KR20230010228A - 자연 살해 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 (cars) - Google Patents

자연 살해 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 (cars) Download PDF

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시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트
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Abstract

본 개시내용은 자연 살해 (NK) 세포 표면 마커에 결합하여 결합된 NK 세포를 파괴하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. NK 세포 표면 마커는 활성화 NK 세포 수용체, 및 억제성 NK 세포 수용체를 포함한다. 또한, 이러한 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포 및 CAR 변형된 세포의 용도도 기술되어 있다.

Description

자연 살해 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 (CARS)
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 5월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/022,149호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 본원에 완전히 기재된 바와 같이 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 2HK4864_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 273 KB이고, 2021년 5월 7일에 생성되었으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고 있다.
기술 분야
본 개시내용은 결합된 NK 세포의 파괴를 초래하는 자연 살해 (NK) 세포 표면 마커에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CARs)를 제공한다. NK 세포 표면 마커는 활성화 NK 세포 수용체, 및 억제성 NK 세포 수용체를 포함한다. 또한, 이러한 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포 및 CAR 변형된 세포의 용도도 기술되어 있다.
자연 살해 (NK) 세포는 종양 세포 및 바이러스에 감염된 세포에 대한 면역 체계 반응에서 중요한 역할을 하는 백혈구의 일종이다. NK 세포는 인터페론 또는 사이토카인과 같은 염증 매개체에 반응하여 활성화된다. NK 세포는 또한 염증이 있거나 감염된 조직을 인식하고 이에 반응하기 위해 다양한 활성화 및 억제성 수용체뿐만 아니라 공동-자극 수용체를 발현한다. 이러한 수용체는 세포 스트레스 리간드에 결합하여 NK 세포 반응을 유발할 수 있다. 이러한 수용체 중 일부는 NK 세포의 활성화를 방지하여 NK 세포가 건강한 조직을 표적으로 하지 않도록 한다.
주 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC I) 및 관련 분자는 NK 세포가 스트레스를 받은 세포, 감염된 세포, 또는 종양 세포로부터 건강한 세포를 구별할 수 있도록 하는 생물학의 일부이다. MHC는 유기체가 '건강하지 않거나 비-자기 세포' (예를 들어, 유기체의 바이러스에 감염된 세포 및 암성 세포 또는 병원체의 외인성 세포)로부터 '건강한 자기 세포' (예를 들어, 유기체의 바이러스에 감염되지 않은 세포 및 비-암성 세포)를 면역학적으로 인식할 수 있도록 하는 다중 유전자 및 이러한 유전자의 다중 변이체에 의해 암호화된 복합체를 지칭한다. MHC에 의해 암호화된 분자는 또한 MHC 분자에 의해 면역 세포에 제시된 단백질, 독소, 및/또는 이물질의 일부에 대한 유기체의 전반적인 면역 반응을 결정한다.
NK 세포는 퍼포린 (perforin) 및 그랜자임 (granzymes)과 같은 NK 세포 내부로부터 분자를 방출함으로써 표적 세포에 대한 그들의 세포독성 기능을 수행한다. NK 세포가 파괴 대상 세포와 접촉하면 NK 세포에서 방출된 퍼포린은 표적 세포의 세포 막에 구멍을 형성하여 이를 통해 그랜자임 및 관련 분자가 들어갈 수 있어 표적 세포의 세포 사멸을 유도한다.
일반적으로 유익하지만, NK 세포는 NK 세포-기반 암과 관련될 수 있다. NK/T 세포 림프종 및 공격성 NK 세포 백혈병을 포함하는 NK 세포 신생물은 희귀한 악성종양이다. 발병률은 미국에서 1,000,000명당 0.8명이며, 이 발병률은 남미와 아시아에서 3 내지 10배 더 높다. 17개월 내지 20개월의 전체 중앙 생존기간 (overall median survival)으로 높은 사망률이 관찰되지만, 재발성/난치성 NK/T 림프종 및 공격성 NK 세포 백혈병의 경우 결과가 훨씬 더 나빠진다. 이러한 악성종양은 일반적으로 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 감염과 관련이 있다. 악성종양은 추가로 비강, 비-비강 및 공격성 림프종/백혈병 하위유형으로 나눌 수 있다. 대부분의 비강 NK 세포 림프종은 1기/2기 질환과 함께 나타난다. 1기/2기 질환은 방사선 요법으로 치료될 수 있다; 그러나, 방사선 요법이 실패하거나 악성 종양이 1기/2기 이상으로 진행된 경우 병용 화학요법이 필요할 수 있다. 조혈 줄기 세포 이식과 조합된 고용량 화학요법은 일부 환자에게 유익할 수 있다.
NK 세포는 또한 일부 상황에서 일부 악성종양 및 감염에 대한 면역 반응을 제한할 수 있는 억제성 표현형을 가질 수 있다. NK 세포 억제성 표현형은 NK 세포 상의 억제성 수용체의 더 많은 발현; NK 세포 활성의 억제; 표적 세포를 용해시키는 NK 세포의 능력 감소; 및/또는 정상 기능 NK 세포 또는 억제성 표현형이 없는 NK 세포와 비교하여 염증, 감염, 종양, 및/또는 파괴될 필요가 있는 기타 세포에 대한 NK 세포 면역 반응의 감소를 포함할 수 있다. 종양 세포는 예를 들어 NK 세포 상의 억제성 수용체인 NGK2A에 결합하는 리간드 (인간 백혈구 항원 E, HLA-E)를 과발현하여 NK 세포에 의한 종양 세포 살해를 차단함으로써 이러한 억제성 표현형을 활용할 수 있다. 종양 세포에서 HLA-E 발현은 나쁜 예후와 관련이 있다.
일부 비-NK 세포 악성종양은 NK 세포 수용체를 비정상적으로 발현한다. 예를 들어, 피부 T-세포 림프종의 공격적인 형태인 세자리 (Sezary) 증후군이 있는 환자는 말초 혈액 악성 CD4+ T 림프구의 세포 표면에서 NKp46 NK 수용체를 발현한다 (문헌 [Bensussan 등 (2011) J Invest Dermatol.　131: 969-976]). 또 다른 예로서, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 및 ALK+ 역형성 대세포 림프종을 포함한 성숙한 T 세포 신생물 중 20%가 NKp46 수용체를 비정상적으로 발현하는 것으로 관찰되었다 (문헌 [Freud 등 (2013) Am J Clin Pathol.　140:853-866]).
순환 또는 조직 NK 세포의 변화는 또한 NK 매개 자가면역 및 동종면역과 관련될 수 있으며, 여기서 건강한 자기 또는 비-자기 조직은 사람의 면역 체계에 의해 공격을 받는다. NK 세포 기능과 연관된 자가면역 장애는 쇼그렌병; 항인지질 증후군; 심상성 천포창; 척추관절병증; 건선을 포함한 피부 질환; 다발성 경화증; 전신 경화증; 제1형 당뇨병; 소아 특발성 관절염; 류마티스 관절염; 염증성 장 질환; 자가면역 간 질환; 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 포함한다. NK 세포 기능과 연관된 동종면역 장애는 태아/신생아 동종면역 저혈소판증 (FNAIT)을 포함하며, 여기서 태아 혈소판 항원에 대한 모체 면역 반응은 유산 및 자궁 내 성장 제한; 조혈 줄기 세포 거부반응; 고형 조직 이식 거부반응; 및 장기 이식 후 만성 동종이식 손상과 같은 합병증을 유발할 수 있다.
자가면역 및 동종면역에 대한 주요 치료법은 염증을 개선하고 과민성 면역 반응을 제어하기 위해 대상체의 면역 체계를 변형시키는 것을 포함한다. 그 예는 면역억제제, 스테로이드, 비스테로이드 소염제, 혈장교환술, 면역흡착, B 세포 감소, 및 비장절제술을 포함한다. 통증, 부기, 피로 및 피부 발진과 같은 증상을 치료하는 약물 또한 종종 사용된다.
다양한 병리학적 조건에서 NK 세포의 역할을 고려할 때, NK 세포 악성종양, NK 세포 수용체를 발현하는 비-NK 악성종양, NK 세포 억제가 효과적인 면역 반응을 방지하고 NK 세포 기능을 증가시키는 데 도움이 될 수 있는 조건 및 NK 세포-매개 자가면역 또는 동종면역 장애에서와 같이 NK 세포의 제거 또는 감소가 관심의 대상이 되는 요법을 개발할 필요가 있다.
본 개시내용은 자연 살해 (NK) 세포 표면 마커에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. NK 세포 표면 마커는 활성화 NK 세포 수용체, 억제성 NK 세포 수용체, 또는 둘 다를 포함한다. 특정 구현예에서, 활성화 NK 세포 수용체는 NKp30, Nkp44, 및 NKp46을 포함한다. 특정 구현예에서, 활성화 NK 세포 수용체는 NKp46을 포함한다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 세포 수용체는 NKG2A 및 살해 면역글로불린 수용체 (KIR)를 포함한다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 세포 수용체는 NKG2A를 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46 결합 도메인은 NKp46 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A 결합 도메인은 인공 HLA-E 모방체를 포함한다. 면역 세포는 NK 세포를 표적으로 하는 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 또는 조혈 전구 세포 (HPC)이다.
항-NK CAR을 발현하도록 변형된 면역 세포는 생체내에서 활성화 NK 수용체 및/또는 억제성 NK 수용체를 발현하는 NK 세포를 고갈시키는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화 NK 세포 수용체는 NKp30, Nkp44, 및 NKp46을 포함한다. 특정 구현예에서, 활성화 NK 세포 수용체는 NKp46을 포함한다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 세포 수용체는 NKG2A 및 KIR을 포함한다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 세포 수용체는 NKG2A를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 NK 세포 악성종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 항-바이러스 치료와 조합하여 NK 세포 악성종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예는 또한 NK 세포 억제가 효과적인 면역 반응을 방지하는 조건의 치료를 제공한다. 특정 구현예에서, 비-NK 세포-기반 암 (예를 들어, 유방암)은 억제성 NK 수용체를 발현하는 NK 세포를 고갈시킴으로써 치료된다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 세포 수용체는 NKG2A를 포함한다.
특정 구현예는 또한 항-NK CAR 변형된 세포로 NK 세포 매개 자가면역 또는 동종면역 장애를 치료하는 것을 제공한다. 특정 구현예에서, NK 세포 매개 자가면역 또는 동종면역 장애는 활성화 NK 수용체를 발현하는 NK 세포를 고갈시킴으로써 치료된다. 특정 구현예에서, 활성화 NK 세포 수용체는 NKp46을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 NK 세포 상의 활성화 수용체에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR 및 NK 세포 상의 억제성 수용체에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR을 공동-발현하여, 표적 NK 세포에 의한 항-NK CAR 변형된 세포의 살해를 방지하거나 개선한다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 NKp46 결합 도메인을 포함하는 CAR 및 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다. 특정 구현예에서, NKp46 결합 도메인은 NKp46 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A 결합 도메인은 인공 HLA-E 모방체를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A 결합 도메인은 항-NGK2A 항체로부터 유래된 scFv를 포함한다.
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도 1. 자연 살해 (NK) 세포 신생물 분류. 문헌 [Kwong, Y. L. (2005) Nature Leukemia, 19(12), 2186-2194]로부터 각색.
도 2a-2c. 항-자연 살해 (NK) 세포 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물 및 CAR 발현. (도 2a) 세포 표면에서 CAR 작제물의 카툰 표현. NKp46은 CD335라고도 한다. 이러한 CAR 작제물에 대한 아미노산 서열은 서열번호: 249 (항-NKp46 CAR의 아미노산 서열), 251 (항-NKG2A (HLA-E) CAR의 아미노산 서열), 253 (항-NKG2A (HLA-E) CAR의 아미노산 서열), 255 (항-NKG2A (HLA-E) CAR의 아미노산 서열), 및 257 (항-NKG2A (HLA-E) CAR의 아미노산 서열)을 포함한다. 이러한 CAR 작제물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 250, 252, 254, 256, 및 258을 포함한다. (도 2b) γ-레트로바이러스-유래 프로모터-강화 MND를 함유하는 pRRL 렌티바이러스 (LV) 백본에서 CAR 작제물의 개략도. (도 2c) 청색 형광 단백질 (BFP) 발현을 평가하는 유세포 분석에 의해 입증된 항-NKp46 (항-CD335) CAR 작제물의 발현.
도 3a, 3b. 배지, 비-특이적 세포 (K562 세포), 및 NKp46 또는 CD19를 발현하도록 조작된 표적 세포의 존재 하에서의 항-NKp46 CAR T 세포의 요약. 항-NKp46 CAR T 세포는 NKp46을 발현하지만 CD19는 발현하지 않는 세포의 존재 하에 활성화된다 (CD137 발현 증가). 반면 항-CD19 CAR T 세포는 CD19를 발현하지만 NKp46을 발현하지 않는 세포의 존재 하에 활성화된다 (CD137 발현 증가). CAR T 세포 활성화의 크기는 항-NKp46 CAR 및 항-CD19 CAR에 대해 유사하였다. 공여자 A (도 3a) 및 공여자 B (도 3b)에 대한 결과는 유사하다.
도 4a, 4b. 배지, 비-특이적 세포 (K562 세포), 및 NKp46 또는 CD19를 발현하도록 조작된 표적 세포의 존재 하에서의 항-NKp46 CAR T 세포 기능의 요약. 항-NKp46 CAR T 세포는 NKp46을 발현하지만 CD19는 발현하지 않는 세포의 존재 하에 적절한 세포내 사이토카인을 발현한다 (IL-2, TNF-α, 및 IFG-γ 증가). 반면 항-CD19 CAR T 세포는 CD19를 발현하지만 NKp46을 발현하지 않는 세포의 존재 하에 적절한 사이토카인을 발현한다. 세포내 사이토카인 발현의 크기는 항-NKp46 CAR 및 항-CD19 CAR에 대해 유사하였다. 공여자 A (도 4a) 및 공여자 B (도 4b)에 대한 결과는 유사하다.
도 5. 항-NKp46 CAR T 세포에 의한 NKp46+ 세포의 살해. NKp46-발현 K562 세포 단독의 유세포 분석 플롯 (왼쪽). NKp46-발현 K562 세포는 항-CD19 CAR T 세포와 2:1 비율 x 유세포 분석 (중앙)으로 분석하기 24시간 전에 혼합되었다. NKp46-발현 K562 세포는 항-NKp46 CAR T 세포와 2:1 비율 x 유세포 분석 (오른쪽)으로 분석하기 24시간 전에 혼합되었다. 표적 세포는 플롯 (CD3lo)의 오른쪽에 있다. T 세포는 더 오른쪽에 있고, 상부 T 세포는 BFP 발현에 의해 평가된 바와 같이 CAR을 발현한다. CAR T 세포의 존재 하에 살아있는 표적 세포의 백분율은 항-CD19 CAR T 세포의 존재 시 16.2%에서 항-NKp46 CAR T 세포의 존재 시 4.85%로 감소한다. 이는 항-NKp46 CAR의 존재 하에 NKp46+ 표적 세포의 70% 감소를 나타낸다. 표적 세포는 검은색 원으로 표시되었다. BFP를 발현하는 T 세포는 검은색 원으로 표시되고 별표로 표시되는 추정 CAR T 세포이다.
도 6. 항-NKp46 CAR T 세포는 자가 NK 세포와 혼합될 때 활성화된다. 도 6은 항-NKp46 CAR T 세포가 자가 NK 세포와 혼합될 때 항-NKp46 CAR T 세포 상에서 CD137 발현의 상향조절을 유세포 분석에 의해 평가한 것을 도시한다. CAR T 세포는 표적 세포와 2:1 비율로 혼합되어 6시간 후 유세포 분석에 의해 평가되었다. CD137 발현은 BFP를 발현하는 단일의 살아있는 CD3+ 림프구에 대한 게이팅에 의해 CAR 세포에서 평가된다. 표적 세포는 NK 세포 (40-50% NK 세포)가 농축된 자가 세포였다.
도 7. 항-NKp46 CAR T 세포는 자가 NK 세포를 살해한다. 자가 NK 세포를 농축하고 세포 트래커 (tracker)로 염색한 다음 항-NKp46 CAR T 세포, 대조군 CAR T 세포 (항-CD19 CAR T 세포), 또는 mock T 세포와 2 CAR 대 1 표적 세포 비율로 24시간 동안 혼합한 다음 유세포 분석으로 평가하였다. NK 세포는 CD3 음성 세포 트래커 오렌지 세포에 대한 게이팅에 의해 정량화되었다. 항-NKp46 CAR T 세포의 존재 하에, NK 세포의 백분율은 항-NKp46 CAR T 세포의 존재 하에서는 72% 감소한 반면, 대조군 CAR T 세포 (항-CD19 CAR)의 존재 하에서는 9%만 감소하였다. 표시된 플롯에 도시된 세포의 백분율: 림프구 = 70.4 (y축은 SSC-A); 싱글렛 (단일 세포) = 92.2 (y축은 FSC-H); 살아있는 세포 = 89.4 (y축은 SSC-A); 표적 집단 = 100.0 (y축은 Comp-PE-A); 및 NK 세포 (CD3 음성) = 45 (y축은 Comp-PE-A).
도 8. NK 세포는 항-NKp46 CAR T 세포와의 접촉에 의해 활성화된다. NK 세포가 농축된 자가 표적 세포를 항-NKp46 CAR T 세포와 2 CAR 세포:1 표적 세포 비율로 24시간 동안 혼합하고 유세포 분석으로 세포내 사이토카인 발현을 평가하였다. NK 세포에 대한 게이팅은 NK 세포가 항-NKp46 CAR T 세포와 혼합될 때 사이토카인 발현이 증가하지만 NK 세포가 mock T 세포 또는 항-CD19 CAR T 세포와 혼합될 때 증가하지 않음을 입증한다. IFN-γ 또는 TNF-α를 발현하는 NK 세포의 백분율은 2-3배 증가하는 반면, IL-2는 증가하지 않는 것으로 보인다. IFN-γ 또는 TNF-α는 전형적으로 활성화된 NK 세포에 의해 생성된 사이토카인이다.
도 9. 자가 NK 세포는 항-NKp46 CAR T 세포를 살해한다. 항-NKp46 또는 항-CD19 CAR T 세포를 자가 NK 세포와 혼합하고 6시간에 유세포 분석으로 평가하였다. 자가 NK 세포에 세포 트래커를 장착하여 표적 세포의 분화를 도왔다. CAR T 세포는 세포 트래커 음성 세포 (비-표적), CD3+ (비-NK 세포), 및 BFP (CAR+ 세포)에 대한 게이팅에 의해 평가되었다. 플롯은 측면 산란 (SSC) 대 BFP를 도시한다. BFP+ 항-NKp46 세포의 비율은 자가 NK 세포 (상단 패널)의 존재 하에 35% (10.2%에서 6.6%) 감소한 반면, BFP+ 항-CD19 CAR T 세포의 백분율은 자가 NK 세포 (하단 패널)의 존재 하에 감소하지 않았다. 항-NKp46 CAR T 세포의 감소는 대부분의 BFP를 발현하는 세포에서 가장 현저한 것으로 보인다.
도 10a-10c. 실시예 2에 기술된 CAR에 대한 항-NK CAR 설계 및 구축. (도 10a) 항-NKp46 및 αNKG2A CAR의 세포외 및 막횡단 도메인의 다이어그램. 묘사된 구현예에에서, αNKp46 CAR은 CD8 알파 사슬 힌지 및 막횡단 도메인에 의해 막에 고정되는 반면, αNKG2A CAR은 HLA-E 막횡단 및 세포내 도메인을 사용한다. TM, 막횡단; scFv, NKp46 수용체 단백질에 특이적인 단일-사슬 가변 영역; b2M, 베타-2-마이크로글로불린. (도 10b) 감마-레트로바이러스로부터 유래된 MND 인핸서-프로모터 하에 pRRL 백본으로 클로닝된 완전한 αNKp46 및 αNKG2A CAR 작제물의 도식적 표현. CD8a 힌지 & TM, CD8a 힌지 및 막횡단 도메인; 4-1BB, 세포내 공동-자극 도메인; CD3z, 자극 도메인; 2A, 자기-절단 펩타이드; BFP, 청색-형광 단백질. (도 10c) Mock, αNKp46 CAR, αNKG2A CAR, 및 αCD19 제어 CAR에서 BFP 리포터 발현을 나타내는 대표적인 흐름도.
도 11a-11f. NKp46+ K562 세포에 대한 αNKp46 CAR T 세포 표현형 및 세포독성. (도 11a) 각각의 수용체를 발현하도록 형질도입된 골수 세포주 K562에서의 NKp46 및 CD19 발현을 나타내는 히스토그램. FMO = 형광 마이너스 원 컨트롤 (Fluorescence Minus One control). (도 11b) αNKp46 CAR T 세포 표면 CD137의 요약 및 (도 11c) NKp46+ K562 세포에 대한 세포내 사이토카인 상향조절. BFP-발현 αNKp46 CAR T 세포를 NKp46+ K562 세포와 2:1 E:T 비율로 24시간 동안 배양하고 CD137에 대해 염색하거나 6시간 동안 배양하고 TNFα, IFNγ 및 IL-2 발현에 대해 염색하였다. 데이터는 3명의 공여자에 걸친 3개 (CD137) 또는 5개 (사이토카인) 개별 실험의 평균 +- S.D.를 나타낸다. 유의성은 양면 스튜던트 t 테스트로 계산하였다. (도 11d) NKp46+ K562 세포와 함께 배양된 αCD19 또는 αNKp46 CAR T 세포의 사이토카인 발현 프로파일을 나타내는 파이 차트. 각 음영은 발현된 사이토카인의 특정 조합을 나타낸다. 파이 차트의 각 영역은 해당 사이토카인 발현 프로파일을 갖는 CAR T 세포의 비율을 나타낸다. 아크 길이는 측정된 각 사이토카인의 발현 빈도를 나타낸다. (도 11e) 왼쪽, αNKp46 및 αCD19 CAR T 세포와의 24시간 공동-배양 후 용해된 NKp46+ K562 세포의 백분율을 나타내는 용량-반응 곡선. 오른쪽, 증가하는 이펙터 용량에서 αNKp46 또는 αCD19 CAR T 세포와 함께 24시간 공동 배양 후 남아 있는 NKp46+ 대 CD19+ K562 세포의 비율. 이러한 검정에서, NKp46+ 및 CD19+ K562 세포는 2:1 E:T 비율로 αNKp46 또는 αCD19 CAR T 세포와 동일한 수와 함께 플레이팅되었다. (도 11f) 표적 세포의 CAR T 세포 특이적 살해의 대표적인 흐름도. NKp46+ 및 CD19+ K562 세포를 24시간 동안 2:1 E:T 비율로 mock, αNKp46 또는 αCD19 CAR T 세포와 함께 단독 배양하였다.
도 12a-12h. NK 세포에 대한 αNKp46, αNKG2A CAR T 세포 표현형 및 세포독성. (도 12a) 상단: CAR T 세포 생성과 동시에 발생하는 자가 NK 세포 분리 및 확장의 개략도. 하단: NK MACS 배지를 사용한 NK 확장 프로토콜을 통해 NK 세포 순도를 나타내는 대표적인 실험의 도트 플롯. (도 12b) NK MACS 배지에서 성장 14일까지 PBMC의 NKp46+ 및 PBMC로부터 선택된 NK 세포에서의 NKG2A 발현을 나타내는 대표적인 히스토그램. (도 12c) NK92 세포에서의 NKp46+ 및 NKG2A 발현을 나타내는 대표적인 히스토그램. (도 12d) 표면 CD137을 발현하는 퍼센트 CAR T 또는 (도 12e) 24시간 (CD137) 또는 6시간 (사이토카인) 후 자가 1차 NK/T 표적 혼합물 또는 NK92 세포와 함께 배양될 때 세포내 사이토카인. (도 12f) 자가 NK/T 세포 혼합물 또는 NK92 세포와 함께 배양된 CAR T 세포의 사이토카인 발현 프로파일을 나타내는 파이 차트. 각 음영은 발현된 사이토카인의 특정 조합을 나타낸다. 파이 차트의 각 영역은 해당 사이토카인 발현 프로파일을 갖는 CAR T 세포의 비율을 나타낸다. 아크 길이는 측정된 각 사이토카인의 발현 빈도를 나타낸다. (도 12g) 6시간 동안 CAR T 세포와 공동 배양한 후 용해된 자가 NK 세포의 백분율을 나타내는 용량-반응 곡선. (도 12h) CAR T 세포와 함께 배양될 때 세포트래커-염색된 자가 NK 세포의 클리어런스를 나타내는 대표적인 도트 플롯.
도 13a-13e. NK 세포 세포독성 및 αNKp46 CAR 보호. (도 13a) αNKp46 CAR T 세포에 대한 NK 세포 세포독성 및 αNKG2A CAR 공동 발현에 의한 완화의 도식적 표현. (도 13b) 상단, 자가 1차 NK 세포와 4시간 공동-배양 후 남아있는 CAR T 세포 (% BFP T 세포)의 분획. 값은 CAR T 세포만 대조군에서 BFP+ 세포의 퍼센트가 1과 같도록 정규화된다. 하단, 상대 BFP는 자가 1차 NK 세포와 4시간 공동 배양 후 CAR T 세포의 형광 강도 (MFI)를 의미한다. 값은 CAR T 세포 단독 조건에서 상대 BFP MFI가 1이 되도록 정규화된다. (도 13c) 상단, NKp46+ K562 세포와 4시간 공동-배양 후 남아있는 αNKp46 CAR T 세포 (% BFP T 세포)의 분획. 값은 αNKp46 CAR T 세포만 대조군에서 BFP+ 세포의 퍼센트가 1과 같도록 정규화된다. 하단, NKp46+ K562 세포와 4시간 공동-배양 후 αNKp46 CAR T 세포의 상대 BFP MFI. 값은 αNKp46 CAR T 세포 단족 조건에서 상대 BFP MFI가 1이 되도록 정규화된다. (도 13d) 4시간 후 단독 배양된 (상단) 또는 2:1 E:T 비율로 자가 1차 NK 세포와 함께 배양된 (하단) CAR T 세포의 BFP 발현을 나타내는 대표적인 밀도 플롯. 플롯은 αNKp46 CAR T 세포만으로 NK 세포를 첨가한 후 %BFP 발현 및 BFP MFI 모두의 감소를 보여준다. (도 13e) 2:1 T:NK 세포 비율로 배양될 때 CAR T 세포에 대해 세포내 사이토카인을 발현하는 자가 1차 NK 세포의 퍼센트.
도 14. 본 개시내용의 예시적인 서열은 다음을 포함한다:
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003

Figure pct00004
자연 살해 (NK) 세포는 종양 세포 및 바이러스에 감염된 세포에 대한 면역 체계 반응에서 결정적인 역할을 하는 백혈구의 일종이다. NK 세포는 인터페론 또는 사이토카인과 같은 염증 매개체에 반응하여 활성화된다. NK 세포는 또한 염증이 있거나 감염된 조직을 인식하고 이에 반응하기 위해 다양한 활성화 및 억제성 수용체뿐만 아니라 공동-자극 수용체를 발현한다. 이러한 수용체는 세포 스트레스 리간드에 결합하여 NK 세포 반응을 유발할 수 있다.
NK 세포는 퍼포린 및 그랜자임과 같은 NK 세포 내부의 특수 분자를 방출하여 표적 세포에 대한 그들의 세포독성 기능을 수행한다. NK 세포가 파괴 대상 세포와 접촉하면 NK 세포에서 방출된 퍼포린은 표적 세포의 세포막에 그랜자임 및 관련 분자 기공이 들어갈 수 있는 구멍을 형성하여 이를 통해 그랜자임과 같은 관련 분자가 들어갈 수 있어 표적 세포의 세포 사멸을 유도한다.
NK 세포는 정상 세포에서 발현되는 주 조직접합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 인식하는 여러 수용체를 발현하기 때문에 정상 세포를 무차별적으로 살해하지 않는다. 중요하게는, 이러한 수용체 중 일부는 NK 세포의 활성화를 방지하여 NK 세포가 건강한 조직을 표적으로 하지 않도록 할 수 있다. 주 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC I) 및 관련 분자는 NK 세포를 건강한 자기 세포를 스트레스, 감염, 외인성 또는 종양 세포와 구별할 수 있도록 하는 생물학의 일부이다. 표적 세포에서 하나 이상의 MHC 클래스 I 대립유전자의 발현의 결여는 NK-매개 표적 세포 용해로 이어진다. 예를 들어, 세포, 조직 또는 장기 이식에서 공여자와 수용자 사이의 MHC I 분자의 불일치는 항체 의존적 세포독성을 통해 NK 세포에 의한 공여자 세포, 조직 또는 장기의 불일치 및 파괴를 인식하는 항체를 유발할 수 있다.
NK 세포는 일반적으로 유익하지만; NK 세포 악성종양 또한 발생한다. 자연 살해 (NK) 세포 신생물은 효과적인 치료 옵션이 제한적이고 사망률이 높다 (문헌 [Campo 등 Blood 117, 5019-5032 (2011); Matutes, E. Int. J. Lab. Hematol. 40, 97-103 (2018)]). 세계 보건 기구 (WHO)는 NK 세포 악성종양의 두 가지 주요 유형을 분류한다: 림프절외 NK/T 세포 림프종, 비강 유형 (ENK/TL) 및 공격적 NK 세포 백혈병 (ANKL) (둘 다 엡스타인-바 바이러스 (EBV)와 강하게 관련되어 있음) (문헌 [Campo 등 Blood 117, 5019-5032 (2011); Matutes, E. Int. J. Lab. Hematol. 40, 97-103 (2018); Saleem & Natkunam. Int. J. Mol. Sci. 21, 1501 (2020)]). NK 세포 신생물 분류는 도 1에 도시되어 있다. 이러한 종양은 혈관 침범 및/또는 혈관파괴; 세포질 아주로필릭 과립 (Romanowsky 염색에 의함); 및/또는 CD2+/CD3-/cCD3ε+/CD56+ 표현형을 특징으로 할 수 있다. 이들은 전 세계적으로 모든 비호지킨 림프종의 2% 이상을 차지하지만 아시아 및 남미 지역에서 3-10배 더 많이 발생한다 (문헌 [Perry 등 Haematologica 101, 1244-1250 (2016)]). 풍토병이 없고 자원이 부족한 국가에서는 불균형적인 질환 부담과 관련이 있다 (문헌 [
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-Romero 등 Head Neck Pathol. 13, 624-634 (2019)]). 저위험 1기/2기 ENKTL의 예후가 더 유리해졌지만(90% 지속성 완화), 고위험 및 후기 ENKTL의 치료는 여전히 어려우며 (문헌 [Tse & Kwong. Best Pract. Res. Clin. Haematol. 32, 253-261 (2019)]), 재발성/난치성 ENKTL은 평균 생존 기간이 6개월로 유지되었다 (문헌 [Lim 등 (2017) Annals of Oncology, 28(9), 2199-2205]). ANKL의 예후는 암울하며 줄기 세포 이식이 없는 경우 (문헌 [Hamadani 등 2017) Biology of Blood and Marrow Transplantation, 23(5), 853-856]) 평균 생존 기간은 2개월로 보고되었다 (문헌 [Kwong, Y.-L. Leukemia 19, 2186-2194 (2005); Suzuki 등 (2004). Leukemia, 18(4), 763-770]). 이를 위하여, NK 세포 악성종양에 대한 혁신적이고 보다 효과적인 치료법이 절실히 필요하다.
순환 또는 조직 NK 세포의 변화는 또한 자가면역 및 동종면역 질환과 관련이 있다. 자가 면역은 자기 자신의 항원에 대한 면역 반응이다. NK 세포 기능과 관련된 자가면역 장애는 쇼그렌병; 항인지질 증후군; 심상성 천포창; 척추관절병증; 건선을 포함한 피부 질환; 다발성 경화증; 전신 경화증; 제1형 당뇨병 (Gur 등 Nat. Immunol. 11, 121-128 (2010)); 소아 특발성 관절염; 류마티스 관절염; 염증성 장 질환; 자가면역 간 질환; 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 포함한다.
동종면역 (alloimmunity) (동종면역 (isoimmunity)이라고도 함)은 같은 종 구성원의 비-자기 항원에 대한 면역 반응이다. 비-자기 항원은 동종항원 (alloantigen) 또는 동종항원 (isoantigen)으로 알려져있다. 동종항원의 두 가지 주요 유형은 혈액형 항원과 조직적합성 항원이다. 동종면역에서, 신체는 동종항원에 대한 항체를 생성하여 수혈된 혈액, 동종이식된 조직 및 태아를 공격한다. 동종면역 반응은 이식 거부반응을 유발할 수 있으며 이식 기능의 악화 또는 완전한 손실로 나타난다. NK 세포는 태아 혈소판 항원에 대한 모체 면역 반응이 유산 및 자궁 내 성장 제한과 같은 합병증을 유발할 수 있는 태아/신생아 동종면역 저혈소판증 (FNAIT)과 관련이 있다 (문헌 [Yougbare 등 (2017) Nat Commun. 8(1): 224]). 자궁 자연 살해(uNK) 세포 모집 및 임신 중기 이후의 생존은 상승된 NKp46 및 CD107 발현, 퍼포린 방출 및 영양막 세포자연사로 이어지는 것으로 관찰되었다. NK 세포는 또한 조혈 줄기 세포 거부반응, 고형 조직 이식 거부반응 및 신장 이식 후 만성 동종이식 손상과 관련이 있다.
NKp46 발현은 일반적으로 NK 세포로 제한되지만, 비정상적인 NKp46 발현은 비-NK 세포 악성종양에서 보고되었다. 예를 들어, 공격적인 형태의 피부 T-세포 림프종인 세자리 증후군이 있는 환자는 말초 혈액 악성 CD4+ T 림프구의 세포 표면에서 NKp46 NK 수용체를 발현한다 (문헌 [Bensussan 등　(2011) J Invest Dermatol.　131: 969-976]). 또 다른 예로서, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 및 ALK+ 역형성 대세포 림프종을 포함하는 성숙한 T 세포 신생물의 20%가 비정상적으로 NKp46 수용체를 발현하는 것으로 관찰되었다 (문헌 [Freud 등　(2013) Am J Clin Pathol.　140:853-866]).
다양한 병리학적 조건에서 NK 세포의 역할을 고려할 때, NK 세포 악성종양, NK 세포 수용체를 발현하는 비-NK 악성종양, NK 세포-매개 자가면역 또는 동종면역 장애, 및 억제제 NK 세포 표현형이 우세하고 NK 세포 기능을 증가시키는 데 도움이 될 수 있는 조건 (예컨대 악성종양, 특히 종양 미세환경 및 일부 만성 감염)에서와 같이 NK 세포의 제거 또는 감소가 관심의 대상이 되는 요법을 개발할 필요가 있다.
본 개시내용은 NK 세포 관련 질환에 대한 요법으로서 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 제공한다. CAR은, 면역 세포에서 발현될 때 표적 세포 (예를 들어, NK 세포)에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 세포에 제공하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 세트를 지칭한다. 특정 구현예에서, CAR의 결합 도메인과 표적 세포의 표면 상의 그의 표적 항원의 결합은 CAR의 클러스터링 및 CAR-발현 세포에 대한 활성화 자극의 전달을 초래한다. CAR의 주요 특징은 면역 세포 특이성을 전환하여 증식, 사이토카인 생성, 식균 작용, 또는 MHC 독립적인 방식으로 표적 항원 발현 세포의 세포 사멸을 매개할 수 있는 분자의 생성을 유발하여 모노클로날 항체, 가용성 리간드, 또는 특이적 공동-수용체의 세포 특이적 표적화 능력을 이용하는 능력이다.
특정 구현예에서, CAR은 막횡단 도메인을 통해 세포내 성분에 연결된 세포외 성분을 포함한다. 세포외 성분은 표적화된 세포, 여기서는 NK 세포에 의해 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. NK 세포는 균일한 세포 표면 마커를 발현하지 않으므로 (문헌 [Hudspeth 등 (2013) Frontiers in immunology 4: 69]), 두 가지 접근법이 개발되었다. 첫 번째는 활성화 NK 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 갖는 CAR이다. 특정 구현예에서, 활성화 NK 수용체는 NKp46 (NCR1, 또는 CD335로도 알려짐)를 포함하며, 두 번째는 억제성 NK 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 갖는 CAR이다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체는 CD94/NKG2A를 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 예를 들어, 결합 도메인은 항-NKp46 항체로부터 유래된 scFv를 포함할 수 있다 (문헌 [Gauthier 등 (2019) Cell 177(7): 1701-1713; WO 2016/207278]). CD94/NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 문헌 [Gornalusse 등 (2017) Nature biotechnology 35(8): 765]에 기술된 바와 같이 인공적으로-설계된 HLA-E 모방체를 포함할 수 있다.
CAR의 세포외 성분은 종종 형태적 유연성을 향상시키기 위한 스페이서 영역, 및/또는 세포 제조 동안 및/또는 대상체에게 전달 후에 CAR을 제어하기 위한 태그 서열과 같은 추가 성분을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포내 성분은 본원에 정의된 바와 같은 자극 분자 및/또는 공동자극 분자 중 하나 이상으로부터 유래된 세포질 신호전달 도메인 (또한 본원에서 "세포내 신호전달 도메인"이라고도 함)을 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 관련된 CD3 제타 (CD3ζ) 사슬이다. 특정 구현예에서, 세포질 신호전달 도메인은 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 공동자극 분자는 4-1BB (즉, CD137) 또는 CD28을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 억제성 NK 수용체 (예를 들어, 항-NKG2A CAR)에 결합하는 CAR은 세포내 신호전달 도메인이 결여된 세포내 성분을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인이 결여된 HLA-E 또는 HLA-E 모방체를 포함하는 억제성 NK 수용체 (예를 들어, 항-NKG2A CAR)에 결합하는 CAR은 기성품 (off-the-shelf) CAR T 세포 요법의 개발에 이점을 부여할 수 있다. HLA-A, HLA-B, 및/또는 HLA-C의 발현이 결여되어 있지만, HLA-E 또는 HLA-E 모방체를 과발현하는 동종 CAR T 세포 생성물은 숙주 T 및 NK 세포-매개 거부반응을 모두 피할 수 있다 (문헌 [Gornalusse 등 Nat. Biotechnol. 35, 765-772 (2017); Torikai 등 Blood 122, 1341-1349 (2013)]). 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체에 결합하는 CAR을 발현하는 세포는 본질적으로 NK-매개 세포 용해로부터 보호된다.
특정 구현예에서, 세포는 억제성 NK 수용체에 결합하는 CAR 및 활성화 NK 수용체에 결합하는 CAR을 공동-발현하여, 활성화 NK 수용체에 결합하는 CAR에 의해 활성화된 표적 NK 세포로 인한 CAR 변형된 세포의 세포 용해를 완화시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화 NK 수용체에 결합하는 CAR을 발현하는 항-NK CAR 변형된 세포는 억제성 NK 수용체에 결합하는 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 존재 하에 표적 NK 세포에 의한 세포 용해를 피할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화 NK 수용체에 결합하는 CAR은 항-NKp46 CAR을 포함한다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체에 결합하는 CAR은 항-NKG2A CAR을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 항-NKG2A CAR은, NKG2A 수용체에 결합하고 세포내 신호전달 도메인을 갖는 HLA-E 또는 HLA-E 모방체를 포함하는 세포외 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 항-NKG2A CAR은, NKG2A 수용체에 결합하고 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 HLA-E 또는 HLA-E 모방체를 포함하는 세포외 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 항-NKG2A CAR은, NKG2A 수용체에 결합하고 세포내 신호전달 도메인을 갖는 항-NKG2A scFv를 포함하는 세포외 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 항-NKG2A CAR은, NKG2A 수용체에 결합하고 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 항-NGK2A scFv를 포함한다.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 링커에 의해 세포내 성분에 연결된다.
특정 구현예에서, CAR은 CAR 단백질의 아미노-말단 (N-말단)에서 임의적 리더 (즉, 신호) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 세포외 결합 도메인의 N-말단에서 리더 서열을 포함하고, 여기서 리더 서열은 세포막으로의 CAR의 국소화 및 세포 프로세싱 동안 결합 도메인으로부터 임의적으로 절단된다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR의 신호 서열은 서열번호: 238에 기재된 CD8 신호 펩타이드 서열; 서열번호: 239에 의해 암호화된 CD8 신호 펩타이드 서열; 서열번호: 130에 기재된 베타-2-마이크로글로불린 (B2M) 신호 펩타이드 서열; 및 서열번호: 131, 132, 및 208에 의해 암호화된 B2M 신호 펩타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 분자는 예를 들어, 형질도입 마커; 안전 스위치 역할을 하는 유전자 생성물; 귀소 수용체; 케모카인 수용체; 및/또는 사이토카인 수용체을 포함하는 CAR과 공동-발현될 수 있다.
표적화된 NK 세포는 다음을 포함하는 특정 특징 및 생물학적 특성에 의해 식별될 수 있다: 거대 과립 림프구 (LGL) 형태; CD16, CD56, CD57, NKR-P1, Ly49D 수용체, 및/또는 gp42를 포함하는 특정 표면 항원의 발현; 세포 표면 상에 α/β 또는 γ/δ TCR 복합체의 부재; 골수과산화효소 (MPO)의 부재; 특정 세포용해 효소의 활성화에 의해 자기 MHC/HLA 항원을 발현하지 못하는 세포에 결합하고 이를 살해하는 능력; NK 활성화 수용체에 대한 리간드를 발현하는 종양 세포 또는 다른 병든 세포를 살해하는 능력; 및/또는 면역 반응을 자극하거나 억제하는 사이토카인이라고 불리는 단백질 분자를 방출하는 능력. 이들 특징 및 활성 중 임의의 것은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 NK 세포를 식별하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 NK 악성종양을 표적으로 하는 CAR T 세포를 기술한다. NKp46 및/또는 NKG2A 발현은 NK 세포의 다른 서브세트에 걸쳐 다양하다. NK 세포 악성종양에서, 대다수는 NKp46을 발현하는 것으로 보인다 (문헌 [Freud 등 (2013) American journal of clinical pathology 140(6): 853-866; Uemura 등 (2018) Cancer Science 109(4): 1254-1262]). NKG2A는 많은 NK 악성종양에서 발현되지만, NKG2A를 발현하는 NK 악성종양의 백분율은 잘 정의되지 않는다 (문헌 [Haedicke 등 (2000) Blood 95(11): 3628-3630; Dukers 등 J. Clin. Path 54(3): 224-228)]). 또한, NK 세포는 일부 자가면역 및 동종면역 염증 및 질환 (문헌 [Poggi & Zocchi (2014) Frontiers in Immunology 5: 27])의 역할을 하여, 이들을 항-NK CAR T-세포로 치료할 수 있도록 한다. NK 세포로 인한 자가면역 또는 동종면역은 NKp46와 같은 활성화 수용체를 발현하는 NK 세포를 고갈시킴으로써 선택적으로 약화될 수 있다. 대조적으로, NK 및 T 세포 면역이 요구될 때, NK 및 T 세포 면역은 또한 암을 치료하기 위한 체크포인트 억제제로서 테스트되고 있는 모날리주맙과 같은 항-NKG2A 모노클로날 항체와 다소 유사한, 높은 수준의 억제성 수용체를 발현하는 NK 및 T 세포를 고갈시킴으로써 부스팅될 수 있다 (문헌 [Creelan & Antonia (2019) Nat. Rev. Clin. Onc. 16(5): 277-278; 및
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등 (2018) Cell 175(7): 1731-1743]). 모날리주맙은 종양 침윤 세포독성 NK 및 CD8 T 림프구에서 발현되는 NKG2A 억제성 수용체를 표적으로 하는 인간화된 IgG4 항체이다 (Innate Pharma SA, Marseille, France).
본원에 기술된 조성물 및 방법은 잠재적으로 장기간 동안 NK 세포를 완전히 또는 부분적으로 고갈시킬 수 있다. 그러나, 개인은 NK 결핍 기간, 예를 들어 줄기 세포 이식 및 기타 절차 동안을 견딜 수 있다. 또한, NK 세포 결핍증이 있는 것으로도 알려진 개인도 있다 (문헌 [Orange J Allergy Clin Immunol (2013) 132(3): 515-525]에서 검토됨). 그러나, 이러한 개인은 결국 바이러스 감염 (특히 인간 헤르페스 바이러스의 경우) 및 바이러스 관련 악성종양으로 발전한다. 따라서, 질환에 걸린 NK 세포 집단이 근절되면, 건강한 NK 세포 집단을 다시 도입하는 것이 유리할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포를 사용한 요법은 또한 항-바이러스 치료 또는 예방과 함께 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 예를 들어 분자 안전 스위치를 이용하여 독성을 관리하기 위해 조절 (즉, 켜짐 또는 꺼짐)된다.
본 개시내용과 관련된 하기 측면 및 옵션은 이제 하기와 같이 추가로 상세히 기술된다: (i) CAR 결합 도메인 및 표적화된 NK 세포 마커; (ii) CAR 세포내 성분; (iii) CAR 막횡단 도메인; (iv) CAR 링커; (v) CAR 검출 및 제어 요소; (vi) CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포; (vii) 생체외 및 생체내에서 세포를 수집 및 변형시키기 위한 방법; (viii) CAR의 생성; (ix) CAR 발현 세포를 특성화하기 위한 검정; (x) 표적 NK 세포를 특성화하기 위한 검정; (xi) 조성물 및 제형; (xii) 사용 방법; (xiii) 키트; (xiv) 변이체; (xv) 예시적인 구현예; (xvi) 예시적인 실시예; 및 (xvii) 마무리 단락. 이러한 제목들은 구조적 목적으로만 제공되며 개시내용의 범위나 해석을 제한하지 않는다.
(i) CAR 결합 도메인 및 표적화된 NK 세포 마커. 특정 구현예에서, CAR은 NK 세포에 의해 발현되는 세포 마커에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인 (즉, 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 마커는 활성화 NK 수용체이다. 활성화 NK 수용체는 자극될 때 사이토카인 생성 (예를 들어, 인터페론 감마 (IFNγ) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)), 세포내 유리 칼슘 수준의 증가 및/또는 재지시된 살해 검정에서 세포를 표적화하는 능력과 같은 NK 활성과 관련된 것으로 당업계에 공지된 임의의 특성 또는 활성에서 측정 가능한 증가를 유발하는 NK 세포의 표면 상의 임의의 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, NK 활성화 수용체는 세포질 티로신-기반 모티프를 통해 신호를 보낼 수 있다. 특정 구현예에서, NK 활성화 수용체는 CD2; CD44; 프랙트알킨 수용체; CD27; CD160; CD137; 자연 살해 그룹 2D (NKG2D); DNAX 보조 분자-1 (DNAM1); 활성화 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KAR); C형 렉틴-유사 활성화 수용체 NKp80; SLAMF3, SLAMF4, SLAMF5, SLAMF6, 및 SLAMF7을 포함하는 수용체의 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM) 패밀리; 및 NKp30, NKp44, 및 NKp46을 포함하는 자연 세포독성 수용체 (NCR)를 포함한다. NCR은 NK 세포에서 선택적으로 발현되며 자가면역 조건에서 병원체, 종양 세포, 바이러스에 감염된 세포, 및 자기-세포에 대한 NK 세포의 인식 및 활성화에 관여한다.
특정 구현예에서, CAR은 NK 세포 상의 NKp46 활성화 수용체 (자연 세포독성 유발 수용체 1 (NCR1), 또는 분화 클러스터 (CD)335로도 알려짐)에 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함할 수 있다. NKp46은 세포외 면역글로불린 (Ig) 도메인, 양전하를 띤 아미노산 잔기를 함유하는 막횡단 도메인, 및 짧은 세포질 꼬리가 있는 46 kDa 유형 I 막횡단 당단백질이다. 예시적인 NKp46 아미노산 서열은 서열번호: 1 (UniProt ID O76036)을 포함한다. NKp46을 암호화하는 예시적인 NKp46 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 2 (NCBI Ref: NM_004829)를 포함한다. 특정 모노클로날 항체에 의한 NKp46의 가교는 강력한 NK 세포 활성화를 유도하여, 세포내 Ca++ 수준을 증가시키고 세포독성을 유발하며 림포카인을 방출한다 (문헌 [Sivori 등 (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136]). WO 2005/105848호는 NK 세포를 활성화할 수 있고 또한 표적 세포의 표면 상에 존재하는 인간 Fc 수용체, 예를 들어 Fc 감마 (Fcγ) 수용체에 의해 특이적으로 결합되는 모노클로날 항-NKp46 항체 (BAB281)를 기술한다. 특정 구현예에서, 모노클로날 항-NKp46 항체는 문헌 [Sivori 등 (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136]에 기술된 NK 세포 클론 S192로 마우스를 면역화함으로써 생성된 IgG1 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 항-NKp46 항체로부터 유래된 scFv를 포함한다 (문헌 [Gauthier 등 (2019) Cell, 177(7), 1701-1713]; WO 2016/207278호; WO 2017/016805호). 특정 구현예에서, NKp46을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 표 1 및 2의 항-NKp46 항체의 상보성 결정 영역 (CDR), 중쇄 가변 (VH) 도메인, 및 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함한다.
[표 1]
NKp46을 표적으로 하는 항-NKp46 항체의 CDR의 예시적인 서열
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[표 2]
NKp46을 표적으로 하는 항-NKp46 항체의 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 도메인의 예시적인 아미노산 서열
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특정 구현예에서, NKp46을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 표 3의 항-NKp46 항체의 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46을 표적으로 하는 항-NKp46 항체로부터 유래된 scFv는 서열번호: 120-126, 및 248을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
[표 3]
NKp46을 표적으로 하는 항-NKp46 항체로부터 유래된 scFv의 예시적인 아미노산 서열
Figure pct00010
특정 구현예에서, NKp46을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 TYGIGVG (서열번호: 260)의 서열을 갖는 CDRH1, HIWWNDNEYYNIDLKS (서열번호: 261)의 서열을 갖는 CDRH2, 및 GNYRYARGYVMDY (서열번호: 262)의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 RASESVEYYGTSLMQ (서열번호: 263)의 서열을 갖는 CDRL1, AASNVES (서열번호: 264)의 서열을 갖는 CDRL2, 및 QQNRKVPWT (서열번호: 265)의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 서열번호: 266에 제시된 중쇄의 항원 결합 단편 및 서열번호: 267에 제시된 경쇄의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 마우스 모노클로날 IgG2b 항-인간 NKp46 클론 # 195314 (R&D Systems, cat # MAB1850, Minneapolis, MN); 및 마우스 모노클로날 IgG1 항-인간 NKp46 클론 9E2 (Biolegend, cat # 331902, San Diego, CA)을 포함하는 상업적으로 입수가능한 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, CAR은 NKp30 활성화 수용체에 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, NKp30은 서열번호: 268 (NCR3, UniProt ID O14931)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp30을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 JP2008502322호에 기술된 항체 AZ20, 항체 A76, 및 항체 Z25의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp30을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 WO2020172605호에 기술된 15E1, 9G1, 15H6, 9D9, 3A12, 및 12D10을 포함하는 햄스터 항-NKp30 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp30을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 마우스 모노클로날 IgG2a 항-인간 NKp30 클론 # 210845 (R&D Systems, cat # MAB1849, Minneapolis, MN); 마우스 모노클로날 IgG1 항-인간 NKp30 클론 p30-15 (BD Biosciences, cat # 563384, Franklin Lakes, NJ); 및 마우스 모노클로날 IgG1 항-NKp30 클론 AF29-4D12 (ThermoFisher Scientific, cat # 501122309, Waltham, MA)를 포함하는 상업적으로 입수가능한 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, CAR은 NKp44 활성화 수용체에 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, NKp44는 서열번호: 269 (NCR2/CD336, UniProt ID O95944)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp44를 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 JP2008502322호에 기술된 마우스 모노클로날　항체　Z231의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp44를 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 마우스 모노클로날 IgG2a 항-인간 NKp44 클론 # 253415 (R&D Systems, cat # MAB22491, Minneapolis, MN); 마우스 모노클로날 IgG2b 항-인간 NKp44 클론 44.189 (ThermoFisher Scientific, cat # 17-3369-42, Waltham, MA); 마우스 모노클로날 IgG2a 항-인간 NKp44 클론 1G6 (Novus Biologicals, cat # NBP242683, Littleton, CO); 및 마우스 모노클로날 IgG1 항-인간 NKp44 클론 P44-8 (BioLegend, San Diego, CA)을 포함하는 상업적으로 입수 가능한 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, CAR은 억제성 NK 수용체에 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체에 결합하는 세포외 결합 도메인은 억제성 NK 수용체에 결합하는 항체로부터 유래된 scFv를 포함한다. 인간에서, 억제성 수용체의 두 가지 주요 부류는 NK 세포, 살해 면역글로불린-유사 수용체 (KIR) 및 CD94-NKG2A 이종이량체에 의해 발현된다. KIR은 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리에 속하는 I형 막횡단 수용체이며 2개 또는 3개의 세포외 Ig-유사 도메인을 특징으로 한다. HLA-C, HLA-B, 또는 HLA-A 대립유전자의 그룹에 특이적인 상이한 KIR이 식별되었다. 특정 구현예에서, KIR 억제성 수용체는 서열번호: 270 (UniProt ID Q8N743; KIR3DL3), 서열번호: 271 (UniProt ID Q99706; KIR2DL4), 서열번호: 272 (UniProt ID P43628; KIR2DL3), 서열번호: 273 (UniProt ID P43630; KIR3DL2), 서열번호: 274 (UniProt ID P43626; KIR2DL1), 및 서열번호: 275 (UniProt ID P43629; KIR3DL1)의 아미노산 서열을 포함한다. 두 번째 유형의 HLA-특이적 수용체는 렉틴-유사 CD94 분자와 NKG2A의 결합에 의해 형성된다. CD94-NKG2A 복합체는 비고전적인 MHC 분자인 HLA-E를 인식한다. HLA-E는 고전적인 MHC I 분자로부터 유래된 펩타이드만을 제시하기 때문에 부분적으로는 비고전적인 것으로 간주된다. 특정 구현예에서, HLA-E는 고전적인 MHC 클래스 I 분자의 신호 서열로부터의 노나머 자기-펩타이드 및 베타-2-마이크로글로불린 (B2M, 하기에 기술됨)이 있는 삼량체 복합체를 형성한다. 특정 구현예에서, 고전적인 MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 및 HLA-G를 포함한다. 특정 구현예에서, 이 특징은 NK 세포가 추정 표적 세포의 환경에서 MHC I 분자의 발현을 감지할 수 있게 한다. NKG2A는 CD94-NGK2A 복합체가 HLA-E에 결합할 때 억제성 신호를 유도하도록 하는 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 (ITIM)를 함유한다. 특정 구현예에서, HLA-E는 HLA-E 중쇄 (알파)를 포함하고, NKG2A 수용체에 결합한다. 특정 구현예에서, HLA-E는 HLA-E 중쇄 (알파) 및 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 경쇄를 포함하고, NKG2A 수용체에 결합한다. 특정 구현예에서, HLA-E는 고전적인 MHC 클래스 I 분자의 신호 서열로부터의 HLA-E 중쇄 (알파), B2M 경쇄, 및 HLA-E 결합 펩타이드를 포함하고, NKG2A 수용체에 결합한다. 특정 구현예에서, HLA-E 중쇄 (알파)는 HLA-E 01:03 중쇄 (알파)를 포함한다.
특정 구현예에서, HLA-E 또는 HLA-E 모방체에 포함된 고전적인 MHC 클래스 I 분자의 신호 서열로부터의 펩타이드는 VMAPRTLLL (서열번호: 276)의 아미노산 공통 서열을 포함할 수 있다 (문헌 [Borst 등 Clin Cancer Res 2020;26:5549-5556]). 특정 구현예에서, HLA-E 또는 HLA-E 모방체에 포함된 HLA-E 결합 펩타이드는 고전적인 MHC 클래스 I 분자의 신호 펩타이드: HLA-A로부터의 VMAPRTLVL (서열번호: 277)의 펩타이드; HLA-B 로부터의 VMAPRTVLL (서열번호: 278)의 펩타이드; HLA-C로부터의 VMAPRTLIL (서열번호: 279)의 펩타이드; HLA-G로부터의 VMAPRTVFL (서열번호: 280)의 펩타이드; HLA-A로부터의 VMPPRTLLL (서열번호: 281)의 펩타이드; HLA-B로부터의 VTAPRTVLL (서열번호: 282)의 펩타이드; HLA-B로부터의 VTAPRTLLL (서열번호: 283)의 펩타이드; HLA-C로부터의 VMAPRALLL (서열번호: 284)의 펩타이드; 및 HLA-C로부터의 VMAPQALLL (서열번호: 285)의 펩타이드를 포함할 수 있다 (문헌 [Borst 등 Clin Cancer Res 2020;26:5549-5556]).바이러스로부터의 신호 펩타이드는 HLA-E에 결합하도록 진화했을 수 있다. 특정 구현예에서, HLA-E 또는 HLA-E 모방체에 포함된 HLA-E 결합 펩타이드는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) (문헌 [Hannoun 등 Immunol Lett 2018;202:65-72]에 기술된 펩타이드), 거대세포바이러스 (CMV) (문헌 [Ulbrecht 등 J Immunol 2000;164(10):5019-5022]에 기술된 펩타이드), 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV) (문헌 [Jorgensen 등 PLoS one. 2012;7(9):e46120]에 기술된 펩타이드)를 포함하는 바이러스로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, HLA-E 또는 HLA-E 모방체에 포함된 HLA-E 결합 펩타이드는 ALALVRMLI (서열번호: 286)의 아미노산 서열을 포함하는 다중약물 내성-관련 단백질 7의 펩타이드 (문헌 [Wooden 등 J Immunol 2005;175:1383-1387]); 및 QMRPVSRVL (서열번호: 287)의 아미노산 서열을 포함하는 HSP60의 리더 펩타이드 (문헌 [Michaelsson 등 J Exp Med 2002;196:1403-1414])를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, CAR은 NK 세포 표면 억제성 수용체 CD94/NKG2A에 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 NKG2A는 서열번호: 186을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 NKG2A는 서열번호: 187에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, NKG2A를 표적으로 하는 결합 도메인은 인공 HLA-E 모방체를 포함한다 (문헌 [Gornalusse 등 (2017) Nature biotechnology, 35(8), 765]). 특정 구현예에서, HLA-E 모방체는 1) HLA-G의 신호 펩타이드 (또 다른 HLA 클래스 I 분자); 2) 성숙한 베타-2 마이크로글로불린 (B2M); 및 3) HLA-E 01:03 중쇄 (도 2a, 10a)의 이종삼량체를 포함한다.
특정 구현예에서, HLA-G의 신호 펩타이드 (즉, 도 2a, 10a의 'G 펩타이드')는 CD94/NKG2A에 대한 그의 결합을 통해 NK-세포 의존성 용해를 억제하는 HLA-E에 의해 일반적으로 제시되는 비-다형성 펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 VMAPRTLFL (서열번호: 127)을 포함하는 HLA-G의 신호 펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체의 HLA-G의 신호 펩타이드 (즉, 도 2a, 10a의 'G 펩타이드')는 서열번호: 128, 129, 및 207에 의해 암호화된다.
B2M은 모든 다형성 HLA 클래스 I 중쇄의 표면 발현에 필요한 공통 단백질 서브유닛을 암호화하는 비-다형성 유전자이다. 다른 HLA 클래스 I 분자와 마찬가지로, HLA-E는 B2M 서브유닛과 함께 이종이량체를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 130에 제시된 B2M 신호 펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체의 B2M 신호 펩타이드는 서열번호: 131, 132, 및 208에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 133에 제시된 B2M 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, B2M 폴리펩타이드는 B2M 신호 펩타이드를 포함하지 않는 성숙한 폴리펩타이드이다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체의 성숙한 B2M 폴리펩타이드는 서열번호: 134, 135, 및 209에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 HLA-E 중쇄 (알파)를 포함한다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 136에 제시된 HLA-E 01:03 중쇄 (알파)를 포함한다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체의 HLA-E 01:03 중쇄 (알파)는 서열번호: 137 및 210에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 130에 기재되고/되거나 서열번호: 131, 132, 또는 208에 의해 암호화된 B2M 신호 펩타이드; 2) VMAPRTLFL (서열번호: 127)의, 및/또는 서열번호: 128, 129, 또는 207에 의해 암호화된 HLA-G 신호 펩타이드; 3) 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 의해 암호화된 (GGGGS)3 가요성 링커; 4) 서열번호: 133에 기재되고/되거나 서열번호: 134, 135, 또는 209에 의해 암호화된 B2M 성숙 단백질; 5) 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 의해 암호화된 (GGGGS)4 가요성 링커; 및 6) 서열번호: 136에 기재되고/되거나 서열번호: 137 또는 210에 의해 암호화된 HLA-E 01:03 중쇄.
특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 130에 기재되고/되거나 서열번호: 208에 의해 암호화된 B2M 신호 펩타이드; 2) VMAPRTLFL (서열번호: 127)의, 및/또는 서열번호: 207에 의해 암호화된 HLA-G 신호 펩타이드; 3) 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 의해 암호화된 (GGGGS)3 가요성 링커; 4) 서열번호: 133에 기재되고/되거나 서열번호: 209에 의해 암호화된 B2M 성숙 단백질; 5) 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 의해 암호화된 (GGGGS)4 가요성 링커; 및 6) 서열번호: 136에 기재되고/되거나 서열번호: 210에 의해 암호화된 HLA-E 01:03 중쇄. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 242에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 243에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 238에 기재되고/되거나 서열번호: 239에 의해 암호화된 CD8 신호 펩타이드; 2) VMAPRTLFL (서열번호: 127)의, 및/또는 서열번호: 207에 의해 암호화된 HLA-G 신호 펩타이드; 3) 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 의해 암호화된 (GGGGS)3 가요성 링커; 4) 서열번호: 133에 기재되고/되거나 서열번호: 209에 의해 암호화된 B2M 성숙 단백질; 5) 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 의해 암호화된 (GGGGS)4 가요성 링커; 및 6) 서열번호: 136에 기재되고/되거나 서열번호: 210에 의해 암호화된 HLA-E 01:03 중쇄. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 244에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 245에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 238에 기재되고/되거나 서열번호: 239에 의해 암호화된 CD8 신호 펩타이드; 2) 서열번호: 130에 기재되고/되거나 서열번호: 208에 의해 암호화된 B2M 신호 펩타이드; 3) VMAPRTLFL (서열번호: 127)의, 및/또는 서열번호: 207에 의해 암호화된 HLA-G 신호 펩타이드; 4) 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 의해 암호화된 (GGGGS)3 가요성 링커; 5) 서열번호: 133에 기재되고/되거나 서열번호: 209에 의해 암호화된 B2M 성숙 단백질; 6) 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 의해 암호화된 (GGGGS)4 가요성 링커; 및 7) 서열번호: 136에 기재되고/되거나 서열번호: 210에 의해 암호화된 HLA-E 01:03 중쇄. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 246에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 247에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 CD8 신호 펩타이드, B2M 신호 펩타이드, HLA-G 신호 펩타이드, (GGGGS)3 가요성 링커, (GGGGS)4 가요성 링커, B2M 성숙 단백질, 및/또는 HLA-E 알파 사슬의 막횡단 도메인 중 하나 이상을 배제할 수 있다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 HLA-G 신호 펩타이드를 배제할 수 있다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 B2M 성숙 단백질을 배제할 수 있다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체는 HLA-E 알파 사슬의 막횡단 도메인을 배제할 수 있다. 특정 구현예에서, HLA-E 알파 사슬의 막횡단 도메인은 서열번호: 136에 기술된 성숙한 B2M에서 발견된 서열 VGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIW (서열번호: 259)을 포함한다.
특정 구현예에서, NK 세포에서 CD94-NKG2A 억제성 수용체에 결합하기 위해 인공 HLA-E 모방체를 사용하는 것의 예상치 못한 이점에는 항-NK CAR 변형된 세포의 NK-매개 세포 용해를 초래하지 않으면서 HLA 파괴 동종이형 항-NK CAR 변형된 세포가 사용되도록 허용하는 것이 포함된다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체와 CAR을 발현하는 항-NK CAR 변형된 세포는 NK 세포가 인공 HLA-E 모방체에 의해 억제되기 때문에 NK-매개 세포 용해를 피할 수 있다. 특정 구현예에서, 인공 HLA-E 모방체에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있다. 특정 구현예에서, 항-NKp46 CAR을 발현하는 항-NK CAR 변형된 세포는 인공 HLA-E 모방체와 CAR을 공동-발현함으로써 표적 NK 세포에 의한 세포 용해를 피할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NKp46 CAR을 발현하는 항-NK CAR 변형된 세포는 인공 HLA-E 모방체와 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 존재 하에 표적 NK 세포에 의한 세포 용해를 피할 수 있다. 공동-발현은 CAR이 활성화 NK 수용체 결합 도메인 및 억제성 NK 수용체 결합 도메인을 모두 갖는 세포에서 CAR을 발현시키거나 세포에서 2개의 개별 CAR을 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 하나의 CAR은 활성화 NK 수용체 결합 도메인을 포함하며 다른 CAR은 억제성 NK 수용체 결합 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, NKG2A를 표적으로 하는 결합 도메인은 NKG2A에 결합하는 항체로부터 유래된 scFv를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A를 표적으로 하는 결합 도메인은 모날리주맙을 포함하거나 모날리주맙으로부터 유래될 수 있다. 모날리주맙은 종양 침윤 세포독성 NK 및 CD8 T 림프구에서 발현되는 NKG2A 수용체를 표적으로 하는 인간화된 IgG4 모노클로날 항체이다 (WO 2016/041947호; Innate Pharma, Marseilles, France).
특정 구현예에서, NKG2A를 표적으로 하는 결합 도메인은 표 4 내지 6에 개시된 모날리주맙의 CDR (Kabat 넘버링에 따름), VH 도메인, 중쇄, 및 경쇄를 포함한다.
[표 4]
모날리주맙의 CDR의 예시적인 서열
Figure pct00011
[표 5]
모날리주맙의 가변 중 도메인 (VH)의 예시적인 아미노산 서열
Figure pct00012
[표 6]
모날리주맙의 중쇄 및 경쇄의 예시적인 아미노산 서열
Figure pct00013
특정 구현예에서, NKG2A를 표적으로 하는 결합 도메인은 항-NKG2A 항체 Z270 (WO2006070286호; WO2008/009545호; US 8,206,709호); 인간화된 항-NKG2A 항체 Z199 (WO2009/092805호; Carretero 등 Eur J Immunol 1997; 27:563-567; Beckman Coulter, Inc., Product No. IM2750, Brea, CA를 통해 상업적으로 입수가능)); 래트 항-뮤린 NKG2-항체 20D5 (Vance 등 (1999) J Exp Med 190: 1801-1812; BD Biosciences Pharmingen, Catalog No. 550518, USA를 통해 상업적으로 입수가능); 및 뮤린 항체 3S9 (US 2003/0095965호)로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, NKG2A를 표적으로 하는 결합 도메인은, US9422368호에 기술된 바와 같이, SYAMS (서열번호: 290)의 서열을 갖는 CDRH1, EISSGGSYTYYADSVKG (서열번호: 291)의 서열을 갖는 CDRH2, 및 HGDYPRFFDV (서열번호: 292)의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 SASSSVSSYIY (서열번호: 293)의 서열을 갖는 CDRL1, LTSNLAS (서열번호: 294)의 서열을 갖는 CDRL2, 및 QQWSGNPYT (서열번호: 295)의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, CAR은 KIR에 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, KIR을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 서열번호: 288에 제시된 중쇄의 항원 결합 단편 및 서열번호: 289에 제시된 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, KIR을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 US8119775호 및 문헌 [Shin 등 Hybridoma 1999; 18:521-527]에 기술된 항체 A210 또는 항체 A803g의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, KIR을 표적으로 하는 CAR의 결합 도메인은 마우스 모노클로날 IgG2b 항-인간 KIR 클론 # 180704 (R&D Systems, cat # MAB1848, Minneapolis, MN); 및 마우스 모노클로날 IgG1 항-인간 KIR 클론 NKVFS1 (Bio-Rad, cat # MCA2243, Hercules, CA; Spaggiari 등 Blood 2002; 99:1706-1714 and Blood 2002; 100:4098-4107)을 포함하는 상업적으로 입수가능한 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
NKp46와 같은 활성화 NK 수용체를 표적으로 하는 CAR을 발현하도록 변형된 면역 세포는 NK 세포를 살해할 수 있지만 NK 세포의 활성화를 유도하여 CAR T 세포의 NK-매개 살해를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체에 결합하는 결합 도메인은 NKp46에 결합하는 항-NKp46 CAR 변형된 세포로 인해 활성화되는 NK 세포에 의한 항-NKp46 CAR 변형된 세포의 용해를 방지하는 것을 돕기 위해 항-NKp46 CAR 변형된 세포에서 발현되거나 과발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체에 결합하는 결합 도메인은 HLA-E 또는 HLA-E 모방체를 포함한다. 이는 문헌 [Gornalusse 등 2017 (Nature biotechnology, 35(8), 765)]의 HLA-E 모방체의 용도와 대조되는데, 상기 문헌에서 HLA-E 모방체는 HLA를 발현하지 않도록 조작된 세포의 용해를 방지하는 데 사용되었다. 대조적으로, 본 개시내용에서, HLA-E는 HLA 및 베타-2-마이크로글로불린이 여전히 온전한 CAR 세포의 용해를 방지하는 데 도움이 된다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체에 결합하는 결합 도메인은 모날리주맙을 포함한다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체에 결합하는 결합 도메인은 본원에 기술된 항-NKG2A 항체로부터 유래된 결합 도메인을 포함한다.
억제성 NK 수용체에 결합하여 CAR 발현 세포 (즉, 항-NK 활성화 수용체 CAR 발현 세포)에 NK 세포 살해에 대한 내성을 부여하는 결합 도메인의 발현 또는 과발현은 다양한 방식으로 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 (a) 세포외 성분이 활성화 NK 수용체 (예를 들어, NKp46)에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR; 및 (b) 세포외 성분이 억제성 NK 수용체 결합 도메인 (예를 들어, HLA-E 모방체)을 포함하는 CAR을 공동-발현할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 (a) 세포외 성분이 활성화 NK 수용체 (예를 들어, NKp46)에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR; 및 (b) 세포외 성분이 억제성 NK 수용체 결합 도메인 (예를 들어, HLA-E 모방체)을 포함하고 세포내 성분에는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR을 공동-발현할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 (a) 세포외 성분이 활성화 NK 수용체 (예를 들어, NKp46)에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR; 및 (b) 세포내 신호전달 성분을 포함하지 않는 억제성 NK 수용체 결합 도메인 (예를 들어, HLA-E 모방체)을 포함하는 세포의 표면 상의 분자를 공동-발현한다. 특정 구현예에서, 세포는 활성화 NK 수용체 (예를 들어, NKp46) 및 억제성 NK 수용체 결합 도메인 (예를 들어, HLA-E 모방체)을 포함하는 세포외 성분을 포함하는 단일 CAR을 발현할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 세포 집단은 세포외 성분이 활성화 NK 수용체 (예를 들어, NKp46)에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현할 수 있고, 제2 세포 집단은 세포외 성분이 억제성 NK 수용체 결합 도메인 (예를 들어, HLA-E 모방체)을 포함하는 CAR (하나 이상의 세포내 신호전달 도메인이 있거나 없음)을 발현할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 세포 집단은 세포외 성분이 활성화 NK 수용체 (예를 들어, NKp46)에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현할 수 있고, 제2 세포 집단은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 억제성 NK 수용체 결합 도메인 (예를 들어, HLA-E 모방체)을 포함하는 각 세포의 표면 상의 분자를 발현할 수 있다. 세포 내 또는 세포 상의 분자 (예를 들어, 폴리펩타이드, CAR)의 과발현은 세포가 정상적으로 생성하는 것보다 더 큰 수준으로 분자의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 세포 내 또는 세포 상의 분자 (예를 들어, 폴리펩타이드, CAR)의 과발현은 세포 내로 도입되는 벡터 내의 유전자에 의해 암호화되는 분자의 발현을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되고 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 완전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2, 및 제3 불변 영역을 포함하는 반면, 각 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 포유동물 중쇄는 α, δ, ε, γ, 및 μ로 분류되고, 포유동물 경쇄는 λ 또는 κ로 분류된다. α, δ, ε, γ, 및 μ 중쇄를 포함하는 면역글로불린은 면역글로불린 (Ig)A, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로 분류된다. 완전한 항체는 "Y" 형상을 형성한다. Y의 줄기는 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역 (IgE 및 IgM의 경우, 제4 불변 영역)으로 구성되며, 이황화 결합 (사슬간)이 힌지에 형성된다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 탄뎀 (tandem) (일렬) Ig 도메인으로 구성된 불변 영역 및 유연성을 추가하기 위한 힌지 영역을 가지며; 중쇄 μ 및 ε은 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 갖는다. 제2 및 제3 불변 영역은 각각 "CH2 도메인" 및 "CH3 도메인"으로 지칭된다. Y의 각 아암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. CDR은 Kabat 등 (Wu and Kabat (1970) J Exp Med. 132(2):211-50; Borden and Kabat (1987) PNAS, 84: 2440-2443; Kabat 등, Sequences of Protein of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991)에 따른 서열에 의해, 또는 Chothia 등 (Chothia and Lesk (1987) J Mol. Biol., 196(4): 901-917; Chothia et al, Nature, 342: 877-883 (1989))에 따른 구조에 의해서와 같은 통상적인 방법에 의해 정의되거나 식별될 수 있다.
상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 인간과 같은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성하는 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 3차원 공간에서 CDR의 위치를 지정하고 정렬하는 역할을 한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 각 사슬의 CDR은 일반적으로 N-말단에서 시작하여 순차적으로 넘버링된 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭되며, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치한 사슬에 의해 식별된다. 따라서, 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치한 CDR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3으로 지칭되는 반면, 항체의 경쇄의 가변 도메인에 위치한 CDR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3으로 지칭된다. 상이한 특이성을 갖는 항체 (즉, 상이한 항원에 대한 상이한 결합 부위)는 상이한 CDR을 갖는다. 항체마다 CDR이 다르기는 하지만, CDR 내의 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접적으로 관여한다. CDR 내의 이러한 위치는 특이성 결정 잔기 (SDR)라고 한다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 참조는 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 본원에 개시된 바와 같은 기타 항체 단편의 것을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "VL" 또는 "VL"에 대한 참조는 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 본원에 개시된 바와 같은 기타 항체 단편의 것을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다. 특정 구현예에서, "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 포함하고, 중쇄의 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, "VL 도메인"은 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 포함하고 경쇄의 CDR을 포함한다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 단일 사슬 가변 (scFv) 항체 단편, 이황화-연결 Fvs (sdFv), VH 및 불변 CH1 도메인을 포함하는 Fd 단편, 선형 항체, sdAb와 같은 단일 도메인 항체 (VL 또는 VH), 낙타류 가변 중쇄 단독 (VHH) 도메인, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체, 및 항체의 분리된 CDR 또는 항체의 기타 에피토프 결합 단편을 포함한다 (Harlow 등, 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow 등, 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird 등, 1988, Science 242:423-426). 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv에 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136] 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩타이드를 기반으로 하는 스캐폴드에 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩타이드 미니바디를 기술하는 US 6,703,199호 참조).
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 합성 링커, 예를 들어 짧은 가요성 폴리펩타이드 링커를 통해 연속적으로 연결되고 단일 사슬 폴리펩타이드로서 발현될 수 있으며, 상기 scFv는 이것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 유지한다. 특정 구현예에서, 가변 영역을 연결하는 링커는 서열번호: 142-145를 포함하는 글리신-세린 링커를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, scFv는 VL 및 VH 가변 영역을 어느 순서로든 가질 수 있으며, 예를 들어, 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단과 관련하여, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
재조합 항체는 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 포함한다. 재조합 항체는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자는 항체 단백질 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 포함하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용 가능하고 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 얻어졌다.
"모노클로날 항체"는 B 림프구의 단일 클론 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 형질감염된 세포에 의해 생성된 항체이다. 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 골수종 세포와 면역 비장 세포의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 제조함으로써 생성된다. 모노클로날 항체는 인간화된 모노클로날 항체를 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 인간화된 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 인간화된 항체는 하나 이상의 인간 면역글로불린의 불변 및 가변 프레임워크 영역이 동물 (비-인간) 면역글로불린의 결합 영역, 예를 들어 CDR과 융합된 항체를 포함한다. 이러한 인간화된 항체는 결합 영역이 유래된 비-인간 항체의 결합 특이성을 유지하지만 비-인간 항체에 대한 면역 반응을 피하도록 설계된다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 완전한 인간 항체 또는 이의 항체 단편을 포함할 수 있고, 여기서 전체 분자는 인간 기원이거나 인간 형태의 항체 또는 면역글로불린과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 키메라 항체는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이하거나 변경된 클래스의 불변 영역, 이펙터 기능 및/또는 종, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 다른 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역 또는 이의 일부가 변경, 대체 또는 교환되는 항체 분자; 또는 (b) 가변 영역 또는 이의 일부가 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환되는 항체 분자를 포함할 수 있다.
(ii) CAR 세포내 성분. CAR의 세포내 성분은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CAR 변형된 세포, 예를 들어 항-NK CAR 변형된 면역 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어, 항-NK CAR 변형된 면역 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함한 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
신호전달 도메인은 2차 메신저를 생성함으로써 정의된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에 정보를 전달하거나 이러한 메신저에 반응함으로써 이펙터로 기능하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다. 자극은 자극 분자 (예를 들어, CAR)와 그 동족 리간드 (예를 들어, NK 세포 표면 마커)의 결합에 의해 유도된 1차 반응을 지칭하며, 이에 의해 CAR의 적합한 신호전달 도메인을 통한 신호 전달과 같은 신호 전달 이벤트를 매개한다. 자극은 특정 분자의 변형된 발현을 매개할 수 있다. 자극 분자는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 지칭하며, 이는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대해 자극 방식으로 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공한다. 특정 구현예에서, 신호는 예를 들어 증식, 활성화, 분화 등을 포함한 면역 세포 반응의 매개를 유도하는 NK 세포 표면 마커에 대한 CAR의 결합에 의해 개시되는 1차 신호이다.
세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3ζ, 공통 FcR γ (FCER1G), Fc γ RIIa, FcR β (Fc ε R1b), CD3 γ, CD3 δ, CD3 ε, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 것을 포함한다.
특정 구현예에서, CD3ζ (CD247) 자극 도메인은 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 T 세포 수용체 제타 사슬의 세포질 도메인, 또는 이의 기능적 유도체로부터의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CD3ζ 자극 도메인은 인간 CD3ζ 자극 도메인 또는 이의 기능적 이종상동체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 CD3ζ 자극 도메인은 서열번호: 146을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 CD3ζ 자극 도메인은 서열번호: 147에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, CD3ζ 분자로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인의 경우, 세포내 신호전달 도메인은 이것이 적절한 조건 하에 신호를 생성할 수 있도록 충분한 CD3ζ 구조를 유지한다.
특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여 증식과 같은 면역 세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 면역 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 또는 그들의 리간드 이외의 세포 표면 분자를 포함한다. 공동자극 분자는 다음의 단백질 패밀리로 제시될 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM 단백질), 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 MHC 클래스 I 분자, B 및 T 세포 림프구 약화인자 (BTLA, CD272), Toll 리간드 수용체, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS (CD278), BAFFR, HVEM (LIGHTR), ICAM-1, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1; CD11a/CD18), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp30, NKp44, NKp46, CD160 (BY55), B7-H3 (CD276), CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49d, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등, 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB (CD137, TNFRSF9)를 포함한다. 4-1BB는 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리의 구성원을 지칭한다. 특정 구현예에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 인간 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 이종상동체를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 4-1BB 공동자극 도메인은 서열번호: 148을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 4-1BB 공동자극 도메인은 서열번호: 149에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 CD28을 포함한다. CD28은 T 세포 활성화, 세포 증식 및 사이토카인 생성 유도, 및 T 세포 생존 촉진에 관여하는 T 세포-특이적 당단백질이다. 특정 구현예에서, CD28 공동자극 도메인은 인간 CD28 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 이종상동체를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 CD28 공동자극 도메인은 서열번호: 188을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 CD28 공동자극 도메인은 서열번호: 189에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 본원에 기술된 하나 이상의 자극 도메인 및 하나 이상의 공동자극 도메인의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 자극 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인은 서열번호: 230에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인은 서열번호: 231에 기재된 서열에 의해 암호화된다.
(iii) CAR 막횡단 도메인. CAR은 CAR의 세포내 성분에 세포외 성분을 연결하는 막횡단 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막횡단 도메인은 CAR 분자를 세포 막에 고정할 수 있다. 막횡단 도메인은 막횡단 영역에 인접한 하나 이상의 추가 아미노산, 예를 들어 막횡단이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 아미노산, 또는 그 이상) 및/또는 막횡단 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 관련된 하나 이상의 추가 아미노산 (예를 들어, 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 아미노산, 또는 그 이상)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 신호전달 도메인, 공동자극 도메인, 또는 힌지 도메인이 유래된 것과 동일한 단백질로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 CAR의 임의의 다른 도메인이 유래된 것과 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 CAR에서 다른 도메인의 결합을 피하거나 이들과의 상호작용을 최소화하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 세포 막에서 열역학적으로 안정한 3차원 구조를 가지며, 일반적으로 길이가 15 내지 30개의 아미노산 범위이다. 막횡단 도메인의 구조는 알파 나선, 베타 배럴, 베타 시트, 베타 나선, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
막횡단 도메인은 자연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 자연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에 신호를 전달할 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 적어도 T-세포 수용체의 α, β, 또는 ζ 사슬; CD28; CD27; CD3ε; CD45; CD4; CD5; CD8; CD9; CD16; CD22; CD33; CD37; CD64; CD80; CD86; CD134; CD137; 및/또는 CD154의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 적어도 KIRDS2; OX40; CD2; LFA-1; ICOS; 4-1BB; GITR; CD40; BAFFR; HVEM; SLAMF7; NKp80; NKp44; NKp30; NKp46; CD160; CD19; IL2Rβ; IL2Rγ; IL7Ra; ITGA1; VLA1; CD49a; ITGA4; IA4; CD49D; ITGA6; VLA-6; CD49f; ITGAD; CDl ld; ITGAE; CD103; ITGAL; CDl la; ITGAM; CDl lb; ITGAX; CDl lc; ITGB1; CD29; ITGB2; CD18; ITGB7; TNFR2; DNAM1; SLAMF4; CD84; CD96; CEACAM1; CRT AM; Ly9; CD160; PSGL1; CD100; SLAMF6 (NTB-A, Lyl08); SLAM; BLAME; SELPLG; LTBR; PAG/Cbp; NKG2D; NKG2C; 또는 이들의 조합의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD8α 사슬로부터의 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CD8 막횡단 도메인은 서열번호: 138을 포함한다. 특정 구현예에서, CD8 막횡단 도메인은 서열번호: 139 또는 233에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인 HLA-E 알파 사슬로부터의 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, HLA-E 알파 사슬은 서열번호: 136에 기재된 성숙한 B2M에서 발견된 서열 VGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIW (서열번호: 259)을 포함한다.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 막횡단 도메인의 각 말단에서 발견되는 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛 (triplet)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CD8 힌지는 막횡단 도메인의 세포외 측에 병치된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 서열번호: 234에 기재되고/되거나 서열번호: 235에 기재된 서열에 의해 암호화되는 CD8 막횡단 도메인 및 CD8 힌지의 아미노산 서열을 포함한다.
(iv) CAR 링커. 본원에서 사용된 바와 같이, 링커는 분자의 2개의 하위성분 또는 도메인을 연결하는 역할을 하는 CAR 분자의 임의의 부분일 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 CAR 또는 CAR의 일부에 유연성을 제공할 수 있다. scFv의 항체 유래 결합 도메인의 VH 및 VL을 연결하는 맥락에서 링커는 위에 기술되어 있다. 링커는 스페이서 영역 및 접합 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 기재된 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 글리신-세린 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 기재된 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 글리신-세린 링커를 포함한다.
스페이서 영역은 다른 연결된 성분으로부터 적절한 거리 및/또는 유연성을 생성하는 데 사용되는 링커 영역의 일종이다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역의 길이는 NK 세포 인식 및 파괴를 최적화하기 위해 NK 세포 상의 개별 세포 마커에 대해 맞춤화될 수 있다. 스페이서는 스페이서가 부재할 때와 비교하여 항원 결합 후 CAR 발현 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역 길이는 NK 세포 마커 인식에 반응하여 생체외 및/또는 생체내에서 표적 NK 세포를 파괴하도록 세포 마커 에피토프의 위치, 에피토프에 대한 결합 도메인의 친화성, 및/또는 CAR 변형된 세포의 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 스페이서 영역은 또한 CAR 변형된 세포에서 높은 발현 수준을 허용할 수 있다. 특정 구현예에서, CAR의 세포외 스페이서 영역은 막횡단 도메인과 세포외 결합 도메인 사이에 위치한다.
예시적인 스페이서는 10 내지 250개의 아미노산, 10 내지 200개의 아미노산, 10 내지 150개의 아미노산, 10 내지 100개의 아미노산, 10 내지 50개의 아미노산, 또는 10 내지 25개의 아미노산을 갖는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역은 12개의 아미노산, 20개의 아미노산, 21개의 아미노산, 26개의 아미노산, 27개의 아미노산, 45개의 아미노산, 또는 50개의 아미노산이다. 특정 구현예에서, 더 긴 스페이서는 119개 이상의 아미노산이고고, 중간 스페이서는 13-119개의 아미노산이고, 짧은 스페이서는 10-12개의 아미노산이다.
특정 구현예에서, 스페이서 영역은 면역글로불린 힌지 영역을 포함한다. 면역글로불린 힌지 영역은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 특정 구현예에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 면역글로불린 힌지 영역이다. 면역글로불린 힌지 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 힌지 영역일 수 있다. IgG 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 힌지 영역일 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역은 IgG1, IgG2, lgG3, lgG4 또는 IgD로부터의 힌지 영역 서열의 전부 또는 일부를 단독으로, 또는 CH2 영역의 전부 또는 일부; CH3 영역의 전부 또는 일부; 또는 CH2 영역의 전부 또는 일부 및 CH3 영역의 전부 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "야생형 면역글로불린 힌지 영역"은 CH1 및 CH2 도메인 (IgG, IgA, 및 IgD의 경우) 사이에 개재되어 이를 연결하거나 항체의 중쇄에서 발견되는 CH1 및 CH3 도메인 (IgE 및 IgM의 경우) 사이에 개재되어 이를 연결하는 자연 발생 상부 및 중간 힌지 아미노산 서열을 지칭한다.
예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서는 아미노산 서열: ESKYGPPCPPC (서열번호: 150)의 IgG4 링커를 포함한다. 힌지 영역은 의도하지 않은 파트너와의 이량체화와 같은 바람직하지 않은 구조적 상호작용을 피하기 위해 변형될 수 있다. 본원에 기술된 CAR에 사용될 수 있는 힌지 영역의 다른 예는 야생형 또는 이의 변이체일 수 있는 CD8α, CD4, CD28, 및CD7과 같은 유형 1 막 단백질의 세포외 영역에 존재하는 힌지 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 힌지는 서열번호: 140에 기재되고/되거나 서열번호: 141 또는 232에 기재된 서열에 의해 암호화되는 CD8α 힌지를 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역은 아미노산 서열 PSPLFPGPSKP (서열번호: 151)의 CD28 링커일 수 있다.
특정 구현예에서, 스페이서 영역은 유형 II C-렉틴 도메인간 (줄기) 영역 또는 분화 클러스터 (CD) 분자 줄기 영역의 힌지 영역을 포함한다. II C-렉틴 또는 CD 분자의 "줄기 영역"은 C-형 렉틴-유사 도메인 (CTLD; 예를 들어, 자연 살해 세포 수용체의 CTLD와 유사함) 및 소수성 부분 (막횡단 도메인) 사이에 위치하는 유형 II C-렉틴 또는 CD 분자의 세포외 도메인 부분을 지칭한다. 예를 들어, 인간 CD94 (GenBank Accession No. AAC50291.1)의 세포외 도메인은 아미노산 잔기 34-179에 해당하지만, CTLD는 아미노산 잔기 61-176에 해당하므로, 인간 CD94 분자의 줄기 영역은 소수성 부분 (막횡단 도메인)과 CTLD 사이에 위치하는 아미노산 잔기 34-60를 포함한다 (문헌 [Boyington 등, Immunity 10:15, 1999; for descriptions of other stalk regions] 참조, 또한 문헌 [Beavil 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:153, 1992; 및 Figdor 등, Nat. Rev. Immunol. 2:11, 2002] 참조). 이러한 유형 II C-렉틴 또는 CD 분자는 또한 줄기 영역과 막횡단 영역 또는 CTLD 사이에서 접합 아미노산을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 233개 아미노산 인간 NKG2A 단백질 (UniProt ID P26715.1)은 아미노산 71-93 범위의 소수성 부분 (막횡단 도메인) 및 아미노산 94-233 범위의 세포외 도메인을 갖는다. CTLD는 아미노산 119-231을 포함하고 줄기 영역은 아미노산 99-116을 포함하며, 추가 접합 아미노산이 옆에 있을 수 있다. 다른 유형 II C-렉틴 또는 CD 분자, 뿐만 아니라 그들의 세포외 리간드-결합 도메인, 줄기 영역, 및 CTLD은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, GenBank 수탁번호 NP 001993.2; AAH07037.1; NP 001773.1; AAL65234.1; CAA04925.1; 각각 인간 CD23, CD69, CD72, NKG2A, 및 NKG2D 및 이들의 설명에 대한 서열 참조).
접합 아미노산은 스페이서에 의해 제공된 거리가 필요하지 않거나 및/또는 원하지 않는 경우 CAR 도메인의 서열을 연결하는 데 사용될 수 있는 링커일 수 있다. 특정 구현예에서, 접합 아미노산은 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 데 사용될 수 있는 짧은 아미노산 서열이다. 특정 구현예에서, 접합 아미노산은 9개 이하의 아미노산이다.
접합 아미노산은 짧은 올리고- 또는 단백질 링커일 수 있으며, 바람직하게는 링커를 형성하기 위해 길이가 2 내지 9개인 아미노산 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 아미노산)일 수 있다. 특정 구현예에서, 글리신-세린 더블렛 (doublet)은 적합한 접합 아미노산 링커로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 적합한 접합 아미노산으로서 단일 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 글리신이 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 길이가 2 내지 9개의 아미노산인 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 세포내 성분을 연결할 수 있다. 글리신-세린 더블렛은 특히 적합한 링커를 제공한다. 특정 구현예에서, 링커는 서열번호: 142-145를 포함할 수 있다.
(v) CAR 검출 및 제어 요소. 특정 구현예에서, CAR은 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 유전적으로 변형된 세포를 활성화, 증식 촉진, 검출, 농축, 분리, 추적, 고갈 및/또는 제거하기 위한 하나 이상의 태그를 포함할 수 있다. 태그는 동족 결합 분자 (예를 들어, 리간드, 항체, 또는 다른 결합 파트너)가 특이적으로 결합할 수 있는 CAR에 융합되거나 CAR의 일부인 독특한 합성 펩타이드 서열을 지칭하며, 여기서 결합 특성은 태그된 CAR을 발현하는 세포를 활성화, 증식 촉진, 검출, 농축, 분리, 추적, 고갈 및/또는 제거하는 데 사용될 수 있다.
CAR에 포함될 수 있는 태그는 예를 들어, His 태그 (서열번호: 152), Flag 태그 (서열번호: 153-155), Xpress 태그 (서열번호: 156), Avi 태그 (서열번호: 157), 칼모듈린 결합 펩타이드 (CBP) 태그 (서열번호: 158), 폴리글루타메이트 태그 (서열번호: 159), HA 태그 (서열번호: 160-162), Myc 태그 (서열번호: 163), Strep 태그 (원래의 STREP® 태그 (서열번호: 164), STREP® tag II (서열번호: 165) (IBA Institut fur Bioanalytik, Germany)를 지칭함; 예를 들어, US 7,981,632호 참조), Softag 1 (서열번호: 166), Softag 3 (서열번호: 167), 및 V5 태그 (서열번호: 168)를 포함한다.
본원에 개시된 태그 서열에 특이적으로 결합하는 분자에 결합된 접합체는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, His 태그 항체는 Life Technologies, Pierce Antibodies, 및 GenScript를 포함한 공급업체에서 상업적으로 입수 가능하다. Flag 태그 항체는 Pierce Antibodies, GenScript, 및 Sigma-Aldrich를 포함한 공급업체에서 상업적으로 입수 가능하다. Xpress 태그 항체는 Pierce Antibodies, Life Technologies, 및 GenScript를 포함한 공급업체에서 상업적으로 입수 가능하다. Avi 태그 항체는 Pierce Antibodies, IsBio, 및 Genecopoeia를 포함한 공급업체에서 상업적으로 입수 가능하다. Calmodulin 태그 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Abcam, 및 Pierce Antibodies를 포함한 공급업체에서 상업적으로 입수 가능하다. HA 태그 항체는 Pierce Antibodies, Cell Signal, 및 Abcam를 포함한 공급업체에서 상업적으로 입수 가능하다. Myc 태그 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Abcam, 및 Cell Signal를 포함한 공급업체에서 상업적으로 입수 가능하다. Strep 태그 항체는 Abcam, Iba, 및 Qiagen을 포함한 공급업체에서 상업적으로 입수 가능하다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 형질도입 마커는 CAR 및 형질도입 마커를 운반하는 벡터를 통합한 세포를 추적하기 위해 별개의 분자로서 형질도입 마커 및 CAR의 발현을 허용하는 스키핑 요소 (skipping element)를 사용하여 CAR과 공동-발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 형질도입 마커는 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 유전적으로 변형된 세포를 활성화, 증식 촉진, 검출, 농축, 분리, 추적, 고갈 및/또는 제거하는 데 사용될 수 있다. 형질도입 마커는 다음을 포함하는 적합한 형광 단백질을 포함할 수 있다: 청색 형광 단백질 (예를 들어, BFP, eBFP, eBFP2, 아주라이트, mKalamal, GFPuv, 사파이어, T-사파이어); 청록색 형광 단백질 (예를 들어, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan); 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl); 또는 주황색 형광 단백질 (예를 들어, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato); 적색 형광 단백질 (예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 모노머, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-모노머, HcRed-탄뎀, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred); 황색 형광 단백질 (예를 들어, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl); 및 예를 들어, 파이어플라이 루시퍼라제 (firefly luciferase)를 포함한 임의의 다른 적합한 형광 단백질. 특정 구현예에서, 형질도입 마커는 마커에 결합하고 마커를 갖는 세포의 분류를 허용하는 항체로 검출될 수 있는 임의의 세포 표면 디스플레이된 마커를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 형질도입 마커는 절단된 저 친화성 신경 성장 수용체 (Low Affinity Nerve Growth Receptor, LNGFRF) 및 스트렙타비딘-접합 자성 비드 (문헌 [Matheson 등 (2014) PloS one 9(10): e111437])를 사용한 1단계 선택 또는 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) (tEGFR; 문헌 [Wang 등, Blood 118: 1255, 2011] 참고)에 의해 세포 표면에 디스플레이된 자성 분류가능한 마커 스트렙타비딘 결합 펩타이드 (SBP)를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 형질도입 마커는 서열번호: 169-174를 포함하는 BFP를 포함한다 (문헌 [Heim and Tsien (1996) Current Biology, 6(2): 178-182; Yang 등 (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(14): 8212-8216; Ai 등 (2007) Biochemistry, 46(20): 5904-5910; 및 Constantini 등 (2015) Nature Communications, 6(1): 7670]). 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR 내의 BFP는 서열번호: 236에 기재된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 서열번호: 237에 기재된 서열에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 태그 또는 형질도입 마커에 특이적으로 결합하고 형광 염료, 방사성-트레이서, 산화철 나노입자 또는 X-선, CT-스캔, MRI-스캔, PET-스캔, 초음파, 유세포 분석, 근적외선 이미징 시스템, 또는 다른 이미징 방식에 의한 검출을 위해 당업계에 공지된 기타 이미징 작용제에 접합된 동족 결합 분자 (예를 들어, 항체)를 사용하여 생체내에서 검출 또는 추적될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yu 등 (2012) Theranostics 2:3] 참조).
특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포 또는 CAR 분자는 독성을 관리하거나 CAR 활성의 크기를 조정하기 위해 CAR의 활성을 조절하는 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 수용체 (예를 들어, 항-NKp46 결합 도메인 및 항-NKG2A 결합 도메인) 내에 2개의 별개의 항원-인식 도메인을 통합하는 이중특이성 (또는 탄뎀) CAR이 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 탄뎀 CAR을 발현하는 세포는 항원 중 어느 하나를 발현하는 표적 세포를 인식한다. 특정 구현예에서, 유도성-카스파제-9 (iCASP9), 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK), 또는 절단된 표면 수용체 (예를 들어, tEGFR)와 같은 자살 유전자 형태의 분자 안전 스위치가 사용될 수 있다. 자살 유전자는 무독성 전구약물 또는 항체의 투여 시 이 분자를 발현하는 세포의 선택적 파괴를 허용하는 분자를 암호화한다 (문헌 [Jones 등 (2014) Front. Pharmacol., 5: 254; Sun 등 (2018) J. Immunol. Res.]). 예를 들어, iCASP9 시스템은 카스파제 9 및 약물에 민감한 FK-변형된 결합 단백질의 융합을 기반으로 한다. 합성 분자 AP1903에 노출되면, 융합 단백질은 이합체화되어 융합 단백질을 발현하는 세포의 빠른 세포자연사를 유도한다. 특정 구현예에서, 억제성 CAR (iCAR)의 사용은 활성화 CAR을 통해 유도된 사이토카인 분비, 세포독성, 및/또는 증식을 선택적으로 제한할 수 있고 항-NK CAR-매개된 파괴로부터 건강한 조직을 보호하기 위해 이용될 수 있다 (문헌 [Fedorov 등 (2013) Sci. Transl. Med., 5: 215ra172].
특정 구현예에서, 대상체에게 투여된 CAR 발현 세포는 투여 후 원하는 시간에 CAR 발현 세포를 고갈시킴으로써 제어될 수 있다. 적어도 하나의 태그 및/또는 형질도입 마커를 포함하는 CAR은 태그 또는 형질도입 마커에 결합하는 각각의 동족 결합 분자를 사용하여 고갈될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 태그 또는 형질도입 마커 (예를 들어, 항체)에 특이적인 동족 결합 분자를 사용함으로써 또는 태그 또는 형질도입 마커에 대한 특이성을 갖는 CAR을 발현하는 두 번째 변형된 세포를 사용함으로써 항-NK CAR 변형된 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 동족 결합 분자는 태그 또는 형질도입 마커에 특이적인 고갈제를 포함한다. 예를 들어, tEFGR이 형질도입 마커로서 사용되는 경우, 세포-독성 시약 (예컨대 독소 또는 방사성금속)에 융합되거나 접합된 항-tEFGR 결합 도메인 (예를 들어, 항체, scFv)이 사용될 수 있거나, 항-tEFGR /항-CD3 이중특이성 scFv, 또는 항-tEFGR CAR T 세포가 사용될 수 있다.
특정 구현예는 CAR의 활성을 켜거나, 유도하거나, 증가시키는 데 사용될 수 있는 요소를 제공한다. CAR 발현의 약리학적 유도를 허용하는 시스템이 개발되었다. 특정 구현예에서, 상기 시스템은 각각이 세포외 이합체화 도메인을 함유하는 별도의 항원-표적화 및 신호 형질도입 폴리펩타이드를 함유하는 이분 수용체 시스템을 포함할 수 있다. T 세포 활성화는 항원 의존적이지만 이합체화 약물인 라파마이신이 존재하는 경우에만 달성될 수 있다 (문헌 [Leung 등 (2019) JCI Insight 4(11): e124430]).
CAR T 세포 활성의 조절은 문헌 [Brandt 등 (2020) Frontiers in Immunology, 11: 326]에서 검토되었다.
(vi) CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포. 본 개시내용은 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "유전적으로 변형된" 또는 "유전적으로 조작된"은 DNA 또는 RNA 형태의 여분의 유전 물질을 세포의 전체 유전 물질에 첨가하는 것을 지칭한다. 용어 "유전적으로 변형된 세포" 및 "변형된 세포"는 상호 교환적으로 사용된다. 특정 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포는 면역 이펙터 세포를 포함한다. "면역 이펙터 세포"는 하나 이상의 이펙터 기능 (예를 들어, 세포독성 세포 살해 활성, 사이토카인의 분비, 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성 (CDC)의 유도)을 갖는 면역 체계의 임의의 세포를 포함한다. 면역 이펙터 세포는 면역 세포의 하위유형이다.
본 개시내용의 세포는 자가/자가유전자 ("자기") 또는 비-자가 ("비-자기" 예를 들어, 동종이형, 동계 또는 이종)일 수 있다. "자가"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다. "동종이형"은 비교가 되는 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다. "동계"는 비교가 되는 세포와 유전적으로 동일한, 상이한 대상체의 세포를 지칭한다. "이종"은 비교가 되는 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 자가 또는 동종이형이다.
특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 림프구를 포함한다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구/대식세포, 및 HSPC를 포함한다.
대부분의 T 세포는 2개의 개별 펩타이드 사슬 (α- 및 β-TCR 사슬)로 구성된 T-세포 수용체 (TCR)를 갖는다. γδ T 세포는 1개의 γ-사슬과 1개의 δ-사슬로 이루어진 별개의 T 세포 수용체 (TCR)를 소유하는 T 세포의 작은 서브세트를 나타낸다.
CD3은 모든 성숙한 T 세포에서 발현된다. T 세포는 세포독성 T 세포 (CD8+ T 세포, 또한 CTL이라고도 함) 및 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포)로 추가로 분류될 수 있다.
세포독성 T 세포는 바이러스에 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부반응과 관련이 있다. 이러한 세포들은 신체의 거의 모든 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I과 관련된 항원에 결합하여 그들의 표적을 인식한다.
중추 기억 T 세포 (TCM)는 CD62L 또는 CCR7 및 CD45RO를 발현하고 나이브 세포와 비교하여 CD45RA를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험 CTL을 지칭한다.
이펙터 기억 T 세포 (TEM)는 중추 기억 세포와 비교하여 CD62L을 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖고 나이브 세포와 비교하여 CD45RA 를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험 T-세포를 지칭한다. 특정 구현예에서, 이펙터 기억 T 세포는 나이브 세포 또는 중추 기억 세포과 비교하여 CD62L 및 CCR7의 발현에 대해 음성이고, CD28 및 CD45RA의 가변적 발현을 갖는다. 이펙터 T 세포는 기억 또는 나이브 T 세포와 비교하여 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다.
헬퍼 T 세포는 다른 기능들 중에서 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화 및 B 세포의 성숙 촉진과 같이 다른 면역 세포를 돕는다. 헬퍼 T 세포는 이들이 항원 제시 세포 (APC)의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원이 제시될 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 이들은 빠르게 분열하여 활성 면역 반응을 조절하거나 보조하는 사이토카인을 분비한다.
자연 살해 T (NKT) 세포는 αβ T-세포 수용체를 공동-발현하는 T 세포의 서브세트이지만, NK1.1 (CD161), CD16, 및/또는 CD56와 같은 자연 살해 세포와 전형적으로 관련된 다양한 분자 마커 또한 발현한다.
자연 살해 세포 (K 세포 및 살해 세포라고도 함)는 CD8, CD16 및 CD56을 발현하지만 CD3을 발현하지 않는다. NK 세포는 또한 종양 및 바이러스에 감염된 세포에 대한 NK 세포 세포독성 기능을 조절하는, NKp46와 같은 활성화 수용체 및 NKG2A와 같은 억제성 수용체를 발현한다.
대식세포 (및 이들의 전구체, 단핵구)는 세포사멸 세포, 병원체 및 기타 비-자기-성분을 삼키는 신체의 모든 조직에 상주한다. 단핵구/대식세포는 CD11b, F4/80, CD68, CD11c, IL-4Rα, 및/또는 CD163을 발현한다.
미성숙 수지상 세포 (즉, 예비-활성화)는 항원 및 기타 비-자기 성분을 주변으로 삼킨 다음 활성화된 형태로 림프 조직의 T 세포 영역으로 이동하며, 여기서 T 세포의 항원 제시를 제공한다. 수지상 세포는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD21, CD35, CD39, CD40, CD86, CD101, CD148, CD209, 및 DEC-205를 발현한다.
조혈 줄기 세포 (HSC)는 자기-재생 및 모든 다른 조혈 세포 유형으로의 분화가 가능한 미분화된 조혈 세포를 지칭한다. HSC는 CD34+이다.
조혈 전구 세포 (HPC)는 HSC로부터 유래하며, 성숙한 세포 유형으로 추가로 분화할 수 있다. HPC는 자기-재생하거나 (i) 궁극적으로 단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판 또는 수지상 세포를 생성하는 골수 전구 세포; 또는 (ii) 궁극적으로 T 세포, B 세포, 및 NK 세포를 생성하는 림프 전구 세포로 분화할 수 있다. HPC는 CD24lo Lin- CD117+이다.
HSPC는 HSC 및 HPC를 갖는 세포 집단을 지칭한다. HSPC 세포 집단은 CD34, CD43, CD45RO, CD45RA, CD59, CD90, CD109, CD117, CD133, CD166, HLA DR, 또는 이들의 조합에 대해 양성일 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예는 CAR 변형된 세포에 의해 표적 NK 세포 상의 NKp46 및 NKG2A의 동시 표적화를 제공한다. 동시 표적화는 NK 세포 상의 표적 항원 중 어느 하나의 하향조절로 인한 종양 탈출을 최소화할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 항-NKp46 CAR 및 항-NKG2A CAR을 공동-발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 세포 집단은 항-NKp46 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있고 제2 세포 집단은 항-NKG2A CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
특정 구현예에서, 항-활성화 NK 수용체 CAR 및 항-억제성 NK 수용체 CAR 둘 모두를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포에 의한 표적 NK 세포 상의 활성화 NK 수용체 및 억제성 NK 수용체의 동시 표적화는 활성화된 표적 NK 세포에 의한 CAR 변형된 세포의 살해를 완화시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 항- 활성화 NK 수용체 CAR 및 항-억제성 NK 수용체 CAR을 공동-발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 항-활성화 NK 수용체 CAR 및 억제성 NK 수용체 결합 도메인을 공동-발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 세포 집단은 항-활성화 NK 수용체 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있고 제2 세포 집단은 항-억제성 NK 수용체 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 세포 집단은 항-활성화 NK 수용체 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있고 제2 세포 집단은 억제성 NK 수용체 결합 도메인을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, HLA 클래스 I 분자 (예를 들어, HLA-A, HLA-B, HLA-C)의 발현이 결여되도록 조작된 비-자가 CAR T 세포는 또한 i) 항-활성화 NK 수용체 CAR 및 항-억제성 NK 수용체 CAR, 또는 ii) 항-활성화 NK 수용체 CAR 및 억제성 NK 수용체 결합 도메인을 공동-발현하도록 조작되어 비-자가 CAR T 세포의 NK-매개된 살해를 감소시켜 기성품 CAR T 세포의 사용을 허용한다. 특정 구현예에서, HLA 클래스 I 분자의 발현이 결여되도록 조작된 비-자가 CAR T 세포는 B2M 유전자의 두 카피 모두에서 파괴를 갖는다 (문헌 [Gornalusse 등 (2017) Nature biotechnology 35(8): 765]). 특정 구현예에서, 항-활성화 NK 수용체 CAR은 항-NKp46 CAR이다. 특정 구현예에서, 항-억제성 NK 수용체 CAR은 항-NKG2A CAR이다. 특정 구현예에서, 억제성 NK 수용체 결합 도메인은 NKG2A 결합 도메인이다. 특정 구현예에서, NKG2A 결합 도메인은 HLA-E이다. 특정 구현예에서, NKG2A 결합 도메인은 인공 HLA-E 모방체이다.
기성품 CAR T 세포는 수용자에서 CAR T 세포의 거부반응을 감소시키는 데 유용할 것이다. 면역 거부반응은 이식된 세포, 조직, 또는 장기가 수용자 (숙주)의 신체에 받아들여지지 않을 때 발생한다. 면역 거부반응은 선천 면역 체계의 NK 세포와 함께 후천 면역 체계의 T 세포 및 B 세포에 의해 매개된다. 예를 들어, CAR의 일부는 숙주의 T 세포 및 NK 세포에 의해 이물질인 것으로 인식되어 파괴 대상이 될 수 있다. 이식체의 면역 거부반응은 초급성 거부반응, 급성 거부반응, 및 만성 거부반응을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 초급성 거부반응은 이식 직후에 발생한다. 특정 구현예에서, 초급성 거부반응은 공여자 조직에 대해 반응성인 기존의 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 초급성 거부반응은 혈액 응고에 이은 심각한 전신 염증 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 급성 거부반응은 HLA 항원 불일치로 인해 이식 후 1주 이내에 발생한다. 특정 구현예에서, 만성 거부반응은 이식체의 장기 거부반응을 초래하는 불일치된 부 조직적합성 복합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 급성 거부반응에 대한 치료는 재이식 또는 화학요법 면역 억제제 (예를 들어, 코르티코스테로이드 및 칼시뉴린 억제제)의 투여를 포함한다. 그러나, 면역 억제제는 면역 저하 합병증을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 수용자에 의한 CAR 변형된 세포의 거부반응은 CAR 요법에 대한 치료학적 반응을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 수용자에 의한 CAR 변형된 세포의 거부반응은 수용자의 세포독성 T 세포 및/또는 NK 세포에 의한 CAR 변형된 세포의 파괴를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-억제성 NK 수용체 CAR (예를 들어, 항-NKG2A CAR) 발현 세포의 투여는 항- 억제성 NK 수용체 CAR 발현 세포의 투여 전 수용자에 의한 CAR 변형된 세포의 거부반응과 비교하여 수용자에 의한 CAR 변형된 세포의 거부반응을 감소시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 항-NKp46 CAR은 서열번호: 3-98, 260-265의 CDR을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 99-112의 VH 및 VL을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 113-119를 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 266을 포함하는 중쇄의 항원 결합 단편; 및/또는 서열번호: 267을 포함하는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-NKp46 CAR은 서열번호: 190-203의 CDR을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 204 및 205의 VH 및 VL을 포함하는 NKp46 scFv; 및/또는 서열번호: 206을 포함하는 NKp46 scFv를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 127, 130, 133, 136, 142, 및 143을 포함하는 인공 HLA-E 모방체를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 242, 244, 및 246을 포함하는 인공 HLA-E 모방체를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 213, 214, 215, 216, 217, 218, 290, 291, 292, 293, 294, 및 295의 CDR; 서열번호: 219, 220, 221, 222, 및 223의 VH; 서열번호: 224, 225, 226, 227, 및 228의 중쇄의 항원 결합 단편; 및/또는 서열번호: 229의 경쇄의 항원 결합 단편을 포함한다.
(vii) 생체외 및 생체내에서 세포를 수집하고 변형시키는 방법. 본 개시내용은 CAR을 발현하도록 세포를 수집하고, 농축하고, 배양하고, 변형시키는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, T 세포는 혈액 또는 혈액-유래 샘플, 성분채집 또는 백혈구성분채집 생성물과 같은 샘플로부터 분리된다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 암 조직, 림프 조직, 비장 또는 기타 적절한 공급원을 포함한다.
HSPC의 공급원은 제대혈, 태반혈, 및 말초혈을 포함한다 (미국 특허 제5,004,681호; 제 7,399,633 호; 및 제 7,147,626 호; 문헌 [Craddock, 등, 1997, Blood 90(12):4779-4788; Jin, 등, 2008, Journal of Translational Medicine 6:39; Pelus, 2008, Curr . Opin . Hematol . 15(4):285-292; Papayannopoulou, 등, 1998, Blood 91(7):2231-2239; Tricot, 등, 2008, Haematologica 93(11):1739-1742; 및 Weaver 등, 2001, Bone Marrow Transplantation 27(2):S23-S29] 참조).
혈액 샘플의 수집, 항-응고 및 프로세싱 등에 관한 방법은 예를 들어 문헌 [Alsever, 등, 1941, N.Y . St. J. Med . 41:126; De Gowin, 등, 1940, J. Am. Med . Ass. 114:850; Smith, 등, 1959, J. Thorac . Cardiovasc . Surg . 38:573; Rous and Turner, 1916, J. Exp . Med . 23:219; 및 Hum, 1968, Storage of Blood, Academic Press, New York, pp. 26-160]에서 발견될 수 있다.
특정 구현예에서,　수집된 세포는 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리, 및/또는 인큐베이션되어, 예를 들어 원하지 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 농축시키고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거한다. 분리는 하나 이상의 다양한 세포 제조 및 분리 단계를 포함할 수 있으며, 여기에는 크기, 밀도, 특정 시약에 대한 민감성 또는 내성, 및/또는 항체 또는 다른 결합 파트너에 대한 친화성, 예를 들어 면역 친화성과 같은 하나 이상의 특성에 기초한 분리가 포함된다.
특정 구현예에서, 제공된 방법에 의해 샘플로부터 농축, 분리 및/또는 선택된 하나 이상의　세포 집단은 표면 마커와 같은 하나 이상의 특정 마커의 높은 수준 (마커 hi)을 발현하거나 (마커+)에 대해 양성인 세포이거나, 또는 하나 이상의 마커의 상대적으로 낮은 수준 (마커 lo)을 발현하거나 (마커-)에 대해 음성인 세포이다. 특정 구현예에서,　세포 집단　(예컨대 T 세포)은 본원의 다른 곳에서 기술된 높은 표면 수준의 세포 마커를 발현하거나 양성인 세포를 농축시킨다.
특정 구현예에서, T 세포는 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 적혈구를 용해하고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, 및CD45RO를 발현하는 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 분리된다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성 선택 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 분류 및/또는 선택은 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자성 면역부착 또는 유세포 분석을 통해 발생한다. 예를 들어, 음성 선택으로 CD4+ 세포를 농축시키기 위해, 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함하는 모노클로날 항체 칵테일이 사용될 수 있다. 유세포 분석 및 세포 분류는 또한 본 개시내용에서 사용하기 위한 관심 세포 집단을 분리시는 데 사용될 수 있다.
분리 및/또는 농축 후, 세포를 확장하여 세포 수를 증가시킬 수 있다. 특정 구현예에서, T 세포는 예를 들어 US 6,352,694호; US 6,534,055 호; US 6,905,680 호; US 6,692,964 호; US 5,858,358 호; US 6,887,466 호; US 6,905,681 호; US 7,144,575 호; US 7,067,318 호; US 7,172,869 호; US 7,232,566 호; US 7,175,843 호; US 5,883,223 호; US 6,905,874 호; US 6,797,514 호; US 6,867,041 호; 및 US 2006/0121005호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 CAR을 발현하기 위하여 유전적 변형 전 또는 후에 활성화되고 확장될 수 있다.
일반적으로, T 세포는 CD3 TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장된다. 특정 구현예에서, PBMC 또는 분리된 T 세포는 적절한 사이토카인이 있는 배양 배지에서 일반적으로 비드 또는 다른 표면에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체와 같은 자극제 및 공동자극제와 접촉한다 (문헌 [Berg 등, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen 등, J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland 등, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999] 참조). 특정 구현예에서, 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체는 "대리 (surrogate)" 항원 제시 세포 (APC)로서 작용한다. 특정 구현예에서, T 세포는 US 6,040,177호; US 5,827,642 호; 및 WO 2012/129514호에 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 피더 세포 및 적합학 항체 및 사이토카인으로 증식하도록 활성화되고 자극될 수 있다.
특정 구현예에서, 인공 APC (aAPC)는 K562, U937, 721.221, T2, 및 C1R 세포를 조작하여 다양한 공동-자극 분자 및 사이토카인의 안정적인 발현 및 분비를 지시함으로써 만들어질 수 있다. 특정 구현예에서, K32 또는U32 aAPC는 aAPC 세포 표면의 하나 이상의 항체-기반 자극 분자의 디스플레이를 지시하는 데 사용된다. aAPC에서 다양한 유전자 조합의 발현은 인간 T 세포 활성화 요구사항을 정확하게 결정할 수 있게 하여, aAPC가 특정 성장 요구사항 및 고유한 기능을 갖는 T 세포 서브세트의 최적 증식에 맞춰질 수 있도록 한다. aAPC는 자연 APC를 사용하는 것과 달리 외인성 사이토카인을 첨가할 필요 없이 기능성 인간 T 세포의 생체외 성장 및 장기간 확장을 지원한다. T 세포 집단은 CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L), 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하는 다양한 공동자극 분자를 발현하는 aAPC에 의해 확장될 수 있다. 마지막으로, aAPC는 유전적으로 변형된 T 세포를 확장하고 T 세포에서 CD28 발현을 유지하기 위한 효율적인 플랫폼을 제공한다. aAPC는 WO 03/057171호 및 US 2003/0147869호에 기술되어 있다.
특정 구현예에서, HSPC는 예를 들어, US 7,399,633호; US 5,004,681 호; US 2010/0183564 호; WO2006/047569 호; WO2007/095594 호; WO 2011/127470 호; 및 WO 2011/127472 호; 문헌 [Vamum-Finney, 등, 1993, Blood 101:1784-1789; Delaney, 등, 2005, Blood 106:2693-2699; Ohishi, 등, 2002, J. Clin . Invest. 110:1165-1174; Delaney, 등, 2010, Nature Med . 16(2): 232-236; 및 Chapter 2 of Regenerative Medicine, Department of Health and Human Services, August 2006], 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술된 방법에 따라 분리 및/또는 확장될 수 있다. 본원에 기술된 다른 세포 유형의 수집 및 프로세싱은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 구현예에서, 분리, 인큐베이션, 확장, 및/또는 조작 단계는 무균 또는 수용된 환경에서 및/또는 단계가 수행되는 장치에 부착된 컴퓨터에 의해 제어되는 것과 같은 자동화된 방식으로 수행된다.
(viii) CAR의 생성. 본 개시내용에 따른 CAR은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된다. CAR의 여러 영역을 암호화하는 핵산 서열은 분자 클로닝의 표준 기술 (게놈 라이브러리 스크리닝, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 프라이머-보조 결찰, 효모 및 박테리아의 scFv 라이브러리, 부위-지정 돌연변이 유발 등)에 의한 완전한 코딩 서열로 준비되고 조립될 수 있다. 생성된 코딩 영역은 발현 벡터에 삽입되어 적합한 발현 세포주를 형질전환하는 데 사용될 수 있다.
용어 "유전자"는 본원에 기술된 바와 같이 항-NK CAR, 항-NK CAR의 성분, 또는 항-NK CAR와 공동 발현된 분자를 암호화하는 핵산 서열 (폴리뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열과 상호교환적으로 사용됨)을 지칭한다. 이 정의는 다양한 서열 다형성, 돌연변이 및/또는 서열 변이체를 포함하며, 이러한 변경은 암호화된 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 용어 "유전자"는 코딩 서열뿐만 아니라 프로모터, 인핸서, 및 종결 영역과 같은 조절 영역을 포함할 수 있다. 상기 용어는 대체 스플라이스 부위로부터 생성된 변이체와 함께 mRNA 전사체로부터 스플라이싱된 모든 인트론 및 다른 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 분자를 암호화하는 유전자 서열은 분자의 발현을 지시하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이러한 핵산 서열은 RNA로 전사되는 DNA 가닥 서열 또는 단백질로 번역되는 RNA 서열일 수 있다. 핵산 서열은 전장 핵산 서열뿐만 아니라 전장 단백질로부터 유래된 비-전장 서열 모두를 포함할 수 있다. 서열은 또한 특정 세포 유형에서 코돈 선호도를 제공하기 위해 도입될 수 있는 서열 또는 천연 서열의 축퇴 코돈 (degenerate codon)을 포함할 수 있다.
"암호화"는 정의된 아미노산 서열과 같은 다른 거대분자의 합성을 위한 주형 역할을 하는 상보적 DNA (cDNA) 또는 메신저 RNA (mRNA)와 같은 유전자 내 뉴클레오타이드의 특정 서열의 특성을 지칭한다. 따라서, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 유전자는 단백질을 코딩한다. "단백질을 암호화하는 유전자 서열"은, 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열 또는 실질적으로 유사한 형태 및 기능의 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
예를 들어 CAR의 일부를 암호화하는 오픈 판독 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 얻을 수 있거나, 합성될 수 있거나 (예를 들어, PCR을 통해) 또는 이들의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 따라 인트론이 mRNA를 안정화하거나 세포-특이적 발현을 제공할 수 있으므로 cDNA, 또는 이들의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-코딩 영역을 사용하는 것이 더 유리할 수 있다.
발현된 CAR의 하나 이상의 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 유전자 서열은 서로 또는 관련 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 여기에는 조절 서열과 외인성 핵산 서열 사이에 기능적 연결이 있어 외인성 핵산 서열을 발현시킬 수 있다. 또 다른 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이고, 필요하거나 도움이 되는 경우 코딩 영역을 동일한 판독 프레임으로 연결한다.
본 개시내용에 이용된 예시적인 핵산 작제물 (폴리뉴클레오타이드)에서, 프로모터는 CAR을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되며, 즉 이들은 CAR을 암호화하는 DNA로부터 mRNA의 전사를 촉진하도록 위치된다. 프로모터는 게놈 기원이거나 합성적으로 생성될 수 있다. 프로모터는 인핸서와 관련되거나 관련되지 않을 수 있으며, 여기서 인핸서는 자연적으로 특정 프로모터와 관련되거나 다른 프로모터와 관련될 수 있다. 세포에서 사용하기 위한 다양한 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, CD4 프로모터). 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있으며, 여기서 유도는 예를 들어 특정 세포 유형 또는 특성 발달 단계와 관련된다. 대안적으로, 다수의 잘 알려진 바이러스 프로모터가 또한 적합하다. 관심 프로모터는 다음을 포함한다: 바이러스 유인원 바이러스 40 (SV40) (예를 들어, 초기 또는 후기) 프로모터; 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터; 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터; 단순 포진 바이러스 (HSV) (티미딘 키나제) 프로모터; 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH) 프로모터; 열 충격 단백질 70 kDa (HSP70) 프로모터; 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터; 또는 포스포글리세레이트 키나아제 -1 (PGK) 프로모터. 특정 구현예는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환 (MND) 프로모터를 이용할 수 있다 (문헌 [Challita 등 (1995) J.　Virol. 69:748-755]). 특정 구현예에서, MND 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서와 함께 변형된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV) 긴 말단 반복 (LTR)의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터이다. 특정 구현예에서, MND 프로모터는 서열번호: 175를 포함한다.
CAR의 발현을 위해, 구성적 또는 유도성 발현을 허용하는 외인성 전사 개시 영역이 사용될 수 있으며, 여기서 발현은 표적 숙주, 원하는 발현 수준, 표적 숙주의 성질 등에 따라 제어될 수 있다.
마찬가지로, CAR을 표면 막으로 향하게 하는 신호 서열은 CAR의 N-말단 성분의 내인성 신호 서열일 수 있다. 임의적으로, 일부 경우에서 이 서열을 다른 신호 서열로 교환하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 선택된 신호 서열은 CAR이 CAR 발현 세포의 표면에 제시되도록 CAR 발현 세포의 분비 경로와 호환되어야 한다.
유사하게, 종결 영역은 CAR의 C-말단 성분을 암호화하는 핵산 서열의 자연 발생 또는 내인성 전사 종결 영역에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 종결 영역은 다른 공급원에서 유래될 수 있다. 대부분의 경우, 종결 영역의 공급원은 일반적으로 재조합 단백질의 발현에 중요한 것으로 간주되지 않으며 다양한 종결 영역이 발현에 악영향을 미치지 않고 이용될 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 일부 경우에, CAR에서 결합 도메인이 말단에 있는 몇 개의 아미노산은 예를 들어 일반적으로 10개 이하, 보다 일반적으로는 5개 이하의 잔기가 결실될 수 있다. 또한, 일반적으로 10개 이하, 보다 일반적으로는 5개 이하의 잔기의 경계에 소수의 아미노산을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 아미노산의 결실 또는 삽입은 편리한 제한 부위, 조작의 용이성, 발현 수준의 개선 등을 제공하는 구성의 필요성의 결과일 수 있다. 또한, 유사한 이유로 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것이 발생할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 자기-절단 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 여기서 자기-절단 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 형질도입 마커 (예를 들어, BFP)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치한다. 예시적인 자기-절단 폴리펩타이드는 돼지 테스코바이러스-1 (P2A), 토세아 아사인아 (Thosea asigna) 바이러스 (T2A), 말 비염 A 바이러스 (E2A), 구제역 바이러스 (F2A), 포티바이러스 2A, 카디오바이러스 2A, 또는 이들의 변이체로부터의 2A 펩타이드를 포함한다. 2A 펩타이드의 추가의 예시적인 핵산 및 아미노산 서열은 예를 들어 문헌 [Kim 등 (PLOS One 6:e18556 (2011)) 및 Donnelly 등 (J. Gen. Virol. 82:1027-1041 (2001))]에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 예시적인 2A 펩타이드 서열은 서열번호: 176-185, 및 240을 포함한다. 특정 구현예에서, 예시적인 2A 펩타이드 서열은 서열번호: 241에 의해 암호화된다.
CAR을 암호하하는 원하는 유전자는 형질감염, 전기천공, 미세주입, 리포펙션, 인산칼슘 매개 형질감염, 유전자 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전달, 마이크로셀-매개 유전자 전달, 스테로플라스트 융합, 생체내 나노입자-매개 전달, 포유류 인공 염색체 (문헌 [Vos, 1998, Curr . Op. Genet. Dev . 8:351-359]), 리포좀 (문헌 [Tarahovsky and Ivanitsky, 1998, Biochemistry (Mosc) 63:607-618]), 리보자임 (문헌 [Branch and Klotman, 1998, Exp . Nephrol . 6:78-83]), 트리플렉스 (triplex) DNA (문헌 [Chan and Glazer, 1997, J. Mol . Med . 75:267-282]) 등을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 외래 유전자를 세포에 도입하기 위한 수많은 기술이 당업계에 공지되어 있으며 (예를 들어, 문헌 [Loeffler and Behr, 1993, Meth . Enzymol . 217:599-618; Cohen, 등, 1993, Meth . Enzymol . 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac . Ther . 29:69-92] 참조), 수용자 세포의 필요한 발달 및 생리학적 기능이 과도하게 방해받지 않는 한 사용될 수 있다. 이 기술은 유전자가 세포에 의해 발현되고 특정 경우에 바람직하게는 유전가능하고 그의 세포 자손에서 발현되도록 유전자의 세포로의 안정한 전달을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, CAR을 암호화하는 유전자는 벡터의 세포에 도입될 수 있다. "벡터"는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 또는 파지일 수 있다. "발현 벡터"는 벡터가 적절한 환경에 존재할 때 벡터에 의해 운반되는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현을 지시할 수 있는 벡터이다.
바이러스로부터 유래된 벡터는 유전자 전달에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 및 알파바이러스를 포함한다. 문헌 [Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503, Rosenfeld, 등, 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld, 등, 1992, Cell 68:143-155; Mastrangeli, 등, 1993, J. Clin . Invest. 91:225-234; Walsh, 등, 1993, Proc . Soc . Exp . Bioi . Med . 204:289-300; 및 Lundstrom, 1999, J. Recept. Signal Transduct. Res. 19: 673-686] 참조.
특정 구현예에서, 사용될 수 있는 벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함한다 (문헌 [Miller, 등, 1993, Meth . Enzymol . 217:581-599] 참조). 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 특정 구현예에서, 전달은 세포의 게놈으로의 핵산의 통합을 초래한다.
"레트로바이러스"는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. "감마레트로바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 지칭한다. 예시적인 감마레트로바이러스는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다.
특정 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 통합에 필요한 모든 시스-작용 서열, 즉 (a) 벡터의 각 말단에 있는 긴 말단 반복 (LTR), 또는 이의 일부; (b) 음성 및 양성 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머 결합 부위; 및 (c) 게놈 RNA를 비리온으로 통합하는데 필요한 패키징 신호를 포함한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 더 자세한 내용은 문헌 [Boesen, 등, 1994, Biotherapy 6:291-302; Clowes, 등, 1994, J. Clin . Invest. 93:644-651; Kiem, 등, 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; 및 Grossman and Wilson, 1993, Curr . Opin . in Genetics and Devel . 3:110-114]에서 찾을 수 있다. 본원에서 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종 핵산 등과 같은 요소를 참조하는 경우, 이러한 요소의 서열은 레트로바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재하고 DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재한다는 것을 이해해야 한다.
특정 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 주로 렌티바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. "렌티바이러스"는 분열 및 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 여러 예는 HIV (인간 면역결핍 바이러스: HIV 유형 1, 및 HIV t 유형 2 포함); 말 전염성 빈혈 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함한다. 다양한 렌티바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있으며 (문헌 [Naldini 등 (1996) Science 272(5259): 263-267; Naldini 등 (1996) Proceedings of the National Academy of Sciences 93(21): 11382-11388; Zufferey 등 (1997) Nature biotechnology 15(9): 871-875; Dull 등 (1998) Journal of virology 72(11): 8463-8471; US 6,013,516; 및 US 5,994,136]), 이들 중 다수는 바이러스 벡터 또는 전달 플라스미드를 생성하도록 개조될 수 있다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 NKp46 또는 NKG2A, CD8α 힌지, CD8α 막횡단 도메인, 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인, 및 세포내 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 유전자에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 2A 절단가능한 펩타이드에 의해 CAR을 암호화하는 유전자에 연결된 BFP 형질도입 마커를 암호화하는 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 3-98, 260-265의 CDR을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 99-112의 VH 및 VL을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 113-119를 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 266을 포함하는 중쇄의 항원 결합 단편; 및/또는 서열번호: 267을 포함하는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 190, 193, 196, 198, 201, 및 202의 CDR을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 204 및 205의 VH 및 VL을 포함하는 NKp46 scFv; 및/또는 서열번호: 206을 포함하는 NKp46 scFv를 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 및 203의 CDR을 포함하는 NKp46 scFv를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 127, 130, 133, 136, 142, 및 143을 포함하는 인공 HLA-E 모방체를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 242, 244, 및 246을 포함하는 인공 HLA-E 모방체를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 213, 214, 215, 216, 217, 218, 290, 291, 292, 293, 294, 및 295의 CDR; 서열번호: 219, 220, 221, 222, 및 223의 VH; 서열번호: 224, 225, 226, 227, 및 228의 중쇄의 항원 결합 단편; 및/또는 서열번호: 229의 경쇄의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 238에 기재되고/되거나 및/또는 서열번호: 239에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD8 신호 펩타이드; 2) 서열번호: 206에 기재되고/되거나 서열번호: 248에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-NKp46 scFv; 3) 서열번호: 234에 기재되고/되거나 서열번호: 235에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD8 힌지 및 CD8 막횡단 도메인; 4) 서열번호: 230에 기재되고/되거나 서열번호: 231에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 5) 서열번호: 240에 기재되고/되거나 서열번호: 241에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 2A 펩타이드; 및 6) 서열번호: 236에 기재되고/되거나 서열번호: 237에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 BFP. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 249에 기재된 항-NKp46 CAR의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 250에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-NKp46 CAR을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 130에 기재되고/되거나 서열번호: 208에 의해 암호화된 B2M 신호 펩타이드; 2) VMAPRTLFL (서열번호: 127)의, 및/또는 서열번호: 207에 의해 암호화된 HLA-G 신호 펩타이드; 3) 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 의해 암호화된 (GGGGS)3 가요성 링커; 4) 서열번호: 133에 기재되고/되거나 서열번호: 209에 의해 암호화된 B2M 성숙 단백질; 5) 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 의해 암호화된 (GGGGS)4 가요성 링커; 및 6) 서열번호: 136에 기재되고/되거나 서열번호: 210에 의해 암호화된 HLA-E 01:03 중쇄; 7) 서열번호: 230에 기재되고/되거나 서열번호: 231에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 8) 서열번호: 240에 기재되고/되거나 서열번호: 241에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 2A 펩타이드; 및 9) 서열번호: 236에 기재되고/되거나 서열번호: 237에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 BFP. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 251에 기재된 항-NKG2A (HLA-E) CAR의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 252에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-NKG2A (HLA-E) CAR을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 130에 기재되고/되거나 서열번호: 208에 의해 암호화된 B2M 신호 펩타이드; 2) VMAPRTLFL (서열번호: 127)의, 및/또는 서열번호: 207에 의해 암호화된 HLA-G 신호 펩타이드; 3) 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 의해 암호화된 (GGGGS)3 가요성 링커; 4) 서열번호: 133에 기재되고/되거나 서열번호: 209에 의해 암호화된 B2M 성숙 단백질; 5) 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 의해 암호화된 (GGGGS)4 가요성 링커; 및 6) 서열번호: 136에 기재되고/되거나 서열번호: 210에 의해 암호화된 HLA-E 01:03 중쇄; 7) 서열번호: 234에 기재되고/되거나 서열번호: 235에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD8 힌지 및 CD8 막횡단 도메인; 8) 서열번호: 230에 기재되고/되거나 서열번호: 231에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD3ζ 자극 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 9) 서열번호: 240에 기재되고/되거나 서열번호: 241에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 2A 펩타이드; 및 10) 서열번호: 236에 기재되고/되거나 서열번호: 237에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 BFP. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 253에 기재된 항-NKG2A (HLA-E) CAR의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 254에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-NKG2A (HLA-E) CAR을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 238에 기재되고/되거나 서열번호: 239에 의해 암호화된 CD8 신호 펩타이드; 2) VMAPRTLFL (서열번호: 127)의, 및/또는 서열번호: 207에 의해 암호화된 HLA-G 신호 펩타이드; 3) 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 의해 암호화된 (GGGGS)3 가요성 링커; 4) 서열번호: 133에 기재되고/되거나 서열번호: 209에 의해 암호화된 B2M 성숙 단백질; 5) 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 의해 암호화된 (GGGGS)4 가요성 링커; 및 6) 서열번호: 136에 기재되고/되거나 서열번호: 210에 의해 암호화된 HLA-E 01:03 중쇄; 7) 서열번호: 230에 기재되고/되거나 서열번호: 231에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD3ζ 자극 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 8) 서열번호: 240에 기재되고/되거나 서열번호: 241에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 2A 펩타이드; 및 9) 서열번호: 236에 기재되고/되거나 서열번호: 237에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 BFP. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 255에 기재된 항-NKG2A (HLA-E) CAR의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 256에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-NKG2A (HLA-E) CAR을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음을 포함한다: 1) 서열번호: 238에 기재되고/되거나 서열번호: 239에 의해 암호화된 CD8 신호 펩타이드; 2) 서열번호: 130에 기재되고/되거나 서열번호: 208에 의해 암호화된 B2M 신호 펩타이드; 3) VMAPRTLFL (서열번호: 127)의, 및/또는 서열번호: 207에 의해 암호화된 HLA-G 신호 펩타이드; 4) 서열번호: 142에 기재되고/되거나 서열번호: 211에 의해 암호화된 (GGGGS)3 가요성 링커; 5) 서열번호: 133에 기재되고/되거나 서열번호: 209에 의해 암호화된 B2M 성숙 단백질; 6) 서열번호: 143에 기재되고/되거나 서열번호: 212에 의해 암호화된 (GGGGS)4 가요성 링커; 및 7) 서열번호: 136에 기재되고/되거나 서열번호: 210에 의해 암호화된 HLA-E 01:03 중쇄; 8) 서열번호: 234에 기재되고/되거나 서열번호: 235에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD8 힌지 및 CD8 막횡단 도메인; 9) 서열번호: 230에 기재되고/되거나 서열번호: 231에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD3ζ 자극 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 10) 서열번호: 240에 기재되고/되거나 서열번호: 241에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 2A 펩타이드; 및 11) 서열번호: 236에 기재되고/되거나 서열번호: 237에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 BFP. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 257에 기재된 항-NKG2A (HLA-E) CAR의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 서열번호: 258에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-NKG2A (HLA-E) CAR을 포함한다.
특정 구현예에서, CAR을 발현하기 위한 세포의 형질도입은 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터를 패키징 세포로 형질감염시켜 CAR을 발현하도록 예정된 세포를 형질도입하는 데 사용되는 바이러스 입자를 제조하는 생산자 세포를 얻는 것을 포함한다. 패키징 세포주는 패키징 신호를 함유하지 않지만 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터의 요소와 함께 바이러스 입자의 올바른 패키징에 필요한 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소 (예를 들어, gag, pol 및 env)를 안정적으로 또는 일시적으로 발현한다. 패키징 세포를 제조하기 위해 임의의 적합한 세포주가 이용될 수 있다. 일반적으로 세포는 포유동물 세포이다. 감염성 바이러스 입자 및 바이러스 원액의 생성은 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Soneoka 등 (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, and Landau 등 (1992) J. Virol. 66:5110-5113]). 감염성 바이러스 입자는 종래의 기술을 사용하여 패키징 세포로부터 수집될 수 있다.
CAR을 암호화하는 핵산을 세포 내로 도입하기 위해 표적화된 유전 공학 접근법 또한 이용될 수 있다. CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))/Cas (CRISPR-관련 단백질) 뉴클레아제 시스템은 박테리아 시스템을 기반으로 하는 유전 공학에 사용되는 조작된 뉴클레아제 시스템이다. CRISPR-Cas 시스템 및 이의 구성 요소에 관한 정보는 예를 들어, US8697359호, US8771945호, US8795965호, US8865406호, US8871445호, US8889356, US8889418호, US8895308호, US8906616호, US8932814호, US8945839호, US8993233호 및 US8999641 호 및 이들과 관련된 출원; WO2014/018423호, WO2014/093595호, WO2014/093622호, WO2014/093635호, WO2014/093655호, WO2014/093661호, WO2014/093694호, WO2014/093701호, WO2014/093709호, WO2014/093712호, WO2014/093718호, WO2014/145599호, WO2014/204723호, WO2014/204724호, WO2014/204725호, WO2014/204726호, WO2014/204727호, WO2014/204728호, WO2014/204729호, WO2015/065964호, WO2015/089351호, WO2015/089354호, WO2015/089364호, WO2015/089419호, WO2015/089427호, WO2015/089462호, WO2015/089465호, WO2015/089473호 및 WO2015/089486호, WO2016205711호, WO2017/106657호, WO2017/127807호 및 이들과 관련된 출원에 기술되어 있다.
특정 구현예는 유전자 편집제 (editing agent)로서 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 이용한다. ZFN은 특정 위치에서 DNA를 결합하고 절단하도록 조작된 부위-특이적 뉴클레아제 부류이다. ZFN은 ZFN이 다양한 상이한 세포의 게놈 내의 고유한 서열을 표적화할 수 있도록 하는 DNA 서열의 특정 부위에서 이중 가닥 절단 (double stranded breaks, DSB)을 도입하는 데 사용된다. 본 개시내용의 교시 내에서 유용한 ZFN 및 ZFN에 관한 추가 정보는 예를 들어 US 6,534,261 호; US 6,607,882 호; US 6,746,838 호; US 6,794,136 호; US 6,824,978 호; 6,866,997 호; US 6,933,113 호; 6,979,539 호; US 7,013,219 호; US 7,030,215 호; US 7,220,719 호; US 7,241,573 호; US 7,241,574 호; US 7,585,849 호; US 7,595,376 호; US 6,903,185 호; US 6,479,626 호; US 2003/0232410 호 및 US 2009/0203140 호, 뿐만 아니라 문헌 [Gaj 등, Nat Methods, 2012, 9(8):805-7; Ramirez 등, Nucl Acids Res, 2012, 40(12):5560-8; Kim 등, Genome Res, 2012, 22(7): 1327-33; Urnov 등, Nature Reviews Genetics, 2010, 11 :636-646; Miller, 등 Nature biotechnology 25, 778-785 (2007); Bibikova, 등 Science 300, 764 (2003); Bibikova, 등 Genetics 161, 1169-1175 (2002); Wolfe, 등 Annual review of biophysics and biomolecular structure 29, 183-212 (2000); Kim, 등 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 1156-1160 (1996); 및 Miller, 등 The EMBO journal 4, 1609-1614 (1985)]을 참조한다.
특정 구현예는 유전자 편집제로서 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 사용할 수 있다. TALEN은 전사-활성화제-유사 이펙터 (TALE) DNA 결합 단백질 및 DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. TALEN은 DNA에서 이중 DSB를 유도하여 유전자와 게놈을 편집하는 데 사용되며, 이는 세포에서 복구 메커니즘을 유도한다. 일반적으로, 2개의 TALEN은 DSB를 이량체화하고 유도하기 위해 DNA 절단 도메인에 대한 표적 DNA 부위의 각 측면에 결합하고 그 옆에 위치해야 한다. TALEN에 대한 추가 정보는 예를 들어 US 8,440,431 호; US 8,440,432 호; US 8,450,471 호; US 8,586,363 호; 및 US 8,697,853 호; 뿐만 아니라 문헌 [Joung and Sander, Nat Rev Mol Cell Biol, 2013, 14(l):49-55; Beurdeley 등, Nat Commun, 2013, 4: 1762; Scharenberg 등, Curr Gene Ther, 2013, 13(4):291-303; Gaj 등, Nat Methods, 2012, 9(8):805-7; Miller, 등 Nature biotechnology 29, 143-148 (2011); Christian, 등 Genetics 186, 757-761 (2010); Boch, 등 Science 326, 1509-1512 (2009); 및 Moscou, & Bogdanove, Science 326, 1501 (2009)]을 참조한다.
특정 구현예는 유전자 편집제로서 MegaTAL을 이용할 수 있다. MegaTAL은 TALE이 메가뉴클레아제의 DNA 절단 도메인과 융합된 sc 희귀-절단 뉴클레아제 구조를 갖는다. 귀소 엔도뉴클레아제라고도 알려진 메가뉴클레아제는 동일한 도메인에서 DNA 인식 및 뉴클레아제 기능을 모두 갖는 단일 펩타이드 사슬이다. TALEN과 달리, megaTAL은 기능적 활성을 위해 단일 펩타이드 사슬의 전달만을 필요로 한다.
CAR을 발현하도록 성공적으로 유전적으로 변형된 세포는 예를 들어 형질도입 마커의 발현에 기초하여 분류되고 추가로 프로세싱될 수 있다.
(ix) CAR 발현 세포를 특성화하기 위한 검정. 당업자에게 잘 알려진 임의의 관련 검정 또는 테스트를 사용하여 항-NK CAR 변형된 세포가 NK 표면 마커 (예를 들어, NKp46 및/또는 NKG2A)를 발현하는 표적 세포에 결합하고/하거나 표적 세포를 살해할 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 항-NK CAR 변형된 세포가 활성화될 때 표적 세포에 결합하고/하거나 표적 세포를 살해할 수 있다. 항-NK CAR 변형된 세포 활성화의 평가는 다음을 포함한다: (i) 표적 세포 상의 NK 세포 표면 마커 결합 시 항-NK CAR 변형된 세포 상의 CD137 (4-1BB) 발현의 유도; (ii) IL-2, IFNγ, 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNFα), 인터루킨(IL)-5, 및 IL-13을 포함한 사이토카인의 분비 (문헌 [Xhangolli 등 (2019) Genomics, proteomics & bioinformatics, 17(2): 129-139]), 및/또는 (iii) NK 세포 표면 마커 (예를 들어, NKp46 및/또는 NKG2A)를 발현하는 표적 세포에 대한 세포독성. 예를 들어, 항-NK CAR 변형된 세포 기능을 평가하는 것은 다음을 포함할 수 있다. NKp46과 같은 NK 세포 표면 마커를 발현하도록 유전적으로 변형된 표적 세포는 2:1의 이펙터 세포: 표적 세포의 비율로 항-NKp46 scFv 결합 도메인을 갖는 항-NK CAR 변형된 세포 (이펙터 세포)와 접촉할 수 있다. 특정 구현예에서, 이펙터 세포: 표적 세포의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 및 10:1을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 인간 불멸화 백혈병 세포주로부터 유래된 K562 세포를 포함한다. K562 세포는 MHC 복합체가 없고, EBV의 흔적이 없으며, 초기 단계의 적혈구, 과립구, 및 단핵구와 유사한 특성을 자발적으로 발달시킨다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 NK92와 같은 NK 세포 림프종 세포주를 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 공여자로부터의 PBMC로부터 얻은 자가 1차 NK 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 항-NK CAR 변형된 T 세포이고, 예를 들어 CD3+ (T 세포 마커) 및 BFP+ (CAR와 공동-발현된 형질도입 마커를 나타내는 형광 방출 파장) 세포에 대한 게이팅에 의해 유세포 분석기에서 선택적으로 관찰될 수 있다.
특정 구현예에서, 표적 세포의 결합 시 항-NK CAR 변형된 세포에 대한 CD137 발현의 유도는 CD137을 인식하는 항체를 사용하는 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. CD137+ 항-NK CAR 변형된 T 세포의 %는 항-NK CAR 변형된 T 세포가 CD137에 결합하는 표지된 항체와 접촉된 후 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. 토끼 모노클로날 [BLR051F] 항-인간 CD137 항체 (Abcam, Cambridge, UK), 마우스 모노클로날 4B4-1 항-인간 CD137 항체 (Thermo Fisher, Waltham, MA), 및 마우스 모노클로날 BBK-2 항-인간 CD137 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)를 비롯한 CD137에 결합하는 항체는 상업적으로 입수 가능하다.
특정 구현예에서, 표적 세포의 결합 시 항-NK CAR 변형된 세포로부터의 사이토카인의 분비는 당업계에 공지된 검정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 사이토카인의 분비는 ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석, 단일 세포 다중 사이토카인 프로파일링, 및 고처리량 단일 세포 3' mRNA 전사체 시퀀싱에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 검정은 특정 사이토카인에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한다. 특정 구현예에서, 검정은 유세포 분석을 사용하여 사이토카인의 세포내 염색을 측정한다. 특정 구현예에서, 검정은 3' mRNA의 세포 바코드 및 고처리량 시퀀싱을 사용한다. 특정 구현예에서, 측정된 사이토카인은 IL-2, IFNγ, 및 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNFα)를 포함한다. 사이토카인 검정은 문헌 [Wilkie 등 (2008) J Immunol. 180:4901-4909, Jena 등 (2014) Curr Hematol Malig Rep. 9:50-56, Kaiser 등 (2015) Cancer Gene Ther. 22:72-78, Xue 등 (2017) J Immunother Cancer 5:85, and Xhangolli 등 (2019) Genomics Proteomics Bioinformatics. 17(2): 129-139]에 추가로 기술되어 있다.
특정 구현예에서, 표적 세포의 결합 시 항-NK CAR 변형된 세포의 세포독성 활성은 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 세포에 의해 발현되는 NK 세포 표면 마커에 대한 표지된 항체를 사용하여 항-NK CAR 변형된 세포의 존재 또는 부재 시 표적 세포의 양을 유세포 분석에 의해 정량화할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포독성 검정은 크롬-51 방출 검정 또는 강화된 녹색 형광 단백질(GFP)-파이어플라이 루시퍼라제 융합과 같은 비-방사성 리포터를 사용하는 유사한 검정 (문헌 [Xiong 등 (2018) J Immunol 200(1): Supplement 1, 179.2]), 락테이트 탈수소효소 (LDH) 방출 검정, 금 미세전극 바이오센서를 사용하여 전기 임피던스로 세포 생존력을 정량화하는 실시간 세포 분석 시스템 (예를 들어, 문헌 [Sener 등 (2017) Exp Ther Med. 14(3): 1866-1870]), 및 프로피듐 아이오다이드와 같은 프로브 기반 실시간 시스템 및 손상된 세포 막 무결성에 기반한 및 SYTOX Green을 포함한다. 방출 검정에서, 표적 세포 사멸은 용해된 세포로부터 방출된 크롬 51 (CAR T 세포와 접촉하기 전에 표적 세포로 미리 로딩됨) 또는 LDH의 양에 의해 정량화될 수 있다. 표적 세포 세포독성는 다음의 공식을 사용하여 계산될 수 있다: 세포독성의 % = 100 × [(CAR-T:표적 세포 - CAR-T 세포 단독 - 표적 세포 단독)/(최대 표적 세포 용해 - 용해 버퍼 없이 표적 세포 단독)]. 특정 구현예에서, 표적 세포의 결합 시 항-NK CAR 변형된 세포의 세포독성 활성은 세포트래커 오렌지 또는 그린 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)과 같은 표지 또는 염료로 사전-염색된 표적 세포의 백분율 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다.
특정 구현예에서, 활성화된 항-NK CAR 변형된 세포는 항-NK CAR 변형된 세포와 표적 세포의 접촉 후 항-NK CAR 변형된 세포의 활성화에서 통계적으로 유의한 (예를 들어, p<0.05) 증가를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포와 표적 세포의 접촉 후 항-NK CAR 변형된 세포의 활성화는 본원에 기술된 바와 같은 CD137+인 항-NK CAR 변형된 세포의 양 또는 배수 증가에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포와 표적 세포의 접촉 후 항-NK CAR 변형된 세포의 활성화는 사이토카인을 생성하는 항-NK CAR 변형된 세포의 양 또는 배수 증가에 의해 또는 본원에 기술된 바와 같이 생성된 사이토카인 (예를 들어, IFNγ, TNFα, IL-2)의 양 또는 배수 증가에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화된 항-NK CAR 변형된 세포는 대조군 조건과 비교하여 5%, 15%, 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 100%, 또는 그 이상의 활성화 증가를 갖는다. 특정 구현예에서, 활성화된 항-NK CAR 변형된 세포는 대조군 조건과 비교하여 10% 내지 50% 의 활성화 증가를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포 활성화의 증가는 대조군 조건과 비교하여 2배, 4배, 6배, 8배, 10배, 12배, 14배, 또는 그 이상이다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포 활성화의 증가는 대조군 조건과 비교하여 1.5배 내지 6배이다. 특정 구현예에서, 활성화된 항-NK CAR 변형된 세포는 항-NK CAR 변형된 세포와 표적 세포의 접촉 후 생존 표적 세포의 양에서 통계적으로 유의한 (예를 들어, p<0.05) 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 생존 표적 세포의 양의 감소는 본 개시내용의 CAR에 노출 시 표적 세포의 고갈을 측정한다. 특정 구현예에서, 생존 표적 세포의 양의 감소는 본원에 기술된 바와 같은 표지 또는 염료로 마킹된 표적 세포의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 생존 표적 세포의 양은 대조군 조건과 비교하여 5%, 15%, 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 또는 그 이상 감소한다. 특정 구현예에서, 생존 표적 세포의 양은 대조군 조건과 비교하여 10% 내지 100% 감소한다. 특정 구현예에서, 생존 표적 세포의 양은 대조군 조건과 비교하여 2배, 4배, 6배, 8배, 10배, 또는 그 이상 감소한다. 특정 구현예에서, 생존 표적 세포의 양은 대조군 조건과 비교하여 2배 내지 5배 감소한다. 특정 구현예에서, 대조군 조건은 항-NK CAR 변형된 세포 단독 (표적 세포가 존재하지 않음)으로 수행된 검정; 표적 세포 단독 (항-NK CAR 변형된 세포가 존재하지 않음)으로 수행된 검정; 항-NK CAR 변형된 세포 및 항-NK CAR 변형된 세포 (예를 들어, 항-NKp46 변형된 CAR T 세포 및 CD19를 발현하는 K562 세포)에 의해 발현된 CAR의 결합 도메인에 의해 인식되지 않은 항원을 발현하는 표적 세포로 수행된 검정을 포함할 수 있다.
(x) 표적 NK 세포를 특성화하기 위한 검정. 당업계에 공지된 임의의 수의 검정을 사용하여 본 개시내용의 항-NK CAR 발현 세포에 의해 표적화된 NK 세포의 특성 및/또는 거동을 특성화할 수 있다. NK 세포는 예를 들어 표적 NK 세포와 항-NK CAR 발현 세포의 접촉 후 특성화될 수 있다. 특정 구현예에서, NK 표적 세포: 항-NK CAR 발현 세포의 비율은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 및 1:10을 포함할 수 있다. 세포독성 마커 (CD107, CD69), 사이토카인 생성 (예를 들어, IFN-γ 또는 TNF-α), 세포내 유리 칼슘 수준 증가 및/또는 세포 용해 능력과 같은 NK 세포 활성과 관련된 모든 매개변수를 측정하거나 검출할 수 있다. 특정 구현예에서, NK 세포에 의한 세포내 사이토카인 발현은 유세포 분석에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, NK 세포는 항-NK CAR 발현 세포로부터 NK 세포를 분화시키기 위해 세포 트래커 염료로 표지될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 발현 세포는 세포 트래커 염료 음성, CD3+, 및/또는 유세포 분석에 의해 선별 마커 양성이 됨으로써 식별될 수 있다. NK 세포 활성은 유전자 발현-기반 활성, 세포독성-기반 검정 및 증식 검정에 의해 평가될 수 있다. NK 세포와 관련된 검정에 유용한 프로토콜은 자연 살해 세포 프로토콜 (Campbell KS and Colonna M. Humana Press, pp. 219-238 (2000)에 의해 편집됨)에서 찾을 수 있다.
특정 구현예에서, NK 세포는 항-NK CAR 발현 세포와의 접촉 후 활성화의 통계적으로 유의한 (예를 들어, p<0.05) 증가를 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, NK 세포 활성화는 대조군 조건과 비교하여 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 또는 그 이상의 사이토카인 생성의 증가로 반영된다. 특정 구현예에서, NK 세포는 항-NK CAR 발현 세포와 접촉 후 억제의 통계적으로 유의한 (예를 들어, p<0.05) 증가를 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, NK 세포 억제는 대조군 조건과 비교하여 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 또는 그 이상의 사이토카인 생성의 감소로 반영된다. 특정 구현예에서, NK 세포는 항-NK CAR 발현 세포와 접촉 후 활성화의 임의의 통계적으로 유의한 (예를 들어, p>0.05) 증가 또는 억제의 증가를 나타내지 않는다. 특정 구현예에서, NK 세포는 (예를 들어 세포 트래커 염료 음성, CD3+, 및/또는 CAR 발현 세포에 대해 양성인 선별 마커에 의해 평가된 바와 같이) NK 세포와 항-NK CAR 발현 세포의 접촉 후 항-NK CAR 발현 세포의 양의 통계적으로 유의한 (예를 들어, p<0.05) 감소를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 발현 세포의 양은 대조군 조건과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상 감소한다. 특정 구현예에서, NK 세포는 NK 세포와 항-NK CAR 발현 세포의 접촉 후 항-NK CAR 발현 세포의 양의 통계적으로 유의한 (예를 들어, p<0.05) 감소를 유도하지 않는다. 특정 구현예에서, 대조군 조건은 항-NK CAR을 발현하도록 변형되지 않은 세포 (예를 들어, mock T 세포) 및 NK 세포로 수행된 검정; 항-활성화 NK 수용체 CAR (예를 들어, 항-NKp46 CAR 세포)을 발현하도록 변형된 세포 및 NK 세포로 수행된 검정; 항-억제성 NK 수용체 CAR을 발현하도록 변형된 세포 (예를 들어, 항-NKG2A CAR 세포) 및 NK 세포로 수행된 검정; NK 세포 표면 상의 항원을 인식하지 않는 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 변형된 세포 (예를 들어, 항-CD19 CAR을 발현하는 세포) 및 NK 세포로 수행된 검정을 포함할 수 있다.
(xi) 조성물 및 제형. CAR을 발현하도록 생체외에서 유전적으로 변형된 세포 및/또는 CAR을 발현하도록 세포의 생체내 유전적 변형을 초래하는 나노입자는 대상체에 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
"약제학적 조성물"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 요법 양식과 조합하여 세포 또는 동물에 투여하기 위해 약제학적으로 허용되거나 생리학적으로 허용되는 용액으로 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한, 원한다면, 조성물이 예를 들어 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 소분자, 화학요법제, 전구약물, 약물, 항체 또는 다른 다양한 약제학적 활성제와 같은 다른 작용제와 조합하여 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 추가 작용제가 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 악영향을 미치지 않는 한 조성물에 또한 포함될 수 있는 다른 성분에는 사실상 제한이 없다.
어구 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 합당한 이익/위험 비율에 상응하는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 방부베, 염료/착색제, 풍미 강화제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장화제, 용매, 계면활성제, 또는 미국 식품 의약국 (US FDA)에서 사람이나 가축에 사용할 수 있는 것으로 승인된 유화제를 포함한다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체 및 제형은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 개시되어 있다. 또한, 조성물 및 제형은 미국 FDA 생물 표준 사무국 및/또는 기타 관련 외국 규제 기관에서 요구하는 무균성, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족하도록 제조될 수 있다.
예시적인 담체는 식염수, 완충 식염수, 생리 식염수, 물, 행크스 (Hanks') 용액, 링거액, 논노솔 (Nonnosol)-R (Abbott Labs), PLASMA-LYTE A® (Baxter Laboratories, Inc., Morton Grove, IL), 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 담체는 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 기타 인간 혈청 성분 또는 태아 소 혈청으로 보충될 수 있다. 특정 구현예에서, 주입을 위한 담체는 5% HAS 또는 덱스트로오스를 갖는 완충 식염수를 포함한다. 추가적인 등장화제는 3가 또는 그 초과의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 또는 만니톨을 포함하는 다가 당 알코올을 포함한다.
담체는 완충제, 예컨대 시트레이트 버퍼, 석시네이트 버퍼, 타르트레이트 버퍼, 푸마레이트 버퍼, 글루코네이트 버퍼, 옥살레이트 버퍼, 락테이트 버퍼, 아세테이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, 히스티딘 버퍼, 및/또는 트리메틸아민염을 포함할 수 있다.
안정화제는 팽화제로부터 용기 벽에 대한 세포 부착을 방지하는 데 도움을 주는 첨가제에 이르기까지의 기능을 범위로 할 수 있는 광범위한 범주의 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알코올 아미노산, 유기 당류 또는 당 알코올, PEG, 황-함유 환원제, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린, 폴리비닐피롤리돈, 및 사카라이드를 포함할 수 있다.
필요하거나 유익한 경우에, 조성물 또는 제형은 주사 부위에서의 통증을 완화하기 위하여 리도카인과 같은 국부 마취제를 포함할 수 있다.
예시적인 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 에타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 벤즈알코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 및 3-펜타놀을 포함한다.
조성물 또는 제형 내 치료학적 유효량은 102 이상의 세포, 103 이상의 세포, 104 이상의 세포, 105 이상의 세포, 106 이상의 세포, 107 이상의 세포, 108 이상의 세포, 109 이상의 세포, 1010 이상의 세포, 또는 1011 이상의 세포일 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 제형에서, 세포의 용적은 일반적으로 1리터 미만, 500 ml 미만, 250 ml 미만, 또는 100 ml 미만이다. 따라서 투여된 세포의 밀도는 전형적으로 104 세포 /ml, 107 세포 /ml, 또는 108 세포/ml 이상이다.
나노입자의 치료학적 유효량은 0.1 내지 5 μg/kg 또는 0.5 내지 1 μg/kg 범위일 수 있다. 다른 예에서, 용량은 1 μg /kg, 15 μg /kg, 30 μg /kg, 50 μg/kg, 55 μg/kg, 70 μg/kg, 90 μg/kg, 150 μg/kg, 350 μg/kg, 500 μg/kg, 750 μg/kg, 1000 μg/kg, 0.1 내지 5 mg/kg 또는 0.5 내지 1 mg/kg을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 용량은 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 100 mg/kg, 300 mg/kg, 500 mg/kg, 700 mg/kg, 1000 mg/kg 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물 및 제형은 하나 이상의 유전적으로 변형된 세포 유형 (예를 들어, 변형된 T 세포, NK 세포, 또는 줄기 세포) 또는 하나 이상의 CAR 유형을 갖는 유전적으로 변형된 세포 (예를 들어, 항-NKp46 CAR을 포함하는 변형된 T 세포 및 항-NKG2A CAR을 포함하는 변형된 T 세포)를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포의 다른 집단은 다른 비율로 제공될 수 있다.
세포-기반 조성물 및 제형은 예를 들어 주사, 주입, 관류 또는 세척에 의한 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물 및 제형은 골수, 정맥내, 피내, 동맥내, 결절내, 림프내, 복강내, 병소내, 전립선내, 질내, 직장내, 국소, 척수강내, 종양내, 근육내, 방광내 및/또는 피하 주사를 위하여 추가로 제형화될수 있다.
주사를 위한 조성물은 행크스 용액, 링거액, 또는 생리 식염수를 포함하는 버퍼와 같은 수용액으로 제형화될 수 있다. 수용액은 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 제형은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 무균 발열원이 없는 물로 구성하기 위한 동결건조 및/또는 분말 형태일 수 있다.
일부 예에서, 본 개시내용의 세포 또는 세포 제형을 동결보존하는 것이 유용할 수 있다. 본원에서 사용되는 "동결보존"은 (전형적으로) 77 K 또는 -196℃ (액체 질소의 끓는점)와 같은 영하의 온도로 냉각하여 세포를 보존하는 것을 지칭한다. 동결보존제는 종종 저온에서의 결빙 또는 실온으로의 가온으로 인한 세포 손상을 개선하거나 방지하기 위해 영하의 온도에서 사용된다. 동결보존제와 최적의 냉각 속도는 세포 손상을 방지할 수 있다. 사용될 수 있는 동결보존제는 디메틸 설폭사이드 (DMSO) (문헌 [Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205]), 글리세롤, 폴리비닐 피롤리돈 (문헌 [Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576]), 및 폴리에틸렌 글리콜 (문헌 [Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48])을 포함한다. 특정 구현예에서, 냉각 속도는 1℃ 내지 3℃/분이다. 적어도 2시간 후, 세포는 -80℃의 온도에 도달하고 장기간 극저온 보관 용기에서와 같이 영구 보관을 위해 액체 질소 (-196℃)에 직접 넣어질 수 있다.
(xii) 사용 방법. 본원에 기술된 유전적으로 변형된 세포는 NK 세포 관련 질환의 치료 방법뿐만 아니라 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 다른 질환의 치료 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, NK 세포 관련 질환은 (예를 들어, NK 세포 악성종양, 자가면역 질환, 동종면역 질환, 또는 감염에서) 질환의 원인 또는 진행이 되거나 (예를 들어, 암에서) 질환을 개선하거나 예방하는 기능을 하는 것을 비롯한 역할을 하는 임의의 질환을 포함한다. 특정 구현예에서, NK 세포 관련 질환은 NK 세포 악성종양, 암, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환을 포함한다. 특정 구현예에서, NK 세포 관련 질환은 보다 억제성인 수용체를 발현하거나 억제성 표현형을 갖는 NK 세포를 고갈시킴으로써 NK 세포 기능을 개선하거나 부스팅하는 데 치료학적 이점이 있는 악성종양 또는 감염을 포함한다. 특정 구현예에서, NK 세포 억제성 표현형은 NK 세포 상의 억제성 수용체의 더 많은 발현; NK 세포 활성의 억제; NK 세포가 표적 세포를 용해시키는 능력의 감소; 및/또는 정상적으로 기능하는 NK 세포 또는 억제성 표현형이 없는 NK 세포와 비교하여 염증, 감염, 종양 및/또는 파괴될 필요가 있는 다른 세포에 대한 NK 세포 면역 반응의 감소를 포함한다. 특정 구현예에서, NK 세포 억제성 표현형은 본원에 기술된 검정에 의해 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, NK 세포 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환은 비정상적인 NK 수용체 발현을 갖는 악성종양을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 집단의 세포 상의 NK 수용체 발현은 집단 내 세포의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 주어진 NK 수용체를 발현할 때 비정상적이다. NK 수용체를 발현하는 세포 집단에서 세포의 백분율은 대조군 조건 또는 참조 값과 비교될 수 있다. 특정 구현예에서, 대조군 조건은 건강한 대상체로부터의 세포 집단 또는 건강한 대상체의 풀 (pool), 또는 비정상적인 NK 수용체 발현을 갖는 악성종양에 걸리지 않은 대상체로부터의 세포 집단 또는 대상체의 풀을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 참조 값은 건강한 대상체의 세포 집단 또는 건강한 대상체의 풀 또는 비정상적인 NK 수용체 발현을 갖는 악성 종양에 걸리지 않은 대상체의 세포 집단 또는 대상체의 풀로부터 유래될 수 있다. 비정상적인 NK 수용체 발현을 갖는 악성 종양은 세자리 증후군, 성숙한 T 세포 신생물, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 및 ALK+ 역형성 대세포 림프종을 포함한다. 특정 구현예에서, NK 세포 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환은 NK 수용체가 T 세포 또는 다른 세포에서 발현되는 자가면역 또는 동종면역 상태를 포함한다.
특정 구현예에서, NKp46 및/또는 NKG2A에 결합하는 CAR을 발현하는 항-NK 변형된 세포는 NK 세포 악성종양을 치료하기 위해 NK 세포의 고갈을 허용한다. 특정 구현예에서, NKG2A 억제성 수용체에 결합하는 CAR을 발현하는 항-NK 변형된 세포는 억제성 NK 세포의 고갈을 허용하여 암에 대한 NK 반응을 부스팅한다. 특정 구현예에서, 암은 비-NK 세포 악성종양을 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A 억제성 수용체에 결합하는 CAR을 발현하는 항-NK 변형된 세포는 억제성 NK 세포의 고갈을 허용하여 감염에 대한 NK 반응을 부스팅한다. 특정 구현예에서, NKp46 활성화 수용체에 결합하는 CAR을 발현하는 항-NK 변형된 세포는 활성화 NK 세포의 고갈을 허용하여 자가면역 또는 동종면역 질환에서 면역 반응을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 투여된 세포는 대상체의 NK 세포를 표적으로 하여 파괴시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 생체내에서 복제할 수 있는 항-NK CAR 변형된 T 세포이며, 결과적으로 지속적인 요법으로 이어질 수 있는 장기간 지속성을 초래한다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 T 세포는 강력한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 T 세포는 재활성화되어 NK 세포를 표적으로 하여 파괴할 수 있는 특정 기억 T 세포로 진화한다. 특정 구현예에서, 항-NK CAR 변형된 세포는 대상체에게 투여된 후 생체내에서 성숙한 면역 이펙터 세포로 분화되는 항-NK CAR 변형된 HSPC이다.
특정 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 대상체의 NK 세포 악성종양, 암, 감염, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환에 대한 세포 면역 반응을 증가시키기 위한 유효량의 조성물을 투여받는다. 면역 반응은 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포 반응, 및/또는 NK 세포를 살해할 수 있는 세포독성 T 세포에 의해 매개되는 세포성 면역 반응을 포함할 수 있다. 주로 B 세포를 활성화할 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 매개되어 항체 생성을 유도하는 체액성 면역 반응 또한 유도될 수 있다. 조성물에 의해 유도된 면역 반응의 유형을 분석하기 위해 다양한 기술이 사용될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 기술되어 있다; 예를 들어. 문헌 [Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y].
T 세포-매개 살해의 경우, CAR-항원 결합은 T 세포에서 CAR 신호전달을 개시하여, T 세포가 다양한 메커니즘에 의한 표적 세포 세포자연사를 유도할 수 있는 단백질을 생성하거나 방출하도록 유도하는 다양한 T 세포 신호전달 경로의 활성화를 초래한다. 이러한 T 세포-매개 메커니즘은 T 세포에서 표적 세포로의 세포내 세포독성 과립의 전달, 표적 세포 살해를 직접적으로 (또는 다른 살해 이펙터 세포의 동원을 통해 간접적으로) 유도할 수 있는 전염증성 사이토카인의 T 세포 분비, 및 표적 세포 상의 그들의 동족 사멸 수용체 (예를 들어, Fas)에 결합한 후 표적 세포 세포자연사를 유도하는 T 세포 표면의 사멸 수용체 리간드 (예를 들어, FasL)의 상향조절을 포함한다.
방법은 본원에 개시된 조성물 및 제형으로 대상체 (인간, 수의학 동물 (개, 고양이, 파충류, 새 등), 가축 (말, 소, 염소, 돼지, 닭 등) 및 연구 동물 (원숭이, 래트, 마우스, 어류 등)을 치료하는 것을 포함한다. 대상체를 치료하는 것은 치료학적 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 치료학적 유효량은 유효량, 예방적 치료 및/또는 치료적 치료를 제공하는 것을 포함한다.
"유효량"은 대상체에서 원하는 생리학적 변화를 초래하는 데 필요한 조성물의 양이다. 예를 들어, 유효량은 항암, 항-감염, 항-자가면역, 또는 항-동종면역 효과를 제공할 수 있다. 유효량은 종종 연구 목적으로 투여된다. 유효량은 NK 세포 악성종양, 암, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환의 발달 또는 진행의 평가와 관련된 동물 모델 또는 시험관내 검정에서 통계적으로 유의한 효과를 야기할 수 있다. 면역원성 조성물은 유효량으로 제공될 수 있으며, 여기서 유효량은 면역 반응을 자극하거나 면역 반응을 약화시킨다.
"예방적 치료"는 NK 세포 악성종양, 암, 감염, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나, NK 세포 악성종양, 암, 감염, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환의 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료를 포함하여, 치료가 NK 세포 악성종양, 암, 감염, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환이 추가로 발병할 위험을 약화시키거나 감소시키기 위한 목적으로 투여되도록 한다. 따라서, 예방적 치료는 NK 세포 악성종양, 암, 감염, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환에 대한 예방적 치료로서 기능한다. 특정 구현예에서, 예방적 치료는 NK 세포 악성종양의 추가 진행을 감소, 지연 또는 예방한다. 특정 구현예에서, 예방적 치료는 암의 전이를 감소, 지연 또는 예방한다. 특정 구현예에서, 예방적 치료는 감염을 감소, 지연 또는 예방한다. 특정 구현예에서, 예방적 치료는 과민성 면역 반응을 감소, 지연 또는 예방한다.
"치료적 치료"는 NK 세포 악성종양, 암, 감염, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에 투여되는 치료를 포함하며, NK 세포 악성종양, 암, 감염, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환의 징후 또는 증상을 완화시키거나 제거할 목적으로 대상체에게 투여된다. 치료적 치료는 NK 세포 악성종양, 암, 감염, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환의 존재 또는 활성을 감소, 제어, 또는 제거하고/하거나 NK 세포 악성종양, 암, 자가면역 질환, 또는 동종면역 질환의 부작용을 감소, 제어 또는 제거할 수 있다.
NK 세포 악성종양은 미성숙한 NK 세포 및 성숙한 NK 세포로부터 발생하는 신생물을 포함한다. 특정 구현예에서, 미성숙 (또는 전구체) NK 세포 신생물은 무과립 CD4+/CD56+ 조혈 신생물, CD94 1A+/TCR- 림프모구 림프종/백혈병 (LBL), 및 골수/NK 세포 급성 백혈병을 포함한다. 특정 구현예에서, 성숙한 NK 세포 신생물은 림프절외 NK 세포 림프종, 비강 유형; 공격적 NK 세포 백혈병; 및 만성 NK 세포 림프구증가증을 포함한다. 성숙한 NK 세포 신생물은 일반적으로 CD2+/CD3-/cCD3ε+/CD56+/MPO- 및 세포독성 분자-양성이다. 성숙한 NK 세포 신생물, 미성숙한 NK 세포 신생물과 달리, EBV와 강한 연관성을 갖는다.
특정 구현예에서, 치료적 치료는 비강 NK 세포 림프종을 갖는 대상체에서 비강 분비물, 비폐색, 화농성 콧물, 코피 및 국소 부기를 감소, 지연 또는 예방한다. 특정 구현예에서, 치료적 치료는 비강외 NK 세포 림프종을 갖는 대상체에서 점막 부위의 궤양화, 혈관의 혈관 중심성 및 혈관 파괴성 성장, 및 피부 병변을 감소, 지연 또는 예방한다. 특정 구현예에서, 치료적 치료는 공격적 NK 세포 백혈병을 갖는 대상체에서 발열, 전신 증상, 간 기능장애, 간비장종대, 중증 빈혈 및 저혈소판증을 감소, 지연 또는 예방한다. 특정 구현예에서, 치료적 치료는 만성 NK 세포 림프구증가증을 갖는 대상체에서 중증 호중구감소증, 순수 적혈구 무형성증, 혈관염 증후군, 발열, 및 말초 혈액 NK 세포의 증가를 감소, 지연 또는 예방한다.
조성물 및 제형에 의해 치료될 수 있는 암은 다음을 포함한다: 방광, 두경부, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 및 편평 세포 암종을 포함하는 피부의 암종을 포함하는 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발 세포 림프종 및 버킷 림프종을 비롯한 림프 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병을 포함하는 골수 계통의 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 신경모세포종 및 신경교종을 비롯한 기타 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포암 및 기형암종을 포함하는 기타 종양. 본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 다른 예시적인 암은 림프 계통의 조혈 종양, 예를 들어 소세포 및 대뇌모양 세포 유형을 포함하는 T-전림프구성 백혈병 (T-PLL)과 같은 T 세포 장애; T 세포 유형의 거대 과립 림프구 백혈병 (LGL); 세자리 증후군 (SS); 성인 T 세포 백혈병 림프종 (ATLL); 간비장 T 세포 림프종; 말초/흉선후 T 세포 림프종 (다형성 및 면역모세포성 하위유형); 혈관면역모세포성 T 세포 림프종; 혈관중심성 (비강) T 세포 림프종; 역형성 (Ki 1+) 대세포 림프종; 장 T 세포 림프종; 및 T-림프모구 림프종 /백혈병 (T-Lbly/T-ALL)을 포함하는 T 세포 및 B 세포 종양을 포함한다.
특정 구현예에서, 치료학적 유효량은 항암 효과를 제공한다. 항암 효과는 악성 NK 세포 수 감소, 전이 수 감소, 종양 용적 감소, 기대 수명 연장, 암세포의 화학- 또는 방사선-감수성 유도, 암세포 주변의 혈관신생 억제, 암 세포 증식 억제, 전이 종양 성장 억제, 전이 예방 또는 감소, 대상체 수명 연장, 암 관련 통증 감소 및/또는 치료 후 암의 재발 또는 재발생 감소를 포함한다.
개시된 조성물 및 제형에 의해 치료될 수 있는 감염은 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충 및 절지동물 감염을 포함한다. 특정 구현예에서, 감염은 만성이다. 특정 구현예에서, 박테리아 감염은 스타필로코커스 종 (Staphylococcus spp.), 스트렙토코커스 종 (Streptococcus spp.), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile), 대장균 (Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 살모넬라 (Salmonella), 비브리오 (Vibrio), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 나이세리아 고노르호애 (Neisseria gonorrhoeae) 및 트레코포네마 팔리둠 (Treponema pallidum)에 의해 유발된 감염을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스 감염은 리노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 코로나바이러스, 단순 포진 바이러스-1 (HSV-1), 수두 대상포진 바이러스 (VZV), A형 간염, 노로바이러스, 로타바이러스, 인유두종바이러스 (HPV), B형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 단순 포진 바이러스-2 (HSV-2), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 엔테로바이러스, C형 간염, 인간 T-림프영양성 바이러스-1 (HTLV-1), 메르켈 세포 폴리오마바이러스 (MCV), 및 HHV8 (카포시 육종)에 의해 유발된 감염을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 진균 감염은 트리코피톤 종 (Trychophyton spp.) 및 칸디다 종 (Candida spp.)에 의해 유발된 감염을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 기생충 감염은 지아디아, 톡소플라스마증, E. 베르미큘라리스, 트리파노소마 크루지, 에키노코쿠스증, 낭포충증, 톡소카리아증, 트리코모나스증 및 아메바증에 의해 유발된 감염을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 절지동물 감염은 캘리포니아 뇌염, 치쿤구니야, 뎅기열, 동부 말 뇌염, 포와산, 세인트루이스 뇌염, 웨스트 나일, 황열병, 지카, 라임병, 및 바베시아증을 비롯한 바이러스 또는 박테리아에 감염된 절지동물에 의해 전파되는 감염을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 치료학적 유효량은 항-감염 효과를 제공한다. 항-감염 효과는 감염성 병원체의 양 또는 수준, 피로, 식욕 부진, 체중 감소, 발열, 식은 땀, 오한, 아픔 및 통증, 설사, 팽만감, 복통, 피부 발진, 기침 및/또는 콧물의 감소를 포함한다.
개시된 조성물 및 제형에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환은 쇼그렌병; 항인지질 증후군; 심상성 천포창; 척추관절병증; 건선을 포함한 피부 질환; 다발성 경화증; 전신 경화증; 제1형 당뇨병; 류마티스 관절염; 소아 특발성 관절염; 염증성 장 질환; 자가면역 간 질환; 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 포함한다.
개시된 조성물 및 제형에 의해 치료될 수 있는 동종면역 질환은 FNAIT; 조혈 줄기 세포 거부반응, 고형 조직 이식 거부반응; 및 장기 이식 후 만성 동종이식 손상을 포함한다.
특정 구현예에서, 치료학적 유효량은 항-자가면역 또는 항-동종면역 효과를 제공한다. 항-자가면역 또는 항-동종면역 효과는 면역 반응의 감소, 염증의 감소, 조직 손상의 감소, 및/또는 자기 또는 비-자기 조직의 NK 세포 내성의 증가를 포함한다.
특정 구현예에서, 치료적 치료는 면역 체계에 의한 세포, 조직 및 관절의 공격; 류마티스 관절염, 건선 관절염, 또는 소아 특발성 관절염에서의 관절의 부종, 강직 및 통증; 다발성 경화증에서의 무감각, 쇠약 및 균형 문제; 과민성 장 질환에서의 위장관 염증염증; 쇼그렌병에서의 안구 건조 및 구강 건조; 동맥 및 정맥에서의 빈번한 응고 및/또는 항인지질 증후군에서의 유산; 심상성 천포창에서의 피부와 점막의 물집; 염증성 척추 통증, 천장관절염, 흉벽 통증, 말초 관절염, 말초 유착염, 촉지염, 폐첨의병변, 결막염, 포도막염 및 척추관절병증의 전도 장애와 함께 대동맥 기능부전; 제1형 당뇨병의 고혈당; 전신 경화증에서의 피부, 관절, 및 내부 장기의 섬유증 및 혈관 이상; 자가면역 간 질환에서의 간경변 및 간부전; SLE에서의 피로, 관절통, 발진 및 발열; FNAIT에서의 유산 및 자궁 내 성장 제한; 조혈 줄기 세포 이식 거부반응; 고형 조직 이식 거부반응; 면역 체계에 의한 동종이형 세포, 조직, 및/또는 장기의 공격; 및 새로운 공여자-특이적 항체의 개발, 혈관층의 내피 손상 및 신장 이식 후 만성 동종이식 손상에서의 세포 비대를 감소, 지연 또는 예방한다.
예방적 치료 및 치료적 치료는 상호 배타적일 필요는 없으며, 특정 구현예에서, 투여된 투여량은 하나 이상의 치료 유형을 달성할 수 있다.
투여를 위해, 치료학적 유효량 (본원에서 용량이라고도 함)은 시험관내 검정 및/또는 동물 모델 연구로부터의 결과에 기초하여 초기에 추정될 수 있다. 이러한 정보는 관심 대상체에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 대상체에게 투여되는 실제 용량은 의사, 수의사 또는 연구원이 표적, 체중, 상태의 중증도, 질환의 유형, 질환의 단계, 이전 또는 동시 치료 개입, 대상체의 특발성 및 투여 경로를 포함하는 신체적 및 생리적 요인과 같은 매개변수를 고려하여 결정될 수 있다.
투여하기 위한 치료학적 유효량은 102 이상의 세포, 103 이상의 세포, 104 이상의 세포, 105 이상의 세포, 106 이상의 세포, 107 이상의 세포, 108 이상의 세포, 109 이상의 세포, 1010 이상의 세포, 또는 1011 이상의 세포를 포함할 수 있다.
유용한 용량은 106-1012 세포/kg의 범위일 수 있다. 유용한 용량은 106 세포/kg, 107 세포/kg, 108 세포/kg, 109 세포/kg, 1010 세포/kg, 1011 세포/kg, 1012 세포/kg, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 세포는 치료를 받는 환자에 대해 동종이형, 동계, 이종 또는 자가일 수 있다. 원하는 경우, 치료는 미토겐 (예를 들어, PHA) 또는 림포카인, 사이토카인, 및/또는 케모카인 (예를 들어, IFN-γ, IL-2, IL-12, TNFα, IL-18, 및 TNFβ, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함하여 면역 반응의 유도를 강화시킬 수 있다.
투여에 유용한 용량은 예를 들어, 0.1 내지 5 μg/kg 또는 0.5 내지 1 μg /kg의 범위일 수 있다. 다른 예에서, 용량은 1 μg /kg, 15 μg /kg, 30 μg /kg, 50 μg/kg, 55 μg/kg, 70 μg/kg, 90 μg/kg, 150 μg/kg, 350 μg/kg, 500 μg/kg, 750 μg/kg, 1000 μg/kg, 0.1 내지 5 mg/kg 또는 0.5 내지 1 mg/kg을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 용량은 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 100 mg/kg, 300 mg/kg, 500 mg/kg, 700 mg/kg, 1000 mg/kg 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
치료학적 유효량은 치료 요법 과정 동안 단일 또는 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다 (예를 들어, 매일, 격일로, 3일 마다, 매주, 2주마다, 매월, 2개월마다, 4개월마다, 6개월 마다, 연간 등).
지시된 바와 같이, 조성물 및 제형은 주사, 수혈, 착상 또는 이식에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물 및 제형은 비경구적으로 투여된다. 어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"은 일반적으로 주사에 의한 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 종양내, 복강내 및 피하, 주사 및 주입을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 조성물 및 제형은 종양, 림프절, 또는 질환 부위로의 직접 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
특정 구현예에서, 조성물 및 제형은 화학요법제, 방사선, 면역억제제 또는 면역절제제, 항-염증제 (예를 들어, 스테로이드, 글루코코르티코이드, 비스테로이드성 항염증제 (NSAIDS)) 및/또는 사이토카인과 같은 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께 (예를 들어, 전, 동시, 또는 후에) 환자에게 투여된다.
특정 구현예에서, 조성물 및 제형은 예를 들어, NK 세포 악성종양 또는 암을 치료할 때 항-바이러스 치료 또는 예방과 조합하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-바이러스 치료 또는 예방은 EBV 감염을 치료하는 데 사용되는 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-바이러스 치료 또는 예방은 아시클로버, 발라시클로버, 팜시클로버, 간시클로버, 또는 발간시클로버를 포함하는 뉴클레오시드 유사체를 포함한다.
(xiii) 키트. 본원에 기술된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 다음 중 하나 이상이 키트에 제공될 수 있다: 면역 세포를 포함하는 항-NK CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 세포; 배지, aAPC, 성장 인자, 및 항체를 포함하는 변형될 세포를 확장하기에 적합한 시약; 세포의 형질감염 및/또는 형질도입을 위한 시약을 포함하여 항-NK CAR을 암호화하는 핵산을 세포로 도입하기에 적합한 시약; 항-NK CAR 변형된 세포; 세포를 동결 보존하기 위한 시약; CAR 발현 작제물; 효소, 중합효소, 및 프라이머를 포함하는 CAR 발현 작제물을 생성하기 위한 시약; CAR 변형된 세포를 분류하거나 검출하기 위한 항체를 포함하는 CAR 변형된 세포를 특성화하기에 적합한 시약; 및/또는 조직 배양 플레이트, 버퍼, 주사기, 피펫 등을 비롯한 핵산 및 세포 조작에 유용한 실험실 용품.
특정 구현예에서, CAR 발현 작제물의 형질감염을 위한 세포는 293 세포, 293T 세포, 또는 A549 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR 발현 작제물의 형질도입을 위한 시약은 피브로넥틴-코팅된 플레이트, 헥사디메트린 브로마이드 (폴리브렌), 및/또는 리포펙타민을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR 발현 작제물은 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR 발현 작제물은 활성화 NK 수용체 및/또는 억제성 NK 수용체에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR 발현 작제물은 NKp46 및/또는 NKG2A에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR 발현 작제물은 NKp46 또는 NKG2A, CD8α 힌지, CD8α 막횡단 도메인, 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인, 및 세포내 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR 발현 작제물은 2A 절단가능한 펩타이드에 의해 CAR을 암호화하는 유전자에 연결된 BFP 형질도입 마커를 암호화하는 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 3-98, 260-265의 CDR을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 99-112의 VH 및 VL을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 113-119를 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 266을 포함하는 중쇄의 항원 결합 단편; 및/또는 서열번호: 267을 포함하는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 190, 193, 196, 198, 201, 및 202의 CDR을 포함하는 NKp46 scFv; 서열번호: 204 및 205의 VH 및 VL을 포함하는 NKp46 scFv; 및/또는 서열번호: 206을 포함하는 NKp46 scFv를 포함한다. 특정 구현예에서, NKp46에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 및 203의 CDR을 포함하는 NKp46 scFv를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 127, 130, 133, 136, 142, 및 143을 포함하는 인공 HLA-E 모방체를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 242, 244, 및 246을 포함하는 인공 HLA-E 모방체를 포함한다. 특정 구현예에서, NKG2A에 결합하는 결합 도메인은 서열번호: 213, 214, 215, 216, 217, 218, 290, 291, 292, 293, 294, 및 295의 CDR; 서열번호: 219, 220, 221, 222, 및 223의 VH; 서열번호: 224, 225, 226, 227, 및 228의 중쇄의 항원 결합 단편; 및/또는 서열번호: 229의 경쇄의 항원 결합 단편을 포함한다.
키트는 본 개시내용의 조성물을 생성하기 위해 하나 이상의 적절하게 분취된 시약을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매체 또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 용기 수단은 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함할 수 있고, 그 안에 성분이 배치될 수 있으며, 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있다. 키트에 하나 이상의 성분이 있는 경우, 키트는 또한 일반적으로 추가 성분이 별도로 배치될 수 있는 두 번째, 세 번째 또는 다른 추가 용기를 함유할 수 있다. 그러나, 다양한 조합의 성분이 용기에 포함될 수 있다. 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 밀폐된 상태에서 CAR 발현 작제물 및 임의의 다른 시약 용기를 포함할 것이다. 이러한 용기는 예를 들어 원하는 바이알이 보유되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
(xiv) 변이체. 본원에 개시되고 참조된 서열의 변이체 또한 포함된다. 어떤 아미노산 잔기가 생물학적 활성을 제거하지 않고 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지 결정하는 지침은 DNASTAR™ (Madison, Wisconsin) 소프트웨어와 같이 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 찾을 수 있다. 바람직하게는, 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 그들의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 포함한다.
기능적 변이체는 단백질의 생리학적 효과에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 잔기 추가 또는 치환을 포함한다. 기능적 단편은 단백질의 생리학적 효과에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 결실 또는 절단을 포함한다. 실질적인 영향의 결여는 활성화 연구 또는 결합 연구에서 실험적으로 비교가능한 결과를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 세포내 도메인 (예를 들어, 세포내 신호전달 도메인)의 기능적 변이체 또는 기능적 단편은 본 개시내용의 활성화된 상태에 있을 때 야생형 참조에 필적하는 활성화 또는 억제 신호를 전달한다. 결합 도메인의 기능적 변이체 및 기능적 단편은 야생형 참조에 필적하는 수준에서 동족 항원 또는 리간드에 결합한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인 VH 영역은 알려진 항체의 VH로부터 유래하거나 이를 기반으로 할 수 있고 임의적으로 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개) 삽입, 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개) 결실, 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개) 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환), 또는 알려진 항체의 VH와 비교할 때 상기 언급된 변화의 조합을 함유할 수 있다. 각 CDR이 0개의 변화 또는 최대 1, 2, 또는 3개의 변화를 포함하고 변형된 VH 영역을 함유하는 결합 도메인이 야생형 결합 도메인과 유사한 친화성으로 그의 표적에 여전히 특이적으로 결합할 수 있다면 삽입, 결실 또는 치환은 아미노- 또는 카르복시-말단 또는 이 영역의 양 말단을 포함하여 VH 영역의 어느 곳에서나 있을 수 있다.
특정 구현예에서, 결합 도메인의 VL 영역은 알려진 VL로부터 유래되거나 이를 기반으로 하고 임의적으로 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개) 삽입, 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개) 결실, 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개) 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 또는 알려진 항체의 VL과 비교할 때 상기 언급된 변화의 조합을 함유한다. 각 CDR이 0개의 변화 또는 최대 1, 2, 또는 3개의 변화를 포함하고 변형된 VL 영역을 함유하는 결합 도메인이 야생형 결합 도메인과 유사한 친화성으로 그의 표적에 여전히 특이적으로 결합할 수 있다면 삽입, 결실 또는 치환은 아미노- 또는 카르복시-말단 또는 이 영역의 양 말단을 포함하여 VL 영역의 어느 곳에서나 있을 수 있다.
펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며 일반적으로 생성된 분자의 생물학적 활성을 변경하지 않고 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩타이드의 비-필수 영역에서 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 인식한다 (예를 들어, 문헌 [Watson 등 Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224] 참조). 자연 발생 아미노산은 일반적으로 다음과 같이 보존적 치환 패밀리로 나뉜다: 그룹 1: 알라닌 (Ala), 글리신 (Gly), 세린 (Ser), 및 트레오닌 (Thr); 그룹 2: (acidic): 아스파르트산 (Asp), 및 글루탐산 (Glu); 그룹 3: (산성; 극성의 음으로 하전된 잔기 및 그들의 아미드로도 분류됨): 아스파라긴 (Asn), 글루타민 (Gln), Asp, 및 Glu; 그룹 4: Gln 및 Asn; 그룹 5: (염기성; 극성의 양으로 하전된 잔기로도 분류됨): 아르기닌 (Arg), 라이신 (Lys), 및 히스티딘 (His); 그룹 6 (큰 지방족, 비극성 잔기): 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 발린 (Val) 및 시스테인 (Cys); 그룹 7 (비하전된 극성): 티로신 (Tyr), Gly, Asn, Gln, Cys, Ser, 및 Thr; 그룹 8 (큰 방향족 잔기): 페닐알라닌 (Phe), 트립토판 (Trp), 및 Tyr; 그룹 9 (비-극성): 프롤린 (Pro), Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Met, 및 Trp; 그룹 11 (지방족): Gly, Ala, Val, Leu, 및 Ile; 그룹 10 (작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기): Ala, Ser, Thr, Pro, 및 Gly; 및 그룹 12 (황 함유): Met 및 Cys. 추가 정보는 문헌 [Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]에서 찾을 수 있다.
이러한 변경을 함에 있어서, 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다 (문헌 [Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157(1), 105-32]). 각 아미노산은 소수성과 전하 특성에 기초하여 소수성 지수를 지정하였다 (문헌 [Kyte and Doolittle, 1982]). 이 값은 다음과 같다: Ile (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); 글루타메이트(-3.5); Gln (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); 및 Arg (-4.5).
특정 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성하고, 즉 여전히 생물학적 기능적으로 등가인 단백질을 얻는다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 변경을 함에 있어서, 소수성 지수가 ±2 이내인 아미노산 치환이 바람직하고, ±1 이내가 특히 바람직하고, ±0.5 이내가 더욱 특히 바람직하다.
미국 특허 제4,554,101호에서 자세히 설명된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: Arg (+3.0); Lys (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Thr (-0.4); Pro (-0.5±1); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); Ile (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); Trp (-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있고 여전히 생물학적으로 등가물, 및 특히 면역학적으로 등가인 단백질을 얻을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산 치환이 바람직하고 ±1 이내가 특히 바람직하고, ±0.5 이내가 더욱 특히 바람직하다.
상기 개략된 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기반할 수 있다.
다른 곳에서 지시된 바와 같이, 유전자 서열의 변이체는 암호화된 생성물의 기능에 통계적으로 유의한 정도로 영향을 미치지 않는 코돈 최적화된 변이체, 서열 다형성, 스플라이스 변이체, 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있다.
단백질, 핵산 및 유전자 서열의 변이체는 또한 본원에 개시된 단백질, 핵산 또는 유전자 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 80% 서열 동일성, 85% 서열, 90% 서열 동일성, 95% 서열 동일성, 96% 서열 동일성, 97% 서열 동일성, 98% 서열 동일성, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
"% 서열 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 열들 사이에서의 일치에 의해 결정되는 바와 같이 단백질, 핵산 또는 유전자 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성" (종종 "유사성"이라고도 함)은 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); 서열 Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987); 및 서열 Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992)]에 기술된 것을 포함하는 (이에 제한되지 않는) 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 테스트된 서열 사이에 최상의 일치를 부여하도록 설계되었다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공공으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 분류되어 있다. 서열 정렬 및 동일성 퍼센트 계산은 LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 제품군의 Megalign 프로그램 (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin)을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 또한 디폴트 매개변수 (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)를 갖는 Clustal 정렬 방법 (문헌 [Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989)])을 사용하여 수행될 수 있다. 관련 프로그램은 또한 GCG 프로그램 제품군 (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin); BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul, 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin); 및 Smith-Waterman 알고리즘을 통합하는 FASTA 프로그램 (Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N.Y.을 포함한다. 본 개시내용의 맥락 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우, 분석 결과는 참조된 프로그램의 "디폴트 값"을 기반으로 함을 이해할 것이다. 본원에서 사용된 "디폴트 값"은 처음 초기화될 때 소프트웨어와 함께 원래 로딩된 값 또는 매개변수의 임의의 세트를 의미할 것이다.
변이체는 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 본원에 개시된 서열에 혼성화하고 참조 서열과 동일한 기능을 제공하는 핵산 분자를 포함한다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 50% 포름아미드, 5XSSC (750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 μg/ml 변성된 절단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 42℃에서 밤새 인큐베이션한 다음 50℃에서 0.1XSSC에서 필터를 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 및 신호 검출의 엄격성의 변화는 주로 포름아미드 농도 (포름아미드의 백분율이 낮으면 엄격성이 낮아짐), 염분 조건, 또는 온도의 조작을 통해 달성된다. 예를 들어, 적당히 높은 엄격성 조건은 6XSSPE (20XSSPE=3M NaCl; 0.2M NaH2PO4; 0.02M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100 μg/ml 연어 정자 차단 DNA를 포함하는 용액에서 37℃에서 밤새 인큐베이션 한 다음; 1XSSPE, 0.1% SDS로 50℃에서 세척하는 것을 포함한다. 또한, 더 낮은 엄격성을 달성하기 위해, 엄격한 혼성화 후에 수행되는 세척을 더 높은 염 농도 (예를 들어, 5XSSC)에서 수행할 수 있다. 상기 조건의 변화는 혼성화 실험에서 배경을 억제하는 데 사용되는 대체 차단 시약의 포함 및/또는 대체를 통해 달성될 수 있다. 전형적인 차단 시약은 덴하르트 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정자 DNA, 및 상업적으로 입수 가능한 독점 제제를 포함한다. 특정 차단 시약을 포함하려면 호환성 문제로 인해 상기 기술한 혼성화 조건의 수정이 필요할 수 있다.
(xv) 예시적인 구현예.
1. 발현될 때, 키메라 항원 수용체 (CAR)는
세포외 성분; 및
세포내 성분
을 포함하고,
상기 세포외 성분은 활성화 NK 수용체 결합 도메인 및/또는 억제성 NK 수용체 결합 도메인을 포함하는, CAR.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 세포외 성분을 상기 세포내 성분에 연결하는 막횡단 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 활성화 NK 수용체 결합 도메인은 NKp30 결합 도메인, NKp44 결합 도메인, 및/또는 NKp46 결합 도메인을 포함하는, CAR.
4. 구현예 3에 있어서, 상기 NKp30 결합 도메인 항체 AZ20, 항체 A76, 항체 Z25, 항체 15E1, 항체 9G1, 항체 15H6, 항체 9D9, 항체 3A12, 항체 12D10, 항체 클론 # 210845, 항체 클론 p30-15, 또는 항체 클론 AF29-4D12의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
5. 구현예 3 또는 4에 있어서, 상기 NKp44 결합 도메인은 항체 Z231, 항체 클론 # 253415, 항체 클론 44.189, 항체 클론 1G6, 또는 항체 클론 P44-8의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
6. 구현예 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은
(A) 서열번호: 190에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 193에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 196에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; 및 서열번호: 198에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 201에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 202에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인;
(B) 서열번호: 3에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 6에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 9에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 12에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 15에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 16에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(C) 서열번호: 19에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 22에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 27에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 30에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 31에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(D) 서열번호: 33에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 36에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 39에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 42에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 45에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 46에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(E) 서열번호: 48에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 51에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 54에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 57에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 60에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 61에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(F) 서열번호: 63에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 66에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 69에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 42에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 45에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 72에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(G) 서열번호: 74에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 77에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 78에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 81에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 30에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 82에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(H) 서열번호: 84에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 87에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 90에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 93에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 96에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 97에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(I) 서열번호: 260에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 261에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 262에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 263에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 264에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 265에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 각각은 Kabat 넘버링을 따르고;
(J) 서열번호: 191에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 194에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 RYG의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 199 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, RMS의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 203 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(K) 서열번호: 4 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 7 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 10에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 13 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, YTS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 17 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(L) 서열번호: 20 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, YGS의 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 25 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 28 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, NAK 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 32 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(M) 서열번호: 34 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 37 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 40 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 43 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, YAS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 47 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(N) 서열번호: 49 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 52 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 55 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 58 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, AAT 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 62 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(O) 서열번호: 64 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 67 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 70 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 43 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, YAS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 73 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(P) 서열번호: 75 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, YSG의 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 79 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 28 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, NAK 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 83 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(Q) 서열번호: 85 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 88 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 91 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 94 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, GAS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 98 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 각각은 Chothia 넘버링에 따르고;
(R) 서열번호: 192 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 195 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 197 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 200 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, RMS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 202에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VL 도메인;
(S) 서열번호: 5 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 8 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 11 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 14 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, YTS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 18 에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(T) 서열번호: 21 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 23 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 26 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 29 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, NAK 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 31에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(U) 서열번호: 35 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 38 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 41 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 44 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, YAS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 46에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(V) 서열번호: 50 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 53 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 56 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 59 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, AAT 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 61에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(W) 서열번호: 65 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 68 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 71 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 44 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, YAS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 72에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(X) 서열번호: 76 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 23 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 80 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 29 에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, NAK 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 82에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
(Y) 서열번호: 86 에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 89 에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 92 에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 95에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, GAS 의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 97에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 각각은 IMGT 넘버링에 따르는, CAR.
7. 구현예 3 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은
(A) 서열번호: 204에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 205 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
(B) 서열번호: 99 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 100 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
(C) 서열번호: 101 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 102 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
(D) 서열번호: 103 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 104 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
(E) 서열번호: 105 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 106 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
(F) 서열번호: 107 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 108 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
(G) 서열번호: 109 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 110 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
(H) 서열번호: 111 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 112 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인; 또는
(I) 서열번호: 266에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 항원 결합 단편 및 서열번호: 267 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 항원 결합 단편
을 포함하는, CAR.
8. 구현예 3 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은
(A) 서열번호: 204에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 205에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
(B) 서열번호: 99에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 100에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
(C) 서열번호: 101에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 102에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
(D) 서열번호: 103에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 104에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
(E) 서열번호: 105에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 106에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
(F) 서열번호: 107에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 108에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
(G) 서열번호: 109에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 110에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
(H) 서열번호: 111에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 112에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인; 또는
(I) 서열번호: 266에 제시된 서열을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편 및 서열번호: 267에 제시된 서열을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편
을 포함하는, CAR.
9. 구현예 3 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은 서열번호: 206, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 서열번호: 118, 또는 서열번호: 119에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는, CAR.
10. 구현예 3 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은 서열번호: 206, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 서열번호: 118, 또는 서열번호: 119에 제시된 서열을 갖는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는, CAR.
11. 구현예 1에 있어서, 상기 억제성 NK 수용체 결합 도메인 살해 면역글로불린 수용체 (KIR) 결합 도메인 및/또는 NKG2A 결합 도메인을 포함하는, CAR.
12. 구현예 11에 있어서, 상기 KIR 결합 도메인은 서열번호: 288에 제시된 중쇄의 항원 결합 단편 및 서열번호: 289에 제시된 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
13. 구현예 11 또는 12에 있어서, 상기 KIR 결합 도메인은 항체 A210, 항체 A803g, 항체 클론 # 180704, 및 항체 클론 NKVFS1의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
14. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 인공 인간 백혈구 항원 (HLA)-E 모방체를 포함하는, CAR.
15. 구현예 14에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는: i) HLA-E 결합 신호 펩타이드; ii) 성숙한 베타-2 마이크로글로불린 (B2M); 및 iii) HLA-E 중쇄의 이종삼량체를 포함하는, CAR.
16. 구현예 15에 있어서, 상기 HLA-E 결합 신호 펩타이드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 HLA-G의 신호 펩타이드; 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 거대세포바이러스 (CMV) 또는 엡스타인-바 바이러스 (EBV)로부터의 펩타이드; 다중약물 내성-관련 단백질 7의 펩타이드; 또는 HSP60의 리더 펩타이드를 포함하는, CAR.
17. 구현예 15 또는 16에 있어서, 상기 HLA-E 결합 신호 펩타이드 서열번호: 127, 및 276-287에 제시된 서열을 포함하는, CAR.
18. 구현예 15 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLA-E 중쇄는 HLA-E 01:03 중쇄를 포함하는, CAR.
19. 구현예 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, CAR.
20. 구현예 14 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열을 갖는, CAR.
21. 구현예 11 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 모날리주맙, 항체 Z270, 항체 Z199, 항체 20D5, 또는 항체 3S9로부터 유래된 scFV인, CAR.
22. 구현예 11 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은
서열번호: 213에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 214에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 215에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 216에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 및 서열번호: 217에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 218에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인, 또는
서열번호: 290에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 291에 제시된 서열을 갖는 CDRH2 및 서열번호: 292에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 293에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 및 서열번호: 294에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 295에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 각각은 Kabat 넘버링에 따르는, CAR.
23. 구현예 11 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 219, 220, 221, 222, 또는 223에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하는, CAR.
24. 구현예 11 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 219, 220, 221, 222, 또는 223에 에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는, CAR.
25. 구현예 11 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 224, 225, 226, 227, 또는 228에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편, 및/또는 서열번호: 229에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
26. 구현예 11 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 224, 225, 226, 227, 또는 228에 제시된 서열을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편, 및/또는 서열번호: 229에 제시된 서열을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포외 성분은 태그를 추가로 포함하는, CAR.
28. 구현예 27에 있어서, 상기 태그는 His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모듈린 결합 펩타이드 (CBP) 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Myc 태그, Strep 태그, Softag 1, Softag 3, 및/또는 V5 태그로부터 선택되는, CAR.
29. 구현예 27 또는 28에 있어서, 상기 태그는 서열번호: 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 또는 168에 제시된 서열을 갖는, CAR.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포외 성분은 힌지를 추가로 포함하는, CAR.
31. 구현예 30에 있어서, 상기 힌지는 인간 Ig 힌지, KIR2DS2 힌지, 또는 CD8α 힌지를 포함하는, CAR.
32. 구현예 30 또는 31에 있어서, 상기 힌지는 CD8α 힌지인, CAR.
33. 구현예 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 힌지는 서열번호: 140에 제시된 서열을 갖는, CAR.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포외 성분은 링커를 추가로 포함하는, CAR.
35. 구현예 34에 있어서, 상기 링커는 글리신-세린 링커, IgG4 링커, 또는 CD28 링커인, CAR.
36. 구현예 34 또는 35에 있어서, 상기 링커는 서열번호: 142, 143, 144, 145, 150, 또는 151에 제시된 서열을 갖는, CAR.
37. 구현예 2 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 상기 T-세포 수용체, CD28, CD27, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, LFA-1, ICOS, 4-1BB, GITR, CD40, BAFFR, HVEM, SLAMF7, NKp80, NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDI Id, ITGAE, CD103, ITGAL, CDI Ia, ITGAM, CDI Ib, ITGAX, CDI Ic, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, DNAM1, SLAMF4, CD84, CD96, CEACAM1, CRT AM, Ly9, CD160, PSGL1, CD100, SLAMF6, SLAM, BLAME, SELPLG, LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C, 또는 이들의 조합의 α, β, 또는 ζ 사슬의 막횡단 도메인을 포함하는, CAR.
38. 구현예 2 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 CD8α 사슬의 막횡단 도메인을 포함하는, CAR.
39. 구현예 2 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 서열번호: 138에 제시된 서열을 갖는, CAR.
40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 성분은 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
41. 구현예 40에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ, 공통 FcR γ, Fc γ RIIa, FcR β, CD3 γ, CD3 δ, CD3 ε, CD79a, CD79b, DAP10, DAP12, 또는 이들의 조합을 포함하는, CAR.
42. 구현예 40 또는 41에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ을 포함하는, CAR.
43. 구현예 40 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 서열번호: 146에 제시된 서열을 갖는, CAR.
44. 구현예 40 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
45. 구현예 44에 있어서, 상기 공동자극 신호전달 도메인은 MHC 클래스 I 분자, B 및 T 세포 림프구 약화인자 (BTLA), Toll 리간드 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1, ICOS, 4-1BB, GITR, BAFFR, HVEM, SLAMF7, NKp80, NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49d, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1, SLAMF4, CD84, CD96, CEACAM1, CRTAM, Ly9, CD160, PSGL1, CD100, CD69, SLAMF6, SLAM, BLAME, SELPLG, LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 또는 이들의 조합을 포함하는, CAR.
46. 구현예 44 또는 45에 있어서, 상기 공동자극 신호전달 도메인은 4-1BB를 포함하는, CAR.
47. 구현예 44 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호: 148에 제시된 서열을 갖는, CAR.
48. 구현예 40 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 서열번호: 230에 제시된 아미노산 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 자극 도메인을 포함하는, CAR.
49. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 서열번호: 249, 251, 253, 255, 또는 257에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, CAR.
50. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 서열번호: 249, 251, 253, 255, 또는 257에 제시된 아미노산 서열을 갖는, CAR.
51. 구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 서열번호: 250, 252, 254, 256, 또는 258에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는, CAR.
52. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 서열번호: 250, 252, 254, 256, 또는 258에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는, CAR.
53. 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
54. 구현예 53에 있어서, 상기 벡터는 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 상기 CAR을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는, 벡터.
55. 구현예 54에 있어서, 상기 프로모터는 MND 프로모터인, 벡터.
56. 구현예 55에 있어서, 상기 MND 프로모터는 서열번호: 175에 제시된 서열을 갖는, 벡터.
57. 구현예 53 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 형질도입 마커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
58. 구현예 57에 있어서, 상기 형질도입 마커는 상기 CAR과 공동-발현되는, 벡터.
59. 구현예 49 또는 50에 있어서, 상기 형질도입 마커는 청색 형광 단백질 (BFP)인, 벡터.
60. 구현예 59에 있어서, 상기 BFP는 서열번호: 169, 170, 171, 172, 173, 174, 또는 236에 제시된 서열을 갖는, 벡터.
61. 구현예 57 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 형질도입 마커를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 절단가능한 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 상기 CAR을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열에 연결되는, 벡터.
62. 구현예 61에 있어서, 상기 절단가능한 펩타이드는 돼지 테스코바이러스-1 (P2A), 토세아 아사인아 바이러스 (T2A), 말 비염 A 바이러스 (E2A), 구제역 바이러스 (F2A), 포티바이러스 2A, 또는 카디오바이러스 2A를 포함하는, 벡터.
63. 구현예 61 또는 62에 있어서, 상기 절단가능한 펩타이드는 서열번호: 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 또는 240에 제시된 서열을 갖는, 벡터.
64. 구현예 53 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 분자 안전 스위치를 추가로 포함하는, 벡터.
65. 구현예 64에 있어서, 상기 분자 안전 스위치는 자살 유전자를 포함하는, 벡터.
66. 구현예 65에 있어서, 상기 자살 유전자는 유도성-카스파제-9 (iCASP9), 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK), 또는 절단된 상피 성장 인자 수용체 (tEGFR)를 포함하는, 벡터.
67. 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포.
68. (a) 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR; 및 (b) 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR을 공동-발현하도록 유전적으로 변형된 세포.
69. (a) 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR; 및 (b) CAR 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하고 세포내 성분에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR을 공동-발현하도록 유전적으로 변형된 세포.
70. 구현예 68 또는 69에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 인간 백혈구 항원 (HLA)-E 또는 인공 HLA-E 모방체를 포함하는, 세포.
71. 구현예 53 내지 66 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 세포.
72. 구현예 67 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 또는 조혈 전구 세포 (HPC)인, 세포.
73. 구현예 67 내지 72 중 어느 하나의 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제형.
74. NK 세포의 제1 집단에서 활성화 NK 수용체 및/또는 억제성 NK 수용체를 발현하는 자연 살해 (NK) 세포를 고갈시키는 방법으로서,
구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR을 발현하기 위해 유전적으로 변형된 세포의 제2 집단에 상기 세포의 제1 집단을 노출시키는 단계를 포함하고,
상기 노출시키는 단계는 상기 제1 집단에서 NK 세포의 고갈을 초래하는, 방법.
75. 구현예 74에 있어서, 상기 노출시키는 단계는 상기 세포의 제1 집단을 갖는 대상체에게 CAR 발현 세포의 상기 제2 집단을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
76. NK 세포를 발현하는 NKp46을 포함하는 세포의 제1 집단에서 활성화 수용체 NKp46을 발현하는 자연 살해 (NK) 세포를 고갈시키는 방법으로서,
(a) 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR; 및
(b) 상기 세포외 성분이 NKG2A 수용체 결합 도메인을 포함하는 CAR
을 공동-발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 제2 집단에 상기 세포의 제1 집단을 노출시키는 단계를 포함하고,
상기 노출시키는 단계는 상기 제1 집단에서 NK 세포를 발현하는 NKp46의 고갈을 초래하는, 방법.
77. NK 세포를 발현하는 NKp46을 포함하는 세포의 제1 집단에서 활성화 수용체 NKp46을 발현하는 자연 살해 (NK) 세포를 고갈시키는 방법으로서,
(a) 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR; 및
(b) 세포외 성분이 NKG2A 수용체 결합 도메인을 포함하고, 세포내 성분에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR
을 공동-발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 제2 집단에 상기 세포의 제1 집단을 노출시키는 단계를 포함하는, 방법.
78. 구현예 76 또는 77에 있어서, 상기 노출시키는 단계는 상기 세포의 제1 집단을 갖는 대상체에세 CAR 발현 세포의 상기 제2 집단을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
79. 구현예 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 인간 백혈구 항원 (HLA)-E 또는 인공 HLA-E 모방체를 포함하는, 방법.
80. 구현예 79에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는: i) HLA-E 결합 신호 펩타이드; ii) 성숙한 베타-2 마이크로글로불린 (B2M); 및 iii) HLA-E 01:03 중쇄의 이종삼량체를 포함하는, 방법.
81. 구현예 80에 있어서, 상기 HLA-E 결합 신호 펩타이드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 HLA-G의 신호 펩타이드; 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 거대세포바이러스 (CMV) 또는 엡스타인-바 바이러스 (EBV)로부터의 펩타이드; 다중약물 내성-관련 단백질 7의 펩타이드; 또는 HSP60의 리더 펩타이드를 포함하는, 방법.
82. 구현예 80 또는 81에 있어서, 상기 HLA-E 결합 신호 펩타이드 서열번호: 127, 및 276-287에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
83. 구현예 79 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
84. 구현예 79 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열을 갖는, 방법.
85. 구현예 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 모날리주맙, 항체 Z270, 항체 Z199, 항체 20D5, 또는 항체 3S9로부터 유래된 scFV인, 방법.
86. 구현예 76 내지 78, 및 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은
서열번호: 213에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 214에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 215에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 216에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 및 서열번호: 217에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 218에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인, 또는
서열번호: 290에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 291에 제시된 서열을 갖는 CDRH2 및 서열번호: 292에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 293에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 및 서열번호: 294에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 295에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 각각은 Kabat 넘버링에 따르는, 방법.
87. 구현예 76 내지 78, 85, 및 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 219, 220, 221, 222, 또는 223에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하는, 방법.
88. 구현예 76 내지 78, 및 85 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 219, 220, 221, 222, 또는 223에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는, 방법.
89. 구현예 76 내지 78, 및 85 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 224, 225, 226, 227, 또는 228에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편, 및/또는 서열번호: 229에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
90. 구현예 76 내지 78, 및 85 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 224, 225, 226, 227, 또는 228에 제시된 서열을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편, 및/또는 서열번호: 229에 제시된 서열을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
91. 구현예 76 내지 90 중 어느 하나에 있어서, CAR 발현 세포에서 상기 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR의 발현은 NKp46 발현 NK 세포에 의한 살해에 대해 상기 CAR 발현 세포에 내성을 부여하는, 방법.
92. 자연 살해 (NK) 세포 관련 질환 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,
구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 제형의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하여,
상기 NK 세포 관련 질환 또는 상기 대상체에서 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
93. 구현예 92에 있어서, 상기 NK 세포 관련 질환은 NK 세포 악성종양인, 방법.
94. 구현예 93에 있어서, 상기 NK 세포 악성종양은 미성숙한 NK 세포 신생물, 무과립 CD4+/CD56+ 조혈 신생물, CD94 1A+/TCR- 림프모구 림프종/백혈병 (LBL), 골수/NK 세포 급성 백혈병, 성숙한 NK 세포 신생물, 림프절외 NK 세포 림프종, 비강 유형, 공격적 NK 세포 백혈병, 및 만성 NK 세포 림프구증가증을 포함하는, 방법.
95. 구현예 92 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에게 항-바이러스 치료 또는 예방을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
96. 구현예 95에 있어서, 상기 항-바이러스 치료는 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 감염을 치료하는, 방법.
97. 구현예 95 또는 96에 있어서, 상기 항-바이러스 치료는 아시클로버, 발라시클로버, 팜시클로버, 간시클로버, 및/또는 발간시클로버로부터 선택된 뉴클레오시드 유사체를 포함하는, 방법.
98. 구현예 92에 있어서, 상기 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환은 비정상적인 NK 수용체 발현을 갖는 비-NK 세포 악성종양을 포함하는, 방법.
99. 구현예 98에 있어서, 상기 질환은 세자리 증후군, 성숙한 T 세포 신생물, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 및 ALK+ 역형성 대세포 림프종을 포함하는, 방법.
100. 구현예 92에 있어서, 상기 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환은 감염을 포함하는, 방법.
101. 구현예 100에 있어서, 상기 감염은 만성인, 방법.
102. 구현예 100 또는 101에 있어서, 상기 감염은 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충, 및/또는 절지동물인, 방법.
103. 구현예 100 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 감염은 스타필로코커스 종 (Staphylococcus spp.), 스트렙토코커스 종 (Streptococcus spp.), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile), 대장균 (Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 살모넬라 (Salmonella), 비브리오 (Vibrio), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 나이세리아 고노르호애 (Neisseria gonorrhoeae) 및 트레코포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 리노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 코로나바이러스, 단순 포진 바이러스-1 (HSV-1), 수두 대상포진 바이러스 (VZV), A형 간염, 노로바이러스, 로타바이러스, 인유두종바이러스 (HPV), B형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 단순 포진 바이러스-2 (HSV-2), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 엔테로바이러스, C형 간염, 인간 T-림프영양성 바이러스-1 (HTLV-1), 메르켈 세포 폴리오마바이러스 (MCV), HHV8 (카포시 육종), 트리코피톤 종 (Trychophyton spp.) 및 칸디다 종 (Candida spp.), 지아디아, 톡소플라스마증, E. 베르미큘라리스 , 트리파노소마 크루지 , 에키노코쿠스증 , 낭포충증 , 톡소카리아증, 트리코모나스증, 아메바증, 캘리포니아 뇌염, 치쿤구니야, 뎅기열, 동부 말 뇌염, 포와산, 세인트루이스 뇌염, 웨스트 나일, 황열병, 지카, 라임병, 및/또는 바베시아증에 의해 유발되거나 이들을 포함하는, 방법.
104. 구현예 92에 있어서, 상기 제형은 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는, 방법.
105. 구현예 104에 있어서, 상기 NK 세포 관련 질환은 암인,방법.
106. 구현예 105에 있어서, 상기 암은 방광, 두경부, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 또는 피부의 암종; 편평 세포 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병; 급성 림프모구성 백혈병; B 세포 림프종; T 세포 림프종; 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종; 모발 세포 림프종; 버킷 림프종; 급성 골수성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 전골수구성 백혈병; 섬유육종; 횡문근육종; 골육종; 신경모세포종; 신경교종; 성상세포종; 신경초종; 흑색종; 색소성 건피증; 각화극세포종; 정상피종; 갑상선 여포암; 기형암종; T-전림프구성 백혈병 (T-PLL); T 세포 유형의 거대 과립 림프구 백혈병 (LGL); 세자리 증후군 (SS); adult T 세포 백혈병 림프종 (ATLL); 간비장 T 세포 림프종; 말초/흉선후 T 세포 림프종; 혈관면역모세포성 T 세포 림프종; 혈관중심성 (비강) T 세포 림프종; 역형성 (Ki 1+) 대세포 림프종; 장 T 세포 림프종; 및/또는 T-림프모구 림프종 /백혈병 (T-Lbly/T-ALL)을 포함하는, 방법.
107. 구현예 92 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에서 NKG2A 억제성 수용체를 발현하는 상기 NK 세포의 양은 제형을 투여하기 전 또는 이를 필요로 하는 참조 집단에서 제형을 투여하지 않은 대상체에서 NKG2A 억제성 수용체를 발현하는 NK 세포의 양과 비교하여 감소되는, 방법.
108. 자연 살해 (NK) 세포 관련 질환 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,
제형의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
상기 제형은
(a) 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 제1 집단; 및
(b) 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 제2 집단
의 세포를 포함하는, 방법.
109. 자연 살해 (NK) 세포 관련 질환 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,
제형의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,,
상기 제형은
(a) 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 제1 집단; ; 및
(b) 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하고 세포내 성분에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 제2 집단
의 세포를 포함하는, 방법.
110. 자연 살해 (NK) 세포 관련 질환 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,:
제형의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,,
상기 제형의 세포는
(a) 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR; 및
(b) 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR
을 공동-발현하는, 방법.
111. 자연 살해 (NK) 세포 관련 질환 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,
제형의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
상기 제형의 세포는
(a) 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 CAR; 및
(b) 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하고 세포내 성분에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR
을 공동-발현하는, 방법.
112. 구현예 108 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에게 항-바이러스 치료 또는 예방을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
113. 구현예 112에 있어서, 상기 항-바이러스 치료는 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 감염을 치료하는, 방법.
114. 구현예 112 또는 113에 있어서, 상기 항-바이러스 치료는 아시클로버, 발라시클로버, 팜시클로버, 간시클로버, 및/또는 발간시클로버로부터 선택된 뉴클레오시드 유사체를 포함하는, 방법.
115. 구현예 108 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 인간 백혈구 항원 (HLA)-E 또는 인공 HLA-E 모방체를 포함하는, 방법.
116. 구현예 115에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 i) HLA-E 결합 신호 펩타이드; ii) 성숙한 베타-2 마이크로글로불린 (B2M); 및 iii) HLA-E 01:03 중쇄의 이종삼량체를 포함하는, 방법.
117. 구현예 116에 있어서, 상기 HLA-E 결합 신호 펩타이드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 HLA-G의 신호 펩타이드; 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 거대세포바이러스 (CMV) 또는 엡스타인-바 바이러스 (EBV)로부터의 펩타이드; 다중약물 내성-관련 단백질 7의 펩타이드; 또는 HSP60의 리더 펩타이드를 포함하는, 방법.
118. 구현예 116 또는 117에 있어서, 상기 HLA-E 결합 신호 펩타이드 서열번호: 127, 및 276-287에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
119. 구현예 115 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는, 방법.
120. 구현예 115 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열을 갖는, 방법.
121. 구현예 108 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 모날리주맙, 항체 Z270, 항체 Z199, 항체 20D5, 또는 항체 3S9로부터 유래된 scFv인, 방법.
122. 구현예 121에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은
서열번호: 213에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 214에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 215에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 216에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 및 서열번호: 217에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 218에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인, 또는
서열번호: 290에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 291에 제시된 서열을 갖는 CDRH2 및 서열번호: 292에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 293에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 및 서열번호: 294에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 295에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 각각은 Kabat 넘버링에 따르는, 방법.
123. 구현예 121 또는 122에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 219, 220, 221, 222, 또는 223에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하는, 방법.
124. 구현예 121 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 219, 220, 221, 222, 또는 223에 에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는, 방법.
125. 구현예 121 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 224, 225, 226, 227, 또는 228에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편, 및/또는 서열번호: 229에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
126. 구현예 121 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 224, 225, 226, 227, 또는 228에 제시된 서열을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편, 및/또는 서열번호: 229에 제시된 서열을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
127. 구현예 108 내지 126 중 어느 하나에 있어서, CAR 발현 세포에서 상기 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR의 발현은 상기 NK 세포 관련 질환에서 NK 세포에 의한 살해에 대해 상기 CAR 발현 세포에 내성을 부여하는, 방법.
128. 구현예 108 내지 127 중 어느 하나에 있어서, CAR 발현 세포에서 상기 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR의 발현은 상기 대상체에 의한 상기 CAR 발현 세포의 거부반응을 감소시키는, 방법.
129. 구현예 108 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 NK 세포 관련 질환은 자가면역 질환 또는 동종면역 질환인, 방법.
130. 구현예 129에 있어서, 상기 자가면역 질환은 쇼그렌병; 항인지질 증후군; 심상성 천포창; 척추관절병증; 건선을 포함한 피부 질환; 다발성 경화증; 전신 경화증; 제1형 당뇨병; 소아 특발성 관절염; 류마티스 관절염; 염증성 장 질환; 자가면역 간 질환; 및/또는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 포함하는, 방법.
131. 구현예 129에 있어서, 상기 동종면역 질환은 태아/신생아 동종면역 저혈소판증 (FNAIT); 조혈 줄기 세포 거부반응; 고형 조직 이식 거부반응; 및/또는 신장 이식 후 만성 동종이식 손상을 포함하는, 방법.
132. 구현예 108 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에서 상기 NKp46 활성화 수용체를 발현하는 상기 NK 세포의 양은 상기 제형을 투여하기 전 또는 이를 필요로 하는 참조 집단에서 제형을 투여하지 않은 대상체에서 NKp46 활성화 수용체를 발현하는 NK 세포의 양과 비교하여 감소되는, 방법.
133. 구현예 1 내지 52 중 어나 하나의 CAR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 구현예 53 내지 66 중 어느 하나의 벡터; 및/또는 구현예 67 내지 72 중 어느 하나의 세포를 포함하는, 키트.
134. 구현예 133에 있어서, 상기 벡터를 생성하기 위한 세포를 추가로 포함하는, 키트.
135. 구현예 133 또는 134에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 키트.
136. 구현예 134에 있어서, 상기 벡터를 생성하기 위한 상기 세포는 293 세포, 293T 세포, 및/또는 A549 세포를 포함하는, 키트.
137. 구현예 133 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 배지, 피브로넥틴-코팅된 플레이트, 헥사디메트린 브로마이드 (폴리브렌), 리포펙타민, 인공 제시 세포, 성장 인자, 및/또는 항체를 추가로 포함하는, 키트.
(xvi) 예시적인 실시예. 실시예 1. 이 실시예는 NKp46에 결합하는 세포외 결합 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형된 T 세포를 갖는 자연 살해 (NK) 세포 상의 활성화 NK 수용체인 NKp46을 표적화하는 것을 기술한다. 이 실시예 및 도 2a에 기술된 CAR의 서열은 서열번호: 127, 130, 133, 136, 138, 140, 142, 143, 146, 148, 190, 193, 196, 198, 201, 202, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 및 258에 기재된 서열을 포함한다.
NK/T 세포 림프종 및 공격적 NK 세포 백혈병을 포함하는 NK 세포 신생물은 희귀 악성종양이다. 발병률은 미국에서 1,000,000명당 0.8명이며 남미와 아시아에서 3 내지 10배 더 높다. 전체 평균 생존 기간이 17 내지 20개월로 높은 사망률이 관찰되지만, 재발성/난치성 NK/T 림프종 및 공격적 NK 세포 백혈병의 경우 훨씬 더 심각하다. 이러한 악성종양은 일반적으로 엡스타인-바 바이러스 (EBV)와 관련이 있다. 이 문제를 해결하기 위해, CAR T 세포는 NK 세포 악성종양을 대상으로 개발되었다. 그러나, NK 세포는 NK 세포에 고유한 균일하게 발현되는 세포 표면 수용체를 발현하지 않는다. NKp46은 많은 NK 세포 서브세트에 의해 광범위하게 발현되는 활성화 NK 수용체이다. 보고에 따르면 NKp46은 NK 세포 악성종양의 90%에서 발현된다. 이 연구는 CAR T 세포로 NKp46의 표적화를 보여준다.
방법: 항-NKp46 항체를 scFv 서열로 합성하고 공동자극 도메인으로서 4-1BB를 함유하는 렌티바이러스 (LV) CAR 백본 및 다운스트림 청색 형광 단백질 (BFP) 리포터에 클로닝하였다 (도 2a-2c). 1차 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 CD3/CD28로 자극하고, 항-NKp46 CAR LV로 형질도입하고 확장시켰다. CAR T 세포를 NKp46으로 형질도입된 K-562 세포와 혼합하였다. 달리 명시되지 않는 한 2:1의 이펙터 대 표적 비율을 사용하였다. CAR T 세포 기능은 유세포 분석에 의해 평가하였다. CAR T 세포는 BFP 발현에 의해 식별하였다. CAR T 세포 활성화는 세포 표면 CD137의 발현 및 세포내 사이토카인 발현에 의해 평가하였고 CD19 CAR T 세포와 비교하였다. NKp46-발현 K562 세포 및 1차 NK 세포의 살해 또한 유세포 분석에 의해 평가하였다.
결과: 항-NKp46 CAR T 세포는 3명의 다른 공여자로부터 만들어졌다. 3명의 공여자에 걸친 BFP+ CAR T 세포의 백분율은 56%의 중앙값 (범위 53-65%; 도 2c)이었다. NKp46+ 표적 세포에 노출되었을 때, CD137을 발현하는 CAR T (BFP+) 세포의 백분율은 동일한 NKp46+ 표적 세포와 혼합된 CD19 CAR T 세포와 비교하여 중앙값이 5배(4 내지 6배 범위) 증가하였다 (도 3a, 3b). 유사하게, 세포내 IL-2, TNF-α, 및 IFN-γ 발현을 갖는 항-NKp46 CAR T 세포의 백분율은 NKp46+ 표적 세포와 혼합된 CD19 CAR T 세포에 비해 중앙값이 10.5배 (10- 내지 11배 범위), 11배 (9- 내지 13배 범위), 및 9배 (7- 내지 11배 범위) 증가하였다 (도 4a, 4b). CD19+ 표적 세포와 혼합될 때 항-CD19 CAR T 세포에서의 활성화는 항-NKp46 CAR T 세포와 유사한 CD137 활성화 및 사이토카인 발현을 나타내었다. 24시간 동안 혼합했을 때, 항-NKp46 CAR T 세포는 NKp46+ K562 세포의 백분율을 70%까지 감소시킬 수 있었다 (도 5). 항-NKp46 CAR T 세포는 또한 1차 자가 NK 세포를 효과적으로 고갈시켰다. 항-CD19 CAR T 세포는 NKp46+ 세포를 고갈시키지 않았다.
항-NKp46 CAR T 세포를 NK 세포 (40-50% NK 세포)가 농축된 자가 표적 세포와 2:1 비율로 혼합하고 6시간 후 유세포 분석으로 평가하였다. CD137 발현은 BFP를 발현하는 단일의 살아있는 CD3+ 림프구에 대한 게이팅에 의해 항-NKp46 CAR T 세포에서 측정하였다. 항-NKp46 CAR T 세포 상에서의 CD137 발현의 상향조절에 의해 측정된 바와 같이 자가 NK 세포와 혼합되었을 때 항-NKp46 CAR T 세포가 활성화되었음을 관찰하였다 (도 6).
자가 표적 NK 세포를 농축하고 세포 트래커로 염색한 다음 항-NKp46 CAR T 세포, 대조군 CAR T 세포 (항-CD19 CAR T 세포), 또는 mock T 세포와 2 CAR 대 1 표적 세포 비율로 24시간 동안 혼합한 다음 유세포 분석으로 평가하였다. NK 세포는 CD3 음성 세포 트래커 오렌지 세포에 대한 게이팅에 의해 정량화되었다. 항-NKp46 CAR T 세포가 자가 표적 NK 세포를 살해하는 것으로 관찰되었다 (도 7). 항-NKp46 CAR T 세포의 존재 하에서, NK 세포의 백분율은 항-NKp46 CAR T 세포의 존재 하에서 72% 감소한 반면, 대조군 CAR T 세포 (항-CD19 CAR)의 존재 하에서는 9%만 감소하였다.
NK 세포가 농축된 자가 표적 세포를 항-NKp46 CAR T 세포와 2 CAR 세포:1 표적 세포 비율로 24시간 동안 혼합하고 유세포 분석으로 세포내 사이토카인 발현에 대해 평가하였다. 자가 표적 NK 세포가 항-NKp46 CAR T 세포와의 접촉에 의해 활성화되었음을 관찰하였다 (도 8). NK 세포에 대한 게이팅은 NK 세포가 항-NKp46 CAR T 세포와 혼합되었을 때 사이토카인 발현이 증가했지만 NK 세포가 모의 T 세포 또는 항-CD19 CAR T 세포와 혼합되었을 때 증가하지 않았음을 입증하였다. IFN-γ 또는 TNF-α를 발현하는 NK 세포의 백분율은 2-3배 증가한 반면 IL-2는 증가하지 않는 것으로 보였다. IFN-γ 또는 TNF-α는 전형적으로 활성화된 NK 세포에 의해 생성되는 사이토카인이다.
항-NKp46 또는 항-CD19 CAR T 세포를 자가 NK 세포와 홉합하고 6시간에 유세포 분석으로 평가하였다. 자가 NK 세포를 세포 트래커에 로딩하여 표적 세포의 분화를 도왔다. The CAR T 세포는 세포 트래커 음성 세포 (비-표적), CD3+ (비-NK 세포), 및 BFP (CAR+ 세포)에 대한 게이팅에 의해 평가되었다. 플롯은 측면 산란 (SSC) 대 BFP를 보여준다. 자가 표적 NK 세포가 항-NKp46 CAR T 세포를 살해하는 것으로 관찰되었다 (도 9). BFP+ 항-NKp46 CAR T 세포의 백분율은 자가 표적 NK 세포의 존재 하에 35% (10.2%에서 6.6%로) 감소한 반면 (상단 패널), BFP+ 항-CD19 CAR T 세포의 백분율은 자가 NK 세포의 존재하에 감소하지 않았다 (하단 패널). 항-NKp46 CAR T 세포의 감소는 대부분의 BFP를 발현하는 세포에서 가장 현저한 것으로 보인다.
강력한 scFv-기반의 2세대 항-NKp46 CAR이 개발되어 세포에서 발현되었다. 항-NKp46 CAR T-세포는 기능적이며 강력하고 특이적인 활성화, 염증성 사이토카인 방출, 및 NKp46 수용체를 발현하도록 변형된 표적 세포 및 자가 1차 NK 세포에 대한 세포 살해를 나타낸다. 이 접근법은 생체 내에서 NK 세포를 실질적으로 고갈시킬 수 있다. 위험은 줄기 세포 이식 동안 수행되는 것과 유사한 항-바이러스 예방으로 단기적으로 관리될 수 있다. 항-NKp46 CAR T 세포를 조절하는 기술 또는 줄시 세포 이식과 항-NKp46 CAR T-세포 요법을 통합하는 기술은 장기적으로 생체내에서 NK 세포의 고갈을 해결할 수 있는 잠재적인 방법이다.
실시예 2. 이 연구는 NKp46 (CD335) 및 NKG2A (CD159a)를 표적으로 하는 2개의 별개의 항-NK 세포 CAR을 발현하는 T 세포가 NKp46를 발현하도록 조작된 세포, NK 세포 림프종 세포주, 및 자가 1차 NK 세포에 대해 특이적이고 강력한 세포독성 활성을 가짐을 입증한다. 이 연구는 CAR T 세포 요법이 NK 세포 악성종양을 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다
키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법은 특정 난치성 혈액 악성종양의 치료에 돌파구를 마련하였다 (문헌 [Brentjens 등 Sci. Transl. Med. 5, 177ra38-177ra38 (2013); Maude 등 N. Engl. J. Med. 371, 1507-1517 (2014)]). CAR T 세포의 선택적 압력으로부터의 항원 탈출이 기술되어 있으며 다중 에피토프를 표적으로 하는 다양한 전략에 동기를 부여하였다 (문헌 [Shah 등 Front. Oncol. 9, (2019)]). 다중 에피토프 접근법에 대한 추가 지원을 지원하면서 NK 세포를 표적으로 하는 특정한 장애물은 독특하고 균일하게 발현되는 NK 세포 표면 수용체가 결여되어 있다는 것이다. NKp46은 NK 세포 악성종양의 대다수 (80%)에서 발현되는 활성화 수용체이다 (문헌 [Freud 등 Am. J. Clin. Pathol. 140, 853-866 (2013)]). NKG2A는 NK 세포 종양의 주요 서브세트를 포함하는 대부분의 CD3-CD56bright NK 세포에서 발현되는 억제성 수용체이다 (문헌 [Lima, M. Pathology (Phila.) 47, 503-514 (2015)]). 따라서, NKp46 (CD335) 및 NKG2A (CD159a)를 표적으로 하는 2개의 별개의 항-NK 세포 CAR이 개발되었으며, 둘 다 동일한 4-1BB/CD3ζ 2세대 CAR 작제물로부터 유래되었고, 이들의 비활성은 시험관내에서 테스트되었다.
재료 및 방법. CAR 작제물 및 바이러스 벡터. 감마 레트로바이러스-유래된 MND 프로모터 및 mTagBFP 리포터를 함유하는 대조군 αCD19 CAR pRRL 벡터는 이전에 기술된 바 있다 (문헌 [Sather 등 Sci. Transl. Med. 7, 307ra156 (2015)]). MND 프로모터와 mTagBFP 리포터 사이에 위치한 CAR 작제물은 CD8a 힌지 및 막횡단 도메인에 융합된 항-CD19 scFv을 포함하고, 이어서 세포내 4-1BB 공동-자극 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. CAR 및 mTagBFP 리포터는 T2A 자기-절단 단백질에 의해 분리된다. αNKp46 CAR을 형성하기 위해, Innate Pharma S.A.에서 개발한 NKp46을 표적으로 하는 항체로부터 scFv를 합성하였다 (αNKp46 scFv은 본원에 개시된 바와 같이 서열번호: 206에 제시된 서열을 포함하고/하거나 서열번호: 248에 제시된 서열에 의해 암호화된다). scFv 코딩 서열을 IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)에 의해 합성하고 이후에 대조군 벡터로부터 항-CD19 scFv를 대체하기 위해 클로닝하였다. αNKp46 CAR은 본원에 개시된 바와 같이 서열번호: 249에 기재된 바와 같고/같거나 서열번호: 250에 제시된 서열에 의해 암호화된다. αNKG2A CAR을 형성하기 위해, 이전에 기술된 HLA-E/B2M/G-펩타이드 삼량체를 암호화하는 서열 (문헌 [Gornalusse 등 Nat. Biotechnol. 35, 765-772 (2017)])을 마찬가지로 IDT에 의해 합성하고 항-CD19 mTagBFP CAR 작제물의 scFv, CD8 힌지 및 막횡단 도메인 대신에 클로닝하였다. HLA-E/B2M/G-펩타이드 삼량체는 서열번호: 242에 제시된 서열을 포함하고/하거나 서열번호: 243에 제시된 서열에 의해 암호화된다. αNKG2A CAR은 서열번호: 251에 제시된 서열을 포함하고/하거나 서열번호: 252에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
NKp46-발현 K562 세포주는 Sino Biologics (NCBI Ref Seq BC064806)로부터 얻은 NKp46 재조합 DNA를 sEF1a 프로모터의 다운스트림 및 mCherry 단백질의 바로 업스트림의 pCVL 백본으로 증폭 및 클로닝함으로써 생성되었다. K562 세포를 형질도입한 다음 자성 비드 분리에 의해 농축시켰다. 렌티바이러스 생성 전에, 모든 새로운 벡터는 제한 분해 및 시퀀싱 둘 모두에 의해 검증되었다. 대조군으로서 사용된 GFP+ CD19-발현 K562 세포는 pRRL-MND-CD19-GFP LV 벡터를 사용하여 형질도입되었다.
1차 세포, 세포주 배양. 1차 T 및 NK 세포는 익명의 헌혈자로부터 획득하였다. PBMC는 이전에 Seattle Children's Center for Global Infectious Disease (Seattle Children's Research Institute's Institutional Review Board의 승인을 받음)의 공여자로부터 분리되거나 Astarte Biologics (Bothell, WA)로부터 구입한 동결보존 PBMC이었다. 인간 Pan T 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 음성 분리를 통해 T 세포를 분리하였다. T 세포 및 PBMC를 20% 태아 소 혈청 (Gibco, Waltham, MA), 1x 20mM GlutaMAX 보충제 (Gibco), 1x 1M N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에타술폰산 (HEPES) (Gibco), 55μM 2-메르캅토에탄올 (Gibco), 및 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)이 보충된 RPMI-1640으로 제조된 T 세포 배지에서 배양하였다. T 세포는 특히 50 ng/mL의 IL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ), 및 5 ng/mL의 IL-7 (Peprotech) 및 IL-15가 보충된 T 세포 배지에서 확장되었다. 세포는 1-1.5 x 106 세포/mL로 유지되었고 1-2일마다 확장되었다. PBMC 또는 T 세포는 10% 디메틸 설폭사이드 T 세포 배지에서 동결보존되었다.
공동-배양에 사용된 1차 NK 세포는 5% AB 혈청, 500 IU/mL IL-2 및 140 IU/mL IL-15가 4-5 x 105 세포/mL로 보충된 NK MACS 배지 (Miltenyi Biotec)에서 PBMC로부터 직접 확장되고 NK 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 사용하기 전에 음성 선택을 통해 농축되었다. NK-92MI 세포는 ATCC에서 구입하여 권장되는 대로 배양하였다. ATCC로부터의 K562 세포는 10% 태아 소 혈청, 1x 20mM GlutaMAX 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 5-8 x 105로 유지되었다. 모든 세포 유형은 37℃ 5% CO2에서 배양하였다.
CAR 벡터로 1차 T 세포의 렌티바이러스 (LV) 형질도입. T 세포를 CD3/CD28 활성화제 비드 (Gibco Dynabeads)로 1:1 비율로 48시간 동안 자극하였다. 이어서 세포를 세척하고 2-4 x 104 MOI에서 CAR LV로 형질도입하기 전에 확장 T 세포 배지에서 24-48시간 동안 휴지시켰다. 각각의 형질도입을 위해, 세포를 4 μg의 폴리브렌 (Sigma-Aldrich)이 보충된 T 세포 배지에서 2 x 106 세포/mL의 밀도로 시딩하였다. 12시간 후, 배지를 첨가하여 농도를 1 x 106 세포/mL로 조정하였다. 최적의 밀도를 유지하기 위해 세포를 더 큰 배양 용적으로 점진적으로 확장하였다. 형질도입 효율은 형질도입 5-7일 후 BFP 발현의 유세포 분석 평가에 의해 측정되었고, 세포는 형질 도입 7-9일 후 공동-배양 실험에 사용하였다. 동일한 방법을 사용하여 표적 K562-NKp46 세포주를 생성하였다.
표면 CD137 및 세포내 사이토카인 발현 및 세포독성 검정. αNKp46 및 αNKG2A CAR T 세포 활성화 및 NKp46-발현 K562s 및 1차 자가 NK 세포에 대한 세포독성 활성을 결정하기 위해 3개의 검정을 수행하였다. CAR T 세포 활성화는 CD137 표면 발현 및 세포내 사이토카인 발현을 통해 결정되었으며, 세포독성은 세포 트래커 오렌지 또는 그린 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)으로 미리 염색된 표적 세포의 백분율 감소를 측정함으로써 결정되었다. NKp46-발현 K562 세포, 1차 NK 세포, 및 NK92 세포에 대한 CAR T 세포 CD137 발현을 결정하기 위해 αNKp46 CAR T 세포, αNKG2A, 또는 대조군 αCD19 CAR T 세포를 37℃에서 24h (K562 표적) 또는 6h (NK 세포 표적) 동안 2:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비율로 표적과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척하고, 모두 BioLegend (San Diego, CA)로부터의 생존력 (Live/Dead), CD3 (HIT3A 또는 OKT3), NKp46 (E3), 및 CD137 항체 (4B4-1)에 대해 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. NKp46-발현 K562 및 1차 NK 세포에 대한 세포내 사이토카인 발현을 결정하기 위해, αNKp46 CAR T 세포 또는 대조군 αCD19 CAR T 세포를 37℃에서 6h 동안 2:1 E:T 비율로 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 배양 1시간 후, 1000x GolgiPlug 단백질 수송 억제제 (BD Biosciences, San Jose, CA)를 공동-배양물에 첨가하여 사이토카인 수송을 차단하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 생존력 및 CD3에 대해 염색하고, 고정 및 투과화하고, IL-2 (MQ1-17H12), TNFα (Mab11) 및 IFNγ (B27)에 대해 염색하고, 마지막으로 유세포 분석으로 분석하였다.
αNKp46 및 αNKG2A CAR 세포독성, NKp46-발현 K562를 포착하는 검정에서, 1차 NK 세포를 2.5 μM 세포트래커 오렌지 또는 그린 (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 표지하고 표지된 E:T 비율로 이펙터 세포에 첨가하였다. 공동-배양 24h 후, 세포를 세척하고, 생존력, CD3 및/또는 NKp46에 대해 염색하였다. 퍼센트 표적 용해는 [(표적 세포 단독의 % 표적 세포 - 이펙터가 있는 % 표적 세포) / 이펙터가 있는 % 표적 세포 x 100]으로 계산되었다.
1차 NK 세포를 포함하는 모든 검정에 대해, T 세포-함유 NK MACS 배양물에서 2:1의 최종 이펙터 대 NK 세포 비율이 되도록 표적을 이펙터 세포 (CAR T 세포)에 첨가하였다. 활성화 검정에서는 공동-배양 당 2 x 105 CAR T 세포를 시딩하였다. 세포독성 검정에서는 CAR T 세포는 0.5:1에서 5:1로 증가하는 E:T 비율에서 5 x 104 표적 세포로 첨가되었다. 모든 공동-배양은 37 ℃에서 1 x 106 세포/mL의 밀도로 플레이팅되었다.
분석 및 통계. 모든 유세포 분석은 BD LSR II에서 수행하였다. 세포 분류는 BD FACSMelody에서 수행하였다. 모든 데이터는 FlowJo에서 분석하였다. 모든 통계학적 분석은 GraphPad 소프트웨어 (8.4.2s)를 사용하여 수행하였다.
결과. CAR 설계 및 CAR T 세포 생성. 항-NKp46 (αNKp46) 및 항-NKG2A (αNKG2A) CAR의 개략도는 도 10a 및 10b에 도시되어 있다. 이 연구에서 테스트된 모든 CAR 작제물은 다운스트림 T2A-절단 BFP 리포터를 함유하였다. BFP 발현은 αNKp46, αNKG2A, 및 대조군 αCD19 CAR 작제물의 형질도입 5-9일 후에 관찰되었다 (도 10c). Mock T 세포는 LV를 받지 않았고 BFP를 발현하지 않았다.
αNKp46 CAR T 세포는 NKp46-발현 K562 세포에 대해 강력하게 활성화하고 살해한다. 광범위하게 특성화되고 접근 가능한 유일한 NK 림프종 세포주인 NK92는 높은 수준의 NKG2A+를 발현하지만 상대적으로 낮은 수준의 NKp46을 발현한다 (도 12c). 따라서, αNKp46 CAR T 세포는 먼저 NKp46 수용체를 발현하도록 변형된 골수 세포주 K562에 대해 테스트되었다. αCD19 CAR T 세포 및 CD19+ K562 세포를 각각 음성 대조군 이펙터 및 표적으로 사용하였다. 각각의 표적 세포주는 유세포 분석에 의해 각각의 표적 항원의 거의 균질한 표면 발현을 갖는 것으로 결정되었다 (도 11a).
αNKp46 CAR T 세포 활성화는 세포-표면 CD137 및 세포내 IL-2, TNFα, 및 IFNγ 발현의 척도로 평가하였다. αNKp46 CAR T 세포를 NKp46+, CD19+, 또는 비-형질도입 (NT) K562 세포와 24시간 (CD137) 또는 6시간 (사이토카인)동안 2:1의 이펙터 대 표적 비율 (E:T)로 혼합하였다. 대조군 αCD19 CAR T 세포와 비교하여, αNKp46 CAR T 세포는 NKp46+ K562 세포에 대하여 특이적 CD137 상향조절 (n = 3) 및 증가된 IL-2, IFNγ, 및 TNFα 발현 (n = 5)을 나타내었다 (도 11b, 11c). 사이토카인-발현 αNKp46 CAR T 세포의 거의 절반이 다기능성을 보였다 (도 11d). 분석된 두 가지 측정에 의해, αNKp46 및 αCD19 CAR T 세포는 그들의 각각의 표적에 대해 비슷한 수준의 활성화를 나타내었다.
αNKp46 CAR T 세포의 살해 효율을 결정하기 위해, Mock 또는 αNKp46 CAR T 세포를 증가하는 E:T 비율에서 NKp46+ 및 CD19+ K562 세포의 동일한 혼합물과 함께 배양하였다. 24-시간 공동-배양 후, NKp46+ K562 세포의 특이적 용해는 mock T 세포와 비교하여 αNKp46 CAR T 세포의 용량이 증가함에 따라 상당히 증가하여 5:1 E:T 비율에서 거의 90%에 도달하였다 (도 11e). 그럼에도 불구하고, 특이적 2:1 E:T 비율에서 뚜렷이 강력하게 유지되었다 (도 11f).
αNKp46 및 αNKG2A CAR T 세포는 NK 세포에 반응하고 용해하는 활성화를 나타낸다. 다음으로 αNKp46 CAR T 세포는 세포주의 적당한 NKp46 발현에도 불구하고 NK92 세포에 대해 테스트되었다. 예상한 바와 같이, αNKp46 CAR T 세포 활성화는 6시간의 공동-배양 후 최소였으며, 약간의 CD137 상향조절을 나타내었지만 사이토카인 생성은 증가하지 않았다 (n = 3, 도 12d, 12e). 특히, αNKp46 CAR T 세포 (평균 = 6.13%)에서 CD137 상향조절은 여전히 αCD19 CAR T 세포 (평균 = 1.04%, n = 4) 보다 6배 더 컸다. 반대로, αNKG2A CAR T 세포는 림프종 세포주에 대해 상승된 CD137 및 사이토카인 발현을 보였다 (n = 4, 도 12d, 12e). CAR-선호 및 이에 따른 최적이 아닌 NK92 공동-배양 조건은 의도치 않게 NK92 생존을 억제함으로써 αNKG2A CAR T 세포 활성을 감소시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 사이토카인-생성 αNKG2A CAR T 세포의 거의 1/3은 다기능성이었다 (도 12f).
강력한 특이적 방식으로 세포주를 표적으로 하는 능력을 감안할 때, αNKp46 및 αNKG2A CAR T 세포를 자가 1차 NK 세포에 대해 테스트하였다. 3명의 공여자로부터의 PBMC를 14일 동안 NK-선별 배지 (NK MACS, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)에서 확장시켜 주로 NK 및 T 세포의 혼합 림프구 배양물을 생성하였다 (도 12a). 이 시점에서, NK 세포는 NKG2A 및 NKp46 모두를 거의 완전히 발현하였다 (도 12b). T-세포-고갈된 NK 세포 배양물은 2:1 E:T 비율에서 공동-배양 6시간 후 αNKp46 및 αNKG2A -- αCD19는 아님 -- CAR T 세포를 활성화하는 것으로 관찰되었다. CD137 상향조절은 αNKp46 CAR T 세포에서 가장 높았고 (n = 5; 도 12d), 사이토카인 생성은 αNKG2A CAR에서 가장 높았다 (n = 4; 도 12e). 이전에 테스트한 세포주와 비교하여, 이러한 자가 1차 NK 세포는 αNKp46 및 αNKG2A CAR T 세포 다기능성을 동일하거나 더 크게 생성하였다 (도 12f).
CAR T 세포가 NK 세포를 살해할 수 있는 지 여부를 추가로 결정하기 위해 사전 표지된 혼합 NK/T 세포 배양물을 2:1 E:T 비율로 24시간 동안 CAR T 세포와 함께 인큐베이션하였다. αCD19 CAR과 달리, 두 항-NK CAR 작제물은 거의 동일한 용량-의존적 경향으로 남아있는 NK 세포의 백분율을 감소시켰다 (도 12g). 강력한 살해는 αNKp46 (79% 살해) 및 αNKG2A (64% 살해) CAR 모두에 대해 2:1 E:T 비율에 의해 관찰되었으며, 5:1 E:T 비율에서 각각 3% 및 6%만 감소하였다 (도 12e).
NK 세포는 αNKp46 CAR T 세포를 활성화하고 용해한다. 이론적으로, 활성화 수용체 NKp46에 결합하면 αNKp46 CAR T 세포를 살해하기에 충분한 세포 독성 반응을 이끌어낼 수 있다. 더욱이, αNKG2A CAR에 대한 결합 도메인인 HLA-E는 NKG2A에 우세하게 결합하는 것으로 알려져 있지만, 또 다른 NK 세포 활성화 수용체인 NKG2C에 대한 리간드로 식별되었다 (문헌 [Wada 등 Eur. J. Immunol. 34, 81-90 (2004)]). 따라서, 표적화된 NK 세포가 어느 CAR 생성물의 NKp46- 및/또는 NKG2C-구동 살해를 유도할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 사전 표지된 αNKp46 또는 αNKG2A CAR T 세포를 자가 NK 세포와 2:1 NK-대-CAR 비율로 4시간 동안 혼합하였다 (도 13a). BFP가 CAR 발현의 리포터로 사용되었기 때문에, NK 세포를 첨가하기 전과 후에 BFP-발현 세포의 백분율 및 평균 BFP 평균 형광 강도 (MFI)를 사용하여 NK-매개된 CAR T 세포 사멸을 평가하였다.
자가 NK 세포와 함께 배양된 αNKp46 CAR T 세포에서 BFP 발현의 12% 감소와 중간 BFP MFI의 15% 감소가 관찰되었다 (도 13b-13d). αNKG2A 및 αCD19 CAR T 세포는 BFP 백분율 발현 또는 MFI중앙값에서 유의미한 변화를 나타내지 않았다. 따라서, αNKp46 CAR을 중심으로 다른 연구에서 기술한 바와 같이 CAR T 세포 동족살해의 경우가 아닌 CAR 사멸이 NK 세포-매개임을 확인하기 위한 실험을 진행하였다 (문헌 [Hamieh 등 Nature 568: 112-116 (2019)]). αNKp46 CAR T 세포를 NKp46+ K562 세포와 2:1 E:T 비율로 4시간 동안 혼합하였다. K562 세포에서 NKp46 수용체와 성공적으로 결합했음에도 불구하고 (도 11b), αNKp46 CAR T 세포는 BFP 퍼센트 발현 또는 MFI 중앙값에서 유의미한 감소를 나타내지 않았다 (도 13c). 대표적인 밀도 플롯 분석은 NK 세포가 첨가되기 전과 후에 αNKp46 CAR T 세포에서 BFP 발현을 보여준다 (도 13d).
자가 NK 세포가 첨가되었을 때 50% 이상 감소한 BFPbright 세포의 하위집단이 식별되었으며, 이는 아마도 더 높은 표면 CAR 밀도를 갖는 αNKp46 CAR T 세포에 대해 용해 감수성이 더 높다는 것을 시사한다.
또한, αNKp46 CAR T 세포와 함께 배양된 NK 세포는 αCD19 CAR T 세포와 함께 배양된 NK 세포와 비교하여 TNFα 발현이 1.8배 증가하고 IFNγ 발현이 3.5배 증가하는 것으로 나타났다 (도 13e).
NK 세포 악성종양은 작지만 효과적인 치료 옵션이 제한적인 혈액암의 파괴적인 서브세트를 포함한다. 최근 몇 년 동안, T 세포 및 B 세포 종양에 대한 CAR T 및 CAR NK 세포의 표능이 입증되었지만, 이 작업은 처음으로 T 세포가 비슷한 효율로 NK 세포를 살해하도록 조작될 수 있음을 입증한다. CAR T 세포의 과거 임상적 성공과 조합하여, 이 작업은 이러한 치명적인 NK 세포 악성종양을 치료하는 데 CAR T 세포의 사용을 장려한다.
본원은 NK 세포 수용체 NKp46 및 NKG2A를 표적으로 하는 2개의 대체 CAR 작제물을 고안하여 NK 세포 이질성과 항원 특이성을 다루었다. 이용 가능한 데이터는 대부분의 NK 악성종양이 이러한 수용체 중 하나 또는 둘 모두를 발현함을 시사한다. NKp46은 활성화 수용체인 반면 NKG2A는 억제성 신호를 촉진한다. 더욱이, αNKp46 CAR은 보다 일반적인 scFv-기반 설계를 사용하는 반면 αNKG2A CAR은 합성 리간드인 HLA-E를 사용하며 이는 면역원성이 낮을 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고, scFv-기반 작제물로 NKG2A를 표적으로 하는 것도 가능해야 한다. 2개의 개별 이펙터를 사용하거나 단일 이중-CAR T 세포 생성물로 각 수용체를 동시에 표적으로 하는 것은 항원 손실 및 종양 탈출을 완화하는 잠재적인 이점을 갖는다 (문헌 [Majzner & Mackall. Cancer Discov. 8, 1219-1226 (2018)]).
활성화 NK 수용체 NKp46를 표적으로 하는 예상치 못한 결과는 NK 세포 활성화 및 αNKp46 CAR T 세포에 대한 적당한 (12-15%) 세포독성이었다. αNKG2A CAR와 함께 억제성 NKG2A 수용체를 동시에 표적화하면 이 효과를 완화할 수 있으며 전술한 이중 특이성의 이점도 얻을 수 있다. 또 다른 측면에서, HLA-A 및 HLA-B가 고갈되었지만 HLA-E를 과발현하는 동종이형 CAR T 세포 생성물이 숙주 T 및 NK 세포-매개 거부반응 모두를 피할 수 있기 때문에 HLA-E 리간드 단독으로 기성품 요법 개발에 이점을 부여할 수 있다 (문헌 [Gornalusse 등 Nat. Biotechnol. 35, 765-772 (2017); Torikai 등 Blood 122, 1341-1349 (2013)]). 요약하면, 이중 αNKG2A/αNKp46 CAR은 1) 표적 환경을 넓히고, 2) 종양 탈출 가능성을 최소화하고, 및 3) 기성 항-NK CAR T 세포 요법의 개발을 지원하는 이점을 제공하며, 이는 접근 가능하고 비용이 적게 든다.
CAR T 세포 요법 (문헌 [Neelapu 등 Nat. Rev. Clin. Oncol. 15, 47-62 (2018)])에서 볼 수 있는 염증성 합병증 외에도, 항-NK 세포 CAR T 세포에서 중요한 온-표적/오프-종양 독성이 예상된다. PBMC의 대략 5-15%는 NK 세포이다. 이들은 효과적인 항-NK 세포 CAR T 세포 요법에 의해 반영구적으로 고갈될 것이다. 이는 B-세포 무형성증을 유발하는 αCD19 CAR T 세포 요법과 유사하다. 그러나, 저감마글로불린혈증은 면역글로불린 대체 요법으로 관리할 수 있다. 선천적 NK 세포 결핍 또는 기능장애가 있는 개인은 헤프헤스 바이러스 및 인유두종바이러스 감염 위험이 높으며 (Mace & Orange. Immunol. Rev. 287, 202-225 (2019)), 완화 전략은 예방적 항바이러스 및/또는 면역 자극 요법을 포함한다 (Orange, J. S. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 515-525 (2013)). 표적 NKG2A는 CD8+ T 세포의 작은 하위집합에서도 발견되지만 (Braud 등 Trends Immunol. 24, 162-164 (2003)), 이것의 임상적 중요성은 덜 명확하다.
항-NK CAR T 세포는 또한 NK 악성종양 이외의 연구 및 치료 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있다. HLA-E는 다양한 종양에서 현저하게 과발현되며, 종양 침윤 NK 및 CD8+ T 세포 둘 다에서 그의 동족 억제성 수용체인 NKG2A의 발현은 불량한 예후와 관련이 있다 (문헌 [Kamiya 등 J. Clin. Invest. 129, 2094-2106 (2019)]). 따라서, 이 NKG2A-HLA-E 축을 표적으로 하는 인식 체크포인트 억제제가 개발되었다 (문헌 [Kamiya 등 J. Clin. Invest. 129, 2094-2106 (2019); van Hall 등 J. Immunother. Cancer 7, 263 (2019)]). 유사한 모노클로날 항체와 비교하여, αNKG2A CAR T 세포는 억제된 세포를 직접 고갈시키고 억제성 NK 및 T 세포를 더 효과적으로 고갈시켜 종양 미세 환경을 개편하는 동시에 더 긴 반감기와 우수한 종양 침윤의 이점을 얻었다. 비-세포 기반 접근법과 마찬가지로, 이 전략은 광범위한 임상적 적용 가능성을 가질 것이다.
요약하면, 이 연구는 CAR T 세포가 NK 세포를 살해하도록 조작될 수 있음을 입증하였다. 2개의 상이한 NK 수용체를 표적으로 하는 것이 효과적이었고 동시에 사용할 때 실용적인 이점이 있었다. 궁극적으로 이 위험은 진행 단계 NK 세포 악성 종양에 대한 새로운 치료 옵션에 대한 절실한 필요성에 의해 균형을 이루지만 임상 환경에서 표적에 대한 독성이 예상되고 치료 가능하다. 따라서, 본 연구는 항-NK CAR T 세포 요법을 위한 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
(xvii) 마무리 단락. 본원에 제공된 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. §1.822 및 WIPO 표준 ST.25 (1998), 부록 2, 표 1 및 3에 정의된 바와 같이 뉴클레오타이드 염기 및 잔기에 대한 문자 약어를 사용하여 표시된다. 각 핵산 서열의 한 가닥만이 나타나 있지만, 상보적 가닥은 적절한 경우 구현예에 포함되는 것으로 이해된다.
서열번호: 128, 129, 131, 132, 134, 및 135에 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 Sequence Manipulation Suite: World Wide Web (bioinformatics.org/sms2/rev_trans.htm)에서 입수 가능한 역 번역 (Reverse Translate)및 World Wide Web (genscript.com/tools/codon-frequency-table)에서 얻은 인간 코돈 사용 표를 사용하여 역 번역되었다. 역 번역은 아미노산 서열을 입력으로 받아들이고 제공된 코돈 사용 표 ('가장 가능성이 있는 코돈')에 따라 가장 가능성이 있는 비-축퇴 코딩 서열을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 생성한다. 각 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈으로부터 유래된 공통 서열 또한 반환된다 ('공통 코돈'). 본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합 친화성" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 표적화하다"는 배경 결합보다 더 큰 결합 친화성으로 한 분자가 또 다른 분자에 결합하는 것을 기술한다. 결합 도메인 (예를 들어, 결합 도메인을 포함하는 CAR의)은 예를 들어 105 M-1 이상의 친화성 또는 Ka (즉, 1/M 단위와의 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 표적 분자에 결합하거나 외합하는 경우 표적 분자에 "특이적으로 결합한다". 특정 구현예에서, 결합 도메인 (또는 CAR)은 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 또는 1013 M-1 이상의 Ka로 표적에 결합한다. "고친화성" 결합 도메인은 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 1013 M-1, 또는 그 이상의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다.
대안적으로, 친화성은 M 단위와의 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수 (Kd)로 정의될 수 있다 (예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M 미만). 본 개시내용에 따른 결합 도메인 및 CAR 단백질의 친화성은 통상적인 기술을 사용하여, 예를 들어 경쟁적 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해, 또는 표직된 리간드를 사용하는 결합 회합, 또는 치환 검정에 의해, 또는 Biacore, Inc., Piscataway, N.J.로부터 입수 가능한 Biacore T100과 같은 표면 플라즈몬 공명 장치, 또는 Corning 및 Perkin Elmer로부터 각각 입수 가능한 EPIC 시스템 또는 EnSpire와 같은 광학 바이오센서 기술을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다 (또한, 예를 들어, 문헌 [Scatchard 등 (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660]; US 5,283,173호; US 5,468,614호 참조).
특정 구현예에서, 특이적 결합의 친화성은 배경 결합보다 2배 이상 더 크고, 배경 결합보다 5배 이상 더 크고, 배경 결합보다 10배 이상 더 크고, 배경 결합보다 20배 이상 더 크고, 배경 결합보다 50배 이상 더 크고, 배경 결합보다 100배 이상 더 크거나, 배경 결합보다 1000배 이상 더 크다.
본원에서 사용된 "~로부터 유래된"은 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이는 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하며, 제2 분자에서 유래된 제1 분자에 대한 프로세스 또는 소스 제한을 의미하거나 포함하지 않는다. 예를 들어, CD3ζ 분자로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인의 경우, 세포내 신호전달 도메인은 필요한 기능, 즉 적절한 조건 하에서 신호를 생성하는 능력을 갖도록 충분한 CD3ζ 구조를 보유한다. 이는 세포내 신호전달 도메인을 생성하는 특정 과정을 암시하거나 제한을 포함하지 않으며, 예를 들어, 이는 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위해, CD3ζ 서열로 시작하여 원하지 않는 서열을 삭제하거나 돌연변이를 부과하여 세포내 신호전달 도메인에 도달해야 한다는 것을 의미하지 않는다.
본원에 개시된 각각의 실시예는 특정 언급된 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 구성될 수 있다. 따라서 "포함하다 (include)" 또는 "포함하는 (including)"이라는 용어는 "포함하다 (comprise), ~로 구성되다 (consist of), 또는 ~로 필수적으로 구성되다 (consist essentially of)"를 인용하는 것으로 해석되어야 한다. 전환 용어 "포함하다 (comprise)" 또는 "포함하다 (comprises)"는 의미는 있지만 이에 제한되지 않으며 지정되지 않은 요소, 단계, 성분 또는 구성 요소를 다량으로 포함할 수 있다. 전환 어구 "~로 구성되는"은 특정되지 않은 임의의 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 제외한다. 전환 문구 "필수적으로 이루어진"은 실시예의 범위를 특정 요소, 단계, 성분 또는 구성요소 및 실시예에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 전환 어구 "~로 필수적으로 구성되는"은 구현예의 범위를 특정 요소, 단계, 성분 또는 구성요소 및 구현예에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 재료 효과는 CAR을 발현하는 세포가 NK 세포 표면 마커에 결합하고 NK 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 표적화하는 능력을 통계적으로 유의하게 감소시킬 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 매개변수는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한, 청구 범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각각의 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 숫자의 수에 비추어 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 추가 명확성이 요구되는 경우, 용어 "약"은 명시된 수치 또는 범위와 함께 사용될 때, 즉 명시된 값의 ±20% 범위; 명시된 값의 ±19%; 명시된 값의 ±18%; 명시된 값의 ±17%; 명시된 값의 ±16%; 명시된 값의 ±15%; 명시된 값의 ±14%; 명시된 값의 ±13%; 명시된 값의 ±12%; 명시된 값의 ±11%; 명시된 값의 ±10%; 명시된 값의 ±9%; 명시된 값의 ±8%; 명시된 값의 ±7%; 명시된 값의 ±6%; 명시된 값의 ±5%; 명시된 값의 ±4%; 명시된 값의 ±3%; 명시된 값의 ±2%; 또는 명시된 값의 ±1% 범위 내에서 명시된 값 또는 범위보다 다소 크거나 다소 작은 것을 나타낼 때 당업자에 의해 합리적으로 부여된 의미를 갖는다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 설명된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 모든 수치에는 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오류가 본질적으로 포함된다.
본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 하기 청구범위의 맥락에서) 사용되는 용어 "a", "an", "the" 및 유사한 지시 대상은 본원에서 달리 나타내거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로 사용하기 위한 것이다. 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 각 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예 또는 예시적인 언어 (예: "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 비청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에 있는 다른 요소와 결합하여 참조 및 청구될 수 있다. 편의 및/또는 특허성 때문에 그룹의 하나 이상의 구성원이 그룹에 포함되거나 그룹에서 삭제될 수 있다. 이러한 포함 또는 삭제가 발생하면 사양은 수정된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구 범위에 사용된 모든 마쿠쉬형 그룹의 서면 설명을 충족한다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 모드를 포함하여 본 발명의 특정 구현예가 본원에 기술된다. 물론, 이러한 기술된 구현예에 대한 변형은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 발명자는 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절하게 채택할 것으로 기대하고, 발명자는 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과는 달리 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 해당 법률이 허용하는 바에 따라 본원에 첨부된 청구 범위에 인용된 주제의 모든 수정 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 전술한 요소들의 모든 가능한 변형의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 특허, 인쇄 간행물, 저널 기사 및 기타 서면 텍스트에 대한 수많은 참조 (본원에서 참조된 자료)가 이루어졌다. 각각의 참조 자료는 참조 교시를 위해 그 전체가 참조로 본원에 개별적으로 포함된다.
본원에 개시된 본 발명의 구현예는 본 발명의 원리를 예시하는 것임을 이해해야 한다. 채용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 제한이 아닌 예로서, 본 발명의 대안적인 구성이 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 정확히 도시되고 설명된 것에 한정되지 않는다.
본 명세서에 도시된 세부사항은 예로서 그리고 본 발명의 바람직한 구현예의 예시적인 논의를 위한 목적일 뿐이며, 본 발명의 다양한 실시예의 원리 및 개념적 측면에 대한 가장 유용하고 쉽게 이해되는 설명이라고 생각되는 것을 제공하는 원인으로 제시된다. 이와 관련하여 본 발명의 기본적인 이해에 필요한 것보다 더 상세하게 본 발명의 구조적 세부 사항을 나타내려는 시도는 하지 않으며, 도면 및/또는 구현예와 함께 기술된 설명은 본 발명의 여러 형태가 실제로 구현될 수 있는 방법을 당업자에게 명백하게 한다.
본 개시내용에 사용된 정의 및 설명은 다음의 예에서 명확하고 모호하지 않게 수정되지 않는 한, 또는 의미의 적용이 임의의 구성을 무의미하거나 본질적으로 무의미하게 만드는 경우가 아니면 미래의 구성에서 제어하는 것을 의미하고 의도한다. 용어의 구성이 의미가 없거나 본질적으로 의미가 없는 경우, Oxford Dictionary of Biochemistry 및 Molecular Biology와 같이 당업자에게 알려진 웹스터 사전, 제3판 또는 사전에서 정의를 가져와야 한다 (Eds. Attwood T 등, Oxford University Press, Oxford, 2006).
SEQUENCE LISTING <110> Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARS) TARGETING NATURAL KILLER CELLS <130> SCRI.268WO/S281-0013PCT <150> US 63/022,149 <151> 2020-05-08 <160> 289 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ser Thr Leu Pro Ala Leu Leu Cys Val Gly Leu Cys Leu Ser 1 5 10 15 Gln Arg Ile Ser Ala Gln Gln Gln Thr Leu Pro Lys Pro Phe Ile Trp 20 25 30 Ala Glu Pro His Phe Met Val Pro Lys Glu Lys Gln Val Thr Ile Cys 35 40 45 Cys Gln Gly Asn Tyr Gly Ala Val Glu Tyr Gln Leu His Phe Glu Gly 50 55 60 Ser Leu Phe Ala Val Asp Arg Pro Lys Pro Pro Glu Arg Ile Asn Lys 65 70 75 80 Val Lys Phe Tyr Ile Pro Asp Met Asn Ser Arg Met Ala Gly Gln Tyr 85 90 95 Ser Cys Ile Tyr Arg Val Gly Glu Leu Trp Ser Glu Pro Ser Asn Leu 100 105 110 Leu Asp Leu Val Val Thr Glu Met Tyr Asp Thr Pro Thr Leu Ser Val 115 120 125 His Pro Gly Pro Glu Val Ile Ser Gly Glu Lys Val Thr Phe Tyr Cys 130 135 140 Arg Leu Asp Thr Ala Thr Ser Met Phe Leu Leu Leu Lys Glu Gly Arg 145 150 155 160 Ser Ser His Val Gln Arg Gly Tyr Gly Lys Val Gln Ala Glu Phe Pro 165 170 175 Leu Gly Pro Val Thr Thr Ala His Arg Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly 180 185 190 Ser Tyr Asn Asn His Ala Trp Ser Phe Pro Ser Glu Pro Val Lys Leu 195 200 205 Leu Val Thr Gly Asp Ile Glu Asn Thr Ser Leu Ala Pro Glu Asp Pro 210 215 220 Thr Phe Pro Ala Asp Thr Trp Gly Thr Tyr Leu Leu Thr Thr Glu Thr 225 230 235 240 Gly Leu Gln Lys Asp His Ala Leu Trp Asp His Thr Ala Gln Asn Leu 245 250 255 Leu Arg Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe 260 265 270 Leu Val Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser 275 280 285 Arg Ala Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu 290 295 300 <210> 2 <211> 915 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtcttcca cactccctgc cctgctctgc gtcgggctgt gtctgagtca gaggatcagc 60 gcccagcagc agactctccc aaaaccgttc atctgggccg agccccattt catggttcca 120 aaggaaaagc aagtgaccat ctgttgccag ggaaattatg gggctgttga ataccagctg 180 cactttgaag gaagcctttt tgccgtggac agaccaaaac cccctgagcg gattaacaaa 240 gtccaattct acatcccgga catgaactcc cgcatggcag ggcaatacag ctgcatctat 300 cgggttgggg agctctggtc agagcccagc aacttgctgg atctggtggt aacagaaatg 360 tatgacacac ccaccctctc ggttcatcct ggacccgaag tgatctcggg agagaaggtg 420 accttctact gccgtctaga cactgcaaca agcatgttct tactgctcaa ggagggaaga 480 tccagccacg tacagcgcgg atacgggaag gtccaggcgg agttccccct gggccctgtg 540 accacagccc acagagggac ataccgatgt tttggctcct ataacaacca tgcctggtct 600 ttccccagtg agccagtgaa gctcctggtc acaggcgaca ttgagaacac cagccttgca 660 cctgaagacc ccacctttcc tgcagacact tggggcacct accttttaac cacagagacg 720 ggactccaga aagaccatgc cctctgggat cacactgccc agaatctcct tcggatgggc 780 ctggcctttc tagtcctggt ggctctagtg tggttcctgg ttgaagactg gctcagcagg 840 aagaggacta gagagcgagc cagcagagct tccacttggg aaggcaggag aaggctgaac 900 acacagactc tttga 915 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Kabat numbering <400> 3 Asp Tyr Val Ile Asn 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Chothia numbering <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, IMGT numbering <400> 5 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Kabat numbering <400> 6 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ala <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Chothia numbering <400> 7 Pro Gly Ser Gly 1 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, IMGT numbering <400> 8 Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Kabat numbering <400> 9 Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Chothia numbering <400> 10 Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp 1 5 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, IMGT numbering <400> 11 Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Kabat numbering <400> 12 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Chothia numbering <400> 13 Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, IMGT numbering <400> 14 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Kabat numbering <400> 15 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Kabat numbering <400> 16 Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, Chothia numbering <400> 17 Tyr Thr Ser Gly Asn Thr Arg Pro Trp 1 5 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-1, IMGT numbering <400> 18 Tyr Thr Ser Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Kabat numbering <400> 19 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Chothia numbering <400> 20 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, IMGT numbering <400> 21 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Kabat numbering <400> 22 Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, IMGT numbering <400> 23 Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Kabat numbering <400> 24 Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Gly Val Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Chothia numbering <400> 25 Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Gly Val Phe Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, IMGT numbering <400> 26 Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Gly Val Phe Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Kabat numbering <400> 27 Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Chothia numbering <400> 28 Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, IMGT numbering <400> 29 Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Kabat numbering <400> 30 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Kabat numbering <400> 31 Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-2, Chothia numbering <400> 32 His Tyr Gly Thr Pro Trp 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Kabat numbering <400> 33 Glu Tyr Thr Met His 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Chothia numbering <400> 34 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, IMGT numbering <400> 35 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr 1 5 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Kabat numbering <400> 36 Gly Ile Ser Pro Asn Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Chothia numbering <400> 37 Pro Asn Ile Gly 1 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, IMGT numbering <400> 38 Ile Ser Pro Asn Ile Gly Gly Thr 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Kabat numbering <400> 39 Arg Gly Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Chothia numbering <400> 40 Gly Gly Ser Phe Asp 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, IMGT numbering <400> 41 Ala Arg Arg Gly Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Kabat numbering <400> 42 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His 1 5 10 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Chothia numbering <400> 43 Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, IMGT numbering <400> 44 Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Kabat numbering <400> 45 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Kabat numbering <400> 46 Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-3, Chothia numbering <400> 47 Gly His Ser Phe Pro Leu 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Kabat numbering <400> 48 Ser Phe Thr Met His 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Chothia numbering <400> 49 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, IMGT numbering <400> 50 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Thr 1 5 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Kabat numbering <400> 51 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Chothia numbering <400> 52 Pro Ser Ser Gly 1 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, IMGT numbering <400> 53 Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Kabat numbering <400> 54 Gly Ser Ser Arg Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Chothia numbering <400> 55 Ser Ser Arg Gly Phe Asp 1 5 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, IMGT numbering <400> 56 Val Arg Gly Ser Ser Arg Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Kabat numbering <400> 57 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Chothia numbering <400> 58 Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, IMGT numbering <400> 59 Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Kabat numbering <400> 60 Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Kabat numbering <400> 61 Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-4, Chothia numbering <400> 62 Phe Trp Gly Thr Pro Arg 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, Kabat numbering <400> 63 Ser Ser Trp Met His 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, Chothia numbering <400> 64 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, IMGT numbering <400> 65 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp 1 5 <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, Kabat numbering <400> 66 His Ile His Pro Asn Ser Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 67 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, Chothia numbering <400> 67 Pro Asn Ser Gly 1 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, IMGT numbering <400> 68 Ile His Pro Asn Ser Gly Ile Ser 1 5 <210> 69 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, Kabat numbering <400> 69 Gly Gly Arg Phe Asp Asp 1 5 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, Chothia numbering <400> 70 Gly Arg Phe Asp 1 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, IMGT numbering <400> 71 Ala Arg Gly Gly Arg Phe Asp Asp 1 5 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, Kabat numbering <400> 72 Gln Asn Gly His Ser Phe Leu Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody NKp46-6, Chothia numbering <400> 73 Gly His Ser Phe Leu Met Tyr 1 5 <210> 74 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-9, Kabat numbering <400> 74 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-9, Chothia numbering <400> 75 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody NKp46-9, IMGT numbering <400> 76 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody NKp46-9, Kabat numbering <400> 77 Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-9, Kabat numbering <400> 78 Cys Trp Asp Tyr Ala Leu Tyr Ala Met Asp Cys 1 5 10 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-9, Chothia numbering <400> 79 Trp Asp Tyr Ala Leu Tyr Ala Met Asp 1 5 <210> 80 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody NKp46-9, IMGT numbering <400> 80 Ala Arg Cys Trp Asp Tyr Ala Leu Tyr Ala Met Asp Cys 1 5 10 <210> 81 <211> 11 <212> PRT 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Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody BAB281, Kabat numbering <400> 87 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody BAB281, Chothia numbering <400> 88 Thr Asn Thr Gly 1 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-NKp46 antibody BAB281, IMGT numbering <400> 89 Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody BAB281, Kabat numbering <400> 90 Asp Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 91 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody BAB281, Chothia numbering <400> 91 Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp 1 5 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-NKp46 antibody BAB281, IMGT numbering <400> 92 Ala Arg Asp Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody BAB281, Kabat numbering <400> 93 Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody BAB281, Chothia numbering <400> 94 Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 1 5 <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody BAB281, IMGT numbering <400> 95 Glu Asn Val Val Thr Tyr 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of anti-NKp46 antibody BAB281, Kabat numbering <400> 96 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody BAB281, Kabat numbering <400> 97 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody BAB281, Chothia numbering <400> 98 Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr 1 5 <210> 99 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable (VH) domain of anti-NKp46-1 <400> 99 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Ile Asn Trp Gly Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Ile Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable (VL) domain of anti-NKp46-1 antibody <400> 100 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 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120 <210> 102 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of VL domain of anti-NKp46-2 antibody <400> 102 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 103 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of VH domain of anti-NKp46-3 antibody <400> 103 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly 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<220> <223> Amino acid sequence of VH domain of anti-NKp46-4 antibody <400> 105 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Val Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asp Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Ser Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 106 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of VL domain of anti-NKp46-4 antibody <400> 106 Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn 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antibody <400> 108 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Leu Met 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 109 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of VH domain of anti-NKp46-9 antibody <400> 109 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn 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Ser Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile 180 185 190 Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Leu Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 118 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for NKp46-9 scFv <400> 118 Ser Thr Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 1 5 10 15 Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser 20 25 30 Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn 35 40 45 Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Cys Trp Asp Tyr Ala Leu Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Cys Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile 130 135 140 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 165 170 175 Trp Cys Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn 180 185 190 Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr His Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp 210 215 220 Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Thr Pro Leu Thr Phe 225 230 235 240 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 245 <210> 119 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for BAB281 scFv <400> 119 Ser Thr Gly 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Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp 210 215 220 Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 120 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for scFv of antibody NKp46-1 <400> 120 tcgactggaa gccaggtaca gctgcagcag tctggccctg aactcgtcaa accaggagct 60 tccgtgaaga tgtcctgcaa ggcttcaggg tacacgttta ccgactatgt gatcaattgg 120 ggtaagcagc gctctgggca aggcttggag tggattggcg agatctatcc tgggagtggg 180 accaactatt acaacgagaa gttcaaggcc aaagccactt tgactgcaga caagagctca 240 aacattgcct acatgcaact gagctccctg acatcagagg attctgctgt gtacttctgt 300 gcacgtagag gtcggtacgg tctgtatgcc atggactatt ggggccaagg cacttccgtg 360 acagtcagct ctgtggaagg aggaagtggc ggttcaggag gtagcggagg gtccggagga 420 gtggatgaca ttcagatgac acagaccact tctagcctct ccgcatccct tggggatagg 480 gtcaccatca gttgtagggc tagccaggac atttccaatt acctgaactg gtatcagcag 540 aaacccgatg gcacagttaa gcttctgatc tactacacaa gcagactgca ctcaggggtt 600 ccatctcggt ttagtggaag tggctctggt accgactatt ccctgaccat caacaatctg 660 gaacaggaag atatcgccac ctacttctgc caacagggca atactcgacc ctggacattt 720 ggtggcggca cgaaactcga gataaaataa 750 <210> 121 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for scFv of antibody NKp46-2 <400> 121 tcgactggat ccgaggtaca gttgcaggag agtgggcctg gactggtcaa accctcccaa 60 tctctgagct tgacatgcac agtcacaggc tacagcatca cctccgacta cgcttggaat 120 tggattcgac agtttcccgg caacaagctg gaatggatgg gctacatcac ctatagtggt 180 agcacttcct ataatccctc acttgagagc cggatttcca tcactaggga tacgagcacc 240 aaccagttct tcctgcagct gaatagcgtc accaccgaag atactgccac ctattactgc 300 gcaagaggcg gttactatgg cagttcatgg ggtgtattcg cctattgggg acaggggaca 360 cttgtgacag tgtctgctgt tgaaggtgga tccggcggat caggagggag tggtggcagt 420 ggaggtgttg acgacattca gatgacccaa tcccctgctt ctctctcagc ctctgtggga 480 gagactgtga ccataacctg tcgtgttagc gagaacatct actcctatct cgcctggtat 540 cagcagaaac aggggaaatc cccacaactg ctcgtgtaca atgccaagac tctggcagaa 600 ggagtgccaa gccgcttttc 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gctccggtag tgacttcaca ctcagcatca atagcgtcga accagaggat 660 gtaggggtgt actactgtca gaatgggcat tcctttcccc tcacatttgg agctggtacc 720 aaactcgagc tgaaataa 738 <210> 123 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for scFv of antibody NKp46-4 <400> 123 tcgactggct cccaagtaca gcttcagcag tctgccgtcg aacttgctcg accaggagct 60 tcagtgaaga tgagctgcaa agcctctggt tacaccttca cgtcctttac catgcattgg 120 gtgaagcagc gtcctggcca aggcctggag tggattggct acatcaatcc ctccagcggg 180 tataccgagt acaaccagaa gttcaaggac aaaacaaccc tgactgccga taagtcaagt 240 agcacagcct atatgcagct ggattccctg acatcagacg atagcgctgt gtattactgc 300 gttaggggct ctagcagagg gttcgactat tggggtcaag gcacactggt cacggttagt 360 gccgttgaag gaggctctgg aggcagtgga ggttctggag ggtcaggcgg tgtggatgac 420 attcagatga ttcagagtcc cgctagcttg agtgtaagcg tcggtgagac agtgaccatc 480 acttgtcgcg catccgaaaa catctactcc aatctcgcat ggttccagca gaaacagggc 540 aaatcacccc aattgctcgt gtatgccgca actaatctgg ctgatggtgt gccttccagg 600 tttagcgggt ctggatctgg gactcagtac tccctgaaga tcaactccct ccagtctgag 660 gacttcggga tctattactg tcagcacttt tggggaactc cacggacctt tggaggcggg 720 accaaactgg agataaagta a 741 <210> 124 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for scFv of antibody NKp46-6 <400> 124 ctggtgaggc caggtgcatc tgtgaagctg tcatgcaaag catccgggta cacgttcacc 60 tcttcatgga tgcattgggc caaacagcgt ccaggccagg gccttgagtg gattggacac 120 attcacccca atagcggcat atccaactac aacgagaagt tcaagggcaa agccacactg 180 acagtggata cttccagctc tacagcctat gtggacctta gtagcttgac cagtgaggat 240 tctgccgtat actactgtgc tagaggtggg cggtttgacg attggggtgc tgggaccaca 300 gtcaccgtga gcagtgtcga aggtggatca ggtggatctg gaggctcagg cggttctggc 360 ggtgttgacg acatcgtgat gactcaaagc cctgctactc tctctgtcac acccggagat 420 agggtaagcc tcagttgtcg agcaagccag tcaatcagcg actatctgca ctggtatcag 480 cagaagtccc atgaatcccc acgcttgctc atcaagtacg ccagtcagtc catcagtggc 540 attccttccc ggttttctgg gtctggatcc gggtcagact tcactctgag cattaactcc 600 gtcgaacccg aggatgttgg cgtgtattat tgccagaatg gacattcctt cctgatgtac 660 acctttggcg gagggaccaa actggagatc aagtaa 696 <210> 125 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for scFv of antibody NKp46-9 <400> 125 tcgactgggt ctgatgtgca gttgcaggag tcaggacctg ggcttgtcaa gccaagccag 60 agcctcagtc tcacttgcac tgtcacaggc tatagcatca catccgacta tgcttggaat 120 tggattaggc agtttcctgg caataagctg gaatggatgg ggtacatcac ctattccggc 180 agtaccaact acaatcccag cttgaaatct cggatttcca taacacgcga tactagcaag 240 aaccagttct tccttcagct gaactctgtg acaacagagg ataccgctac gtactattgc 300 gccagatgct gggattacgc cctgtatgcc atggactgtt ggggtcaagg taccagcgtt 360 actgtgtcta gcgtcgaagg cggaagtggc ggctcaggag ggtcaggagg ctcaggcgga 420 gtggatgaca ttcagatgac ccaatctccc gcatccctgt ccgcatcagt aggggagaca 480 gtgaccatta cctgtcgtac ttccgagaac atctactcct atcttgcctg gtgtcaacag 540 aaacagggga aaagtccaca gctgctggtg tataacgcca agaccttggc agaaggtgtt 600 cccagtcgat tctctggttc cggatccggt acacacttca gcctgaagat caattctctg 660 caaccagagg actttggaat ctactactgc cagcatcact acgacactcc tctgacgttt 720 ggcgctggta ccaagctcga actgaaataa 750 <210> 126 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for scFv of antibody BAB281 <400> 126 tcgactggta gccagataca gctggtacag tcaggaccag agctgcagaa acctggagag 60 acagtgaaga tcagctgcaa ggctagcggg tacaccttca cgaattacgg gatgaactgg 120 gtcaagcagg ctccaggcaa agggctgaag tggatgggct ggattaacac caatactggg 180 gaaccaacct atgccgagga attcaagggg agatttgcct tttccctcga aaccagcgcc 240 tcaaccgcct atctccagat caacaacctg aagaatgagg ataccgctac ctacttctgt 300 gcaagggact acctctacta cttcgactat tggggccaag gtacgactct tacagtctct 360 agtgttgagg gagggagtgg aggttctgga ggctctggtg gctctggagg cgttgacaac 420 atcgtgatga ctcagtctcc caaaagcatg agtatgagtg tgggtgaacg agttaccttg 480 acatgcaaag cctccgagaa tgtcgtgaca tacgtgtcct ggtatcagca gaaacccgag 540 caatccccta agctgctgat ctatggcgct agcaatcgct atactggcgt acctgatcgg 600 ttcacaggat caggctcagc cactgacttt actcttacca tttcctccgt gcaggcagaa 660 gatttggcag attaccactg tgggcaaggt tactcttatc cctatacatt tggaggcggc 720 acaaagctgg agattaagta a 741 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for synthetic peptide derived from the signal sequence of HLA-G (G peptide) <400> 127 Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu 1 5 <210> 128 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of G peptide including most likely codons <400> 128 gtgatggccc cccggaccct gttcctg 27 <210> 129 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of G peptide including consensus codons <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 129 gtnatggcnc cnmgnacnyt nttyytn 27 <210> 130 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for human beta-2-microglobulin (B2M) signal peptide (residues 1-20 of UniProt ID P61769) <400> 130 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala 20 <210> 131 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of human B2M signal peptide including most likely codons based upon SEQ ID NO: 130 <400> 131 atgagccgga gcgtggccct ggccgtgctg gccctgctga gcctgagcgg cctggaggcc 60 <210> 132 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of human B2M signal peptide including consensus codons based upon SEQ ID NO: 130 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <400> 132 atgwsnmgnw sngtngcnyt ngcngtnytn gcnytnytnw snytnwsngg nytngargcn 60 <210> 133 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for mature human B2M without signal peptide (residues 21-119 of UniProt ID P61769) <400> 133 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 20 25 30 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 35 40 45 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 85 90 95 Arg Asp Met <210> 134 <211> 297 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of mature human B2M without signal sequence including most likely codons based upon SEQ ID NO: 133 <400> 134 atccagcgga cccccaagat ccaggtgtac agccggcacc ccgccgagaa cggcaagagc 60 aacttcctga actgctacgt gagcggcttc caccccagcg acatcgaggt ggacctgctg 120 aagaacggcg agcggatcga gaaggtggag cacagcgacc tgagcttcag caaggactgg 180 agcttctacc tgctgtacta caccgagttc acccccaccg agaaggacga gtacgcctgc 240 cgggtgaacc acgtgaccct gagccagccc aagatcgtga agtgggaccg ggacatg 297 <210> 135 <211> 297 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of human B2M without signal sequence including consensus codons based upon SEQ ID NO: 133 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (96)..(96) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (111)..(111) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (129)..(129) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (135)..(135) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (147)..(147) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (156)..(156) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (162)..(162) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (165)..(165) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (171)..(171) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (183)..(183) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (192)..(192) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (195)..(195) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (213)..(213) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (216)..(216) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (219)..(219) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (237)..(237) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (243)..(243) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (255)..(255) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (258)..(258) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (261)..(261) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (264)..(264) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (270)..(270) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (279)..(279) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (291)..(291) <223> n is a, c, g, or t <400> 135 athcarmgna cnccnaarat hcargtntay wsnmgncayc cngcngaraa yggnaarwsn 60 aayttyytna aytgytaygt nwsnggntty cayccnwsng ayathgargt ngayytnytn 120 aaraayggng armgnathga raargtngar caywsngayy tnwsnttyws naargaytgg 180 wsnttytayy tnytntayta yacngartty acnccnacng araargayga rtaygcntgy 240 mgngtnaayc aygtnacnyt nwsncarccn aarathgtna artgggaymg ngayatg 297 <210> 136 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human HLA-E 01:03 heavy chain without signal peptide (residues 22-358 of UniProt ID P13747) <400> 136 Gly Ser His Ser Leu Lys Tyr Phe His Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Val Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr 50 55 60 Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn Leu Arg Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln 85 90 95 Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Glu 130 135 140 Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu Lys Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His 180 185 190 Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly Glu Gly His 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Val Thr Leu 260 265 270 Arg Trp Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile 275 280 285 Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly Ala Val Val Ala 290 295 300 Ala Val Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr 305 310 315 320 Ser Lys Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Glu Ser His Ser 325 330 335 Leu <210> 137 <211> 1011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of human HLA-E 01:03 heavy chain without signal peptide (nucleotides 87-1094 of NCBI Ref: NM_005516.6) <400> 137 ggctcccact ccttgaagta tttccacact tccgtgtccc ggcccggccg cggggagccc 60 cgcttcatct ctgtgggcta cgtggacgac acccagttcg tgcgcttcga caacgacgcc 120 gcgagtccga ggatggtgcc gcgggcgccg tggatggagc aggaggggtc agagtattgg 180 gaccgggaga cacggagcgc cagggacacc gcacagattt tccgagtgaa tctgcggacg 240 ctgcgcggct actacaatca gagcgaggcc gggtctcaca ccctgcagtg gatgcatggc 300 tgcgagctgg ggcccgacgg gcgcttcctc cgcgggtatg aacagttcgc ctacgacggc 360 aaggattatc tcaccctgaa tgaggacctg cgctcctgga ccgcggtgga cacggcggct 420 cagatctccg agcaaaagtc aaatgatgcc tctgaggcgg agcaccagag agcctacctg 480 gaagacacat gcgtggagtg gctccacaaa tacctggaga aggggaagga gacgctgctt 540 cacctggagc ccccaaagac acacgtgact caccacccca tctctgacca tgaggccacc 600 ctgaggtgct gggccctggg cttctaccct gcggagatca cactgacctg gcagcaggat 660 ggggagggcc atacccagga cacggagctc gtggagacca ggcctgcagg ggatggaacc 720 ttccagaagt gggcagctgt ggtggtgcct tctggagagg agcagagata cacgtgccat 780 gtgcagcatg aggggctacc cgagcccgtc accctgagat ggaagccggc ttcccagccc 840 accatcccca tcgtgggcat cattgctggc ctggttctcc ttggatctgt ggtctctgga 900 gctgtggttg ctgctgtgat atggaggaag aagagctcag gtggaaaagg agggagctac 960 tctaaggctg agtggagcga cagtgcccag gggtctgagt ctcacagctt g 1011 <210> 138 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human CD8 alpha chain transmembrane domain (residues 183-203 of UniProt ID P01732-1) <400> 138 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 139 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of human CD8 alpha chain transmembrane domain (nucleotides 1578 to 1640 of NCBI Ref: NM_001145873.1) <400> 139 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 acc 63 <210> 140 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human CD8 alpha chain hinge (residues 135-182 of UniProt ID P01732-1) <400> 140 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 20 25 30 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 141 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of human CD8 alpha chain hinge (nucleotides 1434 to 1577 of NCBI Ref: NM_001145873.1) <400> 141 gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 60 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 120 agggggctgg acttcgcctg tgat 144 <210> 142 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glycine-serine linker sequence <400> 142 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 143 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine-serine linker sequence <400> 143 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 144 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine-serine linker sequence <400> 144 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine-serine linker sequence <400> 145 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 146 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of synthesized cytoplasmic domain of human CD3 zeta chain (residues 52-164 of UniProt ID P20963-1) <400> 146 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 147 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of synthesized cytoplasmic domain of human CD3 zeta chain (nucleotides 299 to 637 of NCBI Ref: NM_198053.2) <400> 147 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 148 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of synthesized cytoplasmic domain of human 4-1BB (residues 214-255 of UniProt ID Q07011) <400> 148 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 149 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of synthesized cytoplasmic domain of human 4-1BB (nucleotides 901 to 1026 of NCBI Ref: NM_001561.5) <400> 149 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 150 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 linker sequence <400> 150 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 linker sequence <400> 151 Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 152 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His tag sequence <400> 152 His His His His His His 1 5 <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag tag sequence <400> 153 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 <210> 154 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag tag sequence <400> 154 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag tag sequence <400> 155 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xpress tag sequence <400> 156 Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Avi tag sequence <400> 157 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 158 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Calmodulin binding peptide (CBP) tag sequence <400> 158 Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu 20 25 <210> 159 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyglutamate tag sequence <400> 159 Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag sequence <400> 160 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag sequence <400> 161 Tyr Ala Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag sequence <400> 162 Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu 1 5 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc tag sequence <400> 163 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 164 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep tag sequence <400> 164 Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 1 5 <210> 165 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep tag II sequence <400> 165 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 166 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Softag 1 sequence <400> 166 Ser Leu Ala Glu Leu Leu Asn Ala Gly Leu Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 167 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Softag 3 sequence <400> 167 Thr Gln Asp Pro Ser Arg Val Gly 1 5 <210> 168 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V5 tag sequence <400> 168 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 169 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized Blue fluorescent protein (BFP) sequence <400> 169 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser His Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 170 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized Enhanced BFP sequence <400> 170 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr His Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 171 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized Enhanced BFP1.2 sequence <400> 171 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Ser His Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Ser His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 172 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized Enhanced BFP2 sequence <400> 172 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Ser His Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Val Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Phe Asn Ser His Asn Ile Tyr Ile Met Ala Val Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Ser His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Arg Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 173 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized oxBFP sequence <400> 173 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Ser Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Ser His Gly Val Gln Val Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Val Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Phe Asn Ser His Asn Ile Tyr Ile Met Ala Val Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Ser His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Arg Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 174 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized moxBFP sequence <400> 174 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Ser Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Ser His Gly Val Gln Val Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Val Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Phe Asn Ser His Asn Ile Tyr Ile Met Ala Val Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Ser His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Arg Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 175 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of myeloproliferative sarcoma virus enhancer, negative control region deleted, dl587rev primer-binding site substituted (MND) promoter <400> 175 tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60 aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120 agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 180 aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 240 atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300 gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 360 tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399 <210> 176 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 176 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 177 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 177 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 178 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 178 Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 179 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 179 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 1 5 10 15 Pro <210> 180 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 180 Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 181 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 181 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 182 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 182 Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro 1 5 10 15 Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys 20 25 30 Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr 35 40 <210> 183 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 183 Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 184 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 184 Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val 1 5 10 15 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 20 25 30 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 35 40 <210> 185 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized 2A peptide sequence <400> 185 Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu 1 5 10 15 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 20 25 30 Pro <210> 186 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn 1 5 10 15 Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Asn Ser Ile Leu 20 25 30 Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala 35 40 45 Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu 50 55 60 Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys 65 70 75 80 Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr 85 90 95 Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys 100 105 110 Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn 115 120 125 Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu 130 135 140 Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu 145 150 155 160 Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly 165 170 175 Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu 180 185 190 Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys 195 200 205 Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser 210 215 220 Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu 225 230 <210> 187 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 187 atggataacc aaggagtaat ctactcagac ctgaatctgc ccccaaaccc aaagaggcag 60 caacgaaaac ctaaaggcaa taaaagctcc attttagcaa ctgaacagga aataacctat 120 gcggaattaa accttcaaaa agcttctcag gattttcaag ggaatgacaa aacctatcac 180 tgcaaagatt taccatcagc tccagagaag ctcattgttg ggatcctggg aattatctgt 240 cttatcttaa tggcctctgt ggtaacgata gttgttattc cctctacatt aatacagagg 300 cacaacaatt cttccctgaa tacaagaact cagaaagcac gtcattgtgg ccattgtcct 360 gaggagtgga ttacatattc caacagttgt tactacattg gtaaggaaag aagaacttgg 420 gaagagagtt tgctggcctg tacttcgaag aactccagtc tgctttctat agataatgaa 480 gaagaaatga aatttctgtc catcatttca ccatcctcat ggattggtgt gtttcgtaac 540 agcagtcatc atccatgggt gacaatgaat ggtttggctt tcaaacatga gataaaagac 600 tcagataatg ctgaacttaa ctgtgcagtg ctacaagtaa atcgacttaa atcagcccag 660 tgtggatctt caataatata tcattgtaag cataagcttt ag 702 <210> 188 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of synthesized cytoplasmic domain of human CD28 (residues 180-220 of UniProt ID P10747) <400> 188 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 189 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of synthesized cytoplasmic domain of human CD28 (nucleotides 223 to 882 of NCBI Ref: NM_006139.3) <400> 189 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 190 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody 8E5B, Kabat numbering <400> 190 Asp Thr Tyr Phe His 1 5 <210> 191 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody 8E5B, Chothia numbering <400> 191 Gly Phe Asn 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Tyr 1 5 <210> 198 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody 8E5B, Kabat numbering <400> 198 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Thr His Leu Phe 1 5 10 15 <210> 199 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody 8E5B, Chothia numbering <400> 199 Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Thr His 1 5 10 <210> 200 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti-NKp46 antibody 8E5B, IMGT numbering <400> 200 Lys Ser Leu Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Thr His 1 5 10 <210> 201 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of anti-NKp46 antibody 8E5B, Kabat numbering <400> 201 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody 8E5B, Kabat numbering <400> 202 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 203 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-NKp46 antibody 8E5B, Chothia numbering <400> 203 His Leu Glu Tyr Pro Phe 1 5 <210> 204 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of VH domain of 8E5B antibody <400> 204 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Phe His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 His Asp Lys Ala Thr Ile Ile Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asn Arg Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 205 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of VL domain of 8E5B antibody <400> 205 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ile 20 25 30 Asn Gly Asn Thr His Leu Phe Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 206 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for 8E5B scFv <400> 206 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ile 20 25 30 Asn Gly Asn Thr His Leu Phe Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 145 150 155 160 Phe His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe His 180 185 190 Asp Lys Ala Thr Ile Ile Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Ala Asn Arg Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser <210> 207 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of G peptide in anti-NKG2A (HLA-E) CAR <400> 207 gtgatggccc ctagaacact gttcctg 27 <210> 208 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of human B2M signal peptide in anti-NKG2A (HLA-E) CAR <400> 208 atgagccgat ccgtggcact ggctgtcctg gctctgctgt ctctgagtgg cctggaagca 60 <210> 209 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of mature human B2M without signal sequence in anti-NKG2A (HLA-E) CAR <400> 209 atccagcgga ctcccaaggt gatggcccct agaacactgt tcctgggcgg aggcggctcc 60 ggaggaggag ggtctggagg cgggggaagt atccagcgga ctcccaagat tcaggtctac 120 agcagacacc ctgccgaaaa cgggaaatcc aacttcctga attgctatgt gtcaggcttt 180 catcccagcg acatcgaggt cgatctgctg aagaatggcg agcggattga aaaagtggag 240 cactctgacc tgtcattcag caaggattgg agcttttacc tgctgtacta tactgagttt 300 accccaacag aaaaagacga gtatgcctgt agggtgaacc atgtcaccct gagtcagccc 360 aagatcgtga aatgggaccg cgatatg 387 <210> 210 <211> 1011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of human HLA-E 01:03 heavy chain without signal peptide in anti-NKG2A (HLA-E) CAR <400> 210 ggttctcact ccttgaagta tttccacact tccgtgtccc ggcccggccg cggggagccc 60 cgcttcatct ctgtgggcta cgtggacgac acccagttcg tgcgcttcga caacgacgcc 120 gcgagtccga ggatggtgcc gcgggcgccg tggatggagc aggaggggtc agagtattgg 180 gaccgggaga cacggagcgc cagggacacc gcacagattt tccgagtgaa tctgcggacg 240 ctgcgcggct actacaatca gagcgaggcc gggtctcaca ccctgcagtg gatgcatggc 300 tgcgagctgg ggcccgacgg gcgcttcctc cgcgggtatg aacagttcgc ctacgacggc 360 aaggattatc tcaccctgaa tgaggacctg cgctcctgga ccgcggtgga cacggcggct 420 cagatctccg agcaaaagtc aaatgatgcc tctgaggcgg agcaccagag agcctacctg 480 gaagacacat gcgtggagtg gctccacaaa tacctggaga aggggaagga gacgctgctt 540 cacctggagc ccccaaagac acacgtgact caccacccca tctctgacca tgaggccacc 600 ctgaggtgct gggccctggg cttctaccct gcggagatca cactgacctg gcagcaggat 660 ggggagggcc atacccagga cacggagctc gtggagacca ggcctgcagg ggatggaacc 720 ttccagaagt gggcagctgt ggtggtgcct tctggagagg agcagagata cacgtgccat 780 gtgcagcatg aggggctacc cgagcccgtc accctgagat ggaagccggc ttcccagccc 840 accatcccca tcgtgggcat cattgctggc ctggttctcc ttggatctgt ggtctctgga 900 gctgtggttg ctgctgtgat atggaggaag aagagctcag gtggaaaagg agggagctac 960 tctaaggctg agtggagcga cagtgcccag gggtctgagt ctcacagctt g 1011 <210> 211 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of GlySer linker <400> 211 ggcggaggcg gctccggagg aggagggtct ggaggcgggg gaagt 45 <210> 212 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of GlySer linker <400> 212 ggcgggggag gctccggggg aggcggctcc ggcggcgggg gaagtggcgg gggaggatcc 60 <210> 213 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of monalizumab <400> 213 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 214 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of monalizumab <400> 214 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 1 5 10 <210> 215 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of monalizumab <400> 215 Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 216 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of monalizumab <400> 216 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 217 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of monalizumab <400> 217 Asn 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Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 230 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 4-1BB/CD3z intracellular signaling domain in CAR constructs <400> 230 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 35 40 45 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 50 55 60 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 65 70 75 80 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 85 90 95 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 100 105 110 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 115 120 125 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 130 135 140 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 145 150 <210> 231 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of 4-1BB/CD3z intracellular signaling domain in CAR constructs <400> 231 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactgcggg tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagaat 180 cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga agggaagagt acgacgtcct ggataagcgg 240 agaggccggg accctgagat gggcggcaag cctcggcgga agaaccccca ggaaggcctg 300 tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc 360 gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg gcctgtccac cgccaccaag 420 gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccaa gg 462 <210> 232 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of CD8 hinge in CAR constructs <400> 232 gccaagccta ccaccacccc tgcccctaga cctccaacac ccgccccaac aatcgccagc 60 cagcctctgt ctctgaggcc cgaggcttgt agaccagctg ctggcggagc cgtgcacacc 120 agaggactgg atttcgcctg cgac 144 <210> 233 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of CD8 transmembrane domain in CAR constructs <400> 233 atctacatct gggcccctct ggccggcaca tgtggcgtgc tgctgctgag cctcgtgatc 60 acc 63 <210> 234 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CD8 hinge and CD8 transmembrane domain in CAR constructs <400> 234 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 20 25 30 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 50 55 60 Ser Leu Val Ile Thr 65 <210> 235 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of CD8 hinge and CD8 transmembrane domain in CAR constructs <400> 235 gccaagccta ccaccacccc tgcccctaga cctccaacac ccgccccaac aatcgccagc 60 cagcctctgt ctctgaggcc cgaggcttgt agaccagctg ctggcggagc cgtgcacacc 120 agaggactgg atttcgcctg cgacatctac atctgggccc ctctggccgg cacatgtggc 180 gtgctgctgc tgagcctcgt gatcacc 207 <210> 236 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mTagBFP (blue fluorescent protein) in CAR constructs <400> 236 Ser Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu Gly 1 5 10 15 Thr Val Asp Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly Lys 20 25 30 Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Val Glu Gly Gly 35 40 45 Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Leu Tyr Gly 50 55 60 Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys 65 70 75 80 Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr Glu 85 90 95 Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp Gly 100 105 110 Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Thr Ser Asn 115 120 125 Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly 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360 agaggggtga acttcacatc caacggccct gtgatgcaga agaaaacact cggctgggag 420 gccttcaccg agacgctgta ccccgctgac ggcggcctgg aaggcagaaa cgacatggcc 480 ctgaagctcg tgggcgggag ccatctgatc gcaaacatca agaccacata tagatccaag 540 aaacccgcta agaacctcaa gatgcctggc gtctactatg tggactacag actggaaaga 600 atcaaggagg ccaacaacga gacctacgtc gagcagcacg aggtggcagt ggccagatac 660 tgcgacctcc ctagcaaact ggggcacaag cttaattga 699 <210> 238 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CD8 signal peptide in CAR constructs <400> 238 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg 20 <210> 239 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of CD8 signal peptide in CAR constructs <400> 239 atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60 ccc 63 <210> 240 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A peptide sequence in CAR constructs <400> 240 Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 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ccggaggagg agggtctgga 120 ggcgggggaa gtatccagcg gactcccaag gtgatggccc ctagaacact gttcctgggc 180 ggaggcggct ccggaggagg agggtctgga ggcgggggaa gtatccagcg gactcccaag 240 attcaggtct acagcagaca ccctgccgaa aacgggaaat ccaacttcct gaattgctat 300 gtgtcaggct ttcatcccag cgacatcgag gtcgatctgc tgaagaatgg cgagcggatt 360 gaaaaagtgg agcactctga cctgtcattc agcaaggatt ggagctttta cctgctgtac 420 tatactgagt ttaccccaac agaaaaagac gagtatgcct gtagggtgaa ccatgtcacc 480 ctgagtcagc ccaagatcgt gaaatgggac cgcgatatgg gcgggggagg ctccggggga 540 ggcggctccg gcggcggggg aagtggcggg ggaggatccg gttctcactc cttgaagtat 600 ttccacactt ccgtgtcccg gcccggccgc ggggagcccc gcttcatctc tgtgggctac 660 gtggacgaca cccagttcgt gcgcttcgac aacgacgccg cgagtccgag gatggtgccg 720 cgggcgccgt ggatggagca ggaggggtca gagtattggg accgggagac acggagcgcc 780 agggacaccg cacagatttt ccgagtgaat ctgcggacgc tgcgcggcta ctacaatcag 840 agcgaggccg ggtctcacac cctgcagtgg atgcatggct gcgagctggg gcccgacggg 900 cgcttcctcc gcgggtatga acagttcgcc tacgacggca aggattatct caccctgaat 960 gaggacctgc gctcctggac cgcggtggac acggcggctc agatctccga gcaaaagtca 1020 aatgatgcct ctgaggcgga gcaccagaga gcctacctgg aagacacatg cgtggagtgg 1080 ctccacaaat acctggagaa ggggaaggag acgctgcttc acctggagcc cccaaagaca 1140 cacgtgactc accaccccat ctctgaccat gaggccaccc tgaggtgctg ggccctgggc 1200 ttctaccctg cggagatcac actgacctgg cagcaggatg gggagggcca tacccaggac 1260 acggagctcg tggagaccag gcctgcaggg gatggaacct tccagaagtg ggcagctgtg 1320 gtggtgcctt ctggagagga gcagagatac acgtgccatg tgcagcatga ggggctaccc 1380 gagcccgtca ccctgagatg gaagccggct tcccagccca ccatccccat cgtgggcatc 1440 attgctggcc tggttctcct tggatctgtg gtctctggag ctgtggttgc tgctgtgata 1500 tggaggaaga agagctcagg tggaaaagga gggagctact ctaaggctga gtggagcgac 1560 agtgcccagg ggtctgagtc tcacagcttg 1590 <210> 244 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an HLA-E mimetic <400> 244 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu 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tgaggggcta 1380 cccgagcccg tcaccctgag atggaagccg gcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc 1440 atcattgctg gcctggttct ccttggatct gtggtctctg gagctgtggt tgctgctgtg 1500 atatggagga agaagagctc aggtggaaaa ggagggagct actctaaggc tgagtggagc 1560 gacagtgccc aggggtctga gtctcacagc ttg 1593 <210> 246 <211> 520 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an HLA-E mimetic <400> 246 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu 20 25 30 Leu Ser Leu Ser Gly Leu Glu Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe 35 40 45 Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 60 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 65 70 75 80 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 85 90 95 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 100 105 110 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 115 120 125 Leu Tyr Tyr Thr 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cgcttcctcc gcgggtatga acagttcgcc tacgacggca aggattatct caccctgaat 960 gaggacctgc gctcctggac cgcggtggac acggcggctc agatctccga gcaaaagtca 1020 aatgatgcct ctgaggcgga gcaccagaga gcctacctgg aagacacatg cgtggagtgg 1080 ctccacaaat acctggagaa ggggaaggag acgctgcttc acctggagcc cccaaagaca 1140 cacgtgactc accaccccat ctctgaccat gaggccaccc tgaggtgctg ggccctgggc 1200 ttctaccctg cggagatcac actgacctgg cagcaggatg gggagggcca tacccaggac 1260 acggagctcg tggagaccag gcctgcaggg gatggaacct tccagaagtg ggcagctgtg 1320 gtggtgcctt ctggagagga gcagagatac acgtgccatg tgcagcatga ggggctaccc 1380 gagcccgtca ccctgagatg gaagccggct tcccagccca ccatccccat cgtgggcatc 1440 attgctggcc tggttctcct tggatctgtg gtctctggag ctgtggttgc tgctgtgata 1500 tggaggaaga agagctcagg tggaaaagga gggagctact ctaaggctga gtggagcgac 1560 agtgcccagg ggtctgagtc tcacagcttg actagtaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1620 tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1680 agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgcgggtgaa gttcagcaga 1740 agcgccgacg cccctgccta ccagcagggc cagaatcagc tgtacaacga gctgaacctg 1800 ggcagaaggg aagagtacga cgtcctggat aagcggagag gccgggaccc tgagatgggc 1860 ggcaagcctc ggcggaagaa cccccaggaa ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag 1920 atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc ggaggcgggg caagggccac 1980 gacggcctgt atcagggcct gtccaccgcc accaaggata cctacgacgc cctgcacatg 2040 caggccctgc ccccaagggg cggccgctcc ggtgagggca gaggaagtct tctaacatgc 2100 ggtgacgtgg aggagaatcc gggcccctct agaagcgagc tgattaagga gaacatgcac 2160 atgaagctgt acatggaggg caccgtggac aaccatcact tcaagtgcac atccgagggc 2220 gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgagaatca aggtggtcga gggcggccct 2280 ctccccttcg ccttcgacat cctggctact agcttcctct acggcagcaa gaccttcatc 2340 aaccacaccc agggcatccc cgacttcttc aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg 2400 gagagagtca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc 2460 caggacggct gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg tgaacttcac atccaacggc 2520 cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggccttca ccgagacgct gtaccccgct 2580 gacggcggcc tggaaggcag aaacgacatg gccctgaagc tcgtgggcgg gagccatctg 2640 atcgcaaaca tcaagaccac atatagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgcct 2700 ggcgtctact atgtggacta cagactggaa agaatcaagg aggccaacaa cgagacctac 2760 gtcgagcagc acgaggtggc agtggccaga tactgcgacc tccctagcaa actggggcac 2820 aagcttaatt ga 2832 <210> 253 <211> 984 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an anti-NKG2A (HLA-E) CAR <400> 253 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr 35 40 45 Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser 50 55 60 Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu 65 70 75 80 Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser 85 90 95 Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr 100 105 110 Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg 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gcccggccgc ggggagcccc gcttcatctc tgtgggctac 660 gtggacgaca cccagttcgt gcgcttcgac aacgacgccg cgagtccgag gatggtgccg 720 cgggcgccgt ggatggagca ggaggggtca gagtattggg accgggagac acggagcgcc 780 agggacaccg cacagatttt ccgagtgaat ctgcggacgc tgcgcggcta ctacaatcag 840 agcgaggccg ggtctcacac cctgcagtgg atgcatggct gcgagctggg gcccgacggg 900 cgcttcctcc gcgggtatga acagttcgcc tacgacggca aggattatct caccctgaat 960 gaggacctgc gctcctggac cgcggtggac acggcggctc agatctccga gcaaaagtca 1020 aatgatgcct ctgaggcgga gcaccagaga gcctacctgg aagacacatg cgtggagtgg 1080 ctccacaaat acctggagaa ggggaaggag acgctgcttc acctggagcc cccaaagaca 1140 cacgtgactc accaccccat ctctgaccat gaggccaccc tgaggtgctg ggccctgggc 1200 ttctaccctg cggagatcac actgacctgg cagcaggatg gggagggcca tacccaggac 1260 acggagctcg tggagaccag gcctgcaggg gatggaacct tccagaagtg ggcagctgtg 1320 gtggtgcctt ctggagagga gcagagatac acgtgccatg tgcagcatga ggggctaccc 1380 gagcccgtca ccctgagatg gaagccggct tcccagccca ccatccccat cgtgggcatc 1440 attgctggcc tggttctcct tggatctgtg 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tgcggtgacg tggaggagaa tccgggcccc 2340 tctagaagcg agctgattaa ggagaacatg cacatgaagc tgtacatgga gggcaccgtg 2400 gacaaccatc acttcaagtg cacatccgag ggcgaaggca agccctacga gggcacccag 2460 accatgagaa tcaaggtggt cgagggcggc cctctcccct tcgccttcga catcctggct 2520 actagcttcc tctacggcag caagaccttc atcaaccaca cccagggcat ccccgacttc 2580 ttcaagcagt ccttccctga gggcttcaca tgggagagag tcaccacata cgaagacggg 2640 ggcgtgctga ccgctaccca ggacaccagc ctccaggacg gctgcctcat ctacaacgtc 2700 aagatcagag gggtgaactt cacatccaac ggccctgtga tgcagaagaa aacactcggc 2760 tgggaggcct tcaccgagac gctgtacccc gctgacggcg gcctggaagg cagaaacgac 2820 atggccctga agctcgtggg cgggagccat ctgatcgcaa acatcaagac cacatataga 2880 tccaagaaac ccgctaagaa cctcaagatg cctggcgtct actatgtgga ctacagactg 2940 gaaagaatca aggaggccaa caacgagacc tacgtcgagc agcacgaggt ggcagtggcc 3000 agatactgcg acctccctag caaactgggg cacaagctta attga 3045 <210> 255 <211> 913 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an anti-NKG2A (HLA-E) CAR <400> 255 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tactatactg agtttacccc aacagaaaaa gacgagtatg cctgtagggt gaaccatgtc 480 accctgagtc agcccaagat cgtgaaatgg gaccgcgata tgggcggggg aggctccggg 540 ggaggcggct ccggcggcgg gggaagtggc gggggaggat ccggttctca ctccttgaag 600 tatttccaca cttccgtgtc ccggcccggc cgcggggagc cccgcttcat ctctgtgggc 660 tacgtggacg acacccagtt cgtgcgcttc gacaacgacg ccgcgagtcc gaggatggtg 720 ccgcgggcgc cgtggatgga gcaggagggg tcagagtatt gggaccggga gacacggagc 780 gccagggaca ccgcacagat tttccgagtg aatctgcgga cgctgcgcgg ctactacaat 840 cagagcgagg ccgggtctca caccctgcag tggatgcatg gctgcgagct ggggcccgac 900 gggcgcttcc tccgcgggta tgaacagttc gcctacgacg gcaaggatta tctcaccctg 960 aatgaggacc tgcgctcctg gaccgcggtg gacacggcgg ctcagatctc cgagcaaaag 1020 tcaaatgatg cctctgaggc ggagcaccag agagcctacc tggaagacac atgcgtggag 1080 tggctccaca aatacctgga gaaggggaag gagacgctgc ttcacctgga gcccccaaag 1140 acacacgtga ctcaccaccc catctctgac catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg 1200 ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc tggcagcagg atggggaggg ccatacccag 1260 gacacggagc tcgtggagac caggcctgca ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct 1320 gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggcta 1380 cccgagcccg tcaccctgag atggaagccg gcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc 1440 atcattgctg gcctggttct ccttggatct gtggtctctg gagctgtggt tgctgctgtg 1500 atatggagga agaagagctc aggtggaaaa ggagggagct actctaaggc tgagtggagc 1560 gacagtgccc aggggtctga gtctcacagc ttgactagta aacggggcag aaagaaactc 1620 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1680 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgcgggt gaagttcagc 1740 agaagcgccg acgcccctgc ctaccagcag ggccagaatc agctgtacaa cgagctgaac 1800 ctgggcagaa gggaagagta cgacgtcctg gataagcgga gaggccggga ccctgagatg 1860 ggcggcaagc ctcggcggaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1920 aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggaggcg gggcaagggc 1980 cacgacggcc tgtatcaggg cctgtccacc gccaccaagg atacctacga cgccctgcac 2040 atgcaggccc tgcccccaag gggcggccgc tccggtgagg gcagaggaag tcttctaaca 2100 tgcggtgacg tggaggagaa tccgggcccc tctagaagcg agctgattaa ggagaacatg 2160 cacatgaagc tgtacatgga gggcaccgtg gacaaccatc acttcaagtg cacatccgag 2220 ggcgaaggca agccctacga gggcacccag accatgagaa tcaaggtggt cgagggcggc 2280 cctctcccct tcgccttcga catcctggct actagcttcc tctacggcag caagaccttc 2340 atcaaccaca cccagggcat ccccgacttc ttcaagcagt ccttccctga gggcttcaca 2400 tgggagagag tcaccacata cgaagacggg ggcgtgctga ccgctaccca ggacaccagc 2460 ctccaggacg gctgcctcat ctacaacgtc aagatcagag gggtgaactt cacatccaac 2520 ggccctgtga tgcagaagaa aacactcggc tgggaggcct tcaccgagac gctgtacccc 2580 gctgacggcg gcctggaagg cagaaacgac atggccctga agctcgtggg cgggagccat 2640 ctgatcgcaa acatcaagac cacatataga tccaagaaac ccgctaagaa cctcaagatg 2700 cctggcgtct actatgtgga ctacagactg gaaagaatca aggaggccaa caacgagacc 2760 tacgtcgagc agcacgaggt ggcagtggcc agatactgcg acctccctag caaactgggg 2820 cacaagctta attga 2835 <210> 257 <211> 1004 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an anti-NKG2A (HLA-E) CAR <400> 257 Met Ala 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tctgggcccc tctggccggc acatgtggcg tgctgctgct gagcctcgtg 1800 atcaccacta gtaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1860 agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1920 gaaggaggat gtgaactgcg ggtgaagttc agcagaagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1980 cagggccaga atcagctgta caacgagctg aacctgggca gaagggaaga gtacgacgtc 2040 ctggataagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agcctcggcg gaagaacccc 2100 caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 2160 ggcatgaagg gcgagcggag gcggggcaag ggccacgacg gcctgtatca gggcctgtcc 2220 accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc aaggggcggc 2280 cgctccggtg agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatccgggc 2340 ccctctagaa gcgagctgat taaggagaac atgcacatga agctgtacat ggagggcacc 2400 gtggacaacc atcacttcaa gtgcacatcc gagggcgaag gcaagcccta cgagggcacc 2460 cagaccatga gaatcaaggt ggtcgagggc ggccctctcc ccttcgcctt cgacatcctg 2520 gctactagct tcctctacgg cagcaagacc ttcatcaacc acacccaggg catccccgac 2580 ttcttcaagc agtccttccc tgagggcttc acatgggaga gagtcaccac atacgaagac 2640 gggggcgtgc tgaccgctac ccaggacacc agcctccagg acggctgcct catctacaac 2700 gtcaagatca gaggggtgaa cttcacatcc aacggccctg tgatgcagaa gaaaacactc 2760 ggctgggagg ccttcaccga gacgctgtac cccgctgacg gcggcctgga aggcagaaac 2820 gacatggccc tgaagctcgt gggcgggagc catctgatcg caaacatcaa gaccacatat 2880 agatccaaga aacccgctaa gaacctcaag atgcctggcg tctactatgt ggactacaga 2940 ctggaaagaa tcaaggaggc caacaacgag acctacgtcg agcagcacga ggtggcagtg 3000 gccagatact gcgacctccc tagcaaactg gggcacaagc ttaattga 3048 <210> 259 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of transmembrane domain of an HLA-E alpha chain found in mature B2M set forth in SEQ ID NO: 136 <400> 259 Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly 1 5 10 15 Ala Val Val Ala Ala Val Ile Trp 20 <210> 260 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-NKp46 antibody <400> 260 Thr Tyr Gly Ile Gly Val Gly 1 5 <210> 261 <211> 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Gly Thr Val Val Ser Glu Gly Gln His Val Thr Leu Gln 35 40 45 Cys Arg Ser Arg Leu Gly Phe Asn Glu Phe Ser Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Gly Met Pro Val Pro Glu Leu Tyr Asn Arg Ile Phe Arg Asn Ser Phe 65 70 75 80 Leu Met Gly Pro Val Thr Pro Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Cys 85 90 95 Ser Ser His Pro His Ser Pro Thr Gly Trp Ser Ala Pro Ser Asn Pro 100 105 110 Val Val Ile Met Val Thr Gly Val His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala 115 120 125 His Pro Gly Pro Leu Val Lys Ser Gly Glu Thr Val Ile Leu Gln Cys 130 135 140 Trp Ser Asp Val Arg Phe Glu Arg Phe Leu Leu His Arg Glu Gly Ile 145 150 155 160 Thr Glu Asp Pro Leu Arg Leu Val Gly Gln Leu His Asp Ala Gly Ser 165 170 175 Gln Val Asn Tyr Ser Met Gly Pro Met Thr Pro Ala Leu Ala Gly Thr 180 185 190 Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Val Thr His Leu Pro Tyr Glu Leu Ser Ala 195 200 205 Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Val Val Val Gly Leu Tyr Gly Lys Pro 210 215 220 Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Gln Ala Gly Glu Asn Val 225 230 235 240 Thr Leu Ser Cys Ser Ser Arg Ser Leu Phe Asp Ile Tyr His Leu Ser 245 250 255 Arg Glu Ala Glu Ala Gly Glu Leu Arg Leu Thr Ala Val Leu Arg Val 260 265 270 Asn Gly Thr Phe Gln Ala Asn Phe Pro Leu Gly Pro Val Thr His Gly 275 280 285 Gly Asn Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg Ala Leu Pro His Ala Trp 290 295 300 Ser Asp Pro Ser Asp Pro Leu Pro Val Ser Val Thr Gly Asn Ser Arg 305 310 315 320 His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Ile Pro Phe Ala 325 330 335 Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ala Asn Lys Lys Asn 340 345 350 Ala Val Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn Arg 355 360 365 Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu 370 375 380 Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg Pro Ser Gln Arg 385 390 395 400 Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ser Val 405 410 <210> 271 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 271 Met Ser Met Ser Pro Thr Val Ile Ile Leu Ala Cys Leu Gly Phe Phe 1 5 10 15 Leu Asp Gln Ser Val Trp Ala His Val Gly Gly Gln Asp Lys Pro Phe 20 25 30 Cys Ser Ala Trp Pro Ser Ala Val Val Pro Gln Gly Gly His Val Thr 35 40 45 Leu Arg Cys His Tyr Arg Arg Gly Phe Asn Ile Phe Thr Leu Tyr Lys 50 55 60 Lys Asp Gly Val Pro Val Pro Glu Leu Tyr Asn Arg Ile Phe Trp Asn 65 70 75 80 Ser Phe Leu Ile Ser Pro Val Thr Pro Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg 85 90 95 Cys Arg Gly Phe His Pro His Ser Pro Thr Glu Trp Ser Ala Pro Ser 100 105 110 Asn Pro Leu Val Ile Met Val Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Pro Ser Leu 115 120 125 Thr Ala Arg Pro Gly Pro Thr Val Arg Ala Gly Glu Asn Val Thr Leu 130 135 140 Ser Cys Ser Ser Gln Ser Ser Phe Asp Ile Tyr His Leu Ser Arg Glu 145 150 155 160 Gly Glu Ala His Glu Leu Arg Leu Pro Ala Val Pro Ser Ile Asn Gly 165 170 175 Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly Glu Thr 180 185 190 Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe His Gly Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Asp 195 200 205 Pro Ser Asp Pro Leu Pro Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser Ser Ser 210 215 220 Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ala Arg His 225 230 235 240 Leu His Ala Val Ile Arg Tyr Ser Val Ala Ile Ile Leu Phe Thr Ile 245 250 255 Leu Pro Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Lys Lys Lys Asp Ala 260 265 270 Ala Val Met Asn Gln Glu Pro Ala Gly His Arg Thr Val Asn Arg Glu 275 280 285 Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asp 290 295 300 His Cys Ile Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Gly Pro Ser Gln Arg Ser 305 310 315 320 Lys Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ser Val Cys Ile Glu Leu Pro Asn Ala 325 330 335 Glu Pro Arg Ala Leu Ser Pro Ala His Glu His His Ser Gln Ala Leu 340 345 350 Met Gly Ser Ser Arg Glu Thr Thr Ala Leu Ser Gln Thr Gln Leu Ala 355 360 365 Ser Ser Asn Val Pro Ala Ala Gly Ile 370 375 <210> 272 <211> 341 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 272 Met Ser Leu Met Val Val Ser Met Val Cys Val Gly Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Gln Gly Ala Trp Pro His Glu Gly Val His Arg Lys Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Ala His Pro Gly Pro Leu Val Lys Ser Glu Glu Thr Val Ile Leu Gln 35 40 45 Cys Trp Ser Asp Val Arg Phe Gln His Phe Leu Leu His Arg Glu Gly 50 55 60 Lys Phe Lys Asp Thr Leu His Leu Ile Gly Glu His His Asp Gly Val 65 70 75 80 Ser Lys Ala Asn Phe Ser Ile Gly Pro Met Met Gln Asp Leu Ala Gly 85 90 95 Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Thr His Ser Pro Tyr Gln Leu Ser 100 105 110 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Val Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Lys 115 120 125 Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Leu Ala Gly Glu Ser 130 135 140 Val Thr Leu Ser Cys Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Asp Met Tyr His Leu 145 150 155 160 Ser Arg Glu Gly Glu Ala His Glu Arg Arg Phe Ser Ala Gly Pro Lys 165 170 175 Val Asn Gly Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His 180 185 190 Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg Asp Ser Pro Tyr Glu 195 200 205 Trp Ser Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro 210 215 220 Ser Asn Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Glu Thr Gly Asn 225 230 235 240 Pro Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Ile Leu 245 250 255 Phe Ile Leu Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Cys Asn Lys 260 265 270 Lys Asn Ala Val Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val 275 280 285 Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr Tyr Ala 290 295 300 Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg Pro Ser 305 310 315 320 Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Ile Ile Val Tyr Thr Glu Leu 325 330 335 Pro Asn Ala Glu Pro 340 <210> 273 <211> 455 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 273 Met Ser Leu Thr Val Val Ser Met Ala Cys Val Gly Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Gln Gly Ala Trp Pro Leu Met Gly Gly Gln Asp Lys Pro Phe Leu Ser 20 25 30 Ala Arg Pro Ser Thr Val Val Pro Arg Gly Gly His Val Ala Leu Gln 35 40 45 Cys His Tyr Arg Arg Gly Phe Asn Asn Phe Met Leu Tyr Lys Glu Asp 50 55 60 Arg Ser His Val Pro Ile Phe His Gly Arg Ile Phe Gln Glu Ser Phe 65 70 75 80 Ile Met Gly Pro Val Thr Pro Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Arg 85 90 95 Gly Ser Arg Pro His Ser Leu Thr Gly Trp Ser Ala Pro Ser Asn Pro 100 105 110 Leu Val Ile Met Val Thr Gly Asn His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala 115 120 125 His Pro Gly Pro Leu Leu Lys Ser Gly Glu Thr Val Ile Leu Gln Cys 130 135 140 Trp Ser Asp Val Met Phe Glu His Phe Phe Leu His Arg Glu Gly Ile 145 150 155 160 Ser Glu Asp Pro Ser Arg Leu Val Gly Gln Ile His Asp Gly Val Ser 165 170 175 Lys Ala Asn Phe Ser Ile Gly Pro Leu Met Pro Val Leu Ala Gly Thr 180 185 190 Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Pro His Ser Pro Tyr Gln Leu Ser Ala 195 200 205 Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Val Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Pro 210 215 220 Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Gln Ala Gly Glu Asn Val 225 230 235 240 Thr Leu Ser Cys Ser Ser Trp Ser Ser Tyr Asp Ile Tyr His Leu Ser 245 250 255 Arg Glu Gly Glu Ala His Glu Arg Arg Leu Arg Ala Val Pro Lys Val 260 265 270 Asn Arg Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly 275 280 285 Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg Ala Leu Pro Cys Val Trp 290 295 300 Ser Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser 305 310 315 320 Ser Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Ser Gly Ile Cys 325 330 335 Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Phe Leu Phe 340 345 350 Ile Leu Leu Leu Phe Phe Leu Leu Tyr Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys 355 360 365 Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asp Arg Thr Val Asn 370 375 380 Arg Gln Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr Tyr Ala Gln 385 390 395 400 Leu Asp His Cys Val Phe Ile Gln Arg Lys Ile Ser Arg Pro Ser Gln 405 410 415 Arg Pro Lys Thr Pro Leu Thr Asp Thr Ser Val Tyr Thr Glu Leu Pro 420 425 430 Asn Ala Glu Pro Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro Arg Ala Pro Gln 435 440 445 Ser Gly Leu Glu Gly Val Phe 450 455 <210> 274 <211> 348 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 274 Met Ser Leu Leu Val Val Ser Met Ala Cys Val Gly Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Gln Gly Ala Trp Pro His Glu Gly Val His Arg Lys Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Ala His Pro Gly Pro Leu Val Lys Ser Glu Glu Thr Val Ile Leu Gln 35 40 45 Cys Trp Ser Asp Val Met Phe Glu His Phe Leu Leu His Arg Glu Gly 50 55 60 Met Phe Asn Asp Thr Leu Arg Leu Ile Gly Glu His His Asp Gly Val 65 70 75 80 Ser Lys Ala Asn Phe Ser Ile Ser Arg Met Thr Gln Asp Leu Ala Gly 85 90 95 Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Thr His Ser Pro Tyr Gln Val Ser 100 105 110 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Val Ile Ile Gly Leu Tyr Glu Lys 115 120 125 Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Leu Ala Gly Glu Asn 130 135 140 Val Thr Leu Ser Cys Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Asp Met Tyr His Leu 145 150 155 160 Ser Arg Glu Gly Glu Ala His Glu Arg Arg Leu Pro Ala Gly Pro Lys 165 170 175 Val Asn Gly Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His 180 185 190 Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe His Asp Ser Pro Tyr Glu 195 200 205 Trp Ser Lys Ser Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro 210 215 220 Ser Asn Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Thr Gly Asn 225 230 235 240 Pro Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Ile Leu 245 250 255 Phe Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys 260 265 270 Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Ser Ala Gly Asn Arg Thr Ala Asn 275 280 285 Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr Tyr Thr Gln 290 295 300 Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg Pro Ser Gln 305 310 315 320 Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Ile Ile Val Tyr Thr Glu Leu Pro 325 330 335 Asn Ala Glu Ser Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro 340 345 <210> 275 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 Met Ser Leu Met Val Val Ser Met Ala Cys Val Gly Leu Phe Leu Val 1 5 10 15 Gln Arg Ala Gly Pro His Met Gly Gly Gln Asp Lys Pro Phe Leu Ser 20 25 30 Ala Trp Pro Ser Ala Val Val Pro Arg Gly Gly His Val Thr Leu Arg 35 40 45 Cys His Tyr Arg His Arg Phe Asn Asn Phe Met Leu Tyr Lys Glu Asp 50 55 60 Arg Ile His Ile Pro Ile Phe His Gly Arg Ile Phe Gln Glu Ser Phe 65 70 75 80 Asn Met Ser Pro Val Thr Thr Ala His Ala Gly Asn Tyr Thr Cys Arg 85 90 95 Gly Ser His Pro His Ser Pro Thr Gly Trp Ser Ala Pro Ser Asn Pro 100 105 110 Val Val Ile Met Val Thr Gly Asn His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala 115 120 125 His Pro Gly Pro Leu Val Lys Ser Gly Glu Arg Val Ile Leu Gln Cys 130 135 140 Trp Ser Asp Ile Met Phe Glu His Phe Phe Leu His Lys Glu Gly Ile 145 150 155 160 Ser Lys Asp Pro Ser Arg Leu Val Gly Gln Ile His Asp Gly Val Ser 165 170 175 Lys Ala Asn Phe Ser Ile Gly Pro Met Met Leu Ala Leu Ala Gly Thr 180 185 190 Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Thr His Thr Pro Tyr Gln Leu Ser Ala 195 200 205 Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Val Val Thr Gly Pro Tyr Glu Lys Pro 210 215 220 Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Lys Val Gln Ala Gly Glu Ser Val 225 230 235 240 Thr Leu Ser Cys Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Asp Met Tyr His Leu Ser 245 250 255 Arg Glu Gly Gly Ala His Glu Arg Arg Leu Pro Ala Val Arg Lys Val 260 265 270 Asn Arg Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly 275 280 285 Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg His Ser Pro Tyr Glu Trp 290 295 300 Ser Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser 305 310 315 320 Ser Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Ser Gly Asn Pro 325 330 335 Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Ile Leu Phe 340 345 350 Ile Leu Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Leu Trp Cys Ser Asn Lys Lys 355 360 365 Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Ala Asn 370 375 380 Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Glu Glu Val Thr Tyr Ala Gln 385 390 395 400 Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg Pro Ser Gln 405 410 415 Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ile Leu Tyr Thr Glu Leu Pro 420 425 430 Asn Ala Lys Pro Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro 435 440 <210> 276 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid consensus sequence of a synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 276 Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu 1 5 <210> 277 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 277 Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu 1 5 <210> 278 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 278 Val Met Ala Pro Arg Thr Val Leu Leu 1 5 <210> 279 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 279 Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu 1 5 <210> 280 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 280 Val Met Ala Pro Arg Thr Val Phe Leu 1 5 <210> 281 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 281 Val Met Pro Pro Arg Thr Leu Leu Leu 1 5 <210> 282 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 282 Val Thr Ala Pro Arg Thr Val Leu Leu 1 5 <210> 283 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 283 Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu 1 5 <210> 284 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 284 Val Met Ala Pro Arg Ala Leu Leu Leu 1 5 <210> 285 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide from the signal sequence of a classical MHC class I molecule <400> 285 Val Met Ala Pro Gln Ala Leu Leu Leu 1 5 <210> 286 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide of multidrug resistance-associated protein 7 <400> 286 Ala Leu Ala Leu Val Arg Met Leu Ile 1 5 <210> 287 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a leader peptide of HSP60 <400> 287 Gln Met Arg Pro Val Ser Arg Val Leu 1 5 <210> 288 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-KIR antibody (US9879082) <400> 288 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Ser Phe Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Pro Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp 115 120 125 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 145 150 155 160 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr 210 215 220 Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 225 230 235 240 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 340 345 350 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Gly Lys 465 <210> 289 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable domain of anti-KIR antibody (US9879082) <400> 289 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105

Claims (112)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포로서, 발현될 때 상기 CAR은
    세포외 성분;
    세포내 성분; 및
    세포외 성분을 세포내 성분에 연결하는 막횡단 도메인
    을 포함하고,
    상기 세포외 성분은
    (A) Kabat 넘버링에 따라, 서열번호: 190에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 193에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 196에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; 및 서열번호: 198에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 201에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 202에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함하는 NKp46 결합 도메인; 및
    (B) i) HLA-G의 신호 펩타이드; ii) 성숙한 베타-2 마이크로글로불린 (B2M); 및 iii) HLA-E 01:03 중쇄의 이종삼량체를 포함하는 인공 인간 백혈구 항원 (HLA)-E 모방체를 포함하는 NKG2A 결합 도메인
    을 포함하는, 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 NKp46 결합 도메인은 서열번호: 204에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 205에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하고; 그리고/또는
    상기 인공 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열을 갖는, 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-NKp46 결합 도메인은 서열번호: 206에 제시된 서열을 갖는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)인, 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포내 성분은 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ, 공통 FcRγ, Fc γ RIIa, FcR β, CD3 γ, CD3 δ, CD3 ε, CD79a, CD79b, DAP10, 및/또는 DAP12를 포함하는, 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 또는 조혈 전구 세포 (HPC)인, 세포.
  7. 키메라 항원 수용체 (CAR)로서, 세포에 의해 발현될 때,
    세포외 성분; 및
    세포내 성분
    을 포함하고,
    상기 세포외 성분은 활성화 NK 수용체 결합 도메인 및/또는 억제성 NK 수용체 결합 도메인을 포함하는, CAR.
  8. 제7항에 있어서, 세포외 성분을 세포내 성분에 연결하는 막횡단 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
  9. 제7항에 있어서, 상기 활성화 NK 수용체 결합 도메인은 NKp30 결합 도메인, NKp44 결합 도메인, 및/또는 NKp46 결합 도메인을 포함하는, CAR.
  10. 제9항에 있어서, 상기 NKp30 결합 도메인은 항체 AZ20, 항체 A76, 항체 Z25, 항체 15E1, 항체 9G1, 항체 15H6, 항체 9D9, 항체 3A12, 항체 12D10, 항체 클론 # 210845, 항체 클론 p30-15, 또는 항체 클론 AF29-4D12의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
  11. 제9항에 있어서, 상기 NKp44 결합 도메인은 항체 Z231, 항체 클론 # 253415, 항체 클론 44.189, 항체 클론 1G6, 또는 항체 클론 P44-8의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
  12. 제9항에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은
    (A) 서열번호: 190에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 193에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 196에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; 및 서열번호: 198에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 201에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 202에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인;
    (B) 서열번호: 3에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 6에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 9에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 12에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 15에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 16에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
    (C) 서열번호: 19에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 22에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 27에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 30에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 31에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
    (D) 서열번호: 33에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 36에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 39에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 42에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 45에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 46에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
    (E) 서열번호: 48에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 51에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 54에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 57에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 60에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 61에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
    (F) 서열번호: 63에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 66에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 69에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 42에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 45에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 72에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
    (G) 서열번호: 74에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 77에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 78에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 81에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 30에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 82에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
    (H) 서열번호: 84에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 87에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 90에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 93에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 96에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 97에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (I) 서열번호: 260에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 261에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 262에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호: 263에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호: 264에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 265에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하고,
    상기 각각은 Kabat 넘버링을 따르는, CAR.
  13. 제9항에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은
    (A) 서열번호: 204에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 205 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
    (B) 서열번호: 99 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 100 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
    (C) 서열번호: 101 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 102 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
    (D) 서열번호: 103 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 104 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
    (E) 서열번호: 105 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 106 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
    (F) 서열번호: 107 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 108 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
    (G) 서열번호: 109 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 110 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인;
    (H) 서열번호: 111 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 112 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인; 또는
    (I) 서열번호: 266에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 항원 결합 단편 및 서열번호: 267 에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 항원 결합 단편
    을 포함하는, CAR.
  14. 제9항에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은
    (A) 서열번호: 204에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 205에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
    (B) 서열번호: 99에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 100에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
    (C) 서열번호: 101에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 102에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
    (D) 서열번호: 103에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 104에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
    (E) 서열번호: 105에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 106에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
    (F) 서열번호: 107에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 108에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
    (G) 서열번호: 109에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 110에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인;
    (H) 서열번호: 111에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호: 112에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인; 또는
    (I) 서열번호: 266에 제시된 서열을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편 및 서열번호: 267에 제시된 서열을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편
    을 포함하는, CAR.
  15. 제9항에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은 서열번호: 206, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 서열번호: 118, 또는 서열번호: 119에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는, CAR.
  16. 제9항에 있어서, 상기 NKp46 결합 도메인은 서열번호: 206, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 서열번호: 118, 또는 서열번호: 119에 제시된 서열을 갖는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는, CAR.
  17. 제7항에 있어서, 상기 억제성 NK 수용체 결합 도메인은 살해 면역글로불린 수용체 (KIR) 결합 도메인 및/또는 NKG2A 결합 도메인을 포함하는, CAR.
  18. 제17항에 있어서, 상기 KIR 결합 도메인은 서열번호: 288에 제시된 중쇄의 항원 결합 단편 및 서열번호: 289에 제시된 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
  19. 제17항에 있어서, 상기 KIR 결합 도메인은 항체 A210, 항체 A803g, 항체 클론 # 180704, 및 항체 클론 NKVFS1의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
  20. 제17항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 인공 인간 백혈구 항원 (HLA)-E 모방체를 포함하는, CAR.
  21. 제14항에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 i) HLA-E 결합 신호 펩타이드; ii) 성숙한 베타-2 마이크로글로불린 (B2M); 및 iii) HLA-E 01:03 중쇄의 이종삼량체를 포함하는, CAR.
  22. 제21항에 있어서, 상기 HLA-E 결합 신호 펩타이드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 HLA-G의 신호 펩타이드; 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 거대세포바이러스 (CMV) 또는 엡스타인-바 바이러스 (EBV)로부터의 펩타이드; 다중약물 내성-관련 단백질 7의 펩타이드; 또는 HSP60의 리더 펩타이드를 포함하는, CAR.
  23. 제21항에 있어서, 상기 HLA-E 결합 신호 펩타이드는 서열번호: 127, 및 276-287에 제시된 서열을 포함하는, CAR.
  24. 제20항에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, CAR.
  25. 제20항에 있어서, 상기 HLA-E 모방체는 서열번호: 242, 244, 또는 246에 제시된 서열을 갖는, CAR.
  26. 제17항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 모날리주맙, 항체 Z270, 항체 Z199, 항체 20D5, 또는 항체 3S9로부터 유래된 scFV인, CAR.
  27. 제17항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은
    서열번호: 213에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 214에 제시된 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호: 215에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 216에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 및 서열번호: 217에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 218에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인, 또는
    서열번호: 290에 제시된 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호: 291에 제시된 서열을 갖는 CDRH2 및 서열번호: 292에 제시된 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호: 293에 제시된 서열을 갖는 CDRL1, 및 서열번호: 294에 제시된 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호: 295에 제시된 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하고,
    상기 각각은 Kabat 넘버링에 따르는, CAR.
  28. 제17항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 219, 220, 221, 222, 또는 223에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하는, CAR.
  29. 제17항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 219, 220, 221, 222, 또는 223에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는, CAR.
  30. 제17항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 224, 225, 226, 227, 또는 228에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편, 및/또는 서열번호: 229에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
  31. 제17항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 서열번호: 224, 225, 226, 227, 또는 228에 제시된 서열을 갖는 중쇄의 항원 결합 단편, 및/또는 서열번호: 229에 제시된 서열을 갖는 경쇄의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR.
  32. 제7항에 있어서, 상기 세포외 성분은 태그를 추가로 포함하는, CAR.
  33. 제32항에 있어서, 상기 태그는 His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모듈린 결합 펩타이드 (CBP) 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Myc 태그, Strep 태그, Softag 1, Softag 3, 및/또는 V5 태그로부터 선택되는, CAR.
  34. 제32항에 있어서, 상기 태그는 서열번호: 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 또는 168에 제시된 서열을 갖는, CAR.
  35. 제7항에 있어서, 상기 세포외 성분은 힌지를 추가로 포함하는, CAR.
  36. 제35항에 있어서, 상기 힌지는 인간 Ig 힌지, KIR2DS2 힌지, 또는 CD8α 힌지를 포함하는, CAR.
  37. 제35항에 있어서, 상기 힌지는 CD8α 힌지인, CAR.
  38. 제35항에 있어서, 상기 힌지는 서열번호: 140에 제시된 서열을 갖는, CAR.
  39. 제7항에 있어서, 상기 세포외 성분은 링커를 추가로 포함하는, CAR.
  40. 제39항에 있어서, 상기 링커는 글리신-세린 링커, IgG4 링커, 또는 CD28 링커인, CAR.
  41. 제39항에 있어서, 상기 링커는 서열번호: 142, 143, 144, 145, 150, 또는 151에 제시된 서열을 갖는, CAR.
  42. 제8항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 상기 T-세포 수용체, CD28, CD27, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, LFA-1, ICOS, 4-1BB, GITR, CD40, BAFFR, HVEM, SLAMF7, NKp80, NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDI Id, ITGAE, CD103, ITGAL, CDI Ia, ITGAM, CDI Ib, ITGAX, CDI Ic, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, DNAM1, SLAMF4, CD84, CD96, CEACAM1, CRT AM, Ly9, CD160, PSGL1, CD100, SLAMF6, SLAM, BLAME, SELPLG, LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C, 또는 이들의 조합의 α, β, 또는 ζ 사슬의 막횡단 도메인을 포함하는, CAR.
  43. 제8항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 CD8α 사슬의 막횡단 도메인을 포함하는, CAR.
  44. 제8항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 서열번호: 138에 제시된 서열을 갖는, CAR.
  45. 제7항에 있어서, 상기 세포내 성분은 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  46. 제45항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ, 공통 FcR γ, Fc γ RIIa, FcR β, CD3 γ, CD3 δ, CD3 ε, CD79a, CD79b, DAP10, DAP12, 또는 이들의 조합을 포함하는, CAR.
  47. 제45항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ을 포함하는, CAR.
  48. 제45항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 서열번호: 146에 제시된 서열을 갖는, CAR.
  49. 제45항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  50. 제49항에 있어서, 상기 공동자극 신호전달 도메인은 MHC 클래스 I 분자, B 및 T 세포 림프구 약화인자 (BTLA), Toll 리간드 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1, ICOS, 4-1BB, GITR, BAFFR, HVEM, SLAMF7, NKp80, NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49d, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1, SLAMF4, CD84, CD96, CEACAM1, CRTAM, Ly9, CD160, PSGL1, CD100, CD69, SLAMF6, SLAM, BLAME, SELPLG, LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 또는 이들의 조합을 포함하는, CAR.
  51. 제49항에 있어서, 상기 공동자극 신호전달 도메인은 4-1BB를 포함하는, CAR.
  52. 제49항에 있어서, 상기 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호: 148에 제시된 서열을 갖는, CAR.
  53. 제45항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 서열번호: 230에 제시된 아미노산 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 자극 도메인을 포함하는, CAR.
  54. 제7항에 있어서, 상기 CAR은 서열번호: 249, 251, 253, 255, 또는 257에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, CAR.
  55. 제7항에 있어서, 상기 CAR은 서열번호: 249, 251, 253, 255, 또는 257에 제시된 아미노산 서열을 갖는, CAR.
  56. 제7항에 있어서, 상기 CAR은 서열번호: 250, 252, 254, 256, 또는 258에 제시된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는, CAR.
  57. 제7항에 있어서, 상기 CAR은 서열번호: 250, 252, 254, 256, 또는 258에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는, CAR.
  58. 제7항의 CAR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  59. 제58항에 있어서, 상기 벡터는 제7항의 상기 CAR을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는, 벡터.
  60. 제59항에 있어서, 상기 프로모터는 MND 프로모터인, 벡터.
  61. 제60항에 있어서, 상기 MND 프로모터는 서열번호: 175에 제시된 서열을 갖는, 벡터.
  62. 제58항에 있어서, 상기 벡터는 형질도입 마커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
  63. 제62항에 있어서, 상기 형질도입 마커는 상기 CAR과 공동-발현되는, 벡터.
  64. 제62항에 있어서, 상기 형질도입 마커는 청색 형광 단백질 (BFP)인, 벡터.
  65. 제64항에 있어서, 상기 BFP는 서열번호: 169, 170, 171, 172, 173, 174, 또는 236에 제시된 서열을 갖는, 벡터.
  66. 제62항에 있어서, 상기 형질도입 마커를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 절단가능한 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 CAR을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열에 연결되는, 벡터.
  67. 제66항에 있어서, 상기 절단가능한 펩타이드는 돼지 테스코바이러스-1 (P2A), 토세아 아사인아 바이러스 (T2A), 말 비염 A 바이러스 (E2A), 구제역 바이러스 (F2A), 포티바이러스 2A, 또는 카디오바이러스 2A를 포함하는, 벡터.
  68. 제66항에 있어서, 상기 절단가능한 펩타이드는 서열번호: 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 또는 240에 제시된 서열을 갖는, 벡터.
  69. 제58항에 있어서, 상기 벡터는 분자 안전 스위치를 추가로 포함하는, 벡터.
  70. 제69항에 있어서, 상기 분자 안전 스위치는 자살 유전자를 포함하는, 벡터.
  71. 제70항에 있어서, 상기 자살 유전자는 유도성-카스파제-9 (iCASP9), 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK), 또는 절단된 상피 성장 인자 수용체 (tEGFR)를 포함하는, 벡터.
  72. 제7항의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포.
  73. 제72항에 있어서, 상기 세포는
    (a) 상기 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는 CAR; 및 (b) 상기 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR, 또는
    (c) 상기 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는 CAR; 및 (d) 상기 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하고 상기 세포내 성분에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR
    을 공동-발현하는, 세포.
  74. 제72항에 있어서, 상기 세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 또는 조혈 전구 세포 (HPC)인, 세포.
  75. 제72항의 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제형.
  76. NK 세포의 제1 집단에서 활성화 NK 수용체 및/또는 억제성 NK 수용체를 발현하는 자연 살해 (NK) 세포를 고갈시키는 방법으로서,
    제7항의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 제2 집단에 상기 세포의 제1 집단을 노출시키는 단계를 포함하고,
    상기 노출시키는 단계는 상기 제1 집단에서 NK 세포의 고갈을 초래하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 노출시키는 단계는 세포의 제1 집단을 갖는 대상체에게 CAR 발현 세포의 상기 제2 집단을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 제2 집단의 세포는
    (a) 상기 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는 CAR; 및 (b) 상기 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR, 또는
    (c) 상기 세포외 성분이 NKp46 결합 도메인을 포함하는 CAR; 및 (d) 상기 세포외 성분이 NKG2A 결합 도메인을 포함하고 상기 세포내 성분에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR
    을 공동-발현하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, CAR 발현 세포에서 상기 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR의 발현은 NKp46 발현 NK 세포에 의한 살해에 대해 상기 CAR 발현 세포에 내성을 부여하는, 방법.
  80. 자연 살해 (NK) 세포 관련 질환의 치료 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,
    제7항의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 제형의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하여,
    상기 NK 세포 관련 질환 또는 상기 대상체에서 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 대상체에게 항-바이러스 치료 또는 예방을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 항-바이러스 치료는 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 감염을 치료하는, 방법.
  83. 제81항에 있어서, 상기 항-바이러스 치료는 아시클로버, 발라시클로버, 팜시클로버, 간시클로버, 및/또는 발간시클로버로부터 선택된 뉴클레오시드 유사체를 포함하는, 방법.
  84. 제80항에 있어서, 상기 NK 세포 관련 질환은 NK 세포 악성종양인, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 NK 세포 악성종양은 미성숙한 NK 세포 신생물, 무과립 CD4+/CD56+ 조혈 신생물, CD94 1A+/TCR- 림프모구 림프종/백혈병 (LBL), 골수/NK 세포 급성 백혈병, 성숙한 NK 세포 신생물, 림프절외 NK 세포 림프종, 비강 유형, 공격적 NK 세포 백혈병, 및 만성 NK 세포 림프구증가증을 포함하는, 방법.
  86. 제80항에 있어서, 상기 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환은 비정상적인 NK 수용체 발현을 갖는 비-NK 세포 악성종양을 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 질환은 세자리(Sezary) 증후군, 성숙한 T 세포 신생물, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 및 ALK+ 역형성 대세포 림프종을 포함하는, 방법.
  88. 제80항에 있어서, 상기 NK 수용체를 발현하는 세포와 관련된 질환은 감염을 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 감염은 만성인, 방법.
  90. 제88항에 있어서, 상기 감염은 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충, 및/또는 절지동물인 방법.
  91. 제88항에 있어서, 상기 감염은 스타필로코커스 종 (Staphylococcus spp.), 스트렙토코커스 종 (Streptococcus spp.), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile), 대장균 (Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 살모넬라 (Salmonella), 비브리오 (Vibrio), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 나이세리아 고노르호애 (Neisseria gonorrhoeae), 트레코포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 리노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 코로나바이러스, 단순 포진 바이러스-1 (HSV-1), 수두 대상포진 바이러스 (VZV), A형 간염, 노로바이러스, 로타바이러스, 인유두종바이러스 (HPV), B형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 단순 포진 바이러스-2 (HSV-2), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 엔테로바이러스, C형 간염, 인간 T-림프영양성 바이러스-1 (HTLV-1), 메르켈 세포 폴리오마바이러스 (MCV), HHV8 (카포시 육종), 트리코피톤 종 (Trychophyton spp.) 및 칸디다 종 (Candida spp.), 지아디아, 톡소플라스마증, E. 베르미큘라리스, 트리파노소마 크루지 , 에키노코쿠스증 , 낭포충증 , 톡소카리아증, 트리코모나스증, 아메바증, 캘리포니아 뇌염, 치쿤구니야, 뎅기열, 동부 말 뇌염, 포와산, 세인트루이스 뇌염, 웨스트 나일, 황열병, 지카, 라임병, 및/또는 바베시아증에 의해 유발되거나 이들을 포함하는, 방법.
  92. 제80항에 있어서, 상기 제형은 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는, 방법
  93. 제92항에 있어서, 상기 NK 세포 관련 질환은 암인, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 암은 방광, 두경부, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 또는 피부의 암종; 편평 세포 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병; 급성 림프모구성 백혈병; B 세포 림프종; T 세포 림프종; 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종; 모발 세포 림프종; 버킷 림프종; 급성 골수성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 전골수구성 백혈병; 섬유육종; 횡문근육종; 골육종; 신경모세포종; 신경교종; 성상세포종; 신경초종; 흑색종; 색소성 건피증; 각화극세포종; 정상피종; 갑상선 여포암; 기형암종; T-전림프구성 백혈병 (T-PLL); T 세포 유형의 거대 과립 림프구 백혈병 (LGL); 세자리 증후군 (SS); 성인 T 세포 백혈병 림프종 (ATLL); 간비장 T 세포 림프종; 말초/흉선후 T 세포 림프종; 혈관면역모세포성 T 세포 림프종; 혈관중심성 (비강) T 세포 림프종; 역형성 (Ki 1+) 대세포 림프종; 장 T 세포 림프종; 및/또는 T-림프모구 림프종 /백혈병 (T-Lbly/T-ALL)을 포함하는, 방법.
  95. 제92항에 있어서, 상기 대상체에서 NKG2A 억제성 수용체를 발현하는 상기 NK 세포의 양은 상기 제형을 투여하기 전 또는 이를 필요로 하는 참조 집단에서 제형을 투여하지 않은 대상체에서 NKG2A 억제성 수용체를 발현하는 NK 세포의 양과 비교하여 감소되는, 방법.
  96. 제80항에 있어서, 상기 제형은 NKp46 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 제형은
    (a) 상기 NKp46 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR을 발현하는 제1 집단; 및 (b) NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 집단, 또는
    (c) 상기 NKp46 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR을 발현하는 제1 집단; 및 (d) NKG2A 결합 도메인을 포함하고 세포내 성분에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR을 발현하는 제2 집단
    의 세포를 포함하거나,
    상기 제형의 세포는
    (e) 상기 NKp46 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR; 및 (f) NKG2A 결합 도메인을 포함하는 CAR, 또는
    (g) 상기 NKp46 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR; 및 (h) NKG2A 결합 도메인을 포함하고 세포내 성분에는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있는 CAR
    을 공동-발현하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 인간 백혈구 항원 (HLA)-E 또는 인공 HLA-E 모방체를 포함하는, 방법.
  99. 제97항에 있어서, 상기 NKG2A 결합 도메인은 모날리주맙, 항체 Z270, 항체 Z199, 항체 20D5, 또는 항체 3S9로부터 유래된 scFV인, 방법.
  100. 제97항에 있어서, CAR 발현 세포에서 상기 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR의 발현은 상기 NK 세포 관련 질환에서 NK 세포에 의한 살해에 대해 상기 CAR 발현 세포에 내성을 부여하는, 방법.
  101. 제97항에 있어서, CAR 발현 세포에서 상기 NKG2A 결합 도메인을 포함하는 상기 CAR의 발현은 상기 대상체에 의한 상기 CAR 발현 세포의 거부반응을 감소시키는, 방법.
  102. 제96항에 있어서, 상기 NK 세포 관련 질환은 자가면역 질환 또는 동종면역 질환인, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 쇼그렌병; 항인지질 증후군; 심상성 천포창; 척추관절병증; 건선을 포함한 피부 질환; 다발성 경화증; 전신 경화증; 제1형 당뇨병; 소아 특발성 관절염; 류마티스 관절염; 염증성 장 질환; 자가면역 간 질환; 및/또는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 포함하는, 방법.
  104. 제102항에 있어서, 상기 동종면역 질환은 태아/신생아 동종면역 저혈소판증 (FNAIT); 조혈 줄기 세포 거부반응; 고형 조직 이식 거부반응; 및/또는 신장 이식 후 만성 동종이식 손상을 포함하는, 방법.
  105. 제96항에 있어서, 상기 대상체에서 상기 NKp46 활성화 수용체를 발현하는 상기 NK 세포의 양은 상기 제형을 투여하기 전 또는 이를 필요로 하는 참조 집단에서 제형을 투여하지 않은 대상체에서 NKp46 활성화 수용체를 발현하는 NK 세포의 양과 비교하여 감소되는, 방법.
  106. 제7항의 CAR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키트.
  107. 제106항에 있어서, 제7항의 상기 CAR을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 벡터 내에 있는, 키트.
  108. 제107항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 키트.
  109. 제106항에 있어서, 제7항의 상기 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 추가로 포함하는, 키트.
  110. 제106항에 있어서, 배지, 인공 제시 세포, 성장 인자, 및/또는 항체를 추가로 포함하는, 키트.
  111. 제106항에 있어서, 293 세포, 293T 세포, 및/또는 A549 세포를 추가로 포함하는, 키트.
  112. 제106항에 있어서, 피브로넥틴-코팅된 플레이트, 헥사디메트린 브로마이드 (폴리브렌), 및/또는 리포펙타민을 추가로 포함하는, 키트.
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