KR20190131061A - Al 아밀로이드증 치료를 위한 cs1 표적화된 키메라 항원 수용체-변형된 t 세포 - Google Patents

Al 아밀로이드증 치료를 위한 cs1 표적화된 키메라 항원 수용체-변형된 t 세포 Download PDF

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Abstract

CS1을 표적화하는 키메라 항원 수용체를 사용하여 AL 아밀로이드증을 치료하는 방법이 기재된다.

Description

AL 아밀로이드증 치료를 위한 CS1 표적화된 키메라 항원 수용체-변형된 T 세포
경쇄 아밀로이드증 (AL 아밀로이드증)은 카파 및 람다 제한의 단일클론 경쇄를 생성하는 골수 내 형질 세포의 클론 집단에 의해 특징지어진다. 아밀로이드생성 경쇄는 부적절하게 접혀 베타 주름진 시트를 형성하고 이는 조합되어 원섬유를 형성한다. 이들 아밀로이드 원섬유는 심장, 신장 및 말초 신경을 포함하는 조직 및 기관에 침착되며 여기서 그들은 구조 및 기능을 점진적으로 방해한다 (Falk et al. 1997 N Engl J Med 337: 898-909). 치료 없이는 예후가 좋지 않아 중앙 생존이 단지 8개월이다 (Kyle et al. 1997 N Engl J Med 336:1202-120). AL 아밀로이드증의 치료는 주로 아밀로이드 원섬유 생성을 저지하고 기관 회복을 허용하도록 기저 형질 세포 클론을 표적화하는데 집중된다. 치료를 위한 옵션은 다발성 골수종을 치료하는데 사용되는 화학치료 요법으로부터 선택되는 것 뿐만 아니라 고용량 멜팔란에 이은 자가 줄기 세포 이식을 포함한다. 비록 AL 아밀로이드증을 갖는 환자가 일반적으로 형질 세포 질환의 치료를 위해 만들어진 다수의 진전으로부터 이익을 얻었지만, 치료는 아밀로이드 관련 기관 기능장애에 기인한 집단의 허약한 특성 및 잔류 클론이 추가의 원섬유 침착을 일으키는 것을 방지하기 위한 신속한 심층 반응을 얻을 필요성에 의해 복잡해진다. 비록 장기간 완화가 줄기 세포 이식 및 프로테오솜 억제제 및 면역조절 약물을 포함하는 더 새로운 제제 모두로 가능하지만, 새로운 내약성이 좋고 효과적인 치료가 필요하다.
본원에는 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM) 수용체 패밀리의 구성원인 세포 표면 당단백질인 CS1에 표적화된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 사용하여 AL 아밀로이드증을 치료하는 방법이 기재된다. 형질 세포 질환을 갖는 환자로부터의 골수 시료를 평가한 연구 결과가 하기에 기재된다. 환자는 혈액학적 클론의 특성화 뿐만 아니라 기관 관여를 포함하여 다발성 골수종 (MM) 또는 AL 아밀로이드증의 진단을 위한 완전한 임상 평가를 가졌다. 다색 유동 세포측정 분석을 이용하여 세포내 카파/람다 쇄의 이상 비율 분석에 의해 악성과 정상 형질 세포를 식별하였다. 매우 편향된 카파 및 람다 비율은 AL 아밀로이드증의 악성 클론의 신뢰할만한 지표이다. 이어서, 형질 세포의 클론 집단을 B 세포 성숙 항원 (BCMA)의 발현 및 CS1 발현에 대해 평가하였다. 이들 연구는 CS1이 AL 아밀로이드증을 갖는 환자의 클론 형질 세포에서 발현되며 BCMA가 AL 아밀로이드 환자의 형질 세포에서 유의하게 발현되지 않는다는 것을 증명하였다. 이는 BCMA가 어디서나 발현되는 것으로 생각되는 MM과 대조적이다. 하기 기재된 추가 연구는 CS1-표적화된 CAR가 뮤린 모델에서 CS1-발현 세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 보여준다.
본원에는, CS1 scFv; 스페이서 영역; 막횡단 도메인; 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 인간 T 세포의 집단을 경쇄 아밀로이드증의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 경쇄 아밀로이드증을 치료하는 방법이 기재된다.
다양한 실시양태에서: 키메라 항원 수용체는 CS1 scFv; 스페이서 영역; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 CS1 scFv; 스페이서 영역; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 CS1 scFv; 서열식별번호 (SEQ ID No): 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 각각 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 형질도입된 인간 T 세포의 적어도 20%, 30% 또는 40%는 중심 기억 T 세포이고; 형질도입된 인간 T 세포의 적어도 30%는 CD4+ 및 CD62L+ 또는 CD8+ 및 CD62L+이고; 인간 T 세포의 집단은 환자에 대해 자가이고; 인간 T 세포의 집단은 환자에 대해 동종이형이다.
도 1A-C는 AL 아밀로이드증의 신생물 형질 세포가 CS1을 우선적으로 발현한다는 것을 보이는 연구 결과를 도시한다. (A) 골수 단핵 세포를 진단된 AL 아밀로이드증 및 다발성 골수종을 갖는 환자로부터 단리하고, CS1 및 BCMA에 대한 항체로 표지하고, 이어서 κ/λ의 세포내 염색을 수행하였다. CS1 및 BCMA 발현을 게이팅된 주요 κ 경쇄에 대해 분석하였다. (B) AL 아밀로이드증의 주요 클론에서의 CS1 및 BCMA 양성 세포의 퍼센트가 제시된다 (N=14). (C) 다발성 골수종의 주요 클론에서의 CS1 및 BCMA 양성 세포의 퍼센트가 제시된다 (N=10).
도 2A-D는 CS1-표적화된 CAR T 세포를 사용하는 연구 결과를 도시하며, 그들이 CS1 양성 세포에 대해 세포독성이며 마우스에서 지속적인 종양 퇴행을 유도한다는 것을 보여준다. (A) 각각 항원-특이적 scFv, IgG4 힌지 영역 및 CD28 공동자극 도메인 뿐만 아니라 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, CS1 CAR 구축물의 개략도. IgG4 힌지 영역은 CH2 부분을 결실시킴으로써 단축되었다. CAR 서열 다음에 T2A 리보솜 스킵 서열, 이어서 EGFRt 추적/자살 유전자에 대한 코딩 서열이 이어진다. (B) 정제된 중심 기억 T 세포 (TCM)를 활성화시키고, CS1 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입하였다. CAR 발현을 EGFR 세툭시맙에 대한 항체로 세포를 염색함으로써 검출하였다. (C) 증식된 CS1 CAR T 세포의 세포독성을 51Cr-표지된 CS1 양성 표적 세포인 MM.1S와 공동-배양 후 4-시간 51Cr 방출을 이용하여 평가하였다. OKT3 발현 LCL을 양성 대조군으로 사용하고, 골수성 백혈병 KG1A를 음성 대조군으로 사용하였다. 비-형질도입된 모의 T 세포는 음성 이펙터 세포였다. (D) 루시페라제 (ffluc) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하도록 조작된 2x106개의 fflucGFP MM.1S 세포를 NOD/Scid IL2RγCnull (NSG) 마우스에 경골내 (i.t.) 주사하였다. 종양 접종 5일 후, 마우스에 1x106개의 CS1 CAR T 세포를 i.v. 주사하고, 비-형질도입된 모의 세포를 대조군 마우스에 주입하였다. 종양 신호를 1주일에 1회 제노겐 (Xenogen) 이미징으로 모니터링하였다.
도 3은 CS1 CAR 발현 렌티바이러스 벡터 (CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28gg-제타(CO)-T2A-EGFRt_epHIV7)의 개략도이다. CS1 CAR 구축물은 GMCSF 신호 서열, CS1 scFv, IgG4 힌지 영역, 링커, CH3 도메인, CD28 공동-자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. CAR 구축물 다음에 T2A 리보솜 스킵 서열, 이어서 자살 유전자 EGFRt 코딩 서열이 이어진다. CAR 및 EGFRt 분자는 단일 전사체로서 발현된다.
도 4는 신호 펩티드, 리보솜 스킵 서열 및 EGFRt를 포함하는 CS1 CAR의 아미노산 서열 (서열식별번호: 29)을 도시한다.
도 5는 CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD4tm-41BB-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 32)을 도시한다.
도 6은 CS1scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD4tm-41BB-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 35)을 도시한다.
도 7은 CS1scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 38)을 도시한다.
도 8은 CS1scFv-링커-CD4tm-41BB-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 41)을 도시한다.
도 9는 CS1scFv-링커-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 44)을 도시한다.
실시예 1: AL 아밀로이드증 및 다발성 골수종에서 CS1 및 BCMA 발현
AL 아밀로이드증을 갖는 14명의 환자를 연구하였다. 이들 환자로부터의 신생물 형질 세포에 대한 CS1 및 BCMA 발현의 분석은 세포가 우선적으로 CS1은 발현하나 BCMA는 발현하지 않는다는 것을 보여준다. 간단히, 골수 단핵 세포를 AL 아밀로이드증으로 진단된 환자로부터 단리하고, CS1 및 BCMA에 대한 항체로 표지하고, 이어서 카파/람다 대한 염색을 수행하였다. 카파 제한된 질환을 갖는 환자의 형질 세포의 클론 집단에 대한 게이팅 후 CS1 발현을 분석한 예가 도 1A에 도시되어 있다. 모든 AL 아밀로이드증 샘플은 높은 수준의 CS1을 발현하였으나 (76.5±4.7%), BCMA에 대해서는 음성이거나 매우 낮은 발현을 나타내었다 (4.9±0.8%) (도 1B).
비교를 위해, 동일한 기간 동안 동일한 방법론을 이용하여 10명의 MM 환자로부터의 골수 시료를 시험하였다 (도 1C). MM을 갖는 환자의 클론 형질 세포는 AL에서 나타난 것과 유사하게 CS1을 발현하나; BCMA가 비교적 훨씬 더 빈번하게 발현된다. 흥미롭게도, AL 환자의 형질 세포 상에서 BCMA의 발현 결여는, 골수종 세포와 비교하여, AL의 클론 형질 세포가 독특하다는 것을 제시한다.
실시예 2: CS1-표적화된 CAR에 의한 세포 사멸
AL 아밀로이드증에 대한 CAR T 세포 요법을 위한 표적으로서 CS1의 유용성을 탐구하기 위해, 본 발명자들은 CD28gg 공동자극 도메인, 리보솜-스킵 T2A 서열, 및 선별, 추적 및 절제 분자로서 말단절단된 EGF 수용체 서열 (EGFRt)을 함유하는 제2 세대 CS1 CAR (도 2A)을 시험하고, 하기에서 더 상세히 기재되는 SIN 렌티바이러스 벡터로 통합하였다. 정제된 중심 기억 T 세포 (TCM)를 활성화시키고, CS1 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입하고, 3주 동안 IL-2 50U/ml 및 IL-15 0.5 ng/ml의 존재 하에 확장시켰다. 세포를 세툭시맙-비오틴 및 스트렙트아비딘 (SA)으로 염색함으로써 CAR 발현을 모니터링하였다 (도 2B). 확장된 CS1 CAR T 세포의 세포독성을 51Cr-표지된 CS1+ 표적 세포 (MM.1S)와의 공동-배양 후 4-시간 51Cr 방출 검정을 이용하여 평가하였다 (도 2C).
6 내지 10주령의 NOD/Scid IL2RγCnull 마우스에 루시페라제 (ffluc) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하도록 조작된 2x106개의 fflucGFP MM.1S를 경골내로 (i.t.) 주사하였다. 종양 접종 5일 후, 마우스에 1x106개의 CS1 CAR T 세포를 정맥내로 (i.v.) 주사하고, 비-형질도입된 모의 세포를 대조군 마우스에 주입하였다. 마취된 마우스를 제노겐 IVIS 100 시리즈 시스템 (제노겐, 캘리포니아 알라메다)을 사용하여 매주 이미지화했다. ffLuc+ 종양 이종이식편으로부터의 광자를 소프트웨어 프로그램 리빙 이미지 (Living Image) (제노겐)를 사용하여 정량화하고, 생물발광 신호를 노출 시간 및 표면적에 대해 정규화된 총 광자 플럭스로 측정하고, 스테라디안당 cm2당 초당 광자 단위로 나타내었다.
항종양 활성을 시험하기 위해, MM.1S를 NSG 마우스에 경골내 주사로 접종하였다. 일단 종양 생착이 확인되면, 1x106개의 CS1 CAR T 세포를 종양-부하 마우스에 정맥내로 주입하였다. CS1 CAR T 세포는 CS1 양성 세포 (MM.1S)에 대해 특이적이고 효율적인 사멸을 나타낸다 (도 2C). 동물 모델에서 항-종양 연구는 CS1 CAR T 세포가 모의 T 세포 처리된 마우스에 비해 상당한 종양 완화를 유도하였음을 보여 주었다 (도 2D).
이들 발견은 AL 아밀로이드증을 갖는 환자에 대한 CS1-지시된 CAR T 세포 요법의 사용을 지지한다. AL은 CAR 매개 요법을 탐색하기 위한 이상적인 세팅이다. 표적화될 상대적으로 적은 수의 악성 세포는 작지만 파괴적인 클론의 성공적인 근절을 위한 기회 뿐만 아니라 시토카인 방출 증후군과 관련된 합병증에 대한 최소한의 위험을 제공한다. 또한, CS1-표적화 항체 엘로투주맙의 상대적으로 안전한 프로파일은 CS1 CAR T 세포가 이와 관련하여 마찬가지로 유리한 결과를 산출할 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들의 작업은, MM으로의 전임상 경험과 달리, BCMA는 적합한 표적이 아닐 것이라는 것을 보이면서, CS1-지시된 CAR T 세포의 새로운 적용을 나타낸다. 본 발명자들은, CS1-지시된 CAR T 세포의 효능을 보여주는 전임상 데이터와 함께, AL에 대해 CS1 CAR T 세포를 사용하는 임상 시험을 진행할 계획이다.
실시예 3: CS1-표적화된 CAR
AL 아밀로이드증을 치료하는데 사용하기에 적합한 CS1-표적화된 CAR은 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 세포외 도메인은 CS1-특이적 scFv 영역 또는 이의 변이체 및 예컨대, 인간 Fc 도메인의 일부를 포함하는 스페이서를 포함한다. 세포외 도메인은 CAR이 T 세포의 표면 상에서 발현될 때 T 세포 활성이 CS1을 발현하는 세포에 대해 지시되게 하는 것을 가능하게 할 수 있다. 막횡단 도메인은, 예컨대 CD4 막횡단 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, 또는 CD3 막횡단 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 쇄로부터의 신호전달 도메인 (CD3ζ) 및 하나 이상의 공동자극 도메인, 예컨대 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 공동자극 도메인, 예컨대 4-1BB (CD137) 공동자극 도메인은, 세포내 영역의 CD3ζ와 연속하여 T 세포가 공동-자극 신호를 수신할 수 있게 한다. T 세포, 예컨대 환자-특이적인 자가 T 세포는 본원에 기재된 CAR을 발현하도록 조작될 수 있으며, 조작된 세포는 확장되어 치료적으로 사용될 수 있다. 알파 베타 T 세포 및 감마 델타 T 세포 둘 다를 포함하는 다양한 T 세포 서브세트가 사용될 수 있다. 또한, CAR은 다른 면역 세포, 예컨대 NK 세포에서 발현될 수 있다. 환자가 본원에 기재된 CAR 발현 면역 세포로 치료되는 경우, 세포는 자가 T 세포 또는 동종이형 T 세포일 수 있다. 일부 경우에, 사용되는 세포는 CD62L+, CCR7+, CD45RO+ 및 CD45RA-인 CD4+ 및 CD8+ 중심 기억 T 세포 (TCM) 둘 다를 포함하는 세포 집단이다. 세포 집단은 또한 다른 유형의 T 세포를 포함할 수 있다. 수개의 CS1-표적화 CAR이 WO 2016/090369에 상세히 기재되어 있다.
CS-1 표적화 scFv
본원에 기재된 CS1-표적화된 CAR은 CS1-표적화 scFv (예컨대, 하기 서열을 포함하는 scFv: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPDGNYWYFDVWGQGTLVTVSSGSTSGGGSGGGSGGGGSSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSSYPYTFGQGTKVEIK; 서열식별번호: 1) 또는 1-5개 (예컨대, 1 또는 2개) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
유용한 CS1 CAR은 서열식별번호: 31, 34, 37, 40, 43 및 46 중 임의의 것의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하거나 (신호 서열이 결여된 성숙한 CAR), CS1 CAR은 서열식별번호: 30, 33, 36, 39, 42 및 45 중 임의의 것의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함한다 (GMCSFRa 신호 서열을 갖는 미성숙 CAR). CAR은 신호 서열, 예컨대 인간 GM-CSF 수용체 알파 신호 서열 (MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP; 서열식별번호: 26)을 포함하는 형태로 발현될 수 있다. CAR은 발현을 모니터링하기에 유용한 추가의 서열, 예컨대 T2A 스킵 서열 및 말단절단된 EGFRt과 함께 발현될 수 있다. 따라서, CAR은 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있거나, 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. CAR은, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화 (바람직하게는 보존적 아미노산 변화)를 갖는, 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
스페이서 영역
본원에 기재된 CAR은 CS1 표적화 도메인 (즉, CS1 ScFv 또는 이의 변이체)과 막횡단 도메인 사이에 위치된 스페이서를 포함할 수 있다. 다양한 상이한 스페이서가 사용될 수 있다. 그들 중 일부는 인간 Fc 영역의 적어도 일부, 예컨대 인간 Fc 영역의 힌지 부분 또는 CH3 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 하기 표 1은 본원에 기재된 CAR에 사용될 수 있는 다양한 스페이서를 제공한다.
<표 1>
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 스페이서 영역은 면역글로불린 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 힌지 영역의 전부 또는 일부, 즉 면역글로불린의 CH1과 CH2 도메인 사이에 속하는 서열, 예컨대 IgG4 Fc 힌지 또는 CD8 힌지를 포함한다. 일부 스페이서 영역은 면역글로불린 CH3 도메인 또는 CH3 도메인 및 CH2 도메인 둘 다를 포함한다. 면역글로불린 유도된 서열은 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개 치환, 예컨대 표적외 (off-target) 결합을 감소시키는 치환을 포함할 수 있다.
힌지/링커 영역은 또한 서열 ESKYGPPCPSCP (서열식별번호: 4) 또는 ESKYGPPCPPCP (서열식별번호: 3)를 갖는 IgG4 힌지 영역을 포함할 수 있다.
힌지/링커 영역은 또한 서열 ESKYGPPCPPCP (서열식별번호: 3)에 이어 링커 서열 GGGSSGGGSG (서열식별번호: 2)에 이어 IgG4 CH3 서열 GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 12)를 포함할 수 있다. 따라서, 전체 링커/스페이서 영역은 서열: ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 11)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 스페이서는 서열식별번호: 11과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 변화 (예컨대, 보존적 변화)를 갖는다. 일부 경우에, IgG4 Fc 힌지/링커 영역은 2개의 위치 (L235E; N297Q)에서 Fc 수용체 (FcR)에 의한 결합을 감소시키는 방식으로 돌연변이될 수 있다.
막횡단 도메인
다양한 막횡단 도메인이 CAR에 사용될 수 있다. 표 2는 적합한 막횡단 도메인의 예를 포함한다. 스페이서 영역이 존재하는 경우, 막횡단 도메인은 스페이서 영역에 대해 카복시 말단에 위치된다.
<표 2>
Figure pct00003
공동자극 도메인
공동자극 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인과 함께 사용하기에 적합한 임의의 도메인일 수 있다. 일부 경우에, 공동자극 도메인은 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열식별번호: 23; LL의 GG로의 아미노산 변화를 이중 밑줄침)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일하거나 이와 동일한 서열을 포함하는 CD28 공동자극 도메인이다. 일부 경우에, CD28 공동-신호전달 도메인은 서열식별번호: 23과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화 (바람직하게는 보존적이며, 바람직하게는 밑줄친 GG 서열에서 변화 없음)를 갖는다. 일부 경우에, 공동-신호전달 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열식별번호: 24)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일하거나 이와 동일한 서열을 포함하는 4-1BB 공동-신호전달 도메인이다. 일부 경우에, 4-1BB 공동-신호전달 도메인은 서열식별번호: 24와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화 (바람직하게는, 보존적)를 갖는다.
공동자극 도메인(들)은 막횡단 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치된다. 표 3은 CD3ζ 신호전달 도메인의 서열과 함께 적합한 공동자극 도메인의 예를 포함한다.
<표 3>
Figure pct00004
다양한 실시양태에서: 공동자극 도메인은 표 3에 나타낸 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 갖는 이의 변이체, CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 갖는 이의 변이체, 4-1BB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 갖는 이의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 갖는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 갖는 이의 변이체가 존재한다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동자극 도메인, 예컨대 CD28 공동-자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는 이의 변이체 및 4-1BB 공동-자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 갖는 이의 변이체가 존재한다. 다양한 실시양태에서, 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형은 치환이다. 공동자극 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인에 대한 아미노 말단이고, 일부 경우에 2 - 10개, 예컨대, 3개의 아미노산 (예컨대, GGG)으로 이루어진 짧은 링커가 공동자극 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치된다.
CD3ζ 신호전달 도메인
CD3ζ 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인과 함께 사용하기에 적합한 임의의 도메인일 수 있다. 일부 경우에, CD3ζ 신호전달 도메인은 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열식별번호: 21)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일하거나 이와 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에, CD3ζ 신호전달 도메인은 서열식별번호: 21과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화 (바람직하게는, 보존적)를 갖는다.
말단절단된 EGFR
CD3ζ 신호전달 도메인 다음에 리보솜 스킵 서열 (예컨대, LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR; 서열식별번호: 27) 및 LVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM (서열식별번호: 28)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일하거나 이와 동일한 서열을 갖는 말단절단된 EGFR이 이어질 수 있다. 일부 경우에, 말단절단된 EGFR은 서열식별번호: 28과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화 (바람직하게는, 보존적)를 갖는다.
AL 아밀로이드증을 앓는 환자는 본원에 기재된 CS1 키메라 항원 수용체 (예컨대, 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 또는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화 (바람직하게는, 보존적 아미노산 변화)를 갖는 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CAR)를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질도입된 인간 T 세포의 집단으로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서: 인간 T 세포의 집단은 중심 기억 T 세포 (TCM), 예컨대, CD8+/CD4+ TCM이다.
아미노산 변형은 단백질 또는 펩티드 서열에서 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 지칭한다. "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 펩티드 또는 단백질 서열의 특정 위치에 있는 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 대체를 지칭한다. 치환은 비-보존적 방식으로 (즉, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산의 그룹에 속하는 아미노산으로부터 또 다른 그룹에 속하는 아미노산으로 코돈을 변화시킴으로써) 또는 보존적 방식으로 (즉, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산의 그룹에 속하는 아미노산으로부터 동일한 그룹에 속하는 아미노산으로 코돈을 변화시킴으로써) 생성된 단백질의 아미노산을 변화시키도록 수행될 수 있다. 이러한 보존적 변화는 일반적으로 생성된 단백질의 구조 및 기능에 변화를 덜 초래한다. 하기는 아미노산의 다양한 그룹화의 예이다: 1) 비극성 R 기를 갖는 아미노산: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌; 2) 하전되지 않은 극성 R 기를 갖는 아미노산: 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민; 3) 하전된 극성 R 기를 갖는 아미노산 (pH 6.0에서 음으로 하전됨): 아스파트산, 글루탐산; 4) 염기성 아미노산 (pH 6.0에서 양으로 하전됨): 리신, 아르기닌, 히스티딘 (pH 6.0에서). 또 다른 그룹화는 페닐 기를 갖는 아미노산: 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신일 수 있다.
CS1 CAR은 도 4-9에 나타낸 아미노산 서열 (서열식별번호: 29-46, GMCSFRa 신호 서열을 포함시키거나 제외시키고, T2A 리보솜 스킵 서열 및 말단절단된 EGFRt를 포함시키거나 제외시킴)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일하거나 이와 동일한 서열을 포함할 수 있다.
다양한 CS-1 표적화 CAR가 WO 2016/090369에 기재되어 있으며, 이들 CAR은 AL 아밀로이드증을 치료하는데 유용할 수 있다.
본원에 기재된 CS1 표적화 CAR 중에는 각각의 CAR에 대한 스페이서 영역, 막횡단 도메인 및 공동자극 도메인(들)이 표시되는 표 4에 요약된 것들이 있다.
<표 4>
Figure pct00005
일부 경우에, CS1 CAR은 CAR 개방 판독 프레임 다음에 T2A 리보솜 스킵 서열 및 말단절단된 EGFR (EGFRt)이 이어지고 세포질 신호전달 테일이 결여된 벡터를 사용하여 생성될 수 있다. 이 배열에서, EGFRt의 공동-발현은 유전자 변형된 세포의 정확한 측정을 허용하고 유전자-변형된 세포의 양성 선택 뿐만 아니라 생체내에서 입양 전달 후 치료 T 세포가 효과적인 세포 추적을 가능하게 하는 불활성의 비-면역원성 표면 마커를 제공한다. 시토카인 폭풍 및 표적외 독성을 피하기 위해 증식을 효율적으로 조절하는 것은 T 세포 면역요법의 성공을 위한 중요한 난관이다. CS1 CAR 렌티바이러스 벡터에 통합된 EGFRt는 치료-관련된 독성의 경우 CAR+ T 세포를 제거하기 위한 자살 유전자로서 작용할 수 있다.
본원에 기재된 CAR은, 비록 바람직하게는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수 있지만, 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 키메라 수용체의 수개의 영역을 코딩하는 핵산은 편리하게는 관련 기술분야에 공지된 분자 클로닝의 표준 기술 (게놈 라이브러리 스크리닝, 중첩 PCR, 프라이머-보조된 라이게이션, 부위-지시된 돌연변이유발 등)에 의해 완전한 코딩 서열로 제조 및 조립될 수 있다. 생성된 코딩 영역은 바람직하게는 발현 벡터로 삽입되고 적합한 발현 호스트 세포주, 바람직하게는 T 림프구 세포주 및 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주를 형질전환시키는데 사용된다.
환자로부터 단리된 다양한 T 세포 서브세트가 CAR 발현을 위한 벡터로 형질도입될 수 있다. 중심 기억 T 세포가 하나의 유용한 T 세포 서브세트이다. 중심 기억 T 세포는 목적하는 수용체를 발현하는 세포를 면역자기적으로 선별하기 위해, 예컨대 클리니막스(CliniMACS)® 디바이스를 사용하여 CD45RO+/CD62L+ 세포를 선별함으로써 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리될 수 있다. 중심 기억 T 세포가 농축된 세포는 항-CD3/CD28로 활성화고, 예컨대 CS1 CAR 뿐만 아니라 생체내 검출, 절제 및 잠재적인 생체외 선별을 위한 비-면역원성 표면 마커의 발현을 지시하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 활성화된/유전자적으로 변형된 CS1 중심 기억 T 세포는 시험관내에서 IL-2/IL-15로 확장되고, 이어서 냉동보존될 수 있다.
실시예 4: CS1-특이적 CAR의 발현에 사용되는 epHIV7의 구축 및 구조
pHIV7 플라스미드는 CS1 CAR을 발현하는 임상 벡터가 유도될 수 있는 모 플라스미드이다. CAR의 발현에 사용되는 epHIV7 벡터는 pHIV7 벡터로부터 생성되었다 (Wang et al. 2011 Blood 118:1255). 중요하게는, 이 벡터는 CAR의 발현을 유도하는데 인간 EF1 프로모터를 사용한다. 벡터의 5' 및 3' 서열 둘 다는 이전에 HXBc2 프로바이러스로부터 유도된 바와 같이 pv653RSN으로부터 유도되었다. 폴리퓨린관 DNA 플랩 서열 (cPPT)은 NIH AIDS 시약 저장소로부터 HIV-1 스트레인 pNL4-3으로부터 유도되었다.
pHIV7의 구축은 하기와 같이 수행되었다. 간단히, 개재되는 SL3-네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (Neo)와 함께 gag-pol 및 5' 및 3' 긴-말단 반복부 (LTR)로부터 653 bp를 함유하는 pv653RSN을 하기와 같이 pBluescript로 서브클로닝하였다: 단계 1에서, 5' LTR부터 rev-반응 요소 (RRE)까지의 서열로 p5'HIV-1 51을 제조하고, 이어서 5' LTR을 TATA 박스의 상류 서열을 제거하여 변형시키고, 먼저 CMV 인핸서에 라이게이션하고, 이어서 SV40 복제 기원에 라이게이션하였다 (p5'HIV-2). 단계 2에서, 3 'LTR을 pBluescript로 클로닝하여 p3'HIV-1을 제조한 후, 3'LTR 인핸서/프로모터에서 400-bp를 결실시켜 HIV U3에서 cis-조절 요소를 제거하고 p3'HIV-2를 형성하였다. 단계 3에서, p5'HIV-3 및 p3'HIV-2로부터 단리된 단편을 라이게이션하여 pHIV-3을 제조하였다. 단계 4에서, 여분의 상류 HIV 서열을 제거함으로써 p3'HIV-2를 추가로 변형시켜 p3'HIV-3을 생성하고, WPRE를 함유하는 600-bp BamHI-SalI 단편을 p3'HIV-3에 첨가하여 p3'HIV-4를 제조하였다. 단계 5에서, pHIV-3 RRE를 PCR에 의해 크기를 감소시키고, pHIV-3 (도시되지 않음)으로부터의 5' 단편 및 p3'HIV-4에 라이게이션시켜 pHIV-6을 제조하였다. 단계 6에서, HIV-1 pNL4-3 (55)으로부터의 cPPT DNA 플랩 서열을 함유하는 190-bp BglII-BamHI 단편을 pNL4-3으로부터 증폭시키고, pHIV6의 RRE와 WPRE 서열 사이에 위치시켜 pHIV-7을 제조하였다. 이 모 플라스미드 pHIV7-GFP (GFP, 녹색 형광 단백질)를 4-플라스미드 시스템을 사용하여 모 벡터를 패키징하는데 사용하였다.
패키징 신호인 psi ψ는 바이러스 게놈의 벡터로의 효율적인 패키징에 필요하다. RRE 및 WPRE는 트랜스진의 RNA 전사물 수송 및 발현을 증진시킨다. WPRE와 함께 플랩 서열은 포유동물 세포에서 렌티바이러스 벡터의 형질도입 효율을 증진시키는 것으로 입증되었다.
바이러스 벡터의 생성에 필요한 헬퍼 기능은 재조합을 통한 복제 적격 렌티 바이러스의 생성 확률을 감소시키기 위해 3개의 별개의 플라스미드로 분할된다: 1) pCgp는 바이러스 벡터 조립에 필요한 gag/pol 단백질을 코딩하고; 2) pCMV-Rev2는 효율적인 패키징을 위한 바이러스 게놈의 수송을 돕기 위해 RRE 서열에 작용하는 Rev 단백질을 코딩하고; 3) pCMV-G는 바이러스 벡터의 감염성에 필요한 소포성 구내염 바이러스 (VSV)의 당단백질을 코딩한다.
pHIV7 코딩된 벡터 게놈과 헬퍼 플라스미드 사이에는 최소한의 DNA 서열 상 동성이 존재한다. 상동성 영역은 pCgp 헬퍼 플라스미드의 gag/pol 서열에 위치된 약 600개 뉴클레오티드의 패키징 신호 영역; 3개의 헬퍼 플라스미드 모두에서 CMV 프로모터 서열; 및 헬퍼 플라스미드 pCgp에서 RRE 서열을 포함한다. 복제 적격 바이러스의 생성은 다중 재조합 이벤트를 필요로 하기 때문에 이들 영역에서의 상동성으로 인해 복제 적격 재조합 바이러스가 생성될 수 있다는 것은 매우 불가능하다. 또한, 임의의 생성된 재조합체는 렌티바이러스 복제에 필요한 기능적 LTR 및 tat 서열이 누락될 것이다.
CMV 프로모터는 EF1α-HTLV 프로모터 (EF1p)로 대체되었고, 새로운 플라스미드는 epHIV7로 명명되었다. EF1p는 563 bp를 가지며 CMV 프로모터가 삭제된 후 NruI 및 NheI를 사용하여 epHIV7에 도입되었다.
야생형 바이러스의 병원성에 필요하고 표적 세포의 생산적 감염에 필요한 gag/pol 및 rev를 제외한 렌티바이러스 게놈은 이 시스템으로부터 제거되었다. 또한, epHIV7 벡터 구축물은 무손상 3'LTR 프로모터를 함유하지 않으므로, 표적화된 세포에서 생성된 발현 및 역전사된 DNA 프로바이러스 게놈은 불활성 LTR을 가질 것이다. 이 디자인의 결과로, HIV-I 유래된 서열은 프로바이러스로부터 전사되지 않고 치료 서열만이 각각의 프로모터로부터 발현될 것이다. SIN 벡터에서 LTR 프로모터 활성의 제거는 호스트 유전자의 의도하지 않은 활성화 가능성을 상당히 감소시킬 것으로 예상된다. 표 5는 epHIV7에 존재하는 다양한 조절기 요소를 요약한다.
도 1은 CS1 scFv, IgG4 힌지 영역, 링커, CD28 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인으로 구성된 CAR 구축물을 함유하는 렌티바이러스 벡터인 CS1 CAR (CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28gg-제타(CO)-T2A-EGFRt_epHIV7)의 개략도이다. CAR 구축물 다음에 T2A 리보솜 스킵 서열에 이어 자살 유전자 EGFRt 코딩 서열이 이어진다. CAR 및 EGFRt 분자는 단일 전사물로부터 발현된다. 표 5는 벡터의 다양한 요소의 위치를 나타낸다.
<표 5>
Figure pct00006
실시예 5: 환자 T 세포의 형질도입을 위한 벡터의 생성
각각의 플라스미드 (CS1 CAR_epHIV7; pCgp; pCMV-G; 및 pCMV-Rev2)에 대해, 발효기에 접종하여 충분한 양의 플라스미드 DNA를 생성하는데 사용되는 시드 뱅크가 생성된다. 플라스미드 DNA는 렌티바이러스 벡터를 생성하는데 사용하기 전에 정체성, 무균성 및 내독소에 대해 시험된다.
간략히, 세포는 멸균 및 바이러스 오염의 부재를 확인하기 위해 시험된 293T 작업 세포 (WCB)로부터 확장된다. 293T WCB로부터 293T 세포의 바이알이 해동된다. 세포는 벡터 생성 및 세포 트레인 (train) 유지를 위한 적절한 수의 10층 세포 팩토리 (CF)를 플레이팅하기에 충분한 수의 세포가 존재할 때까지 성장되고 확장된다. 단일 트레인의 세포가 생성에 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 최대 10 CF의 서브-배치에서 생성되었다. 동일한 주에 2개의 서브-배치를 생성하여 약 20 L의 렌티바이러스 상청액/주를 생성할 수 있다. 모든 서브-배치로부터 생성된 물질을 하나의 로트 생성물을 생성하기 위해 다운 스트림 공정 단계 동안 모았다. 293T 세포를 293T 배지 (10% FBS를 갖는 DMEM) 중의 CF에 플레이팅하였다. CF의 모든 층에 세포의 균일한 분포를 얻기 위해 팩토리를 37 ℃ 인큐베이터에 놓고 수평으로 평평하게 하였다. 2일 후, 세포를 트리스:EDTA, 2M CaCl2, 2X HBS 및 4개의 DNA 플라스미드의 혼합물을 수반하는 CaPO4 방법을 이용하여 상기 기재된 4개의 렌티바이러스 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일째에, 분비된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 수집하고, 정제하고, 농축시켰다. 상청액을 CF로부터 제거한 후, 생산 종료 세포를 각각의 CF로부터 수집하였다. 세포를 각각의 팩토리에서 트립신처리하고, 원심분리로 수집하였다. 세포를 냉동 배지에 재현탁시키고 냉동보존하였다. 이들 세포는 나중에 복제-적격 렌티바이러스 (RCL) 시험에 사용되었다.
벡터를 정제하고 제형화하기 위해, 조 상청액을 막 여과에 의해 정화시켜 세포 파편을 제거하였다. 호스트 세포 DNA 및 잔류 플라스미드 DNA는 엔도뉴클레아 제 분해 (벤조나제(Benzonase)®)에 의해 분해되었다. 0.45 μm 필터를 사용하여 바이러스 상청액을 세포 파편으로부터 정화시켰다. 정화된 상청액을 벤조나제®가 첨가된 사전-계량 용기에 수집하였다 (최종 농도 50 U/mL). 잔류 플라스미드 DNA 및 호스트 게놈 DNA에 대한 엔도뉴클레아제 분해를 37 ℃에서 6시간 동안 수행하였다. 엔도뉴클레아제-처리된 상청액의 초기 접선 유동 한외여과 (TFF) 농축을 이용하여 바이러스를 ~20배 농축시키면서 조 상청액으로부터 잔류하는 저분자량 성분을 제거하였다. 정화된 엔도뉴클레아제-처리된 바이러스 상청액을 플럭스 속도를 최대화하면서 전단 속도를 ~4,000 sec-1 이하로 유지하도록 설계된 유량으로 500 kD의 NMWCO를 갖는 중공 섬유 카트리지를 통해 순환시켰다. 카트리지 성능을 유지하기 위해 농축 과정 동안 뉴클레아제-처리된 상청액의 투석여과를 개시하였다. 투석여과 완충액으로서 PBS 중 4% 락토스를 사용하여 80% 투과물 교체율이 확립되었다. 바이러스 상청액은 조 상청액의 20배 농축을 나타내는 목표 부피에 도달하였으며, 투석여과를 4개의 추가적 교환 부피에 대해 계속하여 100%의 투과물 교체율을 가졌다.
바이러스 생성물의 추가 농축을 고속 원심분리 기술을 이용하여 달성하였다. 렌티바이러스의 각각의 서브-배치를 6 ℃에서 16-20시간 동안 6000 RPM (6,088 RCF)에서 소르발 (Sorvall) RC-26 플러스 원심분리기를 사용하여 펠렛화시켰다. 이어서, 각각의 서브-배치로부터의 바이러스 펠릿을 PBS 중의 4% 락토스와 함께 50 mL 부피로 재구성하였다. 이 완충액 중의 재구성된 펠렛은 바이러스 제제를 위한 최종 제형을 나타낸다. 전체 벡터 농축 과정은 약 200배 부피 감소를 초래했다. 모든 서브-배치의 완료 후, 물질을 -80 ℃에 두고, 각각의 서브-배치로부터의 샘플을 멸균 시험하였다. 샘플 멸균도를 확인한 후, 서브-배치를 빈번한 교반과 함께 37 ℃에서 신속하게 해동시켰다. 이어서, 물질을 모으고, 바이러스 벡터 슈트 내의 클래스 II 유형 A/B3 생물안전 캐비닛에서 수동으로 분취하였다. 멸균 USP 클래스 6의 외부 쓰레드 O-링 냉동바이알 중 1 mL의 농축 렌티바이러스의 충전 구성을 사용하였다. COH의 응용 기술 개발 센터 (Center for Applied Technology Development: CATD)의 품질 시스템 (Quality System: QS)은 모든 물질을 CBG의 정책 및 표준 운영 절차 (Policies and Standard Operating Procedure)에 따라 현행 우수 제조 관리기준 (current Good Manufacturing Practice: cGMP)을 준수하며 방출하였다.
렌티바이러스 벡터 제제의 순도를 보장하기 위해, 잔류 호스트 DNA 오염물 및 잔류 호스트 및 플라스미드 DNA의 전달이 시험된다. 벡터 정체는 정확한 벡터가 존재하는지를 확인하기 위해 다른 시험들 중 RT-PCR에 의해 평가된다. 모든 방출 기준이 이 연구에서 사용이 의도된 벡터에 대해 충족된다.
실시예 6: CS-1 CAR의 발현에 적합한 T CM 세포의 제조
T 림프구는 백혈구성분채집에 의해 환자로부터 수득되며, 적절한 동종이형 또는 자가 T 세포 서브세트, 예컨대 중심 기억 T 세포 (TCM)는 CAR을 발현하도록 유전자적으로 변경되고, 이어서 임의의 임상적으로 허용되는 수단에 의해 환자에게 투여되어 항암 요법을 달성한다.
CD8+인 TCM은 본질적으로 문헌 (Wang et al., J Immunology 35 : 689, 2012)에 기재된 바와 같이 단리된다. 간략히, 백혈구성분채집 당일에, PBMC를 피콜-파크 상에서 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하고, 이어서 PBS/EDTA에서 2회 세척하였다. 이어서, PBMC를 PBS에서 1회 세척하고, 10% 우태 혈청 (FCS)을 함유하는 X Vivo15 배지에 재현탁시키고, 300cc 전달 백으로 옮기고, 실온 (RT)에서 밤새 3-D 회전기에 저장하였다. 다음날, 10% FCS를 함유하는 X Vivo15 중의 최대 5x109개의 PBMC를 300cc 전달 백에서 임상 등급의 항-CD4 (2.5mL), 항-CD14 (1.25mL) 및 항-CD45RA (2.5mL) 마이크로비드 (밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotec))와 함께 30분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 이어서, CD4+, CD14+ 및 CD45RA+ 세포를 제조자 (밀테니 바이오텍)의 지침에 따라 클리니막스™ 고갈 모드를 사용하여 즉시 고갈시켰다. 원심분리 후, 세포의 비표지된 음성 분획을 0.5% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 클리니막스™ PBS/EDTA 완충액 (밀테니 바이오텍)에 재현탁시키고, 이어서 0.1 mg/106개 세포의 임상 등급의 비오틴화된-DREG56 mAb (COHNMC CBG)로 30분 동안 RT에서 표지하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 0.5% HSA를 함유하는 최종 부피 100 mL의 클리니막스™ PBS/EDTA에 재현탁시키고, 새로운 300 cc 전달 백으로 옮겼다. 1.25 mL 항-비오틴 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)와 30분 인큐베이션한 후, PBMC의 CD62L+ 분획 (CD8+ TCM)을 제조자의 지침에 따라 클리니막스™에서 양성 선별로 정제하고, 10% FCS를 함유하는 X Vivo15에 재현탁시켰다.
CD8+/CD4+인 TCM은 CD4+, CD14+ 및 CD45RA+ 선별을 CD14+ 및 CD45RA+ 선별로 변형함으로써 상기 과정의 변형을 이용하여 제조된다. 상기 방법은 클리니막스™ 디바이스에서 2 단계 과정을 이용하여 먼저 CD14+ 및 CD45RA+ 세포를 고갈시키고 이어서 CD62L+ 세포를 양성적으로 선별한다. 이 변형된 플랫폼은 단일 백혈구성분채집으로부터 50x106개의 벌크 TCM을 생성한다.
농축 후, TCM 세포는 완전한 X-Vivo15 + 50 IU/mL IL-2 및 0.5 ng/mL IL-15로 제형화되고, 테플론 세포 배양 백으로 옮겨지고, 여기서 그들은 다이날 클린엑스™ 비보 (Dynal ClinEx™ Vivo) CD3/CD28 비드로 자극된다. 자극 후 최대 5 일에, 세포는 약 3의 감염 다중도 (MOI)로 CS1 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 배양은 세포 확장의 필요에 따라 완전한 X-Vivo15 및 IL-2 및 IL-15 시토카인의 첨가와 함께 최대 42일 동안 유지된다 (3x105 내지 2x106개의 생존 세포/mL의 세포 밀도 유지 및 배양의 월요일, 수요일 및 금요일마다 시토카인 보충). 세포는 전형적으로 이러한 조건 하에서 21일 내에 약 109개의 세포로 확장된다. 배양 기간 말에, 세포를 수거하고, 2회 세척하고, 임상 등급의 냉동보존 배지에 제형화한다.
T 세포 주입일(들)에, 냉동보존되고 방출된 생성물은 해동되고, 세척되고, 재주입을 위해 제형화될 것이다. 방출된 세포 생성물을 함유하는 냉동보존된 바이알은 액체 질소 저장소로부터 옮겨지고, 해동되고, 냉각되고, PBS/2% 인간 혈청 알부민 (HSA) 세척 완충액으로 세척될 것이다. 원심분리 후, 상청액은 제거되고, 세포는 보존제-비함유 생리 식염수 (Preservative-Free Normal Saline: PFNS)/2% HSA 주입 희석액에 재현탁될 것이다. 품질 관리 시험을 위해 샘플이 제거될 것이다.
실시예 7: CS1 CAR (CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-EGFRt)의 아미노산 서열
CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-EGFRt의 완전한 아미노산 서열이 도 4에 도시된다. 전체 서열 (서열식별번호: 29)은 22개 아미노산의 GMCSF 신호 펩티드 (서열식별번호: 26), CS1 scFv 서열 (서열식별번호: 1); IgG4 힌지 서열 (서열식별번호: 3; 음영처리된 S의 P로의 아미노산 치환을 가짐); 10개 아미노산의 링커 (서열식별번호: 2); IgG4 CH3 서열 (서열식별번호: 12); 28개 아미노산의 CD28 막횡단 도메인 서열 (서열식별번호: 14); CD28gg 공동-자극 도메인 서열 (서열식별번호: 23; LL의 GG로의 아미노산 변화가 강조됨); 3개 아미노산의 Gly 링커; 112개 아미노산의 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 21); 24개 아미노산의 T2A 스킵 서열 (서열식별번호: 27); 및 EGFRt 서열 (서열식별번호: 28)을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> CITY OF HOPE <120> CS1 TARGETED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR-MODIFIED T CELLS FOR TREATMENT OF AL AMYLOIDOSIS <130> 40056-0033WO1 <140> PCT/US2018/023381 <141> 2018-03-20 <150> 62/473,980 <151> 2017-03-20 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly 115 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Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 290 295 300 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 305 310 315 320 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 325 330 335 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe 340 345 350 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 355 360 365 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 370 375 380 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 385 390 395 400 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 405 410 415 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 420 425 430 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 435 440 445 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly 450 455 460 Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn 465 470 475 480 Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu 485 490 495 Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu 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Claims (14)

  1. CS1 scFv; 스페이서 영역; 막횡단 도메인; 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 인간 T 세포의 집단을 경쇄 아밀로이드증의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 경쇄 아밀로이드증을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서 영역; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서 영역; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일하며, 각각 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 형질도입된 인간 T 세포의 적어도 20%, 30% 또는 40%가 중심 기억 T 세포인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 형질도입된 인간 T 세포의 적어도 30%가 CD4+ 및 CD62L+ 또는 CD8+ 및 CD62L+인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 인간 T 세포의 집단이 환자에 대해 자가인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 인간 T 세포의 집단이 환자에 대해 동종이형인 방법.
KR1020197030388A 2017-03-20 2018-03-20 Al 아밀로이드증 치료를 위한 cs1 표적화된 키메라 항원 수용체-변형된 t 세포 KR20190131061A (ko)

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