D：描绘了在10nMEC17下以不同的E/T比共培养44小时后，CAR-T细胞来源的Th1细胞因子(IFNg、IL-2和TNFa)水平之间的关系的3D图。子图E：以Log 10标度的相对于FR+靶标细胞的FR水平绘制的CAR-T细胞来源的Th1细胞因子水平。
图61示出了(子图A)显示通过流式细胞术确认并表示为MFI的EC17加载状态的条形图(在FR阴性细胞系中检测不到EC17)，以及(子图B)如图54所示共培养2天后通过膜联蛋白V染色检测到的靶标细胞凋亡(％)。
图62示出了体内CAR-T细胞的药代动力学和肿瘤摄取。子图A：实验规划的示意图，以显示荷有MDA-MB-231肿瘤的小鼠中与CAR-T细胞注射和每周EC17剂量(500nmol/kg)有关的的动物收集时间表。共15只小鼠在第0天接受了～480万个EGFRt分选的CAR-T细胞(3只小鼠开始时患有大的肿瘤)。子图B：左图示出肿瘤体积和体重变化的测量；中图示出单剂量的EC17后7天CAR-T细胞在血液中的扩增；右侧的条形图示出了具有小肿瘤和大肿瘤的小鼠中循环CD4/CD8 CAR-T细胞亚群的分化谱。子图C：肿瘤体积和体重变化的测量。子图D：上图示出血液中CAR-T细胞动力学(实线)相对于肿瘤的CAR-T细胞动力学(虚线)。底部的条形图示出了血液中CAR-T细胞表型的变化。子图E：肿瘤浸润CAR-T细胞上激活标志物(4-1BB、PD1)表面表达的动力学变化。
图63示出了饮食性叶酸样化合物对抗肿瘤活性和CRS毒性的作用。子图A：异种移植了大的MDA-MB-231肿瘤并用CAR-T细胞(～1000万“临床复制本”)加500nmol/kg的EC17SIW处理的NSG小鼠的肿瘤体积和体重变化的测量，所述小鼠在整个研究过程中保持FA充足或FA缺乏饮食(n＝5)。子图B：示出了分别在第52天(FA缺乏)和第59天(FA充足)研究结束时测量的循环CAR-T细胞(人CD3ε+EGFRt+)的条形图。子图C：代表性的流式细胞术点图，示出仅用CAR-T细胞处理(无EC17)的FA缺乏的小鼠中无循环CAR-T细胞，以及与接受相同处理的FA充足饮食下的老鼠相比，用CAR-T处理加EC17处理的FA缺乏饮食下的老鼠的CAR-T细胞数量上升。子图D：在第59天从FA充足的动物收集、并用流式细胞数分析的3个MDA-MB-231肿瘤中，2个检测到FR表达的丧失(后通过定量放射性配体结合测定法证实，数据未示出)。
定义
本文所使用的“一个/一种(a/an)”可以表示一个/种或多个/种。本文所使用的关于数值(包括例如整数、分数和百分比)的“约”通常是指本领域普通技术人员将认为等同于所述值的数值范围(例如，所述值的+/-5％至10％)(例如，具有相同的功能或结果)。
本文所使用的术语“治疗(treat/treating/treated/treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防止性治疗。
本文所使用的关于癌症的术语“改善(ameliorate/ameliorating/amelioration/ameliorated)”可以指减轻癌症的症状、减小肿瘤的尺寸、完全或部分去除肿瘤(例如，完全或部分应答)、使得疾病稳定、防止癌症进展(例如，无进展生存)或医师认为是癌症的治疗性、预防性或防止性治疗的对癌症的任何其它效果。
本文所使用的术语“给予(administer/administering/administered)”是指向患者引入化合物或其药学上可接受的盐或CAR T细胞组合物的所有方式，包括但不限于口服、静脉内、肌内、皮下和透皮，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
本文所使用的术语“脱靶毒性”是指对于治疗患者的医师而言不可接受的器官损伤或患者体重的减轻，或者对于治疗患者的医师而言不可接受的对患者的任何其它影响(例如B细胞发育不全、发烧、血压下降或肺水肿)。
本文所使用的术语“转导”和“转染”是等同使用的，并且该术语意指通过任何人工方法(包括病毒方法和非病毒方法)将核酸引入细胞。
具体实施方式
在本文所述的各种实施方式中，通过接头连接至靶向部分的小分子配体用作癌症与CAR T细胞(即表达嵌合抗原受体的T细胞)之间的桥梁，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的遗传工程化的CAR，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。该桥梁将CAR T细胞引导至癌症以改善该癌症。在一个实施方式中，“小分子配体”可以是叶酸样化合物、CAIX配体、DUPA、NK-1R配体、γ-谷氨酰转肽酶的配体、NKG2D配体或CCK2R配体，它们各自为特异性结合癌细胞类型的小分子配体(即，与正常组织相比，这些配体各自的受体在癌症中过表达)。
连接至小分子配体的“靶向部分”结合由CAR T细胞表达的遗传工程化的CAR的识别区域，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。因此，CAR的识别区域(例如，E2抗荧光素抗体的单链可变区片段(scFv))定向至所述“靶向部分”。因而，通过接头连接至靶向部分的小分子配体充当癌症和CAR T细胞之间的桥梁，其中，该CAR T细胞包含遗传工程化的CAR，所述CAR将CAR T细胞引导至癌症以改善该癌症。
桥梁是小的有机分子，因而能够迅速地(例如，约20分钟或更短)从血液中清除。在一方面，CAR T细胞应答(其中，该CAR T细胞含有遗传工程化的CAR，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段)仅可以被靶向至表达“桥梁”的小分子配体部分的受体的那些癌细胞，从而减少对正常组织的脱靶毒性。此外，该系统可以是“通用的”，因为其中一种类型的CAR T细胞构建体(其中，该CAR T细胞包含E2抗荧光素抗体片段)可以被用来使用不同的“桥梁”靶向各种癌症。说明性地，CAR T细胞(其中，该CAR T细胞含有遗传工程化的CAR，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段)所识别的靶向部分可以保持恒定，从而可以使用一种类型的CAR T细胞，而结合至癌症的小分子配体可以改变，使得能够靶向各种癌症。
在本文所述的各种实施方式中，通过接头连接至靶向部分的小分子配体称为“化合物”。在各种实施方式中，短句“E2抗荧光素抗体片段”是指包含E2抗荧光素抗体的片段(例如，scFv片段)的CAR。E2抗荧光素抗体描述于例如Vaughan等，NatureBiotechnol.Vol.14(3),pp.309-314,1996，通过引用的方式并入本文。在各种实施方式中，CAR可进一步包含IgG4铰链结构域、CD3ζ激活结构域和/或4-1BB共刺激结构域，或任何其它合适的结构域(例如EGFRt结构域)。在其它实施方式中，CAR可以由与SEQ ID NO：1具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的多核苷酸编码。在另一说明性的实施方式中，CAR可以由在高严格条件下与具有SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在另一方面，CAR可以由具有SEQ ID NO：1的多核苷酸或由SEQ IDNO：1的简并变体编码。在其它实施方式中，CAR蛋白序列可与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在又一实施方式中，CAR蛋白序列可具有至多约50个保守氨基酸置换。在本文所述的任何实施方式中，CAR结合荧光素。
在一个实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予第一剂量的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予第二剂量的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，并且其中，CAR T细胞组合物包含CAR T细胞和未转化的T细胞的混合物。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物或抑制CAR T细胞激活的药物，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不含靶向部分。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，并且其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重的剂量至约2500nmole/kg患者体重的剂量进行给予；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，并且其中，所述CART细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约1500万个CAR T细胞。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者连续给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)终止所述化合物或其药学上可接受的盐的连续给予，以抑制或防止患者中的细胞因子释放综合征。
在另一说明性方面，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中，向患者给予至少第一剂量和第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第一剂量和第二剂量不同，其中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐高约2倍至约15000倍；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，并且其中，每周一次向患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予至少第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约50％；以及iii)向所述患者给予一定剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
通过以下列举的条目描述了多个实施方式。也在考虑之列的是以下实施方式与在本专利申请的发明内容部分、具体实施方式、实施例部分或本专利申请的权利要求中描述的任何适用的实施方式组合的任一种。
1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予第一剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予第二剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
2.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；以及ii)向所述患者给予CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含定向至靶向部分的CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，并且其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞和未转化的T细胞的混合物。
3.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物或抑制CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
4.如条目3所述的方法，其中，步骤iii包括给予叶酸样化合物。
5.如条目3或4中任一项所述的方法，其中，步骤iii包括给予叶酸或醛氢叶酸。
6.如条目3所述的方法，其中，步骤iii包括给予所述包含叶酸样基团的缀合物。
7.如条目6所述的方法，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物包含连接至一个或多个氨基酸的叶酸样化合物。
8.如条目7所述的方法，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物具有下式
Figure BDA0002689264240000371
9.如条目3-8中任一项所述的方法，其中，所述叶酸样化合物具有下式
Figure BDA0002689264240000372
其中，X1和Y1各自独立地选自于由卤素、R2、OR2、SR3和NR4R5所组成的组；U、V和W代表各自独立地选自于由-(R6a)C＝、-N＝、-(R6a)C(R7a)-和-N(R4a)-所组成的组中的二价部分；Q选自于由C和CH所组成的组；T选自于由S、O、N和–C＝C-所组成的组；X2和X3各自独立地选自于由如下所组成的组：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烃基和C1-C12烯氧基，其中，Z为氧或硫；R1选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b和R7b各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷氨基)羰基所组成的组；R6和R7各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6和R7一起形成羰基基团；R6a和R7a各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6a和R7a一起形成羰基基团；p、r、s和t各自独立为0或1；以及*表示与所述缀合物其余部分的共价键。
10.如条目3所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述抑制CAR T细胞激活的试剂选自于由如下所组成的组：淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、IL-2诱导型T细胞激酶抑制剂、JAK抑制剂、BTK抑制剂、EC2319以及阻断CAR T细胞结合至所述化合物或其药学上可接受的盐但不结合至所述癌症的试剂。
11.如条目10所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述试剂是淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
12.如条目11所述的方法，其中，所述淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼。
13.如条目10所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述试剂是PI3激酶抑制剂。
14.如条目13所述的方法，其中，所述PI3激酶抑制剂是GDC0980。
15.如条目10所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述试剂是IL-2诱导型T细胞激酶抑制剂。
16.如条目15所述的方法，其中，所述IL-2诱导型T细胞激酶抑制剂是BMS-509744。
17.如条目10所述的方法，其中，给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂，并且所述试剂是阻断CAR T细胞结合至所述化合物或其药学上可接受的盐但不结合至所述癌症的试剂。
18.如条目17所述的方法，其中，所述试剂是荧光素胺、FITC或荧光素钠。
19.如条目18所述的方法，其中，所述试剂是FITC。
20.如条目18所述的方法，其中，所述试剂是荧光素钠。
21.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.01umole/kg患者体重至约300umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
22.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约100umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
23.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约90umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
24.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约80umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
25.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约70umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
26.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约60umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
27.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约50umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
28.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约40umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
29.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约30umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
30.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约20umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
31.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约10umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
32.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约8umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
33.如条目17-20中任一项所述的方法，其中，以约0.06umole/kg患者体重至约6umole/kg患者体重的剂量给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
34.如条目3-33中任一项所述的方法，其中，向所述患者给予多于一个剂量的所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
35.如条目3-34中任一项所述的方法，其中，在所述化合物或其药学上可接受的盐之前和/或之后向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
36.如条目3-35中任一项所述的方法，其中，所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂的给予引起所述患者中细胞因子水平降低，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
37.如条目36所述的方法，其中，在向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂后约3小时内发生细胞因子水平的降低，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
38.如条目36所述的方法，其中，在向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂后约6小时内发生细胞因子水平的降低，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
39.如条目36-38中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子水平的降低是关于未治疗的患者中的细胞因子水平的降低。
40.如条目3-39中任一项所述的方法，其中，在所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂的给予之前和后面给予所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
41.如条目3-40中任一项所述的方法，其中，在给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂后，即使所述患者中的细胞因子水平降低，所述患者血液中的CAR T细胞数量增加，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
42.如条目3-41中任一项所述的方法，其中，在给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂后，即使经治疗的患者中的细胞因子水平降低，相对于未用挽救试剂治疗的患者，CAR T细胞激活增强或维持，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
43.如条目3-42中任一项所述的方法，其中，所述癌症包括肿瘤，并且当向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂时，所述患者中的肿瘤尺寸不增加，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
44.如条目43所述的方法，其中，获得对所述肿瘤的完全应答。
45.如条目3-44中任一项所述的方法，其中，当CRS等级达到1、2、3或4时，向所述患者给予所述叶酸样化合物、所述包含叶酸样基团的缀合物或所述抑制CAR T细胞激活的试剂，其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
46.如条目45所述的方法，其中，当CRS等级达到3或4时，向所述患者给予所述抑制CAR T细胞激活的试剂。
47.如条目3-46中任一项所述的方法，其中，肺水肿减轻。
48.如条目1-47中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约2500nmole/kg患者体重的剂量给予；并且所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约1500万个CAR T细胞。
49.如条目48所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约100nmole/kg患者体重的剂量给予。
50.如条目48-49中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约50nmole/kg患者体重的剂量给予。
51.如条目48-50中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约20nmole/kg患者体重的剂量给予。
52.如条目48所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重的剂量给予。
53.如条目48所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约200nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重的剂量给予。
54.如条目48所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐以约400nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重的剂量给予。
55.如条目48-54中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约1250万个CAR T细胞。
56.如条目48-55中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约700万个CAR T细胞。
57.如条目48-56中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约500万个CAR T细胞。
58.如条目48-57中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的剂量为约200万个CAR T细胞至约500万个CAR T细胞。
59.如条目1-58中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：终止所述化合物或其药学上可接受的盐的连续给予，以抑制或防止所述患者中的细胞因子释放综合征。
60.如条目1-59中任一项所述的方法，其中，向所述患者连续给予所述化合物或其药学上可接受的盐至少一小时。
61.如条目1-59中任一项所述的方法，其中，向所述患者连续给予所述化合物或其药学上可接受的盐至少四小时。
62.如条目1-59中任一项所述的方法，其中，向所述患者连续给予所述化合物或其药学上可接受的盐至少六小时。
63.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，每隔一天向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
64.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，每周三次向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
65.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，每周两次向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
66.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，每周一次向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
67.如条目1-62中任一项所述的方法，其中，向所述患者给予所述化合物或其药学上可接受的盐，直到发生患者体重不可接受地减轻、发烧、血压下降或肺水肿。
68.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中，向所述患者给予至少第一剂量和第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第一剂量和所述第二剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约15000倍；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
69.如条目68所述的方法，其中，向所述患者给予至少第一剂量、第二剂量和第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第一剂量、所述第二剂量和所述第三剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约750倍，并且其中，第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约800倍至约10000倍。
70.如条目68所述的方法，其中，向所述患者给予至少第一剂量、第二剂量、第三剂量和第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第一剂量、所述第二剂量、所述第三剂量和所述第四剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约750倍，其中，第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约800倍至约7500倍，并且其中，第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约8000倍至约15000倍。
71.如条目70所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约100倍，其中，第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约1000倍，并且其中，第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约10000倍。
72.如条目68所述的方法，其中，向所述患者给予至少第一剂量和第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述第一剂量和所述第二剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约15000倍。
73.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予至少第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约50％；以及iii)向所述患者给予一定剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含定向至所述靶向部分的CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
74.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约60％。
75.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约70％。
76.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约80％。
77.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约90％。
78.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约95％。
79.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约96％。
80.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约97％。
81.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约98％。
82.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约99％。
83.如条目74所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约99.5％。
84.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约1000nmole/kg患者体重。
85.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约900nmole/kg患者体重。
86.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约800nmole/kg患者体重。
87.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约700nmole/kg患者体重。
88.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约100nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重。
89.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约200nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重。
90.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约400nmole/kg患者体重至约600nmole/kg患者体重。
91.如条目73-83中任一项所述的方法，其中，第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约500nmole/kg患者体重。
92.如条目84所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约500nmole/kg患者体重。
93.如条目85所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约450nmole/kg患者体重。
94.如条目86所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约400nmole/kg患者体重。
95.如条目87所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约350nmole/kg患者体重。
96.如条目88所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmole/kg患者体重至约300nmole/kg患者体重。
97.如条目89所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约1nmole/kg患者体重至约300nmole/kg患者体重。
98.如条目90所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约2nmole/kg患者体重至约300nmole/kg患者体重。
99.如条目91所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约2nmole/kg患者体重至约250nmole/kg患者体重。
100.如条目92-99中任一项所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约5nmole/kg患者体重至约40nmole/kg患者体重。
101.如条目92-99中任一项所述的方法，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐为约40nmole/kg患者体重至约150nmole/kg患者体重。
102.如条目73-101中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐与第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐相同。
103.如条目102所述的方法，所述方法进一步包括给予第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐与第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐和第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐相同。
104.如条目73-103中任一项所述的方法，其中，相对于第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，在第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐之后给予的所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量维持对癌症生长的抑制。
105.如条目73-104中任一项所述的方法，其中，以约100万个CAR T细胞至约4000万个CAR T细胞的剂量给予所述CAR T细胞。
106.如条目73-105中任一项所述的方法，其中，每周一次给予在第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐之后给予的所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量。
107.如条目73-105中任一项所述的方法，其中，每周两次给予所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量。
108.如条目1-107中任一项所述的方法，其中，所述CAR进一步包含IgG4铰链结构域、CD3ζ激活结构域和4-1BB共刺激结构域。
109.如条目1-108中任一项所述的方法，其中，所述E2抗荧光素抗体片段是scFv片段。
110.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR蛋白序列与SEQ ID NO：2具有至少约90％同一性。
111.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR蛋白序列与SEQ ID NO：2具有至少约95％同一性。
112.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR蛋白序列与SEQ ID NO：2具有至少约98％同一性。
113.如条目1-112中任一项所述的方法，其中，所述CAR结合荧光素。
114.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR蛋白序列具有至多约50个保守氨基酸置换，并且其中，所述CAR结合荧光素。
115.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR由与SEQ ID NO：1具有至少约90％同一性的多核苷酸编码。
116.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR由与SEQ ID NO：1具有至少约95％同一性的多核苷酸编码。
117.如条目1-109中任一项所述的方法，其中，所述CAR由与SEQ ID NO：1具有至少约98％同一性的多核苷酸编码。
118.如条目115-117中任一项所述的方法，其中，所述CAR结合荧光素。
119.如条目1-118中任一项所述的方法，其中，所述CAR由在高度严格条件下与具有SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且其中，所述CAR结合荧光素。
120.如条目1-119中任一项所述的方法，其中，所述CAR由具有SEQ ID NO：1的多核苷酸编码或由SEQ ID NO：1的简并变体编码。
121.如条目1-120中任一项所述的方法，其中，所述配体选自于由叶酸样化合物、DUPA、NK-1R配体、CAIX配体、γ-谷氨酰转肽酶的配体、NKG2D配体和CCK2R配体所组成的组。
122.如条目1-121中任一项所述的方法，其中，所述靶向部分是荧光素或其药学上可接受的盐。
123.如条目1-122中任一项所述的方法，其中，所述接头包括聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、普朗尼克F-127或它们的组合。
124.如条目1-123中任一项所述的方法，其中，所述接头包括PEG。
125.如条目1-124中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
B-L-T，
其中，B代表所述小分子配体，L代表所述接头，T代表所述靶向部分，并且其中，L包括具有下式的结构：
Figure BDA0002689264240000491
其中，n是0至200的整数。
126.如条目1-125中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自于由如下所组成的组：肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部癌、颈部癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜的癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、急性髓细胞白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、髓系白血病、粒单核细胞白血病、毛细胞白血病、粒单核细胞白血病、毛细胞白血病、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤和胃食管连接处的腺癌。
127.如条目1-126中任一项所述的方法，其中，所述癌症是表达叶酸受体的癌症。
128.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是子宫内膜癌。
129.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是非小细胞肺癌。
130.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是卵巢癌。
131.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是三阴乳腺癌。
132.如条目1-127中任一项所述的方法，其中，所述癌症是急性髓细胞白血病。
133.如条目132所述的方法，其中，所述癌症表达叶酸受体-β。
134.如条目1-133中任一项所述的方法，其中，给予多剂量的所述CAR T细胞组合物。
135.如条目1-134中任一项所述的方法，其中，给予至少两剂量的所述CAR T细胞组合物。
136.如条目1-135中任一项所述的方法，其中，在给予所述化合物或其药学上可接受的盐之前或在给予所述CAR T细胞组合物之前对所述患者进行成像。
137.如条目1-136中任一项所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，并且不包含抗体的片段。
138.如条目1-137中任一项所述的方法，其中，所述靶向部分不包含肽表位。
139.如条目1-138中任一项所述的方法，其中，所述患者中不发生引起脱靶毒性的细胞因子释放，并且其中，发生对所述癌症的CAR T细胞毒性。
140.如条目1-138中任一项所述的方法，其中，所述患者中不发生脱靶组织毒性，并且其中，发生对所述癌症的CAR T细胞毒性。
141.如条目1-138中任一项所述的方法，其中，所述癌症包括肿瘤，其中，所述患者中的肿瘤尺寸减小，并且其中，不发生脱靶毒性。
142.如条目1-141中任一项所述的方法，其中，减少或防止CRS，并且所述方法引起所述患者中肿瘤体积的降低。
143.如条目1-142中任一项所述的方法，其中，减少或防止由于CRS引起的体重减轻。
144.如条目59-67中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述患者再给予所述化合物或其药学上可接受的盐。
145.如条目144所述的方法，其中，所述化合物或其药学上可接受的盐的后续给予引起所述患者中CAR T细胞激活以及细胞因子水平的增加。
146.如条目1-145中任一项所述的方法，其中，所述癌症包括肿瘤，并且其中，获得针对所述肿瘤的完全应答。
147.如条目1-146中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞具有中央记忆/效应记忆表型。
148.如条目1-147中任一项所述的方法，其中，所述CAR T细胞的CD8:CD4比为约1:1。
因此，在一个实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向所述患者给予第一剂量的CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，该CAR T细胞包含CAR，并且其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予第二剂量的CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，该CAR T细胞包含CAR，并且其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，并且其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞和未转化的T细胞的混合物。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，该CAR T细胞包含CAR，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向所述患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物或抑制CAR T细胞激活的药物，其中，包含叶酸样基团的缀合物不含靶向部分。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，并且其中，该化合物或其药学上可接受的盐以约10nmole/kg患者体重至约2500nmole/kg患者体重的剂量进行给予；以及ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，该CART细胞包含CAR，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，并且其中，该CAR T细胞的剂量为约100万个CAR T细胞至约1500万个CAR T细胞。
在再一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者连续给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向所述患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)终止所述化合物或其药学上可接受的盐的连续给予，以抑制或防止患者中的细胞因子释放综合征。
在另一说明性方面，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中，向所述患者给予至少第一剂量和第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，第一剂量和第二剂量不同，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约15000倍；以及ii)向患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。所述方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，并且其中每周一次向患者给予该化合物或其药学上可接受的盐；以及ii)向患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞包含CAR，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向患者给予至少第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约50％；以及iii)向患者给予一定剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，并且其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
因此，在前面的段落和上面的条目列表中提供了各种实施方式，并且该“具体实施方式”、发明内容部分、实施例和权利要求中描述的所有适用的实施方式适用于这些实施方式。
本文所述的“患者”可以是人，或者在兽医应用的情况下，患者可以是实验室动物、农业动物、家养动物或野生动物。在各个方面，患者可以是实验动物，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、猴、黑猩猩；家养动物，例如狗、猫或兔)；农业动物，例如牛、马、猪、绵羊、山羊；或圈养的野生动物，例如熊、熊猫、狮、虎、豹、象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚或鲸。
在各种实施方式中，待治疗的癌症可选自：癌(carcinoma)、肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、鼻咽癌、白血病、腺癌或骨髓瘤。在其它实施方式中，癌症可为：肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部癌、颈部癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜的癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病(包括急性髓细胞白血病)、淋巴细胞性淋巴瘤、髓系白血病、粒单核细胞白血病、毛细胞白血病、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤和胃食管连接处的腺癌。
在这些实施方式的一些方面，癌症是表达叶酸受体的癌症。在另一实施方式中，所述癌症是表达叶酸受体α的癌症。在又一实施方式中，所述癌症是表达叶酸受体β的癌症。在这些实施方式的一些方面，癌症是子宫内膜癌、非小细胞肺癌、卵巢癌或三阴乳腺癌。在另一实施方式中，待治疗的癌症是肿瘤。在另一实施方式中，癌症是恶性的。在另一实施方式中，癌症是急性髓细胞白血病。在又一实施方式中，癌症是急性髓细胞白血病，并且该癌症表达叶酸受体-β。在又一实施方式中，癌症是急性髓细胞白血病，并且CAR-T细胞具有中央记忆/效应记忆表型。在又一实施方式中，CAR T细胞的CD8:CD4比为约1:1、为约1.2:1的比率、为约1:1.2的比率、为约1.3:1的比率、为约1:1.3的比率、为约1.4:1的比率、为约1:1.4的比率、为约1.5:1的比率、或为约1:1.5的比率。在其中癌症是急性髓细胞白血病或另一癌症的另一实施方式中，与肿瘤相关的CAR T细胞相对于与肿瘤不相关的CAR T细胞可以具有增加的CD25表达。
在一个实施方式中，“小分子配体”可以是叶酸样化合物(folate)、DUPA(被PSMA阳性人前列腺癌细胞和其它癌细胞类型结合的配体)、NK-1R配体(例如，在结肠癌和胰腺癌中发现的NK-1R配体的受体)、CAIX配体(例如在肾癌、卵巢癌、外阴癌和乳腺癌中发现的CAIX配体的受体)、γ-谷氨酰转肽酶(例如在卵巢癌、结肠癌、肝癌、星形胶质瘤、黑色素瘤和白血病中过表达的转肽酶)、NKG2D配体(例如在肺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、以及T细胞和B细胞淋巴瘤中发现的NKG2D配体的受体)或CCK2R配体(在甲状腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、脑癌、胃癌、胃肠道间质癌和结肠癌等癌症中发现的CCK2R配体的受体)，它们中的每种均为特异性结合癌细胞类型的小分子配体(即与正常组织相比，这些配体中的每种的受体可在癌症中过表达)。
在一个实施方式中，小分子配体的质量可以小于约10000道尔顿、小于约9000道尔顿、小于约8000道尔顿、小于约7000道尔顿、小于约6000道尔顿、小于约5000道尔顿、小于约4500道尔顿、小于约4000道尔顿、小于约3500道尔顿、小于约3000道尔顿、小于约2500道尔顿、小于约2000道尔顿、小于约1500道尔顿、小于约1000道尔顿、或小于约500道尔顿。在另一实施方式中，小分子配体的质量可以为约1道尔顿至约10000道尔顿、约1道尔顿至约9000道尔顿、约1道尔顿至约8000道尔顿、约1道尔顿至约7000道尔顿、约1道尔顿至约6000道尔顿、约1道尔顿至约5000道尔顿、约1道尔顿至约4500道尔顿、约1道尔顿至约4000道尔顿、约1道尔顿至约3500道尔顿、约1道尔顿至约3000道尔顿、约1道尔顿至约2500道尔顿、约1道尔顿至约2000道尔顿、约1道尔顿至约1500道尔顿、约1道尔顿至约1000道尔顿、或约1道尔顿至约500道尔顿。
在一个实施方式中，DUPA衍生物可以是连接至靶向部分的小分子配体的配体，并且DUPA衍生物描述于WO 2015/057852中，通过引用并入本文。
在一个实施方式中，在“连接至接头的小分子配体”的上下文中的小分子配体是叶酸样化合物。在各种实施方式中，叶酸样化合物可以是叶酸、叶酸类似物或其它叶酸受体结合分子。在各种实施方式中，可以使用的叶酸的类似物包括亚叶酸、蝶酰聚谷氨酸(pteropolyglutamic acid)和结合叶酸受体的蝶啶，例如四氢蝶呤、二氢叶酸、四氢叶酸、以及它们的脱氮和双脱氮类似物。术语“脱氮”和“双脱氮”类似物是指用一个碳原子取代天然存在的叶酸结构中的一个或两个氮原子的本领域公认的类似物。例如，脱氮类似物包括1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮和10-脱氮类似物。双脱氮类似物包括例如1,5-双脱氮、5,10-双脱氮、8,10-双脱氮、和5,8-双脱氮类似物。前述叶酸类似物通常被称为“叶酸样化合物”，反映了它们结合叶酸受体的能力。其它结合叶酸受体的类似物包括氨蝶呤、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、N10-甲基叶酸、2-脱氨基羟基叶酸、脱氮类似物，如1-脱氮甲蝶呤或3-脱氮甲蝶呤、以及3',5'-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。
在另一实施方式中，在“连接至接头的小分子配体”的上下文中的小分子配体可具有下式
Figure BDA0002689264240000561
其中，X1和Y1各自独立地选自于由卤素、R2、OR2、SR3和NR4R5所组成的组；U、V和W代表各自独立地选自于由-(R6a)C＝、-N＝、-(R6a)C(R7a)-和-N(R4a)-所组成的组的二价部分；Q选自于由C和CH所组成的组；T选自于由S、O、N和-C＝C-所组成的组；X2和X3各自独立地选自于由如下所组成的组：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烃基和C1-C12烯氧基，其中，Z为氧或硫；R1选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b和R7b各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷氨基)羰基所组成的组；R6和R7各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6和R7一起形成羰基基团；R6a和R7a各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6a和R7a一起形成羰基基团；p、r、s和t各自独立为0或1；以及*表示与缀合物其余部分的共价键。
在一个方面，结合至包含E2抗荧光素抗体片段并由CAR T细胞表达的CAR的“靶向部分”可以选自例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)和NHS-荧光素。靶向部分的身份仅限于它应被包含E2抗荧光素抗体片段的CAR(优选特异性)识别并结合，以及具有相对低的分子量。在各个方面中，示例性的靶向部分是半抗原，包括小分子量有机分子。
在一个说明性实施方式中，靶向部分可具有以下说明性结构：
Figure BDA0002689264240000571
其中，X为氧、氮或硫，并且其中，X连接到接头L；Y为ORa、NRa 2或NRa 3 +；Y'为O、NRa或NRa 2 +；其中，每个R分别独立地选自H、氟、磺酸、磺酸盐/酯及它们的盐等；Ra是氢或烷基。
在一个说明性方面，接头可包括聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、普朗尼克F-127或它们的组合。
在另一说明性方面，本文所述的化合物或其药学上可接受的盐中的接头可以包括直接链接(例如，FITC的异硫氰酸基团与小分子配体的游离胺基基团之间的反应)，或者链接可以通过中间接头进行。在一个实施方式中，如果存在，则中间接头可以是本领域已知的任何生物相容性接头，例如二价接头。在一个说明性的实施方式中，二价接头可包含约1个至约30个碳原子。在另一示例性的实施方式中，二价接头可包含约2个至约20个碳原子。在其它实施方式中，使用较低分子量的二价接头(即，具有约30至约300道尔顿的近似分子量的二价接头)。在另一实施方式中，合适的接头长度包括但不限于具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个或更多个原子的接头。
在各种实施方式中，连接至靶向部分的小分子配体可以具有下式
B-L-T，
其中，B代表小分子配体，L代表接头，T代表靶向部分，并且其中L包含具有下式的结构：
Figure BDA0002689264240000581
其中n是0至200的整数。在另一实施方式中，n可以是0至150、0至110、0至100、0至90、0至80、0至70、0至60、0至50、0至40、0至30、0至20、0至15、0至14、0至13、0至12、0至11、0至10、0至9、0至8、0至7、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、0至1、15至16、15至17、15至18、15至19、15至20、15至21、15至22、15至23、15至24、15至25、15至26、15至27、15至28、15至29、15至30、15至31、15至32、15至33、15至34、15至35、15至36、15至37、15至38、15至39、15至40、15至50、15至60、15至70、15至80、15至90、15至100、15至110、15至120、15至130、15至140、15至150的整数，或者n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、108、110、120、130、140或150。
在另一实施方式中，接头可以是可包含一个或多个间隔区的二价接头。下表示出了说明性的间隔区。描述了以下非限制性的说明性间隔区，其中，*表示与小分子配体或与靶向部分或与其它二价接头部分的连接点。
Figure BDA0002689264240000601
Figure BDA0002689264240000611
在其它实施方式中，连接至靶向部分的小分子配体(桥梁)可具有以下结构中的任一种。
Figure BDA0002689264240000612
Figure BDA0002689264240000621
Figure BDA0002689264240000631
Figure BDA0002689264240000641
在其它实施方式中，所述化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，并且不包含抗体的片段。在又一实施方式中，靶向部分不包含肽表位。
在一个说明性的实施方式中，通过接头连接至靶向部分的小分子配体(桥梁)包含连接至小分子配体的异硫氰酸荧光素(FITC)。在一个方面，癌症可过表达小分子配体的受体。在另一方面，例如，可以对细胞毒性T细胞或另一类型的T细胞进行转化，以表达包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。在这方面，由于小分子配体结合至癌症而用FITC分子修饰癌症，CAR可以靶向FITC。因此，可以避免对正常的非靶标细胞的毒性。在该实施方式中，当表达E2抗荧光素抗体片段CAR的T细胞结合FITC时，CAR T细胞被激活并且癌症得以改善。
在考虑之列的是通过接头连接至靶向部分的小分子配体的“药学上可接受的盐”。本文所使用的术语“药学上可接受的盐”是指其反离子可用于药物中的那些盐。在各种实施方式中，此类盐包括但不限于1)酸加成盐，其可通过母体化合物的游离碱与无机酸或与有机酸反应获得，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸以及高氯酸等，有机酸例如醋酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等；或者2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土离子或铝离子)替代或者与有机碱配位时形成的盐，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等。药学上可接受的盐是本领域技术人员公知的，并且与本文所述实施方式有关的任何此类药学上可接受的盐在考虑之列。
在各种实施方式中，合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。说明性的实例包括醋酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、hibenzate、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘二甲酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟醋酸盐。
在各种实施方式中，合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。说明性的实例包括精氨酸盐、苄星盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐和锌盐。还可形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。
在一个说明性方面，本文所述的化合物或其药学上可接受的盐可以包含一个或多个手性中心，或者可能能够以多种立体异构体的形式存在。因此，各种实施方式可以包括纯的立体异构体以及立体异构体的混合物，例如对映异构体、非对映异构体以及对映异构体或非对映异构体富集的混合物。在一个方面，本文描述的化合物或其药学上可接受的盐可能能够以几何异构体的形式存在。因此，各种实施方式可包括纯几何异构体或几何异构体的混合物。
在一些方面，本文所述的化合物或其药学上可接受的盐可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并且涵盖在本发明的范围内。
本文所述的方法还利用经工程化以表达包含E2抗荧光素抗体片段的嵌合抗原受体(CAR)的T淋巴细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)，所述E2抗荧光素抗体片段识别并结合桥梁的靶向部分(例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、以及NHS-荧光素)。在一个实施方式中，本文所述的CAR包含三个结构域，其包括：1)识别区域(例如E2抗荧光素抗体的单链可变区片段(scFv)、Fab片段等)，特异性识别并结合靶向部分；2)共刺激结构域，增强T淋巴细胞的增殖和存活；以及3)激活信号传导结构域，产生T淋巴细胞激活信号。
在各个方面，作为非限制性实例，可以使用结合荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)和NHS-荧光素的抗体的scFv区。在说明性的非限制性实施方式中，scFv区可以由如下制备：(i)本领域已知的E2抗体，其结合靶向部分；以及(iii)由此类抗体的scFv区衍生而来的序列变体，例如与它们所衍生自的scFv区的氨基酸序列具有至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的scFv区。
在一个方面，当CAR结合至靶向部分后，共刺激结构域用于增强细胞毒性T淋巴细胞的增殖和存活。合适的共刺激结构域包括但不限于CD28、CD137(4-1BB)、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员、CD134(OX40)、受体TNFR超家族的成员、CD27、CD30、CD150、DAP10、NKG2D和CD278(ICOS)、在激活的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子或，它们的组合。在一个说明性实施方式中，工程化的CAR的共刺激结构域包括CD28和CD137。本领域技术人员将理解，可以使用这些共刺激结构域的序列变体而不会对本发明造成不利影响，其中，所述变体具有与其建模自的结构域相同或相似的活性。在各种实施方式中，此类变体可以与它们所衍生自的结构域的氨基酸序列具有至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性。
在说明性实施方式中，当CAR结合至靶向部分后，激活信号传导结构域用于激活T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)。在各种实施方式中，合适的激活信号传导结构域包括T细胞CD3ζ链、CD3δ受体蛋白、mbl受体蛋白、B29受体蛋白和Fc受体γ。本领域技术人员将理解，可以使用这些激活信号传导结构域的序列变体，其中，所述变体具有与其建模自的结构域相同或相似的活性。在各种实施方式中，变体与它们所衍生自的结构域的氨基酸序列具有至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性。
在一个方面，使用遗传工程技术制备编码包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的构建体。此类技术详细描述于：Sambrook等，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)，以引用的方式并入本文；以及Green和Sambrook，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第四版，Cold Spring HarborLaboratory Press,(2012)，以引用的方式并入本文。
作为实例，可制备编码融合蛋白的质粒或病毒表达载体(例如，慢病毒载体、逆转录病毒载体、睡美人和piggyback(包括非病毒介导的CAR基因递送系统的转座子/转座酶系统))，所述融合蛋白包含读码框内并以5'至3'方向连接的识别区域、一个或多个共刺激结构域和激活信号传导结构域。在其它实施方式中，可接受其它排列，包括识别区域、激活信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一个实施方式中，融合蛋白中识别区域的位置通常将使得实现该区域在细胞外部的展示。在一个实施方式中，包含E2抗荧光素抗体片段的CAR可包含额外的元件：例如，信号肽(例如CD8α信号肽)，以确保融合蛋白正确地输出到细胞表面；跨膜结构域，以确保融合蛋白维持为完整的膜蛋白(例如CD8α跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域)；以及铰链结构域(例如CD8α铰链或IgG4铰链)，从而赋予识别区域灵活性并实现与靶向部分的牢固结合；以及任何其它合适的结构域。
图1中示出了示例性CAR构建体的图，其中，表达的CAR包含E2抗荧光素抗体片段，其中，融合蛋白序列掺入表达载体，并且其中，CAR包含E2抗荧光素抗体片段、IgG4铰链结构域、CD28跨膜结构域，并且其中共刺激结构域为CD137(4-1BB)，激活信号传导结构域为CD3ζ。CAR可包含额外的合适的结构域。CAR插入物的示例性核酸序列以SEQ ID NO：1提供，示例性的编码氨基酸序列以SEQ ID NO：2提供。本文所使用的“SEQ ID NO：1”是指以带下划线的“agc”密码子开始并以带下划线的“ggc”密码子结束的序列。较长序列的该部分编码插入T细胞膜的CAR。较长序列的其它部分包括信号肽、EGFRt结构域等的编码序列，它们不是插入膜中并起嵌合抗原受体作用的CAR的部分。本文所使用的“SEQ ID NO：2”是指以下划线“S”开始并以下划线“G”结束的序列。较长序列的该部分是插入T细胞膜中的CAR的氨基酸序列。较长序列的其它部分包括信号肽、EGFRt结构域等的氨基酸序列，它们不是插入膜中并起嵌合抗原受体作用的CAR的部分。在又一实施方式中，SEQ ID NO：2可包含人源化或人氨基酸序列或者由人源化或人氨基酸序列组成。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2如上所述。在较长的核酸序列中的起始密码子和终止密码子用下划线标出，并且较长的序列是可用于转导T细胞以用于本文所述方法的示例性序列。
SEQ ID NO：1(E2抗荧光素抗体片段CAR核酸序列(插入物))
Figure BDA0002689264240000691
SEQ ID NO：2(E2抗荧光素抗体片段CAR氨基酸序列(插入物))
Figure BDA0002689264240000701
在一个实施方式中，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR包含：识别区域，该识别区域是E2抗荧光素抗体的单链可变区片段(scFv)；共刺激结构域，该共刺激结构域为CD137(4-1BB)；以及激活信号传导结构域，该激活信号传导结构域为T细胞CD3ζ链。在另一实施方式中，CAR可进一步包含任何额外的合适的结构域。本领域技术人员公知，抗FITC scFv和抗荧光素scFv是等效的术语。
在各种实施方式中，“E2抗荧光素抗体片段”可为包含E2抗荧光素抗体的片段(例如scFv片段)的CAR。E2抗荧光素抗体描述于例如Vaughan等，Nature Biotechnol.Vol.14(3),pp.309-314,1996，以引用的方式并入本文。在一个实施方式中，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR对荧光素的结合亲和力可为约0.7nM至约0.8nM、约0.72nM至约0.8nM、约0.73nM至约0.8nM、约0.72nM至约7.8nM、约0.73nM至约0.77nM、或约0.75nM。
在各种实施方式中，CAR可以进一步包含IgG4铰链结构域、CD3ζ激活结构域、和/或4-1BB共刺激结构域、以及其它合适的结构域。在其它实施方式中，CAR可以由与SEQ ID NO：1具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的多核苷酸编码。在另一说明性的实施方式中，CAR可以由在高严格条件下与具有SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在另一方面，CAR可以由具有SEQ ID NO：1的多核苷酸编码或者由SEQ ID NO：1的简并变体编码。在其它实施方式中，CAR蛋白序列可以与SEQ IDNO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性。在另一实施方式中，CAR蛋白序列可具有至多约50个保守氨基酸置换。在本文描述的任何实施方式中，CAR结合荧光素。
在一个实施方式中，可通过用编码表达E2抗荧光素抗体片段的CAR构建体的表达载体转染T淋巴细胞群，对T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)进行遗传工程化以表达CAR构建体，其中，该CAR构建体表达E2抗荧光素抗体片段。制备表达E2抗荧光素抗体片段的转导的T淋巴细胞群的合适方法是技术人员所公知的，并描述于：Sambrook等，“MolecularCloning:A Laboratory Manual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)，以引用的方式并入本文；以及Green和Sambrook，“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2012)，以引用的方式并入本文。
在一个实施方式中，如本文所述可使用包含核酸SEQ ID NO：1的CAR T细胞。在另一实施方式中，如本文所述可使用包含多肽SEQ ID NO：2的CAR T细胞。在另一说明性方面，包含SEQ ID NO：1并编码嵌合抗原受体的核酸(例如，分离的核酸)可用于制备CAR T细胞，以用于如本文所述的用途。在又一实施方式中，包含SEQ ID NO：2的嵌合抗原受体多肽可用于制备CAR T细胞，以用于如本文所述的用途。在另一实施方式中，包含SEQ ID NO：1的载体可用于制备CAR T细胞，以用于如本文所述的用途。在另一方面，提供了包含SEQ ID NO：1的慢病毒载体，所述慢病毒载体可用于制备CAR T细胞以用于如本文所述的用途。在另一实施方式中，SEQ ID NO：2可包含人源化或人氨基酸序列或者由人源化或人氨基酸序列组成。
在这些实施方式的每一个中，在考虑之列的是与SEQ ID NO：1具有至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性的变体核酸序列或氨基酸序列。在另一实施方式中，核酸序列可以是与SEQ ID NO：1具有至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性的变体核酸序列，只要该变体序列编码SEQ ID NO：2的多肽。在另一实施方式中，核酸序列或氨基酸序列可以是与SEQ ID NO：1沿200个核酸的区段(stretch)，或对于SEQ ID NO：2沿200个氨基酸的区段具有至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性的变体核酸或氨基酸序列。在一个实施方式中，可例如通过使用GAP程序(Genetics Computer Group，software；现在可通过Accelrys在http://www.accelrys.com上获得)来确定序列之间的同一性或相似性百分比，比对可以使用例如ClustalW算法(VNTI software,InforMax Inc.)完成。可以使用感兴趣的核酸或氨基酸序列搜索序列数据库。用于数据库搜索的算法通常基于BLAST软件(Altschul等，1990)。在一些实施方式中，同一性百分比可以沿核酸或氨基酸序列的全长确定。
也在本发明的范围内的是，与由SEQ ID NO：1所示的核酸互补的核酸可用于制备CAR T细胞以用于如本文所述的用途，以及可以使用与由SEQ ID NO：1所示的核酸杂交的核酸、或在高严格条件下与其互补物杂交的核酸。根据本发明，“高严格条件”是指在65℃下在5×SSPE和50％甲酰胺中杂交，并在65℃下在0.5×SSPE中洗涤。高严格杂交、低严格杂交和中度严格杂交的条件描述于：Sambrook等，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)，以引用的方式并入本文；以及Green和Sambrook，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第四版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,(2012)，以引用的方式并入本文。在一些说明性方面，杂交沿核酸的全长发生。
在其它实施方式中，用于本文所述方法的CAR可以由与SEQ ID NO：1具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的多核苷酸编码。在另一说明性的实施方式中，CAR可以由在高严格条件下与具有SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在又一方面，CAR可以由具有SEQ ID NO：1的多核苷酸编码或者由SEQ ID NO：1的简并变体编码。本文所使用的简并变体是指具有多于一个的密码子以指定任何特定氨基酸的遗传密码。指定每个氨基酸的简并变体密码子是本领域公知的。在又一方面，可以进行置换以优化特定原核或真核宿主细胞中多肽的生产水平(即，密码子使用变体)。
在其它实施方式中，CAR蛋白序列可与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一实施方式中，CAR蛋白序列可具有至多约50个保守氨基酸置换。在一个实施方式中，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR蛋白序列可具有至多约5个保守氨基酸置换、至多约10个保守氨基酸置换、至多约15个保守氨基酸置换、至多约20个保守氨基酸置换、至多约25个保守氨基酸置换、至多约30个保守氨基酸置换、至多约35个保守氨基酸置换、至多约40个保守氨基酸置换、至多约45个保守氨基酸置换、至多约50个保守氨基酸置换、至多约55个保守氨基酸置换、至多约60个保守氨基酸置换、至多约65个保守氨基酸置换、至多约70个保守氨基酸置换或至多约75个保守氨基酸置换。如本领域技术人员所公知，通过保守氨基酸置换来改变多肽的任何非关键氨基酸不应显著改变该多肽的活性，因为置换氨基酸的侧链应能够形成与被置换的氨基酸的侧链相似的键合和接触。在本文描述的任何实施方式中，CAR结合荧光素。
在一个说明性方面，只要非保守置换不过度影响E2抗荧光素抗体片段多肽的荧光素结合活性，这些非保守置换是可能的。如本领域中公知的，氨基酸的“保守置换”或多肽的“保守置换变体”指维持以下的氨基酸置换：1)多肽的二级结构；2)氨基酸的电荷或疏水性；以及3)侧链的体积(bulkiness)；或这些特征中的任一个或多个。在一个实施方式中，保守氨基酸置换可用氨基酸类似物进行。说明性地，公知的术语“亲水性残基”涉及丝氨酸或苏氨酸。“疏水性残基”指亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸等。“带正电荷的残基”涉及赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或组氨酸。“带负电荷的残基”是指天冬氨酸或谷氨酸。具有“大体积侧链”的残基是指苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸等。表1中给出了保守氨基酸置换的示例性列表。
表1
Figure BDA0002689264240000741
在一个实施方式中，尽管也可以使用异源细胞(例如当被治疗的患者接受高剂量化学疗法或放射治疗以破坏患者的免疫系统时)，在本文描述的方法中使用的T淋巴细胞(例如，用于制备表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的细胞毒性T淋巴细胞，或者未转化的T细胞)可以是自体细胞。在一个实施方式中，可以使用同种异体细胞。
在一个方面，可以通过本领域公知的手段从患者获得T淋巴细胞。例如，可通过以下方式获得T细胞(例如，细胞毒性T细胞或未转化的T细胞)：从患者收集外周血，对血液进行Ficoll密度梯度离心，然后使用阴性T细胞分离试剂盒(例如EasySepTM T细胞分离试剂盒)从外周血中分离T细胞群。在一个说明性的实施方式中，T淋巴细胞(例如，细胞毒性T细胞或未转化的T细胞)的群不必是纯的，并且可以包含其它细胞，例如其它类型的T细胞(例如在细胞毒性T细胞的情况下)、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和B细胞。在一个方面，所收集的群可包含至少约90％的所选细胞类型，至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的所选细胞类型。
在一个实施方式中，获得T淋巴细胞(例如，用于制备表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的细胞毒性T细胞)后，在促进细胞激活的条件下培养细胞。在该实施方式中，培养条件可以使得细胞能够被给予至患者而无需担心对于培养基组分的反应性。例如，培养条件可不包含牛血清产品，例如牛血清白蛋白。在一个说明性方面，可以通过将已知的激活剂(例如在细胞毒性T细胞的情况下的抗CD3抗体)引入培养基中来实现激活。其它合适的激活剂包括抗CD28抗体。在一个方面，可在促进激活的条件下培养淋巴细胞群约1天至约4天。在一个实施方式中，可以通过细胞尺寸、增殖速率或由流式细胞术确定的激活标志物来确定适当的激活水平。
在一个说明性实施方式中，在促进激活的条件下培养T淋巴细胞群(例如，用于制备表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的细胞毒性T淋巴细胞)后，可用编码包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的表达载体转染所述细胞。上文描述了用于各种实施方式中的合适的载体和转染方法。在一个方面，转染后，可将细胞立即给予至患者，或将细胞培养至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天或更多天、或约5天至约12天之间、约6天至约13天之间、约7天至约14天之间、或约8天至约15天之间，例如以让细胞有时间从转染中恢复。在一个方面，合适的培养条件可以类似于在有或没有用于促进激活的试剂的情况下培养细胞以进行激活的条件。
因此，如上所述，在一个说明性方面，本文所述的治疗方法可进一步包括：1)获得自体或异源T淋巴细胞(例如，用于制备表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的细胞毒性T淋巴细胞)的群；2)在促进细胞激活的条件下培养T淋巴细胞；以及3)用编码包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的表达载体转染淋巴细胞，以形成表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。
在一个说明性的实施方式中，当细胞已被转染和激活时，可以制备包含CAR T细胞的组合物，并将其和未转化的T细胞一起给予至患者或者将其在不与未转化的T细胞一起的情况下给予至患者，其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。在一个实施方式中，可使用缺乏任何动物产品(例如牛血清)的培养基来培养表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和/或未转化的T细胞。在另一实施方式中，可以使用本领域技术人员通常用于避免被细菌、真菌和支原体污染的组织培养条件。在一个示例性实施方式中，在向患者给予之前，将细胞(例如表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和/或未转化的T细胞)沉淀，洗涤并重悬于药学上可接受的载体或稀释剂中。包含表达E2抗荧光素抗体片段的表达CAR的T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)或未转化的T细胞的示例性组合物包括包含处于如下中的细胞的组合物：无菌290mOsm盐水中、难溶性cryomedia(包含血浆-Lyte A、右旋糖、氯化钠注射液、人血清白蛋白和DMSO)中、含2％人血清白蛋白的0.9％NaCl中、或任何其它无菌的290mOsm不溶性材料中。或者，在另一实施方式中，取决于培养基的身份，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞或未转化的T细胞可以作为组合物在培养基中进行给予，或在给予前浓缩并重悬于培养基中。在各种实施方式中，可以通过任何合适的手段(例如胃肠外给予，如皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或鞘内)向患者给予具有或不具有未转化的T细胞的CAR T细胞组合物(其中，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段)。
在一个方面，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的总数和给予患者的组合物中细胞的浓度将根据多种因素而变化，所述因素包括使用的T淋巴细胞的类型(例如，细胞毒性T淋巴细胞)、包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的结合特异性、靶向部分和小分子配体的身份、癌症的身份、癌症在患者中的位置、用于向患者给予组合物的手段、以及所治疗患者的健康状况、年龄和重量。在各种实施方式中，包含转导的CAR T细胞(表达E2抗荧光素抗体片段)的合适组合物包括体积为约0.1ml至约200ml和约0.1ml至约125ml的组合物。
在各种实施方式中，向患者给予的转导的CAR T细胞(其中，所述CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR)可以包含约1×105至约1×1015或1×106至约1×1015个表达E2抗荧光素抗体片段的转导的CAR T细胞。在各种实施方式中，可以向患者给予约1×105至约1×1010、约1×106至约1×1010、约1×106至约1×109、约1×106至约1×108、约1×106至约2×107、约1×106至约3×107、约1×106至约1.5×107、约1×106至约1×107、约1×106至约9×106、约1×106至约8×106、约1×106至约7×106、约1×106至约6×106、约1×106至约5×106、约1×106至约4×106、约1×106至约3×106、约1×106至约2×106、约2×106至约6×106、约2×106至约5×106、约3×106至约6×106、约4×106至约6×106、约4×106至约1×107、约1×106至约1×107、约1×106至约1.5×107、约1×106至约2×107、约0.2×106至约1×107、约0.2×106至约1.5×107、约0.2×106至约2×107或约5×106个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。在一个方面，在本文所述的任何实施方式中，可以向患者给予单剂量或多剂量的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。在本段落或本文所述的任何实施方式中，CAR T细胞的数量可以以kg患者体重计。在本文所述的任何实施方式中，可以在化合物或其药学上可接受的盐之前给予表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。应当理解的是，除非另有说明，否则用于本文描述的任何方法的步骤的名称i)、ii)和iii)等并不表示顺序。
在本文所述的各种实施方式中，未转化的T细胞也可以与表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞一起给予，并且可以以本文所述的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和未转化的T细胞的量进行给予。在一个方面，可以一次或多次给予CAR T细胞(其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR)和未转化的T细胞的混合物，或者可以给予表达E2抗荧光素抗体片段的纯CAR T细胞以及表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化T细胞的混合物的剂量组合(例如，一定剂量的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞，然后是一剂量或多剂量的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞的混合物)。根据本文的公开内容对技术人员显而易见的是，本文所述的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和未转化的T细胞的“混合物”是指表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞混合，所述未转化的T细胞未暴露于用于表达包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的构建体。
在其它实施方式中，在CAR T细胞组合物中给予患者的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的剂量选自于由如下所组成的组：约100万个、约200万个、约300万个、约400万个、约500万个、约600万个、约700万个、约800万个、约900万个、约1000万个、约1100万个、约1200万个、约1250万个、约1300万个、约1400万个、以及约1500万个的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。
在其它说明性实施方式中，通过注射向患者的血流(bloodstream)中给予包含表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的CAR T细胞组合物，并且患者血流中表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞到注射CAR T细胞组合物后约4周时占患者血流中的患者总T细胞的至少5％、至少7％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％或至少15％；到注射CAR T细胞组合物后约3周时占至少20％、25％、30％、35％、40％或50％；到注射CAR T细胞组合物后约2周时占至少60％、65％、70％、75％或80％；或到注射CAR T细胞组合物后约1周时占至少85％、90％或95％。
在本文所述的实施方式中，CAR T细胞组合物可以包含表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞，而没有任何其它细胞类型，或者可以向患者给予未转化的T细胞与表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的组合。对于给予多剂量的CAR T细胞组合物的实施方式，任何剂量可包含表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞、或表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞的混合物。在各种实施方式中，可以以本文针对表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞所述的量给予未转化的T细胞。
在另一实施方式中，任何剂量的CAR T细胞组合物可包含选自如下比例的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和未转化的T细胞的混合物：表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞约1:5、表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞约1:4、表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞约1:3、表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞约1:2、以及表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞约1:1。
在其它实施方式中，任何剂量的CAR T细胞组合物可包含表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞的混合物，其比例为表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与未转化的T细胞约1:1至约1:5；或者，CAR T细胞组合物可以包含约1000万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和约4000万个未转化的T细胞的混合物、约1500万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和约3500万个未转化的T细胞的混合物、约2000万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和约3000万个未转化的T细胞的混合物、或约2500万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和约2500万个未转化的T细胞的混合物。
可以使用任何本领域已知的合适方法向患者给予本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或者CAR T细胞组合物(其中，该组合物包含含有CAR的CAR T细胞，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段)。如本文所述的术语“给予(administering/administered)”包括向患者引入化合物或其药学上可接受的盐或者包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物(所述CART细胞具有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR)的所有方式，包括但不限于口服、静脉内、肌内、皮下、透皮等。在一个方面，本文所述的化合物或其药学上可接受的盐可以以单位剂型和/或包含常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂和运载体的制剂进行给予。
在一个方面，可以直接向血流中、肌肉中或内部器官中给予本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或者CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含表达CAR的CART细胞，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。在各种实施方式中，用于这种胃肠外给予的合适途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、硬膜外、脑室内、尿道内、胸骨内、颅内、肿瘤内、肌内和皮下递送。在一个实施方式中，用于胃肠外给予的手段包括针(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术。
在一个说明性方面，胃肠外制剂通常是水溶液，所述水溶液可以包含载体或赋形剂(例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选处于pH 3至9))，但是，它们可以更合适地配制为无菌的非水溶液或干燥形式，以与合适的运载体(例如无菌、无热原的水或无菌盐水)结合使用。在其它实施方式中，本文所述的任何液体制剂可适于本文所述的胃肠外给予。通过冻干以生产用于胃肠外制剂的无菌冻干粉剂，在无菌条件下的制备可以使用本领域技术人员公知的标准制药技术容易地完成。在一个实施方式中，用于胃肠外制剂的制备中的化合物或其药学上可接受的盐的溶解度可以通过使用适当的制剂技术(例如掺入溶解度增强剂)而增加。
给予患者的化合物或其药学上可接受的盐的量可以根据所治疗的癌症、化合物或其药学上可接受的盐的给药途径以及组织分布而显著变化。给予患者的量可以基于身体表面积、质量和医师评价。在各种实施方式中，待给予的量的范围可以在例如约0.05mg至约30mg、0.05mg至约25.0mg、约0.05mg至约20.0mg、约0.05mg至约15.0mg、约0.05mg至约10.0mg、约0.05mg至约9.0mg、约0.05mg至约8.0mg、约0.05mg至约7.0mg、约0.05mg至约6.0mg、约0.05mg至约5.0mg、约0.05mg至约4.0mg、约0.05mg至约3.0mg、约0.05mg至约2.0mg、约0.05mg至约1.0mg、约0.05mg至约0.5mg、约0.05mg至约0.4mg、约0.05mg至约0.3mg、约0.05mg至约0.2mg、约0.05mg至约0.1mg、约.01mg至约2mg、约0.3mg至约10mg、约0.1mg至约20mg或约0.8至约3mg。本领域技术人员将容易理解，剂量可以基于上述因素在以上提供的各个范围内变化，并且可以由医师自由裁量。
在其它实施方式中，所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量范围可以是例如约50nmole/kg至约3000nmole/kg患者体重、约50nmole/kg至约2000nmole/kg、约50nmole/kg至约1000nmole/kg、约50nmole/kg至约900nmole/kg、约50nmole/kg至约800nmole/kg、约50nmole/kg至约700nmole/kg、约50nmole/kg至约600nmole/kg、约50nmole/kg至约500nmole/kg、约50nmole/kg至约400nmole/kg、约50nmole/kg至约300nmole/kg、约50nmole/kg至约200nmole/kg、约50nmole/kg至约100nmole/kg、约100nmole/kg至约300nmole/kg、约100nmole/kg至约500nmole/kg、约100nmole/kg至约1000nmole/kg、约100nmole/kg至约2000nmole/kg患者体重。在其它实施方式中，剂量可以为约1nmole/kg、约5nmole/kg、约10nmole/kg、约20nmole/kg、约25nmole/kg、约30nmole/kg、约40nmole/kg、约50nmole/kg、约60nmole/kg、约70nmole/kg、约80nmole/kg、约90nmole/kg、约100nmole/kg、约150nmole/kg、约200nmole/kg、约250nmole/kg、约300nmole/kg、约350nmole/kg、约400nmole/kg、约450nmole/kg、约500nmole/kg、约600nmole/kg、约700nmole/kg、约800nmole/kg、约900nmole/kg、约1000nmole/kg、约2000nmole/kg、约2500nmole/kg或约3000nmole/kg患者体重。
在各种其它实施方式中，所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量范围可以为例如约10nmole/kg至约10000nmole/kg、约10nmole/kg至约5000nmole/kg、约10nmole/kg至约3000nmole/kg、约10nmole/kg至约2500nmole/kg、约10nmole/kg至约2000nmole/kg、约10nmole/kg至约1000nmole/kg、约10nmole/kg至约900nmole/kg、约10nmole/kg至约800nmole/kg、约10nmole/kg至约700nmole/kg、约10nmole/kg至约600nmole/kg、约10nmole/kg至约500nmole/kg、约10nmole/kg至约400nmole/kg、约10nmole/kg至约300nmole/kg、约10nmole/kg至约200nmole/kg、约10nmole/kg至约150nmole/kg、约10nmole/kg至约100nmole/kg、约10nmole/kg至约90nmole/kg、约10nmole/kg至约80nmole/kg、约10nmole/kg至约70nmole/kg、约10nmole/kg至约60nmole/kg、约10nmole/kg至约50nmole/kg、约10nmole/kg至约40nmole/kg、约10nmole/kg至约30nmole/kg、约10nmole/kg至约20nmole/kg、约200nmole/kg至约900nmole/kg、约200nmole/kg至约800nmole/kg、约200nmole/kg至约700nmole/kg、约200nmole/kg至约600nmole/kg、约200nmole/kg至约500nmole/kg、约250nmole/kg至约600nmole/kg、约300nmole/kg至约600nmole/kg、约300nmole/kg至约500nmole/kg、或约400nmole/kg至约600nmole/kg患者体重。在各种其它实施方式中，所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量范围可以为例如约1nmole/kg至约10000nmole/kg、约1nmole/kg至约5000nmole/kg、约1nmole/kg至约3000nmole/kg、约1nmole/kg至约2500nmole/kg、约1nmole/kg至约2000nmole/kg、约1nmole/kg至约1000nmole/kg、约1nmole/kg至约900nmole/kg、约1nmole/kg至约800nmole/kg、约1nmole/kg至约700nmole/kg、约1nmole/kg至约600nmole/kg、约1nmole/kg至约500nmole/kg、约1nmole/kg至约400nmole/kg、约1nmole/kg至约300nmole/kg、约1nmole/kg至约200nmole/kg、约1nmole/kg至约150nmole/kg、约1nmole/kg至约100nmole/kg、约1nmole/kg至约90nmole/kg、约1nmole/kg至约80nmole/kg、约1nmole/kg至约70nmole/kg、约1nmole/kg至约60nmole/kg、约1nmole/kg至约50nmole/kg、约1nmole/kg至约40nmole/kg、约1nmole/kg至约30nmole/kg、或约1nmole/kg至约20nmole/kg。在又一其它实施方式中，剂量可以为约0.1nmole/kg、约0.2nmole/kg、约0.3nmole/kg、约0.4nmole/kg或约0.5nmole/kg、约0.1nmole/kg至约1000nmole/kg、约0.1nmole/kg至约900nmole/kg、约0.1nmole/kg至约850nmole/kg、约0.1nmole/kg至约800nmole/kg、约0.1nmole/kg至约700nmole/kg、约0.1nmole/kg至约600nmole/kg、约0.1nmole/kg至约500nmole/kg、约0.1nmole/kg至约400nmole/kg、约0.1nmole/kg至约300nmole/kg、约0.1nmole/kg至约200nmole/kg、约0.1nmole/kg至约100nmole/kg、约0.1nmole/kg至约50nmole/kg、约0.1nmole/kg至约10nmole/kg、或约0.1nmole/kg至约1nmole/kg患者体重。在其它实施方式中，剂量可以为约0.3nmole/kg至约1000nmole/kg、约0.3nmole/kg至约900nmole/kg、约0.3nmole/kg至约850nmole/kg、约0.3nmole/kg至约800nmole/kg、约0.3nmole/kg至约700nmole/kg、约0.3nmole/kg至约600nmole/kg、约0.3nmole/kg至约500nmole/kg、约0.3nmole/kg至约400nmole/kg、约0.3nmole/kg至约300nmole/kg、约0.3nmole/kg至约200nmole/kg、约0.3nmole/kg至约100nmole/kg、约0.3nmole/kg至约50nmole/kg、约0.3nmole/kg至约10nmole/kg、或约0.3nmole/kg至约1nmole/kg患者体重。在这些实施方式中，“kg”是患者体重的千克。在一个方面，可以向患者给予单剂量或多剂量的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一实施方式中，可以向患者给予约20ug/kg患者体重至约3mg/kg患者体重的化合物或其药学上可接受的盐。在另一方面，所述量可以为约0.2mg/kg患者体重和约0.4mg/kg患者体重，或可以为约50ug/kg患者体重。在一个方面，可以向患者给予单剂量或多剂量的化合物或其药学上可接受的盐。
在一个实施方式中，可在包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物之前向患者给予连接至靶向部分的小分子配体(化合物)，其中，该CAR T细胞具有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。在另一实施方式中，可以同时但在不同制剂中，或在相同制剂中向患者给予连接至靶向部分的小分子配体(桥梁)以及包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞具有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。在又一实施方式中，可在包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物之后向患者给予连接至靶向部分的小分子配体，其中，该CAR T细胞具有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。
在一个说明性方面，给予具有CAR(包含E2抗荧光素抗体片段)的CAR T细胞与连接至靶向部分的小分子(桥梁)之间的时间可根据包括以下的因素而广泛变化：使用的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的类型、具有E2抗荧光素抗体片段的CAR的结合特异性、靶向部分和小分子配体的身份、癌症的身份、癌症在患者中的位置、用于向患者给予表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和连接至靶向部分的小分子配体的手段、以及患者的健康状况、年龄和重量。在一个方面，连接至靶向部分的小分子配体可以在CAR T细胞之前或之后进行给予，例如在约3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、21小时、24小时、27小时、30小时、33小时、36小时、39小时、42小时、45小时、48小时或51小时内，或约0.5天、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更多天内。
在一个实施方式中，本领域已知的任何适用的用药方案可用于所述化合物或其药学上可接受的盐的给予，或者用于CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含具有CAR的CAR T细胞，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。例如，可以使用每天用药一次(又称qd)、每天用药两次(又称bid)、每天用药三次(又称tid)、每周用药两次(又称BIW)、每周用药三次(又称TIW)、每周一次用药等。在一个方面，为化合物或其药学上可接受的盐以及CAR T细胞组合物(其中，该CAR T细胞组合物包含具有CAR的CAR T细胞，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)所选择的用药方案可以考虑化合物或其药学上可接受的盐的浓度，以及给予的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的数量，以调节CAR T细胞组合物(其中，该CAR T细胞组合物包含具有CAR的CAR T细胞，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)的细胞毒性，并控制CRS。
在一个实施方式中，为了防止或抑制患者中的细胞因子释放综合征(CRS)，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向患者给予CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中，该CAR T细胞包含CAR，其中，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段；以及iii)向患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物或抑制CAR T细胞激活的药物，其中，该包含叶酸样基团的缀合物不含靶向部分。
在该方法实施方式中，向患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，该包含叶酸样基团的缀合物不含靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的药物的步骤可以用于防止或抑制患者中的CRS。在该实施方式中，叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，该包含叶酸样基团的缀合物不含靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的药物的任一种在本文中可称为“挽救试剂”。在一个实施方式中，可给予叶酸样化合物(例如叶酸)以防止或抑制患者中的CRS。在该实施方式中，叶酸样化合物抑制桥梁(即通过接头连接至靶向部分的小分子配体)与肿瘤上桥梁的受体的相互作用，从而抑制肿瘤溶解并防止或抑制患者中的CRS。
在另一实施方式中，挽救试剂能够以给予挽救试剂之后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8个小时、约9个小时或约10个小时内迅速降低CRS。例如，可以降低CRS的等级(例如，3级至2级、4级至3级等)。
下面示出示例性分级系统，列1-6为0级、1级、2级、3级、4级和5级：
Figure BDA0002689264240000851
在一个实施方式中，作为桥梁结合至肿瘤的抑制剂给予的叶酸样化合物可以是例如叶酸、叶酸类似物或其它叶酸受体结合分子。在各种实施方式中，可以使用的叶酸的类似物包括亚叶酸、蝶酰聚谷氨酸和结合叶酸受体的蝶啶，例如四氢蝶呤、二氢叶酸、四氢叶酸、以及它们的脱氮和双脱氮类似物。术语“脱氮”和“双脱氮”类似物是指用一个碳原子取代天然存在的叶酸结构中的一个或两个氮原子的本领域公认的类似物。例如，脱氮类似物包括1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮和10-脱氮类似物。双脱氮类似物包括例如1,5-双脱氮、5,10-双脱氮、8,10-双脱氮、和5,8-双脱氮类似物。前述叶酸类似物通常被称为“叶酸样化合物”，反映了它们结合叶酸受体的能力。其它结合叶酸受体的类似物包括氨蝶呤、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、N10-甲基叶酸、2-脱氨基羟基叶酸、脱氮类似物，如1-脱氮甲蝶呤或3-脱氮甲蝶呤、以及3',5'-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰基谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。
在另一实施方式中，作为桥梁结合至肿瘤的抑制剂给予的叶酸样化合物具有下式
Figure BDA0002689264240000861
其中，X1和Y1各自独立地选自于由卤素、R2、OR2、SR3和NR4R5所组成的组；U、V和W代表各自独立地选自于由-(R6a)C＝、-N＝、-(R6a)C(R7a)-和-N(R4a)-所组成的组中的二价部分；Q选自于由C和CH所组成的组；T选自于由S、O、N和–C＝C-所组成的组；X2和X3各自独立地选自于由如下所组成的组：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烃基和C1-C12烯氧基，其中，Z为氧或硫；R1选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b和R7b各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷氨基)羰基所组成的组；R6和R7各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6和R7一起形成羰基基团；R6a和R7a各自独立地选自于由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所组成的组；或者，R6a和R7a一起形成羰基基团；p、r、s和t各自独立地为0或1；以及*表示与所述缀合物其余部分的共价键。
在另一实施方式中，可以给予包含叶酸样基团的缀合物以防止或抑制患者中的细胞因子释放综合征(CRS)。CRS是本领域公知的术语，该综合征可对患者造成有害影响，包括但不限于体重减轻、高烧、肺水肿和危险的血压下降。
在该实施方式中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分，因此，该缀合物抑制桥梁与肿瘤的相互作用以防止肿瘤溶解并降低患者中的CRS。在该实施方式中，包含叶酸样基团的缀合物中的叶酸样基团部分可包括前述段落中描述的任何叶酸样化合物，所述叶酸样化合物连接至不包含靶向部分的化学部分。在一个方面，包含叶酸样基团的缀合物可包含连接至不包含靶向部分的一个或多个氨基酸的叶酸样化合物。说明性地，包含叶酸样基团的缀合物可以具有下式
Figure BDA0002689264240000871
该化合物也可称为“EC923”。在这些实施方式中，可以向患者以相对于桥梁(即，通过接头连接至靶向部分的小分子配体)过量的摩尔量给予叶酸样化合物或包含叶酸样基团的缀合物，例如，相对于通过接头连接至靶向部分的小分子配体，叶酸样化合物或包含叶酸样基团的缀合物10倍过量、100倍过量、200倍过量、300倍过量、400倍过量、500倍过量、600倍过量、700倍过量、800倍过量、900倍过量、1000倍过量或10,000倍过量。抑制桥梁与肿瘤的相互作用所需的相对于通过接头连接至靶向部分的小分子配体的量的叶酸样化合物或包含叶酸样基团的缀合物的量可以由技术人员确定。
在另一实施方式中，可以向患者给予抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的挽救试剂，以抑制CAR T细胞激活并抑制或防止患者中的CRS。在一个方面，该试剂可以选自于由如下所组成的组：淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如达沙替尼)、PI3激酶抑制剂(例如GDC0980)、IL-2诱导型T细胞激酶的抑制剂(例如BMS-509744)、JAK抑制剂、BTK抑制剂、Tociluzumab、SIP激动剂(例如Siponimod和Ozanimod)以及能阻断CAR T细胞结合至桥梁但不结合至癌症的试剂(例如荧光素胺、FITC或荧光素钠)。本领域技术人员理解，FITC(即荧光素)在生理条件下或例如在生理pH下的缓冲液中可处于盐的形式(例如荧光素钠)或其非盐形式。因此，在一个实施方式中，当向患者给予荧光素时，可以在其盐形式(例如荧光素钠)和其非盐形式之间处于平衡。在另一实施方式中，抑制CAR T细胞激活的挽救试剂可以是下式的化合物
Figure BDA0002689264240000881
在各种实施方式中，可以在任何适当的体积(包括例如0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、100mL、或1000ml)中以约0.001nM至约100mM、约.01nM至约100mM、约1nM至约100mM、约10nM至约100mM、约50nM至约100mM、或约100nM至约100mM的浓度给予挽救试剂。在其它实施方式中，可以以约0.01umole/kg至约300umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约100umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约90umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约80umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约70umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约60umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约50umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约40umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约30umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约20umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约10umole/kg患者体重、约0.06umole/kg至约8umole/kg患者体重、或约0.06umole/kg至约6umole/kg患者体重的剂量给予挽救试剂。
在这些实施方式中，可以向患者以相对于化合物或其药学上可接受的盐(即，通过接头连接至靶向部分的小分子配体)过量的摩尔量给予挽救试剂，例如相对于通过接头连接至靶向部分的小分子配体，挽救试剂约10倍过量、约20倍过量、约30倍过量、约40倍过量、约50倍过量、约60倍过量、约70倍过量、约80倍过量、约90倍过量、约100倍过量、约200倍过量、约300倍过量、约400倍过量、约500倍过量、约600倍过量、约700倍过量、约800倍过量、约900倍过量、约1000倍过量或约10,000倍过量。抑制化合物或其药学上可接受的盐与表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞和/或肿瘤的相互作用所需的、相对于通过接头连接至靶向部分的小分子配体(桥梁)的量的挽救试剂的量可以由技术人员确定。
在另一实施方式中，可以向患者给予多于一个剂量的叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的试剂，其中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。
在本文所述的“挽救试剂”实施方式中，可以在化合物或其药学上可接受的盐之前和/或之后向患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的试剂，其中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分。在另一方面，可以在给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的试剂之前和后面给予该化合物或其药学上可接受的盐。在该实施方式中，化合物或其药学上可接受的盐的后续给予可引起表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的激活以及患者中细胞因子水平的增加。
在另一实施方式中，给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的试剂可引起患者中细胞因子水平降低。在又一实施方式中，细胞因子水平的降低可在向患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的试剂后约1小时内、约2小时内、约3小时内、约4小时内、约5小时内、约6小时内、约7小时内或约8小时内发生。在另一实施方式中，细胞因子水平的降低是关于未治疗的患者中细胞因子水平的降低。
在另一说明性的实施方式中，在给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的试剂后，患者血液中表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的数量可增加，即使患者中的细胞因子水平降低。在另一说明性方面，在给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分)或抑制CAR T细胞(其中，该CAR T细胞包含含有E2抗荧光素抗体片段的CAR)激活的挽救试剂后，相对于未用挽救试剂治疗的患者，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的激活可增强或维持，即使经治疗的患者中的细胞因子水平降低。在又一实施方式中，癌症包括肿瘤，并且当向患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的挽救试剂时，患者中的肿瘤尺寸不增加。在该实施方式中，可以获得针对肿瘤的完全应答。
在其它实施方式中，当CRS等级达到1、2、3或4或者当CRS等级达到3或4时，向患者给予抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的激活的挽救试剂。另一方面，当给予挽救试剂时，患者中的肺水肿减轻。
在本文描述的一个实施方式中，提供了治疗癌症的方法，并且该方法包括：i)向患者连续给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR；以及iii)终止化合物或其药学上可接受的盐的连续给予，以抑制或防止患者中的细胞因子释放综合征。
根据该实施方式，术语“连续”可意指向患者给予化合物或其药学上可接受的盐例如至少一小时、至少四小时、至少六小时、至少八小时、至少十小时、至少十二小时或至少二十四小时；或者可意指每天或每周给予的方案，例如每天一次、每天两次、每天三次、每天、隔天、每周一次、每周两次、每周三次、或者本领域技术人员认为是连续给予的任何其它合适方案。在另一方面，术语“连续”可意指该段落中描述的实施方式的任意组合。
在该方法实施方式中，“终止化合物或其药学上可接受的盐的连续给予”以抑制或防止患者中的细胞因子释放综合征的步骤可意指例如在给予连续的一段时间(例如数小时或数天)后停止给予，或停止治疗方案(例如上述的每日或每周的方案)。在另一实施方式中，“终止连续给予”的步骤可意指例如给予直至患者体重发生不可接受的减轻，或直至发生任何其它不可接受的副作用(例如高烧、血压降低或肺水肿)。在该实施方式中，“终止化合物或其药学上可接受的盐的连续给予”的步骤并不意味着用化合物或其药学上可接受的盐进行单次治疗，而不使用该化合物或其药学上可接受的盐进行后续治疗。在该方法实施方式中，“抑制或防止”细胞因子释放综合征(CRS)是指消除CRS或者减轻或改善CRS的症状。
在涉及终止化合物或其药学上可接受的盐的连续给予的实施方式的一个实施方式中，该方法可进一步包括向患者再给予化合物或其药学上可接受的盐的步骤iv)。在一个实施方式中，化合物或其药学上可接受的盐可以例如每周一次给予并且可以省略一剂。在另一实施方式中，化合物或其药学上可接受的盐可以隔日(即隔天)给予，并且可以省略一剂或多(例如二、三、四等)剂。在另一实施方式中，化合物或其药学上可接受的盐可以每周两次进行给予，并且可以省略一剂或多(例如二、三、四等)剂。在另一实施方式中，化合物或其药学上可接受的盐可以在星期一、星期二和下一个星期一进行给予，然后可以停止用药两周，并重复该循环。在另一实施方式中，可以使用上述任何方案的实施方式，并且可以省略一剂或多(例如二、三、四等)剂。在这些实施方式中，省略的剂量可以防止或降低患者中的CRS。
在又一说明性方面，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中，向患者给予至少第一剂量和第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第一剂量和第二剂量不同，其中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约15000倍；以及ii)向患者给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。
在该实施方式中，化合物或其药学上可接受的盐的剂量可以逐渐上升以抑制或防止患者中的细胞因子释放综合征。例如，可以向患者给予至少第一剂量和第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第一剂量和第二剂量不同，其中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约20倍至约15000倍、高约2倍至约15000倍。在其它实施方式中，第二剂量或后续剂量的量可比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约30倍、约2倍至约40倍、约2倍至约50倍、约2倍至约60倍、约2倍至约70倍、约2倍至约80倍、约2倍至约90倍、约2倍至约100倍、约2倍至约15000倍、约2倍至约10000倍、约5倍至约9000倍、约5倍至约8000倍、约5倍至约7000倍、约5倍至约6000倍、约5倍至约5000倍、约5倍至约4000倍、约5倍至约3000倍、约5倍至约4000倍、约5倍至约3000倍、约5倍至约2000倍、约5倍至约1000倍、约5倍至约750倍、约2倍至约750倍、约5倍至约500倍、约5倍至约100倍、约800倍至约15000倍、约800倍至约10000倍、约800倍至约9000倍、约800倍至约8000倍、约800倍至约7000倍、约800倍至约6000倍、约800倍至约5000倍、约800倍至约4000倍、约800倍至约3000倍、约800倍至约2000倍、约800倍至约1000倍、约8000倍至约15000倍、约8000倍至约10000倍、约8000倍至约9000倍、约15000倍、约10000倍、约9000倍、约8000倍、约7000倍、约6000倍、约5000倍、约4000倍、约3000倍、约2000倍、约1000倍、约500倍、约400倍、约300倍、约200倍、约100倍、约90倍、约80倍、约70倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍、约5倍或约2倍。
在剂量上升方法的另一说明性实施方式中，可以向患者给予至少第一剂量、第二剂量和第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第一剂量、第二剂量和第三剂量不同，其中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约750倍，其中，第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约800倍至约10000倍。
在剂量上升方法的另一方面，可以向患者给予至少第一剂量、第二剂量、第三剂量和第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第一剂量、第二剂量、第三剂量和第四剂量不同，其中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约2倍至约750倍，其中，第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约800倍至约7500倍，其中，第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约8000至约15000倍。
在另一实施方式中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量可比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约100倍，第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量可比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约1000倍，第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量可比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量高约10000倍。在示例性实施方式中，第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为0.05nmole/kg，第二剂量为5nmole/kg，第三剂量为50nmole/kg，第四剂量为500nmole/kg。在本文所述的剂量上升的实施方式中，第一剂量、第二剂量、第三剂量、第四剂量和任何后续剂量的化合物或其药学上可接受的盐可多次给予(例如，在给予后续的上升剂量之前给予多次0.05nmole/kg的第一剂量)。
在本文描述的另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向患者给予至少第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约50％；以及iii)向患者给予一定剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，所述CAR T细胞包含CAR，所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在这种剂量降阶(de-escalation)实施方式的各种实施方式中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量可比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约60％、比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约70％、比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约80％、比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约90％、比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约95％、比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约96％、比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约97％、比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约98％、比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约99％、或比第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约99.5％。
在本文所述的剂量降阶实施方式的各种实施方式中，第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐可为约100nmole/kg至约1000nmole/kg患者体重、约100nmole/kg至约900nmole/kg患者体重、约100nmole/kg至约800nmole/kg患者体重、约100nmole/kg至约700nmole/kg患者体重、约100nmole/kg至约600nmole/kg患者体重、约200nmole/kg至约600nmole/kg患者体重、约400nmole/kg至约600nmole/kg患者体重、或约500nmole/kg患者体重。
在本文所述的剂量降阶实施方式的各种实施方式中，第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐可为约0.5nmole/kg至约500nmole/kg患者体重、约0.5nmole/kg至约450nmole/kg患者体重、约0.5nmole/kg至约400nmole/kg患者体重、约0.5nmole/kg至约350nmole/kg患者体重、约0.5nmole/kg至约300nmole/kg患者体重、约1nmole/kg至约300nmole/kg患者体重、约2nmole/kg至约300nmole/kg患者体重、约2nmole/kg至约250nmole/kg患者体重、约5nmole/kg至约40nmole/kg患者体重、或约40nmole/kg至约150nmole/kg患者体重。
在本文所述的剂量降阶实施方式的额外的实施方式中，该方法可以进一步包括给予第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐与第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐相同。在另一实施方式中，该方法可进一步包括给予第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐与第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐、以及第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐相同。在又一实施方式中，相对于第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，在第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐之后给予的化合物或其药学上可接受的盐的剂量可维持对癌症生长的抑制。
在本文所述的剂量降阶实施方式的其它实施方式中，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞可以约100万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞至约4000万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的剂量给予。
在其它实施方式中，在第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐之后给予的化合物或其药学上可接受的盐的剂量可以每周给予一次或两次。在本文所述的剂量降级实施方式的其它实施方式中，该方法可进一步包括向患者给予叶酸样化合物、包含叶酸样基团的缀合物(其中，所述包含叶酸样基团的缀合物不包含靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的试剂的步骤。
在另一实施方式中，向患者给予抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞激活的试剂，并且该试剂是阻断表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞结合至化合物或其药学上可接受的盐的试剂，但该试剂不结合至癌症，并且该试剂是荧光素胺、荧光素钠或荧光素。在又一实施方式中，该试剂是荧光素钠。在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，并且其中，在给予包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物之前至少约一小时向患者给予该化合物或其药学上可接受的盐，其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR；ii)然后向患者给予一定剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR；以及iii)然后向患者给予第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐。在该预处理实施方式的各种实施方式中，可在给予CAR T细胞组合物前至少约两小时、在给予CAR T细胞组合物前至少约四小时、给予CAR T细胞组合物前至少约八小时、给予CAR T细胞组合物前至少约十二小时、给予CAR T细胞组合物前至少约十六小时、给予CAR T细胞组合物前至少约二十小时、或给予CAR T细胞组合物前至少约二十四小时，向患者给予第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，在每种情况下，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，所述CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。
在该预处理实施方式的各种实施方式中，可以在给予CAR T细胞组合物后至少约二十四小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约二十小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约十八小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约十六小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约十四小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约十二小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约十小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约八小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约六小时内、在给予CAR T细胞组合物后至少约四小时内、或在给予CAR T细胞组合物后至少约两小时内，向患者给予第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐，在每种情况下，其中，所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，所述CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。
在本文所述的其中叶酸样化合物是通过接头连接至靶向部分的配体的任何实施方式中，可以在用本文所述的方法治疗之前使患者接受缺乏叶酸样化合物的饮食，或者可以在饮食中向患者给予叶酸样化合物。在向患者给予叶酸样化合物的实施方式中，剂量的范围可为例如约50nmol/kg至约3000nmol/kg患者体重、约50nmol/kg至约2000nmol/kg、约50nmol/kg至约1000nmol/kg、约50nmol/kg至约900nmol/kg、约50nmol/kg至约800nmol/kg、约50nmol/kg至约700nmol/kg、约50nmol/kg至约600nmol/kg、约50nmol/kg至约500nmol/kg、约50nmol/kg至约400nmol/kg、约50nmol/kg至约300nmol/kg、约50nmol/kg至约200nmol/kg、约50nmol/kg至约100nmol/kg、约100nmol/kg至约300nmol/kg、约100nmol/kg至约500nmol/kg、约100nmol/kg至约1000nmol/kg、约100nmol/kg至约2000nmol/kg患者体重。在其它实施方式中，剂量可为约100nmol/kg、约150nmol/kg、约200nmol/kg、约250nmol/kg、约300nmol/kg、约350nmol/kg、约400nmol/kg、约450nmol/kg、约500nmol/kg、约600nmol/kg、约700nmol/kg、约800nmol/kg、约900nmol/kg、约1000nmol/kg、约2000nmol/kg或约3000nmol/kg患者体重。在这些实施方式中，“kg”是患者体重的千克。在一个方面，可以例如每天、每周、每两周、每周三次给予叶酸样化合物，或可使用任何合适的给予叶酸样化合物的方案来给予叶酸样化合物。
在本文所述的各种实施方式中，在CAR T细胞给予后，CAR T细胞处于数量上升的循环CAR T细胞的情况可持续长达约10天、长达约15天、长达约20天、长达约25天、长达约30天、长达约35天、长达约40天、长达约45天、长达约50天、长达约55天、长达约60天、长达约65天、长达约70天、长达约75天或长达约80天。
在本文所述的各种实施方式中，化合物或其药学上可接受的盐的半最大效应浓度(EC50)可为约1pM至约2nM、约1pM至约5nM、约1pM至约10nM、约1pM至约20nM、约1pM至约30nM、约1pM至约40nM、约1pM至约50nM、约1pM至约60nM、约1pM至约70nM、约1pM至约80nM、约1pM至约90nM、约1pM至约100nM、约1pM至约200nM、约1pM至约300nM、约1pM至约400nM、约1pM至约500nM、约1pM至约600nM、约1pM至约700nM、约1pM至约800nM、约1pM至约900nM、约1pM至约1nM、约1pM至约900pM、约1pM至约800pM、约1pM至约700pM、约1pM至约600pM、约1pM至约500pM、约1pM至约400pM、约1pM至约300pM、约1pM至约200pM、约1pM至约100pM、约1pM至约90pM、约1pM至约80pM、约1pM至约70pM、约1pM至约60pM、约1pM至约50pM、约1pM至约40pM、约1pM至约30pM、约1pM至约20pM、约1pM至约10pM、或约1pM至约5pM。
在本文所述的各种实施方式中，化合物或其药学上可接受的盐与CAR T细胞结合的Kd可为约1nM至约100nM、约1nM至约200nM、约1nM至约300nM、约1nM至约400nM、约1nM至约500nM、约1nM至约600nM、约1nM至约700nM、约1nM至约800nM、约1nM至约900nM、约100nM至约500nM、约100nM至约400nM、约100nM至约300nM、约100nM至约200nM、约100nM至约150nM、或约130nM。
在本文所述的各种说明性实施方式中，可以在CAR T细胞之前或之后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天，或者在CAR T细胞之前或之后的任何适当的日期首先向患者给予化合物或其药学上可接受的盐。
在本文描述的各种实施方式中，可以使用EGFRt分选或未分选的CAR T细胞。在另一实施方式中，可以使用具有低分化谱的“临床复制本”批次的CAR T细胞。在另一实施方式中，可以使用“研究批次”的CAR T细胞。“临床复制本”批次(～39％EGFRt+)可包含约66％TSCM和约32％TCM的CD4+亚群以及约95％TSCM和约3％TCM的CD8亚群。研究批次(～23％EGFRt+)可包含约32％TSCM、约53％TCM、约11％TEM和约3.7％TEFF的CD4亚群以及约44％TSCM、约0.28％TCM、约3.4％TEM和约52％TEFF的CD8亚群。
在该预处理实施方式的各种额外的实施方式中，不发生导致患者中脱靶毒性的细胞因子释放，但是发生表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对癌症的毒性；或者，患者中不发生脱靶组织毒性，但是发生表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对癌症的毒性；或者，癌症包括肿瘤，并且患者中的肿瘤尺寸减小，但是不发生脱靶毒性；或者，与给予包含CAR T细胞(所述CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR)的CAR T细胞组合物之前未用化合物或其药学上可接受的盐进行预处理的患者相比，患者中的肿瘤尺寸的减小更多。如技术人员将理解的，“靶标”可以是癌症(例如肿瘤)。
在另一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；以及ii)向患者给予CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，并且其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR，并且其中，小分子配体是PSMA配体，靶向部分是FITC。在该实施方式中，通过接头连接至靶向部分的小分子配体可具有下式
Figure BDA0002689264240000981
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体；以及ii)向患者给予CAR T细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，并且其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR，并且其中，小分子配体是CAIX配体，靶向部分是FITC。在该实施方式中，通过接头连接至靶向部分的小分子配体可具有下式
Figure BDA0002689264240000991
在又一实施方式中，提供了治疗癌症的方法。该方法包括：i)向患者给予第一化合物或其药学上可接受的盐，其中，该第一化合物或其药学上可接受的盐包含通过接头连接至FITC的PSMA配体；ii)向患者给予第二化合物或其药学上可接受的盐，其中，该第二化合物或其药学上可接受的盐包含通过接头连接至FITC的CAIX配体；以及iii)向患者给予CART细胞组合物，其中，该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，并且其中，该CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。在该实施方式中，第一化合物可具有下式
Figure BDA0002689264240000992
并且第二化合物可具有下式
Figure BDA0002689264240001001
在本文描述的方法的一个实施方式中，在向患者给予化合物或其药学上可接受的盐之前，或在向患者给予CAR T细胞组合物(其中，CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，所述CAR T细胞含有包含E2抗荧光素抗体片段的CAR)之前，对癌症进行成像。在一个说明性实施方式中，成像通过PET成像进行。在其它说明性实施方式中，成像通过MRI成像或SPECT/CT成像进行。成像方法可以是本领域已知的任何合适的成像方法。在一个实施方式中，成像方法可以涉及使用本文所述的小分子配体，但是连接至适合于本文所述的成像类型的成像剂。
在本文描述的任何实施方式中，即使发生表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对癌症的毒性，也不发生导致患者中脱靶毒性的细胞因子释放。在本文所述的任何实施方式中，即使发生表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对癌症的毒性，患者中也不会发生脱靶组织毒性。在本文所述的任何实施方式中，该癌症也可包括肿瘤，并且患者中的肿瘤尺寸可减小，即使未发生脱靶毒性。在本文所述的任何实施方式中，可以降低或防止CRS，并且该方法可引起患者中肿瘤体积的减少。在本文所述的任何实施方式中，可以减少或防止由于CRS引起的体重减轻。在本文描述的任何实施方式中，癌症可以包括肿瘤，并且可以获得针对肿瘤的完全应答。
在本文描述的方法的另一实施方式中，本文描述的任何方法可以单独使用；或者，本文描述的任何方法可以与本文描述的任何其它方法组合使用。
实施例
实施例1 EC17剂量降阶能够减少与疗法有关的毒性
研究了EC17剂量降阶对CAR-T疗法的抗肿瘤活性和毒性(体重变化)的影响。两种不同的抗荧光素scFv用于CAR构建(图1)。CAR的第一构建体包含如下结构域：antiFL(FITC-E2)scFv-IgG4铰链(CH2(L235D,N297Q)-CH3)-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRt。CAR的第二个构建体包含以下结构域：antiFL(FITC-4M5.3)scFv-IgG4铰链(CH2(L235D,N297Q)-CH3)-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRt。每个构建体的CAR的核酸序列和氨基酸序列以SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：4示出。分离人T细胞，将其激活并用携带适当CAR基因的慢病毒载体转导。分离具有CAR修饰的CD4+T细胞和具有CAR修饰的CD8+T细胞，并在体外分别培养约7天。在i.v.给予用于动物研究之前，将CD4+CAR-T细胞和CD8+CAR-T细胞以1:1的比例混合。
荷有MDA-MB-231肿瘤(150mm3-250 mm3)的小鼠用于体内研究，以评价E2-CAR-T细胞。在研究的第一部分中，给予了1000万个或2000万个E2-CAR-T细胞，在CAR-T给予后第2、9、16、23等天每周i.v.用药500nmol/kg EC17(如图2A所示)。给予2000万个E2-CAR-T细胞的小鼠在第二EC17剂量后显示出严重的CRS，并且必须用6umol/kg荧光素钠(NaFL)进行挽救。1000万和2000万CAR-T组在第三和第四EC17剂量后均显示出严重CRS，并必须用NaFL挽救(如图5A和图5B所示)。这两组在E2-CAR-T疗法期间均显示出严重的体重减轻(～20％)，表明1000万或2000万E2 CAR-T/EC17 500nmol/kg SIW疗法具有严重毒性。(尽管单独的2000万个E2-CAR-T细胞也显示出抗肿瘤活性(图5A，空心圆)，这可能是由通常在较短时间体外培养的“年轻”T细胞中发现的同种异体HLA错配的TCR引起的。)
在研究的第二部分中，将使用的E2-CAR-T细胞体外培养约2周。给予3000万个E2-CAR-T细胞，并对EC17用药进行了修改使其降阶。如图2B所示，CAR-T给予后2天给予500nmol/kg EC17，然后每周(在CAR-T给予后第9、16、23天等)给予较低剂量的EC17(5nmol/kg或20nmol/kg或100nmol/kg)。如图3A所示，所有三个EC17降阶组均达到完全应答，表明桥梁的降阶不影响CAR-T的抗肿瘤活性。更重要的是，这三个EC17降阶组均未显示任何严重的CRS。如图3B所示，尽管与研究的第一部分(1000万个或2000万个CAR-T细胞)相比，给予更多的CAR-T细胞(3000万个)，但是所有降阶组均显示出非常轻的体重减轻。这些数据表明桥梁降阶(一次高水平的加载剂量，随后为降低水平的维持剂量)能够降低毒性，同时维持CAR-T细胞良好的抗肿瘤活性。
也评价了第二构建体4M5.3-CAR(antiFL(FITC-4M5.3)scFv-IgG4铰链(CH2(L235D,N297Q)-CH3)-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRt)。将荷有MDA-MB-231肿瘤(150mm3-250 mm3)的小鼠用于体内研究，以评价4M5.3-CAR-T细胞。在研究的第一部分中，给予1000万个或2000万个4M5.3-CAR-T细胞，在CAR-T给予后第2、9、16、23等天每周i.v.用药500nmol/kg EC17(如图2A所示)。给予EC17剂量后，给予1000万个或2000万个4M5.3-CAR-T细胞的小鼠未显示出严重的CRS或体重减轻(图6B)，但是它们的肿瘤均减小并最终消失(图6A)。2000万个CAR-T细胞(上方线)显示出比1000万个CAR-T细胞(中间线)更好的抗肿瘤活性。
在研究的第二部分中，将使用的4M5.3-CAR-T细胞体外培养约2周。给予3000万个4M5.3-CAR-T细胞，并对EC17用药进行修改以使其降阶。如图2B所示，CAR-T给予后2天给予500nmol/kg EC17，然后每周(在CAR-T给予后第9、16、23天等)给予较低剂量的EC17(5nmol/kg或20nmol/kg或100nmol/kg)。如图4A所示，100nmol/kg EC17降阶组显示出最佳的抗肿瘤活性，并且所有肿瘤均治愈(下方线)，而5nmole/kg EC17组(从顶部起第二条线)和20nmol/kg EC17组(从顶部起第三条线)均未显示对CAR-T疗法的完全应答。数据表明，CAR-T活性受用于降阶的EC-17剂量控制。此外，如图4B所示，三个降阶组中小鼠的体重减轻也取决于EC17剂量。100nmol/kg EC17剂量降阶组显示出比5nmol/kg或20nmol/kg EC17的其它两组更多的体重减轻。这些数据表明，桥梁的降阶(一次高水平的加载剂量，随后为降低水平的维持剂量)能够控制CAR-T疗法的抗肿瘤活性和毒性二者。
E2-CAR和4M5.3-CAR之间的唯一区别是所使用的scFv序列。通过在相同条件下比较这两种CAR，发现1000万个E2-CAR-T细胞比1000万个4M5.3-CAR-T细胞具有更好的抗肿瘤活性；测试EC17剂量降阶(5nmol/kg或20nmol/kg或100nmol/kg)时，3000万个E2-CAR-T细胞也显示出比3000万个4M5.3-CAR-T细胞更好的抗肿瘤活性。
本文所使用的“SEQ ID NO：4”是指以下划线的“gac”密码子开始并以下划线的“ggc”密码子结束的序列。较长序列的该部分编码示例性4M5.3 CAR。将CAR插入T细胞膜。较长序列的其它部分包括信号肽、EGFRt结构域等的编码序列，它们不是插入膜中并发挥嵌合抗原受体功能的CAR的部分。本文所使用的“SEQ ID NO：3”是指以下划线“D”开始并以下划线“G”结束的序列。较长序列的该部分是插入T细胞膜中的CAR的氨基酸序列。较长序列的其它部分包括信号肽、EGFRt结构域等的氨基酸序列，它们不是插入膜中并发挥嵌合抗原受体作用的CAR的部分。在另一实施方式中，SEQ ID NO：3可包含人源化或人氨基酸序列或者由人源化或人氨基酸序列组成。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4如上所述。在较长的核酸序列中的起始密码子和终止密码子用下划线标出，并且该较长序列是可用于T细胞转导以制备4M5.3 CAR的示例性序列。
SEQ ID NO:3[4M5.3-CAR氨基酸序列(插入物)]
Figure BDA0002689264240001031
SEQ ID NO:4[4M5.3-CAR核苷酸序列(插入物)]
Figure BDA0002689264240001041
实施例2输注入NSG小鼠前对CAR T细胞分化表型的表征
使用多色流式细胞术来确定待输注至荷瘤小鼠中的CAR T细胞产品的表型。如图7A所示，使用表面标志物的特定组合分析CD4+和CD8+亚群的分化状态。未分选的E2临床复制本CAR T细胞产品主要由自我更新的Tscm/Tcm表型构成(图7B)。在图7B中，最高的条形是“Tscm”，而较低的条形是“Tcm”。除了图8A中所示的CD8:CD4比例的差异之外，当前的E2临床复制本CAR T细胞不同于先前分选的E2/4M5.3CAR-T细胞和早期GFP+4M5.3 CAR T体内研究制剂(总结为图8B中的饼状图)。在图8A中，从左到右的10组中，条形表示如下内容-1(高条形Tscm，较低条形Tcm)，2-(高条形Tscm，较低条形Tcm)，3-(高条形Teff，较低条形Tem)，4-(高条形Tem，较低条形Teff，最低条形Tcm)，5-(高条形Teff，较低条形Tem)，6-(高条形Tem，较低条形Teff，最低条形Tcm)，7-(高条形Teff，较低条形Tscm)，8-(高条形Teff，较低条形Tem)，9-(高条形Teff，较低条形Tscm)，10-(高条形Teff，较低条形Tsm，再低条形Tem，最低条形Tcm)。因此，与具有更分化的Tem/Teff表型的过去的CAR T制剂相比，预期主要为Tscm/Tcm表型的CAR T细胞具有优异的抗肿瘤表型。由于相同的原因，在相同的EC17用药方案下，当前CAR-T制剂的sCRS出现得比以前的CAR-T制剂晚。
冷冻保存后CAR T细胞的复苏
将冷冻保存的CAR T细胞在37℃水浴中快速解冻，然后立即放入T细胞复苏培养基(补充有2％人AB血清的含谷氨酰胺的TexMACSTM培养基(Miltenyi Biotec#130-097-196))和50U/mL的重组人IL2，并在体外培养约3至5天以复苏T细胞。
流式细胞术分析
从体外复苏培养基中收获CAR T细胞，并通过在400g下离心5分钟沉淀。然后将T细胞重悬于补充有抗小鼠FcγIII/II受体(CD16/CD32)阻断剂[克隆2.4G2；BD Bioscience，目录号#553142，1:100(v/v)稀释]以及抗-人Fc阻断剂[BD Biosciences，目录号#564220，1:50(v/v)稀释]二者的流式细胞术染色溶液[磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.4)中1％牛血清白蛋白、50mg/mL人IgG(Equitech Bio，cat#SLH56-0001)、0.9％叠氮化钠]中。在黑暗中于冰上向每个样品中添加以下荧光染料缀合的单克隆抗体20分钟而进行表面标志物染色：抗-人CD45RA-APCeF780[克隆HI100，ThermoFisher#47-0458-42，1:20(v/v)稀释]、抗-人CD45RO-eF450[克隆UCHL1，Thermofisher#48-0457-42，1:20(v/v)稀释]、抗-人CD8α-PECy7[克隆RPA-T8，BD Bioscience，目录号#557746，1:20(v/v)稀释]、抗-人CD4-Percpe710[克隆SK3，eBioscience目录号#46-0047-42，1:20(v/v)稀释]、生物素化的抗-人EGFR(西妥昔单抗；R&D Systems#FAB9577B-100，1:10(v/v)稀释)随后是PE缀合的抗-生物素(BioLegend#53-9895-82，1:400(v/v)稀释)。在表面标志物染色后，将T细胞用PBS洗涤，并重悬于含有3μM碘化丙啶的冷PBS中，并转移至流式细胞收集管中。在Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter，Brea，CA)上收集流式细胞术数据，其中，收集至少20,000次事件并使用Kaluza v1.5软件分析数据。
实施例3 E2抗FITC抗体不与任何人正常组织结合
使用具有与E2抗FITC CAR构建体中的可变片段序列相同的可变片段序列的E2抗FITC IgG抗体来测试E2抗体是否与人正常组织结合。重组人E2抗FITC IgG1λ1在HEK293细胞中表达，并使用蛋白A亲和柱纯化。通过使用SEC-HPLC分析，抗体的纯度超过98％。使用Mix-N-Stain DIG抗体标记试剂盒(Biotium)用地高辛(DIG)标记抗体。通过FACS测量DIG标记的E2抗体对FITC固定的珠的结合亲和力。将各种浓度的DIGE2 IgG与FITC固定的珠在室温下孵育30min。洗涤后，加入单克隆抗DIG Ab并与珠孵育30min。加入缀合eF660的抗小鼠二抗，并与经洗涤的珠孵育。通过FACS分析经洗涤的珠的eF660信号。将PE固定的珠用作阴性对照珠。将eF660的荧光强度相对于添加的DIG标记的E2-IgG的浓度作图，并在图9中示出。通过使用PRISM软件计算DIG30标记的E2抗体对FITC的结合亲和力。如图9B插入图所示，Kd为约0.66nM，表明DIG标记的E2抗FITC抗体对FITC具有高结合亲和力，并且可以用于评价E2与人正常组织的结合。
开发了IHC测定以测试E2抗体与人组织的结合。将带有FITC标记的KB细胞的琼脂块的福尔马林固定、石蜡包埋(FFEP)组织切片用作阳性对照，而将未标记的KB细胞的FFPE组织切片用作阴性对照。将组织切片去石蜡并再水化，然后通过将组织切片与抗原修复缓冲液(pH6.0)在91℃下孵育24分钟来进行抗原修复，然后将DIG-E2抗体与再水化的组织切片进行孵育，最后进行抗DIG IHC染色。简而言之，加入单克隆抗DIG抗体并进行孵育，然后加入过氧化物酶标记的抗小鼠二抗。如图10A所示，FITC标记的KB细胞显示阳性染色，表明E2抗体与这些标记的KB细胞上的FITC结合。未标记的KB细胞未显示任何染色(图10B)。
将DIG标记的E2抗体与人多器官正常组织微阵列(FDA999，US Biomax，Inc)进行孵育，并使用上述相同条件下的相同IHC程序评价E2抗体与人正常组织的结合。该多器官正常组织微阵列具有28种正常人器官的99种核心，包括肾上腺(图11)、骨髓(图12)、乳腺(图13)、小脑组织(图14)、宫颈(图15)、结肠(图16)、食道(图17)、眼(图18)、心脏(图19)、垂体(图20)、肾(图21)、喉(图22)、肝(图24)、肺(图25)、淋巴结(图26)、神经(图27)、卵巢(图28)、胰腺(图29)、前列腺(图30)、皮肤(图31)、小肠(图32)、脾(图23)、胃(图33)、横纹肌(图34)、睾丸(图35)、胸腺(图36)、舌(图37)和子宫(图38)。微阵列面板中包含取自至少3名正常人个体的器官。如图11-图38所示，在测试的这28种正常人体器官中没有发现阳性的IHC染色，表明E2抗FITC抗体与正常人器官组织没有任何结合。在与DIG-E2抗体预孵育的试验切片和未用DIG-E2抗体预孵育的阴性对照切片二者中，一些浆细胞显示一定水平的染色强度，表明这种弱染色是非特异性的。
总而言之，E2抗FITC抗体不与任何测试的人正常器官组织结合，表明E2抗FITCCAR-T细胞本身在体内不会结合并攻击任何人正常组织。
实施例4 FITC-叶酸(FITC-FOLATE)的合成
Figure BDA0002689264240001071
在四甲基胍和二异丙胺的存在下，在无水二甲基亚砜(DMF)中将叶酸-γ-乙二胺偶联至异硫氰酸荧光素(FITC)异构体I(Sigma-Aldrich)。将粗产物上样至Xterra RP18制备型HPLC柱(Waters)上，并用梯度条件洗脱，所述梯度条件以20mL/min的流速从99％5mM磷酸钠(流动相A，pH 7.4)和1％乙腈(流动相B)起始，在10min内达到90％A和10％B。在这些条件下，FITC-叶酸主峰通常在27-50min洗脱。通过带有UV检测器的分析型反相HPLC来监测FITC-叶酸级分的质量。将具有大于98.0％纯度(LCMS)的级分冻干以获得最终的FITC-叶酸产物。如本领域已知的，具有该结构的化合物也称为EC17。
实施例5 FITC-PEG12-叶酸的合成
Figure BDA0002689264240001081
将通用聚乙二醇(PEG)Nova TagTM树脂(0.2g)加载入肽合成容器中，并用异丙醇(i-PrOH)(3×10mL)和二甲基甲酰胺(DMF，3×10mL)洗涤。使用处于DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的脱保护。进行Kaiser测试以评价反应进程。然后向该容器中引入N,N-二异丙基乙胺(i-Pr2NEt)(4当量)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)(2当量)和DMF中的Fmoc-L-谷氨酸5-叔丁酯(Fmoc-Glu-(O-t-Bu)-OH)(23.5mg)的溶液。使用处于DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行Fmoc脱保护。然后向该容器中引入N10-TFA-Pte-OH(22.5mg)、DMF、i-Pr2NEt(4当量)和PyBOP(2当量)的溶液。氩鼓泡2h，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。将树脂在二氯甲烷(DCM)中溶胀后，添加处于DCM/三氟乙烷(TFE)(1:1)中的1M羟基苯并三唑(HOBT)的溶液(2×3mL)。氩鼓泡1h，除去溶剂，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。将树脂在DMF中溶胀后，添加i-Pr2NEt(4当量)、PyBOP(2当量)和DMF中的Fmoc-NH-(PEG)12-COOH(46.3mg)的溶液。氩鼓泡2h，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。使用处于DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行Fmoc脱保护。进行Kaiser测试以评价反应进程。然后向该容器中引入i-Pr2NEt(4当量)和DMF中的FITC(Life Technologies 21.4mg)的溶液，然后氩鼓泡2h，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。然后向该容器中加入处于DMF中的2％NH2NH2(2×2mL)。使用TFA:H2O:三异丙基硅烷(TIS)(95:2.5:2.5)(裂解液)从树脂上裂解最终化合物，并在真空下浓缩。将浓缩的产物在Et2O中沉淀并在真空下干燥。使用制备型RP-HPLC(流动相：A＝10mM醋酸铵，pH＝7；B＝ACN；方法：在30min内以13mL/min从0％B到30％B)纯化粗产物。合并纯级分并冷冻干燥，得到FITC-PEG12-叶酸。
实施例6 FITC-PEG20-叶酸的合成
Figure BDA0002689264240001091
将乙二胺、聚合物结合(200-400目)-树脂(50mg)装载入肽合成容器中，并用DCM(3mL)和随后的DMF(3mL)溶胀。然后向容器中引入i-Pr2NEt(6.0当量)、PyBOP(4.0当量)和DMF中的Fmoc-PEG20-COOH(131mg，1.0当量)的溶液。氩鼓泡6h，将偶联溶液排干，并将树脂用DMF(3×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤。进行Kaiser测试以评价反应进程。在每次氨基酸偶联之前，使用处于DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行Fmoc脱保护。重复以上顺序以完成与Fmoc-Glu-OtBu(72mg，2.0当量)和Tfa.蝶酸(Tfa.Pteroic-acid)(41mg，1.2当量)偶联步骤的反应。将该树脂用处于DMF中的2％肼洗涤(3×10mL，5min)以裂解在蝶酸上的三氟乙酰基保护基，并用i-PrOH(3×10mL)洗涤，然后用DMF(3×10mL)洗涤。将该树脂在氩下干燥30min。使用裂解溶液从树脂上裂解叶酸肽(folate-peptide)。引入10mL的裂解混合物，并且氩鼓泡1.5h。将裂解混合物排入干净的烧瓶中。用更多的裂解混合物将树脂洗涤3次。将合并的混合物在减压下浓缩至较小体积(～5mL)，并在乙醚中沉淀。
通过离心收集沉淀物，用乙醚洗涤(3次)并在高真空下干燥。将干燥的叶酸-PEG20-EDA(1.0当量)在室温下用DIPEA和DMSO中的FITC(50mg，1.5当量)处理。通过LCMS监测反应进程。8h后，原料被消耗以得到产物。通过制备型HPLC纯化粗反应混合物(流动相A＝10mM醋酸铵，pH＝7；有机相B＝乙腈；方法：在35分钟内以13mL/min从0％B至30％B)并以60％的产率得到FITC-PEG20-叶酸。
实施例7 FITC-PEG108-叶酸的合成
Figure BDA0002689264240001101
将乙二胺、聚合物结合(200-400目)-树脂(50mg)装载入肽合成容器中，并用DCM(3mL)和随后的DMF(3mL)溶胀。然后向容器中引入i-Pr2NEt(6.0当量)、PyBOP(4.0当量)和DMF中的Fmoc-PEG36-COOH(161mg，1.0当量)的溶液。氩鼓泡6h，将偶联溶液排干，并将树脂用DMF(3×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤。进行Kaiser测试以评价反应进程。在每次氨基酸偶联之前，使用处于DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行Fmoc脱保护。重复以上顺序以完成与2XFmoc-PEG36-COOH(161mg，1.0当量)、Fmoc-Glu-OtBu(72mg，2.0当量)和Tfa.蝶酸(Tfa.Pteroic-acid)(41.0mg，1.2当量)偶联步骤的反应。在结束时，将该树脂用处于DMF中的2％肼洗涤(3×10mL，5min)以裂解蝶酸上的三氟乙酰基保护基，并用i-PrOH(3×10mL)洗涤，然后用DMF(3×10mL)洗涤。将该树脂在氩下干燥30min。使用裂解溶液从树脂上裂解叶酸肽。引入10mL的裂解混合物，氩鼓泡1.5h。将裂解混合物排入干净的烧瓶中。用更多的裂解溶液将树脂洗涤3×。将合并的混合物在减压下浓缩至较小体积(～5mL)，并在乙醚中沉淀。
通过离心收集沉淀物，用乙醚洗涤(3×)并在高真空下干燥。将干燥的叶酸-PEG108-EDA(1.0当量)在室温下用DIPEA和DMSO中的FITC(50mg，1.5当量)处理。通过LCMS监测反应进程。10h后，原料被消耗以得到产物。通过制备型HPLC纯化粗反应混合物(流动相A＝10mM醋酸铵，pH＝7；有机相B＝乙腈；方法：在35分钟内以13mL/min从0％B至30％B)并以64％的产率得到FITC-PEG108-叶酸。
实施例8 FITC-DUPA的合成
Figure BDA0002689264240001111
DUPA-FITC通过固相方法如下合成。将Universal Nova TagTM树脂(50mg，0.53mM)用DCM(3mL)、以及随后的DMF(3mL)进行溶胀。向该树脂中添加处于DMF中的20％哌啶的溶液(3×3mL)，并氩鼓泡5min。用DMF(3×3mL)和异丙醇(i-PrOH，3×3mL)洗涤树脂。在DMF中溶胀树脂后，添加处于DMF中的i-Pr2NEt(4.0当量)、DUPA-(OtBu)-OH(1.5当量)和HATU(2.5当量)的溶液。氩鼓泡2h，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。树脂在DCM中溶胀后，加入处于DCM/TFE(1:1)中的1M HOBt的溶液(2×3mL)。氩鼓泡1h，除去溶剂，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。在DMF中溶胀树脂之后，加入处于DMF中的DIPEA(4.0当量)、Fmoc-Phe-OH(2.5当量)和HATU(2.5当量)的溶液。氩鼓泡2h，然后用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。重复上述顺序进行另外2个偶联步骤，以添加8-氨基辛酸和异硫氰酸荧光素或罗丹明B异硫氰酸酯。使用裂解溶液将最终化合物从树脂上裂解下来，并在真空下浓缩。将浓缩的产物在二乙醚中沉淀并在真空下干燥。粗产物使用制备型RP-HPLC进行纯化[λ＝488nm；溶剂梯度：25min内1％B至80％B，80％B洗涤运行30min；A＝10mM NH4OAc，pH＝7；B＝乙腈(ACN)]。在真空下除去ACN，并将纯化的级分冷冻干燥，以得到棕橙色固体的FITC-DUPA。RP-HPLC：tR＝8.0min(A＝10mM NH4OAc，pH＝7.0；B＝ACN，溶剂梯度：10min内1％B至50％B，80％B洗涤运行15min)。1H NMR(DMSO-d6/D2O)：δ0.98-1.27(ms,9H)；1.45(b,3H)；1.68-1.85(ms,11H)；1H NMR(DMSO-d6/D2O):δ0.98-1.27(ms,9H)；1.45(b,3H)；1.68-1.85(ms,11H)；2.03(m,8H)；2.6-3.44(ms,12H)；3.82(b,2H)；4.35(m,1H)；6.53(d,J＝8.1Hz,2H),6.61(dd,J＝5.3,3.5Hz,2H)；6.64(s,2H)；7.05(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(m,5H)；7.76(d,J＝8.0Hz,1H)；8.38(s,1H)。HRMS(ESI)(m/z)：(M+H)+calcd for C51H59N7O15S，1040.3712，found，1040.3702。UV/vis：λmax＝491nm。
实施例9 FITC-PEG12-DUPA的合成
Figure BDA0002689264240001121
将1,2-二氨基乙烷三苯甲基树脂(0.025g)加载到肽合成容器中，并用i-PrOH(3×10mL)洗涤，然后用DMF(3×10mL)洗涤。然后向容器中引入i-Pr2NEt(2.5当量)、PyBOP(2.5当量)和DMF中的Fmoc-NH-(PEG)12-COOH(42.8mg)的溶液。将所得溶液用Ar鼓泡1h，将偶联溶液排干，并用DMF(3×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤树脂。进行Kaiser测试以评价反应进程。使用处于DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行Fmoc脱保护。重复该程序以完成所有偶联步骤(在其各自的偶联步骤中分别使用2×1.5当量的Fmoc-Phe-OH和1.5当量的8-氨基辛酸和1.2当量的DUPA)。DUPA偶联后，用DMF(3×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤树脂，然后减压干燥。使用裂解溶液从肽合成容器中的树脂上裂解肽。将15mL的裂解溶液加入到肽合成容器中，并将反应物用Ar鼓泡15min。用另两个10mL量的裂解溶液处理树脂各5min。将裂解混合物浓缩至约5mL，并用乙醚沉淀。通过离心收集沉淀物，用乙醚(3×)洗涤，并在高真空下干燥，从而回收粗物质。在室温下，向粗DUPA-(PEG)12-EDA(10mg)和FITC(5.6mg)的二甲基亚砜(DMSO，1mL)的搅拌溶液加入i-Pr2NEt(5当量)，并在氩下搅拌6h。通过LCMS监测反应并通过制备型HPLC进行纯化(流动相：A＝10mM醋酸铵，pH＝7，B＝ACN；方法：在30min内以13mL/min的速度从0％B至50％B)。合并纯化的级分并冷冻干燥，得到FITC-PEG12-DUPA。
实施例10 FITC-PEG11-NK1的合成
Figure BDA0002689264240001131
在室温在氩下，向处于干燥CHCl2中的NK-1(0.02g，0.0433mmol，1.0eq.)、O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(Boc-氨基)乙基]十甘醇(BocNH-PEG11-NH2)(Sigma，0.0336g，0.0521mmol，1.2eq.)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)(0.027g，0.0521mmol，1.2eq.)的搅拌溶液加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(0.076mL，0.4338mmol，10eq.)。反应进程通过LCMS进行监控，并通过制备型RP-HPLC纯化(Waters，XBridgeTM Prep C18，5μm；19×100mm柱，流动相A＝20mM醋酸铵缓冲液，pH 7，B＝乙腈，梯度30min内10％-100％B，13mL/min，λ＝220nm，254nm)。收集纯级分，蒸发所有有机溶剂，并将样品冻干48h以提供NK1-PEG11-NHBoc。产率：40.13mg(97％)。将处于干燥DCM中的NK1-PEG11-NHBoc(0.0165g，0.015mmol)中加入三氟乙酸(TFA，20eq.)，并将反应混合物在r.t.搅拌4h。除去过量的TFA，并将剩余溶液用水稀释，并用CH2Cl2(3×5mL)萃取。将合并的有机层用卤水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将获得的残余物在真空下干燥，无需进一步纯化即可用于下一步。在室温下在氩中，将处于干燥二甲基亚砜(DMSO，0.3mL)中的NK1-PEG11-NH2(0.008g，0.0081mmol，1.0eq.)、异硫氰酸荧光素(FITC)(Sigma，0.0037g，0.0097mmol，1.2eq.)的搅拌溶液添加至二异丙基乙胺(0.0028mL，0.0162mmol，2.0eq.)。通过LCMS监测反应进程，并通过制备型RPHPLC(Waters，XBridgeTM Prep C18，5μm；19×100mm柱，流动相A＝20mM醋酸铵缓冲液，pH7，B＝乙腈，梯度30min内10-100％B，13mL/min，λ＝280nm)进行纯化。收集纯级分，蒸发所有有机溶剂，并将样品冻干48h，以提供产量为8.54mg(77％)的FITC-PEG11-NK1。
*注：NK-1化合物通过两步法从基础配体开始合成，使用文献中的方法制备。(参见：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERYCONJUGATES，申请号：PCT/US2015/44229；以引用的方式并入本文)。
实施例11 FITC-PEG2-CA9的合成
Figure BDA0002689264240001141
在50mL圆底烧瓶中使用Teflon磁力搅拌棒将CA9配体(53.6mg)溶于DMF(2-3mL)中。使用真空除去环境空气并用氮气代替，并将该操作进行三个循环。将圆底烧瓶保持在恒定氮气下。向烧瓶中加入28.9mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，然后加入21.6mg1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)和18.9μL Boc-PEG2-NH2(Sigma Aldrich)。加入5.4μL三乙胺(TEA)，并将反应搅拌过夜。使用HPLC纯化反应混合物，并用UHPLC-MS确认(目标m/z为831)。使用高真空旋转蒸发除去乙腈，并将产物冻干。将该化合物与1:1的TFA:DCM混合30分钟。使用高真空旋转蒸发除去TFA/DCM，然后在高真空下30分钟。然后将化合物溶解在DMF中，并与5摩尔当量的i-Pr2NEt、16mg异硫氰酸荧光素(Life Technologies)合并，并搅拌1h。通过HPLC纯化反应混合物，并用UHPLC-MS确认目标化合物(目标m/z为1120)。将样品冻干并储存在-20℃。
实施例12 FITC-DUPA
DUPA-FITC通过固相方法如下合成。将通用NovaTag树脂(50mg，0.53mM)用二氯甲烷(DCM)(3mL)溶胀，然后用二甲基甲酰胺(DMF，3mL)溶胀。向该树脂中添加处于DMF中的20％哌啶的溶液(3×3mL)，并用氩鼓泡5min。用DMF(3×3mL)和异丙醇(i-PrOH，3×3mL)洗涤树脂。将树脂在DMF中溶胀后，添加处于DMF中的DUPA-(OtBu)-OH(1.5当量)、HATU(2.5当量)和DIPEA(4.0当量)的溶液。用氩鼓泡2h，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。树脂在DCM中溶胀后，加入处于DCM/三氟乙烷(TFE)(1:1)中的1M HOBt溶液(2×3mL)。用氩鼓泡1h，除去溶剂，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。树脂在DMF中溶胀后，添加处于DMF中的Fmoc-Phe-OH(2.5当量)、HATU(2.5当量)和DIPEA(4.0当量)的溶液。用氩鼓泡2h，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。重复上述顺序进行另外两个偶联步骤，以添加8-氨基辛酸和异硫氰酸荧光素或罗丹明B异硫氰酸酯。使用三氟乙酸(TFA):H2O:三异丙基硅烷混合物(95:2.5:2.5)从树脂上裂解最终化合物，并在真空下浓缩。将浓缩的产物在二乙醚中沉淀并在真空下干燥。粗产物使用制备型RP-HPLC进行纯化[λ＝488nm；溶剂梯度：25min内1％B至80％B，80％B洗涤运行30min；A＝10mM NH4OAc，pH＝7；B＝乙腈(ACN)]。在真空下除去ACN，然后将纯级分冷冻干燥，以得到棕橙色固体DUPA-FITC。RP-HPLC：tR＝8.0min(A＝10mM NH4OAc,pH＝7.0；B＝ACN,溶剂梯度:10min内1％B至50％B，80％B洗涤运行15min)。1H NMR(DMSO-d6/D2O):δ0.98-1.27(ms,9H)；1.45(b,3H)；1.68-1.85(ms,11H)；2.03(m,8H)；2.6-3.44(ms,12H)；3.82(b,2H)；4.35(m,1H)；6.53(d,J＝8.1Hz,2H),6.61(dd,J＝5.3,3.5Hz,2H)；6.64(s,2H)；7.05(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(m,5H)；7.76(d,J＝8.0Hz,1H)；8.38(s,1H).HRMS(ESI)(m/z):(M+H)+calcd for C51H59N7O15S,1040.3712,found,1040.3702。UV/vis：λmax＝491nm。
Figure BDA0002689264240001151
实施例13 FTIC-CA9
在50mL的圆底烧瓶中，使用Teflon磁力搅拌棒将CA9配体(53.6mg，在实验室中合成)溶解在期望量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(2-3mL)中。使用真空除去环境空气并用氮气代替，该操作进行三个循环。然后将圆底烧瓶保持在恒定氮气下。向烧瓶中加入28.9mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，然后加入21.6mg 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)和18.9μL Boc-PEG2-NH2(购自Sigma Aldrich)。最后加入5.4μL的三乙胺(TEA)，并将反应搅拌过夜。使用HPLC纯化反应混合物，并通过UHPLC-MS确认(目标m/z为831)。使用高真空旋转蒸发除去乙腈，并置于冻干机上48小时。用1:1的TFA:DCM进行Boc脱保护30分钟。使用高真空旋转蒸发除去TFA/DCM，然后在高真空下30分钟。然后将化合物溶于DMF中，并与5摩尔当量的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)合并。将16mg异硫氰酸荧光素(购自Life Technologies)加入溶液中，并OH搅拌1小时。通过HPLC纯化反应混合物，并用UHPLC-MS确认目标化合物(目标m/z为1120)。将样品置于冻干机上48小时，然后将化合物存储在-20℃下。
Figure BDA0002689264240001161
实施例14 FITC-NK1R
在室温下在氩中，向处于干燥CH2Cl2中的NK-1(0.02g，0.0433mmol，1.0eq.)、O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(Boc-氨基)乙基]十甘醇(BocNH-PEG11-NH2)(Sigma，0.0336g，0.0521mmol，1.2eq.)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PYBOP)(0.027g，0.0521mmol，1.2eq.)的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(0.076mL，0.4338mmol，10eq.)。反应进程通过LCMS进行监控，并通过制备型RP-HPLC进行纯化(Waters，XBridgeTMPrep C18，5μm；19×100mm柱，流动相A＝20mM醋酸铵缓冲液，pH 7，B＝乙腈，梯度30min内10％-100％B，13mL/min，λ＝220nm，254nm)。收集纯级分，蒸发所有有机溶剂，并将样品冻干48h，以提供NK1-PEG11-NHBoc。产量：40.13mg(97％)。向处于干燥CH2Cl2中的NK1-PEG11-NHBoc(0.0165g，0.015mmol)中加入三氟乙酸(TFA，20eq.)，并将反应混合物在r.t.搅拌4h。除去过量的TFA，用水稀释并用CH2Cl2(3×5mL)萃取。将合并的有机层用卤水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将获得的残余物在真空下干燥，无需进一步纯化即可用于下一步。在室温下在氩下，向处于干燥二甲基亚砜(DMSO，0.3mL)中的NK1-PEG11-NH2(0.008g，0.0081mmol，1.0eq.)、异硫氰酸荧光素(FITC)(Sigma，0.0037g，0.0097mmol，1.2eq.)的搅拌溶液加入二异丙基乙胺(0.0028mL，0.0162mmol，2.0eq.)。通过LCMS监测反应进程，并通过制备型RP-HPLC进行纯化(Waters，XBridgeTM Prep C18，5μm；19×100mm柱，流动相A＝20mM醋酸铵缓冲液，pH 7，B＝乙腈，梯度30min内10％-100％B，13mL/min，λ＝280nm)。收集纯级分，蒸发所有有机溶剂，并将样品冻干48h，以提供NK1-PEG11-FITC(5)。产量：8.54mg(77％)。
NK-1化合物通过两步法从基础配体开始合成，使用文献程序制备。(参见：DESIGNAND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES，申请号：PCT/US2015/44229；以引用的方式将其整体并入本文)。
实施例15体外共培养E2 CAR T激活和靶标细胞杀伤分析
将E2 CAR T细胞解冻，并以每毫升T细胞生长培养基(TexMACS培养基+2％人AB血清+50U/mL重组人IL2)50万至200万个T细胞之间的细胞密度从冷冻保存中复苏4天。还解冻了表达不同水平的表面叶酸受体的靶标细胞，并在生长培养基(缺乏叶酸的RPMI1640+10％FCS+pen/strep)中从冷冻保存中复苏4天。
在第-1天，将100,000个靶标细胞铺板于12孔组织培养板的每孔2mL生长培养基中，以使靶标细胞粘附并复苏。在第0天，将接受EC17桥梁分子的孔在组织培养箱中用100nM的EC17处理30min。之后，将所有培养基洗去，并用不含叶酸和EC17的新鲜生长培养基替换。在EC17孵育过程中，收获、计数T细胞，并在完成EC17处理后，将100,000个E2 CAR T细胞直接添加到靶标细胞的每个孔中，比例为1:1(E:T)，共3mL生长培养基，在37℃、5％CO2的标准组织培养加湿条件下孵育1天和2天。一天共培养条件用于分析靶标细胞对E2 CAR T细胞的激活，两天孵育用于分析靶标细胞的死亡。
为了确定与具有不同水平表面叶酸受体的靶标细胞共培养一天后的E2 CAR T细胞活性水平，收获漂浮细胞并与剩余的贴壁细胞合并，所述贴壁细胞使用5分钟0.25％的胰蛋白酶消化从组织培养板移除。用400×重力离心步骤5分钟将合并的漂浮和贴壁细胞沉淀，然后重悬在流式细胞术染色溶液中。通过流式细胞术鉴别E2 T细胞的表面标志物染色，包括抗人EGFR和抗人CD3；而通过流式细胞术检测CAR T细胞激活，使用抗人CD137染色。E2CAR T细胞被鉴别为EGFR+CD3+，而激活的CAR T细胞也共表达CD137(参见流式细胞术方法)。
为了确定在共培养两天后E2 CAR T细胞对具有不同水平的表面叶酸受体表达的靶标细胞的杀伤效率，以与上述一天共培养测定相同的方式沉淀合并的漂浮细胞和贴壁细胞，然后关于E2 CAR T标志物EGFR和CD3进行染色然后洗涤，并通过用Alexa Fluor 647缀合的重组膜联蛋白V(Invitrogen cat#A23204，1:50稀释，处于提供的1×膜联蛋白染色缓冲液中)和3μM碘化丙啶重悬流式抗体染色的样品对凋亡标志物膜联蛋白V进行染色。
E2 CAR T细胞激活依赖于靶标细胞的EC17染色
为了理解激活E2 CAR T细胞所必需的叶酸受体的水平，与表达不同水平的表面叶酸受体(FR)的靶标细胞进行了一天共培养(图39)。共培养一天后激活的E2 CAR T细胞的百分比在y轴上作图，而测定时靶标细胞的FR表达水平在x轴上作图。重要的是，在使用进行测定的相同靶标细胞在同一天获得FR表达水平数据，所述靶标细胞用EC17处理但没有与CART细胞进行培养，以避免被CAR T细胞剔除(culled)的高FR表达细胞的任何伪影(artifacts)。表达大范围的叶酸受体的五种靶标细胞系中的四种将CAR T细胞激活至相似水平。有趣的是，低FR表达细胞系OV90(下三角)像SKOV3细胞(菱形)一样表达约50％的FR，并像SKOV3细胞一样激活约50％的CAR T细胞。这些数据表明，大范围的EC17将E2 CAR T细胞激活至相似的水平，这表明完全激活E2 CAR T细胞所需要的结合至靶标细胞的EC17存在一定阈值。此外，还表明存在将给出次优的E2 CAR T响应的FR表达阈值。
E2 CAR T细胞靶标细胞杀伤
为了证实E2 CAR T细胞激活也转化为成功杀伤靶标细胞，我们进行了两天的共培养测定，然后通过流式细胞术观察了靶标细胞(EGFR-CD3-)事件，并用凋亡表面标志物膜联蛋白V染色确定了靶标细胞染色百分比。在图40中，示出了相同的五个靶标细胞(如x轴上的标记)，每种靶标细胞在三种不同条件下培养了两天，示出为三个不同的条形。每组中的第一个条形代表靶标细胞凋亡的基础水平，因为它们是用EC17处理但在不存在E2 CAR T细胞的情况下培养的靶标细胞。每组中的第二个条形表示未对靶标细胞进行任何先前的EC17处理的情况下的CAR T加靶标细胞共培养，而每组中的第三个条形表示CAR T加EC17预处理的靶标细胞。y轴示出凋亡(膜联蛋白V+)的靶标细胞的百分比。从这些数据发现，CAR T细胞激活可很好地转化为对三种最高叶酸受体表达者(MDAMB231、HOS-FRα和IGROV1)的靶标细胞杀伤。但是，对于具有第四低的FR表达的SKOV3细胞(图39，x轴)，相似的E2 CAR T激活并未转化为相似的靶标细胞杀伤(图40)。SKOV 3细胞中靶标细胞凋亡与CAR T细胞激活之间的这种脱节可能不是低叶酸受体表达的作用。如前所述，每种癌细胞可能已经进化出了自己的抗凋亡机制，处于不同癌细胞系中的情况，像SKOV3细胞一样的FR表达水平可能对更高水平的靶标细胞凋亡来说足够。
综上，来自图39和图40的数据证明，细胞杀伤需要EC17与癌细胞结合。这些数据进一步表明，在靶标细胞结合的EC17的一定阈值以下，表面结合的EC17和E2 CAR T的激活与杀伤之间存在线性关系。
实施例16 3H-叶酸结合测定
将所有肿瘤细胞系接种在含有10％热灭活的胎牛血清的无叶酸的RPMI培养基中过夜。第二天，将细胞在有和没有10μM冷叶酸的情况下，在冰上与100nM 3H-叶酸孵育15min。用冷的1×PBS冲洗3次后，裂解全部细胞，并在闪烁计数器中计数与细胞相关的总放射性。通过减去叶酸竞争样品的计数来确定3H-叶酸的FR特异性结合，并使用3H-叶酸的比活性计算每细胞的分子数。
图41表明了这些细胞系中FR表达的各种水平。FR水平的顺序为：IGROV1>MDA-MB-231、HOS-FRα>OV90、SKOV3。
实施例17具有或不具有皮下植入的MDAMB-231-肿瘤的NSG小鼠的EC17/E2-CAR T细胞疗法
肿瘤植入
MDA-MB-231肿瘤细胞在37℃下在5％CO2的加湿气氛中在具有5％-10％FBS的缺乏叶酸的RPMI 1640中生长。将MDA-MB-231肿瘤细胞以每只动物2.5×106个细胞皮下接种。66只小鼠中只有42只被接种，其余22只小鼠保持无肿瘤。
CAR-T细胞给予
将EGFRt分选的抗FITC E2 scFv-CAR T细胞在T细胞冷冻培养基中冷冻。将冷冻的CAR-T细胞小瓶立即保存在-80℃。将CAR-T细胞在37℃下快速解冻，用PBS洗涤两次，然后以每只动物1000万个存活的EGFRt+E2 CAR-T细胞(CD4/CD8为～1:1)用于动物注射。输注当天取一小等份用于E2-CAR T细胞表型的流式细胞术分析。
人/小鼠细胞因子分析
处理小鼠血液样品以得到血浆，并在-20℃下保存直至使用。人TH1细胞因子面板(Biolegend，目录号740009)和人造血干细胞细胞因子面板(Biolegend，目录号740610)用于检测小鼠血液中的人细胞因子。小鼠13-plex炎性细胞因子面板(Biolegend，No.740150)用于检测小鼠细胞因子。所有分析均按照制造商的说明进行。
流式细胞术分析
全血细胞分析：从预定体积的全EDTA处理的血液中除去血浆，并用RBC裂解液进行裂解。然后将白细胞沉淀重悬于流式细胞术染色溶液(磷酸盐缓冲盐水pH＝7.4中1％牛血清白蛋白、50mg/mL人IgG(Equitech Bio，cat#SLH56-0001)、0.9％叠氮化钠)，并使用以下抗体进行白细胞表面标志物染色：抗人CD45[克隆HI30，eBioscience#47-0459-42，1:20(v/v)稀释]、抗人CD137[克隆4B4-1，BD Bioscience#564092，1:20(v/v)稀释]、抗人CD8α[克隆RPA-T8,BD Bioscience，目录号#557746，1:20(v/v)稀释]、抗人CD4[克隆SK3，eBioscience，目录号#46-0047-42，1:20(v/v)稀释]、抗人EGFR[R&D systems，克隆Hu1，目录号#FAB9577B，1:10(v/v)]、抗人PD1[BD Biosciences，克隆EH12.1，目录号#562511，1:20(v/v)]、抗人LAG3[BD Biosciences，克隆T47-530，目录号#565616，1:20(v/v)]、抗人TIM3[BD Biosciences，克隆7D3，目录号#565558，1:20(v/v)]、抗人CD3ε[BD Biosciences，克隆SK7，目录号#557832，1:20(v/v)]。白细胞染色后，将细胞用PBS洗涤并重悬于含有53,000CountBrightTM珠(Invitrogen目录号#C36950)的冷PBS中，并转移至流式细胞术收集管中。在Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter，Brea，CA)上收集流式细胞术数据。根据Invitrogen的说明计算每个血样中CAR T细胞的浓度的确定。CAR T细胞被鉴别为人CD3ε+EGFRt+事件，并使用KaluzaTM流式细胞术软件容易地区分和计数。然后，将每只输注小鼠的循环中CAR T细胞的数量在图上表示为所分析的每100μL全血的CAR T细胞的总数。通过使用非配对的双尾学生t检验确定统计学显著性，显著性设为p<0.05。
肿瘤和组织分析：收获实体瘤(100-1000mm3)，称重，并将其切成小块，然后转移到含有20mL肿瘤消化混合物的50mL管中。酶促肿瘤消化混合物由补充有抗生素的无血清且缺乏叶酸的RPMI1640培养基中的0.5mg/mL胶原酶IV(Sigma-Aldrich，目录号#C5138)、0.5mg/mL透明质酸酶(Sigma-Aldrich，目录号#H3506)和0.1mg/mL DNase I(Sigma-Aldrich，目录号#DN25)组成。将肿瘤碎块在37℃下在水平振荡器上以300rpm消化1小时。之后，将肿瘤消化物以400×g离心5分钟，肿瘤细胞沉淀物经历红血细胞裂解步骤，然后用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤，最后通过40μm尼龙细胞滤网进行过滤。
E2-CAR-T表型与体内增殖
在临床研究中，已经报道血液中CAR T细胞的扩增和持久性与对CD19特异性CAR T疗法的应答相关。在我们的体内模型中，假定更大的循环血源E2 CAR T池将对EC17定向的FR+肿瘤攻击产生更大的应答并非不合理。为了衡量E2 CAR T细胞疗法对EC17的应答，我们量化了每100uL全血中循环E2 CAR T细胞的数量，并观测到与未接受EC17的同生群(cohorts)(同生群1和6)相比，接受EC17刺激的同生群(同生群2、3、4和5)在循环中具有至少大于10倍的增加。重要的是，血液中的循环CAR T细胞的这种扩增与抗原依赖性方式的CAR T细胞的扩增一致。此外，我们还观测到循环CAR T细胞数量增加的持久性长达CAR T细胞输注后54天，并且与没有接受EC17的同生群1和6相比，CAR T持久性还取决于EC17(同生群2、3、4和5)。
肿瘤小鼠与无肿瘤小鼠
如图42所示，将1000万个E2 CAR-T细胞i.v.注射到无肿瘤的未试验过的NSG小鼠或荷有MDA-MB-231肿瘤的NSG小鼠中。将500nmol/kg的EC17在CAR-T注射后的第2天和第10天i.v.给药，并在第二EC17剂量后20小时(第11天)对小鼠实施安乐死以用于器官评价和血液分析。立即从血液中分离血浆样品，并保存在-20℃下直至细胞因子分析。在CAR-T注射后第12天，如上所述地收获另一组动物用于FACS分析。
如图43所示，荷瘤小鼠中细胞因子的产生是EC17依赖性的。相对于没有EC17剂量的荷瘤小鼠，具有EC17的荷瘤小鼠中的细胞因子(包括IL2、IFN-γ、IL-10)的水平均升高。在没有肿瘤的未试验过的小鼠中，在用EC17给药的小鼠中也观测到细胞因子产生的上调，但是与具有MDA-MB-231肿瘤的小鼠相比，无肿瘤小鼠中的增加要低得多(例如，对于IFN-g来说低23倍)。
荷瘤小鼠比无肿瘤小鼠具有高～23倍的IFN-g产生。尽管无肿瘤的小鼠(FD饮食～2个月)在EC17 SIW500×2剂量后显示出一些细胞因子产生，但通过FACS没有可检测的CAR-T细胞扩增。
实施例18使用人源化的抗FITC scFv E2-CAR构建体和CAR修饰的T细胞在体外证明了靶标特异性活性
细胞系：除非另有说明，所有细胞系均维持在补充有2mM L-谷氨酰胺(Cellgro)、25mM HEPES(Irvine Scientific)和10％热灭活的FBS(Hyclone)的RPMI 1640(IrvineScientific)中。Stanley Riddell博士(FHCRC)友情提供K562靶标细胞系。K562 OKT3细胞系通过用含有慢病毒的OKT3转基因转导而产生。OKT3是靶向CD3ε的膜拴系(tethered)scFv。MDA-MB-231由Endocyte提供，并在无叶酸的DMEM中培养。所有细胞系均通过STRProfiling进行认证，并匹配至亚利桑那大学遗传学中心的DSMZ数据库。
细胞毒性和细胞因子分泌：进行四小时铬释放测定。简而言之，将靶标细胞用51Cr(PerkinElmer)标记过夜，在PBS中洗涤3次，并在96孔板中以5×103细胞/孔与T细胞以各种效应物与靶标(E:T)比例在RPMI中进行三重复孵育。收获上清液进行γ计数并计算特异性裂解。对于细胞因子分泌，以三重复将5×105T细胞与靶标细胞以E:T比为2:1铺板于96孔板中24小时，并按照制造商的说明使用Bio-Plex人细胞因子面板(Bio-Rad)通过细胞计数珠阵列分析上清液。对于EC17标记的靶标，在铺板前，将细胞与PBS中的100nM EC17在黑暗中于室温孵育1h。当使用EC17时，在测定过程中将细胞与无叶酸的RPMI孵育。
细胞因子释放测定：
将CD4+T细胞以T细胞比靶标为2:1的比例共培养24小时，然后分析上清液中效应细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的存在。以三重复进行测定，数据显示为平均值±SE。如图44所示，我们观测到响应于与阳性对照细胞系K562-OKT3共培养时，空白对照和抗FLCAR T细胞产生量上相似水平的细胞因子生产。与K562共培养后，空白对照或抗FLCAR T细胞均未产生细胞因子。细胞因子的释放取决于EC17与MDA-MB-231细胞系的预先孵育，而抗FLCAR T细胞是唯一能够针对EC17标记的MDA-MB-231引起细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α分泌的细胞。
铬释放分析：
将CD8+T细胞与靶标细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比例共培养。描绘了三重复的孔的裂解百分比(平均值±SE)。如图45所示，抗FLCAR T细胞对阴性对照(K562)或未标记的MDA-MB-231细胞系没有显示细胞毒性。然而，空白对照转导的T细胞和抗FLCAR T细胞均能够针对阳性对照K562-OKT3细胞系诱导相似水平的特异性裂解。此外，EC17标记的MDA-MB-231细胞被抗FLCAR T细胞有效识别并裂解，而空白对照T细胞则无法裂解。
实施例19 CAR T细胞适配子的结构
图46-图49示出了CAR-T细胞实验中所用桥梁的结构及其体外确定的针对桥梁所定向的细胞类型(例如，叶酸-FITC对表达叶酸受体的癌细胞)的亲和力。图50示出(通过FACS分析)桥梁与体内模型中使用的肿瘤细胞的结合以及对应于桥梁的小分子配体的受体表达。
对于实施例20至实施例30-参见图55至图63
实施例20细胞系和试剂
除非另有说明，否则所有FR+和FR阴性癌细胞系均维持在补充有10％热灭活的胎牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco BRL)中，其中不含(FFRPMI)或含有(RPMI)2.4mM叶酸(FA)。分别使用KB(带有HeLa标志物的表达FRa的人宫颈癌)和CHO-b(经人FRb转染的中国仓鼠卵巢细胞)分别作为用于放射性配体结合测定的FRa和FRb来源。MDA-MB-231代表人三阴乳腺癌(TNBC)细胞系的FRa亚克隆。对于AML研究，提供了表达绿色荧光蛋白(GFP)的FRb阳性(THP1-FRb)和FR阴性(THP1-FG12)细胞系的同基因对。两者都是从THP-1(ATCC，TIB-202)建立的，所述THP-1是研究儿童AML的常用细胞模型，最初从患有急性单核细胞白血病的1岁男婴中衍生而来。对于骨肉瘤研究，通过用编码人FRα的FOLR1基因慢病毒转导FR阴性HOS-143b(ATCC，CRL8303)来建立HOS-FRa。HOS-143b最初是由13岁的高加索女性的原发性肿瘤建立的，在NSG小鼠中高度致瘤。用慢病毒萤火虫荧光素酶转导表达GFP的FR+HOS-FRαfLuc和FR阴性HOS-143bfLuc的生物发光对。
LEGENDplexTM人细胞因子面板购自BioLegend(San Diego，CA)。基于乳酸脱氢酶(LDH)的
Figure BDA0002689264240001241
非放射性细胞毒性测定试剂盒购自Promega(Madison，WI)。用于多色流式细胞术的商购抗人抗体是：来自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)的CD45RA(克隆HI100)、CD45RO(克隆UCHL1)、CD4(克隆SK3)和CD69(克隆FN50)；来自BD Bioscience(San Jose，CA)的CD3ε(克隆SK7)、CD8α(克隆RPA-T8)、CD137/4-1BB(克隆4B4-1)、CD25(克隆MA251)、PD1(克隆EH12.1)、LAG3(克隆T47-530)以及TIM3(克隆7D3)；来自R&D system(Minneapolis，MN)的生物素化抗人EGFR(西妥昔单抗，克隆Hu1)；以及来自BioLegend(SanDiego,CA)的FRα(克隆LK26)。荧光团缀合的抗生物素也购自BioLegend。APC缀合的抗FITC小鼠IgG2a/κ抗体(克隆NAWESLEE)、CountBrightTM珠(Invitrogen)、膜联蛋白V染色缓冲液和AlexaFluor-647缀合的膜联蛋白V均购自Thermo Fisher Scientific。为了酶促消化肿瘤组织，胶原酶IV、透明质酸酶和DNase I均购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
EC17或叶酸-FITC[FA-(g)-乙二胺-FITC]在Endocyte合成。3HEC17可从Moravekbiochemicals(Brea，CA)购买(～0.952Ci/mmol的比活性)，或通过将FITC与ViTrax(Placentia，CA)生产的3H-FA-(g)-乙二胺缀合在Endocyte制备(～1.2Ci/mmol的比活性)。3H-FA也购自ViTrax，59Ci/mmol的比活性。为了CRS挽救，荧光素钠定量溶液稀释自
Figure BDA0002689264240001251
25％(荧光素注射液，USP)，购自Purdue Pharmacy(NDC17478-250-25)。
实施例21人源化的CAR构建体和CAR修饰的T细胞
先前的研究使用了含有CD8a的铰链和跨膜序列以及4-1BB/CD3ζ信号传导结构域的GFP+第二代抗FITC scFv(克隆4M5.3)CAR(即FITC-4M5.3-scFv-CD8a铰链-CD8atm-4-1BB/CD3z)。为了转化至首次人类测试中，开发了第二代完全人FITC特异性(克隆E2)CAR构建体(在本文中称为E2)(图55，上图)。CAR修饰的T细胞如图55底部的饼状图所示。
本文所述的构建体是FITC特异性CAR构建体，其由如下组成：(1)完全人抗FITCscFv(克隆E2，Kd＝0.75nM)，(2)与CD28跨膜结构域融合的IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CH3间隔区，(3)第二代4-1BB/CD3ζ-内结构域，以及(4)细胞表面人EGFRt标签(图55，上图)(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别是核酸序列和氨基酸序列)。为了产生CAR修饰的T细胞，在与编码CAR的epHIV7慢病毒载体共转染的293T细胞中产生慢病毒。通过免疫磁性选择纯化供体CD4+和CD8+T细胞，并分别或以约50:50的比例进行转导。通常，仅进行一轮CD3/CD28珠活化，然后进行一轮或两轮快速体外扩增。为了临床前评价，使用数个批次的EGFRt分选的CD4、CD8和未分选的CD4/CD8CAR-T细胞。在冷冻保存之前和解冻之后，分析所有CAR-T细胞制剂，以通过流式细胞术确定EGFRt表达和CD4/CD8比例。使用表面标志物的组合，分析输注当天CD4+和CD8+CAR-T细胞亚群的分化状态，并将其定义为：TN，CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95-初始T细胞；TSCM，CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+干细胞记忆T细胞；TCM，CD45RA-CD45RO+CD62L+CD95+中央记忆T细胞；TEM，CD45RA-CD45RO+CD62L-CD95+效应记忆细胞；以及TEFF，CD45RA+CD45RO-CD62L-CD95+效应T细胞。对于以下描述的临床前测试，研究包括两批次的EGFRt分选的纯CD4和CD8亚群(以约1:1的比例混合后)和数个批次的未分选的～1:1的EGFRt+CD4/CD8掺合物，包括具有低分化谱的“临床复制本”制剂。
在合成和评价的一系列不同的CAR构建体中，选择完全人抗FITC scFv(FITC-E2)CAR进行临床前开发(图55)。这种第二代完全人CAR由如下组成：抗FITC scFv(克隆E2)、在CH2区具有双突变(L235D和N297Q)以减少与FcγR的结合的IgG4-Fc间隔区/铰链、CD28跨膜结构域、以及通过T2A核糖体跳跃序列附加到细胞表面EGFRt标签上的4-1BB/CD3z信号传导结构域(即FITC-E2-scFv-IgG4铰链-CD28tm-4-1BB/CD3z-T2A-EGFRt)。对于临床前研究，EGFRt分选和未分选的E2 CAR-T细胞均以～1：1CD4/CD8的比例制备，并且对于各个体内实验，在CAR T细胞输注时(第0天)通过流式细胞术常规地进行T细胞亚型表型分型。EGFRt分选的CAR-T细胞的典型表达模式由分别占大约42％TSCM、10％TCM、12％TEM和34％TEFF的CD4和CD8亚群组成(图55，左侧饼状图)。仅将EGFRt分选的CAR-T细胞用于共培养(图53、图54、图56、图58、图59和图61)和药代动力学研究(图62)。对于肿瘤治疗，使用具有低分化谱的“临床复制本”批次(图55，右侧的饼状图)，并且该“临床批次”也用于MDA-MB-231研究(图63)，研究批次用于THP1-FRb和HOS-FRa研究(图57)。“临床复制本”批次(～39％EGFRt+)由～66％TSCM和～32％TCM的CD4+亚群以及～95％TSCM和3％TCM的CD8亚群组成。研究批次(～23％EGFRt+)更分化，并由32％TSCM、53％TCM、11％TEM和3.7％TEFF的CD4亚群以及44％TSCM、0.28％TCM、3.4％TEM和52％TEFF的CD8亚群组成。
实施例22 EC17 CAM的双特异性亲和力
在基于细胞的放射性配体结合测定中使用3H-EC17评价了EC17CAM的双特异性亲和力。为了结合至FR+靶标，将KB和CHO-β细胞预先接种在24孔组织培养板中过夜，并与处于FFRPMI中的0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM和40nM的3H-EC17在37℃下孵育2h。然后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)冲洗，并用1％十二烷基硫酸钠裂解。通过标准PierceBCA蛋白质测定定量全细胞裂解物的放射性水平和细胞蛋白含量。计算每细胞结合的3H-EC17分子的数量，以分别确定FRα(KB)和FRβ(CHO-b)的解离常数(Kd)(图56)。
CAM控制的CAR T细胞疗法的主要组成部分：CAR-T细胞疗法的基本组成部分包括FITC作为假肿瘤抗原、高亲和力的EC17 CAM(在本申请中，CAM相当于桥梁或“化合物”)、以及合理设计的抗FITC CAR和经CAR修饰的T细胞。EC17已经在临床上经过关于免疫疗法和光学成像目的的测试。为了直接对其双特异性结合亲和力进行量化，合成了3H-EC17并在分别代表FRα+和FRβ+靶标细胞的KB和CHO-β细胞系以及代表效应细胞的未分选EGFRt CAR-T细胞上进行了放射性配体结合测定。与其靶标结合后，EC17对FRα和FRβ表现的亲和力相似，都具有低的Kd值，分别为1.7nM和0.8nM(图56，子图A)。与未分选的E2-CAR-T细胞(～24％EGFRt+，～95:5CD8/CD4比)结合后，Kd值估计为～130nM(图56，子图B)。
实施例23肿瘤模型
所有动物的护理和使用均按照NIH指南并遵守普渡大学动物使用和护理委员会批准的协议进行。4至5周龄的雌性NOD/SCIDγ(NSGTM)小鼠(库存号：005557)购自JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)。除非特别指出，所有动物在抵达时和整个研究期间均维持缺乏FA的饮食(TestDiet，St.Louis，MO)。为了建立皮下异种移植，将MDA-MB-231和HOS-FRa分别以每只动物2.5×106和1×106个细胞植入右胁腹区域。对于静脉内异种移植，以每只动物5×106个细胞接种THP1-FRb细胞。每周用卡尺测量皮下肿瘤2-3次，并使用椭圆公式(长×宽2)/2计算。根据研究设计或以下情况进行安乐死：(i)动物的体重减轻了320％或濒临垂死状态，(ii)皮下肿瘤的尺寸达到≥1500mm3，或(iii)动物出现腹部肿胀和严重窘迫的迹象(即，THP1-FRβ)。所有动物剂量(CAR-T细胞、EC17、荧光素钠)均为静脉内给予。
实施例24肿瘤疗法
在治疗环境中，理论上可以在注射CAR-T细胞之前或之后给予EC17CAM。如本文所述，第一剂量的EC17在CAR-T细胞后2-3.5天给予，使得有对荷瘤小鼠中人T细胞的观察期。将两批未分选的E2 CAR-T细胞(23％或39％EGFRt+，1:1CD4/CD8)用于体内研究。在每个实验的输注当天(第0天)，将冷冻的CAR-T细胞在37℃下快速解冻，用Dulbecco的1×PBS(pH7.4)洗涤2×，并以期望的EGFRt+E2-CAR-T细胞剂量将其注入尾静脉。此外，通过流式细胞术对一小等份CAR-T细胞的CD4与CD8比例以及CAR-T细胞的分化状态进行分析。在EC17剂量的第一天，将荷瘤动物根据其肿瘤尺寸或静脉植入后相同天数随机分组(即THP1-FRβ)。
实施例25毒性和CRS挽救
取决于CAR-T细胞的剂量和EC17的给予方式，接受FITC特异性CAR-T细胞的荷瘤小鼠可能经历严重的CRS和不同程度的体重减轻。因此，开发了CRS分级系统(0-5级)，以从动物的总体形态和社会行为上实证评价CRS毒性，以便更好地安排CRS挽救。0级和5级分别表示正常(无CRS)或死亡(由于严重CRS)，而1级、2级和3-4级被认为是轻度、轻至中度和重度CRS(图57A，表说明)。此外，所有EC17剂量有意在任何给定日期结束时进行给予，以使潜在的CRS症状整夜发展。紧随每次EC17剂量后的第二天，对动物进行评分，并使用挽救试剂(如荧光素钠、叶酸和醛氢叶酸)以缓和CRS毒性。在此特定情况下，在第0天将一批具有高EGFRt+CD4/CD8比(～93:7)的E2 CAR-T细胞以～250万个CD8和～3300万个CD4的混合给予至荷有HOS-FRα肿瘤的小鼠(图57A，图表)。当在第3、10和12天分别以500nmol/kg、100nmol/kg和500nmol/kg剂量给予EC17时，在第4天和第11天发现低CRS(1-2级)，但在第13天发现高CRS(3级)。为了缓和严重的CRS毒性，在第13天早晨以～96mg/kg静脉内给予荧光素钠，并在6小时后收集小鼠血浆样品以分析CRS相关的细胞因子。
为了详细检查荧光素钠的CRS挽救能力，开发了CRS评分系统，该系统能够捕获EC17给予后严重CRS(3/4级)发作(图57A)。如在非常高剂量的3500万总CAR-T细胞(93:7CD4/CD8)导致荷有HOS-FRα肿瘤的小鼠中快速CRS发作的具有挑战性的案例中所示，以人等效剂量(在小鼠中～95mg/kg)的静脉内荧光素钠非常迅速起作用，从而减少了CAR-T细胞来源的人细胞因子(图57B)。
实施例26统计
使用计算机程序GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)进行统计分析。使用学生t检验或单因素ANOVA分析数据。如果适用，使用适当的多重比较后续检验进一步分析处理组之间的数据。*＝p<0.05在所有检验中被认为统计学显著。
实施例27共培养实验
为了研究EC17 CAM在体外的作用，将纯的EGFRt分选的CD4和CD8 CAR-T细胞以1:1的比例混合，并且每个实验设计都包括匹配的空白对照转导的T细胞。除了AML和骨肉瘤细胞系的FR+/-同基因对之外，还添加KB、MDA-MB-231和OV90来代表不同的组织学肿瘤类型以及FR表达水平。所有FR+靶标细胞系经受直接3H-FA结合测定，以量化结合的FR分子的数量/细胞(图58)。在共培养实验之前，将冷冻保存的CAR-T细胞在T细胞培养基中恢复2-3天。所有效应细胞和靶标细胞均用FFRPMI预先洗涤，以去除任何可能与EC17竞争的外源FA。≤3天的短期共培养研究在未添加任何外源细胞因子的FFRPMI中进行。
对于EC17剂量反应研究(图59，子图A和子图B)，将FR+细胞系(KB、MDA-MB-231、HOS-FRα、THP1-FRβ、OV90)与EGFRt分选的E2-CAR-T细胞在EC17(范围从0.1pM到100μM，以10倍增量)的存在下以1:1的效应物与靶标(E/T)比例共培养。共培养24小时后，收集上清液以确定肿瘤细胞杀伤。为了研究体外T细胞激活和FR相关性的动力学(图60，子图A-子图E)，在连续存在的10nM EC17下在FR+/-细胞系中以不同的E/T比例(1:27、1:9、1:3、1:1、3:1)进行共培养。共培养16小时和48小时后，对肿瘤细胞杀伤的动力学进行定量。同时，在共培养44小时后取一部分上清液用于测量IFNg、IL-2和TNFα。使用Promega的CytoTox
Figure BDA0002689264240001301
LDH测定试剂盒，对靶标细胞杀伤进行定量，并表示为特异性裂解(％)，将其按照给定的E/T比例归一化至不存在EC17的基础水平。使用LEGENDplexTM人Th1细胞因子面板(BioLegend，SanDiego，CA)来确定CAR-T细胞来源的细胞因子。
为了研究FR+肿瘤细胞靶标存在下的CAR-T细胞激活(图53)，最初与MDA-MB-231、THP1-FRβ和HOS-FRα进行共培养实验。暴露于含有100nM EC17的培养基30min后，洗涤所有靶标细胞，然后与EGFRt分选的E2-CAR-T细胞(1:1CD4/CD8)或空白对照转导的对照T细胞以1:1E/T比例进行孵育。共培养24小时后，通过流式细胞术分析T细胞激活标志物CD69、CD137(4-1BB)和PD1的表面表达。对于T细胞耗竭研究(图54)，将FR+(KB，MDA-MB-231，HOS-FRαfLuc，THP1-FRβ)和FR阴性(HOS-143bfLuc，THP1-FG12)肿瘤细胞系用作靶标。此处，将靶标细胞在第0天在没有或有0.1nM和10nM EC17的情况下于37℃孵育30min，并通过用抗FITC抗体对细胞表面EC17复染来评价EC17“预加载”状态(图61，子图A)。三天后，分析了PD1、LAG3和TIM3抑制剂受体在共培养的CAR-T细胞上的表面表达，并认为双阳性和三阳性细胞的较高频率为接近耗竭的表型。由于这项研究中使用的肿瘤细胞显示出倍增时间的变异性，因此在共培养2天后，以膜联蛋白V+测量靶标细胞凋亡(％)，并关于在相同条件下不存在T细胞的情况下培养的靶标细胞的背景凋亡水平进行归一化(图61，子图B)。
功能性FR评价
这些功能性FR评价可应用于本文所述的几个实例。除了用FRa(HOS-FRα)和FRβ(THP1-FRβ)转染的儿童癌细胞系外，还包括不同组织学和FR表达水平的癌细胞系(图58)。通过放射性配体结合测定(100nM 3H-FA，在37℃下1h)进行评价，这些细胞系中总可用FR的排列顺序为：9×104(OV90，低FR表达的卵巢癌细胞系)、1.9×105(THP1-FRβ)、2.4×105(HOS-FRαfLuc)、7×105(HOS-FRα)、2.1×106(MDAMB-231)和4.8×106(KB)FA分子/细胞。还包括作为FR阴性对照包括在内的是HOS-143b(fLuc)和THP1-FG12亲本细胞系。因此，在共培养的FR+癌细胞系上功能性FR表达的一般排名为：KB>MDA-MB-231>HOS-FRα>HOSFRαfLuc>THP1-FRβ(AML)>OV90。
FR水平与靶标细胞裂解和细胞因子产生的相关性
为了分析FR依赖性，在连续存在10nM EC17下以不同的E/T比例(1:27、1:9、1:3、1:1和3:1)将5种FR+(MDA-MB-231、KB、HOS-FRα、THP1-FRβ、OV90)细胞系和1种FR阴性(HOS-143b)细胞系与E2-CAR-T细胞共培养。共培养16小时和48小时后，对特异性裂解(％)进行定量；共培养44小时后，对培养基中的Th1细胞因子(IFNg、IL-2、TNFa)进行测量。尽管特异性裂解的开始(～16小时)在不同肿瘤之间有所不同，但对于所有FR+癌细胞系，在48小时时都观测到了特异性细胞溶解的增加(图60，子图A)。在表达FR最低的OV90细胞中，通常需要较长的时间(48小时)和较高的E/T比(≥1:1)才能看到明显的活性(图60，子图A)。高FR表达的KB细胞应答非常缓慢，并且也需要较高的E/T比(≥1:3)和较长的暴露时间以引起明显的细胞死亡(图60，子图B，左图)。当存在足够的效应细胞(≥1:1的E/T比)时，所有FR+癌细胞在共培养48小时后应答。值得注意的是，只有FR阴性的HOS-143b细胞基本上没有受到损害(图60，子图B，右图)。
为了建立体外CAR-T细胞活性与FR表达的相关性，以1:1的E/T比相对于肿瘤细胞上存在的功能性FR水平对16h特异性裂解值进行绘制(图58)。不包括在开始时显示出异常耐受性的KB细胞，FR表达与细胞溶解开始之间存在强半对数相关性，R值为0.98(图60，子图C)。类似的，除FR阴性HOS-143b肿瘤细胞外，所有细胞在与E2-CAR-T细胞以1:1的E/T比共培养44小时后触发了高水平的IFNγ、IL-2和TNFα的产生(图60，子图D)。对于Th1细胞因子的产生，还观测到包括的所有细胞系的半对数相关性，R值分别为0.88(IFNγ)、0.89(IL-2)和0.89(TNFα)(图60，子图E)。在短期共培养中，发现MDA-MB-231对CAR-T细胞杀伤最敏感，但HOS-FRa骨肉瘤和THP1-FRαAML也以FR水平依赖性方式快速应答(图60，子图C)。
EC17 CAM在体外效应物/靶标细胞接合中的高效价
游离形式的单价EC17(即每个FA配体一个FITC)不自动激活抗FITC CAR-T细胞。为了研究CAR-T细胞激活的稳健性，以1:1的E/T比使用5种FR+细胞系(KB、MDA-MB-231、HOS-FRα、THP1-FRβ、OV90)以及宽范围的EC17浓度(0.1pM至100μM)(图59，子图A和子图B)。在共培养24小时后，通过Promega的LDH细胞毒性测定试剂盒，对特异性裂解(％)进行定量。在所有细胞系中，EC17依赖性细胞溶解遵循钟形剂量反应，具有相对宽的浓度平台(～0.1nM至1mM)(图59，子图A)。当剂量反应曲线拟合到峰顶(最高100nM)时，分别在4.5pM(MDA-MB-231)、5.3pM(KB)、15pM(THP1-FRβ)、30pM(HOS-FRα)和418pM(OV90)处获得半最大效应浓度(EC50)。但是，每种细胞系获得的最大裂解的不同排列为45％(MDA-MB-231)、27％(THP1-FRb)、18％(HOS-FRα)、15％(OV90)和11％(KB)(图59，子图B)。低的EC50值通常表明EC17在通过激活的E2-CAR-T细胞触发FR特异性靶标细胞裂解方面高度有效。
EC17/FR依赖性CAR-T细胞的体外激活和耗竭
为了检查抗原依赖性CAR-T细胞激活，在30min内将MDA-MB-231、THP1-FRβ和HOS-FRα细胞预加载100nM EC17。洗涤细胞，然后与EGFRt分选的E2-CAR-T细胞(1:1的CD4/CD8)或空白对照转导的对照T细胞以1:1E/T比进行孵育。共培养24小时后，我们测量了T细胞激活标志物CD69、CD137(4-1BB)和PD1的表面表达(图53)。EC17预加载的MDA-MB-231和HOS-FRa是我们的CAR-T细胞的强激活剂。与MDA-MB-231细胞相比FR表达低11倍的THP1-FRb细胞确实触发了CAR-T细胞激活，但水平较低。重要的是，空白对照T细胞在这些条件下未被激活。一些FR+肿瘤类型(例如KB)显示出对EC17定向的CAR T细胞的杀伤的天然耐受(图56、图58、图59和图60)，我们研究了T细胞激活相对耗竭的EC17 CAM作用机制。为此目的，选择了FR+(KB、MDA-MB-231、HOS-FRαfLuc、THP1-FRβ)和FR阴性(HOS-143bfLuc、THP1-FG12)肿瘤细胞系二者。HOS-FRαfLuc比其亲本HOS-FRα而言表达的功能性FR水平低～5.6×，HOS-143bfLuc为与HOS-143b类似的FR阴性(图59，子图A)。此处，将没有或具有EC17预加载(0.1nM或10nM，在37℃下30min脉冲)的FR+和FR阴性肿瘤细胞与EGFRt分选的CAR-T细胞(1:1的CD4/CD8)以1:2的E/T比进行孵育(图54和图61，子图B)。在第0天，通过用APC缀合的抗FITC抗体(克隆NAWESLEE)对结合膜的EC17复染，确认了EC17剂量依赖性的预加载(图61，子图A)。三天后，测量共培养的CAR-T细胞的T细胞激活/耗竭标志物PD1、LAG3和TIM3的上调和共表达。在没有靶标细胞的情况下，E2-CAR-T细胞在培养过程中经历了低度分化，具有低频率的双阳性或三阳性细胞。有趣的是，单独肿瘤细胞的存在(未预加载EC17)似乎在不同程度上使CAR-T细胞“松懈”。但是，当遇到EC17预加载的FR+(而不是FR阴性)肿瘤细胞靶标时，E2-CAR-T细胞经历了显著的分化，并且耗竭标志物的共表达增加。基于三阳性和双阳性细胞的频率增加，在共培养的CAR-T细胞上出现了更加耗竭的表型，其顺序为KB>HOS-FRαfLuc>THP1-FRβ>MDA-MD-231。尽管在第2天在所有FR+肿瘤细胞系中均观察到EC17剂量依赖性凋亡(膜联蛋白V+)，但高FR表达的KB细胞再次显示出不相称的低凋亡(图61，子图B)。
实施例28 CAR-T细胞扩增和肿瘤摄取的动力学
为了研究体内CAR-T细胞的扩增，分析从15只荷有MDA-MB-231肿瘤的小鼠开始，所述小鼠具有在第0天注射的～480万EGFRt分选的E2-CAR-T细胞(1:1CD4/CD8)(图62，子图A)。当第2天的肿瘤平均尺寸为～350±60mm3时，在第2、9、16、23和30天给予多达6次每周剂量为500nmol/kg的EC17。为了进行离体分析，在第9、16、23和30天在下一次EC17剂量之前取3只动物，共4次收集。为了进行比较，将相同的EC17剂量给予至在第2天有～4.4×大的肿瘤尺寸(～1555±79mm3)的3只CAR-T小鼠。对于每次收集，通过流式细胞术分析新鲜血液和肿瘤样品(如果可获得)中的人CD3e+EGFRt+CAR-T细胞的存在。此外，分析了循环中E2-CAR-T细胞的表型变化(TSCM、TCM、TEM和TEFF)和肿瘤浸润CAR-T细胞(即CD137/4-1BB、PD1)的激活状态。
EC17介导的CAR-T细胞扩增和体内肿瘤摄取
使用MDA-MB-231肿瘤模型进一步分析了EC17和CAR-T细胞在体内的动态相互作用，先前使用基于3H-FA的放射性配体结合测定发现该模型是FR表达最高的肿瘤之一，膜蛋白为103±15pmol/mg。在这项研究中，在接受～480万个EGFRt分选的E2-CAR-T细胞的荷瘤小鼠中研究了CAR-T细胞扩增的动力学(图62，子图A)。在单次EC17剂量后的7天(即研究第9天)，在小鼠血液中检测到人CD3e+EGFRt+CAR-T细胞，在携带较大肿瘤的小鼠中循环数量升高(图62，子图B)。除了趋向于更高的体内扩增，这些血源性CAR-T细胞在具有较大肿瘤的小鼠中也表现出更分化的谱(图62，子图B，2504±441mm3对422±16mm3)。具有较小肿瘤尺寸的小鼠继续进行研究，以500nmol/kg接受共5次的每周EC17剂量。如图62、子图C所示，在第二次EC17剂量后，MDA-MB-231肿瘤开始应答。给予EC17后，小鼠确实经历了轻微的体重减轻，尤其是在第三剂之后。当循环中的CAR-T细胞在第15天左右达到峰值并持续长达30天(通过流式细胞术进行最后分析)时，观测到肿瘤浸润CAR-T细胞稳定增加(图62，子图D，上图，虚线)。此外，CAR-T细胞在血液中经历了动态表型变化，随着EC17连续处理从第9天的主要TSCM表型到后来日期的更分化的谱(图62，子图D，底部条形图)。因此，那些肿瘤浸润CAR-T细胞被激活并表达早期(CD137/4-1BB)和晚期(PD1)T细胞激活标志物(图62，子图E)。CD137/4-1BB表达在第9天左右达到峰值，而PD1表达从第9天开始一直保持高水平。因而，EC17 CAM用药在体内驱动CAR-T细胞激活、扩增和肿瘤摄取，从而产生稳健的抗肿瘤免疫力。
实施例29离体流式细胞术
为了循环中的CAR-T细胞分析，从预定体积的全血中去除血浆，所述全血被收集到含有乙二胺四乙酸抗凝剂的管中。裂解红血细胞后，将白细胞沉淀重悬于流式细胞术染色溶液中，所述溶液包含1％牛血清白蛋白、50mg/mL人IgG(Equitech Bio)和0.9％叠氮化钠。对样品进行人白细胞表面标志物(CD3ε、CD4、CD8α、CD45RA、CD62L)和生物素化的抗人EGFR(西妥昔单抗)染色，然后进行荧光团缀合的抗生物素二抗染色。为了分析肿瘤浸润CAR-T细胞，将预先称重的新鲜肿瘤碎块细细切碎，并用消化混合物进行酶促消化，在37℃下剧烈震荡一小时，所述消化混合物由无血清的FFRPMI中的0.1mg/mL DNase I、0.5mg/mL胶原酶IV和0.5mg/mL透明质酸酶构成。之后，肿瘤细胞沉淀经历红血细胞裂解步骤，用冷PBS洗涤并通过40μm尼龙细胞滤网过滤。对所得的单细胞悬浮液关于EGFRt和人白细胞标志物CD137/4-1BB和PD1进行染色。在Gallios流式细胞仪上收集最少20,000个碘化丙啶阴性活细胞事件，并使用2.1版的Kaluza软件(Beckman Coulter，Brea，CA)进行分析。小鼠血液中将CAR阳性T细胞鉴定为人CD3e+EGFRt+事件，并使用添加到每个样品中的相等数量的CountBrightTM珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)来计算每体积血液的绝对数量。肿瘤浸润CD3ε+EGFRt+CAR-T细胞的数量表示为经分析的总存活肿瘤细胞的％。
实施例30肿瘤疗法
为了研究高饮食性叶酸样化合物的作用(图63，子图A-子图D)，将两组NSG小鼠在抵达后置于FA充足(FA-replete)饮食(4mg/kg，Envigo，Indianapolis，IN)或FA缺乏饮食(TestDiet，St.Louis，MO)。在第0天，两组小鼠都接受了～1000万个相同的“临床复制本”CAR-T细胞，随后在第3天开始接受500nmol/kg的EC17 SIW或不接受EC17。在给予EC17的第一天，FA充足的小鼠中MDA-MB-231肿瘤的尺寸平均约～549±184mm3(280-918mm3)，而FA缺乏的小鼠中为～559±165mm3(356-961mm3)。
高饮食性叶酸样化合物对CRS和抗肿瘤活性的影响
先前，已显示在荷有MDA-MB-231肿瘤的小鼠中给予FA或FA配体有助于降低CRS的严重性。为了测试饮食性叶酸样化合物的长期效果，将小鼠维持在规定的饮食下～73天，并在FA充足的小鼠的肿瘤达到～549±184mm3(280-918mm3)时、以及在FA缺乏的小鼠的肿瘤达到～559±165mm3(356-961mm3)时使用小鼠(图63，子图A-子图D)。所有小鼠在第0天都接受了～1000万个E2-CAR-T细胞的相同“临床复制本”，并从第2天(FA充足)或第3天(FA缺乏)开始，EC17处理的同生群接受了八次每周500nmol/kg的剂量。如前所见，EC17的第一全剂量通常是安全的，并且在两种饮食下都不引起小鼠中的CRS或体重减轻。实际上，FA充足的动物在整个EC17处理期间均未显示CRS症状，而FA缺乏的动物随每次后续的EC17剂量而经历2-3级CRS和体重减轻(高达～11.4％)(图63，子图A，下图)。在EC17治疗的相同持续时间内，与FA充足的饮食下的小鼠(第59天，每100μL血液0.027-4.3×103)相比时，发现FA缺乏的饮食下的小鼠中CD3e+EGFRt+CAR-T细胞的水平更高(第52天每100μL血液1.6-20.4×104)(图63，子图BC)。重要的是，在未接受EC17处理的FA缺乏的动物中未检测到CAR-T细胞扩增(图63，子图C)。
因为我们以比先前的研究更大的尺寸起始MDA-MB-231肿瘤，所以在这种1000万“临床复制本”CAR-T细胞剂量下，归因于同种异体反应的肿瘤消退不明显(图63，子图A，顶行)。与FA缺乏的小鼠中的对照肿瘤相比，FA充足的小鼠中的对照肿瘤(无EC17)似乎具有更快的生长动力学；但总的来说，在接受EC17的FA充足的小鼠中，有2/5治愈、2/5完全应答和1/5部分应答(图63，子图A，左上图)。在FA缺乏的饮食下的小鼠中可见到更稳健的体内T细胞扩增，并引起5/5治愈，尽管这些动物的健康随每次CRS发作而恶化(图63，子图A，右上图)。
在酶促消化后，使用抗人EGFR(克隆Hu1)鉴别小鼠肿瘤块内的MDA-MB-231癌细胞，我们分析了从FA充足的饮食下的小鼠中回收的三种肿瘤中的FRα蛋白表达(克隆LK26)，所述小鼠尽管继续EC17处理但仍经历复发。通过流式细胞术检测，从最小的肿瘤(21mg)中分离的EGFR+癌细胞表达FRα，而从较大的两个肿瘤(90mg和363mg)中分离的EGFR+癌细胞完全丧失了它们的FRa表达(图63，子图D)。使用具有3H-FA的定量放射性配体结合测定，证实了从这些肿瘤获得的组织匀浆中功能性FR水平的丧失(～2.1pmol/mg的结合潜力，相对于来自未处理的动物的肿瘤中～103pmol/mg)。因此，FA缺乏可能导致增强的活性和CRS毒性；而非生理性FA摄取防止CRS，并且持续采食可能导致活性降低。
序列表
<110> Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's ResearchInstitute)
ENDOCYTE, INC.
PURDUE RESEARCH FOUNDATION
<120> CAR T细胞的使用方法
<130> SCRI.200WO
<150> 62/620,414
<151> 2017-02-07
<150> 62/620,706
<151> 2018-01-23
<150> 62/656,233
<151> 2018-04-11
<150> 62/724,171
<151> 2018-08-29
<150> 62/735,627
<151> 2018-09-24
<150> 62/736,727
<151> 2018-09-26
<160> 4
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 3198
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2抗-荧光素抗体片段CAR核酸序列
<400> 1
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaagcg tgctgacaca gcctagctcc gtgtctgccg cccctggcca gaaagtgacc 120
atcagctgta gcggcagcac cagcaacatc ggcaacaact acgtgtcctg gtatcagcag 180
caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaagcggcc cagcggcgtg 240
cccgatagat tttccggcag caagagcggc aacagcgcca gcctggatat cagcggcctg 300
cagtctgagg acgaggccga ctactattgc gccgcctggg acgatagcct gagcgagttc 360
ctgtttggca ccggcaccaa gctgacagtg ctgggcggag gcggaggatc tggcggcgga 420
ggaagtggcg gagggggatc tcaggtgcag ctggtggaaa gcggcggcaa cctggtgcag 480
cctggcggat ctctgagact gagctgtgcc gccagcggct tcaccttcgg cagcttcagc 540
atgagctggg tgcgccaggc tcctggggga ggactggaat gggtggcagg actgagcgcc 600
agaagcagcc tgacccacta cgccgatagc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 660
aacgccaaga acagcgtgta cctgcagatg aacagcctgc gggtggaaga taccgccgtg 720
tactactgcg ccagacggtc ctacgacagc agcggctact ggggccactt ctacagctac 780
atggacgtgt ggggccaggg caccctcgtg acagtgtctg agagcaagta cggaccgccc 840
tgcccccctt gccctgcccc cgagttcgac ggcggaccca gcgtgttcct gttccccccc 900
aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 960
gtgagccagg aagatcccga ggtccagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 1020
aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag ttccagagca cctaccgggt ggtgtctgtg 1080
ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaagaat acaagtgcaa ggtgtccaac 1140
aagggcctgc ccagcagcat cgaaaagacc atcagcaagg ccaagggcca gcctcgcgag 1200
ccccaggtgt acaccctgcc tccctcccag gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1260
acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc 1320
cagcctgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 1380
ctgtacagcc ggctgaccgt ggacaagagc cggtggcagg aaggcaacgt ctttagctgc 1440
agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgag cctgtccctg 1500
ggcaagatgt tctgggtgct ggtggtggtg ggcggggtgc tggcctgcta cagcctgctg 1560
gtgacagtgg ccttcatcat cttttgggtg aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 1620
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1680
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgcggg tgaagttcag cagaagcgcc 1740
gacgcccctg cctaccagca gggccagaat cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1800
agggaagagt acgacgtcct ggataagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag 1860
cctcggcgga agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1920
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc 1980
ctgtatcagg gcctgtccac cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc 2040
ctgcccccaa ggctcgaggg cggcggagag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac 2100
gtggaggaga atcccggccc taggatgctt ctcctggtga caagccttct gctctgtgag 2160
ttaccacacc cagcattcct cctgatccca cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt 2220
gaatttaaag actcactctc cataaatgct acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc 2280
tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg gtggcattta ggggtgactc cttcacacat 2340
actcctcctc tggatccaca ggaactggat attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg 2400
tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta 2460
gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg 2520
aacataacat ccttgggatt acgctccctc aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt 2580
tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc 2640
tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc 2700
caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc 2760
gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag 2820
ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg 2880
cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc 2940
cactacattg acggccccca ctgcgtcaag acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac 3000
aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac 3060
tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc 3120
ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg 3180
atcggcctct tcatgtga 3198
<210> 2
<211> 1065
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2抗-荧光素抗体片段CAR氨基酸序列
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Ser Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser
20 25 30
Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser
35 40 45
Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Asp
85 90 95
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
100 105 110
Trp Asp Asp Ser Leu Ser Glu Phe Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Gly Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gly Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ala Gly Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Thr His Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
210 215 220
Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Trp Gly His
245 250 255
Phe Tyr Ser Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
Phe Asp Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln
340 345 350
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
355 360 365
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
370 375 380
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
405 410 415
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
450 455 460
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
500 505 510
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
515 520 525
Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
530 535 540
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
545 550 555 560
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
565 570 575
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
580 585 590
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
595 600 605
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
610 615 620
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
625 630 635 640
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
645 650 655
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
660 665 670
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly
675 680 685
Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
690 695 700
Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu
705 710 715 720
Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly
725 730 735
Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn
740 745 750
Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile
755 760 765
Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu
770 775 780
Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly
785 790 795 800
Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala
805 810 815
Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln
820 825 830
Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg
835 840 845
Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys
850 855 860
Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr
865 870 875 880
Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys
885 890 895
Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys
900 905 910
Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg
915 920 925
Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg
930 935 940
Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu
945 950 955 960
Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys
965 970 975
Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
980 985 990
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
995 1000 1005
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
1010 1015 1020
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile
1025 1030 1035 1040
Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val
1045 1050 1055
Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
1060 1065
<210> 3
<211> 1068
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4M5.3-CAR氨基酸序列
<400> 3
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
20 25 30
Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
65 70 75 80
Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala
130 135 140
Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Gly
145 150 155 160
Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ala
165 170 175
Met Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr Trp
180 185 190
Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
195 200 205
Gln Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
210 215 220
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr
245 250 255
Cys Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Thr Ser
260 265 270
Val Thr Val Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
275 280 285
Ala Pro Glu Phe Asp Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
290 295 300
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
305 310 315 320
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
325 330 335
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
340 345 350
Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
355 360 365
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
370 375 380
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
385 390 395 400
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
405 410 415
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
420 425 430
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
435 440 445
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
450 455 460
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
465 470 475 480
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
485 490 495
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val
500 505 510
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
515 520 525
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
530 535 540
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
545 550 555 560
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
565 570 575
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
580 585 590
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
595 600 605
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
610 615 620
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
625 630 635 640
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
645 650 655
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
660 665 670
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu
675 680 685
Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
690 695 700
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu
705 710 715 720
Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val
725 730 735
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
740 745 750
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
755 760 765
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
770 775 780
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
785 790 795 800
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
805 810 815
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
820 825 830
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
835 840 845
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
850 855 860
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
865 870 875 880
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
885 890 895
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
900 905 910
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
915 920 925
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
930 935 940
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
945 950 955 960
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
965 970 975
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
980 985 990
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
995 1000 1005
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
1010 1015 1020
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
1025 1030 1035 1040
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
1045 1050 1055
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
1060 1065
<210> 4
<211> 3207
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4M5.3-CAR核苷酸序列
<400> 4
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagacg ttgtaatgac ccagacccct ctgtctctcc ccgtaagctt gggcgaccag 120
gcgagcatct cttgtcggtc ttcccagtcc ctggtccatt caaacggcaa tacttacttg 180
cggtggtact tgcagaagcc cggtcaatcc ccaaaagtgc tgatatacaa ggttagcaat 240
cgggtcagtg gagtgcccga ccgcttcagc ggaagcggat ccgggactga cttcactctg 300
aagatcaacc gggtagaagc tgaagacctg ggggtgtact tctgctctca gtcaacacac 360
gtgccatgga cctttggagg tggcaccaag ctggaaatca aatcatcagc ggacgatgcc 420
aaaaaagacg cggccaagaa ggacgatgcc aagaaggatg atgctaaaaa ggatggcgga 480
gtcaaattgg acgagacagg cgggggactg gtgcagcccg gcggtgccat gaaactgtct 540
tgtgtgacca gcggctttac cttcgggcat tattggatga actgggtgcg acagtctcca 600
gagaaagggc tcgagtgggt ggcccagttt cgaaataaac cgtacaatta tgagacctac 660
tattcagatt ctgtgaaagg gcgcttcact atttcacgcg acgacagcaa aagttccgtc 720
taccttcaga tgaacaacct tagagtggag gataccggaa tatactactg cacgggtgcc 780
agttatggca tggagtactt ggggcagggg acatctgtga ccgtttctga gagcaagtac 840
ggaccgccct gccccccttg ccctgccccc gagttcgacg gcggacccag cgtgttcctg 900
ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagccgga cccccgaggt gacctgcgtg 960
gtggtggacg tgagccagga agatcccgag gtccagttca attggtacgt ggacggcgtg 1020
gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt tccagagcac ctaccgggtg 1080
gtgtctgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagaata caagtgcaag 1140
gtgtccaaca agggcctgcc cagcagcatc gaaaagacca tcagcaaggc caagggccag 1200
cctcgcgagc cccaggtgta caccctgcct ccctcccagg aagagatgac caagaaccag 1260
gtgtccctga cctgcctggt gaagggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1320
agcaacggcc agcctgagaa caactacaag accacccctc ccgtgctgga cagcgacggc 1380
agcttcttcc tgtacagccg gctgaccgtg gacaagagcc ggtggcagga aggcaacgtc 1440
tttagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1500
ctgtccctgg gcaagatgtt ctgggtgctg gtggtggtgg gcggggtgct ggcctgctac 1560
agcctgctgg tgacagtggc cttcatcatc ttttgggtga aacggggcag aaagaaactc 1620
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1680
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgcgggt gaagttcagc 1740
agaagcgccg acgcccctgc ctaccagcag ggccagaatc agctgtacaa cgagctgaac 1800
ctgggcagaa gggaagagta cgacgtcctg gataagcgga gaggccggga ccctgagatg 1860
ggcggcaagc ctcggcggaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1920
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggaggcg gggcaagggc 1980
cacgacggcc tgtatcaggg cctgtccacc gccaccaagg atacctacga cgccctgcac 2040
atgcaggccc tgcccccaag gctcgagggc ggcggagagg gcagaggaag tcttctaaca 2100
tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct aggatgcttc tcctggtgac aagccttctg 2160
ctctgtgagt taccacaccc agcattcctc ctgatcccac gcaaagtgtg taacggaata 2220
ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 2280
aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 2340
ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 2400
atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 2460
gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 2520
gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 2580
gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 2640
tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 2700
gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 2760
agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 2820
cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 2880
gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 2940
cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 3000
ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 3060
catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 3120
cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 3180
gccctgggga tcggcctctt catgtga 3207

Claims (12)

1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述核酸包含：
(a)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4具有至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性的核酸，其中，所述核酸编码抗荧光素scFv；或者
(b)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的序列的核酸；
其中，任选地，(a)或(b)的所述核酸进一步包含编码IgG4铰链结构域、CD3ζ激活结构域和4-1BB共刺激结构域的核酸。
2.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的多肽，所述多肽包含：
(a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性的多肽，其中，所述多肽编码抗荧光素scFv；或者
(b)具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的序列的多肽，其中，所述多肽编码抗荧光素scFv，并且
其中，任选地，(a)或(b)的所述多肽进一步包含编码IgG4铰链结构域、CD3ζ激活结构域和4-1BB共刺激结构域的多肽。
3.包含如权利要求1所述的核酸的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其中，所述载体是慢病毒载体。
5.包含如权利要求1、3或4中任一项所述的核酸或载体的细胞。
6.如权利要求5所述的细胞，其中，所述细胞是T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞。
7.如权利要求2所述的多肽，其中，所述多肽包含人源化或人氨基酸序列，或者所述多肽由人源化或人氨基酸序列组成。
8.包含如权利要求2或7所述的多肽的细胞。
9.如权利要求8所述的细胞，其中，所述细胞是T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞。
10.一种改善或治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括：
用具有异硫氰酸荧光素(FITC)部分的小分子配体对所述患者的癌症进行标记；以及
向所述患者给予包含如权利要求5、6或9所述的细胞、T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞的嵌合抗原受体(CAR)T细胞组合物。
11.如权利要求10所述的方法，其中，在用具有FITC部分的所述小分子配体标记所述癌症之前给予所述CAR T细胞组合物。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述CAR T细胞组合物包括自体细胞。
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