CN113646335A - 使用对b细胞成熟抗原具有特异性的嵌合抗原受体的治疗的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了过继细胞疗法，其涉及施用用于治疗包括某些浆细胞恶性肿瘤在内的疾病和病症的细胞剂量。所述细胞通常表达重组受体，如对B细胞成熟抗原(BCMA)具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述方法用于治疗患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者。还提供了用于过继细胞疗法中的含有此类BCMA结合受体的基因工程化细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求以下申请的优先权：2018年11月1日提交的标题为“使用对B细胞成熟抗原具有特异性的嵌合抗原受体的治疗的方法(METH ODS FOR TREATMENT USINGCHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SP ECFIFIC FOR B-CELL MATURATION ANTIGEN)”的美国临时申请号62/754,577、2018年11月30日提交的标题为“使用对B细胞成熟抗原具有特异性的嵌合抗原受体的治疗的方法(METHODS FOR TREATMENT USING CHIMERIC ANTIGENRECEPTORS SPECFIFIC FOR B-CELL MATURATI ON ANTIGEN)”的美国临时申请号62/774,167、2018年12月3日提交的标题为“使用对B细胞成熟抗原具有特异性的嵌合抗原受体的治疗的方法(MET HODS FOR TREATMENT USING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS S PECFIFICFOR B-CELL MATURATION ANTIGEN)”的美国临时申请号62/774,856、2018年12月7日提交的标题为“使用对B细胞成熟抗原具有特异性的嵌合抗原受体的治疗的方法(METHODS FORTREATMENT USING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECFIFIC FOR B-CELL MATURATI ONANTIGEN)”的美国临时申请号67/777,066、2019年5月9日提交的标题为“使用对B细胞成熟抗原具有特异性的嵌合抗原受体的治疗的方法(MET HODS FOR TREATMENT USINGCHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS S PECFIFIC FOR B-CELL MATURATION ANTIGEN)”的美国临时申请号62/845,817，将其内容通过引用以其整体并入。
通过引用序列表并入
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2019年10月31日创建的标题为735042019140SEQLIST.txt的文件提供，其大小为166千字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
在一些方面，本公开文本涉及过继细胞疗法，其包括施用用于治疗疾病和病症(包括某些浆细胞恶性肿瘤)的细胞的剂量。所述细胞通常表达重组受体，如对B细胞成熟抗原(BCMA)具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述方法用于治疗患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者。本发明还涉及用于过继细胞疗法的含有此类BCMA结合受体的基因工程化细胞。
背景技术
B细胞成熟抗原(BCMA)是在成熟B淋巴细胞上表达的III型跨膜蛋白。在BCMA与其配体即TNF家族的B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)结合后，促存活细胞信号被传递至B细胞，这已被发现是浆细胞存活所必需的。BCMA的表达已与若干种疾病(包括癌症、自身免疫性障碍和感染性疾病)相关。由于BCMA在各种疾病和病症(包括癌症)中的作用，因此BCMA是治疗性靶标。各种BCMA结合嵌合抗原受体(CAR)以及表达此类CAR的细胞都是可用的。然而，仍然需要改善的BCMA结合CAR和工程化BCMA-CAR表达靶向细胞，如以用于过继细胞疗法。本文提供了满足此类需求的实施方案。
发明内容
本文提供了治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：(a)含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
本文提供了治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：(a)含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗CD38抗体。
本文提供了治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：(a)含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
本文提供了治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：(a)含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：在为或约1x107个CAR表达(CAR+)T细胞与2x109个之间的CAR表达T细胞；以为或为约1:1或者在约1:3与约3:1之间的CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的确定比率的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合；并且所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
在一些任何实施方案中，所述CAR的细胞外抗原结合结构域与B细胞成熟抗原(BCMA)特异性地结合。
在一些任何实施方案中，所述VH是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述VL是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述细胞外抗原结合结构域包含scFv。在一些任何实施方案中，所述VH和所述VL通过柔性接头接合。在一些任何实施方案中，所述scFv包含接头，所述接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)。
在一些任何实施方案中，所述VH是所述VL的氨基末端。
在一些任何实施方案中，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，编码所述抗原结合结构域的核酸包含(a)SEQ ID NO:113的核苷酸序列；(b)与其具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的简并序列。在一些任何实施方案中，编码所述抗原结合结构域的所述核酸包含SEQ ID NO:115的核苷酸序列。
在一些任何实施方案中，所述VH是所述VL的羧基末端。
在一些任何实施方案中，所述胞质信号传导结构域是或包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些任何实施方案中，所述共刺激信号传导区包含4-1BB、任选人4-1BB的细胞内信号传导结构域。在一些任何实施方案中，所述共刺激信号传导区是或包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列展现出至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所述共刺激信号传导区在所述跨膜结构域与所述CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域之间。
在一些任何实施方案中，所述跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域。在一些任何实施方案中，所述跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:138中所示序列或与SEQ IDNO:138展现出至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所述CAR从其N至C末端依次包含：所述抗原结合结构域、所述间隔子、所述跨膜结构域和所述细胞内信号传导区。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:116所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ IDNO:119所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；(b)间隔子，所述间隔子包含经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子具有约228个氨基酸的长度；(c)来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列或与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述共刺激信号传导区包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列；(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含含有SEQ ID NO:143中所示序列的胞质信号传导结构域和含有SEQ ID NO:4中所示序列的共刺激信号传导区。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含SEQ ID NO:19中所示序列。
在一些任何实施方案中，在存在可溶性或脱落形式的BCMA的情况下，在暴露于表达表面BCMA的细胞后，所述抗原结合结构域和/或所述CAR的结合或指示所述CAR的功能或活性的量度未被降低或阻断或未被明显降低或阻断。在一些任何实施方案中，所述可溶性或脱落形式的所述BCMA的浓度或量对应于所述受试者或多发性骨髓瘤患者的血清或血液或血浆中存在的浓度或量，或者多发性骨髓瘤患者群体中的平均浓度或平均量；或者为一定浓度或量的所述可溶性或脱落BCMA，在所述浓度或量下对于相同测定中表达参考抗BCMA重组受体、任选参考抗BCMA CAR的细胞，所述结合或量度被降低或阻断或者被明显降低或阻断。
在一些任何实施方案中，所述CAR由以下多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:13中所示序列或与其展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些任何实施方案中，在所提供的方法中由T细胞表达的CAR由包含SEQ ID NO:13中所示序列的多核苷酸序列编码。
在一些任何实施方案中，在人细胞、任选人T细胞中表达编码所述CAR的多核苷酸后，从所述多核苷酸转录的RNA、任选信使RNA(mRNA)展现出至少70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA同质性。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含在为或约1x107个CAR表达(CAR+)T细胞与为或约2x109个之间的CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含在为或约2.5x107个CAR表达T细胞与为或约1.2x109个之间的CAR表达T细胞、在为或约5.0x107个CAR表达T细胞与为或约4.5x108个之间的CAR表达T细胞、或者在为或约1.5x108个CAR表达T细胞与为或约3.0x108个之间的CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约2.5x107、为或约5.0x107、为或约1.5x108、为或约3.0x108、为或约4.5x108、为或约6.0x108、为或约8.0x108或者为或约1.2x109个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约5.0x107、为或约1.5x108、为或约3.0x108或者为或约4.5x108个CAR表达T细胞。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞少于1.5x108个细胞或少于1.5x108个CAR+ T细胞或少于3x108个CAR+ T细胞或少于4.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或少于1.5x108个细胞或少于1.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约5x107个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约1.5x108个细胞或CAR+T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约3x108个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约4.5x108个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约6x108个细胞或CAR+ T细胞。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞少于1.5x108个CAR+ T细胞或少于3x108个CAR+ T细胞或少于4.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或少于1.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约5x107个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约1.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约3x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约4.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约6x108个CAR+ T细胞。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合和/或CD4+CAR表达T细胞和CD8+CAR表达T细胞的组合。在一些实施方案中，CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率为或为约为1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间。在一些实施方案中，CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率为或为约1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间。在一些实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含CD3+CAR表达T细胞。
在一些任何实施方案中，在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些任何实施方案中，在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
在一些任何实施方案中，在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。在一些任何实施方案中，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约30mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨以及每天施用为或约300mg/m2受试者体表面积的环磷酰胺，持续3天。
在一些任何实施方案中，在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天。
在一些任何实施方案中，在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
在一些任何实施方案中，所述受试者患有或怀疑患有复发性或难治性多发性骨髓瘤(R/R MM)。
在一些任何实施方案中，在施用所述剂量的细胞时或之前，所述受试者已经接受过三种或更多种针对所述疾病或障碍的先前疗法、任选四种或更多种先前疗法，其任选地选自：自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗CD38抗体。在一些任何实施方案中，所述受试者在所述三种或更多种先前疗法后已经复发或是难治的。
在一些任何实施方案中，在施用所述剂量的细胞时或之前，所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种针对所述疾病或障碍的先前疗法：自体干细胞移植(ASCT)；免疫调节剂或蛋白酶体抑制剂或其组合；以及抗CD38抗体。在一些任何实施方案中，所述免疫调节剂选自沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。在一些任何实施方案中，所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。在一些任何实施方案中，所述抗CD38抗体是或包含达雷木单抗。
在一些任何实施方案中，在施用所述剂量的细胞时和/或在淋巴细胞耗尽化疗或白细胞单采术时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。在一些任何实施方案中，在施用所述剂量的细胞时，所述受试者已经患上继发性浆细胞白血病(PCL)。
在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者：在至少3种或至少4种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的。在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者是成人受试者或年龄为25或35岁或更大。在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者从多发性骨髓瘤的诊断起的时间为约4年或者在2与15年或2与12年之间。在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者已经接受过约10种或者在3与15种或4与15种针对多发性骨髓瘤的先前方案。在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者已经对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和/或抗CD38单克隆抗体是难治的或无反应。在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者已经进行过先前自体干细胞移植或尚未进行过先前自体干细胞移植。在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者具有IMWG高风险细胞遗传学。在一些任何实施方案中，在施用所述剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞时，所述受试者对于至少3种或至少4种先前疗法已经复发或是难治的，所述先前疗法包括硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和/或抗CD38单克隆抗体。在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者已经进行过先前自体干细胞移植。
在一些任何实施方案中，在施用时，所述受试者：在至少3种或至少4种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的；是成人受试者或年龄为25或35岁或更大；从多发性骨髓瘤的诊断起的时间为约4年或者在2与15年或2与12年之间；已接受过约10种或者在3与15种或4与15种之间的针对多发性骨髓瘤的先前方案；对于硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和/或抗CD38单克隆抗体是难治的或无反应；已经进行过先前自体干细胞移植或尚未进行过先前自体干细胞移植；和/或具有IMWG高风险细胞遗传学。
在一些任何实施方案中，所述方法能够在患有主题疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中任选地在开始所述施用后的指定时间点实现规定的反应或结局，其中：所述反应选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)；所述反应或结局是或包括OR；和/或所述反应或结局是或包括CR。在一些任何实施方案中，所述受试者群组具有与通过所述方法治疗的受试者至少相同的先前疗法数量、预后或预后因素、亚型、二次受累或其他一种或多种规定的患者特征。
在一些任何实施方案中，所述方法能够在患有主题疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中任选地在开始所述施用后的指定时间点实现规定的反应或结局，任选地其中所述受试者群组具有与通过所述方法治疗的受试者至少相同数量的先前疗法、预后或预后因素、亚型、二次受累或其他一种或多种规定的患者特征，其中：所述反应选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)；所述反应或结局是或包括OR；和/或所述反应或结局是或包括CR。
在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约1、2、3、6、9、12、18、24、30或36个月或者在任何前述值限定的的范围内。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后4、8、12、16、20、24、28、32、36、48或52周月或者在任何前述值限定的的范围内。在一些任何实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约1个月。在一些任何实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约3个月。在一些任何实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约6个月。在一些任何实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约9个月。在一些任何实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约12个月。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局是OR或者在所述群组的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的受试者中实现。在一些任何实施方案中，所述反应或结局是VGPR、CR或sCR，并且在所述群组的至少30％、35％、40％、45％或50％的受试者中实现。在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括CR或sCR，并且在所述群组的至少20％、30％或40％的受试者中实现。在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括OR，并且在所述群组的至少50％、60％、70％或80％的受试者中实现。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括VGPR、CR或sCR，并且在所述群组的至少40％、45％或50％的受试者中实现。
在一些任何所提供的实施方案中，所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。在一些任何所提供的实施方案中，与在所述指定时间点测定的反应或结局相比，在所述指定时间点之后为或约3、6、9或12个月时测定的反应或结局是相等的或改善的。
在一些实施方案中，根据所提供的方法治疗的受试者，如在开始所述施用后的指定时间点不展现出具有神经毒性或CRS的任何体征或症状的反应或结局(不存在神经毒性或CRS)。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在神经毒性或不存在细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在神经毒性，并且在所述群组中的至少40％、50％、60％、70％或80％的受试者中实现。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在CRS，并且在所述群组中的至少10％、15％、20％、25％或30％的受试者中实现。
在一些实施方案中，根据所提供的方法治疗的受试者，如在开始所述施用后的指定时间点不展现出具有3级或更高或4级或更高的神经毒性的反应或结局(不存在3级或更高或4级或更高的神经毒性)。在一些实施方案中，根据所提供的方法治疗的受试者，如在开始所述施用后的指定时间点不展现出具有3级或更高或4级或更高的CRS的反应或结局(不存在3级或更高或4级或更高的CRS)。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高或4级或更高的神经毒性、不存在3级或更高或4级或更高的细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中实现。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高的CRS，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中实现。
在一些任何实施方案中，在患有所述疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述方法任选地在开始所述施用后的指定时间点不导致规定的毒性结局。
在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是神经毒性，并且在所述群组中的至少60％、70％或80％的受试者中未导致神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高或4级或更高的神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致3级或更高的神经毒性。
在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是CRS，并且在所述群组中的至少15％、20％、25％或30％的受试者中未导致CRS。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高或4级或更高的细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高的CRS，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致实现3级或更高的CRS。
在一些任何实施方案中，在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有记忆表型。在一些任何实施方案中，在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞具有中央记忆表型。在一些任何实施方案中，在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+。在一些任何实施方案中，在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞呈CCR7+/CD45RA-或呈CCR7+/CD45RO+。
在一些任何实施方案中，所施用的剂量中的细胞通过用于产生展现出预先确定的特征的输出组合物的方法来产生，其中当在多名不同的单独受试者之中进行时，所述方法的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征是：所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征是：所述多种输出组合物中具有中央记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征是：所述多种输出组合物中呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征是：所述多种输出组合物中呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征是：所述多种输出组合物的工程化CD4+ T细胞、任选CAR+CD4+ T细胞中的中央记忆CD4+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征是：所述多种输出组合物的工程化CD8+ T细胞、任选CAR+CD8+ T细胞中的中央记忆CD8+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征是：所述多种输出组合物的工程化T细胞、任选CAR+ T细胞中的中央记忆T细胞、任选CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。
在一些任何实施方案中，所施用的剂量通过用于产生输出组合物的方法来产生，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述方法是在多名不同的单独受试者之中进行的。在一些任何实施方案中，所述多名不同的单独受试者包括患有疾病或病症的受试者。在一些任何实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些任何实施方案中，所述癌症是血液癌症、任选多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症是复发性或难治性多发性骨髓瘤(R/RMM)。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约5.0x107、为或约1.5x108、为或约3.0x108或者为或约4.5x108个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约5.0x107个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约1.5x108个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约3x108个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约4.5x108个CAR表达T细胞。
还提供了以任何所提供的方法或用途施用的所述工程化T细胞或一定剂量的工程化T细胞或者用于根据本文所提供的任何方法使用的工程化T细胞或一定剂量的工程化T细胞。在一些任何实施方案中，其中在施用一定剂量的工程化T细胞后，在受试者群组或其可评价的受试者中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞能够任选地在开始所述施用后的指定时间实现规定的反应或结局，其中所述受试者群组是患有多发性骨髓瘤的群组。在用于使用的任何所述工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞中，所述工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞是根据本文所提供的任何方法施用的。
还提供了用于在本文所提供的方法的任何实施方案中使用或根据本文所提供的方法的任何实施方案使用的一定剂量的工程化T细胞。在一些任何实施方案中，在施用后，在受试者群组或其可评价的受试者中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述剂量的工程化T细胞能够任选地在开始所述施用后的指定时间实现规定的反应或结局，其中所述受试者群组是患有多发性骨髓瘤的群组。在用于使用的任何所提供的剂量的工程化T细胞中，所述剂量的工程化T细胞是根据本文所提供的任何方法施用的。
还提供了用于在本文所提供的方法的任何实施方案中使用或根据本文所提供的方法的任何实施方案使用的一定剂量的工程化T细胞，在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中所述一定剂量的工程化T细胞包含含有嵌合抗原受体(CAR)的一种或多种工程化T细胞，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；并且在施用后，在受试者群组或其可评价的受试者中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述剂量的工程化T细胞能够任选地在开始所述施用后的指定时间实现规定的反应或结局。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:116所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ IDNO:119所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；(b)间隔子，所述间隔子包含经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子具有约228个氨基酸的长度；(c)来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列或与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述共刺激信号传导区包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列；(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含含有SEQ ID NO:143中所示序列的胞质信号传导结构域和含有SEQ ID NO:4中所示序列的共刺激信号传导区。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含SEQ ID NO:19中所示序列。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局的实现是在开始所述施用后的指定时间，即在所述开始后为或约1、2、3、6、9、12、18、24、30或36个月。在一些任何实施方案中，所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间，即在所述开始后1、2、3、6、9或12个月。在一些任何实施方案中，所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间，即在所述开始后1或2或3个月。在一些任何实施方案中，所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约1个月。在一些任何实施方案中，所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约3个月。在一些任何实施方案中，所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约6个月。在一些任何实施方案中，所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约9个月。在一些任何实施方案中，所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约12个月。
在一些任何实施方案中，所述受试者群组是患有复发性或难治性多发性骨髓瘤的受试者。在一些任何实施方案中，所述受试者群组是患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少3种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者，所述先前疗法任选地包括自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体。在一些任何实施方案中，所述受试者群组是患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少3种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者，所述先前疗法任选地包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体和/或自体干细胞移植。在一些任何实施方案中，所述受试者群组是在所述施用时未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或没有PCL病史的受试者。在一些任何实施方案中，所述受试者群组是在施用所述细胞之前已经患上继发性浆细胞白血病(PCL)的受试者。在一些任何实施方案中，所述受试者群组是或包括患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少4种或平均至少10种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者。在一些任何实施方案中，所述受试者群组由成人受试者组成或包括成人受试者。在一些任何实施方案中，所述受试者群组从诊断起的中值时间为4年和/或从诊断起的时间的范围为2至12年。在一些任何实施方案中，所述受试者群组已经接受过中值为10种的先前方案，或者在3与15种或4与15种之间的针对多发性骨髓瘤的先前疗法。在一些任何实施方案中，所述受试者群组包括对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和抗CD38单克隆抗体难治的受试者。在一些任何实施方案中，所述受试者群组包括已经进行过先前自体干细胞移植的受试者。在一些任何实施方案中，所述受试者群组包括具有IMWG高风险细胞遗传学的受试者。在一些任何实施方案中，所述至少3种先前疗法包括自体干细胞移植(ASCT)；免疫调节剂或蛋白酶体抑制剂；或其组合；以及抗CD38抗体。
在一些任何实施方案中，所述受试者群组是患有复发性或难治性多发性骨髓瘤的受试者；所述受试者群组是患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少3种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者，所述先前疗法任选地包括自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体；所述受试者群组是患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少3种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者，所述先前疗法任选地包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体和/或自体干细胞移植；和/或所述受试者群组是在所述施用时未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或没有PCL病史；所述受试者群组是在施用所述细胞之前已经患上继发性浆细胞白血病(PCL)的受试者；所述受试者群组是或包括患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少4种或平均至少10种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者；所述受试者群体由成人受试者组成或包括成人受试者；所述受试者群组从诊断起的中值时间为4年和/或从诊断起的时间的范围为2至12年；所述受试者群组已经接受过中值为10种的先前方案，或者在3与15种或4与15种之间的针对多发性骨髓瘤的先前疗法；所述受试者群组包括对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和抗CD38单克隆抗体难治的受试者；所述受试者群组包括已经进行过先前自体干细胞移植的受试者；和/或所述受试者群组包括具有IMWG高风险细胞遗传学的受试者。在一些任何实施方案中，所述至少3种先前疗法包括自体干细胞移植(ASCT)；免疫调节剂或蛋白酶体抑制剂；或其组合；以及抗CD38抗体。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节剂选自沙利度胺、来那度胺和泊马度胺，所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米，和/或所述抗CD38抗体是或包含达雷木单抗。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；所述反应或结局是或包括OR，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；或者所述反应或结局是或包括CR，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括OR。在一些任何实施方案中，所述剂量能够在所述群组的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的受试者中实现所述反应或结局。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括VGPR、CR或sCR。在一些任何实施方案中，所述剂量能够在所述群组的至少30％、35％、40％、45％或50％的受试者中实现所述反应或结局。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括CR或sCR。在一些任何实施方案中，所述剂量能够在所述群组的至少20％、30％或40％的受试者中实现所述反应或结局。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括OR，并且所述剂量能够在所述群组的至少50％、60％、70％或80％的受试者中实现所述反应或结局。在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括VGPR、CR或sCR，并且所述剂量能够在所述群组的至少40％、45％或50％的受试者中实现所述反应或结局。在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括CR或sCR，并且所述剂量能够在所述群组的至少20％、30％或40％的受试者中实现所述反应或结局。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。在一些任何实施方案中，与在所述指定时间测定的反应或结局相比，在所述指定时间之后为或约3、6、9或12个月时测定的反应或结局是相等的或改善的。
在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1.5x108个细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量少于3x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量少于或少于4.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1.5x108个细胞；或者能够实现反应或结局的剂量少于1.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1x108个细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约5x107个细胞。在一些任何实施方案中，为或约5x107个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约1.5x108个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约3x108个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约4.5x108个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约6.0x108个细胞或CAR+ T细胞。
在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合。在一些任何实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量包含CD4+CAR表达T细胞和CD8+CAR表达T细胞的组合。在一些任何实施方案中，CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率为或为约为1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间。在一些实施方案中，能够实现所述反应或结局的所述剂量包含CD3+CAR表达T细胞。
在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在神经毒性或不存在细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在神经毒性，并且在所述群组中的至少40％、50％、60％、70％或80％的受试者中实现。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在CRS，并且在所述群组中的至少10％、15％、20％、25％或30％的受试者中实现。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高或4级或更高的神经毒性、不存在3级或更高或4级或更高的细胞因子释放综合征。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中实现。在一些任何实施方案中，所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高的CRS，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中实现。
在一些任何实施方案中，在患有所述疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少90％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，施用所述剂量的工程化T细胞任选地在开始所述施用后的指定时间点不导致规定的毒性结局。
在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是神经毒性，并且在所述群组中的至少90％、70％或80％的受试者中未导致神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高或4级或更高的神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致3级或更高的神经毒性。
在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是CRS，并且在所述群组中的至少15％、20％、25％或30％的受试者中未导致CRS。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高或4级或更高的细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高的CRS，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致实现3级或更高的CRS。
在一些任何实施方案中，在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有记忆表型。在一些任何实施方案中，在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞具有中央记忆表型。在一些任何实施方案中，在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+。在一些任何实施方案中，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞呈CCR7+/CD45RA-或呈CCR7+/CD45RO+。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞通过展现出预先确定的特征的方法来产生，其中所述方法的迭代任选地从人生物样品产生多种输出组合物，其中所述方法在多名不同的单独受试者之中进行。在一些任何实施方案中，所施用的剂量中的细胞通过用于产生展现出预先确定的特征的输出组合物的方法来产生，其中当在多名不同的单独受试者之中进行时，所述方法的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物。
在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物中具有中央记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物中呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物中呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；所述多种输出组合物的工程化CD4+ T细胞、任选CAR+CD4+ T细胞中的中央记忆CD4+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物的工程化CD8+ T细胞、任选CAR+CD8+ T细胞中的中央记忆CD8+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；和/或所述多种输出组合物的工程化T细胞、任选CAR+ T细胞中的中央记忆T细胞之间、任选CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。
在一些任何实施方案中，所述剂量通过用于产生输出组合物的方法来产生，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述方法是在多名不同的单独受试者之中进行的。
在一些任何实施方案中，所述多名不同的单独受试者包括患有疾病或病症的受试者。在一些任何实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些任何实施方案中，所述癌症是血液癌症、任选多发性骨髓瘤。在特定实施方案中，所述疾病或病症是作为多发性骨髓瘤的癌症。在一些任何实施方案中，所述疾病或病症是复发性或难治性多发性骨髓瘤(R/R MM)。
提供了一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：(a)含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ IDNO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
提供了一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：(a)含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ IDNO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗CD38抗体。
提供了一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：(a)含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ IDNO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
提供了一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：(a)含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ IDNO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：在为或约1x107个CAR表达T细胞与2x109个之间的CAR表达T细胞；以为或为约1:1或者在约1:3与约3:1之间的CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的确定比率的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合；并且所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
提供了一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：(a)含有SEQ IDNO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
提供了一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：(a)含有SEQ IDNO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗CD38抗体。
提供了一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：(a)含有SEQ IDNO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
提供了一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：(a)含有SEQ IDNO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：在为或约1x107个CAR表达T细胞与2x109个之间的CAR表达T细胞；以为或为约1:1或者在约1:3与约3:1之间的CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的确定比率的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合；并且所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
在一些任何实施方案中，所述细胞外抗原结合结构域与B细胞成熟抗原(BCMA)特异性地结合。在一些任何实施方案中，所述VH是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述VL是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:116所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ IDNO:119所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；(b)间隔子，所述间隔子包含经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子具有约228个氨基酸的长度；(c)来自人CD28的跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列或与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述共刺激信号传导区包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列；(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列；以及(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含含有SEQ ID NO:143中所示序列的胞质信号传导结构域和含有SEQ ID NO:4中所示序列的共刺激信号传导区。
在一些任何实施方案中，所述CAR包含SEQ ID NO:19中所示序列。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含在为或约1x107个CAR表达T细胞与为或约2x109个之间的CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含在为或约2.5x107个CAR表达T细胞与为或约1.2x109个之间的CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含在为或约5.0x107个CAR表达T细胞与为或约4.5x108个之间的CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含在为或约1.5x108个CAR表达(CAR+)T细胞与为或约3.0x108个之间的CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约2.5x107个CAR表达(CAR+)T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约5.0x107个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约1.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约3.0x108个CAR+T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约4.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约6.0x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约8.0x108个或者为或约1.2x109个CAR表达T(CAR+)细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含为或约5.0x107、为或约1.5x108、为或约3.0x108或者为或约4.5x108个CAR表达(CAR+)T细胞。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞少于1.5x108个细胞或少于1.5x108个CAR+ T细胞或少于3x108个CAR+ T细胞或少于4.5x108个CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或少于1.5x108个细胞或少于1.5x108个CAR+ T细胞。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约5x107个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约1.5x108个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约3x108个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约4.5x108个细胞或CAR+ T细胞。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞是为或约6x108个细胞或CAR+ T细胞。
在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含CD4+CAR表达T细胞和CD8+CAR表达T细胞的组合。在一些任何实施方案中，CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+T细胞与CD8+ T细胞的比率为或为约为1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间。在一些任何实施方案中，所述剂量的工程化T细胞包含CD3+CAR表达T细胞。
在一些任何实施方案中，在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物。在一些任何实施方案中，所述凋亡标记物是膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些任何实施方案中，在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
在一些任何本文所提供的方法或用途中，在所施用的剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有记忆表型。在一些任何本文所提供的方法或用途中，在所施用的剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞具有中央记忆表型。在一些任何本文所提供的方法或用途中，在所施用的剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+。在一些任何本文所提供的方法或用途中，在所施用的剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞呈CCR7+/CD45RA-或呈CCR7+/CD45RO+。
在一些任何本文所提供的方法或用途中，所施用的剂量中的细胞通过产生多种输出组合物的方法任选地从人生物样品产生，其中所述方法在多名不同的单独受试者之中进行。在一些任何本文所提供的方法或用途中，所施用的剂量中的细胞通过用于产生展现出预先确定的特征的输出组合物的方法来产生，其中当在多名不同的单独受试者之中进行时，所述方法的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物。
在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比包括所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物中具有中央记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物中呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物中呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物的工程化CD4+ T细胞、任选CAR+CD4+ T细胞中的中央记忆CD4+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物的工程化CD8+ T细胞、任选CAR+CD8+ T细胞中的中央记忆CD8+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。在一些任何实施方案中，所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预先确定的特征包括：所述多种输出组合物的工程化T细胞、任选CAR+ T细胞中的中央记忆T细胞、任选CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。
在一些任何本文所提供的方法或用途中，所施用的剂量通过用于产生输出组合物的方法来产生，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述方法是在多名不同的单独受试者之中进行的。在一些任何实施方案中，所述多名不同的单独受试者包括患有疾病或病症的受试者。在一些任何实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些任何实施方案中，所述癌症是血液癌症、任选多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症是复发性或难治性多发性骨髓瘤(R/R MM)。
附图说明
图1A-图1B描绘了如通过琼脂糖凝胶电泳评估的评估RNA异质性的测定的结果。图1A描绘了含有长间隔子(LS)区域或较短的CD28间隔子区域的若干种抗BCMA-CAR的RNA异质性。图1B描绘了在编码序列优化和剪接位点消除(O/SSE)之前和之后含有长间隔子(LS)区的三种不同的抗BCMA CAR编码序列的RNA异质性。
图2描绘了在编码序列的优化和剪接位点消除之前(未SSE)和之后(O/SSE)评估转导的T细胞表面上BCMA-LS CAR表达水平的测定的结果。
图3描绘了编码BCMA-LS CAR构建体的慢病毒载体和编码已进行密码子优化并被修饰以消除预测的剪接位点的BCMA-LS CAR构建体(O/SSE)的慢病毒载体的转导效率的比较。
图4A描绘了评估在若干种效应物:靶细胞(E:T)比率下BCMA-LS CAR表达T细胞针对表达高(K562/BCMA)或低(RPMI 8226)水平的BCMA的细胞系的细胞溶解活性的测定的结果。图4B描绘了在3:1的E:T比率下若干种BCMA-LS CAR表达T细胞针对RPMI-8226细胞的细胞溶解活性。图4C-图4D描绘了未优化的BCMA-LS CAR表达T细胞和优化的(O/SSE)BCMA-LSCAR表达T细胞在对不同的BCMA表达细胞系的细胞溶解活性。
图5A描绘了评估在若干种效应物:靶细胞(E:T)比率(5:1、2.5:1、1.25:1和0.6:1，在图中分别表示为a、b、c和d)下BCMA-LS CAR表达T细胞响应于与表达高(K562/BCMA)或低(RPMI 8226)水平的BCMA的细胞系一起孵育而释放IFNγ、IL-2和TNFα细胞因子的测定的结果。图5B描绘了在不同的E:T比率(3:1、1.5:1、0.75:1和0.375:1，在图中分别表示为a、b、c和d)下未优化的BCMA-LS CAR表达T细胞和优化的(O/SSE)BCMA-LS CAR表达T细胞响应于与BCMA表达K562/BCMA和RPMI 8226细胞一起孵育而释放IFNγ和IL-2细胞因子。
图6描绘了评估在将来自两个供体的BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达T细胞与表达不同水平的BCMA的BCMA表达细胞一起孵育后的细胞溶解活性的测定的结果。
图7描绘了评估来自两个供体的BCMA-55-LS CAR O/SSE表达T细胞与表达不同水平的BCMA的BCMA表达细胞一起孵育后的IFNγ释放的测定的结果。
图8描绘了评估表达含有不同间隔子区域的CAR的抗BCMA表达CAR T细胞对OPM2靶细胞的细胞溶解活性的测定的结果。
图9A-图9B描绘了评估在存在可溶性BCMA-Fc的情况下抗BCMA CAR表达T细胞与OPM2靶细胞一起孵育后抗BCMA CAR表达T细胞的细胞溶解活性的测定的结果。
图10A描绘了评估在存在来自H929多发性骨髓瘤细胞系的上清液的情况下优化的(O/SSE)抗BCMA CAR表达T细胞的细胞溶解活性的测定的结果。图10B描绘了评估在存在重组B细胞激活因子(BAFF)的情况下优化的(O/SSE)抗BCMA CAR表达T细胞的细胞溶解活性的测定的结果。
图11A-图11B描绘了评估在存在不同浓度(0ng/mL、111ng/mL，333ng/mL和1000ng/mL，在图中分别表示为a、b、c和d)下的可溶性BCMA-Fc(图11A)或来自多发性骨髓瘤细胞系H929的上清液(图11B)的情况下抗BCMA CAR表达T细胞与OPM2靶细胞一起孵育后IFNγ、IL-2和TNFα细胞因子释放的测定的结果。
图12A描绘了评估在单次静脉内注射表达优化的(O/SSE)抗BCMA CAR的CAR T细胞后OPM2人多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型中的肿瘤生长的测定的结果。图12B描绘了评估在单次静脉内注射表达优化的(O/SSE)抗BCMA CAR的CAR T细胞后OPM2人多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型中存活的测定的结果。
图13A描绘了评估在单次静脉内注射表达优化的(O/SSE)抗BCMA CAR的CAR T细胞后RPMI-8226(皮下)异种移植小鼠模型中肿瘤生长的测定的结果。图13B描绘了在单次静脉内注射表达优化的(O/SSE)抗BCMA CAR的CAR T细胞后RPMI-8226(皮下)异种移植小鼠模型中的存活。
图14A-图14B描绘了评估在用源自单一供体(供体2)的优化的(O/SSE)抗BCMA CART细胞治疗的RPMI-8226(皮下)异种移植小鼠的血液中CD4+(图14A)和CD8+(图14B)CAR阳性T细胞数量的测定的结果。
图15A-图15B描绘了评估在用源自单一供体(供体1)的优化的(O/SSE)抗BCMA CART细胞治疗的RPMI-8226(皮下)异种移植小鼠的血液中CD4+(图15A)和CD8+(图15B)CAR阳性T细胞数量的测定的结果。
图16A描绘了评估在用(0.008μg/mL、0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL)的BCMA-Fc(在其C末端与IgG的Fc区融合的可溶性人BCMA)融合多肽包被过夜的96孔细胞培养板中孵育6小时的BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达细胞中tdTomato和截短的受体(CAR表达的替代标记物)的表达水平(如通过流式细胞术所检测)的测定的结果。重组Fc多肽用作对照(Fc对照)。图16B描绘了评估在与十(10)种2倍BCMA-Fc连续稀释液一起孵育的表达截短的受体的细胞，表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR、BC MA-26-LS-O/SSE CAR、BCMA-23-LS-O/SSE CAR和BCMA-25-LS-O/SSE CAR的报告细胞中tdTomato+细胞百分比的测定的结果。表达对不同抗原具有特异性的CAR(抗CD19 CAR)的细胞用作对照。
图17描绘了在与人BCMA表达K562靶细胞(BCMA.K562)靶细胞以不同的E:T比率共培养后表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR或BCMA-55-SS CAR的报告细胞中tdTomato+细胞的百分比。
图18描绘了在没有抗原刺激的情况下孵育3天以评估抗原非依赖性(基础)信号传导程度的表达抗CD19 CAR、BCMA-55-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR、BCMA-23-LS-O/SSE CAR或BCMA-52-LS-O/SSE CAR的报告细胞中tdTomato和GFP(CAR表达的替代标记物)的表达水平，如通过流式细胞术所检测。
图19A-图19B描绘了在没有抗原刺激的情况下孵育以评估抗原非依赖性(基础)信号传导程度的表达含有源自4-1BB或CD28的细胞内结构域的抗CD19 CAR、BCMA-55-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR、BCMA-23-LS-O/SSE CAR或BCMA-52-LS-O/SSE CAR的报告细胞中tdTomato和截短的受体(CAR表达的替代标记物)的表达水平，如通过流式细胞术所检测。
图20A描绘了在以2:1或5:1的E:T比率与表达人BCMA(huBCMA)、鼠BCMA(muBCMA)或食蟹猴BCMA(cynoBCMA)的K562人骨髓性白血病细胞共培养的被工程化以表达对人BCMA具有特异性的BCMA-55-LS-O/SSE CAR的Nur77-tdTomato报告细胞中tdTomato+细胞的百分比，如通过流式细胞所评估。图20B-图20C描绘了在与包被在96孔平底板上的渐增浓度(0、0.1、0.25、1、2.5、10，25和100μg/mL)的huBCMA和cynoBCMA一起孵育的表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR的报告细胞中tdTomato+细胞的百分比(图20B)和平均荧光强度(MFI；图20C)，如通过流式细胞术所评估。
图21A描绘了转录物和预测的扩增产物的示例性扩增策略。图21B描绘了由具有已知和未知(隐秘)剪接位点的转录物扩增产生的示例性扩增产物。图21C描绘了使用嵌套引物对进行的转录物的示例性滑动窗口扩增。
图22A-22D描绘了40种工程化CAR+ T细胞组合物的示例性表型概况，每种组合物来自一名多发性骨髓瘤患者。针对CD4+群体(图22A)和CD8+群体(图22B)，示出CAR+ T细胞组合物中的CD45RA×CCR7表达概况。针对CD4+群体(图22C)和CD8+群体(图22D)，示出CAR+T细胞组合物中的CD27×CD28表达概况。由点(●)、叉(×)、菱形(◇)或三角形(Δ)示出每种CAR+ T细胞组合物。
图23显示了在含有5x107个总CAR+ T细胞的单剂量的剂量水平1(DL1)、含有1.5x108个总CAR+ T细胞的单剂量的剂量水平2(DL2)或含有4.5x108个总CAR+ T细胞的单剂量的剂量水平3(DL3)下，在已被施用含有表达对B细胞成熟抗原(BCMA)具有特异性的CAR的自体T细胞的组合物的患有复发性和/或难治性多发性骨髓瘤(MM)的人受试者中的客观反应率(ORR)和完全反应(CR)以及严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)和部分反应(PR)。b：DL3群组中的一名受试者由于缺少第29天基线后反应评价而无法评价功效。
图24显示了在施用CAR表达T细胞(n＝14)后，在最长的随访时，DL1群组中的受试者随时间而变的反应的评估。
图25显示了在DL1、DL2和DL3群组的受试者的外周血中CAR+T细胞的扩增和长期持久性，如通过对来自全血样品的基因组DNA制剂进行用于检测编码CAR的载体序列的定量聚合酶链式反应(qPCR)所测量(载体拷贝/μg基因组DNA)。LLOQ，定量下限；LLOD，检测下限。
图26A显示了在具有PR或更好的总体反应(PR、VGPR、CR或sCR；反应者)的不同受试者相比于具有比PR更差的总体反应的受试者(MR或SD；无反应者)中，在CAR+ T细胞施用之前和施用之后不同时间点(第29天、第2个月和第3个月)在受试者血清中可溶性BCMA(sBCMA)(ng/mL)的水平。图26B显示了展现出PR或更好的总体反应的受试者(反应者)中和展现出比PR更差的反应的受试者(MR或SD；无反应者)中在CAR+T细胞施用之前(治疗前)的sBCMA水平。
具体实施方式
所提供的实施方案包括组合物、制品、化合物、方法和用途，包括靶向或针对BCMA以及表达BCMA的细胞和疾病的那些。观察到BCMA在某些疾病和病症(如恶性肿瘤或其组织或细胞，例如，恶性浆细胞(如来自所有复发性或新诊断的骨髓瘤患者))上表达，例如不同地表达，例如在正常组织上具有少量表达。所提供的实施方案包括可用于治疗此类疾病和病症和/或用于靶向此类细胞类型的途径，包括编码BCMA结合受体(包括嵌合抗原受体(CAR))的核酸分子和编码的受体(如编码的CAR)以及包含其的组合物和制品。所述受体通常可以含有抗原结合结构域，其包括对BCMA具有特异性的抗体(包括抗原结合抗体片段，如重链可变区(VH)、单结构域抗体片段和单链片段，包括scFv)。还提供了细胞，如表达此类BCMA结合受体(例如，抗BCMA CAR)和/或含有编码此类受体的核酸的工程化或重组细胞；以及含有此类细胞的组合物和制品和治疗性剂量。还提供了评价、优化、制备和使用一种或多种核酸序列(例如，编码重组BCMA结合受体的核酸序列)的方法。还提供了制备和使用(如在治疗或改善表达BCMA的疾病和病症中)表达或含有重组BCMA结合受体和重组BCMA结合受体编码多核苷酸的细胞(例如，工程化细胞)或含有此类细胞的组合物的方法。
过继细胞疗法(包括涉及施用表达对目标疾病或障碍具有特异性的嵌合受体的细胞的那些(所述嵌合受体是如嵌合抗原受体(CAR)和/或其他重组抗原受体)，以及其他过继免疫细胞疗法和过继T细胞疗法)可以有效治疗癌症和其他疾病和障碍。在某些情境下，过继细胞疗法的可行途径可能并不总是完全令人满意。在一些方面，所施用的细胞的以下能力：识别并结合至靶标(例如，靶抗原，如BCMA)，运输、定位至并成功进入受试者、肿瘤和其环境内的适当部位，被激活，扩增，发挥各种效应子功能(包括细胞毒性杀伤和分泌各种因子(如细胞因子))，持续(包括长期)存在，分化、转变或参与重编程为某些表型状态，在清除和再暴露于靶配体或抗原后提供有效且稳健的回忆反应，以及避免或减少消耗、无反应性、终末分化和/或分化为抑制状态。
在一些方面，用于治疗疾病或障碍(如多发性骨髓瘤)的可用途径是复杂的，并且可能并不总是完全令人满意的。在一些方面，选择治疗方案可能取决于许多因素，包括药物可用性、对先前疗法的反应、复发的侵袭性、自体干细胞移植(ASCT)的资格以及复发是在疗法中还是在疗法后发生。在一些方面，MM导致复发和缓解，并且在一些情况下，现有的方案可能导致复发和/或来自治疗的毒性。在一些情况下，患有特别侵袭性疾病的受试者，如在各种疗法之后患有持续性或复发性疾病的受试者、具有高疾病负荷(如高肿瘤负荷)的受试者和/或患有特别侵袭性类型的疾病(如浆细胞瘤)的受试者可能特别难以治疗，并且这些受试者中对某些疗法的反应可能很差或持续时间短。在一些情况下，已进行大量预治疗的受试者(例如，在若干种不同的先前疗法之后已经复发的受试者)可能展现出低反应率和/或不良事件的高发生率。在一些方面，所提供的实施方案基于以下观察结果：根据所提供的实施方案的治疗导致高反应率、不良事件(例如，毒性)的低发生率、延长的反应、以及在一些情况下随着时间的推移所述反应的改善。
在一些情境下，所提供的实施方案基于来自临床研究的观察结果，即施用表达特定重组受体的工程化细胞(如本文所述的那些)导致高反应率和不良事件(如细胞因子释放综合征(CRS)或神经病学事件(NE；或神经毒性，NT))的低比率。在一些方面，所提供的细胞、方法和用途导致这样的细胞疗法，其展现出在施用所述细胞之后细胞的延长的持久性以及高反应率和毒性(例如，CRS或NE，如3级或更高的CRS或者3级或更高的神经毒性)的低比率。在一些方面，通过使用各种不同剂量的细胞实现这种高反应和毒性(例如，3级或更高的CRS或者3级或更高的神经毒性)的低比率。例如，即使以相对较低剂量的细胞，也可实现客观反应的高比率和高水平的反应(例如，非常好的部分应答VGPR或更好)。在一些情况下，可以施用相对较高剂量的细胞，并且观察到此类剂量导致客观反应的高比率以及毒性(例如，3级或更高的CRS或者3级或更高的神经毒性)的低比率。在一些情况下，所提供的实施方案还允许所施用的工程化细胞的改善的扩增和/或持久性，并且在一些情况下导致延长的反应和/或随时间改善的反应。在一些方面，观察到根据所提供的实施方案对患有侵袭性或难治性疾病的受试者(例如，经大量预治疗的受试者、具有高肿瘤负荷的受试者和/或患有侵袭性疾病类型的受试者)的治疗提供了安全、有效且持久的治疗。
在一些情境下，对疗法的最佳反应可以取决于所述工程化重组受体(如CAR)在细胞表面上一致且可靠地表达和/或结合所述靶抗原的能力。例如，在一些情况下，来自所引入的转基因(例如，编码所述重组受体)的转录的RNA的异质性可能在用于细胞疗法中的细胞(如人T细胞)中表达的一些情况下影响所述重组受体的表达和/或活性。在一些情境下，所述重组受体(如CAR)中的间隔子的长度和类型可能影响所述受体的表达、活性和/或功能。
此外，在一些情境下，某些重组受体可以展现出抗原非依赖性活性或信号传导(也称为“基础信号传导”)，这可能导致不希望的作用，如由于表达所述重组受体的T细胞的分化增加和/或消耗。在一些方面，此类活性可能限制T细胞的活性、作用或效力。在一些情况下，在用于重组受体表达的细胞的工程化和离体扩增过程中，所述细胞可能由于通过所述重组受体的基础信号传导而展现出指示消耗的表型。
在一些情境下，所述重组受体特异性地结合、识别或靶向的特定靶抗原的特性可能影响所述受体的活性。在一些情境下，B细胞成熟抗原(BCMA)通常在恶性浆细胞上表达，并且是细胞疗法的有吸引力的治疗性靶标。在一些情况下，BCMA可以被γ分泌酶切割，产生可溶性BCMA(sBCMA)或“脱落”形式的BCMA，从而减少在靶细胞表面上表达的BCMA。在一些情况下，所述BCMA结合分子(如抗BCMA嵌合抗原受体)的活性可以通过可溶性BCMA的存在而被阻断或抑制。对于对细胞疗法，特别是特异性地结合、识别或靶向BCMA(如在靶细胞表面上表达的BCMA)的重组受体的最佳反应，需要改善的策略。
在一些情境下，所提供的实施方案基于以下观察结果：特定间隔子和核酸序列的优化可以导致所述重组受体的一致且稳健的表达。所提供的BCMA结合重组受体提供了相对于可用的细胞疗法(特别是BCMA靶向细胞疗法)途径的优点。在一些实施方案中，所提供的BCMA结合重组受体含有具有对于结合可溶性BCMA的低亲和力的完全人抗原结合结构域。在一些实施方案中，所提供的BCMA结合重组受体含有经修饰的间隔子，其导致与在靶细胞表面上表达的BCMA的增强的结合。在一些实施方案中，观察到所提供的BCMA结合重组受体展现出降低的抗原非依赖性基础信号传导，这在一些情况下可以导致降低的通过抗原非依赖性信号传导的细胞消耗，以及通过可溶性BCMA的抑制的缺乏。在一些实施方案中，所提供的BCMA结合重组受体展现出针对表达低密度或低水平的BCMA的靶细胞的活性或效力。
在不同方面，所提供的BCMA结合重组受体、编码此类受体的多核苷酸、工程化细胞和细胞组合物展现出某些所需的特性，其可以克服或抵消某些限制，所述某些限制可以降低对细胞疗法(例如，具有表达BCMA结合重组受体的工程化细胞的细胞疗法)的最佳反应。在一些方面，观察到含有表达本文所提供的示例性BCMA结合重组受体的工程化细胞的组合物展现出工程化细胞的细胞健康的一致性，并且所述组合物与改善的临床反应相关。在一些方面，观察到含有表达本文所提供的示例性BCMA结合重组受体的工程化细胞的组合物富集了与中央记忆T细胞(TCM)表型相关的免疫细胞亚型(例如CD4+或CD8+ T细胞亚型)，所述中央记忆T细胞在一些方面与工程化细胞的增加的持久性和耐久性相关。在一些情况下，所提供的实施方案(包括所述重组受体、编码此类受体的多核苷酸、工程化细胞和细胞组合物)可以提供相对于靶向BCMA的可用疗法的各种优点，以改善重组受体的活性和对BCMA靶向细胞疗法的反应。另外，已经观察到所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物的所提供的方法和用途在治疗受试者方面提供了优点，其在所测试的各种不同剂量水平下导致高反应率、持久反应和低不良事件率。此外，已经观察到所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物的所提供的方法和用途在治疗患有特别侵袭性和/或难治性疾病的受试者或者对于针对所述疾病的许多不同的先前治疗已经复发和/或是难治的受试者方面提供了优点。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.BCMA结合受体及其编码多核苷酸
在一些方面提供了BCMA结合剂(如细胞表面蛋白，如结合或识别BCMA分子的重组受体或嵌合抗原受体))和编码BCMA结合细胞表面蛋白(如重组受体(例如嵌合抗原受体，CAR))的多核苷酸以及表达此类受体的细胞。BCMA结合细胞表面蛋白通常含有抗体(例如，抗原结合抗体片段)和/或特异性地识别(如特异性地结合至)BCMA(如BCMA蛋白，如人BCMA蛋白)的其他结合肽。在一些方面，所述药剂与BCMA的细胞外部分结合。还提供了包含此类多核苷酸或表达此类受体的细胞(例如，工程化细胞)以及包含此类工程化细胞的组合物。在一些方面，还提供了使用此类细胞和组合物的方法以及其如在治疗方法中的用途。
在一些实施方案中，所述多核苷酸被优化或含有某些特征，所述某些特征被设计用于优化(如用于密码子使用)以降低RNA异质性和/或修饰(例如，增加或赋予)编码的受体在细胞产物批次之间更一致的表达(如表面表达)。在一些实施方案中，与参考多核苷酸相比，编码BCMA结合细胞表面蛋白的多核苷酸被修饰例如以去除隐秘或隐藏的剪接位点，从而降低RNA异质性。在一些实施方案中，编码BCMA结合细胞表面蛋白的多核苷酸是密码子优化的，如以用于在哺乳动物(例如人)细胞(如人T细胞)中表达。在一些方面，当在细胞中表达时，所述经修饰的多核苷酸导致改善的，例如增加的或更均匀或更一致的表达(例如，表面表达)水平。此类多核苷酸可以用于构建体中，以产生表达编码的BCMA结合细胞表面蛋白的工程化细胞。因此，还提供了表达由本文所提供的多核苷酸编码的重组受体的细胞及其在过继细胞疗法(如与BCMA表达相关的疾病和障碍(如多发性骨髓瘤)的治疗)中的用途。
所提供的多核苷酸包括编码特异性地识别(如特异性地结合)BCMA(如人BCMA)的重组受体(如抗原受体)的那些。在一些方面，还提供了编码的受体(如含有BCMA结合多肽的那些)及其组合物和制品以及用途。
所述BCMA结合多肽包括抗体，如单链抗体(例如，抗原结合抗体片段)或其部分。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体，如含有抗BCMA抗体或其抗原结合片段的那些。在任何实施方案中，在所提供的CAR中特异性地识别抗原(例如BCMA)的抗体或抗原结合片段与所述抗原特异性地结合。所提供的多核苷酸可以掺入构建体(如脱氧核糖核酸(DNA)或RNA构建体，如可以引入细胞中以表达编码的重组BCMA结合受体的那些)中。
在一些情况下，编码所述BCMA结合受体的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列，在一些情况下其在编码所述BCMA结合受体的核酸序列的上游编码或者在编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5'末端处接合。在一些情况下，含有编码所述BCMA结合受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，所述信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，所述信号序列可以编码异源或非天然的信号肽。在一些方面，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:166中所示或者由SEQ ID NO:167或168-171中所示核苷酸序列编码的IgGκ链的信号肽；SEQ ID NO:154中所示且由SEQ ID NO:155中所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链；SEQ ID NO:146中所示的CD8α信号肽；或SEQ ID NO:142中所示的CD33信号肽。在一些情况下，编码所述BCMA结合受体的多核苷酸可以含有编码另外的分子(如替代标记物或其他标记物)的核酸序列，或者可以含有另外的组分，如启动子、调节元件和/或多顺反子元件。在一些实施方案中，编码所述BCMA结合受体的核酸序列可以与任何另外的组分可操作地连接。
A.编码的重组BCMA结合受体的组分
所提供的BCMA结合受体(例如在本文所提供的方法和用途中使用的细胞中表达的)通常含有细胞外结合分子和细胞内信号传导结构域。所提供的结合分子包括含有抗体的多肽，包括含有此类抗体的单链细胞表面蛋白(例如，重组受体，如嵌合抗原受体)。
所提供的结合分子(例如，BCMA结合分子)包括包含所提供的抗体或其片段(例如，BCMA结合片段)中的一种的单链细胞表面蛋白，如重组受体(例如，抗原受体)。重组受体包括特异性地结合或特异性地识别BCMA的抗原受体，例如含有所提供的抗BCMA抗体(例如抗原结合片段)的抗原受体。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。还提供表达重组受体的细胞及其在过继细胞疗法(例如与BCMA表达相关的疾病和障碍的治疗)中的用途。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类抗原受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO 2013166321、WO 2013071154、WO 2013123061，美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO 2014055668中描述的那些。示例性CAR包括任何上述出版物(如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、US 7,446,190和US 8,389,282)中披露的CAR，并且其中抗原结合部分(例如scFv)被如本文所提供的抗体或其抗原结合片段替代。
在一些实施方案中，所提供的CAR具有选自SEQ ID NO:15-20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15-20中任一个所示氨基酸序列展现出至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR具有SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列展现出至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所提供的CAR由多核苷酸如以下多核苷酸编码，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:9-14中任一个所示核酸序列，或与SEQ ID NO:9-14中任一个所示核酸序列展现出至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所提供的CAR由多核苷酸如以下多核苷酸编码，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:13和14中任一个所示核酸序列，或与SEQ ID NO:13和14中任一个所示核酸序列展现出至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所提供的CAR由多核苷酸如以下多核苷酸编码，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:13中所示核酸序列，或与其展现出至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所提供的CAR由多核苷酸如具有SEQ ID NO:13中所示核酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合结构域的核酸包含：(a)SEQ ID NO:30、31、50、51、59、60、82、84、113、115中任一个所示核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:30、31、50、51、59、60、82、84、113、115中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的简并序列。在一些实施方案中，编码所述抗原结合结构域的核酸包含：(a)编码SEQ ID NO:29、49、58、83、114、127、128、129、130中任一个所示氨基酸序列的核苷酸序列；(b)与编码SEQ ID NO:29、49、58、83、114、126、127、129、130中任一个所示氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的简并序列。
1.抗原结合结构域
所述嵌合受体包括嵌合抗原受体(CAR)。所述嵌合受体(如CAR)通常包含细胞外抗原结合结构域，其包括所提供的抗BCMA抗体中的一种、是所提供的抗BCMA抗体中的一种或包含在所提供的抗BCMA抗体中的一种内或者包含所提供的抗BCMA抗体中的一种。因此，所述嵌合受体(例如CAR)通常在其细胞外部分中包含一个或多个BCMA结合分子，如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变区和/或抗体分子(如本文所述的那些)。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性地结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联双scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能抗体片段，在本文也称为“抗原结合片段”。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中是已知的，是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,马里兰州贝塞斯达(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927--948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”。(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268--9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母(例如“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案类似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular'sAbM抗体建模软件使用的方案。
下表1列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，规定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述所提供抗体的示例性CDR序列，但应当理解，所提供抗体可以包括如根据任何其他上述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。
同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情形中，规定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，如通过Kabat、Chothia、AbM、IMGT或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的具体氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
包括在所提供的CAR中的抗体包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和仅含有VH区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗原结合结构域是或包括含有可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的抗体片段。在特定实施方案中，所述抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段(例如scFv)。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的全部或部分重链可变区或者全部或部分轻链可变区的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR，并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
所提供的CAR中包含的抗BCMA抗体包括人抗体。“人抗体”是具有与人或人细胞或者利用人抗体库或其他人抗体编码序列(包括人抗体文库)的非人来源产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。所述术语不包括包含非人抗原结合区的非人抗体的人源化形式，如所有或基本上所有CDR都是非人的那些。所述术语包括人抗体的抗原结合片段。
人抗体可以通过将免疫原施用至转基因动物来制备，所述转基因动物已经被修饰以响应于抗原激发产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替代内源免疫球蛋白基因座，或者其存在于在染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因动物中，通常已经使内源性免疫球蛋白基因座失活。人抗体也可以源自人抗体文库，包括噬菌体展示和无细胞文库，其含有源自人库的抗体编码序列。
所提供的CAR中包含的抗体包括作为单克隆抗体的那些，包括单克隆抗体片段。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体的群体(即，构成所述群体的单独抗体是相同的，但含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生期间产生的可能变体除外，此类变体通常以少量存在)获得或在所述群体内的抗体。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一表位。所述术语不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于从杂交瘤产生、重组DNA方法、噬菌体展示和其他抗体展示方法。
在一些实施方案中，所述CAR包含抗体分子的一个或多个BCMA结合部分，如抗体的重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区(例如scFv抗体片段)。在一些实施方案中，所提供的BCMA结合CAR含有赋予所提供的CAR的BCMA结合特性的抗体(如抗BCMA抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合结构域可以是所述任何抗BCMA抗体或源自所述任何抗BCMA抗体。参见例如，Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060、WO 2016090320、WO 2016090327、WO2010104949和WO 2017173256。任何此类抗BCMA抗体或抗原结合片段都可以用于所提供的CAR中。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR含有抗原结合结构域(其是scFv)，所述抗原结合结构域含有源自WO 2016090320或WO2016090327中所述的抗体的可变重链(VH)区和/或可变轻链(VL)区。
在一些实施方案中，所述抗体(例如，抗BCMA抗体或抗原结合片段)含有如所述的重链和/或轻链可变(VH或VL)区或其足够的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体(例如，抗原结合片段)含有VH区序列或其足够的抗原结合部分，所述VH区序列或其足够的抗原结合部分含有如所述的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体(例如，抗原结合片段)含有VL区序列或足够的抗原结合部分，所述VL区序列或足够的抗原结合部分含有如所述的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体(例如，抗原结合片段)含有VH区序列，所述VH区序列含有如所述的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3；并且含有VL区序列，所述VL区序列含有如所述的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。所述抗体还包括具有与这样的序列至少或至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的序列的那些。
在一些实施方案中，所述抗体是单结构域抗体(sdAb)，所述sdAb仅包含VH区序列或其足够的抗原结合部分，例如任何上述VH序列(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和/或CDR-H4)。
在一些实施方案中，包含VH区的本文所提供的抗体(例如，抗BCMA抗体)或其抗原结合片段还包含轻链或其足够的抗原结合部分。例如，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH区和VL区、或VH和VL区的足够的抗原结合部分。在此类实施方案中，VH区序列可以是任何上述VH序列。在一些此类实施方案中，所述抗体是抗原结合片段，如Fab或scFv。在一些此类实施方案中，所述抗体是还含有恒定区的全长抗体。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体(例如，其抗原结合片段)具有重链可变(VH)区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:32、52、61、85、116、125、131中任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:32、52、61、85、116、125、131中任一个的VH区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或者含有存在于这样的VH序列中的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗体片段具有WO 2016/090327、WO2016/090320或WO 2017/173256中描述的任何抗体或抗体结合片段的VH区。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体(例如，其抗原结合片段)具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:33、53、62、88、119、127、132中任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:33、53、62、88、119、127、132中任一个的VL区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或者含有存在于这样的VL序列中的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗体片段具有WO 2016/090327、WO2016/090320或WO 2017/173256中描述的任何抗体或抗体结合片段的VL区。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体(例如，其抗原结合片段)的VH和VL区包含：分别地，SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:32和33具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地，SEQ ID NO:52和53的氨基酸序列，或分别地，与SEQ IDNO:52和53具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地，SEQ ID NO:61和62的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:61和62具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地，SEQ ID NO:85和88的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:85和88具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地，SEQ ID NO:116和119的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:116和119具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地，SEQ ID NO:125和127的氨基酸序列，或分别地，与SEQ IDNO:125和127具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地，SEQ ID NO:131和132的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:131和132具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含：分别地，SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:32和33具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含：分别地，SEQ ID NO:52和53的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:52和53具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含：分别地，SEQ ID NO:61和62的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:61和62具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含：分别地，SEQ ID NO:85和88的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:85和88具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含：分别地，SEQ ID NO:116和119的氨基酸序列，或分别地，与SEQID NO:116和119具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含：分别地，SEQ ID NO:125和127的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:125和127具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含：分别地，SEQ ID NO:131和132的氨基酸序列，或分别地，与SEQ ID NO:131和132具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH和VL区，并且所述VH区包含选自SEQ ID NO:32、52、61、85、116、125、131中任一个的VH区氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)；并且所述VL区包含选自SEQ ID NO:33、53、62、88、119、127、132中任一个的VL区氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)。
在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH和VL区，并且所述VH区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含SEQ IDNO:132的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含SEQ ID NO:52和53的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含SEQ ID NO:61和62的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含SEQ ID NO:85和88的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含SEQ ID NO:116和119的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含SEQ ID NO:125和127的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含SEQ ID NO:131和132的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:116和119，或与任何上述VH和VL具有至少90％序列同一性(如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或其99％序列同一性)的任何抗体或其抗原结合片段，或包含任何上述VH和VL的VH区内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3以及任何上述VH和VL的VL区内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的任何抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体片段，例如单链可变片段(scFv)或双抗体或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是仅包含VH区的单结构域抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的scFv。在一些实施方案中，所述单链抗体片段(例如scFv)包含连接两个抗体结构域或区域(如重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区)的一个或多个接头。所述接头通常是肽接头，例如，柔性和/或可溶性肽接头。所述接头包括富含甘氨酸和丝氨酸的那些和/或在一些情况下富含苏氨酸的那些。在一些实施方案中，所述接头还包括带电荷的残基(如赖氨酸和/或谷氨酸)，其可以改善溶解性。在一些实施方案中，所述接头还包括一个或多个脯氨酸。
因此，所提供的抗BCMA抗体包括单链抗体片段，如scFv和双抗体，特别是人单链抗体片段，通常包含连接两个抗体结构域或区域(如VH和VL区)的一个或多个接头。所述接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头，例如富含甘氨酸和丝氨酸的一种肽接头。
在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包含至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，所述接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸组成。所述接头的长度通常在约5个与约50个氨基酸之间，通常在为或约10个与为或约30个之间，例如10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个，并且在一些例子中长度在10个与25个氨基酸之间。示例性接头包括具有各种数量的序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:7)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:2)的重复的接头，例如在这样的序列的2个、3个、4个和5个重复之间。示例性接头包括具有SEQ ID NO:1(GGGGSGGGGSGGGGS)所示序列或由其组成的那些接头。示例性接头还包括具有SEQ ID NO:176(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)所示序列或由其组成的那些接头。示例性接头还包括具有SEQID NO:255(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)中所示序列或由其组成的那些接头。
因此，在一些实施方案中，所提供的实施方案包括单链抗体片段(例如，scFv)，其包含一个或多个上述接头，如富含甘氨酸/丝氨酸的接头(包括具有GGGS(SEQ ID NO:2)或GGGGS(SEQ ID NO:7)重复的接头，如SEQ ID NO:1中所示接头)。
在一些实施方案中，所述接头具有含有SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸序列。所述片段(例如，scFv)可以包含VH区或其部分，接着是接头，接着是VL区或其部分。所述片段(例如，scFv)可以包含VL区或其部分，接着是接头，接着是VH区或其部分。
表2提供了可包含在所提供的BCMA结合受体(如抗BCMA嵌合抗原受体(CAR))中的示例性抗原结合结构域(如抗体或抗原结合片段)的SEQ ID NO:。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL区，如下表2的每一行中列出的SEQ ID NO:中所示(根据Kabat编号)。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含下表2的每一行中列出的SEQ IDNO:中所示的VH区序列和VL区序列；或者包含与下表2的每一行中列出的SEQ ID NO:中所示的VH区序列和VL区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH和VL区氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含下表2的每一行中列出的SEQ ID NO:中所示的VH区序列和VL区序列。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含下表2的每一行中列出的SEQ ID NO:中所示的scFv序列；或者包含与下表2的每一行中列出的SEQ ID NO:中所示的scFv序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的scFv氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含SEQ ID NO:114中所示scFv序列；或者包含与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的scFv氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含下表2的每一行中列出的SEQ ID NO:中所示的scFv序列。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含SEQ ID NO:114中所示的scFv序列。
所提供的CAR中的抗体(例如抗原结合片段)包括人抗体。在所提供的人抗BCMA抗体(例如，抗原结合片段)的一些实施方案中，人抗体含有VH区，所述VH区包含与由种系核苷酸人重链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分、与由种系核苷酸人重链D区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分、和/或与由种系核苷酸人重链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分；和/或含有VL区，所述VL区包含与由种系核苷酸人κ或λ链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分、和/或与由种系核苷酸人κ或λ链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分。在一些实施方案中，所述VH区的所述部分对应于CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方案中，所述VH区的所述部分对应于框架区1(FR1)、FR2、FR2和/或FR4。在一些实施方案中，所述VL区的所述部分对应于CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方案中，所述VL区的所述部分对应于FR1、FR2、FR2和/或FR4。
在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-H1，所述CDR-H1与由种系核苷酸人重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-H1，所述序列与由种系核苷酸人重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。
在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-H2，所述CDR-H2与由种系核苷酸人重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-H2，所述序列与由种系核苷酸人重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。
在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-H3，所述CDR-H3与由种系核苷酸人重链V区段、D区段和J区段编码的序列内的相应CDR-H3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-H3，所述序列与由种系核苷酸人重链V区段、D区段和J区段编码的序列内的相应CDR-H3区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。
在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-L1，所述CDR-L1与由种系核苷酸人轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-L1，所述序列与由种系核苷酸人轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L1区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。
在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-L2，所述CDR-L2与由种系核苷酸人轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-L2，所述序列与由种系核苷酸人轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。
在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-L3，所述CDR-L3与由种系核苷酸人轻链V区段和J区段编码的序列内的相应CDR-L3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-L3，所述序列与由种系核苷酸人轻链V区段和J区段编码的序列内的相应CDR-L3区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。
在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)包含含有人种系基因区段序列的框架区。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有VH区，其中框架区(例如FR1、FR2、FR3和FR4)与由人种系抗体区段(如V区段和/或J区段)编码的框架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述人抗体含有VL区，其中框架区(例如FR1、FR2、FR3和FR4)与由人种系抗体区段(如V区段和/或J区段)编码的框架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些此类实施方案中，所述VH区和/或VL区内含有的框架区序列与由人种系抗体区段编码的框架区序列相比相差不多于10个氨基酸，例如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。
在一些实施方案中，所述参考抗体可以是在国际专利申请公开号WO 2010/104949中描述的小鼠抗BCMA scFv。
所述抗体(例如，抗原结合片段)可以含有免疫球蛋白恒定区的至少一部分，如一个或多个恒定区结构域。在一些实施方案中，所述恒定区包含轻链恒定区和/或重链恒定区1(CH1)。在一些实施方案中，所述抗体包含CH2和/或CH3结构域，如Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG(如IgG1或IgG4)的Fc区。
2.间隔子
在一些实施方案中，包含本文所提供的抗体(例如，抗原结合片段)的重组受体(例如，CAR)(如由本文所提供的方法和用途中使用的工程化细胞表达的那些)还包含间隔子或间隔子区域。所述间隔子典型地是多肽间隔子并且通常在CAR内位于CAR的抗原结合结构域与跨膜结构域之间。在一些方面，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰的形式的至少一部分，如免疫球蛋白的铰链区(如IgG铰链区，例如IgG4或IgG4来源的铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，所述恒定区或其一个或多个部分是人IgG的，如人IgG4或IgG1或IgG2的。一般而言，所述间隔子(如所述恒定区的所述部分)用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区域。在一些实施方案中，所述间隔子的长度和/或组成被设计为优化或促进CAR与其靶标之间的相互作用的某些特征；在一些方面，所述间隔子的长度和/或组成被设计为优化在CAR与其在表达靶标的细胞上的靶标结合期间或之时或之后CAR表达细胞与表达CAR的靶标的细胞之间的生物物理突触距离；在一些方面，所述表达靶标的细胞是表达BCMA的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述CAR由T细胞表达，并且间隔子的长度是与T细胞激活或优化CAR T细胞性能兼容的长度。在一些实施方案中，所述间隔子是位于所述重组受体(例如，CAR)的配体结合结构域与跨膜结构域之间的间隔子区域。在一些实施方案中，所述间隔子区域是位于所述重组受体(例如，CAR)的配体结合结构域与跨膜结构域之间的区域。
在一些实施方案中，所述间隔子可以具有这样的长度，与不存在所述间隔子和/或存在不同间隔子(如仅长度不同的间隔子)的情况相比，所述长度在抗原结合后提供增加的细胞反应性。在一些实施方案中，所述间隔子具有至少100个氨基酸的长度，如至少110、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个氨基酸的长度。在一些例子中，所述间隔子具有为或约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有至少约10至300个氨基酸、约10至200个氨基酸、约50至175个氨基酸、约50至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约50至100个氨基酸、约100至300个氨基酸、约100至250个氨基酸、约125至250个氨基酸或约200至250个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子或间隔子区域具有至少约12个氨基酸、至少约119个氨基酸、至少约125个氨基酸、至少约200个氨基酸、或至少约220个氨基酸或至少约225个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，所述间隔子具有125至300个氨基酸的长度、125至250个氨基酸的长度、125至230个氨基酸的长度、125至200个氨基酸的长度、125至180个氨基酸的长度、125至150个氨基酸的长度、150至300个氨基酸的长度、150至250个氨基酸的长度、150至230个氨基酸的长度、150至200个氨基酸的长度、150至180个氨基酸的长度、180至300个氨基酸的长度、180至250个氨基酸的长度、180至230个氨基酸的长度、180至200个氨基酸的长度、200至300个氨基酸的长度、200至250个氨基酸的长度、200至230个氨基酸的长度、230至300个氨基酸的长度、230至250个氨基酸的长度或250至300个氨基酸的长度。在一些实施方案中，所述间隔子具有至少或至少约或者具有或具有约130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229个氨基酸的长度或者任何前述值之间的长度。
示例性间隔子包括含有免疫球蛋白恒定区的一个或多个部分的那些，如含有Ig铰链(如IgG铰链结构域)的那些。在一些方面，所述间隔子包括单独的IgG铰链、与CH2和CH3结构域中的一个或多个连接的IgG铰链或者与CH3结构域连接的IgG铰链。在一些实施方案中，所述IgG铰链、CH2和/或CH3可以全部或部分源自IgG4或IgG2。在一些实施方案中，所述间隔子可以是含有源自IgG4、IgG2和/或IgG2和IgG4的铰链、CH2和/或CH3序列中的一种或多种的嵌合多肽。在一些实施方案中，所述铰链区包含IgG4铰链区和/或IgG2铰链区的全部或一部分，其中所述IgG4铰链区任选地是人IgG4铰链区，并且所述IgG2铰链区任选地是人IgG2铰链区；所述CH2区包含IgG4 CH2区和/或IgG2 CH2区的全部或一部分，其中所述IgG4 CH2区任选地是人IgG4CH2区，并且所述IgG2 CH2区任选地是人IgG2 CH2区；和/或所述CH3区包含IgG4 CH3区和/或IgG2 CH3区的全部或一部分，其中所述IgG4 CH3区任选地是人IgG4 CH3区，并且所述IgG2 CH3区任选地是人IgG2 CH3区。在一些实施方案中，铰链CH2和CH3包含来自IgG4的铰链区CH2和CH3中的每一个的全部或一部分。在一些实施方案中，所述铰链区是嵌合的并且包含来自人IgG4和人IgG2的铰链区；所述CH2区是嵌合的并且包含来自人IgG4和人IgG2的CH2区；和/或所述CH3区是嵌合的并且包含来自人IgG4和人IgG2的CH3区。在一些实施方案中，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或含有与人IgG4铰链区相比的至少一个氨基酸替代的经修饰的IgG4铰链；人IgG2/4嵌合CH2区；和人IgG4 CH3区。
在一些实施方案中，所述间隔子可以全部或部分源自IgG4和/或IgG2，并且可以含有突变，例如在一个或多个结构域中的一个或多个单氨基酸突变。在一些例子中，所述氨基酸修饰是在IgG4的铰链区中脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)以降低糖基化异质性，如在SEQ ID NO:173中所示全长IgG4 Fc序列的CH2区中的位置177处的N177Q突变，或者在SEQ ID NO:172中所示全长IgG2 Fc序列的CH2区中的位置176处的N176Q。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子包含
ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:174)
由已针对密码子表达和/或消除剪接位点(如隐秘的剪接位点)进行优化的多核苷酸编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:200中所示核酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:236或8中所示核酸序列。
另外的示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol.Res.,3(2):125-135或国际专利申请公开号WO 2014031687。在一些实施方案中，所述间隔子的核苷酸序列被优化以降低表达后的RNA异质性。在一些实施方案中，所述间隔子的核苷酸序列被优化以减少隐秘的剪接位点或减少剪接位点处发生剪接事件的可能性。
在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:237中所示氨基酸序列，并且由SEQ ID NO:238中所示多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:157中所示氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:156中所示氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:134中所示氨基酸序列，并且由SEQID NO:135中所示多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:174中所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO:175、200、236或8中所示多核苷酸序列，或与SEQ IDNO:175、200、236或8展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有与SEQ ID NO:174展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，其由已任选地针对密码子使用和/或降低RNA异质性进行优化的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，所述间隔子是或包含由SEQ ID NO:200中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。
3.跨膜结构域和细胞内信号传导组分
所述抗原识别组分(例如，抗原结合结构域)通常与一个或多个含有信号传导组分的细胞内信号传导区连接，所述信号传导组分是例如模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)的刺激和/或激活和/或经由另一种细胞表面受体发出信号的信号传导组分。因此，在一些实施方案中，BCMA结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)与一个或多个跨膜结构域(如本文所述的那些)和包含一种或多种细胞内组分(如本文所述的那些)的细胞内信号传导区或细胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然地与受体(例如CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，所述结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域包括源自以下各项的那些(即，包含以下各项的至少一个或多个跨膜结构域)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。例如，所述跨膜结构域可以是CD28跨膜结构域，所述CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140中所示核酸序列编码。可替代地，在一些实施方案中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面，所述合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来进行连接。
细胞内信号传导区或细胞内信号传导结构域包括模拟或接近以下的那些：经由天然抗原受体的信号、经由这种受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在并形成CAR的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间的连接。
受体(例如CAR)通常包括含有至少一种或多种细胞内信号传导组分的细胞内信号传导区。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分或信号传导结构域，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述BCMA结合抗体与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR包括CD3-ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR之时或之后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导结构域刺激和/或激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如如果所述截短部分转导效应子功能信号的话。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要经由TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在相同细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，所述CAR包括此类胞质信号传导序列中的之一或两者。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级刺激和/或激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的细胞内信号传导区或细胞内信号传导结构域含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。在一些实施方案中，所述CD3ζ包含SEQ ID NO:143中所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO:144或SEQID NO:145中所示核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述CAR包含共刺激分子(如T细胞共刺激分子)的信号传导结构域(例如细胞内或胞质信号传导结构域)和/或跨膜部分。示例性共刺激分子包括CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS。例如，共刺激分子可以源自4-1BB，并且可以包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所示核苷酸序列编码。在一些方面，同一CAR包含刺激或激活组分(例如，胞质信号传导序列)和共刺激组分二者。
在一些实施方案中，所述刺激或激活组分被包含在一个CAR中，而所述共刺激组分由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，所述BCMA靶向CAR是刺激或激活CAR；在其他方面，其是共刺激CAR。在一些实施方案中，所述细胞还包含抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，例如识别除BCMA之外的抗原的CAR，由此通过靶向BCMA的CAR传递的刺激或激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而减小或被抑制，例如以降低脱靶效应。
在某些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含连接至CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，所述CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和刺激或激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包含CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，所提供的嵌合抗原受体包含：(a)特异性地识别B细胞成熟抗原(BCMA)的细胞外抗原结合结构域，如本文所述的任何抗原结合结构域；(b)长度为至少125个氨基酸的间隔子；(c)跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含分别含有SEQ ID NO:116和119的氨基酸序列或者分别与SEQID NO:116和119具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH区和VL区。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区是或包含SEQ ID NO:116的VH区氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区是或包含SEQ ID NO:119的VL区氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:97、101和103的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:96、100和103的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:95、99和103的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:94、98和102的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:104、106和108的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，所述VL区是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含刺激型胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述刺激型胞质信号传导结构域能够在T细胞中诱导初级激活信号，是T细胞受体(TCR)组分，和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述刺激型胞质信号传导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分。在一些实施方案中，所述刺激型胞质结构域是人的或源自人蛋白质。在一些实施方案中，所述刺激型胞质结构域是或包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码所述刺激型胞质结构域的核酸是或包含SEQ ID NO:144中所示序列，或者是密码子优化的序列和/或其简并序列。在其他实施方案中，编码所述刺激型胞质信号传导结构域的核酸是或包含SEQ ID NO:145中所示序列。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区还包括共刺激信号传导区。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包括T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包括CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区是人的或源自人蛋白质。在其他实施方案中，所述共刺激信号传导区是或包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列展现出至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码所述共刺激区的核酸是或包含SEQ ID NO:5中所示序列，或者是密码子优化的序列和/或其简并序列。在一些实施方案中，编码所述共刺激信号传导区的核酸包含SEQ ID NO:6中所示序列。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导区之间。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是或包含源自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是或包含源自CD28的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是人的或源自人蛋白质。在其他实施方案中，所述跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138展现出至少90％序列同一性的氨基酸序列。
提供了嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：(1)特异性地结合人B细胞成熟抗原(BCMA)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：(i)含有与SEQID NO:116的VH区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的可变重链(VH)；和(ii)含有与SEQ ID NO:119中任一个的VL区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的可变轻链(VL)；(2)SEQ ID NO:174中所示的间隔子，或者其中编码所述间隔子的核酸是或包含SEQ ID NO:200中所示序列；(3)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(4)含有CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。还提供了编码这种嵌合抗原受体的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述VH区包含SEQ ID NO:116的VH区序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；并且所述VL区包含SEQ ID NO:119的VL区序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或者所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:97、101和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:96、100和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:95、99和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或者所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:94、98和102的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:104、106和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
提供了嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：(1)与人B细胞成熟抗原(BCMA)特异性地结合的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：含有SEQ IDNO:116的VH区序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)区和含有SEQ ID NO:119的VL区序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)区；或者所述VH区包含SEQID NO:116的VH区序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；并且所述VL区包含SEQ ID NO:119的VL区序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或者所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:97、101和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:96、100和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:95、99和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或者所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:94、98和102的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:104、106和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；(2)SEQ ID NO:174中所示的间隔子，或其中编码所述间隔子的核酸是或包含SEQ ID NO:200中所示序列；(3)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(4)含有人CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和T细胞共刺激分子(任选来自人4-1BB或人CD28)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。还提供了编码这种嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:116的VH区序列和SEQ ID NO:119的VL区序列。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体的其他结构域、区域或组分包括本文所述的任何结构域、区域或组分。
4.替代标记物
在一些实施方案中，所述CAR或编码所述CAR的多核苷酸还包含替代标记物，如细胞表面标记物(例如，截短的细胞表面标记物)，其可用于确认细胞的转导或工程化以表达受体。例如，在一些方面，非固有标记基因结合工程化细胞疗法用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还用于促进通过ADCC进行细胞自杀。示例性标记基因包括截短的表皮生长因子受体(EGFRt)，其可以与转导细胞中的目标转基因(CAR或TCR)共表达(参见，例如美国专利号8,802,374)。EGFRt含有由抗体西妥昔单抗
识别的表位。出于这个原因，
可以用于鉴定或选择已经用EGF Rt构建体工程化的细胞，包括还用另一种重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))共同工程化的细胞。另外地，EGFRt通常用作结合细胞疗法的自杀机制。在一些方面，当EGFRt在具有目标转基因(例如CAR或TCR)的细胞中共表达时，它可以被西妥昔单抗单克隆抗体靶向，以经由ADCC减少或耗尽转化的经基因修饰的细胞(参见，美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。重要地，使用tEGFR的自杀杀伤途径要求抗体表位的可用性。这种标记基因的另一个例子是前列腺特异性膜抗原(PSM A)或其修饰形式。PSMA或其修饰形式可以包含被PSMA靶向分子(如抗体或其抗原结合片段)结合或由其识别的氨基酸序列。PSMA靶向分子可以用于鉴定或选择已经用PSMA或经修饰的构建体工程化的细胞，包括还用另一种重组受体(如本文所提供的嵌合抗原受体(CAR))共工程化的细胞。在一些方面，所述标记物包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、神经生长因子受体(NGFR)、表皮生长因子受体(例如，EGFR)或PSMA。
示例性替代标记物可以包括细胞表面多肽的截短形式，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在SEQ ID NO:246中所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，所述标记物(例如替代标记物)包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，所述标记物是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体、以及密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，所述标记物是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，所述标记物是选择标记物。在一些实施方案中，所述选择标记物是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述选择标记物是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记物是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记物是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，编码标记物的核酸可操作地连接至编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。参见WO 2014031687。在一些实施方案中，引入编码由T2A核糖体开关隔开的CAR和替代标记物的构建体可以表达来自相同构建体的两种蛋白质，使得所述替代标记物可以用作检测表达这种构建体的细胞的标记物。在一些实施方案中，所述替代标记物和任选的接头序列可以是如国际公开号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，所述标记物可以是截短的EGFR(tEGFR)或PSMA，其任选地与接头序列(如2A可切割接头序列(例如，T2A、P2A、E2A或F2A可切割接头，如本文别处所述的))连接。截短的EGFR替代标记物的示例性多肽包含SEQ ID NO:246中所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:246展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
在一些实施方案中，所述标记物是并非在T细胞上天然发现或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。
在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白质，即并非被将细胞过继转移至其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，所述标记物不起任何治疗作用和/或不产生除了用作遗传工程化的标记物(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记物可以是治疗性分子或以其他方式发挥一定所需作用的分子，如会在体内遇到的细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体后的反应。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后或响应于抗原结合而仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是在一些方面包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，所述嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv或仅包含VH区的单结构域抗体，并且细胞内信号传导结构域含有ITAM。在一些方面，所述细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含连接细胞外结构域与细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。所述细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有共刺激分子(例如T细胞共刺激分子)的细胞内结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，所述受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体，例如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，所述细胞内结构域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体，如人4-1BB的42个氨基酸的胞质结构域(登录号Q07011.1)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190中所述的CD3ζ信号传导结构域。
例如，在一些实施方案中，所述CAR包括BCMA抗体或片段(如本文所述的任何人BCMA抗体，包括sdAb和scFv)、间隔子(如任何含有Ig铰链的间隔子)、CD28跨膜结构域、CD28细胞内信号传导结构域、和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR包括BCMA抗体或片段(如本文所述的任何人BCMA抗体，包括sdAb和scFv)、间隔子(如任何含有Ig铰链的间隔子)、CD28跨膜结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，此类CAR构建体还包含例如在CAR下游的T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列。
在某些实施方案中，多特异性结合分子(例如多特异性嵌合受体，如多特异性CAR)可以含有任何多特异性抗体，包括例如双特异性抗体、多特异性单链抗体，例如双抗体、三抗体和四抗体、串联双scFv和串联三scFv，如上文第I.A节中所述的任何一种。
B.示例性特征
在一些方面，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段具有一个或多个规定的功能特征(如结合特性)，包括识别或结合至特定表位(如与其他抗体(如参考抗体)所特异性地结合的表位类似或重叠的表位或者与其他抗体(如参考抗体)所特异性地结合的表位不同的表位)、与其他抗体(如参考抗体)竞争结合的能力、和/或特定的结合亲和力。在其他实施方案中，在所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段识别(如特异性地识别)或结合(例如，特异性地结合)至以下表位，所述表位不同于由其他抗体(如参考抗体)所特异性地结合的表位或不与其重叠。例如，所提供的CAR中的抗体所特异性地结合的表位与其他抗体(如参考抗体)所特异性地结合的表位不同。在一些实施方案中，所述抗体及其抗原结合片段不直接与其他抗体(如参考抗体)竞争结合或在较低程度上竞争结合。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性地识别或特异性地结合至BCMA蛋白。在任何实施方案中，所提供的CAR中特异性地识别BCMA的抗体或抗原结合片段特异性地结合BCMA。在本文提供的一些实施方案中，BCMA蛋白是指人BCMA、小鼠BCMA蛋白或非人灵长类(例如食蟹猴)BCMA蛋白。在本文的任何实施方案的一些实施方案中，BCMA蛋白是指人BCMA蛋白。抗体或其他结合分子与BCMA蛋白结合或与BCMA蛋白特异性地结合的观察结果并不一定意味着其与每种物种的BCMA蛋白结合。例如，在一些实施方案中，与BCMA蛋白结合的特征(如与其特异性地结合和/或与参考抗体竞争其结合和/或以特定亲和力结合或在某种程度上竞争的能力)在一些实施方案中是指对于人BCMA蛋白的能力，并且抗体对于另一物种(如小鼠)的BCMA蛋白可能不具有此功能。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与哺乳动物BCMA蛋白(包括与天然存在的BCMA变体，如某些剪接变体或等位基因变体)结合。
在一些实施方案中，所述抗体与人BCMA蛋白(例如与人BCMA蛋白的表位或区域，例如包含SEQ ID NO:164(GenBank号BAB60895.1)或SEQ ID NO:165(NCBI号NP_001183.2)的氨基酸序列的人BCMA蛋白或其等位基因变体或剪接变体)特异性地结合。在一个实施方案中，所述人BCMA蛋白是由转录物变体编码或是具有SEQ ID NO:163所示氨基酸序列的同种型。在一些实施方案中，所述抗体与食蟹猴BCMA蛋白(如SEQ ID NO:147(GenBank号EHH60172.1)所示食蟹猴BCMA蛋白)结合。在一些实施方案中，所述抗体与人BCMA结合，但与食蟹猴BCMA蛋白(例如SEQ ID NO:147(GenBank号EHH60172.1)所示的食蟹猴BCMA蛋白)不结合或以较低水平或程度或亲和力结合。在一些实施方案中，所述抗体与小鼠BCMA蛋白(例如SEQ ID NO:179(NCBI号NP_035738.1)所示的小鼠BCMA蛋白)不结合或以较低水平或程度或亲和力结合。在一些实施方案中，所述抗体与小鼠BCMA蛋白(例如SEQ ID NO:179(NCBI号NP_035738.1)所示的小鼠BCMA蛋白)结合。在一些实施方案中，所述抗体与小鼠BCMA蛋白结合的亲和力低于其与人BCMA蛋白和/或食蟹猴BCMA蛋白的结合。在一些实施方案中，所述抗体与小鼠BCMA蛋白和/或食蟹猴BCMA蛋白结合的亲和力低于其与人BCMA蛋白的结合。在一些实施方案中，所述抗体与小鼠BCMA蛋白和/或食蟹猴BCMA蛋白结合的结合亲和力类似于其与人BCMA蛋白的结合。
在一些实施方案中，与可溶性BCMA相比，所提供的抗原结合结构域或CAR展现出与膜结合的BCMA的优先结合。在一些实施方案中，与可溶性BCMA相比，所提供的抗原结合结构域或CAR展现出对膜结合的BCMA的更大结合亲和力。
在一个实施方案中，所述抗BCMA抗体或抗原结合结构域或CAR与不相关的非BCMA蛋白(如非人BCMA蛋白或其他非BCMA蛋白)的结合程度是所述抗体或抗原结合结构域或CAR与人BCMA蛋白或人膜结合的BCMA的结合的小于或小于约10％，如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗原结合结构域包括如下抗体或抗原结合结构域或CAR，其中与小鼠BCMA蛋白的结合是所述抗体与人BCMA蛋白的结合的小于或为或约10％。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗原结合结构域包括如下抗体，其中与食蟹猴BCMA蛋白的结合是所述抗体与人BCMA蛋白的结合的小于或为或约10％。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗原结合结构域包括如下抗体，其中与食蟹猴BCMA蛋白和/或小鼠BCMA蛋白的结合类似于或约等于所述抗体与人BCMA蛋白的结合。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗原结合结构域包括如下抗体或抗原结合结构域或CAR，其中与可溶性BCMA蛋白的结合是所述抗体与膜结合的BCMA蛋白的结合的小于或为或约10％。
在一些实施方案中，所述抗体与BCMA蛋白(例如人BCMA、小鼠BCMA蛋白或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)BCMA蛋白)特异性地结合和/或所述抗体与参考抗体竞争其结合和/或所述抗体以特定亲和力结合或在某种程度上竞争。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体能够以至少特定的亲和力结合BCMA蛋白(如人BCMA蛋白)，如通过多种已知方法中的任一种所测量。在一些实施方案中，所述亲和力由平衡解离常数(KD)表示；在一些实施方案中，亲和力由EC50表示。
已知多种用于评估结合亲和力和/或确定结合分子(例如，抗体或其片段)是否与特定配体(例如，抗体，如BCMA蛋白)特异性地结合的测定。例如通过使用本领域熟知的许多结合测定中的任何一种确定结合分子(例如，抗体)对抗原(例如，BCMA，如人BCMA或食蟹猴BCMA或小鼠BCMA)的结合亲和力在熟练技术人员的水平内。例如，在一些实施方案中，使用表面等离子体(SPR)分析，可以将
仪器用于确定两种蛋白质(例如，抗体或其片段与抗原(如BCMA蛋白质))之间的复合物的结合动力学和常数(参见例如，Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；Wilson,Science 295:2103,2002；Wolff等人,CancerRes.53:2560,1993；和美国专利号5,283,173、5,468,614或等同物)。
在分子结合至表面或从表面解离时，SPR测量传感器表面处分子浓度的变化。所述SPR信号的变化与靠近表面的质量浓度变化成正比，从而允许测量两个分子之间的结合动力学。可以通过监测当缓冲液经过芯片时折射率关于时间的变化来确定与复合物的解离常数。用于测量一种蛋白质与另一种蛋白质的结合的其他合适的测定包括例如免疫测定(如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA))或通过借助荧光、紫外吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学性质的变化来确定结合。其他示例性测定包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、分析型超速离心、光谱法、流式细胞术、测序和用于检测所表达的多核苷酸或蛋白质结合的其他方法。
在一些实施方案中，所述结合分子(例如，CAR的抗体或其片段或者抗原结合结构域)与抗原(例如，BCMA蛋白或其中的表位)结合(例如特异性地结合)，其中亲和力或KA(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M；等于对于此缔合反应的缔合速率[kon或ka]与解离速率[koff或kd]的比率，假定双分子相互作用)等于或大于105M-1。在一些实施方案中，CAR的抗体或其片段或抗原结合结构域展现出对肽表位的结合亲和力，其KD(即，特定结合相互作用的平衡解离常数，单位为M；等于该缔合反应的解离速率[k解离或kd]与缔合速率[k缔合或ka]的比率，假定是双分子相互作用)等于或小于10-5M。例如，平衡解离常数KD在10-5M至10-13M，如10-7M至10-11M、10-8M至10-10M、或10-9M至10-10M的范围内。缔合速率(缔合速率常数；k缔合或ka；单位为1/Ms)和解离速率(解离速率常数；k解离或kd；单位为1/s)可以使用本领域中已知的任何测定方法(例如，表面等离子体共振(SPR))来测定。
在一些实施方案中，CAR的抗体(例如抗原结合片段)或抗原结合结构域与BCMA蛋白(如人BCMA蛋白)的结合亲和力(EC50)和/或解离常数为从或从约0.01nM至约500nM、从或从约0.01nM至约400nM、从或从约0.01nM至约100nM、从或从约0.01nM至约50nM、从或从约0.01nM至约10nM、从或从约0.01nM至约1nM、从或从约0.01nM至约0.1nM，为从或从约0.1nM至约500nM、从或从约0.1nM至约400nM、从或从约0.1nM至约100nM、从或从约0.1nM至约50nM、从或从约0.1nM至约10nM、从或从约0.1nM至约1nM、从或从约0.5nM至约200nM、从或从约1nM至约500nM、从或从约1nM至约100nM、从或从约1nM至约50nM、从或从约1nM至约10nM、从或从约2nM至约50nM、从或从约10nM至约500nM、从或从约10nM至约100nM、从或从约10nM至约50nM、从或从约50nM至约500nM、从或从约50nM至约100nM、或者从或从约100nM至约500nM。在某些实施方案中，所述抗体与BCMA蛋白(如人BCMA蛋白)的结合亲和力(EC50)和/或平衡解离常数KD为等于或小于或约400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、或1nM或更小。在一些实施方案中，所述抗体以次纳摩尔的结合亲和力，例如以小于约1nM(例如小于约0.9nM、约0.8nM、约0.7nM、约0.6nM、约0.5nM、约0.4nM、约0.3nM、约0.2nM、或约0.1nM或更小)的结合亲和力与BCMA蛋白(如人BCMA蛋白)结合。
在一些实施方案中，可以将结合亲和力分类为高亲和力或低亲和力。在一些情况下，展现出低至中亲和力结合的CAR的结合分子(例如，抗体或其片段)或抗原结合结构域展现出至多107M-1、至多106M-1、至多105M-1的KA。在一些情况下，展现出与特定表位的高亲和力结合的结合分子(例如抗体或其片段)与这种表位以至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的KA相互作用。在一些实施方案中，所述结合分子(例如，CAR的抗BCMA抗体或其片段或抗原结合结构域)与BCMA蛋白的结合亲和力(EC50)和/或平衡解离常数KD为从或从约0.01nM至约1μM、0.1nM至1μM、1nM至1μM、1nM至500nM、1nM至100nM、1nM至50nM、1nM至10nM、10nM至500nM、10nM至100nM、10nM至50nM、50nM至500nM、50nM至100nM、或100nM至500nM。在某些实施方案中，所述结合分子(例如，CAR的抗BCMA抗体或其片段或抗原结合结构域)与BCMA蛋白的结合亲和力(EC50)和/或平衡解离常数的解离常数KD为或为约或者小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、或1nM或更小。可以将特定抗体的亲和力程度与已知抗体(如参考抗体)的亲和力进行比较。
在一些实施方案中，可以比较结合分子(如CAR的抗BCMA抗体或抗原结合结构域)对不同抗原(例如来自不同物种的BCMA蛋白)的结合亲和力以确定物种交叉反应性。例如，可以将物种交叉反应性分类为高交叉反应性或低交叉反应性。在一些实施方案中，可以比较对于不同抗原(例如来自不同物种(如人、食蟹猴或小鼠)的BCMA蛋白)的平衡解离常数KD以确定物种交叉反应性。在一些实施方案中，CAR的抗BCMA抗体或抗原结合结构域的物种交叉反应性可以是高的，例如，抗BCMA抗体与人BCMA和物种变体BCMA以类似的程度结合，例如，对于人BCMA的KD与对于物种变体BCMA的KD的比率为或为约1。在一些实施方案中，CAR的抗BCMA抗体或抗原结合结构域的物种交叉反应性可以是低的，例如，抗BCMA抗体对人BCMA具有高亲和力，但对物种变体BCMA具有低亲和力，反之亦然。例如，对于物种变体BCMA的KD与对于人BCMA的KD的比率为大于10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或更大，并且抗BCMA抗体具有低物种交叉反应性。物种交叉反应性的程度可以与已知抗体(如参考抗体)的物种交叉反应性进行比较。
在一些实施方案中，将CAR的抗BCMA抗体或抗原结合结构域对不同形式或拓扑类型的抗原(例如，可溶性BCMA蛋白)的结合亲和力与对膜结合BCMA的结合亲和力相比较，以确定对特定形式或拓扑类型的优先结合或相对亲和力。例如，在一些方面，所提供的抗BCMA抗体或抗原结合结构域可以展现出与可溶性BCMA相比对膜结合BCMA的优先结合，和/或展现出与可溶性BCMA相比对膜结合BCMA的更大结合亲和力。在一些实施方案中，可以比较对不同形式或拓扑类型的BCMA蛋白的平衡解离常数KD，以确定优先结合或相对结合亲和力。在一些实施方案中，与可溶性BCMA相比，对膜结合BCMA的优先结合或相对亲和力可能较高。例如，在一些情况下，对可溶性BCMA的KD与对膜结合BCMA的KD的比率大于10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或更大，并且抗体或抗原结合结构域优先结合膜结合BCMA或者对膜结合BCMA具有更高结合亲和力。在一些情况下，对膜结合BCMA的KA与对可溶性BCMA的KA的比率大于10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或更大，并且抗体或抗原结合结构域优先结合膜结合BCMA或者对膜结合BCMA具有更高结合亲和力。在一些情况下，CAR的抗体或抗原结合结构域以类似的程度结合可溶性BCMA和膜结合BCMA，例如，对可溶性BCMA的KD与对膜结合BCMA的KD的比率为或为约1。在一些情况下，CAR的抗体或抗原结合结构域以类似的程度结合可溶性BCMA和膜结合BCMA，例如，对可溶性BCMA的KA与对膜结合BCMA的KA的比率为或为约1。可以将对膜结合BCMA或可溶性BCMA的优先结合程度或者相对亲和力与已知抗体(如参考抗体)的所述优先结合程度或相对亲和力相比较。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段与人BCMA蛋白和非人BCMA蛋白或其他非BCMA蛋白以类似的程度结合。例如，在一些实施方案中，CAR的抗体或其抗原结合片段或抗原结合结构域与人BCMA蛋白(例如包含SEQ ID NO:164(GenBank号BAB60895.1)或SEQ ID NO:165(NCBI号NP_001183.2)的氨基酸序列的人BCMA蛋白或其等位基因变体或剪接变体)以平衡解离常数(KD)结合，并且与非人BCMA(如食蟹猴BCMA，例如SEQID NO:147(GenBank号EHH60172.1)所示的食蟹猴BCMA蛋白)以类似的、或约相等的、或小于2倍差异或小于5倍差异的KD结合。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段与可溶性BCMA蛋白和膜结合的BCMA蛋白以类似的程度结合，其中平衡解离常数(KD)是类似的或大约相同的或小于2倍的差异或小于5倍的差异。
例如，在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段与人BCMA以约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、或1nM或更小的KD结合，并且与食蟹猴BCMA以约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、或1nM或更小的KD结合。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与小鼠BCMA蛋白以约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、或1nM或更小的KD结合。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段与人BCMA、食蟹猴BCMA和小鼠BCMA以高亲和力结合。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与人BCMA和食蟹猴BCMA以高亲和力结合，并且与小鼠BCMA以低亲和力结合。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与人BCMA和来自其他物种的BCMA或BCMA蛋白的其他变体以高亲和力结合。
在一些实施方案中，将如使用特定的表面等离子体共振(SPR)条件所测量的总结合容量(Rmax)用于确定所述抗体或其抗原结合片段与抗原(例如，BCMA蛋白，如人BCMA蛋白)的结合能力或容量。对于SPR分析，“配体”是在传感器表面上的固定化靶分子(例如BCMA蛋白)，并且“分析物”是用于与“配体”结合的测试分子(例如抗体)。例如，“分析物”可以是与BCMA蛋白结合的任何抗体或其抗原结合片段。对于SPR中的特定配体和分析物对，可以针对特定条件在假定1:1结合化学计量模型的情况下确定Rmax。使用下式来确定结合容量(Rmax)：Rmax(RU)＝(分析物分子量)/(配体分子量)×固定化配体水平(RU)。例如，在特定的SPR条件下，在任何抗体或其抗原结合片段与BCMA蛋白(如人BCMA或食蟹猴BCMA)之间的结合的Rmax为至少或至少约50个共振单位(RU)，如约25RU、20RU、15RU、10RU、5RU或1RU。
在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体(如人抗体)与BCMA蛋白的特定表位或区域(如通常为细胞外表位或区域)特异性地结合。BCMA蛋白是含有细胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域的184个氨基酸的III型膜蛋白。关于SEQ ID NO:164所示的人BCMA氨基酸序列，细胞外结构域对应于氨基酸1-54，氨基酸55-77对应于跨膜结构域，并且氨基酸78-184对应于胞质结构域。
所提供的CAR包括展现出抗原依赖性活性或信号传导的CAR，即在不存在抗原(例如BCMA)的情况下信号传导活性可测量地不存在或处于背景水平。因此，在一些方面，所提供的CAR在不存在当前抗原(例如BCMA)的情况下不展现出基础信号传导或抗原非依赖性活性或信号传导或者展现出不超过背景或可耐受或低水平的基础信号传导或抗原非依赖性活性或信号传导。在一些实施方案中，所提供的抗BCMA CAR表达细胞展现出生物活性或功能，包括细胞毒性活性、细胞因子产生和增殖能力。
在一些实施方案中，嵌合受体的生物活性或功能活性(如细胞毒性活性)可以使用多种已知方法中的任一种来测量。可以在体外或体内评估或确定所述活性。在一些实施方案中，可以在将所述细胞施用至受试者(例如，人)后评估活性。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其例如在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，所述工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，所述细胞的生物活性还可以通过测定如下某些细胞因子的表达和/或分泌来测量：如白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、TNF-α(TNFα)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD107a和/或TGF-β(TGFβ)。测量细胞因子的测定是本领域所熟知的，并且包括但不限于ELISA、细胞内细胞因子染色、流式微珠阵列、RT-PCR、ELISPOT、流式细胞术和在存在测试样品的情况下测试对相关细胞因子有反应的细胞的反应性(例如，增殖)的生物测定。在一些方面，生物学活性是通过评估临床结局(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量。
在一些方面，报告细胞系可以用于监测通过抗BCMA CAR表达细胞的抗原非依赖性活性和/或基础信号传导。在一些实施方案中，T细胞系(如Jurkat细胞系)含有在内源性Nur77转录调节元件的控制下表达的报告分子，如荧光蛋白或其他可检测分子(如红色荧光蛋白)。在一些实施方案中，所述Nur77报告基因表达是细胞固有的并且依赖于通过重组报告物的信号传导，所述重组报告物含有T细胞中的初级激活信号、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域(如CD3ζ链)。Nur77表达通常不受其他信号传导途径(如细胞因子信号传导或toll样受体(TLR)信号传导)的影响，所述其他信号传导途径可能以细胞非固有方式起作用，并且可能不依赖于通过重组受体的信号传导。因此，只有表达含有适当的信号传导区的外源重组受体(例如抗BCMA CAR)的细胞才能够在刺激(例如，特异性抗原的结合)时表达Nur77。在一些情况下，Nur77表达还可以显示对刺激(例如，抗原)的量的剂量依赖性反应。
在一些实施方案中，如与具有相同氨基酸序列但由未进行剪接位点消除和/或密码子优化的核苷酸序列编码的替代CAR相比，所提供的抗BCMA CAR在细胞表面上展现出改善的表达。在一些实施方案中，可以评估细胞表面上重组受体的表达。用于确定细胞表面上重组受体的表达的途径可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如，Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)、蛋白L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)、表位标签以及与CAR多肽特异性地结合的单克隆抗体(参见国际专利申请公开号WO 2014190273)。在一些实施方案中，所述细胞(例如，原代T细胞)表面上重组受体的表达可以例如通过流式细胞术使用可与所述重组受体或其一部分结合的可被检测到的结合分子来评估。在一些实施方案中，用于检测重组受体表达的结合分子是抗独特型抗体，例如，对结合结构域(例如，scFv)或其一部分具有特异性的抗独特型激动剂抗体。在一些实施方案中，所述结合分子是或包含分离的或纯化的抗原，例如重组表达的抗原。
C.多特异性抗体
在某些实施方案中，BCMA结合分子(例如抗体或多肽，如含有抗体或多肽的嵌合受体)是多特异性的。多特异性结合分子包括多特异性抗体，所述多特异性抗体包括例如双特异性抗体。多特异性结合配偶体(例如抗体)对至少两个不同的位点具有结合特异性，所述至少两个不同的位点可以在相同或不同的抗原中。在某些实施方案中，所述结合特异性中的一种是针对BCMA，并且另一种是针对另一种抗原。在一些实施方案中，另外的结合分子结合和/或识别第三种或更多种抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合BCMA的两个不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位于表达BCMA的细胞。可以将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段。所述多特异性抗体包括多特异性单链抗体(例如双抗体、三抗体和四抗体)、串联双scFv和串联三scFv。还提供含有抗体(例如抗原结合片段)的多特异性嵌合受体，如多特异性CAR。还提供含有抗体或多肽(包含抗体)的多特异性细胞，例如含有细胞表面蛋白(包括抗BCMA抗体)和与不同抗原或BCMA上的不同表位结合的另外的细胞表面蛋白(如另外的嵌合受体)的细胞。
示例性抗原包括B细胞特异性抗原、其他肿瘤特异性抗原，例如在白血病(例如B细胞白血病)、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等)或骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM)、浆细胞恶性肿瘤(例如浆细胞瘤))上特异性地表达或与所述肿瘤相关的抗原。例如，抗原包括在如下肿瘤上特异性地表达或与如下肿瘤相关的那些抗原：B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特淋巴瘤(例如地方性伯基特淋巴瘤或散发性伯基特淋巴瘤)、套细胞淋巴瘤(MCL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、慢性骨髓性(或粒细胞性)白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、难治性滤泡性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、滤泡性淋巴瘤、小无裂细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、边缘区淋巴瘤、结节单核细胞样B细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、肺B细胞血管中心淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤(例如非分泌性多发性骨髓瘤、郁积型多发性骨髓瘤))、胃癌、食道癌、脑癌、肺癌(例如小细胞肺癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)(例如肝癌(hepaticcarcinoma)、肝细胞瘤等)、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、脾癌(例如脾淋巴瘤)、肾上腺癌和/或头颈癌，以及在T细胞上表达的抗原。
在一些实施方案中，用于多靶向策略的第二或另外的抗原包括其中至少一种抗原是通用肿瘤抗原或其家族成员的那些抗原。在一些实施方案中，所述第二或另外的抗原是在肿瘤上表达的抗原。在一些实施方案中，本文提供的BCMA结合分子靶向与所述第二或另外的抗原相同的肿瘤类型上的抗原。在一些实施方案中，所述第二或另外的抗原可以是通用肿瘤抗原或可以是为肿瘤类型所特有的肿瘤抗原。
示例性第二或另外的抗原包括CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CD138、B7、MUC-1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、血管生成因子、VEGF、PIGF、ED-B纤连蛋白、致癌基因、致癌基因产物、CD66a-d、坏死抗原、Ii、IL-2、T101、TAC、IL-6、ROR1、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、Her2、L1-CAM、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD24、CD30、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、erbB二聚体、EGFR vIII、FBP、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、生存素、EGP2、EGP40、TAG72、B7-H6、IL-13受体a2(IL-13Ra2)、CA9、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、双抗原、与通用标签相关的抗原、癌症-睾丸抗原、MUC1、MUC16、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、肾母细胞瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、hTERT、MDM2、CYP1B、WT1、活素、AFP、p53、细胞周期蛋白(D1)、CS-1、BAFF-R、TACI、CD56、TIM-3、CD123、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、MAGE A3、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))和/或病原体特异性抗原、生物素化分子、由HIV、HCV、HBV和/或其他病原体表达的分子；和/或在一些方面，其新表位或新抗原。在一些实施方案中，所述抗原与通用标签相关或者是通用标签。
在一些方面，所述抗原(例如第二或另外的抗原，如疾病特异性抗原和/或相关抗原，如G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(多配体聚糖-1、多配体聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5)在多发性骨髓瘤上表达。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，所述抗原包括存在于淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的那些抗原，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下文献中所述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US20120189622或US 20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006099875、WO 2009080829或WO2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
II.优化和产生多核苷酸例如编码BCMA CAR的多核苷酸和优化的多核苷酸的方法
本文提供了优化用于表达和/或治疗用途的多核苷酸的方法，以及例如根据所述方法优化的多核苷酸。在一些方面，在所提供的方法和用途(如用于细胞治疗的方法和用途)中，采用通过引入优化的多核苷酸而工程化的细胞，如免疫细胞。在一些实施方案中，例如当多核苷酸在细胞中(如在特定细胞类型中，如在哺乳动物(例如人细胞类型，如人T细胞，如原代人T细胞或T细胞系)中)表达时，所提供的方法或优化降低转录的RNA(如信使RNA(mRNA))的异质性和/或增加其同质性。在一些实施方案中，用于优化多核苷酸的方法包括鉴定和去除或改变一个或多个隐秘剪接位点(如供体剪接位点或受体剪接位点中之一或两者)的序列的方法。在一些实施方案中，所述方法可以附加地或还包括密码子优化。在一些实施方案中，密码子优化可以在如通过去除或消除预测的剪接位点降低转录的RNA(例如，mRNA)的异质性的方法之前和/或之后进行。在一些实施方案中，密码子优化被整合在降低转录的RNA的异质性的方法的任何一个或多个步骤中。在一些实施方案中，如通过去除或消除预测的剪接位点降低异质性的方法可以在密码子优化之后进行。在一些实施方案中，提供了如下方法，其中编码转基因的多核苷酸(包括编码任何所提供的抗BCMA CAR多肽的多核苷酸)可以被优化用于表达和/或用于治疗用途。在一些实施方案中，所述多核苷酸被修饰以优化密码子使用。在一些实施方案中，所述多核苷酸进行密码子优化以用于在人细胞(如人T细胞如原代人T细胞)中表达。在一些实施方案中，所述多核苷酸(如编码任何本文所提供的抗体、受体(如抗原受体，如嵌合抗原受体)和/或BCMA特异性结合蛋白的那些)被修饰或已经被修饰以降低异质性或含有本文所观察的一种或多种核酸序列(如通过所述优化方法)，从而导致与含有不同的参考序列或尚未优化的那些相比，所述多肽(如CAR)的改善的特征。此类特征包括RNA异质性(如由于存在一个或多个剪接位点(如一个或多个隐秘剪接位点)而导致的RNA异质性)的改善和/或编码的蛋白质的改善的表达和/或表面表达，如工程化以表达所述多肽的细胞或不同的治疗性细胞组合物之中的增加的表达水平、均匀性或一致性。在一些实施方案中，所述多核苷酸可以进行密码子优化以用于在人细胞中表达。
通常天然地在哺乳动物细胞中的基因组核酸序列经历共转录处理或在转录后立即处理，其中从基因组脱氧核糖核酸(DNA)序列转录的新生前体信使核糖核酸(pre-mRNA)在一些情况下通过剪接的方式进行编辑以去除内含子，接着真核细胞中的外显子进行连接。剪接位点的共有序列是已知的，而在一些方面，定义剪接位点的特定核苷酸信息可能是复杂的，并且基于可用的方法可能不容易看出。隐秘剪接位点是基于标准共有序列无法预测的且可变地激活的剪接位点。因此，前mRNA在隐秘剪接位点处的可变剪接导致在真核细胞中表达后转录的mRNA产物的异质性。
用于表达转基因而产生的多核苷酸通常由不含有内含子的核酸序列(如互补DNA(cDNA)或其部分)构建。因此，预期不发生此类序列的剪接。然而，cDNA序列内的隐秘剪接位点的存在可能导致转录的mRNA中非预期或不希望的剪接反应和异质性。这种异质性导致非预期的蛋白质产物(如展现出经修饰的表达和/或活性的具有可变氨基酸序列的截短的蛋白质产物)的翻译。
还提供了用于确定转录的核酸(如编码或含有转基因或者编码重组蛋白的核酸)的异质性的方法和途径。在一些实施方案中，所述方法包括确定转录的核酸序列的异质性，所述转录的核酸序列包括转录的核酸的5'非翻译区(5′UTR)的全部或一部分和/或3'非翻译区(3′UTR)的全部或一部分。本文还提供了基于转录的核酸的异质性鉴定剪接位点(如隐秘的剪接位点)的存在的方法。还提供了使用所提供的确定转基因的转录的核酸的异质性的方法来鉴定对于去除剪接位点(如隐秘的剪接位点)的转基因候选物的方法。还提供了降低表达的转基因转录物的异质性的方法。
本文还提供了如基于所确定的例如转基因的转录的核酸的异质性鉴定对于去除或修饰一个或多个剪接位点(如隐秘的剪接位点)的转基因或重组蛋白或核酸候选物的方法。
还提供了用于降低转基因(例如，表达的转基因转录物)或其他核酸的转录的核酸(例如，转录物)的异质性的方法和途径。此类方法和途径可以包括根据所提供的方法鉴定对于去除剪接位点(如隐秘的剪接位点)的转基因候选物，以及鉴定转基因内的一个或多个潜在剪接供体和/或剪接受体位点。在所提供的方法的实施方案中，所述剪接供体和/或剪接受体位点可以在所述转录的核酸(例如，转录物)的翻译区和/或非翻译区中。
在一些实施方案中，消除剪接位点(如隐秘的剪接位点)可以改善或优化转基因产物(如从转基因翻译的多肽，如抗BCMA CAR多肽)的表达。在编码的转基因(如编码的BCMACAR分子)的隐秘剪接位点处剪接可以导致降低的蛋白质表达(例如，细胞表面上的表达)和/或降低的功能(例如，降低的细胞内信号传导)。本文提供了已被优化以减少或消除隐秘的剪接位点的编码抗BCMA CAR蛋白的多核苷酸。本文还提供了编码抗BCMA CAR蛋白的多核苷酸，其已被优化以用于密码子表达，和/或其中存在一个或多个序列(如通过本文关于剪接位点的方法或观察鉴定的序列)，和/或其中不存在鉴定的剪接位点(如本文中任何鉴定的剪接位点)。所提供的多核苷酸包括当在某些条件下表达和/或引入特定细胞类型(如人T细胞，如原代人T细胞)以及含有此类多肽和/或展现出此类特性的细胞和组合物以及制品中时，展现出低于某种程度的RNA异质性或剪接形式的那些。
在一些实施方案中，降低RNA异质性或去除潜在的剪接位点包括修饰多核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰包括与参考多核苷酸(如编码相同多肽的未修饰的多核苷酸)相比的一种或多种核苷酸修饰，如替代或取代。在一些实施方案中，所述参考多核苷酸是如下多核苷酸，其中转录的RNA(例如mRNA)当在细胞中表达时展现出大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高RNA异质性。在一些实施方案中，所提供的方法可以导致如下多核苷酸，其中转录的RNA的RNA异质性降低了大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更多。在一些实施方案中，所提供的方法产生如下多核苷酸，其中转录的RNA的RNA同质性为至少70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高。
A.测量和降低RNA异质性的方法
本文提供了用于测量、评价和/或降低核酸(如转录的RNA)例如当在特定细胞类型或环境中表达时的RNA异质性的方法、途径和策略，以及与参考多核苷酸相比展现出这种异质性和/或其风险的降低的多核苷酸。在一些实施方案中，可以如通过本节中所述的方法评估参考多核苷酸的RNA异质性。在一些实施方案中，所提供的途径涉及鉴定如在特定细胞或环境中如由于隐秘的剪接位点而导致的RNA(例如，mRNA)异质性或其可能性。在一些方面，通过使用对5'非翻译区(5′UTR)具有特异性的第一引物和对3'非翻译区(3′UTR)具有特异性或对转基因内的序列具有特异性的第二引物扩增RNA转录物来鉴定这种异质性，所述5'非翻译区对应于转录的RNA中位于转基因上游的元件(如启动子)的一部分，所述3'非翻译区在转录的RNA序列中位于表达的转基因的下游。在一些实施方案中，所述方法涉及使用至少一个5'和3'引物对扩增转录的核酸，其中至少一对包含与转录的核酸的5'非翻译区(5′UTR)内的核酸序列互补的5'引物和与转录的核酸的3'非翻译区(3′UTR)内的核酸序列互补的3'引物以产生一种或多种扩增产物。在一些实施方案中，所述方法涉及检测扩增产物，其中来自至少一个5'和3'引物对的两种或更多种扩增产物的存在指示扩增产物中的异质性。在一些实施方案中，检测到的转录物的差异是扩增的转录物的不同长度。在一些实施方案中，检测到的转录物的差异是色谱图谱的差异。用于鉴定多核苷酸的RNA异质性的示例性方法如下所述。在一些实施方案中，所述方法包括评价RNA异质性是否需要进行修饰以降低异质性。在一些实施方案中，选择展现出大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高的RNA异质性的多核苷酸进行核苷酸修饰以去除一个或多个剪接位点，如一个或多个隐秘的剪接位点。
1.测量RNA异质性
RNA异质性可以通过本文提供的或描述的或已知的多种方法中的任一种来确定。在一些实施方案中，转录的核酸的RNA异质性通过以下方式来确定：扩增转录的核酸，如通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，接着检测一种或多种扩增产物中的一种或多种差异，如大小差异。在一些实施方案中，基于不同大小的扩增产物的数量或各种不同大小的扩增产物的比例来确定RNA异质性。例如，在一些实施方案中，通过确定不同大小的扩增产物的数量、量或与总扩增产物的数量或量相比的比例来定量RNA异质性。在一些情况下，全部或基本上全部的特定转录物被确定为大小相等，并且在这种情况下，RNA异质性低。在一些情况下，与没有隐秘或不希望的剪接事件的情况下扩增产物的预测大小相比，存在各种不同大小的转录物或者大比例的特定转录物具有不同的大小。在一些实施方案中，可以通过以下方式计算RNA异质性：将与扩增产物的预测大小相比具有不同大小的全部扩增产物的总数量或总量除以全部扩增产物的总数量或总量。在一些实施方案中，所述转录物或扩增产物的预测大小是来自不含有或预测不含有隐秘的剪接位点的RNA。在一些实施方案中，所述转录物或扩增产物的预测大小考虑了期望或有意放置的一个或多个剪接位点。
在一些实施方案中，从表达待优化的转基因的细胞收获RNA(如总RNA或胞质聚腺苷酸化RNA)，并将其通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)使用对5'非翻译区(5′UTR)具有特异性的引物以及对3'非翻译区(3′UTR)具有特异性的引物或对转基因内的序列具有特异性的引物进行扩增，所述5'非翻译区在一些情况下对应于表达载体中启动子序列的一部分，所述3'非翻译区在转录的RNA序列中位于表达的转基因的下游。在特定实施方案中，使用与5'非翻译区(UTR)中的序列互补的至少一个引物和与3'非翻译区(UTR)中的序列互补的至少一个引物来扩增转基因。图21A中提供了使用对5′UTR具有特异性的正向引物和对3′UTR中的核苷酸序列具有特异性的引物扩增转录物和所得产物以及预测的扩增产物的示例性描述，在所述预测的扩增产物中没有发生剪接事件。图21B中显示了通过使用对5′UTR和3′UTR的区域具有特异性的引物扩增转录物而产生的示例性的多种扩增产物(即，异质性)的示例性描述，所述转录物具有5′UTR，其具有含有已知的剪接供体位点(P-SD)和已知的剪接受体位点(P-SD)的转录的启动子序列；含有未知的(隐秘的)剪接供体位点(T-SD)和两个未知的(隐秘的)剪接受体位点(T-SA)；以及3′UTR。
对5'非翻译区(UTR)具有特异性的示例性引物包括针对转基因的启动子内的序列的引物。在一些例子中，对EF1a/HTLV启动子具有特异性的引物。对EF1a-HTLV启动子具有特异性的示例性正向引物如SEQ ID NO:150中所示。
对3'非翻译区(UTR)具有特异性的示例性引物包括针对位于转基因下游的3'转录后调节元件的引物。示例性的3'转录后调节元件包括SEQ ID NO:253中所示的土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)。对WPRE具有特异性的示例性正向引物如SEQ ID NO:235中所示。
在一些实施方案中，多个引物对可以用于扩增转基因，如用于长转基因。在一些实施方案中，可使扩增产物的滑动窗口起皱的依序或嵌套正向和反向引物对可以用于增加序列的完全和重叠覆盖度。典型地，所述引物被设计为扩增大约1.5-6kb、2-6kb或3-6kb的转基因长度。图21C提供了使用嵌套引物对扩增转录物的示例性描述。
然后根据扩增的转录物长度分析扩增的核酸序列的异质性。在一些例子中，异质性是由表达的序列的条带的数量和强度来确定。在一些实施方案中，在表达时具有剪接事件的RNA序列产生具有不同迁移率的多个条带。在一些实施方案中，对于不具有任何未预测的剪接事件的序列，在预测的迁移率处检测到主带，并且具有不同强度和迁移率的1个或更多个另外的条带指示转基因序列内的一个或更多个隐秘剪接事件的发生。
熟练的技术人员可以通过若干种方法解析RNA(如信使RNA)并分析其异质性。非限制性的示例性方法包括琼脂糖凝胶电泳、基于芯片的毛细管电泳、分析离心、场流分级和色谱法(如尺寸排阻色谱法或液相色谱法)。
上述技术的一个或多个步骤可以在变性条件、部分变性条件或非变性条件下进行。所述变性条件可以包括由于温度、离液剂(包括盐)、有机试剂以及其他变性机制而导致核酸转录物(例如，mRNA)变性的条件。在热变性条件的情况下，可以施加升高的温度。升高的温度可以是足以使分子内氢键变性从而引起二级或三级结构等的变化或损失的温度。例如，温度或热变性条件可以包括25摄氏度至95摄氏度、35摄氏度至85摄氏度、55摄氏度至75摄氏度的温度或在那些范围内的另一范围的温度。类似地，可以视情况使用更高或更低的温度来引起所需的变性水平。温度或热变性条件也可以取决于核酸转录物的身份，使得不同的温度用于不同的核酸转录物或核酸转录物类型。所述变性条件还可以包括使用离液剂，如高氯酸锂和其他高氯酸盐、氯化胍和其他胍盐、尿素、丁醇、乙醇、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲或其他。所述变性条件还可以包括有机变性剂，如二甲基亚砜(DMSO)、乙腈和乙二醛。另外，所述变性条件可以包括这些变性条件类型中的两种或更多种的组合。RNA异质性确定技术的任何一个或多个步骤可以在有或没有离液剂或有机试剂的情况下在升高的温度下或在环境温度下进行。
a)凝胶电泳
在一些实施方案中，RNA转录物拓扑和表观(流体动力学)大小可以通过凝胶电泳(如琼脂糖凝胶电泳)来分析。在一些例子中，RNA转录物可以在0.05％至2％琼脂糖凝胶(如1.2％琼脂糖凝胶)上解析，并且通过染色或使用对特定序列具有特异性的探针来可视化。在一些实施方案中，RNA转录物可以通过凝胶电泳直接评估或者可以在扩增(如定量扩增方法)之后评估。用于在琼脂糖凝胶上使核酸可视化的核酸染色是熟知的。示例性染色剂包括BlueViewTM核酸染色剂(Millipore Sigma)、
金核酸染色剂(ThermoFisher)、
绿核酸染色剂(Millipore Sigma)、
绿II(ThermoFisher)、
核酸染色剂(Invitrogen)以及在蒸馏水中制备或掺入凝胶中的0.5μg/mL溴化乙锭。在一些例子中，使用Quant-iTTM 
结合对核酸进行染色，接着进行扩增产物的荧光检测和定量。琼脂糖凝胶方法给出了大小分布的更定量但分辨率较低的量度。在一些实施方案中，通过琼脂糖凝胶电泳解析的核酸片段可以通过RNA的Northern印迹或扩增的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)产物的Southern印迹而可视化。
b)基于芯片的毛细管电泳
基于芯片的毛细管电泳(例如，使用AGILENT 2100BIOANALYZERTM)可以用于监测RNA转录物完整性及其大小分布的快速常规方法。分离是基于流体动力学大小和电荷，并受RNA转录物的核苷酸长度和折叠结构的影响。在一个实施方案中，所述方法包括将样品递送至具有电解质介质的芯片的通道中，并向芯片施加电场，所述电场导致RNA转录物和杂质迁移通过所述通道。RNA转录物与杂质具有不同的电泳迁移率，使得RNA转录物以不同于杂质迁移通过通道的速率迁移通过通道。RNA转录物的电泳迁移率与RNA转录物的离子电荷成正比，与电解质介质中的摩擦力成反比。所述方法还包括从芯片收集包含RNA转录物的样品和样品中包含杂质的一个或多个单独部分。另外，所述方法包括表征样品中包含RNA转录物的部分和样品中包含杂质的一个或多个单独部分中的至少一个的方面。所述表征可以包括例如定量电荷变体。
c)分析超速离心(AUC)
分析超速离心(AUC)是用于测量分子量分布的液相方法，其中不存在可能通过SEC、琼脂糖或其他方法中的基质(树脂或凝胶)相互作用而引入的潜在人工产品。同时使用平衡AUC和沉降超速离心，并且后者提供与RNA转录物的大小和形状有关的沉降系数。使用配备扫描UV/可见光光学器件的BECKMANTM分析超速离心机进行RNA转录物的分析。
d)场流分级(FFF)
用于评估流体动力学大小分布的另一种液相方法是场流分级(FFF)。FFF是这样的分离技术，其中将磁场施加至通过垂直于流动方向的细长通道泵送的流体悬浮液或溶液，以使流体中存在的多核苷酸(RNA转录物)在所述场施加的力的作用下分离。所述场可以是通过半透膜、重力、离心、热梯度、电、磁等的不对称流。
e)色谱法
色谱法也可以用于检测RNA转录物长度的异质性。用于测定mRNA异质性的尺寸排阻色谱法和液相色谱法的方法描述于WO 2014144711中，将其通过引用并入本文。
B.优化多核苷酸例如编码BCMA CAR的多核苷酸的方法
在一些实施方案中，所提供的方法包括优化和/或修饰多核苷酸，例如，以降低RNA异质性和/或去除或消除隐秘或不需要的剪接位点。在一些方面，提供了降低表达的转基因转录物的异质性的方法，所述方法涉及如通过上文第I.A节中所述的方法鉴定用于去除剪接位点的转基因候选物；鉴定一个或多个潜在的剪接供体和/或剪接受体位点；以及修饰在一个或多个鉴定的剪接供体位点处或附近的核酸序列，从而产生经修饰的多核苷酸。在一些方面，所述方法还涉及评估去除剪接位点的转基因候选者资格。在一些实施方案中，所述方法还包括重复以上的一个或多个步骤，直到与所确定的转录物的初始异质性(如在修饰之前)相比，所述转录物的异质性降低。
在一些实施方案中，如通过去除或消除预测的剪接位点降低异质性的方法可以在密码子优化之后或在未进行密码子优化的RNA上进行。在一些方面，所述方法涉及鉴定剪接位点，例如一个或多个潜在剪接供体和/或受体位点，以及修饰或改变RNA序列(例如，通过替代或取代在剪接位点处或附近的一个或多个核苷酸)。在一些实施方案中，密码子优化可以在如通过去除或消除预测的剪接位点降低转录的RNA(例如，mRNA)的异质性的方法之前和/或之后进行。在一些实施方案中，转录物是否是降低RNA异质性的候选者是基于测量RNA异质性的方法(例如，如本文第II.A节中所述)来确定的。在一些方面，被检测为具有异质性的转录的核酸被鉴定为用于去除一个或多个剪接位点的转基因候选物。在一些实施方案中，当转基因候选物的转录的核酸在细胞中表达后展现出至少或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更高异质性时，转基因序列可以是用于降低异质性的候选物。在一些实施方案中，在人细胞(任选人T细胞)中多核苷酸的转录和处理后，来自多核苷酸的信使RNA(mRNA)展现出至少70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA同质性。
1.降低RNA异质性的方法
提供了降低表达的转基因转录物的异质性的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及鉴定一个或多个潜在的剪接供体和/或剪接受体位点，以及修饰在一个或多个所鉴定的剪接供体位点处或附近的核酸序列。在一些实施方案中，所述方法还涉及评估用于去除剪接位点的转基因候选物资格。在一些方面，可以重复本文所述的一个或多个步骤，例如直到与起始或未修饰的转录物相比，潜在的RNA异质性降低。
a)剪接位点鉴定
在一些方面，存在于转录物(如转基因转录物)中的潜在的隐秘剪接位点(剪接供体和/或受体位点)的存在可以导致转录物在细胞中表达后的RNA异质性。在一些实施方案中，所述方法涉及鉴定可能存在于转基因转录物中的、不需要的和/或在转录物的密码子优化后和/或通过突变或转录中的错误或误差可在转基因转录物中从各种潜在序列产生的一个或多个潜在剪接位点。在所提供的实施方案的一些方面中，所述剪接供体位点和所述剪接受体位点被独立地鉴定。在一些实施方案中，所述一个或多个剪接受体和/或供体位点是一个或多个经典的、非经典的和/或隐秘的剪接受体和/或供体位点。
在一些实施方案中，所提供的方法包括鉴定可能展现出RNA异质性或含有不需要的多核苷酸(例如编码转基因(如重组受体)的多核苷酸)中的一个或多个潜在剪接位点(例如，一个或多个经典的、非经典的和/或隐秘的剪接受体和/或供体位点或分支位点)。还提供了与此类参考多核苷酸相比具有降低数量的此类剪接位点的多肽。
在一些方面，核酸序列中的一个或多个剪接位点的鉴定是迭代过程。在一些实施方案中，可以使用剪接位点和/或密码子优化预测工具来鉴定剪接位点，如通过将编码转基因(如BCMA结合受体，例如抗BCMA CAR)的起始序列或参考序列提交至数据库、基因合成供应商或能够在计算或算法上比较起始或参考序列以鉴定或预测剪接位点和/或用于密码子优化和/或剪接位点去除的其他来源。在一些实施方案中，在修饰用于密码子优化和/或剪接位点去除的序列之后，对序列(如修订或修饰的核酸序列)进行一个或多个其他评估，以使用一种或多种其他或另外的剪接位点预测工具进一步评价剪接位点(如隐秘的剪接位点)去除。
在一些方面，RNA异质性可能是真核细胞中存在的剪接体活性的结果。在一些方面，剪接通常在由剪接体催化的一系列反应中进行。剪接位点的共有序列是已知的，而在一些方面，定义剪接位点的特定核苷酸信息可能是复杂的，并且基于可用的方法可能不容易看出。隐秘剪接位点是基于标准共有序列无法预测的且可变地激活的剪接位点。因此，前mRNA在隐秘剪接位点处的可变剪接导致在真核细胞中表达后转录的mRNA产物的异质性。在一些情况下，在剪接体内含子中，对于剪接事件需要供体位点(通常在内含子的5'端)、分支位点(内含子的3'端附近)和受体位点(内含子的3'端)。剪接供体位点可以在内含子的5'端包含GU序列，且具有大的较不保守的区域。内含子的3'端的剪接受体位点可以以AG序列终止。
在一些实施方案中，可以通过将序列与已知的剪接位点序列(如序列数据库中的那些)进行比较来鉴定剪接位点，包括潜在的隐秘剪接位点。在一些实施方案中，可以通过提交核苷酸序列以供剪接位点预测工具(如Human Splice Finder(Desmet等人,Nucl.Acids Res.37(9):e67(2009))(一种神经网络剪接位点预测工具)、NNSplice(Reese等人,J.Comput.Biol.,4(4):311(1997))、GeneSplicer(Pertea等人,Nucleic AcidsRes.2001 29(5):1185–1190)或NetUTR(Eden和Brunak,Nucleic Acids Res.32(3):1131(2004)))分析来鉴定剪接位点，所述剪接位点预测工具鉴定潜在的剪接位点以及在此类位点发生剪接事件的概率。另外的剪接预测工具包括RegRNA、ESEfinder和MIT剪接预测器。剪接位点预测工具(如GeneSplicer)已在不同物种(如人、黑腹果蝇、恶性疟原虫、拟南芥和稻米)的数据库上成功地进行了训练和/或测试。在一些实施方案中，不同的预测工具可以不同程度地适用于不同数据库和/或适用于不同物种。在一些实施方案中，所述一种或多种预测工具是基于它们在某些数据库中和/或对于某些物种的效用来选择的。参见例如，Saxonov等人,(2000)Nucleic Acids Res.,28,185-190。
在一些实施方案中，选择一种或多种剪接位点预测工具用于确定潜在的剪接供体和/或受体位点。在一些实施方案中，可以使用如下剪接位点预测工具，其可以在本地运行；可以在用户站点使用一组数据进行再训练；可以使用针对特定物种(如人)的数据库；可以针对多个平台进行编译；允许对序列选择进行实时预测；和/或作为经OSI认证的开源软件，使得可以修改特定的工具或插件。可以采用的示例性工具包括NNSplice、GeneSplicer或两者。
在一些方面，剪接位点预测工具用于鉴定序列(如含有转基因序列的多核苷酸序列)中的潜在剪接供体和/或剪接受体位点的列表。在一些方面，所述预测工具还可以生成所述多核苷酸中的一个或多个序列的一个或多个预测得分，所述预测得分可以指示所述一个或多个序列作为剪接供体或受体位点序列的可能性。
在一些实施方案中，所述方法涉及将特定剪接位点的预测得分与阈值得分或参考得分进行比较，以确定或鉴定用于消除或去除的候选物的特定剪接位点。例如，在一些实施方案中，当预测得分大于或不小于阈值得分或参考得分时，预测的剪接位点被鉴定为潜在的剪接位点。在一些方面，消除或去除特定剪接位点的考虑因素包括与参考得分或阈值得分相比的预测得分；以及特定剪接位点是所需的还是有意的(例如，当剪接事件是对于调节转录和/或翻译更有利的或者所需要的)。在一些方面，当确定用于消除或去除的特定供体和/或受体位点时，也可以考虑所得剪接变体失去所需功能或具有受损功能的可能性。在一些方面，所述一个或多个潜在的剪接供体和/或剪接受体位点展现出剪接事件的约或至少约0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1.0(例如，在最大值为1.0的范围内)得分或剪接事件的概率，并且所述位点可以是用于剪接位点消除或去除的候选物。在一些方面，例如由GeneSplicer使用的在所述一个或多个潜在的剪接供体和/或剪接位点处的得分是基于由真Markov模型针对该序列返回的对数几率得分与由假Markov模型计算的得分之间的差。在特定实施方案中，所述剪接供体位点和剪接受体位点被独立地或单独地评价。在一些实施方案中，剪接供体位点和剪接受体位点作为剪接供体/受体对进行评价。
b)剪接位点消除
在一些实施方案中，所提供的方法涉及消除或消除一个或多个剪接供体和/或剪接受体位点，如可能参与不需要的或导致不需要的RNA异质性的隐秘剪接事件的潜在剪接供体和/或受体位点。在一些实施方案中，消除一个或多个剪接位点包括修饰在剪接供体和/或受体位点处、含有剪接供体和/或受体位点的或在其附近的一个或多个核苷酸(例如，通过取代或替代)，所述剪接供体和/或受体位点是用于去除的候选物。在一些方面，在剪接位点处、含有剪接位点或在其附近的密码子内的特定核苷酸被修饰(如，取代或替代)。在一些方面，所述修饰(如取代或替代)保留或保存由所述位点处的特定密码子编码的氨基酸，同时去除潜在的剪接供体和/或受体位点。
在一些实施方案中，用于修饰的剪接位点处或附近的密码子包含一个或多个密码子，所述一个或多个密码子在所述潜在的剪接位点处涉及这两个核苷酸中的之一或两者(在一些情况下称为“剪接位点密码子”)。当预测潜在的剪接发生在密码子中的两个核苷酸之间时，所述密码子是该剪接位点的唯一剪接位点密码子。如果预测潜在的剪接发生在两个相邻密码子之间，例如，发生在第一个密码子的最后一个核苷酸与下一个密码子的第一个核苷酸之间，则这两个密码子是剪接位点密码子。例如，对于被预测为在两个密码子的边界处的剪接位点，这两个相邻密码子可以是用于核苷酸修饰的候选物。在一些实施方案中，所述一个或多个密码子包括一个剪接位点密码子。在一些实施方案中，所述一个或多个密码子包括两个剪接位点密码子。在一些实施方案中，所述方法涉及通过修饰一个或两个剪接位点密码子来消除潜在的剪接供体位点。在一些实施方案中，所述方法涉及通过修饰一个或两个剪接位点密码子来消除潜在的剪接受体供体位点。在一些实施方案中，例如，当不存在剪接位点密码子的同义密码子时，不修饰剪接位点处的一个或两个密码子。在一些实施方案中，如果不存在特定剪接位点密码子的可用同义密码子，则可以修饰附近密码子中的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，被修饰的一个或多个密码子包括剪接位点密码子，其中所述修饰包括将剪接位点处的一个或两个核苷酸改为一个或多个不同的核苷酸。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法涉及通过修饰一个或两个剪接位点密码子来消除剪接供体位点，其中所述修饰不是将剪接位点处的一个或两个核苷酸改为不同的核苷酸，而是修饰附近的核苷酸，例如与剪接位点相邻的密码子的一部分。在一些实施方案中，可以修饰的附近或相邻核苷酸包括修饰作为附近或相邻密码子(如在剪接位点密码子上游或下游的密码子内的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个密码子)的一部分的核苷酸。
在一些情况下，可以采用手动修饰多核苷酸，同时保存编码的氨基酸序列，以降低预测剪接位点的可能性。在一些实施方案中，手动修饰具有至少80％、85％、90％或95％剪接位点概率的预测剪接位点中的一个或多个，以降低剪接事件的概率。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰是通过1、2、3、4、5、6或7个核苷酸的核苷酸替代或取代。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰是在所述剪接供体位点的接合处或在所述剪接受体位点的接合处。在一些实施方案中，所述一种或多种核苷酸修饰中的至少一种是在所述剪接受体和/或剪接供体位点的剪接位点接合的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基内。在一些实施方案中，经修饰的核酸序列的文库可以以降低的隐秘剪接位点概率生成。在一些实施方案中，剪接供体位点和剪接受体位点作为剪接供体/受体对进行评价。在特定实施方案中，所述剪接供体位点和剪接受体位点被独立地或单独地评价，而不是作为剪接供体/受体对的一部分进行评价。在一些实施方案中，不消除一个或多个预测的剪接位点。在一些实施方案中，不消除转录物的启动子区域内的剪接位点，如已知的或预测的剪接位点。
在一些实施方案中，所述方法涉及通过修饰一个或两个剪接位点密码子或一个或多个附近或相邻密码子来消除一个或多个潜在的供体剪接位点(例如，如果同义密码子对于剪接位点密码子不可用)。在一些实施方案中，所述方法涉及通过修饰一个或两个剪接位点密码子或一个或多个附近或相邻密码子来消除一个或多个潜在的受体剪接位点(例如，如果同义密码子对于剪接位点密码子不可用)。在一些实施方案中，待修饰的附近或相邻密码子包括这样的密码子，其在剪接位点密码子上游或下游的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个密码子内，如在一、二或三个来自剪接位点的密码子内的密码子。在一些实施方案中，所述方法可以包括去除或消除用于剪接的潜在分支位点。在一些方面，在分支位点处或附近的密码子内的核苷酸可以被修饰，例如取代或替代，以消除隐秘剪接和/或降低RNA异质性。在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸的修饰可以涉及可能参与剪接的核苷酸之一的取代或替代(如在剪接供体位点、剪接受体位点或剪接分支位点处)，使得由密码子编码的氨基酸被保存，并且核苷酸取代或替代不会改变由多核苷酸编码的多肽序列。在一些情况下，密码子中的第三个位置比其他两个位置更简并。因此，各种同义密码子可以编码特定的氨基酸(参见例如，下文第II.B.2节)。在一些实施方案中，所述修饰包括用引入了多核苷酸的细胞物种(例如，人)中使用的同义密码子替代所述密码子。在一些实施方案中，所述物种是人。在一些实施方案中，所述一个或多个密码子被替代为在所述物种中使用最频繁的相应同义密码子或者具有与所述相应密码子类似的使用频率(例如，最接近的使用频率)的同义密码子(参见例如，第II.B.2节)。
在一些实施方案中，所述方法还涉及在初始的所提议的修饰之后评估用于去除剪接位点的转基因候选物资格。在一些方面，可以再次评价所提议的修饰，以评估所提议的修饰并在修饰和/或密码子优化之后鉴定任何其他的潜在剪接位点。在一些方面，在修饰用于密码子优化和/或剪接位点去除的序列之后，对序列(如修订或修饰的核酸序列)进行一个或多个其他评估，以使用相同的或一种或多种其他或另外的剪接位点预测工具进一步评价剪接位点(如隐秘的剪接位点)去除。在一些方面，所提议的修饰被考虑用于后续步骤，并且可以使用迭代优化。在一些方面，所述方法还包括重复任何鉴定和/或修饰步骤，例如，直到与最初确定的转录物的异质性相比，转录物的异质性降低。在一些实施方案中，可以在迭代评价和评估之后进行进一步或不同的修饰，如在相同密码子处的不同核苷酸替代或在不同位置或密码子处的修饰。在一些实施方案中，可以使用相应的不同的同义密码子，如在特定物种中使用的第二个最频繁的密码子或具有与所述相应密码子类似的使用频率(例如，下一个最接近的使用频率)的密码子(参见例如，下文第II.B.2节)。
在一些方面，可以进一步评价所提议的修饰，例如以评估所述修饰是否在多核苷酸中产生不需要的或另外的限制位点。在一些方面，可能不需要另外的限制位点，并且可以考虑其他或不同的修饰(例如，在相同密码子处的不同的核苷酸替代或在不同的位置或密码子处的修饰)。在一些方面，避免了特定的限制位点，如指定的限制位点。在一些方面，如果所述修饰基本上不降低或剪接位点预测得分，则可以提议另外的或替代性修饰。在一些实施方案中，在所述方法的一个或多个迭代之后，剪接位点预测得分可以降低或减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，计算机系统可以用于执行一个或多个步骤、工具、功能、过程或脚本。在某些实施方案中，本文提供的方法是计算机实现的方法和/或借助计算机来执行。在一些实施方案中，剪接位点预测、评价和用于消除或去除剪接位点的修饰可以通过计算机实现的方法和/或通过包括作为计算机实现的步骤的步骤的方法来执行。在一些实施方案中，所述序列与已知数据库的比较、计算剪接位点预测得分、确定潜在的核苷酸修饰、密码子优化和/或任一个迭代步骤可以通过计算机或使用由计算机实现的步骤、工具、功能、过程或脚本来实现。在特定实施方案中，提供了一种包括处理器和存储器的计算机系统，其中所述存储器含有可操作以使所述处理器执行本文所提供的方法的任何一个或多个步骤的指令。在一些实施方案中，所述方法包括以计算方式执行的步骤、功能、过程或脚本，例如，使用一个或多个计算机程序和/或通过使用计算算法来执行的步骤、功能、过程或脚本。
所提供的用于鉴定和/或去除可能的剪接位点的方法的示例性步骤、功能、过程或脚本包括以下一个或多个步骤：选择序列、编写FASTA格式序列、加载密码子表(例如，从www.kazusa.or.jp/codon)、运行GeneSplicer、加载预测、解析密码子、确定预测中的重叠、鉴定出下一个最高使用率的同义密码子、审查限制位点、创建注释或评估其他密码子。特定步骤可以评估正向和反向链。在一些方面，也可以考虑先前注释的剪接位点修饰，以允许迭代优化。在一些实施方案中，可以重复步骤、功能、过程或脚本中的任何一个或多个。
在某些实施方案中，本文提供的方法可以至少部分地用计算机系统配置来实践，包括单处理器或多处理器计算机系统、小型计算机、大型计算机以及个人计算机、手持式计算设备、基于微处理器的和/或可编程的消费性电子产品等，其中的每一个可以与一个或多个相关联的设备操作性地通信。在特定实施方案中，本文提供的方法可以至少部分地在分布式计算环境中实施，使得某些任务由通过通信网络连接的远程处理设备执行。在分布式计算环境中，程序模块可以位于本地和/或远程存储器存储设备中。在特定实施方案中，本文提供的方法的一些或所有步骤可以在独立的计算机上实践。
在特定实施方案中，本文提供的方法的一些或所有步骤可以在计算机可执行指令的一般情境下操作，如由一个或多个部件执行的程序模块、插件和/或脚本。通常，程序模块包括执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例行程序、程序、对象、数据结构和/或脚本。典型地，所述程序模块的功能可以根据需要组合或分布。在某些实施方案中，可操作以使处理器执行本文所提供的方法的任何一个或多个步骤的指令可以体现在具有计算机可执行指令的计算机可读介质上，并且作为信号例如在网络上传输，所述信号被产生以传输此类指令以及执行所述指令的结果。在一些实施方案中，还提供了用于执行或进行本文所提供的方法的一个或多个步骤的计算机系统、计算机可读指令、软件、系统、网络和/或设备。
2.密码子优化
在一些实施方案中，所述多核苷酸通过优化用于在人中表达的密码子而被修饰。在一些方面，密码子优化可以在用于剪接位点鉴定和/或剪接位点消除的步骤之前和/或之后，和/或在用于降低RNA异质性的迭代步骤中的每个步骤中来考虑。密码子优化通常涉及使所选择的密码子的百分比与人转移RNA的丰度(例如已公开的丰度)平衡，例如使得没有一者过载或受限。在一些情况下，这可能是必要的或者有用的，因为大多数氨基酸由超过一种密码子编码，并且密码子使用通常因生物而异。转染或转导的基因或核酸与宿主细胞之间的密码子使用的差异可能会影响核酸分子的蛋白质表达。以下表3示出了示例性的人密码子使用频率表。在一些实施方案中，为了生成密码子优化的核酸序列，选择密码子以选择与人使用频率平衡的那些密码子。氨基酸密码子的冗余度使得不同的密码子编码一种氨基酸，如表3中所述。在选择用于置换的密码子时，需要所得突变是沉默突变，使得密码子改变不影响氨基酸序列。通常，密码子的最后一个核苷酸(例如，在第三位置)可以保持不变而不会影响氨基酸序列。
例如，密码子TCT、TCC、TCA、TCG、AGT和AGC全部编码丝氨酸(请注意，DNA中的T等同于RNA中的U)。根据人密码子使用频率，如以上表3中所示，这些密码子的相应使用频率分别是15.2、17.7、12.2、4.4、12.1和19.5。由于TCG对应于4.4％，如果该密码子通常用于基因合成，则该密码子的tRNA将是限制性的。在密码子优化中，目标是使每个密码子的使用与在要表达转基因的动物物种中的正常使用频率平衡。
C.优化的抗BCMA CAR
在一些实施方案中，对编码转基因(如BCMA结合受体，例如抗BCMA CAR)的起始或参考序列进行针对密码子优化和/或剪接位点的评估。
在一些实施方案中，所述方法在抗BCMA CAR(如含有对BCMA具有特异性的scFv抗原结合结构域、间隔子(如SEQ ID NO:174中所示的间隔子)、共刺激信号传导区(如来自4-1BB的共刺激信号传导结构域)和CD3ζ信号传导区的CAR)上进行。针对示例性的抗BCMACAR，在以下表3和表4中列出了示例性的已鉴定的剪接供体位点和剪接受体位点及其相应的得分。
在一些实施方案中，所得的一种或多种经修饰的核酸序列然后被合成并用于转导细胞以测试剪接，如通过RNA异质性所指示。示例性方法如下并描述在实施例中。简而言之，从表达细胞收集RNA，将其通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳进行解析，以确定与起始序列相比RNA的异质性。在一些情况下，可以将改善的序列重新提交至基因合成供应商以进行进一步的密码子优化和剪接位点去除，接着进行进一步的隐秘剪接位点评价、修饰、合成和测试，直到琼脂糖凝胶上的RNA展现出最小的RNA异质性。
在一些实施方案中，用于优化编码转基因(如本文提供的抗BCMA CAR或本文提供的构建体)的编码核酸序列的所提供的方法是既减少或消除隐秘剪接位点(参见例如，对于示例性密码子优化和剪接位点消除的间隔子序列，SEQ ID NO:200)又优化人密码子使用(参见例如，对于示例性密码子优化和间隔子序列，SEQ ID NO:236)。示例性优化策略描述于实施例中。
在一些实施方案中，提供了编码嵌合抗原受体的多核苷酸，其包含编码以下的核酸：(a)特异性地识别BCMA的细胞外抗原结合结构域，包括以下描述的任何抗原结合结构域；(b)长度为至少125个氨基酸的间隔子；(c)跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区，其中在细胞中表达所述多核苷酸之后，来自多核苷酸的转录的RNA、任选信使RNA(mRNA)展现出至少70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA同质性。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含分别含有SEQ ID NO:116和119中所示氨基酸序列或者分别与SEQ ID NO:116和119具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH区和VL区。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区是或包含选自SEQ ID NO:116的VH区氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区是或包含选自SEQ ID NO:119的VL区氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含：VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQID NO:94、98和102的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQID NO:104、106和108的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或VH区和VL区，所述VH区是或包含SEQ ID NO:116中所示氨基酸序列，所述VL区是或包含SEQ ID NO:119中所示氨基酸序列。在一些实施方案中，由多核苷酸编码的嵌合抗原受体中的示例性抗原结合结构域包括本文表2的每一行中描述的那些。在任何此类实施方案中，CAR的跨膜结构域是或包含源自CD28的跨膜结构域；细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分，并且共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供了编码嵌合抗原受体的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以下的核酸：(a)特异性识别BCMA的细胞外抗原结合结构域，包括以下描述的任何抗原结合结构域；(b)(b)间隔子，其中所述编码核酸是或包含SEQ ID NO:200中所示序列或由其组成或基本上由其组成或者编码SEQ ID NO:174中所示氨基酸序列；(c)跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含分别含有SEQ ID NO:116和119中所示氨基酸序列或者分别与SEQ ID NO:116和119具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH区和VL区。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区是或包含选自SEQ ID NO:116的VH区氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区是或包含选自SEQ ID NO:119的VL区氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包含：VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或VH区和VL区，所述VH区包含分别含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述VL区包含分别含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或VH区和VL区，所述VH区是或包含SEQ ID NO:116中所示氨基酸序列，所述VL区是或包含SEQ ID NO:119中所示氨基酸序列。在一些实施方案中，由多核苷酸编码的嵌合抗原受体中的示例性抗原结合结构域包括本文表2的每一行中描述的那些。在任何此类实施方案中，CAR的跨膜结构域是或包含源自CD28的跨膜结构域；细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分，并且共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
本文还提供了示例性经修饰的多核苷酸，包括密码子优化(O)和/或剪接位点消除(SSE)修饰的多核苷酸。此类多核苷酸的例子示于表6中，其中提供了在剪接位点消除和密码子优化之前(未opt)的示例性CAR构建体的组分的示例性核苷酸(nt)序列、在剪接位点消除和优化(O/SSE)后的CAR构建体的组分的核酸(nt)序列、以及由核酸序列编码的相应氨基酸(aa)序列。所述组分包括IgG-κ信号传导序列(ss)、抗BCMA scFv、间隔子区域、跨膜(tm)结构域、共信号传导序列(4-1BB co-sig或CD28 co-sig)、CD3-ζ信号传导结构域(CD3-ζ)、t2A核糖体跳跃元件(T2A)和截短的EGF受体(EGFRt)序列。示例性CAR构建体的多核苷酸序列如SEQ ID NO:9-14所示，其编码SEQ ID NO:15-20中所示氨基酸序列。
III.工程化细胞和产生工程化细胞的过程
还提供含有重组受体(例如嵌合抗原受体)的细胞(如工程化细胞)，所述重组受体例如为含有细胞外结构域(包括如本文所述的抗BCMA抗体或片段)的重组受体。还提供此类细胞的群体、含有此类细胞和/或富集了此类细胞的组合物，例如其中表达BCMA结合分子的细胞构成组合物中总细胞或某种类型的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。所述组合物包括用于施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。还提供了用于向受试者(例如患者)施用所述细胞和组合物的治疗方法，以及用于此类方法中的细胞和药物组合物。
因此，还提供表达含有抗体的重组受体的基因工程化细胞，例如含有CAR的细胞。所述细胞通常是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。所述细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整个T细胞群、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现成的技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程化，如本文所述，并且在低温保存之前或之后将它们重新引入同一患者体内。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+ T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中央记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程化引入的一种或多种多核苷酸，并且由此表达此类多核苷酸的重组或基因工程化的产物。在一些实施方案中，所述多核苷酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的多核苷酸，例如，所述多核苷酸通常不在被工程化的细胞和/或这种细胞所来源的生物中被发现。在一些实施方案中，所述多核苷酸不是天然存在的如自然界中未发现的多核苷酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的多核苷酸的嵌合组合的核酸。在一些实施方案中，所述细胞(例如工程化细胞)包含如本文所述的载体(例如病毒载体、表达载体等)，如包含编码本文所述的重组受体的核酸的载体。
在特定例子中，免疫细胞(如人免疫细胞)用于表达所提供的编码嵌合抗原受体的多肽。在一些例子中，所述免疫细胞是T细胞，如CD4+和/或CD8+免疫细胞，包括原代细胞，如原代CD4+和CD8+细胞。
在特定的实施方案中，所述工程化细胞通过如下过程来产生，所述过程从一种或多种输入组合物和/或从单个生物样品产生富集的T细胞的输出组合物。在某些实施方案中，所述输出组合物含有表达重组受体(例如CAR，例如抗BCMA CAR)的细胞。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞适合于作为疗法(例如自体细胞疗法)施用至受试者。在一些实施方案中，所述输出组合物是富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，用于生成或产生工程化细胞的过程是通过如下过程来进行的，所述过程包括以下中的一些或全部步骤：收集或获得生物样品；从生物样品中分离、选择或富集输入细胞；低温保存和储存输入细胞；解冻和/或在刺激条件下孵育输入细胞；将所刺激的细胞进行工程化以表达或含有重组多核苷酸，例如编码重组受体如CAR的多核苷酸；将工程化细胞培育至阈值量、密度或扩增；将培育的细胞配制在输出组合物中；和/或低温保存和储存配制的输出细胞，直到细胞被释放用于输注和/或适合于被施用至受试者。在一些实施方案中，整个过程用富集的T细胞(例如CD4+和CD8+T细胞)的单一组合物进行。在某些实施方案中，所述过程用富集的T细胞的两种或更多种输入组合物进行，所述两种或更多种输入组合物在所述过程之前和/或期间被组合以产生或生产富集的T细胞的单一输出组合物。在一些实施方案中，所述富集的T细胞是或包含工程化T细胞，例如，转导以表达重组受体的T细胞。
在特定实施方案中，表达重组受体(例如抗BCMA CAR)的工程化细胞的输出组合物是由细胞的初始和/或输入组合物产生的。在一些实施方案中，所述输出组合物是富集的T细胞、富集的CD4+ T细胞和/或富集的CD8+ T细胞的组合物(在下文也分别称为富集的T细胞的组合物、富集的CD4+ T细胞的组合物和富集的CD8+ T细胞的组合物)。在一些实施方案中，富含CD4+ T细胞的组合物含有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD4+ T细胞。在特定实施方案中，富集的CD4+ T细胞组合物含有100％的CD4+ T细胞，含有约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述富集的T细胞的组合物包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞群基本上由CD4+ T细胞组成。在一些实施方案中，富含CD8+ T细胞的组合物含有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD8+ T细胞，或含有约100％CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述富集的CD8+ T细胞的组合物包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，并且/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞群基本上由CD8+ T细胞组成。
在特定实施方案中，工程化细胞的输出组合物是由细胞的初始或输入组合物产生的，所述初始或输入组合物是通过组合、混合和/或合并细胞(包括来自含有富集的T细胞、富集的CD4+ T细胞、和/或富集的CD8+ T细胞的组合物)而产生和/或制备的。在一些实施方案中，细胞的输入组合物是组合的、混合的和/或合并的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述输入组合物含有在30％与70％之间、在35％与65％之间、在40％与60％之间、在45％与55％之间、或约50％或50％的CD4+ T细胞以及在30％与70％之间、在35％与65％之间、在40％与60％之间、在45％与55％之间或约50％或50％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述输入组合物含有在45％与55％之间、约50％或50％的CD4+ T细胞和在45％与55％之间、约50％或50％的CD8+T细胞。
在某些实施方案中，用于产生工程化细胞的过程还可以包括以下中的一种或多种：激活和/或刺激细胞，例如输入组合物的细胞；和/或将激活和/或刺激的细胞进行基因工程化，例如以通过转导或转染引入编码重组蛋白的多核苷酸；和/或例如在促进增殖和/或扩增的条件下，培育工程化细胞。在特定实施方案中，所提供的方法可以与收获、收集和/或配制在细胞已经被孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染和/或培育之后产生的输出组合物结合使用。
在一些实施方案中，所述一个或多个过程步骤至少部分是在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，所述无血清培养基是定义的或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，所述无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，所述无血清培养基可含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含细胞因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含细胞因子或重组细胞因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含重组IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含谷氨酰胺和重组IL-2、IL-15和IL-7。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含含有一种或多种蛋白质或其他添加剂的基础培养基。在一些实施方案中，全部或部分所述孵育是在基础培养基中进行的。在一些实施方案中，所述基础培养基含有无机盐、糖、氨基酸和任选地维生素、有机酸和/或缓冲液或其他熟知的细胞培养营养素的混合物。除了营养素外，所述培养基还有助于维持pH和渗透压。在一些方面，所述无血清培养基的组分支持细胞生长、增殖和/或扩增。
多种可商业购得的基础培养基对本领域技术人员而言是熟知的，并且包括达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、罗斯威尔公园纪念学院培养基(Roswell Park MemorialInstitute Medium，RPMI)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和哈氏(Hams)培养基。在一些实施方案中，所述基础培养基是伊斯科夫改良的达尔伯克培养基、RPMI-1640或α-MEM。在一些实施方案中，所述基础培养基是平衡盐溶液(例如，PBS、DPBS、HB SS、EBSS)。在一些实施方案中，所述基础培养基选自达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和M199。在一些实施方案中，所述基础培养基是复合培养基(例如RPMI-1640、IMDM)。在一些实施方案中，所述基础培养基是OpTmizerTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)。
在一些实施方案中，所述基础培养基还可以包含蛋白质或肽。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白质或源自人。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、纤连蛋白、抑肽酶或胎球蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质包含白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述蛋白质是白蛋白或白蛋白取代物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是天然人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自非人来源的重组白蛋白。白蛋白取代物可以是任何蛋白质或多肽来源。此类蛋白质或多肽样品的例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解物(例如，大米水解物)、胎牛白蛋白(胎球蛋白)、卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)或另一种动物来源的白蛋白、鸡提取物、牛胚胎提取物、
I和
II。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括转铁蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括纤连蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括抑肽酶。在一些实施方案中，所述蛋白质包括胎球蛋白。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的蛋白质是被添加至基础培养基中的血清替代物补充剂的一部分。血清替代物补充剂的例子包括例如免疫细胞血清替代物(ThermoFisher，#A2598101)或Smith等人Clin Transl Immunology.2015年1月；4(1):e31中所述的那些。
在某些实施方案中，所述基础培养基补充有另外的添加剂。细胞培养基的添加剂可以包括但不限于营养素、糖(例如，葡萄糖)、氨基酸、维生素或添加剂(如ATP和NADH)。
在一些实施方案中，所述基础培养基还包含谷氨酰胺，如L-谷氨酰胺。在一些方面，谷氨酰胺是游离形式的谷氨酰胺，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述基础培养基中谷氨酰胺(如L-谷氨酰胺)的浓度小于200mM，如小于150mM、100mM或更小，如20mM至120mM或40mM至100mM，如或约80mM。在一些实施方案中，L-谷氨酰胺的浓度为约0.5mM至约5mM(如2mM)。
在一些实施方案中，所述基础培养基还含有合成氨基酸，如L-谷氨酰胺的二肽形式，例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度为约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，所述基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度为约2mM。
在一些实施方案中，进行所提供的方法，使得用于临床用途(例如，用于过继细胞疗法)的细胞的制备中的一个、多个或所有步骤是在使细胞不暴露于非无菌条件的情况下进行。在一些实施方案中，所述细胞被选择、刺激、转导、洗涤和配制，其全部在封闭的无菌系统或设备内。在一些实施方案中，所述一个或多个步骤是在封闭系统或设备之外进行。在一些此类实施方案中，将细胞在无菌条件下从封闭系统或装置转移出去，如通过无菌转移将其转移到单独的封闭系统中。
A.用于工程化的细胞的制备
在一些实施方案中，所述工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入重组受体(例如CAR)的细胞可以从样品(如生物样品，例如获自或源自受试者的样品)中分离。在一些实施方案中，分离出所述细胞的受试者是患有所述疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如所分离、处理和/或工程化的细胞所用于的过继细胞疗法)的人。
因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。所述样品包括直接取自所述受试者的组织、流体和其他样品，以及从一个或多个处理步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)得到的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。所述生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的处理样品。
在一些方面，所述细胞所来源的或分离出细胞的样品是血液或血液源样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的情境下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，所述细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，所述细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。
在一些实施方案中，所述细胞的分离包括一个或多个制备和/或并非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞洗涤、离心和/或在存在一种或多种试剂的情况下进行孵育，例如以去除不需要的组分，富集所需组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从所述受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺少钙和/或镁和/或多种或全部二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些方面，对于产生分离的或分泌的多肽，除原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被修饰为模拟或接近人细胞中的那些糖基化途径从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
可用于表达多肽(包括分离的或分泌的多肽)的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44。Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；PER.
细胞；以及NSO细胞。在一些实施方案中，可以在酵母中表达抗体重链和/或轻链(例如，VH区和/或VL区)。参见例如，美国公开号US 2006/0270045 A1。在一些实施方案中，基于其对重链和/或轻链(例如，VH区和/或VL区)进行所需的翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽比在293细胞中产生的相同多肽具有更高的唾液酸化水平。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、选择和/或富集、和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后，和/或在培育和/或收获工程化细胞之后，冷冻(例如低温保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。在一些实施方案中，将细胞在具有以下终浓度的介质和/或溶液中冷冻(例如，低温保护或低温保存)：为或约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％DMSO，或者在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将细胞在具有以下终浓度的介质和/或溶液中冷冻(例如，低温保护或低温保存)：为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％HSA，或者在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA。一个例子包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以等于或约1摄氏度/分钟的速率冷冻至等于或约-80摄氏度并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，所述细胞或群体的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞洗涤、离心和/或在存在一种或多种试剂的情况下进行孵育，例如以去除不需要的组分，富集所需组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，至少一部分选择步骤包括将细胞与选择试剂一起孵育。与一种或多种选择试剂一起孵育，例如作为选择方法的一部分可以使用一种或多种选择试剂来进行，以用于基于一种或多种特定分子(如表面标记物(例如表面蛋白)、细胞内标记物或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的利用一种或多种选择试剂基于此类标记物进行分离的方法。在一些实施方案中，所述一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记物(通常是细胞表面标记物)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记物的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法使得在分离的细胞与特异性结合至细胞上的标记物的分子(例如，固体表面(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间产生有利的能量相互作用。在一些实施方案中，方法是使用颗粒如珠(例如磁珠)进行，所述颗粒包被有对细胞的标记物具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中所述选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，使用在国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统、设备或装置进行分离或分开。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体涂覆的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其定时，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数量。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，所述选择步骤的至少一部分是在离心室中进行的，其包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合，所述量远少于根据制造商的说明书在管或容器中进行类似选择以用于选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常采用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量是根据制造商的说明书用于在基于管或容器的孵育中针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有选择缓冲液，所述选择缓冲液含有选择试剂，所述选择试剂例如特异性结合至希望富集和/或耗尽的细胞上而不是组合物中其他细胞上的表面标记物的分子，例如抗体，所述分子任选地偶联到支架，例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL，诸如至少或约至少10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，所述选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与所述选择试剂一起孵育的总持续时间为或为约5分钟至6小时，例如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，所述孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这种过程是在与所述室为整体的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如预先洗涤步骤洗涤含有细胞的样品，例如单采术样品)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和推出所述室并进行离心，以便使用自动化程序在单个封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，使所孵育的细胞经受分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中将细胞与所述选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与所述选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移到系统中用于基于免疫亲和力来分离细胞。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
在一些实施方案中，所述分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记物(例如，表面蛋白)、细胞内标记物或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记物的分离方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于一种或多种标记物(通常是细胞表面标记物)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与和此类标记物特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞分离。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至所述抗体或结合配偶体的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除了所需群体以外的细胞表达的标记物来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
在一些实施方案中，所述处理步骤还包括对所孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择，如使用可以进行基于亲和力的选择的系统或设备。在一些实施方案中，通过以下方式进行分离：通过阳性选择富集特定细胞群，或通过阴性选择耗尽特定细胞群。在一些实施方案中，阳性或阴性选择通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记物+)或以相对较高水平表达(标记物高)的一种或多种表面标记物特异性结合。
分离无需导致特定细胞群或表达特定标记物的细胞的100％富集或去除。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记物的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致全部此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如之后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记物的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记物具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的各种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择各种细胞类型。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。
例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，
M-450CD3/CD28 T细胞扩增器、MACSiBeadsTM等)阳性选择CD3+、CD28+ T细胞。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记物(如CD14)的阴性选择，从PBMC样品分离T细胞。在一些方面，CD4+和/或CD8+选择步骤用于从组合物(如从PBMC组合物，如经由白细胞单采术获得的组合物)分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。在一些方面，通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记物的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。在一些实施方案中，CD4+和CD8+细胞以所需的比率混合。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中央记忆、效应记忆和/或中央记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中央记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72–82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+ T细胞与CD4+ T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，对中央记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富集TCM细胞的CD8+群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一方面，中央记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，对所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依序进行的。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在一些实施方案中，中央记忆CD8+细胞呈CD27+、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD45RA-和/或CD45RO+。在一些实施方案中，中央记忆CD8+细胞呈CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，中央记忆CD8+细胞呈CCR7+和CD45RO+。在一些实施方案中，中央记忆CD8+细胞呈CCR7+和CD45RA-。在一些实施方案中，中央记忆CD8+细胞呈CD62L+和CCR7+。在一些实施方案中，中央记忆CD8+细胞呈CD62L+/CD45RA-、CCR7+/CD45RA-、CD62L+/CCR7+、或CD62L+/CCR7+/CD45RA-，并且具有中等至高表达的CD44。在一些实施方案中，中央记忆CD8+细胞呈CD27+/CD28+/CD62L+/CD45RA-、CD27+/CD28+/CCR7+/CD45RA-、CD27+/CD28+/CD62L+/CCR7+、或CD27+/CD28+/CD62L+/CCR7+/CD45RA-。
在特定实施方案中，使生物样品(例如PBMC或其他白细胞的样品)经受CD4+ T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD8+ T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经受CD8+ T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD4+ T细胞选自阴性级分。
在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后使阴性级分经历基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择和基于中央记忆T细胞所特有的标记物(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中阳性和阴性选择是以任何顺序进行的。
在一些实施方案中，通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+ T辅助细胞分类为幼稚、中央记忆和效应细胞。可以通过标准方法获得CD4+淋巴细胞。在一些实施方案中，幼稚CD4+ T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T细胞。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞呈CD27+、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD45RA-和/或CD45RO+。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞是CCR7+和CD45RO+。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞呈CCR7+和CD45RA-。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞是CD62L+和CCR7+。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞呈CD62L+/CD45RA-、CCR7+/CD45RA-、CD62L+/CCR7+、或CD62L+/CCR7+/CD45RA-，并且具有中等至高表达的CD44。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞呈CD27+/CD28+/CD62L+/CD45RA-、CD27+/CD28+/CCR7+/CD45RA-、CD27+/CD28+/CD62L+/CCR7+、或CD27+/CD28+/CD62L+/CCR7+/CD45RA-。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体结合至固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:Cell Behavior In vitro and In vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
在一些方面，将要分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如，如
或
珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的存在于一种或多种细胞或细胞群上的分子(例如，表面标记物)特异性结合。
在一些实施方案中，所述磁粒或磁珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。存在多种熟知的用于磁分离方法的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(例如在Owen美国专利号4,795,698和Liberti等人,美国专利号5,200,084中所述的那些)是其他的例子。
通常在如下条件下进行孵育，借此附着至磁粒或磁珠的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与样品内细胞上的细胞表面分子(如果存在)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且附着有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或使其经受进一步的分离步骤。
在某些实施方案中，所述磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁粒经由对一种或多种标记物具有特异性的一抗的包被而附着至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，所述磁响应颗粒保持附着至细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附着至用于施用至患者的细胞。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，所述可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选
(Miltenyi Biotec，加利福尼亚州奥本)来进行的。磁激活细胞分选
系统能够高纯度选择附接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，
以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成这个第一洗脱步骤后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群中耗尽。
在某些实施方案中，使用进行所述方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个的系统、设备或装置进行分离或分开。在一些方面，使用所述系统在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以使错误、用户操作和/或污染降至最低。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003或US20110003380 A1中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结局和/或调整。
在一些方面，使用
系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤，例如用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上的细胞的自动化分离。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的全部部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并且与夹紧阀一起确保经过所述系统的缓冲液的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，
系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌、无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁粒标记细胞之后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由预装配的无菌管路(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，系统将细胞样品自动施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群未被标记并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述方法一起使用的细胞群在去除磁场之后从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS
系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS
系统配备有细胞处理单元，其允许自动化洗涤和通过离心来分级分离细胞。CliniM ACS
系统还可以包括机载相机和图像识别软件，所述图像识别软件通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，可以将外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS
系统还可以包括集成的细胞培育室，其实现细胞培养方案，如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660，Terakura等人(2012)Blood.1:72–82，和Wang等人(2012)J Immuno ther.35(9):689-701。
在一些实施方案中，经由流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中流体流中携载针对多种细胞表面标记物染色的细胞。在一些实施方案中，经由制备规模(FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)JBiophoton.1(5):355–376。在两种情况下，可以用多种标记物来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测的标记物来标记抗体或结合配偶体，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以是基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记物具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记物同时进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，所述分离和/或选择产生富集的T细胞，例如CD3+ T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+ T细胞的一种或多种输入组合物。在一些实施方案中，从单一生物样品中分离、选择、富集或获得两种或更多种单独的输入组合物。在一些实施方案中，从单独的生物样品中分离、选择、富集和/或获得单独的输入组合物，所述单独的生物样品从同一受试者收集、获取和/或获得。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括富集的T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD3+ T细胞。在特定实施方案中，所述富集的T细胞的输入组合物基本上由CD3+ T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括富集的CD4+ T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述CD4+ T细胞的输入组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述富集的T细胞的组合物基本上由CD4+ T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种组合物是或包括CD8+ T细胞的组合物，所述组合物是或包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述CD8+ T细胞的组合物含有少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，富集的T细胞的组合物本质上由CD8+ T细胞组成。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，低温保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个例子包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后将细胞以1摄氏度/分钟的速率冷冻至-80摄氏度并储存在液氮储罐的气相中。
B.激活和刺激
在一些实施方案中，在基因工程化之前或结合基因工程化孵育和/或培养所述细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
在一些实施方案中，所提供的方法包括培育、孵育、培养和/或基因工程步骤。例如，在一些实施方案中，提供了用于孵育耗尽的细胞群和培养起始组合物和/或将它们工程化的方法。因此，在一些实施方案中，在培养起始组合物中孵育细胞群。
孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其他容器。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和设计用于激活细胞的任何其他药剂))。
在一些实施方案中，所述刺激条件或刺激剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括抗体，如对TCR具有特异性的那些，例如抗CD3。在一些实施方案中，所述刺激条件包括能够刺激共刺激受体的一种或多种药剂(例如配体)，例如抗CD28。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以与固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，根据多种技术进行孵育，例如以下文献中所述的那些：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177、Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651–660，Terakura等人(2012)Blood.1:72–82，和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞，如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；并且孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，所述非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。任选地，所述孵育可以还包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞。例如，可以通过从被感染的受试者分离T细胞并在体外用相同抗原刺激所述细胞，针对巨细胞病毒抗原来产生抗原特异性T细胞系或克隆。
在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激剂存在下进行的孵育的至少一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO 2016/073602中所述的。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述刺激条件或刺激剂远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的刺激条件或刺激剂。
在一些实施方案中，将刺激剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL(如至少或约至少或为约或为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL)试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，在添加至所述细胞之前预先混合所述孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将所述孵育缓冲液和刺激剂单独添加至所述细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许在实现细胞的刺激和激活的同时使用较少的总体刺激剂。
在一些实施方案中，所述孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，例如至少或约至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，另外的孵育进行在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间的时间，包含端值。
在特定实施方案中，所述刺激条件包括用一种或多种细胞因子和/或在一种或多种细胞因子存在下孵育、培养和/或培育富集的T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一些实施方案中，所述刺激导致例如在转导之前细胞的激活和/或增殖。
C.用于基因工程化的载体和方法
还提供用于表达结合分子(例如抗BCMA结合分子)(包括包含结合分子的重组受体(例如CAR))以及用于产生表达此类结合分子的基因工程化细胞的方法、多核苷酸、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，可以将包括重组受体(例如CAR)的一种或多种结合分子基因工程化至细胞或多种细胞中。基因工程化通常涉及将编码重组或工程化组分的核酸引入细胞中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化。
还提供了编码所述嵌合抗原受体和/或其部分(例如，链)的多核苷酸。所提供的多核苷酸白金编码本文所述的抗BCMA嵌合抗原受体(例如，抗原结合片段)的那些。还提供编码一种或多种抗体和/或其部分的多核苷酸，例如编码本文所述的抗BCMA抗体(例如抗原结合片段)和/或其他抗体和/或其部分(例如，结合其他靶抗原的抗体和/或其部分)中的一种或多种的那些核酸。所述多核苷酸可以包括包含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的那些，例如包括具有骨架修饰的那些。术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用，并且是指核苷酸的聚合物。核苷酸的此类聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指构成核酸分子或多核苷酸的核苷酸的线性序列。
还提供了已针对密码子使用和/或消除剪接位点(如隐秘剪接位点)进行优化的多核苷酸。还提供了优化和产生嵌合抗原受体(如本文所述的任何嵌合抗原受体)的编码序列的方法。此类方法描述在本文的第II节中。
还提供了含有所述多核苷酸(例如本文所述的任何多核苷酸)的载体和含有所述载体的宿主细胞，例如用于产生抗体或其抗原结合片段的宿主细胞或者表达含有此类抗体或片段的重组受体(例如CAR)的细胞。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。还提供了用于产生抗体或其抗原结合片段或表达含有此类抗体或片段的重组受体(例如CAR)的细胞的方法。
在一些实施方案中，核酸可以编码包含抗体的VL区的氨基酸序列和/或包含抗体的VH区的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。核酸可以编码包含抗体的VL区的一个或多个氨基酸序列和/或包含抗体的VH区的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在其他实施方案中，提供包含此类多核苷酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在其他实施方案中，提供了包含此类多核苷酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含载体(例如，已经用载体转化)，所述载体包含编码含有抗体的VH区的氨基酸序列的核酸。在另一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下各项转化)：(1)含有编码包含抗体的VL区的氨基酸序列和包含抗体的VH区的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)含有编码包含抗体的VL区的氨基酸序列的核酸的第一载体和含有编码包含抗体的VH区的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下项转化)一种或多种载体，所述一种或多种载体包含编码一种或多种氨基酸序列的一种或多种核酸，所述一种或多种氨基酸序列包含一种或多种抗体和/或其部分(例如其抗原结合片段)。在一些实施方案中，提供一种或多种此类宿主细胞。在一些实施方案中，提供含有一种或多种此类宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种宿主细胞可以表达不同的抗体或相同的抗体。在一些实施方案中，每种宿主细胞可以表达多于一种抗体。
还提供了制备抗BCMA嵌合抗原受体的方法。对于嵌合受体的重组产生，可以分离编码嵌合受体抗体(例如，如本文所述)的核酸序列，并将其插入至一种或多种载体中，以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)可以容易地分离和测序此类核酸序列。在一些实施方案中，提供了制备抗BCMA嵌合抗原受体的方法，其中所述方法包括在适用于表达所述受体的条件下培养包含编码如以上所提供的抗体的核酸序列的宿主细胞。
在一些情况下，含有编码所述BCMA结合受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，所述信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，所述信号序列可以编码异源或非天然的信号肽。在一些方面，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:166中所示或者由SEQ ID NO:167或168-171中所示核苷酸序列编码的IgGκ链的信号肽；SEQ ID NO:154中所示且由SEQ ID NO:155中所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链；SEQ ID NO:146中所示的CD8α信号肽；或SEQ ID NO:142中所示的CD33信号肽。
在一些实施方案中，所述载体或构建体可以含有启动子和/或增强子或调节编码的重组受体的表达的调节元件。在一些例子中，所述启动子和/或增强子或调节元件可以是条件依赖性启动子、增强子和/或调节元件。在一些例子中，这些元件驱动转基因的表达。在一些例子中，所述CAR转基因可以与启动子(如具有HTLV1增强子的EF1α启动子(SEQ ID NO:151))操作性地连接。在一些例子中，所述CAR转基因与位于转基因下游的土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE；SEQ ID NO:253)操作性地连接。
在一些实施方案中，所述载体或构建体可以含有驱动一种或多种核酸分子的表达的单个启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子(例如转录物)可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如美国专利号6,060,273)。例如，在一些实施方案中，可以将转录单元工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的信息共表达基因产物(例如其编码第一和第二嵌合受体)。可替代地，在一些情况下，单个启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码第一和第二结合分子，例如抗体重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A切割序列)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶(furin))的序列彼此分开。因此，该ORF编码单个多肽，其在翻译期间(在T2A的情况下)或翻译后被切割成单个蛋白质。在一些情况下，所述肽(如T2A)可导致核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和多核苷酸中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:152或153)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:148或149)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:241、242或243)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ IDNO:201或202)，如美国专利公开号20070116690中所述。在一些实施方案中，所述一种或多种不同或单独的启动子驱动编码所述一种或多种结合分子(例如重组受体)的一种或多种核酸分子的表达。
本文提供的任何结合分子(例如抗体和/或重组受体，例如BCMA结合分子和/或另外的重组受体)可以由含有编码受体的一种或多种核酸分子的多核苷酸以任何组合或排列进行编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的受体或结构域。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码一种或多种结合分子(例如抗体和/或重组受体)的核酸分子，并且单独的载体或构建体含有编码另外的结合分子(例如抗体和/或重组受体)的核酸分子。核酸分子中的每一种还可以编码一种或多种标记物，如表面标记物，例如截短的EGFR(tEGFR)。
还提供含有一种或多种核酸分子、载体或构建体(如上文所述的任何核酸分子、载体或构建体)的组合物。在一些实施方案中，核酸分子、载体、构建体或组合物可以用于将细胞(如T细胞)工程化以表达任何结合分子，例如抗体或重组受体和/或另外的结合分子。
在一些实施方案中，可以对包括抗体和/或重组受体(例如CAR)的一种或多种结合分子进行基因工程化，以在细胞或多种细胞中表达。在一些实施方案中，第一重组受体和第二结合分子(例如重组受体)由同一或单独的核酸分子编码。在一些实施方案中，将另外的结合分子工程化为在细胞或多种细胞中表达。
1.基因转移
在一些实施方案中，用于产生工程化细胞的方法包括将编码重组受体(例如，抗BCMA CAR)的多核苷酸引入细胞(例如像刺激的或激活的细胞)中。在特定实施方案中，所述重组蛋白是重组受体，如在第I节中描述的任何重组受体。在细胞中引入编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子可以使用许多已知载体中的任何一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，所述工程化产生富集的T细胞的一种或多种工程化组合物。
在某些实施方案中，所述经刺激T细胞的一种或多种组合物是或包括富集的T细胞的两种单独的经刺激组合物。在特定实施方案中，将富集的T细胞的两种单独组合物，例如，已从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集的T细胞的两种单独组合物分别工程化。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括富集的CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括富集的CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将富集的CD4+ T细胞和富集的CD8+ T细胞的两种单独组合物分别基因工程化。在一些实施方案中，将富集的T细胞的单一组合物基因工程化。在某些实施方案中，所述单一组合物是富集的CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在工程化之前已从单独组合物组合的富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，将富集的CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物组合为单一组合物并且进行基因工程化，例如转导或转染。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成基因工程化之后将富集的CD4+和富集的CD8+ T细胞的单独工程化组合物组合为单一组合物。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记物的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。在某些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先将细胞在刺激条件下孵育，如通过第III-B节中所述的方法中的任一种。
在一些情况下，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对受试者有毒性。因此，在一些情境下，所述工程化细胞包括导致细胞在体内(如在过继免疫疗法中施用后)对阴性选择易感的基因区段。例如，在一些方面，将所述细胞工程化，使得它们可以由于施用它们的患者的体内条件的变化而被消除。阴性选择性表型可以由赋予对所施用的药剂(例如，化合物)的敏感性的基因的插入而产生。阴性选择性基因包括单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell 2:223,1977)，其赋予更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因；细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些方面，进一步工程化所述细胞以促进细胞因子或其他因子的表达。用于引入基因工程化组分(例如，抗原受体，例如CAR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码受体的多核苷酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组多核苷酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组多核苷酸转移到T细胞中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nu clAcids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550–557)。
在一些实施方案中，用于基因工程化的方法通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。所述方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的任何方法。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
和
2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioS afe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如，离心接种)来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，例如速度低于用于沉淀细胞的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，所述旋转是以为或为约100g至3200g(例如，为或为约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
在一些实施方案中，所述引入是通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如，离心接种)来实现。所述方法包括如国际公开号WO2016/073602中所述的任何方法。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
和
2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中描述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性设备描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，所述容器(如袋子)包括一个或多个容器(例如袋子)，其在同一容器或单独容器(例如同一袋子或单独袋子)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统还包括一个或多个容器(如袋)，所述容器含有介质，例如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，所述离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他处理步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，可以使含有细胞、载体(例如病毒颗粒)和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从或从约600rpm至1700rpm(例如为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以为或为约100g至3200g(例如，为或为约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
在一些实施方案中，在基因工程的至少一部分(例如转导)期间，和/或在基因工程之后，将细胞转移到生物反应器袋组件中，用于培养经基因工程化的细胞，例如用于培育或扩增细胞。
2.病毒载体
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(如例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550–557)。
在一些实施方案中，病毒载体或非病毒DNA含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，所述异源重组分子是或包括重组受体(例如抗原受体)、SB转座子(例如用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如用于基因组重组)或报告基因(例如荧光蛋白，如GFP)或萤光素酶。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Bori s-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的异源核酸含于和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，所述病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998，美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，所述病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。所述载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可用于产生自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将此缺失转移到原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有自3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被拷贝到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在经转导细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录之后产生的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。还可以包括增强子序列。可以使用增加病毒RNA基因组在包装细胞系中的表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合的载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身以通过例如使一个或两个附接位点突变或缺失来防止整合，或者通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传途径；这些途径包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些途径并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述途径。例如，整合酶和附接位点两者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人JVirol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，所述载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，所述病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(如细菌细胞)中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体还可以含有这样的基因，其表达赋予可检测或可选择标记物，如抗药性。
所述病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因递送系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分之一或两者时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，所述包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人,1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef和/或Tat(HIV的主要反式激活因子))。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了所述一种或多种目标序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并且在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用含有产生颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目标序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多个载体分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能产生有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单一质粒载体。
在一些实施方案中，将所述逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性、多嗜性或双嗜性包膜，如辛德比斯病毒包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，所述包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装到慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，所述包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，所述包装细胞系稳定地表达所述一种或多种病毒蛋白。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将所述病毒载体和所述包装质粒和/或辅助质粒经由转染或感染引入所述包装细胞系中。所述包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，所述包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，所述包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有可以回收并滴定的重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，如CAR)的表达。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物与病毒颗粒接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些实施方案中，待转染或转导的细胞是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/或选择的细胞。
在一些实施方案中，所述组合物中待转导的细胞的浓度为从或从约1.0x105个细胞/mL至1.0x108个细胞/mL，例如至少或约至少或约1.0x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL。
在一些实施方案中，所述病毒颗粒是以病毒载体颗粒拷贝或其感染单位(IU)与待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)来提供。例如，在一些实施方案中，所述病毒颗粒在接触期间是以为或约或至少或至少约每个细胞0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体颗粒存在。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度在或在约1x106IU/mL与1x108IU/mL之间，如在或在约5x10 6IU/mL与5x107IU/mL之间，如至少6x106IU/mL、7x106IU/mL、8x106IU/mL、9x106IU/mL、1x107IU/mL、2x107IU/mL、3x107IU/mL、4x107IU/mL或5x107IU/mL。
在一些实施方案中，可以按小于100(如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小)的感染复数(MOI)来实现转导。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒颗粒接触或孵育。在一些实施方案中，所述接触进行30分钟至72小时，例如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，例如至少或约至少30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，所述接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒颗粒以从或从约0.5mL至500mL的体积接触，所述体积例如为或为约0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
在某些实施方案中，用包含结合分子的粒子对输入细胞进行处理、孵育或接触，所述结合分子结合至或识别由病毒DNA编码的重组受体。
在一些实施方案中，细胞与病毒载体颗粒的孵育导致或产生包含用病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组多核苷酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组多核苷酸转移至T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec TherNucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的多核苷酸的其他途径和载体是例如国际专利申请公开号WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
另外的多核苷酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善治疗功效的那些，例如通过促进转移细胞的活力和/或功能；提供用于选择和/或评价细胞的遗传标记物的基因，例如以评估体内存活或定位；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human GeneTherapy 3:319-338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，其描述了使用源自将显性阳性选择性标记物与阴性选择性标记物融合的双功能选择性融合基因。参见例如Riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17栏。
3.用于多靶向的工程化细胞、载体和组合物
还提供可以结合和/或靶向多种抗原的细胞，如工程化细胞。在一些实施方案中，通过靶向多种抗原的策略实现改善的选择性和特异性。此类策略通常涉及多个抗原结合结构域，其通常存在于不同的基因工程化抗原受体上并特异性地结合不同的抗原。在一些实施方案中，将细胞工程化为具有结合多于一种抗原的能力。例如，在一些实施方案中，将细胞工程化以表达多特异性结合分子。在一些实施方案中，所述细胞表达多种结合分子(例如重组受体)，其每一种都可以靶向一种抗原或多种抗原，例如一种受体(如本文所述的任何一种)靶向BCMA且另一种受体靶向另一种抗原(例如肿瘤抗原)。在一些方面，将与不同抗原特异地结合的多种基因工程化抗原受体引入细胞中，所述不同抗原中的每一种在将被细胞或组织或其细胞靶向的疾病或病症之中或之上表达。在一些方面，此类特征可以解决脱靶效应或减少脱靶效应的可能性或增加功效。例如，在疾病或病症中表达的单个抗原也在非患病或正常细胞之上或之中表达的情况下，此类多靶向途径可以通过要求经由多种抗原受体结合来激活细胞或诱导特定效应子功能，从而提供对所需细胞类型的选择性。在一些实施方案中，可以将多种细胞工程化以表达一种或多种不同的结合分子(例如重组受体)，其每一种都可以靶向一种抗原或多种抗原。
还提供含有本文所述的任何结合分子的多特异性细胞，例如含有细胞表面蛋白(包括抗BCMA抗体)和与不同抗原或BCMA上的不同表位结合的另外的细胞表面蛋白(如另外的嵌合受体)的细胞。在一些实施方案中，提供表达重组受体的细胞的组合物，其中结合分子、多特异性结合分子和/或重组受体中的一种或多种结合和/或靶向BCMA。在一些实施方案中，所述多特异性结合分子和/或重组受体靶向BCMA上的一个或多个不同的表位。
在一些实施方案中，提供了细胞的组合物，其中每种类型的细胞表达一种或多种结合分子，例如重组受体。在一些实施方案中，所述细胞包含(例如，已经用以下项转化)一种或多种载体，所述一种或多种载体包含编码一种或多种氨基酸序列的一种或多种核酸，所述一种或多种氨基酸序列包含一种或多种抗体和/或其部分(例如其抗原结合片段)。在一些实施方案中，提供一种或多种此类细胞。在一些实施方案中，提供含有一种或多种此类细胞的组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞可以表达不同的抗体或相同的抗体。在一些实施方案中，每种细胞表达一种或多种抗体，如多于一种抗体。在一些实施方案中，每种细胞表达多特异性结合分子，例如多特异性受体，例如CAR。
在一些实施方案中，所述细胞包括靶向BCMA和与特定疾病或病症相关的第二或另外的抗原的多靶向策略。在一些实施方案中，所述第二或另外的抗原被多特异性结合分子和/或多种结合分子和/或多种细胞(例如，一种或多种细胞)靶向，每种细胞被工程化以表达一种或多种重组受体。在一些实施方案中，靶向第二或另外的抗原的重组受体在与BCMA结合分子相同的细胞上或在不同的细胞上表达。
在一些实施方案中，用于多靶向策略的第二或另外的抗原包括其中至少一种抗原是通用肿瘤抗原或其家族成员的那些抗原。在一些实施方案中，所述第二或另外的抗原是在肿瘤上表达的抗原。在一些实施方案中，本文提供的BCMA结合分子靶向与所述第二或另外的抗原相同的肿瘤类型上的抗原。在一些实施方案中，所述第二或另外的抗原可以是通用肿瘤抗原或可以是为肿瘤类型所特有的肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述细胞还包含识别在待治疗的疾病或病症上表达的第二或另外的抗原并诱导刺激或激活信号的另外的基因工程化抗原受体。
示例性的抗原包括CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CD138、B7、MUC-1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、血管生成因子、VEGF、PIGF、ED-B纤连蛋白、致癌基因、致癌基因产物、CD66a-d、坏死抗原、Ii、IL-2、T101、TAC、IL-6、ROR1、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、B细胞成熟抗原(BCMA)、tEGFR、Her2、L1-CAM、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD24、CD30、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、erbB二聚体、EGFR vIII、FBP、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、生存素、EGP2、EGP40、TAG72、B7-H6、IL-13受体a2(IL-13Ra2)、CA9、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、双抗原、与通用标签相关的抗原、癌症-睾丸抗原、MUC1、MUC16、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、肾母细胞瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、hTERT、MDM2、CYP1B、WT1、活素、AFP、p53、细胞周期蛋白(D1)、CS-1、BCMA、BAFF-R、TACI、CD56、TIM-3、CD123、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、MAGE A3、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))和/或病原体特异性抗原、生物素化分子、由HIV、HCV、HBV和/或其他病原体表达的分子；和/或在一些方面，其新表位或新抗原。在一些实施方案中，所述抗原与通用标签相关或者是通用标签。
在一些实施方案中，所述多种抗原(例如，第一抗原(例如BCMA)和第二或另外的抗原)在所靶向的细胞、组织或者疾病或病症上(例如在癌细胞上)表达。在一些方面，所述细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。所述多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞疗法靶向的细胞(如正常或未患病细胞或组织)和/或工程化细胞本身上表达。在此类实施方案中，因为需要连接多种受体以实现细胞的反应，实现特异性和/或功效。
在一些方面，所述抗原(例如第二或另外的抗原，如疾病特异性抗原和/或相关抗原，如G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(多配体聚糖-1、多配体聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5)在多发性骨髓瘤上表达。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，所述抗原包括存在于淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的那些抗原，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下文献中所述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US20120189622或US 20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006099875、WO 2009080829或WO2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方案中，所述细胞和方法包括多靶向策略，如例在细胞上表达两种或更多种基因工程化受体，每种受体识别不同的抗原并且通常各自包括不同的细胞内信号传导组分。此类多靶向策略描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO 2014055668 A1(描述刺激或激活和共刺激CAR的组合，例如，靶向单独存在于脱靶(例如正常细胞)上，但仅一起存在于待治疗疾病或病症的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)(描述表达刺激或激活和抑制性CAR的细胞，例如这样的细胞，其中刺激或激活CAR与同时在正常或非患病细胞和待治疗疾病或病症的细胞上表达的一种抗原结合，并且抑制性CAR与仅在正常细胞或不希望治疗的细胞上表达的另一种抗原结合)。
在一些实施方案中，提供多种细胞，每种细胞被工程化以表达一种或多种重组受体。例如，在一些实施方案中，将一种细胞工程化为表达结合和/或靶向BCMA的结合分子，并且将另一种细胞工程化为表达结合和/或靶向另外或第二抗原的结合分子。在一些实施方案中，所述细胞可以各自表达多特异性结合分子，例如多特异性重组受体，其中靶抗原中的一种或多种是BCMA。在一些此类实施方案中，所述多种细胞可以一起或单独施用。在一些实施方案中，所述多种细胞与所述细胞同时或并行地施用，例如与所述多种细胞中的另一种工程化细胞在同一天和/或以任何顺序依序或间歇地施用。例如，在一些实施方案中，将表达BCMA结合分子(例如CAR)的工程化细胞与表达结合不同靶抗原或BCMA上的不同表位的结合分子的另一种工程化细胞同时或以任何顺序依序施用。在一些实施方案中，所述多种细胞可以在同一组合物中。细胞的示例性组合物包括以下第II节中所描述的组合物。
D.工程化细胞的培育、扩增和配制
在一些实施方案中，所提供的方法包括用于培育细胞(例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后，在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。
在某些实施方案中，所述工程化T细胞的一种或多种组合物是或包括富集的T细胞的两种单独组合物。在特定实施方案中，将富集的T细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集的T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下培育。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括富集的CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括富集的CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将富集的CD4+ T细胞和富集的CD8+ T细胞的两种单独组合物分别例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育。
在一些实施方案中，培育富集的T细胞的单一组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在培育之前已从单独组合物组合的富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将富集的CD4+和经CD8+T细胞的单独组合物组合为单一组合物并且例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成培育之后将富集的CD4+和富集的CD8+ T细胞的单独经培育组合物组合为单一组合物。
在一些实施方案中，培育是在促进增殖和/或扩增的条件下进行的。在一些实施方案中，此类条件可以被设计成诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活。在特定实施方案中，所述刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计成促进细胞的生长、分裂和/或扩增的药剂))。
在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下培育所述细胞。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子(例如重组细胞因子)是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子包括IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，在存在如下浓度的细胞因子(例如，重组人细胞因子)的情况下培育所述细胞(例如，工程化细胞)：在1IU/mL与2,000IU/mL之间、在10IU/mL与100IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在100IU/mL与1,000IU/mL之间、在500IU/mL与2,000IU/mL之间或在100IU/mL与1,500IU/mL之间。
在一些实施方案中，所述培育是在如下条件下进行，所述条件通常包括适合于原代免疫细胞(如人T淋巴细胞)生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或为约37摄氏度。在一些实施方案中，在25至38摄氏度(如30至37摄氏度，例如为或约37摄氏度±2摄氏度)的温度下孵育富集的T细胞的组合物。在一些实施方案中，将所述孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，所述孵育是大于或大于约或持续约或24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。
在特定实施方案中，在封闭系统中进行培育。在某些实施方案中，在无菌条件下在封闭系统中进行所述培育。在特定实施方案中，在与所提供系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行培育。在一些实施方案中，将富集的T细胞的组合物从封闭系统中去除并且置于用于培育的生物反应器中和/或与其连接。合适的用于培育的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20|50、Finesse SmartRocker生物反应器系统和Pall XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，所述生物反应器用于在培育步骤的至少一部分期间灌注和/或混合细胞。
在一些实施方案中，混合是或包括摇摆和/或运动。在一些情况下，所述生物反应器可以经受运动或摇摆，其在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调整摇摆速度和摇摆角度以实现所需的搅动。在一些实施方案中，所述摇摆角度为20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，所述摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，所述摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，所述摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间，包含端值。
在一些实施方案中，使生物反应器保持等于或接近37℃的温度和等于或接近5％的CO2水平，具有如下稳定空气流量：为、为约或至少0.01L/min、0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、1.5L/min、或2.0L/min或大于2.0L/min。在某些实施方案中，在灌注的情况下，如以290ml/天、580ml/天和/或1160ml/天的速率(例如，这取决于与培育起始相关的时间安排和/或经培育细胞的密度)进行培育的至少一部分。在一些实施方案中，在摇摆运动(例如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(例如在5RPM与15RPM之间(如6RMP或10RPM)的速度))的情况下进行细胞培养物扩增的至少一部分。
在一些实施方案中，所提供的用于制造、产生或生产细胞疗法和/或工程化细胞的方法可以包括在孵育、工程化和培育和/或如所述的一个或多个其他处理步骤之前或之后配制细胞，例如配制由所提供的处理步骤产生的基因工程化细胞。在一些实施方案中，一个或多个处理步骤(包括配制细胞)可以在封闭系统中进行。在一些情况下，在用于制造、产生或生产细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行的)中处理细胞，可以包括在培养(例如培育和扩增)和/或如所述的一个或多个其他处理步骤之前或之后配制细胞，例如配制由所提供的转导处理步骤产生的基因工程化细胞。
在一些实施方案中，提供包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的所述剂量的细胞作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品。此类组合物可以根据所提供的方法使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法中。在一些情况下，可以以用于剂量施用(例如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量配制细胞。
在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器如袋子或小瓶中。
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述处理包括将介质交换成药学上可接受的或施用至受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，所述处理步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。包括药学上可接受的载体或赋形剂的此类药物形式的例子可以是下文与将细胞和组合物施用至受试者可接受的形式结合描述的任何形式。在一些实施方案中，所述药物组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。
在一些实施方案中，所述配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％DMSO溶液，如5％至20％DMSO溶液或5％至10％DMSO溶液的低温保存溶液来配制细胞。在一些实施方案中，低温保存溶液是或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，所述低温保存溶液是或含有例如至少或约7.5％DMSO。在一些实施方案中，所述处理步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代在低温保存剂溶液中的细胞。在一些实施方案中，将细胞在具有以下终浓度的介质和/或溶液中冷冻(例如，低温保护或低温保存)：为或约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％DMSO，或者在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞在具有以下终浓度的介质和/或溶液中冷冻(例如，低温保护或低温保存)：为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％HSA，或者在0.1％与5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行所述配制，所述步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞，如培养或扩增的细胞。在一些实施方案中，所述处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包括用于以给定剂量或其部分用的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括减小体积，从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括增加体积，从而根据需要减小细胞的浓度。在一些实施方案中，所述处理包括向转导的和/或扩增的细胞添加一定体积的配制缓冲液。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积是从或从约10mL至1000mL，如至少或约至少或为约或为50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的此类处理步骤在封闭系统中进行。此类处理步骤的例子可以使用结合与细胞处理系统有关的一个或多个系统或试剂盒的离心室(如由Biosafe SA生产和出售的离心室，包括与
or Sepax
细胞处理系统一起使用的那些)来进行。在国际公开号WO2016/073602中描述了示例性系统和过程。在一些实施方案中，所述方法包括从离心室的内部空腔中输送配制的组合物，所述配制的组合物是在如所述的任何上述实施方案中在配制缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制的细胞的所得组合物。在一些实施方案中，将经配制组合物压出至作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的容器(如本文所述的生物医学材料器皿的小瓶)。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿被配置用于整合至和或可操作连接至并且/或者被整合至或可操作地连接至进行一个或多个处理步骤的封闭系统或设备。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿在输出管线或输出位置处连接至系统。在一些情况下，所述封闭系统在入口管处连接至生物医学材料器皿的小瓶。与本文所述的生物医学材料器皿一起使用的示例性封闭系统包括
和
2系统。
在一些实施方案中，如与离心室或细胞处理系统相关联的封闭系统包括多端口输出试剂盒，所述试剂盒含有在管线的每个末端与端口相关联的多路歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器以供输送配制的组合物。在一些方面，所需数量或多个小瓶可以无菌连接至多端口输出中的一个或多个，通常两个或更多个，如至少3、4、5、6、7、8个或更多个端口。例如，在一些实施方案中，一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)可以附接至所述端口或少于全部的所述端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物压出至生物医学材料器皿的多个小瓶中。
在一些方面，细胞可以以用于剂量施用(如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量压出至多个输出容器(例如，小瓶)中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，所述小瓶可以各自含有以给定剂量或其部分施用的细胞数量。因此，在一些方面，每个小瓶可以含有用于施用的单一单位剂量，或者可以含有所需剂量的一部分，使得多个小瓶中的多于一个，如两个小瓶或3个小瓶一起构成用于施用的剂量。
因此，所述容器(例如袋或小瓶)通常含有待施用的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是要施用至受试者的细胞的量或数量，或者是要施用的细胞的数量的两倍(或更多数量)。它可以是要施用至受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)单独地包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x106、2x106、5x106、1x107、5x107或1x108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的经配制细胞组合物的体积为10mL至100mL，如至少或约至少20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，所述容器(例如袋或小瓶)中的细胞可以是低温保存的。在一些实施方案中，所述容器(例如小瓶)可以储存在液氮中，直到进一步使用。
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物施用至受试者以治疗疾病或病症。
E.示例性过程和特征
在一些实施方案中，通过用于选择、分离、激活、刺激、扩增、培育和/或配制细胞的过程产生或生成根据所提供的方法使用的工程化细胞，如表达如所描述的抗BCMA CAR的那些。在一些实施方案中，此类方法包括如所描述的任何一种。
在一些实施方案中，富集的CD4+ T细胞的至少一种单独组合物和富集的CD8+ T细胞的至少一种单独组合物是从单一生物样品(例如，来自同一供体(如患者或健康个体)的PBMC或其他白细胞样品)中分离、选择、富集或获得的。在一些实施方案中，最初从同一生物样品(如获得、收集、和/或获取自单一受试者的单一生物样品)中来源(例如分离、选择和/或富集)富集的CD4+ T细胞的单独组合物和富集的CD8+ T细胞的单独组合物。在一些实施方案中，首先使生物样品经历CD4+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分，并且进一步使阴性级分经历CD8+ T细胞的选择。在其他实施方案中，首先使生物样品经历CD8+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分，并且进一步使阴性级分经历CD4+ T细胞的选择。在一些实施方案中，如在国际PCT公开号WO2015/164675中所述进行选择方法。在一些方面，首先对生物样品阳性选择CD8+ T细胞以产生富集的CD8+ T细胞的至少一种组合物，并且然后对阴性级分阳性选择CD4+ T细胞以产生富集的CD4+ T细胞的至少一种组合物，使得富集的CD8+ T细胞的至少一种组合物和富集的CD4+T细胞的至少一种组合物是来自同一生物样品(例如来自同一供体患者或健康个体)的分开的组合物。在一些方面，将富集的T细胞的两种或更多种分开的组合物(例如，至少一种是来自同一供体的富集的CD4+ T细胞的组合物，并且至少一种是富集的CD8+ T细胞的单独组合物)单独地冷冻(例如低温保护或低温保存)在低温保存介质中。
在一些实施方案中，将来自富集的CD4+ T细胞组合物的细胞和来自富集的CD8+ T细胞组合物的细胞混合、组合和/或合并以产生含有CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物。在某些实施方案中，在刺激条件下在孵育细胞之前合并、混合和/或组合富集的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合物。在某些实施方案中，在从生物样品中分离、富集和/或选择CD4+和CD8+T细胞之后，合并、混合和/或组合富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，在冷冻(例如，低温保存)和解冻富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物之后，合并、混合和/或组合富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在特定实施方案中，所述输入组合物含有在3:1与1:3之间、在2:1与1:2之间、在1.5与0.75之间、在1.25与0.75之间、或在1.2与0.8之间的比率的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述输入组合物含有为或约1:1的比率的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞。
在一些方面，将富集的T细胞的两种或更多种分开的组合物(例如，至少一种是来自同一生物样品的富集的CD4+ T细胞的组合物，并且至少一种是来自同一生物样品的富集的CD8+ T细胞的单独组合物)解冻并混合、组合和/或合并，并且在混合、组合和/或合并之前或之后可以任选地洗涤所述组合物。在一些方面，富集的T细胞的经混合、组合和/或合并和任选地洗涤的组合物形成输入组合物。在一些方面，通过与刺激试剂接触(例如，通过与用于T细胞激活的CD3/CD28缀合的磁珠孵育)来激活和/或刺激输入组合物(例如，包含比率为或约1:1的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞)。在一些方面，例如使用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体对激活/刺激的细胞组合物进行工程化、转导和/或转染，以在细胞组合物的CD4+T细胞和CD8+ T细胞中表达相同的重组蛋白。在一些方面，所述方法包括从细胞组合物中去除刺激试剂，例如磁珠。在一些方面，培育含有工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞的细胞组合物，例如用于其中的CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞群的扩增。在某些实施方案中，例如通过在配制缓冲液中洗涤细胞组合物来收获和/或收集和/或配制来自培育的细胞组合物。在某些实施方案中，将包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的配制细胞组合物冷冻(例如低温保护或低温保存)在低温保存介质中。在一些方面，所述配制品中的工程化CD4+ T细胞和CD8+ T细胞源自同一供体或生物样品并表达相同的重组蛋白(例如CAR)，并且将所述配制品施用至对其有需要的受试者(如同一供体)。
在一些实施方案中，根据所提供的方法使用的工程化细胞(如表达如所描述的抗BCMA CAR的那些)以及包含此类细胞的组合物(如含有表达抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的CD4+和CD8+ T细胞的组合物)是通过示例性过程产生或生成的，所述示例性过程包括从样品单独选择CD4+和CD8+ T细胞，之后将所选择的细胞以限定的比率组合以用于后续处理步骤。
在示例性方法的一些方面中，从来自人白细胞单采术样品的分离的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，并且将选择的细胞组合物低温保存。在一些实施方案中，所述人受试者是患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者。在一些方面，随后，在进行刺激、转导和扩增步骤之前，将所选择的CD4+和CD8+ T细胞组合物解冻，并以1:1的活CD4+ T细胞与活CD8+ T细胞的比率混合。在示例性实施方案中，在无血清培养基中，以1:1的珠与细胞比率，在具有附接的抗CD3和抗CD28抗体的由聚苯乙烯包被的顺磁性珠的存在下，以约3x106个细胞/mL的密度刺激来自混合的细胞组合物的大约300x106个T细胞(150x106个CD4+和150x106个CD8+T细胞)。在一些实施方案中，所述培养基还含有重组IL-2、IL-7和IL-15。通过孵育将刺激进行18至30小时之间。
在示例性过程的一些方面中，在孵育后，洗涤来自刺激的细胞组合物的大约100x106个活细胞，并将其重悬浮于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的示例性无血清培养基中。在一些情况下，不添加转导佐剂。在一些方面，用编码本文所述的任何示例性抗BCMA CAR(例如，含有对BCMA具有特异性的scFv抗原结合结构域、CD28跨膜区、4-1BB共刺激信号传导区和CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域)的示例性慢病毒载体通过以下方式转导细胞：旋转接种60分钟，接着在约37℃下孵育约18至30小时。在一些方面，旋转接种后的细胞密度约为约1x106个细胞/mL。
在一些实施方案中，然后通过转移到生物反应器(例如摇摆运动生物反应器)中的约500mL示例性无血清培养基中来培育转导的细胞以进行扩增，所述示例性无血清培养基含有两倍于在孵育和转导步骤期间所用的浓度的IL-2、IL-7和IL-15。在一些示例性过程中，示例性培养基不含有泊洛沙姆。
在一些方面，在实现大于或约0.6x106个细胞/mL的阈值细胞密度之后，逐步添加培养基，定期(如在约2与约15分钟之间)添加新鲜培养基的注液至1000mL的体积，并且在稳定的摇摆条件下(非灌注)培育细胞直到实现大于或约0.6x106个细胞/mL的阈值活细胞密度。在一些实施方案中，如果活细胞密度大于0.8x106个细胞/mL，则开始组合填充/灌注步骤，其中以例如如上所示的逐步方式添加第一培养基，直到目标体积为1000mL，然后如按以下所述的开始灌注。在一些方面，然后，通过伴随连续混合的半连续灌注替换培养基。在一些实施方案中，在扩增阶段期间随着细胞密度增加将灌注速率和/或摇摆速度增加至少一倍。在一些实施方案中，在扩增阶段期间随着细胞密度增加灌注速率增加至少一倍。在一些实施方案中，以逐步的方式将培养基添加到培养物中，每天的总体积由活细胞密度决定(如一旦达到某一密度，则以较高的速率)，直至速率例如导致每天向培养物中添加大约750mL或1500mL的总新鲜培养基(当达到更高的细胞浓度时，以更高的速率)，在一天中定期(例如在约每0.5小时与约每1.5或2小时之间)添加新鲜培养基的注液。在一些实施方案中，在达到约3500x106或5500x106的示例性扩增阈值之后的那天收获细胞。在一些实施方案中，某一天在有核细胞(TNC)总数已经达到至少或至少大约3500x106个之后的时候以及在TNC数量已经达到至少或至少大约5500x106个总有核细胞的某个时间点时收获细胞。在收获后，通过暴露于磁场将抗CD3和抗CD28抗体缀合的珠从细胞组合物中除去。然后配制细胞，将其等分至用于施用的冷冻袋(例如CryoStore冷冻袋)和用于进一步分析的小瓶中，并低温保存。在一些情况下，每袋等分30mL体积的配制的细胞组合物。在一些情况下，细胞以可变的浓度低温保存，只要满足总输出组合物的靶细胞数即可。
在一些实施方案中，根据所提供的方法使用的工程化细胞(如表达如所描述的抗BCMA CAR的那些)以及包含此类细胞的组合物(如含有表达抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的CD4+和CD8+ T细胞的组合物)是通过另一个示例性过程产生或生成的。在示例性过程中，原代CD4+和CD8+细胞从来自人白细胞单采术样品(包括来自患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者)的含PBMC的生物样品中富集。在一些方面，在进行刺激、转导和扩增步骤之前，将富集的CD4+和富集的CD8+细胞组合物单独地低温保存，并且随后以1:1的活CD4+ T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。
在一些实施方案中，在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的示例性无血清培养基中，以1:1的珠与细胞比率，在具有附接的抗CD3和抗CD28抗体的由顺磁性聚苯乙烯包被的珠的存在下，以约3x106个细胞/mL的密度将来自混合的细胞组合物的大约300x106个T细胞(例如150x106个CD4+和150x106个CD8+ T细胞)孵育18与30小时之间。
在一些方面，在孵育后，用编码本文所述的任何示例性抗BCMA CAR(例如，含有对BCMA具有特异性的scFv抗原结合结构域、CD28跨膜区、4-1BB共刺激信号传导区和CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域)的示例性慢病毒载体在具有细胞因子的示例性无血清培养基中通过以下方式转导来自孵育的细胞组合物的至少约100x106直至约200x106个活细胞：旋转接种60分钟，接着在约37℃下孵育约18至30小时。
在一些实施方案中，然后通过在生物反应器(例如摇摆运动生物反应器)中的约500mL示例性无血清培养基中培育来扩增转导的细胞，所述无血清培养基含有两倍于在孵育和转导步骤期间所用的浓度的IL-2、IL-7和IL-15。在一些方面，所述培养基不包含或不含泊洛沙姆。在一些方面，在认为实现大于或大于约0.6x106个细胞/mL的细胞密度之后，逐步添加培养基，定期(如在约2与约15分钟之间)添加新鲜培养基的注液至1000mL的体积，并且在稳定的摇摆条件下(非灌注)培育细胞直到实现大于或约0.6x106个细胞/mL的阈值活细胞密度。在一些方面，如果活细胞密度大于0.8x106个细胞/mL，则开始组合填充/灌注步骤，其中以如上所示的逐步方式添加第一培养基，直到目标体积为1000mL，然后开始灌注。在一些实施方案中，通过伴随连续混合的半连续灌注替换培养基。在一些方面，在扩增阶段期间随着细胞密度增加将灌注速率和/或摇摆速度增加至少一倍。在一些实施方案中，在扩增阶段期间随着细胞密度增加灌注速率增加至少一倍。在一些方面，以逐步的方式将培养基添加到培养物中，每天的总体积由活细胞密度决定(例如，一旦达到某一密度，则以较高的速率)，直至速率例如导致每天向培养物中添加大约750mL或1500mL的总新鲜培养基(例如，当达到更高的细胞浓度时，以更高的速率)，在一天中定期(例如在为或约每0.5小时与为或约每1.5或2小时之间)添加新鲜培养基的注液。在一些实施方案中，某一天在有核细胞(TNC)总数达到至少或至少大约1000x106个之后的时候以及在TNC数量达到至少或至少大约2400x106个总有核细胞的某个时间点时收获细胞，活力为至少85％。在一些方面，在收获后，将抗CD3和抗CD28抗体缀合的珠从细胞组合物中除去。
在一些实施方案中，然后配制细胞，并将组合物的等分试样转移到容器中，例如用于下游存储或使用。在一些实施方案中，将配制的组合物或其部分转移至适合于例如用于潜在地施用至受试者的细胞组合物的低温保存和存储的冷冻袋(如CryoStore冷冻袋)中，和/或将组合物或其部分转移至小瓶或其他容器中例如用于细胞的进一步分析。在一些方面，例如在适合于下游解冻和施用用途的条件下，将细胞低温保存。在一些情况下，将30mL体积的配制细胞用于单独的袋中。在一些情形中，将细胞以可变的总细胞浓度低温保存，例如，以允许在细胞用于施用的情境下每个剂量中有一致数量或浓度的CAR+ T细胞。在一些实施方案中，目标CAR+CD3+细胞数量为每30mL或每袋有等于或大约所需数量(例如为或约37.5x106个)的CAR+CD3+细胞，这在一些实施方案中涉及由不同的供体或患者产生的组合物之间总细胞浓度的变化。
在一些方面，对于从一系列多发性骨髓瘤患者中获得的个体白细胞单采术样品，这种示例性过程从此类样品中产生工程化细胞组合物可以导致从激活开始到收获的过程部分的持续时间范围在5天与8天之间，并且这些样品之间的平均持续时间为5.5天。在一些方面，对于这组样品，在过程中的平均累积群体倍增数可以为大约5。
在一些方面，本文所述的示例性过程可以用于从许多人多发性骨髓瘤白细胞单采术样品中产生工程化T细胞组合物。在一些方面，评估了各种参数，包括反映细胞表型、功能和细胞工程化的那些参数。在一些实施方案中，观察到T细胞纯度、T细胞谱系代表、转导频率和功能基本上与使用不同的示例性过程(例如，以上所述)用这些白细胞单采术产物产生的组合物的类似。在一些方面，观察到与不同的示例性过程(例如，以上所述)相比，使用以上所述的示例性过程生产时群体倍增数和在激活开始与收获之间的平均持续天数减少。在一些方面，在通过本文所述的不同示例性过程生产的工程化细胞组合物中观察到中央记忆表型细胞的百分比类似或增加(和效应记忆表型细胞的百分比类似或减少)。
在一些实施方案中，使用如下过程产生工程化细胞，所述过程在一些方面具有特定的成功率，如高成功率或大于阈值率的成功率，如能够生成治疗性细胞组合物的那些，如能够针对大数量或百分比的样品(如针对各自源自不同个体受试者或患者(如有待用治疗性组合物治疗的受试者或患者)的所有或高百分比的样品)生成具有某些所需或期望特征的此类组合物(例如，在自体细胞疗法的情境下)。在一些方面，受试者或患者患有疾病或病症，如癌症，如血癌或血液癌症如多发性骨髓瘤。在一些方面，所述样品(针对其高百分比，可能由其生成治疗性细胞组合物)是患者样品，包括例如就细胞表型或其样品或细胞的其他参数而言可变的患者样品。在一些实施方案中，如与经由其他过程生成的细胞组合物相比，所述工程化细胞组合物具有改善的或高度的细胞健康。在一些实施方案中，所述组合物包含高百分比的呈凋亡标记物阴性的细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞组合物是通过如下方法产生的，所述方法产生包含具有稳健的细胞因子产生的多功能细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞组合物是通过如下方法产生的，所述方法产生富集了记忆表型、富集了中央记忆表型和/或富集了呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的T细胞组合物。在一些实施方案中，组合物中的细胞的、组合物中的T细胞的、或组合物中的工程化T细胞的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％或更多(或者，对于使用特定方法生产的至少一半或大多数样品，或者平均而言使用特定方法产生的样品，组合物中的细胞的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％或更多)是具有中央记忆表型的T细胞；呈CD27+、CD28+；呈CCR7+、CD45RA-；和/或呈CCR7+、CD45RO+。在一些实施方案中，所述组合物中的细胞的、组合物中的T细胞的、或组合物中的工程化T细胞的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％或85％或90％或95％或更多(或者，对于使用特定方法生产的至少一半或大多数样品，或者平均而言使用特定方法产生的样品，组合物中的细胞的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％或85％或90％或95％或更多)是具有记忆表型的T细胞；呈CD45RA-；和/或呈CD45RO+。
在某些实施方案中，所述组合物的细胞具有高份额和/或频率的中央记忆细胞。在一些实施方案中，所述组合物的至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的细胞具有记忆表型、具有中央记忆表型或者是中央记忆T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的细胞是中央记忆T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％、在为或约45％与为或约50％、在为或约50％与为或约55％、在为或约55％与为或约60％、或在为或约60％与为或约65％之间的细胞具有记忆表型、具有中央记忆表型或者是中央记忆T细胞。在一些实施方案中，所述组合物的至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的T细胞具有记忆表型、具有中央记忆表型或者是中央记忆T细胞。在某些实施方案中，所述组合物中的至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的T细胞具有记忆表型、具有中央记忆表型或者是中央记忆T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％、在为或约45％与为或约50％、在为或约50％与为或约55％、在为或约55％与为或约60％、或在为或约60％与为或约65％之间的T细胞具有记忆表型、具有中央记忆表型或者是中央记忆T细胞。在一些实施方案中，所述组合物的至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+ T细胞是中央记忆CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+ T细胞是中央记忆CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％、在为或约45％与为或约50％、在为或约50％与为或约55％、在为或约55％与为或约60％、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+ T细胞是中央记忆CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物的至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+CAR+ T细胞是中央记忆CD4+CAR+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+CAR+ T细胞是中央记忆CD4+CAR+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％、在为或约45％与为或约50％、在为或约50％与为或约55％、在为或约55％与为或约60％、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+CAR+ T细胞是中央记忆CD4+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物的至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+ T细胞是中央记忆CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+ T细胞是中央记忆CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％、在为或约45％与为或约50％、在为或约50％与为或约55％、在为或约55％与为或约60％、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+ T细胞是中央记忆CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物的至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+CAR+ T细胞是中央记忆CD8+CAR+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+CAR+ T细胞是中央记忆CD8+CAR+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％、在为或约45％与为或约50％、在为或约50％与为或约55％、在为或约55％与为或约60％、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+CAR+ T细胞是中央记忆CD8+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物的至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+ T细胞(例如，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞)是中央记忆CD4+或CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+ T细胞(例如，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞)是中央记忆CD4+或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中的细胞的至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+ T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。
在一些实施方案中，所述方法的迭代产生多种组合物，任选地从人生物样品中产生，其中所述方法在多名不同的单独受试者中进行。在一些实施方案中，所述多种组合物中的具有记忆表型的细胞的平均的(即，平均)或中值百分比在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间。在一些实施方案中，所述多种组合物中的具有中央记忆表型的细胞的平均的(即，平均)或中值百分比在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间。在一些实施方案中，所述多种组合物中的呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均的(即，平均)或中值百分比在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间。在一些实施方案中，所述多种组合物中的呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均的(即，平均)或中值百分比在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间。在一些实施方案中，所述多种组合物中的工程化CD4+ T细胞(例如，CAR+CD4+ T细胞)中的中央记忆CD4+ T细胞的平均的(即，平均)或中值百分比在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间。在一些实施方案中，所述多种组合物中的工程化CD8+ T细胞(例如，CAR+CD8+ T细胞)中的中央记忆CD8+ T细胞的平均的(即，平均)或中值百分比在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间。在一些实施方案中，所述多种组合物中的工程化T细胞(例如，CAR+ T细胞)中的中央记忆T细胞(例如，CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞)的平均的(即，平均)或中值百分比在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间。
IV.药物组合物
还提供包含BCMA结合分子、免疫缀合物、重组受体和工程化细胞的组合物，包括药物组合物和配制品。此类组合物包括包含表达所提供的抗BCMA重组受体(例如CAR)的工程化细胞(如多种工程化细胞)的那些。在一些方面，还提供了组合物，例如用于所提供的方法和用途(例如治疗方法和用途)的细胞组合物。在一些实施方案中，当施用至患有疾病或障碍(例如多发性骨髓瘤)的受试者时，所提供的组合物能够实现某些治疗结局，例如反应或安全性结局。
本发明提供了药物配制品，其包含BCMA结合的重组嵌合抗原受体或表达所述受体的工程化细胞、表达所述受体的多种工程化细胞和/或用于组合治疗或疗法的另外的药剂。药物组合物和配制品通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种另外的治疗剂。
术语“药物配制品”是指如下制剂，其呈如下形式以允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且其不含对会被施用所述配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面中，载体的选择部分地由特定细胞、结合分子和/或抗体和/或由施用方法决定。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，所述组合物中包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
本文所述的抗体配制品可以包括冻干配制品和水性溶液。
所述配制品或组合物还可以含有可用于用结合分子或细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种的活性成分，优选地具有与结合分子或细胞互补的活性的那些，其中各活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物还包含其他药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，所述细胞或抗体以盐(例如药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。
可以将活性成分包埋在微胶囊、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中。在某些实施方案中，将所述药物组合物配制为包合物(如环糊精包合物)或配制成脂质体。脂质体可以用于将宿主细胞(例如，T细胞或NK细胞)靶向特定组织。许多方法可用于制备脂质体，例如在例如以下参考文献中所述的那些方法：Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980)；以及美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。
在一些方面，所述药物组合物可以利用定时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得所述组合物的递送发生在待治疗部位的致敏之前并且有足够的时间引起致敏。许多类型的释放递送系统是可用的并且是已知的。此类系统可以避免重复施用该组合物，从而增加对受试者和医师的便利性。
在一些实施方案中，所述药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的结合分子和/或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于在数天或更长时间内重复施用，根据病症，重复治疗直到出现对疾病症状的所需抑制为止。然而，其他剂量方案可能有用并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用所述组合物、通过多次推注施用所述组合物或通过连续输注施用所述组合物来递送。
在某些实施方案中，在含有所述结合分子(例如，CAR)的基因工程化细胞的情境下，向受试者施用如下范围的细胞：为或约一百万至为或约1000亿个细胞、例如像100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5000万个细胞、为或约50000万个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞、或任两个前述值限定的的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞、或任两个前述值限定的的范围)，并且在一些情况下，为或约10000万个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约12000万个细胞、为或约15000万个细胞、为或约25000万个细胞、为或约30000万个细胞、为或约35000万个细胞、为或约45000万个细胞、为或约65000万个细胞、为或约80000万个细胞、为或约90000万个细胞、为或约1.20亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这种细胞数量的范围之间的任何值。在一些方面，在表达结合分子(例如，CAR)的基因工程化细胞的情境下，组合物可以含有用于施用一定剂量的细胞疗法的至少所述数量的细胞，如用于施用的约或至少本文(例如，在第V.A节中)所述一定数量的细胞。
可以使用标准施用技术、配制品和/或设备来施用细胞。提供了用于储存和施用所述组合物的配制品和设备(如注射器和小瓶)。细胞的施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并且施用同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。在施用治疗组合物(例如，含有经基因修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外施用所述细胞群。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道、颅内、胸腔内和腹膜内施用。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送向受试者施用细胞群。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间段。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将结合分子掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)掺合。所述组合物也可以是冻干的。所述组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面中，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等)来确保。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品(例如薄膜)或微胶囊的形式。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
还提供用于组合疗法的药物组合物。可以制备本文所述的用于组合疗法的任何另外的药剂(例如第III.B节中所述的药剂)，并将其与本文所述的BCMA结合分子(例如抗体)、免疫缀合物、重组受体(例如嵌合抗原受体)和/或表达所述分子(例如重组受体)的工程化细胞一起作为一种或多种药物组合物来施用。可以将组合疗法在一种或多种药物组合物中施用，例如，其中结合分子、重组受体和/或细胞与另外的药剂在同一药物组合物中或在单独的药物组合物中。例如，在一些实施方案中，所述另外的药剂是另外的工程化细胞(例如被工程化以表达不同重组受体的细胞)并在同一组合物或在单独的组合物中式施用。在一些实施方案中，根据特定的结合分子、重组受体、细胞(例如工程化细胞)和/或另外的药剂、以及特定的剂量方案和/或递送方法，将每种药物组合物配制成合适的配制品。
V.方法和用途
还提供使用BCMA结合分子、免疫缀合物、重组受体、工程化细胞及其药物组合物和配制品的方法，以及BCMA结合分子、免疫缀合物、重组受体、工程化细胞及其药物组合物和配制品例如在治疗其中表达BCMA的疾病、病症和障碍中、和/或在检测、诊断和预后方法中的用途。此类方法(如治疗方法)和用途包括涉及向受试者施用表达所提供的抗BCMA重组受体(例如CAR)的工程化细胞(如多种工程化细胞)的那些。还提供了组合疗法和/或治疗的方法。
A.治疗和预防方法及用途
还提供BCMA结合分子(包括抗BCMA重组受体(例如CAR))、表达重组受体(例如CAR)的工程化细胞、表达受体的多种工程化细胞和/或包含上述各项的组合物的施用方法和用途(如治疗和预防用途)。此类方法和用途包括例如涉及向受试者施用分子(例如，重组受体)、细胞(例如，工程化细胞)或含有所述分子、所述细胞的组合物的治疗方法和用途，所述受试者患有与BCMA相关的疾病、病症或障碍，例如与BCMA表达相关和/或其中细胞或组织表达(例如特异性地表达)BCMA的疾病、病症或障碍。在一些实施方案中，以实现所述疾病或障碍的治疗的有效量施用所述分子、细胞和/或组合物。本文提供了重组受体(例如CAR)和细胞(例如工程化细胞)在此类方法和治疗中以及在制造或制备药物以便进行此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，通过向患有、已经患有或怀疑患有疾病或病症的受试者施用结合分子或细胞或包含所述结合分子或所述细胞的组合物来进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法从而治疗所述受试者的所述疾病或病症或障碍。本文还提供了任何组合物(如本文所提供的药物组合物)用于治疗与BCMA相关的疾病或障碍(如用于治疗方案)的用途。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不利影响或结局、或表型的完全或部分改善或减轻。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结局的一种或多种影响。
如本文所用，“延迟疾病的发生”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发生。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的受试者。足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为受试者不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的分子和组合物用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数以外其他都相同的条件相比时，或者可替代地如与另一种条件相比，降低功能或活性。例如，与不存在抗体或组合物或细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的该抗体或组合物或细胞降低肿瘤的生长速率。
在施用的情境下，药剂(例如，药物配制品、结合分子、抗体、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如药物配制品、结合分子、抗体、细胞或组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效动力学作用的量。该治疗有效量可以根据诸如疾病状态、受试者的年龄、性别和体重以及施用的细胞群等因素而变化。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)施用分子、抗体、细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需预防结果的量。通常但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或在疾病较早期用于受试者，所以预防有效量将小于治疗有效量。
如本文所用，“受试者”或“个体”是哺乳动物。在一些实施方案中，“哺乳动物”包括人、非人灵长类动物、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫、猴等。在一些实施方案中，受试者是人。
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如以下文献中：Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat RevClin Oncol.8(10):577-85。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
要治疗的疾病包括与BCMA相关的任何疾病或障碍或者其中特异性表达BCMA和/或其中已经靶向BCMA以供治疗的任何疾病或障碍(本文中还可互换地称为“BCMA相关疾病或障碍”)。与BCMA表达相关的癌症包括血液学恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症，以及霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤二者。关于BCMA的综述，参见Coquery等人,Crit Rev Immunol.,2012,32(4):287-305。由于BCMA已经参与介导肿瘤细胞存活，因此它是癌症疗法的潜在靶标。先前已经描述过含有小鼠抗人BCMA抗体的嵌合抗原受体和表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060。
在一些实施方案中，与BCMA相关的疾病或障碍是B细胞相关障碍。在一些实施方案中，与BCMA相关的疾病或障碍是选自以下中的一种或多种疾病或病症：胶质母细胞瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增生性障碍、免疫调节性障碍、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性、或意义不明的单克隆丙种球蛋白病。
在一些实施方案中，与BCMA相关的疾病或障碍是自身免疫性疾病或障碍。此类自身免疫疾病或障碍包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病、类风湿性关节炎(例如，幼年型类风湿性关节炎)、ANCA相关的血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、恰加斯氏病(Chagas’disease)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、韦格纳肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、寻常型天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病变、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征(Reynaud’s syndrome)、抗磷脂综合征、古德帕斯丘氏病(Goodpasture’s disease)、川崎病、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性肾小球性肾炎。
在某些疾病和病症中，BCMA在恶性细胞和癌症上表达。在一些实施方案中，所述癌症(例如表达BCMA的癌症)是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症(例如，表达BCMA的癌症)是淋巴瘤、白血病或浆细胞恶性肿瘤。本文所考虑的淋巴瘤包括但不限于伯基特淋巴瘤(例如，地方性伯基特淋巴瘤或散发性伯基特淋巴瘤)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、滤泡性淋巴瘤、小无裂细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤、结节单核细胞样B细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、肺B细胞血管中心性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。此处考虑的白血病包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、浆细胞白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。本文还考虑浆细胞恶性肿瘤，包括但不限于多发性骨髓瘤(例如，非分泌性多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤)或浆细胞瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症是多发性骨髓瘤(MM)，如复发性和/或难治性多发性骨髓瘤(R/R MM)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是浆细胞瘤，如髓外浆细胞瘤。在一些实施方案中，所述受试者不患有浆细胞瘤，如髓外浆细胞瘤。可以被治疗的与BCMA相关的疾病、障碍或病症(例如，表达BCMA的癌症)包括但不限于神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌和头颈癌。
在一些实施方案中，所述方法可以鉴定患有、怀疑患有或有风险患上与BCMA相关的疾病或障碍的受试者。因此，提供了用于鉴定患有与BCMA表达升高相关的疾病或障碍的受试者以及选择它们用于用所提供的BCMA结合重组受体(例如，CAR)和/或表达所述重组受体的工程化细胞治疗的方法。
在一些方面，例如，可以对受试者筛选与BCMA表达升高相关的疾病或障碍(如表达BCMA的癌症)的存在。在一些实施方案中，所述方法包括筛选或检测BCMA相关疾病(例如肿瘤或癌症，如多发性骨髓瘤)的存在。因此，在一些方面，可以从怀疑患有与BCMA表达升高相关的疾病或障碍的患者获得样品，并对其测定BCMA的表达水平。在一些方面，可以选择测试为对于BCMA相关的疾病或障碍呈阳性的受试者进行通过本发明方法的治疗，并且可以向其施用治疗有效量的如本文所述的包含BCMA结合分子的重组受体(例如CAR)、含有重组受体的细胞或其药物组合物。
在一些方面，可以针对例如来自受试者的生物样品(如血液或血清)中的可溶性BCMA(sBCMA)水平筛选受试者。在一些方面，可以针对在用细胞疗法治疗之前的sBCMA水平筛选受试者。在一些方面，所述方法包括在患有与BCMA表达相关的疾病或障碍(例如，肿瘤或癌症，如多发性骨髓瘤)的受试者中筛选或检测sBCMA的水平或量。在一些方面，可以从怀疑患有与BCMA相关的疾病或障碍的患者获得样品，并且例如使用检测可溶性蛋白水平的测定(如酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定sBCMA的水平或量。在一些方面，在患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者中，sBCMA水平可能与骨髓活检中浆细胞的比例相关。在一些方面，在患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者中，sBCMA水平可能与对治疗的反应降低或较短的总存活期或无进展存活期相关(参见例如，Ghermezi等人,Haematologica 2017,102(4):785–795)。在一些方面，展现出低sBCMA水平的受试者可以被选择用于通过本发明的方法治疗，并且可以向其施用治疗有效量的如本文所述的包含BCMA结合分子的重组受体(例如，CAR)、含有重组受体的细胞或其药物组合物。
在一些实施方案中，例如在用另一种BCMA特异性抗体和/或表达靶向BCMA的嵌合受体的细胞和/或其他疗法(包括化疗、辐射和/或造血干细胞移植(HSCT)(例如同种异体HSCT或自体HSCT))治疗之后，受试者患有顽固性或复发性疾病。在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种BCMA靶向疗法产生抗性，但施用仍有效地治疗所述受试者。在一些实施方案中，受试者尚未复发，但是被确定为具有复发风险(例如具有高复发风险)，因此预防性地施用化合物或组合物，例如以降低复发的可能性或防止复发。
在一些实施方案中，所述受试者是有资格进行移植，如有资格进行造血干细胞移植(HSCT)(例如，同种异体HSCT或自体HSCT)的受试者。在一些此类实施方案中，在施用如本文所提供的BCMA结合分子(包括抗BCMA重组受体(例如，CAR))、表达重组受体(例如，CAR)的工程化细胞、表达所述受体的多种工程化细胞、和/或包含其的组合物之前，所述受试者尽管有资格但先前尚未接受过移植。
在一些实施方案中，所述受试者是没有资格进行移植，如没有资格进行造血干细胞移植(HSCT)(例如，同种异体HSCT或自体HSCT)的受试者。在一些此类实施方案中，向这种受试者施用根据本文提供的实施方案的BCMA结合分子(包括抗BCMA重组受体(例如CAR))、表达重组受体(例如CAR)的工程化细胞、表达所述受体的多种工程化细胞和/或包含其的组合物。
在一些实施方案中，在开始施用工程化细胞之前，受试者已经接受一种或多种先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经接受至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多种先前疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经接受至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多种先前疗法。
在一些方面，所述受试者已经复发或对一种或多种先前疗法是难治的。在一些方面，所述先前疗法包括如下治疗，其采用自体干细胞移植(ASCT)；免疫调节剂；蛋白酶体抑制剂；和抗CD38抗体；除非受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌服一种或多种所述疗法。在一些方面，所述受试者已经复发或对三种或更多种先前疗法是难治的，包括用选自以下的三种或更多种疗法的治疗：(1)自体干细胞移植、(2)单独或组合的蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂以及(3)作为组合疗法的一部分或单一疗法的抗CD38单克隆抗体；除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或忌服一种或多种所述疗法。在一些实施方案中，所述免疫调节剂选自沙利度胺、来那度胺或泊马度胺。在一些实施方案中，所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、卡非佐米或伊沙佐米。在一些实施方案中，所述抗CD38抗体是或包含达雷木单抗。在一些实施方案中，除非疾病进展对方案有最佳反应，否则受试者必须已经经受每个方案的至少2个连续的治疗周期。
在一些实施方案中，所述方法可以涉及基于特定标准、诊断或适应症，包括或排除对于使用所提供的抗BCMA抗体、重组受体和/或包含此类受体的细胞的疗法的特定受试者。在一些实施方案中，在施用所述剂量的细胞或治疗前淋巴细胞耗尽化疗时，所述受试者未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。在一些实施方案中，如果受试者在施用时患有活跃的PCL或PCL病史，则可以根据所提供的方法将受试者排除在治疗之外。在一些实施方案中，如果所述受试者在施用时患上PCL(如继发性PCL)，则可以根据所提供的方法将所述受试者排除在治疗之外。在一些实施方案中，对标准、诊断或适应症的评估可以在根据所提供的方法筛选受试者的治疗的资格或适用性时、在治疗方案的各个步骤、在接受淋巴细胞耗尽疗法时和/或在开始施用工程化细胞或其组合物时或之前立即进行。
在一些实施方案中，所述治疗不诱导受试者对疗法的免疫应答，和/或诱导这样的应答没有达到阻止疾病或病症的有效治疗的程度。在一些方面，免疫原性和/或移植物抗宿主应答的程度小于用不同但可比较的治疗所观察到的程度。例如，与包含结合至类似的(例如重叠的)表位和/或与所述抗体竞争结合BCMA的不同抗体(如小鼠或猴或兔或人源化抗体)的CAR相比，在使用表达包含所提供的抗BCMA抗体的CAR的细胞的过继细胞疗法的情况下，在一些实施方案中免疫原性的程度降低。
在一些实施方案中，所述方法包括过继细胞疗法，由此将表达包含BCMA结合分子的所提供的重组受体(例如，包含抗BCMA抗体或其抗原结合片段的CAR)的基因工程化细胞施用至受试者。这种施用能以BCMA靶向的方式促进细胞激活(例如，T细胞激活)，使得疾病或障碍的细胞被靶向进行破坏。
因此，所提供的方法和用途包括用于过继细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法包括将细胞或含有所述细胞的组合物施用受试者、组织或细胞，如患有疾病、病症或障碍，具有疾病、病症或障碍的风险，或怀疑患有疾病、病症或障碍的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，将所述细胞、群体和组合物施用至患有将要例如通过过继细胞疗法(如过继T细胞疗法)治疗的特定疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，将所述细胞或组合物施用该受试者，如患有或有风险患上该疾病或病症的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗疾病或病症(例如，改善其一种或多种症状)，例如通过减轻表达BCMA的癌症中的肿瘤负荷来治疗。
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如授予Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授予Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat RevClin Oncol.8(10):577-85)。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受所述细胞疗法的受试者或从源自这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如患者)，并且在分离和处理后将所述细胞施用至同一受试者。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从除了将要接受或最终接受所述细胞疗法的受试者以外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞施用至相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是类似的。在一些实施方案中，所述第二受试者表达与所述第一受试者相同的HLA类别或超型。
在一些实施方案中，被施用所述细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，施用了所述细胞、细胞群或组合物的受试者是非人灵长类动物。在一些实施方案中，所述非人灵长类动物是猴(例如食蟹猴)或猿。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)。在一些例子中，所述患者或受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结局(如细胞因子释放综合征(CRS))的经验证的动物模型。
所述BCMA结合分子(如重组受体(例如CAR))和表达BCMA结合分子的细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjunctival injection，subconjunctival injection)、眼球筋膜下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、颅内、胸腔内或皮下施用。给药和施用可以部分取决于施用是短暂的还是长期的。各种给药时间表包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，所述结合分子、重组受体或细胞的适当剂量可以取决于待治疗的疾病类型、结合分子或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用结合分子或重组受体是出于预防目的还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对重组受体或细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物和分子和细胞合适地一次或在一系列治疗中施用该患者。
在一些实施方案中，所施用的剂量和/或频率基于功效和/或反应来确定。在一些实施方案中，通过评价疾病状态来确定功效。用于评估疾病状态的示例性方法包括：通过电泳和免疫固定测量生物液体(如血液和/或尿液)中的M蛋白；血液中sFLC(κ和λ)的定量；骨骼检查；并通过正电子发射断层扫描(PET)/计算机断层扫描(CT)对患有髓外疾病的受试者进行成像。在一些实施方案中，可以通过骨髓检查来评价疾病状态。在一些例子中，所施用的剂量和/或频率通过血液和/或骨髓中重组受体或细胞的扩增和持久性来确定。在一些实施方案中，所施用的剂量和/或频率基于重组受体或工程化细胞的抗肿瘤活性来确定。在一些实施方案中，抗肿瘤活性通过总体反应率(ORR)和/或国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准来确定(参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)。在一些实施方案中，使用最小残留病(MRD)评估来评价反应。在一些实施方案中，MRD可以通过诸如流式细胞术和高通量测序(例如，深度测序)的方法来评估。在一些方面，患有MRD阴性疾病的受试者包括那些在骨髓抽吸物中展现出不存在异常克隆浆细胞的受试者，其通过最低灵敏度为105有核细胞中的1个有核细胞或更高(即10-5灵敏度)的测定(如流式细胞术(下一代流式细胞术；NGF)或高通量测序，例如深度测序或下一代测序(NGS))被排除。
在一些方面，持续的MRD阴性包括在骨髓中(NGF或NGS，或两者)并且通过以下定义的成像展现出MRD阴性的受试者，确认间隔最少1年。后续评价可以用于进一步指定阴性持续时间(例如，5年时MRD阴性)。在一些方面，流式MRD阴性包括使用在多发性骨髓瘤中的MRD检测的EuroFlow标准操作程序(或经过验证的等效方法)在骨髓抽吸物中通过NGF展现出不存在表型异常克隆浆细胞的受试者，其中最低灵敏度为在105个有核细胞中的1个有核细胞或更高。在一些方面，测序MRD阴性包括在骨髓抽吸物中通过NGS展现出不存在克隆浆细胞的受试者，其中克隆的存在被定义为使用LymphoSIGHT平台对骨髓抽吸物进行DNA测序(或经验证的等效方法)后获得的少于两个相同的测序读段，其中最低灵敏度为105个有核细胞中的1个有核细胞或更高。在一些方面，成像加MRD阴性包括展现出如通过NGF或NGS评估的MRD阴性的受试者，以及在基线或先前的PET/CT时发现的示踪剂摄取增加的每个区域的消失，或减少至较少的纵隔血池SUV或减少至小于周围正常组织(参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)。
在一些实施方案中，基于施用重组受体或细胞后的反应的持续时间来评价反应。在一些例子中，施用的剂量和/或频率可以基于毒性。在一些实施方案中，可以基于施用重组受体和/或细胞的受试者的健康相关生活质量(HRQoL)来确定剂量和/或频率。在一些实施方案中，施用的剂量和/或频率可以基于上述标准中的任一个来改变，即增加或减少。
在一些方面，评估所述受试者的存活、特定时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方案中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，规定肿瘤负荷的量度。在一些实施方案中，用于确定的示例性参数包括指示肿瘤的改良或改善的特定临床结局。此类参数包括：疾病控制的持续时间，所述疾病控制包括客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)、最小反应(MR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)或复发(参见例如，国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)、客观反应率(ORR)、无进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。在一些实施方案中，使用最小残留病(MRD)评估来评价反应。可以设定参数的具体阈值以确定本文提供的方法的功效。在一些实施方案中，待治疗的疾病或障碍是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤的可测量疾病标准可以包括：(1)血清M蛋白1g/dL或更高；(2)尿M蛋白200mg或更高/24小时；(3)涉及的血清游离轻链(sFLC)水平10mg/dL或更高，具有异常的κ与λ比率。在一些情况下，轻链疾病仅适用于血清或尿液中没有可测量疾病的受试者。
在一些方面，例如，根据所提供的实施方案，对所述疗法的反应可以在开始施用所述细胞疗法之后的指定时间点测量。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约1、2、3、6、9、12、18、24、30或36个月或者在任何前述值限定的的范围内。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后4、8、12、16、20、24、28、32、36、48或52周月或者在任何前述值限定的的范围内。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约1个月。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约3个月。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约6个月。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约9个月。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约12个月。
在一些实施方案中，与在所述指定时间点测定的反应或结局相比，在初始指定时间点之后为或约3、6、9或12个月时测定的反应或结局是相等的或改善的。例如，在一些方面，如果在初始指定时间点测定的反应或结局是疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)或复发，则在初始指定时间点之后为或约3、6、9或12个月之后的随后的时间点根据所提供的实施方案治疗的受试者可以显示出相同或改善的反应或结局(例如，展现出根据国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准的更好的反应结局；参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)，即等于初始指定时间点的反应或结局；或者如下反应或结局，即客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)或部分反应(PR)。在一些方面，根据所提供的实施方案治疗的受试者可以显示在两个确定时间点之间改善的反应或结局。在一些方面，所述受试者可以在用于评估的初始指定时间点(例如，在施用开始后4周)展现出PR或VGPR，然后在稍后的时间点(例如，开始施用后12周)展现出改善的反应，如CR或sCR。在一些方面，无进展存活期(PFS)被描述为在疾病(如癌症)治疗期间和之后，受试者带病生存但所述疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR；在一些情况下也称为总体反应率)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总存活期(OS)被描述为从诊断日期或疾病(如癌症)治疗开始日期起，被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活的时间长度。在一些方面，无事件存活期(EFS)被描述为在癌症治疗结束后，受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括癌症的复发或某些症状的发作，如已经扩散到骨骼的癌症引起的骨痛，或死亡。
在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，从开始治疗起时间段之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在开始治疗后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。
在一些实施方案中，东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态指示物可以用于评估或选择用于治疗的受试者，例如，因先前疗法而具有较差体能的受试者(参见例如，Oken等人(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。ECOG体能状态量表描述患者在其自理能力、日常活动和体能(例如，步行、工作等)方面的机能水平。在一些实施方案中，ECOG体能状态为0指示，受试者可以进行正常活动。在一些方面，ECOG体能状态为1的受试者展现体力活动中的一些限制，但是所述受试者能完全走动。在一些方面，ECOG体能状态为2的患者能大于50％走动。在一些情况下，ECOG体能状态为2的受试者也可能能够自理；参见例如，
等人,(1993)Br J Cancer 67(4)773-775。在一些实施方案中，将根据本文提供的方法或治疗方案施用的受试者包括具有0或1的ECOG体能状态的受试者。
在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生抗性，但所述施用可以治疗所述受试者。在一些实施方案中，当根据本文所述的实施方案施用至受试者时，所述剂量或所述组合物能够在至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％被施用的受试者中实现客观反应(OR)。在一些实施方案中，OR包括实现严格的完全反应(sCR)、完全反应(CR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)的受试者。在一些实施方案中，当根据本文所述的实施方案施用至受试者时，所述剂量或所述组合物能够在至少50％、60％、70％、80％或85％被施用的受试者中实现严格的完全反应(sCR)、完全反应(CR)、非常好的部分反应(VGPR)或部分反应(PR)。在一些实施方案中，当根据本文所述的实施方案施用至受试者时，所述剂量或组合物能够在至少20％、30％、40％、50％、60％或70％被施用的受试者中实现严格的完全反应(sCR)或完全反应(CR)。在一些实施方案中，示例性剂量包含约1.0x107、1.5x107、2.0x107、2.5x107、5.0x107、1.5x108、3.0x108、4.5x108、6.0x108或8.0x108个CAR表达(CAR+)T细胞。在一些实施方案中，示例性剂量包含约5.0x107、1.5x108、3.0x108、4.5x108、6.0x108或8.0x108个CAR表达(CAR+)T细胞。在一些实施方案中，示例性剂量包含约5.0x107、1.5x108、3.0x108或4.5x108个CAR表达(CAR+)T细胞。在一些方面，对例如根据本文提供的方法的治疗的特定反应可以基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准来评估(参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)。
在一些实施方案中，实现特定结局(如OR和/或不存在毒性或严重毒性)的示例性剂量包含约5.0x107个CAR表达(CAR+)T细胞。在一些实施方案中，实现特定结局(如OR和/或不存在毒性或严重毒性)的示例性剂量包含约1.5x108个CAR+ T细胞。在一些实施方案中，实现特定结局(如OR和/或不存在毒性或严重毒性)的示例性剂量包含约3.0x108个CAR+ T细胞。在一些实施方案中，实现特定结局(如OR和/或不存在毒性或严重毒性)的示例性剂量包含约4.5x108个CAR+ T细胞。在一些实施方案中，实现特定结局(如OR和/或不存在毒性或严重毒性)的示例性剂量包含约6.0x108个CAR+ T细胞。在一些方面，所述示例性剂量。
在一些实施方案中，可以监测治疗的毒性和/或副作用，并将其用于调整重组受体(例如，CAR)、细胞和/或组合物的施用剂量和/或频率。例如，可以监测不良事件和实验室异常，并将其用于调整施用剂量和/或频率。不良事件包括输注反应、细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性、巨噬细胞激活综合征和肿瘤溶解综合征(TLS)。任何此类事件都可以建立剂量限制性毒性，并保证剂量减少和/或终止治疗。可以用作确定施用剂量和/或频率的指南的其他副作用或不良事件包括非血液系统不良事件，其包括但不限于疲劳、发热或发热性嗜中性粒细胞减少症、转氨酶在设定的持续时间内增加(例如，少于或等于2周或少于或等于7天)、头痛、骨痛、低血压、缺氧、发冷、腹泻、恶心/呕吐、神经毒性(例如，意识模糊、失语、癫痫发作、抽搐、嗜睡和/或精神状态改变)、弥散性血管内凝血、其他无症状的非血液系统临床实验室异常，如电解质异常。可以用作确定施用剂量和/或频率的指南的其他副作用或不良事件包括血液系统不良事件，其包括但不限于嗜中性粒细胞减少症、白细胞减少症、血小板减少症、动物和/或B细胞发育不全和低丙种球蛋白血症。
在一些实施方案中，例如，与施用其他疗法相比，根据所提供的方法的治疗可以导致更低比率和/或更低程度的毒性、毒性结局或症状、毒性促进特征、因子或特性，如与细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(如严重的CRS或严重的神经毒性)相关或指示其的症状或结局。在一些实施方案中，例如，与施用其他疗法相比，根据所提供的方法的治疗可以导致更高的反应率(例如更高的OR、CR、VGPR或PR率)和/或更持久的反应，以及更低比率和/或更低程度的毒性、毒性结局或症状、毒性促进特征、因子或特性，如与细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(如严重的CRS或严重的神经毒性)相关或指示其的症状或结局。在一些实施方案中，根据所提供的方法的治疗可以导致较高的反应率和较低比率或程度的毒性。在一些方面，与施用其他疗法相比，此类结果还可以伴随所施用的细胞的更高的扩增或延长的持久性。
在某些实施方案中，在含有所述结合分子或重组受体的基因工程化细胞的情境下，向受试者施用如下范围的细胞：为或约10万至为或约1000亿个细胞和/或每公斤受试者体重的该细胞量的范围，例如像10万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约50000万个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞、或任两个前述值限定的的范围)、100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约50000万个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞、或任两个前述值限定的的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约5000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞、或任两个前述值限定的的范围)，并且在一些情况下为或约10000万个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约12000万个细胞、为或约15000万个细胞、为或约25000万个细胞、为或约30000万个细胞、为或约35000万个细胞、为或约45000万个细胞、为或约60000万个细胞、为或约65000万个细胞、为或约80000万个细胞、为或约90000万个细胞、为或约1.20亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这些范围之间的任何值。同样，剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
在一些实施方案中，所述方法包括施用一定剂量的所述工程化细胞或包含一定剂量的所述工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，所述工程化细胞或包含工程化细胞的组合物可用于治疗方案中，其中所述治疗方案包括施用一定剂量的所述工程化细胞或包含一定剂量的所述工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，所述剂量可以包含例如特定数量或范围的重组受体表达T细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如本文所述的任何数量的此类细胞。在一些实施方案中，可以施用含有一定剂量的所述细胞的组合物。在一些方面，细胞群或细胞组合物中CAR表达(CAR+)细胞的数量、量或比例可以通过检测替代标记物(例如，通过流式细胞术或其他手段)或通过检测标记的分子(如标记的抗原)的结合来评估，所述标记的分子可以与本文提供的结合分子或受体特异性地结合。
与所提供的方法有关，所施用的细胞是被工程化以表达BCMA结合(抗BCMA)重组受体(例如CAR)的免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所施用的细胞是CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所施用的细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所施用的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合，如CD4+CAR T细胞和CD8+CAR T细胞的组合，其在一些方面位于同一容器或细胞组合物或悬浮液内。在一些例子中，所施用的CD4+细胞与CD8+细胞(CD4:CD8)的比率(如所述悬浮液或组合物或容器内的比率)是1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1。在一些实施方案中，所述比率在可容忍的错误率内是在1:3与3:1之间，或者是在为或约1:4与为或约4:1之间或在为或约1:3与为或约3:1之间或在为或约1:2与为或约2:1之间，或者任何此类比率。在一些方面中，在接受治疗的受试者和/或从中获取样品并处理以产生细胞组合物的受试者中，CD4+CAR-T细胞与CD8+CAR-T细胞的比率或CD4+与CD8+细胞的比率在所需的范围内，如在为或约1:4与为或约4:1之间或在为或约1:3与为或约3:1之间或在为或约1:2与为或约2:1之间，或者对于给定百分比的此类受试者(如至少65％、至少70％、至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％的此类受试者)，在此类所需的比率内。
在一些实施方案中，例如在受试者是人的情况下，所述剂量包含大于或大于约1x106个总重组受体(例如，CAR)表达(CAR+)细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)且少于或少于约2x109个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在为或约1.0x107至为或约1.2x109个此类细胞的范围内(如为或约1.0x107、1.5x107、2.0x107、2.5x107、5x107、1.5x108、3x108、4.5x108、6x108、8x108或1.2x109个总此类细胞)，或任何两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，例如在受试者是人的情况下，所述剂量包含大于或大于约1x106个总重组受体(例如，CAR)表达(CAR+)细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)且少于或少于约2x109个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在为或约2.5x107至为或约1.2x109个此类细胞的范围内(如为或约2.5x107、5x107、1.5x108、3x108、4.5x108、6x108、8x108或1.2x109个总此类细胞)，或任何两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约1.0x107个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约1.5x107个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约2.0x107个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约2.5x107个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约5x107个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约1.5x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约3x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约4.5x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约6x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约8x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约1.2x109个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方案中，所述剂量的基因工程化细胞包含从为或约1x105至为或约2x109个总CAR表达(CAR+)T细胞、从为或约1x105至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约或2.5x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的基因工程化细胞包含从为或约1.0x107至为或约8x108个总CAR表达(CAR+)T细胞、从为或约1.0x107至为或约6.5x108个总CAR+ T细胞、从为或约1.5x107至为或约6.5x108个总CAR+ T细胞、从为或约1.5x107至为或约6.0x108个总CAR+ T细胞、从为或约2.5x107至为或约6.0x108个总CAR+ T细胞、或者从为或约5.0x107至为或约6.0x108个总CAR+ T细胞。
在一些实施方案中，所述剂量的基因工程化细胞包含在为或约2.5x107个CAR表达(CAR+)T细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)与为或约1.2x109个CAR表达T细胞、总T细胞或总PBMC之间，在为或约5.0x107个CAR表达T细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)与为或约6.0x108个CAR表达T细胞、总T细胞或总PBMC之间，在为或约5.0x107个CAR表达T细胞与为或约4.5x108个CAR表达T细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)之间，在为或约1.5x108个CAR表达T细胞与为或约3.0x108个CAR表达T细胞、总T细胞或总PBMC之间(每个都包含端值)。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于CAR表达(例如CAR+)细胞。在一些实施方案中，所述剂量包含从或从约2.5x107至或至约1.2x109个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从或从约5.0x107至或至约6.0x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从或从约5.0x107至或至约4.5x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、或从或从约1.5x108至或至约3.0x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述基因工程化细胞的剂量参考CD3+CAR表达(CAR+)或CD4+/CD8+CAR表达(CAR+)细胞的总数。在一些实施方案中，所述剂量包含如下数量的基因工程化细胞：从或从约1.0x107至或至约1.2x109个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+CAR表达或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从或从约1.5x107至或至约1.2x109个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+CAR表达或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从或从约2.0x107至或至约1.2x109个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+CAR表达或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从或从约2.5x107至或至约1.2x109个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+CAR表达或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从或从约5.0x107至或至约6.0x108个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+CAR表达或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从或从约5.0x107至或至约4.5x108个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+CAR表达或CD4+/CD8+CAR表达细胞、或从或从约1.5x108至或至约3.0x108个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+CAR表达或CD4+/CD8+CAR表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述剂量包含为或约1.0x107、1.5x107、2.0x107、2.5x107、5x107、1.5x108、3x108、4.5x108、6x108、8x108或1.2x109个CD3+或CD4+/CD8+个总T细胞或CD3+CAR表达或CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量包含为或约2.5x107、5x107、1.5x108、3x108、4.5x108、6x108、8x108或1.2x109个CD3+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量包含为或约1.0x107、1.5x107、2.0x107、2.5x107、5x107、1.5x108、3x108、4.5x108、6x108、8x108或1.2x109个CD4+/CD8+CAR表达细胞。
在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.0x107个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.5x107个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约2.0x107个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约2.5x107个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约5x107个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.5x108个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约3x108个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约4.5x108个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约6x108个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约8x108个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.2x109个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约2.5x107个CD4+或CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约5x107个CD4+或CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.5x108个CD4+或CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约3x108个CD4+或CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约4.5x108个CD4+或CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约6x108个CD4+或CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约6.5x108个CD4+或CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约8x108个CD4+或CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.2x109个CD4+或CD8+CAR表达细胞。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的总量包含在为或约1x106与为或约2x109个之间的总CAR表达CD4+细胞和CAR表达CD8+细胞，例如在为或约2.5x107至为或约1.2x109个此类细胞的范围内，例如在为或约5x107至为或约4.5x108个此类细胞的范围内；如为或约1.0x107、为或约2.5x107、为或约2.0x107、为或约2.5x107、为或约5x107、为或约1.5x108、为或约3x108、为或约4.5x108、为或约6x108、为或约6.5x108、为或约8x108、或为或约1.2x109个总此类细胞，或任何两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量的CD8+ T细胞(包括在包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的剂量中)包含在为或约1x106与为或约2x109个总重组受体(例如，CAR)表达CD8+细胞，例如在为或约2.5x107至为或约1.2x109个此类细胞的范围内，例如在为或约5x107至为或约4.5x108个此类细胞的范围内；如为或约2.5x107、为或约5x107、为或约1.5x108、为或约3x108、为或约4.5x108、为或约6x108、为或约8x108、或为或约1.2x109个总此类细胞，或任何两个前述值之间的范围内。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞(例如，重组受体表达T细胞)是作为单剂量施用至受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，用于施用的工程化细胞或用于施用的工程化细胞的组合物展现出指示细胞健康或与细胞健康一致的特性。在一些实施方案中，为或约或至少或至少约70％、75％、80％、85％或90％的这种剂量的CAR+细胞展现出指示细胞健康或生物活性CAR细胞的一种或多种特性或表型，如不存在凋亡标记物的表达。
在特定实施方案中，所述表型是或包括凋亡的不存在和/或细胞正在经历凋亡过程的指征。凋亡是程序性细胞死亡的过程，其包括一系列刻板的形态和生化事件，所述事件导致特征性的细胞变化和死亡，包括起泡、细胞收缩、核分裂、染色质凝聚、染色体DNA片段化和整体mRNA衰变。在一些方面，凋亡的早期阶段可以通过某些半胱天冬酶(例如2、8、9和10)的激活来指示。在一些方面，凋亡的中期至晚期阶段的特征在于膜完整性的进一步丧失、染色质浓缩和DNA片段化，包括生物化学事件如半胱天冬酶3、6和7的激活。
在特定实施方案中，所述表型是与程序性细胞死亡相关的一种或多种因子的阴性表达，所述一种或多种因子例如已知启动凋亡的促凋亡因子，例如死亡受体途径的成员、线粒体(固有)途径的激活成员，如Bcl-2家族成员(例如Bax、Bad和Bid)以及半胱天冬酶。在某些实施方案中，所述表型是不存在指示物(例如膜联蛋白V分子或通过TUNEL染色)，其当与细胞组合物一起孵育或接触细胞组合物时优先结合经历凋亡的细胞。在一些实施方案中，所述表型是或包括指示细胞中的凋亡状态的一种或多种标记物的表达。在一些实施方案中，所述表型是缺乏半胱天冬酶(如半胱天冬酶3)的表达和/或激活。在一些方面，半胱天冬酶-3的激活指示凋亡的增加或恢复。在某些实施方案中，半胱天冬酶激活可以通过已知方法检测。在一些实施方案中，与激活的半胱天冬酶特异性结合(即，与切割过的多肽特异性结合)的抗体可以用于检测半胱天冬酶激活。在特定实施方案中，所述表型是或包括活性半胱天冬酶3-。在一些实施方案中，所述凋亡标记物是检测细胞中与凋亡相关的特征的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是膜联蛋白V分子。
在一些实施方案中，含有用于施用的工程化细胞的组合物包含一定数量或量的细胞，所述细胞展现出指示细胞健康或与细胞健康一致的表型。在一些任何实施方案中，在所述剂量的工程化T细胞中少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些任何实施方案中，在所述剂量的工程化T细胞中少于5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，将所述细胞、结合分子或重组受体作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预如另一种抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或以任何顺序依序施用。
在一些实施方案中，所述细胞、结合分子和/或重组受体是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依序共施用。在一些情境下，将所述细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之前施用所述细胞、结合分子和/或重组受体。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之后施用所述细胞、结合分子和/或重组受体。
在一些实施方案中，所述受试者可以在白细胞单采术之后和淋巴细胞耗尽化疗之前接受桥接疗法。在制造所提供的组合物或细胞期间，治疗医师可以决定例如为了疾病控制是否有必要进行桥接疗法。在一些实施方案中，桥接疗法不包括生物制剂，如抗体(例如，达雷木单抗)。在一些实施方案中，桥接疗法在开始淋巴细胞耗尽之前停止。在一些实施方案中，桥接疗法在淋巴细胞耗尽之前1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、45天或60天停止。
在将所述细胞施用至哺乳动物(例如人)后，工程化细胞群和/或抗体的生物活性在一些方面通过许多已知方法中的任何一种来测量。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，所述工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，还可以通过测定某些细胞因子(如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量所述细胞的生物活性。在一些方面，生物学活性是通过评估临床结局(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量。
在某些实施方案中，所述工程化细胞以任何数量的方式进行修饰，使得其治疗或预防功效增加。例如，在一些实施方案中，将由群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接与靶向部分缀合。将化合物(例如CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践在本领域是已知的。参见例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting,3(2):111(1995)和美国专利5,087,616。
B.组合疗法
还提供了组合疗法的方法，所述组合疗法包括BCMA结合重组受体(例如CAR)、表达重组受体(例如CAR)的工程化细胞、表达所述受体的多种工程化细胞和/或包含其的组合物的施用和用途，如治疗和预防用途。
在一些实施方案中，将本文所述的BCMA结合分子(例如，嵌合抗原受体)和/或表达所述分子(例如，重组受体)的工程化细胞作为组合治疗或组合疗法的一部分例如与一种或多种另外的治疗性干预同时、以任何顺序依序或间歇地施用。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗性干预包括例如抗体、工程化细胞、受体和/或药剂(如表达重组受体的细胞和/或细胞毒性剂或治疗剂(例如化学治疗剂))。在一些实施方案中，所述组合疗法包括施用一种或多种另外的药剂、疗法和/或治疗，例如本文所述的另外的药剂、疗法和/或治疗中的任何一种。在一些实施方案中，所述组合疗法包括施用用于治疗或疗法的一种或多种另外的药剂，如免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、腺苷途径或腺苷受体拮抗剂或激动剂和激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述组合治疗或组合疗法包括另外的治疗，如手术治疗、移植和/或放疗。还提供了组合治疗或组合疗法的方法，所述组合治疗或组合疗法包括本文所述的BCMA结合重组受体(例如，CAR)、细胞和/或组合物以及一种或多种另外的治疗性干预。
在一些实施方案中，用于组合治疗或组合疗法的另外的药剂增强、加强和/或促进结合分子、重组受体、细胞和/或组合物的治疗作用的功效和/或安全性。在一些实施方案中，所述另外的药剂增强或改善所施用的细胞(例如表达结合分子或重组受体的细胞)的功效、存活或持久性。在一些实施方案中，所述另外的药剂选自蛋白磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫调节剂或降低调节性T(Treg)细胞的水平或活性的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂通过减少或改善所施用的结合分子、重组受体、细胞和/或组合物的不良反应而增强安全性。在一些实施方案中，所述另外的药剂可以治疗同一疾病、病症或共病(comorbidity)。在一些实施方案中，所述另外的药剂可以改善、减少或消除与重组受体、细胞和/或组合物(例如CAR表达细胞)的施用相关的一种或多种毒性、不良反应或副作用。
在一些实施方案中，疼痛管理药物(如对乙酰氨基酚)或抗组胺药(如苯海拉明)可以在施用本文所提供的重组受体、工程化T细胞或工程化T细胞的组合物或剂量之前、期间或之后施用，以改善或减少或消除与治疗相关的次要副作用。在一些实例中，可以施用红细胞和血小板输血和/或集落刺激因子，以减少或消除与重组受体、细胞和/或组合物(例如CAR表达细胞)的施用相关的一种或多种毒性、不良作用或副作用。在一些实施方案中，可以施用预防性或经验性抗感染剂(例如，用于肺孢子虫性肺炎[PCP]预防的甲氧苄啶/新诺明、广谱抗生素、抗真菌剂或用于发热性嗜中性粒细胞减少症的抗病毒剂)来治疗由治疗产生的副作用。在一些例子中，必要时，可以提供预防以治疗因治疗而发生的淋巴细胞减少症和/或嗜中性粒细胞减少症。
在一些实施方案中，所述另外的疗法、治疗或药剂包括化疗、放疗、手术、移植、过继细胞疗法、抗体、细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心药、免疫刺激剂、免疫抑制剂、免疫检查点抑制剂、抗生素、血管发生抑制剂、代谢调节剂或其他治疗剂或其任何组合。在一些实施方案中，所述另外的药剂是蛋白质、肽、核酸、小分子药剂、细胞、毒素、脂质、碳水化合物或其组合，或任何其他类型的治疗剂，例如辐射。在一些实施方案中，所述另外的疗法、药剂或治疗包括手术、化疗、放疗、移植、施用表达重组受体(例如CAR)的细胞、激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂、mTOR途径抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗体、免疫清除剂、抗体和/或其抗原结合片段、抗体缀合物、其他抗体疗法、细胞毒素、类固醇、细胞因子、肽疫苗、激素疗法、抗代谢物、代谢调节剂、抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶或p70S6激酶FK506或抑制p70S6激酶的药物、烷化剂、蒽环类、长春花生物碱、蛋白酶体抑制剂、GITR激动剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、溶瘤病毒和/或其他类型的免疫疗法。在一些实施方案中，所述另外的药剂或治疗是骨髓移植、使用化疗剂(如氟达拉滨)的T细胞清除疗法、外线束放疗(XRT)、环磷酰胺和/或抗体疗法。
在一些实施方案中，将所述细胞、BCMA结合重组受体和/或组合物(例如表达CAR的细胞)与其他工程化细胞(例如其他表达CAR的细胞)组合施用。在一些实施方案中，所述另外的药剂是激酶抑制剂，例如，布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)抑制剂，例如，依鲁替尼。在一些实施方案中，所述另外的药剂是腺苷途径或腺苷受体拮抗剂或激动剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是免疫调节剂，如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。在一些实施方案中，所述另外的药剂是γ分泌酶抑制剂，如抑制或降低细胞(如肿瘤/癌症细胞)上γ分泌酶的靶标(例如BCMA)的膜内切割的γ分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的疗法、药剂或治疗是细胞毒性剂或化学治疗剂、生物疗法(例如，抗体，例如，单克隆抗体，或细胞疗法)或抑制剂(例如，激酶抑制剂)。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是化学治疗剂。示例性化学治疗剂包括蒽环类(例如多柔比星，如脂质体多柔比星)；长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)；烷化剂(例如环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)；免疫细胞抗体(例如阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)；抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂如氟达拉滨)；TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂；蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)；免疫调节剂，如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺)。
在一些实施方案中，所述另外的疗法或治疗是细胞疗法，例如过继细胞疗法。在一些实施方案中，所述另外的疗法包括施用工程化细胞，例如另外的CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述另外的工程化细胞是表达CAR的细胞，所述表达CAR的细胞表达与本文提供的工程化细胞(例如表达抗BCMA CAR的细胞)相同或不同的重组受体。在一些实施方案中，在所述另外的工程化细胞上表达的重组受体(例如CAR)识别不同的抗原和/或表位。在一些实施方案中，在所述另外的工程化细胞上表达的重组受体(例如CAR)与本文所述的重组受体识别相同抗原(例如BCMA)的不同表位。在一些实施方案中，在另外的工程化细胞上表达的重组受体(例如CAR)识别不同的抗原，例如不同的肿瘤抗原或抗原的组合。例如，在一些实施方案中，在所述另外的工程化细胞上表达的重组受体(例如CAR)靶向表达早期谱系标记物的癌细胞(例如癌干细胞)，而其他CAR表达细胞靶向表达晚期谱系标记物的癌细胞。在此类实施方案中，在施用(例如输注)本文所述的CAR表达细胞之前、与其并行或之后施用所述另外的工程化细胞。在一些实施方案中，所述另外的工程化细胞表达同种异体CAR。
在一些实施方案中，一种或多种CAR分子的构型包含一个初级细胞内信号传导结构域和两个或更多个(例如2、3、4或5或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述一种或多种CAR分子可以具有相同或不同的初级细胞内信号传导结构域、相同或不同的共刺激信号传导结构域、或相同数量或不同数量的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述一种或多种CAR分子可以被配置为分离的CAR，其中一种CAR分子包含抗原结合结构域和共刺激结构域(例如4-1BB)，而另一种CAR分子包含抗原结合结构域和初级细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是被工程化以表达一种或多种抗BCMA结合分子的细胞和/或被工程化以表达靶向不同抗原的另外的结合分子(例如重组受体，例如CAR)的细胞中的任一种。在一些实施方案中，所述另外的药剂包括本文(例如在第I.C和III.C节中)所述的细胞中的任何一种或多种细胞。在一些实施方案中，所述另外的药剂是被工程化以表达靶向不同表位和/或抗原(例如与疾病或病症相关的不同抗原)的重组受体(例如CAR)的细胞。在一些实施方案中，所述另外的药剂是被工程化以表达靶向多发性骨髓瘤中表达的第二或另外的抗原(例如GPRC5D、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和/或FcRH5)的重组受体(例如CAR)的细胞。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是免疫调节剂。在一些实施方案中，所述组合疗法包括可以刺激、放大和/或以其他方式增强抗肿瘤免疫应答(例如，来自所施用工程化细胞的抗肿瘤免疫应答)的免疫调节剂，如通过抑制免疫抑制信号传导或增强免疫刺激信号传导。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是肽、蛋白质或是小分子。在一些实施方案中，所述蛋白质可以是融合蛋白或重组蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节剂结合至免疫靶标，如在免疫细胞(如T细胞、B细胞或抗原呈递细胞)上表达的细胞表面受体。例如，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体或抗原结合抗体片段、融合蛋白、小分子或多肽。在一些实施方案中，所述重组受体、细胞和/或组合物是与作为抗体或其抗原结合片段(如单克隆抗体)的另外的药剂组合施用。
在一些实施方案中，所述免疫调节剂阻断、抑制或抵消免疫检查点途径的组分。免疫系统具有参与维持自身耐受性和用于调节免疫应答的多个抑制途径。肿瘤可以使用某些免疫检查点途径作为免疫抗性的主要机制，特别是针对对肿瘤抗原具有特异性的T细胞(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer 12:252-264)，例如工程化细胞，如CAR表达细胞。因为许多此类免疫检查点是通过配体-受体相互作用开始的，所以它们可以容易地被针对配体和/或其受体的抗体阻断。
因此，用阻断免疫检查点途径的拮抗性分子(如小分子、核酸抑制剂(例如RNAi)或抗体分子)的疗法正在成为针对癌症和其他疾病的免疫疗法的有前途的途径。与大多数抗癌剂相反，检查点抑制剂不一定直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体，以增强免疫系统的内源性抗肿瘤活性。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调节T细胞激活或功能。这些蛋白质负责T细胞应答的共刺激或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调节并维持自身耐受性和生理免疫应答的持续时间和幅度。在一些实施方案中，可以向受试者施用另外的药剂，所述另外的药剂可以增强或加强针对疾病或病症(例如癌症，如本文所述的任何一种)的免疫应答，例如由本文所提供的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物所产生的免疫应答。
免疫检查点抑制剂包括以统计学上显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制途径的任何药剂。此类抑制剂可以包括小分子抑制剂或者可以包括与免疫检查点受体、配体结合并阻断或抑制免疫检查点受体、配体和/或受体-配体相互作用的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，特定受体的调节、增强和/或刺激可以胜过免疫检查点途径组分。可以被靶向用于阻断、抑制、调节、增强和/或刺激的示例性免疫检查点分子包括但不限于PD-1(CD279)、PD-L1(CD274、B7-H1)、PDL2(CD273、B7-DC)、CTLA-4、LAG-3(CD223)、TIM-3、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、GITR(TNFRSF18、AITR)、CD40、OX40(CD134、TNFRSF4)、CXCR2、肿瘤相关抗原(TAA)、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于分子的CD2家族并且在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和转化生长因子受体(TGFR；例如，TGFRβ)。免疫检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段或其他结合蛋白，其结合至并阻断或抑制和/或增强或刺激一种或多种任何所述分子的活性。
示例性免疫检查点抑制剂包括曲美目单抗(CTLA-4阻断抗体，也称为替西木单抗、CP-675,206)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、纳武单抗(抗PD-1抗体)、CT-011(抗PD-1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PD-L1抗体)、BMS-936559(抗PD-L1抗体)、MPLDL3280A(抗PD-L1抗体)、MSB0010718C(抗PD-L1抗体)和伊匹单抗(抗CTLA-4抗体，也称为
MDX-010和MDX-101)。示例性的免疫调节抗体包括但不限于达珠单抗(Daclizumab)(Zenapax)、贝伐单抗(Bevacizumab)
巴利昔单抗(Basiliximab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、纳武单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、MPDL3280A、匹地利珠单抗(Pidilizumab)(CT-011)、MK-3475、BMS-936559、MPDL3280A(阿特珠单抗(Atezolizumab))、曲美目单抗、IMP321、BMS-986016、LAG525、乌瑞鲁单抗(urelumab)、PF-05082566、TRX518、MK-4166、达西珠单抗(dacetuzumab)(SGN-40)、鲁卡木单抗(lucatumumab)(HCD122)、SEA-CD40、CP-870、CP-893、MEDI6469、MEDI6383、MOXR0916、AMP-224、MSB0010718C(阿维鲁单抗(Avelumab))、MEDI4736、PDR001、rHIgM12B7、乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)、BKT140、伐立鲁单抗(Varlilumab)(CDX-1127)、ARGX-110、MGA271、利瑞鲁单抗(lirilumab)(BMS-986015、IPH2101)、IPH2201、ARGX-115、艾马珠单抗(Emactuzumab)、CC-90002和MNRP1685A或其抗体结合片段。其他示例性免疫调节剂包括例如阿夫土珠单抗(afutuzumab)(可以从
获得)；培非格司亭(pegfilgrastim)
来那度胺(CC-5013，
)；沙利度胺(thalidomide)
actimid(CC4047)；和IRX-2(人细胞因子的混合物，包括白细胞介素1、白细胞介素2和干扰素γ，CAS 951209-71-5，可以从IRX Therapeutics获得)。
程序性细胞死亡1(PD-1)是在B细胞、NK细胞和T细胞中表达的免疫检查点蛋白(Shinohara等人,1995,Genomics 23:704-6；Blank等人,2007,Cancer ImmunolImmunother 56:739-45；Finger等人,1997,Gene197:177-87；Pardoll(2012)NatureReviews Cancer 12:252-264)。PD-1的主要作用是在炎症过程中限制外周组织中T细胞的活性以响应感染，以及限制自身免疫。在激活的T细胞中诱导PD-1表达，并且PD-1与其内源性配体之一的结合通过抑制刺激性激酶起到抑制T细胞激活的作用。PD-1还起到抑制TCR“停止信号”的作用。PD-1在Treg细胞上高度表达，并且可以在配体存在下增加所述Treg细胞的增殖(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer 12:252-264)。抗PD 1抗体已被用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤和肾细胞癌(Topalian等人,2012,N Engl J Med 366:2443--54；Lipson等人,2013,Clin Cancer Res19:462--8；Berger等人,2008,Clin Cancer Res 14:3044-51；Gildener-Leapman等人,2013,Oral Oncol 49:1089-96；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol5:278-85)。示例性抗PD-1抗体包括纳武单抗(BMS的Opdivo)、派姆单抗(Merck的Keytruda)、匹利珠单抗(Cure Tech的CT-011)、lambrolizumab(Merck的MK-3475)和AMP-224(Merck)，纳武单抗(也称为Opdivo，BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是特异性地阻断PD-1的完全人IgG4单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)和特异性地结合PD-1的其他人单克隆抗体描述于US 8,008,449和WO 2006/121168。匹地利珠单抗(CT-011；CureTech)是与PD-1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体描述于WO 2009/101611中。派姆单抗(先前称为兰姆利珠单抗，也称为Keytruda，MK03475；Merck)是与PD-1结合的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体描述于US 8,354,509和WO 2009/114335。其他抗PD-1抗体尤其包括AMP 514(Amplimmune)，例如，US 8,609,089、US 2010028330、US 20120114649和/或US20150210769中描述的抗PD-1抗体。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，描述于WO2010/027827和WO2011/066342中)是阻断PD-1与B7-H1之间的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。
PD-L1(也称为CD274和B7-H1)和PD-L2(也称为CD273和B7-DC)是PD-1的配体，发现于激活的T细胞、B细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和一些类型的肿瘤细胞上。抗肿瘤疗法已集中于抗PD-L1抗体。PD-1与PD-L1的复合物抑制CD8+ T细胞的增殖并降低免疫应答(Topalian等人,2012,NEngl J Med 366:2443-54；Brahmer等人,2012,N Eng J Med 366:2455-65)。抗PD-L1抗体已被用于治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和血液恶性肿瘤(Brahmer等人,2012,N Eng J Med 366:2455-65；Ott等人,2013,Clin Cancer Res 19:5300-9；Radvanyi等人,2013,Clin Cancer Res 19:5541；Menzies&Long,2013,Ther Adv Med Oncol5:278-85；Berger等人,2008,Clin Cancer Res14:13044-51)。示例性抗PD-L1抗体包括MDX-1105(Medarex)、MEDI4736(Medimmune)、MPDL3280A(Genentech)、BMS-935559(Bristol-Myers Squibb)和MSB0010718C。MEDI4736(Medimmune)是结合至PD-L1并抑制所述配体与PD-1的相互作用的人单克隆抗体。MDPL3280A(Genentech/Roche)是结合至PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和针对PD-L1的其他人单克隆抗体描述于美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906中。其他抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(参见WO 2010/077634)和MDX-1105(也称为BMS-936559，以及例如描述于WO 2007/005874中的抗PD-L1结合剂)。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)也称为CD152，是功能为调节T细胞激活的一种共抑制分子。CTLA-4是仅在T细胞上表达的免疫球蛋白超家族的成员。CTLA-4起到抑制T细胞激活的作用，并且据报道其抑制辅助T细胞活性并增强调节性T细胞免疫抑制活性。尽管CTLA-4的准确作用机制仍在研究之中，但已经提出其通过在与CD80和CD86结合中与CD28竞争而胜出以及将抑制剂信号主动递送至T细胞来抑制T细胞激活(Pardoll(2012)NatureReviews Cancer 12:252-264)。抗CTLA-4抗体已在临床试验中用于治疗黑色素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(Robert&Ghiringhelli,2009,Oncologist 14:848-61；Ott等人,2013,Clin Cancer Res19:5300；Weber,2007,Oncologist 12:864-72；Wada等人,2013,J Transl Med11:89)。抗CTLA-4的重要特征是抗肿瘤作用的动力学，其中在生理反应所需的初始治疗后迟滞期长达6个月。在一些情况下，在治疗开始后，在观察到缩小之前，肿瘤的大小可能实际上增加(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer12:252-264)。示例性抗CTLA-4抗体包括伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)和曲美目单抗(Pfizer)。伊匹单抗最近获得FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤(Wada等人,2013,J Transl Med 11:89)。
淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)也称为CD223，是另一种免疫检查点蛋白。LAG-3与对淋巴细胞活性的抑制相关，并且在一些情况下与淋巴细胞无反应性的诱导相关。LAG-3在免疫系统中的各种细胞上表达，包括B细胞、NK细胞和树突细胞。LAG-3是MHC II类受体的天然配体，所述MHC II类受体在黑色素瘤浸润的T细胞(包括被赋予有效免疫抑制活性的那些T细胞)上大量表达。示例性抗LAG-3抗体包括BMS-986016(Bristol-Myers Squib)，其是靶向LAG-3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗剂LAG-3抗体，并且IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是耗尽的LAG-3抗体。其他LAG-3抑制剂包括IMP321(Immutep)，其是LAG-3的可溶部分的重组融合蛋白；和结合MHC II类分子并激活抗原呈递细胞(APC)的Ig。其他抗体描述于例如WO 2010/019570和US 2015/0259420中。
最初在激活的Th1细胞上鉴定的T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3(TIM-3)已被证明是免疫应答的负调节物。TIM-3的阻断促进T细胞介导的抗肿瘤免疫，并且在一系列小鼠肿瘤模型中具有抗肿瘤活性。TIM-3阻断与其他免疫治疗剂(如TSR-042、抗CD137抗体和其他)的组合在增加抗肿瘤作用方面可以是加和的或协同的。TIM-3表达与许多不同的肿瘤类型(包括黑色素瘤、NSCLC和肾癌)相关，另外，肿瘤内TIM-3的表达已经被证明与跨越一系列肿瘤类型(包括NSCLC、宫颈癌和胃癌)的不良预后相关。TIM-3的阻断也有利于提高对许多慢性病毒性疾病的免疫。TIM-3也已被证明与许多配体(包括半乳糖凝集素-9、磷脂酰丝氨酸和HMGB1)相互作用，尽管目前尚不清楚这些配体中有哪些(如果有的话)是与抗肿瘤反应的调节有关。在一些实施方案中，靶向TIM-3的抗体、抗体片段、小分子或肽抑制剂可以与TIM-3的IgV结构域结合以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM-3的示例性抗体和肽描述于US 2015/0218274、WO 2013/006490和US2010/0247521中。其他抗TIM-3抗体包括RMT3-23的人源化形式(Ngiow等人,2011,Cancer Res,71:3540-3551)和克隆8B.2C12(Monney等人,2002,Nature,415:536-541)。抑制TIM-3和PD-1的双特异性抗体描述于US2013/0156774。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是CEACAM抑制剂(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一些实施方案中，CEACAM抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM-1抗体描述于WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251和WO 2014/022332中，例如，单克隆抗体34B1、26H7和5F4；或其重组形式，如在例如US 2004/0047858、US 7,132,255和WO 99/052552中所述。在一些实施方案中，所述抗CEACAM抗体与CEACAM-5结合，如在例如Zheng等人PLoS One.(2011)6(6):e21146中所述；或与CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应，如在例如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所述。
4-1BB也称为CD137，是属于TNFR超家族的跨膜糖蛋白。4-1BB受体存在于激活的T细胞和B细胞和单核细胞上。示例性抗4-1BB抗体是乌瑞鲁单抗(BMS-663513)，其具有潜在的免疫刺激和抗肿瘤活性。
肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)也称为OX40和CD134，是TNFR超家族的另一个成员。OX40在静止幼稚T细胞上并非组成型表达，并且起次级共刺激免疫检查点分子的作用。示例性抗OX40抗体是MEDI6469和MOXR0916(RG7888，Genentech)。
在一些实施方案中，所述另外的药剂包括减少调节性T细胞(Treg)群的分子。减小(例如，耗尽)Treg细胞数量的方法是本领域中已知的，并且包括例如CD25耗尽、环磷酰胺施用和调节糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)功能。GITR是TNFR超家族的成员，其在激活的T细胞上被上调，从而增强免疫系统。在单采术之前或在施用工程化细胞(例如，CAR表达细胞)之前减小受试者中Treg细胞的数量可以减小肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量并降低所述受试者的复发风险。在一些实施方案中，所述另外的药剂包括靶向GITR和/或调节GITR功能的分子，如耗尽调节性T细胞(Treg)的GITR激动剂和/或GITR抗体。在一些实施方案中，所述另外的药剂包括环磷酰胺。在一些实施方案中，所述GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如GITR激动剂和/或耗尽Treg的GITR抗体)是在工程化细胞(例如CAR表达细胞)之前施用。例如，在一些实施方案中，所述GITR激动剂可以在细胞的单采术之前施用。在一些实施方案中，在施用(例如，输注或再输注)工程化细胞(例如，CAR表达细胞)之前或在细胞的单采术之前，将环磷酰胺施用受试者。在一些实施方案中，在施用(例如，输注或再输注)工程化细胞(例如，CAR表达细胞)之前或在细胞的单采术之前，将环磷酰胺和抗GITR抗体施用受试者。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是GITR激动剂。示例性GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，如例如美国专利号6,111,090、欧洲专利号090505B 1、美国专利号8,586,023、PCT公开号WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白；或例如美国专利号7,025,962、欧洲专利号1947183B 1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号EP 1866339、PCT公开号WO 2011/028683、PCT公开号WO 2013/039954、PCT公开号WO 2005/007190、PCT公开号WO2007/133822、PCT公开号WO2005/055808、PCT公开号WO 99/40196、PCT公开号WO 2001/03720、PCT公开号WO 99/20758、PCT公开号WO 2006/083289、PCT公开号WO 2005/115451、美国专利号7,618,632和PCT公开号WO 2011/051726中描述的抗GITR抗体。示例性抗GITR抗体是TRX518。
在一些实施方案中，所述另外的药剂增强所施用细胞(例如CAR表达细胞)的肿瘤浸润或迁移。例如，在一些实施方案中，所述另外的药剂刺激CD40，如CD40L，例如，重组人CD40L。分化簇40(CD40)也是TNFR超家族的成员。CD40是在抗原呈递细胞上发现的共刺激蛋白，并且介导众多种免疫应答和炎性应答。CD40还在一些恶性肿瘤上表达，其中CD40促进增殖。示例性抗CD40抗体是达西珠单抗(SGN-40)、鲁卡木单抗(Novartis，拮抗剂)、SEA-CD40(Seattle Genetics)和CP-870,893。在一些实施方案中，增强肿瘤浸润的所述另外的药剂包括酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼、乙酰肝素酶和/或趋化因子受体(如CCR2、CCR4和CCR7)。
在一些实施方案中，所述另外的药剂包括沙利度胺药物或其类似物和/或其衍生物，如来那度胺、泊马度胺或阿普斯特。参见例如Bertilaccio等人,Blood(2013)122:4171；Otahal等人,Oncoimmunology(2016)5(4):e1115940；Fecteau等人,Blood(2014)124(10):1637-1644；和Kuramitsu等人,Cancer Gene Therapy(2015)22:487-495。来那度胺((RS)-3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮；也称为Revlimid)是沙利度胺的合成衍生物，并且具有多种免疫调节作用，包括加强T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间的免疫突触形成。例如，在一些情况下，来那度胺调节T细胞应答并导致增加CD4+和CD8+T细胞中白细胞介素(IL)-2的产生，诱导T辅助(Th)应答从Th2转变为Th1，抑制调节性T细胞子集(Treg)的扩增，以及改进滤泡性淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病(CLL)中免疫突触的功能(Otahal等人,Oncoimmunology(2016)5(4):e1115940)。来那度胺在患有多发性骨髓瘤(MM)的患者中也具有直接的肿瘤杀伤活性，并且通过影响支持细胞(如在淋巴组织的微环境中发现的呵护样(nurse-like)细胞)直接和间接地调节CLL肿瘤细胞的存活。来那度胺还可以响应于经由CD3连接激活T细胞或树突细胞介导的激活而增强T细胞增殖和干扰素-γ产生。来那度胺还可以诱导恶性B细胞表达更高水平的免疫刺激分子，如CD80、CD86、HLA-DR、CD95和CD40(Fecteau等人,Blood(2014)124(10):1637-1644)。在一些实施方案中，以每天约1mg至约20mg，例如每天约1mg至约10mg、约2.5mg至约7.5mg、约5mg至约15mg，如每天约5mg、10mg、15mg或20mg的剂量来施用来那度胺。在一些实施方案中，以约10μg/kg至5mg/kg，例如约100μg/kg至约2mg/kg、约200μg/kg至约1mg/kg、约400μg/kg至约600μg/kg，如约500μg/kg的剂量施用来那度胺。在一些实施方案中，以约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)的剂量，例如静脉内施用利妥昔单抗。在一些实施方案中，以低剂量施用来那度胺。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是B细胞抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是一种或多种B细胞抑制剂，所述一种或多种B细胞抑制剂选自CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、CD79a、CD79b、CD179b、FLT-3或ROR1或其组合的抑制剂。在一些实施方案中，所述B细胞抑制剂是抗体(例如，单特异性或双特异性抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述另外的药剂是表达靶向B细胞靶标(例如，CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、CD79a、CD79b、CD179b、FLT-3或ROR1)的重组受体的工程化细胞。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是CD20抑制剂，例如，抗CD20抗体(例如，抗CD20单特异性或双特异性抗体)或其片段。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗(也称为GA101或RO5072759)、维妥珠单抗、奥比妥珠单抗、TRU-015(Trubion Phar maceuticals)、奥卡妥珠单抗(也称为AME-133v或奥卡妥珠单抗)和Pro131921(Genentech)。参见例如Lim等人Haematologica.(2010)95(1):135-43。在一些实施方案中，抗CD20抗体包含利妥昔单抗。利妥昔单抗是嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，其与CD20结合并引起CD20表达细胞的细胞溶解。在一些实施方案中，所述另外的药剂包括利妥昔单抗。在一些实施方案中，所述CD20抑制剂是小分子。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是CD22抑制剂，例如，抗CD22抗体(例如，抗CD22单特异性或双特异性抗体)或其片段。示例性抗CD22抗体包括依帕珠单抗和RFB4。在一些实施方案中，所述CD22抑制剂是小分子。在一些实施方案中，所述抗体是单特异性抗体，任选地与诸如化学治疗剂的第二药剂缀合。例如，在一些实施方案中，所述抗体是抗CD22单克隆抗体-MMAE缀合物(例如，DCDT2980S)。在一些实施方案中，所述抗体是抗CD22抗体的scFv，例如，抗体RFB4的scFv。在一些实施方案中，所述scFv与假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素-A(例如，BL22)的全部或片段融合。在一些实施方案中，所述scFv与假单胞菌属外毒素-A(例如，moxetumomab pasudotox)的全部或片段(例如，38kDa片段)融合。在一些实施方案中，所述抗CD22抗体是抗CD19/CD22双特异性抗体，任选地与毒素缀合。例如，在一些实施方案中，所述抗CD22抗体包含抗CD19/CD22双特异性部分(例如，两个scFv配体，识别人CD19和CD22)，其任选地连接至白喉毒素(DT)的全部或一部分，例如白喉毒素(DT)的前389个氨基酸(DT390)，例如配体引导的毒素如DT2219ARL。在一些实施方案中，所述双特异性部分(例如抗CD19/抗CD22)连接至毒素如脱糖基化蓖麻毒素A链(例如，Combotox)。
在一些实施方案中，所述免疫调节剂是细胞因子。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是细胞因子或者是诱导肿瘤微环境中的细胞因子表达增加的药剂。细胞因子具有与T细胞扩增、分化、存活和稳态有关的重要功能。可以向接受本文提供的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物的受试者施用的细胞因子包括以下中的一种或多种：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18和IL-21。在一些实施方案中，所施用的细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21或其组合。在一些实施方案中，将细胞因子施用至对工程化细胞(例如，CAR表达细胞)的施用具有次最佳反应的受试者，改善所施用细胞(例如CAR表达细胞)的功效和/或抗肿瘤活性。
“细胞因子”意指由一个细胞群释放的作为细胞间介体作用于另一种细胞的蛋白质的通用术语。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。所述细胞因子包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体化激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；泌乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。例如，所述免疫调节剂是细胞因子，并且细胞因子是IL-4、TNF-α、GM-CSF或IL-2。
在一些实施方案中，所述另外的药剂包括白细胞介素-15(IL-15)多肽、白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽、或其组合(例如hetIL-15(Admune Therapeutics，LLC))。hetIL-15是IL-15与IL-15Rα的异二聚体非共价复合物。hetIL-15描述于例如以下文献中：U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413和U.S.2011/0081311。在一些实施方案中，所述免疫调节剂可以含有一种或多种细胞因子。例如，所述白细胞介素可以包括白细胞-白细胞介素注射剂(Multikine)，其是天然细胞因子的组合。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是Toll样受体(TLR)激动剂、佐剂或细胞因子。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是改善或中和与细胞疗法相关的一种或多种毒性或副作用的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂选自类固醇(例如皮质类固醇)、TNFα抑制剂和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的例子是抗TNFα抗体分子，如英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和戈利木单抗。TNFα抑制剂的另一个例子是融合蛋白，如依那西普。TNFα的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱)和安非他酮。IL-6抑制剂的例子是抗IL-6抗体分子，如托珠单抗、萨瑞鲁单抗、伊西莫单抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301和FM101。在一些实施方案中，所述抗IL-6抗体分子是托珠单抗(tocilizumab)。在一些实施方案中，所述另外的药剂是IL-1R抑制剂，如阿那白滞素。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是腺苷水平和/或腺苷途径组分的调节剂。腺苷可以在体内起免疫调节剂的功能。例如，腺苷和非选择性地激活腺苷受体亚型的一些腺苷类似物降低炎性氧化产物的嗜中性粒细胞产生(Cronstein等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.451:291,1985；Roberts等人,Biochem.J.,227:669,1985；Schrier等人,J.Immunol.137:3284,1986；Cronstein等人,Clinical Immunol.Immunopath.42:76,1987)。在一些情况下，细胞外腺苷或腺苷类似物的浓度可以在特定环境(例如肿瘤微环境(TME))中增加。在一些情况下，腺苷或腺苷类似物信号传导取决于缺氧或在缺氧或其调节中所涉及的因子，例如缺氧诱导因子(HIF)。在一些实施方案中，腺苷信号传导的增加可以增加细胞内cAMP和cAMP依赖性蛋白激酶，从而导致抑制促炎性细胞因子产生，并且可以导致免疫抑制分子的合成和Treg的发展(Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605)。在一些实施方案中，另外的药剂可以降低或逆转腺苷、腺苷类似物和/或腺苷信号传导的免疫抑制效应。在一些实施方案中，所述另外的药剂可以减少或逆转缺氧驱动的A2-腺苷酸能T细胞免疫抑制。在一些实施方案中，所述另外的药剂选自腺苷受体的拮抗剂、细胞外腺苷降解剂、CD39/CD73胞外酶产生腺苷的抑制剂和缺氧-HIF-1α信号传导的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂。
通过细胞外腺苷的抑制剂(例如防止细胞外腺苷形成、降解细胞外腺苷、使细胞外腺苷失活和/或减少细胞外腺苷的药剂)和/或腺苷受体抑制剂(例如腺苷受体拮抗剂)可以增强免疫应答，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、树突细胞、T细胞和/或B细胞介导的应答。此外，Gs蛋白介导的cAMP依赖性细胞内途径的抑制剂和腺苷受体触发的Gi蛋白介导的细胞内途径的抑制剂也可以增加急性和慢性炎症。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂，例如腺苷受体A2a、A2b、A1和A3中的一种或多种的拮抗剂或激动剂。分别地，A1和A3抑制腺苷酸环化酶活性，并且A2a和A2b刺激腺苷酸环化酶活性。某些腺苷受体(如A2a、A2b和A3)可以在炎症期间抑制或降低免疫应答。因此，拮抗免疫抑制性腺苷受体可以扩大、加强或增强免疫应答，例如来自所施用细胞(例如，CAR表达T细胞)的免疫应答。在一些实施方案中，所述另外的药剂抑制细胞外腺苷的产生和腺苷通过腺苷受体触发的信号传导。例如，通过抑制或减少产生腺苷的局部组织缺氧；通过降解(或使其失活)所积累的细胞外腺苷；通过防止或减少免疫细胞上腺苷受体的表达；和/或通过抑制/拮抗腺苷配体通过腺苷受体的信号传导，可以增强免疫应答、局部组织炎症和靶向组织破坏的增强。
拮抗剂是作为与细胞受体结合而不引发生物学反应的药剂，倾向于消除另一种物质的作用的任何物质。在一些实施方案中，所述拮抗剂是化学化合物，其是腺苷受体(如A2a、A2b或A3受体)的拮抗剂。在一些实施方案中，所述拮抗剂是结合腺苷受体但是不触发Gi蛋白依赖性细胞内途径的肽或拟肽。示例性拮抗剂描述于以下文献中：美国专利号5,565,566、5,545,627、5,981,524、5,861,405、6,066,642、6,326,390、5,670,501、6,117,998、6,232,297、5,786,360、5,424,297、6,313,131、5,504,090和6,322,771。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是A2受体(A2R)拮抗剂，如A2a拮抗剂。示例性A2R拮抗剂包括KW6002(伊曲茶碱(istradefyline))、SCH58261、咖啡因、副黄嘌呤、3,7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)、8-(间氯苯乙烯基)咖啡因(CSC)、MSX-2、MSX-3、MSX-4、CGS-15943、ZM-241385、SCH-442416、瑞德南特(preladenant)、韦帕南特(vipadenant)(BII014)、V2006、ST-1535、SYN-115、PSB-1115、ZM241365、FSPTP和靶向A2R表达的抑制性核酸(例如，siRNA或shRNA)或靶向A2R的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述另外的药剂是描述于例如以下文献中的A2R拮抗剂：Ohta等人,Proc Natl Acad Sci U SA(2006)103:13132-13137；Jin等人,Cancer Res.(2010)70(6):2245-2255；Leone等人,Computational and Structural Biotechnology Journal(2015)13:265-272；Beavis等人,Proc Natl Acad Sci U S A(2013)110:14711-14716；和Pinna,A.,Expert OpinInvestig Drugs(2009)18:1619-1631；Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605；US 8,080,554；US 8,716,301；US 20140056922；WO2008/147482；US 8,883,500；US 20140377240；WO 02/055083；US 7,141,575；US 7,405,219；US 8,883,500；US 8,450,329和US 8,987,279。
在一些实施方案中，所述拮抗剂是特异性地结合编码腺苷受体的mRNA的反义分子、抑制性核酸分子(例如，小抑制性RNA(siRNA))或催化性核酸分子(例如，核酶)。在一些实施方案中，所述反义分子、抑制性核酸分子或催化性核酸分子结合编码A2a、A2b或A3的核酸。在一些实施方案中，反义分子、抑制核酸分子或催化核酸靶向腺苷受体下游的生化途径。例如，所述反义分子或催化核酸可以抑制Gs蛋白或Gi蛋白依赖性细胞内途径中涉及的酶。在一些实施方案中，所述另外的药剂包括腺苷受体(如A2a、A2b或A3)的显性阴性突变形式。
在一些实施方案中，抑制细胞外腺苷的所述另外的药剂包括使细胞外腺苷无功能(或降低这种功能)的药剂，例如修饰腺苷结构以抑制腺苷通过腺苷受体进行信号传导的能力的物质。在一些实施方案中，所述另外的药剂是细胞外产生腺苷或腺苷降解的酶，其修饰形式或其调节剂。例如，在一些实施方案中，所述另外的药剂是酶(例如，腺苷脱氨酶)或另一种催化分子，所述酶或另一种催化分子选择性地结合并破坏腺苷，从而消除或显著降低内源形成的腺苷通过腺苷受体进行信号传导并终止炎症的能力。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是腺苷脱氨酶(ADA)或其修饰形式，例如，重组ADA和/或聚乙二醇修饰的ADA(ADA-PEG)，其可以抑制细胞外腺苷的局部组织积累。ADA-PEG已用于治疗患有ADA SCID的患者(Hershfield(1995)Hum Mutat.5:107)。在一些实施方案中，抑制细胞外腺苷的药剂包括阻止或减少细胞外腺苷形成，和/或阻止或减少细胞外腺苷积累，从而消除或显著降低腺苷的免疫抑制作用的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂特异性地抑制参与对促炎性分子的合成和/或分泌进行调节的酶和蛋白质，所述另外的药剂包括核转录因子的调节剂。对腺苷受体表达、或Gs蛋白或Gi蛋白依赖性细胞内途径、或cAMP依赖性细胞内途径的抑制可以导致免疫应答的增加/增强。
在一些实施方案中，所述另外的药剂可以靶向生成或产生细胞外腺苷的胞外酶。在一些实施方案中，所述另外的药剂靶向共同作用于产生细胞外腺苷的CD39和CD73胞外酶。CD39(也称为外核苷三磷酸二磷酸水解酶)将细胞外ATP(或ADP)转化为5'AMP。随后，CD73(也称为5'核苷酸酶)将5'AMP转化为腺苷。CD39的活性可通过NDP激酶和腺苷酸激酶的作用逆转，而CD73的活性是不可逆的。CD39和CD73在肿瘤基质细胞(包括内皮细胞和Treg)上表达，并且也在许多癌细胞上表达。例如，在肿瘤微环境的低氧条件下，CD39和CD73在内皮细胞上的表达增加。肿瘤缺氧可能源于血液供应不足和肿瘤血管杂乱，从而影响氧气的输送(Carroll and Ashcroft(2005),Expert.Rev.Mol.Med.7(6):1-16)。缺氧也抑制将腺苷转化为AMP的腺苷酸激酶(AK)，从而导致非常高的细胞外腺苷浓度。因此，响应缺氧以高浓度释放腺苷，缺氧是在实体瘤中或实体瘤周围的肿瘤微环境(TME)中频繁出现的条件。在一些实施方案中，所述另外的药剂是抗CD39抗体或其抗原结合片段、抗CD73抗体或其抗原结合片段(例如MEDI9447或TY/23)、α-β-亚甲基-腺苷二磷酸(ADP)、ARL 67156、POM-3、IPH52中的一种或多种(参见例如Allard等人Clin Cancer Res(2013)19(20):5626-5635；Hausler等人,Am J Transl Res(2014)6(2):129-139；Zhang,B.,Cancer Res.(2010)70(16):6407-6411)。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是缺氧诱导因子1α(HIF-1α)信号传导的抑制剂。示例性HIF-1α抑制剂包括地高辛、吖啶黄素、瑟土因-7(sirtuin-7)和加特司匹(ganetespib)。
在一些实施方案中，所述另外的药剂包括蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂，例如，本文所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂。在一些实施方案中，所述蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本文所述的SHP-1抑制剂，例如，葡萄糖酸锑钠。在一些实施方案中，所述蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂，例如本文所述的SHP-2抑制剂。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是激酶抑制剂。激酶抑制剂(如CDK4激酶抑制剂、BTK激酶抑制剂、MNK激酶抑制剂或DGK激酶抑制剂)可以调节肿瘤细胞中存在的组成型活性的存活途径和/或调节免疫细胞的功能。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，例如依鲁替尼(ibrutinib)。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸酯3-激酶(PI3K)抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，CDK4/6抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)、雷帕霉素类似物、OSI-027。所述mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是MNK抑制剂或双重PI3K/mTOR抑制剂。在一些实施方案中，其他示例性激酶抑制剂包括AKT抑制剂哌立福辛(perifosine)、mTOR抑制剂坦罗莫司(temsirolimus)、Src激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)和福他替尼(fostamatinib)、JAK2抑制剂帕克替尼和鲁索替尼、PKCβ抑制剂恩扎妥林(enzastaurin)和苔藓抑素，以及AAK抑制剂阿立塞替(alisertib)。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一些实施方案中，所述BTK抑制剂不会降低或抑制白细胞介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮；也称为PCI-32765)。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，依鲁替尼(PCI-32765)，并且依鲁替尼是按以下剂量来施用：每天约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)持续一段时间，例如，每天施用持续21天周期，或每天施用持续28天周期。在一些实施方案中，施用依鲁替尼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。在一些实施方案中，所述BTK抑制剂是国际申请WO 2015/079417中描述的BTK抑制剂。
在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是PI3K抑制剂。PI3K是参与细胞周期调节和淋巴瘤存活的PI3K/Akt/mTOR途径的核心。示例性PI3K抑制剂包括艾代拉里司(idelalisib)(PI3Kδ抑制剂)。在一些实施方案中，所述另外的药剂是艾代拉利司和利妥昔单抗。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)的抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：坦罗莫司；利罗莫司(ridaforolimus)(也称为AP23573和MK8669)；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；simapimod；AZD8055；PF04691502；SF1126；和XL765。在一些实施方案中，所述另外的药剂是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)抑制剂，如威罗菲尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)和曲美替尼(trametinib)。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是调节促细胞凋亡或抗细胞凋亡蛋白的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂包括B细胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制剂(例如，维奈妥拉(venetoclax)，也称为ABT-199或GDC-0199；或ABT-737)。维奈托克是抑制抗细胞凋亡蛋白BCL-2的小分子(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基}-1-哌嗪基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)。调节促细胞凋亡或抗细胞凋亡蛋白的其他药剂包括BCL-2抑制剂ABT-737、那维妥拉(navitoclax)(ABT-263)；用于最大功效的Mcl-1siRNA或Mcl-1抑制剂类视色素N-(4-羟苯基)维甲酰胺(4-HPR)。在一些实施方案中，所述另外的药剂提供促细胞凋亡刺激，如重组肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，其可以通过与肿瘤细胞表面上的TRAIL死亡受体DR-4和DR-5结合激活细胞凋亡途径；或TRAIL-R2激动抗体。
在一些实施方案中，所述另外的药剂包括吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。IDO是一种催化氨基酸L-色氨酸降解为犬尿氨酸的酶。许多癌症过表达IDO，例如前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌和肺癌。浆细胞样树突细胞(pDC)、巨噬细胞和树突细胞(DC)可以表达IDO。在一些方面，L-色氨酸的减少(例如由IDO催化)通过诱导T细胞无反应性和凋亡而导致免疫抑制环境。因此，在一些方面，例如通过减少所施用的CAR表达细胞的抑制或死亡，IDO抑制剂可以增强本文所述的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物的功效。IDO的示例性抑制剂包括但不限于1-甲基色氨酸indoximod(New Link Genetics)(参见例如，临床试验标识号NCT01191216；NCT01792050)和INCB024360(Incyte Corp.)(参见例如，临床试验标识号NCT01604889；NCT01685255)。
在一些实施方案中，所述另外的药剂包括细胞毒性剂，例如，CPX-351(CelatorPharmaceuticals)、阿糖胞苷、道诺霉素、沃沙隆沙星(vosaroxin)(SunesisPharmaceuticals)、沙帕他滨(Cyclacel Pharmaceuticals)、伊达比星或米托蒽醌。在一些实施方案中，所述另外的药剂包括低甲基化剂，例如，DNA甲基转移酶抑制剂，例如，阿扎胞苷或地西他滨。
在另一个实施方案中，所述另外的疗法是移植，例如，同种异体干细胞移植。
在一些实施方案中，所述另外的疗法是淋巴细胞耗尽疗法。淋巴细胞耗尽化疗被认为可以改善重组受体表达细胞(如CAR T细胞)的植入和活性。在一些实施方案中，淋巴细胞耗尽化疗可以增强过继转移的肿瘤特异性T细胞，以通过稳态增殖在体内增殖(Grossman2004,Stachel 2004)。在一些实施方案中，化疗可以减少或消除CD4+CD25+调节性T细胞，其可以抑制肿瘤靶向过继转移的T细胞的功能(Turk 2004)。在一些实施方案中，过继性T细胞疗法之前的淋巴细胞耗尽化疗可以增强骨髓中基质细胞衍生因子1(SDF-1)的表达，通过SDF-1与T细胞表面上表达的CXCR-4的结合增强经修饰的T细胞归巢至原发肿瘤部位(Pinthus 2004)。在一些实施方案中，淋巴细胞耗尽化疗还可以减少受试者的肿瘤负荷并潜在地降低CRS的风险和严重程度。
在一些实施方案中，在例如施用工程化细胞(例如，CAR表达细胞)之前对受试者进行淋巴细胞耗尽。在一些实施方案中，所述淋巴细胞耗尽包括施用以下中的一种或多种：美法仑、环磷酰胺(Cytoxan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和/或氟达拉滨。在一些实施方案中，在工程化细胞(例如，CAR表达细胞)的施用(例如，输注)之前、与其并行或之后，向受试者施用淋巴细胞耗尽化疗。在一个例子中，在工程化细胞(例如，CAR表达细胞)的施用之前向受试者施用淋巴细胞耗尽化疗。在一些实施方案中，在施用工程化细胞之前1至10天，如在开始施用工程化细胞之前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，或在开始施用工程化细胞之前至少2天，如至少3、4、5、6或7天，施用所述淋巴细胞耗尽化疗。在一些实施方案中，在开始施用工程化细胞之前不超过7天，如之前不超过6、5、4、3或2天，向所述受试者施用预调理剂。可以根据临床或逻辑情况确定在淋巴细胞耗尽化疗后多少天施用工程化细胞。在一些例子中，可能由于受试者的健康(如由治疗医师确定的受试者的潜在器官功能)而实施对淋巴细胞耗尽化疗方案的剂量调整或其他改变。
在一些实施方案中，淋巴细胞耗尽化疗包括施用淋巴细胞耗尽剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。在一些实施方案中，以在或在约20mg/kg与100mg/kg受试者体重之间(如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间)的剂量向所述受试者施用环磷酰胺。在一些方面，向所述受试者施用约60mg/kg的环磷酰胺。在一些实施方案中，每天一次施用环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞耗尽剂包含环磷酰胺的情况下，向受试者以在或在约100mg/m2与500mg/m2受试者体表面积之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间，或250mg/m2与350mg/m2之间(包含端值)的剂量施用环磷酰胺。在一些情形中，向所述受试者施用约100mg/m2的环磷酰胺。在一些情形中，向所述受试者施用约150mg/m2的环磷酰胺。在一些情形中，向所述受试者施用约200mg/m2的环磷酰胺。在一些情形中，向所述受试者施用约250mg/m2的环磷酰胺。在一些情形中，向所述受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续2至4天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前，向受试者每天施用约300mg/m2受试者体表面积的环磷酰胺持续3天。在一些实施方案中，在开始所述细胞疗法之前，向受试者施用总计为或约300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、600mg/m2、700mg/m2、800mg/m2、900mg/m2、1000mg/m2、1200mg/m2，1500mg/m2、1800mg/m2、2000mg/m2、2500mg/m2、2700mg/m2、3000mg/m2、3300mg/m2、3600mg/m2、4000mg/m2或5000mg/m2的环磷酰胺，或任何前述值限定的范围内的环磷酰胺。
在一些实施方案中，当淋巴细胞耗尽剂包含氟达拉滨时，向所述受试者施用剂量在或在约1mg/m2与100mg/m2受试者体表面积之间、如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间、或24mg/m2与35mg/m2之间的氟达拉滨(包含端值)。在一些情形中，向受试者施用约10mg/m2的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用约15mg/m2的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用约20mg/m2的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用约25mg/m2的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天施用、每隔一天施用或每三天施用。在一些实施方案中，每天施用氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续2至4天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前，向受试者每天施用约30mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨持续3天。在一些实施方案中，在开始所述细胞疗法之前，向所述受试者施用总计为或约10mg/m2、20mg/m2、25mg/m2、30mg/m2、40mg/m2、50mg/m2、60mg/m2、70mg/m2、80mg/m2，90mg/m2、100mg/m2、120mg/m2、150mg/m2、180mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、270mg/m2、300mg/m2、330mg/m2、360mg/m2、400mg/m2或500mg/m2的环磷酰胺，或由任何前述值限定的范围内的环磷酰胺。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞耗尽剂包含单一药剂，如环磷酰胺或氟达拉滨。在一些实施方案中，向所述受试者仅施用环磷酰胺，而不施用氟达拉滨或其他淋巴细胞耗尽剂。在一些实施方案中，在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。在一些实施方案中，向所述受试者仅施用氟达拉滨，例如不施用环磷酰胺或其他淋巴细胞耗尽剂。在一些实施方案中，在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞耗尽剂包含药剂组合，如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，所述药剂组合可以包括任何剂量或施用时间表(如上文所述的那些)的环磷酰胺，以及任何剂量或施用时间表(如上文所述的那些)的氟达拉滨。例如，在一些方面，向受试者每天施用为或约30mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨以及每天施用为或约300mg/m2受试者体表面积的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，可以在淋巴细胞耗尽化疗之前给予除地塞米松或其他类固醇外的止吐疗法。在一些实施方案中，美司钠可以用于具有出血性膀胱炎病史的受试者。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是溶瘤病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒能够在癌细胞中选择性地复制并触发所述癌细胞的死亡或减慢所述癌细胞的生长。在一些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞无影响或影响极小。溶瘤病毒包括但不限于溶瘤腺病毒、溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤细小病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤辛德毕斯病毒(oncolytic Sinbis virus)、溶瘤流感病毒或溶瘤RNA病毒(例如，溶瘤呼吸弧病毒、溶瘤新城疫病毒(NDV)、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水疱性口炎病毒(VSV))。
其他示例性组合疗法、治疗和/或药剂包括抗过敏剂、止吐药、镇痛药和辅助疗法。在一些实施方案中，所述另外的药剂包括细胞保护剂，如神经保护剂、自由基清除剂、心脏保护剂、蒽环类外渗中和剂和营养素。
在一些实施方案中，用作另外的药剂的抗体与本文所述的治疗剂缀合或以其他方式结合，所述治疗剂是例如化学治疗剂(例如，环磷酰胺、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰化酶抑制剂、脱甲基剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷化剂、抗微管剂或抗有丝分裂剂)、抗过敏剂、止吐剂(anti-nausea agent)(或止吐药(anti-emetic))、止痛药或细胞保护剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中，所述另外的药剂可以在DNA、RNA或蛋白质水平上调节、抑制或刺激特定因子，以增强或加强本文提供的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物的功效。在一些实施方案中，所述另外的药剂可以在所施用的细胞(例如被工程化以表达重组受体(例如CAR)的细胞)内在核酸(例如DNA或RNA)水平上调节因子。在一些实施方案中，抑制性核酸(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)可以用于抑制工程化细胞(例如CAR表达细胞)中抑制性分子的表达。在一些实施方案中，所述抑制剂是shRNA。在一些实施方案中，所述抑制性分子在工程化细胞(例如CAR表达细胞)内被抑制。在一些实施方案中，编码抑制调节(“modulate”或“regulate”)(例如抑制)T细胞功能的分子的表达的dsRNA分子的核酸分子可操作地连接至启动子(例如源自HI或U6的启动子)，使得抑制所述抑制性分子的表达的dsRNA分子在工程化细胞(例如CAR表达细胞)内表达。参见例如Brummelkamp TR,等人(2002)Science 296:550-553；Miyagishi M,等人(2002)Nat.Biotechnol.19:497-500。
在一些实施方案中，所述另外的药剂(如本文所述的任何免疫检查点抑制剂)能够破坏编码抑制性分子的基因。在一些实施方案中，破坏是通过缺失(例如整个基因、外显子或区域的缺失)，和/或用外源序列替代，和/或通过在基因内通常在基因的外显子内的突变(例如移码或错义突变)。在一些实施方案中，所述破坏导致提前终止密码子并入基因中，使得抑制性分子不表达或不以能够在细胞表面上表达和/或能够介导细胞信号传导的形式表达。所述破坏通常在DNA水平上进行。所述破坏通常是永久性的、不可逆的或非暂时性的。
在一些方面，所述破坏通过基因编辑如使用在被靶向进行破坏的区域处与基因特异性地结合或杂交的DNA结合蛋白或DNA结合核酸进行。在一些方面，所述蛋白质或核酸与核酸酶偶联或复合，例如以嵌合或融合蛋白的形式。例如，在一些实施方案中，使用对所破坏的基因具有特异性的、包含DNA靶向蛋白质和核酸酶的融合物(如锌指核酸酶(ZFN)或TAL效应子核酸酶(TALEN)或RNA指导的核酸酶(如成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统，如CRISPR-Cas9系统))来实现破坏。在一些实施方案中，产生或生成基因工程化细胞(例如CAR表达细胞)的方法包括向细胞群中引入编码基因工程化抗原受体(例如CAR)的核酸分子和编码靶向抑制性分子的药剂的核酸分子，所述药剂是对抑制分子具有特异性的基因编辑核酸酶，例如DNA靶向蛋白质和核酸酶的融合物(如ZFN或TALEN或RNA指导的核酸酶(如CRISPR-Cas9系统))。
可以制备任何本文所述的另外的药剂，并将其与本文所述的BCMA结合重组受体(例如，嵌合抗原受体)和/或表达所述分子(例如，重组受体)的工程化细胞一起作为组合疗法来施用，例如以包含组合疗法的一种或多种药剂和药学上可接受的载体(如本文所述的任何一种)的药物组合物来施用。在一些实施方案中，可以将BCMA结合重组受体(例如，嵌合抗原受体)、表达所述分子(例如，重组受体)的工程化细胞、表达所述分子(例如，重组受体)的多种工程化细胞与另外的药剂、疗法或治疗同时、并行或以任何顺序依序施用，其中这种施用在受试者体内提供每种药剂的治疗有效水平。在一些实施方案中，可以将所述另外的药剂与BCMA结合重组受体、重组受体、细胞和/或组合物共施用，例如作为同一药物组合物的一部分或使用相同的递送方法来共施用。在一些实施方案中，将所述另外的药剂与本文所述的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物同时但在单独的组合物中施用。在一些实施方案中，所述另外的药剂是另外的工程化细胞(例如被工程化以表达不同重组受体的细胞)并在同一组合物或在单独的组合物中式施用。在一些实施方案中，在施用细胞之前，将另外的药剂与所述工程化细胞(例如，CAR表达细胞)一起孵育。
在一些例子中，在施用本文所述的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物之后或之前(相隔所选时间段)，施用所述一种或多种另外的药剂。在一些例子中，所述时间段是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。在一些例子中，多次施用所述一种或多种另外的药剂和/或多次施用本文所述的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物。例如，在一些实施方案中，在本文所述的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物之前，例如在施用前两周、12天、10天、8天、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，施用另外的药剂。例如，在一些实施方案中，在本文所述的BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物之后，例如在施用后两周、12天、10天、8天、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，施用另外的药剂。
所述另外的药剂的剂量可以是任何治疗有效量，例如本文所述的任何剂量的量，并且另外的药剂的适当剂量可以取决于待治疗疾病的类型，所施用的重组受体、细胞和/或组合物的类型、剂量和/或频率，疾病的严重程度和病程，施用重组受体、细胞和/或组合物是出于预防目的还是治疗目的，先前疗法，患者的临床病史和对重组受体、细胞和/或组合物的反应，以及主治医师的决断。可以将所述重组受体、细胞和/或组合物和/或另外的药剂和/或疗法一次施用至患者、重复地施用或经一系列治疗来施用。
在一些方面，重复施用一定剂量的工程化细胞和/或包含所述工程化细胞的组合物。在一些方面，所述受试者接受一个或多个另外的剂量的所述工程化细胞和/或含有所述工程化细胞的组合物，其与所述工程化细胞和/或含有所述工程化细胞的组合物的初始剂量相同。在一些方面，所述受试者接受一个或多个另外的剂量的所述工程化细胞和/或含有所述工程化细胞的组合物，其不同于所述工程化细胞和/或含有所述工程化细胞的组合物的初始剂量。在一些方面，所述另外的剂量高于初始剂量。在一些方面，所述另外的剂量低于初始剂量。在一些实施方案中，向所述受试者仅施用一个剂量的工程化细胞和/或含有所述工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，不重复施用一定剂量的工程化细胞和/或包含所述工程化细胞的组合物。
VI.制品或试剂盒
还提供了制品或试剂盒，所述制品或试剂盒含有所提供的重组受体(例如CAR)、基因工程化细胞和/或包含其的组合物。所述制品可以包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、试管、IV输液袋等。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，所述容器具有无菌入口。示例性容器包括静脉输液袋、小瓶，包括具有可被注射针刺穿的塞子的那些。所述制品或试剂盒可以还包含包装插页，其指示所述组合物可以用于治疗特定病症如本文所述的病症(例如多发性骨髓瘤)。可替代地或另外地，所述制品或试剂盒可还包括另一个或相同的包含药学上可接受的缓冲液的容器。它还可以包括其他材料，如其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和/或注射器。
所述标签或包装插页可以指示所述组合物用于治疗个体中表达BCMA的或BCMA相关的疾病、障碍或病症。在容器上或与容器相关的标签或包装插页可以指示关于重构和/或使用配制品的指导说明。所述标签或包装插页可以进一步指示所述配制品可用于或旨在用于皮下、静脉内或其他方式的施用以治疗或预防个体中表达BCMA的或BCMA相关的疾病、障碍或病症。
在一些实施方案中，所述容器容纳组合物本身或组合物与可有效治疗、预防和/或诊断病症的另一种组合物的组合。所述制品或试剂盒可以包含(a)在其中含有组合物(即第一药物)的第一容器，其中所述组合物包含抗体(例如抗BCMA抗体)或其抗原结合片段或重组受体(例如CAR)；和(b)在其中含有组合物(即第二药物)的第二容器，其中所述组合物包含另外的药剂(如细胞毒性剂或其他治疗剂)，并且所述制品或试剂盒还包含在标签或包装插页上的用于采用有效量的所述第二药物治疗受试者的说明书。
VII.定义
如本文所用，提及抗体的“相应形式”意指当比较两种抗体的特性或活性时，使用相同形式的抗体来比较特性。例如，如果声明抗体与第一抗体的对应形式的活性相比具有更高的活性，则意味着特定形式(如所述抗体的scFv)与第一抗体的scFv形式相比具有更高的活性。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换地使用以指代具有与天然抗体结构基本上类似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
“编码抗BCMA抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独载体中这样的一种或多种核酸分子、以及在宿主细胞中的一个或多个位置存在的这样的一种或多种核酸分子。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所述抗体和抗体链以及其他肽(例如，接头和BCMA结合肽))可以包括含有天然和/或非天然氨基酸残基的氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可以含有关于自然或天然序列的修饰，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(例如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(例如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”和“序列同一性”被定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可以包括用一个氨基酸替代多肽中的另一个氨基酸。可以将氨基酸取代引入目标结合分子(例如抗体)和针对所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、或降低的免疫原性)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守氨基酸取代将涉及将这些类别之一的成员与另一个类别交换。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，“一种/一个(a)”或“一种/一个(an)”意指“至少一种/至少一个”或“一种或多种/一个或多个”。应理解，本文所述的方面、实施方案和变化包括“包含”方面、实施方案和变化、“由方面、实施方案和变化组成”和/或“本质上由方面、实施方案和变化组成”。
在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括所述限值中的之一或两者的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度为多少，此均适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文提及“约”某一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，“组合物”是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记物呈“阳性”的陈述是指特定标记物(通常是表面标记物)在细胞上或在细胞中的可检测存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的存在，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下可通过流式细胞术检测，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平与已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平基本上类似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记物呈“阴性”的陈述是指特定标记物(通常是表面标记物)在细胞上或在细胞中不存在实质可检测的存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的不存在，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下通过流式细胞术没有被检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平相比基本上类似。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不应一定被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。
VIII.示例性实施方案
本文提供的实施方案包括：
1.一种治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；
其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
2.一种治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂；
蛋白酶体抑制剂；以及
抗CD38抗体。
3.一种治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
4.一种治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：
在为或约1x107个CAR表达T细胞与2x109个之间的CAR表达T细胞；
以为或为约1:1或者在约1:3与约3:1之间的CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的确定比率的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合；并且
所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域与B细胞成熟抗原(BCMA)特异性地结合。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述VH是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述VL是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含scFv。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述VH和所述VL通过柔性接头接合。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述scFv包含接头，所述接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述VH是所述VL的氨基末端。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含SEQID NO:114的氨基酸序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含SEQID NO:114的氨基酸序列。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中编码所述抗原结合结构域的核酸包含(a)SEQ ID NO:113的核苷酸序列；(b)与其具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的简并序列。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中编码所述抗原结合结构域的所述核酸包含SEQ ID NO:115的核苷酸序列。
15.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述VH是所述VL的羧基末端。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述胞质信号传导结构域是或包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含4-1BB、任选人4-1BB的细胞内信号传导结构域。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区是或包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列展现出至少90％序列同一性的氨基酸序列。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区在所述跨膜结构域与所述CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域之间。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是或包含SEQID NO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138展现出至少90％序列同一性的氨基酸序列。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述CAR从其N至C末端依次包含：所述抗原结合结构域、所述间隔子、所述跨膜结构域和所述细胞内信号传导区。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中在存在可溶性或脱落形式的BCMA的情况下，在暴露于表达表面BCMA的细胞后，所述抗原结合结构域和或所述CAR的结合或指示所述CAR的功能或活性的量度未被降低或阻断或未被明显降低或阻断。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述可溶性或脱落形式的所述BCMA的浓度或量对应于所述受试者或多发性骨髓瘤患者的血清或血液或血浆中存在的浓度或量，或者多发性骨髓瘤患者群体中的平均浓度或平均量；或者为一定浓度或量的所述可溶性或脱落BCMA，在所述浓度或量下对于相同测定中表达参考抗BCMA重组受体、任选参考抗BCMA CAR的细胞，所述结合或量度被降低或阻断或者被明显降低或阻断。
26.根据实施方案1-14和16-25中任一项所述的方法，其中所述CAR由以下多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:13中所示序列或与其展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
27.根据实施方案1-14和16-26中任一项所述的方法，其中所述方法是由包含SEQID NO:13中所示序列的多核苷酸序列编码。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中在人细胞、任选人T细胞中表达编码所述CAR的多核苷酸后，从所述多核苷酸转录的RNA、任选信使RNA(mRNA)展现出至少70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA同质性。
29根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含在为或约1x107个CAR表达T细胞与为或约2x109个之间的CAR表达T细胞。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含在为或约2.5x107个CAR表达T细胞与为或约1.2x109个之间的CAR表达T细胞、在为或约5.0x107个CAR表达T细胞与为或约4.5x108个之间的CAR表达T细胞、或者在为或约1.5x108个CAR表达T细胞与为或约3.0x108个之间的CAR表达T细胞。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含为或约2.5x107、为或约5.0x107、为或约1.5x108、为或约3.0x108、为或约4.5x108、为或约8.0x108或者为或约1.2x109个CAR表达T细胞。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含为或约5.0x107、为或约1.5x108、为或约3.0x108或者为或约4.5x108个CAR表达T细胞。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含以为或为约为1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间的CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约30mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨以及每天施用为或约300mg/m2受试者体表面积的环磷酰胺，持续3天。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时或之前，所述受试者已经接受过三种或更多种针对所述疾病或障碍的先前疗法、任选四种或更多种先前疗法，其任选地选自：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂；
蛋白酶体抑制剂；以及
抗CD38抗体。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时或之前，所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种针对所述疾病或障碍的先前疗法：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂或蛋白酶体抑制剂或其组合；以及
抗CD38抗体。
40.根据实施方案38或实施方案39所述的方法，其中所述免疫调节剂选自沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
41.根据实施方案38-40中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。
42.根据实施方案38-41中任一项所述的方法，其中所述抗CD38抗体是或包含达雷木单抗。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时和/或在淋巴细胞耗尽化疗或白细胞单采术时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时，所述受试者已经患上继发性浆细胞白血病(PCL)。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者：
在至少3种或至少4种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的；
是成人受试者或年龄为25或35岁或更大；
从多发性骨髓瘤的诊断起的时间为约4年或者在2与15年或2与12年之间；
已经接受过约10种或者在3与15种或4与15种针对多发性骨髓瘤的先前方案；
已经对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和/或抗CD38单克隆抗体是难治的或无反应；
已经进行过先前自体干细胞移植或尚未进行过先前自体干细胞移植；和/或
具有IMWG高风险细胞遗传学。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所述方法能够在患有主题疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中任选地在开始所述施用后的指定时间点实现规定的反应或结局，任选地其中所述受试者群组具有与通过所述方法治疗的受试者至少相同数量的先前疗法、预后或预后因素、亚型、二次受累或其他一种或多种规定的患者特征，其中：
所述反应选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)；
所述反应或结局是或包括OR；和/或
所述反应或结局是或包括CR。
47.根据实施方案46所述的方法，其中所述反应或结局是OR或者在所述群组的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的受试者中实现。
48.根据实施方案46所述的方法，其中所述反应或结局是VGPR、CR或sCR，并且在所述群组的至少30％、35％、40％、45％或50％的受试者中实现。
49.根据实施方案46所述的方法，其中所述反应或结局是CR或sCR，并且在所述群组的至少20％、30％或40％的受试者中实现。
50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述剂量的细胞少于1.5x108个细胞或少于1.5x108个CAR+ T细胞或少于3x108个CAR+ T细胞或少于4.5x108个CAR+ T细胞。
51.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述剂量的细胞是为或少于1.5x108个细胞或少于1.5x108个CAR+ T细胞。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述剂量的细胞是为或约5x107个细胞或CAR+ T细胞。
53.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述剂量的细胞是为或约1.5x108个细胞或CAR+ T细胞。
54.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述剂量的细胞是为或约3x108个细胞或CAR+ T细胞。
55.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述剂量的细胞是为或约4.5x108个细胞或CAR+ T细胞。
56.根据实施方案46-55中任一项所述的方法，其中所述反应或结局包括或还包括不存在神经毒性或不存在细胞因子释放综合征(CRS)。
57.根据实施方案46-55中任一项所述的方法，其中所述反应或结局包括或还包括不存在神经毒性，并且在所述群组中的至少40％、50％、60％、70％或80％的受试者中实现。
58.根据实施方案46-57中任一项所述的方法，其中所述反应或结局包括或还包括不存在CRS，并且在所述群组中的至少10％、15％、20％、25％或30％的受试者中实现。
59.根据实施方案46-58中任一项所述的方法，其中所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高或4级或更高的神经毒性、不存在3级或更高或4级或更高的细胞因子释放综合征(CRS)。
60.根据实施方案46-59中任一项所述的方法，其中所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中实现。
61.根据实施方案45-59中任一项所述的方法，其中所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高的CRS，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中实现。
62.根据实施方案1-61中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含为或约5.0x107、为或约1.5x108、为或约3.0x108或者为或约4.5x108个CAR表达T细胞。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含为或约5.0x107个CAR表达T细胞。
64.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含为或约1.5x108个CAR表达T细胞。
65.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含为或约3x108个CAR表达T细胞。
66.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含为或约4.5x108个CAR表达T细胞。
67.一种在根据实施方案1-66中任一项所述的方法中施用的工程化T细胞或一定剂量的工程化T细胞，其中在施用一定剂量的工程化T细胞后，在受试者群组或其可评价的受试者中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞能够任选地在开始所述施用后的指定时间实现规定的反应或结局，其中所述受试者群组是患有多发性骨髓瘤的群组。
68.根据实施方案67所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间，即在所述开始后1、2、3、6、9或12个月。
69.根据实施方案68所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间，即在所述开始后1或2或3个月。
70.根据实施方案67-69中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中：
所述受试者群组是患有复发性或难治性多发性骨髓瘤的受试者；
所述受试者群组是患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少3种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者，所述先前疗法任选地包括自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体；
所述受试者群组是患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少3种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者，所述先前疗法任选地包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体和/或自体干细胞移植；和/或
所述受试者群组是在所述施用时未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或没有PCL病史的受试者；
所述受试者群组是在施用所述细胞之前已经患上继发性浆细胞白血病(PCL)的受试者；
所述受试者群组是或包括患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少4种或平均至少10种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者；
所述受试者群组由成人受试者组成或包括成人受试者；
所述受试者群组从诊断起的中值时间为4年和/或从诊断起的时间的范围为2至12年；
所述受试者群组已经接受过中值为10种的先前方案，或者在3与15种或4与15种之间的针对多发性骨髓瘤的先前疗法；
所述受试者群组包括对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和抗CD38单克隆抗体难治的受试者；
所述受试者群组包括已经进行过先前自体干细胞移植的受试者；和/或
所述受试者群组包括具有IMWG高风险细胞遗传学的受试者。
71.根据实施方案70所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述至少3种先前疗法包括自体干细胞移植(ASCT)；免疫调节剂或蛋白酶体抑制剂；或其组合；以及抗CD38抗体。
72.根据实施方案70或实施方案71所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述免疫调节剂选自沙利度胺、来那度胺和泊马度胺，所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米，和/或所述抗CD38抗体是或包含达雷木单抗。
73.根据实施方案67-72中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中
所述反应或结局选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；
所述反应或结局是或包括OR，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；或者
所述反应或结局是或包括CR，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准。
74.根据实施方案67-73中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局是或包括OR。
75.根据实施方案67-74中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述剂量能够在所述群组的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的受试者中实现所述反应或结局。
76.根据实施方案67-73中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局是或包括VGPR、CR或sCR。
77.根据实施方案67-73和76中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述剂量能够在所述群组的至少30％、35％、40％、45％或50％的受试者中实现所述反应或结局。
78.根据实施方案67-73中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局是或包括CR或sCR。
79.根据实施方案67-78中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述剂量能够在所述群组的至少20％、30％或40％的受试者中实现所述反应或结局。
80.根据实施方案67-79中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中：
能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1.5x108个细胞；或者
能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1.5x108个CAR+ T细胞。
81.根据实施方案67-80中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中
能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1.5x108个细胞；
能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1.5x108个CAR+ T；
能够实现所述反应或结局的所述剂量少于3x108个CAR+ T；或者
能够实现所述反应或结局的所述剂量少于或少于4.5x108个CAR+ T细胞。
82.根据实施方案67-81中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中
能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1x108个细胞；
能够实现所述反应或结局的所述剂量少于1x108个CAR+ T细胞。
83.根据实施方案67-82中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约5x107个细胞或者为或约5x107个CAR+ T细胞。
84.根据实施方案67-81中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约1.5x108个细胞或CAR+ T细胞。
85.根据实施方案67-81中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约3x108个细胞或CAR+ T细胞。
86.根据实施方案67-81中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约4.5x108个细胞或CAR+ T细胞。
87.根据实施方案67-86中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局包括或还包括不存在神经毒性或不存在细胞因子释放综合征(CRS)。
88.根据实施方案67-87中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局包括或还包括不存在神经毒性，并且在所述群组中的至少40％、50％、60％、70％或80％的受试者中实现。
89.根据实施方案67-87中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局包括或还包括不存在CRS，并且在所述群组中的至少10％、15％、20％、25％或30％的受试者中实现。
90.根据实施方案67-89中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高或4级或更高的神经毒性、不存在3级或更高或4级或更高的细胞因子释放综合征。
91.根据实施方案67-90中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中实现。
92.根据实施方案67-91中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局包括或还包括不存在3级或更高的CRS，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中实现。
93.根据实施方案67-92中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中：
在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有记忆表型；
其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞具有中央记忆表型；和/或
其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+；和/或
其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞呈CCR7+/CD45RA-或呈CCR7+/CD45RO+。
94.根据实施方案67-93中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中：所述剂量的工程化T细胞通过展现出预先确定的特征的方法来产生，其中所述方法的迭代任选地从人生物样品产生多种输出组合物，其中所述方法在多名不同的单独受试者之中进行，其中：
所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中具有中央记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD4+ T细胞、任选CAR+CD4+ T细胞中的中央记忆CD4+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD8+ T细胞、任选CAR+CD8+ T细胞中的中央记忆CD8+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；和/或
所述多种输出组合物的工程化T细胞、任选CAR+ T细胞中的中央记忆T细胞、任选CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。
95.根据实施方案67-94中任一项所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述剂量通过如下方法来产生，所述方法在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述方法是在多名不同的单独受试者之中进行的。
96.根据实施方案95所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述多名不同的单独受试者包括患有疾病或病症的受试者。
97.根据实施方案96所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述疾病或病症是癌症。
98.根据实施方案97所述的工程化T细胞或所述剂量的工程化T细胞，其中所述癌症是血液癌症、任选多发性骨髓瘤。
99.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；
其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
100.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂；
蛋白酶体抑制剂；以及
抗CD38抗体。
101.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
102.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：
在为或约1x107个CAR表达T细胞与2x109个之间的CAR表达T细胞；
以为或为约1:1或者在约1:3与约3:1之间的CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的确定比率的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合；并且
所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
103.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；
其中在施用所述剂量的工程化T细胞之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
104.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂；
蛋白酶体抑制剂；以及
抗CD38抗体。
105.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
106.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有SEQ ID NO:97、101和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:96、100和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:95、99和103的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:105、107和108的氨基酸序列的VL；
含有SEQ ID NO:94、98和102的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:104、106和108的氨基酸序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：
在为或约1x107个CAR表达T细胞与2x109个之间的CAR表达T细胞；
以为或为约1:1或者在约1:3与约3:1之间的CD4+CAR表达T细胞与CD8+CAR表达T细胞和/或CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的确定比率的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的组合；并且
所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
107.根据实施方案99-106中任一项所述的用途，其中所述细胞外抗原结合结构域与B细胞成熟抗原(BCMA)特异性地结合。
108.根据实施方案99-107中任一项所述的用途，其中所述VH是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述VL是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。
109.根据权利要求1-66和99-108中任一项所述的方法或用途，其中：
在所施用的剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有记忆表型；
其中在所施用的剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞具有中央记忆表型；和/或
其中在所施用的剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+；和/或
其中在所施用的剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞呈CCR7+/CD45RA-或呈CCR7+/CD45RO+。
110.根据实施方案1-66和99-109中任一项所述的方法或用途，其中所施用的剂量中的细胞通过产生多种输出组合物的方法任选地从人生物样品产生，其中所述方法在多名不同的单独受试者之中进行，其中：
所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中具有中央记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD4+ T细胞、任选CAR+CD4+ T细胞中的中央记忆CD4+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD8+ T细胞、任选CAR+CD8+ T细胞中的中央记忆CD8+ T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；和/或
所述多种输出组合物的工程化T细胞、任选CAR+ T细胞中的中央记忆T细胞、任选CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。
111.根据实施方案1-66和99-110中任一项所述的方法或用途，其中所施用的剂量通过如下方法来产生，所述方法在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述方法是在多名不同的单独受试者之中进行的。
112.根据实施方案111所述的方法或用途，其中所述多名不同的单独受试者包括患有疾病或病症的受试者。
113.根据实施方案112所述的方法或用途，其中所述疾病或病症是癌症。
114.根据实施方案113所述的方法或用途，其中所述癌症是血液癌症、任选多发性骨髓瘤。
IX.实施例
本文仅出于说明性目的包括以下实施例，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：针对BCMA的嵌合抗原受体(CAR)和表达抗BCMA CAR的细胞的产生
产生编码示例性嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述示例性嵌合抗原受体各自含有人抗BCMA scFv抗原结合结构域。人抗BCMA scFv包括实施例2中描述的那些。产生的CAR还包括这样的CAR，其包含含有WO 2016090327中描述的抗体的VH和VL序列的scFv。还产生了含有具有WO 2010104949中描述的BCMA抗体的VH和VL序列的scFv的抗BCMA CAR。在scFv的一些情况下，VH是VL的氨基末端，并且在一些情况下，VL是VH的氨基末端。产生的CAR中的示例性scFv区示于表E1中。
特别地，示例性多核苷酸CAR构建体含有编码以下的核酸：人IgG-κ信号传导序列(SEQ ID NO:167，其编码SEQ ID NO:166)；人抗BCMA scFv；间隔子(如含有经修饰的IgG4-铰链CH2-CH3的间隔子(SEQ ID NO:175，编码SEQ ID NO:174)(在一些情况下，所述间隔子可以被称为“LS”)，或者在一些情况下，较短的间隔子(可以被称为“SS”)，如源自IgG铰链区(如IgG4来源的铰链区或其修饰形式)或源自CD28细胞外结构域的间隔子)；人CD28跨膜结构域、人4-1BB来源的细胞内共信号传导序列；以及人CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域。示例性间隔子包括源自IgG4铰链区的间隔子和CD28胞外结构域来源的间隔子。
还产生了编码另一种CAR构建体的多核苷酸，其含有编码以下的核酸：人IgG-κ信号序列(SEQ ID NO:167，其编码SEQ ID NO:166)、小鼠抗BCMA scFv、间隔子(SEQ ID NO:175，其编码SEQ ID NO:174)、人CD28跨膜结构域、人4-1BB来源的细胞内共信号传导序列以及CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域。
将编码此类CAR的cDNA克隆与下游核糖体跳跃元件(如T2A编码序列SEQ ID NO:244或245，其编码SEQ ID NO:243)连接，接着与截短的受体编码序列连接，并将其克隆至慢病毒表达载体中。
为了产生抗BCMA CAR表达T细胞，通过基于免疫亲和力的富集从人供体受试者的白细胞单采术样品分离T细胞。分离的T细胞被激活并用慢病毒载体转导，所述慢病毒载体含有编码抗BCMA CAR的相应多核苷酸。转导和扩增之后，将CD4+和CD8+ T细胞用对截短的受体具有特异性的抗体和荧光标记的重组人BCMA染色，并通过流式细胞术进行分析，确认细胞的转导和抗BCMA CAR的表达。
实施例2：潜在的RNA异质性和修饰的评估
在使用对示例性CAR转录物的5′UTR和3′UTR中的启动子和下游WPRE具有特异性的引物进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)后，通过琼脂糖凝胶电泳分析来自用如实施例3中所述的示例性抗BCMA CAR转导的细胞的RNA的异质性。对于含有包括经修饰的IgG CH2-CH3-铰链区在内的示例性间隔子的各种抗BCMA CAR构建体(BCMA-LS CAR)，观察到多个条带(图1A)，这表明了RNA异质性。对于含有较短间隔子的示例性CAR，例如包括人CD28细胞外区域的一部分在内的CAR(参见例如，BCMA-52-SS CAR)，观察到较少的RNA异质性。
在编码各种BCMA-LS CAR的核苷酸序列中，评估了潜在的剪接位点，并以保守方式进行了修饰，包括去除潜在的预测剪接位点。对修饰之前的序列(起始序列)和修饰之后的序列(优化的序列)进行分析，以评估潜在的隐秘剪接位点的存在。单独评价剪接供体位点和剪接受体位点。鉴定了构建体的各个区域的起始序列的示例性剪接供体和剪接受体位点(例如，在启动子区域和长间隔子区域中)。在初始密码子优化后在长间隔子区域内鉴定出示例性的剪接供体位点和剪接受体位点，其具有>0.7(>70％)的剪接位点得分，例如分别在SEQ ID NO:210(剪接位点得分为0.96)和225(剪接位点得分为0.97)中所示的供体位点。在进行初始密码子优化(参见例如，对于示例性初始密码子优化的间隔子序列，SEQ ID NO:236)以降低不希望的剪接位点的可能性之后，产生了经修饰的构建体，其含有在评估为剪接位点得分>0.7(>70％)的区域内另外的修饰。在密码子优化/剪接位点消除后进一步修饰的此类区域包括在较长的间隔子区域序列内的那些，例如剪接供体位点和剪接受体位点的最终优化的剪接位点消除的(O/SSE)序列分别如SEQ ID NO:190和180中所示。
如上所述，构建经修饰的序列并测试RNA异质性。电泳证实了RNA异质性的降低。在剪接位点消除之前和之后对BCMA-CAR构建体的分析表明RNA异质性降低(图1B)。产生了含有长间隔子区域的修饰的示例性O/SSE CAR构建体，例如BCMA-23-LS-O/SSE CAR、BCMA-25-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR、BCMA-52-LS-O/SSE CAR和BCMA-55-LS-O/SSE CAR。
实施例3：原代T细胞中CAR表达和功能的评估
将如实施例3中所述含有分别具有起始和优化序列的抗BCMA CAR编码多核苷酸的慢病毒构建体转导至T细胞中，并通过流式细胞术分析转导的细胞的转导(基于替代标记物的表达)以及基于与重组BCMA-Fc融合蛋白的结合分析CAR表达。与经由具有起始(未SSE)序列的多核苷酸转导以表达抗BCMA CAR的细胞相比，使用优化的序列BCMA-52-LS-O/SSE CAR和BCMA-55-LS-O/SSE CAR转导的较大百分比的CD4+和CD8+ T细胞在表面上表达相同的相应CAR。代表性数据示于图2和下表E2中。
使用各种体积的含有编码CAR构建体BCMA-23-LS CAR、BCMA 26-LS CAR、BCMA 55-LS CAR和BCMA 55-LS-O/SSE CAR的慢病毒载体的病毒制剂来转导500,000个供体来源的原代人T细胞，并比较转导效率。与起始序列(图3，三角形)相比，在通过优化序列(图3，圆圈)转导后T细胞的转导百分比增加。
实施例4：BCMA-52和BCMA-55scFv的表征
A.组织的免疫组织化学染色
通过免疫组织化学评估表达不同水平的BCMA的细胞和组织与示例性抗BCMA抗体的结合。通过免疫组织化学评估了已与小鼠IgG1 Fc区肽融合的示例性人BCMA靶向的CAR的结合结构域(scFv)的结合细胞和组织。
B.结合动力学的评估
在Jurkat T细胞系中表达具有BCMA-55来源的scFv结合结构域、经修饰的IgG来源的CH2-CH3-铰链间隔子、CD28跨膜结构域以及41BB和CD3ζ胞内域的CAR。使用动力学排阻测定评估CAR与重组人BCMA-hFc(rhBCMAhFc)结合的动力学。还使用基于Biacore的测定评估含有CAR的scFv部分(scFv-Fc)的Fc融合蛋白与重组人BCMA融合蛋白的结合亲和力。在这些研究中，分别观察到CAR和scFv-Fc融合物的结合的KD为约1nM和10nM。
在进一步的实验中，用编码具有BCMA-55来源的scFv结合结构域的CAR的多核苷酸转导Jurkat细胞，并培养至约2x106的密度。收获细胞并在4℃下以1500g旋转15分钟。洗涤细胞沉淀物，将细胞重悬并连续稀释在20nM或1nM生物素化rhBCMA hFc(在本测定中也称为恒定结合配偶体(CBP))中。平衡之后，将细胞旋转并收集上清液以进行KinExa动力学排阻分析。简而言之，来自含有平衡的BCMA-55-LS CAR O/SSE表达Jurkat细胞的rhBCMA hFc的上清液流过链霉亲和素珠流动池，以捕获游离的生物素化rhBCMA hFc。然后使用荧光标记的二级抗hBCMA抗体检测rhBCMA。对于每个样品记录检测到的rhBCMA hFc的吸光度，并将其针对每个稀释液中的细胞数量作图(Darling(2004)Assay Drug.Dev.,2:647-657)。在该研究中，在该测定中BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达细胞与rhBCMA hFc结合的相互作用的KD被确定为约1.46nM，并且表达水平(EL)被确定为每CAR表达Jurkat细胞中的约146,500CAR。
C.BCMA-55scFv-Fc的选择性
使用膜蛋白质组阵列(MPA)测定来评估使用scFv-Fc融合蛋白的BCMA-55来源的结合结构域的结合特异性。使用RetrogenixTM平台评价BCMA-55-Fc与表达超过4400种独特的人细胞外蛋白(代表超过85％的人细胞外蛋白质组)和荧光蛋白的HEK293细胞的相互作用。检测荧光蛋白以验证转染，并且还使用含有匹配的Fc的CTLA4-Fc(在0.2μg/mL下测试)针对CD86进行筛选，作为阳性对照。初始筛选涉及针对全蛋白检测套组的BCMA-55-scFv的scFv结合测定。然后进行随访确认筛选，从而再测试BCMA-55-Fc与初始筛选中鉴定的潜在命中子集的相互作用。在该测定中，BCMA被鉴定为唯一的强特异性命中，这与该结合结构域对BCMA的选择性超过其他细胞外蛋白的结论一致。观察到组织蛋白酶G(CTSG)的一些低水平信号，但观察到没有赋予功能活性(参见实施例16)。
实施例5：工程化以表达各种抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的体外功能评估
在与表达BCMA的靶细胞共培养后，在体外评估了表达各种示例性抗BCMA CAR的基因工程化人T细胞。将T细胞用BCMA-52-LS CAR、BCMA-55-LS CAR、BCMA-52-LS-O/SSE CAR或BCMA-55-LS-O/SSE CAR转导。将反应与作为阳性对照的参考抗BCMA CAR表达细胞或作为阴性对照的模拟物处理的细胞进行比较。
A.对靶细胞的细胞溶解活性
将BCMA表达靶细胞与表达BCMA-52-LS CAR、BCMA-55-LS CAR或参考抗BCMA CAR的T细胞以5:1、2.5:1、1.25:1和0.65:1的效应物与靶标(E:T)比率孵育。作为对照，将靶细胞与不表达CAR的T细胞(模拟物对照)一起孵育。特别地，使用BCMA转导的K562细胞(K562/BCMA，BCMA高)或RPMI 8226细胞(BCMA低人多发性骨髓瘤细胞系)作为裂解的靶标。用NucLight Red(NLR)标记靶细胞以允许通过显微镜检查追踪靶细胞。通过测量如通过红色荧光信号(使用
或细胞分析系统，Essen Bioscience)所确定的在24与72小时之间的时间段内活靶细胞的损失来评估细胞裂解活性。将裂解百分比(裂解％)针对在与模拟处理的T细胞一起孵育的靶细胞中发生的裂解归一化。如图4A所示，表达抗BCMA CAR的T细胞展现出针对BCMA+细胞的抗原特异性细胞溶解活性。细胞裂解的幅度取决于特定的细胞系和CAR。
在单独的实验中，用RPMI 8226靶细胞以3:1的E:T比率测试细胞溶解活性。如图4B所示，BCMA-52-LS和BCMA-55-LS-CAR表达细胞展现出约70％裂解，其针对通过模拟物处理的不表达CAR的细胞所得到的裂解进行归一化；而表达含有参考抗BCMA抗体结合结构域的CAR的细胞展现出约50％裂解。因此，结果表明，被工程化以表达BCMA-52或BCMA-55-CAR的细胞的细胞溶解活性类似于或高于含有参考结合结构域的CAR的细胞溶解活性。
为了比较使用由未修饰的CAR构建体或优化的CAR构建体编码的相同CAR工程化的T细胞的细胞溶解活性，使用含有未修饰的多核苷酸构建体(BCMA-52-LS CAR和BCMA-55-LSCAR)或优化的多核苷酸构建体(BCMA-52-LS-O/SSE CAR和BCMA-55-LS-O/SSE CAR)的病毒载体将T细胞工程化以表达抗BCMA CAR。基本上如上所述测定工程化细胞的细胞溶解活性。将CAR表达T细胞与靶细胞K562-BCMA、RPMI 8226、MM1.S细胞(BCMA中人多发性骨髓瘤细胞系)或OPM2细胞(BCMA中人多发性骨髓瘤细胞系)靶细胞以3:1的E:T比率孵育。如图4C和图4D所示，与用相应的未修饰的构建体转导的细胞相比，用CO/SSE CAR构建体转导的CAR表达细胞展现出更大的细胞溶解活性。
B.细胞因子释放
在将各种抗BCMA CAR表达细胞与抗原表达靶细胞孵育后，评估细胞因子释放。
将BCMA表达靶细胞K562/BCMA或RPMI 8226细胞与表达BCMA-52-LS CAR、BCMA-55-LS CAR或含有参考结合结构域的抗BCMA CAR的T细胞以5:1、2.5:1、1.25:1或0.6:1的E:T比率孵育。作为对照，将靶细胞与不表达CAR的T细胞(模拟物对照)一起孵育。将共培养的细胞孵育约24小时，然后使用多重细胞因子免疫测定收集上清液以测量IFN-γ、TNF-α和IL-2。如图5A所示，测试的抗BCMA CAR表达T细胞在抗原刺激后产生细胞因子。
为了评估使用由未修饰的CAR构建体或优化的CAR构建体编码的相同CAR工程化的T细胞的抗原依赖性细胞因子产生，使用含有未修饰的多核苷酸构建体(BCMA-52-LS CAR和BCMA-55-LS CAR)或优化的多核苷酸构建体(BCMA-52-LS-O/SSE CAR和BCMA-55-LS-O/SSECAR)的病毒载体将T细胞工程化以表达抗BCMA CAR。将CAR表达T细胞与靶细胞K562/BCMA、RPMI 8226细胞、MM1S(BCMA中人多发性骨髓瘤细胞系)或OPM2细胞(BCMA中人多发性骨髓瘤细胞系)靶细胞以3:1、1.5:1、0.75:1和0.375:1的E:T比率孵育。如上所述对细胞因子IFN-γ和IL-2的产生进行评估。如图5B所示，与用相应的未修饰的(起始)构建体转导的细胞相比，观察到使用O/SSE优化构建体转导的CAR表达细胞展现出更高的细胞因子产生。
C.响应于在其表面表达不同水平抗原的靶标的细胞溶解活性、细胞因子释放和增殖
在BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达T细胞与表达不同水平的BCMA的BCMA表达细胞孵育后，评估细胞溶解活性、细胞因子释放和增殖。在存在或不存在可溶性BCMA的情况下评价所有活性。
用CD3/CD28珠刺激从两个人供体(D#1和D#2)收获的1:1比率的CD4+和CD8+原代T细胞，并用慢病毒载体将其转导以稳定表达BCMA-55CAR。在存在BCMA表达靶细胞的情况下，以1:3、1:1或3:1的E:T比率培养转导的细胞。还将来自相同供体的模拟物处理的T细胞与靶细胞混合，以用作对照。BCMA+靶细胞Daudi、RPMI-8226和K562-BCMA细胞展现出不同水平的表面BCMA抗原密度(抗原密度：Daudi(<1000个BCMA分子/细胞)<RPMI-8226<K562-BCMA)，并在与T细胞孵育之前用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色。在具有T细胞和BCMA+靶细胞的培养物中也包含相同数量的靶阴性细胞，其不表达BCMA并被细胞示踪紫罗兰(CTV)染色。孵育24小时后，通过流式细胞术测量剩余的BCMA+与BCMA-靶细胞，并评估指示细胞毒性的靶细胞裂解的程度。
当与靶细胞培养时，BCMA-55-LS-O/SSE CAR T细胞展示出类似的细胞溶解活性，而与BCMA表达水平无关(图6)。另外，对于每个细胞表达大于100,000个分子的靶细胞(NCI-H929)观察到类似的结果。模拟物处理的T细胞未显示出对任何BCMA+靶细胞系的活性。BCMA表达阴性的靶细胞不被来自任何测试的供体的BCMA-55-LS-O/SSE CAR T细胞裂解(数据未示出)。
分析孵育后的上清液中积累的IFN-γ、TNF-α和IL-2细胞因子。数据与以下结论一致：BCMA-55-LS-O/SSE CAR T细胞在与BCMA表达靶细胞接合后释放了一系列细胞因子；其中释放的细胞因子水平通常与抗原水平的增加相对应(即，Daudi<RPMI 8226<K562-BCMA)。IFN-γ的结果示于图7中；对于TNF-α和IL-2观察到类似的数据(数据未示出)。BCMA-55-LSCAR O/SSE T细胞没有响应于BCMA阴性靶标而释放细胞因子，并且在不存在任何靶细胞的情况下它们不表达细胞因子，这证明了对于BCMA+靶细胞的特异性和缺乏基础信号传导。
评估了在存在与不存在可溶性BCMA的情况下BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达T细胞的活性。将BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达T细胞与RP MI-8226肿瘤细胞、与重组BCMA-Fc、或与源自NCI-H929多发性骨髓瘤细胞(分泌BCMA的细胞系，上清液含有可溶性BCMA)的细胞培养物上清液共培养。观察到肿瘤细胞裂解和细胞因子产生均不受任何浓度的NCI-H929来源的可溶性BCMA(高达1000ng/mL)的影响。在重组BCMA的类似的高生理水平下，肿瘤细胞裂解和细胞因子产生二者仅有最低程度地降低。
在BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达T细胞和模拟物处理的T细胞中测量响应于BCMA的增殖。将转导的T细胞用细胞示踪紫罗兰(CTV)标记，并在存在BCMA阳性靶细胞、BCMA阴性靶细胞或无细胞的情况下以1:1的效应物与靶标(E:T)比率培养72小时。通过流式细胞术测量增殖。仅对于BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达T细胞观察到响应于与BCMA阳性靶细胞孵育的T细胞(CD4+和CD8+ T细胞)的增殖。
D.从健康供体和骨髓瘤患者收获的转导的T细胞
在用BCMA+和BCMA-K562靶细胞孵育24小时后，将从多发性骨髓瘤患者收获的被工程化以表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR的T细胞与源自健康人供体的那些进行比较。不表达CAR的T细胞也作为阴性对照进行评价。与来自健康人类供体的表达CAR的细胞相比，源自多发性骨髓瘤患者的CAR T细胞显示出类似的表达、扩增和抗原特异性活性。
实施例6：具有不同间隔子的抗BCMA CAR
产生了编码抗BCMA CAR的多核苷酸构建体，其在编码的CA R多肽的scFv与跨膜区段之间含有不同的间隔子区域。特别地，产生了含有以下的CAR：(1)源自IgG铰链区的间隔子(例如，例如，BCMA-5-SS、BC MA-9-SS、BCMA-18-SS、BCMA-23-SS、BCMA-25-SS、BCMA-26-SS、BC MA-52-SS、BCMA-55-SS和参考1(VH/VL)-SS)；或(2)源自CD28的胞外结构域的短间隔子(例如BCMA-52-SCD28和BCMA-55-SCD28)。将表达含有此类含间隔子的CAR的T细胞与用编码含有如实施例3中所述的间隔子(例如，BCMA-1-LS、BCMA-5-LS、BCMA-9-LS、BCMA-18-LS、BCMA-23-LS、BCMA-25-LS、BCMA-26-LS、BCMA-27-LS、BCMA-52-LS、BCMA-55-LS和参考1(VH/VL)-LS)的示例性CAR的多核苷酸构建体转导的T细胞进行比较。
通过监测以1.25:1和0.65:1的效应物与靶标(E:T)比率与CAR表达T细胞一起培养的OPM2人多发性骨髓瘤靶细胞的裂解来评估CAR表达细胞的细胞溶解活性。将不表达CAR的细胞(模拟物)用作阴性对照。如实施例7中所述对细胞溶解活性进行评估。对于大多数评估的CAR表达细胞，与用含有较短间隔子的CAR工程化的细胞相比，被工程化以表达含有CH2-CH3-铰链间隔子的CAR的细胞的靶细胞裂解更大(图8)。
实施例7：对药剂关于抗BCMA CAR活性的阻断活性的评估
在与BCMA表达靶细胞和可溶性BCMA或其他蛋白质一起孵育后评估抗BCMA CAR表达细胞的功能。基本上如实施例7所述对细胞溶解活性和细胞因子产生进行评估。
A.细胞溶解活性
1.可溶性重组BCMA(rBCMA)-OPM2靶细胞
在存在0、0.3、3、30或300ng/mL的可溶性BCMA-Fc的情况下，将抗BCMA CAR表达T细胞(BCMA-52-LS CAR、BCMA-55-LS CAR或含有参考结合结构域的CAR)以5:1的E:T比率与OPM2靶细胞一起孵育。如图9A所示，在存在3ng/mL或更多BCMA-Fc的情况下，表达含有参考结合结构域的CAR或BCMA-52-LS CAR的T细胞的细胞溶解活性显著降低，然而表达BCMA-55-LS CAR的细胞的细胞溶解活性不被高达300ng/mL BCMA-Fc的存在所阻断。
在另一个实验中，在存在浓度为0、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500和1000ng/mL的可溶性BCMA-Fc的情况下，将抗BCMA CAR表达T细胞(BCMA-1-LS CAR、BCMA-9-LS CAR、BCMA-23-LS CAR、BCMA-25-LS CAR、BCMA-26-LS CAR、BCMA-55-LS CAR和参考1(VH/VL)-LSCAR)以5:1的E:T比率与OPM2靶细胞一起孵育。如图9B所示，表达BCMA-55-CAR的细胞的细胞溶解活性不被任何测试浓度下的BCMA-Fc的存在所阻断；然而，可变浓度的BCMA-Fc的存在在不同程度上阻断了表达其他抗BCMA CAR的细胞的活性。
2.多发性骨髓瘤细胞系(H929)上清液-OPM2靶细胞
在存在0、111、333和1000ng/mL来自H929多发性骨髓瘤细胞系的培养上清液的情况下，将优化的剪接位点消除的(O/SSE)抗BCMA CAR表达T细胞(BCMA-52-LS-O/SSE CAR、BCMA-55-LS-O/SSE CAR或含有参考结合结构域的CAR)以5:1的E:T比率与OPM2靶细胞一起孵育。通过ELISA从H929上清液定量可溶性BCMA的浓度。如图10A所示，表达BCMA-52-LS-O/SSE CAR、BCMA-55-LS-O/SSE CAR或参考CAR的细胞的细胞溶解活性不被H929上清液的存在所阻断。
3.可溶性重组BCMA(rBCMA)和H929上清液-RPMI-8226靶细胞
在进一步的研究中，在存在培养上清液的0、111、333和1000ng/mL来自H929多发性骨髓瘤细胞系(通过ELISA定量的可溶性BCMA)的可溶性BCMA或BCMA-Fc的情况下，将优化的剪接位点消除的(O/SSE)BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达T细胞以3:1的E:T比率与RPMI-8226肿瘤靶细胞一起孵育。表达BCMA-52-LS-O/SSE CAR、BCMA-55-LS-O/SSE CAR或参考CAR的细胞的细胞溶解活性不被H929上清液的存在所阻断。
4.B细胞激活因子(BAFF)
在存在0、1、10、100和1000ng/mL重组B细胞激活因子(BAFF)(BCMA的配体)的情况下，将优化的剪接位点消除的(O/SSE)抗BCMA CAR表达T细胞(BCMA-52-LS-O/SSE CAR、BCMA-55-LS-O/SSE CAR或参考CAR)以5:1的E:T比率与OPM2靶细胞一起孵育。如图10B所示，表达BCMA-52-LS-O/SSE CAR、BCMA-55-LS-O/SSE CAR或参考CAR的T细胞的细胞溶解活性不被BAFF的存在所阻断。
B.细胞因子释放
1.BCMA-Fc
在存在0、111、333和1000ng/mL的可溶性BCMA-Fc的情况下，将抗BCMA CAR表达T细胞(BCMA-52-LS CAR、BCMA-55-LS CAR或参考-LS CAR)以5:1的E:T比率与OPM2靶细胞一起孵育。还评估了不表达CAR的T细胞(模拟物)。评估上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2的细胞因子积累。如图11A所示，在存在111ng/mL或更多BCMA-Fc的情况下，在含有参考CAR或BCMA-52-CAR的T细胞的培养物中的细胞因子积累明显降低，然而在存在所测试的所有浓度的可溶性BCMA-Fc的情况下，在含有表达BCMA-55-CAR的T细胞的培养物中观察到细胞因子积累的较小降低。
2.多发性骨髓瘤细胞系(H929)上清液
在存在0、111、333和1000ng/mL来自多发性骨髓瘤细胞系H929的培养上清液的情况下，将抗BCMA CAR表达T细胞(BCMA-52-LS CAR、BCMA-55-LS CAR或参考-LS CAR)以5:1的E:T比率与OPM2靶细胞一起孵育。含有表达BCMA-52-CAR、BCMA-55-CAR或参考CAR的T细胞的培养物中的细胞因子积累不被H929上清液的存在所阻断(图11B)。
实施例8：动物模型中体内过继转移后抗BCMA CAR表达T细胞的抗肿瘤作用
通过在荷瘤动物模型中过继细胞转移后监测肿瘤，评估了示例性工程化抗BCMACAR表达原代人T细胞的抗肿瘤作用，所述荷瘤动物模型包括OPM2人多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型(原位骨髓模型)和RPMI 8226人多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型(皮下植入模型)。
A.OPM2(原位/骨髓)模型
向NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠静脉内(i.v.)注射2x106个用萤火虫萤光素酶转染的OPM2(多发性骨髓瘤)细胞(OPM2-ffluc)。在肿瘤植入后的第14天，小鼠接受表达优化的剪接位点消除的(O/SSE)BCMA-23-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR或BCMA-55-LS-O/SSE CAR的抗BCMA CAR T细胞的单次静脉内(i.v.)注射。将抗BCMA CAR表达T细胞以1x106(低剂量，n＝8)或3x106(高剂量，n＝8)个CAR表达T细胞/小鼠的剂量施用，并且对于源自两个不同供体的CAR表达T细胞，每种情况都重复进行。作为对照，向小鼠施用不表达CAR的细胞(模拟物，n＝8)或未处理的细胞(n＝3)。评估90天内的存活和肿瘤负荷。
在研究期间，每3至6天通过生物发光成像监测过继转移的CAR表达(CAR-T)细胞的抗肿瘤活性。对于生物发光成像，小鼠接受了重悬于PBS(15μg/g体重)中的萤光素底物(CaliperLife Sciences,马萨诸塞州霍普金顿)的腹膜内(i.p.)注射。本质上如WO 2015/095895中所述将小鼠麻醉并成像。在每个时间点确定总通量(光子/s)。对于阴性对照治疗的小鼠，由于高的肿瘤负荷，在CAR-T细胞施用之后19与23天之间处死动物。来自一个供体来源的CAR表达T细胞的代表性结果如图12A所示。
如图12A所示，对于所有治疗的小鼠，在研究过程中，接受模拟物处理的T细胞或未接受T细胞的小鼠中的肿瘤继续生长。与对照小鼠相比，观察到接受被工程化以表达BCMA-23-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR或BCMA-55-LS-O/SSE CAR的T细胞过继转移的小鼠通常具有较低程度的生物发光信号，这表明在治疗的动物中肿瘤生长随时间的减少和/或较低程度的肿瘤生长。对于示例性测试的抗BCMA CAR，使用更高剂量的抗BCMA CAR表达细胞对肿瘤生长的影响更大。
评估并比较如上所述治疗的小鼠的存活，直到输注CAR表达T细胞后第79天。来自一个供体的代表性存活曲线(Kaplan-Meier方法(GraphPad Prism 7.0，GraphPad软件，拉荷亚))示于图12B中。如图所示，与未接受治疗或接受模拟物处理的T细胞的小鼠相比，低剂量和高剂量的测试的抗BCMA CAR-T细胞导致小鼠的更高存活百分比。还评估了小鼠与肿瘤负荷相关的临床体征的表现，包括后肢瘫痪(HLP)、大于20％的体重减轻(>20％BWL)和移植物抗宿主病(GVHD)。与未接受治疗或接受模拟物T细胞的小鼠相比，具有这些临床体征的小鼠数量减少。
B.RPMI-8226(皮下)模型
向NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下注射RPMI 8226(外周血浆细胞瘤)细胞。在第27天，根据约130mm3的最小平均肿瘤体积，将小鼠随机分组。在第29天，小鼠以1x106(低剂量，n＝8)或3x106(高剂量，n＝8)CAR表达T细胞的剂量接受被工程化以表达优化的剪接位点消除的(O/SSE)BCMA-23-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR或BCMA-55-LS-O/SSE CAR的原代人T细胞(CD4+和CD8+)的单次静脉内(i.v.)注射。对于源自两个不同供体的CAR表达T细胞，每种情况都进行重复。将施用了模拟物处理的细胞的小鼠和未治疗的小鼠用作阴性对照。在CAR T细胞转移后的第152天，每周两次用卡尺测量肿瘤体积，并在垂死、20％体重减轻或肿瘤体积超过1500mm3时安乐死。使用Kaplan-Meier方法绘制CART细胞转移后第108天的存活曲线(GraphPad Prism 7.0，GraphPad)。
源自一个供体的CAR表达T细胞的肿瘤生长和存活的代表性结果分别示于图13A和图13B中。如图13A中所示，在过继转移阴性对照细胞后或者在未接受治疗的小鼠中的研究过程中肿瘤继续生长。与对照小鼠相比，接受被工程化以表达BCMA-23-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR或BCMA-55-LS-O/SSE CAR的T细胞的过继转移的小鼠在接受低或高剂量的CAR表达T细胞后显示出显著减少的肿瘤体积(图13A)。在该模型中，施用了两种测试剂量的抗BCMA CAR T细胞的小鼠在CAR T细胞转移后20天展现出肿瘤生长的完全消退，这在图13A中所示的整个研究评估的持续时间内持续。
施用了抗BCMA CAR表达T细胞的小鼠的存活百分比也显著高于对照组(图13B)。在CAR T细胞输注后108天，在用高剂量的BCMA-26-LS-O/SSE CAR表达T细胞治疗的组中，两只动物在肿瘤消除后死亡，但这可能是由于在该模型中的移植物抗宿主病(GVHD)症状。所有其他CAR-T细胞治疗的小鼠在CAR-T细胞施用后108天仍存活。
监测血液中CAR+ T细胞的存在，以评估治疗的小鼠中CAR表达T细胞的药代动力学。将每个治疗组8只小鼠分为2组，每组4只。每周通过眼眶后出血进行抽血，在2个组之间交替抽血，使得每只小鼠在CAR-T细胞施用后每隔一周出血，持续4周(即，在CAR-T细胞施用后第7、14、21和28天)。通过流式细胞仪(FlowJo软件，Treestar Inc.，俄勒冈州阿什兰)分析收集的血液中每μL血液中的CAR表达T细胞的数量(如使用针对替代标记物或可溶性BCMA-Fc的抗体测定)和非CAR T细胞。
在第7、14、21和28或36天，对于一个供体，每μL血液中的CD4+和CD8+ T细胞的数量分别示于图14A和图14B中，并且对于第二供体分别示于图15A和图15B中。如图所示，在CD4+和CD8+ T细胞的高剂量组和低剂量组中发生了CAR-T扩增，其中对于两个供体均在CAR T细胞转移后第14天观察到最大或峰值扩增。在CAR-T细胞转移后的所有评估时间，与两种供体的CD4+CAR+ T细胞相比，均观察到更多数量的CD8+CAR+ T细胞(比较图14A和图14B或图15A和图15B)。与表达BCMA-23-LS-O/SSE CAR和BCMA-26-LS-O/SSE CAR构建体的T细胞(其展现出彼此相当的表达)相比，被工程化以表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR的T细胞展现出更高的CAR表达。这些结果证明，可以确定BCMA-55-LS CAR表达T细胞在肿瘤清除期间在血液中循环。
实施例9：通过报告细胞系中Nur77-tdTomato报告信号中的抗BCMA嵌合抗原受体
(CAR)的信号的评估
产生了含有Nur77敲入报告基因的示例性稳定的Jurkat T细胞报告细胞系，其中通过同源依赖性修复(HDR)在内源性Nur77基因座处敲入编码报告分子的核酸序列。孤儿核激素受体Nur77(也称为Nr4a1)是由来自T细胞受体和/或经由含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的分子的信号激活所诱导的立即早期反应基因。Nur77报告细胞系用于评估CAR工程化细胞中的T细胞激活，因为Nur77是T淋巴细胞中的直接早期基因产物；转录是在CD3ζ信号传导的下游特异性启动的，并且不受细胞因子或TLR介导的信号的影响。在Jurkat T细胞克隆E6-1(
TIB-152TM)中，通过使用基因编辑引入基因破坏并通过同源依赖性修复(HDR)靶向转基因以在基因破坏附近的位点进行整合，靶向编码红色荧光蛋白(RFP；如tdTomato荧光蛋白)的核酸序列以与内源性Nr4a1(Nur77)基因在最后一个外显子处、终止密码子之前且“自切割”T2A元件后在框架内整合，从而允许共表达作为Nur77表达的报告物的RFP。Nur77-tdTomato报告细胞系被工程化以表达各种抗BCMA嵌合抗原受体，并评估报告物表达。
将含有编码实施例3中描述的以下抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸的病毒载体引入Nur77-tdTomato报告Jurkat T细胞系中：BCMA-55-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR、BCMA-23-LS-O/SSE CAR和BCMA-25-LS-O/SSE CAR。在共培养20小时后，评价了抗BCMA CAR表达报告细胞响应于增加的板结合的重组BCMA的量或响应于示例性多发性骨髓瘤细胞系而得到的Nur77信号传导活性。
A.响应于板结合的重组BCMA的Nur77信号传导
将用编码BCMA-55-LS-O/SSE CAR的病毒载体转导的报告细胞在96孔细胞培养板中孵育6小时，所述细胞培养板已经用不同浓度(0.008μg/mL、0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL)的BCMA-Fc(在其C末端与IgG的Fc区融合的可溶性人BCMA)融合多肽包被。重组Fc多肽用作对照(Fc对照)。如图16A所示，在用重组抗原刺激抗BCMA CAR表达报告细胞后，观察到tdTomato表达的剂量依赖性增加。
在另一项研究中，将被工程化以表达BCMA-55-LS-O/SSE CA R、BCMA-26-LS-O/SSECAR、BCMA-23-LS-O/SSE CAR和BCMA-25-LS-O/SSE CAR的报告细胞与十(10)种2倍BCMA-Fc连续稀释液一起孵育。表达抗CD19 CAR的报告细胞用作非靶标对照。测定表达CAR的细胞群内tdTo mato表达细胞的百分比(如根据替代标记物的表达确定)。如图16B所示，在用重组抗原刺激后观察到tdTomato表达的剂量依赖性增加。表达针对非靶标抗原的CAR的对照报告细胞未观察到对使用BCMA-Fc刺激的反应。
B.响应于多发性骨髓瘤细胞系的Nur77信号传导
将用编码BCMA-55-LS-O/SSE CAR的病毒载体转导的报告细胞与NALM6、Daudi、RPMI-8226、MM1S、OPM2和H929细胞一起孵育20个小时。观察到不同水平的RFP表达，这取决于对抗BCMA CAR表达报告细胞赋予了刺激的细胞系。
为了评估用于刺激抗BCMA CAR表达报告细胞的多发性骨髓瘤细胞系表面的BCMA表达量，用抗人BCMA抗体(BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)将细胞染色，在LSRFortessaTM流式细胞仪(BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞)上收集流式细胞术事件并且用FlowJo软件(Treestar Inc.，俄勒冈州阿什兰)分析数据。使用被相同抗人BCMA抗体包被的QuantumTMSimply
抗小鼠IgG微球珠测定BCMA抗原密度(AD)。标记微球并计算BCMA抗体结合能力。结果证实，当与展现出一定范围的不同抗原密度的各种不同的BCMA表达细胞中的每一种一起孵育时，而不是当与靶标阴性细胞一起孵育时，检测到指示CAR表达报告细胞中特异性CAR活性的参数(报告物的可检测水平)。RFP报告信号的程度通常与表面BCMA表达水平相关。当与其中观察到较低水平的表面BCMA表达的细胞一起孵育时，CAR表达报告细胞展现出较低水平的指示活性的报告物。同样地，与观察到较高水平的表面BCMA表达的细胞系一起孵育的CAR表达报告细胞展现出较高水平的指示活性的报告物。因此，观察到各种多发性骨髓瘤细胞系表面上的BCMA表达密度与指示表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR的报告细胞的抗原特异性活性的参数的水平相关，这表明表达CAR的细胞可以展现出在一定范围的抗原密度内的活性，并且在一些方面可以展现出随着抗原水平增加而增加的活性。
实施例10：表达含有不同长度间隔子的抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的报告细胞系
中的Nur77-tdTomato报告信号的评估
与靶细胞共培养后，测定报告物在被工程化以表达抗BCMA CAR的细胞中的表达，所述抗BCMA CAR含有相同的抗原结合结构域但长度不同的间隔子。如实施例11所述产生的Jurkat Nur77-tdTomato细胞被工程化以表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR(含有源自经修饰的IgG铰链-CH2-CH3的较长间隔子，如SEQ ID NO:174中所示)或BCMA-55-SS CAR(含有源自IgG4铰链的较短间隔子，如SEQ ID NO:237中所示)。将所述细胞以各种E:T比率与人BCMA表达K562靶细胞(BCMA-K562)靶细胞共培养。表达靶向不同抗原的CAR(抗CD19 CAR)的报告细胞用作对照。如图17所示，在含有不同间隔子长度的抗BCMA CAR中观察到Nur77-tdTomato表达水平是不同的，并且观察到对使用表达BCMA的靶细胞刺激的剂量依赖性反应。
实施例11：来自不同抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的抗原非依赖性(基础)信号传导
的评估
如以上实施例11所述用编码抗CD19 CAR(对照)、BCMA-55-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR、BCMA-23-LS-O/SSE CAR或BCMA-25-LS-O/SSE CAR的病毒载体转导Nur77-tdTomato报告细胞，不同之处在于对于转导的替代标记物是超级折叠绿色荧光蛋白sfGFP。在该模型中，在不存在BCMA抗原刺激的情况下，通过tdTomato表达指示基础信号传导。
还产生了编码含有不同的抗BCMA scFv的抗BCMA-52-LS-O/SSE CAR的病毒载体，并将其转导至报告细胞中。在没有抗原刺激的情况下孵育各种CAR表达细胞，以评估抗原非依赖性(基础)信号传导的程度，持续3天，并通过流式细胞术评价tdTomato的表达。
如图18所示，在不存在抗原刺激的情况下，各种CAR表达细胞系展现出不同程度的tdTomato表达。CAR表达细胞(由GFP+细胞指示)中tdTomato+细胞(指示基础报告物激活)的百分比在表达不同CAR的细胞中从0.23％到19.3％变化。
实施例12：来自含有不同细胞内结构域的抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的抗原非依
赖性(基础)信号传导的评估
在表达含有不同细胞内信号传导区的各种CAR的报告细胞中评估了抗原非依赖性(基础)信号传导。用编码抗CD19 CAR、BCMA-55-LS-O/SSE CAR、BCMA-26-LS-O/SSE CAR、BCMA-23-LS-O/SSE CAR或BCMA-52-LS-O/SSE CAR的病毒载体转导Nur77-tdTomato报告细胞，通常如实施例11和13中所述来产生，不同之处在于所述CAR含有源自4-1BB或CD28的细胞内结构域并且转导的替代标记物是截短的受体。在没有抗原刺激的情况下孵育各种CAR表达细胞，以评估抗原非依赖性(基础)信号传导的程度，并通过流式细胞术评价tdTomato的表达。
如图19A和图19B所示，各种CAR中的4-1BB和CD28来源的细胞内结构域导致不同水平的基础信号传导，如CAR+细胞中tdTomato+细胞的百分比(如基于替代标记物的表达所测定)所指示的。
实施例13：使用报告细胞系评估抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的抗原交叉反应性
对人BCMA具有特异性并通常如实施例11中所述产生的被工程化以表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR的Nur77-tdTomato细胞系用于评估CAR的抗原结合结构域的物种交叉反应性。表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR的报告细胞系以2:1或5:1的E:T比率与表达人BCMA(huBCMA)、鼠BCMA(muBCMA)或食蟹猴BCMA(cynoBCMA)的K562人骨髓性白血病细胞共培养。通过流式细胞术测定tdTomato+细胞的百分比。
如图20A所示，当与表达huBCMA的靶细胞一起培养时，在测试的两个E:T比率下，观察到超过90％的BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达细胞呈tdTomato+。相比之下，当与表达muBCMA的靶细胞一起培养时，只有很少的细胞呈tdTomato+，这表明交叉反应性非常低。当与表达cynoBCMA的靶细胞一起培养时，约10％至20％的细胞呈tdTomato+，这表明与cynoBCMA具有一定的交叉反应性。
将表达BCMA-55-LS-O/SSE CAR的报告细胞系与包被在96孔平底板上的渐增浓度(0、0.1、0.25、1、2.5、10、25和100μg/mL)的huBCMA和cynoBCMA一起孵育。测定了CAR细胞中tdTomato+细胞的百分比和tdTomato信号的平均荧光强度(MFI)。
如图20B和图20C所示，cynoBCMA在低浓度下不与BCMA-55-LS-O/SSE CAR发生交叉反应，但在高浓度下发生交叉反应。
实施例14：使用报告细胞系评估抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的抗原特异性
通过比较响应于BCMA表达MM1S靶细胞与被工程化以表达非BCMA蛋白的K562靶细胞的Jurkat Nur77报告细胞的激活，测试BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达细胞的激活的抗原特异性，所述非BCMA蛋白即组织蛋白酶G(CTSG)在实施例5C中显示出在低水平下被BCMA-55-scFv Fc识别。作为阴性对照，还评估了亲本K542细胞。简而言之，将用编码BCMA-55-LS-O/SSE CAR的病毒载体转导的Nur77报告细胞以5:1，1:1和1:5效应物:靶细胞比率与以上列出的靶细胞一起孵育24小时，并且通过流式细胞术测量表达RFP(RFP+)的细胞百分比来测定激活。结果证明，BCMA-55-LS-O/SSE CAR表达细胞被BCMA表达MM1S细胞激活，但不被BCMA阴性靶细胞(亲本细胞或表达非BCMA抗原CTSG的细胞)激活。
实施例15：测定BCMA-52和BCMA-55scFv的结合表位
使用完全不连续的表位定位通过在支架上化学连接肽(Chemical Linkage ofPeptides onto Scaffolds，CLIPS；Pepscan Presto BV，荷兰莱利斯塔德；参见例如Timmerman等人,(2007)J.Mol.Recognit.20:283-329)评估由示例性抗BCMAscFv克隆(BCMA-1、BCMA-5、BCMA-9、BCMA-23、BCMA-25、BCMA-26、BCMA-52和BCMA-55抗BCMA scFv)识别(例如特异性地结合)的表位。使用抗BCMA scFv克隆(如与小鼠Fc融合的那些(scFv-mFc))进行定位。
基于组合矩阵设计产生人BCMA的氨基酸残基1-54(如SEQ ID NO:164的氨基酸残基1-54所示)的线性和构象肽文库。在氨基官能化固体支持物上使用线性肽和结构模拟物，包括单环、α-螺旋、β-转角、组合和线性二硫桥模拟物和不连续的表位模拟物，以及阳性和阴性对照肽。
使用ELISA确定与表位文库中的肽的结合亲和力。将肽阵列与含有scFv的溶液在4℃下孵育过夜。在迭代筛选中使用亲和力信息来定义表位的序列和构象。生成两个或更多个环的亲和力信息的热图。
观察到评估的scFv识别构象表位，所述构象表位包括BCMA肽序列的若干个不连续肽段。观察到BCMA-1、BCMA-5、BCMA-23和BCMA-25scFv与肽30SNTPPLTCQR39(SEQ ID NO:160所示)结合，所述肽可以以线性形式被识别。在一些方面，此类抗体识别包含SEQ ID NO:160这种肽的残基的非线性或线性表位，并且在一些方面，识别还包含21CIPCQLR27(SEQ ID NO:159所示)、30SNTPPLTCQR39和/或44SVTNSVK50(SEQ ID NO:161所示)的残基的非线性表位。观察到BCMA-26scFv识别包含存在于8CSQNEYF14(SEQ ID NO:162所示)和17LLHACIPCQLR27(SEQID NO:158所示)中的残基的表位。观察到BCMA-52-scFv-mFc与含有以下不连续肽的残基的表位结合：10QNEYF14(SEQ ID NO:91)、21CIPCQL26(SEQ ID NO:92)和7CQRYC41(SEQ ID NO:93)。观察到BCMA-55-scFv-mFc与表位特异性地结合，所述表位含有存在于包含BCMA多肽序列的不连续部分的肽中的残基，所述不连续部分单独地包含以下序列：1MLMAG6(SEQ ID NO:122)、13YFDSL17(SEQ ID NO:21)和25QLRCSSNTPPL35(SEQ ID NO:124)。在一些实施方案中，所提供的抗体或受体与表位特异性地结合，所述表位包含存在于具有以下序列的不连续肽中的一个或多个(例如，每一个)内的残基：MLMAG(SEQ ID NO:122)、YFDSL(SEQ ID NO:21)和QLRCSSNTPPL(SEQ ID NO:124)。在一些方面，所提供的抗体或受体与表位特异性地结合，所述表位包含存在于具有以下序列的不连续肽中的一个或多个(例如，每一个)内的残基：MLMAG(SEQ ID NO:122)、YFDSLL(SEQ ID NO:123)和QLRCSSNTPPL(SEQ ID NO:124)；在一些方面，所提供的抗体或受体与表位特异性地结合，所述表位包含存在于具有以下序列的不连续肽中的一个或多个(例如，每一个)内的残基：MLMAG(SEQ ID NO:233)、QNEYFDSLL(SEQID NO:133)和QLRCSSNTPPL(SEQ ID NO:124)。
实施例16：向复发性或难治性多发性骨髓瘤(MM)受试者施用抗BCMA
CAR表达细胞
将含有表达对B细胞成熟抗原(BCMA)具有特异性的CAR的自体T细胞的嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞组合物施用至患有复发性和/或难治性多发性骨髓瘤(MM)的人受试者。
A.受试者和治疗
将含有被工程化以表达对BCMA具有特异性的示例性CAR的自体T细胞的组合物施用至患有复发性或难治性(R/R)多发性骨髓瘤(MM)的成人受试者，他们已经接受过3种或更多种先前的治疗(所述3种或更多种先前的治疗包括至少蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和抗CD38单克隆抗体，在除了受试者不是接受这种治疗的候选者(如通过忌服的方式)之外的每一种情况下。
所施用的T细胞组合物已经通过如下过程产生，所述过程包括从来自患有MM的单独受试者的白细胞单采术样品的CD4+和CD8+细胞群的基于免疫亲和力的富集，将此类群体的细胞(如以为或约1:1的比率)组合，以及使所述细胞经受处理步骤，包括刺激、在示例性无血清培养基中的细胞转导和扩增、和低温保存、以及产生具有一定范围的CD4+与CD8+CART细胞比率的细胞。与起始样品和使用不同的制造过程产生的细胞组合物相比，观察到所述过程产生的细胞组合物富集了中央记忆表型。所述CAR含有BCMA-55来源的scFv结合结构域、经修饰的IgG来源的CH2-CH3-铰链间隔子、CD28跨膜结构域和细胞内信号传导区(包括串联的4-1BB胞内域和CD3ζ胞内域)。编码抗BCMACAR的多核苷酸序列不包含已鉴定的潜在隐秘剪接供体和受体位点。
CAR+ T细胞输注前的两天至七天(并在CAR-T输注前至少48小时完成)受试者接受了使用氟达拉滨(flu，30mg/m2/天)和环磷酰胺(Cy，300mg/m2/天)的淋巴细胞耗尽化疗(LDC)，持续3天，LDC在CAR-T输注前的至少48小时完成。在静脉内施用之前，将低温保存的细胞组合物在床旁解冻，其中输液日指定为第1天。在第1天，向受试者施用如下剂量的CAR表达T细胞：含有5x107个总CAR表达T细胞的单剂量的剂量水平1(DL1)或含有1.5x108个总CAR表达T细胞的单剂量的剂量水平2(DL2)。
在分析的特定时间点，已有19名成人受试者参加了正在进行的涉及这种疗法的临床研究。在这个特定时间点的这19名受试者中，有13名受试者已被施用了抗BCMA CAR+细胞，每名受试者都以DL1或DL2施用。在这13名受试者中，在正在进行的研究的这个特定时间点，有8名受试者可评价指示安全性的属性(基于≥1个月随访的可评价性)(n＝5DL1；n＝3DL2)。由于LDC后的败血症导致在CAR+ T细胞施用前死亡，一名受试者无法接受CAR+ T细胞。根据国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准(Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)，三名受试者(全部DL1)在这个时间点可评价确认的反应(基于≥2个月随访的可评价性)。
对于在这个时间点评估的这8名受试者，中值随访为5周(范围为4-13周)。中值年龄为53岁(范围为36-66)，并且从诊断起的中值时间为4年(范围为2-12)。受试者已经接受过中值为10种(范围为4-15)的针对MM的先前方案。在8名受试者中，有4名(50％)对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和抗CD38单克隆抗体是难治的(在最后一次疗法后的60天内无反应或进展)。8名受试者中有7名(88％)已经进行过先前自体干细胞移植，并且8名受试者中有4名(50％)就有IMWG高风险细胞遗传学。
在正在进行的研究的时间点进行评估时，在接受DL1或DL2的所评估的受试者中未观察到剂量限制性毒性(DLT)。在所述时间点已在8名受试者中的6名(75％)观察到细胞因子释放综合征(CRS)(所有1级或2级)。8名受试者在所述时间点的中值CRS发作时间为9天(范围为4-10)，并且中值持续时间为4.5天(范围为2-19天)。在所述时间点具有2级CRS的受试者中，没有一名需要血管加压药支持，并且只有1名受试者接受过托珠单抗。没有一名受试者展现出3级或更高的CRS。8名受试者中有3名(38％)已经经历过神经系统不良事件(AE)。在所述时间点八名受试者中有两名已经展现过1级事件，并且1名已经展现过3级事件(嗜睡)，其在接受类固醇后24小时内已经缓解。对于3名经历神经病学AE的受试者，神经病学AE的发作分别为9、11和12天，持续时间为2、3和1天。截至所述时间点的分析，经历过3级神经毒性(NT)的受试者在接受LDC之前患上继发性浆细胞白血病(PCL)。
观察到在所述时间点包括患有继发性PCL的受试者在内的全部8名受试者都有客观反应的证据。观察到三名受试者(均施用了DL1)已实现了确认的反应(1名为部分反应，PR；2名为严格的完全反应，sCR)，而其余受试者仍未确认(1名为完全反应，CR；2名为非常好的部分反应，VGPR；1名为PR，1名为最小反应，MR)。截至评估的时间点，没有观察到受试者具有进展。
结果表明，在评估的剂量水平下，抗BCMA CAR细胞疗法的施用展现出有利的安全性，并且在正在进行的临床研究中在这个时间点尚无DLT报告。结果与以下结论一致：在这个时间点，3级或更高的NT的发生率较低，并且对于临床反应没有观察到3级或更高的CRS。
实施例17：评估通过示例性制造过程产生的T细胞组合物
在示例性过程中，从收集自50名单独的人受试者的单采术(每名受试者一个单采术)(包括10名健康供体和40名多发性骨髓瘤患者)中产生了含有表达抗BCMA CAR的自体T细胞的50种CAR+ T细胞组合物。从单采术样品中选择CD4+和CD8+ T细胞，并分开低温保存。然后将细胞解冻，并且将CD4+ T细胞和CD8+ T细胞以1:1的活CD4+与CD8+细胞的比率组合。刺激组合的CD4+和CD8+ T细胞，将其在示例性无血清培养基中用编码CAR的载体转导并扩增，并通过低温保存冷冻，通常如实施例16中所述。
在示例性替代性过程中，通过包括从来自55名单独人癌症受试者的白细胞单采术样品中基于免疫亲和力选择T细胞的过程来产生治疗性T细胞组合物。将混合T细胞进行激活并用编码CAR的病毒载体转导，扩增和低温保存。
将冷冻组合物中的细胞解冻，并通过流式细胞术评估其活力、凋亡标记物(如活性半胱天冬酶3(CAS))的表达、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CCR7和CD45RA和CAR的表面表达。确定了组合物中CD3+CAR+细胞中的CD3+细胞的百分比、CAR+凋亡标记物阴性细胞的百分比、以及组合物中中央记忆CD4+CAR+细胞的百分比和中央记忆CD8+CAR+细胞的百分比。评估了通过所述制造过程产生的细胞组合物的细胞表型，并且在一些方面将其与通过替代性过程产生的细胞组合物的那些细胞表型进行比较。
此实施例的制造过程导致经历所述制造过程的100％的人生物样品中满足某些预定特征的工程化细胞组合物，所述预定特征包括向患者施用的细胞组合物中的表达CAR的细胞的阈值数量。图22A和图22B示出了对于从来自40个多发性骨髓瘤患者的样品组单独生成的组合物，分别在组合物的CD4+CAR+细胞(图22A)中和CD8+CAR+细胞(图22B)中的所示表型(基于CD45RA和CCR7表面表达)的细胞百分比的中值(水平线)、四分位差(框)和1.5x四分位差(须)。图22C和图22D示出了对于从来自40个多发性骨髓瘤患者的样品组单独生成的组合物，分别在组合物的CD4+CAR+细胞(图22C)中和CD8+CAR+细胞(图22D)中的所示表型(基于CD27和CD28表面表达)的细胞的百分比的中值(水平线)、四分位数(框)和1.5x四分位数(须)。对于从一系列多发性骨髓瘤患者中获得的个体白细胞单采术样品，使用此示例性过程从此类样品中产生工程化细胞组合物，观察到从激活开始到收获的过程部分的持续时间范围在7天与10天之间，并且这些样品之间的平均持续时间为大约7.5天。进一步确定，在不同样品之间，整个过程的历程中平均累积群体倍增数为大约7.5。
在这项研究中，在通过示例性过程生产的细胞组合物中的工程化T细胞群包括小于15％的表达凋亡标记物的细胞，并且如与起始样品和与使用示例性替代性过程产生的细胞组合物相比，其富集了中央记忆表型。
实施例18：向复发性或难治性多发性骨髓瘤(MM)受试者施用抗BCMA
CAR表达细胞
后进一步评估反应和安全性结局
在实施例16中描述的临床研究中的后续时间点在患者中评估反应和安全性结局。
A.受试者和治疗
在本实施例中呈现的时间点的分析是基于对总计44名受试者的评估，这些受试者已经施用了抗BCMA CAR表达细胞。所述44名受试者是患有复发性或难治性(R/R)多发性骨髓瘤(MM)的成人受试者，他们已经接受过失败的3种或更多种先前的治疗(所述3种或更多种先前的治疗包括至少(1)自体干细胞移植、(2)单独或组合的蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂、以及(3)作为组合疗法的一部分或单一疗法的抗CD38单克隆抗体，在除了受试者不是接受这种治疗的候选者(如通过忌服的方式)之外的每一种情况下。治疗的受试者包括最后一个治疗线失败且东部肿瘤协作组(ECOG)得分在0与1之间的受试者。受试者不是根据受试者的样品中BCMA表达水平选择的。
在第1天，如下向受试者施用一定剂量的CAR+ T细胞：含有5x107个总CAR+ T细胞的单剂量的剂量水平1(DL1)、含有1.5x108个总CAR+T细胞的单剂量的剂量水平2(DL2)、含有3.0x108个总CAR+ T细胞的单剂量的剂量水平2A(DL2A)、或含有4.5x108个总CAR+ T细胞的单剂量的剂量水平3(DL3)。施用后第15天，进行骨髓检查，并在施用后第29天评估疾病。
随时间推移监测受试者的反应，包括客观反应率(ORR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、部分反应(PR)、非常好的部分反应(VGPR)、微小残留病(MRD)、疾病进展(PD)、疾病稳定(SD)和最小反应(MR)(例如，根据国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)；以及任何不良事件的发展，如严重不良事件(SAE)。在筛选评价时鉴定出主要克隆型的受试者中，通过下一代测序(NGS)评估微小残留病(MRD)。
在施用CAR表达T细胞后的第1、5、8、11、15、22、29、60和90天，通过使用对编码抗BCMA CAR的载体具有特异性的引物对来自受试者的全血样品的基因组DNA制剂进行定量聚合酶链式反应(qPCR)，评估DL1、DL2和DL3群组中的受试者外周血中抗BCMA CAR+ T细胞的扩增和长期持久性(载体拷贝/μg基因组DNA)。在施用CAR+ T细胞之前和施用CAR+T细胞后的不同时间点，还测量了受试者的血清样品中可溶性BCMA(sBCMA)的水平。
所述时间点的全部、DL1、DL2和DL3群组受试者的人口统计学和基线特征示于表E3中。受试者通常具有高度难治性骨髓瘤，其中77％受试者具有高风险细胞遗传学。接受了桥接疗法的受试者的多于50％在接受抗BCMA CAR+ T细胞施用之前展现出疾病进展。如通过血清和尿液M蛋白水平、血清游离轻链(FLC)水平以及在骨髓和髓外浆细胞瘤中的浆细胞的存在所指示，受试者在施用CAR+ T细胞之前通常具有高肿瘤负荷。
所述时间点的全部、DL1、DL2和DL3群组受试者的治疗史示于表E4中。
SCT，干细胞移植；IMiD，免疫调节药物；PI，蛋白酶体抑制剂。
B.治疗后的安全性和反应结局
表E5示出了在全部、DL1、DL2和DL3群组中发生的严重不良事件(SAE)。
CRS，细胞因子释放综合征；DLT，剂量限制性毒性；SAE，严重不良事件；AESI，特别关注的不良事件。
a肺炎、阑尾炎、弯曲菌感染、蜂窝组织炎、败血症。
b精神混乱状态、激动、无反射、嗜睡、意识状态低迷。
DL3群组中的一名受试者发生了4级CRS的DLT，所述受试者有与骨髓瘤相关的慢性肾脏疾病史，伴有意识模糊的神经病学事件以及缺乏咽反射、急性肾损伤和院内感染形式的克雷伯氏肺炎杆菌败血症，并在施用CAR+ T细胞后第19天死亡。
表E6显示了全部、DL1、DL2和DL3群组在CRS和神经病学事件方面的安全性结局。神经病学事件通常与CRS相关。1级或2级CRS发生在全部受试者的71％中，而3级或更高的CRS仅在全部受试者的9％中观察到。一名受试者经历了4级的无反射的神经病学事件。一名具有CRS事件的受试者需要高剂量血管加压药。
CRS，细胞因子释放综合征。
关于延长的血细胞减少症，例如，如根据实验室评估确定，在18％的受试者中发生了在淋巴细胞耗尽化疗开始之前的3级或4级贫血和血小板减少症。28/42名受试者(67％)发生了持续时间超过29天的3级或4级血细胞减少症。在3个月的随访中，17/24名受试者(71％)的血细胞减少症在第3个月时消退至≤2级。在一些情况下，到消退的中值时间对于嗜中性粒细胞减少症为2.1个月，对于贫血为2.2个月并且对于血小板减少症为3.4个月，其中在一些情况下，在实验室评估的1周内没有输血的情况下或在实验室评估的1周内没有生长因子支持的情况下(培非格司亭，2周)恢复被定义为2级或更低。
在全部、DL1、DL2和DL3群组之中基于最佳总体反应的客观反应率(ORR)示于图23中。在所有受试者中，观察到82％的ORR，其中受试者的48％展现出比VGPR更好的反应。在最低剂量水平的5x107个总CAR表达T细胞(DL1)中观察到43％的完全反应(CR)率。DL3群组中的一名受试者由于缺少第29天基线后反应评价而无法评价功效。表E7示出了通过下一代测序(NGS)在21名可以进行MRD评价的受试者中进行的最小残留病(MRD)评估的结果。
在施用CAR表达T细胞(n＝14)后，在最长的随访时，DL1群组中的受试者随时间而变的反应的评估示于图24中。通常，观察到反应随时间而继续改善，其中14名受试者中的五(5)名(36％)在第29天后显示出反应的加强。在进行MRD评价的九(9)名受试者中有六(6)名在第29天呈MRD阴性(由NGS评估)，其中一名受试者在第2个月进行MRD评估。
C.持久性
CAR+ T细胞在DL1、DL2和DL3群组中的受试者的外周血中的扩增和长期持久性示于图25中。结果与在所有剂量水平(DL1、DL2和DL3)下观察到的CAR+ T细胞的稳健扩增一致。通常，在施用了≥150x106个总CAR表达T细胞(DL2和DL3)的剂量的受试者中，观察到过去第2个月增加的持久性。
D.可溶性BCMA
在CAR+ T细胞施用之前和施用后不同时间点的受试者血清中可溶性BCMA(sBCMA)水平(ng/mL)示于图26A中。图26B显示了展现出PR或更好的总体反应的受试者(反应者)中和展现出比PR更差的反应的受试者(MR或SD；无反应者)中在CAR+ T细胞施用之前(治疗前)的sBCMA水平。在受试者中跨越广泛范围的sBCMA水平观察到反应，并且反应或缺乏反应与sBCMA水平无关。抗BCMA CAR施用后观察到sBCMA水平下降，这与抗BCMA CAR+细胞的肿瘤杀伤活性一致。结果显示，与具有比PR差的总体反应(MR或SD)的受试者相比，在具有PR或更好的总体反应的受试者(PR、VGPR、CR或sCR；反应者)中在第29天或以后观察到较大的sBCMA下降。结果与抗BCMA CAR+ T细胞不受高的治疗前sBCMA水平抑制的观察结果一致。
E.结论
所述结果与以下观察结果一致：响应于施用抗BCMA CAR+细胞的高总体反应率(ORR)(82％)在进行大量预治疗的患有复发性/难治性多发性骨髓瘤(R/R MM)的受试者中是高的，所述细胞表达完全人抗原结合结构域并且是通过制造过程产生的，所述过程导致富集了中央记忆T细胞表型的群体，所述受试者的77％具有高风险细胞遗传学。在所测试的所有剂量水平下观察到所施用的细胞的稳健扩增，并且大约27％的受试者实现了完全反应(CR)或严格的完全反应(sCR)，其中普遍观察到随着时间的推移反应加强。在施用的最低剂量水平(50x106个CAR+ T细胞)下观察到CR和sCR的43％高比率。结果也与可管理的毒性特征一致，包括3级或更高的CRS(9％)和3级或更高的神经病学事件(7％)的低比率。在大约71％的受试者中观察到1级或2级CRS，并且在18％的受试者中观察到1级或2级神经病学事件。结果还显示，抗BCMA CAR+ T细胞在具有治疗前的高可溶性BCMA水平的受试者中显示出活性。
在实施例16和本实施例中所述的临床研究的其他时间，向另外的受试者包括以含有6.0x108个总CAR+ T细胞的单剂量的剂量水平4(DL4)施用抗BCMA CAR表达细胞。
本发明在范围上并不旨在受限于具体公开的实施方案，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。此类变化可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践，并且旨在落入本公开文本的范围内。
序列
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
纪念斯隆凯特琳癌症中心
<120> 使用对B细胞成熟抗原具有特异性的嵌合抗原受体的治疗的方法
<130> 73504-20191.40
<140> 尚未分配
<141> 随同提交
<150> US 62/754,577
<151> 2018-11-01
<150> US 62/774,167
<151> 2018-11-30
<150> US 62/774,856
<151> 2018-12-03
<150> US 67/777,066
<151> 2018-12-07
<150> US 62/845,817
<151> 2019-05-09
<160> 255
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Gly Gly Ser
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<223> 4-1BB/CD3 ζ预测的剪接受体位点
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gctgagagtc aagttttcca ggtccgccga cgctccagcc t 41
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<220>
<223> 4-1BB来源的细胞内共信号传导序列
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
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<212> DNA
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<223> 4-1BB来源的细胞内共信号传导序列
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actacccagg aggaagacgg atgcagctgt aggtttcccg aggaagagga aggaggctgt 120
gagctg 126
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aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 替代性CO/SSE 间隔子
<400> 8
gaatctaagt acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caag 684
<210> 9
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 9
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc cctgaggctg 60
tcttgcgcag ccagcggctt cacctttagc gactactata tgtcctggat cagacaggca 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagctcct ctggctccac aatctactat 180
gccgactctg tgaagggccg gtttaccatc agcagagata acgccaagaa ttccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300
ggcgattaca ccgaggatta ttggggccag ggcacactgg tgaccgtgag ctccggcggc 360
ggcggctctg gaggaggagg cagcggcgga ggaggctccc agtctgccct gacacagcca 420
gccagcgtgt ccggctctcc cggacagtcc atcacaatct cttgtaccgg ctctagctcc 480
gacgtgggca agtacaacct ggtgtcctgg tatcagcagc cccctggcaa ggcccctaag 540
ctgatcatct acgatgtgaa caagaggcca tctggcgtga gcaatcgctt cagcggctcc 600
aagtctggca ataccgccac actgaccatc agcggcctgc agggcgacga tgaggcagat 660
tactattgtt ctagctacgg cggcagcaga tcctacgtgt tcggcacagg caccaaggtg 720
accgtgctgg aatctaagta cggaccgcct tgtcctcctt gtcccgctcc tcctgttgcc 780
ggaccttccg tgttcctgtt tcctccaaag cctaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 840
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaagagg atcccgaggt gcagttcaac 900
tggtatgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagttc 960
cagagcacct acagagtggt gtccgtgctg acagtgctgc accaggattg gctgaacggc 1020
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccta gcagcatcga gaaaaccatc 1080
tccaaggcca agggccagcc aagagagccc caggtttaca cactgcctcc aagccaagag 1140
gaaatgacca agaatcaggt gtccctgaca tgcctggtca agggcttcta cccctccgat 1200
atcgccgtgg aatgggagag caatggccag cctgagaaca actacaagac cacacctcct 1260
gtgctggaca gcgacggcag tttcttcctg tatagtagac tcaccgtgga taaatcaaga 1320
tggcaagagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380
acccagaaaa gcctgagcct gtctctgggc aagatgttct gggtgctcgt ggtcgttggc 1440
ggagtgctgg cctgttacag cctgctggtt accgtggcct tcatcatctt ttgggtcaag 1500
cggggcagaa agaagctgct ctacatcttc aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc 1560
acacaagagg aagatggctg ctcctgcaga ttccccgagg aagaagaagg cggctgcgag 1620
ctgagagtga agttcagcag atccgccgac gctccagcct atcagcaggg ccaaaaccag 1680
ctgtacaacg agctgaacct ggggagaaga gaagagtacg acgtgctgga taagcggaga 1740
ggcagagatc ctgaaatggg cggcaagccc agacggaaga atcctcaaga gggcctgtat 1800
aatgagctgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggaat gaagggcgag 1860
cgcagaagag gcaagggaca cgatggactg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat 1920
acctatgacg cactgcacat gcaggccctg ccacctaga 1959
<210> 10
<211> 1950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 10
gaggtgcagc tggtgcagag cggaggaggc ctggtgcagc ctggcaggtc cctgcgcctg 60
tcttgcaccg ccagcggctt cacatttggc gactatgcca tgtcctggtt caagcaggca 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgggcttt atccgctcta aggcctacgg cggcaccaca 180
gagtatgccg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgactc taagagcatc 240
gcctacctgc agatgaactc tctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgcagca 300
tggagcgccc caaccgatta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccggcggc 360
ggcggctctg gaggaggagg aagcggagga ggaggatccg acatccagat gacacagtcc 420
cctgcctttc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtgaccg tgacatgtcg cgcctcccag 480
ggcatctcta actacctggc ctggtatcag cagaagcccg gcaatgcccc tcggctgctg 540
atctacagcg cctccaccct gcagagcgga gtgccctccc ggttcagagg aaccggctat 600
ggcacagagt tttctctgac catcgacagc ctgcagccag aggatttcgc cacatactat 660
tgtcagcagt cttacaccag ccggcagaca tttggccccg gcacaagact ggatatcaag 720
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 780
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 840
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 900
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 960
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 1080
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 1140
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 1200
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 1260
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 1320
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 1380
agcctgagcc tgtctctggg caagatgttc tgggtgctcg tggtcgttgg cggagtgctg 1440
gcctgttaca gcctgctggt taccgtggcc ttcatcatct tttgggtcaa gcggggcaga 1500
aagaagctgc tctacatctt caagcagccc ttcatgcggc ccgtgcagac cacacaagag 1560
gaagatggct gctcctgcag attccccgag gaagaagaag gcggctgcga gctgagagtg 1620
aagttcagca gatccgccga cgctccagcc tatcagcagg gccaaaacca gctgtacaac 1680
gagctgaacc tggggagaag agaagagtac gacgtgctgg ataagcggag aggcagagat 1740
cctgaaatgg gcggcaagcc cagacggaag aatcctcaag agggcctgta taatgagctg 1800
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggaa tgaagggcga gcgcagaaga 1860
ggcaagggac acgatggact gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctatgac 1920
gcactgcaca tgcaggccct gccacctaga 1950
<210> 11
<211> 1953
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 11
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc tctgaggctg 60
agctgcgcag cctccggctt caccttttct gactactata tgagctggat caggcaggca 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtcttac atcagctcct ctggcagcac aatctactat 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tctcgcgata acgccaagaa tagcctgtat 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300
ggcccccctt cctttgatat ctggggccag ggcacaatgg tgaccgtgag ctccggagga 360
ggaggatccg gcggaggagg ctctggcggc ggcggctcta gctatgtgct gacccagcca 420
ccatccgtgt ctgtggcacc tggacagaca gcaaggatca cctgtggagc aaacaatatc 480
ggcagcaagt ccgtgcactg gtaccagcag aagcctggcc aggccccaat gctggtggtg 540
tatgacgatg acgatcggcc cagcggcatc cctgagagat tttctggcag caactccggc 600
aataccgcca cactgaccat ctctggagtg gaggcaggcg acgaggcaga ttacttctgt 660
cacctgtggg accggagcag agatcactac gtgttcggca caggcaccaa gctgaccgtg 720
ctggaatcta agtacggacc gccttgtcct ccttgtcccg ctcctcctgt tgccggacct 780
tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatcagcag gacccctgaa 840
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccaa gaggatcccg aggtgcagtt caactggtat 900
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gttccagagc 960
acctacagag tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 1020
tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaaaac catctccaag 1080
gccaagggcc agccaagaga gccccaggtt tacacactgc ctccaagcca agaggaaatg 1140
accaagaatc aggtgtccct gacatgcctg gtcaagggct tctacccctc cgatatcgcc 1200
gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg 1260
gacagcgacg gcagtttctt cctgtatagt agactcaccg tggataaatc aagatggcaa 1320
gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380
aaaagcctga gcctgtctct gggcaagatg ttctgggtgc tcgtggtcgt tggcggagtg 1440
ctggcctgtt acagcctgct ggttaccgtg gccttcatca tcttttgggt caagcggggc 1500
agaaagaagc tgctctacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gaccacacaa 1560
gaggaagatg gctgctcctg cagattcccc gaggaagaag aaggcggctg cgagctgaga 1620
gtgaagttca gcagatccgc cgacgctcca gcctatcagc agggccaaaa ccagctgtac 1680
aacgagctga acctggggag aagagaagag tacgacgtgc tggataagcg gagaggcaga 1740
gatcctgaaa tgggcggcaa gcccagacgg aagaatcctc aagagggcct gtataatgag 1800
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gaatgaaggg cgagcgcaga 1860
agaggcaagg gacacgatgg actgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctat 1920
gacgcactgc acatgcaggc cctgccacct aga 1953
<210> 12
<211> 1974
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 12
agctatgagc tgacacagcc tccaagcgcc tctggcacac ctggacagcg agtgacaatg 60
agctgtagcg gcaccagcag caacatcggc agccacagcg tgaactggta tcagcagctg 120
cctggcacag cccctaaact gctgatctac accaacaacc agcggcctag cggcgtgccc 180
gatagatttt ctggcagcaa gagcggcaca agcgccagcc tggctatttc tggactgcag 240
agcgaggacg aggccgacta ttattgtgcc gcctgggacg gctctctgaa cggccttgtt 300
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctg ggatctagag gtggcggagg atctggcggc 360
ggaggaagcg gaggcggcgg atctcttgaa atggctgaag tgcagctggt gcagtctggc 420
gccgaagtga agaagcctgg cgagagcctg aagatcagct gcaaaggcag cggctacagc 480
ttcaccagct actggatcgg ctgggtccga cagatgcctg gcaaaggcct tgagtggatg 540
ggcatcatct accccggcga cagcgacacc agatacagcc ctagctttca gggccacgtg 600
accatcagcg ccgacaagtc tatcagcacc gcctacctgc agtggtccag cctgaaggcc 660
tctgacaccg ccatgtacta ctgcgccaga tactctggca gcttcgacaa ttggggccag 720
ggcacactgg tcaccgtgtc cagcgagtct aaatacggac cgccttgtcc tccttgtccc 780
gctcctcctg ttgccggacc ttccgtgttc ctgtttcctc caaagcctaa ggacaccctg 840
atgatcagca ggacccctga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca agaggatccc 900
gaggtgcagt tcaactggta tgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct 960
agagaggaac agttccagag cacctacaga gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag 1020
gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaagggcct gcctagcagc 1080
atcgagaaaa ccatctccaa ggccaagggc cagccaagag agccccaggt ttacacactg 1140
cctccaagcc aagaggaaat gaccaagaat caggtgtccc tgacatgcct ggtcaagggc 1200
ttctacccct ccgatatcgc cgtggaatgg gagagcaatg gccagcctga gaacaactac 1260
aagaccacac ctcctgtgct ggacagcgac ggcagtttct tcctgtatag tagactcacc 1320
gtggataaat caagatggca agagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1380
ctgcacaacc actacaccca gaaaagcctg agcctgtctc tgggcaagat gttctgggtg 1440
ctcgtggtcg ttggcggagt gctggcctgt tacagcctgc tggttaccgt ggccttcatc 1500
atcttttggg tcaagcgggg cagaaagaag ctgctctaca tcttcaagca gcccttcatg 1560
cggcccgtgc agaccacaca agaggaagat ggctgctcct gcagattccc cgaggaagaa 1620
gaaggcggct gcgagctgag agtgaagttc agcagatccg ccgacgctcc agcctatcag 1680
cagggccaaa accagctgta caacgagctg aacctgggga gaagagaaga gtacgacgtg 1740
ctggataagc ggagaggcag agatcctgaa atgggcggca agcccagacg gaagaatcct 1800
caagagggcc tgtataatga gctgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1860
ggaatgaagg gcgagcgcag aagaggcaag ggacacgatg gactgtacca gggcctgagc 1920
accgccacca aggataccta tgacgcactg cacatgcagg ccctgccacc taga 1974
<210> 13
<211> 1962
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 13
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 60
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 120
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 180
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 240
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 300
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 360
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 420
ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 480
tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 540
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 600
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 660
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 720
accgtgtcca gcgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 780
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 840
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 900
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960
ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 1080
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 1140
gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc 1200
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 1260
cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca 1320
agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380
tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 1440
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1500
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 1560
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 1620
gagctgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgctccag cctatcagca gggccaaaac 1680
cagctgtaca acgagctgaa cctggggaga agagaagagt acgacgtgct ggataagcgg 1740
agaggcagag atcctgaaat gggcggcaag cccagacgga agaatcctca agagggcctg 1800
tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg aatgaagggc 1860
gagcgcagaa gaggcaaggg acacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1920
gatacctatg acgcactgca catgcaggcc ctgccaccta ga 1962
<210> 14
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 14
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 60
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 120
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 180
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 240
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 300
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 360
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 420
ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 480
tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 540
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 600
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 660
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 720
accgtgtcca gcgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 780
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 840
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 900
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960
ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 1080
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 1140
gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc 1200
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 1260
cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca 1320
agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380
tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 1440
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1500
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1560
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1620
tccagagtga agttcagcag atccgccgac gctccagcct atcagcaggg ccaaaaccag 1680
ctgtacaacg agctgaacct ggggagaaga gaagagtacg acgtgctgga taagcggaga 1740
ggcagagatc ctgaaatggg cggcaagccc agacggaaga atcctcaaga gggcctgtat 1800
aatgagctgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggaat gaagggcgag 1860
cgcagaagag gcaagggaca cgatggactg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat 1920
acctatgacg cactgcacat gcaggccctg ccacctaga 1959
<210> 15
<211> 653
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser
130 135 140
Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Asp Val Gly Lys Tyr Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Gly Leu Gln Gly Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Thr Val Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
305 310 315 320
Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
340 345 350
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
465 470 475 480
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
485 490 495
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
500 505 510
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
515 520 525
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
530 535 540
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
545 550 555 560
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
565 570 575
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
580 585 590
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
595 600 605
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
610 615 620
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
625 630 635 640
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650
<210> 16
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala
165 170 175
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ser Arg Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Asp Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
210 215 220
Tyr Thr Ser Arg Gln Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
245 250 255
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
465 470 475 480
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
485 490 495
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
500 505 510
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
515 520 525
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
530 535 540
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
545 550 555 560
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
565 570 575
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
580 585 590
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
595 600 605
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
610 615 620
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
625 630 635 640
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650
<210> 17
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
130 135 140
Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile
145 150 155 160
Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Met Leu Val Val Tyr Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp
210 215 220
Arg Ser Arg Asp His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
245 250 255
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
340 345 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
465 470 475 480
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
485 490 495
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
500 505 510
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
515 520 525
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
530 535 540
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
545 550 555 560
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
565 570 575
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
580 585 590
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
595 600 605
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
610 615 620
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
625 630 635 640
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650
<210> 18
<211> 658
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 18
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Ser Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
290 295 300
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
370 375 380
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
405 410 415
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
435 440 445
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val
465 470 475 480
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
485 490 495
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
500 505 510
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
515 520 525
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
530 535 540
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
545 550 555 560
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
565 570 575
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
580 585 590
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
595 600 605
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
610 615 620
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
625 630 635 640
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
645 650 655
Pro Arg
<210> 19
<211> 654
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 19
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val
145 150 155 160
Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
180 185 190
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val
465 470 475 480
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
485 490 495
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
500 505 510
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
515 520 525
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
530 535 540
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
545 550 555 560
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
565 570 575
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
580 585 590
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
595 600 605
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
610 615 620
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
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Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650
<210> 20
<211> 653
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 20
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val
145 150 155 160
Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
180 185 190
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val
465 470 475 480
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
485 490 495
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
500 505 510
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
515 520 525
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
530 535 540
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
545 550 555 560
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
565 570 575
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
580 585 590
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
595 600 605
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
610 615 620
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
625 630 635 640
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA 表位
<400> 21
Tyr Phe Asp Ser Leu
1 5
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 CDR-L1
<400> 22
Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Lys Tyr Asn Leu Val Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 CDR-L2
<400> 23
Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 CDR-L3
<400> 24
Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val
1 5 10
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 预测的剪接受体位点
<400> 25
ggctgattat tattgtagct catatggagg tagtaggtct t 41
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 预测的剪接受体位点
<400> 26
ctactacatg agctggatcc gccaggctcc agggaagggg c 41
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 预测的剪接受体位点 (O/SSE)
<400> 27
ctactatatg tcctggatca gacaggcacc tggcaagggc c 41
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 预测的剪接受体位点 (O/SSE)
<400> 28
ggcagattac tattgttcta gctacggcgg cagcagatcc t 41
<210> 29
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 scFv
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser
130 135 140
Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Asp Val Gly Lys Tyr Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Gly Leu Gln Gly Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 30
<211> 729
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23
<400> 30
Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr
20 25 30
Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr
65 70 75 80
Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys
85 90 95
Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys
100 105 110
Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr
130 135 140
Thr Cys Ala Thr Ala Cys Ala Thr Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Ala
145 150 155 160
Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Thr Ala Thr Ala
165 170 175
Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly
180 185 190
Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala
195 200 205
Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys
210 215 220
Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Thr
225 230 235 240
Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys
245 250 255
Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys
260 265 270
Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr
275 280 285
Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly
290 295 300
Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys
325 330 335
Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr
340 345 350
Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys
355 360 365
Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr
370 375 380
Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Gly Cys
385 390 395 400
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Thr Cys Ala
405 410 415
Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Thr
420 425 430
Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Thr
435 440 445
Cys Gly Ala Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly
450 455 460
Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr
465 470 475 480
Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala
485 490 495
Ala Thr Cys Thr Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala
500 505 510
Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys
515 520 525
Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala
530 535 540
Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Cys Ala Ala
545 550 555 560
Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly
565 570 575
Gly Thr Thr Thr Cys Thr Ala Ala Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr
580 585 590
Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly
595 600 605
Cys Ala Ala Cys Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly
610 615 620
Ala Cys Ala Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys
625 630 635 640
Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys
645 650 655
Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Thr Ala Gly Cys
660 665 670
Thr Cys Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala
675 680 685
Gly Gly Thr Cys Thr Thr Ala Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Gly Gly
690 695 700
Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly
705 710 715 720
Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Ala
725
<210> 31
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23
<400> 31
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc cctgaggctg 60
tcttgcgcag ccagcggctt cacctttagc gactactata tgtcctggat cagacaggca 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagctcct ctggctccac aatctactat 180
gccgactctg tgaagggccg gtttaccatc agcagagata acgccaagaa ttccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300
ggcgattaca ccgaggatta ttggggccag ggcacactgg tgaccgtgag ctccggcggc 360
ggcggctctg gaggaggagg cagcggcgga ggaggctccc agtctgccct gacacagcca 420
gccagcgtgt ccggctctcc cggacagtcc atcacaatct cttgtaccgg ctctagctcc 480
gacgtgggca agtacaacct ggtgtcctgg tatcagcagc cccctggcaa ggcccctaag 540
ctgatcatct acgatgtgaa caagaggcca tctggcgtga gcaatcgctt cagcggctcc 600
aagtctggca ataccgccac actgaccatc agcggcctgc agggcgacga tgaggcagat 660
tactattgtt ctagctacgg cggcagcaga tcctacgtgt tcggcacagg caccaaggtg 720
accgtgctg 729
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 VH 链
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 VL 链
<400> 33
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Lys Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Gly Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Gly Ser
85 90 95
Arg Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23, -26 CDR-H1 (aa) Kabat 编号
<400> 34
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23, -26 CDR-H2 (aa) Kabat 编号
<400> 35
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 CDR-H3 (aa)
<400> 36
Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr
1 5
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 CDR-H1 (aa) Kabat 编号
<400> 37
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 CDR-H2 (aa) Kabat 编号
<400> 38
Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 CDR-H3 (aa)
<400> 39
Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr
1 5
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 CDR-L1
<400> 40
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 CDR-L2
<400> 41
Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 CDR-L3
<400> 42
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Thr
1 5
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 预测的剪接受体位点
<400> 43
ctatgccatg tcctggttca ggcaggcacc aggcaagggc c 41
<210> 44
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 预测的剪接受体位点
<400> 44
gtccgcctct gtgggcgata gggtgaccgt gacatgtcgc g 41
<210> 45
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 预测的剪接受体位点
<400> 45
gtgggcttta tccgctctaa ggcctacggc ggcaccacag a 41
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 预测的剪接受体位点
<400> 46
gtgacatgtc gcgcctccca gggcatctct aactacctgg c 41
<210> 47
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 预测的剪接受体位点
<400> 47
tacagcgcct ccaccctgca gagcggagtg ccctcccggt t 41
<210> 48
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 预测的剪接受体位点 (O/SSE)
<400> 48
ctatgccatg tcctggttca agcaggcacc aggcaagggc c 41
<210> 49
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 scFv 序列
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala
165 170 175
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ser Arg Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Asp Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
210 215 220
Tyr Thr Ser Arg Gln Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
<210> 50
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 scFV
<400> 50
gaggtgcagc tggtgcagag cggaggaggc ctggtgcagc ctggcaggtc cctgcgcctg 60
tcttgcaccg ccagcggctt cacatttggc gactatgcca tgtcctggtt caggcaggca 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgggcttt atccgctcta aggcctacgg cggcaccaca 180
gagtatgccg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgactc taagagcatc 240
gcctacctgc agatgaactc tctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgcagca 300
tggagcgccc caaccgatta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccggcggc 360
ggcggctctg gaggaggagg aagcggagga ggaggatccg acatccagat gacacagtcc 420
cctgcctttc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtgaccg tgacatgtcg cgcctcccag 480
ggcatctcta actacctggc ctggtatcag cagaagcccg gcaatgcccc tcggctgctg 540
atctacagcg cctccaccct gcagagcgga gtgccctccc ggttcagagg aaccggctat 600
ggcacagagt tttctctgac catcgacagc ctgcagccag aggatttcgc cacatactat 660
tgtcagcagt cttacaccag ccggcagaca tttggccccg gcacaagact ggatatcaag 720
<210> 51
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 scFV (O/SSE)
<400> 51
gaggtgcagc tggtgcagag cggaggaggc ctggtgcagc ctggcaggtc cctgcgcctg 60
tcttgcaccg ccagcggctt cacatttggc gactatgcca tgtcctggtt caagcaggca 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgggcttt atccgctcta aggcctacgg cggcaccaca 180
gagtatgccg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgactc taagagcatc 240
gcctacctgc agatgaactc tctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgcagca 300
tggagcgccc caaccgatta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccggcggc 360
ggcggctctg gaggaggagg aagcggagga ggaggatccg acatccagat gacacagtcc 420
cctgcctttc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtgaccg tgacatgtcg cgcctcccag 480
ggcatctcta actacctggc ctggtatcag cagaagcccg gcaatgcccc tcggctgctg 540
atctacagcg cctccaccct gcagagcgga gtgccctccc ggttcagagg aaccggctat 600
ggcacagagt tttctctgac catcgacagc ctgcagccag aggatttcgc cacatactat 660
tgtcagcagt cttacaccag ccggcagaca tttggccccg gcacaagact ggatatcaag 720
<210> 52
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 VH 链
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 VL 链
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Arg Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 CDR-H3
<400> 54
Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile
1 5
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 CDR-L1
<400> 55
Gly Ala Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 CDR-L2
<400> 56
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 CDR-L3
<400> 57
His Leu Trp Asp Arg Ser Arg Asp His Tyr Val
1 5 10
<210> 58
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 scFv 序列
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
130 135 140
Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile
145 150 155 160
Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Met Leu Val Val Tyr Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp
210 215 220
Arg Ser Arg Asp His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu
<210> 59
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 scFV
<400> 59
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc tctgaggctg 60
agctgcgcag cctccggctt caccttttct gactactata tgagctggat caggcaggca 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtcttac atcagctcct ctggcagcac aatctactat 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tctcgcgata acgccaagaa tagcctgtat 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300
ggcccccctt cctttgatat ctggggccag ggcacaatgg tgaccgtgag ctccggagga 360
ggaggatccg gcggaggagg ctctggcggc ggcggctcta gctatgtgct gacccagcca 420
ccatccgtgt ctgtggcacc tggacagaca gcaaggatca cctgtggagc aaacaatatc 480
ggcagcaagt ccgtgcactg gtaccagcag aagcctggcc aggccccaat gctggtggtg 540
tatgacgatg acgatcggcc cagcggcatc cctgagagat tttctggcag caactccggc 600
aataccgcca cactgaccat ctctggagtg gaggcaggcg acgaggcaga ttacttctgt 660
cacctgtggg accggagcag agatcactac gtgttcggca caggcaccaa gctgaccgtg 720
ctg 723
<210> 60
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 scFV(O/SSE)
<400> 60
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc tctgaggctg 60
agctgcgcag cctccggctt caccttttct gactactata tgagctggat caggcaggca 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtcttac atcagctcct ctggcagcac aatctactat 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tctcgcgata acgccaagaa tagcctgtat 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300
ggcccccctt cctttgatat ctggggccag ggcacaatgg tgaccgtgag ctccggagga 360
ggaggatccg gcggaggagg ctctggcggc ggcggctcta gctatgtgct gacccagcca 420
ccatccgtgt ctgtggcacc tggacagaca gcaaggatca cctgtggagc aaacaatatc 480
ggcagcaagt ccgtgcactg gtaccagcag aagcctggcc aggccccaat gctggtggtg 540
tatgacgatg acgatcggcc cagcggcatc cctgagagat tttctggcag caactccggc 600
aataccgcca cactgaccat ctctggagtg gaggcaggcg acgaggcaga ttacttctgt 660
cacctgtggg accggagcag agatcactac gtgttcggca caggcaccaa gctgaccgtg 720
ctg 723
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 VH 链
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 VL 链
<400> 62
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp Arg Ser Arg Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H1
<400> 63
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H1 (aa) - AbM 编号
<400> 64
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H1 (aa) - Chothia 编号
<400> 65
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H1 (aa) - Kabat 编号
<400> 66
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H2 (aa)
<400> 67
Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H2 (aa) - AbM 编号
<400> 68
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
1 5 10
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H2 (aa) - Chothia 编号
<400> 69
Tyr Pro Gly Asp Ser Asp
1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H2 (aa) - Kabat 编号
<400> 70
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H3
<400> 71
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-H3 (aa) - Kabat, Chothia和AbM
编号
<400> 72
Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-L1
<400> 73
Ser Ser Asn Ile Gly Ser His Ser
1 5
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-L1 (aa) - Kabat, Chothia和AbM
编号
<400> 74
Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His Ser Val Asn
1 5 10
<210> 75
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-L2
<400> 75
Thr Asn Asn
1
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-L2 (aa) - Kabat, Chothia和AbM
编号
<400> 76
Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 CDR-L3 (aa) - Kabat, Chothia和AbM
编号
<400> 77
Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu Asn Gly Leu Val
1 5 10
<210> 78
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 预测的剪接受体位点
<400> 78
ctggccatca gtggcctcca gtctgaggat gaggctgatt a 41
<210> 79
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 预测的剪接受体位点
<400> 79
agatacagcc cgtccttcca aggccacgtc accatctcag c 41
<210> 80
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 预测的剪接受体位点 (O/SSE)
<400> 80
ctggctattt ctggactgca gagcgaggac gaggccgact a 41
<210> 81
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 预测的剪接受体位点 (O/SSE)
<400> 81
agatacagcc ctagctttca gggccacgtg accatcagcg c 41
<210> 82
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 scFv
<400> 82
tcctatgagc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatg 60
tcttgttctg gaaccagctc caacatcgga agtcactctg taaactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat actaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggcctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg gcagcctgaa tggtctggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggttctagag gtggtggtgg tagcggcggc 360
ggcggctctg gtggtggtgg atccctcgag atggccgagg tgcagctggt gcagtctgga 420
gcagaggtga aaaagcccgg ggagtctctg aagatctcct gtaagggttc tggatacagc 480
tttaccagct actggatcgg ctgggtgcgc cagatgcccg ggaaaggcct ggagtggatg 540
gggatcatct atcctggtga ctctgatacc agatacagcc cgtccttcca aggccacgtc 600
accatctcag ctgacaagtc catcagcact gcctacctgc agtggagcag cctgaaggcc 660
tcggacaccg ccatgtatta ctgtgcgcgc tactctggtt ctttcgataa ctggggtcaa 720
ggtactctgg tgaccgtctc ctca 744
<210> 83
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 scFv
<400> 83
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Ser Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 84
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 scFv (nt) (O/SSE)
<400> 84
agctatgagc tgacacagcc tccaagcgcc tctggcacac ctggacagcg agtgacaatg 60
agctgtagcg gcaccagcag caacatcggc agccacagcg tgaactggta tcagcagctg 120
cctggcacag cccctaaact gctgatctac accaacaacc agcggcctag cggcgtgccc 180
gatagatttt ctggcagcaa gagcggcaca agcgccagcc tggctatttc tggactgcag 240
agcgaggacg aggccgacta ttattgtgcc gcctgggacg gctctctgaa cggccttgtt 300
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctg ggatctagag gtggcggagg atctggcggc 360
ggaggaagcg gaggcggcgg atctcttgaa atggctgaag tgcagctggt gcagtctggc 420
gccgaagtga agaagcctgg cgagagcctg aagatcagct gcaaaggcag cggctacagc 480
ttcaccagct actggatcgg ctgggtccga cagatgcctg gcaaaggcct tgagtggatg 540
ggcatcatct accccggcga cagcgacacc agatacagcc ctagctttca gggccacgtg 600
accatcagcg ccgacaagtc tatcagcacc gcctacctgc agtggtccag cctgaaggcc 660
tctgacaccg ccatgtacta ctgcgccaga tactctggca gcttcgacaa ttggggccag 720
ggcacactgg tcaccgtgtc cagc 744
<210> 85
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 VH 链
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 VH 链
<400> 86
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca cgtcaccatc tcagctgaca agtccatcag cactgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gcgctactct 300
ggttctttcg ataactgggg tcaaggtact ctggtgaccg tctcctcagc 350
<210> 87
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 VH 链 (nt) (O/SSE)
<400> 87
gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgagag cctgaagatc 60
agctgcaaag gcagcggcta cagcttcacc agctactgga tcggctgggt ccgacagatg 120
cctggcaaag gccttgagtg gatgggcatc atctaccccg gcgacagcga caccagatac 180
agccctagct ttcagggcca cgtgaccatc agcgccgaca agtctatcag caccgcctac 240
ctgcagtggt ccagcctgaa ggcctctgac accgccatgt actactgcgc cagatactct 300
ggcagcttcg acaattgggg ccagggcaca ctggtcaccg tgtccagc 348
<210> 88
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 VL 链
<400> 88
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 89
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 VL 链
<400> 89
tcctatgagc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatg 60
tcttgttctg gaaccagctc caacatcgga agtcactctg taaactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat actaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggcctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg gcagcctgaa tggtctggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
<210> 90
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 VL 链 (nt) (O/SSE)
<400> 90
agctatgagc tgacacagcc tccaagcgcc tctggcacac ctggacagcg agtgacaatg 60
agctgtagcg gcaccagcag caacatcggc agccacagcg tgaactggta tcagcagctg 120
cctggcacag cccctaaact gctgatctac accaacaacc agcggcctag cggcgtgccc 180
gatagatttt ctggcagcaa gagcggcaca agcgccagcc tggctatttc tggactgcag 240
agcgaggacg aggccgacta ttattgtgcc gcctgggacg gctctctgaa cggccttgtt 300
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctg gga 333
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52-scFV-mFc BCMA 结合表位 1
<400> 91
Gln Asn Glu Tyr Phe
1 5
<210> 92
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52-scFV-mFc BCMA 结合表位 2
<400> 92
Cys Ile Pro Cys Gln Leu
1 5
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52-scFV-mFc BCMA 结合表位 3
<400> 93
Cys Gln Arg Tyr Cys
1 5
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H1
<400> 94
Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H1 (aa) - AbM 编号
<400> 95
Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H1 (aa) - Chothia 编号
<400> 96
Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
1 5
<210> 97
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H1 (aa) - Kabat 编号
<400> 97
Asp Tyr Tyr Val Tyr
1 5
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H2
<400> 98
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H2 - AbM 编号
<400> 99
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn
1 5 10
<210> 100
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H2 - Chothia 编号
<400> 100
Asn Pro Asn Ser Gly Gly
1 5
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H2 (aa) - Kabat 编号
<400> 101
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H3
<400> 102
Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-H3 (aa) - Kabat, Chothia和AbM
编号
<400> 103
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-L1
<400> 104
Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-L1 (aa) - Kabat, Chothia和AbM
编号
<400> 105
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly
1 5
<210> 106
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-L2
<400> 106
Glu Asp Ser
1
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-L2 (aa) - Kabat, Chothia和AbM
编号
<400> 107
Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 CDR-L3 (aa) - Kabat, Chothia和AbM
编号
<400> 108
Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val
1 5 10
<210> 109
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 预测的剪接受体位点
<400> 109
gccctcaggg gtttctaatc gcttctctgg ctccaagtct g 41
<210> 110
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 预测的剪接受体位点
<400> 110
cgaggctgat tattactgca gctcaaatac aagaagcagc a 41
<210> 111
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 预测的剪接受体位点 (O/SSE)
<400> 111
cgaggccgat tactactgca gcagcaacac ccggtccagc a 41
<210> 112
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 预测的剪接受体位点 (O/SSE)
<400> 112
gcccagcggc gtgtccaata gattcagcgg cagcaagagc g 41
<210> 113
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 scFv
<400> 113
caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgcgtctc ctggacagtc gatcgccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt tggtatcaac agcacccagg caaagccccc 120
aaactcatga tttatgagga cagtaagcgg ccctcagggg tttctaatcg cttctctggc 180
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggacgaggct 240
gattattact gcagctcaaa tacaagaagc agcactttgg tgttcggcgg agggaccaag 300
ctgaccgtcc taggttctag aggtggtggt ggtagcggcg gcggcggctc tggtggtggt 360
ggatccctcg agatggccga agtgcagctg gtgcagtctg gggctgagat gaagaagcct 420
ggggcctcac tgaagctctc ctgcaaggct tctggataca ccttcatcga ctactatgta 480
tactggatgc gacaggcccc tggacaaggg cttgagtcca tgggatggat caaccctaac 540
agtggtggca caaactatgc acagaagttt cagggcaggg tcaccatgac cagggacacg 600
tccatcagca cagcctacat ggagctgagc aggctgagat ctgacgacac cgccatgtat 660
tactgtgcgc gctcccagcg tgacggttac atggattact ggggtcaagg tactctggtg 720
accgtctcct ca 732
<210> 114
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 scFv
<400> 114
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val
145 150 155 160
Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
180 185 190
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 115
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 scFv (O/SSE)
<400> 115
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 60
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 120
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 180
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 240
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 300
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 360
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 420
ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 480
tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 540
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 600
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 660
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 720
accgtgtcca gc 732
<210> 116
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 VH 链
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 117
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 VH 链
<400> 117
gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag atgaagaagc ctggggcctc actgaagctc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcatc gactactatg tatactggat gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtc catgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac accgccatgt attactgtgc gcgctcccag 300
cgtgacggtt acatggatta ctggggtcaa ggtactctgg tgaccgtctc ctca 354
<210> 118
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 VH 链 (O/SSE)
<400> 118
gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag atgaagaaac ctggcgcctc tctgaagctg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcatc gactactacg tgtactggat gcggcaggcc 120
cctggacagg gactcgaatc tatgggctgg atcaacccca atagcggcgg caccaattac 180
gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg accagagaca ccagcatcag caccgcctac 240
atggaactga gccggctgag atccgacgac accgccatgt actactgcgc cagatctcag 300
cgcgacggct acatggatta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtgtc cagc 354
<210> 119
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 VL 链
<400> 119
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 120
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 VL 链
<400> 120
caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgcgtctc ctggacagtc gatcgccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt tggtatcaac agcacccagg caaagccccc 120
aaactcatga tttatgagga cagtaagcgg ccctcagggg tttctaatcg cttctctggc 180
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggacgaggct 240
gattattact gcagctcaaa tacaagaagc agcactttgg tgttcggcgg agggaccaag 300
ctgaccgtcc ta 312
<210> 121
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 VL 链 (O/SSE)
<400> 121
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 60
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 120
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 180
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 240
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 300
ctgacagtgc tg 312
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55-scFv-mFc BCMA 结合表位 1
<400> 122
Met Leu Met Ala Gly
1 5
<210> 123
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55-scFv-mFc BCMA 结合表位 2
<400> 123
Tyr Phe Asp Ser Leu Leu
1 5
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55-scFv-mFc BCMA 结合表位 3
<400> 124
Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu
1 5 10
<210> 125
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-C1 VH 链
<400> 125
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 126
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-C1 VH-VL scFv
<400> 126
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala
130 135 140
Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr
180 185 190
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 127
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-C1 VL 链 BCMA-C1 VL 链
<400> 127
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 128
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-C1 VL-VH scFv
<400> 128
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly
180 185 190
Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu
210 215 220
Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 129
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-C2 VH-VL scFv
<400> 129
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
130 135 140
His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr
180 185 190
Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Asp Ile Lys
<210> 130
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-C2 VL-VH scFv
<400> 130
Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Gly Met Asn Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met Ala Trp Ile Asn Thr Tyr
165 170 175
Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe
180 185 190
Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu
195 200 205
Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Glu Ile Tyr
210 215 220
Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ala
<210> 131
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-C2 VH 链
<400> 131
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-C2 VL 链
<400> 132
Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA 表位
<400> 133
Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu
1 5
<210> 134
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 胞外结构域间隔子
<400> 134
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 135
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 胞外结构域间隔子
<400> 135
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 136
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 胞内域
<400> 136
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 137
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 胞内域
<400> 137
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 138
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 跨膜结构域
<400> 138
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 139
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 跨膜结构域
<400> 139
atgttttggg tgctggtcgt ggtcggaggg gtgctggcct gttacagcct gctggtgaca 60
gtcgctttca tcatcttctg ggtg 84
<210> 140
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 跨膜结构域
<400> 140
atgttctggg tgctcgtggt cgttggcgga gtgctggcct gttacagcct gctggttacc 60
gtggccttca tcatcttttg ggtc 84
<210> 141
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28TM 预测的剪接受体位点
<400> 141
aggggtgctg gcctgttaca gcctgctggt gacagtcgct t 41
<210> 142
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33 信号肽
<400> 142
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 143
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域
<400> 143
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 144
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域
<400> 144
agagtcaagt tttccaggtc cgccgacgct ccagcctacc agcaggggca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336
<210> 145
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域
<400> 145
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgct ccagcctatc agcagggcca aaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg gagaagagaa gagtacgacg tgctggataa gcggagaggc 120
agagatcctg aaatgggcgg caagcccaga cggaagaatc ctcaagaggg cctgtataat 180
gagctgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgc 240
agaagaggca agggacacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300
tatgacgcac tgcacatgca ggccctgcca cctaga 336
<210> 146
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8 α信号肽
<400> 146
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 147
<211> 18
<212> PRT
<213> 食蟹猴 (Macaca fascicularis)
<220>
<223> 食蟹猴BCMA; GenBank号EHH60172.1
<400> 147
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 148
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A 肽
<400> 148
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 149
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A 肽
<400> 149
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF1a/HTLV 启动子正向引物
<400> 150
ctttttcgca acgggtttgc 20
<210> 151
<211> 544
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有HTLV1增强子的EF1α启动子
<400> 151
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540
ctac 544
<210> 152
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A 肽
<400> 152
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly
20
<210> 153
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A 肽
<400> 153
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 154
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号肽
<400> 154
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 155
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 155
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 156
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3 间隔子
<400> 156
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 157
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子
<400> 157
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 158
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人BCMA 表位 (残基 17-27)
<400> 158
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 159
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人BCMA 表位 (残基 21-27)
<400> 159
Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg
1 5
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人BCMA 表位 (残基 30-39)
<400> 160
Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg
1 5 10
<210> 161
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人BCMA 表位 (残基 44-50)
<400> 161
Ser Val Thr Asn Ser Val Lys
1 5
<210> 162
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人BCMA 表位 (残基 8-15)
<400> 162
Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe
1 5
<210> 163
<211> 135
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人BCMA 变体; GenBank号ABN42510.1
<400> 163
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Arg Ser Gly Leu Leu
35 40 45
Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu Ile
50 55 60
Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys Glu
65 70 75 80
Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe Pro
85 90 95
Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys Thr
100 105 110
Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile
115 120 125
Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
130 135
<210> 164
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人BCMA; GenBank号BAB60895.1
<400> 164
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 165
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人BCMA; NCBI号NP_001183.2
<400> 165
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 166
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人IgG -κ 信号肽
<400> 166
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 167
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人IgG -κ 信号序列
<400> 167
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60
<210> 168
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人IgG -κ 信号序列
<400> 168
atggtgctgc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60
<210> 169
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人IgG -κ 信号序列
<400> 169
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctacggc 60
<210> 170
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人IgG -κ 信号序列
<400> 170
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatgga 60
<210> 171
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG -κ 信号序列
<400> 171
atggtgctgc agacacaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctctgg agcatacgga 60
<210> 172
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人IgG2 Fc (Uniprot P01859)
<400> 172
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 173
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapien)
<220>
<223> 人IgG4 Fc (Uniprot P01861)
<400> 173
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 174
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的IgG4 铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 间隔子
<400> 174
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 175
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的IgG4 铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 间隔子
<400> 175
gaatctaagt acggaccgcc ctgccctccc tgccctgctc ctcctgtggc tggaccaagc 60
gtgttcctgt ttccacctaa gcctaaagat accctgatga tttcccgcac acctgaagtg 120
acttgcgtgg tcgtggacgt gagccaggag gatccagaag tgcagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aagtccacaa tgctaagact aaaccccgag aggaacagtt tcagtcaact 240
taccgggtcg tgagcgtgct gaccgtcctg catcaggatt ggctgaacgg gaaggagtat 300
aagtgcaaag tgtctaataa gggactgcct agctccatcg agaaaacaat tagtaaggca 360
aaagggcagc ctcgagaacc acaggtgtat accctgcccc ctagccagga ggaaatgacc 420
aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtc aaaggcttct atccaagtga catcgccgtg 480
gagtgggaat caaatgggca gcccgagaac aattacaaga ccacaccacc cgtgctggac 540
tctgatggaa gtttctttct gtattccagg ctgaccgtgg ataaatctcg ctggcaggag 600
ggcaacgtgt tctcttgcag tgtcatgcac gaagccctgc acaatcatta tacacagaag 660
tcactgagcc tgtccctggg caaa 684
<210> 176
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 176
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 177
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MND 启动子
<400> 177
tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60
aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120
agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 180
aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 240
atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300
gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 360
tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399
<210> 178
<211> 554
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的EF1 α启动子
<400> 178
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540
ctacggctag cgcc 554
<210> 179
<211> 185
<212> PRT
<213> 小家鼠 (Mus musculus)
<220>
<223> 小鼠 BCMA; NCBI号NP_035738.1
<400> 179
Met Ala Gln Gln Cys Phe His Ser Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Cys Lys Pro Cys His Leu Arg Cys Ser Asn Pro Pro Ala Thr Cys
20 25 30
Gln Pro Tyr Cys Asp Pro Ser Val Thr Ser Ser Val Lys Gly Thr Tyr
35 40 45
Thr Val Leu Trp Ile Phe Leu Gly Leu Thr Leu Val Leu Ser Leu Ala
50 55 60
Leu Phe Thr Ile Ser Phe Leu Leu Arg Lys Met Asn Pro Glu Ala Leu
65 70 75 80
Lys Asp Glu Pro Gln Ser Pro Gly Gln Leu Asp Gly Ser Ala Gln Leu
85 90 95
Asp Lys Ala Asp Thr Glu Leu Thr Arg Ile Arg Ala Gly Asp Asp Arg
100 105 110
Ile Phe Pro Arg Ser Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys Glu
115 120 125
Asp Cys Val Lys Ser Lys Pro Lys Gly Asp Ser Asp His Phe Phe Pro
130 135 140
Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys Thr
145 150 155 160
Gly Asp Tyr Gly Lys Ser Ser Val Pro Thr Ala Leu Gln Ser Val Met
165 170 175
Gly Met Glu Lys Pro Thr His Thr Arg
180 185
<210> 180
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 180
cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca a 41
<210> 181
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 181
gggcaacgtg ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg c 41
<210> 182
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 182
cggagtgctg gcctgttaca gcctgctggt taccgtggcc t 41
<210> 183
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 183
gctgagagtg aagttcagca gatccgccga cgctccagcc t 41
<210> 184
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 184
acacctccac tggatcccca agagctggat atcctgaaaa c 41
<210> 185
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 185
accggattcc tcctgatcca agcctggcca gagaacagaa c 41
<210> 186
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 186
acggccagtt tagcctggct gtggtgtctc tgaacatcac c 41
<210> 187
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 187
aagtttcttt ctgtattcca gactgaccgt ggataaatct c 41
<210> 188
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接受体位点
<400> 188
cgccttgtcc tccttgtccc gctcctcctg ttgccggacc t 41
<210> 189
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 189
agtctaaata cggac 15
<210> 190
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 190
tcaactggta tgtgg 15
<210> 191
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 191
accatctcca aggcc 15
<210> 192
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 192
gccccaggtt tacac 15
<210> 193
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 193
tcagcagatc cgccg 15
<210> 194
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 194
ctcctgtgtg aactc 15
<210> 195
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 195
tcggaaagtg tgcaa 15
<210> 196
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 196
cagcacggcc agttt 15
<210> 197
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 197
aaccggggcg agaac 15
<210> 198
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点
<400> 198
ctggaaggcg agccc 15
<210> 199
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的剪接供体位点 (编码区之外的最近4 nt)
<400> 199
tgttcatgtg agcgg 15
<210> 200
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的经 SSE 修饰的IgG4 铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4
CH3 间隔子
<400> 200
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caag 684
<210> 201
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A 肽
<400> 201
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 202
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A 肽
<400> 202
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 203
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接受体位点
<400> 203
cgccttgtcc tccttgtcca gctcctcctg ttgccggacc t 41
<210> 204
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接受体位点
<400> 204
cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca a 41
<210> 205
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接受体位点
<400> 205
accggattcc tcctgattca ggcctggcca gagaacagaa c 41
<210> 206
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 206
cgtctaggta agttt 15
<210> 207
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 207
gaccaaggtg accgt 15
<210> 208
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 208
tgcactggta ccagc 15
<210> 209
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 209
taaactggta ccagc 15
<210> 210
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 210
atctcctgta agggt 15
<210> 211
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 211
ggtcaaggta ctctg 15
<210> 212
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 212
gaggacagta agcgg 15
<210> 213
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 213
ggtcaaggta ctctg 15
<210> 214
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 214
tgcctccgtg tctgc 15
<210> 215
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 215
caccaaggtg accgt 15
<210> 216
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 216
tgaactggta tcagc 15
<210> 217
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 217
atctcttgaa atggt 15
<210> 218
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 218
ggccagggca cactg 15
<210> 219
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 219
gaggacagca agagg 15
<210> 220
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 220
ggccagggaa ccctg 15
<210> 221
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 221
tgccagcgtt agtgc 15
<210> 222
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 222
aatctaagta cggac 15
<210> 223
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 223
tcaactggta cgtgg 15
<210> 224
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 224
acaattagta aggca 15
<210> 225
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 225
accacaggtg tatac 15
<210> 226
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 226
tttccaggtc cgccg 15
<210> 227
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 227
ctgctctgtg agtta 15
<210> 228
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 228
acgcaaagtg tgtaa 15
<210> 229
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 229
caacatggtc agttt 15
<210> 230
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 230
aacagaggtg aaaac 15
<210> 231
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接供体位点
<400> 231
ctggagggtg agcca 15
<210> 232
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子预测的剪接受体位点
<400> 232
tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata t 41
<210> 233
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子预测的剪接受体位点
<400> 233
tgaactgcgt ccgccgtcta ggtaagttta aagctcaggt c 41
<210> 234
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子预测的剪接受体位点
<400> 234
ttctgttctg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg c 41
<210> 235
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚好在WPRE的5'处的反向引物
<400> 235
gatatcgaat tcctgcagcc 20
<210> 236
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子 - 密码子优化的
<400> 236
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtccagctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ttggtacgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caaa 684
<210> 237
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链
<400> 237
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 238
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 238
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 239
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子预测的剪接受体位点
<400> 239
aagtttcttt ctgtattcca ggctgaccgt ggataaatct c 41
<210> 240
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子预测的剪接受体位点
<400> 240
gggcaacgtg ttctcttgca gtgtcatgca cgaagccctg c 41
<210> 241
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 肽
<400> 241
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 242
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 肽
<400> 242
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 243
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 肽
<400> 243
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 244
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 肽
<400> 244
ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta gg 72
<210> 245
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 肽
<400> 245
cttgaaggtg gtggcgaagg cagaggcagc ctgcttacat gcggagatgt ggaagagaac 60
cccggaccta ga 72
<210> 246
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的 EGFR (tEGFR) 序列
<400> 246
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 247
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的 EGFR (tEGFR) 序列
<400> 247
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600
cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660
ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720
aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780
acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840
gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900
gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960
ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020
ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074
<210> 248
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的 EGFR (tEGFR) 序列 (nt) (O/SSE)
<400> 248
atgctgctcc tcgtgacaag cctgctcctg tgtgaactcc ctcatccagc ttttctgctc 60
attcctcgga aagtgtgcaa cggcatcggc atcggagagt tcaaggacag cctgagcatc 120
aatgccacca acatcaagca cttcaagaat tgcaccagca tcagcggcga cctgcacatt 180
ctgcctgtgg cctttagagg cgacagcttc acccacacac ctccactgga tccccaagag 240
ctggatatcc tgaaaaccgt gaaagagatt accggattcc tcctgatcca agcctggcca 300
gagaacagaa ccgatctgca cgccttcgag aacctcgaga tcatcagagg ccggaccaaa 360
cagcacggcc agtttagcct ggctgtggtg tctctgaaca tcaccagtct gggcctgaga 420
agcctgaaag aaatctccga cggcgacgtg atcatctccg gaaacaagaa cctgtgctac 480
gccaacacca tcaactggaa gaagctgttc ggcacctccg gccagaaaac aaagatcatc 540
tctaaccggg gcgagaacag ctgcaaggcc accggacaag tttgtcacgc cctgtgtagc 600
cctgaaggct gttggggacc cgaacctaga gactgtgtgt cctgccggaa tgtgtcccgg 660
ggcagagaat gtgtggataa gtgcaacctg ctggaaggcg agccccgcga gtttgtggaa 720
aacagcgagt gcatccagtg tcaccccgag tgtctgcccc aggccatgaa cattacatgc 780
accggcagag gccccgacaa ctgtattcag tgcgcccact acatcgacgg ccctcactgc 840
gtgaaaacat gtccagctgg cgtgatggga gagaacaaca ccctcgtgtg gaagtatgcc 900
gacgccggac atgtgtgcca cctgtgtcac cctaattgca cctacggctg taccggacct 960
ggcctggaag gatgccctac aaacggccct aagatcccca gcattgccac cggaatggtt 1020
ggagccctgc tgcttctgtt ggtggtggcc ctcggaatcg gcctgttcat gtga 1074
<210> 249
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的标记物预测的剪接受体位点
<400> 249
actcctcctc tggatccaca ggaactggat attctgaaaa c 41
<210> 250
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的标记物预测的剪接受体位点
<400> 250
acagggtttt tgctgattca ggcttggcct gaaaacagga c 41
<210> 251
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的标记物预测的剪接受体位点
<400> 251
atggtcagtt ttctcttgca gtcgtcagcc tgaacataac a 41
<210> 252
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的标记物预测的剪接供体位点
<400> 252
tcttcatgtg agcgg 15
<210> 253
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 土拨鼠肝炎病毒 (WHP)
转录后调节元件 (WPRE)
<400> 253
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 254
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 预测的剪接位点
<400> 254
tcaattggta cgtgg 15
<210> 255
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 255
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
Claims (179)
1.一种治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；
其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
2.一种治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂；
蛋白酶体抑制剂；以及
抗CD38抗体。
3.一种治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和
CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的
CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
4.一种治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：
在为或约1x107个CAR表达(CAR+)T细胞与为或约2x109个之间的CAR+T细胞；
以为或为约1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间的CD4+CAR+T细胞与CD8+CAR+T细胞和/或CD4+T细胞与CD8+T细胞的确定比率的CD4+T细胞和CD8+T细胞的组合；并且
所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR+T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域与B细胞成熟抗原(BCMA)结合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述VH是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述VL是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含scFv。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述VH和所述VL通过柔性接头接合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述scFv包含含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)的接头。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述VH是所述VL的羧基末端。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含SEQID NO:114的氨基酸序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含SEQID NO:114的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中编码所述细胞外抗原结合结构域的核酸包含(a)SEQ ID NO:113的核苷酸序列；(b)与其具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的简并序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中编码所述细胞外抗原结合结构域的所述核酸包含SEQ ID NO:115的核苷酸序列。
15.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述VH是所述VL的氨基末端。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述胞质信号传导结构域是或包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含4-1BB、任选人4-1BB的细胞内信号传导结构域。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区是或包含SEQID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区在所述跨膜结构域与所述CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域之间。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是或包含SEQ IDNO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述CAR从其N至C末端依次包含：所述细胞外抗原结合结构域、所述间隔子、所述跨膜结构域和所述细胞内信号传导区。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
(b)间隔子，所述间隔子包含经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子具有约228个氨基酸的长度；
(c)来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
25.根据权利要求1-14和16-24中任一项所述的方法，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列或与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述共刺激信号传导区包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
26.根据权利要求1-14和16-25中任一项所述的方法，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列；
(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列；
(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含含有SEQ ID NO:143中所示序列的胞质信号传导结构域和含有SEQ ID NO:4中所示序列的共刺激信号传导区。
27.根据权利要求1-14和16-26中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:19中所示序列。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中在人细胞、任选人T细胞中表达编码所述CAR的多核苷酸后，从所述多核苷酸转录的RNA、任选信使RNA(mRNA)展现出至少70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA同质性。
29.根据权利要求1-14和16-28中任一项所述的方法，其中所述CAR由以下多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:13中所示序列或与其展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
30.根据权利要求1-14和16-29中任一项所述的方法，其中所述CAR由包含SEQ ID NO:13中所示序列的多核苷酸序列编码。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中在存在可溶性或脱落形式的BCMA的情况下，在暴露于表达表面BCMA的细胞后，所述细胞外抗原结合结构域和/或所述CAR的结合或指示所述CAR的功能或活性的量度未被降低或阻断或未被明显降低或阻断。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述可溶性或脱落形式的所述BCMA的浓度或量对应于所述受试者或多发性骨髓瘤患者的血清或血液或血浆中存在的浓度或量，或者多发性骨髓瘤患者群体中的平均浓度或平均量；或者为一定浓度或量的所述可溶性或脱落BCMA，在所述浓度或量下对于相同测定中表达参考抗BCMA重组受体、任选参考抗BCMA CAR的细胞，所述结合或量度被降低或阻断或者被明显降低或阻断。
33.根据权利要求1-3和5-32中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含在为或约1x107个CAR+T细胞与为或约2x109个之间的CAR+T细胞。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约5x107个细胞或CAR+T细胞。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约1.5x108个细胞或CAR+T细胞。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约3x108个细胞或CAR+T细胞。
37.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约4.5x108个细胞或CAR+T细胞。
38.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约6x108个细胞或CAR+T细胞。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的组合。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞的组合。
41.根据权利要求38或39所述的方法，其中CD4+CAR+T细胞与CD8+CAR+T细胞和/或CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率为或为约为1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述剂量的工程化T细胞包含CD3+CAR+T细胞。
43.根据权利要求1-3和5-42中任一项所述的方法，其中在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR+T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约5％、4％、3％、2％或1％的CAR+T细胞表达膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
45.根据权利要求2-44中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
46.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天。
47.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约30mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨以及每天施用为或约300mg/m2受试者体表面积的环磷酰胺，持续3天。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或怀疑患有复发性或难治性多发性骨髓瘤(R/R MM)。
50.根据权利要求1和3-49中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时或之前，所述受试者已经接受过三种或更多种针对所述疾病或障碍的先前疗法、任选四种或更多种先前疗法，其任选地选自：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂；
蛋白酶体抑制剂；以及
抗CD38抗体。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时或之前，所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种针对所述疾病或障碍的先前疗法：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂或蛋白酶体抑制剂或其组合；以及
抗CD38抗体。
52.根据权利要求2和5-51中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述三种或更多种先前疗法后已经复发或是难治的。
53.根据权利要求2和5-52中任一项所述的方法，其中所述免疫调节剂选自沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
54.根据权利要求2和5-53中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。
55.根据权利要求2和5-54中任一项所述的方法，其中所述抗CD38抗体是或包含达雷木单抗。
56.根据权利要求1、2和4-55中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时和/或在淋巴细胞耗尽化疗或白细胞单采术时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时，所述受试者已经患上继发性浆细胞白血病(PCL)。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者在至少3种或至少4种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者是成人受试者或年龄为25或35岁或更大。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者从多发性骨髓瘤的诊断起的时间为约4年或者在2与15年之间或在2与12年之间。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者已经接受过约10种或者在3与15种或4与15种针对多发性骨髓瘤的先前方案。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者已经对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和/或抗CD38单克隆抗体是难治的或无反应。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者已经进行过先前自体干细胞移植。
64.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者尚未进行过先前自体干细胞移植。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者具有IMWG高风险细胞遗传学。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中在患有所述疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述方法能够任选地在开始所述施用后的指定时间点实现规定的反应或结局，其中：
所述反应选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)；
所述反应或结局是或包括OR；和/或
所述反应或结局是或包括CR。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述受试者群组具有与通过所述方法治疗的受试者至少相同数量的先前疗法、预后或预后因素、亚型、二次受累或其他一种或多种规定的患者特征。
68.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述反应或结局是或包括OR，并且在所述群组的至少50％、60％、70％或80％的受试者中实现。
69.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述反应或结局是或包括VGPR、CR或sCR，并且在所述群组的至少40％、45％或50％的受试者中实现。
70.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述反应或结局是或包括CR或sCR，并且在所述群组的至少20％、30％或40％的受试者中实现。
71.根据权利要求66-70中任一项所述的方法，其中所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。
72.根据权利要求66-70中任一项所述的方法，其中与在所述指定时间点测定的反应或结局相比，在所述指定时间点之后为或约3、6、9或12个月时测定的反应或结局是相等的或改善的。
73.根据权利要求66-72中任一项所述的方法，其中所述反应或结局是或包括或者还包括不存在神经毒性或不存在细胞因子释放综合征(CRS)。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中在患有所述疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述方法任选地在开始所述施用后的指定时间点不导致规定的毒性结局。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述规定的毒性结局是神经毒性。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述规定的毒性结局是神经毒性，并且在所述群组中的至少60％、70％或80％的受试者中未导致神经毒性。
77.根据权利要求74-76中任一项所述的方法，其中所述规定的毒性结局是3级或更高或4级或更高的神经毒性。
78.根据权利要求74-77中任一项所述的方法，其中所述规定的毒性结局是3级或更高的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致3级或更高的神经毒性。
79.根据权利要求74所述的方法，其中所述规定的毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)。
80.根据权利要求74或79所述的方法，其中所述规定的毒性结局是CRS，并且在所述群组中的至少15％、20％、25％或30％的受试者中未导致CRS。
81.根据权利要求74、79和80中任一项所述的方法，其中所述规定的毒性结局是3级或更高或4级或更高的细胞因子释放综合征(CRS)。
82.根据权利要求74和79-81中任一项所述的方法，其中所述规定的毒性结局是3级或更高的CRS，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致实现3级或更高的CRS。
83.根据权利要求66-82中任一项所述的方法，其中所述指定时间点是在开始所述施用后为或约1个月。
84.根据权利要求66-82中任一项所述的方法，其中所述指定时间点是在开始所述施用后为或约3个月。
85.根据权利要求66-82中任一项所述的方法，其中所述指定时间点是在开始所述施用后为或约6个月。
86.根据权利要求66-82中任一项所述的方法，其中所述指定时间点是在开始所述施用后为或约9个月。
87.根据权利要求66-82中任一项所述的方法，其中所述指定时间点是在开始所述施用后为或约12个月。
88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有记忆表型。
89.根据权利要求1-88中任一项所述的方法，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有中央记忆表型。
90.根据权利要求1-89中任一项所述的方法，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+。
91.根据权利要求1-90中任一项所述的方法，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞呈CCR7+/CD45RA-或呈CCR7+/CD45RO+。
92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所施用的剂量中的细胞通过用于产生展现出预先确定的特征的输出组合物的方法来产生，其中当在多名不同的单独受试者之中进行时，所述方法的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中所述多种输出组合物之中的所述输出组合物的预先确定的特征选自：
所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中具有中央记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD4+T细胞、任选CAR+CD4+T细胞中的中央记忆CD4+T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD8+T细胞、任选CAR+CD8+T细胞中的中央记忆CD8+T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；和/或
所述多种输出组合物的工程化T细胞、任选CAR+T细胞中的中央记忆T细胞、任选CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所施用的剂量通过用于产生输出组合物的方法来产生，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述方法是在多名不同的单独受试者之中进行的。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述多名不同的单独受试者包括患有疾病或病症的受试者。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述癌症是血液癌症、任选多发性骨髓瘤。
97.一种用于根据权利要求1-96中任一项所述的方法中的一定剂量的工程化T细胞，其中所述剂量在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中包含含有嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；并且
在施用后，在受试者群组或其可评价的受试者中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述剂量的工程化T细胞能够任选地在开始所述施用后的指定时间实现规定的反应或结局，其中所述受试者群组是患有多发性骨髓瘤的群组。
98.根据权利要求97所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
(b)间隔子，所述间隔子包含经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子具有约228个氨基酸的长度；
(c)来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
99.根据权利要求97或98所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列或与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述共刺激信号传导区包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
100.根据权利要求97-99中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列；
(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列；
(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含含有SEQ ID NO:143中所示序列的胞质信号传导结构域和含有SEQ ID NO:4中所示序列的共刺激信号传导区。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含SEQ ID NO:19中所示序列。
102.根据权利要求97-101中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始所述施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约1、2、3、6、9、12、18、24、30或36个月。
103.根据权利要求97-102中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始所述施用后的指定时间点，即在所述开始后1、2、3、6、9或12个月。
104.根据权利要求97-103中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始所述施用后的指定时间点，即在所述开始后1、2或3个月。
105.根据权利要求97-103中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约1个月。
106.根据权利要求97-103中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约3个月。
107.根据权利要求97-103中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约6个月。
108.根据权利要求97-103中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约9个月。
109.根据权利要求97-103中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局的实现是在开始施用后的指定时间点，即在所述开始后为或约12个月。
110.根据权利要求97-109中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中：
所述受试者群组是患有复发性或难治性多发性骨髓瘤的受试者；
所述受试者群组是患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少3种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者，所述先前疗法任选地包括自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体；
所述受试者群组是患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少3种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者，所述先前疗法任选地包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体和/或自体干细胞移植；
所述受试者群组是在所述施用时未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或没有PCL病史的受试者；
所述受试者群组是在施用所述细胞之前已经患上继发性浆细胞白血病(PCL)的受试者；
所述受试者群组是或包括患有已经进行施用的复发性或难治性多发性骨髓瘤并且在至少4种或平均至少10种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的受试者。
所述受试者群组已经接受过中值为10种的先前方案，或者在3与15种或4与15种之间的针对多发性骨髓瘤的先前疗法；
所述受试者群组包括对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和抗CD38单克隆抗体难治的受试者；和/或
所述受试者群组包括已经进行过先前自体干细胞移植的受试者。
111.根据权利要求97-110中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中：
所述受试者群组由成人受试者组成或包括成人受试者；
所述受试者群组从诊断起的中值时间为4年和/或从诊断起的时间的范围为2至12年；和/或
所述受试者群组包括具有IMWG高风险细胞遗传学的受试者。
112.根据权利要求110或111所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述至少3种先前疗法包括自体干细胞移植(ASCT)；免疫调节剂或蛋白酶体抑制剂；或其组合；以及抗CD38抗体。
113.根据权利要求110-112中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述免疫调节剂选自沙利度胺、来那度胺和泊马度胺，所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米，和/或所述抗CD38抗体是或包含达雷木单抗。
114.根据权利要求97-113中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中
所述反应或结局选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；
所述反应或结局是或包括OR，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；或者
所述反应或结局是或包括CR，任选地基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准。
115.根据权利要求97-114中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局是或包括OR，并且所述剂量能够在所述群组的至少50％、60％、70％或80％的受试者中实现所述反应或结局。
116.根据权利要求97-114中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局是或包括VGPR、CR或sCR，并且所述剂量能够在所述群组的至少40％、45％或50％的受试者中实现所述反应或结局。
117.根据权利要求97-114中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局是或包括CR或sCR，并且所述剂量能够在所述群组的至少20％、30％或40％的受试者中实现所述反应或结局。
118.根据权利要求97-117中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。
119.根据权利要求97-117中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中与在所述指定时间测定的反应或结局相比，在所述指定时间之后为或约3、6、9或12个月时测定的反应或结局是相等的或改善的。
120.根据权利要求97-119中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的组合和/或CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞的组合。
121.根据权利要求120所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中CD4+CAR+T细胞与CD8+CAR+T细胞和/或CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率为或为约为1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间。
122.根据权利要求97-121中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量包含CD3+CAR+T细胞。
123.根据权利要求97-122中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中在患有所述疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少90％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，施用所述剂量的工程化T细胞任选地在开始所述施用后的指定时间点不导致规定的毒性结局。
124.根据权利要求123所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述规定的毒性结局是神经毒性。
125.根据权利要求123或124所述的工程化T细胞的剂量，其中所述规定的毒性结局是神经毒性，并且在所述群组中的至少90％、70％或80％的受试者中未导致神经毒性。
126.根据权利要求123-125中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述规定的毒性结局是3级或更高或4级或更高的神经毒性。
127.根据权利要求123-126中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述规定的毒性结局是3级或更高的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致3级或更高的神经毒性。
128.根据权利要求123所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述规定的毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)。
129.根据权利要求123或128所述的工程化T细胞的剂量，其中所述规定的毒性结局是CRS，并且在所述群组中的至少15％、20％、25％或30％的受试者中未导致CRS。
130.根据权利要求123、128和129中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述规定的毒性结局是3级或更高或4级或更高的细胞因子释放综合征(CRS)。
131.根据权利要求123和128-130中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述规定的毒性结局是3级或更高的CRS，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致实现3级或更高的CRS。
132.根据权利要求97-131中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约5x107个细胞或CAR+T细胞。
133.根据权利要求97-131中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约1.5x108个细胞或CAR+T细胞。
134.根据权利要求97-131中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约3x108个细胞或CAR+T细胞。
135.根据权利要求97-131中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约4.5x108个细胞或CAR+T细胞。
136.根据权利要求97-119中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中能够实现所述反应或结局的所述剂量是为或约6.0x108个细胞或CAR+T细胞。
137.根据权利要求97-136中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有记忆表型。
138.根据权利要求97-137中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有中央记忆表型。
139.根据权利要求97-138中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+。
140.根据权利要求97-139中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞呈CCR7+/CD45RA-或呈CCR7+/CD45RO+。
141.根据权利要求97-140中任一项所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中：所述剂量的工程化T细胞通过用于产生展现出预先确定的特征的输出组合物的方法来产生，其中当在多名不同的单独受试者之中进行时，所述方法的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中所述多种输出组合物之中的所述输出组合物的预先确定的特征选自：
所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中具有中央记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD4+T细胞、任选CAR+CD4+T细胞中的中央记忆CD4+T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD8+T细胞、任选CAR+CD8+T细胞中的中央记忆CD8+T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；和/或
所述多种输出组合物的工程化T细胞、任选CAR+T细胞中的中央记忆T细胞、任选CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。
142.根据权利要求141所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述剂量通过用于产生输出组合物的方法来产生，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述方法是在多名不同的单独受试者之中进行的。
143.根据权利要求142所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述多名不同的单独受试者包括患有疾病或病症的受试者。
144.根据权利要求143所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述疾病或病症是癌症。
145.根据权利要求144所述的用于所述用途的所述剂量的工程化T细胞，其中所述癌症是血液癌症、任选多发性骨髓瘤。
146.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；
其中在所述施用之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
147.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂；
蛋白酶体抑制剂；以及
抗CD38抗体。
148.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
149.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在针对患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的治疗方案中的用途，所述治疗方案包括向所述受试者施用所述剂量的工程化T细胞，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：
在为或约1x107个CAR+T细胞与2x109个之间的CAR+T细胞；
以为或为约1:1或者在约1:3与约3:1之间的CD4+CAR+T细胞与CD8+CAR+T细胞和/或CD4+T细胞与CD8+T细胞的确定比率的CD4+T细胞和CD8+T细胞的组合；并且
所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR+T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
150.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；
其中在施用所述剂量的工程化T细胞之前，所述受试者已经接受过淋巴细胞耗尽疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m2受试者体表面积、任选为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m2受试者体表面积、任选为或约300mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天。
151.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时或之前，除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或者忌用一种或多种所述疗法，否则所述受试者已经接受过选自以下的三种或更多种疗法：
自体干细胞移植(ASCT)；
免疫调节剂；
蛋白酶体抑制剂；以及
抗CD38抗体。
152.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中在施用所述剂量的工程化T细胞时，所述受试者尚未患有活跃的浆细胞白血病(PCL)或浆细胞白血病史。
153.一定剂量的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞用于制造治疗患有或怀疑患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者的药物的用途，其中所述CAR包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
含有分别在SEQ ID NO:97、101和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:96、100和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:95、99和103中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:105、107和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；
含有分别在SEQ ID NO:94、98和102中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH以及含有分别在SEQ ID NO:104、106和108中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL；或
含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL；
(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174中所示的间隔子；
(c)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分；其中所述剂量的工程化T细胞包含：
在为或约1x107个CAR+T细胞与2x109个之间的CAR+T细胞；
以为或为约1:1或者在约1:3与约3:1之间的CD4+CAR+T细胞与CD8+CAR+T细胞和/或CD4+T细胞与CD8+T细胞的确定比率的CD4+T细胞和CD8+T细胞的组合；并且
所述剂量中少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR+T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
154.根据权利要求146-153中任一项所述的用途，其中所述细胞外抗原结合结构域与B细胞成熟抗原(BCMA)特异性地结合。
155.根据权利要求146-154中任一项所述的用途，其中所述VH是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述VL是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。
156.根据权利要求146-155中任一项所述的用途，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：
含有SEQ ID NO:116中所示序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(VH)以及含有SEQ ID NO:119中所示序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(VL)；
(b)间隔子，所述间隔子包含经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合CH2区和IgG4 CH3区，所述间隔子具有约228个氨基酸的长度；
(c)来自人CD28的跨膜结构域；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。
157.根据权利要求146-156中任一项所述的用途，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列或与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:143中所示序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述共刺激信号传导区包含SEQ ID NO:4中所示序列或与SEQ ID NO:4中所示序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
158.根据权利要求146-157中任一项所述的用途，其中所述CAR包含
(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114中所示序列；
(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174中所示序列；
(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138中所示序列；以及
(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含含有SEQ ID NO:143中所示序列的胞质信号传导结构域和含有SEQ ID NO:4中所示序列的共刺激信号传导区。
159.根据权利要求146-158中任一项所述的用途，其中所述CAR包含SEQ ID NO:19中所示序列。
160.根据权利要求146-148、150-152和154-159中任一项所述的用途，其中所述剂量的工程化T细胞包含在为或约1x107个CAR+T细胞与为或约2x109个之间的CAR+T细胞。
161.根据权利要求146-160中任一项所述的用途，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约5x107个细胞或CAR+T细胞。
162.根据权利要求146-160中任一项所述的用途，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约1.5x108个细胞或CAR+T细胞。
163.根据权利要求146-160中任一项所述的用途，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约3x108个细胞或CAR+T细胞。
164.根据权利要求146-160中任一项所述的用途，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约4.5x108个细胞或CAR+T细胞。
165.根据权利要求146-160中任一项所述的用途，其中所述剂量的工程化T细胞是为或约6x108个细胞或CAR+T细胞。
166.根据权利要求146-164中任一项所述的用途，其中所述剂量的工程化T细胞包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的组合和/或CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞的组合。
167.根据权利要求165所述的用途，其中CD4+CAR+T细胞与CD8+CAR+T细胞和/或CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率为或为约为1:1或者在为或约1:3与为或约3:1之间。
168.根据权利要求146-166中任一项所述的用途，其中所述剂量的工程化T细胞包含CD3+CAR+T细胞。
169.根据权利要求146-148、150-152和154-167中任一项所述的用途，其中在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR+T细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
170.根据权利要求146-168中任一项所述的用途，其中在所述剂量的工程化T细胞中少于或少于约5％、4％、3％、2％或1％的CAR+T细胞表达膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
171.根据权利要求146-169中任一项所述的用途，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有记忆表型。
172.根据权利要求146-170中任一项所述的用途，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞具有中央记忆表型。
173.根据权利要求146-171中任一项所述的用途，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、颗粒酶B-和/或CD127+。
174.根据权利要求146-172中任一项所述的用途，其中在所述剂量中的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或大于95％的细胞呈CCR7+/CD45RA-或呈CCR7+/CD45RO+。
175.根据权利要求146-173中任一项所述的用途，其中所施用的剂量中的细胞通过用于产生展现出预先确定的特征的输出组合物的方法来产生，其中当在多名不同的单独受试者之中进行时，所述方法的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中所述多种输出组合物之中的所述输出组合物的预先确定的特征选自：
所述多种输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中具有中央记忆表型的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物中呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD4+T细胞、任选CAR+CD4+T细胞中的中央记忆CD4+T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；
所述多种输出组合物的工程化CD8+T细胞、任选CAR+CD8+T细胞中的中央记忆CD8+T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间；和/或
所述多种输出组合物的工程化T细胞、任选CAR+T细胞中的中央记忆T细胞、任选CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比是在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间或在约60％与约65％之间。
176.根据权利要求174所述的用途，其中所施用的剂量通过用于产生输出组合物的方法来产生，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述方法是在多名不同的单独受试者之中进行的。
177.根据权利要求175所述的用途，其中所述多名不同的单独受试者包括患有疾病或病症的受试者。
178.根据权利要求176所述的用途，其中所述疾病或病症是癌症。
179.根据权利要求177所述的用途，其中所述癌症是血液癌症、任选多发性骨髓瘤。
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