CN118055944A - 调节Bcl-2增强嵌合抗原受体癌症免疫疗法功效 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了经修饰的细胞，即免疫细胞或其前体细胞，其中所述细胞被工程化以表达a)嵌合抗原受体(CAR)和b)B细胞淋巴瘤2(Bcl‑2)家族蛋白的变体，其中该变体赋予对Bcl‑2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。还提供了经修饰的细胞的例如用于治疗癌症的至少一种体征和/或症状的方法和用途。还提供了相关的核酸、载体和药物组合物。

Description

调节Bcl-2增强嵌合抗原受体癌症免疫疗法功效
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年8月11日提交的美国临时专利申请号63/232,051的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CART)免疫疗法已显示出对复发/难治性(r/r)淋巴瘤和白血病患者的临床结果的显著改善(Lee,et al.,The Lancet(2015)385(9967):517-28；Maudeet al.,New England Journal of Medicine(2018)378(5):439-48；Park et al.,NewEngland Journal of Medicine(2018)378(5):449-59；Schuster,et al.,New EnglandJournal of Medicine(2019)380(1):45-56；Turtle,et al.,Science TranslationalMedicine(2016)8(355):355ra116-355ra116)。尽管抗CD19 CART(CART19)具有显著的临床结果，但超过60％的接受CART19治疗的淋巴瘤患者仍然没有反应或最终复发(Schuster,etal.,New England Journal of Medicine(2019)380(1):45-56)。此外，绝大多数利用目前批准的CART产品治疗的患者都未能通过这些治疗，并且CAR T细胞由于众多挑战而在对抗实体瘤方面缺乏功效。本领域需要增强CART抗肿瘤功效，以改善用CART细胞治疗的患者的临床结果。本发明解决了这一需求。
发明内容
在一些方面，本发明提供了一种分离核酸，其包含：a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和b)编码B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体的核苷酸序列，其中所述变体赋予对所述Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
在某些实施方式中，分离核酸进一步包含在编码CAR的核苷酸序列和编码Bcl-2家族蛋白的变体的核苷酸序列之间的编码2A自切割肽的核苷酸序列。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
在某些实施方式中，Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
在某些实施方式中，Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是小分子。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自维奈托克(venetoclax)(ABT-199)、那维妥拉(navitoclax)(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(sabutoclax)(BI-97C1)、奥巴克拉(obatoclax)(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是维奈托克。
在某些实施方式中，a)Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包含选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V以及其任何组合；或b)Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且所述变体包含G179E突变。
在某些实施方式中，所述变体包含F104L Bcl-2。
在某些实施方式中，肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、LewisY、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A(Melan A)、间皮素(mesothelin)、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1至6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2和其任意组合。
在某些实施方式中，肿瘤抗原是CD19。
在某些实施方式中，抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体(affibody)、monobody(monobody)(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
在某些实施方式中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
在某些实施方式中，胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，胞内结构域包括选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)，或其变体，或源自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
在某些实施方式中，胞内结构域包括选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
在某些实施方式中，胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞内信号转导结构域或其变体。
在一些方面，本发明提供了包含本文所述的分离核酸的载体。
在某些实施方式中，所述载体是慢病毒载体。
在一些方面，本发明提供了包含本文所述的分离核酸或本文所述载体的经修饰的细胞，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞。
在某些实施方式中，细胞是T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
在一些方面，本发明提供了一种经修饰的细胞，其中该细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中该细胞被工程化以表达：a)嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和b)B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对所述Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
在某些实施方式中，Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
在某些实施方式中，Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是小分子。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自：维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是维奈托克。
在某些实施方式中，a)Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包含选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V、以及其任何组合；或b)Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且所述变体包括G179E突变。
在某些实施方式中，所述变体包含F104L Bcl-2。
在某些实施方式中，肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、LewisY、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1-6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2及其任意组合。
在某些实施方式中，肿瘤抗原是CD19。
在某些实施方式中，抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体、monobody(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
在某些实施方式中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
在某些实施方式中，胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，胞内结构域包括选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)，或其变体，或源自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
在某些实施方式中，胞内结构域包括选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
在某些实施方式中，胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞内信号转导结构域或其变体。
在某些实施方式中，细胞是T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
在一些方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的经修饰的细胞的群体和至少一种药学上可接受的载体。
在一些方面，本发明提供了一种治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括给予所述对象经修饰的细胞的群体，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中所述细胞被工程化以表达：a)嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合由所述癌症表达的肿瘤抗原；和b)B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对所述Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
在某些实施方式中，所述对象在给予所述经修饰的细胞的群体之前已给予所述细胞毒性抑制剂。
在某些实施方式中，该方法还包括在给予所述经修饰的细胞的群体之前、同时或之后向所述对象给予所述细胞毒性抑制剂。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
在某些实施方式中，Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
在某些实施方式中，Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是小分子。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自：维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是维奈托克。
在某些实施方式中，a)Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包含选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V、以及其任何组合；或b)Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且所述变体包括G179E突变。
在某些实施方式中，所述变体包含F104L Bcl-2。
在某些实施方式中，抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体、monobody(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
在某些实施方式中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
在某些实施方式中，肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、LewisY、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1-6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2及其任意组合。
在某些实施方式中，肿瘤抗原是CD19。
在某些实施方式中，胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，胞内结构域包括选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)，或其变体，或源自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
在某些实施方式中，胞内结构域包括选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
在某些实施方式中，胞内信号传导结构域包括CD3ζ的胞内信号传导结构域或其变体。
在某些实施方式中，细胞群体包括T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
在一些实施方式中，对象是人。
在某些实施方式中，癌症是B细胞淋巴瘤或白血病。
附图说明
通过以下结合附图对说明性实施方式的详细描述，将更充分地理解本发明的上述和其它特征及优点。
图1A-1H示例了维奈托克增强CART细胞介导的维奈托克敏感淋巴瘤的杀伤的发现。图1A是促凋亡小分子及其通过单一剂或与CART19组合的细胞毒性的表。在48小时时通过发光定量NALM6细胞的杀伤。用两种浓度(100和1000nM)进行促凋亡小分子的药物筛选。图1B是来自与CART19组合的促凋亡小分子对B细胞白血病细胞系NALM6的两次独立药物筛选的组合数据的图。利用两种浓度的29种药物(100nM和1000nM)。在48小时时通过发光评估NALM6细胞的杀伤。图1C是说明CART/维奈托克联合疗法以增强CART介导的肿瘤杀伤的示意图。图1D显示维奈托克对几种淋巴恶性肿瘤细胞系的半数最大抑制浓度(IC50)数据。在媒介物(DMSO)或维奈托克存在下(48小时)通过对照未转导对照T细胞(UTD)或CART19对肿瘤杀伤的定量。E:T比＝0.125:1(OCI-Ly18)、0.06:1(MINO)、0.125:1(NALM6)和0.006:1(原发MCL)。维奈托克浓度为10nM(OCI-Ly18和MINO)、250nM(NALM6)和3nM(原发MCL)。图1E显示通过维奈托克与含有CD28或4-1BB共刺激结构域的CART19细胞的组合的肿瘤杀伤。E:T比＝0.1:1。维奈托克浓度为20nM。图1F显示了在媒介物(DMSO)或维奈托克存在下(48小时)通过UTD或CART33的肿瘤杀伤。E:T比＝0.063:1(MOLM-14)，0.15:1(KG-1)。维奈托克浓度为125nM(MOLM-14)，50nM(KG-1)。图1G通过流式细胞术显示胱天蛋白酶3/7活性。E:T比＝0.1:1。维奈托克浓度为10nM。图1H显示维奈托克敏感淋巴瘤(OCI-Ly18)的异种移植模型的示意性和定量数据。当肿瘤体积达到约150mm3时，通过静脉注射输注CART细胞(2x106)。经由口服管饲法(oral gavage)给予媒介物或维奈托克(25mg/kg/天)达3周。通过卡尺测量肿瘤负荷随时间的变化，并将肿瘤体积用带有事后Tukey检验的单因素ANOVA进行比较。还监测了总存活率，并利用对数秩(Mantel Cox)检验进行分析。所有数据代表平均值±标准差(SD)。进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验(图1D-1G)。所提供的所有数据都代表了至少两个独立的实验。ns：不显著，*p<0.05，**p<0.01。UTD：未转导T细胞；CART19：抗CD19CAR T细胞；MCL：套细胞淋巴瘤；E:T＝效应物与目标物的比；IAP：凋亡(细胞凋亡，apoptosis)蛋白的抑制。
图2A至2F示例了维奈托克和CART19作为单一剂诱导浓度和剂量依赖性肿瘤杀伤的发现。表达荧光素酶的癌症细胞(5x104个细胞/孔)与不同浓度的维奈托克或不同剂量的CART19共同培养48小时，并利用发光来量化肿瘤杀伤。48小时后，将荧光素添加到细胞，并利用光度计(Biotek Synergy H4)检测发光。肿瘤杀伤(％)利用以下公式计算：(样品-最大肿瘤生长)/(裂解对照-最大肿瘤生长)x100。图2A显示了用OCI-Ly18进行的维奈托克介导杀伤。图2B显示了用MINO进行的维奈托克介导杀伤。图2C显示了用NALM6进行的维奈托克介导杀伤。图2D显示了用OCI-Ly18进行的CART19介导杀伤。图2E显示了用MINO进行的CART19介导杀伤。图2F显示了用NALM6进行的CART19介导杀伤。E:T＝效应物与目标物的比。EC50：半数最大有效浓度。CART19：抗CD19 CAR T细胞。
图3示例了用维奈托克而不是AZD5991(MCL-1抑制剂)治疗导致肿瘤杀伤增强的发现。为了研究另一种关键的抗凋亡调节因子MCL-1的抑制是否导致肿瘤杀伤的增强，将各种B细胞恶性肿瘤(萤光素酶+)细胞系与媒介物(DMSO)、维奈托克或AZD5991在CART19存在下共培养48小时，并测量发光强度的变化以量化肿瘤杀伤。为了测试CART/药物在不同肿瘤类型中的联合作用，在维奈托克或AZD5991的存在下，将AML细胞系(荧光素酶阳性MOLM-14)与CART33共培养。利用以下式计算肿瘤杀伤(％)：(样品-最大肿瘤生长)/(裂解对照-最大肿瘤生长)x100。MINO(维奈托克:1nM，AZD5991：125nM)，Z-138(维奈托克：25nM，AZD5991：125nM)，MAVER(维奈托克：25nM，AZD5991：125nM)，OCI-Ly18(维奈托克：10nM，AZD5991：125nM)，SU-DHL-4(维奈托克：500nM，AZD5991：125nM)，NALM6(维奈托克：500nM，AZD5991：125nM)，MOLM-14(维奈托克：125nM，AZD5991：125nM)。进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验。*p＜0.05；**p＜0.01。CART19：抗CD19 CAR T细胞。
图4A-4C示例了淋巴瘤细胞系中BCL-2过表达赋予对CAR T细胞介导细胞毒性的抗性的发现。为了研究BCL-2在CAR T细胞的抗肿瘤活性中的潜在作用，通过利用编码BCL-2的慢病毒在多发性淋巴瘤(MINO，SU-DHL-4)和白血病(NALM6)细胞系中诱导BCL-2过表达。图4A显示了通过流式细胞术对亲本(灰色线)和BCL-2过表达癌症细胞系(红色线)中BCL-2表达的验证，并且针对MINO显示了BCL-2过表达对CART19介导的肿瘤杀伤的影响。图4B显示了通过流式细胞术对亲本(灰色线)和BCL-2过表达癌症细胞系(红色线)中BCL-2表达的验证，并且显示了针对SU-DHL-4的BCL-2过表达对CART19介导的肿瘤杀伤的影响。图4C显示了通过流式细胞术对亲本(灰色线)和BCL-2过表达癌症细胞系(红色线)中BCL-2表达的验证，并且显示了针对NALM6的BCL-2过表达对CART19介导的肿瘤杀伤的影响。E:T比＝0.25:1。进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验。所提供的所有数据都代表了至少两个独立的实验。所有数据代表平均值±标准差。****P＜0.0005，*P＜0.05。ns：不显著。E:T＝效应物与目标物的比。UTD：未转导T细胞。CART19：抗CD19 CAR T细胞。
图5A-5C示例了CART细胞和维奈托克治疗的组合增强癌症中的凋亡的发现。图5A显示了MINO中胱天蛋白酶3/7活性的代表性点图。MINO(5x104)与CART19或维奈托克共培养24小时。CellEventTM胱天蛋白酶3/7Green Read FlowTM试剂用于定量MINO中的胱天蛋白酶3/7活性。E:T比＝0.05:1。维奈托克浓度＝2.5nM。图5B显示凋亡细胞的定量。图5C显示OCI-Ly18(5x104)分别与缺乏FASL、TRAIL或粒酶B(GZB)的各种CART19共培养的数据，以研究参与CART/维奈托克组合效应的潜在凋亡调节剂。利用发光来量化肿瘤杀伤。进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验。所提供的所有数据都代表了至少两个独立的实验。所有数据代表平均值±标准差。E:T＝效应物与目标物的比。ns：不显著。*p＜0.05；**p＜0.01。UTD：未转导T细胞。MOCK：非基因修饰CART19。GZB:粒酶B敲除CART19。TRAIL：TRAIL敲除CART19。FASL：FAS配体敲除CART19。
图6A-6G示例了CART细胞和维奈托克治疗的组合诱导淋巴瘤细胞中的凋亡和细胞周期阻滞的发现。图6A是scRNA-seq工作流程的图形摘要。图6B是每个代表性聚簇中差异表达基因的热图。图6C是scRNA-seq数据的UMAP投影。肿瘤细胞聚集成6组，每一组通过不同的细胞周期或增殖阶段标记。最大的聚簇(S高)由处于S期的细胞组成。图6D显示按条件和细胞比例划分的scRNA-seq数据的UMAP投影。值得注意的是，与单独的CART19治疗相比，在CART19+维奈托克治疗条件下，G1显性聚簇显示出选择性的比例耗竭(减少，depletion)。图6E显示了示例GSEA Hallmark干扰素γ反应基因集在G1显性聚簇和MKI67hi聚簇中富集的数据(p.adj<0.05)，表明这些聚簇与CAR T细胞相互作用。图6F显示了示例针对MKI67hi聚簇的CART19+维奈托克治疗的肿瘤和CART19治疗的肿瘤之间的DEG的GO途径富集的数据。联合疗法的MKI67hi聚簇中显著上调的途径包括那些参与G2/M细胞周期负调节的途径。图6G显示了示例限定MKI67高聚簇的DEG的GO途径富集的数据。为了确定每个聚簇的两种处理条件之间的差异表达基因(DEG)，利用FindMarkers函数，阈值为min.pct＝0.1，对数倍数变化＝0.25。细胞周期评分功能也用于确认UMAP中细胞周期阶段与每个聚簇的关联。UMAP：用于降维的统一流形逼近和投影(Uniform manifold approximation and projection fordimension reduction)。DEG：差异表达基因。GSEA：基因集富集测定。CART19：抗CD19 CAR T细胞。E:T＝效应物与目标物的比。
图7A-7B示例了维奈托克治疗在淋巴瘤的OCILy18异种移植模型中显示出剂量依赖性肿瘤控制的发现。图7A是异种移植模型的示意图。通过皮下注射将OCI-Ly18植入NSG小鼠的胁(flank)。当肿瘤达到约150mm3时，通过口服管饲法向小鼠每天给予增加剂量(25、50、100mg/kg)的维奈托克，持续两周。图7B显示了量化的肿瘤生长数据。每周用卡尺测量OCI-Ly18的生长，持续两周，并根据方程计算肿瘤体积：肿瘤体积＝1/2(L×W2)，其中L是肿瘤的最长轴，W是垂直于L的轴。
图8A-8E示例了维奈托克治疗诱导CART细胞毒性的发现。图8A是维奈托克抗性肿瘤的体内异种移植模型的示意图。对于MINO模型，CART细胞(5x104)在植入荧光素酶+MINO细胞14天后输注(静脉注射)。对于NALM6模型，CART细胞(5x105)在植入荧光素酶+NALM6细胞后3-4天输注(静脉注射)。经由口服管饲法给予媒介物或维奈托克(50mg/kg/天)5周。图8B显示用UTD或CART19加媒介物或维奈托克治疗的携带MINO细胞的小鼠的肿瘤进展。图8C显示用UTD或CART19加媒介物或维奈托克治疗的携带NALM6细胞的小鼠的肿瘤进展。图8D显示了体内CART细胞扩增。为了量化NALM6异种移植模型中的CART细胞扩增，在CART细胞输注后第10天采集小鼠外周血，并通过流式细胞术进行分析。图8E显示在各种剂量的维奈托克(110nM～10000nM)体外治疗时维奈托克诱导的CART细胞毒性的定量。每个点表示从不同的健康供体(n＝8)产生的CART细胞。E:T比＝0.25:1。维奈托克浓度＝1100nM。所有数据代表平均值±标准差。进行带有事后Tukey检验的单因素ANOVA(图8B和8C)。进行带有Welch校正的双尾非配对Student t检验(图8D和8E)。所提供的所有数据都代表了至少两个独立的实验。ns：不显著，*p<0.05；**p＜0.01；UTD：未转导T细胞；CART19：抗CD19 CAR T细胞；E:T＝效应物与目标物的比。
图9示例了用MCL-1抑制剂AZD5991治疗诱导了严重CART细胞毒性的发现。为了量化CART细胞毒性，将CART19与辐照的NALM6在媒介物(DMSO)、维奈托克或AZD5991存在下共培养120小时。共培养后，用抗CD3抗体和抗CAR19独特型抗体对样品进行染色，以区分效应物(T细胞)和靶细胞(NALM6)。然后通过利用流式细胞术测量CART细胞的存活率。E:T比＝0.25:1。维奈托克和AZD5991的浓度：110nM、330nM、1100nM、3300nM和10000nM。进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验。所有数据代表平均值±标准差。**P＜0.005，*P＜0.05。ns：不显著。
图10A-10E示例了突变体BCL-2的表达阻止维奈托克介导的CART细胞毒性的发现。图10A是本文用于开发维奈托克抗性CART细胞的策略的示意图。图10B显示了通过流式细胞术测量的CART细胞中BCL-2表达。图10C显示了在媒介物(DMSO)或维奈托克存在下，通过未转导对照T细胞(UTD)或CART19、CART19-BCL-2(WT)或CART19-BCL-2中(F104L)对肿瘤(MINO)杀伤的定量。E:T比＝0.06:1。维奈托克浓度＝10nM。图10D显示维奈托克介导的对CART19、CART19-BCL-2(WT)或CART19-BCL-2(F104L)的毒性的评估。CART细胞存活率(左图)和IC50值(右图)。每个点表示从不同的健康供体(n＝3)产生的CART细胞。图10E显示用CART19或CART19-BCL-2(F104L)加媒介物或维奈托克治疗的携带MINO的异种移植小鼠的肿瘤进展和存活率。所有数据代表平均值±标准差。进行带有事后Tukey检验的单因素ANOVA(图10C和10D)。在图10E中，将肿瘤体积与带有事后Tukey检验的单因素ANOVA进行比较，并利用对数秩(Mantel Cox)检验分析存活率。所提供的所有数据都代表了至少两个独立实验：ns：不显著，*p<0.05，**p<0.01。UTD：未转导T细胞；CART19：抗CD19 CAR T细胞；CART19-BCL-2(WT)：表达BCL-2的CART19；CART19-BCL-2(F104L)：表达BCL-2(F104L)的CART19；E:T＝效应物与目标物的比。
图11示例了BCL-2(WT)或BCL-2(F104L)的过表达不影响CART/维奈托克组合效应的发现。表达荧光素酶的癌症细胞(OCI-Ly18，5x104个细胞/孔)与CART19、CART19-BCL2(WT)或CART19-BCL(F104L)在媒介物或维奈托克存在下共培养48小时。为了监测肿瘤杀伤，通过光度计(Biotek Synergy H4)测量每个样品中的发光强度的变化。肿瘤杀伤(％)利用以下公式计算：(样品-最大肿瘤生长)/(裂解对照-最大肿瘤生长)x100。E:T比＝0.125:1。维奈托克浓度＝10nM。进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验。所提供的所有数据都代表了至少两个独立的实验。所有数据代表平均值±标准差。*P＜0.05。ns：不显著。E:T＝效应物与目标物的比。UTD：未转导T细胞。CART19：抗CD19 CAR T细胞。CART19-BCL2(WT)：过表达BCL-2(WT)的抗CD19 CAR T细胞。CART19-BCL2(F104L)：过表达BCL-2(F104L)的抗CD19 CAR T细胞。
图12A-12B示例了在CART细胞中缺乏与维奈托克结合能力的BCL-2(F104L)的过表达保护CART细胞免受维奈托克介导的毒性的发现。为了验证BCL-2(F104L)在体内保护CART免受维奈托克介导的毒性的作用，通过静脉注射将NALM6(1x106个细胞/小鼠)注射到NSG小鼠中。接下来，将CART19或CART19-BCL-2(F104L)输注到携带NALM6的NSG小鼠中。每天经由口服管饲法向小鼠给予维奈托克(100mg/kg)或媒介物。为了监测CART在体内的存活率，在CART输注后第15天从小鼠的下颌下静脉采集小鼠血液(100μl)，并利用流式细胞术测量小鼠血液中人CD3+T细胞的绝对数量。通过IVIS系统测量小鼠体内的发光强度来监测肿瘤体积。图12A显示了肿瘤进展。进行带有事后Tukey检验的单因素ANOVA。图12B显示了用更高剂量的维奈托克治疗后的CART存活率。进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验。所有数据代表平均值±标准差。*P＜0.05。ns：不显著。UTD：未转导T细胞。CART19：抗CD19CAR T细胞。CART19-BCL2(WT)：过表达BCL-2(WT)的抗CD19 CAR T细胞。CART19-BCL2(F104L)：过表达BCL-2(F104L)的抗CD19 CAR T细胞。
图13A-13H示例了淋巴瘤患者中的BCL-2的染色体改变与CART疗法的不良预后相关的发现。图13A是本文用于研究BCL-2的基因改变是否影响CART的抗肿瘤临床反应的策略的示意图。通过荧光原位杂交(FISH)分析LCL患者的CART前活检，以寻找BCL-2染色体畸变。图13B显示了根据BCL-2染色体改变(获得或易位)的存在，用CART19治疗的87名LCL患者的最佳总反应率。图13C显示了根据BCL-2染色体改变(获得或易位)的存在用CART19治疗的87名LCL患者的总存活率。图13D显示了根据BCL-2染色体改变(获得或易位)的存在，用CART19治疗的37名DLBCL患者的最佳总体反应。图13E显示了根据BCL-2染色体改变(获得或易位)的存在，用CART19治疗的37名DLBCL患者的总存活率。图13F是本文用于研究维奈托克桥接疗法(bridging therapy)对MCL患者中CART19的临床反应的影响的策略的示意图。图13G显示了根据包括维奈托克或不包括维奈托克的桥接疗法，用CART19治疗的18名MCL患者的最佳总体反应率。图13H显示在用(YES)或不用(NO)维奈托克的桥接疗法后，用CART19治疗的MCL患者的无事件存活率。采用分类变量的卡方检验和连续变量的t Student检验(视情况而定)进行各组之间的比较。通过Kaplan-Meier估计进行存活率分析，并用对数秩检验进行比较。所有统计学检验均为双侧检验，统计学显著性限定为p值<0.05。利用社会科学软件v.22.0(美国伊利诺伊州芝加哥)的统计软件包进行分析。CR：完全反应；PR：部分反应；SD：病情稳定；PD：进展性疾病。LCL：大B细胞淋巴瘤；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；MCL：套细胞淋巴瘤。
图14是LBCL患者的特征的表。IQR：四分位距；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；NOS：未另行规定；HGBCL：高级别B细胞淋巴瘤；tFL：转化性滤泡性淋巴瘤；PS ECOG：根据东方肿瘤合作组织(Eastern Cooperative Oncology Group)的表现状态；CR：完全缓解。
图15A-15K示例了以下发现：BCL-2的基因改变对CART19治疗的LCL和DLBCL患者的临床反应具有显著影响，但对毒性没有影响或影响不大。图15A显示了疾病导致的LCL的无进展存活率。图15B示出了LCL的完全反应率。图15C显示了LCL在3个月时的完全反应率。图15D显示了LCL的无进展存活率。图15E示出了LCL中任何级别的CRS的发生率。图15F显示了LCL中任何级别的ICANS的发生率。图15G示出了DLBCL的完全反应率。图15H显示了DLBCL在3个月时的完全反应率。图15I显示了DLBCL的无进展存活率。图15J示出了DLBCL中任何级别的CRS的发生率。图15K显示了DLBCL中任何级别的ICANS的发生率。LCL：大B细胞淋巴瘤。DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤。CRS：细胞因子释放综合征。ICANS：免疫效应细胞相关神经毒性综合征。通过Cox回归估计变量与PFS之间的调整相关性。
图16是用CART19治疗的LBCL患者的无进展存活率的多变量分析表。HR：风险比；CI：置信区间。
图17是DLBCL-NOS患者的特征表。IQR：四分位距；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；NOS：未另行规定；PS ECOG：根据东方肿瘤合作组织的表现状态；CR：完全缓解。
图18是用CART19治疗的DLBCL患者的无进展存活率的多变量分析表。HR：风险比；CI：置信区间。
图19是在CD28共刺激的逆转录病毒CART19产物brexucabtagene autoleucel之前用维奈托克作为桥接疗法治疗的MCL患者的特性表。ASCT：自体干细胞移植。
图20是在每个MCL患者中利用的桥接疗法的表。指出了在CART给予前输注到每个MCL患者中的桥接疗法的类型。
图21A-21I示例了BCL-2(WT)在CART细胞中过表达增强其抗肿瘤功效的发现。图21A是用于研究BCL-2过表达对CART的抗肿瘤活性的影响的体内异种移植模型的示意图。图21B显示了用CART19或CART19-BCL2(WT)治疗的携带MINO的小鼠的随时间的肿瘤进展和总存活率(代表2个重复实验，n＝5)。在萤光素酶+MINO细胞静脉注射后14天输注CART细胞(5x104)。图21C显示了在用CART19或CART19-BCL2(WT)治疗的携带NALM6的小鼠中随时间的肿瘤进展和总存活率(代表2个重复实验，n＝5)。在萤光素酶+NALM6细胞静脉注射后3-4天输注CART细胞(5x105)。图21D显示了在CART细胞输注后第10天通过流式细胞术对从CART治疗的携带NALM6的小鼠中收集的小鼠血液中的CART细胞峰值扩增的定量。图21E通过流式细胞术(NALM6模型)显示CART治疗的小鼠血液中随时间的CART细胞持久性。图21F显示在用辐照的MINO刺激时CART细胞的倍数变化(代表2个重复实验)。图21G显示火山图，其显示在用辐照的MINO刺激后第18天，与CART19相比，CART19-BCL2(WT)中差异表达的基因。图21H显示在用辐照的MINO刺激后第18天，与CART19相比，CART19-BCL2(WT)中差异表达基因的基因集富集分析(GSEA)。图21I显示了在细胞因子退出后CART细胞的存活。用辐照的MINO刺激CART细胞48小时，并用新鲜培养基代替培养基以退出细胞因子。在加入新鲜培养基48小时后，通过流式细胞术监测CART细胞的存活。所有数据代表平均值±标准差。对所有比较进行带有事后Tukey检验的单因素ANOVA。利用对数秩(Mantel Cox)检验分析总存活率(图21B和21C)。所提供的所有数据都代表了至少两个独立的实验，除了批量(bulk)RNA-seq(用两个生物学重复进行一次)。ns：不显著，*p<0.05，**p<0.05。UTD：未转导T细胞；CART19：抗CD19CAR T细胞；CART19-BCL-2(WT)：表达BCL-2(WT)的CART19；E:T＝效应物与目标物的比。
图22A-22C显示CART中BCL-2过表达不改变CART肿瘤杀伤能力或细胞因子产生。图22A显示了由CART19和CART19-BCL-2(WT)产生的OCI-Ly18的细胞毒性。图22B显示了由CART19和CART19-BCL-2(WT)产生的MINO的细胞毒性。为了监测CART19-BCL2(WT)的细胞毒性，在不同的E:T比(0.0156:1～0.5:1)下，将CART19和CART19-BCL2(WT)与表达荧光素酶的OCI-Ly18或MINO共同培养。通过测量癌症细胞中发光强度的变化来定量由CART19和CART19-BCL2(WT)产生的肿瘤杀伤。采用带有事后Tukey检验的单因素ANOVA。图22C显示通过nCounter基因表达测定法(Nanostring)确定的CART19和CART19-BCL-2(WT)中所指示的细胞因子(Log2)的mRNA表达水平。为了比较CART19和CART19-BCL-2(WT)之间的mRNA表达水平(Log2)，进行了带有Holm-Sidak检验的双向ANOVA。除CXCL11外，大多数细胞因子的表达水平差异在统计学上不显著(p＝0.0184)。所有数据代表平均值±标准差。ns：不显著。*P＜0.05。E:T＝效应物与目标物的比。UTD：未转导T细胞。CART19：抗CD19 CAR T细胞。CART19-BCL2(WT)：过表达BCL-2(WT)的抗CD19 CAR T细胞。
图23显示了CART中BCL-2过表达不影响CART分化。为了监测BCL-2的持续过表达是否改变CART分化状态，首先用辐照的MINO刺激CART19和CART19-BCL-2(WT)。为了表征CART的分化，在刺激后第0天(刺激前)、第9天和第18天收获CART19或CART19-BCL-2(WT)，并用抗CCR7抗体和抗CD45RA抗体染色用于流式细胞术分析。对第9天的数据进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验。所有数据代表平均值±标准差。ns：不显著。UTD：未转导T细胞。CART19：抗CD19 CAR T细胞。CART19-BCL2(WT)：过表达BCL-2(WT)的抗CD19 CAR T细胞。
图24显示了由BCL-2的过表达介导的长期存活的CART不损害CART的细胞因子产生能力。为了研究长期存活的表达CART的BCL-2(WT)是否仍然具有功能，采集初始刺激后18天的CART19-BCL2(WT)，并用PMA/离子霉素再刺激6小时。通过细胞内细胞因子染色对IL-2和TNFa的表达进行定量，用于流式细胞术分析。
图25是与CART19相比在CART19-BCL-2(WT)中差异表达的基因的表。将CART19或CART19-BCL-2(WT)与辐照的MINO共培养，并在刺激后第18天提取每个CART的RNA。蓝色代表在CART19-BCL-2(WT)中下调的基因。红色代表在CART19-BCL-2(WT)中上调的基因。数据表明每个基因的Log2倍数变化。
图26A-26H示例了从CART单采血液成分术产物(apheretic product)中增加的T细胞中BCL-2表达与淋巴瘤患者长期的阳性临床结果相关的发现。图26A是用于研究BCL-2水平与CART的临床反应之间的关系的方法的示意性描述。在临床试验(NCT02030834)中，从38名接受CART19免疫疗法(CTL019，即tisagenleucleucel)的淋巴瘤患者的单采血液成分术产物的T细胞中提取RNA。接下来，通过nCounter分析系统(NanoString Technologies,Inc,Seattle,WA)对BCL-2mRNA表达进行定量。图26B是火山图，其显示基于最佳总体反应(CR或NR)的T细胞中的差异基因表达。图26C显示了CR/PR与NR中CART19治疗的患者的T细胞单采血液成分术产物中BCL-2表达的比较。图26D显示了利用线性回归分析确定的T细胞单采血液成分术产物的BCL-2的表达与总体存活率的相关性。图26E显示了利用线性回归分析确定的T细胞单采血液成分术产物中BCL-2表达与总存活率的相关性。图26F显示由BCL-2的持续过表达介导的异常CART扩增的监测(左图：CART扩增(倍数变化)，右图：CART的频率(％)。图26G显示了化疗(阿霉素，300和1000nM)治疗24小时后对CART19和CART19-BCL-2(WT)的细胞毒性。图26H显示用同种型对照或抗EGFR抗体(西妥昔单抗(Cetuximab))治疗24小时后CART19-tEGFR和CART19-BCL2(WT)-tEGFR的细胞毒性。所有数据代表平均值±标准差。进行带有Welch校正的双尾非配对Student t检验(图26C、26F、26H和26I)。*P＜0.05。ns：不显著，*p<0.05，**p<0.05。UTD：未转导T细胞；CART19：抗CD19 CAR T细胞；CART19-BCL-2(WT)：表达BCL-2(WT)的CART19；CART19-tEGFR：表达截短型EGFR的抗CD19 CAR T细胞；CART19-BCL-2(WT)：表达BCL-2(WT)和截短的EGFR的CART19；E:T＝效应物与目标物的比。EGFR：表皮生长因子受体。
图27A-27B显示了从单采血液成分术产物分离的T细胞中BCL-2表达与CART19峰值扩增和无进展存活率无关。图27A显示了在临床试验(NCT02030834)中38名接受CART19免疫疗法(CTL019，例如tisagenleucleucel)的患者的T细胞单采血液成分术产物中归一化的BCL-2表达与CART峰值扩增无关。图27B显示在T细胞单采血液成分术产物中的BCL-2表达与相同患者的无进展存活率无关。进行线性回归以评估各因素之间的相关性。CART19：抗CD19CART细胞。
图28A-28B显示了BCL-2的组成型过表达不会导致体外异常CART扩增。为了阐明BCL-2的持续过表达是否导致不受控制的CART扩增，将冷冻的CART细胞解冻，并在不存在或存在IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)的情况下培养7天。利用流式细胞术测量CART细胞数。图28A显示了在不存在细胞因子的情况下CART细胞的倍数变化。图28B显示了在细胞因子存在下CART细胞的倍数变化。进行了带有Welch校正的双尾非配对Student t检验。所有数据代表平均值±标准差。ns：不显著。UTD：未转导T细胞。CART19：抗CD19 CAR T细胞。CART19-BCL-2(WT)：过表达BCL-2(WT)的抗CD19 CAR T细胞。
具体实施方式
肿瘤凋亡是任何癌症治疗的最终目标——从化疗到最新的免疫疗法，包括CART疗法。然而，凋亡逃逸确实是癌症生物学的关键特征(Fulda et al.,International Journalof Cancer(2009)124(3):511-5；Fulda et al.,Oncogene(2002)21(15):2283-94；Jianget al.,Translational Oncology(2018)11(5):1171-87；Maruyama et al.,BritishJournal of Cancer(2006)95(9):1244-9)。本公开涉及利用CART免疫疗法的新平台来增强癌症中凋亡的策略。
在一个方面，本发明提供了一种分离核酸，其包含a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和b)编码B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体的核苷酸序列，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
在另一个方面，本发明提供了一种经修饰的细胞，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中该细胞被工程化以表达a)嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和b)B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗有需要的对象中的癌症的方法，包括给予对象经修饰的细胞的群体，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中将所述细胞工程化以表达a)嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合由癌症表达的肿瘤抗原；和b)B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性
在其它方面，本文提供了相关的组合物(例如，药物组合物)和试剂盒。
应当理解，本公开中描述的方法不限于本文公开的特定方法和实验条件，因为这样的方法和条件可以变化。还应理解，本文中利用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制。
此外，除非另有说明，否则本文所述的实验利用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。这些技术是本领域技术人员熟知的，并在文献中进行了充分解释。参见，例如，Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)(包括所有增刊)、MR Green和J.Sambrook的Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第四版)以及Harlow et al.,Antibodies:ALaboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013年第2版)。
利用具有嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)的方法和技术描述于例如Ruella,etal.,J.Clin.Invest.,126(10):3814-3826(2016)和Kalos,et al.,3(95),95ra73:1-11(2011)，其全部内容通过引用并入本文。
A.定义
除非另外定义，否则本文利用的技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员的通常理解相同的含义。在有任何潜在模棱两可的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外在的定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的利用是指“和/或”。术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”和“包括的(included)”之类的其它形式的利用不是限制性的。
总体上，关于本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学以及杂交所利用的命名法在本领域中是公知且常用的。除非另有说明，否则本文提供的方法和技术总体上是根据本领域公知并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所述的常规方法进行的。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书进行的，如本领域通常完成的或如本文所述的那样。关于本文描述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学所利用的命名法，以及本文描述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学的实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
为了更容易理解本公开，选择的术语定义如下。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代一个或多于一个(即，指代至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意为一个元素或多于一个元素。
如本文利用的“约”，当指的是可测量的值如量、时间持续期等时，意指包含从指定值±20％或±10％的变化，更优选±5％，甚至更优选±1％，以及还更优选±0.1％的变化，只要这种变化适于执行所公开的方法即可。
如本文所用，“活化(激活，Activation)”指的是已经被充分地刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生以及可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”指的是正经历细胞分裂的T细胞等。
如本文所用，“减轻”疾病是指降低疾病的一种或多种症状的严重性。
如本文所用的术语“抗原”被定义为激发免疫反应的分子。该免疫反应可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，都可充当抗原。
此外，抗原可源自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包含编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文利用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以各种组合进行布置以引起期望的免疫反应。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可经合成生成，也可源自生物学样品。这种生物学样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。
如本文所用，术语“自体的”意指源自相同个体的任意物质，其随后被再次引入该个体。
“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合从而介导通过T细胞的共刺激反应——诸如但不限于增殖——的T细胞上的关联结合伙伴(partner)。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用的“共刺激信号”是指与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，以及其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“障碍是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该障碍相比不太有利。不加以治疗，障碍不必定引起动物健康状态的进一步降低。
如本文所用的术语“下调”是指一个或多个基因的基因表达的减少或消除。
“有效量”或“治疗有效量”在本文可交换地利用，并且是指对实现特定的生物学结果或提供治疗或预防益处有效的如本文描述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于当给予于哺乳动物时，与在不存在本发明组合物的情况下检测到的免疫反应相比，引起可检测水平的免疫抑制或耐受的量。免疫反应可以容易地通过大量本领域公认的方法进行评估。本领域技术人员会理解本文所给予的组合物的量是变化的，并且可以基于许多因素容易地确定，诸如所治疗的疾病或状况、所治疗的哺乳动物的年龄和健康状况以及身体状况、疾病的严重程度、所给予的特定化合物等。
“编码”是指多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列充当模板合成在生物学过程中的其它多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
如本文所用的“内源性”是指来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用的术语“表位”被定义为抗原上的可引发免疫反应(包括B细胞反应或T细胞反应)的小化学分子。抗原可具有一个或多个表位。大多数抗原具有多个表位；即，它们是多价的。总体上，一个表位的大小约10个氨基酸和/或糖。优选地，表位约4-18个氨基酸，更优选约5-16个氨基酸，甚至更最优选6-14个氨基酸，更优选约7-12个氨基酸，以及最优选约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解，通常而言分子的整体三维结构而非分子的特异性线性序列是抗原特异性的主要标准，因此来区分一个表位与另一个表位。基于本公开，本发明中利用的肽可以是表位。
如本文所用，术语“外源性”是指从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。
如本文所用，术语“扩增”是指数量增加，如T细胞数量增加。在一个实施方式中，离体扩增的T细胞的数量相对于原来存在于培养物中的数量增加。在另一实施方式中，离体扩增的T细胞的数量相对于培养物中的其它细胞类型增加。如本文所用，术语“离体”是指已经从活生物体(例如，人)移出并在该生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
如本文利用的术语“表达”被定义为由特定核苷酸序列的启动子驱动的该序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含充足的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，如包含该重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文利用的“同一性”是指两个多聚体分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，诸如，两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同的位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每个中的位置均被精氨酸占据，则它们在该位置处是同一的。在比对时，两个氨基酸序列在相同位置处具有相同残基的同一性或程度经常表达为百分数。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个氨基酸长度的多聚体中的五个位置)是同一的，则这两个序列是50％同一的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同一的，则这两个氨基酸序列是90％同一的。
如本文利用的术语“免疫反应”被定义为当淋巴细胞将抗原分子识别为异物和诱发形成抗体和/或活化淋巴细胞以去除抗原时发生的针对抗原的细胞反应。
术语“免疫抑制”在本文中用于指减少整体免疫反应。
“分离的”是指自天然状态改变或移出的。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分开的同一核酸或肽是“分离的”。分离核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，也可以存在于非天然环境，如，例如宿主细胞中。
如本文利用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；其可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此其是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了实现体内显著水平基因转移的手段。
如本文利用的术语“修饰的”意指本发明的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可以以多种方式被修饰，包括化学地、结构地和功能地。细胞可以通过引入核酸而被修饰。
如本文利用的术语“调节”意指与不存在治疗或化合物的对象中的反应水平相比，和/或与在其它方面相同但未治疗的对象中的反应水平相比，介导对象中的反应水平的可检测的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或反应，从而介导对象(优选地，人)中的有益的治疗性反应。
在本发明的背景下，利用常见核酸碱基的下列缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，以及“U”是指尿苷。
术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、C、G)表示时，这也包括RNA序列(即A、U、C、G)——其中“U”取代了“T”。
除非另外指定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，就编码该蛋白质的核苷酸序列可以在一些译本中包含内含子(一个或多个)而言。
免疫原性组合物的“肠胃外”给予包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。
如本文利用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。另外，核酸是核苷酸的多聚体。因而，如本文利用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是可以被水解为单体“核苷酸”并且包括一个或多个“核苷酸序列”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可以被水解为核苷。如本文利用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任何手段——非限制性地包括重组手段，即，利用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，和通过合成手段——获得的所有核酸序列(即，“核苷酸序列”)。
如本文利用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地利用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质的或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，该肽或蛋白质包含通过肽键相互连接的两个或更多个氨基酸。如本文所用，该术语是指短链(在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和寡聚物)；和较长链(在本领域中通常被称为蛋白质，其具有多种类型)两者。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文关于抗体利用的术语“特异性结合”意指识别特异性抗原，但是基本上不识别或不结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的抗原的抗体也结合至来自一个或多个物种的该抗原。但是，这样的跨物种反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这样的交叉反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在某些情况下，术语“特异性的结合”或“特异性结合”可以关于抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用利用，意指相互作用依赖该化学物质上特定结构(例如，抗原决定聚簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合特异性蛋白质结构，而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体特异于表位“A”，则在包含标示的“A”和该抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标示的A)的分子将降低结合该抗体的标示的A的量。
术语“刺激”意指通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其关联配体，从而介导信号转导事件——诸如，但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导——诱导的初次反应。刺激可以介导某些分子的改变的表达，如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等。
“刺激分子”，作为本文利用的术语，意指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
如本文利用的“刺激配体”意指如下配体：其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)时，可以与T细胞上的关联结合伙伴(在本文称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初次反应，其包括但不限于活化、起始免疫反应、增殖等。刺激配体在本领域是公知的，并且涵盖，特别是利用肽、抗CD3抗体、超兴奋剂(superagonist)抗CD28抗体和超兴奋剂抗CD2抗体负载的MHC I类分子。
术语“对象”意图包括其中可以引发免疫反应的活的生物体(例如，哺乳动物)。如本文利用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，家畜和宠物，如羊、牛、猪、狗、猫和鼠哺乳动物、以及猿猴和非人灵长类哺乳动物。优选地，对象是人。
“靶位点”或“靶序列”是指限定结合分子可以在足以使结合发生的条件下特异性结合的核酸部分的核酸序列。在某些实施方式中，靶序列是指限定结合分子可以在足以使结合发生的条件下特异性结合的核酸部分的基因组核酸序列。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指反应抗原呈递而参与T细胞激活的膜蛋白的复合体。TCR负责识别与主要组织相容性复合体分子结合的抗原。TCR由α和β链的异二聚体组成，但在某些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上相似，但在解剖位置和功能上不同。每条链由两个胞外结构域组成，一个可变结构域和一个恒定结构域。在某些实施方式中，可在包含TCR的任意细胞上修饰TCR，这些细胞包括例如辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆性T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
如本文利用的术语“治疗性”意为治疗和/或预防。治疗效果通过疾病状态的抑制、缓解或根除而获得。
如本文利用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指如下过程：通过该过程，外源性核酸被转移或引入到宿主细胞中。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原发对象细胞及其子代。
作为本文利用的术语，“治疗”疾病，意指降低对象经历的疾病或障碍的至少一种迹象或症状的频率或严重性。
“载体”是包含分离核酸并且可被用于将该分离核酸递送至细胞内部的物质组合物。多种载体在本领域已知，包括但不限于线性多核苷酸、与离子型或两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸到细胞中转移的非质粒和非病毒化合物，如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
范围：贯穿本公开内容，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解，以范围格式的描述仅仅出于方便和简洁，而不应当解释为对本发明的范围的死板限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体地公开了子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这均适用。
B.嵌合抗原受体
本发明提供表达CAR并进一步表达B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体的经修饰的免疫细胞或其前体细胞(例如，经修饰的T细胞)，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。还提供了包含编码CAR的核苷酸序列并进一步包含编码Bcl-2变体的核苷酸序列的核酸、包含核酸的载体和包含CAR和Bcl-2变体、载体和/或核酸的经修饰的细胞(例如经修饰的T细胞)。
在某些实施方式中，核酸包含编码CAR的核苷酸序列，其包含抗原结合结构域(例如，肿瘤抗原结合结构域)、跨膜结构域和胞内结构域，并且进一步包含编码B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体的核苷酸序列，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。在某些实施方式中，编码CAR的核苷酸序列通过本文所述的编码2A自切割肽(如P2A或T2A肽)的核苷酸序列与编码变体的核苷酸序列连接。
CAR的抗原结合结构域可操作地连接到CAR的其它结构域如铰链、跨膜结构域或胞内结构域(其各自在本文别处都有描述)以供在细胞中表达。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的第一核苷酸序列可操作地连接到编码铰链和/或跨膜结构域的第二核苷酸序列，并且进一步可操作地连接到编码胞内结构域的第三核苷酸序列。
本文所述的抗原结合结构域可与本文所述的任意跨膜结构域、本文所述的任意胞内结构域或胞质结构域或者本文所述的可包括在本发明CAR中的任意其它结构域组合。本发明的CAR还可包括如本文所述的前导序列。
本发明的CAR还可包括如本文所述的铰链结构域。本发明的CAR还可包括一个或多个如本文所述的间隔区结构域或连接体，它们可用于将CAR的一个结构域与相邻结构域连接。
抗原结合结构域
CAR的抗原结合结构域是用于结合包括蛋白质、碳水化合物和糖脂的特异性靶抗原的CAR的胞外区。本发明的CAR包括能够结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。合适的肿瘤抗原是本领域已知的，包括但不限于甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、Lewis Y、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1至6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2和其任意组合。在某些实施方式中，肿瘤抗原是CD19。在某些实施方式中，抗原结合结构域是能够结合CD19的抗CD19抗原结合结构域，如本领域已知的FMC63 scFv。
抗原结合结构域可包括与抗原(例如肿瘤抗原)结合的任何结构域，并且可包括但不限于单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、单结构域抗体、全长抗体或其任何抗原结合片段、Fab和单链可变片段(scFv)。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括非糖基化(aglycosylated)抗体或其片段或其scFv。
如本文所用，术语“单链可变区片段”或“scFv”是免疫球蛋白(例如，小鼠或人)的经共价连接以形成VH::VL异二聚体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。可变重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过肽连接体连接，该连接体将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或将VH的C-末端与VL的N-末端连接。在某些实施方式中，抗原结合结构域(例如，肿瘤抗原结合结构域)包含具有N-末端至C-末端的构型(VH-连接体-VL)的scFv。在某些实施方式中，抗原结合结构域包含具有N-末端至C-末端的构型(VL-连接体-VH或VH-连接体-VL)的scFv。本领域技术人员将能够选择出用于本发明的适合的构型。
连接体通常富含甘氨酸以实现柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以实现溶解性。连接体可连接胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。连接体的非限制性实例在Shen et al.,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010(其内容特此通过引用以其整体并入)中公开。各种连接体序列是本领域已知的，非限制性地包括甘氨酸丝氨酸(GS)连接体。本领域技术人员将能够选择出用于本发明的适合的连接体序列。在一个实施方式中，本发明的抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL由连接体序列分隔。
尽管去除了恒定区并导入了连接体，但是scFv蛋白仍保持原始免疫球蛋白的特异性。如Huston,et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)描述的，单链Fv多肽抗体可由包含编码VH和VL的序列的核酸表达。另外参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公开号20050196754和20050196754。已经描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见，例如，Zhao et al.,Hybridoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peteret al.,J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012August 12；Shieh et al.,J Imunol 2009183(4):2277-85；Giomarelli et al.,Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife eta.,JClin Invst 2006116(8):2252-61；Brocks et al.,Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer et al.,Ther Immunol 1995 2(10:31-40))。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见，例如，Peter etal.,J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7；Xie et al.,Nat Biotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter et al.,Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55；Ho et al.,BioChim Biophys Acta 20031638(3):257-66)。
如本文所用，“Fab”是指结合抗原但为单价且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个Fab片段和一个Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不结合抗原的Fc区)。
如本文所用，“F(ab′)2”是指通过胃蛋白酶消化整个IgG抗体产生的抗体片段，其中此片段具有两个抗原结合(ab′)(二价)区，其中每个(ab′)区包含两条单独的氨基酸链，由S—S键连接的H链和轻(L)链的部分用于结合抗原，并且其中其余的H链部分连接在一起。一个F(ab′)2片段可分成两个独立的Fab′片段。
在其它实施方式中，抗原结合结构域包含抗体模拟蛋白，如例如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体、monobody(即adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体、avimer、Kunitz结构域肽或anticalin。具有特异性结合亲和力的构建体可以利用DARPin文库产生，例如如Seeger,et al.,,Protein Sci.,22:1239-1257(2013)中所述。
在某些实施方式中，抗原结合结构域可源自相同物种，CAR最终将会用于该物种中。例如，对于在人中利用，CAR的抗原结合结构域可包含人抗体或其片段。在某些实施方式中，抗原结合结构域可源自最终将利用CAR的不同物种。例如，对于在人中利用，CAR的抗原结合结构域可包含鼠抗体或其片段，或其人源化鼠抗体或片段。
在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区和包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括连接体。
跨膜结构域
本发明的CAR可包括将CAR的抗原结合结构域与CAR的胞内结构域连接的跨膜结构域。CAR的跨膜结构域是能够跨越细胞(例如，免疫细胞或其前体)的质膜的区域。在某些实施方式中，跨膜结构域插入在CAR的抗原结合结构域与胞内结构域之间。
在某些实施方式中，跨膜结构域天然地与CAR中的一个或多个结构域缔合。在某些实施方式中，可以选择或通过一个或多个氨基酸取代修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。在天然来源的情况下，该结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，例如，I型跨膜蛋白。在合成来源的情况下，跨膜结构域可以是促进CAR插入细胞膜的任意人工序列，例如，人工疏水序列。本发明中具体应用的跨膜结构域的实例非限制地包括源自以下的跨膜结构域(即，包含以下的至少跨膜区(一个或多个))：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS(CD278)、TolL样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9，或源自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜结构域。
在某些实施方式中，跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。在某些实施方式中，CD8的跨膜结构域是CD8α的跨膜结构域。
在某些实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包括疏水残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜结构域的每一端将会存在苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
本文所述的跨膜结构域可与本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何胞内结构域或本文所述的可包括在CAR中的任何其它结构域组合。
在某些实施方式中，跨膜结构域还包括铰链区。本发明的CAR还可以包括铰链区。CAR的铰链区是位于抗原结合结构域与跨膜结构域之间的亲水区。在某些实施方式中，此结构域促进CAR的适当的蛋白质折叠。铰链区是CAR的任选组分。铰链区可以包括选自抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链序列或其组合的结构域。铰链区的实例非限制地包括CD8a铰链、由可短至三个甘氨酸(Gly)的多肽制成的人工铰链以及IgG(如人IgG4)的CH1和CH3结构域。
在某些实施方式中，本公开的CAR包括铰链区，该铰链区将抗原结合结构域与进而连接至胞内结构域的跨膜结构域连接。铰链区优选地能够支撑抗原结合结构域以识别并结合靶细胞上的靶抗原(参见，例如，Hudecek et al.,Cancer Immunol.Res.(2015)3(2):125-135)。在某些实施方式中，铰链区是柔韧性的结构域，因此允许抗原结合结构域具有最佳识别细胞如肿瘤细胞上靶抗原的特异性结构和密度的结构(Hudecek et al.，同上)。铰链区的柔韧性允许铰链区采用许多不同的构象。
在某些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。在某些实施方式中，铰链区是源自受体的铰链区多肽(例如，源自CD8的铰链区)。
铰链区可具有如下长度：约4个氨基酸至约50个氨基酸，例如，约4个aa至约10个aa、约10个aa至约15个aa、约15个aa至约20个aa、约20个aa至约25个aa、约25个aa至约30个aa、约30个aa至约40个aa或约40个aa至约50个aa。在某些实施方式中，铰链区可以具有如下长度：大于5aa、大于10个aa、大于15个aa、大于20个aa、大于25个aa、大于30个aa、大于35个aa、大于40个aa、大于45个aa、大于50个aa、大于55个aa或更多。
合适的铰链区可以容易地选择并且可以是许多合适长度中的任一个，如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。合适的铰链区可以具有大于20个氨基酸(例如，30、40、50、60个或更多个氨基酸)的长度。
例如，铰链区包括甘氨酸多聚体(G)n、甘氨酸-丝氨酸多聚体、甘氨酸-丙氨酸多聚体、丙氨酸-丝氨酸多聚体和本领域已知的其它柔韧性连接体。可以利用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸多聚体；Gly和Ser两者是相对非结构的(unstructured)，因此可以充当组分之间的中性拴序列(neutral tether)。可以利用甘氨酸多聚体；甘氨酸实现比均一的丙氨酸显著更多的空间，并且比具有较长侧链的残基受到的限制要少得多(参见，例如，Scheraga,Rev.Computational.Chem.(1992)2:73-142)。铰链区可包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列(参见，例如，Yan et al.,J.Biol.Chem.(2012)287:5891-5897)。在一个实施方式中，铰链区可包括源自人CD8的氨基酸序列或其变体。
胞内信号传导结构域
本发明的CAR还包括胞内信号传导结构域。术语“胞内信号传导结构域”和“胞内结构域”在本文中可互换利用。CAR的胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的细胞(例如，免疫细胞)的至少一种效应物功能。胞内信号传导结构域转导效应物功能信号并指导细胞(例如，免疫细胞)执行其专门的功能，例如，伤害和/或毁坏靶细胞。
用于本发明的胞内结构域的实例包括但不限于表面受体的胞质部分、共刺激分子和一致作用以发起T细胞中信号转导的任意分子，以及这些元件的任意衍生物或变体和具有相同功能能力的任意合成序列。
胞内信号传导结构域的实例非限制性地包括T细胞受体复合物的ζ链或其任意同系物，例如，η链、FcsRIγ和β链、MB 1(Iga)链、B29(Ig)链等、人CD3ζ链、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)，以及参与T细胞转导的其它分子，如CD2、CD5和CD28。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域可以包括选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾区、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体及其组合。
在一个实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包括一种或多种共刺激分子的任意部分，诸如来自CD2、CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1、如其任意衍生物或变体、如其具有相同功能能力的任意合成序列及其任意组合的至少一个信号传导结构域。
胞内信号传导结构域的其它实例包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，包括但不限于TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、通用FcRγ、FcRβ(FcεRIb)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CDlib、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉(Tactile))、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其它共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同作用能力的共刺激分子的任何合成序列及其任意组合。
胞内信号传导结构域的其它实例非限制地包括若干类型的各种其它免疫信号传导受体的胞内信号传导结构域，包括但不限于第一代、第二代和第三代T细胞信号传导蛋白，其包括CD3、B7家族共刺激和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族受体(参见，例如，Park和Brentjens,J.Clin.Oncol.(2015)33(6):651-653)。另外，胞内信号传导结构域可包括NK细胞与NKT细胞所用的信号传导结构域(参见，例如，Hermanson和Kaufman,Front.Immunol.(2015)6:195)，如NKp30(B7-H6)的信号传导结构域(参见，例如，Zhang et al.,J.Immunol.(2012)189(5):2290-2299)，以及DAP 12(参见，例如，Topfer et al.,J.Immunol.(2015)194(7):3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10和CD3z的信号传导结构域。
适用于本发明的CAR的胞内信号传导结构域包括反应于CAR的激活(即，由抗原和二聚化剂激活)提供有区别的且可检测到的信号(例如，该细胞增加产生一种或多种细胞因子；靶基因转录的变化；蛋白质活性的变化；细胞行为的变化，例如，细胞死亡；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导反应的调节；等等)的任意期望的信号传导结构域。在某些实施方式中，胞内信号传导结构域包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)如下所述的ITAM基序。在某些实施方式中，胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在某些实施方式中，胞内信号传导结构域不共价地与膜结合CAR连接，而代替地在细胞质中扩散。
适用于本发明的CAR的胞内信号传导结构域包括含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞内信号传导多肽。在某些实施方式中，ITAM基序在胞内信号传导结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一实例和第二实例彼此相隔6至8个氨基酸。在一个实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包含3个ITAM基序。
在某些实施方式中，胞内信号传导结构域包括含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的人免疫球蛋白受体，诸如但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(参见，例如，Gillis et al.,Front.Immunol.(2014)5:254)。
合适的胞内信号传导结构域可以是源自含有ITAM基序的多肽的含有ITAM基序的部分。例如，合适的胞内信号传导结构域可以是来自任意含有ITAM基序的蛋白的含有ITAM基序的结构域。因此，合适的胞内信号传导结构域无需含有其所源自的整个蛋白的整个序列。合适的含有ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12、FCER1G(Fcε受体Iγ链)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3ζ)和CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。
在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX-激活蛋白12；KAR相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤激活受体相关蛋白；杀伤-激活受体-相关蛋白；等等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ-链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRlγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体，高亲和力γ链；等等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T-细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合物)；OKT3，δ链；T-细胞受体T3δ链；T-细胞表面糖蛋白CD3δ链；等等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T-细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T-细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T-细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T-细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、T-细胞受体T3γ链、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T-细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T-细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-Z、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自CD79A(也称为B-细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白；等等)。在一个实施方式中，适用于本公开的FN3 CAR的胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一个实施方式中，适用于本公开的FN3 CAR的胞内信号传导结构域包括ZAP70多肽。在某些实施方式中，胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的胞质信号传导结构域。在一个实施方式中，CAR中的胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的胞质信号传导结构域。
尽管通常可以利用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下无需利用整个分子。就利用胞内信号传导结构域的截短部分而言，这样的截短部分可用于代替完整的链，只要其转导效应物功能信号即可。胞内信号传导结构域包括足以转导效应物功能信号的胞内信号传导结构域的任意截短部分。
本文所述的胞内结构域可与本文所述的任意抗原结合结构域、本文所述的任意跨膜结构域或可包括在CAR中的本文所述的任意其它结构域组合。
在某些实施方式中，胞内结构域包括4-1BB的共刺激结构域。在某些实施方式中，胞内结构域包括CD3ζ或其变体的胞内结构域。在某些实施方式中，胞内结构域包括4-1BB的共刺激结构域和CD3ζ的胞内结构域。
各个CAR结构域序列(前导序列、抗原结合结构域、铰链、跨膜和/或胞内结构域)的容许的变化将是本领域技术人员已知的。例如，在某些实施方式中，CAR结构域包含与任意天然存在或已知的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
一方面，本发明提供嵌合抗原受体(CAR)，其包括肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在某些实施方式中，CAR包括抗CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3z胞内结构域。在某些实施方式中，CAR是包括以下氨基酸序列的CTL019CAR：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQK
PDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGG
GTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIR
QPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:1)。在某些实施方式中，CAR由以下核苷酸序列编码：
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt1080
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agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta1200
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg1260
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg1440
caggccctgc cccctcgc 1458
(SEQ ID NO:2)。
C.Bcl-2及其细胞毒性抑制剂
为了解决癌症的凋亡抗性，探索了可以调节癌症凋亡的细胞毒性剂与CART疗法的共同治疗，并发现通过使癌症对CART介导的凋亡敏感来提高整个CART细胞的抗肿瘤活性。具体而言，在CART19的存在下测试各类促凋亡小分子的细胞毒性，以找到类中最佳的CART/小分子组合。结果表明，当与CART19联合利用时，对b细胞淋巴瘤2(bcl-2)的拮抗作用显示出巨大的潜力。值得注意的是，与没有bcl-2改变的患者相比，具有bcl-2改变(即染色体易位和增益)的大B细胞淋巴瘤患者对CART疗法具有显著的抗性。这些结果进一步强调了靶向bcl-2在癌症中抗凋亡作用的重要性，以提高CART细胞治疗淋巴瘤的临床效果。
维奈托克(也称为ABT-199)是一种有效的bcl-2抑制剂，是FDA批准的用于淋巴和骨髓恶性肿瘤的药物(Cang S,et al.,2015,Journal of Hematology&Oncology,8(1):1-8；Roberts AW,et al.,2016,New England Journal of Medicine,374(4):311-22；和Seymour JF,et al.,2018,New England Journal of Medicine,378(12):1107-20)。
如本文所述，维奈托克可以通过抑制CART疗法中bcl-2的抗凋亡功能，协同增加CART介导的肿瘤凋亡。结果表明，CART介导的肿瘤杀伤在体外和体内对维奈托克敏感的淋巴瘤中显著增强。然而，结果也表明，靶向维奈托克抗性淋巴瘤所需的更高剂量的维奈托克通过促进CART中的凋亡而限制了CART细胞的长期持久性，导致联合作用减弱。为了克服这种维奈托克诱导的CART细胞凋亡，通过过表达在与维奈托克结合的关键残基处含有点突变(F104L)的bcl-2变体来开发抗维奈托克CART细胞(Tahir SK,et al.,2017,BMC Cancer,17(1):1-10)。如本文所述，变体bcl2(F104L)的过表达完全将CART细胞从维奈托克诱导的毒性中拯救出来，从而允许CART细胞和维奈托克组合之间的长期协同作用。此外，结果表明，bcl-2过表达通过促进长期存活，显著增强了CART细胞的整体抗肿瘤活性。
总之，这些数据表明，赋予对强效促凋亡药物抗性(例如，F104L Bcl-2变体对维奈托克具有抗性)的CART细胞中的基因调节是一种有希望的策略——通过实现令人惊讶的协同组合效应，同时显著减少不希望的旁观者效应。此外，抗凋亡分子(例如Bcl-2)在CART细胞中的表达促进了CART细胞的长期存活，从而增强了CART的整体抗肿瘤活性。
BCL-2蛋白家族包括促存活成员，如BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1和BFL1，仅促凋亡BH3的蛋白，如BIM和BAD，以及促凋亡最终效应物BAK和BAX。Bcl-2家族蛋白是线粒体凋亡途径的关键调控因子。在某些实施方式中，Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、BFL-1、BIM、BAD、BAK和BAX。
在某些实施方式中，B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白是人Bcl-2。人Bcl-2的多种同种型是已知的并且适合用于本发明，包括α和β同种型。
人Bcl-2，同种型α，包含以下氨基酸序列：
MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAGDVGAAPPGAAPAPGIFSSQPGHTPHPAASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALSPVPPVVHLTLRQAGDDFSRRYRRDFAEMSSQLHLTPFTARGRFATVVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIALWMTEYLNRHLHTWIQDNGGWDAFVELYGPSMRPLFDFSWLSLKTLLSLALVGACITLGAYLGHK(SEQ ID NO:3)。
人Bcl-2，同种型α，包含以下cDNA序列：
atggcgcacgctgggagaacggggtacgataaccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgcagaggggctacgagtgggatgcgggagatgtgggcgccgcgcccccgggggccgcccccgcaccgggcatcttctcctcccagcccgggcacacgccccatccagccgcatcccgggacccggtcgccaggacctcgccgctgcagaccccggctgcccccggcgccgccgcggggcctgcgctcagcccggtgccacctgtggtccacctgaccctccgccaggccggcgacgacttctcccgccgctaccgccgcgacttcgccgagatgtccagccagctgcacctgacgcccttcaccgcgcggggacgctttgccacggtggtggaggagctcttcagggacggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaaccgggagatgtcgcccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccggcacctgcacacctggatccaggataacggaggctgggatgcctttgtggaactgtacggccccagcatgcggcctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagactctgctcagtttggccctggtgggagcttgcatcaccctgggtgcctatctgggccacaagtga(SEQ ID NO:4)。
人Bcl-2，同种型β，包含以下氨基酸序列：
MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAGDVGAAPPGAAPAPGIFSSQPGHTPHPAASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALSPVPPVVHLTLRQAGDDFSRRYRRDFAEMSSQLHLTPFTARGRFATVVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIALWMTEYLNRHLHTWIQDNGGWVGALGDVSLG(SEQ ID NO:5)。
人Bcl-2，同种型β，包含以下cDNA序列：
atggcgcacgctgggagaacagggtacgataaccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgcagaggggctacgagtgggatgcgggagatgtgggcgccgcgcccccgggggccgcccccgcaccgggcatcttctcctcccagcccgggcacacgccccatccagccgcatcccgggacccggtcgccaggacctcgccgctgcagaccccggctgcccccggcgccgccgcggggcctgcgctcagcccggtgccacctgtggtccacctgaccctccgccaggccggcgacgacttctcccgccgctaccgccgcgacttcgccgagatgtccagccagctgcacctgacgcccttcaccgcgcggggacgctttgccacggtggtggaggagctcttcagggacggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaaccgggagatgtcgcccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccggcacctgcacacctggatccaggataacggaggctgggtaggtgcacttggtgatgtgagtctgggc(SEQ ID NO:6)。
在某些实施方式中，Bcl-2的变体赋予对Bcl-2细胞毒性抑制剂的抗性。任何对Bcl-2的细胞毒性抑制剂赋予抗性的Bcl-2变体都适用于本发明。例如，若干Bcl-2变体已被描述(参见例如Fresquet V,et al.,2014,Blood,123:4111-9；Tausch E,et al.,2019,Haematologica,104(9):e434-e437；Blombery P,et al.,2020,Blood,135(10):773-777；Birkinshaw RW,et al.,2019,Nature Communications,10,2385,https://doi.org/10.1038/s41467-019-10363-1；和Tahir S,et al.,2017,BMC Cancer,17,399,https://doi.org/10.1186/s12885-017-3383-5)。在某些实施方式中，Bcl-2是人Bcl-2，并且该变体包含选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V，以及其任何组合。在某些实施方式中，Bcl-2是人BAX，并且该变体包括G179E突变。
在某些实施方式中，变体是F104L Bcl-2。在某些实施方式中，F104L Bcl-2包含以下氨基酸序列：
MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAGDVGAAPPGAAPAPGIFSSQPGHTPHPAASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALSPVPPVVHLTLRQAGDDLSRRYRRDFAEMSSQLHLTPFTARGRFATVVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIALWMTEYLNRHLHTWIQDNGGWDAFVELYGPSMRPLFDFSWLSLKTLLSLALVGACITLGAYLGHK(SEQ ID NO:7)。在某些实施方式中，F104L Bcl-2由包含以下核苷酸序列的核酸编码：
ATGGCCCATGCCGGAAGAACCGGCTACGACAATAGAGAGATCGTCATGAAGTACATCCACTACAAGCTGTCCCAGAGGGGCTATGAGTGGGACGCCGGAGATGTGGGCGCTGCTCCTCCCGGAGCTGCCCCCGCCCCCGGAATTTTTTCCAGCCAGCCCGGCCATACCCCTCACCCCGCCGCCTCCAGAGATCCCGTGGCTAGAACCAGCCCTCTGCAAACCCCCGCCGCCCCCGGCGCCGCTGCTGGACCCGCCCTCAGCCCCGTGCCTCCCGTGGTGCACCTCACACTGAGGCAAGCCGGAGACGATCTGAGCAGAAGATATAGAAGGGACTTCGCCGAGATGAGCAGCCAGCTGCATCTGACCCCTTTCACAGCCAGAGGCAGATTTGCCACCGTCGTGGAGGAGCTCTTCAGAGACGGCGTGAATTGGGGAAGAATCGTGGCCTTCTTCGAGTTCGGCGGCGTCATGTGCGTCGAGAGCGTGAATAGGGAGATGTCCCCCCTCGTGGACAACATCGCCCTCTGGATGACAGAGTATCTGAATAGACATCTGCACACATGGATCCAAGACAACGGAGGCTGGGACGCCTTTGTGGAACTCTACGGCCCTAGCATGAGACCTCTGTTCGACTTCAGCTGGCTGTCTCTGAAGACACTGCTGTCTCTGGCTCTGGTGGGAGCTTGCATTACACTGGGAGCCTATCTGGGACACAAG(SEQ ID NO:8)。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。在某些实施方式中，细胞毒性药物是小分子。在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77和BH3I-1。在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是维奈托克。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是维奈托克，并且变体是F104L Bcl-2。
D.核酸与表达载体
本公开提供一种核酸，其包含a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和b)编码B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体的核苷酸序列，其中所述变体赋予对所述Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
在某些实施方式中，本公开的核酸包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。第一和第二核苷酸序列可以通过连接体分隔。用于本公开的连接体允许多个蛋白由同一核酸序列(例如，多顺反子序列或双顺反子序列)编码，其被翻译为解离成单独的蛋白组分的多蛋白。在某些实施方式中，核酸从5’到3’包括第一核苷酸序列、连接体和第二核苷酸序列。在某些实施方式中，核酸从5’到3’包括第二核苷酸序列、连接体和第一核苷酸序列。在某些实施方式中，第一核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中抗原结合结构域结合肿瘤抗原；并且所述第二核苷酸序列编码B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
在一些实施方式中，连接体包含编码内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列。如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进内部核糖体直接进入蛋白编码区的起始密码子(如ATG)，进而引起对该基因的帽独立性(cap-independent)翻译的元件。各种内部核糖体进入位点是本领域技术人员已知的，其非限制地包括可获自以下的IRES：病毒或细胞mRNA来源，例如，免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)；血管内皮生长因子(VEGF)；成纤维细胞生长因子2；胰岛素样生长因子；翻译起始因子eIF4G；酵母转录因子TFIID和HAP4；和可获自以下的IRES：例如，心病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV、弗兰德鼠白血病病毒(FrMLV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的IRES。
在一些实施方式中，连接体包含编码自切割肽的核酸序列。如本文所用，“自切割肽”或“2A肽”是指允许多个蛋白编码为多蛋白的寡肽，多蛋白在转录后解离成组分蛋白。术语“自切割”的利用不意图暗示蛋白水解切割反应。各种自切割肽或2A肽是本领域技术人员已知的，其非限制性包括在小核糖核酸病毒科病毒家族成员中发现的那些，例如，口蹄疫病毒(FMDV)、马甲型鼻炎病毒(ERAV0、明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)和猪捷申病毒-1(PTV-1)；和心病毒如泰勒病毒(Theilovirus)和脑心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽在本文中分别被称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的自切割肽。
在一些实施方式中，构建体包括连接体，所述连接体任选地进一步包含编码弗林蛋白酶切割位点的核酸序列。弗林蛋白酶是无所不在地表达的蛋白酶，位于反式高尔基体中并在蛋白前体分泌前对其加工。弗林蛋白酶在其共有识别序列的COOH-末端切割。各种弗林蛋白酶共有识别序列(或“弗林蛋白酶切割位点”)是本领域技术人员已知的。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的弗林蛋白酶切割位点。
在一些实施方式中，连接体包含编码弗林蛋白酶切割位点和2A肽的组合的核酸序列。实例非限制地包括：包含编码弗林蛋白酶和F2A的核酸序列的连接体、包含编码弗林蛋白酶和E2A的核酸序列的连接体、包含编码弗林蛋白酶和P2A的核酸序列的连接体、包含编码弗林蛋白酶和T2A的核酸序列的连接体。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的组合。在这样的实施方式中，连接体可进一步包含在弗林蛋白酶和2A肽之间的间隔区序列。在一些实施方式中，连接体包括在2A肽5’的弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方式中，连接体包括在弗林蛋白酶切割位点5’的2A肽。各种间隔区序列都是本领域已知的，其非限制地包括甘氨酸丝氨酸(GS)间隔区(也被称为GS连接体)。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的间隔区序列。
在一些实施方式中，本公开的核酸可以可操作地连接至转录控制元件，例如，启动子和增强子等。合适的启动子和增强子元件是本领域技术人员已知的。
在某些实施方式中，编码外源CAR的核酸与启动子可操作地连接。在某些实施方式中，启动子是磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子。
为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子元件和增强子元件；巨细胞病毒即时早期启动子；单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于来自逆转录病毒的长末端重复序列的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和各种本领域已知的组织特异性启动子。合适的可逆启动子(包括可逆诱导型启动子)是本领域已知的。这样的可逆启动子可从多种生物体分离和源自多种生物体，例如，真核生物和原核生物。对源自第一生物体的可逆启动子的修饰用于第二生物体(例如，第一原核生物和第二真核生物、第一真核生物和第二原核生物等)是本领域公知的。这样的可逆启动子和基于这样的可逆启动子的系统还包含其它控制蛋白，包括但不限于醇调控启动子(例如，醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、反应于醇反式激活蛋白(A1cR)的启动子等)、四环素调控启动子(例如，包括Tet激活子(TetActivators)、TetON、TetOFF等的启动子系统)、类固醇调控启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌性激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调控启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)、发病机理相关调控启动子(例如，水杨酸调控启动子、乙烯调控启动子、苯并噻二唑调控启动子等)、温度调控启动子(例如，热激诱导型启动子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆热激启动子等)、光调控启动子、合成诱导型启动子等。
在一些实施方式中，启动子是CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。例如，可以利用CD4基因启动子；参见，例如，Salmon et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1993)90:7739；和Marodon et al.(2003)Blood101:3416。作为另一实例，可以利用CD8基因启动子。可通过利用NcrI(p46)启动子实现NK细胞特异性表达；参见，例如，Eckelhart et al.Blood(2011)117:1565。
为了在酵母细胞中表达，合适的启动子是组成型启动子，如ADH1启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子等；或可调控启动子，如GAL1启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PHOS启动子、CUP1启动子、GALT启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子和AOX1(例如，用于毕赤酵母属)。对适合的载体和启动子进行选择完全是在本领域普通技术人员的水平内的。用于原核宿主细胞的合适的启动子包括但不限于噬菌体T7 RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如，lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；araBAD启动子；体内调控启动子，如ssaG启动子或相关启动子(参见，例如，美国专利公开号20040131637)、pagC启动子(Pulkkinen和Miller,J.Bacteriol.(1991)173(1):86-93；Alpuche-Aranda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21):10079-83)、nirB启动子(Harborne et al.Mol.Micro.(1992)6:2805-2813)等(参见，例如，Dunstan et al.,Infect.Immun.(1999)67:5133-5141；McKelvie et al.,Vaccine(2004)22:3243-3255；和Chatfield et al.,Biotechnol.(1992)10:888-892)；σ70启动子，例如，共有σ70启动子(参见，例如，GenBank登录号AX798980、AX798961和AX798183)；稳定期启动子，例如，dps启动子、spv启动子等；源自毒力岛SPI-2(pathogenicity island SPI-2)的启动子(参见，例如，WO96/17951)；actA启动子(参见，例如，Shetron-Rama et al.,Infect.Immun.(2002)70:1087-1096)；rpsM启动子(参见，例如，Valdivia和Falkow Mol.Microbiol.(1996).22:367)；tet启动子(参见，例如，Hillen,W.和Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.和Heinemann,U.(eds),Topics in Molecular and Structural Biology,Protein--NucleicAcid Interaction.Macmillan,London,UK,第10卷,第143-162页)；SP6启动子(参见，例如，Melton et al.,Nucl.Acids Res.(1984)12:7035)；等等。用于原核生物(如大肠杆菌)的合适的强启动子包括但不限于Trc、Tac、T5、T7和PΛ。用于细菌宿主细胞的操纵子的非限制性实例包括乳糖启动子操纵子(当与乳糖接触时，LacI抑制蛋白改变构象，进而防止Lad抑制蛋白与操纵子结合)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸复合时，TrpR抑制蛋白具有结合操纵子的构象；在色氨酸不存在时，TrpR抑制蛋白具有不与操纵子结合的构象)和tac启动子操纵子(参见，例如，deBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:21-25)。
合适的启动子的其它实例包括即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任意多核苷酸序列的高水平表达。还可以利用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)或人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、EF-1α启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步，本发明不应限于组成型启动子的利用。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的利用提供了分子开关，该分子开关能够能够开启诱导型启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达(当期望这种表达时)，或使该表达关闭(当不期望该表达时)。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方式中，含有合适的启动子的基因座或构建体或转基因通过诱导系统的诱导，是不可逆地开关的。用于诱导不可逆开关的合适的系统是本领域公知的，例如，不可逆开关的诱导可利用Cre-lox介导的重组(参见，例如，Fuhrmann-Benzakein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28:e99，其公开内容通过引用并入本文)。本领域已知的重组酶、核酸内切酶、连接酶、重组位点等的任意合适的重组都可用于产生不可逆地开关的启动子。本文别处描述的用于执行位点特异性重组的方法、机理和要求可用于产生不可逆地开关的启动子，并且是本领域公知的，参见，例如，Grindley et al.Annual Review ofBiochemistry(2006)567-605；and Tropp,Molecular Biology(2012)(Jones&BartlettPublishers,Sudbury,Mass.)(其公开内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，本公开的核酸进一步包含编码CAR诱导表达盒的核酸序列。在一个实施方式中，CAR诱导表达盒用于产生一经CAR信号传导就释放的转基因多肽产物。参见，例如，Chmielewski和Abken,Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8):1145-1154；和Abken,Immunotherapy(2015)7(5):535-544。在一些实施方式中，本公开的核酸进一步包含编码可操作地连接至T-细胞激活反应启动子的细胞因子的核酸序列。在一些实施方式中，可操作地连接至T-细胞激活反应启动子的细胞因子存在于单独的核酸序列上。在一个实施方式中，细胞因子是IL-12。
本公开的核酸可存在于表达载体和/或克隆载体内。表达载体可包括可选标记物、复制起始点和提供载体的复制和/或维护的其它特征。合适的表达载体包括，例如，质粒、病毒载体等。本领域技术人员已知多种合适的载体和启动子；很多都可商业获得以用于产生对象重组构建体。以下载体通过实例的方式提供，并且不应以任何方式解释为是限制性的：细菌的：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,瑞典)。真核生物的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常具有靠近启动子序列的便利的限制性位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。在表达宿主中有效的(operative)可选标记物可以存在。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如，Li et al.,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35:2543-2549；Borrasetal.,Gene Ther.(1999)6:515-524；Li和Davidson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7700-7704；Sakamotoet al.,H.Gene Ther.(1999)5:1088-1097；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如，Aliet al.,Hum.Gene Ther.(1998)9:81-86,Flanneryet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:6916-6921；Bennettet al.,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38:2857-2863；Jomaryet al.,Gene Ther.(1997)4:683 690,Rolling et al.,Hum.Gene Ther.(1999)10:641-648；Aliet al.,Hum.Mol.Genet.(1996)5:591-594；Srivastava in WO 93/09239,Samulskiet al.,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelsonet al.,Virol.(1988)166:154-165；和Flotteet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:10319-23；Takahashiet al.,J.Virol.(1999)73:7812-7816)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和源自以下逆转录病毒的载体：如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)；等等。
适合利用的其它表达载体是，例如，但不限于慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、工程改造的杂合病毒载体、转座子介导的载体等。病毒载体技术在本领域是公知的，并且例如在Sambrook etal.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第1-4卷,Cold Spring HarborPress,NY)和其它病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。
总体上，合适的载体包含在至少一种生物体中具有功能的复制起始点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)可用于将CAR导入到免疫细胞或其前体(例如，T细胞)中。因此，本发明的表达载体(例如，慢病毒载体)可包含编码CAR的核酸。在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)将包含将辅助其中所编码的CAR的功能表达的其它元件。在一些实施方式中，包含编码CAR的核酸的表达载体进一步包含哺乳动物启动子。在一个实施方式中，载体进一步包含延长因子-1-α启动子(EF-1α启动子)。EF-1α启动子的利用可提高下游转基因(例如，编码CAR的核酸序列)表达的效率。生理启动子(例如，EF-1α启动子)不太可能诱导整合介导的基因毒性，而可能废除逆转录病毒载体转化干细胞的能力。适用于载体(例如，慢病毒载体)的其它生理启动子对本领域技术人员是已知的，并且可并入到本发明的载体中。在一些实施方式中，载体(例如，慢病毒载体)进一步包含可提供可提高滴定度和基因表达的非必需顺式作用序列。非必需顺式作用序列的一个非限制实例是中心多聚嘌呤区(central polypurine tract)和中心终止序列(cPPT/CTS)，其对高效逆转录和核输入是很重要的。其它非必需顺式作用序列对本领域技术人员是已知的，并且可并入到本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。在一些实施方式中，载体进一步包含转录后调控元件。转录后调控元件可提高RNA转录、提高转基因表达和稳定RNA转录物。转录后调控元件的一个实例是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。因此，在一些实施方式中，本发明的载体进一步包含WPRE序列。各种转录后调控元件对本领域技术人员是已知的，并且可并入到本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。本发明的载体可进一步包含其它元件如用于RNA运输、包装序列的rev反应元件(RRE)以及和5’和3’长末端重复序列(LTR)。术语“长末端重复序列”或“LTR”是指碱基对的位于逆转录病毒DNA末端的包含U3、R和U5区域的结构域。LTR总体上提供逆转录病毒基因表达(例如，启动、起始和基因转录物的聚腺苷酸化)和病毒复制所需的功能。在一个实施方式中，本发明的载体(例如，慢病毒载体)包括3’U3缺失的LTR。因此，本发明的载体(例如，慢病毒载体)可包含本文所述的元件的任意组合，以增强转基因的功能表达的效率。例如，本发明的载体(例如，慢病毒载体)除编码CAR的核酸外可包括WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5’LTR、3’U3缺失的LTR’。
本发明的载体可以是自失活载体。如本文所用，术语“自失活载体”是指3’LTR增强启动子区(U3区)已被修饰(例如，通过缺失或取代)的载体。自失活载体可防止病毒转录超出第一轮病毒复制。因此，自失活载体能够感染，然后仅一次就能整合到宿主基因组(例如，哺乳动物基因组)中，并且无法进一步去除(passed)。因此，自失活载体可大大地降低产生具有复制能力的病毒的风险。
在一些实施方式中，本发明的核酸可以是RNA，例如，体外合成的RNA。用于体外合成RNA的方法是本领域技术人员已知的；可以利用任何已知的方法来合成包含编码本公开的CAR的序列的RNA。用于将RNA导入到宿主细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，Zhaoet al.Cancer Res.(2010)15:9053。将包含编码本公开的CAR的核苷酸序列的RNA导入到宿主细胞可在体外或离体或者体内实施。例如，可用包含编码本公开的CAR的核苷酸序列的RNA将宿主细胞(例如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)体外或离体电穿孔。
为了评估多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可以包含可选标记基因或报告基因，或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在一些实施方式中，可选标记物可携带在单独的DNA片段上并在共转染程序中利用。可选标记物和报告基因的两侧都可以有适当的调控序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的可选标记物非限制地包括抗生素抗性基因。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调控序列的功能性。一般来说，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由其表达的编码多肽的基因，该多肽的表达通过某些易于检测的特性(例如，酶活性)来表现。报告基因的表达在DNA导入受体细胞后的适当时间进行评估。合适的报告基因可非限制地包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei et al.,2000FEBS Letters 479:79-82)。
在一些实施方式中，提供本公开的核酸用于例如在哺乳动物细胞中产生本文所述的CAR。在一些实施方式中，本公开的核酸提供编码CAR的核酸的扩增。
E.经修饰的免疫细胞
本发明提供被工程化以表达CAR和B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体的经修饰的免疫细胞或其前体细胞(包括但不限于，例如，经修饰的T细胞(包括，但不限于例如，自然杀伤T(NKT)细胞和γ-ΔT细胞)、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞)，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。还提供了经修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包含核酸，所述核酸包含编码CAR的核苷酸序列和编码B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体的核苷酸序列，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。因此，这种经修饰的细胞具有由其中表达的CAR所引导的特异性。例如，包含CAR的本公开的经修饰的细胞对靶细胞(例如癌症细胞)上的肿瘤抗原(例如CD19)具有特异性。
在某些实施方式中，编码CAR的核苷酸序列经由如本文所述的编码2A自切割肽的核苷酸序列(如P2A或T2A序列)连接到编码Bcl-2变体的核苷酸序列。
在某些实施方式中，Bcl-2是人Bcl-2。在某些实施方式中，Bcl-2的变体赋予对Bcl-2的细胞毒性抑制剂的抗性。在某些实施方式中，变体是F104L Bcl-2。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。在某些实施方式中，细胞毒性药物是小分子。在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是维奈托克。
在某些实施方式中，细胞毒性抑制剂是维奈托克，并且变体是F104L Bcl-2
在某些实施方式中，经修饰的细胞是经修饰的免疫细胞。在某些实施方式中，经修饰的细胞是自体细胞。在某些实施方式中，经修饰的细胞是由人受试者获得的自体细胞。在某些实施方式中，经修饰的细胞是T细胞。
F.治疗方法
本文所述的经修饰的细胞(例如，T细胞)可包括在免疫疗法的组合物中。该组合物可包括药物组合物，并进一步包括药学上可接受的载体。可以给予治疗有效量的包括经修饰的T细胞的药物组合物。
在一个方面，本发明包括过继细胞转移疗法的方法，该方法包括向有需要的对象给予本发明的经修饰的细胞的群体，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞(例如，T细胞)。在一个方面，本发明提供了一种治疗有需要的对象中的癌症的方法，该方法包括给予经修饰的细胞的群体，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中将所述细胞被工程化以表达a)嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合由所述癌症表达的肿瘤抗原；和b)B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对所述Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性，从而治疗所述癌症。
在某些实施方式中，对象在给予经修饰的细胞的群体之前已给予细胞毒性抑制剂。在某些实施方式中，该方法还包括在给予经修饰的细胞的群体之前、同时或之后向对象给予细胞毒性抑制剂。
给予免疫细胞以用于过继性细胞疗法的方法是已知的，并且可结合所提供的方法和组合物利用。例如，过继性免疫细胞疗法方法在授权Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授权Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)中进行了描述。参见，例如，Themeli et al.(2013)NatBiotechnol.31(10):928-933；Lee et al.,Int J.Mol Sci.(2021)22(9):4590；Banerjeeet al.,JCO Clin Cancer Inform.(2021)5:668-678；Robbins et al.,Stem Cell ResTher.(2021)12(1):350；Wrona et al.,Int J Mol Sci.(2021)22(11):5899；Atrash andMoyo,Onco Targets Ther.(2021)14:2185-2201；Martinez Bedoya et al.,FrontImmunol.(2021)12:640082；Morgan et al.,Front Immunol.(2020)11:1965；Chicaybamet al.,Cancers(Basel)(2020)12(9):2360；和Rafiq et al.,Nat Rev Clin Oncol.(2020)17(3):147-167。在某些实施方式中，细胞疗法(例如，过继性T细胞疗法)通过自体转移进行，其中细胞从待接受细胞疗法的对象中分离和/或以其它方式从待接受细胞疗法的对象制备，或来自源自这样的对象的样品。因此，在某些方面中，细胞源自对象(例如，需要治疗的患者)，并且细胞在分离和处理之后被给予至同一个对象。
在某些实施方式中，细胞疗法(例如，过继性T细胞疗法)通过同种异体转移来实施，其中细胞从除了待接受或最终接受细胞疗法的对象以外的对象(例如，第一对象)分离和/或以其它方式制备。在这样的实施方式中，然后将细胞给予至同一物种的不同对象，例如，第二对象。在某些实施方式中，第一对象和第二对象在遗传上是相同的。在某些实施方式中，第一对象和第二对象在遗传上是相似的。在某些实施方式中，第二对象表达与第一对象相同的HLA类别或超型。
在某些实施方式中，在给予细胞或含有细胞的组合物之前，对象已用靶向疾病或状况(例如，肿瘤)的治疗剂治疗过。在一些方面中，对象是其它治疗剂难治的或对其无反应。在某些实施方式中，对象例如在用其它治疗干预(包括化疗、放射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT)治疗之后患有持久性或复发性疾病。在某些实施方式中，尽管对象已对其它疗法有抗性，但给予仍有效地治疗对象。
在某些实施方式中，对象对其它治疗剂有反应，并且用该治疗剂治疗减轻了疾病负担。在一些方面中，对象最初对治疗剂有反应，但随着时间的推移表现出疾病或状况的复发。在某些实施方式中，对象没有复发。在一些这样的实施方式中，对象被确定处于复发风险，诸如处于高复发风险，因此预防性地给予细胞，从而例如降低复发的可能性或防止复发。在一些方面中，对象之前没有接受其它治疗剂的治疗。
在某些实施方式中，对象例如在用其它治疗干预(包括化疗、放射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT)治疗之后患有持久性或复发性疾病。在某些实施方式中，尽管对象已对其它疗法有抗性，但给予仍有效地治疗对象。
本发明的经修饰的免疫细胞可给予于动物，优选哺乳动物，甚至更优选人，以治疗癌症。此外，本发明的细胞可用于任何与癌症相关的状况的治疗，特别是针对肿瘤细胞(一种或多种)的细胞介导的免疫反应，其中需要治疗或减轻该疾病。用本发明的经修饰的细胞或药物组合物治疗的癌症的类型包括某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。示例性癌症包括但不限于B细胞恶性肿瘤、B细胞淋巴瘤和白血病等，以及结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、淋巴瘤和肝细胞癌。癌症可以是非实体肿瘤(如血液肿瘤)或实体肿瘤。成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。在一个实施方式中，癌症是实体肿瘤或血液肿瘤。在某些实施方式中，癌症是白血病和/或淋巴瘤。在某些实施方式中，癌细胞表达CD19。
就经历疗法的对象而言，待给予的细胞可以是自体的。
本发明的细胞的给予可以本领域技术人员已知的任何便利的方式实施。本发明的细胞可通过雾化吸入、注射、摄取、输注、植入或移植给予于对象。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内给予于患者。在其它情况下，将本发明的细胞直接注射到对象的炎症部位、对象的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等。
在一些实施方式中，以所需剂量(dosage)给予细胞，所需剂量在一些方面中包括细胞或细胞类型(一种或多种)的所需剂数(dose)或数量和/或所需的细胞类型比。因此，在一些实施方式中，细胞的剂量基于细胞的总数(或每kg体重的数量)和单独的群体或亚型的所需比，诸如CD4+与CD8+的比。在一些实施方式中，细胞的剂量基于单独的群体或单独的细胞类型中所需细胞总数(或每kg体重的数量)。在一些实施方式中，剂量基于这样的特征的组合，如单独的群体中所需的总细胞数、所需的比和所需的细胞总数。
在一些实施方式中，在总细胞的所需剂量(如T细胞的所需剂量)的容许差异下或在该容许差异内给予细胞群或细胞亚型(如CD8+T细胞和CD4+T细胞)。在一些方面中，所需剂量是所需的细胞数或被给予细胞的对象的每单位体重所需的细胞数，例如，细胞数/kg。在一些方面中，所需剂量等于最小细胞数或每单位体重最小细胞数，或在最小细胞数或每单位体重最小细胞数以上。在一些方面中，在以所需剂量给予的总细胞中，单独的群体或亚型以所需的输出比(如CD4+与CD8+的比)或接近所需的输出比(例如，在这种比的某个容许差异或误差内)存在。
在一些实施方式中，在一种或多种单独的细胞群或细胞亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)的容许差异下或在该容许差异内给予细胞。在一些方面中，所需剂量是该亚型或群体细胞的所需数量，或是被给予细胞的对象的每单位体重此类细胞的所需数量，例如，细胞数/kg。在一些方面中，所需剂量等于该群体或亚型细胞的最小数或在该群体或亚型细胞的最小数以上，或等于每单位体重该群体或亚型细胞的最小数或在每单位体重该群体或亚型细胞的最小数以上。因此，在一些实施方式中，剂量基于总细胞的所需的固定剂量和所需的比，和/或基于单独的亚型或亚群中一种或多种(例如，每一种)的所需的固定剂量。因此，在一些实施方式中，剂量基于T细胞的所需的固定剂量或最小剂量和CD4+与CD8+细胞的所需的比，和/或基于CD4+和/或CD8+细胞的所需的固定剂量或最小剂量。
在某些实施方式中，这些细胞，或细胞亚型的单独的群体以如下范围向对象给予：约100万至约1000亿个细胞，诸如，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约250万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或上述值中任意两个所限定的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或上述值中任意两个所限定的范围)，并且在某些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围内的任意值。
在一些实施方式中，总细胞的剂量和/或细胞的单独亚群的剂量在以下范围内：在等于或约1x105个细胞/kg至约1x1011个细胞/kg之间，和等于或约104至1011个细胞/千克(kg)体重，如在105与106个细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x 105个细胞/kg体重、1.5x105个细胞/kg体重、2x 105个细胞/kg体重或1x 106个细胞/kg体重。例如，在一些实施方式中，在以下某个误差范围下或在该误差范围内给予细胞：在等于或约104与等于或约109个T细胞/千克(kg)体重之间，如在105与106个T细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x 105个T细胞/kg体重、1.5x 105个T细胞/kg体重、2x 105个T细胞/kg体重或1x 106个T细胞/kg体重。在其它示例性实施方式中，用于本公开方法的经修饰的细胞的合适的剂量范围非限制地包括约1x105个细胞/kg至约1x106个细胞/kg、约1x106个细胞/kg至约1x107个细胞/kg、约1x107个细胞/kg约1x108个细胞/kg、约1x108个细胞/kg约1x109个细胞/kg、约1x109个细胞/kg、约1x1010个细胞/kg、约1x1010个细胞/kg、约1x1011个细胞/kg。在示例性实施方式中，用于本公开方法的合适的剂量是约1x108个细胞/kg。在示例性实施方式中，用于本公开方法的合适的剂量是约1x107个细胞/kg。在其它实施方式中，合适的剂量是约1x107个总细胞至约5x107个总细胞。在一些实施方式中，合适的剂量是约1x108个总细胞至约5x108个总细胞。在一些实施方式中，合适的剂量是约1.4x107个总细胞至约1.1x109个总细胞。在示例性实施方式中，用于本公开方法的合适的剂量是约7x109个总细胞。
在一些实施方式中，在以下某个误差范围下或在该误差范围内给予细胞：在等于或约104与等于或约109个CD4+和/或CD8+细胞/千克(kg)体重之间，如在105与106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x 105个CD4+和/或CD8+细胞/kg、1.5x 105个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重、2x 105个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重或1x 106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重。在一些实施方式中，在以下某个误差范围下或在该误差范围内给予细胞：大于，和/或至少约1x 106、约2.5x 106、约5x 106、约7.5x 106或约9x 106个CD4+细胞，和/或至少约1x 106、约2.5x 106、约5x 106、约7.5x 106或约9x 106个CD8+细胞，和/或至少约1x 106、约2.5x 106、约5x 106、约7.5x 106或约9x 106个T细胞。在一些实施方式中，在以下某个误差范围下或在该误差范围内给予细胞：在约108与1012个T细胞之间或在约1010与1011个T细胞之间、在约108与1012个CD4+细胞之间或在约1010与1011个CD4+细胞之间和/或在约108与1012个CD8+细胞之间或在约1010与1011个CD8+细胞之间。
在一些实施方式中，在多个细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需的输出比的容许范围下或在该容许范围内给予细胞。在一些方面中，所需的比可以是具体的比或者可以是比的范围，例如，在一些实施方式中，所需的比(例如，CD4+细胞与CD8+细胞的比)在等于或约5:1与等于或约5:1(或大于约1:5与小于约5:1)之间，或在等于或约1:3与等于或约3:1(或大于约1:3与小于约3:1)之间，如在等于或约2:1与等于或约1:5之间(或大于约1:5与小于约2:1之间，如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5)。在一些方面中，容许差异在所需的比的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包含这些范围之间的任意值。
在一些实施方式中，以单剂量或多剂量向有需要的对象给予经修饰的细胞的剂量。在一些实施方式中，以多剂量给予经修饰的细胞的剂量，例如，一周一次或每7天一次、每2周一次或每14天一次、每3周一次或每21天一次、每4周一次或每28天一次。在示例性实施方式中，向有需要的对象给予单剂量的经修饰的细胞。在示例性实施方式中，通过快速静脉内输注向有需要的对象给予单剂量的经修饰的细胞。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗疾病的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和过程、是否出于预防或治疗目的给予细胞、先前疗法、对象的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的判断。在一些实施方式中，组合物和细胞一次或通过一系列治疗适当地给予于对象。
在一些实施方式中，作为组合治疗的一部分来给予细胞，诸如与其它治疗性干预(如抗体或工程改造的细胞或受体或剂，如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任意顺序与其按顺序给予。在一些实施方式中细胞同时或以任意顺序按顺序与一种或多种其它治疗剂共同给予，或结合另一治疗性干预给予。在一些情况下，细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同给予使得细胞群增强一种或多种其它治疗剂的效果，反之亦然。在一些实施方式中，在一种或多种其它治疗剂之前给予细胞。在一些实施方式中，在一种或多种其它治疗剂之后给予细胞。在一些实施方式中，一种或多种其它试剂包括细胞因子，如IL-2，从而例如增强持久性。在一些实施方式中，方法包括化疗剂的给予。
在某些实施方式中，本发明的经修饰的细胞(例如，包含CAR的经修饰的细胞)可与免疫检查点抗体(例如，抗PD-1、抗CTLA-4或抗PDL1抗体)组合给予对象。例如，经修饰的细胞可与靶向例如PD-1(程序性死亡1蛋白)的抗体或抗体片段组合给予。抗PD-1抗体的实例包括但不限派姆单抗(pembrolizumab)(以前是lambrolizumab，也称为MK-3475)和纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、/>)或其抗原结合片段。在某些实施方式中，经修饰的细胞可以与抗PD-L1抗体或其抗原结合片段组合给予。抗PD-L1抗体的实例包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A(/>阿特珠单抗(Atezolizumab))和MEDI4736(德瓦鲁单抗(Durvalumab),Imfinzi)。在某些实施方式中，经修饰的细胞可以与抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段组合给予。抗CTLA-4抗体的实例包括但不限于伊匹单抗(Ipilimumab)(商品名Yervoy)。也可以利用其它类型的免疫检查点调节剂，包括但不限于小分子、siRNA、miRNA和CRISPR系统。免疫检查点调节剂可以在包含CAR的经修饰的细胞之前、之后或与其同时给予。在某些实施方式中，包含免疫检查点调节剂的组合治疗可提高包含本发明经修饰的细胞的疗法的治疗功效。
在细胞给予后，在一些实施方式中，例如通过多种已知方法中的任意种来测量的工程改造的细胞群的生物活性。评估参数包括工程改造的或天然的T细胞或其它免疫细胞在体内(例如，通过成像)或在体外(例如，通过ELISA或流式细胞术)与抗原的特异性结合。在某些实施方式中，可利用本领域已知的任何合适的方法测量工程改造的细胞破坏靶细胞的能力，诸如，例如Kochenderfer et al.,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；Herman etal.J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)；Kiesgen et al.,NatProtoc.(2021)16(3):1331-1342；和Maldini et al.,J Immunol Methods(2020)484-485:112830中描述的细胞毒性测定。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNy、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面中，生物活性是通过评估临床结局，如肿瘤负担或负荷的减少来衡量的。
在某些实施方式中，对象被提供二级治疗(secondary treatment)。二级治疗包括但不限于化疗、放疗、手术和药物。
在一些实施方式中，可以在CAR T细胞疗法之前给予对象调理疗法(conditioningtherapy)。在一些实施方式中，调理疗法包括向对象给予有效量的环磷酰胺。在一些实施方式中，调理疗法包括向对象给予有效量的氟达拉滨。在优选的实施方式中，调理疗法包括向对象给予有效量的环磷酰胺和氟达拉滨的组合。在CAR T细胞疗法之前给予调理疗法可提高CAR T细胞疗法的功效。美国专利号9,855,298(其通过引用以其整体并入本文)中描述了针对T细胞疗法对患者进行调理的方法。
在一些实施方式中，本公开的具体剂量方案包括在给予修饰T细胞之前的淋巴细胞耗竭步骤(lymphodepletion step)。在示例性实施方式中，淋巴细胞耗竭步骤包括环磷酰胺和/或氟达拉滨的给予。
在一些实施方式中，淋巴细胞耗竭步骤包括以约200mg/m2/天与约2000mg/m2/天之间(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的剂量给予环磷酰胺。在示例性实施方式中，环磷酰胺的剂量是约300mg/m2/天。在一些实施方式中，淋巴细胞耗竭步骤包括以约20mg/m2/天与约900mg/m2/天之间(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的剂量给予氟达拉滨。在示例性实施方式中，氟达拉滨的剂量是约30mg/m2/天。
在一些实施方式中，淋巴细胞耗竭步骤包括以约200mg/m2/天与约2000mg/m2/天之间(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的剂量给予环磷酰胺，和以约20mg/m2/天与约900mg/m2/天之间(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的剂量给予氟达拉滨。在示例性实施方式中，淋巴细胞耗竭步骤包括以约300mg/m2/天的剂量给予环磷酰胺，和以约30mg/m2/天的剂量给予氟达拉滨。
在示例性实施方式中，环磷酰胺的给予是三天内300mg/m2/天，而氟达拉滨的给予是三天内30mg/m2/天。
相对于在第0天输注T细胞(例如，CAR-T、TCR-T、修饰T细胞等)，在第-6天至第-4天安排淋巴细胞耗竭化疗的给予(窗口为-1天，即，在第-7天至第-5天给予)。
在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象在给予修饰T细胞前接受包括静脉内输注3天300mg/m2环磷酰胺的淋巴细胞耗竭化疗。在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象在给予修饰T细胞前接受包括静脉内输注3天300mg/m2环磷酰胺的淋巴细胞耗竭化疗。
在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象接受淋巴细胞耗竭化疗，淋巴细胞耗竭化疗包括剂量为约20mg/m2/天与约900mg/m2/天之间(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的氟达拉滨。在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象接受包括剂量为30mg/m2氟达拉滨达3天的淋巴细胞耗竭化疗。
在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象接受淋巴细胞耗竭化疗，淋巴细胞耗竭化疗包括剂量为约200mg/m2/天与约2000mg/m2/天之间(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的环磷酰胺，和剂量为约20mg/m2/天与约900mg/m2/天之间(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的氟达拉滨。在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象接受淋巴细胞耗竭化疗，淋巴细胞耗竭化疗包括剂量为约300mg/m2/天的环磷酰胺和剂量为30mg/m2的氟达拉滨达3天。
本发明的细胞可按剂量和途径给予，并且有时在适当的临床前与临床实验和试验中确定。细胞组合物可按在这些范围内的剂量多次给予。本发明的细胞的给予可与可用于治疗由本领域技术人员所确定的需的疾病或状况的其它方法组合。
本领域已知，输注CAR T细胞后的不良效果之一是免疫激活的开始，免疫激活的开始被称为细胞因子释放综合征(CRS)。CRS是导致炎症细胞因子升高的免疫激活。CRS是一种已知的中靶毒性(on-target toxicity)，其发展可能与功效相关。临床测量和实验室测量的范围从轻度CRS(全身症状和/或2级器官毒性)到严重CRS(sSCR；3级以上的器官毒性、攻击性临床干预和/或潜在的生命威胁)。临床特征包括：高热、不适、疲劳、肌痛、恶心、厌食、心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心机能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CAR T-细胞输注后，细胞因子包括干扰素-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10和IL-6显示出显著升高。一种CRS特征是细胞因子包括IL-6(严重升高)、IFN-γ、TNF-α(中度)和IL-2(轻度)的升高。还观察到包括铁蛋白和C-反应蛋白(CRP)在内的临床上可用的炎症标志物的升高与CRS综合征相关。CRS的存在通常与过继转移的细胞的扩大和进行性免疫激活有关。已经证明，CRS的严重程度取决于输注时的疾病负担，因为肿瘤负担重的患者经历更多的sCRS。
因此，本发明提供在CRS诊断之后适当的CRS管理策略以减轻不受控制的炎症的生理症状，而不减少工程改造的细胞(例如，CAR T细胞)的抗肿瘤功效。CRS管理策略是本领域已知的。例如，可给予全身性皮质类固醇以快速逆转sCRS(例如，3级CRS)的症状，而不损害初始抗肿瘤反应。
在一些实施方式中，可给予抗IL-6R抗体。抗IL-6R抗体的实例是食品和药品监督管理局批准的单克隆抗体托珠单抗(tocilizumab)，也称为atlizumab(市场上称为Actemra或RoActemra)。托珠单抗是一种针对白介素-6受体(IL-6R)的人源化单克隆抗体。托珠单抗的给予已证明CRS几乎立即被逆转。
CRS通常根据观察到的综合征的严重程度进行管理，并为此量身定制干预措施。CRS管理决策可能基于临床体征和症状以及对干预措施的反应，而不仅仅是实验室值。
轻中度病例一般采用充分缓解症状所需的流体疗法、非甾体抗炎药(NSAID)和抗组胺剂进行症状管理。更严重的病例包括任意程度的血液动力学不稳定的患者；患有任意的血液动力学不稳定，建议给予托珠单抗。在一些实施方式中，CRS的一线管理可以是60分钟内IV 8mg/kg的标记剂量(不超过800mg/剂量)的托珠单抗；托珠单抗可重复Q8小时。如果对第一剂量的托珠单抗反应不理想，可以考虑额外剂量的托珠单抗。托珠单抗可单独给予，也可与皮质类固醇疗法联用。持续性或进行性CRS症状、12-18小时内临床改善不足或对托珠单抗反应差的患者可采用大剂量皮质类固醇疗法进行治疗，一般IV氢化可的松100mg或甲泼尼龙1-2mg/kg。对于血液动力学不稳定或呼吸症状较严重的患者，可在CRS早期给予大剂量皮质类固醇疗法。CRS管理指南可基于已发布的标准(Lee et al.(2019)Biol BloodMarrow Transplant,doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758；Neelapu et al.(2018)NatRev Clin Oncology,15:47；Teachey et al.(2016)Cancer Discov,6(6):664-679)。
在用CAR-T疗法治疗的患者中观察到与巨噬细胞激活综合征(MAS)或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)一致的特征(Henter,2007)，与CRS的临床表现一致。MAS似乎是对CRS引起的免疫激活的反应，因此应被视为CRS的一种表现。MAS类似于HLH(也是对免疫刺激的反应)。MAS的临床综合征的特征在于高等级的非缓解性发热、影响三个谱系中至少两个谱系的细胞减少以及肝脾大。它与高血清铁蛋白、可溶性白介素-2受体和甘油三酯以及循环的自然杀伤(NK)活性的降低有关。
一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的癌症的方法，包括向对象给予本文公开的经修饰的免疫细胞或前体细胞的任一种。本发明的又一方面包括治疗有需要的对象中的癌症的方法，包括向对象给予由本文公开的任一种方法产生的经修饰的免疫细胞或前体细胞。
G.免疫细胞的来源
在某些实施方式中，从对象获得免疫细胞的来源(例如T细胞)用于离体操纵和/或体内转导。供离体操纵的靶细胞的来源还可包括，例如，自体或异源供体血液、脐带血或骨髓。例如，免疫细胞的来源可来自待用本发明的修饰的免疫细胞处理的对象，例如，对象的血液、对象的脐带血或对象的骨髓。对象的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，对象是人。例如在Pfeiffer et al.,EMBO Mol Med.(2018)10(11):e9158；Weidner et al.,Nat Protoc.(2021)16(7):3210-3240；Frank et al.,BloodAdvances(2020)4(22):5702-5715；Nawaz et al.,Blood Cancer J.(2021)11(6):119中描述了体内转导免疫细胞用于CAR表达的方法。
免疫细胞可从多种来源获得，包括血液、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带、淋巴或淋巴器官。免疫细胞是免疫系统的细胞，如先天性免疫或适应性免疫的细胞，例如，髓样细胞或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是T细胞和/或NK细胞。其它示例性细胞包括干细胞，如多能干细胞和多潜能干细胞，包括诱导多潜能干细胞(iPSC)。在某些方面中，这些细胞是人细胞。对于待处理的对象，这些细胞可以是同种异体和/或自体的。这些细胞一般是原发细胞，诸如那些从对象直接分离和/或从对象分离并冷冻的细胞。
在某些实施方式中，免疫细胞是T细胞，例如，CD8+T细胞(例如，CD8+幼稚T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、调节T细胞(Treg)、干细胞记忆T细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞或树枝状细胞。在某些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树枝状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在一个实施方式中，靶细胞是诱导多潜能干(iPS)细胞或源自iPS细胞的细胞，例如，从对象生成的iPS细胞，经操纵以改变(例如，诱导一个或多个靶基因的突变)或操纵一个或多个靶基因的表达，并分化成例如T细胞，例如CD8+T细胞(例如，CD8+幼稚T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、干细胞记忆T细胞、淋巴祖细胞或造血干细胞。
在某些实施方式中，细胞包括一个或多个T细胞亚群或其它细胞类型，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞，及其亚群，如由功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或隔室中的存在、标记或细胞因子分泌概况(profile)和/或分化程度所定义的那些。在T细胞和/或CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的亚型和亚群中的是幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，如干细胞记忆T细胞(TSCM)、中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在的和适应性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞，如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。在某些实施方式中，可以利用本领域中可获得的任意数量的T细胞系。
在某些实施方式中，方法包括从对象分离免疫细胞，对其制备、处理、培养和/或改造。在某些实施方式中，改造细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。所述用于改造的细胞可从样品(如生物样品，例如，获自或源自对象的生物样品)中分离。在某些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有疾病或状况或需要细胞疗法或将要对其给予细胞疗法的对象。在某些实施方式中，对象是需要特定治疗干预(诸如细胞进行分离、处理和/或改造的过继性细胞疗法)的人。因此，一些实施方式中的细胞是原发细胞，例如，原发人细胞。样品包括组织、流体和直接取自对象的其它样品，以及得自一个或多个处理步骤，如分离、离心、基因改造(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或温育的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品，也可以是经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括源自其中的经处理的样品。
在一些方面中，细胞源自或从中分离的样品是血液样品或源自血液的样品，或是或源自单采血液成分术产物或白细胞提取法产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其它淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继性细胞疗法)的环境下，样品包括来自自体来源和同种异体来源的样品。
在某些实施方式中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在某些实施方式中细胞获自异种来源，例如获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。在某些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种试剂的存在下被洗涤、离心和/或温育，从而例如去除不需要的组分、富集所期望的组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性)来分离细胞。
在一些实例中，例如通过单采血液成分术或白细胞提取法从对象的循环血液中获得细胞。在一些方面中，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和/或血小板，而在一些方面中包含除红细胞和血小板之外的细胞。在某些实施方式中，洗涤从对象收集的血细胞，从而例如去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于后续处理步骤。在某些实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些方面中，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)来完成洗涤步骤。在某些实施方式中，细胞在洗涤后被重悬于多种生物相容性缓冲液中。在某些实施方式中，去除血细胞样品的组分并且将细胞直接重悬于培养基中。在某些实施方式中，方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。
在一个实施方式中，通过单采血液成分术或白细胞提取法获得来自个体的循环血液的免疫。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。可洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(甚至所有的)二价阳离子以用于后续处理步骤。洗涤后，细胞可重悬于多种生物相容性缓冲液中，如，例如无钙无镁的PBS。可选地，可以去除单采血液成分术样品的不期望的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在某些实施方式中，分离方法包括基于一种或多种特异性分子，如表面标记(例如，表面蛋白)、胞内标记或核酸在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在某些实施方式中，可以利用基于此类标记的任意已知的分离方法。在某些实施方式中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面中，分离包括基于细胞的表达或一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的表达水平对细胞和细胞群进行的分离，例如，通过与特异性地结合此类标记的抗体或结合伙伴温育，之后大体上是洗涤步骤和将结合了抗体或结合伙伴的细胞与未结合该抗体或结合伙伴的细胞分离。
这种分离步骤可以基于阳性选择，其中保留已结合试剂的细胞以供进一步利用，和/或基于阴性选择，其中保留未结合抗体或结合伙伴的细胞。在一些实例中，这两部分都被保留以供进一步利用。在一些方面中，阴性选择在没有可用于在异质群体中特异性地鉴定细胞类型的抗体的情况下会特别有用，使得基于由除了所期望的群体之外的细胞所表达的标记进行分离是最佳的。分离无需导致特定细胞群或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，对特定类型的细胞(诸如表达标记的细胞)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不必导致不表达该标记的细胞的完全缺失。同样地，特定类型细胞(诸如表达标记的细胞)的阴性选择、去除或耗竭是指减少此类细胞的数量或百分比，但不必导致完全去除所有此类细胞。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中从一个步骤经阳性选择或阴性选择的部分经历另一分离步骤，诸如后续的阳性选择或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可同时耗竭表达多个标记的细胞，诸如通过将细胞与多个抗体或结合伙伴温育，每个抗体或结合伙伴都对阴性选择所靶向的标记具有特异性。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多个抗体或结合伙伴温育，可以同时阳性选择出多种细胞类型。
在某些实施方式中，针对对一个或多个特定标记(如表面标记)呈阳性(标记+)或表达高水平(标记高)的一个或多个特定标记的细胞来富集T细胞群中的一个或多个或使其从上述细胞中耗竭，或针对对一个或多个标记呈阴性(标记-)或表达相对低水平(标记低)的一个或多个标记的细胞来富集T细胞群中的一个或多个或使其从上述细胞中耗竭。例如，在一些方面中，通过阳性选择技术或阴性选择技术分离T细胞的特异性亚群，诸如呈阳性的或表达高水平的一个或多个表面标记的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在某些情况下，此类标记是在某些T细胞群(如非记忆细胞)上缺失或以相对较低水平表达，但在某些其它T细胞群(如记忆细胞)上存在或以相对较高水平表达的标记。在一个实施方式中，针对呈阳性的或表达高表面水平CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞来富集(即，阳性选择)细胞(如CD8+细胞或T细胞，例如，CD3+细胞)和/或使其从呈阳性的或表达高表面水平CD45RA的细胞中耗竭(例如，阴性选择)。在某些实施方式中，针对呈阳性的或表达高表面水平CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)的细胞来富集细胞或使其从上述细胞中耗竭。在一些实例中，针对对CD45RO呈阳性(或对CD45RA呈阴性)且对CD62L呈阳性的细胞来富集CD8+T细胞。例如，可以利用CD3/CD28共轭磁珠(例如，M-450CD3/CD28 T Cell Expander)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。
在某些实施方式中，通过在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其它白细胞)上表达的标记(如CD14)的阴性选择，从PBMC样品中分离T细胞。在一些方面中，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一个或多个幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达到相对较高程度的标记进行阳性选择或阴性选择，可将此类CD4+和CD8+群体进一步分选为亚群。在某些实施方式中，诸如通过基于与相应亚群相关联的表面抗原的阳性选择或阴性选择，针对幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞来进一步富集CD8+细胞或使其从上述细胞中耗竭。在某些实施方式中，对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以提高功效，从而在给予后诸如提高长期存活、扩增和/或移植，这在某些方面在此类亚群中是尤其稳健的。在某些实施方式中，将富集TCM的CD8+T细胞和CD4+T细胞组合，进一步增强功效。
在某些实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。可诸如利用抗CD8抗体和抗CD62L抗体，针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分来富集PBMC或将其从上述部分中耗竭。在某些实施方式中，CD4+T细胞群和CD8+T细胞亚群，例如，是针对中枢记忆T(TCM)细胞富集的亚群。在某些实施方式中，对中枢记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于对表达或高表达CD45RA和/或粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面中，通过耗竭表达CD4、CD14、CD45RA的细胞和对表达CD62L的细胞阳性选择或富集来进行针对TCM细胞富集的CD8+群体的分离。一方面，对中枢记忆T(TCM)细胞进行的富集以基于CD4表达所选择的细胞的阴性部分开始，该阴性部分经历基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择，并且经历基于CD62L的阳性选择。在一些方面中，这种选择是同时进行的，而在其它方面中，是以任一顺序相继进行的。在一些方面中，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性部分和阴性部分都得以保留，并且任选地在一个或多个其它阳性选择或阴性向选择步骤之后用于方法的后续步骤中。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分选为幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应物。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在某些实施方式中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在某些实施方式中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在某些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。在一个实例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CDl lb、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方式中，抗体或结合伙伴与固体载体或基质如磁珠或顺磁性珠结合，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。
在某些实施方式中，细胞在基因改造之前或与基因改造结合时被温育和/或培养。温育步骤可以包括培养(culture)、培育(cultivation)、刺激、活化和/或繁殖。在某些实施方式中，在刺激条件或刺激剂存在下温育组合物或细胞。这种条件包括那些被设计用于诱导细胞在群体中增殖、扩增、活化和/或存活以模拟抗原暴露，或和/启动细胞以进行基因改造(诸如用于将重组抗原受体引入)的条件。这些条件可包括以下中的一个或多个：特定的培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、剂，例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伙伴、融合蛋白、重组可溶性受体)以及被设计以使细胞活化的任意其它剂。在某些实施方式中，刺激条件或剂包括一种或多种剂，例如，配体，其能够活化TCR复合体的胞内信号传导结构域。在一些方面中，该剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3胞内信号传导级联。此类剂可包括抗体，诸如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体，例如，例如结合固体载体(诸如珠)的抗CD3、抗CD28，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法可进一步包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在某些实施方式中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，至少约10单位/mL的IL-2浓度。
在另一个实施方式中，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心将T细胞从外周血中分离出来。可选地，T细胞可以从脐带中分离出来。在任何情况下，特定T细胞亚群都可以通过阳性选择技术或阴性选择技术进一步分离。
可以从表达某些抗原，包括但不限于CD34、CD8、CD14、CD19和CD56的细胞中耗竭如此分离的脐带血单核细胞。可利用分离的抗体、包含抗体的生物样品(如腹水)、结合到物理载体的抗体和细胞结合抗体来完成对这些细胞的耗竭。
通过阴性选择富集T细胞群可以利用针对以阴性方式选择的细胞所特有的表面标记的抗体的组合来实现。优选方法是通过利用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物的阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8抗体。
为了通过阳性选择或阴性选择来分离所期望的细胞群，可以改变细胞的浓度和表面(例如，颗粒，如珠子)。在某些实施方式中，会期望显著减少珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方式中，利用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，利用10亿个细胞/ml的浓度。在其它实施方式中，利用大于1亿个细胞/ml。在其它实施方式中，利用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方式中，利用7500、8000、8500、9000、9500万个或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其它实施方式中，可利用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。利用高浓度可导致细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。
T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻，不需要去除单核细胞的步骤。虽然不希望受到理论的束缚，但冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和在某种程度上去除单核细胞提供了更为均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，细胞可以悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在此环境下将是有用的，但在非限制性实例中，一种方法涉及利用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其它合适的细胞冷冻介质。然后以每分钟1℃的速率将细胞冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的汽相中。可利用其它的受控冷冻方法，也可在-20℃下或在液氮中立即进行非受控冷冻。
在一个实施方式中，T细胞群包含在诸如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系的细胞内。在另一实施方式中，外周血单核细胞包含T细胞群。在又一实施方式中，纯化的T细胞包含T细胞群。
在某些实施方式中，可从样品中分离T调节细胞(Treg)。样品可包括但不限于脐带血或外周血。在某些实施方式中，通过流式细胞术分选来分离Treg。在分离之前，可通过本领域已知的任意手段富集样品中的Treg。分离的Treg可冷冻保存，和/或在利用前扩增。分离Treg的方法在美国专利号：7,754,482、8,722,400和9,555,105以及美国专利申请号13/639,927(其内容以其整体并入本文中)中有所描述。
H.免疫细胞的扩增
不管是在对细胞进行修饰以表达CAR之前还是之后，都可以利用例如在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国公开号20060121005中描述的方法使细胞激活并在数量上扩大细胞。例如，本发明的T细胞可通过接触附着了刺激CD3/TCR复合体相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面来扩大。具体而言，T细胞群可通过接触抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗CD2抗体，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)接触来刺激。为了对T细胞表面的辅助分子进行共刺激，利用结合辅助分子的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，T细胞可与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,法国)，并且这些可如本领域已知的其它方法和试剂那样在本发明中利用(参见，例如，ten Berge etal.,Transplant Proc.(1998)30(8):3975-3977；Haanen et al.,J.Exp.Med.(1999)190(9):1319-1328；和Garland et al.,J.Immunol.Methods(1999)227(1-2):53-63)。
通过本文公开的方法扩大T细胞可乘以约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大，以及在其之间的任意和全部或部分整数。在一个实施方式中，T细胞在约20倍至约50倍的范围内扩大。
培养后，T细胞可在培养设备中的细胞培养基中温育一段时间，或直到细胞达到汇合(confluency)或高细胞密度以供最佳传代，之后再将细胞送至另一培养设备。培养设备可以是常用于体外培养细胞的任何培养设备。优选地，在将细胞送至另一培养设备之前，汇合水平为70％或更高。更优选地，汇合水平为90％或更高。一段时间可以是适合细胞体外培养的任何时间。在T细胞培养过程中，可随时更换T细胞培养基。优选地，大约每2到3天更换一次T细胞培养基。然后从培养设备中获取T细胞，随之可立即利用T细胞或将其冷冻保存以供后期利用。在一个实施方式中，本发明包括冷冻保存经扩大的T细胞。在将核酸导入T细胞之前使冷冻保存的T细胞解冻。
在另一实施方式中，方法包括分离T细胞和扩大T细胞。在另一实施方式中，本发明还包括在扩大之前冷冻保存T细胞。在又一实施方式中，将冷冻保存的T细胞解冻以用编码嵌合膜蛋白的RNA进行电穿孔。
另一种离体扩大细胞的程序在美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)中描述。扩大，如美国专利号5,199,942中描述的，可以是本文所述其它扩大方法的替代方案或除此之外的其它方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩大包括添加细胞生长因子(如美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子)或其它因子(如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体)。在一个实施方式中，扩大T细胞包括用选自flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体的因子来培养T细胞。
如本文所述的培养步骤(如本文所述与剂接触或在电穿孔后)可以非常短暂，例如小于24小时，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。如本文进一步所述的培养步骤(如本文所述与剂接触)可以更长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天。
各种术语被用来描述培养中的细胞。细胞培养通常是指从活生物体中取出并在受控条件下生长的细胞。原发细胞培养是在第一次继代培养之前，直接从生物体中取出的细胞、组织或器官的培养。当细胞被置于促进细胞生长和/或分裂的条件下的生长培养基中时，细胞在培养中扩大，从而产生更大的细胞群。当细胞在培养中扩大时，细胞增殖的速率通常是通过细胞数量加倍所需的时间来衡量的，也就是所谓的加倍时间。
每一轮继代培养都被称为一次传代。当细胞进行继代培养时，它们被称为已经传代。特定的细胞群或细胞系有时指代其已传代的次数或以其已传代的次数为特征。例如，传代十次的所培养的细胞群可被称为P10培养。原代培养，即从组织中分离细胞后的第一次培养，称为P0。第一次继代培养后，细胞被描述为是次代培养(P1或第1代)。第二次继代培养后，细胞变成第三代培养(P2或第2代)，依此类推。本领域技术人员将理解，在传代期间可能存在多种群体加倍；因此培养物的群体加倍数大于传代数。传代期间细胞的扩大(即，群体加倍数)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、底物、培养基和传代间隔时间。
在一个实施方式中，细胞可培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任意小时整数值。适合T细胞培养的条件包括适合的培养基(例如，极限必需培养基或RPMI培养基1640或，X-vivo 15,(Lonza))，其可包含增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α，或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任意其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制剂(plasmanate)和还原剂如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使T细胞生长和扩大的量的细胞因子(一种或多种)。抗生素(例如，青霉素和链霉素)只包含在实验培养物中，而不包含在待输注到对象体内的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％的二氧化碳)。
用于培养T细胞的培养基可包括可共同刺激T细胞的剂。例如，能够刺激CD3的剂是针对CD3的抗体，而能够刺激CD28的剂是针对CD28的抗体。通过本文公开的方法分离的细胞可扩大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍，10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一个实施方式中，T细胞在约20倍至约50倍或更大的范围内扩大。在一个实施方式中，通过抗CD3抗体包被的KT64.86人工抗原呈递细胞(aAPC)来扩大人T调节细胞。用于使T细胞扩大和激活的方法可在美国专利号7,754,482、8,722,400和9,555,105(其内容以其整体并入本文)中找到。
在一个实施方式中，扩大T细胞的方法可进一步包括分离扩大的T细胞以供进一步应用。在另一实施方式中，扩大的方法可进一步包括随后对扩大的T细胞进行电穿孔，之后进行培养。随后的电穿孔可包括向扩大的T细胞群中导入编码剂的核酸，诸如用核酸对扩大的T细胞转导、对扩大的T细胞转染或对扩大的T细胞电穿孔，其中剂进一步刺激T细胞。剂可刺激T细胞(诸如通过刺激进一步的扩大)、效应物功能或其它T细胞功能。
I.药物组合物和制剂
还提供了本发明的免疫细胞的群体，包含这类细胞和/或富集这类细胞的组合物，例如其中表达CAR的细胞占组合物中总细胞的或者某种类型细胞比如T细胞或CD8+或CD4+细胞的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。组合物中包括用于给予的药物组合物和制剂，例如用于过继细胞疗法。还提供了用于向对象(例如，患者)给予细胞和组合物的治疗方法。
还提供了包括用于给予的细胞的组合物，该组合物包括药物组合物和制剂，如单位剂型组合物，单位剂型组合物包括以给定剂量或其部分来给予的细胞的数量。药物组合物和制剂通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载剂或媒介物。在某些实施方式中，组合物包括至少一种其它的治疗剂。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指这样的制剂：这种形式的该制剂允许其中所含活性成分的生物活性有效，且不含有对将给予该制剂的对象具有不可接受的毒性的其它成分。“药学上可接受的载剂”是指药物制剂中除活性成分外，对于对象无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、媒介物、稳定剂或防腐剂。在一些方面中，载剂的选择部分地由特定细胞和/或给予方法确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，利用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。例如，Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)对载剂进行了描述。所采用的剂量和浓度下的药学上可接受的载剂通常对接受者是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯类，如羟苯甲酯或羟苯丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面中，缓冲剂包括在组合物中。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其它酸和盐。在一些方面中，利用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中有更详细的描述。
制剂可包括水溶液。制剂或组合物还可包含多于一种的活性成分，活性成分可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或状况，优选活性与该细胞互补的活性，其中各自的活性彼此不产生不利影响。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在某些实施方式中，药物组合物进一步包括其它药学活性剂或药物，如化疗剂，例如天门冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春花碱和/或长春新碱。在某些实施方式中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或状况的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在某些实施方式中，通过对所治疗的对象周期性评估来监测治疗或预防功效。所期望的剂量可通过细胞的单次弹丸给予、细胞的多次弹丸给予，或通过细胞的连续输注给予来递送。
制剂包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、经皮、肌肉内、鼻内、口腔、舌下或栓剂给予的制剂。在某些实施方式中，肠胃外给予细胞群。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在某些实施方式中，利用外周全身性递送，通过静脉内注射、腹膜内注射或皮下注射将细胞给予于对象。在某些实施方式中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在某些方面可缓冲至选定的pH值。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物更便于给予，尤其是通过注射给予。另一方面，粘性组合物可在适当的粘度范围内配制以提供与特定组织的长时期接触。液体组合物或粘性组合物可包含载剂，其可以是溶剂或分散介质，溶剂或分散介质含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可通过将细胞并入溶剂中来制备，诸如与合适的载剂、稀释剂或媒介物(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物可包含辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、凝胶或粘性增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素，这取决于给予途径和所期望的制剂。在某些方面可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚和山梨酸可以确保对微生物作用的预防。通过利用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以延长可注射的药物形式的吸收。
待用于体内给予的制剂通常是无菌的。无菌性可以很容易地实现，例如通过无菌过滤膜来过滤。
本文提到或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和可以电子方式获得的信息的内容特此通过引用以其整体并入，其程度与所指示通过引用将每一个独立的出版物具体且独立地并入一样。申请人保留将来自任何此类文章、专利、专利申请或其它实体和电子文件中的任何以及所有材料和信息并入本申请的权利。
尽管已经参考其具体实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变和等同物替换。对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本文所公开的实施方式的范围的情况下，可以利用合适的等同物对本文描述的方法进行其它合适的修改和改动。另外，可以做出多种修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、一个或多个方法步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都旨在落入所附权利要求的范围内。现在已经详细描述了某些实施方式，通过参考以下实例将会对其更清楚地了解，这些实例仅出于说明的目的被包括在内而不旨在限制。
实验实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并且本发明不限于这些实施例，而是涵盖由于本文提供的教导而显而易见的所有变型。
材料和方法
细胞系与一般细胞培养
利用6种B细胞恶性细胞系(B-ALL：NALM6，MCL：MINO，Z-138，MAVER和DLBCL：OCI-Ly18，SU-DHL-4)。利用两种急性髓系白血病细胞系(MOLM-14和KG-1)。除非另有规定，否则在37℃、5％环境CO2中，以1x106个细胞/mL的标准培养基(RPMI 1640+10％FBS、1％青霉素/链霉素、1％HEPES、1％GultaMAX)的浓度生长和培养细胞。所有细胞系最初从ATCC或DSMZ获得，经过鉴定(University of Arizona Genetics Core，2019)并测试支原体污染(LONZA，OR)。原发MCL样本获取自宾夕法尼亚大学医院(the Hospital of the University ofPennsylvania)的临床实践(UPCC55418)。
慢病毒载体产生和CAR工程人T细胞的转导
利用HEK293T细胞(ATCC ACS-4500)产生复制缺陷的第三代慢病毒载体。将大约7～9×106个细胞铺平板在标准培养基中的T150培养容器中，并在37℃下温育过夜。第二天，利用Lipofectamine 2000(116μL，Invitrogen)、pMDG.1(7μg)、pRSV.rev(18μg)和pMDLg/p.RRE(18μg)包装质粒和15μg表达质粒(CAR)的组合转染细胞。在转移到慢病毒生产烧瓶中之前，将Lipofectamine和质粒DNA在4mL Opti-MEM培养基中稀释。在转染后24和48小时，分离培养基并利用高速超速离心(8000×g过夜)浓缩。人T细胞是通过the University ofPennsylvania Human Immunology Core获得的。CD4+和CD8+细胞以1:1的比例组合，并利用CD3/CD28刺激珠(ThermoFisher)以3珠/细胞的比例激活，并在37℃下温育过夜。第二天，将CAR慢病毒载体以1至3的MOI添加到刺激性培养物中。在刺激的第6天去除珠，每隔一天对细胞进行计数，直到生长动力学和细胞大小证明它们已停止刺激(细胞体积：约350fL)。除非另有说明，否则所有实验都利用编码CTL019嵌合抗原受体的CAR19，该受体由FMC63-scFv、4-1BB和CD3ζ结构域组成。为了验证维奈托克与不同CAR构建体的组合，产生了具有CD28/CD3ζ结构域的抗CD19 CAR T细胞(Milone,et al.,Molecular therapy:The Journal ofthe American Society of Gene Therapy 2009；17(8):1453-64doi 10.1038/mt.2009.83)和具有4-1BB/CD3ζ结构域的抗CD33 CART细胞(Kenderian,et al.,Biologyof Blood and Marrow Transplantation 2015；21(2):S25-S6)。为了培养抗维奈托克的CART细胞，将抗凋亡基因(BCL-2(WT)、BCL-2(F104L))克隆到CAR19中，然后进行P2A自切割序列。为了产生BCL-2过表达的B细胞恶性细胞系，从Addgene获得编码BCL-2(WT)的慢病毒载体。
临床样本
对于大B细胞淋巴瘤队列，从诊断为DLBCL(未另行规定(NOS))、高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)(NOS)、伴有MYC和BCL-2和/或BCL-6重排的HGBCL以及在宾夕法尼亚大学利用两种商业CART19产品(tisagenlecleucel或axicabtagene ciloleucel，UPCC44420)治疗的或登记CTL019临床试验NCT02030834的转化的滤泡性淋巴瘤的患者收集临床数据。本研究仅包括通过中期FISH分析评估涉及BCL-2基因座的染色体改变的患者。对于MCL队列，收集了在商业环境中用商用brexucabtagene autoleucel(UPCC44420)治疗的诊断为MCL的患者的临床数据。根据Lugano分类确定疾病反应。PFS时间定义为从CART19输注到进展(事件)、任何原因的死亡(事件)或输注后上至24个月的最后一次随访(检查)的日期之间的时间。无复发存活定义为从CART19输注到进展(事件)或输注后上至24个月的最后一次随访(检查)的日期之间的时间。OS时间定义为从CART19输注到死亡(事件)或输注后上至24个月的最后一次随访(检查)的日期之间的时间。CRS和ICANS根据CTCAE(针对NCT02030834)和theAmerican Society of Transplantation and Cellular Therapy分类(ASTCT)(针对商业CART患者)定义的一致分级标准进行分级。在CTL019临床试验NCT02030834中登记的38名患者身上进行了利用nanoString nCounter的基因表达谱研究。所有患者都提供了参与研究的书面知情同意书。这项研究得到了the Institutional Review Board的批准，并根据1964年赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)及其后来的修正案的道德标准进行。
靶向小分子筛选
利用MultidropTM Combi试剂分配器(Thermo Scientific)将CART19和NALM6(荧光素酶+)细胞以每孔0.08E:1T(即600CART:7000NALM6)的比例接种在25μl生长培养基(RPMI1640+10％FBS+1％Pen-strep+1％谷氨酰胺)的384孔Corning 3570微孔板中。细胞接种后，利用50nL开槽销工具(slotted pin tool)(V&P Scientific)和JANUS自动化工作站(Perkin Elmer)将药物(50nL)转移到测定板上。将化合物/药物加入，最终浓度为0.2％DMSO中1μM。用0.2％ DMSO处理列(column)1和23(阴性对照)。用50nM硼替佐米(bortezomib)处理列2和24(阳性对照)。将细胞在37℃、5％ CO2的加湿室中温育48小时。在加入25μL 0.25X Britelite(PerkinElmer)之前，将测定板从培养箱中取出1小时以平衡至室温。利用超灵敏发光测量技术在EnVision Xcite多标签板读取器(PerkinElmer)上测量发光。
基于生物发光的细胞毒性测定
细胞系(MINO、Z-138、MAVER、OCI-Ly18、SU-DHL-4、NALM6、MOLM-14和KG-1)被工程化以表达叩头虫绿，并利用生物发光定量测量细胞存活率。将D-荧光素钾盐(Perkin-Elmer)加入细胞培养物(终浓度15μg/mL)中，并在37℃下温育10分钟。利用BioTek SynergyH4成像仪检测生物发光信号，并利用BioTek Gen5软件分析信号。利用没有效应物的靶细胞的对照计算特异性裂解百分比。在添加媒介物或维奈托克的情况下，如前所述建立细胞毒性测定(Singh,et al.,Cancer Discovery 2020；10(4):552-67)。
流式细胞测定
利用以下抗体将细胞重悬于FACS染色缓冲液(PBS+2％胎牛血清)中：人CD3(克隆OKT3，Biolegend)、抗BCL-2(克隆100，Biolegends)、人CD45(克隆2D1，Biolegent)、小鼠CD45(克隆30-F11，Biolegend)。利用PE缀合的抗CAR19独特型抗体(Novartis)检测CART19。为了监测胱天蛋白酶3/7活性，通过遵循制造方案利用CellEventTM Caspse3/7Green ReadFlowTM试剂。为了确定流式细胞术期间获得的绝对细胞数(肿瘤或T细胞)，利用CountBright绝对计数珠(ThermoFisher)。利用活/死Aqua或紫外可固定染色试剂盒(ThermoFisher)、碘化丙啶(PI)和7-氨基放线菌素D(7-Aminoacctinomycine D，7-AAD)建立细胞活力，并在LSRII Fortessa细胞仪(BD)上获取数据。细胞内染色通过利用固定/渗透缓冲液并遵循制造方案进行。所有数据分析均利用FlowJo 9.0或10软件(FlowJo,L.L.C.,BD,Ashland,OR)进行。
长期共培养测定
将CART细胞与目标癌症细胞以0.25:1的E:T比合并，每三天利用CountBright绝对计数珠(ThermoFisher)通过流式细胞术评估共培养物的T细胞和癌症细胞的绝对计数。培养物保持在1×106个总细胞/mL的浓度。为了监测其分化状态，在第0、9和18天收获CART细胞。接下来，用抗CCR7和抗CD45RA抗体对CART细胞进行染色，用于流式细胞术分析。在初始刺激后第18天通过PMA/离子霉素再次刺激CART细胞，以评估长期存活的CART细胞的抗肿瘤活性。
异种移植小鼠模型
从宾夕法尼亚大学的干细胞及异种移植中心(the Stem Cell&Xenograft Core)获得6至10周龄的NOD SCIDγ链-/-(NSG)小鼠，并将其保持在无病原体的条件下。为了建立OCI-Ly18皮下异种移植小鼠模型，在200μl含有50％ Matrigel(Corning)的PBS中制备5x106的OCI-Ly 18，并通过皮下注射将其植入NSG小鼠的胁。当肿瘤体积达到约150mm3时，通过静脉注射引入次优剂量的CART(2x106个CAR+细胞)。对于系统性肿瘤模型，通过尾静脉注射将1x106 NALM6或MINO给予NSG小鼠。当NSG小鼠的生物发光强度(BLI)达到约107(总通量[P/S])时，将5x104 CAR19+细胞或5x105 CAR19+细胞分别注射到携带MINO的小鼠或携带NALM6的小鼠中。每周通过卡尺测量OCI-Ly18肿瘤，并根据方程计算肿瘤体积：肿瘤体积＝1/2(L×W2)，其中L是肿瘤的最长轴，W是垂直于L的轴。利用Xenogen IVIS生物发光成像系统随时间监测NALM6和MINO。在维奈托克组合研究中，在含有5％DMSO、40％PEG300、5％Tween 80和50％PBS的溶液中制备维奈托克。如每幅图中所示，利用了不同剂量的维奈托克。监测动物的疾病进展和明显毒性迹象，如异种移植物抗宿主病——如体重减轻>10％、皮毛脱落、腹泻、结膜炎和疾病相关的后肢瘫痪所证明的。所有动物护理和使用均遵循NIH指导方针，所有实验方案均经宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会(the University ofPennsylvania Animal Care and Use Committee)批准。
nCounter基因表达测定
将CART细胞与辐照的MINO细胞以0.25:1的E:T比组合48小时。对于临床样品，解冻来自单采血液成分术的冷冻单核细胞，并利用Pan T细胞分离试剂盒(Milteny，Germany)分离T细胞。然后利用RNeasy plus迷你试剂盒(Qiagen)按照制造商方案分离来自T细胞的RNA。nCounter基因表达测定(nanoString Technologies)按照制造商方案用CAR-T表征面板进行。向CAR19和WPRE添加了自定义探针。数据通过Rosalind nanoString分析方法进行分析(https://rosalind.onramp.bio/)。
RNA测序与分析
根据制造商的说明书(Qiagen)，在用储存在PAX基因管中的辐照MINO刺激后的第18天，与CART19相比，从CART19-BCL-2(WT)中提取总RNA。在Agilent TapeStation(RIN)上检查完整性，然后利用TruSeq R.N.A.v2制剂(Illumina)进行测序准备。在Illumina HiSeq2500平台上进行高通量测序，目标深度为每个样本5000万双末端读数。Fastq文件被处理用于数据质量控制、读取映射、转录物组装和转录物丰度估计。评估了众多质量控制指标，包括数据质量、每个碱基和序列水平上的鸟嘌呤和胞嘧啶含量、序列长度分布和重复水平以及插入物大小分布。最后，利用HTSeq来计数映射到每个基因的读取次数。利用FastaQC(v0.11.2)评估原始读数质量，利用Trimmomatic(v0.36)去除低质量碱基。然后利用STAR(v2.6.0c)和默认参数将剩余读数映射到人基因组(hg38)。利用featureCount(v1.6.1)计算基因计数，在差异表达分析之前，去除所有样本中总计数为10的未表达和低表达基因。DESeq2用于差异表达分析，然后利用fdrtools(v1.2.16)进行p值校正。差异表达基因被定义为log2倍变化为1且fdrtools调整的p值为0.05的基因。利用DESeq2标准化的烯基质(enematrix)进行基因集富集分析(GSEA v4.1.0)，并在分析前去除未表达的基因，即所有样本中读取计数为零的基因。
单细胞RNA测序与分析
在用CART19(样品1)或CART19+维奈托克(样品2)治疗的第7天，从两只小鼠中切除皮下肿瘤异种移植物(OCI-Ly18)。将切除的肿瘤切碎，并利用0.45μm过滤器分离成单细胞悬浮液。根据制造商的说明，利用带有v1.1 Chemistry(10x Genomics)的铬单细胞5'试剂盒(Chromium Single Cell 5'Reagent Kit)制备单细胞RNA测序文库。文库构建后，在Illumina NovaSeq 6000上对两个文库进行测序。利用Cell Ranger软件(版本5.0.1)(10xGenomics)对原始scRNA-seq数据进行预处理。将读数与预先构建的GRCh38人参考基因组比对后，获得特征条形码矩阵。利用Seurat软件包(版本4.0.1)处理过滤的基因表达。为了进行额外的质量控制，利用基于中位数绝对偏差(MAD)的异常值定义从数据集中去除推定的低质量细胞。在这里，从下游分析中丢弃任何表达基因少于200个、独特分子标识符计数异常高(高于3个M.A.D.)或高线粒体RNA表达(高于3个MAD)的细胞。为了比较两种处理条件下的OCI-Ly18细胞，首先合并CART19和CART19+维奈托克样品的两个文库，并利用Seurat中的IntregrateData函数进行批量校正。利用NormalizeData和ScaleData函数对数据进行归一化和缩放。利用FindVariableGenes函数识别变量特征，并利用RunPCA函数计算主成分。由ElbowPlot函数生成的弯头图(elbow plot)确定了细胞聚簇所需的显著主成分(PC)的数量。利用RunUMAP函数(分辨率＝0.4)，利用前15个PC通过统一流形逼近(UMAP)驱动无监督聚簇分析。为了确定每个聚簇的两种处理条件之间的差异表达基因(DEG)，利用FindMarkers函数，阈值为min.pct＝0.1，对数倍变化＝0.25。从MSigDB数据库下载基因本体论基因集，并在默认参数下利用gseGO函数在R中进行通路分析。利用clusterProfiler接口进行基因集富集分析(GSEA)。CellCycleScoring函数也用于确认UMAP中每个聚簇的细胞周期阶段。
一般统计分析
所提供的所有体外数据都代表了至少两个独立的实验，除了多细胞和单细胞(bulk and single-cell)RNA-seq(用两个生物学重复进行一次)。除非另有规定，否则两组之间的所有比较均利用带有Welch校正的双尾非配对Student t检验进行。除非另有说明，否则所有结果均表示为平均值±标准差。利用对数秩(Mantel-Cox)检验分析存活数据。利用GraphPad Prism v9.0(San Diego,CA)进行数据分析。
现在描述实验结果：
实施例1：促凋亡小分子筛选将BCL-2抑制剂鉴定为CART细胞毒性的增强剂
癌症细胞获得凋亡抗性在其存活和发展中起着至关重要的作用。此外，这种凋亡抗性使癌症细胞能够逃避各种癌症治疗的抗肿瘤活性，包括常规化疗、靶向治疗和免疫疗法。特别是，先前的研究表明，在B-ALL患者中，癌症细胞对外在凋亡的敏感性降低显示出对CART细胞治疗的反应率显著降低，这表明癌症凋亡对CART疗法成功的重要性(Singh N,etal.,2020,Cancer Discovery,10(4):552-67)。此外，已知Bcl-2是内在凋亡的关键调节因子(Czabotar PE,et al.,2014,Nature Reviews Molecular Cell Biology,15(1):49-63；Siddiqui WA,et al.,2015,Archives of Toxicology,89(3):289-317；和Thomadaki H,etal.,Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 2006；43(1):1-67)，并且在B细胞淋巴瘤中具有重要性(Iqbal J,et al.,2006,Journal of Clinical Oncology,24(6):961-8；和Schuetz J,et al.,2012,Leukemia,26(6):1383-90)。
为了筛选能够增强CART细胞杀伤的促凋亡小分子，进行了靶向筛选测定。该测定包括29种促凋亡药物的文库(图1A)，其包含IAP抑制剂(n＝6)、BCL-2拮抗剂(n＝13)、p53作用剂(n＞6)、胱天蛋白酶激活剂(n＜2)和铁死亡(ferroptosis)激活剂(n＝2)。对于此筛选，将人抗CD19 CART细胞与CD19+肿瘤B细胞(NALM6)在两种不同临床相关剂量(100和1000nM)的药物或媒介物对照(二甲基亚砜，DMSO)存在下温育。在48小时时通过发光测量肿瘤杀伤。如图1B所示，鉴定了若干增加CART细胞毒性的促凋亡小分子，包括先前报道的IAP抑制剂(例如，birinapant，BV-6)(Singh N,et al.,2020,Cancer Discovery,10(4):552-67；Michie,et al.,Cancer Immunology Research,2019；7(2):183-92)。有趣的是，在两次筛选中，BCL-2抑制剂类，特别是FDA批准的剂维奈托克，显示出对CART19杀伤的强烈增强(单独CART 47-63％对比CART+BCL-2抑制剂75-88％)。
实施例2：利用维奈托克的BCL-2抑制通过增强胱天蛋白酶3/7切割增强CART细胞 的抗肿瘤作用
为了研究维奈托克的给予是否增强CART细胞介导的肿瘤杀伤(图1C)，利用了两种不同的B细胞淋巴瘤和一种白血病细胞系：OCI-Ly18(弥漫性大B细胞淋巴瘤，DLBCL)、MINO(MCL)和NALM6(B-ALL)，它们对维奈托克具有不同的敏感性：OCI-Ly-18为高敏感性(半数最大抑制浓度(IC50)：18.5nM)，MINO为中等敏感性(IC50：68.17nM)，NALM6为低敏感性(IC50：1300nM)(图1D，图2A-2F)。CART19细胞与媒介物(DMSO)或维奈托克共培养，并在48小时测量细胞毒性。在此短期模型中，与单剂CART19或维奈托克和CART19加媒介物相比，维奈托克与CART19组合导致肿瘤杀伤显著增加(图1D)。利用原发NHL细胞(MCL)进一步证实了这种效果(图1D)。值得注意的是，对MCL-1(内在凋亡的关键负调节因子)的抑制没有导致与CART的协同作用，这可能表明MCL-1在淋巴瘤细胞中CART驱动的毒性中的作用与BCL-2相比并不小(图3)。此外，为了证实BCL-2通路在抵抗CART杀伤中的重要性，在缺乏BCL-2基因改变的B细胞淋巴瘤和白血病细胞系(MINO、SU-DHL-4和NALM-6)中诱导BCL-2的过表达。BCL-2过表达导致所有模型中CART细胞对肿瘤杀伤显著减少，特别是维奈托克介质敏感模型(MINO)(图4A-4C)。
为了测试是否独立于CAR共刺激结构域观察到维奈托克对CART肿瘤杀伤的协同增加，在含有CD28或4-1BB共刺激结构域的CART细胞存在下，将癌症细胞与维奈托克共培养。如图1E所示，维奈托克增强了CART细胞介导的肿瘤杀伤，而与共刺激结构域无关。为了评估在不同的血液学癌症中是否也证明了相同的效果，利用AML模型重复实验，AML模型是最近获得了美国食品药品监督管理局(FDA)批准使用的疾病。AML是一种源于髓系祖细胞的侵袭性癌症，尽管有最好的治疗方法，但其总体存活率通常令人沮丧。在过去的几年里，一些CART产品已经在临床环境中进行了测试，包括抗CD33和抗CD123CAR T细胞。为了测试BCL-2抑制是否在除B细胞肿瘤之外的其它模型中增强CART杀伤，利用两种AML细胞系和CD33靶向CART(CART33)重复上述体外模型。如图1F所示，当维奈托克在MOLM-14和KG-1AML细胞系中共同给予时，抗CD33 CAR T细胞的肿瘤杀伤显著改善。
为了研究增强肿瘤细胞死亡的机制，在存在或不存在维奈托克的情况下测量与CART19细胞共培养的癌症细胞中的胱天蛋白酶3/7活性。有趣的是，维奈托克治疗导致NHL细胞中胱天蛋白酶3/7活性的协同增加，以及B-ALL细胞中的胱天蛋白酶活性的协同提高程度较低——当与CART19组合时(图1G，图5A-5C)。此外，还研究了参与触发这种增强的凋亡的关键介质。基于先前对BID KO肿瘤细胞的研究，预计这些癌症细胞通过直接或间接机制对FASL/TNFα和穿孔蛋白/颗粒酶具有抗性。因此，产生了几种CAR T细胞群体，其被改造，以针对细胞凋亡的关键触发剂(FAST，TRAIL和颗粒酶B)进行敲出(KO)。有趣的是，当针对FASL或TRAIL对CAR T细胞进行KO时，BCL2抑制和CART杀伤的协同作用显著减弱(图5C)。这一结果表明淋巴瘤中的BCL-2在阻断FASL或TRAIL介导的凋亡中起着重要作用。
为了进一步研究在CART19治疗期间维奈托克在体内对淋巴瘤细胞的影响，对从用CART19或CART19加维奈托克治疗的小鼠收获的淋巴瘤细胞(OCI-Ly18)进行单细胞RNA测序(图6A)。利用统一流形逼近(UMAP)分析对具有共享基因表达谱的淋巴瘤细胞进行聚簇。鉴定了六个以不同细胞周期阶段为特征的聚簇(图6B-6C)，包括一个G1显性聚簇、两个S聚簇、一个G1/G2聚簇、一个G2/M聚簇和一个具有高Ki67表达的M聚簇。观察到在CART19/维奈托克治疗的条件下分配给G1显性的细胞比例(8.4％)显著低于CART19治疗条件(24％)，这表明通过添加维奈托克，G1显性(“G1-dom”)聚簇普遍耗竭(图6D)。根据最近的报道，维奈托克可以诱导G1中肿瘤细胞的细胞周期阻滞和死亡，这些结果表明维奈托克治疗还通过阻碍细胞周期的进展来增强CART的抗肿瘤功效。有趣的是，G1显性和高增殖细胞(“MKI67hi”)聚簇显示出与干扰素γ反应性相对应的显著的基因富集，这表明这两个聚簇的细胞可能已经与CART细胞相互作用(图6E)。值得注意的是，包括MKI67hi聚簇中CART19/维奈托克治疗条件下G2/M阶段转变负调节的富集(图6F-6G)通过对MKI67hi聚簇中代表快速增殖肿瘤亚群的CART19和CART19/维奈托克组合之间的差异表达基因(DEG)进行GO富集分析来鉴定。总之，这些数据表明，维奈托克治疗通过促进癌症细胞中的肿瘤凋亡和抑制细胞周期来增强CART介导的肿瘤杀伤，同时也增强了与CART细胞结合的肿瘤B细胞中的干扰素反应。
为了进一步验证这种组合，利用对维奈托克高度敏感的DLBCL细胞系OCI-Ly18应用体内B-NHL异种移植模型(图1H)。将OCI-Ly18细胞皮下(s.c.)植入免疫缺陷的NOD-SCIDγ链缺陷(NSG)小鼠中。当肿瘤体积达到约150mm2时，在不存在或存在次优剂量维奈托克(25mg/kg/天，3周，口服管饲法)的情况下，将小鼠随机分组以接受次优剂量的CART19(2x106个CAR+细胞/小鼠，静脉内，i.v.)。维奈托克的次优剂量是基于维奈托克剂量递增研究确定的(图7A-7B)。虽然这些剂量的单剂维奈托克和CART19都没有延迟肿瘤生长，但维奈托克协同增强了CART细胞介导的肿瘤控制(CART19加媒介物对比CART19加维奈托克，p＝0.0035)，导致与对照组的0％相比的100％总存活率(图1H)。总之，这些结果表明，将维奈托克与CART细胞相结合可能是一种改善CART19疗法在维奈托克敏感淋巴瘤的临床结果的有希望策略。
实施例3：维奈托克治疗导致长期CART细胞毒性
鉴于临床环境中对维奈托克的敏感性在不同的淋巴瘤和白血病子集中有很大差异(Juárez-Salcedo,et al.,Drugs Context 2019；8:212574；and Klanova,et al.,Cancers2020；12(4):938)，至关重要的是研究维奈托克敏感细胞系中显示的有益作用是否适用于对维奈托克具有中等至低敏感性的恶性肿瘤(图8A)。为此，利用了两种异种移植模型：B细胞淋巴瘤MINO模型和B-ALL NALM6模型，它们分别在体外显示出对维奈托克的中等和高抗性(图1D和图2A-2F)。NSG小鼠注射表达荧光素酶的MINO细胞，并在第14天，将小鼠随机接受相对低剂量的CART19(5x104个细胞/小鼠)或对照T细胞(UTD)与维奈托克(每天50mg/kg，口服管饲法，5周)或媒介物的组合。利用更高剂量的维奈托克是因为维奈托克对MINO的半数最大抑制浓度(IC50)是OCI-Ly18的5倍(图2A-2F)。有趣的是，与单独用CART19治疗的小鼠相比，用CART119和维奈托克治疗的小鼠在CART输注后早期(第7天)显示出略胜一筹的抗淋巴瘤疗效。然而，从长远来看，这种有益效果丧失了。事实上，总体而言，尽管添加了维奈托克，但没有统计学益处(图8B)。接下来，利用维奈托克抗性模型(NALM6)，并且由于NALM6(B-ALL细胞系)对维奈托克的较高抗性，维奈托克的量增加(100mg/kg/天，口服管饲法，5周)。观察到用高剂量维奈托克连续治疗的40％的小鼠(5只小鼠中的2只)显示出肿瘤复发，而在单独用CART19治疗的小鼠中没有发现肿瘤复发的证据(图8C)。这些体内发现似乎与短期体外结果相矛盾，短期体外结果显示维奈托克/CART19组合在几乎所有测试的细胞系中都有益处，并暗示更高剂量的维奈托克可能导致CAR T细胞毒性。这些数据表明，维奈托克诱导了CAR T细胞的凋亡，从而降低了它们在体内控制癌症细胞的长期能力。
为了研究这一假设，利用流式细胞术分析用CART19加维奈托克或单独用CART19治疗的NSG小鼠外周血中CART19细胞的扩增和持久性。如图8D所示，用维奈托克加CART19治疗的小鼠的血液中CART19细胞的水平低于单独CART19。这些结果与维奈托克影响CART细胞存活和/或增殖的能力，从而阻碍其整体抗肿瘤作用的假设一致。为了测试长期暴露于维奈托克是否会导致CART细胞毒性，利用由8种不同T细胞供体制造的CART细胞进行体外维奈托克毒性测定。如图8E所示，通过与维奈托克共培养5天，维奈托克导致CART19细胞的存活率显著降低。值得注意的是，不同的T细胞供体对CART细胞的毒性水平不同，这可能是由于基线时不同的凋亡启动状态(apoptotic priming statuses)。有趣的是，当相同抗凋亡调节家族的其它成员在CART细胞中被抑制时，观察到类似的CART细胞毒性。事实上，MCL-1抑制导致CART存活率降低，这表明线粒体介导的凋亡的调节对于CART细胞适应度是重要的(图9)。为了辨别存活率的降低是由于凋亡增加还是增殖减少，在维奈托克存在或不存在的情况下评估CART19中的胱天蛋白酶3/7活性。事实上，维奈托克在CART细胞中诱导了显著的胱天蛋白酶3/7激活，促进了凋亡(图8E)，并且在这样做的过程中减少了增殖。总之，这些研究表明，抑制具有维奈托克抗性的肿瘤所需的更高剂量的维奈托克可导致CART19细胞凋亡。然而，BCL-2途径是癌症对CART免疫疗法的抗性的关键节点，并且维奈托克可能对CART细胞有毒性。因此，需要一种不同的方法来克服靶向BCL-2与CART免疫疗法相结合的局限性。
实施例4：赋予CART细胞对维奈托克抗性的新策略
为了开发出具有抵抗维奈托克毒性的内在能力的CART细胞，从而允许维奈托克与CART细胞的成功结合，本文采用已知的在白血病和淋巴瘤中驱动对维奈托克的抗性的机制来使CART细胞对维奈托克产生抗性。特别地，先前的研究已经在CLL患者和B-NHL细胞系中发现了与维奈托克抗性相关的各种类型的BCL-2突变。值得注意的是，在104个氨基酸残基处含有点突变的突变体BCL-2(Phe104Leu或F104L)显示出对维奈托克的强抗性(Birkinshaw,et al.,Nature Communications 2019；10(1):1-10；Tahir,et al.,Haematologica,2019；104(9):e434)。然而，这些突变在T细胞，特别是CART细胞中的作用仍然未知。
因此，包含CAR19和与2A自切割肽(P2A)序列连接的突变BCL-2(F104L)两者的新慢病毒构建体在本文中被工程化(图10A)。通过利用流式细胞术对CAR19和BCL-2进行细胞内染色来证实转基因在靶细胞中的正确表达(图10B)。接下来，证明了表达BCL-2(F104L)的CART19在杀死淋巴瘤细胞中确实具有功能，并且在体外维持了与维奈托克的短期协同作用(图10C，图11)。此外，进行维奈托克CART细胞毒性测定，以评估突变体BCL-2是否能提供对维奈托克的抗性。令人惊讶的是，如图10D所示，BCL-2(F104L)的表达在长期体外测定中成功地将CART细胞从维奈托克相关毒性中拯救出来(即，平均IC50值：CART19-BCL-2(F104L)9027nM和CART19 130.7nM，p＝0.0071)。值得注意的是，BCL-2野生型(WT)(用作对照)的表达增加也提供了一定程度的CART细胞保护，使其免受维奈托克毒性的影响，但与BCL-2(F104L)相比，效果明显较差(即，平均IC50值：997.6nM)。这些数据表明，通过BCL-2的维奈托克结合口袋中的点突变直接抑制维奈托克与BCL-2连接是开发抗维奈托克的CART细胞的有效策略。
接下来，利用MINO淋巴瘤(对维奈托克中度抗性；NHL)和NALM-6(对维奈托克高抗性；B-ALL)异种移植模型在体内评估CART19-BCL-2(F104L)的维奈托克抗性(图10E)。在MINO模型中，表明虽然维奈托克(50mg/Kg)对CART19有毒性，但CART19-BCL-2(F104L)与维奈托克组合显示出显著的协同作用——无论是在肿瘤控制还是存活方面。特别地，维奈托克与CART19-BCL-2(F104L)组合出乎意料地导致100％存活，而维奈托克与对照CART19的组合没有长期存活(p＝0.0024)(图10E)。值得注意的是，在利用100mg/kg维奈托克的高抗性NALM-6模型中，BCL-2(F104L)突变也被证实具有保护性(图12A-12B)。事实上，在CART输注后第10天和第14天进行了血流式细胞术，并且在CART-BCL-2(F104L)中没有观察到毒性。正如在对维奈托克不敏感的B-ALL模型中所预期的那样，将维奈托克添加到CART19中仅导致抗肿瘤活性的最小增强，显著低于NHL模型(图12A-12B)。
这些结果表明，在癌症细胞中导致对维奈托克抗性的BCL-2突变可以被改变用途，以在CART细胞中诱导类似程度的抗性，从而允许否则有毒性的CART药物组合得以开发。
实施例5:淋巴瘤细胞CART19治疗的淋巴瘤患者中BCL-2染色体改变的临床作用
为了验证BCL-2轴与淋巴瘤CART治疗反应相关的临床前发现，分析了宾夕法尼亚大学接受CART19治疗的两个NHL患者队列。基于临床前的结果，假设B细胞淋巴瘤中BCL-2的改变可能导致临床环境中对CART19免疫疗法的抗性。为了验证这一假设，根据BCL-2基因的染色体改变，即BCL-2染色体易位t(14；18)(n＝40)或BCL-2染色体增益(n＝16)的存在，或者其不存在(n＝31)，回顾性分析了接受FDA批准的CART19产品(tisagenlecleucel和axicabtagene ciloleucel)治疗的87名大B细胞淋巴瘤(LBCL)患者队列的临床结果(图13A)。如图14所示，来自三组的患者在输注时的年龄、表现状态、利用的CAR共刺激结构域和输注时疾病状态方面是平衡的。重要的是，在这组患者中，包括DLBCL——未另行指定的(NOS)、转化的滤泡淋巴瘤(tFL)、双重击大B细胞淋巴瘤(BCL)和高级别BCL(HGBCL)NOS，无进展存活期(PFS)没有基于不同的组织学而改变(p＝0.918)(图15A)。然而，观察到携带BCL-2易位t(14；18)和BCL-2增益的患者与没有BCL-2改变的患者(67.7％；分别地p＝0.195和p＝0.047)相比，具有较差的最佳总体反应(BORR)(分别地52.5％和37.5％)(图13B)。与没有BCL-2染色体改变的患者(61.3％)相比，在携带BCL-2增益(31.2％)和BCL-2易位(40.0％)的患者中也观察到较差的完全缓解率(图15B)。当观察3个月的反应率时，结果得到了证实(图15C)。此外，在12.6个月的中位随访时间，与没有BCL-2改变的患者相比，具有BCL-2染色体易位或增益的患者具有较低的总存活率(图13C)。没有BCL-2改变的患者达到中位总存活率(OS)时间，以及具有BCL-2易位t(14；18)或BCL-2增益的患者(分别p＝0.009和p＝0.056)分别达到15.7和15.8个月，其中具有BCL-2易位t(14；18)和BCL-2增益的患者与没有涉及BCL-2基因座的染色体改变的患者相比具有显著更短的OS，其中大多数BCL-2改变的患者在5个月内治疗失败(图15D)。BCL-2染色体增加对PFS的影响在多变量分析中得到验证，包括性别、年龄、输注时的疾病状态和BCL-2易位变量的存在(图16)。值得注意的是，其它临床结果的发生率和本体(本质，entity)——如任何级别的CART介导的毒性(如细胞因子释放综合征、CRS和免疫效应细胞相关神经毒性综合征、ICANS)——与BCL-2改变无关(图15E-15F)。
为了证实BCL-2改变在更同质的患者队列中的作用，分析了更有限的患者组，即DLBCL-NOS组织学(n＝37)(图17)。在该亚群中，与没有BCL-2异常的患者(65.0％；分别地p＝0.508和p＝0.013；图13D)相比，携带BCL-2易位t(14；18)(50％)和BCL-2增益(18.2％)的患者的BORR较差。具有BCL-2增益异常的DLBCL患者的完全缓解率显著低于没有BCL-2异常的患者(18.2％对比60.0％；p＝0.025；图15G)。此外，如在亲代LBCL队列中观察到的，以BCL-2改变为特征的DLBCL-NOS患者具有较差的OS(图13E)。3个月的反应率也证实了该结果(图15H)。值得注意的是，输注一年后，具有BCL-2增益的患者没有反应，相比的是在没有BCL-2-染色体畸变的对照组中反应为50.0％。对于没有BCL-2改变的患者，中位PFS为9.0个月，对于具有BCL-2易位t(14；18)或BCL-2增益的患者，分别为2.5和3.1个月(分别地p＝0.936和p＝0.006；图15I)。BCL-2染色体增益对较短PFS的影响也在DLBCL队列的多变量分析中得到验证(图18)。至于之前的队列，在这组患者中，CRS和ICANS的发生率与BCL-2的改变无关(图15J-15K)。
总之，这两项对接受CART19治疗的淋巴瘤患者大队列的回顾性分析和临床前研究表明，BCL-2的染色体畸变，特别是BCL-2增益，与反应降低、中位PFS和总存活率有关。
实施例6：在套细胞淋巴瘤中在CART19后维奈托克桥接疗法与更好的结果相关
本文已经证明了BCL-2抑制增强CART疗法对淋巴瘤的临床前作用，以及BCL-2染色体畸变和CART结果的临床相关性。鉴于在具体的患者子集中，即复发或难治性套细胞淋巴瘤患者，维奈托克和CART19在临床实践中都是常规利用的，研究了维奈托克的桥接疗法是否会改善CART结果。由于在CART19治疗期间同时给予维奈托克尚未在临床环境中获得批准，因此评估了在制造期间维奈托克暴露作为桥接疗法的影响。假设维奈托克会使肿瘤细胞产生CART介导的凋亡。对于该分析，研究了18名MCL患者，他们接受了单采血液成分术和输注FDA批准的CD28共刺激CART19产品brexucabtagene autoleucel(brex-cel)之间的桥接疗法(图13F)。在这18名患者中，有8名接受了桥接疗法，包括维奈托克(图19)。与接受基于非维奈托克的桥接的对照组患者相比，他们在性别、输注时的年龄、既往自体干细胞移植治疗、既往疗法路线的数量方面没有差异。然而，它们在输注时具有更高的反应率(图20)。值得注意的是，所有用维奈托克作为桥接疗法治疗的患者在brex-cel后都获得了完全缓解(7/8，87.5％)，而接受基于非维奈托克的桥接疗法的患者显示出50％的CR率(5/10)(p＝0.094)(图13G)。此外，与未接受维奈托克的患者相比，接受维奈托克桥接疗法的患者的无事件存活率更长(p＝0.018)，与对照组的约60％相比，100％的维奈托克患者在一年内完全缓解(图13H)。总之，这些结果验证了BCL-2通路在接受CART19免疫疗法的淋巴瘤患者中也是一个关键节点。
实施例7：CART细胞中BCL-2过表达增强其抗肿瘤作用
在先前描述的研究中，观察到除了减少维奈托克毒性外，CART细胞中BCL-2(F104L)的过表达增加了它们控制肿瘤的固有能力，即使在没有维奈托克的情况下也是如此(图10E，红点线)。因此，推测BCL-2(WT)在CART细胞中的表达增强了它们的存活率和长期持久性，从而导致更高的治疗指数。为了研究组成型BCL-2表达可能提高CART细胞抗肿瘤活性的机制，进行了体外和体内CART细胞功能研究(图21A)。如图21B和21C所示，在小鼠异种移植模型中，CART19-BCL-2(WT)细胞在体内对MINO(MCL)和NALM6(B-ALL)的抗肿瘤活性极大增强。此外，与CART19相比，在小鼠的血液中观察到CART19-BCL2(WT)的显著扩增(图21D)。值得注意的是，在肿瘤清除后，血液中CART19-BCL-2(WT)的水平降低，表明在该模型中不存在不受控制的增殖(图21E)。从机制上讲，没有观察到与CART细胞体外抗肿瘤活性的BCL-2表达相关的明显功能障碍；细胞毒性和细胞因子产生没有差异(图22A-22C)。鉴于BCL-2在记忆T细胞中的表达高于效应T细胞，监测刺激后BCL-2的恒定表达是否影响CART细胞的分化状态。如图23所示，CART激活后，CART细胞分化的频率随时间没有显著差异。相反，观察到BCL-2过表达为CART细胞提供了体外长期存活的极大优势(图21F)。值得注意的是，这些长期存活的CART细胞仍然表现出极大的抗肿瘤活性，如从长期来看，它们仍然可以通过分泌多种细胞因子对佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)/离子霉素产生反应(图24)。
为了了解这种增强的抗肿瘤活性的机制，在体外激活18天后从CART19或CART19-BCL-2(WT)中分离RNA，并进行批量RNAseq分析。如图21G和图25所示，与CART19相比，总共鉴定了304个在CART19-BCL-2(WT)中差异表达的基因(上调：117个基因，下调：187个基因)(图21G)。利用这些差异表达的基因进行基因集富集分析(GSEA)，其显示CART19-BCL-2(WT)显示出与凋亡相关的途径强相关的基因的下调，这可以解释存活率的增强(图21H，左)。此外，观察到JAK-STAT途径中的基因表达增加和干扰素-α反应(图21H，右)，这可能表明促存活表型和更高的γ受体细胞因子介导的信号传导，尽管在这种长期共培养中细胞因子的可用性降低(第18天)。事实上，先前对鼠T细胞的研究表明，BCL-2的过表达允许T细胞在没有γ-受体细胞因子如IL-2(Charo,et al.,Cancer Research,2005；65(5):2001-8)或IL-7(Maraskovsky,et al.,Cell 1997；89(7):1011-9)的情况下存活。为了在功能上验证这一假设，在缺乏对CART细胞存活/扩增至关重要的细胞因子的情况下，BCL-2过表达是否拯救了CART细胞。值得注意的是，与先前的报道一致，证明了当从CART19细胞的培养基中提取细胞因子时，CART-BCL-2(WT)细胞比CART19细胞更好地存活，这表明BCL-2过表达可以在缺乏源自细胞因子的存活信号的情况下保护CART细胞，可能通过增强的JAK-STAT存活信号通路(图21I)。
实施例8：单采血液成分术产品中更高的BCL-2RNA水平与CART19后CART持续性延 长的结果改善相关
接下来，假设患者T细胞中BCL-2的表达可能与CART19免疫疗法后的改善结果有关，这是由于增强了CART适应度。为了解决这一假设，分析了在中试临床试验(NCT02030834)中接受CART19免疫疗法(CTL019，现在称为tisagenleucleucel)的38名B-NHL患者的单采血液成分术产品的T细胞中的基因表达，并将其与长期结果(超过5年)相关联(图26A)。如图26B所示，利用nanoString nCounter平台，观察到BCL-2是在CART后获得CR的患者中与NR患者相比显著富集的居前位基因之一。此外，与NR相比，CR或PR患者的绝对BCL-2水平更高(图26C)。此外，还鉴定T细胞中BCL-2的表达与延长的CART持续性相关(图26D，p＝0.0005)，但与临床前模型(图21F)中观察到的CART峰值扩增无关(图27A)。最后，发现T细胞中BCL-2的表达水平与患者的总存活率延长显著相关(图26E，p＜0.0001)，但与PFS无关(图27B)。这些结果表明，来自单采血液成分术产品的T细胞中更高水平的BCL-2与CART19的临床结果的改善有关。
实施例9：CART19(F104L)的临床前安全性和缓解策略
虽然BCL-2过表达导致CART细胞抗淋巴瘤活性的显著提高，但这种方法的一个关键问题可能是长期安全性。事实上，尽管BCL-2不被认为是淋巴瘤发生的独立驱动因素，但它的过表达可能导致CART细胞不受控制的增殖和潜在的T细胞转化。值得注意的是，在本研究中，CART19增殖增加并没有导致这些细胞在小鼠中的异常扩增；重要的是，CART19-BCL2(WT)在不存在靶抗原的情况下确实收缩(图21E)。此外，进行了一项增殖研究，旨在评估CART19-BCL-2(WT)在存在或不存在细胞因子(如IL-7和IL-15)的情况下在没有抗原刺激的情况下增殖的能力。如图26F和图28A-28B所示，证明了CART19-BCL2(WT)显示出与未修饰的CART细胞相似的扩增能力。此外，在肿瘤根除时观察到外周血中CART扩增的减少(图21E)。
然而，为了进一步研究这种方法的安全性，评估了CART19-BCL-2(WT)细胞是否仍然对常规细胞毒性药物如化疗(chemotherapy)(例如阿霉素)敏感。如图26G所示，无论BCL-2的组成型表达如何，临床剂量的阿霉素导致CART19-BCL-2(WT)的快速有效消除。此外，为了增强CART19-BCL-2(WT)细胞的安全性，通过将截短的EGFR表达到CART19-BCL-2(WT)中利用CART自杀系统(Paszkiewicz,et al.,The Journal of clinical investigation 2016；126(11):4262-72)。测试抗EGFR抗体是否可以介导抗体依赖性细胞毒性，从而根除CART19-BCL-2(WT)。如预期的那样，利用抗EGFR抗体成功地消除了CART19-BCL-2(WT)细胞(图26H)。
总之，本文证明了BCL-2的组成型表达显著增强了CART细胞的存活和扩增，这进而提高了它们在若干组合模型中的整体抗肿瘤活性。此外，目前的研究表明，如果有必要，常规淋巴细胞耗竭剂和靶向抗体介导的耗竭都可以用作临床方案来耗竭患者中表达BCL-2的CART细胞。
在本研究中，展示了癌症的内在凋亡如何影响B细胞淋巴瘤患者的CART细胞疗法的总体临床结果。本文提供的数据表明与没有基因改变的患者相比，具有bcl-2基因改变的患者对CART细胞疗法的反应性显著更低，并强调了开发一种能有效抑制bcl-2抗凋亡作用的有效策略以增强CART细胞治疗的抗肿瘤功效的急切需要。
此前，各种类型的小分子药物(例如，奥巴克拉,at101,ABT737,S-055746,S65487,PNT-2258,那维妥拉和维奈托克)已经被开发(Seymour JF,et al.,2018,New EnglandJournal of Medicine,378(12):1107-20；Perini GF,et al.,2018,Journal ofHematology&Oncology,11(1):1-15；和Soderquist RS,et al.,2016,Molecular CancerTherapeutics,15(9):2011-7)，以抑制bcl-2的促肿瘤活性，并评估了它们与CART治疗的联合作用。例如，Karlsson等人证明，与单独的CART治疗相比，ABT737的添加导致CART介导的肿瘤杀伤显著增加(Karlsson S,et al.,2013,Cancer Gene Therapy,20(7):386-93)。此外，Yang等人表明，维奈托克对肿瘤的预致敏增强了CART19介导的肿瘤杀伤(Yang M,etal.,2020,Frontiers in Immunology,11)。结合本文提供的数据，其中显示维奈托克/CART19组合在维奈托克敏感细胞系中产生显著的细胞毒性，这些先前的研究表明，CART疗法和抗bcl2抑制剂的组合可能是改善CART疗法的临床结果的有效策略。
然而，上述先前的研究仅监测了CART/bcl-2抑制剂组合的短期体外效果，并且未能检测bcl-2抑制剂长期治疗的影响，尤其是对CART19的存活率的影响。考虑到bcl-2在CART细胞的存活中也起着重要作用，强效bcl-2抑制剂治疗可能会导致CART细胞中不必要的旁观者效应，如CART细胞存活率的降低(如Yang等人所证实的)，这证明了维奈托克剂量依赖性CART毒性(Yang M,et al.,2020,Frontiers in Immunology,11)。除了本文提供的数据显示维奈托克治疗可诱导严重的CAR T细胞毒性外，这些先前的研究强调需要开发一种对维奈托克治疗具有抗性的新型CART细胞，以实现最佳的CART/维奈托克组合效果。
关于维奈托克对CAR T细胞毒性的预防，人们可能认为调节维奈托克给予的频率和/或剂量等方法可能是最直观的努力。然而，考虑到临床上常规利用的维奈托克的生理浓度，通过简单地调整维奈托克注射的频率和/或剂量可能非常难以避免维奈托克的毒性。例如，接受维奈托克治疗的患者体内维奈托克的生理浓度约为2.3μM(Jones AK,et al.,2016,The AAPS Journal,18(5):1192-202)。然而，健康供体来源的CAR T细胞的IC50浓度的平均值为600nM，表明维奈托克介导的CAR T细胞毒性在大多数用CAR细胞治疗的患者中是不可避免的。
因此，为了克服这种不可避免的维奈托克诱导的CAR T细胞毒性，本文通过采用癌症细胞的抗性机制来逃避维奈托克治疗(即，在CAR T细胞中表达Bcl-2变体)来开发抗维奈托克的CART细胞。本文展现的结果表明，通过F104L Bcl-2变体的表达而结合维奈托克的能力的完全丧失允许CART细胞克服维奈托克诱导的毒性。相反，其它方法(例如，通过过表达bcl-2WT来补偿bcl-2的损失)未能产生对维奈托克治疗的完全抗性。
此外，本文还证明了bcl-2在CAR T细胞中的持续表达提高了CAR T细胞的长期存活，从而导致整体的CART细胞抗肿瘤活性的增加。有趣的是，Charo等人(Charo J,et al.,2005,Cancer Research,65(5):2001-8)和Wang等人(Wang H,et al.,2021,Cancers,13(2):197)还发现，过继性T细胞疗法中的bcl-2表达显著增强了T细胞抗肿瘤活性，这表明对CAR T细胞的内在凋亡的调节可能是提高T细胞疗法的内源性抗肿瘤活性的关键。总之，本研究表明，通过调节癌症细胞和CAR T细胞的凋亡，可以大大提高CAR T细胞的治疗指数。
列举的实施方式
提供了以下列举的实施方式，其编号不应被解释为指定重要级别。
实施方式1提供了分离核酸，其包含：
a.编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和
b.编码B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白变体的核苷酸序列，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
实施方式2提供了实施方式1所述的分离核酸，其进一步包含在编码CAR的核苷酸序列和编码Bcl-2家族蛋白变体的核苷酸序列之间的编码2A自切割肽的核苷酸序列。
实施方式3提供了实施方式1或2所述的分离核酸，其中细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
实施方式4提供前述实施方案中任一项所述的分离核酸，其中Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
实施方式5提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
实施方式6提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
实施方式7提供前述实施方案中任一项所述的分离核酸，其中细胞毒性抑制剂是小分子。
实施方式8提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中细胞毒性抑制剂选自维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
实施方式9提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中所述细胞毒性抑制剂是维奈托克。
实施方式10提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中：
a.所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包含选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V以及其任何组合；或
b.Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且所述变体包括G179E突变。
实施方式11提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中所述变体包含F104LBcl-2。
实施方式12提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、Lewis Y、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A(Melan A)、间皮素(mesothelin)、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1至6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2和其任意组合。
实施方式13提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中所述肿瘤抗原是CD19。
实施方式14提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体(affibody)、monobody(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
实施方式15提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
实施方式16提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中所述胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
实施方式17提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中所述胞内结构域包含选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)，或其变体，或衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
实施方式18提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中所述胞内结构域包含选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾区、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3-Δ、CD3-ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
实施方式19提供前述实施方式中任一项所述的分离核酸，其中所述胞内信号转导结构域包括CD3ζ的胞内信号传导结构域或其变体。
实施方式20提供了包含前述实施方式中任一项所述的分离核酸的载体。
实施方式21提供了实施方式20所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
实施方式22提供了包含实施方式1-19中任一项所述的分离核酸或实施方式20-21中任一项所述的载体的经修饰的细胞，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞。
实施方式23提供了实施方式22所述的经修饰的细胞，其中所述细胞是T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
实施方式24提供了经修饰的细胞，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中所述细胞被工程化以表达：
a.嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和
b.B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
实施方式25提供了实施方式24所述的经修饰的细胞，其中细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
实施方式26提供实施方式24或25所述的经修饰的细胞，其中Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
实施方式27提供了实施方式24-26中任一项所述的经修饰的细胞，其中Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
实施方式28提供了实施方式24-27中任一项所述的经修饰的细胞，其中细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
实施方式29提供了实施方式21-24中任一项所述的经修饰的细胞，其中细胞毒性抑制剂是小分子。
实施方式30提供了实施方式24-29中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞毒性抑制剂选自：维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
实施方式31提供了实施方式24-30中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞毒性抑制剂是维奈托克。
实施方式32提供了实施方式24-31中任一项所述的经修饰的细胞，其中：
a.所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包含选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V以及其任何组合；或
b.Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且该变体包括G179E突变。
实施方式33提供实施方式24-32中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述变体包含F104L Bcl-2。
实施方式34提供实施方式24-33中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、Lewis Y、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1-6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2及其任意组合。
实施方式35提供了实施方式24-34中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述肿瘤抗原是CD19。
实施方式36提供实施方式24-35中任一项所述的经修饰的细胞，其中抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体(affibody)、monobody(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
实施方式37提供了实施方式24-36中任一项所述的经修饰的细胞，其中抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
实施方式38提供了实施方式24-37中任一项所述的经修饰的细胞，其中胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
实施方式39提供了实施方式24-38中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述胞内结构域包含选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)或其变体，或源自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
实施方式40提供了实施方式24-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述胞内结构域包含选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾区、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3-Δ、CD3-ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
实施方式41提供了实施方式24-40中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述胞内信号转导结构域包括CD3ζ的胞内信号传导结构域或其变体。
实施方式42提供了实施方式24-41中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞是T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
实施方式43提供药物组合物，其包含实施方式22-42中任一项所述的经修饰的细胞群体和至少一种药学上可接受的载体。
实施方式44提供了一种治疗有需要的对象中的癌症的方法，包括给予对象经修饰的细胞群体，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中细胞被工程化以表达：
a.嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合由癌症表达的肿瘤抗原；和
b.B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
实施方式45提供了实施方式38所述的方法，其中对象在给予经修饰的细胞群体之前已给予细胞毒性抑制剂。
实施方式46提供了实施方式38或39所述的方法，进一步包括在给予经修饰的细胞群体之前、同时或之后向对象给予细胞毒性抑制剂。
实施方式47提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
实施方式48提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
实施方式49提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
实施方式50提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
实施方式51提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中细胞毒性抑制剂是小分子。
实施方式52提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性抑制剂选自：维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
实施方式53提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性抑制剂是维奈托克。
实施方式54提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中：
a.所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包含选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V以及其任何组合；或
b.所述Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且该变体包括G179E突变。
实施方式55提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述变体包括F104LBcl-2。
实施方式56提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体(affibody)、monobody(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
实施方式57提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
实施方式58提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、Lewis Y、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1-6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2及其任意组合。
实施方式59提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是CD19。
实施方式60提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
实施方式61提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述胞内结构域包含选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)，或其变体，或衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
实施方式62提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述胞内结构域包含选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾区、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3-Δ、CD3-ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
实施方式63提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞内信号转导结构域或其变体。
实施方式64提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中细胞群体包括T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
实施方式65提供前述实施方式中任何一项所述的方法，其中对象是人。
实施方式66提供前述实施方式中任一项所述的方法，其中癌症是B细胞淋巴瘤或白血病。
其它实施方式
本文引用的每件专利、专利申请和出版物的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。虽然已经参考具体实施方式公开了本发明，但显然本领域其它技术人员可以在不背离本发明真实精神和范围的情况下设计出本发明的其它实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。

Claims (66)

1.一种分离核酸，所述分离核酸包含：
a.编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和
b.编码B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体的核苷酸序列，其中所述变体赋予对所述Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
2.根据权利要求1所述的分离核酸，其进一步包含在编码CAR的核苷酸序列和编码Bcl-2家族蛋白的变体的核苷酸序列之间的编码2A自切割肽的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的分离核酸，其中所述细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
5.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述细胞毒性抑制剂是小分子。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述细胞毒性抑制剂选自维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述细胞毒性抑制剂是维奈托克。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中：
a.所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包括选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V以及其任何组合；或
b.所述Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且所述变体包括G179E突变。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述变体包括F104L Bcl-2。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、Lewis Y、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1至6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2和其任意组合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述肿瘤抗原是CD19。
14.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体、monobody(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
15.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
16.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述胞内结构域包括选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)，或其变体，或衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
18.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述胞内结构域包括选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾区、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3-Δ、CD3-ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述胞内信号转导结构域包括CD3ζ的胞内信号传导结构域或其变体。
20.一种载体，其包含根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸。
21.根据权利要求20所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
22.一种经修饰的细胞，其包含根据权利要求1-19中任一项所述的分离核酸或根据权利要求20-21中任一项所述的载体，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞。
23.根据权利要求22所述的经修饰的细胞，其中所述细胞是T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
24.一种经修饰的细胞，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中将所述细胞工程化以表达：
a.嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原；和
b.B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对所述Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
25.根据权利要求24所述的经修饰的细胞，其中所述细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
26.根据权利要求24或25所述的经修饰的细胞，其中所述Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
29.根据权利要求21-24中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞毒性抑制剂是小分子。
30.根据权利要求24-29中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞毒性抑制剂选自：维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞毒性抑制剂是维奈托克。
32.根据权利要求24-31中任一项所述的经修饰的细胞，其中：
a.所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包含选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V、以及其任何组合；或
b.所述Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且所述变体包括G179E突变。
33.根据权利要求24-32中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述变体包括F104L Bcl-2。
34.根据权利要求24-33中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、Lewis Y、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1-6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2及其任意组合。
35.根据权利要求24-34中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述肿瘤抗原是CD19。
36.根据权利要求24-35中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体、monobody(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
37.根据权利要求24-36中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
38.根据权利要求24-37中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
39.根据权利要求24-38中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述胞内结构域包括选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)或其变体，或源自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
40.根据权利要求24-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述胞内结构域包括选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾区、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3-Δ、CD3-ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
41.根据权利要求24-40中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述胞内信号转导结构域包括CD3ζ的胞内信号传导结构域或其变体。
42.根据权利要求24-41中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞是T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求22-42中任一项所述的经修饰的细胞的群体和至少一种药学上可接受的载体。
44.一种治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括给予所述对象经修饰的细胞的群体，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中所述细胞被工程化以表达：
a.嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域结合由所述癌症表达的肿瘤抗原；和
b.B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白的变体，其中所述变体赋予对所述Bcl-2家族蛋白的细胞毒性抑制剂的抗性。
45.根据权利要求38所述的方法，其中所述对象在给予所述经修饰的细胞的群体之前已给予所述细胞毒性抑制剂。
46.根据权利要求38或39所述的方法，进一步包括在给予所述经修饰的细胞的群体之前、同时或之后向所述对象给予所述细胞毒性抑制剂。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性抑制剂是促凋亡药物。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2家族蛋白选自Bcl-2、BCL-XL、BCL-W、MCL1、BFL1、BIM、BAD、BAK和BAX。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2或人BAX。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性抑制剂选自小分子、抗体和抑制性核酸。
51.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性抑制剂是小分子。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性抑制剂选自：维奈托克(ABT-199)、那维妥拉(ABT-263)、ABT-737、沙布托克(BI-97C1)、奥巴克拉(GX15-070)、TW-37、AT-101、HA14-1、RU486、BAM7、A-1331852、A-1155463、BDA-366、UMI-77、BH3I-1及其任何组合。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性抑制剂是维奈托克。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
a.所述Bcl-2家族蛋白是人Bcl-2，并且所述变体包括选自以下的突变：F104L、G101V、D103E、D103Y、F101C、F101L、V92L、T187I、A131V、以及其任何组合；或
b.所述Bcl-2家族蛋白是人BAX，并且所述变体包括G179E突变。
55.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述变体包括F104L Bcl-2。
56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、单特异性抗体、双特异性抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)和抗体模拟物(如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲合体、monobody(adnectin)、affilin、affimer、affitin、α体、avimer、Kunitz结构域肽、anticalin和syntherin)。
57.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD123、CD133、CD147、CD171、CD276、CEA、密蛋白18.2、c-Met、DLL3、DR5、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAM1、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-1、Lewis Y、LMP1(EBV)、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、黑色素A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUC1、柄蛋白4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP 1-6)、NY-ESO-1、P16、PD-L1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、TIM-3、TM4SF1、VEGFR2及其任意组合。
59.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是CD19。
60.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胞内结构域包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胞内结构域包含选自以下的蛋白质的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)，或其变体，或衍生自杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胞内结构域包含选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、DAP10、DAP12、Fc受体的胞质尾区、携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3-Δ、CD3-ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，或其变体。
63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞内信号转导结构域或其变体。
64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞的群体包括T细胞、自体细胞、人细胞或其任何组合。
65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是B细胞淋巴瘤或白血病。
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