TW201940520A - 攝護腺特異性膜抗原嵌合抗原受體及其用途 - Google Patents

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nucleic acid
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psma
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趙陽兵
思華 林
劉曉軍
安 周
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賓夕法尼亞大學董事會
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Abstract

本發明提供經修飾的免疫細胞(例如，經修飾的T細胞)，其包括對攝護腺特異性膜抗原(PSMA)(例如人類PSMA)具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)。本發明提供經修飾的免疫細胞(例如，經修飾的T細胞)，其包括對PSMA具有親和力的CAR以及顯性負受體及/或轉換受體。本發明提供經修飾的免疫細胞(例如，經修飾的T細胞)，其包括對PSMA具有親和力的CAR以及顯性負受體及/或轉換受體，其中經修飾的細胞能夠表現及分泌雙特異性抗體。

Description

攝護腺特異性膜抗原嵌合抗原受體及其用途
本申請案依據35 U.S.C.§ 119(e)享有以下美國臨時申請案優先權之權利：於2018年3月6日申請，申請號為62/639,321。前述案件通過引用而將其整體納入本文。
免疫療法應用於實體惡性腫瘤的主要挑戰是打破對自體抗原的耐受性。旨在利用內源抗腫瘤T細胞的疫苗策略受到T細胞受體(TCR)庫的限制，其可在胸腺內缺失作為中樞耐受的一部分或透過外周耐受的胸腺外機制使其不具功能。克服這些障礙的一種策略是使用嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)途徑產生重新導向至腫瘤抗原的基因改造T細胞。CAR T細胞使用以嵌合受體基因轉導的經遺傳編程的來自於患者的淋巴球，以便將特定抗體的抗原辨識域(antigen recognition domain)與TCR的訊息傳遞域(signaling domain)組合。
攝護腺特異性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen，PSMA)是在細胞表面表現的膜結合蛋白，據報導其在攝護腺癌組織中高度過量表現。PSMA的表現與腫瘤等級和階段的推進直接相關，並且被認為賦予攝護腺癌細胞選擇性生長優勢。因此，PSMA可能是攝護腺癌免疫療法的理想標靶。
癌症免疫療法中的另一個主要挑戰是標靶腫瘤所在的惡劣微環境。舉例來說，免疫抑制受體配體例如PDL1(CD274)與PD1(CD279)結合，在腫瘤微環境中上調並負調控T細胞的活性。另外，在攝護腺腫瘤細胞中過度表現的TGF-β可以作為免疫抑制分子。
因此，本領域亟需靶定PSMA的新型癌症免疫療法。本發明滿足了這種需求。
本發明基於以下研究結果：人類和鼠類攝護腺特異性膜抗原(PSMA)嵌合抗原受體(CAR)T細胞表現出有效的抗腫瘤活性。本發明還基於以下研究結果：包括顯性負受體(dominant negative receptor)及/或一轉換受體(switch receptor)的PSMA-CAR T細胞顯示出顯著增強的抗腫瘤活性。
因此，在某些實施例中，本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，其包括對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)，其中CAR包括PSMA結合域；以及顯性負受體及/或轉換受體。
在某些例示性實施例中，PSMA結合域是一鼠類PSMA結合域。
在某些例示性實施例中，PSMA結合域是一人類PSMA結合域。
在某些例示性實施例中，PSMA結合域是選自於抗體、Fab或scFv所組成的群組。
在某些例示性實施例中，scFv包括於SEQ ID NO：13、14、26、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，CAR包括一跨膜域(transmembrane domain)及一胞內域(intracellular domain)。
在某些例示性實施例中，跨膜域包括一衍生自CD8的跨膜區(transmembrane region)。
在某些例示性實施例中，衍生自CD8的跨膜區包括一SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，跨膜域更包括一衍生自CD8的鉸鏈區(hinge region)。
在某些例示性實施例中，衍生自CD8的鉸鏈區包括一SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，胞內域包括一4-1BB訊息傳遞域及一CD3 zeta訊息傳遞域。
在某些例示性實施例中，胞內域包括一ICOS訊息傳遞域及一CD3 zeta訊息傳遞域。
在某些例示性實施例中，胞內域包括一變異體ICOS訊息傳遞域及一CD3 zeta訊息傳遞域。
在某些例示性實施例中，4-1BB訊息傳遞域包括一SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，ICOS訊息傳遞域包括一SEQ ID NO：203所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，變異體ICOS訊息傳遞域包括一SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，CD3 zeta訊息傳遞域包括SEQ ID NO：97或100所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，顯性負受體是一與負訊號相關的野生型蛋白質的截短變異體(truncated variant)。
在某些例示性實施例中，與負訊號相關的野生型蛋白質的截短變異體包括一SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一第一域，其中第一域衍生自與負訊號相關的一第一多肽；以及一第二域，其中第二域衍生自與正訊號相關的一第二多肽。
在某些例示性實施例中，第一域包括與負訊號相關的該第一多肽的胞外域(extracellular domain)的至少一部分，且其中第二域包括與正訊號相關的第二多肽的胞內域的至少一部分。
在某些例示性實施例中，轉換受體更包括一轉換受體跨膜域。
在某些例示性實施例中，轉換受體跨膜域包括與負訊號相關的第一多肽的跨膜域；或與正訊號相關的該第二多肽的跨膜域。
在某些例示性實施例中，與負訊號相關的第一多肽是選自於CTLA4、PD-1、BTLA、TIM-3及TGFβR所組成的群組。
在某些例示性實施例中，與正訊號相關的第二多肽是選自於CD28、ICOS、4-1BB及IL-12R所組成的群組。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一第一域，包括PD1的 胞外域的至少一部分；一轉換受體跨膜域，包括CD28的跨膜域的至少一部分；以及一第二域，包括CD28的胞內域的至少一部分。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一SEQ ID NO；117所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一第一域，包括PD1的胞外域的至少一部分；一轉換受體跨膜域，包括PD1的跨膜域的至少一部分；以及一第二域，包括CD28的胞內域的至少一部分。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，第一域包括PD1的胞外域的至少一部分，PD1包括在胺基酸132位置的丙胺酸(A)取代為白胺酸(L)。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一第一域，包括PD1的胞外域的至少一部分，PD1包括在胺基酸132位置的丙胺酸(A)取代為白胺酸(L)；以及一第二域，包括CD28的胞內域的至少一部分。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一第一域，包括PD1的胞外域的至少一部分，該PD1包括在胺基酸132位置的丙胺酸(A)取代為白胺酸(L)；以及一第二域，包括4-1BB的胞內域的至少一部分。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一SEQ ID NO：215所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一第一域，包括TIM-3的胞外域的至少一部分；以及一第二域，包括CD28的胞內域的至少一部分。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一SEQ ID NO：127所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一第一域，包括TGFβR 的胞外域的至少一部分；以及一第二域，包括IL12Rβ1的胞內域的至少一部分。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一第一域，包括TGFβR的胞外域的至少一部分；以及一第二域，包括IL12Rβ2的胞內域的至少一部分。
在某些例示性實施例中，轉換受體包括一SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一顯性負受體，包括一SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：213或215所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：117或119所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞， 包括一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：127所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，經修飾的細胞分泌一雙特異性抗體。
在某些例示性實施例中，雙特異性抗體包括一第一抗原結合域及一第二抗原結合域。
在某些例示性實施例中，第一抗原結合域與一負訊號結合，負訊號選自於CTLA4、PD-1、BTLA、TIM-3及TGFβR所組成的群組。
在某些例示性實施例中，第二抗原結合域與一共刺激分子結合。
在某些例示性實施例中，共刺激分子是CD28。
在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是一經修飾的T細胞。
在某些例示性實施例中，經修飾的T細胞是自體細胞。
在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是胞毒型T淋巴球 (CTL)。
在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是自然殺手細胞(NK cell)。
在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是造血幹細胞或造血前驅細胞。
在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是自體細胞。
在某些例示性實施例中，經修飾的細胞衍生自人類。
在某些例示性實施例中，經修飾的T細胞衍生自人類。
另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，包括一第一核酸序列，其編碼一嵌合抗原受體(CAR)，CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域；以及一第二核酸序列，其編碼一顯性負受體及/或一轉換受體。
在某些例示性實施例中，第一核酸序列包括SEQ ID NO：106、108、110、112、114、210、212中任一者所示的核酸序列。
在某些例示性實施例中，第二核酸序列包括SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、214或216中任一者所示的核酸序列。
在某些例示性實施例中，第一核酸序列與第二核酸序列被一連接子所分離。
在某些例示性實施例中，連接子包括編碼一內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)的核酸序列。
在某些例示性實施例中，連接子包括編碼一自我剪切肽(self-cleaving peptide)的核酸序列。
在某些例示性實施例中，自我剪切肽是一2A肽。
在某些例示性實施例中，2A肽是選自於豬鐵士古病毒-1 2A(porcine teschovirus-1 2A，P2A)、明脈扁刺蛾病毒2A(Thoseaasigna virus 2A，T2A)、馬鼻炎A病毒2A(equine rhinitis A virus 2A，E2A)及口蹄疫病毒2A(foot-and-mouth disease virus 2A，F2A)所組成的群組。
在某些例示性實施例中，2A肽是T2A。
在某些例示性實施例中，2A肽是F2A。
在某些例示性實施例中，分離的核酸從5’至3’包括第一核酸序列、連接子及第二核酸序列。
在某些例示性實施例中，分離的核酸從5’至3’包括第二核酸序列、連接子及第一核酸序列。
另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，包括一第一核酸序列，其編碼一嵌合抗原受體(CAR)，CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，第一核酸序列包括SEQ ID NO：180、15、27、39、51或63中任一者所示的核酸序列；以及一第二核酸序列，其編碼一顯性負受體及/或一轉換受體，第二核酸序列包括SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、214或216中任一者所示的核酸序列。
另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，包括一第一核酸序列，其編碼一嵌合抗原受體(CAR)，CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，第一核酸序列包括SEQ ID NO：180所示的核酸序列；以及一第二核酸序列，其編碼一顯性負受體及/或一轉換受體，第二核酸序列包括SEQ ID NO：116所示的核酸序列。
在某些例示性實施例中，第一核酸序列與第二核酸序列被一連接子所分離，連接子包括編碼T2A的核酸序列。
在某些例示性實施例中，第一核酸序列與第二核酸序列被一連接子所分離，連接子包括編碼F2A的核酸序列。
另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，包括SEQ ID NO：152至168、210、212及217至226中任一者所示的核酸序列。
另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，包括一編碼一雙特異性抗體的核酸序列，核酸序列為SEQ ID NO：130、132、134、136或138中任一者所示。
另一方面，本發明提供了一種表現構築體(expression construct)，包括一如前述實施例中任一實施例所述之分離的核酸。
在某些例示性實施例中，表現構築體是一病毒載體(viral vector)，病毒載體選自於反轉錄病毒載體(retroviral vector)、慢病毒載體(lentiviral vector)、腺病毒載體(adenoviral vector)及腺相關病毒載體(adeno-associated viral vector)所組成的群組。
在某些例示性實施例中，表現構築體是一慢病毒載體。
在某些例示性實施例中，慢病毒載體更包括一EF-1α啟動子。
在某些例示性實施例中，慢病毒載體更包括一rev反應元件(rev response element，RRE)。
在某些例示性實施例中，慢病毒載體更包括一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)。
在某些例示性實施例中，慢病毒載體更包括一cPPT序列。
在某些例示性實施例中，慢病毒載體更包括一EF-1α啟動子、一rev反應元件(RRE)、一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)及一cPPT序列。
在某些例示性實施例中，慢病毒載體是自我去活化慢病毒載體(self-inactivating lentiviral vector)。
另一方面，本發明提供了一種用於產生如前述實施例中任一實施例所述之經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括將如前述實施例中任一實施例所述之核酸、或如前述實施例中任一實施例所述之表現構築體中的一或多種引入免疫細胞中。
另一方面，本發明提供了一種在有需要的一個體中治療癌症的方法，該方法包括向個體施用治療有效量的一組成物，組成物包括如前述實施例中任一實施例所述之經修飾的免疫細胞。
在某些例示性實施例中，該方法更包括向個體施用一淋巴球清除性化療(lymphodepleting chemotherapy)。
在某些例示性實施例中，淋巴球清除性化療包括向個體施用治療有效量的環磷醯胺及/或氟達拉濱(fludarabine)。
另一方面，本發明提供了一種在有需要的一個體中治療攝護腺癌的方法。該方法包括向個體施用一淋巴球清除性化療，淋巴球清除性化療包括向個體施用治療有效量的環磷醯胺以及經修飾的T細胞。經修飾的T細胞包括一嵌合抗原受體(CAR)，CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；及一顯性負受體包括SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種在有需要的一個體中治療轉移性去勢抵抗攝護腺癌(metastatic castrate resistant prostate cancer)的方法。該方法包括向個體施用一淋巴球清除性化療，淋巴球清除性化療包括向個體施用治療有效量的環磷醯胺；以及向個體施用一經修飾的T細胞，經修飾的T細胞包括一嵌合抗原受體(CAR)，CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；及一顯性負受體包括SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
從以下結合附圖對例示性實施例的詳細描述，將更全面地理解本發明的前述特徵和優點。應當理解的是，本發明不限於圖式中實施例所示的明確安排及手段。
圖1A顯示在瓊脂糖凝膠上分辨使用經純化的IVT PSMA RNA CAR和全長PSMA RNA的結果。
圖1B顯示了使用經純化的PSMA RNA CAR電穿孔到ND444 T細胞中並透過流式細胞儀檢測CAR表現的結果。平均螢光強度標記在圖下方。
圖1C顯示了PSMA的表現。將經純化的全長PSMA RNA電穿孔到Nalm6或K562細胞中(中圖和右圖)。透過流式細胞儀檢測PSMA的表現。
圖1D顯示了使用組合的PC3.PSMA單細胞殖株的結果。用PC3.PSMA細胞進行有限稀釋(左圖)，分離出7個單菌落並合併為新細胞株PC3.PSMA.7SC(右圖)。透過流式細胞術檢測PSMA的表現。
圖2A顯示使用各種PSMA RNA CAR與腫瘤細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選(gate)。
圖2B顯示使用各種PSMA RNA CAR與腫瘤細胞一起培養並依據CTL測定螢光素酶的結果。結果顯示為殺傷百分比，其是以在沒有T細胞的情況下僅具有腫瘤的孔中所檢測出的螢光素酶活性為基準。
圖2C顯示了使用各種PSMA RNA CAR和與腫瘤細胞一起培養並進行ELISA測定的結果。(IL-2，左圖；IFN-γ，右圖)。
圖3A顯示使用PSMA Lenti CAR構築並轉導到初代人類T細胞中的結果(MOI=3)。在第8天透過流式細胞儀檢測CAR表現。
圖3B顯示使用各種PSMA Lenti CAR與或不與腫瘤細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選。圖中顯示第12天的結果。
圖3C顯示使用各種PSMA Lenti CAR與腫瘤細胞一起培養並依據CTL測定螢光素酶的結果。結果顯示為殺傷百分比，其是以在沒有T細胞的情況下僅具有腫瘤的孔中所檢測出的螢光素酶活性為基準。圖中顯示第12天的結果。
圖3D顯示了使用各種PSMA Lenti CAR與PC3或PC3.PSMA細胞一起培養並進行ELISA測定的結果(IL-2，左圖；IFN-γ，右圖)。圖中顯示第12天的結果。
圖4A顯示透過F2A將轉換受體PD1*PTM.CD28或PD1.CD28連接到各個人類的PSMA Lenti CAR並轉導進入初代人類T細胞的結果。在第12天透過流式細胞儀檢測PD1和CAR的表現。
圖4B顯示透過T2A將顯性負(dn)轉化生長因子β受體II(TGFRβII)序列連接到各個人類PSMA Lenti CAR的結果。在第7天透過流式細胞儀分析經Dn-TGFRβII-PSMA CAR轉導的T細胞。
圖4C顯示使用各種量的純化全長PDL1 RNA電穿孔到PC3.PSMA細胞中並在第13天透過流式細胞儀檢測的PDL1表現的結果。
圖4D顯示使用各種PSMA Lenti CAR與以PC3.PSMA或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選。圖中顯示了第14天的結果。
圖4E顯示使用各種PSMA Lenti CAR與以PC3.PSMA或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選。圖中顯示了第14天的結果。
圖4F顯示使用各種PSMA Lenti CAR與以PC3.PSMA或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選。圖中顯示了第14天的結果。
圖4G顯示使用各種PSMA Lenti CAR與以PC3.PSMA或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選。圖中顯示了第14天的結果。
圖4H顯示使用各種PSMA Lenti CAR與PC3.PSMA細胞一起培養並依據CTL測定螢光素酶的結果。結果顯示為殺傷百分比，其是以在沒有T細胞的情況下僅具有腫瘤的孔中所檢測出的螢光素酶活性為基準。
圖4I顯示了使用各種PSMA Lenti CAR與以PC3.PSMA或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞一起培養並進行ELISA測定的結果。(IL-2，上圖；IFN-γ，下圖)。
圖5A顯示透過F2A將轉換受體PD1.CD28連接到各個人類的PSMA Lenti CAR並轉導進入初代人類T細胞的結果。透過流式細胞儀檢測PD1和CAR的表現。
圖5B顯示透過T2A將顯性負(dn)TGFRβII序列連接到各個人類2A10 PSMA Lenti CAR的結果。透過流式細胞儀分析CAR轉導的T細胞。
圖5C顯示使用各種PSMA Lenti CAR與PC3.PSMA.7SC細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選。
圖5D顯示使用各種PSMA Lenti CAR與以PDL1電穿孔的PC3.PSMA.7SC細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選。
圖5E顯示使用各種P5MA Lenti CAR與腫瘤細胞一起培養並依據CTL測定螢光素酶的結果。結果顯示為殺傷百分比，其是以在沒有T細胞的情況下僅具有腫瘤的孔中所檢測出的螢光素酶活性為基準。
圖5F顯示了使用各種PSMA Lenti CAR與以PC3、PC3.PSMA.7SC或PDL1電穿孔的PC3.PSMA.PDL1細胞一起培養並進行ELISA測定的結果。(IL-2，上圖；IFN-γ，下圖)。
圖5G顯示了使用定量PCR分析PSMA表現的結果。以Nalm6.CBG細胞將倍數變化(△△CT)標準化。縮寫參見表1。
圖5H顯示使用各種PSMA Lenti CAR與腫瘤細胞或初代人類細胞一起培養並進行CD107a測定的結果。細胞透過CD3圈選。
圖5I顯示了來自圖5H所示實驗的定量數據。HSAEpC：人類小氣道上皮細胞。HPMEC：人類肺微血管內皮細胞。
圖5J顯示了使用各種PSMA Lenti CAR與初代人類細胞一起培養並進行ELISA測定的結果。(IL-2，左圖；IFN-γ，右圖)。HREpC：人類腎上皮細胞。HSAEpC：人類小氣道上皮細胞。HPMEC：人類肺微血管內皮細胞。
圖5K顯示使用以叩頭蟲(click beetle)轉導的2 x 106個PC3.PSMA.7SC細胞並注射到小鼠(i.v)體內的結果。在27天後，將2 x 106個PSMA CAR-T陽性轉導的T細胞注射到攜帶腫瘤的小鼠(i.v.)中。活體分子影像(Bioluminescence imaging，BLI)在多個時間點進行。上圖的平均發光強度的最小值為5 x 105；下圖的平均發光強度的最小值為3 x 105。
圖5L顯示了圖5K的平均發光強度的定量結果。
圖6是dn-TGFRβII PSMA CAR構築體和pTRPE的構築圖譜(construct map)的示意圖。
圖7顯示了單獨用2F5 PSMA CAR(2F5 ICOS)轉導到T細胞或將2F5 PSMA CAR與各種轉換受體一起轉導到T細胞中，經轉導的T細胞的CAR表現的流式細胞儀分析結果。
圖8顯示了單獨用2F5 PSMA CAR(2F5 ICOS)轉導到T細胞或將2F5 PSMA CAR與各種轉換受體一起轉導到T細胞中，經轉導的T細胞的PD1及Tim3表現的流式細胞儀分析結果。
圖9顯示單獨用2F5 PSMA ICOS-CAR(ICOS)、PSMA 41BB-CAR(41BB)轉導到T細胞或將2F5 PSMA CAR與各種轉換受體一起轉導到T細胞中，經轉導的T細胞的CD107a的表現圖。UTD表示未轉導。
圖10顯示單獨用2F5 PSMA ICOS-CAR(ICOS)、PSMA 41BB-CAR(41BB)轉導到T細胞或將2F5 PSMA CAR與各種轉換受體一起轉導到T細胞中，經轉導的T細胞的顆粒酶B的表現圖。UTD表示未轉導。
圖11A顯示單獨用2F5 PSMA ICOS-CAR(ICOS)、PSMA 41BB-CAR(41BB)轉導到T細胞或將2F5 PSMA CAR與各種轉換受體一起轉導到T細胞中，經轉導的T細胞的IL-2分泌量的圖。NTD表示未轉導。
圖11B顯示單獨用2F5 PSMA ICOS-CAR(ICOS)、PSMA 41BB-CAR(41BB)轉導到T細胞或將2F5 PSMA CAR與各種轉換受體一起轉導到T細胞中，經轉導的T細胞的IFNγ分泌量的圖。UTD表示未轉導。
圖12A顯示將攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後成像所獲得的生物發光的定量圖。
圖12B顯示將攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後成像所獲得的生物發光的定量圖。
圖13顯示攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後的腫瘤尺寸圖。
圖14A顯示將攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後成像所獲得的生物發光的定量圖。
圖14B顯示將攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後成像所獲得的生物發光的定量圖。
圖14C顯示將攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後成像所獲得的生物發光的定量圖。
圖14D顯示將攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後成像所獲得的生物發光的定量圖。
圖14E顯示將攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後成像所獲得的生物發光的定量圖。
圖14F顯示將攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠以經轉導的T細胞進行處理後成像所獲得的生物發光(左)及腫瘤尺寸(右)的定量圖。
圖14G是將如前所示的經轉導的T細胞按照腫瘤控制能力的順序從上到下列於表中。ICOSYMNM優於WT ICOS。當與ICOSz或ICOSzYMNM一起使用時，PD1*BB優於PD1*CD28。
圖15A顯示CART-PSMA-TGFβRdn細胞(dnTGFBR2-T2A-Pbbz)在42天共培養並用表現PSMA的腫瘤細胞重複刺激(箭頭)後，其相對於CART-PSMA(Pbbz)顯示出增強的抗原特異性增生的圖。CD19-BBz CART(19bbz)和經轉導的T細胞(空白組)作為控制組。
圖15B顯示CART-PSMA-TGFβRdn細胞(dnTGFBR2-T2A-Pbbz)、CART-PSMA細胞(Pbbz)及作為控制組的未經轉導的細胞(空白組)在與T細胞注射後27天內在攜帶腫瘤小鼠中檢測到的平均發光強度的圖。
圖15C顯示每週進行生物發光成像(BLI)評估的腫瘤的位置和系統負擔的照片。
圖16顯示在第1期臨床試驗中使用的研究方案。
圖17顯示在受試者中透過CART-PSMA-TGFβRdn DNA的qPCR評估CAR-T細胞動力學的圖。受試者32816-02、-04及-05在組別1中，受試者32816-06、-07和-08在組別2中。
圖18A顯示發炎性細胞激素(IL-6、IL-15、IL-2、IFNγ)和鐵蛋白顯著增加的圖，其與受試者32816-06中的3級細胞激素釋放症候群(cytokine release syndrome)的事件相關。
圖18B顯示發炎性細胞激素(IL-6、IL-15、IL-2、IFNγ)和鐵蛋白顯著增加的圖，其與受試者32816-07中的3級細胞激素釋放症候群的事件相關。
圖19顯示組別1和組別2患者中的攝護腺特異性抗原(PSA)反應的圖。
圖20A顯示受試者32816-07中PSMA-TGFβRDN CART的表現(左側y軸，基因體DNA拷貝數/ug)和IL-6的水平(右側y軸，pg/ml)，指出在輸注後一天在受試者中表現出細胞激素釋放症候群。
圖20B顯示細胞激素釋放症候群管理伴隨短暫PSA降低的圖，其透過C-反應蛋白(CRP；左側y軸，mg/L)水平和血清鐵蛋白水平(右側y軸，ng/L)進行測量。
圖21顯示在各個受試者中隨時間檢測的PSMA陽性循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)的數量的圖。
本發明提供了經修飾的免疫細胞的組成物和方法，例如T細胞和NK細胞，或其前驅細胞，例如經修飾的T細胞，其包括嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR包含攝護腺特異性膜抗原(PSMA)結合域(PSMA-CAR)，並且對標靶細胞(例如攝護腺癌細胞)的PSMA具有親和力。在一些實施例中，經修飾的免疫細胞包括PSMA-CAR，其包括鼠類PSMA結合域。在一些實施例中，經修飾的免疫細胞包括PSMA-CAR，其包括人類PSMA結合域。本發明還提供了產生前述基因改造的細胞的方法。在一些實施例中，細胞和組成物可用於過繼性細胞療法(adoptive cell therapy)，例如過繼性腫瘤免疫療法。
在一些實施例中，本發明所提供的免疫細胞包括額外的受體，例如顯性負受體及/或轉換受體，以增強免疫細胞在腫瘤微環境中的功效。前述細胞能夠改變或減少腫瘤微環境中免疫抑制訊號的作用。本發明的經修飾的免疫細胞抵消了可以負面控制T細胞活化和T細胞功能的抑制劑受體或配體的上調及/或表現。舉例來說，在T細胞上及/或腫瘤微環境中的某些免疫檢查點蛋白(例如PD-1或PD-L1)的表現可以降低過繼性T細胞療法的效力和功效。例如，在T細胞上及/或腫瘤微環境中TGF-β的表現可降低過繼性T細胞療法的效力和功效。在過繼性細胞療法的背景下，前述免疫抑制訊號可能會損害某些所需的效用功能(effector function)。腫瘤微環境中的腫瘤細胞及/或細胞通常上調免疫抑制蛋白，例如PD-L1、傳遞免疫抑制訊號。前述免疫抑制蛋白也可以在腫瘤微環境中的T細胞上被上調，例如在腫瘤浸潤性T細胞上，這可以發生在透過抗原受體或某些其他活化訊號發出訊號後。前述事件可能有助於基因改造免疫細胞(例如，靶向PSMA)T細胞獲得耗竭的表型，例如當存在於表 現前述蛋白質的其他細胞附近時，這反過來可導致功能降低。因此，本發明的經修飾的免疫細胞解決了T細胞衰竭及/或缺乏T細胞持久性(persistence)的問題，這是傳統過繼性細胞療法的功效和治療結果的障礙。
本發明包括PSMA CAR及其在治療癌症中的用途。在某些實施例中，本發明包括具有顯性負受體及/或轉換受體的人類PSMA CAR。癌症免疫療法的主要障礙之一是腫瘤微環境。免疫抑制分子(例如PD-1)的上調負調控了T細胞的活性。
本發明基於以下研究結果：包括PSMA-CAR和顯性負受體及/或轉換受體的T細胞能夠繞過腫瘤微環境中免疫抑制分子的作用，提供持續且有效的抗腫瘤活性。
應當理解的是，本文中描述的方法不限於本文公開的特定方法和實驗條件，因為前述方法和條件都是可以改變的。還應當理解的是，本文使用的術語僅用於描述特定實施例，而非對本發明的限制。
此外，除非另有說明，本文所述的實驗使用本領域技術範圍內的習知分子和細胞生物學和免疫學技術。前述技術是技術人員所熟知的，並且已在文獻中有充分的解釋。參見，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，including all supplements，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第四版)，其由MR Green和J.Sambrook和Harlow等人所著、Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(2013，第2版)。
A.定義
除非另外定義，否則所有本文使用的技術和科學術語的涵義，通常與本發明所屬技術領域的通常知識者所能理解的相同。如果存在任何潛在的歧義，本文提供的定義優先於任何字典或外來的定義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，複數術語應包括單數。除非另有說明，否則「或」的使用意味著「及/或」。術語「包括」以及例如「包含」和「具有」之類的其他形式的用語非限制性的。
通常，本文所述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生 物學、遺傳學及蛋白質和核酸化學和雜交結合使用的命名法是本領域公知且常用的。本文提供的方法和技術通常根據本領域熟知的常規方法進行，並且如在整個本說明書中引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻中所述，除非另有說明。酶促反應和純化技術是根據製造商的說明書進行的，如本領域通常實現的或如本文中所述的。本文所述的分析化學、合成有機化學以及藥物和藥物化學相關的術語和實驗室程序和技術是本領域公知且常用的。標準技術用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及患者的治療。
以下定義所選擇的術語可以更容易地理解本發明。
如本文所使用的，「一」及「一種」是指一個或多於一個(即至少一個)的物體。舉例來說，「一元件」是指一個元件或多於一個元件。
當涉及例如量、持續時間等可測量值時，術語「約」意味著包括距離特定值±20%或±10%的變化範圍、更優選地為±5%、甚至更優選地為±1%、還更優選地為±0.1%，只要此種變化程度適合用於執行本文所揭露的方法。
如本文所使用的，術語「活化」在T細胞方面是指，其已經充分刺激而被誘發出細胞增生的狀態。活化還與細胞激素(cytokine)的誘導產生有關，並使其產生可檢測的效用功能(effector function)。術語「活化的T細胞」表示正在進行細胞分裂的T細胞。
如本文所使用的，術語「減輕」疾病是指著降低該疾病的一或多種症狀的嚴重程度。
如本文所用的，術語「抗體」是指與抗原特異性結合的免疫球蛋白分子。抗體可以是衍生自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白，並且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應性部分(例如抗體的結合片段)。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚體。本發明中的抗體可以以多種形式存在，包括例如多株抗體、單株抗體、Fv、Fab及F(ab)2，以及單鏈抗體(scFv)及人源化抗體(Harlow等人，1999，In：Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow等人，1989，In：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988，Science 242：423-426)。
術語「抗體片段」是指完整抗體的一部分，並且是指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、scFv抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。
如本文所使用的，「抗體重鏈」是指於抗體分子的天然構形中，兩種多肽鏈中較大的那一個。
如本文所使用的，「抗體輕鏈」是指抗體分子的天然構形中，兩種多肽鏈中較小的那一個。α和β輕鏈，是兩種主要的抗體輕鏈同型。
如本文所使用的，術語「合成抗體」是指使用重組DNA技術產生的抗體，例如本文所述的由噬菌體所表現的抗體。該術語還應該解釋為，透過合成方式，編碼有抗體的DNA分子所產生的抗體，並且該DNA分子會表現抗體蛋白質或指定抗體的胺基酸序列，可以使用本領域所習知的合成DNA或胺基酸序列技術來獲得DNA或胺基酸序列。
如本文所使用的，術語「抗原」或「Ag」被定義為會引起免疫反應的分子。這種免疫反應可能涉及抗體產生，或特定的免疫活性細胞的活化，或兩者皆有。本領域技術人員能夠理解，任何大分子，包括幾乎所有的蛋白質或肽，都可以作為抗原。
此外，抗原可以衍生自重組或基因體DNA。本領域技術人員能夠理解，任何DNA，包含編碼有會引發免疫反應之蛋白的核苷酸序列或其部分序列的DNA，其係編碼有如本文使用的術語「抗原」。此外，本領域技術人員能夠理解，抗原不需要由整段基因的核苷酸序列來編碼。很明顯地，本發明包括但不限於使用多於一個基因的部分核苷酸序列，而這些核苷酸序列係以各種方式進行組合排列，以引起所需的免疫反應。再者，本領域技術人員能夠理解抗原不需要由一「基因」所編碼。很明顯地，抗原可以是以合成方式產生或從生物樣品中獲得。這樣的生物樣品可以包括但不限於組織樣品、腫瘤樣品、細胞、或生物流體。
如本文所使用的，術語「自體的」是指源自同一個體的任何物質，其隨後被重新引入該個體中。術語「同種異體」是指源自相同物種但不同動物體的任何物質。「異種」是指源自不同物種的動物的任何物質。
如本文所使用的，術語「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」或「CAR」是指人工的T細胞受體，其係經改造以表現在免疫細胞上，並與抗原產生專一性結合。CAR可用於過繼性細胞轉移療法。從患者體內取出T細胞並進行修飾，使其表現對抗原或特定形式抗原具有專一性的受體。在一些實施例中，CAR對選定的目標具有專一性，例如表現攝護腺特異性膜抗原的細胞。CAR還可以包含胞內活化域、跨膜域和胞外域。胞外域包含抗原結合區。
如本文所使用的，術語「共刺激配體」包括在抗原呈現細胞(例如，人造抗原呈現細胞(aAPC)、樹突細胞、B細胞等)上的分子，該分子係專一性結合到同源共刺激分子，而該同源共刺激分子在T細胞上。除了例如由TCR/CD3複合體與裝載有肽的MHC分子進行結合所提供的主要訊號之外，該共刺激配體與其同源共刺激分子的結合也提供介導T細胞反應的訊號，所述T細胞反應包括但不限於增殖、活化、分化等。共刺激配體可包括但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L，誘導型共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏著分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配體受體的促效劑或抗體、以及與B7-H3專一性結合的配體。共刺激配體更包括與T細胞上存在的共刺激分子專一性結合的抗體，例如但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及與CD83專一性結合的配體。
術語「共刺激分子」是指T細胞上的同源結合配偶體，其專一性地與共刺激配體結合，從而介導T細胞的共刺激反應，例如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於MHC第I型分子、BTLA和Toll配體受體。
如本文所使用的，術語「共刺激訊號」是指與主要訊號(例如TCR/CD3連接)搭配的訊號，兩者共同導致T細胞增生及/或關鍵分子的上調或下調。
「疾病(disease)」是動物無法維持體內恆定的健康狀態，且如 果疾病沒有改善則該動物的健康狀態會繼續惡化。相反地，動物的「病症(disorder)」是指動物能夠維持體內恆定的健康狀態，但該動物的健康狀態不如沒有病症時的那樣良好。如果不及時治療，病症並不一定會導致動物的健康狀態進一步變差。
如本文所使用的，術語「下調」是指減少或剔除一或多種基因的表現。
如本文所使用的，術語化合物的「有效量」或「治療有效量」是指如本文所述的化合物、調配物、材料或組成物的劑量，能有效實現特定的生物學結果、提供治療，或預防的益處。前述結果可包括但不限於當投予至哺乳動物時，與不存在本發明組成物時所檢測到的免疫反應相比，該組成物的量可引起可檢測程度的免疫抑制反應或免疫耐受反應。免疫反應可以容易地以許多本領域所認可的方法加以評估。本領域技術人員能夠理解，本文所施用的組成物其量的變化可以基於許多因素所決定，例如所治療的疾病或病症、所治療的哺乳動物的年齡、健康狀況、身體狀況、疾病的嚴重程度以及所給予的特定化合物等。
「編碼」是指多核苷酸中特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性。其在生物過程中用作合成其他具有確定核苷酸序列(即，rRNA、tRNA及mRNA)或確定胺基酸序列的聚合物和大分子的模板，該些聚合物和大分子會具有相應的生物學特性。因此，在細胞或其他生物系統中，如果對應於一基因的mRNA轉錄和轉譯產生一蛋白質，則該基因編碼該蛋白質。編碼股(其核苷酸序列與mRNA序列相同並且通常顯示在序列表中)與非編碼股(係用作基因或cDNA轉錄的模板)均可被稱為編碼蛋白質或該基因或cDNA的其他產物。
如本文所使用的，術語「內源」是指來自生物體、細胞、組織或系統的任何物質，或在生物體、細胞、組織或系統內部所產生的任何物質。
如本文所使用的，術語「表位」定義為抗原上的小化學分子，其可引發免疫反應，誘發B及/或T細胞反應。抗原可具有一或多個表位。大多數抗原具有多個表位。亦即，該些抗原是多價的。通常，表位的大小約為10個 胺基酸及/或糖。優選地，表位為約4至18個胺基酸，更優選地約5至16個胺基酸，甚至更優選地為6至14個胺基酸，更優選地約7至12個胺基酸，最優選地約8至10個胺基酸。本領域技術人員能夠理解，一般來說，抗原專一性的主要條件是分子的整體三維結構，而非其特定的一維序列，因而由此區分不同表位。基於本文的揭露內容，本發明的肽可以是一表位。
如本文所使用的，術語「外源」是指從生物體、細胞、組織或系統外引入的任何物質，或從生物體、細胞、組織或系統外所產生的任何物質。
如本文所使用的，術語「擴增」是指數量增加，例如T細胞數量的增加。在一實施例中，離體擴增的T細胞數量相對於其於培養基中的初始數量有所增加。在另一實施例中，相對於培養基中的其他細胞，離體擴增的T細胞其數量有所增加。如本文所使用的，術語「離體(ex vivo)」是指已經從活體(例如人類)中移出，並在體外繁殖的細胞(例如，在培養皿、試管或生物反應器中)。
如本文所使用的，術語「表現」定義為特定核苷酸序列藉由其啟動子所驅動的轉錄及/或轉譯。
「表現載體」是指包括重組多核苷酸的載體，前述重組多核苷酸包括與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。表現載體包含有順式作用元件(cis-acting element)，且其數量足以進行表現。其他用於表現的元件可以由宿主細胞提供或在體外表現系統中提供。表現載體包括本領域已知的所有類型，例如黏接質體(cosmid)、質體(例如裸露的質體或包含在微脂體中的質體)及併入重組多核苷酸的病毒(例如，仙台病毒(Sendai viruses)、慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
非人類(例如鼠類)抗體的「人源化」形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合序列)，其含有來自非人類免疫球蛋白的最小序列。在大多數情況下，人源化抗體是人類免疫球蛋白(接受者(recipient)抗體)，其中來自接受者的互補決定區(CDR)的殘基被來自非人類物種(給予者(donor)抗體)例如小鼠、大鼠或兔子的CDR的殘基取代，其具有所需的特異性，親和力及能力。在一些情況 下，人類免疫球蛋白的Fv框架區(framework region，FR)殘基被對應的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可包括既不在接受者抗體中也不在導入的CDR或框架序列中的殘基。進行這些修飾以進一步改進和優化抗體性能。通常，人源化抗體將包括基本上至少一個的全部，通常是兩個可變域，其中全部或基本上全部的CDR區對應於非人類免疫球蛋白和全部或基本上全部的人類免疫球蛋白的FR區。人源化抗體還可以包括免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分，通常是人類免疫球蛋白的恆定區。有關進一步的細節，請參見Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Reichmann等人，Nature,332：323-329,1988；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596,1992。「完全人類」是指免疫球蛋白，例如抗體或其結合片段，其中整個分子是人源的或由與人類抗體形式相同的胺基酸序列組成的。
如本文所使用的，術語「免疫球蛋白」或「Ig」定義為一類蛋白質，其具有抗體的作用。此類蛋白質中包括五個成員IgA、IgG、IgM、IgD及IgE。IgA是存在於體內分泌物中的一級抗體，例如唾液、淚液、母乳、胃腸分泌物和呼吸道及泌尿生殖道的黏液分泌物。IgG是最常見的循環抗體。IgM是大多數受試者在初級免疫反應中產生的主要免疫球蛋白。其為凝集、補體結合和其他抗體反應中最有效的免疫球蛋白，並且在防禦細菌和病毒方面是很重要的。IgD是免疫球蛋白，其沒有已知的抗體功能，但可以作為抗原受體。IgE是免疫球蛋白，其透過在暴露於過敏原時從肥大細胞和嗜鹼性球釋放介質而介導即發性過敏反應。
如本文所使用的，術語「同一性(identity)」是指兩個聚合分子之間的次單元序列同一性(identity)，特別是在兩個胺基酸分子之間，例如兩個多肽分子之間。當兩個胺基酸序列的相同位置具有相同的殘基時，例如，若兩個多肽分子中的一位置都被精胺酸所佔據一則它們在該位置是具有同一性的。兩個胺基酸序列在相同比對位置中相同殘基的同一性或箱同程度通常以百分比進行表示。兩個胺基算序列之間的同一性是匹配或相同位置量的直接函數。舉例來說，如果兩個序列中有一半位置(例如，長度為10個次單元的胺基酸聚合物中有5個位置)是相同的，則這兩個序列的同一性為50%；如果90%的位置(例如10個中有9個)是匹配的或相同，則兩個序列的同一性為90%。
如本文所使用的，術語「免疫反應」定義為對於抗原的細胞反應，這種反應發生在淋巴細胞將抗原性分子鑑定為外來物並誘發抗體形成及/或活化淋巴球以除去抗原時。
如本文所使用的，術語「免疫抑制」是指總體免疫反應的降低。
「分離的」是指從自然狀態改變或移除。舉例來說，自然存在於活體動物中的核酸或肽即不屬於「分離的」，但是與其自然狀態下的共存物質部分或完全分離開來的相同核酸或肽，即屬於「分離的」。分離的核酸或蛋白質可以純化的形式存在，或者可以存在於非自然環境中，例如宿主細胞內。
如本文所使用的，術語「慢病毒(lentivirus)」是指反轉錄病毒科的一個屬。慢病毒屬於反轉錄病毒中獨特的一種類，因其能感染非分裂細胞。它們可以將大量遺傳訊息傳遞到宿主細胞的DNA中，因此是基因傳遞載體中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒。衍生自慢病毒的載體提供了在體內實現顯著水平基因轉移的手段。
如本文所使用的，術語「經修飾的」是指本發明的分子或細胞狀態或結構的改變。分子可以以多種方式進行修飾，包括以化學上地、結構上地和功能上地方式來進行。細胞可以藉由引入核酸來進行修飾。
如本文所使用的，術語「調節」，是指相較於沒有治療或化合物的個體及/或在其他方面相同但未經治療的個體，在受試者中介導了可檢測程度的增加或減少的反應。該術語包括擾亂及/或影響天然訊號或反應，從而介導受試者(優選地為人類)的有益治療反應。
在本文中，以下列縮寫來表示常見的核酸鹼基。「A」是指腺苷、「C」是指胞嘧啶、「G」是指鳥苷、「T」是指胸苷、「U」是指尿苷。
除非另有說明，否則「編碼一胺基酸序列的核苷酸序列」包括所有編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列以及該等核苷酸序列之簡併形式。編碼蛋白質或RNA的片語「核苷酸序列」也可包括內含子，以至於編碼蛋白質的核苷酸序列在某些形式中可含有內含子。
術語「可操作地連接」或「可操作的連接」是指調節序列和異種的核酸序列之間的功能性連接，導致後者的表現。例如，當第一核酸序列與第 二核酸序列處於功能性關係時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表現，則啟動子與編碼序列可操作地連接。
如本文所使用的，術語「多核苷酸」定義為核苷酸鏈。此外，核酸是指核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領域技術人員能夠理解核酸是多核苷酸，其可以水解成單體「核苷酸」。單體核苷酸可以水解成核苷。如本文所使用的，多核苷酸包括但不限於透過本領域可用的任何方法獲得的所有核酸序列，該些方法包括但不限於重組方法及合成方法。重組方法係即使用傳統選殖(cloning)技術及PCR等方式從重組文庫或細胞基因體進行選殖以獲得核酸序列。
如本文所使用的，術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可互換使用，並且指由透過肽鍵共價連接的胺基酸殘基所組成的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且不限制蛋白質或肽序列可包含的胺基酸的最大數量。多肽包括任何肽或蛋白質，其包括透過肽鍵彼此連接的兩個或更多個胺基酸。如本文所使用的，該術語是指短鏈，其在本領域中通常也稱為肽、寡肽及寡聚物；例如較長的鏈，其在本領域通常稱為蛋白質，其中有很多種類。「多肽」包括，例如，生物活性片段、實質上同源的多肽(substantially homologous polypeptides)、寡肽、同二聚體(homodimers)、異二聚體(heterodimers)、多肽變異體(variants)、經修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
如本文關於抗體所使用的術語「專一性結合」是指辨識特定抗原但基本上不辨識或結合樣品中的其他分子的抗體。例如，專一性結合來自一個物種抗原的抗體，也可以與來自一或多個物種的該抗原結合。但是，這種跨物種反應性本身並不會改變抗體為專一性的分類。在另一個實例中，專一性結合至一抗原的抗體，也可以結合至該抗原的不同等位基因形式。然而，這種交叉反應性本身並不會改變抗體為專一性的分類。在一些情況下，術語「專一性結合」或「特異性結合」可用於指稱抗體、蛋白質或肽與第二化學物質間的相互作用，以表示該相互作用係取決於該化學物質上存有特定結構(例如，抗原決 定位(antigenic determinant)或表位(epitope))。舉例來說，抗體通常辨識並結合至蛋白質的特定結構而不是通常的蛋白質。如果抗體對表位「A」具有專一性，則在有標記的「A」和抗體的反應中，存在有表位A(或游離的，未標記的A)分子時，則有標記的A與抗體的結合量將會降低。
術語「刺激」是指透過刺激分子(例如，TCR/CD3複合體)與其同源配體的結合所誘導的初級反應，進而介導訊息傳遞事件，例如但不限於透過TCR/CD3複合體所介導的訊息傳遞。刺激可以介導某些分子的表現改變，例如TGF-β的下調及/或細胞骨架結構的重組等。
如本文所使用的，術語「刺激分子」是指T細胞上的分子，其係專一性結合至抗原呈現細胞上的同源刺激配體。
如本文所使用的，術語「刺激配體」是指當存在於抗原呈現細胞(例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等)上時，該配體可以專一性結合至T細胞上的同源結合配偶體(請參考本文中「刺激分子」的描述)，從而介導T細胞的初級反應，包括但不限於活化、免疫反應的引發、增生等。刺激配體是本領域習知的，並且，特別是包括載有肽的MHC第I型分子、抗CD3抗體、抗CD28抗體的超級促效劑、及抗CD2抗體的超級促效劑。
術語「受試者」是指包括可以被引發免疫反應的活體(例如哺乳動物)。如本文所使用的，「受試者」或「患者」可以是人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如綿羊、牛、豬、犬科動物、貓科動物和鼠類哺乳動物。優選地，受試者是人類。
「標靶位」或「標靶序列」是指基因體核酸序列，其定義出在足以發生結合的情況下會與結合分子進行專一性結合的核酸的一部分。
如本文所使用的，術語「治療」(therapeutic)意指治療處理及/或預防。治療效果係透過抑制、緩解或根除疾病狀態來獲得。
「移植物」是指待移植的生物相容性晶格(biocompatible lattice)或捐贈者組織、器官或細胞。移植的實例可包括但不限於皮膚細胞或組織、骨髓及實體器官，例如心臟、胰臟、腎臟、肺臟及肝臟。移植也可以意指任何要向宿主施用的材料。例如，移植可以意指核酸或蛋白質。
如本文所使用的，術語「轉染的(transfected)」或「轉化的(transformed)」或「轉導的(transduced)」是指將外源核酸轉移或引入宿主細胞的過程。「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」細胞是已經用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。細胞包括受試者初代細胞及其後代。
如本文所使用的，術語「治療」是指降低受試者所經歷的疾病或病症的至少一種體徵或症狀的頻率或嚴重性。
「載體」是組成物，其包括分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部。本領域已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關的多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質體或病毒。該術語還應解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、微脂體等。病毒載體的實例包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體等。
範圍：在本發明全文中，各個實施例可以以範圍的形式呈現。應該理解的是，範圍形式的描述僅僅是為了方便及簡潔，不應該被解釋為對本發明範圍的限制。因此，範圍的描述應被視為是具體公開了所有可能的子範圍以及該範圍內的單一數值。例如，從1到6的範圍的描述應該被視為具有特定公開的子範圍，例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及在該範圍內的單一及部分數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。無論何種大小的範圍皆適用。
B.嵌合抗原受體
本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如修飾的T細胞)的組成物和方法，其包含嵌合抗原受體(CAR)。因此，在一些實施例中，免疫細胞已經被基因修飾以表現CAR。本發明的CAR包含抗原結合域、跨膜域、鉸鏈域及細胞內訊息傳遞域。
抗原結合域可以與CAR的另一個域可操作地連接，例如本文其他地方描述的跨膜域或胞內域，用於在細胞中表現。在一實施例中，編碼抗原結合域的第一核酸序列與編碼跨膜域的第二核酸可操作地連接，並且進一步可 操作地連接至編碼胞內域的第三核酸序列。
本文所述的抗原結合域可以組合至任何本文所述的跨膜域、胞內域，或細胞質域、或可組合至其他任何本文所述涵括在CAR中的域。本發明的標的CAR還可包括如本文所述的間隔域。在一些實施例中，各個抗原結合域、跨膜域和胞內域係透過連接子(linker)分開。
抗原結合域
CAR的抗原結合域是CAR的胞外區，其用於結合特定的標靶抗原，包括蛋白質、碳水化合物和醣脂。在一些實施例中，CAR包括對標靶細胞上的標靶抗原的親和力。標靶抗原可包括與標靶細胞相關的任何類型的蛋白質或其表位。舉例來說，CAR可以包括對標靶細胞上的標靶抗原的親和力，其指出標靶細胞的特定疾病狀態。
在一例示性實施例中，標靶細胞抗原是攝護腺特異性膜抗原(PSMA)。PSMA是在細胞表面上表現的膜結合蛋白，據報導其在攝護腺癌組織中高度過量表現。PSMA的表現與腫瘤等級和階段的推進直接相關，並且被認為賦予攝護腺癌細胞選擇性生長優勢。因此，本發明的例示性CAR對標靶細胞上的PSMA具有親和力。
如本文所述，對標靶細胞上的特定標靶抗原具有親和力的本文的CAR，可包括有標靶專一性的結合域。在一些實施例中，標靶專一性的結合域是鼠類標靶專一性的結合域，例如，標靶專一性的結合域是鼠類來源的。在一些實施例中，標靶專一性的結合域是人類標靶專一性的結合域，例如，標靶專一性的結合域是人類來源的。在一例示性實施例中，對標靶細胞上的PSMA具有親和力的本文的CAR，可包括有PSMA結合域。在一些實施例中，PSMA結合域是鼠類PSMA結合域，例如，PSMA結合域是鼠類來源的。在一些實施例中，PSMA結合域是人類PSMA結合域，例如，PSMA結合域是人類來源的。
在一些實施例中，本文的CAR可以對一或多種標靶細胞上的一或多種標靶抗原具有親和力。在一些實施例中，CAR可以對標靶細胞上的一或多種標靶抗原具有親和力。在前述實施例中，CAR是雙特異性CAR或多特異性CAR。在一些實施例中，CAR包括一或多種標靶特異性的結合域，其賦予對一 或多種標靶抗原的親和力。在一些實施例中，CAR包含一或多種標靶特異性的結合域，其賦予對相同標靶抗原的親和力。舉例來說，包括對相同標靶抗原具有親和力的一或多個標靶特異性結合域的CAR，可以結合至標靶抗原的不同表位。當CAR中存在多個標靶特異性結合域時，該等結合域可以串聯排列並且可以透過連接子肽分開。舉例來說，在包括有兩個標靶特異性結合域的CAR中，該等結合域係透過寡肽或多肽連接子、Fc鉸鏈區或膜鉸鏈區在單個多肽鏈上共價連接。
在一些實施例中，抗原結合域選自於抗體、抗原結合片段(antigen binding fragment，Fab)及單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)所組成的群組。在一些實施例中，本發明的PSMA結合域選自於PSMA特異性抗體、PSMA特異性Fab及PSMA特異性scFv所組成的群組。在一實施例中，PSMA結合域是PSMA特異性抗體。在一實施例中，PSMA結合域是PSMA特異性Fab。在一實施例中，PSMA結合域是PSMA特異性scFv。
抗原結合域可包括結合抗原的任何域，並且可包括但不限於單株抗體、多株抗體、合成抗體，人類抗體、人源化抗體、非人類抗體和其任何片段。在一些實施例中，抗原結合域部分包括哺乳動物抗體或其片段。抗原結合域的選擇可取決於標靶細胞表面上存在的抗原的類型和數量。
如本文所使用，術語「單鏈可變片段」或「scFv」是免疫球蛋白(例如，小鼠或人類)的重鏈可變區(heavy chain，VH)和輕鏈可變區(light chain，VL)的融合蛋白，其共價連接以形成VH：VL異二聚體。重鏈(VH)和輕鏈(VL)直接連接或透過肽編碼的連接子連接，前述連接子連接VH的N端與VL的C端，或連接VH的C端與VL的N端。在一些實施例中，抗原結合域(例如，PSMA結合域)包括scFv，其從N端到C端的構型為VH-連接子-VL。在一些實施例中，抗原結合域(例如，PSMA結合域)包括scFv，其從N端到C端的構型為VL-連接子-VH。本領域技術人員能夠選擇適用於本發明的構型配置。
連接子通常富含甘胺酸以獲得可撓性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以獲得溶解性。連接子可以連接胞外抗原結合域的重鏈可變區和輕鏈可變區。 連接子的非限制性實例已公開於Shen等人，Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008)及WO2014/087010中，其內容通過引用而將其整體併入本文。各種連接子序列是本領域已知的，包括但不限於甘胺酸絲胺酸(GS)連接子，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：1)、(GGGS)n(SEQ ID NO：2)及(GGGGS)n(SEQ ID NO：3)，其中n表示至少為1的整數。例示性的連接子序列可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：4)、GGSGG(SEQ ID NO：5)、GSGSG(SEQ ID NO：6)、GSGGG(SEQ ID NO：7)、GGGSG(SEQ ID NO：8)、GSSSG(SEQ ID NO：9)、GGGGS(SEQ ID NO：10)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：11)等。本領域技術人員能夠選擇適合用於本發明的連接子序列。在一實施例中，本發明的抗原結合域(例如PSMA結合域)包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH和VL由具有胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：11)的連接子序列所分開。前述連接子序列可以由核酸序列GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT(SEQ ID NO：12)編碼。
儘管去除了恆定區並引入了連接子，但scFv蛋白仍保有原始免疫球蛋白的專一性。單鏈Fv多肽抗體可以由包含VH和VL編碼序列的核酸來表現，如Huston等人於Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85：5879-5883,1988中所述的。也請參見美國專利號5,091,513、5,132,405及4,956,778、以及美國專利公開號20050196754及20050196754。下列文獻中已經描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(參見例如，Zhao等人，Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6)：455-51、Peter等人，J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12、Shieh等人，J Imunol 2009 183(4)：2277-85、Giomarelli等人，Thromb Haemost 2007 97(6)：955-63、Fife等人，J Clin Invst 2006 116(8)：2252-61、Brocks等人，Immunotechnology 1997 3(3)：173-84、Moosmayer等人，Ther Immunol 1995 2(10：31-40))。下列文獻中已經描述了具有刺激活性的促效性scFv(參見例如，Peter等人，J Bioi Chem 2003 25278(38)：36740-7、Xie等人，Nat Biotech 1997 15(8)：768-71、Ledbetter等人，Crit Rev Immunol 1997 17(5-6)：427-55、Ho等人，BioChim Biophys Acta 2003 1638(3)：257-66)。
如本文所使用，「Fab」是指抗體結構的片段，其結合抗原但是是單價且不具有Fc部分，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗體產生兩個Fab片段和一個Fc片段(例如，重(H)鏈恆定區；不與抗原結合的Fc區)。
如本文所使用，「F(ab')2」是指透過胃蛋白酶消化完整IgG抗體產生的抗體片段，而該片段具有兩個抗原結合(ab')(二價)區，其中每個(ab')區包含兩個獨立的胺基酸鏈，各H鏈的一部分和輕鏈(L)透過S-S鍵連接以與抗原結合，且該等H鏈的剩餘部分則連接在一起。「F(ab')2」片段可以分成兩個獨立的Fab'片段。
在一些實施例中，抗原結合域可以衍生自最終前述CAR將被使用的相同物種。例如，為了要在人類中使用，CAR的抗原結合域可包括如本文所述的人類抗體或其片段。
在一例示性實施例中，本發明的PSMA-CAR包括PSMA結合域，例如PSMA特異性scFv。
(a)小鼠PSMA結合域及其變異體
在某些實施例中，本發明的PSMA-CAR包括鼠類PSMA結合域或其變異體。
在某些實施例中，本發明的PSMA-CAR包括非人類PSMA抗體(例如，小鼠或大鼠PSMA抗體)或其變異體的PSMA結合域。如本領域眾所周知的，可以透過用人類PSMA或其片段使非人類(例如小鼠)產生免疫，來產生鼠類或其他非人類抗體。
在一實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：14)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：15)。
鼠類J591 PSMA結合域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持結合至PSMA。舉例來說，在一些實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示的鼠類J591 PSMA結合域胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其包括在SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列中。
在一些實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：15所示的鼠類J591 PSMA結合域編碼序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其編碼自SEQ ID NO：15所示的核酸序列。
在一例示性實施例中，本發明的PSMA-CAR包含PSMA結合域，例如PSMA特異性scFv。在一實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：13)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：180)。
鼠類J591 PSMA結合域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持結合至人類PSMA。舉例來說，在一些實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：180所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其由SEQ ID NO：180所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包含輕鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：16)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：17)。
輕鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，在一些實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：17所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其由SEQ ID NO：17所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括NCBI GenBank序列數據庫ID：CCA78125.1中描述的輕鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：181)。
輕鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，在一些實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：181所示的胺基酸序列。鼠類J591 PSMA結合域的輕鏈可變區包括三個輕鏈互補性決定區(CDR)。如本文所使用，「互補性決定區」或「CDR」是指結合特定抗原的抗原結合分子的可變鏈區。因此，鼠類J591 PSMA結合域可包括輕鏈可變區，其包括由胺基酸序列KASQDVGTAVD(SEQ ID NO：18)表示的CDR1；由胺基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO：19)表示的CDR2；以及由胺基酸序列QQYNSYPLT(SEQ ID NO：20)表示的CDR3。輕鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，鼠類J591 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：18所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，鼠類J591 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：19所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，鼠類J591 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：20所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%，至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括輕鏈可變區，其包括上述三個輕鏈可變區CDR。
在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括重鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：21)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：22)。
重鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，在一些實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：22所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其由SEQ ID NO：22所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括NCBI GenBank序列數據庫ID：CCA78124.1中描述的重鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：182)。
重鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，在一些實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：182所示的胺基酸序列。
鼠類J591 PSMA結合域的重鏈可變區包括三個重鏈互補性決定區(CDR)。因此，鼠類J591 PSMA結合域可包括重鏈可變區，其包括由胺基酸序列GYTFTEYTIH(SEQ ID NO：23)表示的CDR1；由胺基酸序列NINPNNGGTTYNQKFED(SEQ ID NO：24)表示的CDR2；以及由胺基酸序列GWNFDY(SEQ ID NO：25)表示的CDR3。重鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，鼠類J591 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：23所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，鼠類J591 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：24所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，鼠類J591 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：25所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少 86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，鼠類J591 PSMA結合域包括重鏈可變區，其包括上述三個重鏈可變區CDR。
在一實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：16及21所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一實施例中，PSMA結合域是鼠類J591 PSMA結合域，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：181及182所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
(b)人源化PSMA結合域
在某些實施例中，本發明的PSMA-CAR包括非人類PSMA抗體或其變異體或其片段的PSMA結合域的人源化變異體。在某些例示性實施例中，PSMA CAR包括結合至人類PSMA的鼠類J591抗體的人源化變異體。用於人源化鼠類抗體的方法是本領域熟知的。
在一實施例中，PSMA結合域是人源化PSMA特異性結合域。在某些實施例中，PSMA結合域是人源化J591 PSMA結合域。在某些實施例中，PSMA結合域包括PCT公開號WO2017212250A1和WO2018033749A1中公開的任何重鏈和輕鏈可變區，其公開內容通過引用整體併入本文。舉例來說，本發明的PSMA結合域可包括scFv，其包括本文的任何重鏈和輕鏈可變區。因此，如WO2017212250A1和WO2018033749A1中所公開的，本發明的PSMA-CAR包括結合至人類PSMA的鼠J591抗體的人源化變異體。
在某些實施例中，本發明的PSMA結合域可包括表19中列出的任何重鏈可變區和輕鏈可變區：
(c)人類PSMA結合域
在某些實施例中，本發明的PSMA-CAR包括人類PSMA抗體或其變異體的PSMA結合域。在一實施例中，PSMA結合域是人類1C3 PSMA結合域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：26)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：27)。
人類1C3 PSMA結合域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持結合至人類PSMA。例如，在一些實施例中，PSMA結合域是人類1C3 PSMA結合域，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是人類1C3 PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：26所示 的胺基酸序列。
在一些實施例中，PSMA結合域是人類1C3 PSMA結合域，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：27所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是人類1C3 PSMA結合域，其由SEQ ID NO：27所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，人類1C3 PSMA結合域包含重鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：28)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：29)。
重鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。例如，在一些實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：29所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其由SEQ ID NO：29所示的核酸序列所編碼。
人類1C3 PSMA結合域的重鏈可變區包括三個重鏈互補性決定區(CDR)。因此，人類1C3 PSMA結合域可包括重鏈可變區，其包括由胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：30)表示的CDR1；由胺基酸序列VISYDGNNKYYADSVKG(SEQ ID NO：31)表示的CDR2；以及由胺基酸序列AVPWGSRYYYYGMDV(SEQ ID NO：32)表示的CDR3。重鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，人類1C3 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：30所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類1C3 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：31所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類1C3 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：32所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括重鏈可變區，其包括上述三個重鏈可變區CDR。
在一實施例中，人類1C3 PSMA結合域包含輕鏈可變區，其包括以下胺基酸序列：AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKSGKAPKLLIFDASSL ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：33)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：34)。
輕鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。例如，在一些實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：34所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、 至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其由SEQ ID NO：34所示的核酸序列所編碼。
人類1C3 PSMA結合域的輕鏈可變區包括三個輕鏈互補性決定區(CDR)。因此，人類1C3 PSMA結合域可包括輕鏈可變區，其包括由胺基酸序列RASQGISSALA(SEQ ID NO：35)表示的CDR1；由胺基酸序列DASSLES(SEQ ID NO：36)表示的CDR2：以及由胺基酸序列QQFNSYPLT(SEQ ID NO：37)表示的CDR3。輕鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，人類1C3 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：35所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類1C3 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：36所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類1C3 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：37所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類1C3 PSMA結合域包括輕鏈可變區，其包括上述三個輕鏈可變區CDR。
在一實施例中，PSMA結合域是人類2A10 PSMA結合域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：38)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：39)。
人類2A10 PSMA結合域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持結合至人類PSMA。舉例來說，在一些實施例中，PSMA結合域是人類2A10 PSMA結合域，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是人類2A10 PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，PSMA結合域是人類2A10 PSMA結合域，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：39所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是人類2A10 PSMA結合域，其由SEQ ID NO：39所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，人類2A10 PSMA結合域包含重鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：40)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：41)。
重鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，在一些實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：40 所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：41所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其由SEQ ID NO：41所示的核酸序列所編碼。
人類2A10 PSMA結合域的重鏈可變區包括三個重鏈互補性決定區(CDR)。因此，人類2A10 PSMA結合域可包括重鏈可變區，其包括由胺基酸序列SNWIG(SEQ ID NO：42)表示的CDR1；由胺基酸序列IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：43)表示的CDR2；以及由胺基酸序列QTGFLWSSDL(SEQ ID NO：44)表示的CDR3。重鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，人類2A10 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：42所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2A10 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：43所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2A10 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：44所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括重鏈可變區，其包括 上述三個重鏈可變區CDR。
在一實施例中，人類2A10 PSMA結合域包含輕鏈可變區，其包括以下胺基酸序列：AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGYGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：45)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：46)。
輕鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，在一些實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：46所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2A10 PSMA 結合域包括一輕鏈可變區，其由SEQ ID NO：46所示的核酸序列所編碼。
人類2A10 PSMA結合域的輕鏈可變區包括三個輕鏈互補性決定區(CDR)。因此，人類2A10 PSMA結合域可包括輕鏈可變區，其包括由胺基酸序列CRASQDISSAL(SEQ ID NO：47)表示的CDR1；由胺基酸序列YDASSLES(SEQ ID NO：48)表示的CDR2；以及由胺基酸序列CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：49)表示的CDR3。輕鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，人類2A10 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：47所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2A10 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：48所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2A10 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：49所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2A10 PSMA結合域包括輕鏈可變區，其包括上述三個輕鏈可變區CDR。
在一實施例中，PSMA結合域是人類2F5 PSMA結合域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：50)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：51)。
人類2F5 PSMA結合域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持結合至人類PSMA。例如，在一些實施例中，PSMA結合域是人類2F5 PSMA結合域，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是人類2F5 PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，PSMA結合域是人類2F5 PSMA結合域，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：51所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是人類2F5 PSMA結合域，其由SEQ ID NO：51所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，人類2F5 PSMA結合域包含重鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：52)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：53)。
重鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。例如，在一些實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：52所 示的胺基酸序列。
在一些實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：53所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其由SEQ ID NO：53所示的核酸序列所編碼。
人類2F5 PSMA結合域的重鏈可變區包括三個重鏈互補性決定區(CDR)。因此，人類2F5 PSMA結合域可包括重鏈可變區，其包括由胺基酸序列SNWIG(SEQ ID NO：54)表示的CDR1；由胺基酸序列IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：55)表示的CDR2；以及由胺基酸序列QTGFLWSFDL(SEQ ID NO：56)表示的CDR3。重鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，人類2F5 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：54所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2F5 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：55所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2F5 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：56所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括重鏈可變區，其包括 上述三個重鏈可變區CDR。
在一實施例中，人類2F5 PSMA結合域包含輕鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：57)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：58)。
輕鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，在一些實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：58所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2F5 PSMA 結合域包括一輕鏈可變區，其由SEQ ID NO：58所示的核酸序列所編碼。
人類2F5 PSMA結合域的輕鏈可變區包括三個輕鏈互補性決定區(CDR)。因此，人類2F5 PSMA結合域可包括輕鏈可變區，其包括由胺基酸序列RASQDISSALA(SEQ ID NO：59)表示的CDR1；由胺基酸序列DASSLES(SEQ ID NO：60)表示的CDR2；以及由胺基酸序列QQFNSYPLT(SEQ ID NO：61)表示的CDR3。輕鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，人類2F5 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：59所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2F5 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：60所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2F5 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：61所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2F5 PSMA結合域包括輕鏈可變區，其包括上述三個輕鏈可變區CDR。
在一實施例中，PSMA結合域是人類2C6 PSMA結合域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：62)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：63)。
人類2C6 PSMA結合域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持結合至人類PSMA。舉例來說，在一些實施例中，PSMA結合域是人類2C6 PSMA結合域，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是人類2C6 PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，PSMA結合域是人類2C6 PSMA結合域，其編 碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：63所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，PSMA結合域是人類2C6 PSMA結合域，其由SEQ ID NO：63所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，人類2C6 PSMA結合域包含重鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：64)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：65)。
重鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。例如，在一些實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：65所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括一重鏈可變區，其由SEQ ID NO：65所示的核酸序列所編碼。
人類2C6 PSMA結合域的重鏈可變區包括三個重鏈互補性決定區(CDR)。因此，人類2C6 PSMA結合域可包括重鏈可變區，其包括由胺基酸序列TNYWI(SEQ ID NO：66)表示的CDR1；由胺基酸序列GIIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：67)表示的CDR2；以及由胺基酸序列SPGYTSSWTS(SEQ ID NO：68)表示的CDR3。重鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，人類2C6 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：66所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2C6 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：67所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2C6 PSMA結合域可包括一重鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：68所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括重鏈可變區，其包括上述三個重鏈可變區CDR。
在一實施例中，人類2C6 PSMA結合域包含輕鏈可變區，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：69)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：70)。
輕鏈可變區的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至人類PSMA的貢獻。舉例來說，在一些實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：70所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括一輕鏈可變區，其由SEQ ID NO：70所示的核酸序列所編碼。
人類2C6 PSMA結合域的輕鏈可變區包括三個輕鏈互補性決定區(CDR)。因此，人類2CwPSMA結合域可包括輕鏈可變區，其包括由胺基酸序列CRASQSVSSYL(SEQ ID NO：71)表示的CDR1；由胺基酸序列YDASNRAT(SEQ ID NO：72)表示的CDR2；以及由胺基酸序列CQQRSNWPLFT(SEQ ID NO：73)表示的CDR3。輕鏈可變區的CDR的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其結合至PSMA的貢獻。舉例來說，人類2C6 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR1，CDR1包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：71所示的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2C6 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR2，CDR2包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：72所示的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。舉例來說，人類2C6 PSMA結合域可包括一輕鏈可變區，其包括CDR3，CDR3包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：73所示的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，人類2C6 PSMA結合域包括輕鏈可變區，其包括上述三個輕鏈可變區CDR。
跨膜域
本發明的CAR(例如PSMA-CAR)可包括跨膜域，其將CAR的抗原結合域連接至CAR的胞內域。標的CAR的跨膜域是能夠跨越細胞(例如免疫細胞或其前驅細胞)的細胞膜的區域。跨膜域用於插入細胞膜，例如真核細胞膜。在一些實施例中，跨膜域插入抗原結合域和CAR的胞內域之間。
在一些實施例中，跨膜域天然地與CAR中的一或多個域相關。在一些實施例中，跨膜域可以透過一或多個胺基酸取代來選擇或修飾，以避免 這些域與相同或不同的表面膜蛋白的跨膜域結合，以最小化與受體複合體的其他成員的相互作用。
跨膜域可以源自天然或合成來源。在天然來源的情況下，該域可以衍生自任何膜結合或跨膜蛋白，例如第I型跨膜蛋白。在合成來源的情況下，跨膜域可以是促進CAR插入細胞膜的任何人工序列，例如人工疏水序列。在本發明中特別使用的跨膜域的實例包括但不限於衍生自(即至少包括的跨膜域)T細胞受體的α、β或zeta鏈、CD28、CD3ε(epsilon)、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、，CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、類Toll受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9。在一些實施例中，跨膜域可以是合成的，在這種情況下，它將主要包含疏水性殘基，例如白胺酸和纈胺酸。優選地，在合成跨膜域的每個末端發現苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。
本文所述的跨膜域可組合至任何本文所述的抗原結合域、胞內域、或其他任何可包括在標的CAR中的域。
在一些實施例中，跨膜域還包含鉸鏈區。本發明的標的CAR還可包括鉸鏈區。CAR的鉸鏈區是親水區，其位於抗原結合域和跨膜域之間。在一些實施例中，該域促進CAR進行適當的蛋白質折疊。鉸鏈區是CAR的可選組件。鉸鏈區包括一域，而該域可選自於抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人工鉸鏈序列或其組合。鉸鏈區的實例包括但不限於CD8a鉸鏈、由多肽製成的人工鉸鏈，其可以小至三個甘胺酸(Gly)，也可以為IgG的CH1和CH3域(例如人類IgG4)。
在一些實施例中，本文的標的CAR包括一鉸鏈區，其係將抗原結合域連接至跨膜域，而前述跨膜域又連接至胞內域。鉸鏈區優選地能夠支持抗原結合域以辨識並結合標靶細胞上的標靶抗原(參見例如，Hudecek等人，Cancer Immunol.Res.(2015)3(2)：125-135)。在一些實施例中，鉸鏈區是可撓性域，因此使抗原結合域具有最佳的辨識結構，辨識如腫瘤細胞上標靶抗原的特定結構和密度(Hudecek等人，同上註)。鉸鏈區的可撓性使鉸鏈區域適應於許多不同的構型中。
在一些實施例中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區是衍生自受體(例如，CD8衍生的鉸鏈區)的鉸鏈區多肽。
鉸鏈區的長度可為約4個胺基酸至約50個胺基酸，例如約4個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、約20個胺基酸至約25個胺基酸、約25個胺基酸至約30個胺基酸、約30個胺基酸至約40個胺基酸、或約40個胺基酸至約50個胺基酸。
適合的鉸鏈區可以很容易地選擇，並且可以是任何一種的適合長度，例如1個胺基酸(例如，Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸、4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸，且可以是1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。
例如，鉸鏈區包括甘胺酸聚合物((G)n)、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：1)及(GGGS)n(SEQ ID NO：2)，其中n是至少為一的整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物，及本領域已知的其它可撓性連接子。可以使用甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物；Gly和Ser都是相對非結構化的，因此可以作為組分之間的中性系鏈(neutral tether)。可以使用甘胺酸聚合物；甚至與丙胺酸相比，甘胺酸獲得顯著更多的phi-psi空間，並且其所受到的限制比更長側鏈的殘基要來得更少(參見例如，Scheraga,Rev.Computational.Chem.(1992)2：73-142)。例示性鉸鏈區可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：4)、GGSGG(SEQ ID NO：5)、GSGSG(SEQ ID NO：6)、GSGGG(SEQ ID NO：7)、GGGSG(SEQ ID NO：8)、GSSSG(SEQ ID NO：9)等。
在一些實施例中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列是本領域已知的：參見例如，Tan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1)：162-166、及Huck等人，Nucleic Acids Res.(1986)14(4)：1779-1789。作為非限制性實例，免疫球蛋白鉸鏈區可包括以下胺基酸序列的其中之一：DKTHT(SEQ ID NO：74)、CPPC(SEQ ID NO：75)、CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO：76)(參見例如，Glaser等人，J.Biol.Chem.(2005) 280：41494-41503)、ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：77)、KSCDKTHTCP(SEQ ID NO：78)、KCCVDCP(SEQ ID NO：79)、KYGPPCP(SEQ ID NO：80)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：81，人類IgG1鉸鏈)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：82，人類IgG2鉸鏈)、ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：83，人類IgG3鉸鏈)、SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO：84，人類IgG4鉸鏈)等。
鉸鏈區可包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、鉸鏈區的胺基酸序列。在一實施例中，與野生型(天然存在的)鉸鏈區相比，鉸鏈區可包括一或多個胺基酸取代及/或插入及/或缺失。舉例來說，人類IgG1鉸鏈的His229可以被Tyr取代，因此該鉸鏈區包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO：85)，參見例如Yan等人，J.Biol.Chem.(2012)287：5891-5897。在一實施例中，鉸鏈區可包含衍生自人類CD8的胺基酸序列或其變異體。
跨膜域可以與任何鉸鏈區組合及/或可以包括一或多種本文所述的跨膜域。在一實施例中，跨膜域包括CD8跨膜域。在一實施例中，跨膜域包括CD8鉸鏈區及CD8跨膜域。在一些實施例中，標的CAR包括具有以下胺基酸序列的CD8鉸鏈區：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：86)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：87)。
跨膜域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一跨膜域，其包括CD8鉸鏈區，該CD8鉸鏈區包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一跨膜域，其包括CD8鉸鏈區，該CD8鉸鏈區包括SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一跨膜域，其包括CD8鉸鏈區，該CD8鉸鏈區編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：87所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，標的CAR包括一跨膜域，其包括CD8鉸鏈區，該CD8鉸鏈區由SEQ ID NO：87所示的核酸序列所編碼。
在一些實施例中，標的CAR包括具有以下胺基酸序列的CD8跨膜域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：88)，其可以由下列核酸序列所編碼：ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO：89)。
跨膜域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一跨膜域，其包括CD8跨膜域，該CD8跨膜域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一跨膜域，其包括CD8跨膜域，該CD8跨膜域包括SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一跨膜域，其包括CD8跨膜域，該CD8跨膜域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：89所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一跨膜域，其包括CD8跨膜域，該CD8跨膜域由SEQ ID NO：89所示的核酸序列所編碼。
在一些實施例中，跨膜域包括具有以下胺基酸序列的CD8鉸鏈區及CD8跨膜域：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：90)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：91)。
跨膜域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一跨膜域，其包括CD8鉸鏈區及CD8跨膜域，該CD8鉸鏈區及CD8跨膜域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一跨膜域，其包括CD8鉸鏈區及CD8跨膜域，該CD8鉸鏈區及CD8跨膜域包括SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一跨膜域，其包括CD8鉸鏈區及CD8跨膜域，該CD8鉸鏈區及CD8跨膜域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：91所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99% 的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一跨膜域，其包括CD8鉸鏈區及CD8跨膜域，該CD8鉸鏈區及CD8跨膜域由SEQ ID NO：91所示的核酸序列所編碼。
在CAR的胞外域及跨膜域之間、或在CAR的胞內域及跨膜域之間，可以併入間隔域。如本文所使用，術語「間隔域」通常是指任何將跨膜域連接至前述多肽鏈中的胞外域或胞內域的寡肽或多肽。間隔域可包括最多300個胺基酸，例如10至100個胺基酸、或25至50個胺基酸。在一些實施例中，間隔域可以是短的寡肽或多肽連接子，例如長度為2至10個胺基酸。例如，甘胺酸-絲胺酸雙聯體，特別合適作為在標的CAR的跨膜域及胞內訊息傳遞域之間的連接子。
胞內訊息傳遞域
本發明的標的CAR還包括胞內訊息傳遞域。術語「胞內訊息傳遞域」和「胞內域」在本文中可交替使用。CAR的胞內訊息傳遞域負責活化表現有該CAR的細胞(例如免疫細胞)的至少一種效用功能。胞內訊息傳遞域轉導效用功能訊號並引導該細胞(例如免疫細胞)執行其特化功能，例如，損傷及/或破壞標靶細胞。
用於本發明的胞內域其實例包括但不限於表面受體、共刺激分子、以及任何分子的細胞質部分，前述分子係共同作用以啟動T細胞中的訊息傳遞。其實例也包括任何前述分子的衍生物或其變異體、以及任何具有相同功能的合成序列。
胞內訊息傳遞域的實例包括但不限於T細胞受體複合體的ζ鏈或其任何同源物，例如η鏈、FcεRIγ及β鏈、MB1(Iga)鏈、B29(Ig)鏈等、人類CD3 zeta鏈、CD3多肽(△、δ及ε)，syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其他涉及T細胞轉導的分子，例如CD2、CD5及CD28。在一實施例中，胞內訊息傳遞域可以是人類CD3 zeta鏈、FcγRIII、FcsRI、Fc受體的細胞質尾區、具有細胞質受體的免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)，及其組合。
在一實施例中，CAR的胞內域包括一或多種共刺激分子的任何 部分，例如來自CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-IBB、PD-1、任何其衍生物或其變異體、任何具有相同功能的合成序列、及其任意組合。
胞內域的其他實例包括來自一或多種分子或受體的片段或域，該一或多種分子或受體包括但不限於TCR、CD3 zeta、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、常見FcRγ(common FcR gamma)、FcRβ(Fc Epsilon Rib)、CD79a、CD79b、Fcγ Rlla、DAP10、DAP 12、T細胞受體(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴球功能相關抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)專一性結合的配體、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 Id、ITGAE、CD 103、ITGAL、CD 11a、LFA-1、ITGAM、CD lib、ITGAX、CD 11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD 18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、類Toll受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其他共刺激分子、其任何衍生物、變異體或片段、任何具有相同功能的共刺激分子的合成序列、及其任何組合。
胞內域的其他實例包括但不限於各種其他免疫訊號受體中某些類型的胞內訊息傳遞域。該些免疫訊號受體包括但不限於第一代、第二代和第三代T細胞訊息傳遞蛋白，其包括CD3、B7家族共刺激，及腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族受體(參見例如，Park and Brentjens,J.Clin.Oncol.(2015)33(6)：651-653)。另外，胞內訊息傳遞域可包括NK及NKT細胞所使用的訊息傳遞域(參見例如，Hermanson and Kaufman,Front.Immunol.(2015)6：195)，例如NKp30 (B7-H6)的訊息傳遞域(參見例如，Zhang等人，J.Immunol.(2012)189(5)：2290-2299)及DAP 12(參見例如，Topfer等人，J.Immunol.(2015)194(7)：3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10及CD3z。
適用於本發明的標的CAR胞內訊息傳遞域，包括任何所需訊息傳遞域，該訊息傳遞域係響應於CAR的活化(即，被抗原和二聚化劑所活化)而提供獨特和可檢測訊號(例如，細胞一或多種細胞激素的產量增加、標靶基因的轉錄變化、蛋白質活性的改變；細胞行為的變化：例如細胞死亡、細胞增生、細胞分化、細胞存活、細胞訊號反應的調節等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域包括至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個等)如下所述的ITAM基序。在一實施例中，胞內訊息傳遞域包括DAP10/CD28型訊息傳遞鏈。在一實施例中，胞內訊息傳遞域並非共價連接至膜結合的CAR，而是散布在細胞質中。
適用於本發明標的CAR的胞內訊息傳遞域，包括基於免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)的胞內訊息傳遞多肽。在一些實施例中，ITAM基序在胞內訊息傳遞域中重複兩次，其中ITAM基序的第一重複和第二重複彼此間隔6至8個胺基酸。在一實施例中，標的CAR的胞內訊息傳遞域包含3個ITAM基序。
在一些實施例中，胞內訊息傳遞域包括人類免疫球蛋白受體的訊息傳遞域，其含有基於免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAM)，例如但不限於FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(參見例如，Gillis等人，Front.Immunol.(2014)5：254)。
合適的訊息傳遞域可以是含有ITAM基序的部分，其衍生自含有ITAM基序的多肽。例如，合適的胞內訊息傳遞域可以是來自任何含有ITAM基序蛋白質的含ITAM基序域。因此，合適的胞內訊息傳遞域不需要包含衍生它的整個蛋白質的完整序列。含有ITAM基序的合適多肽其實例包括但不限於：DAP12、FCER1G(Fcε受體Iγ鏈)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3 zeta)及CD79A(抗原受體複合體相關蛋白α鏈)。
在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自DAP12(也稱為 TYROBP、TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白、KARAP、PLOSL、DNAX-活化蛋白12、KAR相關蛋白、TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白、殺傷活化受體相關蛋白、殺傷活化受體相關蛋白等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自FCER1G(也稱為FCRG、Fcε受體Iγ鏈、Fc受體γ鏈、fc-εRI-γ、fcRγ、fceR1γ、高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ、免疫球蛋白E受體、高親和力γ鏈等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3δ鏈(也稱為CD3D、CD3-DELTA、T3D、CD3抗原、δ次單元、CD3δ、CD3d抗原、δ多肽(TiT3複合體)、OKT3、δ鏈、T細胞受體T3δ鏈、T細胞表面醣蛋白CD3δ鏈等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3ε鏈(也稱為CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4ε鏈，T細胞表面醣蛋白CD3ε鏈、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3γ鏈(也稱為CD3G、T細胞受體T3γ鏈、CD3-GAMMA、T3G、γ多肽(TiT3複合體)等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3 zeta鏈(也稱為CD3Z、T細胞受體T3 zeta鏈、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自CD79A(也稱為B細胞抗原受體複合體相關蛋白α鏈、CD79a抗原(免疫球蛋白相關α)、MB-1膜醣蛋白、ig-α、膜結合免疫球蛋白相關蛋白、表面IgM相關蛋白等)。在一實施例中，適用於本文的FN3 CAR的胞內訊息傳遞域包括DAP10/CD288型訊息傳遞鏈。在一實施例中，適用於本文的FN3 CAR的胞內訊息傳遞域包括ZAP70多肽。在一實施例中，胞內訊息傳遞域包括TCR zeta、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的細胞質訊息傳遞域。在一實施例中，CAR中的胞內訊息傳遞域包括人類CD3 zeta的細胞質訊息傳遞域。
雖然通常可以使用整個胞內訊息傳遞域，但在許多情況下不必使用整個鏈。在使用胞內訊息傳遞域的截短部分的情況下，可以使用前述截短部分來代替完整的鏈，只要其長度足夠轉導效用功能訊號。胞內訊息傳遞域包括足以轉導效用功能訊號的胞內訊息傳遞域的任何截短部分。
本文所述的胞內訊息傳遞域可組合至下列域：任何本文所述的抗 原結合域、跨膜域、或其他任何可包含在CAR中的域。
在一實施例中，標的CAR的胞內域包含4-1BB域，其包括以下胺基酸序列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：92)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：93)，或下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：94)。
胞內域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括4-1BB域，該4-1BB域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括4-1BB域，該4-1BB域包括SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括4-1BB域，該4-1BB域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：93或94所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括4-1BB域，該4-1BB域由SEQ ID NO：93或94所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，標的CAR的胞內域包括具有以下胺基酸序列的ICOS域：TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID NO：203)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：204)。
胞內域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括ICOS域，該ICOS域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：203所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括ICOS域，該ICOS域包括SEQ ID NO：203所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括ICOS域，該ICOS域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：204所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括ICOS域，該ICOS域由SEQ ID NO：204所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，標的CAR的胞內域包括具有以下胺基酸序列的變異體ICOS域：TKKKYSSSVHDPNGEYMNMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID NO：95)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：96)。
變異體ICOS域在本文中也稱為ICOS(YMNM)。
胞內域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括ICOS域，該ICOS域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括ICOS域，該ICOS域包括SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括ICOS域，該ICOS域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：96所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括ICOS域，該ICOS域由SEQ ID NO：96所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，標的CAR的胞內域包括具有以下胺基酸序列的CD3 zeta域： (SEQ ID NO：97)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：98)，或下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：99)。
胞內域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括CD3 zeta域，該CD3 zeta域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括CD3 zeta域，該CD3 zeta域包括SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括CD3 zeta域，該CD3 zeta域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：98或99所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括CD3 zeta域，該CD3 zeta 域由SEQ ID NO：98或99所示的核酸序列所編碼。
CD3 zeta域可包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：100)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：101)。
胞內域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。例如，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括CD3 zeta域，該CD3 zeta域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括CD3 zeta域，該CD3 zeta域包括SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括CD3 zeta域，該CD3 zeta域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：101所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實 施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括CD3 zeta域，該CD3 zeta域由SEQ ID NO：101所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，CAR包括胞內域，前述胞內域包括CD3 zeta域，前述CD3 zeta域包括SEQ ID NO：97或100中所示的胺基酸序列。
在一例示性實施例中，標的CAR的胞內域包含4-1BB域及CD3 zeta域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：102)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：103)，或下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：104)。
胞內域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括4-1BB域及CD3 zeta域，該4-1BB域及CD3 zeta域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括4-1BB域及CD3 zeta域，該4-1BB域及CD3 zeta域包括SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括4-1BB域及CD3 zeta域，該4-1BB域及CD3 zeta域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：103或104所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括4-1BB域及CD3 zeta域，該4-1BB域及CD3 zeta域由SEQ ID NO：103或104所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，標的CAR的胞內域包括具有以下胺基酸序列的ICOS域及CD3 zeta域： (SEQ ID NO：205)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：206)。
胞內域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。例如，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括ICOS域及CD3 zeta域，該ICOS域及CD3 zeta域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：205所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括ICOS域及CD3 zeta域，該ICOS域及CD3 zeta域包括SEQ ID NO：205所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括ICOS域及CD3 zeta域，該ICOS域及CD3 zeta域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：206所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括ICOS域及CD3 zeta域，該ICOS域及CD3 zeta域由SEQ ID NO：206所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，標的CAR的胞內域包括具有以下胺基酸序列的變異體ICOS域及CD3 zeta域： (SEQ ID NO：207)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：208)。
胞內域的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域，該變異體ICOS域及CD3 zeta域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：207所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域，該變異體ICOS域及CD3 zeta域包括SEQ ID NO：207所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR包括一胞內域，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域，該變異體ICOS域及CD3 zeta域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：208所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、 至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR包括一胞內域，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域，該變異體ICOS域及CD3 zeta域由SEQ ID NO：208所示的核酸序列所編碼。
CAR序列
本發明的標的CAR可以選自J591鼠類PSMA-CAR、人源化J591 PSMA-CAR、1C3人類PSMA-CAR、2A10人類PSMA-CAR、2F5人類PSMA-CAR及2C6人類PSMA-CAR。
在一實施例中，本發明的標的CAR是J591鼠類PSMA-CAR。在一實施例中，J591鼠類PSMA-CAR包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：105)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：106)。
在一實施例中，本發明的標的CAR是人源化PSMA-CAR，例如人源化J591 PSMA-CAR。在該實施例中，人源化PSMA-CAR包括PCT公開號WO2017212250A1和WO2018033749A1中公開的任何重鏈和輕鏈可變區。舉例來說，本發明的人源化PSMA-CAR可包括scFv，其包括本文公開的任何重鏈和 輕鏈可變區，參見例如本文的表19中所列出的序列。
在一實施例中，本發明的標的CAR是1C3人類PSMA-CAR。在一實施例中，1C3人類PSMA-CAR包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：107)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：108)。
在一實施例中，本發明的標的CAR是2A10人類PSMA-CAR。在一實施例中，2A10人類PSMA-CAR包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：109)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：110)。
在一實施例中，本發明的標的CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一實施例中，2F5人類PSMA-CAR包括4-1BB域及CD3 zeta域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：111)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：112)。
在一實施例中，本發明的標的CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一實施例中，2F5人類PSMA-CAR包括ICOS域及CD3 zeta域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：209)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：210)。
在一實施例中，本發明的標的CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一實施例中，2F5人類PSMA-CAR包括變異體ICOS域及CD3 zeta域，其包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：211)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：212)。
在一實施例中，本發明的標的CAR是2C6人類PSMA-CAR。在一實施例中，2C6人類PSMA-CAR包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：113)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：114)。
標的CAR的序列的可耐受變異對於本領域技術人員而言是已知的，同時維持其功能。
例如，在一些實施例中，本發明的標的CAR是J591鼠類PSMA-CAR，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：105所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是J591鼠類PSMA-CAR，其包括SEQ ID NO：105所示的胺基酸序列。
舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR是人源化J591 PSMA-CAR。人源化J591 PSMA-CAR包括人源化J591 PSMA結合域，其包括選自表19中列出的任何重鏈和輕鏈可變區序列的重鏈和輕鏈可變區。在一些實施例中，人源化J591 PSMA-CAR包括4-1BB域及CD3 zeta域。
舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR是1C3人類PSMA-CAR，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：107所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是1C3人類PSMA-CAR，其包括SEQ ID NO：107所示的胺基酸序列。
舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR是2A10人類PSMA-CAR，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2A10人類PSMA-CAR，其包括SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列。
舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括4-1BB域及CD3 zeta域，該4-1BB域及CD3 zeta域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括4-1BB域及CD3 zeta域，該4-1BB域及CD3 zeta域包括SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3 zeta域，該ICOS域及CD3 zeta域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：209所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3 zeta域，該ICOS域及CD3 zeta域包括SEQ ID NO：209所示的胺基酸序列。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域，該變異體ICOS域及CD3 zeta域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：211所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域，該變異體ICOS域及CD3 zeta域包括SEQ ID NO：211所示的胺基酸序列。舉例來說，在一些實施例中，標的CAR是2C6人類PSMA-CAR，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2C6人類PSMA-CAR，其包括SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的標的CAR是J591鼠類PSMA-CAR，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：106所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是J591鼠類PSMA-CAR，其由SEQ ID NO：106所示的核酸序列所編碼。
舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR是1C3人類PSMA-CAR，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：108所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是1C3人類PSMA-CAR，其由SEQ ID NO：108所示的核酸序列所編碼。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR是2A10人類PSMA-CAR，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：110所示的核酸序列具有至少60%、 至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2A10人類PSMA-CAR，其由SEQ ID NO：110所示的核酸序列所編碼。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括4-1BB域及CD3zeta域，該4-1BB域及CD3zeta域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：112所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括4-1BB域及CD3zeta域，該4-1BB域及CD3zeta域是由SEQ ID NO：112所示的核酸序列所編碼的。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3zeta域，該ICOS域及CD3zeta域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：210所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3zeta域，該ICOS域及CD3zeta域是由SEQ ID NO：210所示的核酸序列所編碼的。在一實施例中，CAR是2F5人類PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3zeta域，該變異體ICOS域及CD3 zeta域編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：212所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2F5人 類PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3zeta域，該變異體ICOS域及CD3zeta域是由SEQ ID NO：212所示的核酸序列所編碼的。舉例來說，在一些實施例中，本發明的標的CAR是2C6人類PSMA-CAR，其編碼自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：114所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，CAR是2C6人類PSMA-CAR，其由SEQ ID NO：114所示的核酸序列所編碼。
在某些實施例中，本發明的標的CAR可包括對應於SEQ ID NO：209、211或227~236中所示的任一胺基酸序列。
因此，本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，例如經修飾的T細胞，其包括對標靶細胞(例如，攝護腺癌細胞)上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR包括PSMA結合域。在一些實施例中，CAR包括鼠類PSMA結合域。在一實施例中，CAR包括J591鼠類PSMA結合域。在一實施例中，CAR包括人源化J591 PSMA結合域。在一些實施例中，CAR包括人類PSMA結合域。在一些實施例中，CAR包括人類PSMA結合域，其選自1C3、2A10、2F5及2C6人類PSMA結合域。
因此，本發明的標的CAR包括PSMA結合域和跨膜域。在一實施例中，CAR包括PSMA結合域和跨膜域，其中跨膜域包括CD8鉸鏈區。在一實施例中，CAR包括PSMA結合域和跨膜域，其中跨膜域包括CD8跨膜域。在一實施例中，CAR包括PSMA結合域和跨膜域，其中跨膜域包括CD8鉸鏈區和CD8跨膜域。
因此，本發明的標的CAR包括PSMA結合域、跨膜域和胞內域。在一實施例中，CAR包括PSMA結合域、跨膜域和胞內域，其中胞內域包括4-1BB域。在一實施例中，CAR包括PSMA結合域、跨膜域和胞內域，其中胞內域包含CD3 zeta域。在一實施例中，CAR包括PSMA結合域、跨膜域和胞內域，其 中胞內域包括4-1BB域和CD3 zeta域。
C.顯性負受體和轉換受體
本發明提供了包括顯性負受體及/或轉換受體的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如經修飾的T細胞)的組成物和方法。因此，在一些實施例中，免疫細胞已經經過基因修飾以表現顯性負受體及/或轉換受體。如本文所使用，術語「顯性負受體」是指一種分子，其係設計來降低負訊息傳遞分子的作用，例如負訊息傳遞分子對本發明經修飾的免疫細胞的作用。本發明的顯性負受體可以透過與負訊息相關的胞外域結合負向訊息傳遞分子，例如TGF-β或PD-1，並降低負訊息傳遞分子的作用。本文描述了前述顯性負受體。例如，包括顯性負受體的經修飾的免疫細胞可以結合在經修飾的免疫細胞的微環境中的負向訊息傳遞分子，並降低負訊息傳遞分子可能對經修飾的免疫細胞產生的影響。
除了減少負訊息傳遞分子的作用之外，本發明的轉換受體可以設計成將負訊號轉換成正訊號，其係藉由具有與正訊號相關的胞內域。設計用於將負訊號轉換為正訊號的轉換受體如本文中所描述的。因此，轉換受體包含有與負訊號相關的胞外域及/或與正訊號相關的胞內域。
腫瘤細胞會產生免疫抑制微環境，以保護其免受免疫辨識及消除。前述免疫抑制微環境會限制免疫抑制療法(如CAR-T細胞療法)的有效性。分泌的細胞激素轉化生長因子β(TGFβ)會直接抑制毒殺性T細胞的功能，並另外誘發調節性T細胞形成以進一步抑制免疫反應。先前文獻已經證實了在攝護腺癌中TGFβ會引發T細胞的免疫抑制(Donkor等人2011；Shalapour等人2015)。為了降低TGFβ的免疫抑制作用，可以修飾免疫細胞以表現顯性負受體，其為TGF-β的顯性負受體。
在一些實施例中，顯性負受體是與負訊號相關的野生型蛋白質的截短變異體。在一些實施例中，顯性負受體是TGF-β的顯性負受體。因此，在一些實施例中，TGF-β的顯性負受體是野生型TGF-β受體的截短變異體。在一些實施例中，顯性負受體是TGF-β受體第II型(TGFβRII-DN)的截短的顯性負變異體。在一實施例中，TGFβRII-DN包括下列胺基酸序列： (SEQ ID NO：115)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：116)。
TGFβRII-DN序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時維持其預期的功能。舉例來說，在一些實施例中，本發明的顯性負受體是TGFβRII-DN，其包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，顯性負受體是TGFβRII-DN，其包括SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的顯性負受體是TGFβRII-DN，其編碼 自一核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO：116所示的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，顯性負受體是TGFβRII-DN，其由SEQ ID NO：116所示的核酸序列所編碼。
在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是PD1-CTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1-CTM-CD28受體將PD1的負訊號轉換成CD28的正訊號。PD1-CTM-CD28受體包含PD1胞外域的變異體、CD28跨膜域及CD28細胞質域。在一實施例中，PD1-CTM-CD28受體包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：117)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：118)。
PD1-CTM-CD28受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將PD1的負訊號轉化為CD28的正訊號)。因此，本發明的PD1-CTM-CD28受體與SEQ ID NO：117所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼PD1-CTM-CD28受體的核酸與SEQ ID NO：118所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是PD1-PTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1-PTM-CD28受體將PD1的負訊號轉換成CD28的正訊號。PD1-PTM-CD28受體包含PD1胞外域的變異體、PD1跨膜域及CD28細胞質域。在一實施例中，PD1-PTM-CD28受體包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：119)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：120)。
PD1-PTM-CD28受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將PD1的負訊號轉化為CD28的正訊號)。因此，本發明的PD1-PTM-CD28受體與SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼PD1-PTM-CD28受體的核酸與SEQ ID NO：120所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是PD1A132L-PTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1A132L-PTM-CD28受體將PD1的負訊號轉換成CD28 的正訊號。先前文獻發現用胺基酸位置132處的點突變，用丙胺酸取代白胺酸(A132L)的PD1，使其與PD-L1的親和力增加兩倍(參見例如，Zhang et al.,Immunity(2004)20(3),337-347)。PD1A132L-PTM-CD28受體包含PD1胞外域的變異體、其在132位置具有胺基酸取代(A132L)、PD1跨膜域及CD28細胞質域。在一實施例中，PD1A132L-PTM-CD28受體包含下述胺基酸序列： (SEQ ID NO：121)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：122)。
PD1A132L-PTM-CD28受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將PD1的負訊 號轉化為CD28的正訊號)。因此，本發明的PD1A132L-PTM-CD28受體與SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼PD1A132L-PTM-CD28受體的核酸與SEQ ID NO：122所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是PD1-4-1BB受體。當在細胞中表現時，PD1-4-1BB受體(在本文中也稱為PD1-BB)將PD1的負訊號轉換成4-1BB的正訊號。在一實施例中，PD1-4-1BB受體包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：213)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：214)。
PD1-4-1BB受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，其係同時維保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時，會將PD1的負訊號轉化為4-1BB的正訊號)。因此，本發明的PD1-4-1BB受體與SEQ ID NO：213所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼有PD1-4-1BB受體的核酸與SEQ ID NO：214所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是PD1A132L-4-1BB受體。當在細胞中表現時，PD1A132L-4-1BB受體(在本文中也稱為PD1*BB)將PD1的負訊號轉換成4-1BB的正訊號。在一實施例中，PD1A132L-4-1BB受體包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：215)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：216)。
PD1A132L-4-1BB受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，其係同時維保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時，會將PD1的負訊號轉化為4-1BB的正訊號)。因此，本發明的PD1A132L-4-1BB受體與SEQ ID NO：215所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼有PD1A132L-4-1BB受體的核酸與SEQ ID NO：216所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至 少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是TGFβR-IL12Rβ1受體。當在細胞中表現時，TGFβR-IL12Rβ1受體將TGF-β的負訊號轉換成IL-12的正訊號。在一實施例中，TGFβR-IL12Rβ1受體包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：123)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：124)。
TGFβR-IL12Rβ1受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的， 其係同時維保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時，會將TGF-β的負訊號轉化為IL-12的正訊號)。因此，本發明的TGFβR-IL12Rβ1受體與SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼有TGFβR-IL12Rβ1受體的核酸與SEQ ID NO：124所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是TGFβR-IL12Rβ2受體。當在細胞中表現時，TGFβR-IL12Rβ2受體將TGF-β的負訊號轉換成IL-12的正訊號。在一實施例中，TGFβR-IL12Rβ2受體包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：125)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：126)。
TGFβR-IL12Rβ2受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將TGF-β負訊號轉化為IL-12正訊號)。因此，本發明的TGFβR-IL12Rβ2受體與SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一 性。因此，本發明編碼TGFβR-IL12Rβ2受體的核酸與SEQ ID NO：126所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是TIM3-CD28受體。當在細胞中表現時，TIM3-CD28受體將TIM-3的負訊號轉換成CD28的正訊號。在一實施例中，IM3-CD28受體包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：127)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：128)。
TIM3-CD28受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將TIM-3的負訊號轉化為CD28的正訊號)。因此，本發明的TIM3-CD28受體與SEQ ID NO：127所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼TIM3-CD28受體的核酸與SEQ ID NO：128所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
用於本發明的其他合適的顯性負受體和轉換受體如PCT公開號WO2013019615A2中所描述，其內容通過引用併入本文。
D.雙特異性抗體
本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如經修飾的T細胞)的組成物和方法，其包括編碼雙特異性抗體的核酸。因此，在一些實施例中，免疫細胞已經經過基因修飾以表現雙特異性抗體。如本文所使用，「雙特異性抗體」是指對至少兩種不同抗原表位具有結合專一性的抗體。在一實施例中，表位來自相同的抗原。在另一實施例中，表位來自兩種不同的抗原。製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。例如，可以使用兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表現以重組地產生雙特異性抗體。參見，例如，Milstein等人，(1983)Nature 305：537-39。或者，可以使用化學鍵結製備雙特異性抗體。參見，例如，Brennan等人，(1985)Science 229：81。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片段。參 見，例如，Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48、Gruber等人，(1994)J.Immunol.152：5368。
在某些實施例中，本發明的經修飾的細胞包括對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力的CAR和雙特異性抗體。在某些實施例中，本發明的經修飾的細胞分泌雙特異性抗體。
在一實施例中，雙特異性抗體包括結合第一抗原的第一抗原結合域和結合第二抗原的第二抗原結合域。在一些實施例中，雙特異性抗體包括抗原結合域，其包括第一及第二單鏈可變片段(scFv)分子。在一實施例中，第一及第二抗原結合域結合標靶細胞上的抗原和活化T細胞上的抗原。
在一實施例中，雙特異性抗體包括對活化T細胞上的至少一種抗原的專一性。活化T細胞抗原包括在T細胞表面上發現的可以激活另一細胞的抗原。活化T細胞抗原可以結合共刺激分子。共刺激分子是除了抗原受體或其配體之外的細胞表面分子，其是淋巴球對抗原產生有效反應所必需的。活化T細胞抗原的實例可包括但不限於CD3、CD4、CD8、T細胞受體(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及與CD83專一性結合的配體、或其任何片段。在一些實施例中，雙特異性抗體包括對T細胞抗原CD28的專一性。
其他共刺激元素也在本發明的範圍內。在這些實施例中，雙特異性抗體辨識T細胞抗原，並且可以稱為雙特異性T細胞Engager(BiTE)。然而，本發明不受任何特定雙特異性抗體的使用限制。相反地，可以使用任何雙特異性抗體或BiTE。雙特異性抗體或BiTE分子也可以表現為對至少一種標靶細胞相關抗原具有專一性的可溶性蛋白質。
在一實施例中，雙特異性抗體包括一個以上的抗原結合域。在該實施例中，至少一個抗原結合域包括合成抗體、人類抗體、人源化抗體、單鏈可變片段、單域抗體、其抗原結合片段，及其任意組合。製備人類和人源化抗體的技術描述於本文的其他部分。
在一些實施例中，雙特異性抗體包括一個以上的抗原結合域，其 中至少一個抗原結合域與負訊息傳遞分子(例如，可以在分泌雙特異性抗體的細胞的微環境中發現的負訊息傳遞分子)或其相互作用配偶體(例如受體)結合。在一些實施例中，雙特異性抗體的至少一個抗原結合域與TGF-β或其相互作用配偶體(例如受體)結合。在一些實施例中，雙特異性抗體的至少一個抗原結合域與PD-1或其相互作用配偶體結合。在一實施例中，雙特異性抗體的至少一個抗原結合域與TGF-βR結合。在另一實施例中，雙特異性抗體的至少一個抗原結合域與PD-L1結合。
在一些實施例中，雙特異性抗體包括至少一個抗原結合域，其結合至T細胞上的分子並激活T細胞。例如，本發明的雙特異性抗體可包括如美國專利號7,585,960中所述的超級抗性CD28結合域，其內容通過引用而整體併入本文。
在一些實施例中，雙特異性抗體包括至少一個結合至PD-L1的抗原結合域。例如，本發明的雙特異性抗體可包括但不限於如PCT公開號WO2007005874A2中所述的衍生自10A5、13G4或1B12的PD-L1結合域，其內容通過引用而整體併入本文。在一些實施例中，雙特異性抗體包含至少一個結合至TGF-β受體的抗原結合域，例如TGFβRII。例如，如美國專利號8,147,834中所述，本發明的雙特異性抗體可包括但不限於衍生自TGF1或TGF3的TGFβRII結合域，其內容通過引用而整體併入本文。
因此，在一實施例中，本發明的雙特異性抗體包括至少一個結合至PD-L1或TGFβRII的抗原結合域和結合至CD28的抗原結合域。
在一些實施例中，標靶細胞抗原可以是與T細胞受體結合的抗原相同或不同的抗原。標靶細胞抗原包括任何腫瘤相關抗原(TAA)或病毒、細菌及寄生蟲抗原、或其任何片段。標靶細胞抗原可包括限定標靶細胞的任何類型的配體。例如，可以選擇標靶細胞抗原以辨識配體，該配體係為與特定疾病狀態相關的標靶細胞上的細胞標記物。因此，細胞標記物可以作為雙特異性抗體中抗原結合域的配體，包括與病毒、細菌及寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌細胞相關的細胞標記物。
在一些實施例中，標靶細胞抗原是與活化T細胞抗原相同的抗 原，包括但不限於CD3、CD4、CD8、T細胞受體(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及與CD83專一性結合的配體、或其任何片段。在一實施例中，本發明包括編碼雙特異性抗體的核酸，其包括對於標靶細胞上的抗原和活化T細胞上的抗原的雙特異性，其中T細胞暫時分泌雙特異性抗體。用於改造和表現雙特異性抗體的技術包括但不限於具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現(參見，例如，Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983),WO 93/08829，以及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「杵-進入-臼(KIH)」工程(參見，例如，美國專利號5,731,168)。多特異性抗體也可以透過用於製備抗體Fc-異二聚體分子的電荷排斥作用來製備(WO 2009/089004A1)；交聯兩種或多種抗體或片段(參見，例如，美國專利號4,676,980，及Brennan等人，Science 229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體(參見，例如，Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙抗體」技術用於製備雙特異性抗體片段(參見，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；以及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol,152：5368(1994))；以及製備三特異性抗體，例如，如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。本文還包括具有三個或更多個功能性抗原結合位的改造抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576A1)。可以透過連接兩種不同的抗體或其部分來構築雙特異性抗體。例如，雙特異性抗體可包含來自兩種不同抗體的Fab、F(ab')2、Fab'、scFv及sdAb。
本發明的雙特異性抗體包括對PD-L1和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一實施例中，本發明的13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：129)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：130)。
13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，結合至PD-L1及CD28)。因此，本發明的13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體與SEQ ID NO：129所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸與SEQ ID NO：130所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
本發明的雙特異性抗體包括對PD-L1和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一實施例中，本發明的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：131)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：132)。
10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，結合至PD-L1及CD28)。因此，本發明的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體與SEQ ID NO：131所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸與SEQ ID NO：132所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
本發明的雙特異性抗體包括對PD-L1和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一實施例中，本發明的1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：133)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：134)。
1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，結合至PD-L1及CD28)。因此，本發明的1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體與SEQ ID NO：133所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸與SEQ ID NO：134所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
本發明的雙特異性抗體包括對TGF-β受體第II型(TGFβRII-DN) 和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一實施例中，本發明的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：135)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：136)。
TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，結合至TGFβRII及CD28)。因此，本發明的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體與SEQ ID NO：135所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的核酸與SEQ ID NO：136所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、 至少98%、至少99%的序列同一性。
本發明的雙特異性抗體包括對TGF-β受體第II型(TGFβRII-DN)和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一實施例中，本發明的TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體包括以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：137)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：138)。
TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，結合至TGFβRII及CD28)。因此，本發明的TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體與SEQ ID NO：137所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的核酸與SEQ ID NO：138所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至 少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
用於本發明的其他合適的雙特異性抗體如PCT公開號WO2016122738A1中所描述，其內容通過引用併入本文。
E.核酸和表現載體
本發明提供了編碼CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體的核酸。在一實施例中，本文的核酸包括編碼本發明的標的CAR的核酸序列(例如，PSMA-CAR)。在一實施例中，本文的核酸包括編碼顯性負受體及/或轉換受體(例如，PD1-PTM-CD28受體)的核酸序列。
在一些實施例中，本文的核酸係用來例如在哺乳動物細胞中產生如本文所述的CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體。在一些實施例中，本文的核酸係用來擴增編碼有CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體的核酸。
如本文所述，標的CAR包括抗原結合域、跨膜域及胞內域。因此，本發明提供了編碼標的CAR的抗原結合域、跨膜域及胞內域的核酸。如本文所述，提供了各種顯性負受體及轉換受體。因此，本發明提供了編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸。
在一些實施例中，編碼CAR的核酸與編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸是分開的。在一例示性實施例中，編碼CAR的核酸和編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸位於同一個核酸內。
在一些實施例中，本發明的核酸包括含有CAR編碼序列和顯性負受體及/或轉換受體編碼序列的核酸。在一些實施例中，本發明的核酸包括核酸，其包括CAR編碼序列和顯性負受體及/或轉換受體編碼序列，前述序列透過連接子分開。用於本發明的連接子(例如，在連接CAR編碼序列和顯性負受體及/或轉換受體編碼序列的背景下)允許多個蛋白質可以由同一個核酸序列(例如，多順反子或雙順反子序列)編碼，其被轉譯為多蛋白，前述多蛋白被解離成獨立的蛋白質組分。例如，用於本文的核酸的連接子包括CAR編碼序列和顯性負受體及/或轉換受體編碼序列，使CAR和顯性負受體及/或轉換受 體會轉譯為多蛋白，該多蛋白解離成獨立的CAR和顯性負受體及/或轉換受體組分。
在一些實施例中，連接子包含一核酸序列，其編碼內部核醣體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)。如本文所使用的，「內部核醣體進入位點」或「IRES」是指促進內部核醣體直接進入蛋白質編碼區的起始密碼子(例如ATG)的元件，從而使基因進行端帽不依賴性(cap-independent)的轉譯。各種內部核醣體進入位點是本領域技術人員已知的，其包括但不限於，可從病毒或細胞mRNA來源所獲得的IRES，例如免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)、血管內皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞生長因子2、類胰島素生長因子、轉譯起始因子eIF4G、酵母菌轉錄因子TFIID及HAP4、及IRES可從例如心臟病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV、弗里德氏鼠類白血病病毒(Friend murine leukemia virus，FrMLV)和莫洛尼氏鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)所獲得的。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的IRES。
在一些實施例中，連接子包含編碼自我截切肽的核酸序列。如本文所使用，「自我截切肽」或「2A肽」是指一種寡肽，其使多個蛋白質被編碼為多蛋白，其在轉譯時解離成組分蛋白。術語「自我截切」的使用並非意指蛋白質的水解切割反應。各種自我截切肽或2A肽是本領域技術人員已知的，包括但不限於在小核糖核酸病毒科中所發現的下列病毒，例如口蹄疫病毒(FMDV)，馬鼻炎A病毒(ERAV0)、明脈扁刺蛾病毒(TaV)及豬鐵士古病毒-1(PTV-1)、及心臟病毒例如泰勒病毒(Theilovirus)及腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)。來自FMDV、ERAV、PTV-1，和TaV的2A肽在本文中分別稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」和「T2A」。本領域技術人員將能夠選擇適合用於本發明的自我截切肽。
在一些實施例中，本文的核酸包括核酸序列，其包括CAR編碼序列和顯性負受體及/或轉換受體編碼序列，前述序列透過包括T2A肽序列的連接子分開。在一些實施例中，T2A肽序列包括胺基酸序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：139)，其可以由核酸序列GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCG GCCCT(SEQ ID NO：140)編碼。在一些實施例中，包括T2A肽序列的連接子可以進一步包括本文所述的間隔序列。例如，包括T2A肽序列的連接子可以進一步包括間隔序列，其包括胺基酸序列SGRSGGG(SEQ ID NO：141)，其可以由核酸序列TCCGGAAGATCTGGCGGCGGA(SEQ ID NO：142)編碼。
在一些實施例中，本文的核酸包括核酸序列，其包括CAR編碼序列和顯性負受體及/或轉換受體編碼序列，前述序列透過包括F2A肽序列的連接子分開。在一些實施例中，F2A肽序列包括胺基酸序列VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：143)，其可以由核酸序列GTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCAGGGCCG(SEQ ID NO：144)編碼。
在一些實施例中，連接子還包含編碼弗林蛋白酶(furin)切割位的核酸序列。弗林蛋白酶是一種普遍表現的蛋白酶，其存在於反式高基氏體中，並在蛋白質分泌之前對其前驅物進行加工。弗林蛋白酶在其共通辨識序列的COOH-末端進行切割。各種弗林蛋白酶的共通辨識序列(或「弗林蛋白酶切割位」)是本領域技術人員已知的，其包括但不限於Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO：145)或Arg-X-Arg-Arg(SEQ ID NO：146)及Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO：147)，例如Arg-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO：148)，其中X是任何天然存在的胺基酸。弗林蛋白酶切割位點的另一個例子是X1-Arg-X2-X3-Arg(SEQ ID NO：149)，其中X1是Lys或Arg，X2是任何天然存在的胺基酸，X3是Lys或Arg。本領域技術人員將能夠選擇合適的弗林蛋白酶切割位用於本發明。
在一些實施例中，連接子包含編碼弗林蛋白酶切割位和2A肽的組合的核酸序列。其實例包括但不限於包含編碼弗林蛋白酶和F2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和E2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和P2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和T2A的連接子。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的組合。在前述實施例中，連接子可進一步包含弗林蛋白酶和2A肽之間的間隔序列。各種間隔序列是本領域已知的，包括但不限於甘胺酸絲胺酸(GS)間隔子，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：1)及(GGGS)n(SEQ ID NO：2)，其中n表示至少為1的整數。例示性間隔序列可 包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：4)、GGSGG(SEQ ID NO：5)、GSGSG(SEQ ID NO：6)、GSGGG(SEQ ID NO：7)、GGGSG(SEQ ID NO：8)、GSSSG(SEQ ID NO：9)等。本領域技術人員將能夠選擇適合用於本發明的間隔序列。
在一些實施例中，本發明的核酸包含核酸序列，前述核酸序列包括CAR編碼序列和顯性負受體及/或轉換受體編碼序列，前述編碼序列被弗林蛋白酶-(G4S)2-T2A(F-GS2-T2A)連接子分開。F-GS2-T2A連接子可以由核酸序列CGTGCGAAGAGGGGCGGCGGGGGCTCCGGCGGGGGAGGCAGTGAGGGCCGCGGCTCCCTGCTGACCTGCGGAGATGTAGAAGAGAACCCAGGCCCC(SEQ ID NO：150)編碼，並且可以包含胺基酸序列RAKRGGGGSGGGGSEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：151)。本領域技術人員能夠理解，本發明的連接子可包括可耐受的序列變異。
在一些實施例中，本發明提供了核酸，其包含編碼如本文所述之顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列。在一些實施例中，核酸包括編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列和編碼本文所述之CAR的核酸序列(例如，PSMA-CAR)。在一實施例中，編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列位於不同的核酸上。在一實施例中，編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列位於同一個核酸內。在前述實施例中，編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列係以如本文所述的連接子分開。
舉例來說，本發明的核酸可包含編碼顯性負受體的核酸序列、連接子和編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，連接子包含編碼2A肽(例如F2A)的核酸序列。在一例示性實施例中，本發明的核酸可包括編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列，前述核酸序列被編碼T2A的核酸序列分開。
因此，在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列、編碼連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸 序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼CAR的核酸序列、編碼連接子的核酸序列以及編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，顯性負受體是TGFβRII-DN。在一實施例中，CAR是鼠類J591 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼鼠類J591 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼鼠類J591 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：152)。
在一實施例中，CAR是人源化J591 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編 碼包括2A肽(例如，T2A)的連接子的核酸序列以及編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本文的核酸從5'至3'包括：編碼人源化PSMA-CAR的核酸、編碼包括2A肽(例如，T2A)的連接子的核酸以及編碼顯性負受體及/或轉換受體的核酸。
在一實施例中，CAR是人源化J591 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列。
人源化PSMA-CAR可包括PCT公開號WO2017212250A1和WO2018033749A1中公開的任何重鏈和輕鏈可變區。例如，本發明的人源化PSMA-CAR可包括scFv，其包括本文所述的任何重鏈和輕鏈可變區。在一些實施例中，人源化J591 PSMA-CAR包括人源化J591 PSMA結合域，其包括重鏈和輕鏈可變區，其選自於表19中列出的任何重鏈和輕鏈可變區序列。
在一實施例中，CAR是人類1C3 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：153)。
在一實施例中，CAR是人類2A10 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：154)。
在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：155)。
在一實施例中，CAR是人類2C6 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，核酸從5'至3'包括：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包括T2A 的連接子的核酸序列以及編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：156)。
編碼TGFβRII-DN及PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。舉例來說，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：152~156中任一者所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼TGFβRII-DN和鼠類J591 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：152所示的核酸序列。在一實施例中，編碼TGFβRII-DN和人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：153所示的核酸序列。在一實施例中，編碼TGFβRII-DN和人類2A10 PSMA-CAR的 核酸序列包括SEQ ID NO：154所示的核酸序列。在一實施例中，編碼TGFβRII-DN和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：155所示的核酸序列。在一實施例中，編碼TGFβRII-DN和人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：156所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1-CTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類1C3 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：157)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1-CTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2A10 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：158)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1-CTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：159)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一 實施例中，轉換受體是PD1-CTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2C6 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：160)。
編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。例如，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：157~160中任一者所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至 少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1-CTM-CD28和人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：157所示的核酸序列。在一實施例中，編碼PD1-CTM-CD28和人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：158所示的核酸序列。在一實施例中，編碼PD1-CTM-CD28和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：159所示的核酸序列。在一實施例中，編碼PD1-CTM-CD28和人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：160所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類1C3 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：161)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2A10 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：162)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：163)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2C6 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：164)。
編碼PD1A132L-PTM-CD28及PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。舉例來說，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：161~164中任一者所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：161所示的核酸序列。在一實施例中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：162所示的核酸序列。在一實施例中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：163所示的核酸序列。在一實施例中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：164所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是TIM3-CD28。在一實施例中，CAR是人類1C3 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：165)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是TIM3-CD28。在一實施例中，CAR是人類2A10 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：166)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是TIM3-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：167)。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是TIM3-CD28。在一實施例中，CAR是人類2C6 PSMA-CAR。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： ( SEQ ID NO：168)。
編碼TIM3-CD28及PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。例如，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：165~168中任一者所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼TIM3-CD28和人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：165所示的核酸序列。在一實施例中，編碼TIM3-CD28和人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：166所示的核酸序列。在一實施例中，編碼TIM3-CD28和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：167所示的核酸序列。在一實施例中，編碼TIM3-CD28和人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：168所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1-CTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3zeta域。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28 的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：217)。
編碼PD1-CTM-CD28及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。舉例來說，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：217所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1-CTM-CD28及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：217所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1-CTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：218)。
編碼PD1-CTM-CD28及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人 類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。舉例來說，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：218所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1-CTM-CD28及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：218所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3zeta域。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：219)。
編碼PD1A132L-PTM-CD28及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。舉例來說，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：219所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1A132L-PTM-CD28及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：219所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：220)。
編碼PD1A132L-PTM-CD28及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。例如，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：220所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1A132L-PTM-CD28及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：220所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3zeta域。因此，在一例示性實施例中，本發 明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：221)。
編碼PD1A132L-4-1BB及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。舉例來說，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：221所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、 至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1A132L-4-1BB及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：221所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：222)。
編碼PD1A132L-4-1BB及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。舉例來說，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：222所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1A132L-4-1BB及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：222所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是TIM3-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3zeta域。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：223)。
編碼TIM3-CD28及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。舉例來說，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：223所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼TIM3-CD28及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：223所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，轉換受體是TIM3-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3 zeta域。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的連接子的核酸序列以及編碼包括變異 體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：224)。
編碼TIM3-CD28及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。例如，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：224所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼TIM3-CD28 及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：224所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼第一轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的第一連接子的核酸序列、編碼第二轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的第二連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，第一轉換受體是TIM3-CD28且第二轉換受體是PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，第一轉換受體是PD1A132L-4-1BB且第二轉換受體是TIM3-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括ICOS域及CD3zeta域。在一實施例中，第一和第二連接子是相同的。在一實施例中，第一和第二連接子是不同的。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包括F2A的第一連接子的核酸序列、編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的第二連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包括F2A的第一連接子的核酸序列、編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的第二連接子的核酸序列以及編碼包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：225)。
編碼PD1A132L-4-1BB、TIM3-CD28及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。例如，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：225所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、 至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1A132L-4-1BB、TIM3-CD28及包括ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：225所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼第一轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的第一連接子的核酸序列、編碼第二轉換受體的核酸序列、編碼包括F2A的第二連接子的核酸序列以及編碼CAR的核酸序列。在一實施例中，第一轉換受體是TIM3-CD28且第二轉換受體是PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，第一轉換受體是PD1A132L-4-1BB且第二轉換受體是TIM3-CD28。在一實施例中，CAR是人類2F5 PSMA-CAR，其包括變異體ICOS域及CD3zeta域。在一實施例中，第一和第二連接子是相同的。在一實施例中，第一和第二連接子是不同的。因此，在一例示性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包括F2A的第一連接子的核酸序列、編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的第二連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包括F2A的第一連接子的核酸序列、編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包括F2A的第二連接子的核酸序列以及編碼包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列，其包括以下核酸序列： (SEQ ID NO：226)。
編碼PD1A132L-4-1BB、TIM3-CD28及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可耐受變異是本領域技術人員已知的。例如，在一些實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：226所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在一實施例中，編碼PD1A132L-4-1BB、TIM3-CD28及包括變異體ICOS域及CD3 zeta域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包括SEQ ID NO：226所示的核酸序列。
在一些實施例中，本發明的核酸可以與轉錄控制單元(例如啟動子和促進子(enhancer)等)可操作地連接。適合的啟動子和促進子是本領域技術人員已知的。
為了在細菌細胞中表現，合適的啟動子包括但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。為了在真核細胞中表現，合適的啟動子包括但不限於輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子及促進子單元、巨細胞病毒立即早期啟動子(cytomegalovirus immediate early promoter)、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的長末端重複中的啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子，以及各種本領域已知的組織專一性啟動子。合適的可逆啟動子(reversible promoter)，係包括可逆誘導型啟動子(reversible inducible promoter)，是本領域已知的。前述可逆啟動子可以分離並衍生自許多生物，例如真核生物和原核生物。對來自第一生物體的可逆啟動子的修飾以用於第二生物體(例如，第一生物為原核生物而第二生物為真核生物、或是一第一生物為真核生物而第二生物為原核生物等)是本領域公知的。前述可逆啟動子，和基於前述可逆啟動子但也包含其他控制蛋白的系統，係包括但不限於醇調節啟動子(alcohol regulated promoter)(例如，乙醇去氫酶I(alcA)基因啟動子、對乙醇反式活化蛋白(alcohol transactivator proteins，A1cR)產生反應的啟動子)等、四環素調節啟動子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等的啟動子系統)、類固醇調節啟動子(例如，大鼠糖皮質素受體啟動子系統、人類雌激素受體啟動子系統、類視色素啟動子系統，甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素(ecdysone) 啟動子系統、美服培酮(mifepristone)啟動子系統等)、金屬調節啟動子(如金屬硫蛋白啟動子系統等)、相關病原調節之啟動子(如水楊酸調節啟動子、乙烯調節啟動子、苯并噻二唑調節啟動子等)、溫度調節啟動子(例如，熱休克誘導型啟動子(如HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等))、光調節啟動子、合成誘導型啟動子及前述啟動子的類似物等。
在一些實施例中，啟動子是CD8細胞專一性啟動子、CD4細胞專一性啟動子、嗜中性球專一性啟動子或NK專一性啟動子。例如，啟動子可以是CD4基因啟動子：參見例如，Salmon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：7739、及Marodon等人，(2003)Blood 101：3416。另一個實例啟動子可以是CD8基因啟動子。NK細胞的專一性表現可以藉由使用NcrI(p46)啟動子來達成：參見例如，Eckelhart et al.Blood(2011)117：1565。
為了在酵母菌細胞中表現，合適的啟動子是組成型啟動子，例如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子等；或可調控的啟動子，如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子及AOX1(例如，用於畢赤酵母菌屬(Pichia))。選擇合適的載體和啟動子是本領域普通技術人員的公知常識。適用於原核宿主細胞的啟動子包括但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子、trp啟動子、lac操縱子啟動子、雜交啟動子(hybrid promoter)，例如lac/tac雜交啟動子、tac/trc雜交啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子、trc啟動子、tac啟動子等、araBAD啟動子、體內調控的啟動子，例如ssaG啟動子或相關啟動子(參見例如，美國專利公開號20040131637)、pagC啟動子(Pulkkinen及Miller，J.Bacteriol.(1991)173(1)：86-93、Alpuche-Aranda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21)：10079-83)，nirB啟動子(Harborne等人，Mol.Micro.(1992)6：2805-2813)等(參見例如，Dunstan等人，Infect.Immun.(1999)67：5133-5141、McKelvie等人，Vaccine(2004)22：3243-3255、及Chatfield等人，Biotechnol.(1992)10：888-892)、sigma70啟動子，例如共通sigma70啟動 子(參見例如，GenBank登錄號AX798980、AX798961及AX798183)、固定相啟動子(stationary phase promoter)，例如dps啟動子、spv啟動子等、源自致病島(pathogenicity island)SPI-2的啟動子(參見例如WO96/17951)、actA啟動子(參見例如，Shetron-Rama等人，Infect.Immun.(2002)70：1087-1096)、rpsM啟動子(參見例如，Valdivia及Falkow Mol.Microbiol.(1996).22：367)、tet啟動子(參見例如，Hillen,W.及Wissmann，A.(1989)In Saenger,W.and Heinemann,U.(eds),Topics in Molecular and Structural Biology,Protein--Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK,Vol.10,pp.143-162)、SP6啟動子(參見例如，Melton等人，Nucl.Acids Res.(1984)12：7035)等等。適用於原核生物如大腸桿菌的強效啟動子包括但不限於Trc、Tac、T5、T7和PLambda。用於細菌宿主細胞的操縱子的非限制性實例包括乳糖啟動操縱子(當與乳糖接觸時，LacI抑制蛋白改變結構，進而阻止Lad抑制蛋白與操縱子結合)、色胺酸啟動操縱子(當與色胺酸複合時，TrpR抑制蛋白具有結合操縱子的結構；在不存在色胺酸的情況下，TrpR抑制蛋白具有不與操縱子結合的結構)及tac啟動操縱子(參見例如deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80：21-25)。
合適的啟動子的其他實例包括立即早期巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子序列。該啟動子序列是強效組成型啟動子序列，其能夠驅動任何與其可操作地連接的多核苷酸序列的高水平表現。也可以使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、家禽白血病病毒啟動子，艾伯斯坦-巴爾病毒迅早期啟動子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)、EF-1α啟動子、以及人類基因啟動子，例如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌胺酸激酶啟動子。此外，本發明不應僅限於使用組成型啟動子，本發明亦涵蓋誘導型啟動子。誘導型啟動子可以作為一種分子開關，在有需要時，可用來啟動與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現，或是在不想要發生這種表現時，用來關閉與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現。誘導型啟動子的實例包括但 不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子、黃體素啟動子及四環素啟動子。
在一些實施例中，含有合適啟動子的基因座或構築體或轉基因，係透過誘導系統的誘導來進行不可逆轉換。適用於誘導不可逆轉換的系統是本領域熟知的，例如，不可逆轉換的誘導可以利用Cre-lox介導的重組(參見例如，Fuhrmann-Benzakein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28：e99，其公開內容通過引用併入本文)。任何本領域已知的重組酶、核酸內切酶、連接酶，重組位點等的合適組合，皆可用於產生不可逆轉換的啟動子。本文中所述的進行位點專一性重組的方法、機制及需求，可用於產生不可逆轉換的啟動子，並且是本領域熟知的，參見例如Grindley等人，Annual Review of Biochemistry(2006)567-605、及Tropp,Molecular Biology(2012)(Jones & Bartlett Publishers,Sudbury,Mass.)中所述內容，其公開內容以引用方式而納入本文。
在一些實施例中，本發明的核酸還包含編碼有TCR/CAR誘導型表現盒(inducible expression cassette)的核酸序列。在一實施例中，TCR/CAR誘導型表現盒係用於產生在TCR/CAR訊息傳遞後所釋放的轉基因多肽產物。參見例如，Chmielewski及Abken，Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8)：1145-1154、及Abken,Immunotherapy(2015)7(5)：535-544。在一些實施例中，本文的核酸更包括編碼與T細胞活化反應性啟動子可操作地連接的細胞激素的核酸序列。在一些實施例中，與T細胞活化反應性啟動子可操作地連接的細胞激素位於獨立的核酸序列上。在一實施例中，細胞激素是IL-12。
本發明的核酸可以存在於表現載體及/或轉殖載體中。表現載體可包括可篩選標記、複製起始序列及提供載體複製及/或維持的其他特徵。合適的表現載體包括例如質體、病毒載體等。本領域技術人員已知大量合適的載體和啟動子、且目前已有許多商售可購得而用於產生標的重組構築體。可透過實例提供以下載體，且不應解釋為本發明的限制：細菌：pBs、噬菌體、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，Calif，美國)、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL(Pharmacia)。
表現載體通常具有位於啟動子序列附近的方便限制性位點(convenient restriction site)，讓編碼有異源蛋白質的核酸序列得以插入。表現宿主可具有操作性的可篩選標記。合適的表現載體包括但不限於病毒載體(例如基於痘病毒的病毒載體、小兒麻痺病毒、腺病毒(參見例如，Li等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35：2543-2549、Borras等人，Gene Ther.(1999)6：515-524、Li及Davidson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：7700-7704、Sakamoto等人，H.Gene Ther.(1999)5：1088-1097、WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)、腺相關病毒(參見例如，Ali等人，Hum.Gene Ther.(1998)9：81-86、Flannery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6916-6921、Bennett等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38：2857-2863、Jomary等人，Gene Ther.(1997)4：683690、Rolling等人，Hum.Gene Ther.(1999)10：641-648、Ali等人，Hum.Mol.Genet.(1996)5：591-594、Srivastava於WO 93/09239、Samulski等人，J.Vir.(1989)63：3822-3828、Mendelson等人，Virol.(1988)166：154-165及Flotte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：10613-10617))、SV40、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(參見例如，Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sei.USA(1997)94：10319-23、Takahashi等人，J.Virol.(1999)73：7812-7816)、反轉錄病毒載體(例如，鼠類白血病病毒、脾臟壞死病毒及衍生自反轉錄病毒的載體，例如勞氏肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、家禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)及乳癌病毒)及前述病毒載體的類似物等。
適合使用的其他表現載體例如但不限於慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體、經改造的雜交病毒載體、轉位子所介導的載體等。病毒載體技術是本領域公知的，並且描述於例如Sambrook等人，2012，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press，NY)，以及其他病毒學和分子生物學手冊中。可用作載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。
傳統上，合適的載體含有可在至少一種生物中發揮功能的複制起 始序列、啟動子序列、方便的限制性內切核酸酶位點及一或多個可篩選擇標記(例如，WO 01/96584、WO 01/29058及美國專利號6,326,193)。
在一些實施例中，表現載體(例如，慢病毒載體)可用於將TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體引入免疫細胞或其前驅細胞(例如T細胞)中。因此，本發明的表現載體(例如，慢病毒載體)可包含編碼有TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體的核酸。在一些實施例中，表現載體(例如，慢病毒載體)將包含有助於TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體的功能性表現的其他單元。在一些實施例中，包含編碼TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體核酸的表現載體，還包含哺乳動物啟動子。在一實施例中，載體還包含延長因子-1-α啟動子(EF-1α啟動子)。使用EF-1α啟動子可以提高下游轉基因(例如TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體編碼核酸序列)的表現效率。生理啟動子(例如，EF-1α啟動子)可能較不會誘發由嵌入所介導的遺傳毒性，並且可消除反轉錄病毒載體轉化幹細胞的能力。適用於載體(例如慢病毒載體)的其他生理學啟動子是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體中。在一些實施例中，載體(例如，慢病毒載體)還包含非必需順式作用序列(non-requisite cis acting sequence)，前述序列可以改善效價和基因表現。非必需順式作用序列的一個非限制性實例是中心多嘌呤管道和中心終止序列(central polypurine tract and central termination sequence，cPPT/CTS)，其對於有效的反轉錄和細胞核輸入是重要的。其他非必需的順式作用序列是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。在一些實施例中，載體還包含轉錄後調控元件。轉錄後調控元件可以改善RNA轉譯、改善轉基因表現並穩定RNA轉錄物。轉錄後調控元件的一個實例是土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)。因此，在一些實施例中，用於本發明的載體還可包含WPRE序列。各種轉錄後調節元件是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。本發明的載體可以進一步包含其他元件，例如用於RNA轉運的rev反應元件(rev response element，RRE)、包裝序列(packaging sequences)和5'和3'長末端重複(LTR)。術語「長末端重複」或「LTR」是指 位於反轉錄病毒DNA末端的鹼基對的域，其包含U3、R和U5區。LTR通常提供表現反轉錄病毒基因所需的功能(例如，基因轉錄物的促進、起始及多腺苷酸化)和病毒複製。在一實施例中，本發明的載體(例如，慢病毒載體)包括3'U3缺失的LTR。因此，本發明的載體(例如，慢病毒載體)可包含本文所述元件的任何組合，以增強轉基因功能性表現的效率。例如，除了編碼TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體的核酸之外，本發明的載體(例如，慢病毒載體)可以包含WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5'LTR、3'U3缺失的LTR'。
本發明的載體可以是自我去活化載體(self-inactivating vector)。如本文所使用的，術語「自我去活化載體」是指其中3'LTR促進子啟動子區(U3區)已被修飾(例如，透過缺失或取代)的載體。自我去活化載體可以在病毒第一次複製後阻止病毒轉錄。因此，自我去活化載體可以僅感染一次，然後嵌入到宿主基因體(例如哺乳動物基因體)中，且不能進一步被傳遞。因此，自我去活化載體可以大幅的降低產生出具有複製能力病毒的風險。
在一些實施例中，本發明的核酸可以是RNA，例如體外合成的RNA。用於體外合成RNA的方法是本領域技術人員已知的，任何已知的方法皆可用來合成包含編碼本發明TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體序列的RNA。將RNA引入宿主細胞的方法是本領域已知的。參見例如，Zhao等人，Cancer Res.(2010)15：9053。將包含編碼本發明的TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體的核苷酸序列的RNA引入宿主細胞，係可在體外或離體或體內進行。例如，宿主細胞(例如，NK細胞、胞毒性T淋巴球等)可以用包含本發明編碼TCR/CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體核苷酸序列的RNA，在體外或離體進行電穿孔。
為了評估多肽或其部分的表現，待引入細胞的表現載體還可含有可篩選標記基因或報導基因，或兩者皆有，以便於從被病毒載體所轉染或感染的細胞群中鑑定和選出有表現的細胞。在一些實施例中，可篩選標記可以在獨立的DNA片段上攜帶，並用於共轉染步驟。可篩選標記和報導基因的兩側可以接有適當的調控序列，以使其能夠在宿主細胞中表現。有用的可篩選標記例如包括但不限於抗生素抗藥性基因。
報導基因係用來鑑定潛在被轉染的細胞和評估調控序列的功能。一般來說，報導基因在受體生物體或組織中是不存在或不表現的，且編碼有一多肽，該多肽的表現可透過一些易於檢測的特性(例如酵素活性)顯現出來。在將DNA引入受體細胞後，在適當的時間評估報導基因的表現。合適的報導基因可包括但不限於下列基因：編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌的鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。
F.經修飾的免疫細胞
本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如T細胞)，其包括CAR及/或顯性負受體及/或轉換受體。因此，前述經修飾的細胞具有由其所表現的CAR引導的特異性。例如，包括PSMA-CAR的本發明的經修飾細胞對標靶細胞上的PSMA具有特異性。
在一些實施例中，本發明的經修飾的細胞包括CAR。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力的CAR。在一些實施例中，本發明的經修飾細胞包括顯性負受體及/或轉換受體。在一實施例中，本發明經修飾的細胞包括顯性負受體，其能夠降低微環境中負訊息傳遞分子的作用。在一實施例中，本發明經修飾的細胞包括轉換受體，其能夠降低微環境中負訊息傳遞分子的作用，並在經修飾的細胞內將負訊號轉換成正訊號。在一些實施例中，本發明經修飾的細胞包括CAR和顯性負受體及/或轉換受體。在一實施例中，本發明經修飾的細胞包括對標靶細胞具有對PSMA的親和力的CAR、以及顯性負受體及/或轉換受體。包括本發明的顯性負受體及/或轉換受體的經修飾的細胞能夠借助於它們各自的胞外域接合微環境中的負訊息傳遞分子(例如，抑制性配體)。在一些實施例中，包括顯性負受體的本發明的經修飾的細胞能夠降低負訊息傳遞分子在微環境中的作用，其中顯性負受體包括與負訊號相關的胞外域。在一些實施例中，包含轉換受體的本發明的經修飾的細胞能夠將微環境中的負訊息傳遞分子的作用轉化為正訊號，其中所述轉換受體包括與所述負訊號相關的胞外域和與正訊號相關的胞內域。
在一例示性實施例中，本發明的經修飾的細胞包括顯性負受體，其能夠降低負訊息傳遞分子的作用。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括TGFβRII-DN。
在一例示性實施例中，本發明的經修飾的細胞包括轉換受體，其能夠在經修飾的細胞內將負訊息傳遞分子的作用轉化為正(例如活化)訊號。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包含PD1-CTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包含PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包含TIM3-CD28。
在一例示性實施例中，本發明的經修飾的細胞包括PSMA-CAR及顯性負受體，其能夠降低負訊息傳遞分子的作用。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括鼠類J591 PSMA-CAR及TGFβRII-DN。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR及TGFβRII-DN。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR及TGFβRII-DN。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR及TGFβRII-DN。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR及TGFβRII-DN。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR及TGFβRII-DN。除了對標靶細胞上的PSMA具有親和力之外，這種經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)能夠減少來自它們所處的微環境的抑制性TGF-β訊號。
在一例示性實施例中，本發明的經修飾的細胞包含PSMA-CAR及轉換受體，其能夠在經修飾的細胞內將負信息傳遞導分子的抑制作用轉化為正訊號。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括鼠類J591 PSMA-CAR及PD1-CTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人源化J591 PSMA-CAR和PD1-PTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類1C3 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2A10 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2F5 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2C6 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一實施例中， 本發明的經修飾的細胞包括鼠類J591 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人源化J591 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類1C3 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2A10 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2F5 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2C6 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括鼠類J591 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人源化J591 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類1C3 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2A10 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2F5 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2C6 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括鼠類J591 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人源化J591 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類1C3 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2A10 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2F5 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2C6 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括鼠類J591 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人源化J591 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類1C3 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2A10 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2F5 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2C6 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括鼠類J591 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人 源化J591 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類1C3 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2A10 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2F5 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2C6 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括鼠類J591 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人源化J591 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類1C3 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2A10 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2F5 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括人類2C6 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。除了對標靶細胞具有對PSMA的親和力之外，前述經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)能夠在經修飾的細胞內將來自微環境的抑制性PD-1或TGFβ訊號轉換成正(例如，活化)訊號。此類經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)除了對標靶細胞具有對PSMA的親和力之外，還能夠在經修飾的細胞內將來自微環境的抑制性PD-1或TIM-3訊號轉換為正(例如，活化)CD28訊號。
在一例示性實施例中，本發明的經修飾的細胞包括編碼雙特異性抗體的核酸。在一實施例中，前述經修飾的細胞可在經修飾的細胞外分泌雙特異性抗體。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括編碼雙特異性抗體的核酸，其中所述雙特異性抗體包含一個以上的抗原結合域，其中至少一個抗原結合域結合負訊息傳遞分子(例如，在經修飾的細胞的微環境中發現的負訊息傳遞分子)，並且至少一個抗原結合域結合經修飾的細胞表面上的共刺激分子。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括編碼如本文所述的13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括編碼如本文所述的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括編碼如本文所述的11B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括編碼如本文所 述的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的核酸。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括編碼如本文所述的TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的核酸。
在一例示性實施例中，本發明的經修飾的細胞包括PSMA-CAR、顯性負受體及/或轉換受體，並且還可包括編碼雙特異性抗體的核酸。前述經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)除了對標靶細胞具有對PSMA的親和力之外，還能夠減少它們所處的微環境的抑制訊號，並將雙特異性抗體分泌到它們所處的微環境中。在這些細胞中，雙特異性抗體的活性可以進一步增加經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)的活化。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括PSMA-CAR，其選自於下列群組：鼠類J591 PSMA-CAR、人源化J591 PSMA-CAR、人類1C3 PSMA-CAR、人類2A10 PSMA-CAR、人類2F5 PSMA-CAR及人類2C6 PSMA-CAR；TGFβRII-DN；以及選自於下列群組的表現和分泌的雙特異性抗體：13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體、10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體、1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體、TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體及TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體。
在一例示性實施例中，本發明的經修飾的細胞包括PSMA-CAR、轉換受體，並且還可包括編碼雙特異性抗體的核酸。前述經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)除了對標靶細胞具有對PSMA的親和力之外，還能夠在經修飾的細胞內將來自它們所處的微環境的抑制訊號轉換成正(例如，活化)訊號，並分泌雙特異性抗體到它們所處的微環境中。在這些細胞中，雙特異性抗體的活性可以進一步增加經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)的活化。在一實施例中，本發明的經修飾的細胞包括PSMA-CAR，其選自於下列群組：鼠類J591 PSMA-CAR、人源化J591 PSMA-CAR、人類1C3 PSMA-CAR、人類2A10 PSMA-CAR、人類2F5 PSMA-CAR及人類2C6 PSMA-CAR；選自於下列群組的轉換受體：PD1-CTM-CD28轉換受體、PD1A132L-PTM-CD28轉換受體及TIM3-CD28轉換受體；以及選自於下列群組的表現和分泌的雙特異性抗體：13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體、10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗 體、1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體、TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體及TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體。
本發明的包括本發明的PSMA-CAR、顯性負受體及/或轉換受體的任何經修飾的細胞、及/或表現和分泌本發明的雙特異性抗體，是本領域技術人員可以想像的，並且藉由本文的公開內容可以容易地理解及製造。
G.產生經修飾的免疫細胞的方法
本發明提供了產生或製造本發明的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如T細胞)的方法，用於腫瘤免疫療法，例如過繼性免疫療法。細胞通常透過引入編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體及/或雙特異性抗體及/或其組合的一或多種核酸來進行改造。
在一些實施例中，係透過表現載體將編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體的一或多種核酸引入細胞中。本文提供了包含編碼有標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸序列的表現載體。合適的表現載體包括慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體、經改造的雜交病毒、裸DNA(包括但不限於轉位子所介導的載體，例如Sleeping Beauty 轉位子、Piggybak轉位子及Integrases轉位子(如Phi31))。其他某些合適的表現載體包括單純皰疹病毒(HSV)和反轉錄病毒表現載體。
腺病毒表現載體係基於腺病毒，而腺病毒嵌入到基因體DNA中的能力不好，但轉染宿主細胞的效率高。腺病毒表現載體含有足夠的腺病毒序列，其足以：(a)支持表現載體的包裝，及(b)最終在宿主細胞中表現標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合。在一些實施例中，腺病毒基因體是36kb的線性雙股DNA。其中，為了製備本發明的表現載體，可以插入外源DNA序列(例如，編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸)以取代大片段的腺病毒DNA(參見例如，Danthinne及Imperiale，Gene Therapy(2000)7(20)：1707-1714)。
另一種表現載體是基於腺相關病毒的，其係利用腺病毒偶合系 統。該AAV表現載體嵌入到宿主基因體中的頻率很高。它可以感染非分裂中的細胞，進而使其可將基因遞送到哺乳動物細胞中，例如，在組織培養物中或體內。AAV載體能夠感染相當多種的宿主。關於AAV載體的產生和使用的細節，係描述於美國專利號5,139,941及4,797,368中。
反轉錄病毒表現載體能夠嵌入到宿主基因體中，遞送大量外來遺傳物質，感染許多不同的物種和細胞類型，並被包裝在特殊細胞株中。透過在某些位置將核酸(例如，編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸)插入病毒基因體中，以產生具有複製缺陷的病毒，來構築反轉錄病毒載體。儘管反轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型，但標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的嵌入和穩定表現需要宿主細胞的分裂。
慢病毒載體係衍生自慢病毒。慢病毒是複雜的反轉錄病毒，除了常見的反轉錄病毒基因gag、pol和env之外，其還含有具有調節或結構功能的其他基因(參見例如，美國專利號6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。透過將HIV毒力基因進行多次減毒以產生慢病毒載體，例如，讓env、vif、vpr、vpu和nef等基因產生缺失，而使載體具備生物安全性。慢病毒載體能夠感染非分裂中的細胞，並且可以用於體內和離體的基因轉移和表現，例如編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸(參見例如美國專利號5,994,136)。
可以透過本領域技術人員已知的任何方法將包括本發明內容的核酸的表現載體引入宿主細胞中。如果需要，表現載體可包括用於轉染的病毒序列。或者，可以透過融合、電穿孔、基因槍法、轉染、脂質轉染或其類似方式等引入表現載體。宿主細胞可以在引入表現載體之前，係在培養基中生長和擴增，接著進行適當的處理以引入和嵌入載體。然後可以將宿主細胞擴增，並可以藉助載體中存有的標記來進行篩選。可以使用本領域已知的各種標記，並且可以包括hprt、新黴素抗藥性、胸苷激酶、潮黴素抗藥性等。如本文所使用的，術語「細胞」、「細胞株」和「細胞培養物」可以是可以交替使用的。在一些 實施例中，宿主細胞是免疫細胞或其前驅細胞，例如T細胞、NK細胞或NKT細胞。
本發明還提供了基因改造細胞，其包括並穩定表現有本發明的標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合。在一些實施例中，基因改造細胞是基因改造T-淋巴球(T細胞)、初級T細胞(naive T cells，TN)、記憶T細胞(例如，中樞記憶T細胞(TCM)、作用記憶細胞(effector memory cell，TEM))、自然殺手細胞(NK細胞)和能夠產生治療相關子代的巨噬細胞。在一實施例中，基因改造細胞是自體細胞。
將具有本發明內容的核酸的表現載體穩定的轉染至宿主細胞，可以用來產生經修飾的細胞(例如，包含標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或表現及分泌雙特異性抗體、及/或其組合)。其他產生本發明經修飾細胞的方法，包括但不限於化學轉化方法(例如，使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物(dendrimer)、微脂體及/或陽離子聚合物)、非化學轉化方法(例如，電穿孔、光學轉化、基因電轉移及/或流體動力學遞送)，及/或基於顆粒的方法(例如，使用基因槍及/或磁性轉染進行的基因交付(impalefection))。表現本發明的標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的轉染細胞可以離體方式進行擴增。
以物理方式將表現載體引入宿主細胞的方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、基因槍法(particle bombardment)、顯微注射、電穿孔或其類似方法等。產生包括載體及/或外源核酸的細胞的方法是本領域習知的。參見例如，Sambrook等人，(2001),Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。以化學方式將表現載體引入宿主細胞的方法包括膠體分散系統(例如巨分子複合體、奈米膠囊、微球體、珠子)和基於脂質的系統(包括水包油的乳劑、微胞(micelles)、混合微胞和微脂體)。
適合使用的脂質可以由市面上購得。例如，二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(dimyristyl phosphatidylcholine，「DMPC」)可購自Sigma，St.Louis，MO、雙二十六烷基磷酸(dicetyl phosphate，「DCP」)可購自K&K實驗室(Plainview，NY)、膽固醇(「Choi」)可購自Calbiochem-Behring、二肉荳蔻醯磷脂醯甘 油酯(dimyristyl phosphatidylglycerol，「DMPG」)和其他脂質可購自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham，AL)。脂質在氯仿或氯仿/甲醇中的儲備原液，可以儲存在約-20℃。因為氯仿比甲醇更容易蒸發，因此被用作唯一的溶劑。「微脂體」是通用術語，其係指因雙層脂質進行封閉生成或聚集而產生的各種單層及多層脂質載體。微脂體之特徵為具有囊泡結構，其具有雙層磷脂膜，而內部為水性介質。多層微脂體具有多個脂質層，其係藉由水性介質所分隔。當磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們會自動的形成。在形成封閉結構之前，脂質組分會進行自體重排，並在雙層脂質之間截留水和溶於水中的溶質(Ghosh等人，1991Glycobiology 5：505-10)。本實施例還包括在溶液中具有與正常囊泡結構不同結構的組成物。例如，脂質可呈現微胞結構(micellar structure)或僅以脂質分子之不均勻聚集體的形式存在。本實施例還包括脂質轉染試劑-核酸複合體(lipofectamine-nucleic acid complexes)。
無論是將外源核酸引入宿主細胞中的方法、或是以其他使細胞暴露於本發明抑制劑的方法，為了要證實核酸在宿主細胞中之存在，可以進行多種檢測。前述檢測包括，例如，本領域技術人員所習知的分子生物學檢測(例如南方墨點法和北方Northern墨點法、RT-PCR和PCR)、例如檢測特定肽的存在或不存在的生物化學檢測(例如透過免疫學方法(ELISA和蛋白質墨點法))，或透過本文所述的測定法鑑定落入本發明範圍內的試劑。
在一實施例中，引入宿主細胞的核酸是RNA。在另一實施例中，RNA是mRNA，其包含體外轉錄RNA或人工合成RNA。RNA可以利用聚合酶連鎖反應(PCR)所產生的模板透過體外轉錄方式所產生。任何來源的目標DNA可以藉由PCR直接轉化成模板，並利用適合的引子和RNA聚合酶來進行體外mRNA合成。DNA的來源可以是，例如，基因體DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合適的DNA來源。
使用PCR產生mRNA體外轉錄用的模板，然後將其引入細胞。進行PCR的方法是本領域習知的。用於PCR的引子係經設計而具有與可作為PCR模板的DNA區域實質上互補的區域。如本文所使用的，「實質上互補的」是指係指引子序列中之大部分或全部鹼基為互補。實質上互補的序列能夠在 PCR的退火條件下與預期的DNA目標發生黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板的任何部分實質上互補。例如，可以設計引子以擴增一基因在細胞中通常會發生轉錄的部分(開放閱讀框)，其包括5'和3'UTR。引子還可以經設計以擴增一基因的一部分，其係編碼有特定目標域。在一實施例中，引子係經設計以擴增人類cDNA的編碼區，包括全部或部分的5'和3'UTR。適用於PCR的引子，可透過本領域習知的合成方法來產生。「正向引子」是指含有一核苷酸片段的引子，前述核苷酸片段與待擴增DNA序列上游的DNA模板核苷酸實質上互補。「上游」在本文中用於指相對於編碼股中待擴增DNA序列的5'位置。「反向引子」是指含有一核苷酸片段的引子，前述核苷酸片段與待擴增DNA序列下游的雙股DNA模板基本上互補。「下游」在本文中用於指相對於編碼股中待擴增DNA序列的3'位置。
本文也可以利用能夠促進RNA穩定性及/或轉譯效率的化學結構。RNA優選地具有5'和3'UTR。在一實施例中，5'UTR的長度為0至3000個核苷酸。待添加到編碼區的5'和3'UTR序列的長度可以不同方法來改變，包括但不限於設計會黏接至UTR不同區域的PCR引子。使用前述方法，本發明所屬技術領域具有通常知識者可以修飾所需的5'和3'UTR的長度，用以使所轉錄出的RNA於轉染後有最佳的轉譯效率。
5'和3'UTR部分可以是標靶基因天然存在的內源5'和3'端的UTR。或者，可以透過在正向和反向引子中併入UTR序列，或透過其他任何對模板的修飾，來添加對標靶基因而言不是內源的UTR序列。使用對標靶基因而言不是內源的UTR序列，有助於修飾RNA的穩定性及/或轉譯效率。例如，目前已知3'UTR序列中的AU富含單元(AU-rich elements)會降低mRNA的穩定性。因此，基於本領域熟知的UTR特性來選擇或設計3'UTR，可以增加所轉錄出的RNA穩定性。
在一實施例中，5'UTR可含有內源基因的克紮克(Kozak)序列。或者，當如上所述係透過PCR添加對標靶基因而言不是內源的5'UTR時，可以透過添加5'UTR序列來重新設計共通Kozak序列。Kozak序列可以提高某些RNA轉錄物的轉譯效率，但似乎並非所有的RNA都需要此種序列來進行有效率的轉 譯。本領域中已知有許多mRNA需要Kozak序列。在其他實施例中，5'UTR可以衍生自RNA病毒，其RNA基因體在細胞中是穩定的。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5'UTR中以阻止mRNA的核酸外切酶降解。
為了能夠在無需基因轉殖也能夠從DNA模板進行RNA合成，轉錄啟動子應連接到待轉錄序列上游的DNA模板上。當充當RNA聚合酶啟動子的序列被添加到正向引子的5'末端時，RNA聚合酶啟動子在PCR產物中會被併入待轉錄的開放閱讀框的上游。在一實施例中，啟動子是T7聚合酶啟動子，如本文其他部分所述。其他有用的啟動子包括但不限於T3和SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3和SP6啟動子的共通核苷酸序列是本領域已知的。
在一實施例中，mRNA在5'末端具有封帽並在3'端具有Poly(A)尾部，其確定細胞中核醣體結合，轉譯起始和mRNA的穩定性。在環狀DNA模板上，例如質體DNA，RNA聚合酶會產生長多聯體(concatemeric)產物，其不適於在真核細胞中表現。質體DNA的轉錄物，其於3' UTR末端線性化後會產生正常尺寸之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化，轉染至真核細胞後亦不會發生作用。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄物的3'末端延伸超出模板的最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf，Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)、Nacheva and Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003))。
在PCR期間使用含有聚胸腺苷酸尾(例如，100個胸腺苷酸所聚合而成，尺寸可為50至5000個胸腺苷酸)之反向引子，或在PCR之後藉由其他任何方法-包括但不限於DNA接合或體外重組，可以在轉錄用DNA模板上生成po1yA/T區段。聚腺苷酸尾也讓RNA穩定且減少其降解。一般而言，聚腺苷酸尾的長度與經轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施例中，聚腺苷酸尾為100至5000個腺苷。
在使用Poly(A)聚合酶(例如大腸桿菌polyA聚合酶，E-PAP)進行體外轉錄後，可以進一步延長RNA的聚腺苷酸尾部。在一實施例中，將聚腺苷酸尾部的長度從100個核苷酸增加至300至400個核苷酸，可導致RNA的 轉譯效率增加約2倍。另外，不同化學基團與3'末端的連接可以增加mRNA穩定性。這種連接可含有修飾的/人工的核苷酸、適配體和其他化合物。例如，可以使用聚腺苷酸聚合酶將ATP類似物併入聚腺苷酸尾部。ATP類似物可以進一步增加RNA的穩定性。
5'端帽也為RNA分子提供穩定性。在優選的實施例中，本文公開的方法所產生的RNA包括5'端帽。提供5'端帽的方法是本領域已知的，且描述於下列文獻中：Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)、Stepinski等人，RNA,7：1468-95(2001)、Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005)。
在一實施例中，將RNA電穿孔到細胞中，例如體外轉錄的RNA。本文可以包括任何適用於細胞電穿孔的溶質，其可以包含促進細胞滲透性和活性的因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑和介面活性劑。
在一些實施例中，本發明的核酸可以是RNA，例如體外合成的RNA，其編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合。用於體外合成RNA的方法是本領域已知的，任何已知的方法皆可用來合成包含編碼本發明標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的RNA。將RNA引入宿主細胞的方法是本領域已知的。參見例如，Zhao等人，Cancer Res.(2010)15：9053。將包含編碼本發明的標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核苷酸序列的RNA引入宿主細胞，係可在體外或離體或體內進行。例如，宿主細胞(例如，NK細胞、胞毒性T淋巴球等)可以用包含編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核苷酸序列的RNA，在體外或離體進行電穿孔。
本文所公開的方法可應用於基礎研究和治療領域中關於T細胞活性的調節，用於癌症、幹細胞，急性和慢性感染以及自體免疫疾病，包括分析經基因修飾的T細胞殺死標靶癌細胞的能力。
該方法還提供了大範圍地控制表現量的能力，其係透過改變例如啟動子或輸入RNA的量，裨能單獨調節表現量。此外，基於PCR的mRNA產 生技術，對於設計出具有不同結構和其域組合之mRNA，有很大的幫助。
本發明RNA轉染方法其中一個優點是，RNA轉染基本上是暫時性的且無需載體。RNA轉基因可以被遞送至淋巴球，並在簡短的體外細胞活化後於其中表現，其係作為最小表現卡匣而不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉基因不會嵌入到宿主細胞基因體中。由於RNA的轉染效率及其一致性地修飾整個淋巴球族群的能力，故無須進行細胞轉殖。
用體外轉錄的RNA(in vitro-transcribed RNA，IVT-RNA)對T細胞來進行基因修飾，係利用兩種不同的策略，這兩種策略都已經在各種動物模型中測試過。透過脂質轉染或電穿孔用體外轉錄的RNA轉染細胞。理想的是能夠使用各種修飾來穩定IVT-RNA，以使轉移的IVT-RNA的表現能夠延長。
在文獻中已知有某些IVT載體，其以標準化方式用作體外轉錄的模板，並且以產生穩定RNA轉錄物的方式進行基因修飾。目前，本領域所使用的方法是基於具有以下結構的質體載體：能使RNA進行轉錄的5'RNA聚合酶啟動子，接著是目標基因(其3'及/或5端為'非轉譯區(UTR))、以及含有50至70個腺核苷酸的3'端多腺苷酸卡匣。在體外轉錄之前，透過II型限制酶將環狀質體在多腺苷酸卡匣的下游進行線性化(辨識序列對應於切割位點)。因此，多腺苷酸卡匣對應於轉錄物中後面的聚腺苷酸序列。該程序的結果為一些核苷酸在線性化後保留為酶切位點的一部分，並在3'末端延伸或掩蔽聚腺苷酸序列。目前尚不清楚這種非生理性突出物是否會影響這種構築體在細胞內所產生的蛋白量。
在另一實施例中，透過電穿孔將RNA構築體遞送到細胞中。參見例如，US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教示的將核酸構築體電穿孔到哺乳動物細胞中的調配物和方法。前述方式的各種參數，包括任何已知細胞類型所需的電穿孔電場強度，基本上已揭露於相關研究文獻以及本領域許多專利和申請案中。參見例如美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264及美國專利號7,173,116。應用於治療的電穿孔裝置可以在市面上買到，例如MedPulserTM DNA電穿孔處理系統(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，並且描述於下列專利 中，例如美國專利號4,522,517、6,567,694、6,516,223、5,993,434、6,181,964、6,241,701及6,233,482。電穿孔也可用於體外轉染細胞，例如在US 20070128708A1中所述的。電穿孔也可用於在體外將核酸遞送到細胞中。因此，利用本領域技術人員已知的各種可用裝置和電穿孔系統中的任何一種，透過電穿孔所介導的將核酸(包括表現構築體)施用於細胞，提供了一種將目標RNA遞送至目標細胞的新方法。
在一些實施例中，可以在引入編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸分子之前、期間及/或之後培養或培養免疫細胞(例如T細胞)。在一些實施例中，可以在引入編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸分子之前、期間或之後培養或培養細胞(例如T細胞)，例如在用編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體及/或雙特異性抗體、及/或其組合的病毒載體(例如慢病毒載體)轉導細胞之前、期間或之後。在一些實施例中，該方法包括在引入編碼標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸分子之前用刺激或活化劑(例如抗CD3/抗CD28抗體)活化或刺激細胞。
在一些實施例中，其中編碼本發明的標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸序列位於一或多個獨立的核酸序列上，可以改變引入一或多種核酸序列中的每一種的順序。例如，可先將編碼標的CAR及顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列引入宿主細胞，然後引入編碼標的雙特異性抗體的核酸序列。例如，可先將編碼標的雙特異性抗體的核酸序列引入宿主細胞，然後引入編碼標的CAR及顯性負受體及/或轉換受體的核酸序列。在一些實施例中，將一或多種核酸序列中的每一種同時引入宿主細胞中。本領域技術人員將能夠決定將一或多種核酸序列中的每一種引入宿主細胞的順序。
H.免疫細胞的來源
在擴增之前，免疫細胞的來源是從受試者獲得，將其用於離體操作。用於離體操作的標靶細胞的來源還可以包括例如自體的或異體捐贈者的血 液、臍帶血或骨髓。例如，免疫細胞的來源可以來自待用本發明的經修飾免疫細胞治療的受試者，例如是受試者的血液、受試者的臍帶血或受試者的骨髓。受試者的非限制性實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。優選地，受試者是人類。
免疫細胞可以從許多來源獲得，包括血液、周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾組織、臍帶、淋巴或淋巴器官。免疫細胞是免疫系統的細胞，例如先天性或適應性的免疫細胞，例如骨髓類(myeloid)或淋巴類(lymphoid)細胞(包括淋巴球，通常是T細胞及/或NK細胞)。其他例示性細胞包括幹細胞，例如全能幹細胞和多能幹細胞，多能幹細胞包括誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。在一些實施例中，細胞是人類細胞。關於待治療的受試者，細胞可以是同種異體的及/或自體的。細胞通常是初代細胞，例如直接從受試者分離及/或從受試者分離並冷凍的細胞。
在某些實施例中，免疫細胞是T細胞，例如CD8+ T細胞(例如，CD8+初級T細胞、中樞記憶T細胞或作用性記憶T細胞)、CD4+ T細胞、自然殺手T細胞(NKT細胞)、調節性T細胞(Treg)、幹細胞記憶T細胞、淋巴前驅細胞、造血幹細胞、自然殺手細胞(NK細胞)或樹突細胞。在一些實施例中，細胞是單核球或顆粒性白血球，例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性白血球及/或嗜鹼性白血球。在一實施例中，目標細胞是誘導性多能幹細胞(iPS)或源自iPS細胞的細胞，例如，從受試者產生的iPS細胞，被操縱以改變(例如，誘導突變)或操縱以表現一或多個目標基因的分子，並分化成例如T細胞、例如CD8+ T細胞(例如，CD8+初級T細胞、中樞記憶T細胞或作用性記憶T細胞)、CD4+ T細胞、幹細胞記憶T細胞、淋巴前驅細胞或造血幹細胞。
在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型的一個或多個亞組，例如整個T細胞群、CD4+細胞、CD8+細胞及其亞群，其亞群可例如由功能、活化狀態、成熟度、分化的潛力、擴增、再循環、定位及/或持久性能力、抗原專一性、抗原受體類型、在特定器官或腔室中的存在、標記或細胞激素分泌圖譜、及/或分化程度所定義。在T細胞及/或CD4+及/或CD8+ T細 胞的亞型和亞群中，有初級T(TN)細胞、作用性T細胞(TEFF)、記憶T細胞及其亞型，其例如為幹細胞記憶T(stem cell memory T，TSCM)細胞、中樞記憶T(TCM)細胞、作用性記憶T(TEM)細胞或終極分化作用性記憶T細胞(terminally differentiated effector memory T cell)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助型T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T(mucosa-associated invariant T，MAIT)細胞，天然存在和適應性調節T(Treg)細胞、輔助型T細胞，如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助型細胞T細胞、α/β T細胞和δ/γ T細胞。在某些實施例中，可以使用本領域可獲得的任何數量的T細胞株。
在一些實施例中，所述方法包括從受試者中分離免疫細胞、製備、加工、培養及/或改造前述細胞。在一些實施例中，改造細胞的製備包括一個或多個培養及/或製備步驟。如上所述的改造細胞可以從樣品中分離，例如生物樣品，例如從受試者獲得、或來自受試者的樣品。在一些實施例中，分離細胞的受試者是患有疾病或病症、或需要細胞療法、或將施用細胞療法的受試者。在一些實施例中，受試者是需要特定治療干預的人類，例如過繼性細胞療法，其中細胞被分離、加工及/或改造。因此，在一些實施例中，細胞是初代細胞，例如初代人類細胞。樣品包括直接取自受試者的組織、液體和其他樣品，以及來自一個或多個處理步驟的樣品，處理步驟可例如是分離、離心、基因改造(例如用病毒載體轉導)、清洗及/或培養。生物樣品可以是直接從生物來源或經過處理的樣品所獲得的樣品。生物樣品包括但不限於體液，例如血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑液、尿液和汗、組織和器官樣品，也包括由其衍生的加工樣品。
在一些實施例中，衍生出或分離出細胞的樣品是血液或血液衍生樣品，或為或來源於血球分離術或白血球分離術的產物。例示性樣品包括全血、周邊血液單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺，組織生檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾、其他淋巴組織、肝、肺、胃、小腸、大腸、腎、胰臟、乳房、骨、攝護腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃腺或其他器官、及/或由其衍生的細胞。在細胞療法的情況下，樣品 包括例如過繼性細胞療法，來自自體和同種異體來源的樣品。
在一些實施例中，細胞衍生自細胞株，例如T細胞株。在一些實施例中，細胞獲取自異種來源，例如，來自小鼠、大鼠、非人靈長類動物及豬。在一些實施例中，細胞的分離包括一種或多種製備及/或基於細胞的非親和力分離步驟。舉例來說，在一些實例中，細胞係在一種或多種試劑的存在下進行清洗、離心及/或培養，以除去不需要的組分、富集所需組分、裂解，或除去對特定試劑敏感的細胞。在一些實例中，基於一或多種性質來分離細胞，例如密度、黏附性質、尺寸、靈敏度及/或對特定組分的抗性。
在一些實例中，來自受試者循環血液的細胞係例如透過血球分離或白血球分離而獲得。在一些實施例中，樣品含有淋巴細胞(其包括T細胞、單核細胞、顆粒性白血球、B細胞，其他有核的白血球)、紅血球及/或血小板，並且在一些實施例中，包含除了紅血球和血小板之外的細胞。在一些實施例中，從受試者所收集到的血球細胞被清洗，以例如除去血漿部分，並將細胞置於合適的緩衝液或培養液中用於後續處理步驟。在一些實施例中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗細胞。在一些實施例中，根據製造商的說明透過切向流過濾(tangential flow filtration，TFF)完成清洗步驟。在一些實施例中，在清洗後將細胞重新懸浮於各種生物相容性緩衝液中。在某些實施例中，去除血球細胞樣品的組分並將細胞直接重新懸浮於培養液中。在一些實施例中，所述方法包括基於密度的細胞分離方法，例如，裂解紅血球並透過Percoll或Ficoll梯度進行離心而從周邊血液製備白血球。
在一實施例中，免疫獲得的細胞是來自個體循環血液，其係透過血球分離或白血球分離而獲得。血球分離的產物通常包括淋巴細胞，其包括T細胞、單核細胞、顆粒性白血球、B細胞，其他有核的白血球、紅血球及血小板。透過血球分離獲得的細胞可以被清洗以去除血漿部分並將細胞置於適當的緩衝液或培養基中，例如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或不含鈣並且可能不含鎂或者可能不含許多(如果不是全部)的二價陽離子的清洗溶液，用於後續處理步驟。清洗後，可將細胞重新懸浮於各種生物相容性緩衝液中，例如無Ca、無Mg的PBS。或者，可以去除單採血球分離樣品中的不需要的組分，並將細胞直接重新懸浮 於培養基中。
在一些實施例中，分離方法包括基於細胞中一或多種特定分子的表現或存在，來分離不同細胞類型。前述特定分子可例如表面蛋白、細胞內標記物或核酸等表面標記物。在一些實施例中，可以使用任何已知基於這些標記的分離方法。在一些實施例中，分離是基於親和力或免疫親和力來分離。例如，在一些實施例中，分離包括根據欲分離的細胞和細胞群其是否表現有一或多種標記物(通常是細胞表面標記物)，或其表現量。舉例來說，其係透過與標記物專一性結合的抗體或結合配偶體一起培養。接著，通常透過清洗步驟，並將結合至抗體或結合搭配物的細胞與未結合至抗體或結合搭配物的細胞進行分離。
前述分離步驟可以基於正向選擇及/或負向選擇，正向選擇保留了與試劑結合的細胞供進一步的使用，負向選擇保留了未與抗體或結合配偶體結合的細胞。在一些實例中，兩種部分皆被保留以供進一步使用。在一些實施例中，當無法取得能從一混雜群體中專一性識別出單一細胞類型的抗體時，此時負向篩選的方式特別好用。因此，分離所根據的標記物最好是非目標群體細胞所表現的標記物。分離率不需要到達100%，也不需要完全去除特定的細胞群體或表現有特定標記物的細胞。舉例而言，特定類型細胞(例如，該些表現有標記物的細胞)的正向篩選或富集，係指增加這些細胞的數量或百分比，但不表示完全去除不表現該標記的細胞。同樣地，特定類型細胞(例如，該些表現有標記物的細胞)的負向篩選、去除或耗竭，是指減少這些細胞的數量或百分比，但無須完全去除這些細胞。
在一些實例中，進行多次分離步驟，其係將一步驟所得出的正向選擇或負向選擇部分進行另一次的分離步驟，例如隨後的正向或負向選擇。在一些實例中，單次分離步驟可以同時剔除表現多種標記物的細胞，例如透過將細胞與多個抗體或結合配偶體一起培養，每個抗體或結合配偶體能夠專一性地辨識出負向選擇用的標記物。同樣地，透過將細胞與多種抗體或在各種細胞類型上表現的結合配偶體一起培養，可以同時對多種細胞類型進行正向選擇。
在一些實施例中，一種或多種T細胞群為富含有或被剔除掉一或 多種特定標記物(例如表面標記物)呈陽性(標記物+)或表現高水平(標記物hlgh)的細胞，或者為富含有或被剔除掉一或多種標記物為陰性(標記物)或表現相對低水平(標記物low)。例如，在一些實施例中，其係透過正向或負向選擇技術來分離出T細胞的特定亞群。舉例來說，其可以是一或多種表面標記物為陽性或高表現量的細胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及/或CD45RO+ T細胞。在某些情況下，此類標記物是在某些T細胞群(例如非記憶細胞)上不存在或其表現量相對較低，但這些標記物存在在某些其他T細胞群(如記憶細胞)中或其表現量相對較高。在一實施例中，細胞(例如CD8+細胞或T細胞，例如CD3+細胞)富含有(即正向選擇出)CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127及/或CD62L為陽性或高表面表現量的細胞，及/或剔除(例如，用負向選擇以去除)CD45RA為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實施例中，細胞富含有或剔除掉CD122、CD95、CD25、CD27及/或IL7-Ra(CD127)為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實例中，CD8+ T細胞富含有CD45RO為陽性(或CD45RA為陰性)和CD62L為陽性的細胞。舉例來說，可以使用CD3/CD28綴合的磁珠(例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)來正向選擇CD3+、CD28+ T細胞。
在一些實施例中，將T細胞與PBMC樣品分離的方式係對不會在T細胞(例如，B細胞、單核球或其他白血球)上表現的標記物(例如，CD14)進行負向選擇。在一些實施例中，係使用CD4+或CD8+篩選步驟來分離出CD4+輔助細胞與CD8+胞毒性T細胞。藉由對在一或多個初始、記憶及/或作用T細胞亞群上有表現或表現量較高的標記物進行正向或負向選擇，以將這些CD4+和CD8+群體進一步分選成亞群。在一些實施例中，舉例而言，藉由以基於與相應亞群相關的表面抗原進行正向或負向選擇，CD8+細胞會進一步富含或剔除掉初始、中樞記憶、作用記憶和/或中樞記憶幹細胞。在一些實施例中，會對中樞記憶T(TCM)細胞進行富集，以增加療效，例如改善投與後的長期存活率、擴增程度和/或移植狀況。在某些方面，這些亞群的療效尤其顯著。在一些實施例中，將富含有TCM的CD8+T細胞和CD4+T細胞合併起來，會進一步增強 療效。
在實施例中，記憶T細胞存在於CD8+周邊血液淋巴細胞的CD62L+和CD62L-亞群中。PBMC可以富含有或剔除掉CD62L-CD8+及/或CD62L+CD8+部分，例如使用抗CD8和抗CD62L抗體。在一些實施例中，CD4+ T細胞群和CD8+ T細胞亞群，例如富含中樞記憶(TCM)細胞的亞群。在一些實施例中，中樞記憶T(TCM)細胞的富集是基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及/或CD127的陽性或高表面表現；在某些實施例中，前述富集是基於對表現有或有高度表現的CD45RA及/或顆粒酶B的細胞的負向選擇。在一些實施例中，其係透過剔除表現有CD4、CD14、CD45RA的細胞以及對表現有CD62L的細胞進行正向選擇或富集，來分離出富含有TCM細胞的CD8+群體。在一實施例中，中樞記憶T(TCM)細胞的富集是藉由以下方式進行：選出沒有CD4表現的細胞，將其作為起始物，接著以CD14和CD45RA的表現進行負向選擇，並且以CD62L進行正向選擇。在某些情況下，前述選擇是同時進行的，而在其他情況是依序進行，但其順序不拘。在一些方面，用在製備CD8+細胞群體或亞群過程中針對CD4表現進行選擇的相同步驟也會用在產生CD4+細胞群體或亞群的過程中，致使針對以CD4進行分離後，且視情況在一或多個進一步的正向或負向選擇步驟之後，陽性和陰性部分兩者都會保留下來，且其會用於所述方法的後續步驟中。
透過鑑定具有細胞表面抗原的細胞群，將CD4+ T輔助型細胞分類為初級、中樞記憶和作用性細胞。CD4+淋巴細胞可透過標準方法獲得。在一些實施例中，初級CD4+ T淋巴細胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T細胞。在一些實施例中，中樞記憶CD4+細胞是CD62L+和CD45RO+。在一些實施例中，作用性CD4+細胞是CD62L-和CD45RO。在一實例中，為了以負向選擇來富集出CD4+細胞，所用的單株抗體混合物通常會包括抗-CD14、抗-CD20、抗-CD11b、抗-CD16、抗-HLA-DR和抗-CD8的抗體。在一些實施例中，抗體或結合搭配物係結合於固體載體或基質(例如，磁珠或順磁珠)，以便在正向和/或負向選擇中分離細胞。
在一些實施例中，在基因改造前或於基因改造過程中，將細胞進 行培養及/或培養。培養步驟可包括培育、栽培(cultivation)、刺激、活化及/或繁殖。在一些實施例中，組成物或細胞在刺激條件或刺激劑的存在下進行培養。前述條件包括經設計以模擬抗原暴露及/或使細胞俾便進行基因改造(例如，引入重組抗原受體)等條件，前述條件係用來誘導群體中細胞的增殖、擴增、活化及/或存活。前述條件可包括一或多種特定介質、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑，例如營養素、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，例如細胞激素、趨化因子、抗原、結合配偶體、融合蛋白、重組可溶性受體及任何其他細胞活化試劑。在一些實施例中，刺激條件或試劑包括一或多種試劑，例如配體，其能夠活化TCR複合體的細胞內訊息傳遞域。在一些實施例中，該試劑在T細胞中開啟或啟動TCR/CD3細胞內訊息級聯。前述試劑可包括抗體，例如對TCR組分及/或共刺激受體具有專一性的抗體，例如抗CD3、抗CD28、例如與固體支持物如珠子結合的抗體、及/或一種或多種細胞激素。任選地，擴增方法可以進一步包括向培養基中加入抗CD3及/或抗CD28抗體的步驟(例如，濃度至少約0.5ng/ml)。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15。舉例來說，刺激劑包括濃度為至少約10個單位/mL的IL-2。
在另一實施例中，其係透過裂解紅血球和剔除單核細胞以從周邊血液中分離出T細胞，例如，透過PERCOLLTM梯度離心。或者，T細胞可以從臍帶中分離出來。在任何情況下，以正向或負向選擇技術可進一步分離出T細胞的特定亞群。
以前述方式所分離出的臍帶血單核細胞可以剔除掉表現有某些抗原的細胞，包括但不限於CD34、CD8、CD14、CD19和CD56。剔除掉前述細胞，可使用經分離的抗體，包含抗體的生物樣品(如腹水)、與物理支持物結合的抗體，及與細胞結合的抗體。
以負向選擇來富集T細胞群，可以使用針對被負向選擇過的細胞所特有的表面標記物的抗體組合。優選的方法是透過負向磁性免疫黏附或流式細胞儀來進行細胞分選及/或選擇，前述方法係使用一單株抗體混合物，該單株抗體混合物係針對會表現在經負向選擇過的細胞上的細胞表面標記物。舉例來說，為了以負向選擇來富集CD4+細胞，所使用的單株抗體混合物通常包括 抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。
為了透過正向或負向選擇來分離出所需的細胞群，可以改變細胞和表面(例如珠子等顆粒)的濃度。在某些實施例中，可能需要顯著降低珠子和細胞混合在一起的體積(即，增加細胞濃度)，以確保細胞和珠子的最大接觸。舉例來說，在一實施例中，其係使用20億個細胞/毫升的濃度。在一實施例中，其係使用10億個細胞/毫升的濃度。在另一實施例中，其係使用大於1億個細胞/毫升。在另一實施例中，其係使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/毫升的細胞濃度。在另一實施例中，其係使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/毫升的細胞濃度。在進一步的實施例中，其可以使用125或150百萬個細胞/毫升的濃度。使用高濃度可導致細胞產量增加、細胞活化程度提高和細胞擴增情況更好。
在清洗步驟後也可以將T細胞冷凍，這不需要單核細胞去除步驟。雖然不希望受理論約束，但冷凍和隨後的解凍步驟可透過去除細胞群中的顆粒性白血球和一定程度的單核細胞提供了更均勻的產物。在去除血漿和血小板的清洗步驟之後，可以將細胞懸浮在冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液和參數在本領域中是已知的並且在這種情況下是有用的，但在非限制性實例中，其中一種方法係涉及使用含有20% DMSO和8%人類血清白蛋白的PBS、或其他合適的細胞冷凍介質。接著，將細胞以每分鐘1℃的速率冷凍至-80℃，並將其儲存在液態氮儲存槽的氣相中。本發明可以使用其他受控制冷凍方法，也可以用不受控地在-20℃或液態氮中進行的立即冷凍法。
在一實施例中，T細胞群包含在下列細胞內，例如周邊血液單核細胞、臍帶血細胞、純化的T細胞群和T細胞株。在另一實施例中，周邊血液單核細胞包含T細胞群。在另一實施例中，經純化的T細胞包含T細胞群。
在某些實施例中，可以從樣品中分離出T調節細胞(Tregs)。前述樣品可包括但不限於臍帶血或周邊血液。在某些實施例中，其係透過流式細胞儀的分選來分離出Tregs。在分離之前，可透過任何本領域已知的方法對樣品中的Tregs進行富集。經分離的Tregs可以在使用前進行冷凍保存及/或擴增。分離Tregs的方法係描述於美國專利號7,754,482、8,722,400和9,555,105以 及美國專利申請號13/639,927中，其內容以及其整體併入本文。
I.免疫細胞的擴增
無論是在將細胞進行修飾以表現標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合之前還是之後，都可以使用如下列文獻中所述的方法對細胞進行活化和擴增。例如美國專利號6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041、以及美國專利公開號20060121005。舉例來說，本發明的T細胞可以透過與一表面接觸來擴增，而該表面係附著有一刺激試劑與一配體。前述刺激試劑會刺激CD3/TCR複合體相關訊號，而前述配體會刺激T細胞表面的共刺激分子。具體而言，T細胞群可以透過與下列物質接觸而被刺激：抗CD3抗體或其抗原結合片段，或固定在表面上的抗CD2抗體，或與鈣離子載體結合的蛋白質激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)。為了共刺激T細胞表面上的輔助分子，會使用結合輔助分子的配體。例如，可以在適於刺激T細胞增殖的條件下，使T細胞與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。抗CD28抗體的實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，前述抗體都可以用於本發明，其他本領域的已知方法和試劑也可以用於本發明(參見例如，ten Berge等人，Transplant Proc.(1998)30(8)：3975-3977、Haanen等人，J.Exp.Med.(1999)190(9)：1319-1328、及Garland等人，J.Immunol.Methods(1999)227(1-2)：53-63)。
透過本文所公開的方法來擴增T細胞，其可以增加約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及可以是前述數值間的任一、所有、全部，或部分整數之倍數。在一實施例中，T細胞的擴增範圍約20倍至約50倍之間。
培養後，T細胞可以在培養裝置中的細胞培養基中培養一段時間，或直到細胞達到匯合滿度(confluency)或高細胞密度，以便在將細胞傳遞到另一個培養裝置之前到達最佳傳代。培養裝置可以是通常用於體外培養細胞 的任何培養裝置。優選地，在將細胞傳遞到另一個培養裝置之前，滿度為70%或更高。更優選地，滿度為90%或更高。前述一段時間可以是適合於體外培養細胞的任何時間。T細胞培養基可在T細胞培養期間的任何時間被替換。優選地，T細胞培養基每2至3天更換一次，然後從培養裝置中收取T細胞，T細胞可立即使用或冷凍保存以備後續使用。在一實施例中，本發明包括冷凍保存的擴增的T細胞。在將核酸引入T細胞之前，會將冷凍保存的T細胞解凍。
在另一實施例中，該方法包括分離T細胞和擴增T細胞。在另一實施例中，本發明還包括在擴增前冷凍T細胞以保存之。在另一實施例中，冷凍保存的T細胞會被解凍，以用於將編碼嵌合膜蛋白的RNA進行電穿孔。
另一種離體擴增細胞的方法，係描述於美國專利號4,522,587中(其通過引用併入本文)。美國專利號4,522,587中所述的擴增細胞的方法，可以是本文所述的擴增方法的替代形式或與其他擴增方法一起使用。簡而言之，離體培養和T細胞的擴增，包括添加例如美國專利號5,199,942中所述的因子或其他因子到細胞生長因子中，例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體。在一實施例中，T細胞之擴增包括將T細胞與選自於由flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit所組成之群組的因子一起培養。
如本文所述的培養步驟(與本文所述的與試劑接觸或在電穿孔後)時間可以非常短，例如小於24小時，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時。如本文進一步描述的培養步驟(與本文所述的藥劑接觸)可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
有各種術語用於描述培養中的細胞。細胞培養通常用來指稱自活體生物中取出並在受控制的條件下生長的細胞。初代細胞培養是指直接自生物體中取出細胞、組織或器官，並在進行第一次繼代培養之前的培養。當細胞在促進細胞生長及/或分裂的條件下置於生長培養基中時，細胞在培養下擴增，產生更大的細胞群。當細胞在培養下擴增時，細胞增生速率通常透過細胞倍增所需的時間量來測量，也稱為倍增時間。
每一輪的繼代培養稱為一次繼代。當細胞進行繼代培養時，它們 被稱為已經繼代。特定的細胞群或細胞有時被稱為或透過其繼代的次數來表徵。例如，已繼代十次的培養細胞群可稱為P10培養物。初代培養物，即從組織中所分離出的細胞的第一次培養物，命名為P0。在第一次繼代培養後，將細胞稱為二級培養物(P1或第1代)。在第二次繼代培養後，該些細胞變成三級培養物(P2或第2代)，依此類推。本領域技術人員將理解，在繼代期間可能存在許多群體倍增。因此，培養群體倍增的次數會大於繼代次數。在繼代期間細胞的擴增(即群體倍增的數量)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基質、培養基和繼代之間的時間。
在一實施例中，細胞可以培養數小時(約3小時)至約14天或期間的任何整數值的小時數。適合T細胞培養的條件包括適當的培養基(例如，MEM培養基(Minimal Essential Media)、或RPMI 1640培養基、或X-vivo 15，(Lonza))，其可包含增殖和活性所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人類血清)，介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α、或本領域技術人員已知的任何其他用於細胞生長的添加劑。其他用於細胞生長的添加劑，包括但不限於介面活性劑、血漿蛋白(plasmanate)及還原劑，例如N-乙醯基-半胱胺酸和2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，並可添加胺基酸、丙酮酸鈉和維生素，且可不含血清，或可補充有適當量的血清(或血漿)或一組確定的激素，及/或足以使T細胞生長和擴增的細胞激素的量。抗生素，例如青黴素和鏈黴素，僅在實驗培養物中添加，而不包括在要注入受試者的細胞培養物中。標靶細胞係維持在支持生長所需的條件下，例如適當的溫度(例如37℃)和氣體環境下(例如空氣加5% CO2)。
用於培養T細胞的培養基可包括可共刺激T細胞的試劑。例如，可以刺激CD3的試劑是抗CD3的抗體，可以刺激CD28的試劑是抗CD28的抗體。透過本文公開的方法所分離的細胞可以擴增大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、 10,000,000倍或更多。在一實施例中，其係透過抗CD3抗體所披覆的KT64.86人工抗原呈現細胞(aAPC)來擴增人類T調節細胞。在一實施例中，其係透過抗CD3抗體所披覆的K562人工抗原呈現細胞(aAPC)來擴增人類T調節細胞。擴增和活化T細胞的方法可以在美國專利號7,754,482、8,722,400及9,555,105中找到，其內容以及其整體併入本文。
在一實施例中，擴增T細胞的方法可以進一步包括分離經擴增的T細胞，以供進一步的應用。在另一實施例中，擴增方法可以進一步包括將擴增過的T細胞進行後續的電穿孔，然後進行培養。後續的電穿孔可以包括將編碼有介質的核酸引入到擴增過的T細胞群中，例如轉導擴增的T細胞、轉染擴增的T細胞，或用電穿孔方式將核酸引入擴增過的T細胞，其中前述試劑會進一步刺激T細胞。前述試劑可以刺激T細胞，例如透過刺激其進一步的擴增、反應功能或其他T細胞功能。
J.治療方法
本文所述的經修飾的細胞(例如，T細胞)可包含在用於治療的組成物中。該組成物可包括醫藥組成物，並且還包括醫藥上可接受的載劑。包括有經修飾免疫細胞的醫藥組成物，可以一治療有效量的方式進行投予。
在一實施例中，本發明包括用於過繼性細胞轉移療法的方法，其包括向有需要的受試者施用本發明經修飾的T細胞。在另一實施例中，本發明包括治療受試者疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用經修飾的T細胞群。
本發明亦包括在有需要的個體治療疾病或病症的方法，包括向個體施用本發明的經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)。在一實施例中，在有需要的個體治療疾病或病症的方法包括向個體施用包括標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的經修飾的細胞(例如，修飾的T細胞)。在一實施例中，在有需要的個體治療疾病或病症的方法包括向個體施用包括標的CAR(例如，對標靶細胞上的PSMA具有親和力的CAR)及顯性負受體及/或轉換受體的經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)。在一實施例中，在有需要的個體治療疾病或病症的方法包括向個體施用包括標 的CAR(例如，對標靶細胞上的PSMA具有親和力的CAR)、顯性負受體及/或轉換受體的經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)，並且其中經修飾的細胞能夠表現和分泌雙特異性抗體。
用於過繼性細胞療法的免疫細胞的施用方法是已知的，並且可以與本文所提供的方法和組成物一起使用。例如，過繼性T細胞治療方法描述於例如Gruenberg等人的美國專利申請公開號2003/0170238；Rosenberg的美國專利號4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10)：577-85)中。參見，例如，Themeli等人，(2013)Nat Biotechnol.31(10)：928-933；Tsukahara等人，(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1)：84-9；Davila等人，(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338。在一些實施例中，細胞療法，例如過繼性T細胞療法是透過自體轉移進行的，其中細胞從接受細胞療法的受試者中分離及/或以其他方式製備，或者從衍生自受試者的樣品中製備。因此，在一些實施例中，細胞來自有需要治療的受試者，例如患者，並且在分離和加工後將細胞施用於相同的受試者。
在一些實施例中，細胞療法，例如過繼性T細胞療法，透過同種異體轉移進行，其中從接受或最終接受細胞治療的受試者以外的受試者分離及/或以其他方式製備細胞，例如第一受試者。在這樣的實施例中，接著將細胞施用於相同物種的不同受試者中，例如第二受試者。在一些實施例中，第一和第二受試者在遺傳上是相同的。在一些實施例中，第一和第二受試者在遺傳上是相似的。在一些實施例中，第二受試者表現與第一受試者相同的HLA類型或超類型(supertype)。
在一些實施例中，在施用細胞或含有細胞的組成物之前，用靶向疾病或病症(例如腫瘤)的治療劑治療受試者。在一些實施例中，其他治療劑對於受試者是難治的或無反應的。在一些實施例中，受試者患有持續性或複發性疾病，例如在用另一種治療性干預治療後，包括化療，放射線及/或造血幹細胞移植(HSCT)，例如同種異體HSCT。在一些實施例中，儘管受試者已經對另一種療法產生抗性，但給藥有效地治療了受試者。
在一些實施例中，受試者對其他治療劑有反應，並且用治療劑治療減輕了疾病負擔。在一些實施例中，受試者最初對治療劑有反應，但隨著時 間的推移疾病或病症發生復發。在一些實施例中，受試者未復發。在一些這樣的實施例中，鑑定出受試者處於復發的風險中，例如復發的高風險，因此預防性地施用細胞，例如用以降低復發的可能性或防止復發。在一些實施例中，受試者未接受過另一種治療劑的預先治療。
在一些實施例中，受試者患有持續性或復發性疾病，例如在用另一種治療性干預治療後，包括化療、放射線及/或造血幹細胞移植(HSCT)，例如同種異體HSCT。在一些實施例中，儘管受試者已經對另一種療法產生抗性，但給藥有效地治療了受試者。
本發明的經修飾的免疫細胞可以施用於動物以治療癌症，動物優選地是哺乳動物，更優選地是人類。此外，本發明的細胞可用於治療任何與癌症有關的病症，尤其是細胞介導而針對腫瘤細胞的的免疫反應，其係被寄望治療或減輕該疾病。用本發明的經修飾的細胞或醫藥組成物治療的癌症類型包括癌、胚細胞瘤和肉瘤、以及某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、及惡性腫瘤，例如肉瘤、上皮癌和黑色素瘤。其他例示性癌症包括但不限於乳癌、攝護腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲狀腺癌等。癌症可以是非實體瘤(例如血液腫瘤)或實體瘤。還包括成人腫瘤/癌症和小兒腫瘤/癌症。
實體瘤是通常不包括囊腫或液體區域的異常組織塊。實體瘤可以是良性或惡性的。不同類型的實體瘤是以形成它們的細胞類型來命名的(例如肉瘤、癌及淋巴瘤)。實體瘤如肉瘤和癌的實例包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、攝護腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓質癌、乳突狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、髓樣上皮癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms't umor)、子宮頸癌、睾丸瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS腫瘤(例如神經膠瘤(例如腦幹神經膠瘤和混合膠瘤))、神經膠質母細胞瘤(也稱為多形性神經膠質母細胞瘤)星細胞瘤、CNS淋巴瘤、胚細胞瘤、 神經管胚細胞瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦膜瘤、神經胚細胞瘤、視網膜母細胞瘤和腦轉移瘤)。
可透過本文公開的方法治療的癌包括但不限於食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌(一種皮膚癌)、鱗狀細胞癌(各種組織)、膀胱癌，包括移行細胞癌(膀胱惡性腫瘤)、支氣管癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌，包括肺的小細胞癌和非小細胞癌、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、攝護腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣上皮癌、腎細胞癌，原位管癌(ductal carcinoma in situ)或膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、骨原性癌(osteogenic carcinoma)、上皮癌和鼻咽癌。
可透過本文公開的方法治療的肉瘤包括但不限於纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮細胞瘤、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤和其他軟組織肉瘤。
攝護腺癌是一種極其常見且致命的疾病。攝護腺癌是男性中最常見的惡性腫瘤。攝護腺癌是男性癌症相關死亡的第二大原因，估計占每年男性癌症死亡人數的10%。PSMA在惡性攝護腺組織中高度表現，在一些正常人組織中表現水平低。在正常生理條件下，PSMA在攝護腺(分泌腺泡上皮)、腎(近端小管)、神經系統神經膠(星狀細胞和許旺細胞)及小腸(空腸刷狀緣)中表現。PSMA在攝護腺上皮中高度表現，並且在惡性攝護腺組織中顯著上調。目前已發現正常細胞中的PSMA表現比攝護腺癌細胞低100倍至1000倍。在從良性攝護腺增生轉變為攝護腺癌期間，PSMA的表現顯著增加。目前已經發現PSMA表現與惡性攝護腺組織的組織學分級直接相關，並且隨著更晚期的疾病(即在攝護腺癌轉移到淋巴結和骨頭中發現最高的PSMA表現)而增加。
在一實施例中，本發明的方法可用於治療攝護腺癌，例如晚期去勢抵抗攝護腺癌。本領域技術人員應容易理解，可以使用本發明的方法治療其中表現PSMA腫瘤抗原的任何類型的癌症。例如，在非小細胞肺癌中發現了 PSMA的新生血管性表現，參見例如PLoS One.2017 Oct27；12(10)。因此，本發明的方法也可用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)。
在某些例示性實施例中，本發明的經修飾的免疫細胞用於治療攝護腺癌。在一實施例中，本發明的方法用於治療去勢抵抗攝護腺癌。在一實施例中，本發明的方法用於治療晚期去勢抵抗攝護腺癌。在一實施例中，本發明的方法用於治療轉移性去勢抵抗攝護腺癌。在一實施例中，本發明的方法用於治療轉移性去勢抵抗攝護腺癌，其中患有轉移性去勢抵抗攝護腺癌的患者具有10%的腫瘤細胞表現PSMA。在一實施例中，本發明的方法用於治療去勢抵抗攝護腺癌，其中患者在使用或不使用雄激素剝奪療法的情況下具有去勢睾酮水平(例如，<50ng/mL)。
在某些實施例中，向個體提供二級治療。二級治療包括但不限於化療、放射線、手術和藥物治療。
本發明的細胞可以以適當的臨床前和臨床實驗和試驗中所決定的劑量、途徑和時間來施用。細胞組成物可以在這些劑量範圍內進行多次給藥。如本領域技術人員所決定的，本發明細胞的施用可以與其他治療所需疾病或病症的方法組合。
對於接受治療的受試者而言，待施用的本發明的細胞可以是自體的。
本發明細胞的施用可以以任何本領域技術人員已知的方便方式來進行。其可以透過噴霧吸入、注射、攝食、輸血、植入或移植等方法將本發明的細胞施用於受試者。本文所述的組成物可透過靜脈內(i.v.)注射、腹腔內、經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌肉內的方式給予患者。在其他情況下，係將本發明的細胞直接注射到受試者的發炎部位、受試者的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。
在一些實施例中，細胞以所需的劑量施用，其在一些方面包括細胞或細胞類型的所需劑量或數量、及/或所細胞類型的需比例。因此，在一些實施例中，細胞的劑量基於細胞總數(或每公斤體重的數量)和個別群體或亞型的所需比例，例如CD4+與CD8+的比例。在一些實施例中，細胞劑量基於個 別群體或個別細胞類型中所需的細胞總數(或每公斤體重的數量)。在一些實施例中，劑量基於前述特徵的組合，例如總細胞的所需數量、所需比例和個別群體中所需的細胞總數。
在一些實施例中，細胞的群體或亞型，例如CD8+和CD4+ T細胞，在所需劑量的總細胞(例如所需劑量的T細胞)的耐受差異之內被施用。在一些實施例中，所需劑量是所需的細胞數或施用細胞的受試者每單位體重所需的細胞數，例如細胞數/公斤。在一些實施例中，所需劑量等於或高於最小細胞數或每單位體重的最小細胞數。在一些實施例中，在以所需劑量施用的總細胞中，個別群體或亞型以所需的輸出比例(例如CD4+至CD8+比例)或附近存在，例如，在一定的耐受差異或誤差內的比例。
在一些實施例中，細胞在一或多種細胞的個別群體或亞型的所需劑量的耐受差異之內被施用，例如所需劑量的CD4+細胞及/或所需劑量的CD8+細胞。在一些實施例中，所需劑量是細胞的亞型或群體的所需數量，或施用細胞的受試者其每單位體重所需的前述細胞的數量，例如細胞數/公斤。在一些方面，所需劑量等於或高於群體或亞型的最小細胞數，或每單位體重的群體或亞型的最小細胞數。因此，在一些實施例中，劑量基於所需的總細胞的固定劑量和所需的比例、及/或基於一或多個(例如每個)各亞型或亞群體的所需固定劑量。因此，在一些實施例中，劑量基於所需的T細胞的固定或最小劑量和所需的CD4+與CD8+細胞的比例、及/或基於所需的CD4+及/或CD8+細胞的固定或最小劑量。
在某些實施例中，細胞或細胞亞型的個別群體以約一百萬至約一千億個細胞的範圍施用於受試者，例如，100萬至約500億個細胞(例如，大約500萬個細胞、大約2500萬個細胞、大約5億個細胞、大約10億個細胞、大約50億個細胞、大約200億個細胞、大約300億個細胞、大約400億個細胞，或者上述任意兩個值所定義的範圍)，例如，大約1000萬至大約1000億個細胞(例如，大約2000萬個細胞、大約3000萬個細胞、大約4000萬個細胞、大約6000萬個細胞、大約7000萬個細胞、大約8000萬個細胞、大約9000萬個細胞、大約100億個細胞、大約250億個細胞、大約500億個細胞、大約750億個細胞、 大約900億個細胞，或者上述任意兩個值所定義的範圍)，在某些情況下大約1億個細胞至大約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞)或這些範圍之間的任何值。
在一些實施例中，總細胞的劑量及/或個別亞群的細胞的劑量在約1x105個細胞/公斤體重至約1x1011個細胞/公斤體重的範圍內、104或約1011個細胞/公斤體重，例如105至106個細胞/公斤體重之間，例如，約1 x 105個細胞/公斤體重、1.5 x 105個細胞/公斤體重、2 x 105個細胞/公斤體重或1 x 106個細胞/公斤體重。舉例來說，在一些實施例中，細胞在等於或在一定誤差範圍內被施用，等於或約為104或等於或約為109個T細胞/公斤體重之間，例如105至106個T細胞/公斤體重之間，舉例來說，等於或約為1 x 105個T細胞/公斤體重、1.5 x 105個T細胞/公斤體重、2 x 105個T細胞/公斤體重、或1 x 106個T細胞/公斤體重。在其他例示性實施例中，用於本發明的方法的經修飾的細胞的合適劑量範圍包括但不限於自約1x105個細胞/公斤至約1x106個細胞/公斤、自約1x106個細胞/公斤至約1x107個細胞/公斤、自約1x107個細胞/公斤至約1x108個細胞/公斤、自約1x108個細胞/公斤至約1x109個細胞/公斤、自約1x109個細胞/公斤至約1x1010個細胞/公斤、自約1x1010個細胞/公斤至約1x1011個細胞/公斤。在一例示性實施例中，用於本發明的方法的合適劑量為約1x108個細胞/公斤。在一例示性實施例中，用於本發明的方法的合適劑量為約1x107個細胞/公斤。在其他實施例中，合適的劑量為自約1x107個總細胞至約5x107個總細胞。在一些實施例中，合適的劑量為自約1x108個總細胞至約5x108個總細胞。在一些實施例中，合適的劑量為自約1.4x107個總細胞至約1.1x109個總細胞。在一例示性實施例中，用於本發明的方法的合適劑量是約7x109個總細胞。在一例示性實施例中，合適的劑量為自約1x107個總細胞至約3x107個總細胞。
在一些實施例中，總細胞的劑量及/或細胞個別亞群的劑量在約1x105個細胞/m2至約1x1011個細胞/m2之間的範圍內。在一例示性實施例中，總細胞的劑量及/或細胞個別亞群的劑量在約1x107/m2至約3x107/m2的範圍內。在一例示性實施例中，總細胞的劑量及/或細胞個別亞群的劑量在約1x108/m2 至約3x108/m2的範圍內。在一些實施例中，總細胞的劑量及/或細胞個別亞群的劑量是給予患者的最大耐受劑量。
在一些實施例中，細胞在等於或在約為104和等於或約為109CD4+及/或CD8+細胞/公斤體重的一定誤差範圍內被施用，例如105和105及/或CD8+細胞/公斤體重之間，舉例來說，等於或約為1 x 105 CD4+及/或CD8+細胞/公斤、1.5 x 105 CD4+及/或CD8+細胞/公斤、2 x 105 CD4+及/或CD8+細胞/公斤、或1 x 106 CD4+及/或CD8+細胞/公斤體重。在一些實施例中，細胞在等於或在一定誤差範圍內、或大於、及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個CD4+細胞，及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個CD8+細胞，及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個T細胞被施用。在一些實施例中，細胞在等於或在約為108至1012之間或約1010至1011個T細胞之間、約108至1012之間或約1010至1011個CD4+細胞之間及/或約108至1012之間或約1010至1011個CD8+細胞之間的一定誤差範圍內被施用。
在一些實施例中，細胞在多種細胞群或亞型(例如CD4+和CD8+細胞或亞型)的所需輸出比例的耐受範圍或其範圍內被施用。在一些方面，所需比例可以是特定比例或可以是比例範圍，例如，在一些實施例中，所需比例(例如，CD4+與CD8+細胞的比例)在等於或約5：1至等於或約5：1之間(或大於約1：5且小於約5：1)、或等於或約1：3至等於或約3：1之間(或大於約1：3且小於約3：1)，例如介於等於或約2：1至等於或約1：5之間(或大於約1：5且小於約2：1，例如約為5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5或1：5。在一些方面，所需比例的耐受差異在約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%之間，或包括其範圍內的任何值。
在一些實施例中，將一定劑量的經修飾的細胞以單劑量或多劑量 被施用於有需要的受試者。在一些實施例中，一定劑量的經修飾細胞以多劑量被施用，例如，每週一次或每7天一次、每2週一次或每14天一次、每3週一次或每21天一次、每4週一次或每28天一次。在一例示性實施例中，將單劑量的經修飾的細胞施用於有需要的受試者。在一例示性實施例中，透過快速靜脈內輸注將單劑量的經修飾的細胞施用於有需要的受試者。
對於預防或治療疾病，適當的劑量可取決於待治療的疾病類型、細胞或重組受體的類型、疾病的嚴重程度和病程，細胞是否用於預防或治療目的、先前的治療、受試者的臨床病史和對細胞的反應，以及主治醫師的自由裁量權。在一些實施例中，組成物和細胞適合一次或在一系列治療中施用於受試者。
在一些實施例中，細胞作為組合治療的一部分施用，例如與另一種治療性干預同時或依序、或任何順序施用，該治療性干預例如抗體或改造細胞或受體或試劑，例如細胞毒性劑或治療劑。在一些實施例中，細胞與一或多種額外的治療劑共同施用或與另一種治療干預同時或以任何順序依序施用。在一些情況下，細胞與另一種療法以足夠接近的時間共同施用，使得細胞群增強一或多種額外的治療劑的作用，或反之亦然。在一些實施例中，在一或多種額外的治療劑之前施用細胞。在一些實施例中，在一或多種額外的治療劑之後施用細胞。在一些實施例中，前述一或多種額外的藥劑包括細胞激素，例如IL-2，以增強持久性。在一些實施例中，該方法包括施用化學治療劑。
在施用細胞後，改造細胞群的生物活性在一些實施例中被測量，例如透過許多已知方法中的任何一種進行測量。要評估的參數包括被改造的或天然的T細胞或其他免疫細胞與抗原的特異性結合，體內，例如透過成像，或離體，例如透過ELISA或流式細胞儀。在某些實施例中，可以使用本領域已知的任何合適的方法測量改造細胞破壞標靶細胞的能力，例如Kochenderfer等人，J.Immunotherapy,32(7)：689-702(2009)，及Herman等人，J.Immunological Methods,285(1)：25-40(2004)中所描述的方法。在某些實施例中，透過測定一或多種細胞激素(例如CD107a、IFNy、IL-2和TNF的表現和/或分泌來測量細胞的生物活性。在一些實施例中，透過評估臨床結果(例如腫瘤負擔或負荷的減 少)來測量生物活性。
在一些實施例中，本發明的特定劑量方案包括在施用經修飾的T細胞之前的淋巴球清除步驟。在一例示性實施例中，淋巴球清除步驟包括施用環磷醯胺及/或氟達拉濱(fludarabine)。
在一些實施例中，淋巴球清除步驟包括以約200mg/m2/天至約2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天、或500mg/m2/天)的劑量施用環磷醯胺。在一例示性實施例中，環磷醯胺的劑量為約300mg/m2/天。在一些實施例中，淋巴球清除步驟包括以約20mg/m2/天至約900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、60mg/m2/天)的劑量施用氟達拉濱。在一例示性實施例中，氟達拉濱的劑量為約30mg/m2/天。
在一些實施例中，淋巴球清除步驟包括以約200mg/m2/天至約2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的劑量施用環磷醯胺，並以約20mg/m2/天至約900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)的劑量施用氟達拉濱。在一例示性實施例中，淋巴球清除步驟包括以約300mg/m2/天的劑量施用環磷醯胺，以及以約30mg/m2/天的劑量施用氟達拉濱。
在一例示性實施例中，對於具有去勢抵抗攝護腺癌的個體，該受試者在施用經修飾的T細胞之前接受淋巴球清除性化療。在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者接受淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括透過靜脈內輸注約500mg/m2或約1g/m2的環磷醯胺。在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者在施用經修飾的T細胞約3天(±1天)前接受淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括透過靜脈內輸注約500mg/m2至約1g/m2的環磷醯胺。在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者在施用經修飾的T細胞最多4天前接受淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括透過靜脈內輸注約500mg/m2至約1g/m2的環磷醯胺。在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者在施用經修飾的T細胞4天前接受淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括透過靜脈內輸注約500mg/m2至約1g/m2的環磷醯胺。 在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者在施用經修飾的T細胞3天前接受淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括透過靜脈內輸注約500mg/m2至約1g/m2的環磷醯胺。在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者在施用經修飾的T細胞2天前接受淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括透過靜脈內輸注約500mg/m2至約1g/m2的環磷醯胺。
在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者在施用經修飾的T細胞3天前接受淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括透過靜脈內輸注300mg/m2的環磷醯胺。在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者在施用經修飾的T細胞前接受3天的淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括透過靜脈內輸注300mg/m2的環磷醯胺。
在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者接受淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療包括氟達拉濱，劑量為約20mg/m2/天至約900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)。在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者接受淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療包括30mg/m2劑量的氟達拉濱以持續3天的方式進行。
在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者接受淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療包括環磷醯胺的劑量為約200mg/m2/天至約2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天，或500mg/m2/天)以及氟達拉濱的劑量約為20mg/m2/天至約900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)。在一例示性實施例中，對於患有去勢抵抗攝護腺癌的受試者，該受試者接受淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療包括劑量為約300mg/m2/天的環磷醯胺以及30mg/m2劑量的氟達拉濱，以持續3天的方式進行。
本領域已知，輸注CAR T細胞後的一種副作用是免疫激活的開始，稱為細胞激素釋放症候群(CRS)。CRS是免疫激活，導致發炎性細胞激 素升高。臨床和實驗室測量範圍從輕度CRS(全身症狀及/或2級器官毒性)到嚴重CRS(sCRS；3級器官毒性、攻擊性臨床干預及/或可能危及生命)。臨床特徵包括：高燒、不適、疲勞、肌痛、噁心、厭食、心跳過速/低血壓、微血管滲漏、心功能不全、腎損害、肝衰竭和廣泛性血管內凝固。在CAR T細胞輸注後，細胞激素顯著的升高，包括干擾素-γ、顆粒球巨噬細胞群落刺激生長因子、IL-10及IL-6。CRS的存在通常與過繼性轉移細胞的擴增和進行性免疫激活相關。目前已經證明CRS的嚴重程度取決於輸注時的疾病負荷，因為具有高腫瘤負荷的患者經歷更多的sCRS。
因此，本發明在CRS診斷後提供了適當的CRS管理策略，以減輕不受控制的炎症的生理症狀，而不會抑制經改造的細胞(例如CAR T細胞)的抗腫瘤功效。CRS管理策略在本領域中是已知的。例如，可施用全身性皮質類固醇以快速逆轉sCRS(例如，3級CRS)的症狀而不損害初始抗腫瘤反應。
在一些實施例中，可以施用抗IL-6R抗體。抗IL-6R抗體的實例是食品和藥物管理局批准的單株抗體托珠單抗(tocilizumab)，也稱為atlizumab(以Actemra或RoActemra銷售)。托珠單抗是針對介白素-6受體(IL-6R)的人源化單株抗體。施用托珠單抗已經證明幾乎立即逆轉CRS。
在一些實施例中，本發明的方法涉及選擇和治療在至少一個癌症治療標準的先前療程中失敗的受試者。例如，合適的受試者可能已確診攝護腺癌復發。在一些實施例中，本發明的方法涉及選擇和治療已接受至少一種癌症治療標準的先前療程的受試者。例如，合適的受試者可能先前已經用至少一種標準17α裂解酶抑制劑或第二代抗雄激素療法治療轉移性去勢抵抗攝護腺癌。
在一例示性實施例中，合適的受試者是患有轉移性去勢抵抗攝護腺癌的受試者。在一例示性實施例中，合適的受試者是患有轉移性去勢抵抗攝護腺癌的受試者，其透過對新鮮組織的免疫組織化學分析證明其具有10%的腫瘤細胞表現PSMA。
在一些實施例中，合適的受試者是具有骨轉移性疾病及/或可測量的非骨轉移性疾病(淋巴結或內臟)的放射線攝影證據的受試者。
在一些實施例中，合適的受試者是具有0-1的ECOG表現狀態的 受試者。
在一些實施例中，合適的受試者是具有足夠器官功能的受試者，如下定義：血清肌酸酐1.5mg/dl或肌酸酐清除率60cc/min；及/或血清總膽紅素<1.5x ULN；血清ALT/AST<2x ULN。
在一些實施例中，合適的受試者是具有適當血液學特徵的受試者，定義如下：Hgb>10g/dl；PLT>100k/ul；及/或ANC>1.5k/ul。
在一些實施例中，合適的受試者是不依賴輸血的受試者。
在一些實施例中，合適的受試者是具有進展性去勢抵抗攝護腺癌的證據的受試者，定義如下：使用或不使用雄激素剝奪療法的睾固酮的去勢水平(<50ng/ml)；及/或以下進展性疾病之一的證據：依據RECIST 1.1標準的軟組織級數，骨掃描中有2或更多新病變的骨疾病進展(根據PCWG2標準)，血清PSA增加至少25%且最低點絕對增加2ng/ml或更多(根據PCWG2標準)。
在一些實施例中，合適的受試者先前已經用至少一種第二代雄激素訊息傳遞抑制劑治療。在一些實施例中，合適的受試者先前已經用阿比特龍(abiraterone)治療。在一些實施例中，合適的受試者先前已經用恩雜魯胺(enzalutamide)治療。
在一些實施例中，合適的受試者透過免疫組織化學(IHC)在轉移組織生檢上發現其具有10%的腫瘤細胞表現PSMA。
在一些實施例中，合適的受試者具有轉移性疾病(骨質或淋巴結/內臟)的放射線攝影證據。
在一些實施例中，合適的受試者對轉移性CRPC具有4線治療。
K.醫藥組成物和調配物
本文還提供了免疫細胞群、含有前述細胞及/或富含前述細胞的組成物。舉例來說，表現重組受體的細胞占組成物內總細胞數的比例為，或占某特定類型細胞(如T細胞或CD8+或CD4+細胞)的比例為50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。這些組成物中包含適用於投與的醫藥組成物和調配物，例如用於過繼性細胞療法。本文還提供了將細胞和組成物投予至受試者(例如患者)的治療方法。
本文還提供了包括用於投予之細胞的組成物，其包括醫藥組成物和調配物，例如單位劑量形式的組成物，其包括於給定劑量或其部分中所投予的細胞數量。醫藥組成物和調配物通常包括一或多種可選的醫藥上可接受的載劑或賦形劑。在一些實施例中，組成物包括至少一種額外的治療劑。
術語「醫藥調配物」是指一種製劑，其所呈形式允許所含活性成分之生物活性得以有效發揮，且不含有其他會對所投與之個體產生不可接受毒性之成分。「醫藥上可接受的載劑」是指醫藥調配物中除了活性成分以外的成分，其對受試者是無害的。醫藥上可接受的載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在一些實施例中，載劑的選擇在某種程度上係由特定細胞及/或透過施用方法來決定。因此，有多種調配物係適合用於本發明。例如，醫藥組成物可含有防腐劑。合適的防腐劑可包括例如，對羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及羥基氯苯胺。在一些實施例中，其係使用兩種或更多種防腐劑的混合物。防腐劑或其混合物通常佔組成物總重量約0.0001%至約2%。載劑係描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed中。醫藥上可接受的載劑通常在所用劑量和濃度下對受試者是無害的，並且其係包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲雙銨、羥基氯苯胺、氯化本索寧、苯酚、丁基或芐基醇、對羥苯甲酸酯類，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；醣類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子(salt-forming counterion)如鈉；金屬複合體(例如鋅-蛋白質複合體)；及/或非離子介面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，緩衝劑包括在組成物中。合適的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀和各種其他酸和鹽類。在一些實施例中，其係使用兩種或以上緩衝劑的混合物。緩衝劑或其混合物的種量通常佔組成物 總重量約0.001%至約4%。製備可施用的醫藥組成物的方法是已知的。例示性方法更詳細地描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams & Wilkins；21st ed.(May 1,2005)中。
調配物可包括水溶液。調配物或組成物還可含有一種以上適用以細胞治療的特定適應症、疾病或病症的活性成分，前述活性成分優選地具有與細胞互補的活性，各活性不會相互作用而產生不利的影響。前述活性成分適合以對預期目的有效的劑量組合存在。因此，在一些實施例中，醫藥組成物還包含其他醫藥活性劑或藥物，例如化學治療劑，例如天冬醯胺酸酶、硫酸布他卡因、卡鉑、順鉑、道諾黴素、艾黴素(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、胺甲喋呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)、長春花鹼(vinblastine)、及/或長春花新鹼(vincristine)。在一些實施例中，醫藥組成物含有有效治療或預防疾病或病症的細胞量，例如治療有效量或預防有效量。某些實施例中的治療或預防功效，係透過定期評估接受治療的受試者來進行監測。所需劑量可透過單次推注施用細胞、透過多次推注施用細胞、或透過連續輸注施用細胞來遞送。
調配物包括口服、靜脈內、腹腔內、皮下、肺、經皮、肌肉內、鼻腔內、口腔、舌下或栓劑給藥的調配物。在一些實施例中，其係非經腸胃道來施用細胞群。本文所用的術語「非經腸胃道」包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道和腹腔內給藥。在一些實施例中，係透過靜脈內、腹腔內或皮下注射等周邊全身遞送方式將細胞施用於受試者。一些實施例中的組成物係以無菌液體調配物的形式來提供，其例如等張性水溶液、懸浮液、乳液、分散體或黏性組成物，在一些實施例中其可以緩衝至選定的pH值。液體調配物通常比凝膠、其他黏性組成物和固體組成物更容易製備。另外，液體組成物在某些程度上更便於給藥，特別是透過注射。另一實施例中，黏性組成物可以配製在適當的黏度範圍內，使其能與特定組織接觸的更久。液體或黏性組成物可包含載劑，其可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其合適的混合物。
無菌的注射溶液可以透過將細胞摻入溶劑中來製備，例如與合適 的載劑，稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理食鹽水、葡萄糖、右旋糖等)混合。組成物可含有輔助物質，例如潤濕劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH值緩衝劑、凝膠或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑及/或顏色，這取決於給藥途徑和所需的調配物。在某些實施例中，可以參考標準文本來製備合適的調配物。
在本文的組成物中可以加入各種增強組成物穩定性和無菌性的添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可用來確保防止微生物的作用。延長可注射藥物形式的吸收，可透過使用延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明膠)來實現。
一般來說，用於體內施用的調配物是無菌的。舉例來說，透過無菌過濾膜過濾可以容易地達到無菌。
本文提及或引用的文章、專利和專利申請案的內容以及所有其他文獻和電子可用資訊在此通過引用而將其整體併入本文，其程度如同每個單獨的公開文獻被具體地且單獨地指明為以引用方式納入本文。申請人保留將任何此類文章、專利、專利申請或其他實體文獻和電子文獻中任何和所有材料與資訊實際併入本申請的權利。
雖然已經參考本發明的特定實施例描述了本發明，但是本領域技術人員應該理解，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以進行各種改變並且可以替換等同物。對於本領域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本文公開的實施例的範圍的情況下，可以使用合適的等同物進行本文所述方法的其他合適的修改和改變。另外，可以進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、過程、過程步驟或步驟適用本發明的目的、精神和範圍。所有這些修改都包括在權利要求的範圍內。現在已經詳細描述了某些實施例，透過參考以下實驗例將更清楚地理解前述實施例，前述實施例僅用以說明，而非對本發明的限制。
實施例
以下實施例用於描述本發明，這些實施例僅用於說明而非對本發 明造成限制，本發明涵蓋由本文提供的教示以及顯而易見的所有變化。
實驗中使用的材料和方法如下所述。
RNA CAR構築體設計：靶向人類PSMA的四種特異性人類scFv：1C3、2A10、2C6和2F5從IDT合成作為gBlocks。透過重疊PCR組裝具有4-1BB-zeta(BBZ)的CAR，並將其選殖到RNA體外轉錄載體pD-A中。pD-A載體針對T細胞轉染、CAR表現和RNA產生進行了優化。在RNA IVT之前，透過SpeI分解將四種人類PSMA CAR和一種小鼠PSMA CAR(J591)線性化。利用T7 mScript標準mRNA生產系統(Cellscript，Inc.，Madison，WI)產生加帽/尾部IVT RNA。透過RNeasy Mini Kit(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)純化IVTRNA。純化的RNA以1~2mg/mL的無RNA酶的水洗提，並儲存在-80℃直至使用。透過260/280吸光值確認RNA的完整性，並在瓊脂糖凝膠上進行目測。
Lenti CAR構築體設計：將所有PSMA CAR次選殖到pTRPELenti載體中。接著將轉換受體：PD1.CD28-F2A(SW)、PD1A132LPTM.CD28-F2A(SW*)及顯性負TGFRβII序列dnTGFRβII-T2A(dn)次選殖到各個Lenti載體中，接著是人類PSMA scFv。
Lenti載體包括的序列的實例如下：1C3(SEQ ID NO：169)
2A10(SEQ ID NO：170)
2F5(SEQ ID NO：171)
2C6(SEQ ID NO：172)
PD1.CD28-F2A(SW)(SEQ ID NO：173)
PD1 A132L -PTM.CD28-F2A(SW*)(SEQ ID NO：174)
dnTGFRβII-T2A(dn)(SEQ ID NO：175)
轉導方法：將從人類免疫學核心獲得的大量T細胞(CD4和CD8)稀釋至106個細胞/mL1的濃度，並用CD3/28珠子(T細胞擴增劑，Invitrogen)在細胞：珠子1：3的比例下進行刺激。使用3：1的MOI在刺激後第1天將包 裝的慢病毒載體進行轉導，並使其在37℃/5% CO2培養箱中擴增。
轉導效力：使用Biotin-SP-AffiniPure山羊抗小鼠IgG(Cat#：115-065-072、Jackson ImmunoResearch Labs)或Biotin-SP-AffiniPure兔子抗人類IgG(Cat#：309-065-082，Jackson ImmunoResearch Labs)，接著是鏈親和素APC(Cat#：17-4317-82，eBioscience)或鏈親和素PE(Cat#：554061，BD Pharmingen)透過流式細胞儀評估CAR的轉導效力。APC抗人類CD279(PD-1)抗體(Cat#：329908，BioLegend)和人類TGF-βRIIAPC-綴合的抗體(目錄號#FAB241A，R&D系統)用於檢查轉換受體或顯性負TGFRβII部分。
T細胞擴增：從刺激後第3天開始每2天餵食細胞並分裂。在第4天將T細胞去珠子，並在第10天冷凍以備後用。
RNA電穿孔：使用BTX830在500V和700μs下用10或20μg IVT PSMA RNA CAR電穿孔休眠T細胞。使用BTX830在300V和500μs下用5μg或15μg PSMA IVT RNA電穿孔Nalm6.CBG或K562細胞。使用BTX830在300V和500μs下用0.5μg、2μg或5μg PDL1 IVT RNA電穿孔PC3.PSMA細胞。電穿孔後，立即將細胞置於37℃和5% CO2的預熱培養基中。18小時後，PSMA或PDL1電穿孔的腫瘤細胞被APC抗人類PSMA(FOLH1)抗體(Cat#：342507，BioLegend)或APC抗人類CD274(PDL-1或B7-H1)抗體染色(Cat#：17-5983-42，BD Biosciences)並透過流式細胞儀分析。
細胞計數：在擴增-休眠循環期間的不同時間點，將細胞輕輕混合並從已知的培養物體積收集40μL等分試樣的細胞，並置於具有20mL Isoton II稀釋劑緩衝液的計數器(Beckman Coulter)中用於計數。Coulter Multisizer 3(Beckman Coulter)符合CCI實驗室SOP。這些測定可確定細胞濃度、總細胞數、生長速率及細胞體積，並用於計算稀釋體積並確定細胞何時休眠以進行冷凍。
定量PCR：將初代細胞或腫瘤細胞裂解並通過QIA破碎機(Cat#79656)。根據製造商的方案，透過RNeasy Mini試劑盒(Cat#74104)萃取總RNA。進行反轉錄(Cat#：11904-018，Invitrogen)以獲得cDNA。用對PSMA具有專一性的引子對cDNA進行定量PCR：(F引子： AGGAAGTCTCAAAGTGCCCT(SEQ ID NO：176)，R引子：GAACAACAGCTGCTCCACTC(SEQ ID NO：177))或GAPDH：(F引子：GCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTC(SEQ ID NO：178)，R引子：CCCAGCAGTGAGGGTCTCTCTCTTC(SEQ ID NO：179))。
IL-2和IFN-γ的ELISA：清洗T細胞或標靶細胞後，將細胞以1x106個細胞/mL的濃度懸浮於R10培養基中。將各個細胞株以大約0.1mL加入96孔盤(Corning)的孔中，並在37℃下培養18至20小時。收穫上清液並進行ELISA。
CD107a測定：在100μL R10培養基中製備E：T比例為1：2(5×104效應子：1×105標靶)的細胞，並種植於96孔盤中。將10μL藻紅蛋白標記的抗CD107aAb加入96孔盤中並在37℃溫育1小時。將Golgi Stop(3ml R10培養基中有2ul Golgi Stop，10ul/孔；BD Biosciences，51-2092KZ)加入96孔盤中再培養2.5小時。然後加入2μL FITC-抗-CD8(Cat#：551347，BD Pharmingen)和2μL APC-抗-CD3(Cat#：555342，BD Pharmingen)並在37℃下培養30分鐘。培養後，用FACS緩衝液洗滌樣品並透過流式細胞儀進行分析。
基於螢光素酶的CTL測定：將Nalm6-CBG、PC3-CBG、PC3.PSMA-CBG腫瘤細胞以1×105個細胞/mL的濃度重新懸浮於R10培養基中，並與不同比例的T細胞(例如10：1、5：1、2.5等)在37℃下培養18小時。加入等體積的基質並立即檢測螢光。檢測結果為殺傷百分比，其係以具有腫瘤細胞但沒有T細胞的孔中的螢光素酶活性作為基準(殺傷%=100-((作用細胞和標靶細胞共培養的孔中所測得的RLU)/(標靶細胞的孔中所測得的RLU)×100))。
PC3.PSMA腫瘤模型：將用叩頭蟲轉導的2E6 PC3.PSMA.7SC細胞注射到小鼠(iv)，在28天後，將2E6個PSMA CAR-T陽性轉導的T細胞注射到攜帶腫瘤的小鼠中(iv)。在多個時間點進行生物發光成像(BLI)。
實驗結果如下所述。
實施例1：人類RNA PSMA CAR具有與小鼠RNA PSMA CAR，J591等同的抗腫瘤活性
各使用四種scFv序列的其中之一：1C3(SEQ ID NO：169)、 2A10(SEQ ID NO：170)、2C6(SEQ ID NO：172)及2F5(SEQ ID NO：171)(來自美國專利申請案US2009/0297438A1，其內容通過引用整體併入本文)來構築靶向PSMA的四種人類RNA CAR。ScFv與CD8跨膜域和4-1BB和CD3 zeta胞內訊息傳遞域相連。將純化的RNA顯現於瓊脂糖凝膠上(圖1A)並電穿孔到休止的人類初代T細胞中。在所測試的條件下，所有CAR具有接近100%的CAR表現。無論是人類或小鼠PSMA CAR，10μg IVT RNA CAR可達到CAR表現的最大平均螢光強度(MFI)；因此，10μg IVT RNA用於進一步的實驗(圖1B)。不同的人類CAR中的CAR的表現不同，1C3.BBZ表現的CAR的MFI最高。小鼠J591 CAR表現的MFI比1C3.BBZ高4倍；然而，由於抗體來源的種類不同，10μg小鼠J591 RNA CAR也用於進一步的實驗。
將全長PSMA選殖到PD-A載體中以獲得最佳的RNA表現。將純化的RNA顯現於瓊脂糖凝膠上(圖1A)，電穿孔到Nalm6.CBG或K562腫瘤細胞中，並透過流式細胞儀分析PSMA的表現(圖1C)。將15μg和5μg PSMARNA分別用於Nalm6.CBG和K562腫瘤細胞的後續實驗。先前構築的PC3.PSMA.PSCA.CBG腫瘤細胞，其PSMA表現減少(37.5%)(圖1C)。對PC3.PSMA.CBG腫瘤細胞株進行有限稀釋，分離7個單細胞植株並組合成新的細胞株PC3.PSMA.7SC.CBG(圖1D)。
用PSMA RNA、PC3或PC3.PSMA.PSCA.CBG腫瘤細胞電穿孔的Nalm6.CBG或K562與各種PSMA RNA CAR共培養。進行CD107a測定、基於螢光素酶的CTL測定和ELISA測定以確定四種新的人類CAR的功能性。當與PSMA陽性細胞共培養時，所有四種人類PSMA CAR具有與小鼠PSMA CAR，J591相當的去顆粒活性(圖2A)。然而，四分之三的人類PSMA CAR對PC3細胞的非特異性活化比J591 CAR更高(圖2A)。與J591 CAR相比，所有四種人類CAR對PSMA陽性細胞具有相當的細胞毒性和抗腫瘤活性(圖2B和圖2C)。細胞激素的產生是對1C3.BBZ、2A10.BBZ和2F5.BBZ CAR專一的PSMA標靶(圖2C)。
實施例2：人類Lenti PSMA CAR特異性靶向PSMA陽性細胞
將四種人類PSMA CAR次選殖到pTRPE Lenti載體中。用人類 PSMA CAR轉導的初代人類T細胞具有不同的CAR表現水平：1C3.BBZ為40%、2A10.BBZ為66%、2C6.BBZ為50%、2F5.BBZ為6%(圖3A)。透過T2A序列(dnTGFRβII-J591.BBZ)將顯性負TGFRβII序列與小鼠J591.BBZ CAR連接。用PSMA RNA、PC3或PC3.PCMA.CBG細胞電穿孔的Nalm6.CBG並與各種PSMA Lenti CAR共培養。進行CD107a測定、基於螢光素酶的CTL測定和ELISA測定以確定四種新的人類PSMA Lenti CAR的功能性，並與小鼠J591CAR進行比較。1C3.BBZ、2A10.BBZ和2F5.BBZ在去顆粒化測定和基於螢光素酶的殺傷測定中與dnTGFRβII-J591發揮相似的抗腫瘤活性(圖3B和圖3C)。就細胞激素的產生而言，所有四種人類PSMA Lenti CAR引起特異性IL-2和INF-γ產生，但其量在各個人類CAR中不同(圖3D)。
實施例3：轉換受體或顯性負-TGFRβII連接的人類Lenti CAR的構築
設計包含PD1的截短的胞外域和CD28的跨膜和細胞質訊息傳遞域的轉換受體(PD1.CD28)，並透過T2A序列與各個人類PSMA CAR連接。在PD1上的132(小鼠為99)位置從丙胺酸到白胺酸的點突變使其與PDL1的親和力增加2倍(Zhang等人，Immunity 20,337-347,2004)。因此，第二種形式的轉換受體「PD1A132LPTM.CD28」(具有截短的PD1的胞外和跨膜域和CD28的細胞質訊息傳遞域)與各個人類PSMA CAR連接。將顯性負TGFRβII序列也次選殖到各個人類PSMA CAR中。進行流式細胞儀以檢查各種轉換受體-CAR(圖4A)和dnTGFRβIICAR(圖4B)的轉導效率。對於所有轉換受體-CAR轉導的T細胞，觀察到不同的CAR/PD1雙陽性群體。人類PSMA Lenti CAR與它們的兩個轉換受體對應體之間的轉導效率相似(圖4A)。各個2C6 CAR具有最低的轉導效率。沒有檢測到單獨的dnTGFRβII群體，但是對於各個dnTGFRβII連接的人類PSMA CAR，觀察到明顯的位移(圖4B)。
為了檢查轉換受體的功能，將各種不同量的PDL1 RNA(0.5μg、2μg和5μg)電穿孔到PC3.PSMA細胞中(圖4C)。將用5ug PDL1 RNA電穿孔的PC3.PSMA細胞與各種PSMA CAR共培養。在共培養實驗之前，將dnTGFRβII-J591.BBZ標準化至50%的轉導效率。當與PSMA陽性細胞共培養 時，四分之三的人類PSMA CAR及其轉換受體或dnTGFRβII對應體顯示出與dnTGFRβII-J591.BBZ CAR相當的去顆粒化活性(圖4D、圖4E和圖4F)。2C6.BBZ CAR及其相關對應體表現出較低的去顆粒活性，這可能是由於轉導效率較低所引起的(圖4G)。所有四種人類PSMA CAR及其轉換受體或dnTGFRβII對應體對於PC3.PSMA細胞顯示出相似的細胞毒性(圖4H)。所有人類PSMA CAR均引發與dnTGFRβII-J591.BBZ CAR相當量的細胞激素(圖4I)。當與PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞共培養時，各個轉換受體CAR與非轉換受體或dnTGFRβII CAR對應體相比，分泌的IL-2的量幾乎高兩倍(圖4I)。
實施例4：PC3.PSMA.7SC異種移植模型
選擇以下六種人類PSMA CAR用於PC3.PSMA.7SC小鼠異種移植模型：1C3.BBZ、PD1CD28.1C3.BBZ、2A10.BBZ、PD1CD28.2A10.BBZ、dnTGFRβII-2A10.BBZ和dnTGFRβII-J591.BBZ。透過流式細胞儀檢測CAR的表現(圖5A和圖5B)。小鼠J591.BBZ Lenti CAR包含在功能性測試中。所有測試的PSMA CAR在CD107a測定中顯示相似的去顆粒活性(圖5C和圖5D)，並且在基於螢光素酶的CTL測定中具有相當的殺傷活性，其中2A10.BBZ最低且dnTGFRβII-J591.BBZ最高(圖5E)。當與PDL1電穿孔的PC3.PSMA.7SC細胞共培養時，各個轉換受體CAR與其非轉換受體或dnTGFRβII CAR對應體相比，分泌的IL-2的量幾乎高兩倍(圖5F)。
為了確保使用上述人類PSMA CAR的安全性，透過定量PCR測試一組初代人類細胞(表1)的PSMA表現(圖5G)。所有測試的初代細胞透過Nalm6.CBG進行標準化後具有不同的PSMA表現水平，甚至是PC3細胞，其僅對PSMA RNA CAR具有有限的反應性(圖2A)而非PSMA LentiCAR(圖5H)(PC3.PSMA比PC3細胞的PSMA表現高1800倍)。將HREpC、HSAEpC和HPMEC人類初代細胞與上述CAR共培養。進行CD107a和ELISA測定。當與HPMEC共培養時，所有測試的PSMA CAR具有最小的可檢測的去顆粒活性(圖5H和圖5I)。與1C3.BBZ相比，當與HPMEC共培養時，PD1CD28.1C3.BBZ引起IL-2增加(圖5J)。儘管是與PC3.PSMA.7SC相比，初代人類細胞引發的細胞激素水平，特別是HPMEC可忽略不計(圖5J與圖5F相比)。
NSG小鼠體內實驗設計使用7組(每組5隻小鼠)來測試上述6種PSMA CAR加上未轉導的控制組。將用叩頭蟲綠轉導的2E6 PC3.PSMA.7SC細胞注射到小鼠(i.v.)中，在28天後，將2E6 CAR陽性轉導的T細胞注射到攜帶腫瘤的小鼠(i.v.)中。在不同時間點進行生物發光成像(BLI)：腫瘤注射後第27、34、42、49天(圖5K和圖5L)。不受任何理論的束縛，該實驗的結果顯示，所測試的所有PSMA CAR具有與dnTGFRβII.J591.BBZ相當的抗腫瘤活性。
圖6顯示了dnTGFRII-T2A PSMA-CAR構築體的不同域，以及pTRPE dnTGFRII-T2A PSMA CAR的載體圖譜。
實施例5：PSMA CAR-T細胞的體內腫瘤控制
轉導方法：將從人類免疫學核心獲得的大量T細胞(CD4和CD8)稀釋至106個細胞/ml的濃度，並用CD3/28珠子(T細胞擴增劑，Invitrogen)在細胞：珠子1：3的比例下進行刺激。使用3：1的MOI在刺激後第1天將包裝 的慢病毒載體進行轉導，並使其在37℃/5% CO2培養箱中擴增。
轉導效力：使用PE抗人類TCR Vβ8抗體(Cat#：348104，BioLegend)和APC抗人類CD279(PD-1)抗體(Cat#：329908，BioLegend)透過流式細胞儀評估轉導效力。
T細胞擴增：從刺激後第3天開始每2天餵食細胞並分裂。在第3或第4天將T細胞去珠子，並在第12天冷凍以備後用。
細胞計數：在擴增-休眠循環期間的不同時間點，將細胞輕輕混合並從已知的培養物體積收集40μL等分試樣的細胞，並置於具有20mL Isoton II稀釋劑緩衝液的計數器(Beckman Coulter)中用於計數。Coulter Multisizer 3(Beckman Coulter)符合CCI實驗室SOP。這些測定可確定細胞濃度、總細胞數、生長速率及細胞體積，並用於計算稀釋體積並確定細胞何時休眠以進行冷凍。
IL-2和IFN-γ的ELISA：清洗T細胞或標靶細胞後，將細胞以1x106個細胞/mL的濃度懸浮於R10培養基中。將各個細胞株以大約0.1mL加入96孔盤(Corning)的孔中，並在37℃下培養18至20小時。收穫上清液並進行ELISA。
CD107a測定：將效應子：標靶(E：T)細胞的比例為1：1(105效應子：105標靶)的細胞，種植在含有160μL R/10培養基的96孔盤中。將抗CD107a抗體加入96孔盤中並在37℃溫育1小時後，將Golgi Stop加入96孔盤中再培養2.5小時。然後加入抗-CD8和抗-CD3抗體並在37℃下培養30分鐘。培養後，清洗樣品一次並用BD Accuri C6進行流式細胞儀分析。使用FlowJo軟體分析數據。
PC3-PMSA腫瘤模型：將1E6 PC3-PMSA-CBG皮下注射(s.c.)到小鼠中，在21天後，將慢病毒轉導的T細胞靜脈內注射(i.v.)到攜帶腫瘤的小鼠中。在多個時間點進行生物發光成像(BLI)和腫瘤測量。
結果：產生表2中列出的序列並測試它們在體內控制腫瘤的能力。
構築具有ICOS或ICOS.YMNM訊息傳遞域並和CAR+PD1(或Tim3)轉換受體組合的PSMA CAR，並選殖到慢病毒載體中(參見表2的序列)。經轉導的T細胞中的CAR表現水平對於大多數CAR構築體而言是相當的(圖7)，並且轉換受體適度表現(圖8)。當用PSMA陽性細胞株PC3.PSMA或PC3.PSMA.PD-L1刺激並檢測CD107a上調時，具有ICOS.YMNM訊息傳遞域(ICOS ymnm)的PSMA CAR與野生型ICOS(ICOS)或4-1BB(41BB)CAR相比顯示了顯著更高的CD107a表現(圖9)。ICOS和ICOS.YMNM PSMA CAR的顆粒酶B表現類似於4-1BB PSMA CAR(圖10)。當用表現PD-L1的PC3.PSMA細胞刺激時，與包括ICOS、ICOS.YMNM或4-1BB的PSMA CAR共轉導的PD1轉換受體產生的細胞激素(IL-2和IFN-γ)顯著更高(圖11A和圖11B)。
圖12顯示了攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠，其以CAR轉導的T細胞處理至86天(圖12A)，甚至長達151天(圖12B)的生物發光成像的定量結果。圖13顯示攜帶PC3-PSMA.CBG誘導腫瘤的NSG小鼠的腫瘤尺寸，腫瘤用圖中所示的CAR轉導的T細胞進行處理長達164天。如圖所示，ICOS(2F5.ICOSz)和ICOS.YMNM PSMA CAR(2F5.ICOSzYMNM)均顯示出比4-1BB PSMA CAR(2F5.BBZ)更差的腫瘤控制。PD1-CD28轉換受體改善具有4-1BB共刺激域(PD1.CD28.2F5.BBZ)的PSMA CAR，但不改善ICOS(PD1CD28.2F5ICOSz)或ICOS.YMNM(PD1CD28.2F5ICOSzYMNM)的PSMA CAR。與4-1BB PMSA CAR相比，PD1.CD28.2F5.BBZ和PD1CD28.2F5ICOSzYMNM均顯示較差的腫瘤控制。當這些基於CAR的ICOS與具有4-1BB訊息傳遞域(PD1*BB)的高親和力PD1轉換受體共同遞送至T細胞時，可以像4-1BB PMSA CAR一樣有效地控制腫瘤。如圖14A至14F所示，T細胞與ICOS.YMNM CAR和具有4-1BB訊息傳遞域的PD1轉換受體(PD1*BB.2F5ICOSzYMNM)共同遞送消除了腫瘤。圖14G按腫瘤控制能力的順序提供了T細胞的列表。
實施例7：PSMA CAR-T細胞共表現PD1至CD28轉換的雙特異性抗體、或TGFβ受體II至CD28轉換的雙特異性抗體
使用可結合PD-L1(10A5、13G4及1B12，參見例如PCT公開 號WO2007005874A2)的scFv或TGFβ受體II(aTGFbRII-1和aTGFbRII-3(TGFb1和TGFb3，參見例如，美國專利號8,147,834)和抗CD28 scFv(1412，參見例如美國專利號7,585,960)，設計五種雙特異性抗體並透過PCR合成基因。將經序列驗證的DNA選殖到基於RNA的PGEM.64A體外轉錄載體中，以產生pGEM.aTGFbR-1-1412和pGEM.aTGFbR-3-1412。參見例如，PCT公開號WO2016122738A1。
產生PSMA CAR-T細胞，其共表現選自上述的雙特異性抗體。
實施例8：臨床CART-PSMA-TGFβRDN自體T細胞的製備和施用
根據臨床細胞和疫苗生產設施(CVPF)的標準作業流程(SOP)，進行CART-PSMA-TGFβRDN研究性細胞產物製備、最終調配物、測試和標記如下所述。CVPF是賓夕法尼亞大學病理學和檢驗醫學系的輸血醫學和治療病理學部門的一個單位。在該部門內，除了CVPF和血球分離收集設施外，還有一個獨立的造血幹細胞處理實驗室，負責骨髓和周邊血液幹細胞產品，主要致力於支持臨床造血幹細胞移植服務。CVPF是一個註冊的HCT設施，並獲得了細胞治療認證協會(Accreditation of Cellular Therapy，FACT)的認證。
Dynabeads CD3/C28 CTSTM(以前稱為ClinExVivo)珠子用於T細胞活化和擴增。
CART-PSMA-TGFβRDN研究產品製造是從白血球分離術產品開始的。根據貝克曼庫爾特Multisizer和BD FACS Calibur裝置評估的白血球分離術產品的構成，發現以下情況：在TTerumoBCT Elutra上的逆流離心淘洗(counterflow centrifugal elutriation)清除單核球，其使用一次性封閉式系統拋棄式裝置進行，使用半自動封閉式系統裝置Haemonetics CellSaver 5進行洗滌步驟、及/或Ficoll分離PBMC的膚色部分。在第0天，用Dynabeads CD3/CD28 CTS珠子激活T淋巴球開始CART-PSMATGFβRDN的製造過程。在第1天以總最終MOI添加PSMA-TGFbRIIDN CAR LV載體。在第1天和第3天之間發生載體轉導。在第3天，清洗細胞並更換培養基。培養物可以繼續在GE Wave生物反應器系統中進行擴增。在培養的最後一天，收穫細胞並在收獲前使用Cell Saver 進行濃縮，將細胞產物放置於Baxter MaxSep上以去除Dynabeads CD3/CD28 CTS珠子。去除珠子後，使用Haemonetics Cell Saver 5清洗細胞擴增物，以去除殘留的載體、病毒顆粒和細胞碎片。將CART-PSMA-TGFβRDN細胞重新懸浮於含有31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、1%右旋糖40和5%右旋糖、5%人類血清白蛋白集7.5% DMSO的冷凍保存培養基中。使用控制速率的冷凍機將細胞在Cryostore乙酸乙烯酯(EVA)(OriGen Biomedical)或等同的透明袋中冷凍。
冷凍保存的CART-PSMA-TGFβRDN：每個輸液袋含有約10至50mL的細胞。冷凍保存的細胞也以與輸注劑量相同的細胞濃度的小等分試樣保留，並用作哨兵小瓶(sentinel vial)，用於在輸注之前進行存活率和內毒素測試，並用於穩定性測試。
白血球分離術收集和細胞分離/富集：在賓夕法尼亞大學醫院(HUP)的血球分離單位透過白血球分離術收集自體周邊血液淋巴球。在進入研究之前從患者收集的冷凍保存的歷史血球分離產品可用於CART-PSMA-TGFβRDN細胞製造。如果使用，樣品必須在經過適當認證的血球分離中心收集，且產品的單核細胞必須達到足夠產量。
在COBE Spectra血球分離系統或等同系統上處理大約10至15L血液以獲得約5x109個白血球的群體。除了方案中提供的篩查測試要求之外，來自所有血球分離捐贈者的血液都要經過由美國紅十字會國家測試實驗室進行的傳染病測試。
將血球分離產物在隔熱容器中運輸至CVPF，並在收到時記錄溫度。取出樣品用於細菌和真菌培養，透過流式細胞儀進行即時表型分析，以及研究和相關研究目的。將血球分離產物冷凍保存或透過淘洗加工。在淘洗或細胞洗滌後，在Coulter Multisizer M3/M4上透過台盼藍染料排除測定法測定細胞數。將經過淘洗的產物冷凍保存或進行進一步處理。將冷凍保存的血球分離或淘洗產物解凍並在培養前清洗以去除冷凍保存培養基。然後透過1)清洗和接種經淘洗的淋巴球，2)用CD3/CD28珠子進行陽性選擇，或3)基於Ficoll的梯度分離進行進一步的T細胞選擇來處理這些產物。
開始培養和擴增：在靜態組織培養瓶中用Dynabeads CD3/CD28 CTS刺激經富集的淋巴球，該靜態組織培養瓶中有8 x 105至1 x 106個細胞在補充有5%人類AB血清、2mM L-GlutaMAX、20mM Hepes、1mM丙酮酸鈉、1% MEM維生素必需混合物、10mM N-乙醯半胱胺酸和100IU/ml IL-2的XVIVO-15培養基中(改良的X-VIVO 15培養基)。以珠子與細胞3：1比例的添加珠子。在培養的第5天，如果達到可接受的細胞數，則將細胞轉移到WAVE 2/10EH生物反應器中以擴增至合適的細胞數，用於收穫、電穿孔、取樣和最終調配物。在培養的最後一天，收穫細胞並使用Cell Saver Wash系統濃縮。在收穫之前，將細胞產物置於Baxter MaxSep上以去除抗CD3/CD28磁性微珠。收穫後，將經擴增的T細胞以2 x 106個細胞/mL的濃度重新懸浮於補充有5%人類AB血清的X-VIVO培養基中，將細胞置於37℃培養箱中至隔天。
CART-PSMA-TGFBRDN劑量調配物：對於一個組別，劑量調配物以1~3x107/m2 CART-PSMA-TGFBRDN細胞的劑量開始，對於其他組別，劑量調配物以1~3x108/m2的劑量開始。給藥基於抗PSMA CAR的表現。總劑量配製為單劑量。
最終調配物：培養後，在去除所有釋放測試樣品和檔案後，將細胞重新懸浮於含有31.25% PlasmaLyte-A、31.25%右旋糖(5%)的NaCl溶液(0.45%)、7.5% DMSO、5%人類血清白蛋白和1%低分子量右旋糖(LMD)的不溶性冷凍保存培養基中。
產品施用：
解凍細胞：由經過培訓的人員使用水浴或可維持在36℃至38℃的類似裝置在CVPF或床邊解凍細胞。當容器連接到I.V.管時，容器中不應留下冷凍塊。如果CART-PSMA-TGFβRDN細胞產品的袋子可能有破損或洩漏、或者受到損害，則不輸注，並返回CVPF。
給藥：輸注在CTRC的一個隔離室或賓夕法尼亞大學醫院的其他地方使用免疫抑制患者的預防措施進行。在輸注之前，兩個個體在受試者存在的情況下獨立地驗證關於輸注產品標籤的訊息，並確認該訊息與參與者正確匹配。在解凍後約30分鐘內輸注細胞。透過外周靜脈(優選的)或中央靜脈將CART 細胞靜脈輸注到18號靜脈內導管中。使用Macrodrip靜脈內管透過重力(即，沒有輸注泵)以約10mL/分鐘的速率通過具有3向栓塞的乳膠游離Y型輸血套輸注CART細胞。白血球減除過濾器不用於輸注CART細胞產物。如果受試者有過敏反應，或嚴重的低血壓危症或對輸注的任何其他反應，則在輸注期間可獲得緊急醫療設備(即緊急推車)。在輸注之前和之後測量生命體徵(溫度、呼吸速率、脈搏、血壓和脈搏血氧飽和度的氧飽和度)。如果受試者的生命體徵不能令人滿意和穩定，則至少每小時或臨床指示持續監測生命體徵直至穩定。在管理受試者的醫生確定受試者處於令人滿意的狀態後，受試者可出院。
實施例9：CART-PSMA-TGFβRDN臨床試驗設計
該方案測試了2個劑量水平的CART-PSMA-TGFβRDN細胞的安全性，單獨靜脈內施用前述CART-PSMA-TGFβRDN細胞，或在施用CART-PSMA-TGFβRDN細胞之前三天施用中等劑量的環磷醯胺以清除淋巴細胞後靜脈內施用前述CART-PSMA-TGFβRDN細胞。劑量遞增遵循3+3設計。將CART-PSMA-TGFβRDN細胞永久性修飾以針對PSMA蛋白質，其中抗PSMACAR與4-1BB和TCRζ的訊息傳遞域融合。研究人群包括患有去勢抵抗攝護腺癌的患者，其具有淋巴結、內臟或骨轉移的放射線攝影證據。所有患者在用至少一種標準17α裂解酶抑制劑或第二代抗雄激素療法治療後其疾病必須有進展。
第一名患者施用的日期是2017年8月31日。
作為知情同意的一部分，要求受試者允許測試其腫瘤的PSMA作為適格標準之一。優選地在新鮮腫瘤生檢中評估PSMA的表現；然而，如果生檢不可行或臨床上不合適，則使用來自最近轉移組織生檢的歸檔組織來確定在先前90天內獲得的適格性。
有資格參加本實驗的患者為確診10%的腫瘤細胞具有PSMA表現的且符合所有其他入選標準。
組別1(N=3或6)在第0天接受單劑量的1~3 x 107/m2經慢病毒轉導的CART-PSMA-TGFβRDN細胞，且沒有任何調理化療方案。如果製造的CAR T細胞的數量不符合預先規定的1 x 107/m2細胞的最小輸注劑量，則不施用劑量，並且在研究中替換受試者。如果出現1個DLT/3受試者，該研究在 該劑量水平下招募額外3個受試者。如果出現0個DLT/3受試者或1個DLT/6受試者，則該研究進展至組別2。如果2個DLT/3受試者以1~3 x 107/m2細胞的劑量發生，則停止該組別的招募並且將劑量降低10倍至1~3 x 106個細胞/m2(組別-1)。在這種情況下，最多6個受試者參與組別-1。
組別2的受試者(N=3或6)在第0天接受單劑量的1~3 x 108/m2經慢病毒轉導的CART-PSMA-TGFβRDN細胞，且沒有任何調理化療方案。如果製造的CAR T細胞數量不符合方案規定的最少1 x 108/m2個細胞，但確實滿足至少1 x 107/m2的最低劑量要求，則受試者接受給藥而不包括在組別2的DLT評估中。該受試者將被替換為該劑量的DLT評估。如果製造的CAR T細胞的數量不足如組別1所述的預先規定的最小輸注劑量，則不施用劑量，並且在研究中替換受試者。如果發生1個DLT/3受試者，該研究在該劑量水平下招募另外3個受試者。如果出現0個DLT/3受試者或1個DLT/6受試者，則該研究進展至組別3。如果出現2個DLT/3受試者，則停止研究並宣布最大耐受劑量(MTD)。
組別1和組別2用於鑑定CART-PSMA-TGFβRDN細胞的MTD。MTD定義為發生0/3或1/6 DLT的最高劑量。
組別3的受試者(N=3或6)在第0天接受單次輸注經慢病毒轉導的CART-PSMA-TGFβRDN細胞的MTD，然後在CAR T細胞處理前4天(第-3±1天)給予單劑量1.0克/m2的環磷醯胺。如果出現0個DLT/3受試者，該研究將招募額外3個患者以確認耐受性。如果發生1個DLT/3受試者，該研究在該劑量水平上招募額外3個受試者。如果最初的三個受試者中的兩個經歷DLT，則在CAR T細胞處理前4天(第-3±1天)施用淋巴清除性化療的劑量減少至500mg/m2。
受試者連續招募。交錯輸注以允許評估DLT的組別進展、擴展或劑量降低。每個組別中前兩個受試者的輸注錯開了28天；第二個受試者直到第一個受試者輸注後28天才輸注。每個組別中的第2和第3個受試者被輸注並且並行追蹤，但僅在該組別中的第1個受試者在沒有DLT的情況下完成第28天的訪問之後才開始。
DLT定義為至少可能與T細胞輸注後28天內發生的T細胞方案 相關的任何新的3級或更高級的不良事件。如果在以劑量水平治療的前3個受試者中發生1個DLT，則該研究以該劑量水平招募另外3個受試者。如果出現2個DLT/3受試者，則停止研究並宣布最大耐受劑量，除了組別1，其中發生10倍劑量的降低。如果0個DLT/3受試者或1個DLT/6受試者處於該劑量水平，則該研究進展到下一個組別。對於組別3，如果最初的三個受試者中的兩個經歷DLT，則另外三個患者在CAR T細胞之前的4天(第-3±1天)內將淋巴清除性化療的劑量減少至500mg/m2。否則，如果在組別3中發生0~1個DLT/3受試者，則該研究招募額外3個患者以確認耐受性。
對受試者進行安全性評估和研究評估。為了安全性評估，受試者在第1、3、7、10、14、21和28天返回研究追蹤。在第28天(±5)，用胸部/腹部/骨盆的CT、骨掃描和血清PSA進行疾病分期。在第28天進行這種早期成像評估的原因是用於評估全身性發炎作用並監測CART-PSMA-TGFβRDN細胞預期歸巢(homing)時的疾病狀態。在第3個月和第6個月進行重複疾病評估(包括成像)並且此後作為護理標準。如果受試者在第3個月及/或第6個月的4週內具有相關的成像數據(CT abd/骨盆、MRI abd/骨盆、骨掃描)作為其護理標準的一部分，則在第3個月及/或第6個月不再重複。
不良事件報告在同意時開始，並持續到受試者結束研究之前。在研究期間，受試者不斷重新評估急性和累積毒性的證據。從主要追蹤階段中斷後，受試者從他們的CART-PSMA-TGFβRDN輸注進入長達5年的追蹤期。在長期追蹤期間，監測受試者用於追蹤可能與施用CART-PSMA-TGFβRDN細胞相關的延遲性不良事件。
在限定的時間點獲得周邊血液樣品以監測安全性和功效的測量。還可以將為臨床適應症獲得的額外的血液和組織樣品(例如，液體、組織生檢)送去進行研究分析。在獲得組織或體液的任何時間(例如，胸水或腹水的引流)，將流體樣品用於研究目的而取代被丟棄。這些研究包括但不限於透過Q-PCR進行的CART-PSMA-TGFβRDN細胞持久性研究和使用基於Luminex的細胞激素和趨化介素的發炎標記物評估。
在意外的AE的情況下，收集額外的血液和組織用於研究分析， 集中於評估注入的CART-PSMA-TGFβRDN細胞的未預期事件的潛在因果關係。用於研究的額外樣品在一周內收集兩次不超過3湯匙血液，並且每月進行一次組織樣品採集程序。
納入標準：
1.轉移性去勢抵抗攝護腺癌
2.透過對組織生檢的免疫組織化學分析證實，10%的腫瘤細胞表現PSMA。
3.骨轉移性疾病及/或可測量的非骨轉移性疾病(淋巴結或內臟)的放射線攝影證據
4.患者18歲
5.ECOG的表現狀態為0~1
6.充分的器官功能，定義如下：
a.血清肌酸酐1.5mg/dl或肌酸酐清除率60cc/分鐘
b.血清總膽紅素<1.5x ULN
c.血清ALT/AST<2x ULN
7.研究登記後4週內有適當的血液學特徵，具體如下：
a.Hgb>10g/dl
b.PLT>100k/ul
c.ANC>1.5k/ul
注意：受試者不得依賴輸血
8.進展性去勢抵抗攝護腺癌的證據，定義如下：
a.使用或不使用雄激素剝奪療法的睾固酮的去勢水平(<50ng/ml)
b.在研究招募前的12週內，有以下一種進展性疾病的證據：
i.依據RECIST 1.1標準的軟組織級數
ii.骨掃描中有2或更多新病變的骨疾病進展(根據PCWG2標準)
iii.血清PSA增加至少25%且最低點絕對增加2ng/ml或更多(根據PCWG2標準)
9.先前已經用至少一種標準17α裂解酶抑制劑或第二代抗雄激素療法治療轉移性去勢抵抗攝護腺癌
10.提供書面知情同意書
11.具有生殖潛力的受試者必須同意使用可接受的避孕方法。
排除標準：
1.先前治療使用基於免疫的療法治療攝護腺癌，包括癌症疫苗療法(例如SipuleucelT、PROSTVAC)、免疫檢查點抑制劑、鐳-223和免疫綴合物療法
2.在過去5年內有活躍的非治癒性非攝護腺原發性惡性腫瘤的病史
3.需要長期使用全身性皮質類固醇治療的受試者
4.已接受>3種先前療法治療去勢抵抗攝護腺癌的受試者(不包括釋黃體素促效劑或拮抗劑、或第一代抗雄激素療法)。這包括在非去勢抵抗環境中接受紫杉烷的受試者。
5.根據紐約心臟病協會分類為III/IV級心血管疾病受試者(見附件2)
6.具有影響脊髓功能的症狀性脊椎轉移的受試者(由臨床病史、理學檢查或MRI成像確定)
7.需要免疫抑制治療的活動性自體免疫疾病的歷史
8.持續或感染活躍的患者。
9.對研究產品賦形劑(人類血清白蛋白、DMSO和聚葡萄醣40)有過敏或過敏的歷史
10.活動性B型肝炎、C型肝炎或愛滋病毒感染。
實施例10：第1期臨床安全性數據
截至2018年7月25日，總共輸注了6名受試者，並且兩名受試者仍在研究中。在組別1中輸注3名受試者，在組別2中輸注3名受試者。因此，組別2已招募完成。在與組別1的契約中，在組別2中輸注的所有三個受試者都經歷了細胞激素釋放症候群(CRS)：兩個受試者具有3級CRS且一個受試者具有1級CRS，所有CRS都在CAR T細胞輸注的12小時內發生。這些毒性按照方案/機構指南進行管理並得到解決。因此，組別2在沒有DLT的情況下完成。
研究試驗訪視會議於2017年2月22日星期三舉行，該研究於2017年3月8日啟動。截至2018年7月25日，臨床端同意了8名受試者。在同 意的8名受試者中，有1名篩選失敗、1名受試者在治療前退出，6名受試者被輸注。
表3顯示了篩選受試者的人口統計學概況(N=8)。
N/A=不適用
*長期追蹤期間發生死亡。因此，此事件不符合PDAE的要求，並且與IP無關。
表4顯示了經輸注的受試者的當前方案狀態的總結(N=6)。
表4：經輸注的受試者的當前方案狀態
表5顯示了經輸注的受試者的偏差或異常的總結(N=6)。
表6顯示了經輸注的受試者中輸注日期和劑量的總結(N=6)。
表7是經輸注的受試者的疾病反應的總結(N=6)。
表7：經輸注的受試者的疾病反應
NE=不可評估
PD=進展性疾病
SD=穩定的疾病
待定=受試者尚未達到此時間點
未評估=在這個時間點沒有進行評估
N/A=不適用/受試者在此時間點之前停止了主要追蹤
表8是經輸注的受試者的血清PSA水平的總結(N=6)。
N/A=不適用
¥=受試者於11/1/2017進入LTFU；第2個月PSA於2017年2月2日繪製
---=沒有關於此受試者的計劃外數據
待定=受試者尚未達到此時間點
表9顯示對於經輸注的受試者(N=6)透過qPCR在周邊血液中標記PSMA-TGFβRDN細胞的總結。
ND=沒有檢測到
N/A=不適用-受訪者在此次就診前已停止進行主要追蹤
待定=受試者尚未達到此時間點
未收集=未收集研究樣品用於分析
尚未有結果=尚未測試樣品
表10顯示對於經輸注的受試者(N=6)透過qPCR對在其他組織中的PSMA-TGFβRDN細胞進行標記的總結。
FFPE=福馬林固定、石蠟包埋
BMBMX=骨髓生檢
BX=生檢
ND=沒有檢測到
表11顯示透過免疫組織化學測定的被招募的受試者的PSMA陽性腫瘤細胞百分比的總結(N=7)。
NA=未指定的
ND=沒有檢測到
實驗例11：PSMA導向的/TGFβ不敏感的CAR-T細胞在轉移性去勢抵抗攝護腺癌中的第1期臨床試驗
背景：
CAR-T細胞的過繼性免疫療法具有治療癌症的轉化潛力。這些治療在攝護腺癌中成功的主要挑戰是免疫抑制微環境，包括腫瘤浸潤後重新導向的T細胞遇到的高水平TGFβ。重要的是，使用顯性負TGFβ受體(TGFβRdn)可以在T細胞中抑制TGFβ的這些免疫抑制功能，從而增強抗腫瘤免疫力。在體內散布的腫瘤模型中，TGFβRdn在PSMA導向的CAR-T細胞上的共表現導致T細胞增生的提高、細胞激素分泌的增加、長期持久性和更加地誘導腫瘤根除。適應性腫瘤抗性的機制尚不清楚。
圖15顯示了CART-PSMA-TGFβRdn細胞在體內散布的腫瘤模型中的功效。圖15A顯示CART-PSMA-TGFβRdn細胞在42天共培養和用表現PSMA的腫瘤細胞的重複刺激下相對於CART-PSMA表現出增強的抗原特異性增生的圖。圖15B顯示體內CART-PSMA-TGFβRdn細胞與CART-PSMA相比顯示出顯著增加了腫瘤減少的圖，如透過每週BLI成像測量以評估腫瘤負擔。圖15C顯示每週BLI評估的腫瘤的位置和系統負擔的照片。圖15中使用的縮寫：Pbbz=CAR-T PSMA；dnTGFBR2-T2A-Pbbz=CART-PSMA-TGFβRdn；19bbz=抗CD19 CAR。
研究規劃：
研究概述：首次進行人體第1期臨床試驗以評估慢病毒轉導的PSMA導向/TGFβ不敏感CAR-T細胞(CART-PSMA-TGFβRdn)在治療有難治的轉移性去勢抵抗攝護腺癌(CRPC)(NCT03089203)的男性安全性和初步療效。在初步劑量遞增組別中，患者接受單劑量1~3 x 107/m2(組別1)或1~3 x 108/m2(組別2)CART-PSMA-TGFβRdn細胞，無3+3設計的淋巴球清除性化療。在組別3中，患者在用環磷醯胺300mg/m2和氟達拉濱30mg/m2進行淋巴球清除性化療3天後接受CART-PSMA-TGFβRdn細胞的最大耐受劑量(MTD)。所有接受治療的患者在基線時以及CAR-T細胞輸注後+10天接受轉移性腫瘤生檢。
關鍵適格標準：轉移性CRPC，先前使用至少一種第二代雄激素訊息傳遞抑制劑(阿比特龍或恩雜魯胺)治療；透過IHC對轉移組織生檢時發現10%的腫瘤細胞表現PSMA；轉移性疾病(骨質或淋巴結/內臟)的放射線攝 影證據；轉移性CRPC治療4線。
研究方案：圖16顯示了該臨床試驗中使用的研究方案。
相關分析：CART-PSMA-TGFβRdnDNA的定量PCR在連續時間點進行以評估CAR-T擴增和周邊血液中的持久性以及向標靶組織的運輸。透過免疫和發炎因子的Luminex分析評估周邊血液中CART-PSMA-TGFβRdn細胞的生物活性。在連續時間點收集循環腫瘤材料並與臨床反應相關聯。
研究狀態和初步結果：6名患者接受指定劑量水平的CART-PSMA-TGFβRdn細胞輸注(組別1，N=3；組別2，N=3)。所有CART-PSMA-TGFβRdn輸注產品均符合標靶轉導效率。在初步劑量遞增中未觀察到劑量限制性毒性。
透過CART-PSMA-TGFβRdn DNA的qPCR評估CAR-T細胞動力學證實了周邊血液T細胞的擴增(圖17)，以及對治療後腫瘤活組檢中的腫瘤組織運輸(表17)。
*拷貝數/ug gDNA
FFPE=福馬林固定、石蠟包埋
ND=沒有檢測到
在組別2中，兩名患者發展出預期的3級細胞激素釋放症候群(CRS)，這是CAR-T治療的生物學活性的關鍵標誌，並且一名患者發展為需要皮質類固醇的3級CAR-T神經毒性。
發炎性細胞激素(IL-6、IL-15、IL-2、IFNγ)和鐵蛋白的顯著增加與所有3級CRS事件相關(受試者32816-06：圖18A；和受試者32816-07：圖18B)。所有CRS事件用托珠單抗(抗IL6R)救援可迅速解決。
組別3的招募(MTD與淋巴清除性化療)於2018年9月開始。
實施例12：組別1和2的觀察和案例研究
圖19顯示了組別1和組別2患者中攝護腺特異性抗原(PSA)反應的圖。
受試者32816-07：74歲患有轉移性去勢抵抗攝護腺癌(mCRPC；初步診斷：2014年5月)。在PSMA-TGFβRDNCART輸注後幾小時發燒至103F(無淋巴丘清除)。在PSMA-TGFβRDNCART輸注後約8小時，觀察到低血壓，最低點為83/44mmHg。在輸注PSMA-TGFβRDNCART後第二天用類晶體輸注(在ICU入院期間不需要藥理學管理)和托珠單抗治療低血壓。
在PSMA-TGFβRDNCART輸注後，在患者32816-07中觀察到細胞激素釋放症候群(CRS)(圖20A)。在圖20A中，左側y軸表示周邊血液中PSMA-TGFβRDNCART的水平，單位為拷貝數/ug基因體DNA(32816-07)，右側y軸表示IL-6水平，單位為pg/ml(IL6)。CRS伴有短暫的PSA降低(圖20B)。在圖20B中，左側y軸表示C-反應蛋白(CRP)的血清水平，以mg/L表示，右側y軸表示鐵蛋白的血清水平，以ng/L表示。
組別1和組別2中的PSMA陽性CTC觀察：表18顯示了在不同時間點在每個受試者中檢測到的PSMA陽性循環腫瘤細胞(CTC)的數量的總 結，其數據在圖21中繪出。
本文中各專利、專利申請案、以及引用的公開文獻，其全部內容皆藉由引用而納為本文揭露之一部。本發明雖已參照前述實施例方式進行揭露，但對於其他本發明所屬技術領域具有通常知識者來說，仍可設計出未脫離本發明精神與範疇的其他實施例與變形，至為灼然。後附之申請專利範圍之解釋應包含所有此種實施例及其等效變更。
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 鉸鏈
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<223> CD8跨膜域
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8鉸鏈及CD8跨膜域
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS(YMNM)
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<212> PRT
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 zeta域
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 zeta域
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 zeta域
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 zeta域
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB域及CD3 zeta域
<400> 103
<210> 104
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB域及CD3 zeta域
<400> 104
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> J591鼠類PSMA-CAR
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 1C3人類PSMA-CAR
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 2A10人類PSMA-CAR
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<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6人類PSMA-CAR
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBRII-DN
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28轉換受體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-PTM-CD28轉換受體
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<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28轉換受體
<400> 121
<210> 122
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28轉換受體
<400> 122
<210> 123
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-IL12RB1受體
<400> 123
<210> 124
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-IL12RB1受體
<400> 124
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<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-IL12RB2受體
<400> 125
<210> 126
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-IL12RB2受體
<400> 126
<210> 127
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28受體
<400> 127
<210> 128
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28受體
<400> 128
<210> 129
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體
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<211> 1508
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 130
<210> 131
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 131
<210> 132
<211> 1499
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 132
<210> 133
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 133
<210> 134
<211> 1520
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 134
<210> 135
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-1-1412 TGFBRII/CD28雙特異性抗體
<400> 135
<210> 136
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-1-1412 TGFBRII/CD28雙特異性抗體
<400> 136
<210> 137
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-3-1412 TGFBRII/CD28雙特異性抗體
<400> 137
<210> 138
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-3-1412 TGFBRII/CD28雙特異性抗體
<400> 138
<210> 139
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 139
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 140
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 間隔子
<400> 141
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 間隔子
<400> 142
<210> 143
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 143
<210> 144
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 144
<210> 145
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<400> 145
<210> 146
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<400> 146
<210> 147
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<400> 147
<210> 148
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<400> 148
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<400> 149
<210> 150
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F-GS2-T2A連接子
<400> 150
<210> 151
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F-GS2-T2A連接子
<400> 151
<210> 152
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-PSMA-CAR
<400> 152
<210> 153
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-1C3PSMA-CAR
<400> 153
<210> 154
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-2A10PSMA-CAR
<400> 154
<210> 155
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-2F5PSMA-CAR
<400> 155
<210> 156
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-2C6PSMA-CAR
<400> 156
<210> 157
<211> 2250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28-1C3PSMA-CAR
<400> 157
<210> 158
<211> 2235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28-2A10PSMA-CAR
<400> 158
<210> 159
<211> 2241
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28-2F5PSMA-CAR
<400> 159
<210> 160
<211> 2244
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28-2C6PSMA-CAR
<400> 160
<210> 161
<211> 2232
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28-1C3PSMA-CAR
<400> 161
<210> 162
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28-2A10PSMA-CAR
<400> 162
<210> 163
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28-25FPSMA-CAR
<400> 163
<210> 164
<211> 2226
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28-2C6PSMA-CAR
<400> 164
<210> 165
<211> 2340
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-1C3PSMA-CAR
<400> 165
<210> 166
<211> 2325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2A10PSMA-CAR
<400> 166
<210> 167
<211> 2331
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-25FPSMA-CAR
<400> 167
<210> 168
<211> 2334
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2C6PSMA-CAR
<400> 168
<210> 169
<211> 821
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C3
<400> 169
<210> 170
<211> 806
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A10
<400> 170
<210> 171
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5
<400> 171
<210> 172
<211> 815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6
<400> 172
<210> 173
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1.CD28-F2A
<400> 173
<210> 174
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM.CD28-F2A
<400> 174
<210> 175
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnTGFRBII-T2A
<400> 175
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 176
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 177
<210> 178
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 178
<210> 179
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 179
<210> 180
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> J591 PSMA scFv
<400> 180
<210> 181
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> J591 VL
<400> 181
<210> 182
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> J591 VH
<400> 182
<210> 183
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH一致性
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> X是A或P
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> X是V或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> X是A或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> X是R或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> X是P或H
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(55)
<223> X是N或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> X是V或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> X是I或L
<400> 183
<210> 184
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL一致性
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X是Q或V
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X是T或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> X是S或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> X是P或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> X是V或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> X是Y或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> X是K或M
<400> 184
<210> 185
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 185
<210> 186
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 186
<210> 187
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 187
<210> 188
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 188
<210> 189
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 189
<210> 190
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 190
<210> 191
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 191
<210> 192
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 192
<210> 193
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 193
<210> 194
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH一致性
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> X是A或P
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> X是V或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> X是A或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> X是R或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> X是P或H
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(55)
<223> X是N或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> X是V或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> X是I或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> X是L或P
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(102)
<223> 是AYWLF,GGWTF，或GAWTM
<400> 194
<210> 195
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL一致性
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X是Q或V
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X是T或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> X is S or T X是S或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> X是P或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> X是V或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> X是Y或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(95)
<223> 是FTRYP或YNAYS
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> X是K或M
<400> 195
<210> 196
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 196
<210> 197
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 197
<210> 198
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 198
<210> 199
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 199
<210> 200
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 200
<210> 201
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 201
<210> 202
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 202
<210> 203
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS ICD
<400> 203
<210> 204
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS ICD
<400> 204
<210> 205
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS CD3zeta ICD
<400> 205
<210> 206
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS CD3zeta ICD
<400> 206
<210> 207
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異體ICOS CD3zeta ICD
<400> 207
<210> 208
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異體ICOS CD3zeta ICD
<400> 208
<210> 209
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 209
<210> 210
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 210
<210> 211
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 211
<210> 212
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 212
<210> 213
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-4-1BB轉換受體
<400> 213
<210> 214
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-4-1BB轉換受體
<400> 214
<210> 215
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB轉換受體
<400> 215
<210> 216
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB轉換受體
<400> 216
<210> 217
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-F2A-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 217
<210> 218
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 218
<210> 219
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 219
<210> 220
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 220
<210> 221
<211> 2220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-41BB-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 221
<210> 222
<211> 2220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-41BB-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 222
<210> 223
<211> 2313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 223
<210> 224
<211> 2313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 224
<210> 225
<211> 3090
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB-TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 225
<210> 226
<211> 3090
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB-TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 226
<210> 227
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 227
<210> 228
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 228
<210> 229
<211> 740
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-41BB-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 229
<210> 230
<211> 771
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 230
<210> 231
<211> 1030
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB-TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 231
<210> 232
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 232
<210> 233
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 233
<210> 234
<211> 740
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-41BB-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 234
<210> 235
<211> 771
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 235
<210> 236
<211> 1030
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB-TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 236

Claims (94)

  1. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：一嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域(PSMA binding domain)；以及一顯性負受體(dominant negative receptor)及/或一轉換受體(switch receptor)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之經修飾的細胞，其中該PSMA結合域是一鼠類PSMA結合域。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之經修飾的細胞，其中該PSMA結合域是一人類PSMA結合域。
  4. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中該PSMA結合域是選自於抗體、Fab或scFv所組成的群組。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中當該scFv是鼠類的時，該scFv包括於SEQ ID NO：13或14中任一者所示的胺基酸序列，且其中當該scFv是人類的時，該scFv包括於SEQ ID NO：26、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中該CAR包括一跨膜域(transmembrane domain)及一胞內域(intracellular domain)。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之經修飾的細胞，其中該跨膜域包括一衍生自CD8的跨膜區(transmembrane region)。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之經修飾的細胞，其中該衍生自CD8的跨膜區包括一SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第6項至第8項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該跨膜域更包括一衍生自CD8的鉸鏈區(hinge region)。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之經修飾的細胞，其中該衍生自CD8的鉸鏈區包括一SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第6項至第10項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該胞內域包括一4-1BB訊息傳遞域及一CD3 zeta訊息傳遞域。
  12. 如申請專利範圍第6項至第10項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該胞內域包括一ICOS訊息傳遞域及一CD3 zeta訊息傳遞域。
  13. 如申請專利範圍第6項至第10項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該胞內域包括一變異體ICOS訊息傳遞域及一CD3 zeta訊息傳遞域。
    【第13項】如申請專利範圍第11項所述之經修飾的細胞，其中該4-1BB訊息傳遞域包括一SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之經修飾的細胞，其中該ICOS訊息傳遞域包括一SEQ ID NO：203所示的胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之經修飾的細胞，其中該變異體ICOS訊息傳遞域包括一SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第11項至第13項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該CD3 zeta訊息傳遞域包括SEQ ID NO：97或100所示的胺基酸序列。
  17. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中該顯性負受體是一與負訊號相關的野生型蛋白質的截短變異體(truncated variant)。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之經修飾的細胞，其中該與負訊號相關的野生型蛋白質的截短變異體包括一SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
  19. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括：一第一域，其中該第一域衍生自與負訊號相關的一第一多肽；以及一第二域，其中該第二域衍生自與正訊號相關的一第二多肽。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之經修飾的細胞，其中該第一域包括與負訊號相關的該第一多肽的胞外域(extracellular domain)的至少一部分，且其中該第二域包括與正訊號相關的該第二多肽的胞內域的至少一部分。
  21. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體更包括一轉換受體跨膜域。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體跨膜域包括：與負訊號相關的該第一多肽的跨膜域；或 與正訊號相關的該第二多肽的跨膜域。
  23. 如申請專利範圍第19項至第22項中任一項所述之經修飾的細胞，其中與負訊號相關的該第一多肽是選自於CTLA4、PD-1、BTLA、TIM-3及TGFβR所組成的群組。
  24. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項所述之經修飾的細胞，其中與正訊號相關的該第二多肽是選自於CD28、ICOS、4-1BB及IL-12R所組成的群組。
  25. 如申請專利範圍第19項至第22項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括：一第一域，包括PD1的胞外域的至少一部分；一轉換受體跨膜域，包括CD28的跨膜域的至少一部分；以及一第二域，包括CD28的胞內域的至少一部分。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括一SEQ ID NO：117所示的胺基酸序列。
  27. 如申請專利範圍第19項至第22項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括：一第一域，包括PD1的胞外域的至少一部分；一轉換受體跨膜域，包括PD1的跨膜域的至少一部分；以及一第二域，包括CD28的胞內域的至少一部分。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括一SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列。
  29. 如申請專利範圍第27項所述之經修飾的細胞，其中該第一域包括PD1的胞外域的至少一部分，該PD1包括在胺基酸132位置的丙胺酸(A)取代為白胺酸(L)。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括一SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列。
  31. 如申請專利範圍第19項至第22項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括： 一第一域，包括PD1的胞外域的至少一部分，該PD1包括在胺基酸132位置的丙胺酸(A)取代為白胺酸(L)；以及一第二域，包括CD28的胞內域的至少一部分。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括一SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列。
  33. 如申請專利範圍第19項至第21項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括：一第一域，包括PD1的胞外域的至少一部分，該PD1包括在胺基酸132位置的丙胺酸(A)取代為白胺酸(L)；以及一第二域，包括4-1BB的胞內域的至少一部分。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括一SEQ ID NO：215所示的胺基酸序列。
  35. 如申請專利範圍第19項至第21項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括：一第一域，包括TIM-3的胞外域的至少一部分；以及一第二域，包括CD28的胞內域的至少一部分。
  36. 如申請專利範圍第35項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括一SEQ ID NO：127所示的胺基酸序列。
  37. 如申請專利範圍第19項至第21項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括：一第一域，包括TGFβR的胞外域的至少一部分；以及一第二域，包括IL12Rβ1的胞內域的至少一部分。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括一SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列。
  39. 如申請專利範圍第19項至第21項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括：一第一域，包括TGFβR的胞外域的至少一部分；以及一第二域，包括IL12Rβ2的胞內域的至少一部分。
  40. 如申請專利範圍第39項所述之經修飾的細胞，其中該轉換受體包括一SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列。
  41. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一顯性負受體，包括一SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
  42. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：213或215所示的胺基酸序列。
  43. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：117或119所示的胺基酸序列。
  44. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列。
  45. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：127所示的胺基酸序列。
  46. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括： 一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列。
  47. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13、14、16、38、50或62中任一者所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列。
  48. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：一嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；以及一轉換受體，包括SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
  49. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞更包括一雙特異性抗體。
  50. 如申請專利範圍第49項所述之經修飾的細胞，其中該雙特異性抗體包括一第一抗原結合域及一第二抗原結合域。
  51. 如申請專利範圍第50項所述之經修飾的細胞，其中該第一抗原結合域與一負訊號結合，該負訊號選自於CTLA4、PD-1、BTLA、TIM-3及TGFβR所組成的群組。
  52. 如申請專利範圍第50項或第51項所述之經修飾的細胞，其中該第二抗原結合域與一共刺激分子結合。
  53. 如申請專利範圍第52項所述之經修飾的細胞，其中該共刺激分子是CD28。
  54. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞是一經修飾的T細胞。
  55. 如申請專利範圍第54項所述之經修飾的T細胞，其中該經修飾的T細胞是自體細胞。
  56. 如申請專利範圍第1項至第55項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞是胞毒型T淋巴球(CTL)。
  57. 如申請專利範圍第1項至第53項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞是自然殺手細胞(NK cell)。
  58. 如申請專利範圍第1項至第53項中任一項所述之經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞是造血幹細胞或造血前驅細胞。
  59. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞是自體細胞。
  60. 如前述申請專利範圍中任一項所述之經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞衍生自人類。
  61. 如申請專利範圍第54或55項所述之經修飾的T細胞，其中該經修飾的T細胞衍生自人類。
  62. 一種分離的核酸，包括：一第一核酸序列，其編碼一嵌合抗原受體(CAR)，該CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域；以及一第二核酸序列，其編碼一顯性負受體及/或一轉換受體。
  63. 如申請專利範圍第62項所述之分離的核酸，其中該第一核酸序列包括SEQ ID NO：106、108、110、112、114、210、212中任一者所示的核酸序列。
  64. 如申請專利範圍第62項或第63項所述之分離的核酸，其中該第二核酸序列包括SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、214或216中任一者所示的核酸序列。
  65. 如申請專利範圍第62項至第64項中任一項所述之分離的核酸，其中該第一核酸序列與該第二核酸序列被一連接子所分離。
  66. 如申請專利範圍第65項所述之分離的核酸，其中該連接子包括編碼一內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)的核酸序列。
  67. 如申請專利範圍第65項所述之分離的核酸，其中該連接子包括編碼一自我剪切肽(self-cleaving peptide)的核酸序列。
  68. 如申請專利範圍第67項所述之分離的核酸，其中該自我剪切肽是一2A肽。
  69. 如申請專利範圍第68項所述之分離的核酸，其中該2A肽是選自於豬鐵士古病毒-1 2A(porcine teschovirus-1 2A，P2A)、明脈扁刺蛾病毒2A(Thoseaasigna virus 2A，T2A)、馬鼻炎A病毒2A(equine rhinitis A virus 2A，E2A)及口蹄疫病毒2A(foot-and-mouth disease virus 2A，F2A)所組成的群組。
  70. 如申請專利範圍第68項所述之分離的核酸，其中該2A肽是T2A。
  71. 如申請專利範圍第68項所述之分離的核酸，其中該2A肽是F2A。
  72. 如申請專利範圍第62項至第71項中任一項所述之分離的核酸，其中該分離的核酸從5’至3’包括該第一核酸序列、該連接子及該第二核酸序列。
  73. 如申請專利範圍第62項至第71項中任一項所述之分離的核酸，其中該分離的核酸從5’至3’包括該第二核酸序列、該連接子及該第一核酸序列。
  74. 一種分離的核酸，包括：一第一核酸序列，其編碼一嵌合抗原受體(CAR)，該CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，該第一核酸序列包括SEQ ID NO：180、15、27、39、51或63中任一者所示的核酸序列；以及一第二核酸序列，其編碼一顯性負受體及/或一轉換受體，該第二核酸序列包括SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、214或216中任一者所示的核酸序列。
  75. 一種分離的核酸，包括；一第一核酸序列，其編碼一嵌合抗原受體(CAR)，該CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，該第一核酸序列包括SEQ ID NO：180所示的核酸序列；以及一第二核酸序列，其編碼一顯性負受體及/或一轉換受體，該第二核酸序列包括SEQ ID NO：116所示的核酸序列。
  76. 如申請專利範圍第75項所述之分離的核酸，其中該第一核酸序列與該第二核酸序列被一連接子所分離，該連接子包括編碼T2A的核酸序列。
  77. 如申請專利範圍第75項所述之分離的核酸，其中該第一核酸序列與該第二核酸序列被一連接子所分離，該連接子包括編碼F2A的核酸序列。
  78. 一種分離的核酸，包括SEQ ID NO：152至168、210、212及217至226中任一者所示的核酸序列。
  79. 一種分離的核酸，包括一編碼一雙特異性抗體的核酸序列，該核酸序列為SEQ ID NO：130、132、134、136或138中任一者所示。
  80. 一種表現構築體(expression construct)，包括一如申請專利範圍第62項至第79項中任一項所述之分離的核酸。
  81. 如申請專利範圍第80項所述之表現構築體，其中該表現構築體是一病毒載體(viral vector)，該病毒載體選自於反轉錄病毒載體(retroviral vector)、慢病毒載體(lentiviral vector)、腺病毒載體(adenoviral vector)及腺相關病毒載體(adeno-associated viral vector)所組成的群組。
  82. 如申請專利範圍第81項所述之表現構築體，其中該表現構築體是一慢病毒載體。
  83. 如申請專利範圍第82項所述之表現構築體，其中該慢病毒載體更包括一EF-1α啟動子。
  84. 如申請專利範圍第82項或第83項所述之表現構築體，其中該慢病毒載體更包括一rev反應元件(rev response element，RRE)。
  85. 如申請專利範圍第81項至第84項中任一項所述之表現構築體，其中該慢病毒載體更包括一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)。
  86. 如申請專利範圍第81項至第84項中任一項所述之表現構築體，其中該慢病毒載體更包括一cPPT序列。
  87. 如申請專利範圍第82項所述之分離的表現構築體，其中該慢病毒載體更包括一EF-1α啟動子、一rev反應元件(RRE)、一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)及一cPPT序列。
  88. 如申請專利範圍第81項至第87項中任一項所述之表現構築體，其中該慢病毒載體是自我去活化慢病毒載體(self-inactivating lentiviral vector)。
  89. 一種用於產生如申請專利範圍第1項至第61項中任一項所述之經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括將如申請專利範圍第62項至第79項中任一項所述之核酸、或如申請專利範圍第80項至第88項中任一項所述之表現構築體中的一或多種引入該免疫細胞中。
  90. 一種在有需要的一個體中治療癌症的方法，該方法包括向該個體施用治療有效量的一組成物，該組成物包括如申請專利範圍第1項至第61項中任一項所述之經修飾的免疫細胞。
  91. 如申請專利範圍第90項所述之方法，其更包括向該個體施用一淋巴球清除性化療(lymphodepleting chemotherapy)。
  92. 如申請專利範圍第91項所述之方法，其中該淋巴球清除性化療包括向該個體施用治療有效量的環磷醯胺及/或氟達拉濱(fludarabine)。
  93. 一種在有需要的一個體中治療攝護腺癌的方法，該方法包括：向該個體施用一淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括向該個體施用治療有效量的環磷醯胺；以及向該個體施用一經修飾的T細胞，該經修飾的T細胞包括：一嵌合抗原受體(CAR)，該CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；及一顯性負受體包括SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
  94. 一種在有需要的一個體中治療轉移性去勢抵抗攝護腺癌(metastatic castrate resistant prostate cancer)的方法，該方法包括：向該個體施用一淋巴球清除性化療，該淋巴球清除性化療包括向該個體施用治療有效量的環磷醯胺；以及向該個體施用一經修飾的T細胞，該經修飾的T細胞包括： 一嵌合抗原受體(CAR)，該CAR對標靶細胞上的攝護腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中該CAR包括一PSMA結合域，其包括SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；及一顯性負受體包括SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列。
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