ES2902987T3 - Receptores de antígeno quiméricos que contienen un dominio de clorotoxina - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico que codifica para un receptor de antígeno quimérico, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico: clorotoxina o variante de la misma que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido; un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana CD4 o variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3ζ o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido; una región espaciadora ubicada entre la clorotoxina o variante de la misma y el dominio transmembrana; un dominio coestimulador seleccionado de: un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1- 5 modificaciones de aminoácido, un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido y un dominio coestimulador OX40 o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido; y dominio de señalización CD3 ζ o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, posibilitando la clorotoxina o variante de la misma que el receptor de antígeno quimérico, cuando se expresa en la superficie de una célula T, dirija la actividad de célula T a células de glioblastoma.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de antígeno quiméricos que contienen un dominio de clorotoxina
ANTECEDENTES
Las inmunoterapias a base de células T específicas de tumor, incluyendo las terapias que emplean células T modificadas mediante ingeniería, se han investigado para el tratamiento antitumoral. Los receptores de antígeno quiméricos (CAR) se componen de un dominio de reconocimiento/selección como diana de tumor extracelular, un ligador/espaciador extracelular, un dominio transmembrana, y dominios de señalización coestimuladores y activadores de células T intracelulares. El diseño del dominio de reconocimiento/selección como diana es crítico para evitar efectos fuera de diana perjudiciales. La mayoría de los dominios que seleccionan como diana un tumor CAR son fragmentos variables de cadena sencilla (scFvs) derivados de secuencias de anticuerpo que aprovechan la especificidad de unión de anticuerpo a antígenos particulares. También hay ejemplos de dominios de selección como diana de tumor CAR derivados de ligandos receptores normales, tal como el CAR de citocina IL-13 que selecciona como diana células que expresan el receptor de IL-13, IL13Ra2. A pesar de algunos éxitos notables, la identificación y validación de dominios de selección como diana de tumor CAR novedosos sigue siendo un reto importante en el campo.
Los gliomas malignos (MG), que incluyen astrocitoma anaplásico (AA-WHO de grado III) y glioblastoma (GBM-WHO de grado IV), tienen una tasa de incidencia de aproximadamente 20.000 nuevos casos diagnosticados anualmente en los Estados Unidos. Según la Asociación Americana de Tumores Cerebrales la prevalencia total de individuos que viven con un tumor cerebral maligno, basándose en datos de censo del 2010 de los Estados Unidos, es de aproximadamente 140.000 personas. Aunque el MG es una enfermedad rara, es altamente agresivo y heterogéneo con respecto a su comportamiento maligno y letal de manera casi uniforme. Las terapias de estándar de cuidado actuales para el MG de alto grado solo produjeron beneficios a corto plazo, y estos tumores cerebrales son prácticamente incurables. De hecho, incluso con técnicas radioterapéuticas y quirúrgicas modernas, que a menudo agravan las morbilidades ya severas impuestas por la ubicación en el sistema nervioso central (SNC), las tasas de supervivencia a los 5 años son bastante bajas. Además, para la mayoría de los pacientes que experimentan una recaída de la enfermedad, hay pocas opciones terapéuticas. Por tanto, existe una necesidad significativa de terapias más efectivas, particularmente para aquellos pacientes que han experimentado una recurrencia/progresión tras terapias de primera línea.
La terapia con células T adoptiva (ACT) que utiliza células T modificadas mediante ingeniería que expresan un CAR pueden proporcionar un modo seguro y efectivo para reducir las tasas de recurrencia de MG, dado que las células T de CAR pueden modificarse mediante ingeniería para reconocer específicamente poblaciones tumorales antigénicamente distintas (Cartellieri et al. 2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304; Ahmed et al. 2010 Clin Cancer Res 16:474; Sampson et al. 2014 Clin Cancer Res 20:972; Brown et al. 2013 Clin Cancer Res 2012 18:2199; Chow et al. 2013 Mol Ther 21:629), y las células T pueden migrar a través del parénquima cerebral para seleccionar como diana y destruir células malignas infiltrativas (Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Brown et al. 2007 J Immunol 179:3332; Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Yaghoubi 2009 Nat Clin Pract Oncol 6:53).
El documento WO 2010/025177 A1 describe que la integración de dominios de señalización coestimuladores dentro de un CAR que selecciona como diana un tumor, tal como la IL13-zetaquina específica de ILI3Ra2 (IL13Z), potencia las respuestas mediadas por células T frente a tumores incluso en ausencia de ligandos expresados para receptores coestimuladores.
Cheng Y. et al. describen en Am. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, vol. 4, n.° 5, 15 de agosto de 2014 en las páginas 385­ 405 ventajas en el diagnóstico y el tratamiento de gliomas usando bioconjugados a base de clorotoxina.
SUMARIO
La presente invención se define mediante las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes representan realizaciones adicionales de la invención.
En el presente documento se describen inmunorreceptores transmembrana quiméricos (receptores de antígeno quiméricos o “CAR”) que comprenden un dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular. El dominio extracelular de un CAR según la invención incluye clorotoxina (una toxina peptídica de 36 aminoácidos encontrada en el veneno del escorpión Leiurus quinquestriatus), o una variante de clorotoxina que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, y un espaciador, que comprende, por ejemplo, una porción del dominio Fc humano. La porción transmembrana incluye, por ejemplo, un dominio transmembrana CD4, un dominio transmembrana CD8, un dominio transmembrana CD28 o un dominio transmembrana CD3. El dominio de señalización intracelular incluye el dominio de señalización de la cadena zeta del complejo CD3 humano (CD3Z) y uno o más dominios coestimuladores, por ejemplo, un dominio coestimulador 4-1BB. El dominio extracelular posibilita que el CAR, cuando se expresa en la superficie de una célula T, dirija la actividad de célula T a células de glioblastoma. La inclusión de un dominio coestimulador, tal como el dominio coestimulador 4-1BB (CD137), en serie con CD3Z en la región intracelular posibilita que la célula T reciba señales coestimuladoras. Las células T, por ejemplo, células T autólogas, específicas del paciente, pueden modificarse mediante ingeniería para expresar los CAR descritos en el presente documento, y las células modificadas mediante ingeniería pueden expandirse y usarse en ACT. Pueden usarse diversos subconjuntos de células T, incluyendo tanto células T alfa-beta y células T gamma-delta. Además, el CAR puede expresarse en otras células inmunitarias tales como las células NK. Cuando se trata a un paciente con una célula inmunitaria que expresa un CAR descrito en el presente documento, la célula puede ser una célula T autóloga 0 una célula T alogénica. En algunos casos, las células usadas son una población celular que incluye células T de memoria central (Tcm) tanto CD4+ como CD8+, que son CD62L+, CCR7+, CD45RO+ y CD45Ra -, o las células usadas son una población celular que incluye células Tcm CD4+ y CD8+, células T de memoria central madre y células T vírgenes (es decir, una población de células Tcm/scm/n). Una población de células Tcm/scm/n son CD62L+, CCR7+ e incluyen células tanto CD45RA+ como CD45RO+ así como tanto células CD4+ como células CD8+. El uso de tales células puede mejorar la persistencia a largo plazo de las células tras la transferencia adoptiva en comparación con el uso de otros tipos de células T específicas de paciente.
En el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico que codifica para un CAR que comprende: clorotoxina (MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR; SEQ ID NO:1) o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido siempre que los residuos cisteína no estén modificados; un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana CD4 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; un dominio coestimulador seleccionado de: un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o tanto un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido como un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; y un dominio de señalización CD3Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido.
En algunos ejemplos no según la invención, el CAR incluye una toxina relacionada con clorotoxina en lugar de clorotoxina. Por tanto, en algunos ejemplos no según la invención, el CAR puede incluir GaTx2, una toxina de Leiurus quinquestriatus hebraeus (VSCEd Cp DHCSTQKARAKCDNDKCVCEPI; SEQ ID NO:56) o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido siempre que los residuos cisteína no estén modificados; un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana CD4 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; un dominio coestimulador (por ejemplo, un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o tanto un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido como un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; y dominio de señalización CD3 Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido.
En algunos ejemplos, el CAR puede incluir más de una secuencia de clorotoxina (por ejemplo, dos o tres o más copias de SEQ ID NO: 1 ya sea consecutivamente o separadas por 1-10 aminoácidos). Por tanto, el CAR puede incluir dos o secuencias de clorotoxina (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 seguida de SEQ ID NO: 1 seguida del resto de la molécula) o el CAR puede incluir una secuencia de clorotoxina seguida de la secuencia de una toxina relacionada con clorotoxina (por ejemplo, SEQ ID NO:57 u otra toxina representada en la Figura 25).
En algunos ejemplos no según la invención, el CAR puede incluir GaTx1, una toxina de Leiurus quinquestriatus hebraeus (CGPc Ft TDHQMEQKCAECCGGIGKCYGPQCLCNR; SEQ ID NO:57) o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido siempre que los residuos cisteína no estén modificados; un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana CD4 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido; un dominio coestimulador (por ejemplo, un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o tanto un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido como un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; y dominio de señalización CD3 Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido.
En algunos ejemplos no según la invención, el CAR puede incluir AaCtx, una toxina de Androctonus australis (MCIPCFTTNPNMAAKCNACCGSRRGSCRGPQCIC; SEQ ID NO:58) o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido siempre que los residuos cisteína no estén modificados; un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana CD4 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido; un dominio coestimulador (por ejemplo, un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o tanto un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido como un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; y dominio de señalización CD3 Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido.
En algunos ejemplos no según la invención, el CAR puede incluir BmKCT, una toxina de Buthus martensii (CGPCFTTDANMARKCRECCGGIGKCFGPQCLCNRI; SEQ ID NO:59) o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido siempre que los residuos cisteína no estén modificados; un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana representado en la tabla 2 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido, un dominio transmembrana CD4 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3Z o una variante del mismo que tiene 1-10 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; un dominio coestimulador (por ejemplo, un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o tanto un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido como un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; y dominio de señalización CD3 Z o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido.
En algunos ejemplos no según la invención, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs:26 - 55 en las que la secuencia de clorotoxina (SEQ ID NO:1) está reemplazada por una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 56-59 o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido
En diversas realizaciones: el dominio coestimulador se selecciona del grupo que consiste en: un dominio coestimulador representado en la tabla 3 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido, un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido, un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido y un dominio coestimulador OX40 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido. En determinadas realizaciones está presente un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido. En algunas realizaciones hay dos dominios coestimuladores, por ejemplo, un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido y un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido. En diversas realizaciones, las 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido son sustituciones.
En algunos casos, hay una secuencia corta de 1-6 aminoácidos (por ejemplo, GGG) entre los dominios coestimuladores y el dominio de señalización CD3 Z y/o entre los dos dominios coestimuladores.
En algunas realizaciones, el CAR comprende: una variante de una clorotoxina que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido que aumentan la especificidad de unión o la inmunogenicidad para el receptor de clorotoxina (Cltx-R); la variante de clorotoxina es una variante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 con 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido; dos dominios coestimuladores diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido, un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido y un dominio coestimulador OX40 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido; dos dominios coestimuladores diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido, un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido y un dominio coestimulador OX40 o una variante del mismo que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido; clorotoxina o una variante de la misma que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido; un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana CD4 o variante del mismo que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3Z o una variante del mismo que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido; un dominio coestimulador seleccionado de: un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o tanto un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido como un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; y dominio de señalización CD3Z de una variante del mismo que tiene 1-2 modificaciones de aminoácido; una región espaciadora ubicada entre la clorotoxina o variante de la misma y el dominio transmembrana (por ejemplo, la región espaciadora comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NOs: 2-12 (tabla 3) o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido); el espaciador comprende una región bisagra de IgG; la región espaciadora comprende 1-150 aminoácidos; no hay espaciador; el dominio de señalización 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24, el dominio de señalización CD3Z comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y un ligador de 3 a 15 aminoácidos que está ubicado entre el dominio coestimulador y el dominio de señalización CD3Z o variante del mismo. En determinadas realizaciones en las que hay dos dominios coestimuladores, uno es un dominio coestimulador 4-1BB y el otro un dominio coestimulador seleccionado de: CD28 y CD28gg. En diversas realizaciones, las 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones de aminoácido son sustituciones.
En algunas realizaciones: la molécula de ácido nucleico expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26-55; el receptor de antígeno quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26-55.
También se da a conocer una población de células T humanas transducidas mediante un vector que comprende un casete de expresión que codifica para un receptor de antígeno quimérico, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico: o bien clorotoxina o una variante de la misma que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido o bien una toxina relacionada con clorotoxina o una variante de la misma que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana c D4 o variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3z o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; un dominio coestimulador seleccionado de: un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; o tanto un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido como un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; y dominio de señalización CD3 Z de una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido. En diversas realizaciones: la población de células T humanas comprende un vector que expresa un receptor de antígeno quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26-55 o una variante de la misma que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido; la población de células T humanas comprende células T de memoria central (células Tcm) por ejemplo, al menos el 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% de las células son células Tcm, o la población de células T comprende una combinación de células T de memoria central, células T vírgenes y células de memoria central madre (células Tcm/scm/n), por ejemplo, al menos el 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% de las células son células Tcm/scm/n. En cualquier caso, la población de células T incluye tanto células CD4+ como células CD8+ (por ejemplo, al menos el 20% de las células T CD3+ son CD4+ y al menos el 3% de las células T CD3+ son CD8+ y al menos el 70, 80 o 90% son o bien CD4+ o bien CD8+; al menos el 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% de las células células CD3+ son CD4+ y al menos el 4%, 5%, 8%, 10%, 20 de las células CD3+ son células cD8+).
También se describe una población de células T humanas autólogas o alogénicas para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un paciente que comprende administrar la población de células T humanas autólogas o alogénicas (por ejemplo, células T autólogas o alogénicas que comprenden células T de memoria central (células Tcm) o una combinación de células T de memoria central, células T vírgenes y células de memoria central madre (es decir, las células T son células Tcm/scm/n) al menos el 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% de las células son células Tcm/scm/n. En cualquier caso, la población de células T incluye tanto células CD4+ como células CD8+ (por ejemplo, al menos el 20% de las células T CD3+ son CD4+ y al menos el 3% de las células T CD3+ son CD8+ y al menos el 70, 80 o 90% son o bien CD4+ o bien CD8+; al menos el 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% de las células células CD3+ son CD4+ y al menos el 4%, 5%, 8%, 10%, 20 de las células CD3+ son células CD8+) transducidas mediante un vector que comprende un casete de expresión que codifica para un receptor de antígeno quimérico, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26­ 55 o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido. En diversas realizaciones: el cáncer es glioblastoma; y las células T humanas transducidas se prepararon mediante un método que comprende obtener células T del paciente, tratar las células T para aislar células T de memoria central, y transducir al menos una porción de las células de memoria central a con un vector viral que comprende un casete de expresión que codifica para un receptor de antígeno quimérico, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26-55 o una variante de la misma que tiene 1-5 (por ejemplo, 1 o 2) modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido.
También se describe: una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica al 95% a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs 26­ 55; una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26-55 excepto por la presencia de no más de 5 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácido; una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:26-55 excepto por la presencia de no más de 5 sustituciones de aminoácido; y una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:26-55 excepto por la presencia de no más de 2 sustituciones de aminoácido.
Las células T que expresan un CAR que comprende clorotoxina o una variante de la misma pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres tales como glioblastoma, así como otros cánceres que expresan un receptor para clorotoxina, que incluyen, pero no se limitan a: tumores cerebrales primarios y gliomas (glioblastoma multiforme WHO de grado IV, astrocitoma anaplásico WHO de grado III, astrocitoma de grado bajo WHO de grado II, astrocitoma pilocítico WHO de grado I, otros gliomas sin grado, oligodendroglioma, gliosarcoma, ganglioglioma, meningioma, ependimoma), tumores neuroectodérmicos (meduloblastoma, neuroblastoma, ganglioneuroma, melanoma (metastásico), melanoma (primario), feocromocitoma, sarcoma de Ewing, tumores neuroectodérmicos primitivos, carcinoma pulmonar de células pequeñas, schwannoma), otros tumores cerebrales (quistes epidermoides, tumores cerebrales de patología desconocida, glándula pituitaria de glioblastoma multiforme pt., tumores metastásicos al cerebro de origen tisular desconocido) y otros tumores (cáncer de mama, metástasis de cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, cáncer de ovarios, cáncer pancreático, cáncer de próstata).
Esta divulgación también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican para cualquiera de los CAR descritos en el presente documento (por ejemplo, vectores que incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica para uno de los CAR) y linfocitos T aislados que expresan cualquiera de los CAR descritos en el presente documento.
El CAR descrito en el presente documento incluye una región espaciadora ubicada entre el dominio de clorotoxina (es decir, la clorotoxina o variante de la misma) y el dominio transmembrana. Pueden usarse una variedad de espaciadores diferentes. Algunos de ellos incluyen al menos una porción de una región Fc humana, por ejemplo, una porción bisagra de una región Fc humana o un dominio CH3 o variantes del mismo. La tabla 1 a continuación proporciona diversos espaciadores que pueden usarse en los CAR descritos en el presente documento.
Tabla 1: Ejemplos de espaciadores
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Algunas regiones espaciadoras incluyen todo o parte de una región bisagra de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), es decir, la secuencia que se encuentra entre los dominios CH1 y CH2 de una inmunoglobulina, por ejemplo, una bisagra de Fc IgG4 o una bisagra de CD8. Algunas regiones espaciadoras incluyen un dominio CH3 de o tanto un dominio CH3 como un dominio CH2. Las secuencias derivadas de inmunoglobulina pueden incluir una o más modificaciones de aminoácido, por ejemplo, 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones, por ejemplo, sustituciones que reducen la unión fuera de diana.
Una “modificación de aminoácido” se refiere a una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácido en una secuencia proteínica o peptídica. Una “sustitución de aminoácido” o “sustitución” se refiere a un reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia peptídica o proteínica parental con otro aminoácido. Una sustitución puede hacerse para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de una manera no conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un agrupamiento de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular por un aminoácido que pertenece a otro agrupamiento) o de una manera conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un agrupamiento de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular por un aminoácido que pertenece al mismo agrupamiento). Un cambio conservador de este tipo conduce generalmente a cambio menor en la estructura y función de la proteína resultante. Los siguientes son ejemplos de diversos agrupamientos de aminoácidos: 1) aminoácidos con grupos R no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina; 2) aminoácidos con grupos R polares no cargados: glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina; 3) aminoácidos con grupos R polares cargados (cargados de manera negativa a pH 6,0): ácido aspártico, ácido glutámico; 4) aminoácidos básicos (cargados de manera positiva a pH 6,0): lisina, arginina, histidina (a pH 6,0). Otro agrupamiento puede ser aquellos aminoácidos con grupos fenilo: fenilalanina, triptófano y tirosina.
En determinadas realizaciones, el espaciador se deriva de una IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 que incluye uno o más residuos de aminoácido sustituidos con un residuo de aminoácido diferente del que está presente en un espaciador no modificado. El uno o más residuos de aminoácido sustituidos se seleccionan de, pero no se limitan a, uno o más residuos de aminoácido en las posiciones 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339, o una combinación de los mismos. En este esquema de numeración, descrito en mayor detalle más adelante, el primer aminoácido en el espaciador de IgG4(L235E,N297Q) en la tabla 1 es 219 y el primer aminoácido en el espaciador IgG4(HL-CH3) en la tabla 1 es 219 ya que es el primer aminoácido en la secuencia bisagra de IgG y la secuencia de ligador bisagra de IgG4 (HL) en la tabla 1
En algunas realizaciones, el espaciador modificado se deriva de una IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 que incluye, pero no se limita a, una o más de las siguientes sustituciones de residuo de aminoácido: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, E233P, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, K290E, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, T299A, Y300L, V305I, V309L, E318A, K326A, K326W, K326E, L328F, A330L, A330S, A331S, P331S, I332E, E333A, E333S, E333S, K334A, A339D, A339Q, P396L, o una combinación de las mismas.
En determinadas realizaciones, el espaciador modificado se deriva de la región IgG4 que incluye uno o más residuos de aminoácido sustituidos con un residuo de aminoácido diferentes del que está presente en una región no modificada. El uno o más residuos de aminoácido sustituidos se seleccionan de, pero no se limitan a, uno o más residuos de aminoácido en las posiciones 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331,332, 333, 334, 336, 339, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el espaciador modificado se deriva de una región IgG4 que incluye, pero no se limita a, una o más de las siguientes sustituciones de residuo de aminoácido: 220S, 226S, 228P, 229S, 230S, 233P, 234A, 234V, 234F, 234A, 235A, 235E, 236A, 237A, 238S, 239D, 243L, 2471, 267E, 268Q, 280H, 290S, 290E, 290N, 292P, 297A, 297Q, 298A, 298G, 298D, 298V, 299A, 300L, 3051, 309L, 318A, 326A, 326W, 326E, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332E, 333A, 333S, 333S, 334A, 339D, 339Q, 396L, o una combinación de las mismas, estando sustituido el aminoácido en el espaciador no modificado con los aminoácidos identificados anteriormente en la posición indicada.
Para las posiciones de aminoácido en inmunoglobulina discutidas en el presente documento, la numeración es según el índice EU o el esquema de numeración EU (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda). El índice EU o índice EU según Kabat o esquema de numeración EU se refiere a la numeración del anticuerpo EU (Edelman et al. 1969 Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85).
La tabla 2 incluye ejemplos de dominios transmembrana adecuados. El dominio transmembrana está ubicado de manera carboxilo-terminal con respecto al dominio de espaciador.
Tabla 2: Ejemplos de dominios transmembrana
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El CAR descrito en el presente documento incluye uno o más (por ejemplo, dos) dominios coestimuladores. El/Los dominio(s) coestimulador(es) está(n) ubicado(s) entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización CD3Z.
La tabla 3 incluye ejemplos de dominios coestimuladores adecuados junto con la secuencia del dominio de señalización CD3Z.
Tabla 3: Dominio CD3Z y ejemplos de dominios coestimuladores
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Entre los CAR que comprenden clorotoxina descritos en el presente documento están los resumidos en la tabla 4, en la que se indican el dominio de espaciador, el dominio transmembrana y el/los dominio(s) coestimulador(es) para cada CAR.
Tabla 4: Ejemplos de CAR que comprenden clorotoxina
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DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1A-C: Generación de células T que expresan CLTX-CAR. (A) Esquema del constructivo lentiviral que codifica para el casete de receptor de antígeno quimérico (CAR) redirigido por clorotoxina (CLTX), dirigiéndose la transcripción del CLTX-CAR, así como el salto ribosómico T2A y las secuencias CD19 truncadas (CD19t) mediante el promotor EF1 (EF1p). (B) Diagrama del CLTX-CAR, que contiene los dominios de espaciador de IgG4Fc (EQ) y de péptido de clorotoxina de 36 aminoácidos extracelulares, el dominio transmembrana CD28 y las secuencias de dominios de señalización citoplasmáticos CD28 y CD3Z intracelulares. (C) Análisis de citometría de flujo de células T donadoras sanas (HD187.2 Tcm/scm/n) modificadas mediante ingeniería para expresar el CLTX-CAR. Se muestra tinción anti-CD19, anti-Fc y anti-CD8, que representa la expresión conjunta de los transgenes CLTX-CAR y CD19t en subconjuntos de células T tanto CD8+ como CD4+ (CD8‘). Se muestra que los porcentajes de células inmunorreactivas para células transducidas (CLTX-CAR) y células no transducidas (simuladas) 18 días tras la estimulación por perlas de CD3/CD28 demuestran la capacidad de transducir células T humanas con CLTX-CAR.
Figura 2A-F: Las células T CLTX-CAR reconocen específicamente la línea celular de glioblastoma U251T. (A-E) CLTX se une a células GBM y muestra una unión mínima a células no GBM. Se muestra la evaluación de la unión de Cy5.5 conjugada con clorotoxina (CLTX-Cy5.5) a A, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas derivadas de un donante sano; B, una línea celular linfoblástica transformada con EBV humana, LCL; C, la línea de riñón embrionario humano transformada con antígeno T grande 293T; D, astrocitos humanos diferenciados de células madre pluripotentes inducidas derivadas de un donante sano (iPSC); y E, la línea celular de glioblastoma humano U251T. Las líneas celulares se cultivaron en medios (sin tratar) o medios que contenían 1 pM de CLTX-Cy5.5 durante 1 h a 37°C y entonces se evaluaron mediante citometría de flujo. (F) Destrucción específica de la línea tumoral de glioma U251T mediante células T CLTX-CAR, pero no LCL, 293T o astrocitos humanos primarios. Se representan gráficamente los números de células diana viables (LCL, 293T, astrocitos y U251T) cultivadas conjuntamente con células T CLTX-CAR durante 72 h, a una relación de efector:diana = 1:1 (15.000 células T, 15.000 células diana), tras normalizar con respecto a aquellas cultivadas conjuntamente con células T simuladas durante la misma duración de tiempo. **: p < 0,01; ns: no específico, prueba de la t de Student realizada entre grupos tal como se indica en la figura.
Figura 3A-B: La unión de CLTX a múltiples líneas de tumor cerebral primario (PBT) humano de pase bajo es independiente de la expresión de IL13Ra2. Análisis de citometría de flujo de (A) cuatro líneas celulares IL13Ra2-bajo y (B) cuatro IL13Ra2-alto cultivadas en medios que contienen 1 pM de CLTX-Cy5.5 durante 1 h, y entonces se tiñó con anticuerpo IL13Ra2 conjugado con PE.
Figura 4A-B: El reconocimiento de células T CLTX-CAR y la destrucción de líneas de glioblastoma humano PBT de pase bajo es independiente de la expresión de IL13Ra2. (A) Las células T CLTX-CAR muestran una destrucción estadísticamente significativa de un panel de líneas GBM primarias frente a la línea de riñón embrionario 293T. Se representan gráficamente los números de células diana viables cultivadas conjuntamente con células T CLTX-CAR durante 24, 48 y 72 h, a una relación de efector:diana = 1:1 (15.000 células T, 15.000 células diana), tras normalizar con respecto a aquellas cultivadas conjuntamente con células T simuladas durante la misma duración de tiempo. ***: p < 0,001, prueba de la t de Student realizada entre la viabilidad de células PBT y la viabilidad de células 293T. (B) Eliminación de células tumorales PBT003-4 y PBT009 mediante células T CLTX-CAR, en comparación con el control simulado, observado con obtención de imágenes de células vivas. Imágenes representativas de células PBT003-4 y PBT009 cultivadas conjuntamente con células T simuladas o CLTX-CAR, a una relación de efector:diana = 1:4 (4.000 células T, 16.000 células diana), tomadas mediante microscopía de campo luminoso inmediatamente después del cultivo conjunto (0 h) y tras 3 días de cultivo conjunto (72 h).
Figura 5A-B: Activación de células T CLTX-CAR tras estimular con células GBM. Las células T se estimularon mediante células diana durante 5 h a una relación de efector:diana = 1:1 (25.000 células T, 25.000 células diana) en presencia de inhibidor de transporte de proteína. El porcentaje de células T CAR que experimentan desgranulación se determinó usando citometría de flujo mediante inmunorreactividad de CD107a (A ), y producción de citocina detectada mediante tinción intracelular (B). **: p < 0,01; ***: p < 0,001, ANOVA de una vía con corrección de Sidak-Bonferroni que compara la desgranulación/secreción de citocina en cada una de las células T estimuladas con PBT con células T estimuladas con células 293T.
Figura 6A-C: Efecto antitumoral de células T CLTX-CAR con diferentes diseños de ligador. (A ) Diagrama esquemático de constructos CLTX-CAR que difieren en los ligadores, incluyendo IgG4Fc (EQ), IgG4(HL-CH3), CD8h y ligador corto (L) (dominio transmembrana no representado). (B) Las células T CLTX-c A r con diferentes ligadores son capaces de destruir células GBM U251T. Se representan gráficamente los números de células U251T viable cultivadas conjuntamente con células T que albergan diferentes constructos redirigidos por CLTX durante 24, 48 y 72 h, a una relación de efector:diana = 1:1 (15.000 células T, 15.000 células diana), tras normalizar con respecto a aquellas cultivadas conjuntamente con células T simuladas durante la misma duración de tiempo. (C) Las células T CLTX-CAR con diferentes ligadores muestran niveles de producción de citocina diferenciales tras la exposición a antígeno. Las células T modificadas mediante ingeniería con diferentes constructos redirigidos por CLTX se estimularon con células U251T a una relación de efector:diana = 1:1 (20.000 células T, 20.000 células diana). La secreción de IFN-y se detectó mediante el ensayo ELISA del sobrenadante. *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001, análisis ANOVA de una vía con corrección de Sidak-Bonferroni que compara las células T CAR y las células T simuladas indicadas.
Figura 7A-C: Efecto antitumoral de células T CLTX-CAR con diferentes dominios de señalización intracelulares. (A) Diagrama esquemático de constructos de CLTX-CAR que difieren en los dominios coestimuladores intracelulares CD28 y 41BB. (B) Las células T CLTX-CAR con diferentes dominios coestimuladores son capaces de destruir células GBM U251T. Se representan gráficamente los números de células U251T viables cultivadas conjuntamente con células T que albergan diferentes constructos redirigidos por CLTX durante 24, 48 y 72 h, a una relación de efector:diana = 1:1 (15.000 células T, 15.000 células diana), tras normalizar con respecto a aquellas cultivadas conjuntamente con células T simuladas durante la misma duración de tiempo. (C) Las células T CLTX-CAR con diferentes dominios coestimuladores producen diversos niveles de citocinas tras la exposición a tumor. Las células T modificadas mediante ingeniería con diferentes constructos redirigidos por CLTX se estimularon con células U251T a una relación de efector:diana = 1:1 (20.000 células T, 20.000 células diana). La secreción de IFN-y se detectó mediante en ensayo ELISA del sobrenadante. **: p < 0,01; ***: p < 0,001, análisis ANOVA de una vía con corrección de Sidak-Bonferroni que compara las células T CAR y células T simuladas indicadas.
Figura 8A-B: Las células T CLTX-CAR reducen el crecimiento de tumores GBM U251T establecidos in vivo.
(A ) Esquema que muestra el crecimiento de xenoinjerto de U251T y el tratamiento con células T en ratones NSG. Los ratones con células U251T injertadas de manera subcutánea (día -14 a día 0) se trataron con PBS (tumor solo), células T simuladas o células T CLTX-CAR. (B) La progresión del tumor se inhibe mediante el tratamiento con células T CLTX-CAR. Crecimiento de tumor, determinado a través de medición de calibre, a lo largo de 20 días desde el momento de inyección de células T (día 0 a día 20). ***: p < 0,001, análisis ANOVA de una vía con corrección de Sidak-Bonferroni realizado para datos en el día 20 tras la inyección de células T, que compara volúmenes tumorales en ratones tratados con CLTX-CAR con los grupos de tumor solo o tratado de manera simulada.
La Figura 9 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(EQ)-CD28tm-CD28-zeta (SEQ ID NO:26).
La Figura 10 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(HL-CH3)-CD28tm - CD28-zeta(SEQ ID NO:27).
La Figura 11 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-CD8h-CD28tm-CD28-zeta (SEQ ID NO:28). La Figura 12 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(bisagra)-CD28tm - CD28-zeta (SEQ ID NO:29).
La Figura 13 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-L--CD28tm-CD28-zeta (SEQ ID NO:30).
La Figura 14 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(EQ)-CD28-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:31).
La Figura 15 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(HL-CH3)-CD28tm - CD28-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:32).
La Figura 16 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-CD8h-CD28tm-CD28-4-1 BB-zeta (SEQ ID NO:33).
La Figura 17 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(bisagra)-CD28tm-CD28-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:34).
La Figura 18 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-L-CD28tm-CD28-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:35).
La Figura 19 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(EQ)-CD28tm-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:36).
La Figura 20 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(HL-CH3)-CD4tm-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:37).
La Figura 21 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-CD8h-CD28tm-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:38). La Figura 22 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4(bisagra)-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:39). La Figura 23 representa la secuencia de aminoácidos de CLTX-L-CD28tm-4-1BB-zeta (SEQ ID NO:40).
La Figura 24 representa el CAR de la Figura 21 con una secuencia de salto ribosómico T2A y una CD19 truncada. La CD19 truncada se expresa conjuntamente con CAR, permitiendo una manera simple en la que identificar y cuantificar las células transfectadas.
La Figura 25 representa diversas toxinas relacionadas con clorotoxina y una alineación de sus secuencias de aminoácidos (Dardevet et al. 2015 Toxins (Basel) 7:1079).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A continuación, se describe la estructura, la construcción y la caracterización de diversos receptores de antígeno quiméricos que comprenden clorotoxina (CLTX). Un antígeno quimérico (CAR) es una biomolécula recombinante que contiene, como mínimo, un dominio de reconocimiento extracelular, una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular. Por tanto, el término “antígeno” no se limita a moléculas que se unen a anticuerpos, sino a cualquier molécula que pueda unirse específicamente a una diana. Por ejemplo, un CAR puede incluir un ligando que se une específicamente a un receptor de superficie celular. El dominio de reconocimiento extracelular (también denominado dominio extracelular o simplemente mediante el elemento de reconocimiento que contiene) comprende un elemento de reconocimiento que se une específicamente a una molécula presente en la superficie celular de una célula diana. La región transmembrana ancla el CAR en la membrana. El dominio de señalización intracelular comprende el dominio de señalización de la cadena zeta del complejo CD3 humano y opcionalmente comprende uno o más dominios de señalización coestimuladores. Los CAR pueden tanto unirse a antígeno como transducir la activación de células T, independientemente de la restricción de MHC. Por tanto, los CAR son inmunorreceptores “universales” que pueden tratar a una población de pacientes con tumores positivos para antígeno independientemente de su genotipo de HLA. La inmunoterapia adoptiva que usa linfocitos T que expresan un CAR específico de tumor puede ser una estrategia terapéutica potente para el tratamiento del cáncer.
Un CAR que comprende clorotoxina descrito en el presente documento se denomina CLTX-IgG4(EQ)-CD28gg-Zeta. Este CAR incluye una variedad de características importantes que incluyen: clorotoxina; una región Fc de IgG4 que está mutada en dos sitios dentro de la región CH2 (L235E; N297Q) de una manera que reduce la unión mediante receptores Fc (FcRs); dominio, un dominio coestimulador CD28, y dominio de activación CD3Z
En algunos casos, el CAR descrito en el presente documento puede producirse usando un vector en el que el marco de lectura abierto de CAR va seguido de una secuencia de salto ribosómico T2A y una CD19 truncada (CD19t), que carece de la cola de señalización citoplasmática (truncada en el aminoácido 323). En esta disposición, la expresión conjunta de CD19t proporciona un marcador superficial no inmunogénico, inerte, que permite una medición precisa de células modificadas con genes, y posibilita la selección positiva de células modificadas con genes, así como el seguimiento celular eficiente y/o la obtención de imágenes de las células T terapéuticas in vivo tras una transferencia adoptiva. La expresión conjunta de CD19t proporciona un marcador para la selección como diana inmunológica de las células transducidas in vivo usando anticuerpos clínicamente disponibles y/o reactivos de inmunotoxina para delecionar de manera selectiva las células terapéuticas, y de ese modo funcionar como interruptor de suicidio.
El CAR descrito en el presente documento puede producirse mediante cualquier medio conocido en la técnica, aunque preferiblemente se produce usando técnicas de ADN recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican para las varias regiones del receptor quimérico pueden prepararse y ensamblarse en una secuencia codificante completa mediante técnicas estándar de clonación molecular conocidas en la técnica (examen de bibliotecas genómicas, PCR, ligación asistida por cebador, mutagénesis dirigida al sitio, etc.) como sea conveniente. La región codificante resultante se inserta preferiblemente en un vector de expresión y se usa para transformar una línea de células huésped de expresión adecuada, preferiblemente una línea celular de linfocitos T y lo más preferiblemente una línea celular de linfocitos T autólogos.
Diversos subconjuntos de células T aislados del paciente, que incluyen subconjuntos de PBMC no seleccionadas o células T CD3 enriquecidas o células T CD3 o de memoria enriquecidas o Tcm o Tcm/scm/n pueden transducirse con un vector para la expresión de CAR. Las células T de memoria central son un subconjunto de células T útil. La célula T de memoria central puede aislarse a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) enriqueciendo para células CD45RO+/CD62L+, usando, por ejemplo, el dispositivo CliniMACS® para seleccionar de manera inmunomagnética células que expresan los receptores deseados. Las células enriquecidas para células T de memoria central pueden activarse con anti-CD3/CD28, transducirse con, por ejemplo, un vector lentiviral SIN que dirige la expresión del CAR así como una CD19 humana truncada (CD19t), un marcador superficial no inmunogénico para tanto la detección in vivo como la selección ex vivo potencial. Las células T de memoria central activadas/modificadas genéticamente pueden expandirse in vitro con IL-2/IL-15 y entonces criopreservarse.
Ejemplo 1: Construcción y estructura de CAR CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta
La estructura de un CAR útil que comprende clorotoxina, CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta, se describe a continuación. La secuencia de CAR optimizada por codón incluye: clorotoxina, un espaciador Fc de IgG4 que contiene mutaciones (S228P, L235E) que reducen enormemente el reconocimiento mediado por receptor Fc, un dominio transmembrana CD28, una dominio de señalización citoplasmático CD28 coestimulador y un dominio de señalización citoplasmático CD3Z. Una secuencia de salto ribosómico T2A separa esta secuencia CAR de CD19t, un marcador de detección/selección de superficie celular no inmunogénico, inerte. Este ligamiento de T2A da como resultado la expresión coordinada de tanto CAR como CD19t a partir de un único transcrito. La Figura 1A es un dibujo esquemático del marco de lectura abierto de CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta-T2ACD19t. En este dibujo, el CAR CLTX-IgG4Fc(EQ) CD28-zeta, así como las secuencias de salto ribosómico T2A y CD19 truncada se indican todas. La expresión del casete de CAR y CD19t se dirige mediante el promotor EF1 humano (EF1p). La Figura 1B representa esquemáticamente el CAR maduro, expresado.
La secuencia CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta se generó mediante la fusión de la clorotoxina de péptido líder de receptor alfa GM-CSF humana, bisagra Fc de IgG4 modificada con S228P/L235E/N297Q (donde la mutación doble L235E/N297Q interfiere con el reconocimiento de FcR), secuencias transmembrana CD28, de dominio de señalización citoplasmático CD28 y de dominio de señalización citoplasmático CD3Z. Esta secuencia se sintetizó de novo tras la optimización de codones. La secuencia T2A se obtuvo a partir de la digestión de un plásmido que contiene T2A. La secuencia CD19t se obtuvo a partir de la que abarca desde la secuencia de péptido líder hasta los componentes transmembrana (es decir, pares de bases 1-972) de un plásmido que contiene CD19. Los tres fragmentos, 1) CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta, 2) T2A, y 3) CD19t, se clonaron en el sitio de clonación múltiple del vector lentiviral epHIV7. Cuando se transfecta a células apropiadas, el vector se integra en el genoma de las células huésped. La secuencia de aminoácidos de CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta se presenta en la Figura 9 con los diversos dominios indicados. l
Ejemplo 2: Construcción y estructura de epHIV7 usado para la expresión de CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta
El plásmido pHIV7 es el plásmido parental a partir del que se derivó el vector clínico CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta-T2A-CD19t_epHIV7 en el T cell Therapeutics Research Laboratory (TCTRL) en City of Hope (COH). El vector epHIV7 usado para la expresión del CAR se produjo a partir del vector pHIV7. De manera importante, este vector usa el promotor EF1 humano para dirigir la expresión del CAR. Las secuencias tanto 5' como 3' del vector se derivaron de pv653RSN tal como se derivó previamente del provirus HXBc2. Las secuencias de ADN solapado de tracto de polipurina (cPPT) se derivaron de la cepa de VIH-1 pNL4-3 del NIH AIDS Reagent Repository. La secuencia del elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE) se describió previamente.
La construcción de pHIV7 se llevó a cabo tal como sigue. Resumiendo, pv653RSN, que contiene 653 pb de repeticiones terminales largas (LTR) 5' y 3' gag-pol plus con un gen SL3-neomicina fosfotransferasa interviniente (Neo), se subclonó en pBluescript, tal como sigue: en la etapa 1, las secuencias de LTR 5' con respecto al elemento de respuesta rev (RRE) hicieron p5'HIV-1 51, y entonces la LTR 5' se modificó eliminando las secuencias en el sentido de 5' de la caja TATA, y se ligó en primer lugar a un potenciador CMV y entonces al origen de replicación SV40 (p5'HIV-2). En la etapa 2, tras clonar la LTR 3' en pBluescript para hacer p3'HIV-1, se hizo una deleción de 400 pb en el potenciador/promotor de LTR 3' para eliminar elementos reguladores cis en HIV U3 y formar p3'HIV-2. En la etapa 3, los fragmentos aislados de p5'HIV-3 y p3'HIV-2 se ligaron para hacer pHIV-3. En la etapa 4, el p3'HIV-2 se modificó adicionalmente eliminando secuencias de HIV en el sentido de 5' adicionales para generar p3'HIV-3 y se añadió un fragmento BamHI-SalI de 600 pb que contiene WPRE a p3'HIV-3 para hacer el p3'HIV-4. En la etapa 5, se redujo el tamaño de pHIV-3 RRE mediante PCR y se ligó a un fragmento 5' de pHIV-3 (no mostrado) y al p3'HIV-4, para hacer pHIV-6. En la etapa 6, se amplificó un fragmento BglII-BamHI de 190 pb que contiene la secuencia de ADN solapado cPPT de HIV-1 pNL4-3 (55) a partir de pNL4-3 y se colocó entre las secuencias RRE y WPRE en pHIV6 para hacer pHIV-7. Este plásmido parental pHIV7-GFP (GFP, proteína fluorescente verde) se usó para empaquetar el vector parental usando un sistema de cuatro plásmidos.
Se requiere una señal de empaquetamiento, psi (y ), para el empaquetado eficiente de genoma viral en el vector. La RRE y WPRE potencian el transporte de transcrito de ARN y la expresión del transgén. Se he demostrado que la secuencia solapada, en combinación con WPRE, potencia la eficiencia de transducción de vector lentiviral en células de mamífero.
Las funciones auxiliares, requeridas para la producción del vector viral), se dividen en tres plásmidos independientes para reducir la probabilidad de generación de lentivirus competente para la replicación a través de recombinación: 1) pCgp codifica para la proteína gag/pol requerida para el ensamblaje de vector viral; 2) pCMV-Rev2 codifica para la proteína Rev, que actúa sobre la secuencia RRE para ayudar en el transporte del genoma viral para un empaquetado eficiente; y 3) pCMV-G codifica para la glicoproteína del virus estomatitis vesicular (VSV), que se requiere para la infectividad del vector viral.
Hay una homología de secuencia de ADN mínima entre el genoma de vector codificado por pHIV7 y los plásmidos auxiliares. Las regiones de homología incluyen una región señal de empaquetamiento de aproximadamente 600 nucleótidos, ubicada en la secuencia gag/pol del plásmido auxiliar pCgp; una secuencia promotora CMV en los tres plásmidos auxiliares; y una secuencia RRE en el plásmido auxiliar pCgp. Es altamente improbable que el virus recombinante competente para la replicación pueda generarse debido a la homología en estas regiones, ya que requeriría múltiples eventos de recombinación. Adicionalmente, cualquier recombinante resultante carecería de las secuencias tat y LTR funcionales requeridas para la replicación lentiviral.
El promotor CMV se reemplazó por el promotor EF1a-HTLV (EF1p), y el nuevo plásmido se denominó epHIV7. El EFlp tiene 563 pb y se introdujo en epHIV7 usando NruI y NheI, después de escindir el promotor CMV.
El genoma lentiviral, excluyendo gag/pol y rev que son necesarias para la patogenicidad del virus de tipo silvestre y se requieren para una infección productiva de células diana, se ha eliminado de este sistema. Además, el constructo de vector CLTX-IgG4Fc(EQ)-CD28-zeta-T2ACD19t_epHIV7 no contiene un promotor LTR 3' intacto, de modo que el genoma proviral de ADN transcrito de manera inversa y expresado resultante en células seleccionadas como diana tendrá lTr inactivas. Como resultado de este diseño, no se transcribirá ninguna secuencia derivada de HIV-I desde el provirus y solo se expresarán las secuencias terapéuticas a partir de sus respectivos promotores. Se espera que la eliminación de la actividad de promotor LTR en el vector SIN reduzca significativamente la posibilidad de una activación no intencionada de genes huésped.
Ejemplo 3: Producción de vectores para la transducción de células T del paciente
Vectores para la transducción de células T del paciente pueden prepararse tal como sigue. Para cada plásmido (es decir, 1) el plásmido que expresa el CAR y, opcionalmente, un marcador tal como CD19 truncada; 2) pCgp; 3) pCMV-G; y 4) pCMV-Rev2), se genera un banco de semillas, que se usa para inocular el fermentador para producir cantidades suficientes de ADN de plásmido. El ADN de plásmido se somete a prueba para la identidad, esterilidad y endotoxina antes de su uso en la producción del vector lentiviral.
Resumiendo, las células se expanden a partir de la célula de trabajo 293T (WCB), que se ha sometido a prueba para confirmar la esterilidad y la ausencia de contaminación viral. Se descongela un vial de células 293T de la WCB 293T. Se hacen crecer las células y se expanden hasta que existen números suficientes de células para sembrar en placa un número apropiado de fábricas celulares (CF) de 10 capas para la producción del vector y el mantenimiento del tren celular. Puede usarse un único tren de células para la producción.
El vector lentiviral se produce en sublotes de hasta 10 CF. Pueden producirse dos sublotes en la misma semana conduciendo a la producción de aproximadamente 20 l de sobrenadante lentiviral/semana. El material producido de todos los sublotes se reúne durante la fase de procesamiento aguas abajo, con el fin de producir un lote de producto. Se siembran en placa células 293T en CF en medio 293T (DMEM con el 10% de FBS). Las fábricas se colocan en un incubador a 37°C y se nivelan horizontalmente con el fin de obtener una distribución uniforme de las células en todas las capas de las CF. Dos días después, las células se transfectan con los cuatro plásmidos lentivirales descritos anteriormente usando el método de CaPÜ4, que implica una mezcla de Tris:EDTA, CaCl22 M, 2X HBS y los cuatro plásmidos de ADN. El día 3 tras la transfección, el sobrenadante que contiene vectores lentivirales secretados se recoge, purifica y concentra. Tras retirar el sobrenadante de las CF, se recogen las células de final de producción de cada CF. Las células se tripsinizan de cada fábrica y se recogen mediante centrifugación. Las células se resuspenden en medio de congelación y se criopreservan. Estas células se usan posteriormente para pruebas de lentivirus competente para la replicación (RCL).
Para purificar y formular vectores brutos, el sobrenadante se clarifica mediante filtración por membrana para eliminar el residuo celular. El ADN de célula huésped y el ADN de plásmido residual se degradan mediante digestión por endonucleasa (Benzonase®). El sobrenadante viral se clarifica de residuo celular usando un filtro de 0,45 pm. El sobrenadante clarificado se recoge en un recipiente pesado previamente al que se añade la Benzonase® (concentración final 50 U/ml). La digestión por endonucleasa para a Dn de plásmido residual y ADN genómico huésped se realiza a 37°C durante 6 h. La concentración de ultrafiltración por flujo tangencial (TFF) inicial del sobrenadante tratado con endonucleasa se usa para eliminar los componentes de bajo peso molecular residuales del sobrenadante bruto, al tiempo que se concentra el virus ~20 veces. El sobrenadante viral tratado con endonucleasa clarificado se hace circular a través de un cartucho de fibras huecas con un NMWCO de 500 kD a una tasa de flujo diseñada para mantener una tasa de cizallamiento a -4.000 s_1 o menos, al tiempo que se maximiza la tasa de flujo. Se inicia la diafiltración del sobrenadante tratado con nucleasa durante el proceso de concentración para sustentar el rendimiento del cartucho. Se establece una tasa de reemplazo de permeado del 80%, usando lactosa al 4% en PBS como tampón de diafiltración. El sobrenadante viral se lleva hasta el volumen diana, que representa una concentración de 20 veces del sobrenadante bruto, y se continúa con la diafiltración para 4 volúmenes de intercambio adicionales, con la tasa de reemplazo de permeado al 100%.
Se lleva a cabo una concentración adicional del producto viral usando una técnica de centrifugación a alta velocidad. Cada sublote del lentivirus se hace sedimentar usando una centrífuga Sorvall RC-26 plus a 6000 rpm (6.088 RCF) a 6°C durante 16-20 h. El sedimento viral de cada sublote se reconstituye entonces en un volumen de 50 ml con lactosa al 4% en PBS. El sedimento reconstituido en este tampón representa la formulación final para la preparación de virus. Todo el proceso de concentración de vector da como resultado una reducción de volumen de 200 veces, aproximadamente. Tras completar todos los sublotes, el material se pone entonces a -80°C, al tiempo que muestras de cada sublote se someten a prueba para la esterilidad. Tras la confirmación de la esterilidad de la muestra, los sublotes se descongelan rápidamente a 37°C con agitación frecuente. El material se reúne entonces y se toman alícuotas manualmente en la cabina de bioseguridad de clase II tipo A/B3. Se usa una configuración de llenado de 1 ml del lentivirus concentrado en crioviales de junta tórica roscados externamente, USP clase 6, estériles.
Para garantizar la pureza de la preparación de vector lentiviral, se somete a prueba para contaminantes de ADN huésped residuales, y la transferencia de ADN huésped y de plásmido residual. Entre otras pruebas, la identidad de vector se evalúa mediante RT-PCR para garantizar que está presente el vector correcto.
Ejemplo 4: Preparación de células T adecuadas para su uso en ACT
Si deben usarse Tcm para expresar el CAR, pueden prepararse células de paciente adecuadas tal como sigue. En primer lugar, se obtienen linfocitos T de un paciente mediante leucoféresis, y el subconjunto de células T alogénicas o autólogas apropiadas, por ejemplo, células T de memoria central (Tcm), se alteran genéticamente para expresar el CAR, entonces se administran de vuelta al paciente mediante cualquier medio clínicamente aceptable, para conseguir terapia anticancerígena.
Pueden generarse Tcm adecuadas tal como sigue. Productos de aféresis obtenidos de participantes en la investigación que han dado su consentimiento se extraen con Ficoll, se lavan y se incuban durante la noche. Las células se empobrecen entonces de poblaciones de células T reguladoras, monocíticas, y de células T vírgenes usando reactivos anti-CD 14, anti-CD25 y anti-CD45RA de calidad GMP (Miltenyi Biotec) y el dispositivo de separación CliniMACS™. Tras el empobrecimiento, las células de la fracción negativa se enriquecen para células Tcm CD62L+ usando DREG56-biotina (COH de calidad clínica) y microperlas de anti-biotina (Miltenyi Biotec) en el dispositivo de separación CliniMACSTM.
Tras el enriquecimiento, las células Tcm se formulan en X-Vivo15 complete más 50 IU/ml de IL-2 y 0,5 ng/ml de IL-15 y se transfieren a una bolsa de cultivo celular de Teflon, donde se estimulan con perlas Dynal ClinEx™ Vivo CD3/CD28. Hasta cinco días tras la estimulación, las células se transducen con vector lentiviral que expresa el CAR deseado a una multiplicidad de infección (MOI) de 1,0 a 0,3. Los cultivos se mantienen durante hasta 42 días con adición de X-Vivo15 completo y citocina IL-2 e IL-15 según se requiera para la expansión celular (manteniendo la densidad celular entre 3x105 y 2x106 células viables/ml, y suplementación de citocina cada lunes, miércoles y viernes de cultivo). Las células se expanden normalmente hasta aproximadamente 109 células en estas condiciones en el plazo de 21 días. Al final del periodo de cultivo, se recogen las células, se lavan dos veces y se formulan en medio de criopreservación de calidad clínica (Cryostore CS5, BioLife Solutions).
El/Los día(s) de infusión de células T, el producto criopreservado y liberado se descongela, se lava y se formula para su nueva infusión. Los viales criopreservados que contienen el producto celular liberado se retiran del almacenamiento en nitrógeno líquido, se descongelan, se enfrían y se lavan con un tampón de lavado de PBS/2% de albúmina sérica humana (HSA). Tras la centrifugación, el sobrenadante se retira y las células se resuspenden en un diluyente de infusión solución salina normal libre de conservante (PFNS)/2% de HSA. Se retiran las muestras para pruebas de control de calidad.
Ejemplo 5: Expresión de Cltx-IgG4(EQ)-CD28gg-Zeta
La Figura 1C representa los resultados de análisis de citometría de flujo de células T donadoras sanas (HD187.2 TCM/SCM/N) modificadas mediante ingeniería para expresar el CLTX-CAR. Se muestra tinción de anti-CD19, anti-Fc y anti-CD8, que representa la expresión conjunta de los transgenes CLTX-CAR y CD19t en subconjuntos de células T tanto CD8+ como CD4+ (CD8‘). Se muestran los porcentajes de células inmunorreactivas para células transducidas (CLTX-CAR) y células no transducidas (simuladas) 18 días después de la estimulación por perlas de CD3/CD28 para demostrar la capacidad de transducir células T humanas con CLTX-CAR.
Ejemplo 6: La clorotoxina y células T Cltx-IgG4(EQ)-CD28gg-Zeta reconocen específicamente la línea celular de glioma U251
Se usó clorotoxina conjugada con la etiqueta fluorescente, Cy5.5 (CLTX-Cy5.5) para evaluar la unión de clorotoxina a diversos tipos de células. Los resultados de este estudio se presentan en las Figuras 2A-E (A, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas derivadas de un donante sano; B, una línea celular linfoblástica transformada con EBV humana, LCL; C, la línea de riñón embrionario humano transformada con antígeno T grande 293T; D, astrocitos humanos diferenciados de células madre pluripotentes inducidas derivadas de un donante sano (iPSCs); y E, la línea celular de glioblastoma humano U251T). Las líneas celulares se cultivaron en medios (sin tratar) o medios que contenían 1 pM de CLTX-Cy5.5 durante 1 h a 37°C y entonces se evaluaron mediante citometría de flujo.
Como se muestra en la Figura 2F, las células T CLTX-CAR destruyen específicamente la línea tumoral de glioma U251T, pero no LCL, 293T o astrocitos humanos primarios. Se representan gráficamente los números de células diana viables (LCL, 293T, astrocitos y U251T) cultivadas conjuntamente con células T CLTX-CAR durante 72 h, a una relación de efector:diana = 1:1 (15.000 células T, 15.000 células diana), tras normalizar con respecto a aquellas cultivadas conjuntamente con células T simuladas durante la misma duración de tiempo.
Ejemplo 7: La clorotoxina se une a líneas de glioblastoma human PBT de pase bajo independientemente de la expresión de IL13Ra2
Para examinar si la unión de clorotoxina es independiente de la expresión de IL13Ra2, se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo de líneas celulares IL13RA2-bajo y líneas celulares IL13RA2-alto que se cultivaron en los medios que contenían 1 uM de CLTX-Cy5.5 durante 1h, y entonces se tiñó con anticuerpo ILl3Ra2 conjugado con PE. Como puede verse en la Figura 3A-B, la clorotoxina se une a líneas de glioblastoma humano PBT de pase bajo independientemente de la expresión de IL13Ra2.
Ejemplo 8: Las células T CLTX-IgG4(EQ)-CD28gg-Zeta reconocen y destruyen líneas de glioblastoma humano de PBT de pase bajo independientemente de la expresión de IL13Ra2 y el subtipo molecular TCGA.
Como se muestra en la Figura 4A, las células T CLTX-CAR muestran una destrucción estadísticamente significativa de un panel de líneas de GBM primarias frente a la línea de riñón embrionario 293T. Se representan gráficamente los números de células diana viables cultivadas conjuntamente con células T CLTX-CAR durante 24, 48 y 72 h, a una relación de efector:diana = 1:1 (15.000 células T, 15.000 células diana), tras normalizar con respecto a aquellas cultivadas conjuntamente con células T simuladas durante la misma duración de tiempo.
La Figura 4B muestra la eliminación de células tumorales PBT003-4 y PBT009 mediante CLTX las células T CLTX-CAR pueden células T -CAR, en comparación con el control simulador, observada con obtención de imágenes de células vivas. Imágenes representativas de células PBT003-4 y PBT009 cultivadas conjuntamente con células T simuladas o CLTX-CAR, a una relación de efector:diana = 1:4 (4.000 células T, 16.000 células diana), tomadas mediante microscopía de campo luminoso inmediatamente tras el cultivo conjunto (0 h) y tras 3 días de cultivo conjunto (72 h).
Ejemplo 9: Las células T CLTX-IgG4(EQ)-CD28gg-Zeta se activan mediante la estimulación con células GBM.
Se estimularon células T (simuladas o que expresan CAR CLTX) mediante células diana durante 5 h a una relación de efector:diana = 1:1 (25.000 células T, 25.000 células diana) en presencia de inhibidor de transporte de proteína. El porcentaje de células T CAR que experimentan desgranulación se determinó usando citometría de flujo mediante inmunorreactividad de CD107a (Figura 5A) y la producción de citocina se detectó mediante tinción intracelular (Figura 5B).
Ejemplo 10: Las células T CLTX-CAR con diferentes diseños de espaciador son efectivas frente a células tumorales.
La Figura 6A es un diagrama esquemático de constructos de CLTX-CAR que tienen diferentes espaciadores (ligadores), que incluyen IgG4Fc (EQ), IgG4(HL-CH3), CD8h y ligador corto (L). Todos tienen el dominio transmembrana CD28 (no representado). Como se muestra en la Figura 6B, las células T CLTX-CAR con diferentes ligadores son capaces de destruir las células GBM U251T. Se representan gráficamente los números de células U251T viables cultivadas conjuntamente con células T que albergan diferentes constructos redirigidos por CLTX durante 24, 48 y 72 h, a una relación de efector:diana = 1:1 (15.000 células T, 15.000 células diana), tras normalizar con respecto a aquellas cultivadas conjuntamente con células T simuladas durante la misma duración de tiempo. Como se muestra en la Figura 6C, las células T CLTX-CAR con diferentes ligadores muestran niveles de producción de citocina diferenciales tras la exposición a antígeno. Las células T modificadas mediante ingeniería con diferentes constructos redirigidos por CLTX se estimularon con células U251T a una relación de efector:diana = 1:1 (20.000 células T, 20.000 células diana). La secreción de IFN-y se detectó mediante el ensayo ELISA del sobrenadante.
Ejemplo 11: Efecto antitumoral de células T CLTX-CAR con diferentes dominios de señalización intracelulares.
La Figura 7A es un diagrama esquemático de constructos de CLTX-CAR que tienen diferentes dominios coestimuladores intracelulares CD28 y 41BB. Como se muestra en la Figura 7B, células T CLTX-CAR con diferentes dominios coestimuladores son capaces de destruir células GBM U251T. Se representan gráficamente los números de células U251T viables cultivadas conjuntamente con células T que albergan diferentes constructos redirigidos por CLTX durante 24, 48 y 72 h, a una relación de efector:diana = 1:1 (15.000 células T, 15.000 células diana), tras normalizar con respecto a aquellas cultivadas conjuntamente con células T simuladas durante la misma duración de tiempo. Como se muestra en la Figura 7C, células T CLTX-CAR con diferentes dominios coestimuladores producen diversos niveles de citocinas tras la exposición a tumor. Las células T modificadas mediante ingeniería con diferentes constructos redirigidos por CLTX se estimularon con células U251T a una relación de efector:diana = 1:1 (20.000 células T, 20.000 células diana). La secreción de IFN-y se detectó mediante el ensayo ELISA del sobrenadante.
Ejemplo 12: Las células T CLTX-CAR reducen el crecimiento de tumores GBM U251T establecidos in vivo.
La Figura 8A es una representación esquemática de un estudio del crecimiento de xenoinjerto de U251T y el tratamiento con células T en ratones NSG. Los ratones con células U251T injertadas de manera subcutánea (día -14 a día 0) se trataron con PBS (tumor solo), células T simuladas o células T CLTX-CAR. Figura 8B, la progresión del tumor se inhibe mediante el tratamiento con células T CLTX-CAR. El crecimiento de tumor, determinado a través de medición de calibre, a lo largo de 20 días desde el momento de inyección de células T (día 0 a día 20).
Ejemplo 13: CAR CLTX adicionales
Las Figuras 9-24 presentan las secuencias de aminoácidos de diversos CLTX-CAR adicionales que pueden construirse y expresarse tal como se describió anteriormente para el CAR CLTX-IgG4(EQ)-CD28gg-Zeta. En las Figuras 8-24 las diversas regiones (listadas bajo la secuencia en cada figura desde un extremo aminoterminal a carboxiloterminal) se indican mediante porciones subrayadas y porciones no subrayadas alternantes. Por tanto, en la Figura 9 el péptido señal GMCSFRa está subrayados, la secuencia de clorotoxina no está subrayada, el espaciador (IgG4(SmP)(L235E,N297Q)) está subrayado, la secuencia transmembrana CD28 no está subrayada, el dominio coestimulador CD28cyto (LLmGG) está subrayado, la secuencia (Gly)3 que separa el dominio coestimulador de la secuencia CD3 zeta no está subrayada y la secuencia CD3 zeta está subrayada. En las Figuras 9-23 las secuencias T2A y CD19t expresadas conjuntamente con el CAR no se muestran. La Figura 24 representa el CAR de la Figura 23 con una secuencia de salto ribosómico T2A y una CD19 truncada incluidas. La CD19 truncada se expresa conjuntamente con CAR, permitiendo una manera simple en la que identificar y cuantificar las células transfectadas.
Ejemplo 14: Secuencias de toxinas adicionales
La Figura 25 representa una alineación de secuencias de clorotoxina con diversas toxinas relacionadas con clorotoxina (Dardevet et al. 2015 Toxins (Basel) 7:1079). Estas toxinas pueden, en casos no según la invención, sustituirse por clorotoxina en el CAR descrito en el presente documento.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. - Una molécula de ácido nucleico que codifica para un receptor de antígeno quimérico, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico:
clorotoxina o variante de la misma que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido;
un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana CD4 o variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, un dominio transmembrana CD8 o variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, un dominio transmembrana CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, y un dominio transmembrana CD3Z o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido;
una región espaciadora ubicada entre la clorotoxina o variante de la misma y el dominio transmembrana;
un dominio coestimulador seleccionado de: un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1­ 5 modificaciones de aminoácido, un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido y un dominio coestimulador OX40 o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido; y
dominio de señalización CD3 Z o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, posibilitando la clorotoxina o variante de la misma que el receptor de antígeno quimérico, cuando se expresa en la superficie de una célula T, dirija la actividad de célula T a células de glioblastoma.
2. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, comprendiendo la variante de clorotoxina la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 con de 1 a 5 modificaciones de aminoácido.
3. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico dos dominios coestimuladores diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulador CD28 o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, un dominio coestimulador 4-1BB o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido y un dominio coestimulador OX40 o una variante del mismo que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido.
4. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, comprendiendo la región espaciadora 5-300 aminoácidos, o comprendiendo la región espaciadora una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2-12 o una variante de la misma que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido, o comprendiendo el espaciador una región bisagra de IgG, o comprendiendo el espaciador 10-50 aminoácidos.
5. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, comprendiendo el dominio coestimulador 4-1BB la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 o una variante de la misma que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido.
6. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, comprendiendo el dominio de señalización CD3Z la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7.
7. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, estando ubicado un ligador de 3 a 15 aminoácidos entre el dominio coestimulador y el dominio de señalización CD3Z o variante del mismo.
8. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, expresando la molécula de ácido nucleico un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26-55 o una variante de la misma que tiene 1-5 modificaciones de aminoácido.
9. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, siendo las 1-5 modificaciones de aminoácido 1 o 2 modificaciones de aminoácido.
10. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, siendo las 1-5 modificaciones de aminoácido 1-5 sustituciones de aminoácido.
11. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico dos o más clorotoxinas o variantes de la misma.
12. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico: clorotoxina;
un dominio transmembrana seleccionado de: un dominio transmembrana CD4, un dominio transmembrana CD8, un dominio transmembrana CD28 y un dominio transmembrana CD3Z;
una región espaciadora ubicada entre la clorotoxina y el dominio transmembrana;
un dominio coestimulador seleccionado de: un dominio coestimulador CD28, un dominio coestimulador 4-1BB y un dominio coestimulador OX40; y
dominio de señalización CD3 Z,
posibilitando la clorotoxina que el receptor de antígeno quimérico, cuando se expresa en la superficie de una célula T, dirija la actividad de célula T a células de glioblastoma.
13. - La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, expresando la molécula de ácido nucleico un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26-55.
14. - Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un receptor de antígeno quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs 26-55.
15. - Una población de células T humanas transducidas mediante un vector que comprende un casete de expresión que codifica para el receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
16. - La población de células T humanas según la reivindicación 15, estando compuestas las células T de una población de células T de memoria central.
17. - Una población de células T humanas autólogas o alogénicas para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un paciente, transduciéndose las células T mediante un vector que comprende un casete de expresión que codifica para el receptor de antígeno quimérico, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26-55.
18. - La población para su uso según la reivindicación 17, comprendiendo la población de células T humanas células T de memoria CD62L+, y/o siendo el cáncer glioblastoma, y/o habiéndose preparado las células T humanas transducidas mediante un método que comprende obtener células T del paciente, tratar las células T para aislar células T de memoria central y transducir al menos una porción de las células de memoria central con un vector viral que comprende un casete de expresión que codifica para el receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 26-55.
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