JP2018531015A6 - クロロトキシンドメインを含むキメラ抗原レセプター - Google Patents
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Abstract
ヒト神経膠腫又は他のヒト腫瘍細胞に結合する、クロロトキシン若しくは関連毒素又はクロロトキシンのバリアント若しくは関連毒素を含む細胞外ドメイン、膜貫通領域、共刺激ドメイン、並びに細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ膜貫通免疫レセプター(CAR)が記述される。
Description
操作されたT細胞(engineered T cells)を使う治療を含む、腫瘍特異的T細胞(Tumor-specific T cell)に基づく免疫療法(immunotherapy)は、抗腫瘍処置(anti-tumor treatment)のために研究されてきた。キメラ抗原レセプター(CARs)は、細胞外腫瘍認識/標的化ドメイン、細胞外リンカー/スペーサー、膜貫通ドメイン、並びに細胞内T細胞活性化及び共刺激シグナリングドメインで構成される。認識/標的化ドメインの設計は、有害な標的外効果(off-target effects)を回避するために決定的に重要である。CAR腫瘍標的化ドメインの大部分は、特定の抗原に結合する抗体の特異性を活用する、抗体配列に由来する一本鎖可変断片(single chain variable fragments)(scFvs)である。IL‐13レセプター、IL13Rα2を発現する細胞を標的とするIL−13サイトカインCARのような、通常のレセプターリガンドに由来するCAR腫瘍目標化ドメインの例も存在する。いくつかの注目に値する成功に関わらず、新規なCAR腫瘍標的化ドメインの同定及び検証は、本分野における主要な問題のままである。
悪性神経膠腫(MG)は、未分化星状細胞腫(AA‐WHOグレードIII)及び神経膠芽腫(GBM‐WHOグレードIV)を含み、米国において毎年診断される約20,000新規症例の発生率を有する。米国脳腫瘍学会(American Brain Tumor Association)によれば、米国の2010年の国勢調査データに基づいて、悪性脳腫瘍を有して生活している個人の総有病者数はざっと140,000人である。MGはまれな疾患であるが、それは、その悪性挙動及びほぼ均一に致死的な点で高度に攻撃的且つ異質である。高グレード(高悪性度)のMGのための現在の標準治療法は、短期間の利益しかもたらさず、これらの脳腫瘍は事実上治癒不可能である。実際に、たとえ現代の外科的及び放射線治療技術を用いても、それは中枢神経系(CNS)内の位置によって課された既に重度の病的状態をしばしば悪化させ、5年生存率はかなり低い。さらに、疾患が再発する患者の大多数にとって、治療の選択肢はほとんどない。したがって、特に第一線の治療法に続いて再発/進行した患者のために、より効果的な治療法に対する重要な必要性が存在する。
CARを発現する操作されたT細胞を利用する養子T細胞療法(Adoptive T cell therapy)(ACT)は、CAR T細胞が抗原的に異なる腫瘍集団を特異的に認識するように操作されることができるため、MGの再発率を低下させる安全且つ有効な方法を提供し得る(Cartellieriら、2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304;Ahmedら、2010 Clin Cancer Res 16:474;Sampsonら、2014 Clin Cancer Res 20:972;Brownら、2013 Clin Cancer Res 2012 18:2199;Chowら、2013 Mol Ther 21:629)。また、T細胞は、脳実質(brain parenchyma)を通って移動して、浸潤性悪性細胞を標的とし、死滅させることができる(Hongら、2010 Clin Cancer Res 16:4892;Brownら、2007 J Immunol 179:3332;Hongら、2010 Clin Cancer Res 16:4892;Yaghoubi 2009 Nat Clin Pract Oncol 6:53)。
2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304
2010 Clin Cancer Res 16:474
2014 Clin Cancer Res 20:972
2013 Clin Cancer Res 2012 18:2199
2013 Mol Ther 21:629
2010 Clin Cancer Res 16:4892
2007 J Immunol 179:3332
2010 Clin Cancer Res 16:4892
2009 Nat Clin Pract Oncol 6:53
本明細書において、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ膜貫通免疫レセプター(キメラ抗原レセプター又は“CARs”)が記述される。細胞外ドメインは、クロロトキシン(サソリ(Leiurus quinquestriatus)の毒液中に見出される36アミノ酸ペプチド毒素)、若しくは関連毒素、又はクロロトキシン若しくは関連する毒素のバリアント、並びに、任意的に、例えば、ヒトFcドメインの一部分を含む、スペーサー、を含む。膜貫通部分は、例えば、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、又はCD3膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナリングドメインは、ヒトCD3複合体のゼータ鎖(CD3ζ)からのシグナリングドメイン、及び一つ又はそれ以上の共刺激ドメイン(costimulatory domain)、例えば4‐1BB共刺激ドメイン、を含む。細胞外ドメインは、細胞外ドメインは、T細胞の表面上に発現された場合に、CARが、T細胞活性を、クロロトキシンのためのレセプターを発現しているそれらの細胞に向けさせることを可能にする。そのような細胞は、神経膠芽腫細胞を含む。細胞内領域内にCD3ζと直列に、4‐1BB(CD137)共刺激ドメインのような共刺激ドメインを含むことは、T細胞が共刺激シグナルを受けることを可能にする。T細胞、例えば患者特異的な、自己T細胞は、本明細書において記述されるCARsを発現するように操作されてもよく、操作された(engineered)細胞は、ACTにおいて増やされ(expanded)、使用されてもよい。アルファベータ(αβ)T細胞及びガンマデルタ(γδ)T細胞の両方を含む、様々なT細胞サブセットが使用され得る。加えて、CARは、NK細胞のような他の免疫細胞においても発現され得る。患者が本明細書に記載のCARを発現する免疫細胞を用いて処置される場合、その細胞は、自己(autologous)のT細胞又は同種(allogenic)のT細胞であってもよい。いくつかの場合において、使用される細胞は、CD62L+、CCR7+、CD45RO+及びCD45RA−である、CD4+及びCD8+の両方のセントラルメモリーT細胞(TCM)を含むセル集団であり、或いは、使用される細胞は、CD4+及びCD8+のTCM細胞、ステムセントラルメモリーT細胞及びナイーブT細胞を含むセル集団(すなわち、TCM/SCM/N細胞の集団)である。TCM/SCM/N細胞の集団は、CD62L+、CCR7+であり、CD45RA+細胞及びCD45RO+細胞の両方、並びに、CD4+細胞及びCD8+細胞の両方を含む。そのような細胞の使用は、他の種類の患者特異的T細胞の使用と比較して、養子移植後の細胞の長期の持続性を改善することができる。
本明細書において記述されるものは、CARをエンコードする(encoding)核酸分子であって:クロロトキシン(MCMPCFTTDHQMAKRCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR;配列ID番号:1)、又は、システイン残基は改変されないという条件で1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(modifications)(例えば、置換)を有するそのバリアント;膜貫通ドメインであり:CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン(例えば、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント及び4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントの両方;並びに、CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、を含む、核酸分子である。
いくつかの実施形態において、CARは、クロロトキシンの代わりに、クロロトキシンに関連する毒素を含む。したがって、CARは、GaTx2、サソリ(Leiurus quinquestriatus hebraeus)からの毒素(VSCEDCPDHCSTQKARAKCDNDKCVCEPI;配列ID番号:56)、又は、システイン残基は改変されないという条件で1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;膜貫通ドメインであり:CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン(例えば、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント及び4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントの両方;並びに、CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、を含んでもよい。
いくつかの場合において、CARは、一つより多くのクロロトキシン配列(例えば、連続的であるか又は1‐10個のアミノ酸によって分離されているかのいずれかの、二つ若しくは三つ又はそれ以上の配列ID番号:1のコピー)、又は一つより多くのクロロトキシンに関連する毒素を含んでもよい。したがって、CARは、二つ又はそれ以上のクロロトキシン配列(例えば、配列ID番号:1、続いて配列ID番号:1、続いてその分子の残り)を含んでもよく、或いは、CARは、クロロトキシン配列に続いてクロロトキシンに関連する毒素の配列(例えば、配列ID番号:57又は図25に示される他の毒素)を含んでもよい。
CARは、GaTx1、サソリ(Leiurus quinquestriatus hebraeus)からの毒素(CGPCFTTDHQMEQKCAECCGGIGKCYGPQCLCNR;配列ID番号:57)、又は、システイン残基は改変されないという条件で1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;膜貫通ドメインであり:CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン(例えば、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント及び4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントの両方;並びに、CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、を含んでもよい。
CARは、AaCtx、サソリ(Androctonus australis)からの毒素(MCIPCFTTNPNMAAKCNACCGSRRGSCRGPQCIC;配列ID番号:58)、又は、システイン残基は改変されないという条件で1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;膜貫通ドメインであり:CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン(例えば、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント及び4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントの両方;並びに、CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、を含んでもよい。
CARは、BmKCT、サソリ(Buthus martensii)からの毒素(CGPCFTTDANMARKCRECCGGIGKCFGPQCLCNRI;配列ID番号:59)、又は、システイン残基は改変されないという条件で1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;膜貫通ドメインであり:表2に示される膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐10個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン(例えば、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント及び4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントの両方;並びに、CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、を含んでもよい。
様々な実施形態において、CARは、クロロトキシン配列(配列ID番号:1)が配列ID番号:56‐59のうちのいずれか又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントによって置き換えられている、配列ID番号:26‐55のいずれかのアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態において、共刺激ドメインは:表3に示される共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びOX40共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から成る群から選択される。特定の実施形態において、4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアントが存在する。いくつかの実施形態において、二つの共刺激ドメイン、例えばCD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、並びに4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントがある。様々な実施形態において、1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変は、置換である。
いくつかの場合において、共刺激ドメインとCD3ゼータシグナリングドメインとの間及び/又は二つの共刺激ドメインの間には、1‐6個のアミノ酸の短い配列(例えば、GGG)がある。
CARの追加的な実施形態は、以下を含む:クロロトキシンレセプター(Cltx‐R)のための結合特異性又は免疫原性を高める1‐5個のアミノ酸改変を有するクロロトキシンのバリアント;クロロトキシンバリアントは、1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変とともに配列ID番号:1のアミノ酸配列を含むバリアントである;二つの異なる共刺激ドメインであり:CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びOX40共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン;二つの異なる共刺激ドメインであり:CD28共刺激ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びOX40共刺激ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン;クロロトキシン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;膜貫通ドメインであり:CD4膜貫通ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、CD8膜貫通ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、CD28膜貫通ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン(例えば、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント及び4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントの両方;並びに、CD3ζシグナリングドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;クロロトキシン又はそのバリアントと膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域(例えば、配列ID番号:2‐12(表3)又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、スペーサー領域);スペーサーは、IgGヒンジ領域を含む;スペーサー領域は、1‐150個のアミノ酸を含む;スペーサーがない;4‐1BBシグナリングドメインは、配列ID番号:24のアミノ酸配列を含み、CD3ζシグナリングドメインは、配列ID番号:21のアミノ酸配列を含み、3個から15個のアミノ酸のリンカーが、共刺激ドメインとCD3ζシグナリングドメイン又はそれらのバリアントとの間に位置する。二つの共刺激ドメインがある特性の実施形態において、一方は4‐1BB共刺激ドメインであり、他方は:CD28及びCD28ggから選択される共刺激ドメインである。様々な実施形態において、1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変は、置換である。
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列ID番号:26‐55から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する;キメラ抗原レセプターは、配列ID番号:26‐55から選択されるアミノ酸配列を含む。
また、キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセット(expression cassette)を含むベクターによって導入された(transduced)ヒトT細胞の集団(population)も開示され、キメラ抗原レセプターは:クロロトキシン又は1‐5個のアミノ酸改変(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアント、クロロトキシンに関連する毒素又は1‐5個のアミノ酸改変(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変を有するそのバリアントのいずれか;膜貫通ドメインであり:CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン(例えば、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント;又は、CD28共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント及び4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントの両方;並びに、CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアント、を含んでもよい。様々な実施形態において、ヒトT細胞の集団は、配列ID番号:26‐55又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原レセプターを発現するベクターを含む;ヒトT細胞の集団は、セントラルメモリーT細胞(TCM)を含み、例えば、細胞のうちの少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%がTCM細胞であり、或いは、ヒトT細胞の集団は、セントラルメモリーT細胞、ナイーブT細胞及びステムセントラルメモリーT細胞の組み合わせ(TCM/SCM/N細胞)を含み、例えば、細胞のうちの少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%がTCM/SCM/N細胞である。いずれの場合においても、T細胞の集団は、CD4+細胞及びCD8+細胞の両方を含む(例えば、CD3+T細胞のうちの少なくとも20%がCD4+であり、CD3+T細胞のうちの少なくとも3%がCD8+であり、少なくとも70%、80%又は90%がCD4+又はCD8+のいずれかであり;CD3+細胞である細胞のうちの少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%がCD4+であり、CD3+細胞のうちの少なくとも4%、5%、8%、10%、20がCD8+細胞である)。
また、患者の癌を処置する方法であって、キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入された自己又は同種のヒトT細胞の集団(例えば、セントラルメモリーT細胞(TCM細胞)又はセントラルメモリーT細胞、ナイーブT細胞及びステムセントラルメモリーT細胞の組み合わせ(すなわち、T細胞はTCM/SCM/N細胞である)を含み、細胞のうちの少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%がTCM/SCM/N細胞である、自己又は同種のT細胞)を、投与するステップ(administering)、を含む方法も記述されている。いずれの場合においても、T細胞の集団は、CD4+細胞及びCD8+細胞の両方を含み(例えば、CD3+T細胞のうちの少なくとも20%がCD4+であり、CD3+T細胞のうちの少なくとも3%がCD8+であり、少なくとも70%、80%又は90%がCD4+又はCD8+のいずれかであり;CD3+細胞である細胞のうちの少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%がCD4+であり、CD3+細胞のうちの少なくとも4%、5%、8%、10%、20がCD8+細胞である)、キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入され、キメラ抗原レセプターは、配列ID番号:26‐55又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む。様々な実施形態において:癌は、神経膠芽腫(glioblastoma)であり;導入されたヒトT細胞は、患者からT細胞を採取するステップ(obtaining)、セントラルメモリーT細胞を単離するためにT細胞を処理するステップ、及びキメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて、セントラルメモリーT細胞の少なくとも一部分に導入するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ID番号:26‐55又は1‐5個(例えば、1個又は2個)のアミノ酸改変(例えば、置換)を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、を含む方法によって調製された。
また:配列ID番号:26‐55から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子;5個以下のアミノ酸の置換、削除又は挿入の存在を除いて配列ID番号:26‐55から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子;5個以下のアミノ酸の置換の存在を除いて配列ID番号:26‐55から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子;並びに、2個以下のアミノ酸の置換の存在を除いて配列ID番号:26‐55から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子、も記述されている。
クロロトキシン又はそのバリアントを含むCARを発現するT細胞は、神経膠芽腫、及びクロロトキシンのためのレセプターを発現する他の癌のような、癌の処置において有用であり得る。そのような癌は:原発性脳腫瘍及び神経膠腫(多形神経膠芽腫 WHOグレードIV、未分化星状細胞腫 WHOグレードIII、低悪性度(低グレード)星状細胞腫 WHOグレードII、毛様細胞性星状細胞腫 WHOグレードI、他の等級を付けられていない神経膠腫、乏突起神経膠腫、膠肉腫、神経節膠腫、髄膜腫、上衣腫)、神経外胚葉性腫瘍(髄芽腫、神経芽腫、神経節腫、黒色腫(転移性)、黒色腫(原発性)、褐色細胞腫、ユーイング肉腫、原発性神経外胚葉性腫瘍、小細胞肺癌、シュワン細胞腫)、他の脳腫瘍(類表皮嚢胞(類表皮腫)、未知の病理の脳腫瘍、脳下垂体の神経膠芽腫(pt.))未知の組織期限の脳への転移腫瘍)、並びに他の癌(乳癌、乳癌転移、腎臓癌、肝臓癌肺癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌)を含むが、これらに限定されない。
本開示はまた、本明細書に記載のCARsのいずれかをエンコードする核酸分子(例えば、CARsのうちの一つをエンコードする核酸配列を含むベクター)及び本明細書に記載のCARsのいずれかを発現する単離されたTリンパ球を含む。
本明細書に記載のCARは、クロロトキシンドメイン(すなわち、クロロトキシン又はそのバリアント)と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含んでもよい。様々な異なるスペーサーが使用されてもよい。それらのいくつかは、ヒトFc領域の少なくとも一部分、例えばヒトFc領域のヒンジ部分若しくはCH3ドメイン又はそのバリアントを含む。以下の表1は、本明細書に記載のCARsにおいて使用され得る様々なスペーサーを提供する。
表1:スペーサーの例
表1:スペーサーの例
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンCH1ドメインとCH2ドメインとの間に入る配列、例えばIgG4 Fcヒンジ又はCD8ヒンジの全て又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンCH3ドメイン又はCH3ドメインとCH2ドメインの両方を含む。免疫グロブリンに由来する配列は、一つ又はそれ以上のアミノ酸改変、例えば1、2、3、4又は5個の置換、例えば標的外結合(off-target binding)を低減する置換、を含んでもよい。
“アミノ酸改変”は、タンパク質若しくはペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び/又は削除を参照する。“アミノ酸置換”若しくは“置換”は、元の(parent)ペプチド若しくはタンパク質配列における特定の位置のアミノ酸の、他のアミノ酸による交換を参照する。置換は、非保存的(non-conservative)な方法で(すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、他の分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって)、或いは、保存的(conservative)な方法で(すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、同じ分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって)、結果として生じるタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行われてもよい。そのような保存的な変化は、概して、結果として生じるタンパク質の構造及び機能のより小さな変化につながる。以下はアミノ酸の種々の分類の例である:1)無極性R基を有するアミノ酸:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン;2)非荷電極性R基を有するアミノ酸:グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン;3)荷電極性R基を有するアミノ酸(pH6.0で負に帯電):アスパラギン酸、グルタミン酸;4)塩基性アミノ酸(pH6.0で正に帯電):リシン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0)。別の分類は、フェニル基を有するアミノ酸:フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンであり得る。
特定の実施形態において、スペーサーは、改変されていないスペーサーに存在するものと異なるアミノ酸残基によって置換された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4に由来する。一つ又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置220、226、228、229、230、233、234、235、234、237、238、239、243、247、267、268、280、290、292、297、298、299、300、305、309、218、326、330、331、332、333、334、336、339又はそれらの組み合わせの、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下で更に詳細に記述されるこの番号付け体系において、表1のIgGヒンジ配列及びIgG4ヒンジリンカー(HL)配列の最初のアミノ酸が219であるように、表1のIgG4(L235E、N297Q)スペーサーの最初のアミノ酸は219であり、表1のIgG4(HL‐CH3)スペーサーの最初のアミノ酸は219である。
いくつかの実施形態において、改変されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換の一つ又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4に由来する:C220S、C226S、S228P、C229S、P230S、E233P、V234A、L234V、L234F、L234A、L235A、L235E、G236A、G237A、P238S、S239D、F243L、P247I、S267E、H268Q、S280H、K290S、K290E、K290N、R292P、N297A、N297Q、S298A、S298G、S298D、S298V、T299A、Y300L、V305I、V309L、E318A、K326A、K326W、K326E、L328F、A330L、A330S、A331S、P331S、I332E、E333A、E333S、E333S、K334A、A339D、A339Q、P396L又はそれらの組み合わせ。
特定の実施形態において、改変されたスペーサーは、改変されていないスペーサーに存在するものと異なるアミノ酸残基によって置換された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むIgG4領域に由来する。一つ又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置220、226、228、229、230、233、234、235、234、237、238、239、243、247、267、268、280、290、292、297、298、299、300、305、309、218、326、330、331、332、333、334、336、339又はそれらの組み合わせの、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、改変されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換の一つ又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、IgG4領域に由来する:220S、226S、228P、229S、230S、233P、234A、234V、234F、234A、235A、235E、236A、237A、238S、239D、243L、247I、267E、268Q、280H、290S、290E、290N、292P、297A、297Q、298A、298G、298D、298V、299A、300L、305I、309L、318A、326A、326W、326E、328F、330L、330S、331S、331S、332E、333A、333S、333S、334A、339D、339Q、396L又はそれらの組み合わせ。ここで、改変されていないスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置において上記の同定されたアミノ酸によって置換される。
本明細書において論じられる免疫グロブリン中のアミノ酸位置について、番号付けは、EUインデックス又はEU番号付け体系(Kabatら、1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、米国公衆衛生局、国立保健研究機構、ベスセダ、参照により全体が本明細書に組み込まれる)に従う。EUインデックス若しくはKabatにおけるようなEUインデックス又はEU番号付け体系は、EU抗体の番号付け(Edelmanら、1969 Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85)を参照する。
様々な膜貫通ドメインが使用されてもよい。表2は、適切な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合には、膜貫通ドメインは、スペーサードメインに対してカルボシキ末端に位置する。
表2:膜貫通ドメインの例
表2:膜貫通ドメインの例
本明細書に記載のCARの多くは、一つ又はそれ以上の(例えば、二つの)共刺激ドメインを含む。(複数の)共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとCD3ζシグナリングドメインとの間に位置する。表3は、CD3ζシグナリングドメインと一緒に、適切な共刺激ドメインの例を含む。
表3:CD3ζドメイン及び共刺激ドメインの例
表3:CD3ζドメイン及び共刺激ドメインの例
本明細書に記載のクロロトキシンを含むCARの中には、表4に要約されるものがあり、その中で、各CARについてのスペーサードメイン、膜貫通ドメイン及び(複数の)共刺激ドメインが示されている。
表4:クロロトキシンを含むCARの例
*シグナル配列を含む配列についての配列ID番号/シグナル配列を除く配列についての配列ID番号
表4:クロロトキシンを含むCARの例
以下に記述されるものは、クロロトキシン(CLTX)を含む様々なキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptors)の構造、構築及び特徴付けである。キメラ抗原(CAR)は、最低限、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナリングドメインを含む組換え生体分子である。したがって、用語“抗原”は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができる任意の分子である。例えば、CARは、細胞表面レセプターに特異的に結合するリガンドを含んでもよい。細胞外認識ドメイン(細胞外ドメイン又は単にそれが含む認識要素によっても呼ばれる)は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜中にCARをつなぐ。細胞内シグナリングドメインは、ヒトCD3複合体のゼータ鎖からのシグナリングドメインを含み、任意的に一つ又はそれ以上の共刺激シグナリングドメインを含む。CARsは、MHC拘束から独立して、抗原に結合すること及びT細胞活性化を導入することの両方である。したがって、CARsは、彼ら/彼女らのHLA遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を処置することができる“普遍的な(universal)”免疫レセプターである。腫瘍特異的CARを発現するTリンパ球を使用する養子免疫療法(Adoptive immunotherapy)は、癌の処置のための強力な治療戦略であり得る。
本明細書に記載のクロロトキシンを含む一つのCARは、CLTX‐IgG4(EQ)‐CD28gg‐Zeta(ゼータ)と呼ばれる。このCARは、以下を含む様々な重要な特徴を含む:クロロトキシン;CH2領域内の二つの部位においてFcレセプター(FcRs)による結合を低減するような方法で変異させられた(L235E; N297Q)、IgG4 Fc領域;ドメイン、CD28共刺激ドメイン、及びCD3ζ活性化ドメイン。
いくつかの場合において、本明細書に記載のCARは、CAR翻訳領域(open reading frame)の後にT2Aリボソームスキップ配列、及び細胞質シグナルシグナリングテールを欠く(アミノ酸323で切断された)、切断型CD19(CD19t)が続くベクターを使用して産生されてもよい。この配置において、CD19tの同時発現は、不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供し、それは、遺伝子改変細胞の正確な測定を可能にし、遺伝子改変細胞の正の選択(positive selection)、並びに、養子移植に続いての生体内(in vivo)での効率的な細胞追跡及び/又は治療用T細胞(therapeutic T cells)の画像化ができるようにする。CD19tの同時発現は、治療用細胞を選択的に除去し、それにより自殺スイッチとして機能するための、臨床的に利用可能な抗体及び/又は免疫毒素試薬を使用する、導入された細胞の生体内(in vivo)での免疫学的標的化のためのマーカーを提供する。
本明細書に記載のCARは、当分野において知られる任意の手段によって産生されてもよいが、好ましくは、それは組換えDNA技術を使用して産生される。キメラレセプターのいくつかの領域をエンコードする核酸は、便利であるように、当分野において知られる分子クローニングの標準的な技術(ゲノムライブラリースクリーニング、PCR、プライマー補助ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など)によって、調製され、完全なコード配列に組み立てられてもよい。結果として生じるコード領域は、好ましくは発現ベクターの中に挿入され、適切な発現宿主細胞株、好ましくはTリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Tリンパ球細胞株を変換する(transform)ために使用される。
選択されていないPBMC又は富化された(enriched)CD3 T細胞又は富化されたCD3又はメモリーT細胞サブセットを含む、患者から単離された様々なT細胞サブセット又はTCM又はTCM/SCM/Nは、CAR発現のためにベクターを用いて導入され得る。セントラルメモリーT細胞は、一つの有用なT細胞サブセットである。セントラルメモリーT細胞は、所望のレセプターを発現する細胞を免疫磁気的に(immunomagnetically)選択するために、例えばCliniMACS(登録商標)装置を使用して、CD45RO+/CD62L+細胞について富化することによって、末梢血単核球(PBMC)から単離されてもよい。セントラルメモリーT細胞について富化された細胞は、例えば、CAR、並びに、生体内(in vivo)検出及び潜在的な生体外(ex vivo)選択の両方のための非免疫原性の表面マーカーである切断型ヒトCD19(CD19t)の発現を指示するSINレンチウイルスベクターを用いて導入された、抗CD3/CD28によって活性化されてもよい。活性化/遺伝的に改変されたセントラルメモリーT細胞は、IL−2/IL−15を用いて生体外(in vitro)で増やされ、次いで凍結保存されてもよい。
実施例1:CLRX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta CARの構築及び構造
クロロトキシンを含む有用なCARの構造、CLTX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zetaは、以下に記述される。コドン最適化されたCAR配列は:クロロトキシン、Fcレセプター媒介認識を大幅に減少させる変異(S228P、L235E)を含むIgG4 Fcスペーサー、CD28膜貫通ドメイン、共刺激CD28細胞質シグナリングドメイン、及びCD3ζ細胞質シグナリングドメインを含む。T2Aリボソームスキップ配列は、不活性で非免疫原性の細胞表面検出/選択マーカーであるCD19tから、このCAR配列を分離する。このT2A連鎖(linkage)は、
単一の転写産物からのCAR及びCD19tの両方の同調発現(coordinate expression)をもたらす。図1Aは、CLRX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta‐T2ACD19tの翻訳領域の模式図である。この図において、CLTX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta CAR、並びにT2Aリボソームスキップ及び切断型CD19配列は、全て示されている。CAR及びCD19tカセットの発現は、ヒトEF1プロモーター(EF1p)によって駆動される。図1Bは、発現された、成熟CARを模式的に示す。
クロロトキシンを含む有用なCARの構造、CLTX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zetaは、以下に記述される。コドン最適化されたCAR配列は:クロロトキシン、Fcレセプター媒介認識を大幅に減少させる変異(S228P、L235E)を含むIgG4 Fcスペーサー、CD28膜貫通ドメイン、共刺激CD28細胞質シグナリングドメイン、及びCD3ζ細胞質シグナリングドメインを含む。T2Aリボソームスキップ配列は、不活性で非免疫原性の細胞表面検出/選択マーカーであるCD19tから、このCAR配列を分離する。このT2A連鎖(linkage)は、
単一の転写産物からのCAR及びCD19tの両方の同調発現(coordinate expression)をもたらす。図1Aは、CLRX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta‐T2ACD19tの翻訳領域の模式図である。この図において、CLTX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta CAR、並びにT2Aリボソームスキップ及び切断型CD19配列は、全て示されている。CAR及びCD19tカセットの発現は、ヒトEF1プロモーター(EF1p)によって駆動される。図1Bは、発現された、成熟CARを模式的に示す。
CLTX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta配列は、ヒトGM‐CSFレセプターアルファリーダーペプチドクロロトキシン、S228P/L235E/N297Q改変IgG4 Fcヒンジ(ここで二重変異L235E/N297QはFcR認識を妨げる)、CD28膜貫通、CD28細胞質シグナリングドメイン、及びCD3ζ細胞質シグナリングドメイン配列の融合によって生成された。この配列は、コドン最適化後に新規に(de novo)合成された。T2A配列は、T2A含有プラスミドの消化から得られた。CD19t配列は、CD19含有プラスミドの膜貫通コンポーネントまで、リーダーペプチド配列にわたるもの(すなわち、塩基対1‐972)から得られた。全3つの断片、1)CLTX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta、2)T2A、及び3)CD19tは、epHIV7レンチウイルスベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。適切な細胞の中にトランスフェクトされると、ベクターは宿主細胞ゲノムの中に組み込まれる。CLTX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zetaのアミノ酸配列は、表示された様々なドメインと共に図9に表わされている。
実施例2:CLRX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zetaの発現のために使用されたepHIV7の構築及び構造
pHIV7プラスミドは、臨床用ベクターCLRX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta‐T2A‐CD19t_epHIV7がシティ・オブ・ホープ(COH)のT細胞治療研究所(TCTRL)において導き出された、元のプラスミドである。CARの発現に使用されたepHIV7ベクターは、pHIV7ベクターから産生された。重要なことに、このベクターは、CARの発現を駆動するためにヒトEF1プロモーターを使用する。ベクターの5’配列及び3’配列の両方は、以前にHXBc2プロウイルスから導き出されたように、pv653RSNから導き出された。ポリプリントラクトDNAフラップ配列(cPPT)は、NIH AIDS Reagent RepositoryからのHIV‐1系統pNL4‐3から導き出された。ウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)配列は以前に記述されている。
pHIV7プラスミドは、臨床用ベクターCLRX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐zeta‐T2A‐CD19t_epHIV7がシティ・オブ・ホープ(COH)のT細胞治療研究所(TCTRL)において導き出された、元のプラスミドである。CARの発現に使用されたepHIV7ベクターは、pHIV7ベクターから産生された。重要なことに、このベクターは、CARの発現を駆動するためにヒトEF1プロモーターを使用する。ベクターの5’配列及び3’配列の両方は、以前にHXBc2プロウイルスから導き出されたように、pv653RSNから導き出された。ポリプリントラクトDNAフラップ配列(cPPT)は、NIH AIDS Reagent RepositoryからのHIV‐1系統pNL4‐3から導き出された。ウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)配列は以前に記述されている。
pHIV7の構築は、以下のように実行された。簡潔に、介在SL3−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Neo)とともにgag−polプラス5’及び3’末端反復配列(LTRs)から653bpを含む、pv653RSNは、以下のようにpBluescriptにサブクローニングされた:ステップ1において、5’LTRからrev‐応答配列(RRE)までの配列はp5’HIV−151を作製し、次いで5’LTRがTATAボックスの上流の配列を除去することによって改変され、最初にCMVエンハンサーに連結され(ligated)、次いでSV40複製開始点(origin of replication)連結された(p5’HIV‐2)。ステップ2において、3’LTRをpBluescriptにクローニングしてp3’HIV−1を作製した後に、3’LTRエンハンサー/プロモーターにおける400bp削除が行われ、HIV U3におけるシス調節エレメントを除去し、p3’HIV‐2を形成した。ステップ3において、pHIV‐3を作製するために、p5’HIV‐3及びp3’HIV‐2から単離された断片が結合された。ステップ4において、p3’HIV‐3を生成するために、p3’HIV‐2が余分な上流のHIV配列を除去することによって更に改変され、また、p3’HIV‐4を作製するために、WPREを含む600bpのBamHI‐SalI断片がp3’HIV‐3に加えられた。ステップ5において、て、pHIV‐6を作製するために、pHIV‐3RREはPCRによりサイズを減少され、pHIV‐3からの5’断片(示さず)及びp3’HIV‐4に連結された。ステップ6において、pHIV‐7を作製するために、HIV‐1 pNL4‐3(55)由来のcPPT DNAフラップ配列を含む190bpのBglII‐BamHI断片は、pNL4‐3から増幅され、pHIV6のRRE配列とWPRE配列の間に配置された。この元のプラスミドpHIV7‐GFP(GFP、緑色蛍光タンパク質)は、4プラスミド系を使用して元のベクターをパッケージングするために使用された。
パッケージングシグナル、psi(Ψ)、は、ベクターへのウイルスゲノムの効率的なパッケージングのために要求される。RRE及びWPREは、RNA転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、WPREと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの導入効率を増強することが実証されている。
ヘルパー機能(ウイルスベクターの産生のために要求される)は、組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の可能性を減少させるために、3つの別個のプラスミドに分割された:1)pCgpはウイルスベクターアセンブリのために要求されるgag/polタンパク質をエンコードする;2)pCMV‐Rev2は、効率的なパッケージングのためのウイルスゲノムの輸送を助けるためにRRE配列に作用する、Revタンパク質をエンコードする;3)pCMV‐Gは、ウイルスベクターの感染性のために要求される、水疱性口内炎(vesiculo-stomatitis)ウイルス(VSV)の糖タンパク質をエンコードする。
pHIV7にエンコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小限のDNA配列相同性が存在する。相同性の領域は、pCgpヘルパープラスミドのgag/pol配列中に位置する、約600ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域;全3種のヘルパープラスミド中のCMVプロモーター配列;及び、ヘルパープラスミドpCgp中のRRE配列を含む。複数の組換え事象を要求するので、これらの領域の相同性のために複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。加えて、如何なる結果として生じる組換え体も、レンチウイルス複製のために要求される機能的LTR及びtat配列を有していないであろう。
CMVプロモーターがEF1α‐HTLVプロモーター(EF1p)によって置き換えられ、新しいプラスミドがepHIV7と名付けられた。EF1pは、563bpを有し、CMVプロモーターが切除された後に、NruI及びNheIを使用してepHIV7に導入された。
野生型ウイルスの病原性に必要であり、標的細胞の増殖性感染のために要求されるgag/pol及びrevを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれている。加えて、CLRX‐IgG4Fc(EQ)‐CD28‐ゼータ‐T2ACD19t_epHIV7ベクターコンストラクトはインタクトな3’LTRプロモーターを含まず、そのため、標的細胞における、結果として生じ発現及び逆転写されるDNAプロウイルスゲノムは、不活性なLTRsを有するであろう。この設計の結果として、一切のHIV‐1由来の配列はプロウイルスから転写されず、治療用の配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されるであろう。SINベクターにおけるLTRプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させると予想される。
実施例3:患者T細胞の導入のためのベクターの産生
患者T細胞の導入のためのベクターは、以下のように調製されてもよい。各プラスミド(すなわち、1)CAR、及び任意的に切断型CD19のようなマーカー;2)pCgp;3)pCMV‐G;及び4)pCMV‐Rev2を発現するプラスミド)について、十分な量のプラスミドDNAを産生するために発酵槽に接種する(inoculate)ために使用される、シードバンクが生成された。プラスミドDNAは、レンチウイルスベクターの産生におけるその使用に先立って、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験された。
患者T細胞の導入のためのベクターは、以下のように調製されてもよい。各プラスミド(すなわち、1)CAR、及び任意的に切断型CD19のようなマーカー;2)pCgp;3)pCMV‐G;及び4)pCMV‐Rev2を発現するプラスミド)について、十分な量のプラスミドDNAを産生するために発酵槽に接種する(inoculate)ために使用される、シードバンクが生成された。プラスミドDNAは、レンチウイルスベクターの産生におけるその使用に先立って、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験された。
簡潔に、細胞は、無菌性及びウイルス汚染が存在しないこと確認するために試験された293T作業細胞(WCB)から増やされる。293T WCBからの293T細胞のバイアルが解凍される。ベクター産生及び細胞トレイン維持のために適切な数の10層細胞ファクトリー(CFs)を蒔くために十分な数の細胞が存在するまで、細胞は生育され及び増やされる。単一の細胞のトレインが産生のために使用されてもよい。
レンチウイルスベクターは、10CFsまでのサブバッチで産生される。同じ週に2つのサブバッチを産生されてもよく、約20Lのレンチウイルス上清/週の産生につながる。一つのロットの産物を産生するために、全てのサブバッチから生成された物質は、下流の処理段階の間プールされる。293T細胞は、293T培地(10%FBSを含むDMEM)中でCFs中に蒔かれる(plated)。ファクトリーは、37℃のインキュベーター内に置かれ、CFの全層上に細胞の均一な分布を得るために水平にならされる。2日後、細胞は、Tris:EDTA、2M CaCl2、2X HBS、及び4つのDNAプラスミドの混合物を伴う、CaPO4法を使用して、上述の4つのレンチウイルスプラスミドを用いてトランスフェクトされる。トランスフェクションの3日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含む上清は、回収され、精製され、濃縮される。上清がCFsから除去された後に、生産最終細胞が各CFから回収される。細胞は各ファクトリーからトリプシン処理され、遠心分離により回収される。細胞は凍結培地に再懸濁され、凍結保存される。これらの細胞は、複製コンピテントレンチウイルス(RCL)試験のために後に使用される。
ベクターを精製及び製剤化(formulate)するために、粗製上清は細胞片を除去するための膜濾過によって清澄化される。宿主細胞DNA及び残留プラスミドDNAは、エンドヌクレアーゼ消化(Benzonase(登録商標))によって分解される。ウイルス上清は0.45μmのフィルターを使用して細胞片から清澄化される。清澄化された上清は予め秤量した容器に回収され、その中にBenzonase(登録商標)を加えられる(最終濃度50U/mL)。残留プラスミドDNA及び宿主ゲノムDNAのエンドヌクレアーゼ消化は、37℃で6時間実行される。最初の接線流限外濾過(TFF)濃度のエンドヌクレアーゼ処理された上清は、ウイルスを約20倍濃縮しながら、粗製上清から残留低分子量成分を除去するために使用される。清澄化されたエンドヌクレアーゼ処理ウイルス上清は、フラックス速度(flux rate)を最大化しながら、せん断速度を約4,000秒−1又はそれ以下に維持するように設計された流速で、500kDのNMWCOを有する中空繊維カートリッジを通して循環させられる。ヌクレアーゼ処理された上清のダイアフィルトレーションは、カートリッジの性能を維持するために濃縮プロセスの間に開始される。ダイアフィルトレーション緩衝液としてのPBS中に4%ラクトースを使用して、80%透過物置換率が確立される。ウイルス上清は標的体積にされて、粗製上清の20倍濃度を示し、ダイアフィルトレーションは100%の透析液置換率で4回の追加交換容量にわたって続けられる。
ウイルス産物の更なる濃縮は、高速遠心分離技術を使用することによって達成される。レンチウイルスの各サブバッチは、Sorvall RC−26 plus centrifugeを6000RPM(6,088RCF)、6℃、16‐20時間で使用してペレット化される。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットは、PBS中の4%ラクトースで50mL体積に再構成される。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製のための最終製剤を代表する。ベクター濃縮プロセス全体は、約200倍の体積減少をもたらす。全てのサブバッチの完了に続き、次に物質は−80℃に置かれ、その間に各サブバッチからの試料が無菌性について試験される。サンプル無菌性の確認に続き、サブバッチを頻繁に撹拌しながら37℃で急速に解凍される。次いで、物質はプールされ、クラスII型A/B3バイオセーフティーキャビネット内にて手動で分注される。無菌USPクラス6、雄ネジOリングクリオバイアル内の、1mLの濃縮レンチウイルスの充填構成が使用される。
レンチウイルスベクター調製物の純度を確実にするために、それは、残留宿主DNA汚染物質、並びに残留宿主及びプラスミドDNAの移入について試験される。他の試験の中でも、正しいベクターが存在することを確実にするために、RT‐PCRによってベクター同一性が評価される。
実施例4:ACTにおける使用に適したT細胞の調製
CARを発現するためにTCMが使用される場合は、適した患者の細胞は、以下のように調製されてもよい。最初に、Tリンパ球は、白血球フェレーシスによって患者から得られ、適切な同種又は自己のT細胞サブセット、例えばセントラルメモリーT細胞(TCM)がCARを発現するように遺伝的に変更され、次いで抗癌治療を達成するために、任意の臨床的に許容される手段によって患者に投与して戻された。
CARを発現するためにTCMが使用される場合は、適した患者の細胞は、以下のように調製されてもよい。最初に、Tリンパ球は、白血球フェレーシスによって患者から得られ、適切な同種又は自己のT細胞サブセット、例えばセントラルメモリーT細胞(TCM)がCARを発現するように遺伝的に変更され、次いで抗癌治療を達成するために、任意の臨床的に許容される手段によって患者に投与して戻された。
適切なTCMは、以下のように生成されてもよい。合意された研究参加者から得られたアフェレーシス産物は、フィコール処理され(ficolled)、洗浄され、一晩インキュベートされる。次いで細胞は、GMP等級の抗CD14、抗CD25及び抗CD45RA試薬(Miltenyi Biotec)及びCliniMACS(商標)分離装置を使用して、単球、調節性T細胞及びナイーブT細胞集団を枯渇させる。枯渇に続いて、陰性画分細胞(negative fraction cells)は、CliniMACS(商標)分離装置上でDREG56‐ビオチン(COH臨床等級)及び抗ビオチンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を使用して、CD62L+TCM細胞について富化される(enriched)。
富化に続いて、TCM細胞は、完全X−Vivo15プラス50IU/mLのIL‐2及び0.5ng/mLのIL‐15中に処方され、テフロン(登録商標)細胞培養バッグに移され、Dynal Clin(商標)Vivo CD3/CD28ビーズを用いて刺激される。刺激後の最大5日目まで、細胞は、1.0から0.3の感染多重度(MOI)で所望のCARを発現するレンチウイルスベクターを用いて導入される。培養は、細胞増殖のための要求に応じた完全X‐Vivo15並びにIL‐2及びIL‐15サイトカインの追加を伴い(細胞密度を3×105と2×106生存細胞/mLの間に保ち、サイトカイン補充は培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日)、最大で42日間維持される。細胞は、典型的には、21日以内にこれらの条件下で約109細胞まで増える。培養期間の終わりに、細胞は採取され、2回洗浄され、臨床等級の凍結保存培地(Cryostore CS5, BioLife Solutions)中に処方される。
T細胞注入の日に、凍結保存及び放出された産物は、解凍され、洗浄され、再輸液のために処方される。放出された細胞産物を含む低温保存バイアルは、液体窒素貯蔵から取り出され、解凍され、冷却され、PBS/2%ヒト血清アルブミン(HSA)洗浄緩衝液で洗浄される。遠心分離後、上清は除去され、細胞は保存料無添加の通常生理食塩水(PFNS)/2%HSA輸液希釈液(infusion diluent)に再懸濁される。品質管理試験のために試料が取り出される。
実施例5:Cltx‐IgG4(EQ)‐CD28gg‐Zetaの発現
図1Cは、CLTX‐CARを発現するように操作された健常ドナーT細胞(HD187.2 TCM/SCM/N)のフローサイトメトリー分析の結果を示す。示されているのは、CD8+及びCD4+(CD8−)T細胞サブセットの両方におけるCLTX‐CAR及びCD19t導入遺伝子の同時発現を表す、抗CD19抗Fc及び抗CD8染色である。CD3/CD28ビーズ刺激の18日後の導入された細胞(CLTX‐CAR)及び導入されていない細胞(モック)についての免疫反応性細胞の割合が示されて、ヒトT細胞をCLTX−CAR用いて形質導入する能力を実証している。
図1Cは、CLTX‐CARを発現するように操作された健常ドナーT細胞(HD187.2 TCM/SCM/N)のフローサイトメトリー分析の結果を示す。示されているのは、CD8+及びCD4+(CD8−)T細胞サブセットの両方におけるCLTX‐CAR及びCD19t導入遺伝子の同時発現を表す、抗CD19抗Fc及び抗CD8染色である。CD3/CD28ビーズ刺激の18日後の導入された細胞(CLTX‐CAR)及び導入されていない細胞(モック)についての免疫反応性細胞の割合が示されて、ヒトT細胞をCLTX−CAR用いて形質導入する能力を実証している。
実施例6:クロロトキシン及びCltx‐IgG4(EQ)‐CD28gg‐ZetaT細胞は、神経膠腫細胞株U251Tを特異的に認識する
蛍光ラベル、Cy5.5に抱合されたクロロトキシン(CLTX‐Cy5.5)は、様々な細胞種へのクロロトキシン結合を評価するために使用された。この研究の結果は、図2A‐Eに表されている(A、健常ドナー由来のヒト末梢血単核球(PBMC);B、ヒトEBV転換リンパ芽球細胞株、LCL;C、大型T抗原転換ヒト胎性腎臓細胞株293T;D、健常ドナー由来の誘導多能性幹細胞(iPSCs)から分化したヒト星状細胞;及びE、ヒト神経膠芽腫細胞株U251T)。細胞株は、培地(未処置)中、又は1μMのCLTX‐Cy5.5を含む培地中、37℃で1時間にわたって培養され、次いでフローサイトメトリーによって評価された。
蛍光ラベル、Cy5.5に抱合されたクロロトキシン(CLTX‐Cy5.5)は、様々な細胞種へのクロロトキシン結合を評価するために使用された。この研究の結果は、図2A‐Eに表されている(A、健常ドナー由来のヒト末梢血単核球(PBMC);B、ヒトEBV転換リンパ芽球細胞株、LCL;C、大型T抗原転換ヒト胎性腎臓細胞株293T;D、健常ドナー由来の誘導多能性幹細胞(iPSCs)から分化したヒト星状細胞;及びE、ヒト神経膠芽腫細胞株U251T)。細胞株は、培地(未処置)中、又は1μMのCLTX‐Cy5.5を含む培地中、37℃で1時間にわたって培養され、次いでフローサイトメトリーによって評価された。
図2Fに示されるように、CLTX−CAR T細胞は、神経膠腫腫瘍細胞株U251Tを特異的に死滅させたが、LCL、293T又は原発性のヒト星状細胞を死滅させなかった。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックT細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター:標的比=1:1(15,000T細胞、15,000標的細胞)で72時間にわたってCLTX−CAR T細胞と共培養された、生存標的細胞(LCL、293T、星状細胞及びU251T)の数である。
実施例7:クロロトキシンは、IL13Rα2発現から独立して低継代PBT、ヒト原発性神経膠芽腫細胞株に結合する
クロロトキシン結合がIL13Rα2発現から独立しているかどうかを調べるために、1μMのCLTX‐Cy5.5を含む培地中で1時間培養され、次いでPE抱合IL13Rα2抗体を用いて染色された、IL13Rα2‐low細胞株及びIL13Rα2‐high細胞株のフローサイトメトリー分析が実行された。図3A‐Bに見られるように、クロロトキシンは、IL13Rα2発現から独立して低継代PBT、ヒト原発性神経膠芽腫細胞株に結合する。
クロロトキシン結合がIL13Rα2発現から独立しているかどうかを調べるために、1μMのCLTX‐Cy5.5を含む培地中で1時間培養され、次いでPE抱合IL13Rα2抗体を用いて染色された、IL13Rα2‐low細胞株及びIL13Rα2‐high細胞株のフローサイトメトリー分析が実行された。図3A‐Bに見られるように、クロロトキシンは、IL13Rα2発現から独立して低継代PBT、ヒト原発性神経膠芽腫細胞株に結合する。
実施例8:CLTX‐IgG4(EQ)‐CD28gg‐ZetaT細胞は、IL13Rα2発現及びTCGA分子サブタイプから独立して低継代PBTヒト神経膠芽腫細胞株を認識し、死滅させる
図4Aに示されるように、CLTX‐CAR T細胞は、原発性GBM株対胎性腎臓細胞株293Tのパネルの統計的に有意な死滅を示す。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックT細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター:標的比=1:1(15,000T細胞、15,000標的細胞)で24、48及び72時間にわたってCLTX‐CAR T細胞と共培養された、生存標的細胞の数である。
図4Aに示されるように、CLTX‐CAR T細胞は、原発性GBM株対胎性腎臓細胞株293Tのパネルの統計的に有意な死滅を示す。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックT細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター:標的比=1:1(15,000T細胞、15,000標的細胞)で24、48及び72時間にわたってCLTX‐CAR T細胞と共培養された、生存標的細胞の数である。
図4Bは、生細胞画像化を用いて観察され、モック対照に比較した、CLTX‐CAR T細胞によるPBT003‐4及びPBT009腫瘍細胞の排除を示す。エフェクター:標的比=1:4(4,000T細胞、16,000標的細胞)でモック又はCLTX‐CAR T細胞と共培養されたPBT003‐4及びPBT009細胞の代表的な画像であり、共培養直後(0時間)及び共培養の3日後(72h)に明視野顕微鏡によって撮影された、
実施例9:CLTX‐IgG4(EQ)‐CD28gg‐ZetaT細胞は、GBM細胞を用いた刺激によって活性化される
(モック又はCLTX CARを発現する)T細胞は、タンパク質輸送阻害剤の存在下、エフェクター:標的比=1:1(25,000T細胞、25,000標的細胞)で5時間にわたって標的細胞によって刺激された。脱顆粒を起こしているCAR‐T細胞の割合は、フローサイトメトリーを使用して、CD107a免疫反応性(図5A)、及び細胞内染色によって決定されるサイトカイン産生(図5B)によって決定された。
(モック又はCLTX CARを発現する)T細胞は、タンパク質輸送阻害剤の存在下、エフェクター:標的比=1:1(25,000T細胞、25,000標的細胞)で5時間にわたって標的細胞によって刺激された。脱顆粒を起こしているCAR‐T細胞の割合は、フローサイトメトリーを使用して、CD107a免疫反応性(図5A)、及び細胞内染色によって決定されるサイトカイン産生(図5B)によって決定された。
実施例10:異なるリンカー設計を有するCLTX‐CAR T細胞は、腫瘍細胞に対して有効である
図6Aは、IgG4Fc(EQ)、IgG4(HL‐CH3)、CD8h及び短いリンカー(L)を含む、異なるスペーサー(リンカー)を有するCLTX‐CARコンストラクトの模式図である。全てが、CD28膜貫通ドメインを有する(図示されていない)。図6Bに示されるように、異なるリンカーを有するCLTX‐CAR T細胞は、U251T GBM細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックT細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター:標的比=1:1(15,000T細胞、15,000標的細胞)で24、48及び72時間にわたって、異なるCLTX‐リダイレクトコンストラクトを宿すT細胞と共培養された、生存U251T細胞の数である。図6Cに示されるように、異なるリンカーを有するCLTX‐CAR T細胞は、抗原攻撃に続いて、異なるサイトカイン産生レベルを示す。異なるLTX‐リダイレクトコンストラクトを用いて操作されたT細胞は、エフェクター:標的比=1:1(20,000T細胞、20,000標的細胞)でU251T細胞を用いて刺激された。IFNγ分泌は、上清のELISAアッセイによって検出された。
図6Aは、IgG4Fc(EQ)、IgG4(HL‐CH3)、CD8h及び短いリンカー(L)を含む、異なるスペーサー(リンカー)を有するCLTX‐CARコンストラクトの模式図である。全てが、CD28膜貫通ドメインを有する(図示されていない)。図6Bに示されるように、異なるリンカーを有するCLTX‐CAR T細胞は、U251T GBM細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックT細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター:標的比=1:1(15,000T細胞、15,000標的細胞)で24、48及び72時間にわたって、異なるCLTX‐リダイレクトコンストラクトを宿すT細胞と共培養された、生存U251T細胞の数である。図6Cに示されるように、異なるリンカーを有するCLTX‐CAR T細胞は、抗原攻撃に続いて、異なるサイトカイン産生レベルを示す。異なるLTX‐リダイレクトコンストラクトを用いて操作されたT細胞は、エフェクター:標的比=1:1(20,000T細胞、20,000標的細胞)でU251T細胞を用いて刺激された。IFNγ分泌は、上清のELISAアッセイによって検出された。
実施例11:異なる細胞内シグナリングドメインを有するCLTX‐CAR T細胞の抗腫瘍効果
図7Aは、異なる細胞内共刺激ドメインCD28及び41BBを有するCLTX‐CARコンストラクトの模式図である。図7Bに示されるように、異なる共刺激ドメインを有するCLTX‐CAR T細胞は、U251T GBM細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックT細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター:標的比=1:1(15,000T細胞、15,000標的細胞)で24、48及び72時間にわたって、異なるCLTX‐リダイレクトコンストラクトを宿すT細胞と共培養された、生存U251T細胞の数である。図7Cに示されるように、異なる共刺激ドメインを有するCLTX‐CAR T細胞は、抗原攻撃に続いて、様々なレベルのサイトカインを産生する。異なるLTX‐リダイレクトコンストラクトを用いて操作されたT細胞は、エフェクター:標的比=1:1(20,000T細胞、20,000標的細胞)でU251T細胞を用いて刺激された。IFNγ分泌は、上清のELISAアッセイによって検出された。
図7Aは、異なる細胞内共刺激ドメインCD28及び41BBを有するCLTX‐CARコンストラクトの模式図である。図7Bに示されるように、異なる共刺激ドメインを有するCLTX‐CAR T細胞は、U251T GBM細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックT細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター:標的比=1:1(15,000T細胞、15,000標的細胞)で24、48及び72時間にわたって、異なるCLTX‐リダイレクトコンストラクトを宿すT細胞と共培養された、生存U251T細胞の数である。図7Cに示されるように、異なる共刺激ドメインを有するCLTX‐CAR T細胞は、抗原攻撃に続いて、様々なレベルのサイトカインを産生する。異なるLTX‐リダイレクトコンストラクトを用いて操作されたT細胞は、エフェクター:標的比=1:1(20,000T細胞、20,000標的細胞)でU251T細胞を用いて刺激された。IFNγ分泌は、上清のELISAアッセイによって検出された。
実施例12:CLTX‐CAR T細胞は、生体内で(in vivo)、確立されたU251T GBM腫瘍の成長を低減する。
図8Aは、NSGマウスにおけるU251T異種移植の増殖及びT細胞処置の研究の模式的な描写である。皮下に移植されたU251T細胞を有するマウス(第−14日目から第0日目)は、PBS(腫瘍のみ)、モックT細胞、又はCLTX‐CAR T細胞を用いて処置された。図8B、腫瘍進行は、CLTX‐CAR T細胞処置によって阻害される。T細胞注入の時から20日間(第0日目から第20日目)にわたって、腫瘍の成長がキャリパー測定によって測定された。
図8Aは、NSGマウスにおけるU251T異種移植の増殖及びT細胞処置の研究の模式的な描写である。皮下に移植されたU251T細胞を有するマウス(第−14日目から第0日目)は、PBS(腫瘍のみ)、モックT細胞、又はCLTX‐CAR T細胞を用いて処置された。図8B、腫瘍進行は、CLTX‐CAR T細胞処置によって阻害される。T細胞注入の時から20日間(第0日目から第20日目)にわたって、腫瘍の成長がキャリパー測定によって測定された。
実施例13:追加的なCLTX CAR
図9‐24は、CLTX‐IgG4(EQ)‐CD28gg‐Zeta CARに関して上述されたように構築及び発現されることができる様々な追加的なCLTX‐CARのアミノ酸配列を提示する。図8‐24において、様々な領域(アミノ末端からカルボキシ末端までの各図の配列の下に列挙されている)は、下線部分及び非下線部分を交互にすること(alternating)によって示されている。したがって、図9において、GMCSFRaシグナルペプチドは下線が引かれており、クロロトキシン配列は下線が引かれておらず、スペーサー(IgG4(SmP)(L235E、N297Q))は下線が引かれており、CD28膜貫通配列は下線が引かれておらず、CD28cyto(LLmGG)共刺激ドメインは下線が引かれており、共刺激ドメインをCD3ζ配列から分離する(Gly)3配列は下線が引かれておらず、そしてCD3ζ配列は下線が引かれている。図9‐23において、CARと同時発現されるT2A及びT19t配列は示されていない。図24は、T2A(リボソームスキップ)及び切断型CD19)が含まれた図23のCARを示す。切断型CD19は、CARと同時発現され、トランスフェクトされた細胞を同定及び定量化するための単純な方法を可能にする。
図9‐24は、CLTX‐IgG4(EQ)‐CD28gg‐Zeta CARに関して上述されたように構築及び発現されることができる様々な追加的なCLTX‐CARのアミノ酸配列を提示する。図8‐24において、様々な領域(アミノ末端からカルボキシ末端までの各図の配列の下に列挙されている)は、下線部分及び非下線部分を交互にすること(alternating)によって示されている。したがって、図9において、GMCSFRaシグナルペプチドは下線が引かれており、クロロトキシン配列は下線が引かれておらず、スペーサー(IgG4(SmP)(L235E、N297Q))は下線が引かれており、CD28膜貫通配列は下線が引かれておらず、CD28cyto(LLmGG)共刺激ドメインは下線が引かれており、共刺激ドメインをCD3ζ配列から分離する(Gly)3配列は下線が引かれておらず、そしてCD3ζ配列は下線が引かれている。図9‐23において、CARと同時発現されるT2A及びT19t配列は示されていない。図24は、T2A(リボソームスキップ)及び切断型CD19)が含まれた図23のCARを示す。切断型CD19は、CARと同時発現され、トランスフェクトされた細胞を同定及び定量化するための単純な方法を可能にする。
実施例14:追加的な毒素配列
図25は、クロロトキシン及び様々なクロロトキシン関連毒素の配列アライメントを示す(Dardevetら、2015 Toxins (Basel) 7:1079)。これらの毒素は、いくつかの場合において、本明細書に記載のCARにおけるクロロトキシンのために置換されてもよい。
図25は、クロロトキシン及び様々なクロロトキシン関連毒素の配列アライメントを示す(Dardevetら、2015 Toxins (Basel) 7:1079)。これらの毒素は、いくつかの場合において、本明細書に記載のCARにおけるクロロトキシンのために置換されてもよい。
Claims (32)
- キメラ抗原レセプターをエンコードする核酸分子であって、
前記キメラ抗原レセプターは:
クロロトキシン若しくはクロロトキシン関連毒素又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;
膜貫通ドメインであり:
CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
CD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;並びに
CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;
を含む、
核酸分子。 - 前記共刺激ドメインは:
CD28共刺激ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
OX40共刺激ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から成る群から選択される、
請求項1に記載の核酸分子。 - 1‐5個のアミノ酸改変を有するクロロトキシンのバリアント、を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記クロロトキシンバリアントは、1‐5個のアミノ酸改変とともに配列ID番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記キメラ抗原レセプターは、
二つの異なる共刺激ドメインであり:
CD28共刺激ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
OX40共刺激ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン、
を含む、
請求項2に記載の核酸分子。 - 前記キメラ抗原レセプターは、
二つの異なる共刺激ドメインであり:
CD28共刺激ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
4‐1BB共刺激ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
OX40共刺激ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン、
を含む、
請求項5に記載の核酸分子。 - 前記キメラ抗原レセプターは:
クロロトキシン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;
膜貫通ドメインであり:
CD4膜貫通ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
CD8膜貫通ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
CD28膜貫通ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
CD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;並びに
CD3ζシグナリングドメイン又は1‐2個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;
を含む、
請求項1に記載の核酸分子。 - 前記クロロトキシン又はそのバリアントと前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記スペーサー領域は、5‐300個のアミノ酸を含む、請求項8に記載の核酸分子。
- 前記スペーサー領域は、配列ID番号:2‐12又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の核酸分子。
- 前記スペーサーは、IgGヒンジ領域を含む、請求項8に記載の核酸分子。
- 前記スペーサーは、10‐50個のアミノ酸を含む、請求項8に記載の核酸分子。
- 前記4‐1BB共刺激ドメインは、配列ID番号:24又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の核酸分子。
- 前記CD3ζシグナリングドメインは、配列ID番号:7のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 3個から15個のアミノ酸のリンカーが、前記共刺激ドメインと前記CD3ζシグナリングドメイン又はそれらのバリアントとの間に位置する、請求項1に記載の核酸分子。
- 当該核酸分子は、配列ID番号:26‐55又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記キメラ抗原レセプターは、
4‐1BB共刺激ドメイン、及び
配列ID番号:2‐12のいずれか又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含むスペーサー領域、
を含む、
請求項1に記載の核酸分子。 - 前記キメラ抗原レセプターは、配列ID番号:26‐55から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の核酸分子。
- 前記1‐5個のアミノ酸改変は、1個又は2個のアミノ酸改変である、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記1‐5個のアミノ酸改変は、1‐5個のアミノ酸置換である、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記キメラ抗原レセプターは、
二つ又はそれ以上のクロロトキシン若しくはそのバリアント、又は二つ又はそれ以上のクロロトキシンに関連する毒素、又は少なくとも一つのクロロトキシン及び少なくとも一つのクロロトキシンに関連する毒素、
を含む、請求項1に記載の核酸分子。 - キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入されたヒトT細胞の集団であって、
キメラ抗原レセプターは:
クロロトキシン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;
膜貫通ドメインであり:
CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
CD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;並びに
CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;
を含む、
ヒトT細胞の集団。 - 配列ID番号:26‐55又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原レセプターを発現するベクターを含む、ヒトT細胞の集団。
- 前記T細胞は、セントラルメモリーT細胞の集団で構成される、請求項22に記載のヒトT細胞の集団。
- 患者の癌を処置する方法であって、
キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入された自己又は同種のヒトT細胞の集団を投与するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ID番号:26‐55又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、
を含む、方法。 - 前記ヒトT細胞の集団は、CD62L+メモリーT細胞を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記癌は、神経膠芽腫である、請求項25に記載の方法。
- 前記導入されたヒトT細胞は、
患者からT細胞を採取するステップ、
セントラルメモリーT細胞を単離するために前記T細胞を処理するステップ、及び
キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて、前記セントラルメモリーT細胞の少なくとも一部分に導入するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ID番号:26‐55又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、
を含む方法によって調製される、
請求項25に記載の方法。 - 配列ID番号:26‐40から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子。
- 配列ID番号:26‐55又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列に一致するポリペプチドを発現する、T細胞。
- キメラ抗原レセプターをエンコードする核酸分子であって、
前記キメラ抗原レセプターは:
クロロトキシン関連毒素又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;
膜貫通ドメインであり:
CD4膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
CD8膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
CD28膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
CD3ζ膜貫通ドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;並びに
CD3ζシグナリングドメイン又は1‐5個のアミノ酸改変を有するそのバリアント;
を含む、
核酸分子。 - 前記クロロトキシン関連毒素は、配列ID番号:57‐59又は図25に示されるクロロトキシン関連毒素から選択される、請求項31に記載の核酸分子。
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JP2022007016A JP7331162B2 (ja) | 2015-10-13 | 2022-01-20 | クロロトキシン領域を含むキメラ抗原受容体 |
JP2023129665A JP2023144018A (ja) | 2015-10-13 | 2023-08-09 | クロロトキシン領域を含むキメラ抗原受容体 |
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