CN114014941B - 靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体、编码所述嵌合抗原受体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、以及经工程化以表达所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。本发明还涉及所述经工程化的免疫效应细胞的用途，用于治疗与表达IL13Rα2相关的疾病，例如，胶质瘤。

Description

靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体及其用途

技术领域

本发明总体上涉及靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体、经工程化以表达本发明的嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、以及所述经工程化的免疫效应细胞的用途，用于治疗与表达IL13Rα2相关的疾病。

背景技术

胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是世界范围内最常见、最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤之一，大多数病例恶性程度比较高。由于高发病率、高死亡率和低治愈率，GBM在世界范围内造成了巨大的社会和医疗负担，而且目前常规的治疗手段几乎无法治愈胶质母细胞瘤。即使采用最好的多模式治疗，患者的中位生存率也只有21个月左右，半个世纪以来，胶质母细胞瘤患者的总体生存率没有实质性的提高。对于大多数患者来说，治疗失败的主要原因是侵袭性耐药恶性细胞的复发。研究表明，肿瘤的持续生长和复发是由于未能产生有效的免疫反应。

因此，有必要开发在GBM患者体内能够产生有效的免疫反应的新疗法，以改善GBM患者的预后。

嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）是一种人工合成的分子，其通过特异性识别肿瘤细胞表面表达的抗原来引导经基因工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)清除肿瘤(Sampson JH, Choi BD, Sanchez-Perez L等人,EGFRvIIImCAR-modified T-cell therapy cures mice with establishedintracerebralglioma and generates host immunity against tumor-antigen loss.Clinical cancer research: an official journal of the American Association forCancer Research. 2014; 20(4):972-984)。例如，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是通过T细胞上的嵌合抗原受体(CAR)分子直接靶向肿瘤细胞的表面抗原，从而达到识别和杀伤肿瘤的目的，其中所述嵌合抗原受体的N端包含识别抗原的胞外域。当所述CAR-T细胞针对的抗原阳性细胞存在时，CAR-T细胞能识别并杀伤这些抗原阳性细胞。

CAR T细胞介导的CD19⁺恶性血液病的临床成功为CAR T细胞过继免疫治疗的发展提供了支持(Batlevi CL, Matsuki E, Brentjens RJ, Younes A. Novelimmunotherapies in lymphoid malignancies. Nature reviews. Clinical oncology.2016; 13(1):25-40)。研究发现，CD19-CAR T细胞可以降低脑转移性白血病的发病率(Abramson JS, McGree B, Noyes S等人, Anti-CD19 CAR T Cells in CNS DiffuseLarge-B-Cell Lymphoma. The New England journal of medicine. 2017; 377(8):783-784)。CAR T细胞可以通过趋化因子迁移到脑实质中，靶向并杀死肿瘤细胞(Hong JJ,Rosenberg SA, Dudley ME等人, Successful treatment of melanoma brainmetastases with adoptive cell therapy. Clinical cancer research: an officialjournal of the American Association for Cancer Research. 2010; 16(19):4892-4898)。然而，CAR T细胞在脑肿瘤治疗中的应用尚处于早期阶段。在实体瘤领域，CAR T细胞治疗效果并不理想，其原因与缺乏肿瘤特异性抗原、T细胞的存活及扩增不足、T细胞向肿瘤组织的迁移效率低和免疫抑制的肿瘤微环境等因素有关。

IL13Rα2是IL-13的受体多肽，几乎只在癌细胞中表达，在正常组织细胞中不表达（睾丸除外），在GBM患者中，有50%以上的患者表达IL13Rα2，使其成为CAR-T治疗GBM的有效靶点(Sharma P, Debinski W. Receptor-Targeted Glial Brain Tumor Therapies.International journal of molecular sciences. 2018; 19(11))。早期临床试验包括IL13Rα2疫苗治疗GBM(Iwami K, Shimato S, Ohno M等人, Peptide-pulsed dendriticcell vaccination targeting interleukin-13 receptor alpha2 chain in recurrentmalignant glioma patients with HLA-A*24/A*02 allele. Cytotherapy. 2012; 14(6):733-742)和第一代IL13ζCAR T细胞和第二代IL13BBζCAR T细胞治疗复发性胶质母细胞瘤，使IL13Rα2成为免疫治疗的一个有吸引力的靶点(Brown CE, Aguilar B, Starr R等人, Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cellsfor Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma. Molecular therapy :the journal of the American Society of Gene Therapy. 2018; 26(1):31-44)。

尽管CAR-T细胞治疗突破了抗原需要被MHC分子呈递的限制，且能够克服血脑屏障的障碍，已被证明是一种具有持久有效抗肿瘤活性的突破性治疗方法，但其在实体瘤中的副作用和低效性已逐渐成为一个挑战。

本领域仍然需要结构得到进一步优化的靶向IL13Rα2的CAR，以降低CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤的副作用并提高其疗效。

发明内容

嵌合抗原受体（CAR）修饰T（CAR-T）细胞治疗已被证明是一种有效的抗癌手段，但其副作用的发生，以及在实体瘤中的低效性逐渐成为一个挑战。为了提高CAR-T治疗的抗胶质母细胞瘤效果，本发明提供了多种针对IL13Rα2的第三代CAR T细胞，它们分别包含来自CD4、CD8或CD28的不同跨膜区，旨在通过优化CAR的跨膜结构域（TMD）来提高CAR-T的抗肿瘤效果。

因此，在第一方面，本发明提供了跨膜结构域不同的多种第三代IL13Rα特异性CAR多肽，其包含

(i) 人IL-13或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；

(ii) 跨膜结构域，其选自：CD4跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、CD8跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、CD28跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；

(iii) 共刺激结构域，其选自：(a)CD28共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、(b)4-1BB共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、(c)OX40共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、和所述(a)、(b)和／或(c)的任意组合；和

(iv) CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，

其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体多肽还包含在所述(ii)和所述(iii)之间的间隔区，例如，所述间隔区是IgG铰链区或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，IgG4铰链区或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，ESKYGPPCPSCP（SEQ ID NO:1）所示的IgG4铰链区，其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体多肽中的(i)是人IL-13或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，人IL-13的位置13上的氨基酸不是E，例如，人IL-13的位置13上的氨基酸是Y，也称为IL-13(E13Y) 或IL-13 E13Y，例如，所述(i)是SPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO:2)。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体多肽中的(ii)是CD4跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、或CD28跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代；例如，所述CD4跨膜结构域是MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF（SEQ ID NO:3）所示的序列；所述CD8跨膜结构域是IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（SEQ ID NO:4）所示的序列；所述CD28跨膜结构域是VWWWLVESWLVIACYYQWPLLFSG（SEQ ID NO:5）所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体多肽中的(iii)是(a)CD28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、(b)4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、(c)OX40共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、和所述(a)、(b)和／或(c)的任意组合，其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代；例如，所述(iii)是两个不同的共刺激结构域，例如，(a) CD28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体和(b)4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体的组合，例如，所述CD28共刺激结构域是SKRSRLLMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（SEQ ID NO:6）所示的序列，所述4-1BB共刺激结构域是AERNSCIYSNNHLCDQYKLLKRKMAVAADFQKKKKEDV（SEQ ID NO:7）所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体多肽中的(iv)是CD3ζ信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代；例如，所述CD3ζ信号传导结构域是RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAKDTYDALHMQALPPRYQPLE（SEQ IDNO:8）所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体多肽包含：

(i) 人IL-13或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，IL-13(E13Y)；

(ii) 跨膜结构域，其是CD4跨膜结构域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:3所示的CD4跨膜结构域；CD8跨膜结构域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:4所示的CD8跨膜结构域；或者CD28跨膜结构域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:5所示的CD28跨膜结构域；

(iii) 共刺激结构域，其是两个不同的共刺激结构域，例如，(a) CD28共刺激结构域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体和(b)4-1BB共刺激结构域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体的组合，例如，SEQ ID NO:6所示的CD28共刺激结构域和SEQ ID NO:7所示的4-1BB共刺激结构域的组合；和

(iv) CD3ζ信号传导结构域或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:8所示的CD3ζ信号传导结构域。

任选地，包含在所述(ii)和所述(iii)之间的间隔区，例如，IgG4铰链区或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:1所示的IgG4铰链区，

其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在第二方面，本发明提供了编码如本文所述的嵌合抗原受体（CAR多肽）的核酸、包含编码本文所述CAR多肽的核酸的载体、和包含本文所述CAR核酸分子或载体的细胞、或表达本文所述CAR多肽的细胞，优选地，所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。

在一个实施方案中，本发明采用人PBMC制备了原代CAR-T细胞。用本发明的CAR分子转导的CAR-T细胞具有体外效应功能，在体外具有持续杀伤靶细胞的活性。

用本发明的CAR分子转导的CAR-T细胞还具有体内杀伤肿瘤细胞的功能。在肿瘤细胞异种移植小鼠模型中，本发明的CAR-T细胞具有提高的抗肿瘤活性。

在第三方面，本发明提供了一种产生细胞、例如免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码本文所述CAR多肽的核酸分子(例如，RNA分子，例如mRNA分子)，或包含编码本文所述CAR多肽的核酸分子的载体引入(例如转导)免疫效应细胞。

在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞，例如，所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞、NK细胞后制备的。

在一些实施方案中，用逆转录病毒将本发明例示的三种CAR，即IL13-CD4-28BBζ、IL13-CD8-28BBζ或IL13-CD28-BBζ分别导入原代T细胞中，获得了本发明的CAR-T细胞。

用流式细胞术和实时细胞分析（RTCA）检测了本发明的CAR-T细胞的体外抗胶质瘤作用，并分别在表达较高IL13Rα2的U373细胞异种移植小鼠模型和在低表达IL13Rα2的U251细胞异种移植小鼠模型上验证了本发明的CAR-T细胞的体内抗胶质瘤功效。

本发明显示，用本发明例示的三种CAR转导的T细胞与表达较高IL13Rα2的U373细胞共培养时具有相似的抗肿瘤活性，但所述三种CAR转导的T细胞与低表达IL13Rα2的U251细胞共培养时，它们的抗肿瘤活性不同。本发明的三种CAR-T细胞均能被高表达IL13Rα2的U373细胞激活，但只有IL13-CD28BBζ CAR-T细胞能被U251细胞激活，且在与U251细胞共培养后，IFN-γ表达显著增加。另外，IL13-CD28BBζ型CAR-T细胞在异种移植小鼠模型中，能浸润肿瘤且表现出最好的抗肿瘤活性。

通过高通量测序，本发明筛选出与不同抗GBM活性相关的差异表达基因。IL13-CD28BBζ CAR-T细胞的优越抗肿瘤作用的部分原因是细胞外组装、细胞外基质、细胞迁移和粘附相关基因的差异表达，这些基因有助于降低其发挥活性所需的IL13Rα2阈值、增加CAR-T细胞增殖和提高CAR-T细胞的迁移能力。

在第四方面，本发明提供了本发明的表达CAR多肽的免疫效应细胞的用途，用于制备在受试者中预防或治疗肿瘤（例如癌症）或提供抗肿瘤免疫的药物，优选地，所述肿瘤为胶质瘤，更优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。

在第五方面，本发明提供了本发明的表达CAR多肽的免疫效应细胞的用途，用于在受试者中治疗与表达IL13Rα2相关的疾病，包括向受试者施用治疗有效量的表达CAR多肽的免疫效应细胞，其中所述与表达IL13Rα2相关的疾病是例如胶质瘤，优选地胶质母细胞瘤。

本发明提供了治疗患有与表达IL13Rα2相关的疾病的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的本发明的表达CAR多肽的免疫效应细胞，例如，其中与表达IL13Rα2相关的疾病是胶质瘤，优选地，是胶质母细胞瘤。

由此，本发明首次证实了表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞能够在体内外调节CAR-T细胞功能；证实了本发明的表达CAR多肽的免疫效应细胞适用于靶向治疗性靶点IL13Rα2来治疗胶质瘤，特别地治疗胶质母细胞瘤。

附图说明

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1：显示了三种CAR构建体的结构示意图，图中SD表示剪接供体（Splice donor）；SA表示剪接受体（splice acceptor）；LTR表示长末端重复序列（ long terminal repeat）；“TM”或“TMD”表示跨膜结构域(transmembrane domain)。在所述构建体中，胞外域包含能够特异性结合IL13Rα2的IL13或其变体。

图2：例示了CAR-T细胞的制备和评价流程图，其中，在第0天分离健康捐赠者外周血中的单个核细胞（PBMC）。用抗CD3/CD28 T细胞激活剂Dynabeads（Invitrogen）刺激PBMC中的T细胞。在第2天（即，刺激48小时后），用包含编码CAR的核苷酸序列的逆转录病毒上清液转染T细胞。在第7天，使用流式细胞术检测转染的T细胞中CAR表达阳性率。在第9-14天，收集细胞进行体外实验。

图3：显示了体外在含有5%人AB血清、100U/ml IL-2、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的X-VIVO-15培养基中培养CAR-T细胞后，CAR-T细胞的增殖能力。

图4：显示了体外与U251细胞共培养时，CAR-T细胞的增殖。

图5：显示了体外与U251细胞或U373细胞共培养时，CAR-T细胞的胞内IFN-γ的表达。

图6：显示了体外CAR-T细胞与U251细胞或U373细胞共培养时，通过流式细胞仪珠阵列（CBA）试剂盒（BD Biosciences）检测来自共培养细胞的上清液中人干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL17、 IL4、IL6和IL10的表达。

图7：显示了CAR-T细胞与U373-GL细胞和U251-GL细胞以不同的E:T比例共培养，24小时后加入荧光素酶底物，通过光学成像系统评估靶细胞在体外的存活。

图8：显示了实时细胞分析（RTCA）法检测的肿瘤细胞的细胞生长结果，体外评价了CAR-T细胞的抗肿瘤能力。

图9：显示了IL13Ra2在U251细胞系和U373细胞系表面的表达百分数，图中，U373-GL表示U373细胞系；U251-GL表示U251细胞系。

图10：显示了使用胶质瘤细胞系U373产生异种移植模型小鼠、以及注射CAR-T细胞和检测的方案。其中，在第1天（也简写为D1）向雌性NOD-SCID小鼠右脑纹状体注射2×10⁵个U373细胞。在第6天（D6）通过尾静脉注射3×10⁷个CAR-T细胞。

图11和图12：显示了注射CAR-T细胞后对U373-GL模型小鼠的肿瘤生长的抑制。

图13：显示了注射CAR-T细胞后U373-GL模型小鼠生存曲线。

图14：显示了注射CAR-T细胞后U373-GL模型小鼠中，CAR-T细胞对肿瘤组织的浸润。

图15：显示了使用胶质瘤细胞系U251产生异种移植模型小鼠、以及注射CAR-T细胞和检测的方案。其中，在第1天（也简写为D1）向雌性NOD-SCID小鼠右脑纹状体注射2×10⁵个U251细胞。在第6天（D6）通过尾静脉注射3×10⁷个CAR-T细胞。

图16和图17：显示了注射CAR-T细胞后对U251-GL模型小鼠的肿瘤生长的抑制。

图18：显示了注射CAR-T细胞后U251-GL模型小鼠生存曲线。

图19：显示了注射CAR-T细胞后U251-GL模型小鼠中，CAR-T细胞对肿瘤组织的浸润。

图20-图22：显示了三种CAR-T细胞的差异表达基因的比较。

图23：显示了差异表达基因的GO分析结果。

图24：显示了蛋白质-蛋白质相互作用网络图。

图25：显示了RT-qPCR验证的差异表达基因。

图26：显示了CAR-T细胞在与U251和U373细胞共培养后，记忆性T细胞的百分数和效应T细胞的百分数。

图27：显示了通过细胞结合试验检测CAR-T细胞在体外识别肿瘤细胞的能力的流程图。

图28：显示了细胞粘附实验的荧光成像结果，及粘附细胞数的统计。

图29：显示了CAR上的CD28-TMD与T细胞上天然存在的CD28分子形成异源二聚体。

具体实施方式

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

定义

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“嵌合受体”、“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中可互换使用，是指至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及胞内信号结构域的重组多肽。

术语“刺激分子”指由提供初级胞质信号传导序列的T细胞表达的分子，所述的初级胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式调节TCR复合体的初级活化。在一个实施方案中，初级信号例如通过TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CAR中的胞内信号结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3ζ的初级信号传导序列。

术语“CD3ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或其等同物，并且“CD3ζ刺激信号结构域”定义为来自CD3ζ链胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个实施方案中，CD3ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD3ζ刺激信号结构域”是在SEQID NO: 8中提供的序列或其变体。

术语“共刺激分子”是指细胞上的与共刺激配体特异性结合从而介导细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中，“共刺激分子”是CD28、4-1BB(即CD137)。共刺激信号结构域是指共刺激分子的胞内部分。

术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激信号结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO: 7提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。

术语“信号传导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号传导分子之间的生物化学关系。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括γ-干扰素。

术语“氨基酸变化”和“氨基酸修饰”可互换地使用，是指氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰。可以进行氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰的任意组合，条件是最终的多肽序列具有所需的特性。在一些实施方案中，氨基酸的取代是非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物（例如、4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸）的取代。可以使用本领域公知的遗传或化学方法产生氨基酸变化。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过除基因工程化之外的方法（如化学修饰）改变氨基酸侧链基团的方法可能是有用的。本文可使用多种名称来表示相同的氨基酸变化。例如，IL-13第13位的谷氨酸到酪氨酸的取代可以表示为13Y、E13Y。

术语“保守序列修饰”、 “保守序列变化”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的CAR或其组成元件的特征的氨基酸修饰或变化。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的CAR或其组成元件中引入修饰。保守性取代是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR的功能。

术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。

术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上足够地不相似以发生抗原性相互作用。

术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植物。

如本文所用的术语“单采血液成分术”指本领域认可的体外方法，借助所述方法，供体或患者的血液从供体或患者取出并且穿过这样的装置，所述装置分离选择的特定组分并将剩余部分返回供体或患者的循环，例如，通过再输血。因此，在“单采样品”的语境中，指使用单采血液成分术获得的样品。

术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。

“免疫效应功能”、“免疫效应应答”或“免疫效应反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的例子。

术语“效应功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。

术语“T细胞激活”或“T细胞活化”可互换地使用，是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物的表达。本发明的嵌合抗原受体能够诱导T细胞激活。用于测量T细胞激活的合适测定法在实施例中描述，并是本领域中已知的。

术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。

术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，尤其包括如Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453–1464(2009)中提供的自我失活慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的LENTIVECTOR®基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX™载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。

术语“与表达IL13Rα2相关的疾病”是指由IL13Rα2增加的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何病症。

术语“个体”或“受试者”可互换地使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。

“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的CAR免疫效应细胞用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

术语“有效量”指本发明的CAR免疫效应细胞的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体CAR免疫效应细胞；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。CAR免疫效应细胞的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和CAR免疫效应细胞在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中CAR免疫效应细胞的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20%、更优选地至少约40%、甚至更优选地至少约50%、60%或70%和仍更优选地至少约80%或90%。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价CAR免疫效应细胞抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。

在本文中当谈及核酸时使用的术语“载体(vector)”是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。

本发明的嵌合抗原受体(CAR)

脑胶质瘤是在颅内发病率最高的一类肿瘤，其恶性程度高，疗效差，且容易复发，其发病诱因、发病机制及有效治疗方法一直是研究的难点。现有技术发现脑胶质瘤与许多细胞因子存在密切的关系，其中与IL13的关系尤为密切。IL13是一种多功能的细胞因子，其在体内错综复杂的细胞因子网络中有着重要的生物学功能。大量研究表明IL13在免疫应答和炎症反应过程中起着相当重要的作用。利用放射标记的IL13的放射自显影技术已经证明在所研究的几乎所有脑胶质瘤组织上存在大量的IL13结合，这是因为脑胶质瘤中IL13R表达异常，其中，IL-13受体α链异构体2（IL13Rα2）在脑胶质瘤细胞表面存在高表达，并在脑胶质瘤恶性增殖的过程中起着重要的作用。

本发明涉及能够特异性结合IL13Rα2的嵌合抗原受体(CAR)多肽。嵌合抗原受体(CAR)是一种重组多肽，其至少包含胞外识别域、跨膜区和胞内信号传导域。胞外识别域(也简称为“胞外域”)特异性识别并结合靶细胞的细胞表面上存在的分子。由于所述CAR可以既结合抗原又转导T细胞激活，且所述T细胞激活是不依赖于MHC限制的，因此，CAR能够用于治疗抗原阳性的肿瘤患者，不论该肿瘤患者HLA基因型如何。使用表达肿瘤特异性CAR的T淋巴细胞的过继性免疫疗法可以是用于治疗癌症的强大治疗策略。

本发明构建了特异性结合IL13Rα2的多种包含不同跨膜结构域的CAR多肽，并证实了它们的抗肿瘤效果，为GBM患者的免疫治疗提供了备选的治疗方案。本发明的嵌合抗原受体包含

(i) 人IL-13或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；

(ii) 跨膜结构域，其选自：CD4跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、CD8跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、CD28跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体；

(iii) 共刺激结构域，其选自：(a)CD28共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、(b)4-1BB共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、(c)OX40共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体、和所述(a)、(b)和／或(c)的任意组合；和

(iv) CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，

其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体的胞外域是特异性结合IL13Rα2的人IL-13或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-2个氨基酸修饰的变体。

在一个实施方案中，本发明的CAR包括在CAR的IL13Rα2结合部分即IL13的第13位氨基酸处具有氨基酸修饰，例如，人IL-13的位置13上的氨基酸不是E，例如E变成Y、E变成一些其他氨基酸如K或R或L或V。

在一个实施方案中，将本发明CAR的胞外域包含的人IL-13上α螺旋A位置13处的天然谷氨酸残基用酪氨酸取代，获得IL13(E13Y)突变体。IL13(E13Y)突变体选择性地降低对IL13Rα1受体的亲和力，同时，IL13(E13Y)突变体与IL13Rα2的结合相对于野生型IL13与IL13Rα2的结合是增加的。由此，本发明的CAR的IL13Rα2结合部分包含E13Y突变，该突变增加IL13对IL13Rα2的结合特异性，并减少与IL13Rα1的结合，从而减少对健康组织的靶向性。在一个实施方案中，所述IL13(E13Y)突变体具有SPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO:2)所示的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，本发明CAR的胞外域包含天然序列的IL13。在通过局部施用直接将CAR免疫效应细胞（如，T细胞、NK细胞）注射到肿瘤块中的情形，特别地可以使用CAR的胞外域包含天然序列的IL13。

当本发明的CAR在免疫效应细胞（如，T细胞、NK细胞）表面上表达时，CAR的胞外域（即，IL13或其变体）使得其能够将免疫效应细胞（如，T细胞、NK细胞）特异性导向表达IL13Rα2的那些细胞，例如，所述表达IL13Rα2的细胞是肿瘤细胞（包括神经胶质瘤细胞）。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中包含的跨膜结构域是锚定的跨膜结构域，其是能够整合在细胞膜中的多肽链的组成部分。跨膜结构域可以与其他胞外和/或胞内多肽结构域融合，由此，这些胞外和/或胞内多肽结构域也将被限制在细胞膜上。在本发明的嵌合抗原受体(CAR)多肽中，跨膜结构域赋予本发明的CAR多肽的膜附着。本发明的CAR多肽包含至少一个跨膜结构域，其可以衍生自天然来源或重组来源，包含优势疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在天然来源的情况下，跨膜结构域可以衍生自膜结合蛋白或跨膜蛋白例如CD4、CD28、CD8 (例如，CD8α，CD8β)的跨膜结构域。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的跨膜结构域是CD4跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。例如，所述CD4跨膜结构域是MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF（SEQID NO:3）所示的序列。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。例如，所述CD8跨膜结构域是IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（SEQ ID NO:4）所示的序列。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。例如，所述CD28跨膜结构域是VWWWLVESWLVIACYYQWPLLFSG（SEQ ID NO:5）所示的序列。

在一个实施方案中，包含CD28跨膜结构域的特异性结合IL13Rα2的CAR-T细胞具有极好的体内抗GBM活性。

在一些实施方案中，本发明的CAR中的跨膜结构域可以借助铰链区/间隔区与CAR的胞外区(即，IL-13或其变体)连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头作为铰链区/间隔区。例如，在一个实施方案中，接头包含GGGGS的氨基酸序列。

本发明的CAR中包含的胞质结构域包含胞内信号结构域。胞内信号结构域能够活化引入了本发明CAR的免疫细胞的至少一个效应功能。

在一些实施方案中，本发明的CAR还包含在跨膜结构域和所述胞内信号结构域之间的间隔区，例如，所述间隔区是IgG铰链区或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，IgG4铰链区或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，ESKYGPPCPSCP（SEQ ID NO:1）所示的IgG4铰链区。

用于本发明CAR中的胞内信号结构域的例子包括协同发挥作用以在胞外结构域结合IL13Rα2后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。

考虑到仅通过TCR生成的信号尚不足以完全活化T细胞，因此本发明的CAR还设计了能够产生共刺激信号的共刺激信号结构域(CSD)。T细胞的活化由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。

在一个实施方案中，本发明的CAR包含初级胞内信号结构域，例如，CD3ζ的初级信号结构域，例如，SEQ ID NO: 8所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体，其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

本发明CAR中的胞内信号结构域还包次级信号结构域(即，共刺激信号结构域)。共刺激信号结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外免疫效应细胞对抗原作出有效反应所需要的细胞表面分子。在一些实施方案中，共刺激分子包括但不限于CD28、4-1BB (CD137)、OX40，其引起的共刺激作用在体外增强人CART细胞的增殖、效应功能和存活并且在体内增进人T细胞的抗肿瘤活性。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的共刺激信号结构域是CD28共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的共刺激信号结构域是4-1BB共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在一个实施方案中，本发明CAR的胞内区包含与CD3ζ串联的一个或多个共刺激结构域，如4-1BB(也称为CD137)的共刺激结构域，当所述CAR在免疫效应细胞（如，T细胞、NK细胞）表面上表达时，所述CAR使得T细胞能够接受共刺激信号。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的共刺激信号结构域是OX40共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在本发明CAR的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或按指定的顺序连接。任选地，短寡肽接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成键接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。

在一个实施方案中，本发明CAR的胞内信号结构域设计成包含CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ的刺激信号结构域。又在一个实施方案中，胞内信号结构域设计成包含4-1BB的共刺激信号结构域和CD3ζ的刺激信号结构域。

在一个优选的实施方案中，本发明CAR的胞内信号结构域设计成包含CD28的共刺激信号结构域、4-1BB的共刺激信号结构域和CD3ζ的刺激信号结构域。

本领域普通技术人员将理解，本发明的CAR多肽还可以进行修饰，从而在氨基酸序列上变动，但是在所需的活性方面不变动。例如，可以对CAR多肽进行导致“非必需”氨基酸残基处氨基酸置换的额外核苷酸置换。例如，可以将分子中的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，可以将一个氨基酸片段替换为结构上相似的片段，所述的片段在侧链家族成员的顺序和组成方面中不同，例如，可以进行保守性置换，其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。

本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

在一些实施方案中，本发明也构思了产生功能上等同的CAR多肽分子。

编码本发明的CAR的核酸分子、载体和表达本发明CAR的细胞

本发明提供了编码本文所述的CAR构建体的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子作为DNA构建体提供。

可以使用本领域公知的重组方法获得编码本发明CAR的构建体。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非通过基因重组方法产生目的核酸。

本发明还提供了插入有本发明CAR构建体的载体。通过将编码CAR多肽的核酸有效连接至启动子并将构建体并入表达载体中，实现编码CAR的天然或合成的核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

已经开发了众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将本发明CAR构建体插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。例如，将本发明CAR构建体的核酸序列克隆至慢病毒载体中，以在单个编码框中产生全长CAR构建体，并用EF1α启动子用于表达。

衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的额外优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有额外的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。

能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见，例如，Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453–1464(2009)。

启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，所述其他组成型启动子序列包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。

在一些实施方案中，本发明提供了在哺乳动物免疫效应细胞（例如哺乳动物T细胞或哺乳动物NK细胞）中表达本发明的CAR构建体的方法和由此产生的免疫效应细胞。

从受试者获得细胞来源(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)。术语“受试者”意在包括可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。可以从众多来源获得T细胞，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。

可以使用本领域技术人员已知的任何技术(如Ficoll™分离法)，从采集自受试者的血液成分中获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。

可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠(如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)温育一段足够正向选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一些实施方案中，该时间段是约30分钟至36小时之间或更长时间。较长的温育时间可以用来在存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。

可以用抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集，其中所述抗体针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。

在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。

缺少功能性TCR的T细胞可以例如经工程化，从而它在其表面上不表达任何功能性TCR；经工程化，从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基(例如，经工程化，从而它不表达或显示出减少表达的TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)；或经工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。

本文所述的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以如此工程化，从而HLA(例如，HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。在一些方面，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)表达实现HLA的下调。

在一些实施方案中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA，例如，HLA I类和/或HLA II类。

在一个实施方案中，对编码本发明所述的CAR的核酸转导的细胞进行增殖，例如，将细胞在培养下增殖2小时至约14天。

对经体外增殖后获得的表达CAR的免疫效应细胞可以如实施例中所述进行效应功能的检测。

在一些实施方案中，表达本发明的针对IL13Rα2的具有CD28-TMD的CAR多肽可显著地提高其转导的CAR-T细胞增殖、迁移、促进蛋白激酶B活化和蛋白激酶C信号的表达，提示CD28-TMD诱导的异构化使T细胞更容易被激活。同时，在T细胞活化过程中，认为T细胞共刺激分子CD28能够提供有助于CAR-T细胞存活的信号。另外，所转染的CAR上具有的CD28-TMD与T细胞上天然存在的CD28分子能够形成异源二聚体，这也可能与增强的CAR-T细胞存活和扩增有关。

在一些实施方案中，即使肿瘤细胞上的IL13Rα2肿瘤抗原密度非常低，本发明的CAR-T细胞也能维持对表达IL13Rα2的肿瘤的杀伤活性。

在一些实施方案中，用本发明的IL13-CD428BBζ或IL13-CD828BBζCAR转导的T细胞与U373细胞共培养后，细胞内IFN-γ水平显著升高，而与U251细胞共培养后，细胞内IFN-γ水平没有升高。这可能是由于U251细胞IL13Rα2水平相对较低所致。因此，包含CD4或CD8跨膜区的CAR-T细胞可能需要肿瘤细胞上的IL13Rα2水平相对较高才能发挥活性，在本文中也称为需要更高的激活阈值。另一方面，IL13-CD28BBζCAR-T细胞在与GBM细胞共培养前表达相似的IFN-γ，在体外表现出与IL13-CD428BBζ或IL13-CD828BBζCAR-T细胞相似的抗肿瘤活性。IL13-CD28BBζCAR-T细胞在体内显示出极佳的抗肿瘤活性，这可能是由于包含CD28跨膜结构域的CAR诱导了更稳定有效的免疫相互作用，降低了激活阈值。

在一个实施方案中，通过细胞粘附检测方法检测了本发明的CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别能力。本发明的多种CAR-T细胞与U373细胞的相互作用相似，但与U251细胞的相互作用存在不同，表明CAR中包含的跨膜结构域（TMD）改变了CAR-T细胞与肿瘤细胞的结合能力，这在与表达较少IL13受体IL13Rα2的肿瘤细胞共培养时表现出来。

在一些实施方案中，将本发明的CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后，用Dynabeads TMCD4阳性分离试剂盒和Dynabeads TM CD8阳性分离试剂盒（Invitrogen，Thermo FisherScience）将CAR-T细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，然后进行高通量测序，检测到本发明的CAR-T细胞的差异表达基因。RNA提取、cDNA文库构建和测序均严格按照转录组测序标准进行。使用在线生物信息学工具DAVID bioinformatics Resources 6.8对本发明的CAR-T细胞差异表达的基因进行基因本体（GO）分析。数据可视化和分析由定制的R studio脚本按照包（ggplot2和Tree map）进行处理。基因富集分析采用Fisher精确检验。GO分析结果表明，IL13-CD28BBζCAR-T细胞中的大多数差异表达基因定位于细胞外区域，在功能上与细胞外基质的组装和解离、粘着斑组装有关。本发明的CAR-T细胞增殖、迁移、蛋白激酶B活性的激活、蛋白激酶C(PKC)信号转导和转录激活活性的增强可能诱导CAR-T细胞与肿瘤细胞发生较强的相互作用，从而有助于提高体内抗肿瘤的疗效。同时，本发明的CAR-T细胞中的趋化因子如CXCL5、细胞骨架基因如ACTN2的上调以及抑制性细胞因子如IL-10的减少可能促进CAR-T细胞在体内更容易移向肿瘤部位。

PKC是一个在哺乳动物细胞中广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，已鉴定出多种亚型，主要作为细胞骨架重塑、细胞极性和T细胞迁移的关键调节因子。Real等人证明PKCζ和PKCι 影响T细胞运动和对DC细胞表面趋化因子受体分子的扫描行为（Real E, Faure S,Donnadieu E, Delon J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocytepolarity and scanning behavior. Journal of immunology. 2007; 179(9):5649-5652）。在本发明中，IL13-CD28BBζ CD4+CAR-T细胞中PKCζ的上调超过2.9倍。PKCζ的上调可能是下游基因过度表达的上游信号，有助于改变细胞外基质组装和细胞粘附组装。此外，肿瘤中T细胞浸润的增加也可能是PKC信号激活的结果。

丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白激酶Bα (PKB/Akt）是PI3K活性的下游靶点，在多种模型中作为一个关键分子参与调节细胞存活。活化的PKB已被证实在生长因子和细胞因子介导的生存中发挥作用，并保护细胞免受各种刺激诱导的凋亡。在本发明中，IL13-CD28BBζ CD8+CAR-T细胞中FGF1、ANG和PINK1显著上调，这些基因在功能上与PKB的激活有关。

在一些实施方案中，本发明的含有CD28跨膜结构域的第三代IL13BBζ CAR-T细胞由于其较低的活性阈值和改变的转录组而具有极佳的体内抗GBM活性。

表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞的用途和使用表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞的治疗方法

T细胞治疗首次应用于血液学B细胞恶性肿瘤的治疗，并显示出有效和令人鼓舞的结果。然而，CAR-T细胞治疗实体瘤的抗肿瘤活性有限，尚处于实验阶段。同时，在实体瘤中副作用的发生和低效性也逐渐成为一个挑战。本发明通过优化CAR构建体的结构，获得了表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞，其用于在受试者中治疗与表达IL13Rα2相关的疾病。

在一些实施方案中，工程化改造T细胞（例如患者特异的自体T细胞）以表达本发明的CAR多肽。通过扩增所述工程化改造的T细胞后，将其用于过继细胞治疗(ACT)。可以使用多种T细胞亚群表达本发明的CAR多肽。

在一些实施方案中，在利用表达本发明的CAR多肽的免疫效应细胞治疗患者时，所述免疫效应细胞可以是自体T细胞或同种异体T细胞。在一些实施方案中，所用的T细胞是CD4+和CD8+中央记忆型T细胞(T_CM)，其是CD45RO+CD62L+，并且使用此类细胞相比于使用其他类型的患者特异性T细胞可以提高过继性转移后细胞的长期存活。

在一些实施方案中，工程化改造其他免疫细胞（例如，NK细胞）以表达本发明的CAR多肽。通过扩增所述工程化改造的其他免疫细胞（例如，NK细胞）后，将其用于过继细胞治疗(ACT)。

在一个实施方案中，表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞用于在受试者中治疗表达或过表达IL13Rα2的癌症，并且能够减轻癌症的至少一种症状或指征的严重性或抑制癌细胞生长。

本发明提供了在受试者中治疗与表达IL13Rα2相关的疾病（例如，表达或过表达IL13Rα2的癌症）的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞。

本发明提供了前述表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞在制备用于治疗与表达IL13Rα2相关的疾病（例如，表达或过表达IL13Rα2的癌症）的药物中的用途。

表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞也可以施用于已经用一种或多种先前疗法治疗癌症但随后复发或转移的个体。

在一些实施方案中，表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)用于胃肠外、经皮、腔内、动脉内、静脉内、鞘内施用，或直接注入组织或肿瘤中。

表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞可以以合适的剂量施用于受试者。剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域中公知的，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体重、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况、和待并行施用的其他药物。

在一些实施方案中，表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)以1x10⁶个－1x10¹²个免疫效应细胞、优选地1x10⁷个－1x10¹⁰个免疫效应细胞、例如5x10⁷个、1x10⁸个、5x10⁸个、1x10⁹个、5x10⁹个免疫效应细胞的剂量以单次或多次肠胃外施用，优选为静脉内施用。

在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞导致肿瘤的完全消失。在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞导致肿瘤细胞或肿瘤大小减少至少85％或更多。可以通过本领域已知的任何方法测量肿瘤的减少，例如X-线、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、细胞学、组织学或分子遗传分析。

本发明所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。

实施例

一般方法：

除非另外说明，本发明的实施将利用本领域技术人员已知并可获得的细胞生物学、细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、生物化学、动物学、病毒学和免疫学的常规技术。这类技术在如下文献中描述：Molecular Cloning: A laboratory Manual,第3版(Sambrook等人, 2001) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(P. Herdewijn编著, 2004)；Animal Cell Culture (R.I. Freshney编著, 1987)；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人编著, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编著, 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等人编著,1991)；和Short Protols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)。除非另外规定，本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。

细胞系

人GBM细胞系U251、U373及逆转录病毒包装细胞系PG13和Phoenix ECO购自美国组织培养收藏中心（ATCC）。U251细胞和U373细胞通过逆转录病毒转导表达ffLuc报告基因和GFP基因。GBM细胞系在含有10%胎牛血清（FBS，Biosera）、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（EallBio Life Sciences）的DMEM培养基（Lonza）中良好培养。逆转录病毒产生细胞系在不含青霉素和链霉素的含10%FBS的DMEM培养基中培养。

流式细胞术分析

使用BD FacsCanto II Plus仪器（BD Biosciences）进行流式细胞术检测，利用FlowJo v.10软件（Tree star，Inc.Ashland，OR）对流式结果进行分析。所用抗体具体如下：anti-human CD3-APC-R700抗体（BD Bioscience），anti-human-CD4-V450（BDBioscience），anti-human-CD8-PE-Cy7（BD Bioscience），anti-human IL13Ra-APC (BDBioscience) 和羊抗鼠IgG-APC（Sigma）。

脱颗粒实验

CAR-T细胞与靶细胞按E:T=10:1进行共培养，加入适量的anti-human CD107a-APC（BD-Biosciences）和封闭剂（eBioscience™ Protein Transport Inhibitor Cocktail,Invitrogen），共培养6h后，收集细胞，制备单细胞悬液，加入anti-human-CD3-APC-R700抗体，避光孵育，用PBS洗涤细胞，然后用含有1%FBS的PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测T细胞的脱颗粒情况。

胞内IFN-γ实验

CAR-T细胞与靶细胞按E:T=10:1进行共培养，加入2 µl 1×封闭剂（eBioscience™ Protein Transport Inhibitor Cocktail, Invitrogen），共培养6H后，收集细胞，制备单细胞悬液，加anti-human-CD3-APC-R700抗体，避光孵育，用PBS洗涤细胞，然后用含有1%FBS的PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测胞内IFN-γ的释放情况。

增殖实验

先用CSFE染料标记CAR-T细胞，然后再与靶细胞U251按E:T=5:1进行共培养，5天后，收集细胞，加适量anti-human CD3-APC-R700抗体孵育，PBS洗去多余的抗体，加含有1%FBS的PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测T细胞增殖。并使用Flow Jo v.10软件（Tree star，Inc.Ashland，OR）分析细胞增殖情况。

功能检测

CAR-T细胞与靶细胞（U251-GL和U373-GL细胞系）按不同的效靶比（E:T=10:1；5:1；2.5:1；1:1）共培养24H后，采用Perkinelmer光化学成像系统采集信号，加入底物D-荧光素钾盐工作液后，混匀拍照，Living Imaging分析系统分析荧光信号的强度，评估CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力。

细胞因子产生的测定

CAR-T细胞与人GBM细胞系以E:T=10:1的比例共培养24小时。使用商业化的流式细胞仪珠阵列（CBA）试剂盒（BD Biosciences）检测来自共培养细胞的上清液中人干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL17A、 IL4、IL6和IL10的表达情况，具体操作步骤根据试剂盒的说明书进行。

实时细胞分析（RTCA）

使用xCELLigence RTCA系统（瑞士巴塞尔罗氏应用科学公司）评估CAR T细胞的增殖/细胞毒性。本系统基于一个电阻抗读数的金板传感器电极，位于细胞毒性板（E-16板）的底部。首先，将靶细胞U251-GL和U373-GL细胞按每孔1×10⁴个细胞接种于E-16板中。24H后，在E-16平板上加入1×10⁵个CAR-T细胞，与人GBM细胞共同孵育，每15min监测一次，得到48小时的细胞指数。每一个独立的实验分三次进行。利用RTCA软件自动计算区间斜率，评价细胞指数的变化率。为了证明处理的效果，在标准化时间点将细胞指数标准化为相等的值。

转录组测序

CAR-T细胞与U251细胞以10:1的效靶比共培养。4小时后用Dynabeads TM CD4阳性分离试剂盒和Dynabeads TM CD8阳性分离试剂盒（Invitrogen，Thermo Fisher Science）分离CD4和CD8 CAR T细胞。将共培养的混合细胞、分选的CD4-CAR-T细胞、CD8-CAR-T细胞和U251细胞送至安诺优达基因科技有限公司（中国北京）进行RNA测序。RNA提取、cDNA文库构建和测序均严格按照转录组测序标准进行。

使用在线生物信息学工具DAVID bioinformatics Resources 6.8对各种CAR-T细胞之间差异表达的基因进行基因本体（GO）分析。数据可视化和分析由定制的R studio脚本按照包（ggplot2和Tree map）进行处理。基因富集分析采用Fisher精确检验。

统计分析

使用GraphPad Prism 7软件（GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥）进行数据分析。数据以平均值±SEM表示，采用非配对t检验来评估差异。采用Kaplan-Meier法测定GBM异种移植小鼠的总存活率，并采用Cox比例风险回归分析进行组间比较。P< 0.05为有统计学意义。

实施例1. IL13Rα2特异性CAR逆转录病毒载体的构建和逆转录病毒上清液的制备

使用逆转录病毒构建了图1所示的三种不同的IL13Rα2靶向的CAR。

由图1可见，IL13CD428BBζ CAR从N端至C端包含：一个位于细胞膜表面的E13Y位点突变的人IL13结构域(SEQ ID NO: 2)、一个CD4跨膜结构域(SEQ ID NO: 3)、一个人CD28和4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7)、一个人CD3ζ胞浆结构域(SEQ ID NO:8)；

IL13CD828BBζ CAR从N端至C端包含：一个位于细胞膜表面的E13Y位点突变的人IL13结构域(SEQ ID NO: 2)、一个CD8跨膜结构域(SEQ ID NO: 4)和一个IgG4铰链结构域(SEQ ID NO: 1)、一个人CD28和4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7)、一个人CD3ζ胞浆结构域(SEQ ID NO: 8)；

IL13CD28BBζ CAR从N端至C端包含：一个位于细胞膜表面的E13Y位点突变的人IL13结构域(SEQ ID NO: 2)、一个CD28跨膜结构域(SEQ ID NO: 5)、一个人CD28和4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7)、一个人CD3ζ胞浆结构域(SEQ ID NO: 8)。

这三个CAR在结构上均共有一个位于细胞膜表面的E13Y位点突变的人IL13结构域、一个人CD28和4-1BB共刺激结构域和一个人CD3ζ胞浆结构域（参见图1）。这三个CAR均通过单一位点（E13Y）修饰的膜栓系IL-13作为配体来识别IL13Rα2，并具有CD28和4-1 BB的细胞内信号结构域作为共刺激序列，以促进CAR-T细胞的持久性和防止无能，这三个CAR的胞内段还具有CD3ζ。

这三个CAR唯一的区别在于跨膜结构域的不同。IL13CD428BBζ在IL13（E13Y）序列后连接一个CD4的跨膜结构域，IL13CD828BBζ在IL13（E13Y）序列后连接一个CD8的跨膜结构域和IgG4（铰链）区域，而IL13CD28BBζ在IL13（E13Y）序列后连接一个CD28的跨膜结构域。

采用Thermo公司的GeneArt基因合成技术，合成IL13（E13Y）序列的编码序列，设计引物，通过同源重组的方式将其与上述三种不同的IL13Rα2靶向的CAR的其他结构域编码序列连接形成完整的IL13Rα2特异的CAR序列，最后再通过同源重组的方式将上述三种CAR序列分别亚克隆至转录病毒载体SFG上，获得三种目的质粒。

采用脂质体转导的方法将编码CAR逆转录病毒载体的三种目的质粒分别与RD114包装质粒共同转导293GP包装细胞系，48小时后收获逆转录病毒上清液，用于转导T细胞。

实施例2. CAR-T细胞的产生

在本实施例中，使用实施例1收获的逆转录病毒上清液转导T细胞，由此制备CAR-T细胞。

首先，用淋巴细胞分离液（GE-healthcare）通过梯度离心法分离健康捐赠者外周血中的单个核细胞（PBMC）。用抗CD3/CD28 T细胞激活剂Dynabeads（Invitrogen）刺激PBMC中的T细胞。刺激48小时后，用实施例1的逆转录病毒上清液转染T细胞。逆转录病毒转染实验参照磷酸钙转染试剂盒（Sigma）的说明书进行。在第7天，使用流式细胞术检测转染的T细胞中CAR表达阳性率。在第9-14天，收集细胞，进行实验。具体的CAR-T细胞制备和评价流程详见图2。

在含有5%人AB血清（SIGMA）、100U/ml IL-2、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（EallBio Life Sciences）的X-VIVO-15培养基中培养CAR-T细胞。本研究由北京世纪坛医院机构评审委员会批准，并获得所有参与者的知情同意。

结果表明，实施例1中构建的三种CAR分别被成功地导入T细胞。如图3所示，所获得的三种CAR-T细胞在体外都表现出良好的生存能力和增殖能力，其中，IL13CD428BBζ CAR-T细胞增殖能力最强，IL13CD28BBζ CAR-T增殖能力次之。

实施例3. CAR-T细胞在IL13Rα2+肿瘤细胞刺激下的体外增殖

将实施例2制备的三种CAR-T细胞分别与IL13Rα2+肿瘤细胞进行体外共培养，观察了CAR-T细胞的细胞生长及细胞因子释放情况。

图4显示了CAR-T细胞与U251细胞共培养时的增殖情况。结果表明，当实施例2制备的三种CAR-T细胞与低表达IL13Rα2的胶质瘤细胞U251细胞共培养时，所述CAR-T细胞均能够有效扩增，其中IL13CD28BBζ CAR-T细胞具有最佳的增殖能力（图4）。

当实施例2制备的三种CAR-T细胞与高表达IL13Rα2的胶质瘤细胞U373细胞共培养6小时后，检测到能够发生胞内IFN-γ释放的IFN-γ阳性细胞比例均增加（图5）。另外，当实施例2制备的三种CAR-T细胞与U251细胞共培养6小时后，只有IL13CD28BBζCAR-T细胞IFN-γ表达显著增加（图5）。

CAR-T细胞与U251细胞、CAR-T细胞与U373细胞共培养24小时后，收集细胞上清液，采用细胞因子微球检测技术（Cytometric Bead Array（CBA））基于流式细胞检测系统进行多种细胞因子水平的定量检测。结果表明，三种CAR-T细胞与U373细胞共培养后，培养液中IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-4水平升高；而与U251细胞共培养后，只有IL13CD28BBζCAR-T细胞的IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-4水平显著升高（图6）。这些结果表明，IL13CD28BBζ CAR-T细胞具有较低的活性阈值。

实施例4. CAR-T细胞对肿瘤细胞的体外杀伤

为了进一步评价CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，将三种CAR-T细胞分别与胶质瘤细胞U251-GL或U373-GL细胞按效应细胞与靶细胞之比（E:T）0.5:1、1:1、2.5:1、5:1和10:1共培养24小时后，加入荧光素酶底物，通过光学成像系统评估靶细胞在体外的存活情况，由此，借助测定的发光信号评价CAR-T细胞对肿瘤细胞的体外杀伤能力。设置了阴性对照（NT）组，其使用外周血单个核细胞（PBMC）作为效应细胞。

图7显示了CAR-T细胞与U373-GL和U251-GL细胞以不同的E:T比例共培养24小时后，靶细胞在体外存活的结果。如图7所示，与阴性对照（NT）组相比，本发明的三组CAR-T细胞均显著抑制发光信号，其中IL13CD28BBζCAR-T细胞的抑制作用最强，尤其是在低E:T比值（0.5:1和1:1）时，与其他两组CAR-T细胞比较，IL13CD28BBζCAR-T细胞对胶质瘤细胞的体外抑制作用更强。

采用RTCA实时细胞分析仪（real-time cell analyzer）进行肿瘤细胞的细胞生长分析。检测板E-Plate 16的底部整合有微金电子传感器芯片，当生长在微电极表面的肿瘤细胞引起电极界面阻抗的改变时，该阻抗值的变化直接反映细胞的生长。

图8显示了RTCA法检测的肿瘤细胞的细胞生长结果，体外评价了CAR-T细胞的抗肿瘤能力。结果显示，三组CAR-T细胞均显著抑制U373-GL和U251-GL细胞生长，具有明显的抗肿瘤活性，且三组间无显著性差异（图8）。

实施例5. CAR-T细胞的小鼠体内抗肿瘤作用

首先，通过颅内注射胶质瘤细胞构建了原位异种移植小鼠模型。

胶质瘤细胞系U373和U251细胞表面表达IL13Rα2。采用流式细胞术检测了这两种胶质瘤细胞上IL13Rα2的表达水平。

结果如图9所示，IL13Ra2在U251和U373细胞系表面的表达分别为36.1%和90.9%。

使用胶质瘤细胞系U373和U251细胞构建了原位异种移植小鼠模型。具体而言，实验所用小鼠为六到八周龄的NOD-SCID小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。向雌性NOD-SCID小鼠右脑纹状体分别注射2×10⁵个U251-GL细胞或U373-GL细胞（记为第一天，也简写为D1）。在第六天（即，D6）通过尾静脉注射3×10⁷个实施例2制备的CAR-T细胞（图10、图15）。实验设置了空白对照组，对于原位异种移植小鼠模型在D6不施用本发明的CAR-T细胞，而是施用PBS。

使用小动物成像仪器（IVIS，Xenogen，Alameda，CA，USA）通过检测荧光信号观察肿瘤生长情况，由此监测肿瘤的发展，当肿瘤直径达到20mm时处死小鼠。动物实验经北京世纪坛医院伦理委员会批准通过。

i) 对于U373-GL生成的异种移植模型小鼠

图10显示了使用胶质瘤细胞系U373（本文中也称为U373-GL；或U373）产生异种移植模型小鼠、以及注射本发明的三种CAR-T细胞和检测的方案。

如图11和图12所示，注射本发明的三种CAR-T细胞均能够抑制U373-GL模型小鼠的肿瘤生长，其中，IL13-CD28BBζ CAR-T细胞对U373-GL模型小鼠的控制效果更好。图13显示，IL13-CD28BBζ CAR-T细胞使得U373-GL模型小鼠生存曲线显著延长，达90天以上。

免疫组化结果显示，本发明的三种CAR-T细胞均可以浸润到肿瘤组织中，而对照组则无T细胞浸润到肿瘤组织中（图14）。

ii) 对于U251-GL生成的异种移植模型小鼠

图15显示了使用胶质瘤细胞系U251（本文中也称为U251-GL；或U251）产生异种移植模型小鼠、以及注射本发明的三种CAR-T细胞和检测的方案。

如图16和图17所示，注射本发明的三种CAR-T细胞均能够抑制U251-GL模型小鼠的肿瘤生长，其中，IL13-CD28BBζ CAR-T细胞对U251-GL模型小鼠的控制效果更好。图18显示，IL13-CD28BBζ CAR-T细胞使得U251-GL模型小鼠生存曲线显著延长，小鼠的存活率最高。

免疫组化结果显示，本发明的三种CAR-T细胞均可以浸润到脑组织中，并有效的杀伤U251细胞，而对照组则无T细胞浸润到肿瘤组织中（图19）。

实施例6. 高通量RNA测序分析CAR-T细胞的差异表达基因

分别将本发明的三种CAR-T细胞与U251细胞共培养4h后，将CAR-T细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，然后进行高通量测序，检测三种CAR-T细胞之间的差异表达基因。

图20-图22显示了三种CAR-T细胞的差异表达基因比较；图23显示了差异表达基因的GO分析结果。如图20-图22所示，与其他两种本发明的CAR转染的CD4+T细胞比较，在IL13-CD28BBζCAR转染的CD4+ T细胞中有413个上调基因；与其他两种本发明的CAR转染的CD8+T细胞比较，在IL13-CD28BBζCAR转染的CD8+ T细胞中有509个上调基因。

GO分析结果表明，IL13-CD28BBζCAR-T细胞中的大多数上调基因定位于细胞外区域，在功能上与细胞外基质的组装和解离有关（图23）。

经过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，观察到CYBB、IL-10、CXCL5、TCF7和ACTN2位于差异表达基因的网络中心。图24显示了蛋白质-蛋白质相互作用网络图。

为了验证RNA-seq结果，收集了与U251或U373细胞共培养4小时后的CAR-T细胞，然后用RT-qPCR检测了候选基因CYBB、IL-10、CXCL5、TCF7和ACTN2在CAR-T细胞中的表达情况。方法如下：使用TRIzol试剂（Invitrogen）按照制造商的说明从细胞中提取总RNA。使用Nanodrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量RNA的数量和纯度。使用高容量cDNA反转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA，然后使用SYBR Green PCRMaster Mix（Thermo Fisher Scientific）和基因特异引物进行扩增。GAPDH被用来作为内部对照。使用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达。

图25显示了RT-qPCR验证的差异表达基因。结果显示，IL13-CD28BBζCAR-T细胞具有最低的IL10水平和最高的Tcf7表达（图25）。所述Tcf7编码TCF1蛋白，该蛋白在记忆性T细胞中高表达。

本发明的CAR-T细胞在与U251和U373细胞共培养后，发现记忆性T细胞在IL13-CD28BBζ CAR-T细胞与U251细胞共培养中所占比例较高，IL13-CD28BBζ CAR-T细胞与U373细胞共培养7d后记忆性T细胞减少，而效应T细胞的比例正好相反（图26）。

实施例7. CAR-T细胞在体外识别肿瘤细胞的能力

在本实施例中，通过使用细胞结合试验来检测CAR-T细胞在体外识别肿瘤细胞的能力（图27）。

如图27所示，首先将GBM细胞接种于24孔板上；待其贴壁后，对T细胞进行CSFE染色；后将T细胞与肿瘤细胞共培养，振荡5min后进行拍照（Pic1）；洗涤3次，将未粘附在24孔板的细胞清除后，进行第二次拍照（Pic2）。

图28显示了细胞粘附实验荧光成像结果，及粘附细胞数的统计。如图28所示，更多的IL13-CD28BBζ CAR-T细胞在孵育5min后与U251细胞结合，但这三组CAR-T细胞与U373细胞结合的数量相似。

图29显示了在IL13-CD28BBζ CAR-T细胞上，CAR上的CD28跨膜结构域与T细胞上天然存在的CD28分子形成异源二聚体，由此可能增强CAR-T细胞的存活和扩增。

以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。

序列表

<110> 卡瑞济（北京）生命科技有限公司

<120> 靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体及其用途

<130>

<160> 8

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4铰链区

<400> 1

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-13(E13Y)

<400> 2

Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu

1 5 10 15

Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly

20 25 30

Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala

35 40 45

Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr

50 55 60

Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln

65 70 75 80

Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe

85 90 95

Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg

100 105 110

Phe Asn

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD4跨膜结构域

<400> 3

Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ile Phe Phe

20

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8跨膜结构域

<400> 4

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28跨膜结构域

<400> 5

Val Trp Trp Trp Leu Val Glu Ser Trp Leu Val Ile Ala Cys Tyr Tyr

1 5 10 15

Gln Trp Pro Leu Leu Phe Ser Gly

20

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28共刺激结构域

<400> 6

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr

1 5 10 15

Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr

20 25 30

Arg Ser

<210> 7

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB共刺激结构域

<400> 7

Ala Glu Arg Asn Ser Cys Ile Tyr Ser Asn Asn His Leu Cys Asp Gln

1 5 10 15

Tyr Lys Leu Leu Lys Arg Lys Met Ala Val Ala Ala Asp Phe Gln Lys

20 25 30

Lys Lys Lys Glu Asp Val

35

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3ζ信号传导结构域

<400> 8

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Tyr

100 105 110

Gln Pro Leu Glu

115

Claims (18)

1.靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体多肽，其特征在于，包含

(i)人IL-13或人IL-13的位置13上的氨基酸由E变成Y、K、R、L或V，

(ii)跨膜结构域，其是：VWWWLVESWLVIACYYQWPLLFSG的SEQ ID NO:5所示CD28跨膜结构域；

(iii)共刺激结构域，其选自：(a)CD28共刺激结构域、(b)4-1BB共刺激结构域、和所述(a)和(b)的组合；和

(iv)CD3ζ信号传导结构域。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体多肽，其中，所述(i)是人IL-13的位置13上的氨基酸是Y，也称为IL-13E13Y。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体多肽，其中，所述(i)是SPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN的SEQ ID NO:2。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体多肽，其中，所述(iii)是(a)CD28共刺激结构域和(b)4-1BB共刺激结构域的组合。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体多肽，其中，所述CD28共刺激结构域是SKRSRLLMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS的SEQ ID NO:6所示序列，所述4-1BB共刺激结构域是AERNSCIYSNNHLCDQYKLLKRKMAVAADFQKKKKEDV的SEQ ID NO:7所示序列。

6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体多肽，其中，所述(iv)是RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAKDTYDALHMQALPPRYQPLE的SEQ ID NO:8所示CD3ζ信号传导结构域。

7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体多肽，其中，所述嵌合抗原受体多肽包含：

(i)人IL-13或IL-13E13Y；

(ii)跨膜结构域，其是SEQ ID NO:5所示的CD28跨膜结构域；

(iii)共刺激结构域，其是(a)CD28共刺激结构域和(b)4-1BB共刺激结构域的组合；和

(iv)SEQ ID NO:8所示的CD3ζ信号传导结构域。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体多肽，其中，所述嵌合抗原受体多肽包含：

(i)IL-13E13Y；

(ii)跨膜结构域，其是SEQ ID NO:5所示的CD28跨膜结构域；

(iii)共刺激结构域，其是SEQ ID NO:6所示的CD28共刺激结构域和SEQ ID NO:7所示的4-1BB共刺激结构域的组合；和

(iv)SEQ ID NO:8所示的CD3ζ信号传导结构域。

9.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体多肽。

10.载体，其特征在于，包含权利要求9所述的核酸分子。

11.细胞，其特征在于，包含权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体多肽、权利要求9所述的核酸分子、或权利要求10所述的载体。

12.根据权利要求11所述的细胞，其中，所述细胞是免疫效应细胞。

13.根据权利要求12所述的细胞，其中，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞。

14.根据权利要求13所述的细胞，其中，所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。

15.制备权利要求11-14中任一项所述的细胞的方法，其特征在于，包括用权利要求10所述的载体转导细胞。

16.权利要求11-14中任一项所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备在受试者中预防或治疗肿瘤或提供抗肿瘤免疫的药物组合物。

17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述肿瘤为胶质瘤。

18.根据权利要求16所述的用途，其中，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。

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