KR20210050540A - 유전적으로 변형된 면역 세포의 생존 및 확장을 특이적으로 자극하는 방법 - Google Patents

유전적으로 변형된 면역 세포의 생존 및 확장을 특이적으로 자극하는 방법 Download PDF

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다리오 캄파나
마사루 이마무라
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내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

본 발명은 T 세포 생존 및 증식을 촉진하기 위한 야생형 또는 트렁케이션 형태의 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)를 인코딩하는 벡터에 관한 것이다. 구체적으로, 이는 CAR-T 세포보다 더 큰 생체 외 확장을 갖고 생체 내에서 유의하게 더 높은 항-백혈병 활성을 나타내는 항-CD19-41 BB-003ζ 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 트렁케이션된 EpoR을 발현하는 바이시스트로닉 벡터를 예시한다. 이는 또한 상기 벡터를 발현하는 세포를 생성하는 방법 및 CD19+ 종양 세포를 사멸시키기 위한 이들 세포의 용도를 기재한다.

Description

유전적으로 변형된 면역 세포의 생존 및 확장을 특이적으로 자극하는 방법
관련 출원
본 출원은 2018년 8월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/724,488호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시내용은 참조로서 본원에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 자료의 참조로서의 포함
본 출원은 본원과 동시에 제출되는 하기 ASCII 텍스트 파일에 포함된 서열 목록을 참조로서 포함한다:
a) 파일명: 4459_1151-001_PCT_SL.txt; 2019년 8월 26일에 생성됨, 54,419 바이트 크기.
암을 갖는 환자의 경우, 면역 세포의 입양 전이는 모든 표준 치료가 실패한 경우에도 임상 반응으로 이어질 수 있는 유망하고, 점점 더 이용 가능한 치료 옵션이다. 종양 침윤 림프구, 및 T-세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 이용하여 종양 관련 분자로 리디렉션된 T 림프구를 이용한 임상 연구는 백혈병 및 고형 종양을 갖는 환자에서 이들 접근법의 잠재성에 대한 강력한 증거를 제공하였다.1 예를 들어, 항-CD19 CAR-T 세포를 이용한 B-세포 백혈병 및 림프종의 치료는 기존 요법에 내성이 있는 질병을 갖는 환자에서 지속적인 완화를 발생시켰다.2~10
주입 전 림프고갈 요법의 강도 및 주입된 T 세포의 증식 잠재성 및 고갈 성향을 포함하여 주입된 T 림프구의 증식 및 수명에 여러 요인이 집합적으로 영향을 미친다.1,9 CAR 조작된 T 세포의 경우, CAR의 품질이 중요한 특징이며, CAR이 전달할 수 있는 공동 자극 유형이 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.11~13
인터루킨-2(IL-2)는 생체 내에서 T 세포의 확장 및 지속성을 촉진하며, 이를 위해 일부 세포 요법 시험에 사용된다.14,15 그러나, IL-2의 투여는 상당한 독성을 가질 수 있다.16,17 또한, 이는 항-종양 능력에 관계없이 IL-2 수용체를 발현하는 모든 T 세포와 반응하기 때문에 특이성이 부족하다. 이 때문에, IL-2는 조절 T 세포를 자극하며, 이는 면역 반응을 약화시킨다.18
주입된 세포의 확장 및/또는 지속성을 개선시킴으로써 입양 세포 요법의 임상적 효능을 개선하는 데 사용될 수 있는 벡터, 핵산 및 트랜스제닉 세포가 본원에 기재된다.
핵산을 포함하는 벡터가 본원에 기재된다. 핵산은 에리트로포이에틴(Epo) 수용체; 자가 절단 펩티드 또는 내부 리보솜 진입 부위; 및 세포 표면 단백질을 인코딩한다.
Epo 수용체는 SEQ ID NO:2, 4, 6 및 8 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Epo 수용체는 SEQ ID NO:2에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Epo 수용체는 SEQ ID NO:4에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Epo 수용체는 SEQ ID NO:6에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Epo 수용체는 SEQ ID NO:8에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Epo 수용체는 돌연변이체 Epo 수용체이다. 일부 구현예에서, 핵산은 Epo 수용체의 엑손 8 내의 정지 코돈을 인코딩하는 돌연변이를 갖는다.
뉴클레오티드는 Epo 수용체에 대해 C 말단에 존재하는 플래그(Flag) 태그(DYKDDDDK(SEQ ID NO:23))를 추가로 인코딩할 수 있다. 핵산은 2A 펩티드(예를 들어, T2A, P2A, E2A, F2A)와 같은 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 2A 펩티드는 T2A 펩티드일 수 있다.
신호 펩티드는 CD8α 신호 펩티드와 같은 표면 단백질의 신호 펩티드일 수 있다.
세포 표면 수용체는 표적 세포 항원에 결합하는 세포 외 수용체 도메인을 포함할 수 있다.
세포 표면 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. CAR은 신호 펩티드; 표적 세포 항원에 결합하는 세포 외 수용체 도메인; 세포의 표면에 세포 외 수용체 도메인을 고정시키는 힌지 및 막횡단 도메인; 및 효과기 도메인을 포함할 수 있다. 세포 표면 수용체가 키메라 항원 수용체인 경우, 세포 외 도메인은 전형적으로 단일쇄 가변 단편(scFv)이다.
세포 외 수용체 도메인은 링커 도메인에 의해 연결된 가변 면역글로불린 경쇄 도메인 및 가변 면역글로불린 중쇄 도메인을 포함할 수 있다. 링커 도메인은 (G4S)x(SEQ ID NO:24)일 수 있으며, 여기서 x는 1 내지 100의 정수이다. 링커 도메인은 (G4S)3(SEQ ID NO:25)일 수 있다.
세포 표면 수용체는 T 세포 수용체일 수 있다.
세포 외 도메인은 모노클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일쇄 가변 단편(scFv), 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 단일 도메인 항체, 또는 이들의 기능적 유도체 또는 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
세포 외 수용체 도메인은 CD16, CD32 또는 CD64와 같은 면역글로불린 Fc 수용체를 포함할 수 있다. 세포 외 수용체 도메인은 IL-13, IL-4, IL-7 또는 IL-3와 같은 사이토카인을 포함할 수 있다.
세포 표면 수용체는 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 수용체는 NKG2D, NKG2C, NCR1, NCR2, NCR3, CD137, CD28 또는 ICOS를 포함할 수 있다. 세포 표면 수용체는 NKG2D, NKG2C, NCR1, NCR2, NCR3, CD137, CD28 또는 ICOS의 단편을 포함할 수 있다. 세포 표면 수용체는 NKG2D, NKG2C, NCR1, NCR2, NCR3, CD137, CD28 또는 ICOS의 리간드를 포함할 수 있다.
세포 표면 수용체는 면역 세포를 억제할 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 수용체는 NKG2A, PD-1 또는 CTLA-4를 포함할 수 있다. 세포 표면 수용체는 NKG2A, PD-1 또는 CTLA-4의 단편을 포함할 수 있다. 세포 표면 수용체는 NKG2A, PD-1 또는 CTLA-4의 리간드를 포함할 수 있다.
세포 표면 수용체는 사이토카인에 대한 수용체일 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 수용체는 IL-6, IL-1 또는 TNF알파에 대한 수용체일 수 있다.
표적 세포 항원은 종양 관련 항원 또는 종양 특이적 항원일 수 있다. 표적 세포 항원은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 관련 항원일 수 있다.
표적 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD123, CD33, B-세포 성숙 항원(BCMA), 메소텔린(mesothelin), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2), 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 디시알로강글리오시드(GD)-2이다.
표적 세포 항원은 CD19일 수 있다.
세포 외 도메인은 항-CD19 단일쇄 가변 단편(scFv)일 수 있다. 힌지 및 막횡단 도메인은 CD8α 힌지 및 막횡단 도메인일 수 있다. 힌지는 복수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 막횡단 도메인은 CD4, CD8β, CD16, CD28, CD32, CD34, CD64, CD137, FcεRIγ, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, VEGFR2, FAS 또는 FGFR2B로부터의 막횡단 도메인일 수 있다.
효과기 도메인은 4-1BB 및 CD3ζ를 포함할 수 있다. CAR은 항-CD19-41BB-CD3ζ일 수 있다.
벡터는 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 레트로바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스일 수 있다. 벡터는 형광 단백질을 추가로 인코딩할 수 있다. 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 인코딩할 수 있다. 벡터는 핵산의 발현을 위한 적어도 하나의 조절 요소를 추가로 인코딩할 수 있다.
트랜스제닉 포유동물 숙주 세포를 제조하는 방법이 본원에 기재된다. 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 포유동물 숙주 세포는 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포 또는 T 세포와 같은 면역 세포일 수 있다. T 세포는 인간 말초 혈액 T 림프구일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있다. T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다. T 세포는 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 추가로 발현할 수 있다. TCR은 내인성이다. 예를 들어, T 세포는 종양 침윤 림프구(TIL)일 수 있고, 상기 방법은 종양에서 종양 침윤 림프구를 추출하고 생체 외에서 TIL을 확장시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. TCR은 외인성일 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 외인성 TCR을 발현하는 벡터를 T 세포에 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 벡터를 포함하는 포유동물 면역 세포가 본원에 기재된다. 포유동물 면역 세포는 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포 또는 T 세포일 수 있다. T 세포는 인간 T 세포일 수 있다. T 세포는 인간 말초 혈액 T 림프구일 수 있다. T 세포는 이전 단락에 기재된 바와 같거나 본원에 달리 기재된 바와 같을 수 있다.
포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키는 방법이 본원에 기재된다. 상기 방법은 포유동물 T 세포를 대상체에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 포유동물 T 세포는 본원에 기재된 임의의 벡터를 포함할 수 있다. 포유동물은 인간일 수 있다. 포유동물 T 세포는 포유동물로부터 분리된 자가 세포일 수 있다. 포유동물 T 세포는 공여자로부터 분리된 동종이형 세포일 수 있다. 상기 방법은 대상체에 Epo를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 대상체에 IL-2를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키는 것은 급성 림프모구 백혈병(ALL)을 치료할 수 있다.
암, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염 또는 기생충을 치료하거나 예방할 필요가 있는 포유동물에서 암, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염 또는 기생충을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 임의의 벡터의 용도가 본원에 기재된다.
포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키기 위한 본원에 기재된 임의의 포유동물 면역 세포의 용도가 본원에 기재된다.
포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키기 위한 방법에 사용하기 위한 벡터가 본원에 기재된다. 벡터는 본원에 기재된 임의의 벡터일 수 있다.
포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키기 위한 방법에 사용하기 위한 포유동물 면역 세포가 본원에 기재된다. 포유동물 면역 세포는 본원에 기재된 임의의 포유동물 면역 세포일 수 있다.
돌연변이체 에리트로포이에틴(Epo) 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 기재된다. 예를 들어, 돌연변이체 Epo 수용체는 SEQ ID NO:6에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 돌연변이체 에리트로포이에틴(Epo) 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입시킴으로써 트랜스제닉 포유동물 숙주 세포를 제조하는 방법이 또한 본원에 기재된다. 돌연변이체 에리트로포이에틴(Epo) 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 포유동물 면역 세포가 또한 본원에 기재된다. 포유동물 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포 또는 수지상 세포일 수 있다.
Epo 수용체는 T 세포에서 발현될 수 있으며, 신호를 전달한다.
EpoRm은 EpoR보다 높은 수준으로 발현된다.
EpoRm은 더 강력하고 더 지속적인 신호를 유도한다.
Epo는 EpoRm-CAR-T 세포의 증식을 지원할 수 있다.
EpoRm의 발현 및 Epo에 대한 노출은 CAR-T 세포의 세포독성을 방해하지 않는다.
EpoRm-CAR-T 세포는 생체 내에서 확장되고 세포독성을 발휘할 수 있다.
전술한 내용은 유사한 참조 부호가 상이한 도면에 걸쳐 동일 부분을 지칭하는 첨부 도면에 예시된 바와 같이 예시적 구현예의 하기의 보다 구체적인 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 일정한 비율로 그려질 필요는 없으며, 대신 구현예를 예시하는 경우에 강조된다.
도 1a 내지 도 1e는 인간 말초 혈액 T 세포에서 EpoR의 발현이 생존 신호를 부여하는 것을 제시한다. 도 1a는 PE-컨쥬게이션된 항-EpoR 항체(R&D Systems)에 의해 검출된 바와 같은 Jurkat 세포에서의 표면 EpoR 발현을 예시하는 흐름세포측정법 도트-플롯이며; GFP 단독으로 형질도입된 세포가 대조군으로 제시된다. 각각의 사분면의 세포의 백분율이 제시된다. 도 1b는 Jurkat 세포에 대한 Epo 결합을 예시하는 흐름세포측정법 히스토그램이다. 세포는 비오틴-컨쥬게이션된 Epo(R&D Systems) 및 스트렙타비딘-PE(Jackson ImmunoResearch)로 표지되었다. 도 1c는 GFP 단독 또는 GFP + EpoR로 형질도입된 T 림프구에서의 표면 EpoR 발현을 예시하는 흐름세포측정법 도트-플롯이다. 도 1d는 15분 동안 10 IU/㎖ Epo를 이용한 자극 후 AF647-컨쥬게이션된 항체(BD Biosciences)로 검출된 STAT5 Y647의 인산화를 예시하는 대표적인 흐름세포측정법 도트-플롯이며; Epo 자극 전 1시간 동안 10 μM 룩솔리티닙(ruxolitinib)으로 처리된 세포를 이용한 결과가 또한 제시된다. 도 1e는 외인성 사이토카인의 부재(Epo 없음) 또는 Epo의 존재(4 IU/㎖) 하에서 배양된 EpoR 형질도입된 T 세포 및 GFP 단독으로 형질도입된 T 세포의 생존을 제시하는 그래프이다. 기호는 투입 세포 수에 비한 세포 회수의 백분율을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2f는 EpoRm이 EpoR보다 더 높고 더 안정적인 발현을 가짐을 제시한다. 도 2a는 293T 세포에서의 EpoR 발현의 웨스턴 블롯 분석이다. EpoR, EpoRm 또는 GFP 단독으로 형질도입된 293T 세포의 세포 용해질은 환원 조건하에서 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리되었다. 블롯팅된 막은 마우스 항-플래그 항체(9A3; Cell Signaling Technology)에 이어 호스라디쉬 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG(HRP, R&D Systems)로 프로빙되었으며; 토끼 항-인간 GAPDH(EPR16891; Abcam)에 이어 HRP에 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG(Abcam)가 GAPDH(로딩 대조군)를 검출하기 위해 사용되었다. 항체 결합은 Clarity Western ECL 기질(Bio-Rad)에 의해 밝혀졌고, ChemiDoc Touch Imager(Bio-Rad)에 의해 시각화되었다. 도 2b는 EpoR, EpoRm 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구의 흐름세포측정법 분석이다. 흐름세포측정법 도트-플롯은 PE-컨쥬게이션된 항-EpoR 항체(R&D Systems)에 의해 검출된 바와 같은 EpoR 발현을 예시한다. 각각의 사분면의 세포의 백분율이 제시된다. 도 2c는 EpoR 또는 EpoRm으로 형질도입된 T 세포의 EpoR을 발현하는 GFP+ T 세포의 백분율(좌측) 또는 EpoR의 평균 형광 강도(MFI)(우측)를 제시하는 차트이다. ****, P < 0.0001. 도 2d는 EpoR을 발현하는 6명의 공여자로부터의 CD4+(좌측) 또는 CD8+(우측) T 세포의 백분율을 제시하는 차트이다. ****, P < 0.0001. 도 2e는 EpoR 또는 EpoRm으로 형질도입된 3명의 공여자로부터의 T 세포에서 GFP의 MFI와 EpoR의 MFI 사이의 관계를 제시하는 그래프이다. 각각의 패널은 1명의 공여자의 T 세포를 이용한 결과를 제시한다. ****, P < 0.0001. 도 2f는 EpoR 또는 EpoRm으로 형질도입된 후 10 IU/㎖ Epo로 자극된 3명의 공여자로부터의 T 림프구를 제시하는 그래프이다. 표면 EpoR의 발현은 자극 후 표시된 시점에서 흐름세포측정법에 의해 평가되었다. 각각의 패널은 1명의 공여자의 T 세포를 이용한 결과를 제시한다.
도 3a 내지 도 3e는 EpoRm이 Epo 신호전달을 향상시키는 것을 제시한다. 도 3a는 15분 동안 Epo(10 IU/㎖)로 자극 후 EpoR, EpoRm 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 세포에서 STAT5의 인산화를 예시하는 대표적인 흐름세포측정법 윤곽 플롯이다. 도 3b는 EpoR 또는 EpoRm으로 형질도입된 3명의 공여자로부터의 T 세포에서 GFP의 MFI와 pSTAT5의 MFI 사이의 관계를 제시하는 그래프이다. 각각의 패널은 1명의 공여자의 T 세포를 이용한 결과를 제시한다. ****, P < 0.0001. 도 3c는 10 IU/㎖ Epo로 자극되거나 Epo 자극 전에 10 μM 룩솔리티닙으로 처리된 EpoR, EpoRm 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 세포에서 pSTAT5를 발현하는 GFP+ 세포의 백분율을 제시하는 플롯이다. 각각의 기호는 1회 실험의 결과를 나타낸다. ****, P < 0.0001; **, P < 0.01. 도 3d는 15분 동안 상이한 농도의 Epo로 자극 후 pSTAT5를 발현하는 GFP+ 세포의 백분율을 제시하는 그래프이다. 각각의 기호는 2회 실험의 평균 값을 나타낸다. 도 3e는 10 IU/㎖ Epo로 자극된 EpoR, EpoRm 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 세포를 제시하는 그래프이고, pSTAT5는 표시된 시점에서 흐름세포측정법에 의해 평가되었다. 각각의 기호는 2회 실험의 평균 값을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 T 세포에서 EpoRm에 의해 유도된 증식 및 생존 신호를 제시한다. 도 4a는 사이토카인 무함유 배지에서 3일의 배양 후 자극되지 않거나(상단 열), 10 IU/㎖ Epo로 자극된(하단 열) EpoR, EpoRm 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구의 세포 주기 분석을 예시하는 흐름세포측정법 도트-플롯이다. FxCycle 염색에 의해 검출된 DNA 함량은 x 축에 제시되며; Edu 통합에 의해 제시된 DNA 합성은 y 축에 제시된다. Edu+ 세포는 이들의 백분율과 함께 박스에 제시된다. 도 4b는 3주 동안 외인성 사이토카인의 부재(Epo 없음) 또는 Epo의 존재(10 IU/㎖)하에서 배양된 EpoR, EpoRm 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구의 생존을 제시하는 그래프이다. 기호는 삼중 측정에서 투입 세포의 수에 비한 세포 회수의 평균(± SD) 백분율을 나타낸다. **** P <0.0001; ** P <0.01. 도 4c는 100 IU/㎖ IL-2 및/또는 10 IU/㎖ Epo와 함께 또는 이들 없이 6 내지 8일 배양 후 투입 세포에 비한 T 세포 회수의 백분율을 제시하는 그래프이다. 각각의 기호는 4명의 공여자 중 1명의 T 세포를 이용한 측정을 나타낸다(3명의 공여자에 대해 3회 측정의 평균, 및 1명의 공여자에 대해 1회 측정). * P = 0.02. 도 4d는 Epo의 부재 또는 존재(10 IU/㎖)하에서 100 IU/㎖ IL-2와 함께 배양된 EpoR, EpoRm 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구의 생존을 제시하는 그래프이다. 표시된 날짜에 투입 세포에 비한 T 세포 회수의 백분율이 제시된다.
도 5a 내지 도 5f는 EpoRm-CAR T 세포의 발현 및 기능을 제시한다. 도 5a는 EpoRm-CAR 작제물의 개략적 대표도이다. 도 5b는 EpoRm-CAR로 형질도입된 T 세포에서 CAR 및 EpoR의 표면 발현을 예시하는 흐름세포측정법 도트-플롯이고; GFP 단독으로 형질도입된 세포가 대조군으로 사용되었다. 각각의 사분면의 세포의 백분율이 제시된다. EpoR 발현을 검출하기 위해 세포가 EpoR-PE 항체로 염색되었고; CAR 발현은 염소 항-마우스 F(ab')2 항체 및 스트렙타비딘-APC(Jackson ImmunoResearch)로 검출되었다. 도 5c는 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구 중에서 CAR(좌측) 및 EpoR(우측)을 발현하는 GFP+ 세포의 백분율을 제시하는 플롯이다. 각각의 기호는 1회 형질도입에 대한 측정에 해당한다. 수평 막대는 중앙값을 나타낸다. 도 5d는 10 IU/㎖ Epo를 이용한 15분 자극, 또는 Epo 자극 전에 10 μM 룩솔리티닙을 이용한 1시간 전처리 후에 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구에서 pSTAT5를 발현하는 GFP+ 세포의 백분율을 제시하는 플롯이다. 각각의 기호는 1회 형질도입에 대한 측정에 해당한다. 수평 막대는 중앙값을 나타낸다. 도 5e는 CD19+ 세포주 OP-1, RS4;11 및 Nalm6에 대한 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구의 세포독성을 제시하는 차트이다. 막대는 1:1 E:T 비율에서 4시간 세포독성 검정에서 삼중 실험의 평균(± SD)을 나타낸다. 도 5f는 10 IU/㎖ Epo의 존재하에서 표시된 E:T 비율에서 OP-1 mCherry 세포에 대한 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구의 장기 세포독성을 제시하는 그래프이다. 기호는 표시된 시점에서 측정된 평균(± SD) 백분율 세포독성을 나타낸다. * P = 0.03; ** P < 0.01.
도 6a 내지 도 6f는 Epo가 EpoRm-CAR T 세포의 증식을 지원함을 제시한다. 도 6a는 10 IU/㎖ Epo의 부재 또는 존재하에서 Streck 처리되거나 방사선 조사된 OP-1 세포와 1:1 비율로 공동 배양된 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 3명의 공여자로부터의 T 림프구의 생존 및 확장을 제시하는 차트이다. 각각의 기호는 투입 세포의 수와 비교한 세포 회수의 백분율을 나타낸다. 단지 2회의 측정의 평균이 제시되는 1명의 공여자에 대한 14일 측정을 제외하고는 삼중 배양의 평균(± SD)이 제시된다. 도 6b는 10 IU/㎖ Epo의 존재하에서 1 μM 룩솔리티닙과 함께 또는 이 없이 7일의 배양 후 투입 세포에 비한 EpoRm-CAR-형질도입된 T 세포의 회수를 제시하는 플롯이다. *** P < 0.001. 도 6c는 10 IU/㎖ 또는 100 IU/㎖의 IL-2와 함께 10 IU/㎖ Epo의 존재하에서 1:1 비율로 방사선 조사된 CD19+ OP-1과의 공동 배양 7일 후 회수된 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구의 백분율을 제시하는 차트이다. 각각의 기호는 삼중 배양의 평균을 나타낸다. 도 6d는 표시된 시점에서 10 IU/㎖ Epo 및/또는 100 IU/㎖ IL-2로 자극 후 EpoRm-CAR 형질도입된 T 세포에서 pSTAT5의 MFI를 제시하는 플롯이다. 도 6e는 표시된 농도의 Epo 및 IL-2로 자극된 pSTAT5를 발현하는 GFP+ EpoRm-CAR 형질도입된 T 세포의 백분율을 제시하는 플롯이다. * P = 0.045; ** P <0.01. 도 6f는 EpoRm-CAR 형질도입된 T 세포가 10 IU/㎖ Epo 또는 100 IU/㎖ IL-2로 자극 전에 표시된 용량으로 1시간 동안 토파시티닙(tofacitinib)(n = 2) 또는 룩솔리티닙(n = 1)으로 처리되었음을 나타내는 차트이다. 막대는 토파시티닙에 대한 2회 측정의 평균 및 룩솔리티닙에 대한 1회 측정을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7e는 면역결핍 마우스에서 EpoRm-CAR T 세포의 생체 내 종양 사멸 및 확장을 제시한다. 도 7a는 5 x 105 Nalm6-루시페라제 세포를 i.v. 주입한 NSG 마우스의 대표적 이미지이다. 2일 후, 4마리의 마우스에 2 x 107 EpoRm-CAR T 세포가 i.v. 주사되었고; 이들 중 2마리는 2주 동안 주 3회 100 IU Epo의 i.p. 주사가 투여되었고; 1마리의 마우스는 T 세포가 투여되지 않았다. 2일에서의 생물발광 복부 이미지는 Nalm6 생착을 문서화하기 위해 향상된 민감도로 제시된다. 도 7b는 패널 7A에 제시된 마우스에서 초 당 광자로 표현된 백혈병 세포 성장을 제시하는 플롯이다. 기호는 복부 및 등쪽 영상화에 의한 전체 생물발광에 해당한다. 총 복부 및 등쪽 생물발광 신호가 초 당 1 x 1010 광자에 도달한 경우 마우스는 안락사되었다. 도 7c는 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 세포가 i.v. 주사된 마우스의 말초 혈액에서 인간 CD45+ 세포의 절대 수를 제시하는 플롯이며; 일부 마우스는 표시된 바와 같이 2주 동안 주 3회 100 IU Epo가 i.p. 투여되었다. 혈액은 T 세포 주입 13일 후에 볼 출혈을 통해 획득되었다. * P = 0.02; ** P<0.01. 도 7d는 마우스 말초 혈액에서 인간 CD45+ GFP+ (상단) 및 인간 CD45+ (하단) T 세포의 존재를 예시하는 대표적 흐름세포측정법 윤곽 플롯이다. 도 7e는 15분 동안 80 ng/㎖의 마우스 또는 인간 Epo로 자극한 후 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 세포에서 pSTAT5 MFI를 제시하는 차트이다.
도 8a 내지 도 8c는 EpoRm-CAR T 세포의 탈과립화 및 사이토카인 방출 프로파일을 제시한다. 도 8a는 4시간 동안 1:1 E:T 비율로 OP-1 세포와 공동 배양 후 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 세포에서 CD107a를 발현하는 GFP+ 세포의 백분율을 제시하는 차트이다. 막대는 3명의 공여자의 세포를 이용한 평균(± SD) 삼중 측정을 나타낸다. 도 8b는 1:1 E:T 비율로 OP-1 세포와 6시간의 공동 배양 후 도 8a에서와 같이 형질도입된 T 세포에서 IFNγ(좌측) 및 TNFα(우측)를 발현하는 GFP+ 세포의 백분율을 제시하는 그래프이다. IFNγ에 대한 3명의 공여자 및 TNFα에 대한 1명의 공여자로부터의 세포를 이용한 삼중 측정의 평균(± SD)이 제시된다. *** P <0.001. 도 8c는 10 IU/㎖ Epo의 부재 또는 존재하에서 24시간 동안 1:4 E:T 비율로 OP-1 세포와의 공동 배양 후 EpoRm-CAR 형질도입된 T 세포에 의한 사이토카인 생성의 Luminex 분석 플롯이다.
도 9a 내지 도 9f는 이종이식 모델에서 EpoRm-CAR-T 세포의 항-백혈병 활성을 제시한다. 도 9a는 CAR, EpoRm-CAR 또는 GFP 단독으로 형질도입된 1 x 107 T 세포가 i.v. 주사된 NOD/scid IL2RGnull 마우스의 이미지이고; 한 그룹의 마우스에는 T 세포가 투여되지 않았다. 2주 후, 마우스에 루시페라제를 발현하는 2.5 x 105 Nalm6 세포가 i.v. 주사되었다. 복부 이미지는 수성 D-루시페린 포타슘 염(150 ㎍/g 체중)의 i.p. 주사 후 발광에 의해 측정된 Nalm6 세포 생착을 예시한다. 도 9b는 도 9a에 제시된 마우스 그룹에서의 발광 측정을 제시하는 차트이다. 59일째에 108 광자/초 미만의 신호를 갖는 각각의 그룹의 마우스의 수가 제시된다. 도 9c는 도 9a에 제시된 마우스에서 주입된 T 세포의 지속성을 제시하는 차트이다. 마우스 혈액은 뺨 찌르기에 의해 수집되었고, 세포는 APC(2D1; Biolegend) 또는 PE/Cy7 컨쥬게이션된 항-인간 CD45(HI30; BD Pharmingen) 및 PE-컨쥬게이션된 항-마우스 CD45(30-F11; BD Pharmingen)로 염색되었다. 모든 CD45+(인간 및 마우스) 림프계 세포 중 hCD45+ GFP+ 세포의 백분율이 제시된다. 도 9d는 루시페라제로 형질도입된 Nalm6 세포가 NOD/scid IL2RGnull 마우스에 i.v. 주사(마우스 당 5 x 105 세포)된 이미지이다. 4일 후, 종양 생착이 평가되었고, 1 내지 2 x 107 T 세포가 i.v. 주사되었다. 복부 이미지는 수성 D-루시페린 포타슘 염(150 ㎍/g 체중)의 i.p. 주사 후 발광에 의해 측정된 Nalm6 세포 생착을 예시한다. 도 9e는 도 9d에 제시된 마우스 그룹에서의 발광 측정을 제시하는 차트이다. 55일째에 108 광자/초 미만의 신호를 갖는 각각의 그룹의 마우스의 수가 제시된다. 도 9f는 2개 세트의 실험에 포함된 마우스의 총 장기 생존을 제시하는 차트이다.
도 10은 Epo 수용체 또는 GFP 단독으로 형질도입된 Jurkat 세포의 성장 곡선을 제시하는 차트이다. 각각의 기호는 3회 측정의 평균을 나타낸다.
예시적인 구현예의 설명은 하기와 같다.
야생형 에리트로포이에틴(Epo) 수용체의 이소성 발현 및 적혈구증가증과 관련된 천연 발생 트렁케이션된 형태의 이소성 발현이 인간 말초 혈액 림프구에 대한 Epo 반응성을 부여할 수 있는지의 여부와 관련된 실험이 본원에 기재된다. 상기 수용체 및 CAR을 인코딩하는 단일 작제물로 형질도입된 T 세포를 사용하여, 시험관 내 및 생체 내에서 CAR-T 세포를 특이적으로 확장시키는 Epo의 잠재성을 평가하였다.
Epo 수용체는 면역 세포(예를 들어, T 세포)에서 발현될 수 있으며, 기능적이다. 정상적인 Epo 수용체와 비교하여, 돌연변이체 Epo 수용체는 더 높고 더 지속되는 발현, 더 높은 신호 강도 및 T 세포 활성의 더 큰 자극을 나타내었다. 돌연변이체 EpoR의 우월성과 마찬가지로 T 세포에서 Epo 수용체의 발현 및 기능은 예기치 못한 일이다.
급성 림프모구 백혈병 및 CD19
급성 림프모구 백혈병(ALL)은 림프계 혈액 세포의 암이다. ALL은 신속히 진행되며, 치료하지 않으면 치명적이다. 표준 치료는 화학요법 및 조혈 줄기 세포 이식을 포함한다. CD19는 대부분의 ALL 사례에서 모든 백혈병 세포에서 발현되는 B 세포 특이적 항원이다.
본원에 기재된 벡터는 변형된 T 세포를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이는 차례로 ALL의 표적화된 치료에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 공정은 파괴를 위해 CD19+ B 세포를 표적화할 수 있고 이에 의해 ALL의 위험 및/또는 중증도를 감소시킬 수 있는 트랜스제닉 T 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 특정 예는 패러다임으로서 CD19+ B 세포를 표적으로 하지만, 상기 접근법은 암 및 기타 질병의 발병기전에서 세포의 마커인 다른 항원을 표적으로 하는 데 적용할 수 있다.
핵산
본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 다중 뉴클레오티드 단량체(예를 들어, 리보뉴클레오티드 단량체 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체)를 포함하는 중합체를 나타낸다. "핵산"은, 예를 들어, DNA(예를 들어, 유전체 DNA 및 cDNA), RNA 및 DNA-RNA 하이브리드 분자를 포함한다. 핵산 분자는 천연 발생, 재조합 또는 합성일 수 있다. 또한, 핵산 분자는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥일 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 변형될 수 있다. 이중 가닥 중합체의 경우, "핵산"은 분자의 어느 한 가닥 또는 둘 모두의 가닥을 나타낼 수 있다.
용어 "뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 단량체"는 천연 발생 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체뿐만 아니라 이의 비-천연 발생 유도체 및 유사체를 나타낸다. 따라서, 뉴클레오티드는, 예를 들어, 천연 발생 염기(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 이노신, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 또는 데옥시시티딘)를 포함하는 뉴클레오티드 및 당 분야에 공지된 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 2개의 뉴클레오티드 서열 또는 2개의 아미노산 서열이 백분율로 표현되는 최대 동일성 수준을 달성하기 위해 서열이 정렬되는 경우 동일 위치에서 동일한 잔기를 갖는 정도를 나타낸다. 서열 정렬 및 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로 지정되며, 이는 시험 서열과 비교된다. 참조 및 시험 서열 사이의 서열 동일성은 최대 수준의 동일성을 달성하기 위해 참조 및 시험 서열의 정렬시 참조 및 시험 서열이 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 공유하는 참조 서열의 전체 길이에 걸친 위치의 백분율로 표현된다. 일 예로서, 최대 수준의 동일성을 달성하기 위해 정렬시 시험 서열이 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 동일 위치의 70%에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 경우에 70%의 서열 동일성을 갖는 것으로 간주된다.
최대 수준의 동일성을 달성하기 위한 비교를 위한 서열의 정렬은 적절한 정렬 방법 또는 알고리즘을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 일부 예에서, 정렬은 최대 수준의 동일성을 제공하기 위해 도입된 갭을 포함할 수 있다. 예로는 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 전산화된 구현(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA) 및 시각적 검사(일반적으로, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology] 참조)를 포함한다.
서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 후속 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 비한 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다. 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 일반적으로 사용되는 도구는 미국 국립보건원(United States National Institutes of Health)의 국립 의학 도서관(National Library of Medicine)인 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 이용 가능한 단백질 기본 국소 정렬 검색 도구(Protein Basic Local Alignment Search Tool; BLASTP)이다. (Altschul et al., J Mol Biol. 215(3):403-10 (1990)).
다양한 구현예에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 또는 2개의 아미노산 서열은, 적어도, 예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 확인하는 경우, 본원에 기재된 서열은 참조 서열이다.
벡터
용어 "벡터", "벡터 작제물" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시키고, 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진하기 위해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포로 도입될 수 있는 비히클을 의미한다. 벡터는 전형적으로 제한 효소 기술에 의해 단백질을 인코딩하는 외래 DNA가 삽입되는 전달 가능한 제제의 DNA를 포함한다. 일반적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 일반적으로 추가(외래) DNA를 용이하게 수용할 수 있고, 적합한 숙주 세포로 용이하게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자체 함유 분자이다. 플라스미드 및 진균 벡터를 포함하는 다수의 벡터가 다양한 진핵생물 및 원핵생물 숙주에서의 복제 및/또는 발현에 대해 설명되었다.
용어 "발현하다" 및 "발현"은, 예를 들어, 상응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역과 관련된 세포 기능을 활성화시켜 단백질을 생성함으로써 유전자 또는 DNA 서열의 정보가 명백해지도록 허용하거나 유발하는 것을 의미한다. DNA 서열은 단백질과 같은 "발현 생성물"을 형성하기 위해 세포에서 또는 세포에 의해 발현된다. 발현 생성물 자체, 예를 들어, 생성된 단백질은 또한 세포에 의해 "발현"되는 것으로 언급될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 예를 들어, 외래 또는 고유 프로모터의 제어 하에 외래 숙주 세포에서, 또는 외래 프로모터의 제어 하에 고유 숙주 세포에서 발현되거나 생성되는 경우 재조합적으로 발현된다. 유전자 전달 벡터는 일반적으로 벡터가 도입되는 숙주 세포에서 트랜스진의 발현에 필요한 프로모터 및 다른 핵산 요소에 작동 가능하게 연결된 트랜스진(예를 들어, 효소를 인코딩하는 핵산)을 포함한다. 유전자 발현 및 전달 작제물에 적합한 프로모터는 당 분야에 공지되어 있다. 재조합 플라스미드는 또한 세포에서 효소의 발현을 위한 유도성 또는 조절 가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
다양한 유전자 전달 비히클은 당 분야에 공지되어 있으며, 바이러스 및 비-바이러스(예를 들어, 네이키드 DNA, 플라스미드) 벡터 둘 모두를 포함한다. 유전자 전달에 적합한 바이러스 벡터는 당업자에게 공지되어 있다. 상기 바이러스 벡터는, 예를 들어, 헤르페스 바이러스로부터 유래된 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV) 및 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)를 포함한다. 바이러스 벡터는 복제되거나 복제되지 않을 수 있다. 상기 벡터는 본원에 개시되거나 인용되거나 관련 기술 분야의 당업자에게 달리 공지된 방법을 사용하여 많은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다.
유전자 전달을 위한 비-바이러스 벡터는 네이키드 DNA, 플라스미드, 트랜스포존 및 mRNA 등을 포함한다. 비제한적인 예는 pKK 플라스미드(Clonetech), pUC 플라스미드, pET 플라스미드(Novagen, Inc., Madison, Wis.), pRSET 또는 pREP 플라스미드(Invitrogen, San Diego, Calif.), pMAL 플라스미드(New England Biolabs, Beverly, Mass.)를 포함한다. 상기 벡터는 본원에 개시되거나 인용되거나 관련 기술 분야의 당업자에게 달리 공지된 방법을 사용하여 많은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 앰피실린 내성 유전자(Amp)와 같은 선택 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 mCherry와 같은 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 EcoRI와 XhoI 사이에 pMSCV-IRES-GFP로 서브클로닝하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 벡터는 원하는 유전자의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위(MCS)를 함유한다.
대부분의 아미노산이 다중 코돈("동의어" 또는 "동의어" 코돈으로 언급됨)에 의해 표현된다는 점에서 유전 코드는 축퇴성이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 사용은 무작위가 아니며 특정 코돈 삼중체(triplet)로 편향된다는 것이 당 분야에서 이해된다. 따라서, 일부 구현예에서, 벡터는 특정 유형의 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화(예를 들어, 코돈 최적화를 통함)된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 코돈 최적화는 관심 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 해당 폴리뉴클레오티드의 특정 코돈을 동일한 아미노산(들)을 인코딩하지만 핵산이 발현될 숙주 세포에서 더 일반적으로 사용/인지되는 코돈으로 대체하도록 변형되는 과정을 나타낸다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 T 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
에리트로포이에틴(Epo) 수용체 및 이의 돌연변이체
본원에서 사용되는 용어 "Epo 수용체"는 당단백질 사이토카인인 에리트로포이에틴에 결합하는 단백질을 나타낸다. 특정 Epo 수용체 및 이의 돌연변이체는 예시에 기재된다.
돌연변이체 Epo 수용체의 예는 트렁케이션된 Epo 수용체를 포함하며, 이는 프레임시프트, 삽입 및 결실을 포함하여 여러 상이한 유형의 돌연변이에 의해 형성될 수 있다. C-말단 음성 조절 도메인이 없는 것들은 적혈구에서 Epo 자극에 대해 과민성을 나타낸다. 일 예는 조기 정지 코돈을 인코딩하는 Epo 수용체 유전자의 엑손 8 내에 넌센스 돌연변이를 갖는 Epo 수용체를 인코딩하는 핵산에 의해 표시된다. 상기 돌연변이체는 적혈구 전구세포에서 증강된 Epo 신호전달을 갖는 EpoR의 트렁케이션된 형태를 생성할 수 있다. EpoR 돌연변이체의 한 특정 예는 뉴클레오티드 6002에서 돌연변이를 가져 코돈 439가 트립토판(TGG) 대신 정지 코돈(TAG)을 인코딩한다.
키메라 항원 수용체(CAR) 작제물
도 5a는 힌지 및 막횡단 도메인에 커플링된 항-CD19 단일쇄 가변 단편(항-CD19 scFv)인 특정 작제물을 예시한다. 도 5a의 특정 예에서, 힌지 및 막횡단 도메인은 CD8α 힌지 및 막횡단 도메인이다. 항-CD19 scFv는 항-CD19 가변 경쇄 도메인, 항-CD19 가변 중쇄 도메인, 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결하는 링커 도메인을 포함한다. 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인의 상대적 위치는 역전될 수 있지만, 이들은 모두 CD8α 힌지 및 막횡단 도메인으로서 도 5a에 예시된 막횡단 도메인에 대해 N' 말단에 존재한다. 작제물은 또한 CD8α 신호 펩티드와 같은 N-말단 신호 펩티드를 포함할 수 있다(SEQ ID NO:21 및 22 참조). 표면 단백질의 신호 펩티드가 일반적으로 적합하다.
다양한 링커 도메인이 적합하다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 (G4S)x(SEQ ID NO:24)일 수 있으며, 여기서 x는 1 내지 100의 정수이고; 바람직하게는, x는 1 내지 10의 정수이고; 더욱 더 바람직하게는, x는 2 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 (G4S)3(SEQ ID NO:25)일 수 있다. 다른 구현예에서, 링커 도메인은 하나 이상의 글리신 잔기, (예를 들어, (G)y(SEQ ID NO:26)일 수 있으며, 여기서 y는 2 내지 100의 정수이다. 다른 구현예에서, 링커 도메인은 (EAAAK)3(SEQ ID NO:27)일 수 있다. (G4S)x(SEQ ID NO:24), (G4S)3(SEQ ID NO:25) 및 (G)y(SEQ ID NO:26)는 유연한 링커의 예인 반면, (EAAAK)3(SEQ ID NO:27)는 보다 견고한 링커의 예이다.
다양한 힌지 및 막횡단 도메인이 적합하다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD8α 막횡단 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 및 막횡단 도메인은 CD8α 힌지 및 막횡단 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지는 복수의 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD4, CD8β, CD16, CD28, CD32, CD34, CD64, CD137, FcεRIγ, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, VEGFR2, FAS 또는 FGFR2B로부터의 막횡단 도메인일 수 있다.
도 5a의 구현예는 항-CD19 작제물인 반면, CD20, CD22, CD123, CD33, B-세포 성숙 항원(BCMA), 메소텔린, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2), 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 디시알로강글리오시드(GD)-2와 같은 다른 표적 항원에 대한 작제물을 생성시키는 데 유사한 접근법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 도 5a의 도식을 기반으로 하여, 항-CD19 scFv 부분은 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 상이한 scFv로 대체될 수 있다.
작제물은 또한 Epo 수용체를 인코딩한다. 도 5a의 작제물에서, Epo 수용체는 아미노산 439에 대한 코돈을 TGG(Trp)에서 TAG(정지)로 변경하기 위해 부위 특이적 돌연변이유발 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 생성된 돌연변이체(EpoRm)이다. Epo 수용체의 다른 돌연변이체는 당 분야에 공지되어 있으며, 천연에 존재하지 않는 다른 Epo 수용체 변이체가 생성될 수 있다. 하나의 예는 수용체의 세포 내 부분에 존재하는 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)이 결여된 Epo 수용체이며, 이는 향상된 신호전달 특성을 가질 수 있으며, 적합할 수 있다. 또 다른 예는 세포 내 부분에 다수의 JAK2 결합 도메인을 갖는 Epo 수용체이다.
작제물에서, Epo 수용체는 자가 절단 펩티드인 2A 펩티드에 의해 키메라 항원 수용체(CAR)와 결합된다. Epo 수용체와 CAR을 결합시킴으로써 단일 벡터에서 둘 모두의 단백질의 공동발현이 달성될 수 있다. 2A 펩티드의 예는 P2A(SEQ ID NO:13 및 14), T2A(SEQ ID NO:15 및 16), E2A(SEQ ID NO:17 및 18) 및 F2A(SEQ ID NO:19 및 20)이나, 다른 2A 펩티드가 당 분야에 공지되어 있다.
트랜스제닉 숙주 세포를 제조하는 방법
트랜스제닉 T 세포와 같은 트랜스제닉 숙주 세포를 제조하는 방법이 본원에 기재된다. 트랜스제닉 숙주 세포는, 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 벡터 구현예를 숙주 세포에 도입시킴으로써 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 항-CD19-41BB-CD3ζ와 같은 Epo 수용체 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이시스트로닉 벡터(bicistronic vector)와 같은 핵산은 Epo 수용체 및 CAR을 발현한다. 일부 구현예에서, Epo 수용체 및 CAR을 발현하는 트랜스제닉 T 세포와 같은 트랜스제닉 세포를 생성시키기 위해 2개의 별개의 벡터가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 중 하나 이상은 숙주 세포의 유전체로 통합된다. 일부 구현예에서, 숙주 유전체로 통합될 핵산은, 예를 들어, 상동성 재조합, CRISPR 기반 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cpf1) 및 TALEN 시스템을 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 다양한 적합한 방법론을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다.
다양한 숙주 세포, 가장 전형적으로 면역 세포가 적합하다. T 세포(T 림프구)에 더하여, EpoR의 발현은 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포 및 다른 면역 세포를 활성화시킬 것으로 예상된다. 일부 예에서, T 세포는 인간 말초 혈액 T 림프구일 수 있다. 일부 예에서, T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있다. 일부 예에서, T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다.
일부 예에서, T 세포는 또한 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현할 수 있다. 일부 예에서, TCR은 내인성일 수 있다. 예를 들어, T 세포는 종양에서 추출되고 생체 외에서 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)일 수 있다. 일부 예에서, TCR은 외인성일 수 있다. 예를 들어, TCR은 바이러스 형질도입 또는 다른 수단에 의해 T 세포에서 발현될 수 있다. TCR은 바이러스 펩티드, 예를 들어, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 펩티드 또는 종양 세포로부터 유래된 펩티드, 예를 들어, 흑색종 관련 항원(MAGE), NY-ESO-1, 텔로메라제 역전사효소(TERT)에 특이적일 수 있다.
값 및 범위
달리 표시되거나 문맥 및 당업자의 이해로부터 달리 명백하지 않다면, 범위로 표현되는 값은 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 다양한 구현예에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위범위를 가정할 수 있다. 수치 값과 관련하여 "약"은 달리 언급되거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않다면 일반적으로 값의 ±8%, 일부 구현예에서 ±6%, 일부 구현예에서 ±4%, 일부 구현예에서 ±2%, 일부 구현예에서 ±1%, 일부 구현예에서 ±0.5% 내에 해당하는 값의 범위를 나타낸다.
예시
재료 및 방법
세포
백혈병 세포주 Jurkat, Nalm6 및 RS4;11을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC; Rockville, MD)로부터 획득하였다. CD19+ B-계통 ALL 세포주 OP-1을 본 발명자의 실험실에서 개발하였다.19 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 mCherry 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 함유하는 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 레트로바이러스 벡터를 Nalm6에서 반딧불이 루시페라제 유전자 및 OP-1에서 mCherry를 각각 발현시키는 데 사용하였다. 세포주를 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 유지시켰다. 인간 배아 신장 섬유모세포 293T(HEK 293T) 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(HyClone, GE Life Sciences, Logan, Utah)에서 배양하였다.
말초 혈액 샘플을 싱가포르 국립 대학병원 혈액 은행(National University Hospital Blood Bank) 또는 보건과학청 혈액 은행(Health Science Authority Blood Bank)의 건강한 성인 공여자로부터의 폐기된 익명화된 혈소판 기증 부산물에서 획득하였다. 단핵 세포를 Lymphoprep 밀도 단계(Nycomed, Oslo, Norway)에서의 원심분리에 의해 분리하였고, RPMI-1640에서 2회 세척하였다. T 세포를 Dynabeads 인간 T-활성제 CD3/CD28(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 농축하였고, RPMI-1640, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 인터루킨-2(IL-2; 120 IU/㎖; Proleukin, Novartis, Basel, Switzerland)에서 배양하였다.
유전자 클로닝 및 레트로바이러스 형질도입
Epo 수용체(EpoR) cDNA를 GeneCopoeia(Rockville, MD)에서 획득하였다. 돌연변이체 EpoR(EpoRm)을 아미노산 439에 대한 코돈을 TGG(Trp)로부터 TAG(정지)로 변경하도록 부위 특이적 돌연변이유발 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 생성하였다.20 일부 실험에서, 플래그 태그(DYKDDDDK(SEQ ID NO:23))를 EpoR 및 EpoRm의 C-말단에 추가하였다. 항-CD19-41BB-CD3ζ CAR은 이전에 본 발명자의 실험실에서 제조하였다.21 EpoRm-2A-CAR을 2A 펩티드 서열을 통해 EpoRm 및 항-CD19-41BB-CD3ζ를 결합하는 융합 PCR에 의해 생성시켰다.22 작제물 및 발현 카세트를 pMSCV-IRES-GFP 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위에 서브클로닝하였다.
레트로바이러스 상층액의 제조 및 형질도입은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다.23 간단히, pMSCV 레트로바이러스 벡터 적응용 배지(conditioned medium)를 RetroNectin(Takara, Otsu, Japan) 코팅된 폴리프로필렌 튜브에 첨가하였고; 원심분리 및 상층액의 제거 후, T 세포(5 x 105)를 튜브에 첨가하고, 12시간 동안 37℃에서 방치하였고; 신선한 바이러스 상층액을 추가로 2일 연속 첨가하였다. 이후, T 림프구를 형질도입 후 7 내지 21일 동안 실험 시점까지 FBS, 항생제 및 200 IU/㎖ IL-2를 갖는 RPMI-1640에서 유지시켰다.
EpoR 및 CAR 발현의 검출
EpoR의 표면 발현을 피코에리트린(PE)-컨쥬게이션된 항-인간 EpoR 항체(38409; R&D Systems, Minneapolis, MN)로 검출하였다. 일부 실험에서, 2시간 동안 사이토카인 무함유 배지에서 배양된 세포에 대해 EpoR의 표면 염색을 수행한 후, 15 내지 60분 동안 37℃에서 10 IU/㎖의 재조합 인간 Epo(Thermo Fisher Scientific)와 함께 인큐베이션하였다. CAR의 발현을 비오틴-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 F(ab')2 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에 이어 알로피코시아닌에 컨쥬게이션된 스트렙타비딘(APC; Jackson ImmunoResearch)을 사용하여 검출하였다. PE/Cy7-컨쥬게이션된 항-CD4(SK3) 항체는 BD Biosciences(San Jose, CA)로부터 구입하였고; APC-컨쥬게이션된 항-CD8(BW135/80) 항체는 Miltenyl Biotec(Bergisch Gladbach, Germany)로부터 구입하였다. 모든 시험에서, 비-반응성 동형 일치 항체를 대조군으로 사용하였다. Diva(BD Biosciences) 또는 FlowJo 소프트웨어(FlowJo, Ashland, OR)와 함께 Accuri C6 또는 Fortessa 흐름세포측정기(BD Bioscience)를 사용하여 세포 염색을 분석하였다.
293T 세포에서의 EpoR 발현의 웨스턴 블롯 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다.24 간단히, Pierce BCA 단백질 검정 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용한 단백질 정량화 전에 CelLytic M 세포 용해 시약(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)을 사용하여 세포 용해질을 추출하였다. 세포 용해질을 환원 조건하에서 전기영동에 의해 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리 전에 4x Laemmli 샘플 완충액(Bio-rad, Hercules, CA)으로 희석시켰다. 블롯팅된 막을 마우스 항-플래그(9A3; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)에 이어 호스라디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG(R&D Systems)로 프로빙하였고; 토끼 항-인간 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)(EPR16891; Abcam, Cambridge, UK)에 이어 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG 항체(Abcam)를 로딩 대조군으로 사용하였다. 항체 결합은 Clarity Western ECL 기질(Bio-Rad)에 의해 밝혀졌고, ChemiDoc Touch Imager(Bio-Rad)에 의해 시각화되었다.
Epo 결합 및 신호전달의 검출
EpoR에 대한 Epo의 결합을 결정하기 위해, 세포를 실온에서 2시간 동안 비오티닐화된 Epo(R&D Systems)와 함께 인큐베이션하였다. 비오티닐화된 Epo를 스트렙타비딘-PE(Jackson ImmunoResearch)로 시각화하였다.
Epo 신호전달을 검출하기 위해, 세포를 2시간 동안 사이토카인 무함유 배지에서 인큐베이션한 후, 15분 내지 24시간 동안 37℃에서 Epo(0.01 내지 10 IU/㎖)로 자극하였다. 일부 실험에서, 세포를 Epo 자극 전에 1시간 동안 0.1 내지 10 μM의 룩솔리티닙(Selleckchem) 또는 0.5 내지 5 nM의 토파시티닙(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)으로 처리하였다. 이후, 세포를 1x 용해/고정 완충액(BD Biosciences)으로 고정하고, Perm Buffer III(BD Biosciences)로 투과시키고, Alexa Fluor 647(AF647)(47; BD Biosciences)에 컨쥬게이션된 항-STAT5(pY694)로 염색하였다. 일부 실험에서, 인간 Epo의 효과를 뮤린 Epo(Biolegend, San Diego, CA)의 효과와 비교하였다.
세포 증식 검정
세포 주기에 대한 Epo의 효과를 결정하기 위해, 세포를 3일 동안 사이토카인 무함유 배지에서 배양한 후, 1일 동안 10 IU/㎖의 Epo로 자극하였다. DNA 합성은 Click-iT EdU AF647 Flow Cytometry Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)로 측정하였으며, DNA 함량은 FxCycle Violet Stain(Thermo Fisher Scientific)으로 측정하였다.
세포 생존을 평가하기 위해, T 세포를 편평 바닥 96-웰 또는 24-웰 플레이트(Cellstar)에서 Epo(4 내지 10 IU/㎖)와 함께 또는 Epo(4 내지 10 IU/㎖) 없이 외인성 사이토카인의 부재하에서 배양하였다. 세포 증식을 위해, T 세포를 편평 바닥 96-웰 플레이트에서 1:1 효과기 대 표적(E:T) 비율로 표적 세포(OP-1 세포)와 공동배양하였고; Epo(10 IU/㎖)를 2일마다 첨가하였다. 성장을 억제하기 위해 방사선 조사(100 Gy)되거나 Streck 세포 보존제(Streck Laboratories, Omaha, NE)로 처리된 표적 세포를 배양 시작시 및 그 이후 7일마다 첨가하였다. 일부 실험에서, 저용량(10 IU/㎖) 또는 고용량(100 IU/㎖) IL-2를 또한 배양에 첨가하였다. GFP+ T 세포의 수는 흐름세포측정법으로 측정하였다.
세포독성 및 사이토카인 생성
세포독성을 시험하기 위해, CD19+ 표적 세포(OP-1, RS4;11, 및 Nalm6)를 칼세인 레드-오렌지 AM(Thermo Fisher Scientific)으로 표지하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트(Corning Costar, Corning, NY)에 넣었다. T 세포를 1:1의 E:T 비율로 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 표적 세포와 공동 배양하였다. 생존 가능한 표적 세포를 흐름세포측정법에 의해 계수하였다.25 장기 세포독성을 위해, OP-1 mCherry 세포를 96-웰 편평 바닥 플레이트에 넣고, T 세포를 상이한 E:T 비율로 첨가하고, 10 IU/㎖의 Epo와 함께 3일 동안 배양하였다. 플레이트를 4시간마다 데이터 수집(전체-웰 영상화)을 쌓도록 설정된 IncuCyte Zoom System(Essen BioScience)에 넣었다.
용해 과립의 세포외유출을 측정하기 위해, T 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 4시간 동안 1:1 E:T 비율로 OP-1 세포와 공동 배양하였다. PE-컨쥬게이션된 항-인간 CD107a 항체(H4A3; BD Biosciences)를 배양 시작 시에 첨가하고, 1시간 후에 모넨신(BD GolgiStop)을 첨가하였다.
인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 생성을 측정하기 위해, 1:1 E:T 비율의 표적 및 효과기 세포를 상기와 같이 플레이팅하였다. 1시간 후, 브레펠딘 A(BD GolgiPlug)을 배양에 첨가하고, 추가로 5시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, PE-컨쥬게이션된 항-IFN-γ(클론 25723.11; BD Biosciences) 또는 항-TNF-α(클론 6401.1111; BD Biosciences)을 사용한 세포 내 염색을 흐름세포측정법에 의한 분석 전에 수행하였다. 사이토카인 프로파일을 평가하기 위해, 표적 및 효과기 세포를 24시간 동안 10 IU/㎖ Epo의 부재 또는 존재하에서 1:4의 E:T 비율로 공동배양하였다. Luminex Multiplex Assay(Bio-Rad)로 분석하기 위해 배양 상층액을 수집하였다.
이종이식 실험
생체 내 T 세포의 생존을 결정하기 위해, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull) 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에 GFP 단독, CAR 또는 EpoRm-CAR로 형질도입된 1 x 107 T 세포를 정맥 내(i.v.) 주사하였다. 일부 마우스에서, 100 IU의 Epo를 2주 동안 2일마다 복강 내(i.p) 주사하였다. 13일에, 혈액 세포를 세포 계수기(Beckman Coulter, Miami, FL)로 계수하였다. 적혈구 용해 용액(Sigma-Aldrich)을 이용한 처리 후, 세포를 APC-컨쥬게이션된 항-인간 CD45(2D1; Biolegend) 및 PE-컨쥬게이션된 항-마우스 CD45(30-F11; BD Pharmingen)로 염색하였다.
항-백혈병 활성을 평가하기 위해, NOD-scid-IL2RGnull 마우스에 1x107 T 세포를 i.v. 주사하고, 2주 후, 루시페라제를 발현하는 2.5x105 Nalm6 세포를 i.v. 주사하였다. ALL 세포 생착을, 수성 D-루시페린 포타슘 염(150 ㎍/g 체중; Perkin Elmer)의 i.p. 주사 후 Xenogen IVIS-200 System(Perkin Elmer, Waltham, MA)으로 발광 신호를 측정하여 결정하였고; 신호를 Living Image 3.0 소프트웨어로 분석하였다. 또 다른 모델에서, 5x105 Nalm6-루시페라제 세포를 i.v. 주사하고, 4일 후, 1 내지 2x107 T 세포를 i.v. 주사하였다. 발광이 초 당 1 x 1010 광자에 도달하면 마우스를 안락사시키고, 안락사를 정당화하는 신체적 징후가 있는 경우에는 더 일찍 안락사시켰다.
T 세포의 항-백혈병 활성을 시험하기 위한 또 다른 모델에서, 루시페라제로 형질도입된 Nalm6 세포를 i.v. 주사(마우스 당 5 x 105개의 세포)한 후, 2일 후 EpoRm-CAR을 발현하는 T 세포를 주사(마우스 당 2 x 107개의 세포, i.v.)한 반면, 대조군 마우스는 T 세포를 투여하지 않았고; 일부 마우스는 주 당 3회 Epo(100 IU)를 i.p. 투여하였다. 종양 세포 로드를 수성 D-루시페린 포타슘 염(150 ㎍/g 체중; Perkin Elmer)을 i.p. 주사한 후 Xenogen IVIS-200 System(Perkin Elmer, Waltham, MA)으로 결정하였다. 발광을 Living Image 3.0 소프트웨어로 분석하였다. 발광이 초 당 1 x 1010 광자에 도달하면 마우스를 안락사시키고, 안락사를 정당화하는 신체적 징후가 있는 경우 더 일찍 안락사시켰다.
Jurkat 세포 성장 곡선
세포 성장에 대한 EpoR 및 EpoRm 발현의 효과를 결정하기 위해, GFP 단독, EpoR 및 EpoRm으로 형질도입되고 동일한 배양 조건하에서 유지된 Jurkat 세포의 수를 주기적으로 계수하였다.
결과
EpoR은 T 세포에서 발현될 수 있으며, Epo 생존 신호를 매개한다.
EpoR 유전자를 사용한 Jurkat 세포의 레트로바이러스 형질도입은 수용체의 높은 발현을 발생시켰다(도 1a). EpoR을 발현하는 세포는 Epo에 결합할 수 있는 반면, GFP 단독으로 형질도입된 세포에서는 검출 가능한 결합이 없었다(도 1b). 다음으로, 본 발명자는 EpoR이 말초 혈액 T 림프구에서도 발현될 수 있는지의 여부를 결정하였다. 이를 위해, 본 발명자는 항-CD3 및 CD28 항체 및 IL-2로 말초 혈액 단핵 세포를 자극하고, EpoR 유전자 또는 GFP 단독으로 이들을 형질도입시켰다. 4명의 공여자의 T 세포를 사용한 5개의 실험에서, EpoR을 발현하는 형질도입된 T 림프구(GFP+)의 백분율은 74.9% ± 4.8%였고; EpoR은 GFP 단독으로 형질도입된 세포에서 검출 가능하지 않았다(도 1c).
EpoR이 기능적인지의 여부를 시험하기 위해, 본 발명자는 15분 동안 EpoR-형질도입된 T 림프구를 Epo(10 IU/㎖)에 노출시키고, 적혈구 세포에서 EpoR 라이게이션에 의해 촉발된 하류 활성화 신호 중 하나인 STAT5 Y647의 인산화를 측정하였다.26,27 3명의 공여자로부터의 T 세포를 이용한 실험에서, GFP+ EpoR-형질도입된 T 림프구 중 pSTAT5-양성 세포의 백분율은 Epo 노출 후 1.0% ± 0.9%에서 85.9% ± 5.1%로 증가하였고; 이는 GFP 단독으로 형질도입된 T 림프구에서 본질적으로 변하지 않았다(1.3% ± 0.4%에서 1.5% ± 0.7%)(도 1d). 적혈구 세포에서 EpoR 라이게이션 후, JAK2 키나제는 STAT5를 인산화한다.28 EpoR T 림프구를 JAK1/2 억제제인 룩솔리티닙에 노출시킨 후,29 Epo에 의해 유도된 STAT5 인산화가 제거되었다(도 1d). 최종적으로, EpoR-형질도입된 T 세포로의 Epo(4 IU/㎖)의 첨가는 외인성 IL-2의 부재하에서 배양에서 생존을 지원하였다(도 1e). 종합하면, 이들 결과는 EpoR이 T 림프구에서 발현될 수 있고, Epo에 대한 노출이 EpoR-발현 T 림프구에서 생존 신호를 전달할 수 있음을 제시한다.
EpoR 돌연변이체는 T 세포에서 EpoR 발현을 향상시킨다.
EpoR 엑손 8의 넌센스 돌연변이가 적혈구 전구세포에서 Epo 신호전달이 증가된 EpoR의 트렁케이션된 형태를 생성하여 적혈구 생산량을 증가시킨다는 것이 이전에 보고되었다.20,30 본 발명자는 트립토판을 인코딩하는 코돈 439(TGG)의 돌연변이가 삽입되어 이를 정지 코돈 TAG로 변경한 EpoR 돌연변이체("EpoRm")를 인코딩하는 cDNA를 생성하였다. 293T 세포에서 cDNA를 발현한 후, 본 발명자는 EpoR에 대한 62 kDa와 비교하여 인코딩된 단백질이 웨스턴 블로팅에 의해 54 kDa의 예측 크기를 갖는 것을 발견하였다(도 2a). 본 발명자는 활성화된 말초 혈액 T 림프구에서 EpoR 및 EpoRm을 발현시켰고, EpoRm의 발현 수준이 동일한 T 세포에서 야생형 EpoR 작제물에 대해 측정된 것보다 지속적으로 더 높음을 관찰하였다(도 2b). 따라서, 7명의 공여자로부터의 T 림프구를 이용한 18개의 실험에서, EpoR을 발현하는 GFP+ T 세포의 백분율은 EpoRm에 대한 93.1% ± 6.1%에 비해 71.9% ± 14.1%였고(대응표본 t 검정에 의해 P <0.0001); 평균 형광 강도(MFI)는 각각 3,620 ± 2,449 및 8,773 ± 5,851이었다(P <0.0001)(도 2c). EpoRm 발현은 세포가 CD4+ 또는 CD8+인지에 관계없이 더 높았다(도 2d).
EpoR 또는 EpoRm으로 형질도입된 T 세포의 전체 GFP 발현은 유의하게 상이하지 않았다: GFP+ T 세포의 백분율은 EpoR로 75.2% ± 8.4%였고, EpoRm으로 80.4% ± 7.5%였으며; MFI는 각각 7,003 ± 2,820 및 8,331 ± 3,343이었다(어느 한 비교에 대해 P >0.05). 따라서, 2개의 수용체 사이의 발현의 차이는 단순히 상이한 형질도입 효율 때문인 것 같지는 않다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자는 상기 가능성을 해결하고, 3개의 실험에서 제공된 수준의 GFP 발현과 관련하여 수용체 발현 수준의 상세한 분석을 수행하였다. 이들 측정에 의해, EpoRm 발현은 EpoR보다 높았다(도 2e; 3개 모두의 비교에 대해 P <0.0001).
EpoRm의 더 높은 발현은 Epo에 대한 노출 후의 더 오랜 지속과 관련이 있었다. 3명의 공여자로부터의 T 세포를 사용한 실험에서, EpoR-양성 세포의 백분율 감소는 EpoRm으로 형질도입된 세포보다 EpoR로 형질도입된 세포에서 명백히 더 높았다(도 2f).
EpoRm의 신호전달 특성
EpoRm의 더 높고 더 지속적인 발현에 따라, Epo에 대한 T 세포의 노출은 이들 세포가 EpoRm을 발현한 경우 더 활발한 활성을 발생시켰다. EpoRm T 세포는 EpoR T 세포보다 높은 pSTAT5 Y647 인산화를 가졌으며, 이는 JAK1/2 억제제 룩솔리티닙(10 mM)에 대한 노출에 의해 억제되었다(도 3a, 도 3b, 도 3c). EpoRm에 의해 야기된 더 높은 STAT5 인산화는 GFP의 수준에 따른 pSTAT5 Y647 MFI의 분석에 의해 확증되었다. GFP에 의해 측정된 임의의 제공된 수준의 레트로바이러스 형질도입에서, pSTAT5 MFI는 EpoRm으로 더 높았으며, 이는 더 낮은 수준의 형질도입에서 pSTAT5 신호전달의 플래토(plateau)에 접근하였다(도 3b). Epo에 의해 촉발된 STAT5 인산화는 용량 의존적이었고, EpoRm은 STAT5 인산화를 유도하기 위해 더 낮은 Epo 수준을 요구하였다. 따라서, 2개의 실험에서, 0.1 IU/㎖ 용량의 평균 pSTAT5 Y647은 EpoRm의 경우 29.1%에 비해 EpoR의 경우 8.9%였으며; 이는 1 IU/㎖의 Epo로 88.6%에 비해 66.1%였다(도 3d). STAT5 인산화는 또한 EpoR을 발현하는 세포에서보다 EpoRm을 발현하는 세포에서 더 오래 지속되었다(도 3e).
24시간 동안 Epo에 대한 노출은 Epo 수용체를 갖는 T 세포에서 DNA 합성을 유도하였고, 자극은 EpoRm을 발현하는 세포에서 더 높았다(도 4a). IL-2의 부재하에서, T 세포는 Epo 수용체 발현에 관계없이 신속하게 사멸하였다. 그러나, Epo가 배양에 첨가된 경우, Epo 수용체를 발현하는 세포는 적어도 2주 동안 지속되었고, EpoRm을 발현하는 T 세포의 배양은 더 높은 세포 수를 생성시켰다(도 4b).
본 발명자는 세포가 100 IU/㎖의 IL-2의 존재하에서 배양된 경우 Epo 자극이 T 세포 회수를 추가로 개선시킬지의 여부를 결정하였다. 4명의 공여자로부터의 세포를 이용한 실험에서, Epo(10 IU/㎖)를 IL-2(100 IU/㎖)에 첨가한 경우 7일 배양 후에 EpoRm으로 형질도입된 T 세포의 회수는 유의하게 더 높았고(P = 0.020); 이들 조건하에서, 세포 회수는 EpoR로 형질도입된 세포보다 더 나았다(P = 0.019)(도 4c). 14일 동안 연장된 개별 배양에서, Epo 수용체를 발현하는 T 세포는 GFP 단독으로 형질도입된 세포보다 더 높고 더 지속되는 확장을 나타내며; 마찬가지로, EpoRm 세포는 EpoR 세포보다 더 잘 수행되었다(도 4d).
동시에 발현된 EpoRm 및 CAR의 기능적 활성
이전 실험은 EpoRm이 T 세포에서 야생형 Epo 수용체보다 더 높은 발현을 가졌고, 더 강하고 더 지속적인 신호를 생성한 것을 나타내었다. 따라서, 본 발명자는 본 발명자의 실험실에서 개발된 항-CD19-41BB-CD3ζ CAR을 인코딩하는 유전자를 또한 함유하는 바이시스트로닉 벡터에 EpoRm을 인코딩하는 유전자를 통합하였다(도 5a).21 T 림프구에서 상기 작제물의 형질도입은 EpoRm 및 CAR 둘 모두의 발현을 발생시켰고(도 5b), 어느 한 유전자는 단일 유전자 벡터로 형질도입된 세포의 수준과 유사한 수준으로 발현되었다(도 5c). EpoRm의 기능성은 그것이 단독으로 또는 CAR과 조합하여 발현되는지에 관계없이 유지되었다(도 5d).
CAR-T 세포 기능은 EpoRm을 발현하는 세포에서도 유지되었다. 따라서, CAR-T 세포가 EpoRm을 발현하는지 또는 배양에 Epo가 존재하는지에 관계없이 CD19+ ALL 세포주 OP-1 세포와의 4시간의 공동 배양 후 CD107a 발현에 의해 측정된 바와 같이 세포독성 과립의 세포외유출에 차이가 없었다(도 8a). 동일한 배양 조건하에서 CAR 자극에 의해 촉발된 IFNg의 분비는 또한 Epo 신호전달에 의해 영향을 받지 않았지만, 본 발명자는 EpoRm-CAR-T 세포가 EpoRm이 결여된 CAR-T 세포보다 Epo의 존재하에서 더 많은 TNFα를 분비한 것을 관찰하였다(P <0.001)(도 8b). Epo와 함께 및 Epo 없이 OP-1 세포와 공동 배양된 EpoRm-CAR T 세포의 사이토카인 프로파일은 대체로 유사했지만, 본 발명자는 Epo로 배양된 세포에서 더 높은 수준의 IL-6 및 IL-4 및 더 낮은 수준의 IL-2를 주목하였다(도 8c).
본 발명자는 CD19+ 표적 세포를 사멸시키는 EpoRm-CAR T 세포의 능력을 결정하였다. 3개의 ALL 세포주(OP-1, RS4;11 및 Nalm6)를 사용한 실험에서, 1:1 E:T의 이들 T 세포의 4시간 세포독성은 Epo(10 IU/㎖)가 배양에 첨가되었는지의 여부에 관계없이 CAR 단독으로 형질도입된 T 세포의 세포독성과 구별할 수 없었다(도 5e). 그러나, Epo의 존재하에서 72시간에 걸쳐 세포독성을 시험한 경우, 낮은(1:4, 1:8) E:T 비율에서 CAR-T 세포에 비해 EpoRm-CAR T 세포에 의한 사멸이 유의하게 더 높았다(도 5f).
EpoRm-CAR T 세포에서의 Epo 및 IL-2의 증식 신호
장기 배양에서 EpoRm-CAR T 세포에 의해 발휘된 더 높은 사멸은 이들 세포의 더 높은 증식 속도로 설명될 수 있으며, 이에 의해 더 높은 E:T 비율을 생성한다. 이러한 개념을 시험하기 위해, EpoRm-CAR, CAR 단독 또는 GFP로 형질도입된 T 세포를 Streck-처리 또는 방사선 조사된 OP-1 세포와 함께 공동 배양하고, 2주에 걸쳐 T 세포 성장을 모니터링하였다. 본 발명자는 배양에 Epo(10 IU/㎖)를 추가했지만, 외인성 IL-2를 추가하지 않았다. 도 6a에 제시된 바와 같이, 3명의 공여자로부터의 T 세포의 확장은 CAR-T 세포가 EpoRm을 발현한 경우에 더 높았으며, 이는 CAR-유도 세포 증식이 EpoRm 신호전달에 의해 향상되는 것을 나타낸다. EpoRm-CAR T 세포 증식은 룩솔로티닙(1 μM)에 의해 제거되었다(도 6b). Epo 자극이 외인성 IL-2에 의해 제공되는 자극에 추가될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 10 IU/㎖(4명의 공여자) 또는 100 IU/㎖의 IL-2(3명의 공여자)의 존재하에서 7일 후 방사선 조사된 OP-1과의 공동 배양에서 T 세포 회수를 평가하였다. IL-2 및 Epo 둘 모두와 함께 배양된 CAR-자극 EpoRm-CAR T 세포는 IL-2 단독으로 배양된 세포보다 상당히 더 높은 확장을 가졌다(도 6c).
IL-2-촉발 신호전달과 Epo-촉발 신호전달 사이의 관계를 추가로 결정하기 위해, 본 발명자는 STAT5 Y647 인산화를 측정하였다. 도 6d에 제시된 바와 같이, Epo 및 IL-2에 노출된 세포는 어느 한 성장 인자에 노출된 세포보다 높은 pSTAT5 MFI를 갖는다. 사이드-투-사이드(side-to-side) 비교에서, 1 IU/㎖의 Epo에 의해 유도된 pSTAT5 수준은 50 IU/㎖ IL-2(P = 0.0019)에 의해 유도된 수준보다 유의하게 더 높았으며, 100 IU/㎖의 IL-2에 유도된 수준을 능가하였다)(도 6e). 최종적으로, 본 발명자는 Epo(10 IU/㎖) 또는 IL-2(100 IU/㎖)에 노출된 EpoRm-CAR T 세포의 JAK 억제제에 대한 상대 민감도를 결정하였다. 본 발명자는 JAK3를 주로 억제하는 토파시티닙, 및 JAK1 및 JAK2 신호전달을 주로 억제하는 록솔리티닙을 사용하였다.29,31 IL-2에 의해 야기된 STAT5 Y647 인산화를 완전히 제거한 농도에서, 억제제는 Epo 신호전달에 영향을 미치지 않았다(도 6f). 따라서, CAR-T 세포에서 EpoRm 신호전달은 IL-2와는 다른 신호전달 캐스케이드를 촉발시키고, IL-2의 증식 자극을 향상시킨다.
이종이식 모델
생체 내 EpoRm-CAR-T 세포의 항-백혈병 활성을 평가하는 것을 시작하기 위해, 본 발명자는 루시페라제-표지된 CD19+ Nalm6 ALL 세포를 5마리의 NSG 마우스에 i.v. 주입하였다. 2일 후 생착 확인 후, 4마리의 마우스에 EpoRm-CAR-T 세포를 i.v. 투여하고, 1마리는 미처리 상태로 두었다. 도 7a 및 도 7b에 제시된 바와 같이, ALL 세포는 미처리된 마우스에서 신속하게 확장된 반면, 처리된 마우스는 백혈병 세포 주입 후 2개월에 관해 상태였다. 참고로, 이들 마우스 중 2마리에서 2주 동안 주 3회 100 IU Epo의 i.p. 주사는 EpoR-CAR-T 세포의 항-백혈병 활성에 영향을 미치지 않았다(도 7a).
두 번째 세트의 실험에서, CAR, 또는 GFP 단독의 EpoRm-CAR로 형질도입된 T 림프구를 NSG 마우스에 i.v. 주사하였다. 주사 후 13일에, 말초 혈액을 GFP 및 인간 CD45를 발현하는 세포의 존재에 대해 시험하였다. 도 7c 및 도 7d에 제시된 바와 같이, EpoRm-CAR-T 세포가 주사된 마우스에서 GFP+/hCD45+ 세포의 수준은 GFP 단독으로 형질도입된 세포 또는 EpoRm이 결여된 CAR이 주사된 마우스에서 측정된 수준보다 높았으며; 후자 그룹에서 2주 동안 주 3회 100 IU Epo의 i.p. 주사는 세포수를 유의하게 증가시키지 않았다. GFP+/hCD45+ 세포의 수준은 Epo i.p. 주사를 투여한 EpoRm-CAR-T 세포가 주사된 마우스에서 가장 높았다. 그러나, 특히 GFP+/hCD45+ 세포의 유의한 증가는 Epo 보충보다 수준이 낮았지만 Epo 주사를 투여받지 않은 마우스에서 분명하였다. 이러한 결과는 내인성 뮤린 Epo가 인간 EpoRm을 발현하는 세포를 자극할 수 있음을 시사하였다. 실제로, 뮤린과 인간 Epo 유전자 사이에는 상당한 상동성이 있다.32 뮤린 Epo가 T 세포에서 인간 EpoRm을 통해 신호를 유도할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 뮤린 및 인간 Epo 자극 후 pSTAT5 Y647을 시험하였다. 도 7e에 제시된 바와 같이, 어느 것이든 pSTAT5에서 유사한 증가를 발생시켰으며, 이는 EpoRm-CAR-T 세포가 인간 Epo 보충 없이 주입된 경우에 관찰된 GFP+/hCD45+ 세포에서의 상대적 증가에 대한 설명을 제공한다.
생체 내에서 EpoRm-CAR-T 세포의 증가된 수가 ALL 생착에 대해 우수한 보호를 제공하는지의 여부를 평가하기 위해, 본 발명자는 NOD-scid-IL2RGnull 마우스에 T 세포를 i.v. 주사한 후, 14일 후, Nalm6 세포를 i.v. 주사하였다. ALL 세포의 생착은 CAR-T 세포에 의해서만 지연되었지만, EpoRm-CAR-T 세포에 의해 완전히 제거되었다(도 9a 및 도 9b). ALL 세포 주입 2개월 후, CAR-T 세포가 주사된 모든 5마리의 마우스에서 ALL 생착이 있는 반면, EpoRm-CAR-T 세포가 주사된 5마리의 마우스 중 어느 것도 ALL을 갖지 않았다(피셔 정확도 검정에 의해 P=0.0079). ALL 세포 접종 1일 전, 외인성 Epo가 없는 13일에서, 말초 혈액 림프계 세포 중 CAR-T 세포의 백분율은 EpoRm-CAR-T 세포의 경우 48.9%±17.0%에 비해 18.8%±6.7%였다(P=0.0062)(도 9c). EpoRm-CAR-T 세포의 수준은 후속 시점에서 CAR-T 세포의 수준보다 높게 유지되었다.
또 다른 모델에서, Nalm6 세포는 먼저 i.v. 주사에 의해 NOD-scid-IL2RGnull 마우스에 생착되었다. 4일째에, 마우스는 유사한 종양 로드를 갖는 4개의 그룹으로 분배되었고; 3개의 그룹에 CAR-T 세포, EpoRm-CAR-T 세포, 또는 GFP 단독으로 형질도입된 T 세포를 i.v. 주사에 의해 투여하였고; 4번째 그룹에는 조직 배양 배지만 투여하였다. ALL 세포는 미처리 마우스, 및 CAR 없이 대조군 T 세포만 투여받은 마우스에서 신속하게 확장되었다. CAR- 및 EpoRm-CAR-T 세포 둘 모두는 백혈병 신호를 현저하게 감소시켰다(도 9d 및 도 9e). 그러나, 주입 후 55일에, CAR-T 세포로 처리된 10마리의 마우스 중 5마리가 재발한 반면 EpoRm-CAR-T 세포를 투여받은 9마리의 마우스 중 어느 것도 재발하지 않았다(피셔 정확도 검정에 의해 P=0.0325). 도 9f는 2개의 코호트의 조합된 장기 생존을 제시하며; EpoRm-CAR-T 세포는 CAR-T 세포보다 유의하게 더 높은 전체 항-백혈병 효과를 발생시켰다(로그 순위 검정에 의해 P=0.0076).
Jurkat 세포 성장 곡선
EpoR 또는 EpoRm의 발현은 Jurkat 세포의 장기 세포 성장에 악영향을 미치지 않았다(도 10).
구현예
구현예 1. a) 에리트로포이에틴(Epo) 수용체; b) 자가 절단 펩티드 또는 내부 리보솜 진입 부위; 및 c) 세포 표면 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, Epo 수용체가 SEQ ID NO:2에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 벡터.
구현예 3. 구현예 1에 있어서, Epo 수용체가 돌연변이체 Epo 수용체인 벡터.
구현예 4. 구현예 3에 있어서, 핵산이 Epo 수용체의 엑손 8 내에 정지 코돈을 인코딩하는 돌연변이를 갖는 벡터.
구현예 5. 구현예 3에 있어서, Epo 수용체가 SEQ ID NO:6에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 벡터.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 Epo 수용체에 대해 C 말단에 존재하는 플래그(Flag) 태그(DYKDDDDK(SEQ ID NO:23))를 추가로 인코딩하는 벡터.
구현예 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 자가 절단 펩티드를 포함하는 벡터.
구현예 8. 구현예 7에 있어서, 자가 절단 펩티드가 2A 펩티드인 벡터.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 2A 펩티드가 T2A 펩티드인 벡터.
구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 신호 펩티드가 CD8α 신호 펩티드인 벡터.
구현예 11. 구현예 10에 있어서, 세포 표면 수용체가 표적 세포 항원에 결합하는 세포 외 수용체 도메인을 포함하는 벡터.
구현예 12. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 세포 표면 수용체가 i) 신호 펩티드; ii) 표적 세포 항원에 결합하는 세포 외 수용체 도메인; iii) 세포의 표면에 세포 외 수용체 도메인을 고정시키는 힌지 및 막횡단 도메인; 및 iv) 효과기 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체인 벡터.
구현예 13. 구현예 11 또는 12에 있어서, 세포 외 수용체 도메인이 링커 도메인에 의해 연결된 가변 면역글로불린 경쇄 도메인 및 가변 면역글로불린 중쇄 도메인을 포함하는 벡터.
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 링커 도메인이 (G4S)x(SEQ ID NO:24)이며, 여기서 x가 1 내지 100의 정수인 벡터.
구현예 15. 구현예 13에 있어서, 링커 도메인이 (G4S)3(SEQ ID NO:25)인 벡터.
구현예 16. 구현예 12에 있어서, 세포 외 수용체 도메인이 단일쇄 가변 단편(scFv)인 벡터.
구현예 17. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 세포 표면 수용체가 T 세포 수용체인 벡터.
구현예 18. 구현예 11에 있어서, 세포 외 수용체 도메인이 모노클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일쇄 가변 단편(scFv), 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 단일 도메인 항체, 또는 이들의 기능적 유도체 또는 변이체 또는 단편을 포함하는 벡터.
구현예 19. 구현예 11에 있어서, 세포 외 수용체 도메인이 면역글로불린 Fc 수용체를 포함하는 벡터.
구현예 20. 구현예 19에 있어서, 면역글로불린 Fc 수용체가 CD16, CD32 또는 CD64인 벡터.
구현예 21. 구현예 11에 있어서, 세포 외 수용체 도메인이 사이토카인을 포함하는 벡터.
구현예 22. 구현예 21에 있어서, 사이토카인이 IL-13, IL-4, IL-7 또는 IL-3인 벡터.
구현예 23. 구현예 11에 있어서, 세포 표면 수용체가 면역 세포를 활성화시키는 벡터.
구현예 24. 구현예 23에 있어서, 세포 표면 수용체가 NKG2D, NKG2C, NCR1, NCR2, NCR3, CD137, CD28 또는 ICOS, 또는 이들의 단편 또는 리간드를 포함하는 벡터.
구현예 25. 구현예 11에 있어서, 세포 표면 수용체가 면역 세포를 억제하는 벡터.
구현예 26. 구현예 25에 있어서, 세포 표면 수용체가 NKG2A, PD-1 또는 CTLA-4, 또는 이들의 단편 또는 리간드를 포함하는 벡터.
구현예 27. 구현예 11에 있어서, 세포 표면 수용체가 사이토카인에 대한 수용체인 벡터.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, 세포 표면 수용체가 IL-6, IL-1 또는 TNF알파에 대한 수용체인 벡터.
구현예 29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포 항원이 종양 관련 항원 또는 종양 특이적 항원인 벡터.
구현예 30. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포 항원이 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 관련 항원 또는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 특이적 항원인 벡터.
구현예 31. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포 항원이 CD19, CD20, CD22, CD123, CD33, B-세포 성숙 항원(BCMA), 메소텔린(mesothelin), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2), 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 디시알로강글리오시드(GD-2)인 벡터.
구현예 32. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포 항원이 CD19인 벡터.
구현예 33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 세포 외 도메인이 항-CD19 단일쇄 가변 단편(scFv)인 벡터.
구현예 34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 힌지 및 막횡단 도메인이 CD8α 힌지 및 막횡단 도메인인 벡터.
구현예 35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 힌지가 복수의 아미노산 잔기를 포함하는 벡터.
구현예 36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 막횡단 도메인이 CD4, CD8β, CD16, CD28, CD32, CD34, CD64, CD137, FcεRIγ, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, VEGFR2, FAS 또는 FGFR2B로부터의 막횡단 도메인인 벡터.
구현예 37. 구현예 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 효과기 도메인이 4-1BB 및 CD3ζ를 포함하는 벡터.
구현예 38. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, CAR이 항-CD19-41BB-CD3ζ인 벡터.
구현예 39. 돌연변이체 에리트로포이에틴(Epo) 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
구현예 40. 구현예 39에 있어서, 핵산이 Epo 수용체의 엑손 8 내에 정지 코돈을 인코딩하는 돌연변이를 갖는 벡터.
구현예 41. 구현예 39에 있어서, 돌연변이체 Epo 수용체가 SEQ ID NO:6에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 벡터.
구현예 42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 레트로바이러스인 벡터.
구현예 43. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 레트로바이러스 벡터인 벡터.
구현예 44. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 형광 단백질을 추가로 인코딩하는 벡터.
구현예 45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 인코딩하는 벡터.
구현예 46. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 핵산의 발현을 위한 적어도 하나의 조절 요소를 추가로 인코딩하는 벡터.
구현예 47. 구현예 1 내지 46 중 어느 하나의 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 트랜스제닉 포유동물 숙주 세포를 제조하는 방법.
구현예 48. 구현예 47에 있어서, 포유동물 숙주 세포가 면역 세포인 방법.
구현예 49. 구현예 48에 있어서, 면역 세포가 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포 또는 수지상 세포인 방법.
구현예 50. 구현예 48에 있어서, 면역 세포가 T 세포인 방법.
구현예 51. 구현예 50에 있어서, T 세포가 인간 말초 혈액 T 림프구인 방법.
구현예 52. 구현예 50에 있어서, T 세포가 CD4+ T 세포인 방법.
구현예 53. 구현예 50에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포인 방법.
구현예 54. 구현예 50에 있어서, T 세포가 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 추가로 발현하는 방법.
구현예 55. 구현예 54에 있어서, TCR이 내인성인 방법.
구현예 56. 구현예 55에 있어서, T 세포가 종양 침윤 림프구(TIL)이고, 상기 방법이 종양으로부터 종양 침윤 림프구를 추출하고 생체 외에서 TIL을 확장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 57. 구현예 54에 있어서, TCR이 외인성인 방법.
구현예 58. 구현예 57에 있어서, 상기 방법이 외인성 TCR을 발현하는 벡터를 T 세포에 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 59. 구현예 1 내지 46 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 포유동물 면역 세포.
구현예 60. 구현예 59에 있어서, 포유동물 면역 세포가 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포 또는 수지상 세포인 포유동물 면역 세포.
구현예 61. 구현예 59에 있어서, 포유동물 면역 세포가 T 세포인 포유동물 면역 세포.
구현예 62. 구현예 61에 있어서, T 세포가 인간 T 세포인 포유동물 면역 세포.
구현예 63. 구현예 61에 있어서, T 세포가 인간 말초 혈액 T 림프구인 포유동물 면역 세포.
구현예 64. 포유동물 T 세포를 대상체에 도입하는 것을 포함하는 포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 상기 포유동물 T 세포가 구현예 1 내지 46 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 방법.
구현예 65. 구현예 64에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
구현예 66. 구현예 64 또는 65에 있어서, 포유동물 T 세포가 포유동물로부터 분리된 자가 세포인 방법.
구현예 67. 구현예 64 또는 65에 있어서, 포유동물 T 세포가 공여자로부터 분리된 동종이형 세포인 방법.
구현예 68. 구현예 64 내지 67 중 어느 하나에 있어서, Epo를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 69. 구현예 64 내지 68 중 어느 하나에 있어서, IL-2를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
구현예 70. 구현예 64 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키는 것이 급성 림프모구 백혈병(ALL)을 치료하는 방법.
구현예 71. 암, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염 또는 기생충을 치료하거나 예방할 필요가 있는 포유동물에서 암, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염 또는 기생충을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 구현예 1 내지 46 중 어느 하나에 따른 벡터의 용도.
구현예 72. 포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키기 위한 구현예 59 내지 63 중 어느 하나에 따른 포유동물 면역 세포의 용도.
구현예 73. 포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 구현예 1 내지 46 중 어느 하나에 따른 벡터.
구현예 74. 포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 구현예 59 내지 63 중 어느 하나에 따른 포유동물 면역 세포.
구현예 75. 구현예 39 내지 46 중 어느 하나의 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 트랜스제닉 포유동물 숙주 세포를 제조하는 방법.
구현예 76. 구현예 75에 있어서, 포유동물 숙주 세포가 면역 세포인 방법.
구현예 77. 구현예 76에 있어서, 면역 세포가 T 세포인 방법.
구현예 78. 구현예 77에 있어서, T 세포가 종양 침윤 림프구(TIL)인 방법.
구현예 79. 구현예 76에 있어서, 면역 세포가 자연 살해 세포인 방법.
구현예 80. 구현예 39 내지 46 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 포유동물 면역 세포.
구현예 81. 구현예 80에 있어서, 포유동물 면역 세포가 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포 또는 수지상 세포인 포유동물 면역 세포.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
서열
SEQ ID NO:1: Epo 수용체 (EpoR) cDNA:
Figure pct00005
SEQ ID NO:2: Epo 수용체 (EpoR) 아미노산:
Figure pct00006
SEQ ID NO:3: 플래그 태그를 갖는 EpoR cDNA:
Figure pct00007
SEQ ID NO:4: 플래그 태그를 갖는 EpoR 아미노산:
Figure pct00008
SEQ ID NO:5: 돌연변이체 EpoR (EpoRm) cDNA:
Figure pct00009
SEQ ID NO:6: 돌연변이체 EpoR (EpoRm) 아미노산:
Figure pct00010
SEQ ID NO:7: 플래그 태그를 갖는 EpoRm cDNA:
Figure pct00011
SEQ ID NO:8: 플래그 태그를 갖는 EpoRm 아미노산:
Figure pct00012
SEQ ID NO:9: 항-CD19-41BB-CD3ζ CAR cDNA:
Figure pct00013
SEQ ID NO:10: 항-CD19-41BB-CD3ζ CAR 아미노산:
Figure pct00014
SEQ ID NO:11: EpoRm-2A-CAR cDNA:
Figure pct00015
Figure pct00016
SEQ ID NO:12: EpoRm-2A-CAR 아미노산:
Figure pct00017
SEQ ID NO:13: P2A cDNA:
Figure pct00018
SEQ ID NO:14: P2A 아미노산:
Figure pct00019
SEQ ID NO:15: T2A cDNA:
Figure pct00020
SEQ ID NO:16: T2A 아미노산:
Figure pct00021
SEQ ID NO:17: E2A cDNA:
Figure pct00022
SEQ ID NO:18: E2A 아미노산:
Figure pct00023
SEQ ID NO:19: F2A cDNA:
Figure pct00024
SEQ ID NO:20: F2A 아미노산:
Figure pct00025
SEQ ID NO:21: CD8α 신호 펩티드 cDNA:
Figure pct00026
SEQ ID NO:22: CD8α 신호 펩티드 아미노산:
Figure pct00027
참조로서의 포함; 동등물
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌의 교시내용은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다.
예시적 구현예가 특히 제시되고 기재되었으나, 첨부된 청구항에 의해 포함되는 구현예의 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변화가 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE <120> A METHOD TO SPECIFICALLY STIMULATE SURVIVAL AND EXPANSION OF GENETICALLY-MODIFIED IMMUNE CELLS <130> 4459.1151-001 PCT <140> <141> <150> 62/724,488 <151> 2018-08-29 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1551 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Epo receptor (EpoR) cDNA sequence <400> 1 ccggaattcg ccaccatgga ccacctcggg gcgtccctct ggccccaggt cggctccctt 60 tgtctcctgc tcgctggggc cgcctgggcg cccccgccta acctcccgga ccccaagttc 120 gagagcaaag cggccttgct ggcggcccgg gggcccgaag agcttctgtg cttcaccgag 180 cggttggagg acttggtgtg tttctgggag gaagcggcga gcgctggggt gggcccgggc 240 aactacagct tctcctacca gttagaagat gagccatgga agctgtgtcg cctgcaccag 300 gctcccacgg ctcgtggtgc ggtgcgcttc tggtgttcgc tgcctacagc cgacacgtcg 360 agcttcgtgc ccctagagtt gcgcgtcaca gcagcctccg gcgctccgcg atatcaccgt 420 gtcatccaca tcaatgaagt agtgctccta gacgcccccg tggggctggt ggcgcggttg 480 gctgacgaga gcggccacgt agtgttgcgc tggctcccgc cgcctgagac acccatgacg 540 tctcacatcc gctacgaggt ggacgtctcg gccggcaacg gcgcagggag cgtacagagg 600 gtggagatcc tggagggccg caccgagtgt gtgctgagca acctgcgggg ccggacgcgc 660 tacaccttcg ccgtccgcgc gcgtatggct gagccgagct tcggcggctt ctggagcgcc 720 tggtcggagc ctgtgtcgct gctgacgcct agcgacctgg accccctcat cctgacgctc 780 tccctcatcc tcgtggtcat cctggtgctg ctgaccgtgc tcgcgctgct ctcccaccgc 840 cgggctctga agcagaagat ctggcctggc atcccgagcc cagagagcga gtttgaaggc 900 ctcttcacca cccacaaggg taacttccag ctgtggctgt accagaatga tggctgcctg 960 tggtggagcc cctgcacccc cttcacggag gacccacctg cttccctgga agtcctctca 1020 gagcgctgct gggggacgat gcaggcagtg gagccgggga cagatgatga gggccccctg 1080 ctggagccag tgggcagtga gcatgcccag gatacctatc tggtgctgga caaatggttg 1140 ctgccccgga acccgcccag tgaggacctc ccagggcctg gtggcagtgt ggacatagtg 1200 gccatggatg aaggctcaga agcatcctcc tgctcatctg ctttggcctc gaagcccagc 1260 ccagagggag cctctgctgc cagctttgag tacactatcc tggaccccag ctcccagctc 1320 ttgcgtccat ggacactgtg ccctgagctg ccccctaccc caccccacct aaagtacctg 1380 taccttgtgg tatctgactc tggcatctca actgactaca gctcagggga ctcccaggga 1440 gcccaagggg gcttatccga tggcccctac tccaaccctt atgagaacag ccttatccca 1500 gccgctgagc ctctgccccc cagctatgtg gcttgctctt agctcgagcg g 1551 <210> 2 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Epo receptor (EpoR) amino acid sequence <400> 2 Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp 20 25 30 Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu 35 40 45 Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp 50 55 60 Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala 85 90 95 Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala 100 105 110 Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser 115 120 125 Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu 130 135 140 Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly 145 150 155 160 His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser 165 170 175 His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser 180 185 190 Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser 195 200 205 Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met 210 215 220 Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val 225 230 235 240 Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser 245 250 255 Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu 260 265 270 Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser 275 280 285 Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe 290 295 300 Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys 305 310 315 320 Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu 325 330 335 Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu 340 345 350 Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr 355 360 365 Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp 370 375 380 Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly 385 390 395 400 Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro 405 410 415 Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser 420 425 430 Ser Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr 435 440 445 Pro Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile 450 455 460 Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu 465 470 475 480 Ser Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala 485 490 495 Ala Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser 500 505 <210> 3 <211> 1581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic EpoR with Flag tag cDNA sequence <400> 3 atatatgaat tcgccaccat ggaccacctc ggggcgtccc tctggcccca ggtcggctcc 60 ctttgtctcc tgctcgctgg ggccgcctgg gcgcccccgc ctaacctccc ggaccccaag 120 ttcgagagca aagcggcctt gctggcggcc cgggggcccg aagagcttct gtgcttcacc 180 gagcggttgg aggacttggt gtgtttctgg gaggaagcgg cgagcgctgg ggtgggcccg 240 ggcaactaca gcttctccta ccagttagaa gatgagccat ggaagctgtg tcgcctgcac 300 caggctccca cggctcgtgg tgcggtgcgc ttctggtgtt cgctgcctac agccgacacg 360 tcgagcttcg tgcccctaga gttgcgcgtc acagcagcct ccggcgctcc gcgatatcac 420 cgtgtcatcc acatcaatga agtagtgctc ctagacgccc ccgtggggct ggtggcgcgg 480 ttggctgacg agagcggcca cgtagtgttg cgctggctcc cgccgcctga gacacccatg 540 acgtctcaca tccgctacga ggtggacgtc tcggccggca acggcgcagg gagcgtacag 600 agggtggaga tcctggaggg ccgcaccgag tgtgtgctga gcaacctgcg gggccggacg 660 cgctacacct tcgccgtccg cgcgcgtatg gctgagccga gcttcggcgg cttctggagc 720 gcctggtcgg agcctgtgtc gctgctgacg cctagcgacc tggaccccct catcctgacg 780 ctctccctca tcctcgtggt catcctggtg ctgctgaccg tgctcgcgct gctctcccac 840 cgccgggctc tgaagcagaa gatctggcct ggcatcccga gcccagagag cgagtttgaa 900 ggcctcttca ccacccacaa gggtaacttc cagctgtggc tgtaccagaa tgatggctgc 960 ctgtggtgga gcccctgcac ccccttcacg gaggacccac ctgcttccct ggaagtcctc 1020 tcagagcgct gctgggggac gatgcaggca gtggagccgg ggacagatga tgagggcccc 1080 ctgctggagc cagtgggcag tgagcatgcc caggatacct atctggtgct ggacaaatgg 1140 ttgctgcccc ggaacccgcc cagtgaggac ctcccagggc ctggtggcag tgtggacata 1200 gtggccatgg atgaaggctc agaagcatcc tcctgctcat ctgctttggc ctcgaagccc 1260 agcccagagg gagcctctgc tgccagcttt gagtacacta tcctggaccc cagctcccag 1320 ctcttgcgtc catggacact gtgccctgag ctgcccccta ccccacccca cctaaagtac 1380 ctgtaccttg tggtatctga ctctggcatc tcaactgact acagctcagg ggactcccag 1440 ggagcccaag ggggcttatc cgatggcccc tactccaacc cttatgagaa cagccttatc 1500 ccagccgctg agcctctgcc ccccagctat gtggcttgct ctgactacaa agacgatgac 1560 gacaagtagc tcgagtatat a 1581 <210> 4 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic EpoR with Flag tag amino acid sequence <400> 4 Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp 20 25 30 Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu 35 40 45 Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp 50 55 60 Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala 85 90 95 Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala 100 105 110 Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser 115 120 125 Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu 130 135 140 Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly 145 150 155 160 His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser 165 170 175 His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser 180 185 190 Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser 195 200 205 Asn Leu Arg Gly Arg Thr 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tggtgttcgc tgcctacagc cgacacgtcg 360 agcttcgtgc ccctagagtt gcgcgtcaca gcagcctccg gcgctccgcg atatcaccgt 420 gtcatccaca tcaatgaagt agtgctccta gacgcccccg tggggctggt ggcgcggttg 480 gctgacgaga gcggccacgt agtgttgcgc tggctcccgc cgcctgagac acccatgacg 540 tctcacatcc gctacgaggt ggacgtctcg gccggcaacg gcgcagggag cgtacagagg 600 gtggagatcc tggagggccg caccgagtgt gtgctgagca acctgcgggg ccggacgcgc 660 tacaccttcg ccgtccgcgc gcgtatggct gagccgagct tcggcggctt ctggagcgcc 720 tggtcggagc ctgtgtcgct gctgacgcct agcgacctgg accccctcat cctgacgctc 780 tccctcatcc tcgtggtcat cctggtgctg ctgaccgtgc tcgcgctgct ctcccaccgc 840 cgggctctga agcagaagat ctggcctggc atcccgagcc cagagagcga gtttgaaggc 900 ctcttcacca cccacaaggg taacttccag ctgtggctgt accagaatga tggctgcctg 960 tggtggagcc cctgcacccc cttcacggag gacccacctg cttccctgga agtcctctca 1020 gagcgctgct gggggacgat gcaggcagtg gagccgggga cagatgatga gggccccctg 1080 ctggagccag tgggcagtga gcatgcccag gatacctatc tggtgctgga caaatggttg 1140 ctgccccgga acccgcccag tgaggacctc ccagggcctg 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gctggcggcc cgggggcccg aagagcttct gtgcttcacc 180 gagcggttgg aggacttggt gtgtttctgg gaggaagcgg cgagcgctgg ggtgggcccg 240 ggcaactaca gcttctccta ccagttagaa gatgagccat ggaagctgtg tcgcctgcac 300 caggctccca cggctcgtgg tgcggtgcgc ttctggtgtt cgctgcctac agccgacacg 360 tcgagcttcg tgcccctaga gttgcgcgtc acagcagcct ccggcgctcc gcgatatcac 420 cgtgtcatcc acatcaatga agtagtgctc ctagacgccc ccgtggggct ggtggcgcgg 480 ttggctgacg agagcggcca cgtagtgttg cgctggctcc cgccgcctga gacacccatg 540 acgtctcaca tccgctacga ggtggacgtc tcggccggca acggcgcagg gagcgtacag 600 agggtggaga tcctggaggg ccgcaccgag tgtgtgctga gcaacctgcg gggccggacg 660 cgctacacct tcgccgtccg cgcgcgtatg gctgagccga gcttcggcgg cttctggagc 720 gcctggtcgg agcctgtgtc gctgctgacg cctagcgacc tggaccccct catcctgacg 780 ctctccctca tcctcgtggt catcctggtg ctgctgaccg tgctcgcgct gctctcccac 840 cgccgggctc tgaagcagaa gatctggcct ggcatcccga gcccagagag cgagtttgaa 900 ggcctcttca ccacccacaa gggtaacttc cagctgtggc tgtaccagaa tgatggctgc 960 ctgtggtgga gcccctgcac ccccttcacg 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atctacatct gggcgccctt 960 ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg 1020 cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca 1080 agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag 1140 agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta 1200 taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg 1260 ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga 1320 actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg 1380 gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta 1440 cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaacag ccaggggatt tcaccactca 1500 aaggccagac ctgcagacgc ccagattatg agacacactc gagcc 1545 <210> 10 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic anti-CD19-41BB-CD3-zeta CAR amino acid sequence <400> 10 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met 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Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 11 <211> 2844 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic EpoRm-2A-CAR cDNA sequence <400> 11 gccaccatgg accacctcgg ggcgtccctc tggccccagg tcggctccct ttgtctcctg 60 ctcgctgggg ccgcctgggc gcccccgcct aacctcccgg accccaagtt cgagagcaaa 120 gcggccttgc tggcggcccg ggggcccgaa gagcttctgt gcttcaccga gcggttggag 180 gacttggtgt gtttctggga ggaagcggcg agcgctgggg tgggcccggg caactacagc 240 ttctcctacc agttagaaga tgagccatgg aagctgtgtc gcctgcacca ggctcccacg 300 gctcgtggtg cggtgcgctt ctggtgttcg ctgcctacag ccgacacgtc gagcttcgtg 360 cccctagagt tgcgcgtcac agcagcctcc ggcgctccgc gatatcaccg tgtcatccac 420 atcaatgaag tagtgctcct agacgccccc gtggggctgg tggcgcggtt ggctgacgag 480 agcggccacg tagtgttgcg ctggctcccg ccgcctgaga cacccatgac gtctcacatc 540 cgctacgagg tggacgtctc ggccggcaac ggcgcaggga gcgtacagag ggtggagatc 600 ctggagggcc gcaccgagtg tgtgctgagc aacctgcggg gccggacgcg ctacaccttc 660 gccgtccgcg cgcgtatggc tgagccgagc ttcggcggct tctggagcgc ctggtcggag 720 cctgtgtcgc tgctgacgcc tagcgacctg gaccccctca tcctgacgct ctccctcatc 780 ctcgtggtca tcctggtgct gctgaccgtg ctcgcgctgc tctcccaccg ccgggctctg 840 aagcagaaga tctggcctgg catcccgagc ccagagagcg agtttgaagg cctcttcacc 900 acccacaagg gtaacttcca gctgtggctg taccagaatg atggctgcct gtggtggagc 960 ccctgcaccc ccttcacgga ggacccacct gcttccctgg aagtcctctc agagcgctgc 1020 tgggggacga tgcaggcagt ggagccgggg acagatgatg agggccccct gctggagcca 1080 gtgggcagtg agcatgccca ggatacctat ctggtgctgg acaaatggtt gctgccccgg 1140 aacccgccca gtgaggacct cccagggcct ggtggcagtg tggacatagt ggccatggat 1200 gaaggctcag aagcatcctc ctgctcatct gctttggcct cgaagcccag cccagaggga 1260 gcctctgctg ccagctttga gtacactatc ctggacccca gctcccagct cttgcgtcca 1320 ggatcaggcg agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc 1380 ccaatggcct taccagtgac cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc 1440 aggccggaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 1500 gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 1560 aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 1620 ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 1680 gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 1740 ggagggggga ccaagctgga gatcacaggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 1800 ggcggcggat ctgaggtgaa actgcaggag tcaggacctg gcctggtggc gccctcacag 1860 agcctgtccg tcacatgcac tgtctcaggg gtctcattac ccgactatgg tgtaagctgg 1920 attcgccagc ctccacgaaa gggtctggag tggctgggag taatatgggg tagtgaaacc 1980 acatactata attcagctct caaatccaga ctgaccatca tcaaggacaa ctccaagagc 2040 caagttttct taaaaatgaa cagtctgcaa actgatgaca cagccattta ctactgtgcc 2100 aaacattatt actacggtgg tagctatgct atggactact ggggccaagg aacctcagtc 2160 accgtctcct caaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 2220 tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 2280 acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 2340 ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 2400 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 2460 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 2520 aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 2580 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 2640 gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 2700 aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 2760 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 2820 atgcaggccc tgccccctcg ctaa 2844 <210> 12 <211> 945 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic EpoRm-2A-CAR amino acid sequence <400> 12 Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp 20 25 30 Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu 35 40 45 Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp 50 55 60 Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala 85 90 95 Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala 100 105 110 Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser 115 120 125 Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu 130 135 140 Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly 145 150 155 160 His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser 165 170 175 His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser 180 185 190 Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser 195 200 205 Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met 210 215 220 Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val 225 230 235 240 Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser 245 250 255 Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu 260 265 270 Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser 275 280 285 Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe 290 295 300 Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys 305 310 315 320 Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu 325 330 335 Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu 340 345 350 Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr 355 360 365 Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp 370 375 380 Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly 385 390 395 400 Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro 405 410 415 Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser 420 425 430 Ser Gln Leu Leu Arg Pro Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu 435 440 445 Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val 450 455 460 Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro 465 470 475 480 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 485 490 495 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 500 505 510 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 515 520 525 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 530 535 540 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 545 550 555 560 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 565 570 575 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu 595 600 605 Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys 610 615 620 Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg 625 630 635 640 Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser 645 650 655 Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile 660 665 670 Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln 675 680 685 Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly 690 695 700 Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 705 710 715 720 Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 725 730 735 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 740 745 750 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 755 760 765 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 770 775 780 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 785 790 795 800 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 805 810 815 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 820 825 830 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 835 840 845 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 850 855 860 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 865 870 875 880 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 885 890 895 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 900 905 910 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 915 920 925 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 930 935 940 Arg 945 <210> 13 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic P2A cDNA sequence <400> 13 ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60 ggacct 66 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic P2A amino acid sequence <400> 14 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 15 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic T2A cDNA sequence <400> 15 ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60 cct 63 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic T2A amino acid sequence <400> 16 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 17 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic E2A cDNA sequence <400> 17 ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60 cctggacct 69 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic E2A amino acid sequence <400> 18 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 19 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic F2A cDNA sequence <400> 19 ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60 tccaaccctg gacct 75 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic F2A amino acid sequence <400> 20 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 21 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic CD8-alpha signal peptide cDNA sequence <400> 21 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic CD8-alpha signal peptide amino acid sequence <400> 22 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 24 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(500) <223> This sequence may encompass 1-100 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 305 310 315 320 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 325 330 335 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 405 410 415 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 420 425 430 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 485 490 495 Gly Gly Gly Ser 500 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 26 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(100) <223> This sequence may encompass 2-100 residues <400> 26 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Gly 100 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15

Claims (29)

  1. 하기를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터:
    a) 에리트로포이에틴(Epo) 수용체;
    b) 자가 절단 펩티드 또는 내부 리보솜 진입 부위; 및
    c) 세포 표면 수용체.
  2. 제1항에 있어서, Epo 수용체가 SEQ ID NO:2에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 벡터.
  3. 제1항에 있어서, Epo 수용체가 돌연변이체 Epo 수용체인 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 핵산이 Epo 수용체의 엑손 8 내에 정지 코돈을 인코딩하는 돌연변이를 갖는 벡터.
  5. 제3항에 있어서, Epo 수용체가 SEQ ID NO:6에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 핵산이 Epo 수용체에 대해 C 말단에 존재하는 플래그(Flag) 태그(DYKDDDDK(SEQ ID NO:23))를 추가로 인코딩하는 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 핵산이 자가 절단 펩티드를 포함하는 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 자가 절단 펩티드가 2A 펩티드인 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 세포 표면 수용체가 표적 세포 항원에 결합하는 세포 외 수용체 도메인을 포함하는 벡터.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 수용체가 하기를 포함하는 키메라 항원 수용체인 벡터:
    i) 신호 펩티드;
    ii) 표적 세포 항원에 결합하는 세포 외 수용체 도메인;
    iii) 세포 표면에 세포 외 수용체 도메인을 고정시키는 힌지 및 막횡단 도메인; 및
    iv) 효과기 도메인.
  11. 제10항에 있어서, 세포 외 수용체 도메인이 링커 도메인에 의해 연결된 가변 면역글로불린 경쇄 도메인 및 가변 면역글로불린 중쇄 도메인을 포함하는 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 링커 도메인이 (G4S)x(SEQ ID NO:24)이며, 여기서 x가 1 내지 100의 정수인 벡터.
  13. 제10항에 있어서, 세포 외 수용체 도메인이 단일쇄 가변 단편(scFv)인 벡터.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 수용체가 T 세포 수용체인 벡터.
  15. 제10항에 있어서, 세포 외 수용체 도메인이 항-CD19 단일쇄 가변 단편(scFv)인 벡터.
  16. 제10항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 항-CD19-41BB-CD3ζ인 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는 트랜스제닉 포유동물 숙주 세포를 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 포유동물 숙주 세포가 면역 세포인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 면역 세포가 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포 또는 수지상 세포인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 면역 세포가 T 세포인 방법.
  21. 제20항에 있어서, T 세포가 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 추가로 발현하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, TCR이 내인성인 방법.
  23. 제22항에 있어서, T 세포가 종양 침윤 림프구(TIL)이고, 상기 방법이 종양으로부터 종양 침윤 림프구를 추출하고 생체 외에서 TIL을 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 포유동물 면역 세포.
  25. 제24항에 있어서, 포유동물 면역 세포가 자연 살해(NK) 세포, 단핵구/대식세포 또는 수지상 세포인 포유동물 면역 세포.
  26. 제24항에 있어서, 포유동물 면역 세포가 T 세포인 포유동물 면역 세포.
  27. 제26항에 있어서, T 세포가 인간 T 세포인 포유동물 면역 세포.
  28. 제26항에 있어서, T 세포가 인간 말초 혈액 T 림프구인 포유동물 면역 세포.
  29. 포유동물 T 세포를 대상체에 도입하는 단계를 포함하는 포유동물에서 CD19+ 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 상기 포유동물 T 세포가 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 방법.
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