KR20070115967A - 전립선 특이 막 항원(ｐｓｍａ)에 대한 인간 모노클로날항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PSMA와 결합하는 분리된 모노클로날 항체, 구체적으로 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자, 본 발명의 항체를 발현하는 발현 벡터와 숙주 세포, 그리고 본 발명의 항체를 발현하는 방법도 제공된다. 본 발명의 항체를 포함하는 면역 컨쥬게이트, 이중 특이적 분자 및 약학 조성물도 제공된다. 본 발명은 또한 암을 치료하는 방법도 제공한다.

Description

전립선 특이 막 항원(ＰＳＭＡ)에 대한 인간 모노클로날 항체{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN(PSMA)}

본 발명은 전립선 특이 막 항원(PSMA)에 대한 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.

전립선암은 남성의 주요 유병 원인 또는 사망 원인이다. 전립선암의 치료 방법으로서는 수술, 호르몬 치료, 방사선 치료 및 화학 요법 등을 포함한다. 전이성 전립선 질환에 대한 효율적인 치료 방법은 그다지 많이 존재하지는 않는다. 그러므로, 진단 및 예후 마커로서 대표되는 유전자 및/또는 유전자 산물, 그리고 치료 표적을 동정하는 것이 중요하다. 전립선 특이 항원(PSA)은 전립선암의 임상적 진단을 수행하고 진행 기수를 파악하는데에 유용한 암 마커의 하나이다. 그러나, PSA는 4∼10 ng/㎖의 범위에서 전립선염 또는 전립선암으로부터 양성 전립선 비대증(Benign Prostatic Hyperplasia; BPH)을 분화시킬 수 없으므로, 적절한 진단 결과를 도출해내기 위해서는 세포학적 평가 및/또는 해부학적 평가를 필요로 한다[Barren, R.J.외 다수(1998) Prostate 36:181-188].

전립선 특이 막 항원(PSMA)은 750개의 아미노산으로 이루어진 제II형 경막 당 단백질로서, 분자량은 약 110 kDa이며 트랜스페린 수용체와의 상동성은 54%이 다. PSMA는 3개의 구조적 도메인을 가지는데, 이 3개의 도메인으로서는 19개의 아미노산으로 이루어진 세포 내 도메인, 24개의 아미노산으로 이루어진 경막 도메인, 그리고 707개의 아미노산으로 이루어진 세포 외 도메인을 포함한다. PSMA 단백질은 뉴로카복시펩티다제 및 엽산 가수 분해 효소 활성을 나타내며, 전립선 성장 및 분화에 있어서 신경 내분비 조절 작용에 관여하는 것으로 보고되었다[Heston, W.D. (1996) Urologe-Ausgabe A. 35:400-407]. PSM은 다른 형태로 스플라이싱된 PSMA으로서, 세포질에 존재하는 것이다.

PSMA는 주로 전립선 상피 세포에 의해 발현된다. PSMA의 발현량은 전립선암 특히, 덜 분화되었고, 덜 전이되었으며, 난치성인 호르몬 암의 경우에 증가한다[Gregorakis, A.K.외 다수(1998) Seminars in Urologic Oncology 16:2-12; Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85]. 전립선 외 조직 예를 들어, 소장, 침샘, 십이지장 점막, 근위 신장 세뇨관 및 뇌에서의 PSMA 발현 수준은 낮은 것으로 파악된다[Silver, D. A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85]. PSMA는 또한 임의의 악성 종양 예를 들어, 신장 세포 암 및 결장 암의 종양 주변 조직 및 종양 내부 조직의 모세 혈관 내피 세포에서는 발현되지만, 정상 조직의 혈관에서는 발현되지 않는다. 뿐만 아니라, PSMA는 종양의 신생 혈관 형성과 관련되어 있는 것으로 보고되었다[Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85]. 최근 들어, PSMA는 결장암, 유방암, 방광암, 췌장암, 신장암 및 흑색종에 있어서 종양 관련 신생 혈관 조직의 내피 세포에서 발현되는 것으로 입증된 바 있다[Chang, S. S. (2004) Curr Opin Investig Drugs 5:611-5].

PSMA의 세포외 도메인에 대한 항체에 관하여는 예를 들어, 다음과 같은 문헌에 기술되어 있다: Liu, H.외 다수(1997) Cancer Res. 57:3629-3634; Murphy, G.P. 외 다수(1998) J. Urol. 160:2396-2401; Wang, S.외 다수(2001) Int. J. Cancer 92:871-876; Kato, K.외 다수(2003) Int. J. Urol. 10:439-444; 미국 특허 제6,150,508호 및 동 제6,107,090호. 보다 최근에는 예를 들어, 다음과 같은 문헌에 PSMA와 결합하는 인간 항체 및 인간화된 항체에 관하여 기술된 바 있다:Bander, N.H.외 다수(2003) Semin. Oncol. 30:667-676; PCT 공개 공보 WO 02/098897; PCT 공개 공보 WO 01/09192; PCT 공개 공보 WO 03/064606; PCT 공개 공보 WO 03/034903; 및 미국 특허 출원 제2004/0033229호]. 이러한 항체들은 전립선암 세포를 이미지화하는데에 사용되고 있다[예를 들어, Yao, D.외 다수(2002) Semin. Urol. Oncol. 20:211-218; Bander, N.H.외 다수 (2003) J. Urol. 170:1717-1721 참조]. 항-PSMA 항체는 또한 전립선암 치료에 치료적 개입 수단(통상적으로 화학 요법 제제 또는 방사선 동위 원소와의 컨쥬게이트)으로서 사용되고 있기도 하다[예를 들어, Nanus, D.M.외 다수(2003) J. Urol. 170:S84-89; Milowsky, M.I.외 다수(2004) J. Clin. Oncol. 22:2522-2531; Henry, M.D.외 다수(2004) Cancer Res. 64:7995-8001].

그러므로, PSMA는 PSMA 발현을 특징으로 하는 전립선암과 기타 다수의 질병에 대한 유리한 표적이 되고 있으며, 그외에도 이 PSMA를 인지하는 추가의 치료제가 요망된다.

발명의 개요

본 발명은 PSMA와 결합하는 분리된 모노클로날 항체, 구체적으로 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 바람직한 특성 예를 들어, PSMA에 대한 높은 친화성, PSMA 발현 세포에 의하여 내재화되는 능력 그리고 높은 용융 온도를 가진다. 바람직하게, 본 발명의 항체의 용융 온도는 67℃ 이상, 또는 69℃ 이상, 또는 71℃ 이상이다.

하나의 측면에서, 본 발명은 인간의 V_H 3-30.3 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래하는 중쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 여기서 상기 항체는 PSMA와 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 인간의 VκL18 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래하는 경쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서 상기 항체는 PSMA와 특이적으로 결합한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은

(a) 인간의 V_H 3-30.3 유전자의 중쇄 가변부; 및

(b) 인간의 VκL18 유전자의 경쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서 상기 항체는 PSMA와 특이적으로 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명은

(a) 인간의 V_H 5-51 유전자의 중쇄 가변부; 및

(b) 인간의 VκL18 유전자의 경쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서 상기 항체는 PSMA와 특이적으로 결합한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은

(a) 서열 번호 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 21, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 25, 26, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 29, 30, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합한다.

바람직한 조합으로서는

(a) 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 21을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 29를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함한다.

기타 바람직한 조합으로서는

(a) 서열 번호 10을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 26을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 30을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함한다.

기타 바람직한 조합으로서는

(a) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 27을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함한다.

기타 바람직한 조합으로서는

(a) 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함한다.

본 발명의 기타 바람직한 항체 또는 이의 항원 결합부는

(a) 서열 번호 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

(b) 서열 번호 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하며, 여기서 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합한다.

바람직한 조합으로서는

(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

(b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함한다.

기타 바람직한 조합으로서는

(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

(b) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함한다.

기타 바람직한 조합으로서는

(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함한다.

기타 바람직한 조합으로서는

(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

(b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함한다.

본 발명의 항체는 예를 들어, 전장 항체 예를 들어, IgG1 또는 IgG4 동 기준 표본의 전장 항체일 수 있다. 대안적으로, 항체는 항체 단편 예를 들어, Fab 또는 Fab'₂ 단편, 또는 단일 사슬 항체일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하고, 치료제 예를 들어, 세포 독소 또는 방사성 동위 원소와 결합되어 있는 면역 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하고, 이 항체 또는 이의 항원 결합부와는 상이한 결합 특이성을 가지는 제2 작용부(functional moiety)와 결합되어 있는 이중 특이적 분자를 제공한다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부, 또는 면역 컨쥬게이트 또는 이중 특이적 분자와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물도 제공된다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터와 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 발명에 포함된다. 더욱이, 본 발명은 인간의 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자(transgene)를 포함하는 트랜스게닉 마우스를 제공하는데, 여기서 이 마우스는 본 발명의 항체및 이 마우스로부터 생산된 하이브리도마를 발현하고, 상기 하이브리도마는 본 발명의 항체를 생산한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에 본 발명의 항-PSMA 인간 항체를 종양 세포 성장에 효과적인 양만큼 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 종양 세포 또는 이 종양 세포에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현한다. 바람직한 구체예에서, 전립선 종양 세포의 성장은 억제된다.

본 발명은 또한 본원에 제공된 항-PSMA 항체의 서열을 바탕으로 하는 "2 세대" 항-PSMA 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 항-PSMA 항체를 생산하는 방법을 제공한다:

(a) (i) 서열 번호 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열; 서열 번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열; 및 서열 번호 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변부 항체 서열; 또는 (ii) 서열 번호 21, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열; 서열 번호 25, 26, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열; 및 서열 번호 29, 30, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변부 항체 서열을 제공하는 단계;

(b) 하나 이상의 가변부 항체 서열 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 하나 이상의 변형된 항체 서열을 제조하는 단계로서, 상기 서열은 중쇄 가변부 항체 서열 및 경쇄 가변부 항체 서열로부터 선택되는 것인 단계; 및

(c) 상기 변형된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계.

다른 측면에서, 본 발명은 개체 내에서 종양(예를 들어, 전립선암, 결장암, 신장암, 직장암, 요로 상피 암, 유방암, 방광암, 간암, 췌장암 또는 흑색종)의 성장을 억제 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 여기서 종양 세포 또는 종양에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현한다. 이 방법은 개체에 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 항 종양제와 함께 종양의 성장을 억제 또는 예방하는데에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 개체 내에서 종양의 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity; ADCC)을 자극하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 종양 세포 또는 이 종양에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현한다. 이 방법은 개체에 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 항 종양제와 함께 종양의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 자극하는데에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 개체 내에서 종양 관련 악액질을 억제하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 종양 세포 또는 종양에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현한다. 이 방법은 개체에 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 항 종양제와 함께 개체 내 발생하는 종양 관련 악액질을 억제하는데에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 개체에 항 종양제와 함께 투여하면 종양의 성장을 억제하는데에 있어서 상승 (synergistic) 효과를 볼 수 있다. 다른 구체예에서, 항 종양제는 종양 덩어리를 손상시켜 종양의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 보다 효과적으로 유도한다.

다른 구체예에서, 항-PSMA 항체는 7F12 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6 항체일 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 항 종양제는 화학 요법 제제 예를 들어, 탁소텔(Taxotere)®(도세탁셀)이다. 다른 구체예에서, 항 종양제는 항 혈관 신생 제제 예를 들어, 엔지오스타틴 K1-3, 어레스텐(Arresten), aaAT, 칸스타틴(Canstatin), DL-α-디플루오로메틸-오르니틴, 엔도스타틴(Endostatin), 푸마길린(Fumagillin), 제니스테인(Genistein), 미노사이클린(Minocycline), 스토로스포린(Staurosporine), 탈리도미드(Thalidomide) 및 텀스타틴(Tumstatin)이다. 다른 구체예에서, 항 종양제는 면역 조정제 예를 들어, 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 포스포로티올레이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드(1018 ISS), GM-CSF 유전자 백신, 인터루킨-2, 인터루킨-7(CYT 99 07), 인터루킨-12 및 인터루킨-21이다.

다른 측면에서, 본 발명은 종양의 성장을 억제 또는 예방하는데에 있어서 항-PSMA 항체와 함께 상승 작용할 수 있는 항 종양제를 동정하는 방법을 제공하는데, 여기서 종양 세포 또는 종양에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현한다. 이 방법은 지표 조성물(indicator composition)을 (a) 시험 항 종양제 단독, (b) 항-PSMA 항체 단독 및 (c) 시험 항 종양제 및 항-PSMA 항체 둘 다와 접촉시키는 단계; 및 (a) 시험 항 종양제 단독 및 (b) 항-PSMA 항체 단독이 종양의 성장을 억제 또는 예방하는 능력과, (c) 시험 항 종양제 및 항-PSMA 항체 둘 다가 종양의 성장을 억제 또는 예방하는 능력을 비교하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 (c)에 의하여 종양 성장을 억제 또는 예방하는 효과는 상기 (a) 및 (b)의 상가(additive) 효과보다 커서, 종양의 성장을 억제 또는 예방하는데에 있어서 항-PSMA 항체와 상승 작용할 수 있는 항 종양제를 동정할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 항-PSMA 항체(예를 들어, 7F12 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6)와 항 종양제(예를 들어, 탁소텔®(도세탁셀), 엔지오스타틴 K1-3, 어레스텐, aaAT, 칸스타틴, DL-α-디플루오로메틸-오르니틴, 엔도스타틴, 푸마길린, 제니스테인, 미노사이클린, 스토로스포린, 탈리도미드, 텀스타틴, 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 포스포로티올레이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드(1018 ISS), GM-CSF 유전자 백신, 인터루킨-2, 인터루킨-7(CYT 99 07), 인터루킨-12 또는 인터루킨-21)와 약학적으로 허용 가능한 담체를, 종양의 성장을 억제 또는 예방하는데에 효과적인 양으로, 또는 종양의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 촉진하는데에 효과적인 양으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 기타 특징 및 이점들은 이하 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안될, 상세한 설명과 실시예를 통하여 명백해 질 것이다. 본원에 전반적으로 인용되어 있는 모든 참고 문헌, Genebank를 통한 정보, 특허 및 공개된 특허 출원은 본원에 참고용으로서 인용되어 있는 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 고 친화도로 PSMA와 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체, 구체적으로 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 생식 계열 서열로부터 유래하며/유래하거나 특정한 구조적 특징 예를 들어, 특정한 아미노산 서열을 포함하는 CDR 부위를 포함한다. 본 발명은 분리된 항체와, 이러한 항체, 이 항체를 포함하는 면역 컨쥬게이트 및 이중 특이적 분자, 본 발명의 항체, 면역 컨쥬게이트 또는 이중 특이적 분자를 함유하는 약학 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 예를 들어, 암과 같은 질병을 치료하기 위하여 이와 같은 항체를 사용하는 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명을 더욱 잘 이해하기 위해서는 우선 몇 가지 용어에 관하여 정의해 두어야 할 것이다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시되어 있다.

"전립선 특이 막 항원(prostate specific membrane antigen)" 및 "PSMA"라는 용어는 본원에서 호화적으로 사용되고 있는 것으로서, 세포에 의하여 천연 상태에서 발현되고 본원에 개시된 항체인 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6에 대한 결합 특성을 보유하는, 인간 PSMA의 임의의 변이체, 아형 및 종간 상동체(species homolog)를 포함한다. 인간 PSMA 단백질의 완전한 아미노산 서열의 Genbank 승인 번호는 NP_004467이다. 인간 PSMA 단백질을 암호화하는 완전 cDNA 서열의 Genbank 승인 번호는 NM_004476이다.

"신호 전달 경로"란, 신호를 세포의 일부에서 세포의 다른 부분으로 전달하는 역할을 하는 다수의 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 의미하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포 표면 수용체"란 어구는 예를 들어, 신호를 받아들일 수 있고 이러한 신호를 세포의 원형질막을 통과하여 전달할 수 있는 분자 및 이러한 분자들의 복합체를 포함한다. 본 발명의 "세포 표면 수용체"의 예로서는 PSMA 수용체가 있다.

본원에 사용된 "항체"란 용어는 전 항체 및 이의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합부") 또는 단일 사슬을 포함한다. "항체"란, 이황화 결합에 의하여 상호 연결되어 있는 2개 이상의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당 단백질 또는 이의 항원 결합부를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부(이하, "V_H"라 약칭함) 및 중쇄 불변부로 이루어져 있다. 중쇄 불변부는 3개의 도메인 즉, C_H1, C_H2 및 C_H3로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부(이하, "V_L"이라 약칭함) 및 경쇄 불변부로 이루어져 있다. 경쇄 불변부는 하나의 도메인 즉, C_L로 이루어져 있다. V_H 및 V_L 부위는 추가로 세분화될 수 있는데 즉, 과 변이가 일어난 상보성 결정 부위(CDR), 보다 보존적인 부위가 산재되어 있는 틀 부위(framework region)(FR)로 세분화될 수 있다. V_H 및 V_L는 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어져 있으며, 이들은 아미노 말단 → 카복시 말단의 방향으로 다음의 순서에 따라서 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변부는 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변부는 숙주 조직 또는 인자 예를 들어, 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적 보체 계의 제1 성분(C1q)에 면역 글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다.

본원에 사용된 항체(또는 약칭 "항체 부분")의 "항원 결합부(antigen-binding portion)"란 용어는, 항원(예를 들어, PSMA)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 이루어질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로서는 (i) Fab 단편 즉, V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편 즉, 힌지부에 이황화 결합에 의해서 연결되어 있는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 한쪽 팔의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편[Ward외 다수(1989) Nature 341:544-546]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 부위(CDR)를 포함한다. 뿐만 아니라, 비록 Fv 단편의 2개의 도메인인 V_L 및 V_H는 별도의 유전자에 의해서 암호화되지만, 이 도메인들은 재조합법을 통하여, 상기 도메인들이 V_L 및 V_H 부위가 쌍을 이루어 1가 분자[단일 사슬 Fv(scFv)로서 알려져 있음; 예를 들어, Bird외 다수(1988) Science 242:423-426; 및 Huston외 다수(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 참조]를 형성한 단일의 단백질 사슬로서 생산되도록 만드는 합성 링커에 의해서 서로 결합될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되기도 한다. 이와 같은 항체 단편은 당 업자에게 공지된 종래의 기술을 이용하여 생산되며, 이 단편들은 원래의 항체에서와 같은 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

본원에 사용된 "분리된 항체"란 용어는, 상이한 항원 특이성을 가지는 기타 항체를 실질적으로 배제한 항체를 의미하는 것이다[예를 들어, 특이적으로 PSMA와 결합하는 분리된 항체는 PSMA를 제외한 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 배제하는 의미임]. 그러나, PSMA와 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 기타 항원 예를 들어, 다른 종으로부터 유래한 PSMA 분자와의 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 분리된 항체는 실질적으로 기타 세포 물질 및/또는 화학 물질이 제거된 것일 수 있다.

본원에 사용된 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이란 용어는, 단일의 분자 조성물인 항체 분자 제제를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.

본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 틀 부위 및 CDR 부위 둘 다가 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열로부터 유래하는 가변부를 가지는 항체를 포함하는 의미이다. 뿐만 아니라, 만일 항체가 불변부를 함유하면, 이 불변부는 또한 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열로부터 유래하는 것이다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 랜덤 또는 위치-특이적 돌연 변이 유발법 또는 생체 내 체성 돌연 변이에 의해 도입된 돌연 변이가 일어난 잔기)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 "인간 항체"란 용어는, 다른 포유동물 종 예를 들어, 마우스의 생식 계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 틀 서열로 옮겨진 항체들을 포함하는 의미는 아니다.

"인간 모노클로날 항체"라는 용어는, 틀 부위 및 CDR 부위가 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열로부터 유래하는 가변부를 가지는 단일의 결합 특이성을 나타내는 항체를 의미한다. 하나의 구체예에서, 인간의 모노클로날 항체는 하이브리도마 즉, 트랜스게닉 비-인간 동물 예를 들어, 트랜스게닉 마우스로부터 얻어지는 B 세포를 포함하고, 인간 중쇄 트랜스 유전자 및 경쇄 트랜스 유전자가 무한 증식 세포에 융합되어 있는 게놈을 가지는 하이브리도마에 의하여 생산된다.

본원에 사용된 "재조합 인간 항체"란 용어는, 재조합 수단 예를 들어, (a) 인간 면역 글로불린 유전자에 대하여 트랜스게닉이거나 또는 이에 대한 트랜스염색체를 가지는 동물(예를 들어, 마우스) 또는 이로써 생산된 하이브리도마로부터 분리된 항체(이하, 상세히 설명함), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질 전환된 숙주 세포 예를 들어, 형질 감염 세포(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합된 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체 및 (d) 인간 면역 글로불린 유전자 서열을 기타 DNA 서열로 스플라이싱하는 단계를 포함하는 임의의 기타 방법에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 항체에 의하여 제조, 발현, 생산 또는 분리되는 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 틀 부위 및 CDR 부위가 인간의 생식 계열 면역 글로불린 서열로부터 유래한 가변부를 가진다. 그러나, 임의의 구체예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연 변이가 유발될 수 있으므로(또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스게닉인 동물이 사용되는 경우에는, 생체 내 체성 돌연 변이가 유발될 수 있으므로), 재조합 항체의 V_H 및 V_L 부위의 아미노산 서열은 천연적으로 생체 내 인간 항체 생식 계열 레퍼토리 내에 존재할 수 없는 서열임과 동시에, 인간 생식 계열 V_H 및 V_L 서열로부터 유래하고 이와 관련된 서열이다.

본원에 사용된 "동 기준 표본"이란, 중쇄 불변부 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 군(예를 들어, IgM 또는 IgG1)을 의미한다.

"항원 인지 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 호환적으로 사용된다.

"인간 항체 유도체"란 용어는, 인간 항체의 임의의 변형된 형태의 것으로서, 예를 들어, 항체와 기타 제제 또는 항체의 컨쥬게이트를 의미한다.

"인간화된 항체"란 용어는, 다른 포유동물 종 예를 들어, 마우스의 생식 계열로부터 유래하는 CDR 서열이 인간의 틀 서열에 이식된 항체를 의미하는 것이다. 추가의 틀 부위 변형은 인간의 틀 서열 내에서 일어날 수 있다.

"키메라 항체"란 용어는, 가변부 서열은 하나의 종에서 유래하고 불변부 서열은 다른 종으로부터 유래하는 항체 예를 들어, 가변부 서열은 마우스 항체로부터 유래하고 불변부 서열은 인간 항체로부터 유래하는 항체를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, "인간 PSMA와 특이적으로 결합하는" 항체란, 항체가 인간 PSMA와 K_D 5×10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10^-9 M 이하, 더욱 바람직하게는 1.2×10^-9 M 이하, 더더욱 바람직하게는 1.2×10^-9 M 및 1.2×10^-10 M 이하로 결합하는 항체를 의미한다.

본원에 사용된 "K_assoc" 또는 "K_a"란 용어는 특정 항체-항원 상호 작용의 결합률을 의미하는 것이며, 반면에 본원에 사용된 "K_dis" 또는 "K_d"란 용어는, 특정 항체-항원 상호 작용의 해리율을 의미하는 것이다. 본원에 있어서 "K_D"란 용어는, K_d : K_a의 비율(즉, K_d/K_a)로부터 구하여지는 해리 상수를 의미하는 것으로서, 몰 농도(M)로서 표시한다. 항체에 대한 K_D값은 당 업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 항체의 K_D를 측정하기 위한 바람직한 방법으로서는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용하는 방법이 있는데, 바람직하게는 바이오센서 시스템 예를 들어, 바이어코어(Biacore)® 시스템을 사용하는 방법이 있다.

본원에 사용된 IgG 항체가 "고 친화성"이란 용어는, 표적 항원에 대한 K_D값이 10^-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-9 M 이하 및 더더욱 바람직하게는 10^-10 M 이하인 항체를 의미하는 것이다. 그러나, "고 친화성" 결합은 기타 항체의 동 기준 표본에 있어서 다양할 수 있다. 예를 들어, IgM 동 기준 표본에 대한 "고 친화성" 결합이란, 항체의 K_D값이 10^-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-8 M 이하, 더더욱 바람직하게는 10^-9 M 이하인 경우를 의미한다. 본원에 사용된 "벡터"란 용어는, 임의의 핵산을 그것이 결합되어 있는 다른 핵산으로 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 벡터의 일종인 "플라스미드"는, 부가 DNA 절편이 결찰될 수 있는 환형의 이중 사슬 DNA 루프를 의미한다. 다른 종류의 벡터로서는 바이러스 벡터가 있는데, 이 경우 부가의 DNA 절편은 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있다. 임의의 벡터는 이 벡터가 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다[예를 들어, 박테리아 벡터는 박테리아의 복제 기원과 포유동물의 에피좀 벡터를 가짐]. 기타 벡터(예를 들어, 비-에피좀형 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입될 때에 숙주 세포의 게놈에 통합화될 수 있으므로, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 유전자들이 작동 가능하도록 결합되어 있는 임의의 벡터는 이 유전자들을 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서는 "재조합 발현 벡터"(또는 약칭 "발현 벡터")라 부른다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용될 수 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태일 수 있다. 플라스미드는 가장 널리 사용되는 벡터의 형태이므로, 본 발명의 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 호환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 균등한 기능을 수행하는 기타 종류의 발현 벡터 예를 들어, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-결합 바이러스)를 포함하는 경향이 있다.

본원에 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 약칭 "숙주 세포")란 용어는, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 이러한 용어들은 특정 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손도 의미하는 것임을 이해하여야 한다. 임의의 변형은 돌연 변이 또는 환경의 영향으로 이후 세대에서도 일어날 수 있으므로, 이러한 자손들은 실제로 부모 세포와 동일할 수는 없지만, 본원에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에는 포함된다. 재조합 숙주 세포로서는 예를 들어, CHO 세포, 형질 감염체 및 림프 세포를 포함한다.

본원에 사용된 "개체"란 용어는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. "비-인간 동물"이란 용어는, 모든 척추 동물 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물 예를 들어, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류 및 파충류 등을 포함한다.

"트랜스게닉 비-인간 동물"이란 용어는, (동물의 천연 게놈 DNA에 통합되었거나 또는 통합되지 않은) 하나 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스 유전자 또는 트랜스 염색체를 포함하는 게놈을 가지며, 완전 인간 항체를 발현할 수 있는 비-인간 동물을 의미한다. 예를 들어, 트랜스게닉 마우스는 인간의 경쇄 트랜스 유전자와, 인간의 중쇄 트랜스 유전자 또는 인간의 중쇄 트랜스 염색체 중 어느 하나를 가질 수 있으므로, 이 마우스는 PSMA 항원 및/또는 PSMA 발현 세포로 면역화될 때 인간 항-PSMA 항체를 생산한다. 인간 중쇄 트랜스 유전자는 마우스의 염색체 DNA에 통합될 수 있는데, 이러한 특성은 트랜스게닉 마우스 예를 들어, HuMAb 마우스의 경우도 마찬가지이며, 또는 인간 중쇄 트랜스 유전자는 염색체 외에서 유지될 수 있는데, 이러한 특성은 WO 02/43478에 개시된 트랜스 염색체(예를 들어, KM) 마우스의 경우도 마찬가지이다. 이러한 트랜스게닉 및 트랜스 염색체 마우스는 V-D-J 재조합 및 동 기준 표본 스위칭(isotype switching)을 수행함으로써 PSMA에 대한 인간의 모노클로날 항체의 다수의 동 기준 표본(예를 들어, IgG, IgA 및/또는 IgE)을 생산할 수 있다.

본원에 사용된 "개체"란 용어는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. "비-인간 동물(nonhuman animal)"이란 용어는 모든 척추 동물 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물 예를 들어, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류 및 파충류 등을 포함한다.

본 발명의 다양한 측면에 관하여는 이하 섹션에 보다 상세히 기술되어 있다.

항- PSMA 항체

본 발명의 항체는 항체의 특정한 기능상의 특징 또는 성질을 특징으로 한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 인간 PSMA와 특이적으로 결합한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 PSMA와 고 친화도 예를 들어, K_D 5×10^-7 M 이하로 결합한다. 다른 예로서, 항체는 PSMA-발현 LNCaP(ATCC CRL-1740) 세포주에 특이적으로 결합한다. PSMA에 대한 항체의 결합 능을 평가하기 위한 표준적인 검정법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있는데, 그 예로서는 ELISA, 웨스턴 블럿 및 RIA를 포함한다. 적당한 검정법에 관하여는 실시예에 보다 상세히 기술되어 있다. 항체의 결합 동력학적 특성(예를 들어, 결합 친화도)은 또한 당 업계에 널리 공지된 표준적인 검정법 예를 들어, ELISA, 스캐처드(Scatchard) 분석법 및 바이어코어(Biacore) 분석법에 의하여 평가될 수도 있다. 본 발명의 항체의 기타 바람직한 특성으로서는 PSMA 발현 세포에 의하여 내재화되는 능력과 높은 열 안정성을 포함한다. 항체의 내재화는 실시예 6에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 열 안정성은 실시예 7에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체의 용융점은 65℃ 이상, 더욱 바람직하게는 66℃ 이상, 더욱 바람직하게는 67℃ 이상, 더욱 바람직하게는 68℃ 이상, 더욱 바람직하게는 69℃ 이상, 더욱 바람직하게는 70℃ 이상 및 가장 바람직하게는 71℃ 이상이다. 바람직하게, 본 발명의 항체의 용융점은 67∼72℃, 더욱 바람직하게는 68∼72℃, 또는 69∼72℃, 또는 70∼72℃, 또는 69∼71.43℃이거나, 또는 항체의 용융점은 약 71.43℃이다.

모노클로날 항체인 1 C3 , 2A10, 2F5 및 2 C6

본 발명의 바람직한 항체로서는 인간의 모노클로날 항체인 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6이 있는데, 이들은 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 분리되며 또한 이에 기술된 바와 같이 구조적으로 특성 규명된다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 V_H 아미노산 서열은 각각 서열 번호 1, 2, 3 및 4에 나타내었다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 V_L 아미노산 서열은 각각 서열 번호 5, 6, 7 및 8에 나타내었다.

이와 같은 항체들 각각이 PSMA와 결합할 수 있다면, V_H 및 V_L 서열은 "혼합 및 매치되어(mixed and matched)" 본 발명의 기타 항-PSMA 결합 분자를 생산할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치된" 항체의 PSMA 결합 특성은 전술한 결합 검정법 및 실시예에 기술된 방법(예를 들어, FACS 또는 ELISA)을 이용하여 평가될 수 있다. 바람직하게, V_H 및 V_L 사슬이 혼합 및 매치되는 경우, 특정 V_H/V_L 쌍으로부터 얻어지는 V_H 서열은 구조적으로 유사한 V_H 서열로 치환된다. 이와 유사하게, 특정 V_H/V_L 쌍으로부터 얻어지는 V_L 서열은 구조적으로 유사한 V_L 서열로 치환되는 것이 바람직하다.

그러므로, 본 발명의 하나의 측면에서, 본 발명은 다음과 같은 성분들을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 이때 이 항체는 PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA와 특이적으로 결합한다:

(a) 서열 번호 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

(b) 서열 번호 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부.

바람직한 중쇄 및 경쇄의 조합으로서는 다음과 같은 것들을 포함한다:

(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및 (b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 또는

(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및 (b) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 또는

(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및 (b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 또는

(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및 (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부.

다른 측면에서, 본 발명은 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 V_H CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12에 나타내었다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 V_H CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 13, 14, 15 및 16에 나타내었다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 V_H CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 17, 18, 19 및 20에 나타내었다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 Vκ CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 21, 22, 23 및 24에 나타내었다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 Vκ CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 25, 26, 27 및 28에 나타내었다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 Vκ CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 29, 30, 31 및 32에 나타내었다. CDR 부위는 Kabat 체계에 따라서 밑줄쳐서 나타내었다[Kabat, E. A.,외 다수(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242].

이러한 항체들 각각이 PSMA와 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위에 의해 제공될 경우, V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 Vκ CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 "혼합 및 매치"되어[즉, 각각의 항체는 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3와, Vκ CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유해야하지만, 상이한 항체로부터 유래하는 CDR은 혼합 및 매치 될 수 있음], 본 발명의 기타 항-PSMA 결합 분자를 생산할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치된" 항체의 PSMA 결합 특성은 전술한 결합 검정법과 실시예에 기술된 방법(예를 들어, FACS, ELISA, 바이어코어 분석법)을 이용하여 시험 될 수 있다. 바람직하게, V_H CDR 서열이 혼합 및 매치 될 때, 특정 V_H 서열로부터 유래하는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 치환된다. 이와 유사하게, Vκ CDR 서열이 혼합 및 매치 될 때, 특정 Vκ 서열로부터 유래하는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 치환된다. 신규의 V_H 및 V_L 서열은 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L CDR 부위 서열을 구조적으로 유사한 서열(즉, 모노클로날 항체인 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6에 관하여 본원에 개시되어 있는 CDR 서열로부터 유래하는 서열)로 치환함으로써 생산될 수 있다는 사실은 당 업자에게 명백할 것이다.

그러므로, 다른 측면에서, 본 발명은 다음과 같은 성분들을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서 이러한 항체는 PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA와 특이적으로 결합한다:

(a) 서열 번호 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 21, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 25, 26, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 29, 30, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3.

바람직한 구체예에서, 항체는

(a) 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 21을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 29를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함한다.

기타 바람직한 구체예에서, 항체는

(a) 서열 번호 10을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 26을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 30을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함한다.

기타 바람직한 구체예에서, 항체는

(a) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 27을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함한다.

기타 바람직한 구체예에서, 항체는

(a) 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

(b) 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

(c) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

(d) 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

(e) 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

(f) 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3을 포함한다.

특정 생식 계열 서열을 가지는 항체

임의의 구체예에서, 본 발명의 항체는 특정 생식 계열 중쇄 면역 글로불린 유전자로부터 유래하는 중쇄 가변부 및/또는 특정 생식 계열 경쇄 면역 글로불린 유전자로부터 유래하는 경쇄 가변부를 포함한다.

예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 V_H 3-30.3 유전자의 산물이거나 또는 이 유전자로부터 유래하는 중쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서, 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합한다. 기타 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 V_κ L18 유전자의 산물이거나 또는 이 유전자로부터 유래하는 경쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서, 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합한다.

추가의 기타 바람직한 구체예에서, 본 발명은 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서 이 항체는

(a) 인간 V_H 3-30.3 유전자(서열 번호 41)의 산물이거나 또는 이 유전자로부터 유래하는 중쇄 가변부를 포함하고;

(b) 인간 V_κ L18 유전자(서열 번호 43)의 산물이거나 또는 이 유전자로부터 유래하는 경쇄 가변부를 포함하며; 또한

이 항체는 PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA와 결합한다.

추가의 기타 바람직한 구체예에서, 본 발명은 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서 이 항체는

(a) 인간 V_H 5-51 유전자(서열 번호 42)의 산물이거나 또는 이 유전자로부터 유래하는 중쇄 가변부를 포함하고;

(b) 인간 V_κ L18 유전자(서열 번호 44)의 산물이거나 또는 이 유전자로부터 유래하는 경쇄 가변부를 포함하며; 또한

이 항체는 PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA와 결합한다.

V_H 및 Vκ가 각각 V_H 3-30.3이고 V_κ L18인 항체의 예로서는 1C3이 있다. V_H 및 Vκ가 각각 V_H 5-51이고 V_κ L18인 항체의 예로서는 2A10 및 2F5가 있다.

본원에 있어서, 인간의 항체는 중쇄 또는 경쇄 가변부 즉, 항체 가변부가 인간 생식 계열 면역 글로불린 유전자를 이용하는 계로부터 얻어지는 경우, 특정 생식 계열 서열의 "산물"이거나 "이로부터 유래하는 것"인 중쇄 또는 경쇄 가변부를 포함한다. 이러한 계는 인간의 면역 글로불린 유전자를 보유하는 트랜스게닉 마우스를 목적 항원으로 면역화시키는 것, 또는 파지 상에 나타난 인간 면역 글로불린 유전자 라이브러리를 목적 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 항체 즉, 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열의 "산물"이거나 또는 "이로부터 유래하는 것"인 인간 항체는, 인간 항체의 아미노산 서열과 인간 생식 계열 면역 글로불린의 아미노산 서열을 비교한 후, 인간 항체의 서열과 가장 가까운 서열을 가지는(즉, 상동성 %가 가장 큰) 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열을 선택함으로써 동정될 수 있다. 인간 항체 즉, 특정 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열의 "산물"이거나 또는 "이로부터 유래하는" 인간 항체는, 예를 들어, 천연 발생 체성 돌연 변이 또는 위치-배향 돌연 변이의 고의적 도입으로 인하여, 생식 계열 서열과 비교하였을 때 아미노산에 차이가 있을 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 통상적으로 인간 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 비교하였을 때 아미노산 서열에 있어서 90% 이상 상동성이고, 다른 종의 생식 계열 면역 글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 쥣과 동물 생식 계열 서열)과 비교하였을 때, 인간 항체가 인간의 것임을 확인시켜 주는 아미노산 잔기들을 함유한다. 임의의 경우에 있어서, 인간 항체는 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 비교하였을 때 95% 이상, 또는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 통상적으로, 특정 인간 생식 계열 서열로부터 유래하는 인간 항체는 인간 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산이 상이할 것이다. 임의의 경우에, 인간 항체는 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산이 상이할 수 있다.

상동성 항체

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변부를 포함하는데, 여기서 이 항체는 본 발명의 항-PSMA 항체의 바람직한 기능상의 특성을 보유한다.

예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변부 및 경쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서

(a) 중쇄 가변부는 서열 번호 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;

(b) 경쇄 가변부는 서열 번호 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하며;

(c) 이 항체는 PSMA-발현 LNCaP 세포주와 특이적으로 결합한다.

다른 구체예에서, V_H 및/또는 V_L 아미노산 서열은 상기 제시한 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 상기 제시한 서열들의 V_H 및 V_L 부위와의 상동성이 큰(즉, 80% 이상인) V_H 및 V_L 부위를 가지는 항체는, 서열 번호 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40에 해당하는 핵산 분자들에 대해 돌연 변이 유발법(예를 들어, 위치-배향 또는 PCR-매개 돌연 변이 유발법)을 수행한 후, 본원에 개시된 기능 검정법을 이용하여 보유 기능(즉, 인간 PSMA와 K_D 5×10^-8 M 이하로 결합하는 능력)에 대해 암호화된 변형 항체를 시험함으로써 얻어질 수 있다.

본원에 있어서, 2개의 아미노산 서열간 상동성%는 2개의 서열 간 상동성%와 같다. 2개의 서열 간 상동성%는 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수(즉, 상동성% = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 × 100)로서, 2개 서열의 최적 정렬시 도입되어야 하는 갭의 갯 수와 각 갭의 길이를 고려한 것이다. 서열 간 비교와 2개 서열 간 상동성%의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 이루어질 수 있다(이하 비 제한적인 실시예에 기술됨).

2개의 아미노산 서열 간 상동성%는 ALIGN 프로그램(2.0 버전)에 활용되는 이.메이어(E.Meyer) 및 더블유.밀러(W.Miller)의 알고리즘(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 통하여 측정될 수 있는데, 여기서는 PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 패널티(12) 및 갭 패널티(4)를 이용한다. 뿐만 아니라, 2개 아미노산 서열 간 상동성%는 니들만(Needleman) 및 운치(Wunsch)(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 이용하여 측정될 수 있는데, 이 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 입수 가능)의 GAP 프로그램에 활용되며, 또한 이는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 이용하고, 갭 가중치는 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4이며, 길이 가중치는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.

부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 또한 예를 들어, 관련 서열들을 동정하기 위해 공중이 이용 가능한 데이터베이스에 대해 검색하기 위한 "의문 서열(query sequence)"로서 사용될 수도 있다. 이러한 검색은 XBLAST 프로그램(2.0 버전)을 통하여 이루어질 수 있다[Altschul외 다수(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 문자 길이 = 3)을 통하여 행하여지며, 그 결과 본 발명의 항체 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교를 위하여 갭 형성 정렬을 얻기 위해서는, 갭이 형성된 BLAST를 사용할 수 있다[Altschul외 다수(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]. BLAST 및 갭 형성 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개 변수를 사용할 수 있다. 홈페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 참조하시오.

보존적 변형이 일어난 항체

임의의 구체예에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변부와 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는데, 여기서 상기 CDR 서열들 중 하나 이상은 본원에 개시된 바람직한 항체(예를 들어, 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6)을 바탕으로 하는 특정 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형체를 포함하는데, 여기서 이 항체는 본 발명의 항-PSMA 항체의 바람직한 기능상의 특성을 보유한다. 그러므로, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변부와 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서

(a) 중쇄 가변부 CDR3 서열은 서열 번호 17, 18, 19 및 20의 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 이의 보존적 변형체를 포함하고;

(b) 경쇄 가변부 CDR3 서열은 서열 번호 29, 30, 31 및 32의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 이의 보존적 변형체를 포함하며;

(c) 이 항체는 PSMA-발현 LNCaP 세포주에 특이적으로 결합한다.

바람직한 구체예에서, 중쇄 가변부 CDR2 서열은 서열 번호 13, 14, 15 및 16의 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 이의 보존적 변형체를 포함하고; 경쇄 가변부 CDR2 서열은 서열 번호 25, 26, 27 및 28의 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 이의 보존적 변형체를 포함한다. 기타 바람직한 구체예에서, 중쇄 가변부 CDR1 서열은 서열 번호 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 이의 보존적 변형체를 포함하고; 경쇄 가변부 CDR1 서열은 서열 번호 21, 22, 23 및 24 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 이의 보존적 변형체를 포함한다.

본원에 사용된 "보존적 서열 변형(conservative sequence modification)"이란 용어는, 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 이를 변형시키지 않는 아미노산의 변형을 의미하는 것이다. 이러한 보존적 변형으로서는 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당 업계에 공지된 표준적 기술 예를 들어, 위치-배향 돌연 변이 유발법 및 PCR-매개 돌연 변이 유발법에 의하여 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 치환되는 경우이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기 군은 당 업계에 규명되어 있다. 이러한 군으로서는, 염기성 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 및 트립토판), 비극성 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌 및 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린 및 이소루신) 그리고 방향성 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)이 있다. 그러므로, 본 발명의 항체의 CDR 부위 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 아미노산 군에 속하는 다른 아미노산 잔기와 치환될 수 있으며, 변형된 항체는 본원에 기술된 기능 검정법을 통하여 보유하고 있는 기능(즉, (c)에 제시된 기능)에 대해 시험될 수 있다.

본 발명의 항- PSMA 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체

다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 PSMA 모노클로날 항체 중 임의의 것과 동일한, 인간 PSMA상 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다[즉, 본 발명의 모노클로날 항체 중 임의의 항체와 PSMA 결합에 대해 상호 경쟁하는 성질을 가지는 항체]. 바람직한 구체예에서, 상호 경쟁 연구(cross-competition study)에 대한 참고 항체(reference antibody)는, 모노클로날 항체 1C3(서열 번호 1 및 5에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 가지는 항체), 또는 모노클로날 항체 2A10(서열 번호 2 및 6에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 가지는 항체), 또는 모노클로날 항체 2F5(서열 번호 3 및 7에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 가지는 항체), 또는 모노클로날 항체 2C6(서열 번호 4 및 8에 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 가지는 항체)일 수 있다. 이러한 상호 경쟁 항체(cross-competing antibody)는 표준 PSMA 결합 검정법에서 이 항체가 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6와 상호 경쟁하는 능력을 바탕으로 하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 바이어코어 분석법, ELISA 검정법 또는 유동성 혈구 계측법은 본 발명의 항체와의 상호 경쟁 능력을 입증하는데에 사용될 수 있다. 시험 항체가 예를 들어, 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6와 인간 PSMA의 결합을 억제하는 능력을 통하여, 이 시험 항체는 인간 PSMA와의 결합에 대해 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6와 경쟁할 수 있으므로, 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6와 동일한, 인간 PSMA 상의 에피토프와 결합함을 알 수 있다. 바람직한 구체예에서, 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6와 동일한, 인간 PSMA 상의 에피토프와 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 실시예에 기술된 바와 같이 제조 및 분리될 수 있다.

조작 및 변형된 항체

본 발명의 항체는 또한 출발 물질로서 본원에 기술된 V_H 및/또는 V_L 서열 중 하나 이상을 가지는 항체를 이용하여 제조되어 변형 항체를 조작할 수 있는데, 여기서 변형된 항체는 출발 항체와는 다른 성질을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 2개의 가변부(즉, V_H 및/또는 V_L) 예를 들어, 하나 이상의 CDR 부위 및/또는 하나 이상의 틀 부위 내에 존재하는 하나 이상의 잔기들을 변형함으로써 조작될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는 불변부(들) 내에 존재하는 잔기들을 변형시켜 조작함으로써 예를 들어, 항체의 효과기 기능(들)을 변형시킬 수 있다.

수행될 수 있는 가변부 조작의 한 종류로서는 CDR 이식(CDR grafting)이 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 부위(CDR) 내에 존재하는 아미노산 잔기들을 통하여 표적 항원과 상호 작용한다. 이러한 이유로, CDR 내에 존재하는 아미노산 서열은 각각의 항체 간에 있어서 CDR 외부 서열보다 더욱 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호 작용에 관여하므로, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터 유래하는 틀 서열에 특정한 천연 생성 항체로부터 유래하는 CDR 서열을 이식시킨 발현 벡터를 구성함으로써 특정한 천연 생성 항체의 특성을 모의하는 제조합 항체를 발현시킬 수 있다[예를 들어, Riechmann, L.외 다수(1998) Nature 332:323-327; Jones, P.외 다수(1986) Nature 321:522-525; Queen, C.외 다수(1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 제 5,225,539호(Winter), 및 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호(Queen외 다수)].

그러므로, 본 발명의 다른 구체예는 각각 서열 번호 9, 10, 11 및 12, 서열 번호 13, 14, 15 및 16, 그리고 서열 번호 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변부와, 서열 번호 21, 22, 23 및 24, 서열 번호 25, 26, 27 및 28, 그리고 서열 번호 29, 30, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 그러므로, 이러한 항체는 모노클로날 항체 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6의 V_H 및 V_L CDR 서열을 함유하고, 또한 이 항체와 상이한 틀 서열을 함유할 수도 있다.

이러한 틀 서열은 생식 계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공표된 참고 문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변부 유전자에 대한 생식 계열 DNA 서열에 관하여는 "VBase" 인간 생식 계열 서열 데이터베이스(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase) 및 문헌[Kabat, E. A.,외 다수(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M.,외 다수(1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798: 및 Cox, J. P. L.외 다수(1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; 상기 각 문헌의 내용은 본원에 참고용으로 인용되어 있음]에서 살펴볼 수 있다.

본 발명의 항체에 사용하기에 바람직한 틀 서열은 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용된 틀 서열 예를 들어, 본 발명의 바람직한 모노클로날 항체에 의해 사용된 V_H 3-30.3 틀 서열(서열 번호 41) 및/또는 V_H 5-51 틀 서열(서열 번호 42) 및/또는 Vκ L18 틀 서열(서열 번호 43) 및/또는 Vκ L6 틀 서열(서열 번호 44)과 구조적으로 유사한 것이다. V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 Vκ CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 틀 서열이 유래된 생식 계열 면역 글로불린 유전자에서 살펴볼 수 있는 서열과 동일한 서열을 가지는 틀 부위에 이식될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 생식 계열 서열에 비하여 하나 이상의 돌연 변이를 함유하는 틀 부위에 이식될 수 있다. 예를 들어, 임의의 경우 틀 부위 내에 존재하는 잔기들을 돌연 변이시켜 항체의 항원 결합 능을 유지 또는 강화하는 것이 유리함을 알 수 있다[예를 들어, 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호(Queen외 다수)].

다른 유형의 가변부 변형은 V_H 및/또는 Vκ CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부위 내에 존재하는 아미노산 잔기들을 돌연 변이시켜 목적 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화성)을 개선시키는 것이다. 위치-배향 돌연 변이 유발법 또는 PCR-매개 돌연 변이 유발법은 돌연 변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체의 결합 능 또는 기타 목적으로 하는 기능상의 특성은 본원에 기술되어 있으며 실시예에 제공된 시험관 내 또는 생체 내 검정법을 통하여 평가될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형(전술함)이 도입된다. 돌연 변이로서는 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 있을 수 있으나, 치환이 바람직하다. 뿐만 아니라, 통상적으로 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기들(CDR 부위 내에 존재하는 잔기들)은 변형된다.

그러므로, 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 9, 10, 11 및 12에 비하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR1 부위; (b) 서열 번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 13, 14, 15 및 16에 비하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR2 부위; (c) 서열 번호 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 17, 18, 19 및 20에 비하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR3 부위; (d) 서열 번호 21, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 21, 22, 23 및 24에 비하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 Vκ CDR1 부위; (e) 서열 번호 25, 26, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 25, 26, 27 및 28에 비하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 Vκ CDR2 부위; 및 (f) 서열 번호 29, 30, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 29, 30, 31 및 32에 비하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 Vκ CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변부를 포함하는, 분리된 항-PSMA 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.

조작된 본 발명의 항체는 V_H 및/또는 Vκ 내에 존재하는 틀 잔기에 변형이 가하여져 항체의 특성을 개선시킨 항체를 포함한다. 통상적으로 이러한 틀 변형은 항체의 면역원성을 줄이기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 가지 방법은 하나 이상의 틀 잔기를 상응하는 생식 계열 서열로 "역 돌연변이(backmutate)"시키는 것이다. 더욱 구체적으로, 체성 돌연 변이가 진행된 항체는 항체가 유래된 생식 계열 서열과 상이한 틀 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기들은 항체 틀 서열을 항체가 유래된 생식 계열 서열과 비교함으로써 동정할 수 있다. 이와 같이 "역 돌연 변이된" 항체도 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 2C6의 경우, V_H의 9번 아미노산 잔기(FR1 내)는 세린이지만, V_H 5-51 생식 계열 서열에 존재하는 상응 잔기는 알라닌이다. 틀 부위 서열을 이의 생식 계열 형태로 되돌리기 위해서, 체성 돌연 변이는 예를 들어, 위치-배향 돌연 변이 유발법 또는 PCR-매개 돌연 변이 유발법에 의해 생식 계열 서열로 "역 돌연 변이"시킬 수 있다[예를 들어, 2C6의 V_H의 FR1 내 9번 잔기는 세린에서 알라닌으로 "역 돌연변이"될 수 있다].

다른 예로서, 2F5의 경우 V_H의 84번 아미노산 잔기(FR3 내)는 아스파라긴이지만, V_H 5-51 생식 계열 서열에 존재하는 상응 잔기는 세린이다. 틀 부위 서열을 이의 생식 계열 형태로 되돌리기 위해서, 예를 들어, 2F5의 V_H의 FR3 내 18번 잔기는 아스파라긴에서 세린으로 "역 돌연 변이"될 수 있다.

다른 유형의 틀 변형은 틀 부위 내에 존재하는 하나 이상의 잔기 또는 하나 이상의 CDR 부위 내에 존재하는 하나 이상의 잔기를 돌연 변이시켜, T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 줄이는 과정을 포함한다. 이러한 방법을 "면역 제거(deimmunization)"라고도 부르며, 이에 관하여는 미국 특허 공보 20030153043(Carr외 다수)에 더욱 자세히 기술되어 있다.

틀 또는 CDR 부위 내에 발생하는 변형에 부가하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 Fc 부위 내에 변형을 포함하도록, 통상적으로는 항체의 하나 이상의 기능상 특성 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 특성 및/또는 항원-의존성 세포 내 세포 독성을 변화시키도록 조작될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 하나 이상의 화학부가 항체에 결합될 수 있거나) 또는 항체의 글리코실화를 변화시키도록 변형될 수 있으며, 또한 항체의 하나 이상의 기능상 특성들도 변화할 수 있다. 이러한 구체예 각각에 관하여는 이하 보다 상세히 기술되어 있다. Fc 부위 내 잔기의 번호 메김 방식은 Kabat의 EU 인덱스 방식에 따른다.

하나의 구체예에서, C_H1의 힌지 부는 변형되어 힌지 부 내에 존재하는 시스테인 잔기의 수는 변화(예를 들어, 증가 또는 감소)된다. 이에 관하여는 미국 특허 제5,677,425호(Bodmer외 다수)에 더 상세히 기술되어 있다. C_H1의 힌지 부 내에 존재하는 시스테인 잔기 수는 예를 들어, 경쇄 또는 중쇄의 조립을 촉진하거나, 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변화된다.

다른 구체예에서, 항체의 Fc 힌지 부는 돌연 변이되어 항체의 생물학적 반감기를 감소시킬 수 있다. 구체적으로 말하면, 하나 이상의 아미노산 돌연 변이가 Fc-힌지 단편의 C_H2-C_H3 도메인 계면부에 도입되면, 항체는 원래의 Fc-힌지 도메인 SpA 결합 특성에 비하여 스타필로코실 단백질 A(SpA) 결합 특성에 손상을 입게 된다. 이에 관하여는 미국 특허 제6,165,745호(Ward외 다수)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

다른 구체예에서, 항체는 변형되어 이의 생물학적 반감기가 증가할 수 있다. 이에는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 돌연 변이체 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F(미국 특허 제6,277,375호, Ward외 다수). 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서, 항체의 C_H1 또는 C_L 부위 내에 변형이 일어나 IgG의 Fc 부위의 C_H2 도메인의 2개의 루프로부터 유래하는 구원 수용체 결합 에피토프(salvage receptor binding epitope)를 함유할 수 있게 된다[미국 특허 제5,869,046호 및 동 제6,121,022호, Presta외 다수].

또 다른 구체예에서, Fc 부위는 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기와 치환하여 항체의 효과기 기능(들)을 변화시킴으로써 변질된다. 예를 들어, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322번 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 상이한 아미노산 잔기와 치환되어, 효과기 리간드에 대한 친화성은 변화되되 모 항체의 항원 결합 능은 보유하는 항체가 생산될 수 있다. 친화성이 변화된 효과기 리간드는 예를 들어, 보체의 C1 성분 또는 Fc 수용체일 수 있다. 이에 관하여는 미국 특허 제5,624,821호 및 동 제5,648,260호(둘 다 Winter외 다수에 의함)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

다른 예에 있어서, 329, 331 및 322번 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 상이한 아미노산 잔기로 치환되어, C1q 결합 특성이 변화되었고/되었거나 보체 의존성 세포 독성(CDC)이 감소 또는 소멸된 항체가 생산될 수 있다. 이에 관하여는 미국 특허 제6,194,551호(Idusogie외 다수)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

다른 예에 있어서, 231 및 239번 아미노산 위치 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형되면, 보체를 고정시킬 수 있는 항체의 능력은 변화할 수 있다. 이에 관하여는 PCT 공보 WO 94/29351(Bodmer외 다수)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

또 다른 예에 있어서, Fc 부위는 항체가 항체 의존성 세포 내 세포 독성(ADCC)을 매개하는 능력을 증강하고/증강하거나 다음과 같은 위치 즉, 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 번 위치의 아미노산 중 하나 이상을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증강시키도록 변형될 수 있다. 이에 관하여는 PCT 공보 WO 00/42072(Presta)에 더욱 상세히 기술되어 있다. 뿐만 아니라, 인간 IgG1 상에 존재하는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 위치는 이미 맵핑되어 있으며, 결합 특성이 개선된 변이체에 관하여는 문헌[Shields, R.L.외 다수(2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604]에 기술되어 있다. 256, 290, 298, 333, 334 및 339 번 위치에서 발생한 특이적 돌연 변이는 FcγRIII에 대한 결합 특성을 개선시키는 것으로 파악된다. 뿐만 아니라, 다음과 같은 조합 돌연 변이체는 FcγRIII 결합 특성을 개선시키는 것으로 파악된다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.

또 다른 구체예에서, 항체의 글리코실화에 변화가 발생한다. 예를 들어, 글리코실화되지 않은 항체(즉, 글리코실화가 일어나지 않는 항체)가 생산될 수 있다. 글리코실화는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성이 증가하도록 변화할 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내에서 글리코실화에 관여하는 위치들 중 하나 이상의 위치를 변형시킴으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변부 틀 글리코실화 위치를 제거하여 이 위치에서 글리코실화가 일어나지 않도록 만드는 하나 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이와 같은 비-글리코실화(aglycosylation)는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이에 관하여는 미국 특허 제5,714,350호 및 동 제6,350,861호(Co외 다수)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

부가적으로 또는 대안적으로, 글리코실화 유형이 변형된 항체 예를 들어, 하이포푸코실화 항체(푸코실 잔기 수가 감소한 항체) 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가한 항체가 생산될 수 있다. 이와 같이 변형된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증강시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 변형된 글리코실화 기구를 가지는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 이루어질 수 있다. 변형된 글리코실화 기구를 가지는 세포는 당 업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜, 변형된 형태의 글리코실화가 일어난 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8(알파(1,6)푸코실트랜스퍼라제)가 결여되어 있어서, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체들은 이 항체의 탄수화물에 푸코스가 존재하지 않는다. 상기 Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8^-/- 세포주는 2개의 치환 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포 내 FUT8 유전자를 표적 파괴하여 생산되었다[미국 특허 공보 20040110704(Yamane외 다수) 및 Yamane-Ohnuki외 다수(2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22]. 다른 예로서, EP 1,176,195(Hanai외 다수)에는, FUT8 유전자가 기능상 파괴된 세포주에 관하여 기술되어 있는데, 여기서 이 유전자는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하므로 이러한 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거하여 하이포푸코실화된다. Hanai외 다수에 의한 문헌에는 항체의 Fc 부위에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 효소 활성이 낮은 세포주, 또는 효소 활성을 갖지 않는 세포주 예를 들어, 래트 골수종 세포주인 YB2/0(ATCC CRL 1662)에 관하여 기술되어 있다. PCT 공보 WO 03/035835(Presta)에는, 변이 CHO 세포주, Lec13 세포[푸코스를 Asn(297)-결합 탄수화물에 결합시키는 능력이 감소되었으며, 또한 이 숙주 세포 내 발현된 항체를 하이포푸코실화시키는 세포]에 관하여 기술되어 있다[Shields, R.L.외 다수(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740]. PCT 공보 WO 99/54342(Umana외 다수)에는, 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 세포 주를 조작하여, 이 조작된 세포주 내에서 발현된 항체의 이분화 GlcNAc 구조가 증가하도록 만들고, 결국에는 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것에 관하여 기술되어 있다[Umana외 다수(1999) Nat. Biotech. 17:176-180]. 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 제거할 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다[Tarentino, A.L.외 다수(1975) Biochem. 14:5516-23].

본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 다른 변형으로서는 페그화(pegylation)가 있다. 항체는 페그화되어, 예를 들어, 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체를 페그화하기 위해, 항체 또는 이의 단편을, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 결합하는 조건 하에서, 통상적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 예를 들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게, 페그화는 반응성 PEG 분자(또는 유사 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 이루어진다. 본원에 사용된 "폴리에틸렌 글리콜"이란 용어는, 기타 단백질을 유도체화하는데에 사용되는 임의의 형태를 갖는 PEG 예를 들어, 모노(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 의미이다. 임의의 구체예에서, 페그화된 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 단백질을 페그화하는 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316(Nishimura외 다수) 및 EP 0 401 384(Ishikawa외 다수)를 참조하시오.

항체 조작 방법

전술한 바와 같이, 본원에 개시된 V_H 및 Vκ 서열을 가지는 항-PSMA 항체는, V_H 및/또는 Vκ 서열을 변형시킴으로써 새로운 항-PSMA 항체 또는 이에 결합되어 있는 불변부(들)를 생산하는데에 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 항-PSMA 항체 예를 들어, 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6의 구조적 특징은 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능상의 특성 예를 들어, 인간 PSMA와의 결합 특성을 보유하는, 구조적으로 관련된 항-PSMA 항체를 생산하는데에 사용된다. 예를 들어, 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6의 하나 이상의 CDR 부위, 또는 이의 돌연 변이체는 공지의 틀 부위 및/또는 기타 CDR과 재조합적으로 화합하여, 전술한 바와 같이, 부가적이고 재조합적으로 조작된 본 발명의 항-PSMA 항체를 생산할 수 있다. 기타 유형의 변형으로서는 전 섹션에 기술된 것들을 포함한다. 조작 방법에 있어서 출발 물질은 본원에 제공된 V_H 및/또는 Vκ 서열 중 하나 이상이거나, 또는 이의 하나 이상의 CDR 부위이다. 조작된 항체를 생산하기 위해서, 본원에 제공된 V_H 및/또는 Vκ 서열 중 하나 이상을 가지는 항체, 또는 이의 하나 이상의 CDR 부위를 가지는 항체를 실질적으로 만들 필요는 없다(즉, 단백질로서 발현시킬 필요는 없다). 오히려, 서열(들) 내에 포함된 정보가 근본 서열(들)로부터 유래하는 "2 세대" 서열(들)을 생산하는 출발 물질로서 사용되어, 이러한 "2 세대" 서열(들)은 단백질로서 제조 및 발현된다.

그러므로, 다른 구체예에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 항-PSMA 항체를 제조하는 방법을 제공한다:

(a) (i) 서열 번호 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열; 서열 번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열; 및/또는 서열 번호 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변부 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 번호 21, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열; 서열 번호 25, 26, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열; 및/또는 서열 번호 29, 30, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변부 항체 서열을 제공하는 단계;

(b) 중쇄 가변부 항체 서열 및/또는 경쇄 가변부 항체 서열 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 하나 이상의 변형된 항체 서열을 제조하는 단계; 및

(c) 상기 변형된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계.

표준적인 분자 생물학적 기술은 변형된 항체 서열을 제조 및 발현시키는데에 사용될 수 있다.

바람직하게, 변형된 항체 서열(들)에 의해 암호화되는 항체는 본원에 기술된 항-PSMA 항체의 기능상의 특성 중 하나, 일부 또는 전부를 보유하는 항체로서, 여기서 이 기능상 특성으로서는 PSMA-발현 LNCaP 세포주에 특이적으로 결합하는 특성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

변형된 항체의 기능상 특성은 당 업계에 널리 공지되어 있고/있거나 본원에 기술된 표준적인 검정법 예를 들어, 실시예에 제시된 방법(예를 들어, 유동성 혈구 계측법, 결합 검정법)을 이용하여 평가될 수 있다.

본 발명의 항체를 조작하는 방법에 관한 임의의 구체예에서, 돌연 변이는 항-PSMA 항체 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라서 랜덤하게 또는 선택적으로 도입될 수 있으며, 결과로 변형된 항-PSMA 항체는 본원에 기술된 바와 같이 결합 활성 및/또는 기타 기능상 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연 변이 방법은 당 업계에 기술된 바 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 02/092780(Short)에는, 포화 돌연 변이 유발법(saturation mutagenesis), 합성 결찰 조립법 또는 이들의 조합법을 이용하여 항체를 돌연 변이시키고 이 돌연 변이를 스크리닝하는 방법에 관하여 기술되어 있다. 대안적으로, PCT 공보 WO 03/074679(Lazar외 다수)에는, 항체의 생리 화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 이용하는 방법에 관하여 기술되어 있다.

본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이 핵산은 전 세포(whole cell), 세포 용해물 중에 존재할 수 있거나 또는 부분적으로 정제 또는 실질적으로 순수한 형태일 수 있다. 핵산은 기타 세포 성분 또는 기타 오염물 예를 들어, 기타 세포성 핵산 또는 단백질로부터 표준적인 기술 예를 들어, 알칼리 처리/SDS 처리, CsCl 밴딩(CsCl banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로즈 겔 전기 영동 및 기타 당 업계에 널리 공지된 기술에 의해 정제하여 "분리된" 또는 "실질적으로 순수하게 제조된" 핵산이다. 예를 들어, 문헌[F. Ausubel외 다수 편(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조하시오. 본 발명의 핵산은 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 함유하고 있을 수도 있거나 또는 함유하지 않을 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.

본 발명의 핵산은 표준적인 분자 생물학 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 이하 더욱 상세히 기술된 바와 같이 인간 면역 글로불린 유전자를 보유하는 트랜스게닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의하여 발현된 항체에 있어서, 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 표준적 PCR 증폭법 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻어질 수 있다. 면역 글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻어진(예를 들어, 파지 디스플레이 기술 이용) 항체에 있어서, 이 항체를 암호화하는 핵산은 상기 라이브러리로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 바람직한 핵산 분자는 1C3, 2A10, 2F5 또는 2C6 모노클로날 항체의 V_H 및 V_L 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 V_H 서열을 암호화하는 DNA 서열을 각각 서열 번호 33, 34, 35 및 36에 나타내었다. 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6의 V_L 서열을 암호화하는 DNA 서열을 각각 서열 번호 37, 38, 39 및 40에 나타내었다.

일단 V_H 및 V_L 절편을 암호화하는 DNA 단편을 얻으면, 이 DNA 단편은 표준적인 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작되어, 예를 들어, 가변부 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이와 같은 조작 과정에서, V_L- 또는 V_H-암호화 DNA 단편은 다른 단백질을 암호화하는 DNA 단편 예를 들어, 항체 불변부 또는 가요성 링커에 작동 가능하도록 결합된다. 본 명세서에 사용된 "작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 2개의 DNA 단편들이 서로 결합하여, 이 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame) 상태로 잔류하게 되는 경우를 의미한다.

V_H-암호화 DNA를 중쇄 불변부(C_H1, C_H2 및 C_H3)를 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하도록 결합시킴으로써, V_H 부위를 암호화하는 분리된 DNA를 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간의 중쇄 불변부 유전자 서열은 당 업계에 공지되어 있으며[예를 들어, Kabat, E.A.외 다수(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242], 이러한 부위들을 포함하는 DNA 단편은 표준적인 PCR 증폭법에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변부는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변부일 수 있으나, IgG1 또는 IgG4 불변부가 가장 바람직하다. Fab 단편 중쇄 유전자에 있어서, V_H-암호화 DNA는 중쇄 C_H1 불변부만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하도록 결합될 수 있다.

V_L 부위를 암호화하는 분리된 DNA는, V_L-암호화 DNA를 경쇄 불변부인 C_L을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하도록 결합되어, 전장 경쇄 유전자(그리고 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변부 유전자 서열은 당 업계에 공지되어 있으며[예를 들어, Kabat, E. A.,외 다수(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이 부위들을 포함하는 DNA 단편은 표준적인 PCR 증폭법에 의하여 얻을 수 있다. 경쇄 불변부는 카파 또는 람다 불변부일 수 있지만, 카파 불변부가 가장 바람직하다.

scFv 유전자를 생산하기 위해서, V_H- 및 V_L-암호화 DNA 단편은 가요성 링커 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly₄-Ser)₃(서열 번호 48)을 암호화하는 다른 단편에 작동 가능하도록 결합되어, V_H 및 V_L 서열이 연속적인 단일 사슬 단백질(V_L 및 V_H 부위가 가요성 링커에 의해 결합되어 있는 단백질)로서 발현될 수 있다[예를 들어, Bird외 다수(1988) Science 242:423-426; Huston외 다수(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty외 다수(1990) Nature 348:552-554].

본 발명의 모노클로날 항체의 생산

본 발명의 모노클로날 항체(mAb)는 다양한 기술 예를 들어, 종래의 모노클로날 항체를 이용하는 방법 예를 들어, 표준적인 체성 세포 혼성화 기술[Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]에 의해 생산될 수 있다. 체성 세포 혼성화 방법이 바람직하다고는 하지만, 원칙적으로 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술 예를 들어, B 림프구의 바이러스 형질 전환 기술 또는 발암 형질 전환 기술도 사용할 수 있다.

하이브리도마를 생산하는데에 바람직한 동물계로서는 쥣과 동물계가 있다. 마우스에서 하이브리도마를 생산하는 방법은 널리 공지된 방법이다. 융합용으로 면역화된 비장 세포의 분리를 위한 면역화 방법 및 기술은 당 업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예를 들어, 쥣과 동물의 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화된 항체는 전술한 바와 같이 제조된 쥣과 동물의 모노클로날 항체의 서열을 바탕으로 하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린을 암호화하는 DNA는 목적으로 하는 쥣과 동물의 하이브리도마로부터 얻을 수 있으며, 또한 표준적인 분자 생물학적 기술을 이용하여 쥣과 동물 이외의 동물(예를 들어, 인간)의 면역 글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생산하기 위해서, 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 쥣과 동물의 가변부를 인간의 불변부에 결합시킬 수 있다[예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호, Cabilly외 다수]. 인간화된 항체를 생산하기 위해, 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 쥣과 동물의 CDR 부위들을 인간의 틀에 삽입할 수 있다[예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호(Winter) 및 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호(Queen et al) 참조].

바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간의 모노클로날 항체이다. PSMA에 대해 유도된 인간의 모노클로날 항체는 마우스계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스게닉 마우스 또는 트랜스 염색체 함유 마우스를 이용하여 생산될 수 있다. 이러한 트랜스게닉 및 트랜스 염색체 함유 마우스로서는 HuMAb 마우스 및 KM 마우스™라 불리는 마우스를 포함하며, 이들을 총칭하여 본원에서는 "인간 Ig 마우스"라 부른다.

HuMAb 마우스®(Medarex, Inc.)는 정렬되지 않은 인간의 중쇄(μ 및 γ)와 κ 경쇄 면역 글로불린 서열을 암호화하는 인간의 면역 글로불린 유전자 소 위치(miniloci)와, 내인성 μ 및 κ 사슬 위치를 불활성화하는 표적화 돌연 변이를 함유한다[예를 들어, Lonberg,외 다수(1994) Nature 368(6474): 856-859 참조]. 그러므로, 이 마우스는 마우스 IgM 또는 κ를 조금 발현시키고, 면역화됨에 따라서, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스 유전자는 클래스 스위칭(class switching) 및 체성 돌연 변이를 일으켜 고 친화성 인간 IgGκ 모노클로날 항체를 생산한다[Lonberg, N.외 다수(1994), 상동; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 참조; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]. HuMab 마우스의 제조 및 사용 방법과 이 마우스에 의해 수행되는 게놈 변형에 관하여는 문헌[Taylor, L.외 다수(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J.외 다수(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon외 다수(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi외 다수(1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J.외 다수(1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon외 다수(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L.외 다수(1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D.외 다수(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 이 문헌에 기술된 내용은 모두 그 자체로서 참고용으로 인용됨]에 더욱 상세히 기술되어 있다. 뿐만 아니라, 미국 특허 제5,545,806호; 동 제5,569,825호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,789,650호; 동 제5,877,397호; 동 제5,661,016호; 동 제5,814,318호; 동 제5,874,299호; 및 동 제5,770,429호(상기 특허 모두 Lonberg 및 Kay에 의함); 미국 특허 제5,545,807호(Surani외 다수); PCT 공보 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962(상기 PCT 출원 모두 Lonberg 및 Kay에 의함); 및 PCT 공보 WO 01/14424(Korman외 다수)를 참조하시오.

다른 구체예에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스 유전자 및 트랜스 염색체 상에 인간의 면역 글로불린 서열을 보유하는 마우스 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스 유전자 및 인간 경쇄 트랜스 염색체를 보유하는 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 마우스(본원에서는 "KM 마우스™"라 칭함)에 관하여는 PCT 공보 WO 02/43478(Ishida외 다수)에 상세히 기술되어 있다.

뿐만 아니라, 인간 면역 글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스게닉 동물계도 당 업계에서 입수할 수 있으며, 이를 본 발명의 항-PSMA 항체를 생성하는데에 사용할 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse; Abgenix, Inc.)라 불리는 대안적 트랜스게닉계가 사용될 수 있으며; 이 마우스에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 제5,939,598호; 동 제6,075,181호; 동 제6,114,598호; 동 제6,150,584호 및 동 제6,162,963호(Kucherlapati외 다수)에 기술되어 있다.

또한, 인간 면역 글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스 염색체 동물계도 당 업계에서 입수할 수 있으며, 이를 본 발명의 항-PSMA 항체를 생성하는데에 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스 염색체와 인간 경쇄 트랜스 염색체 둘 다를 보유하는 마우스("TC 마우스")가 사용될 수 있으며; 이 마우스에 관하여는 문헌[Tomizuka외 다수(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기술되어 있다. 더욱이, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스 염색체를 보유하는 소에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며(Kuroiwa외 다수(2002) Nature Biotechnology 20:889-894), 이 또한 본 발명의 항-PSMA 항체를 생성하는데에 사용될 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 면역 글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 이와 같이, 인간 항체를 분리하기 위한 파지 디스플레이 방법은 당 업계에 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제5,223,409호; 동 제5,403,484호; 및 동 제5,571,698호(Ladner외 다수); 미국 특허 제5,427,908호 및 동 제5,580,717호(Dower외 다수); 미국 특허 제5,969,108호 및 동 제6,172,197호(McCafferty외 다수); 및 미국 특허 제5,885,793호; 동 제6,521,404호; 동 제6,544,731호; 동 제6,555,313호; 동 제6,582,915호 및 동 제6,593,081호(Griffiths외 다수)]을 참조하시오.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 SCID 마우스(인간 면역 세포가 재구성되어, 면역화함에 따라서 인간 항체 반응이 일어날 수 있는 마우스)를 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 마우스에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 제5,476,996호 및 동 제5,698,767호(Wilson외 다수)에 기술되어 있다.

인간 Ig 마우스의 면역화

인간 Ig 마우스가 본 발명의 인간 항체를 생성하는데에 사용될 때, 그러한 마우스는 PSMA-발현 세포주 예를 들어, LNCaP 세포주(ATCC CRL-1740), 정제 또는 농축 PSMA 항원 및/또는 재조합 PSMA 또는 PSMA 융합 단백질 제제로 면역화될 수 있다[Lonberg, N.외 다수(1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.외 다수(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 및 PCT 공보 WO 98/24884 및 WO 01/14424]. 마우스는 처음 주입시 6∼16주령인 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, PSMA 항원의 정제된 제제 또는 재조합 제제(5∼50 ㎍)는 인간 Ig 마우스를 복강 내에서 면역화하는데에 사용될 수 있다.

PSMA에 대한 완전히 인간의 것인 모노클로날 항체를 생산하는 방법에 관하여는 이하 실시예 1에 더욱 상세히 기술되어 있다. 다양한 항원에 의해 누적된 경험을 통하여, 처음에 완전 프룬트 애쥬반트 중 항원으로 복강내(IP) 면역화된 후, 2주에 한 번씩 불완전 프룬트 애쥬반트 중 항원으로 IP 면역화(총 6회 이하)하였을 때, 트랜스게닉 마우스는 반응을 나타냄을 알 수 있다. 그러나, 프룬트 애쥬반트 이외의 애쥬반트도 효과적인 것으로 파악된다. 더욱이, 애쥬반트 부재 하에서의 전 세포는 면역원성이 큰 것으로 파악된다. 면역 반응은 후 안와 채혈(retroorbital bleed)로 얻은 혈장 시료를 사용하여 면역화함에 따라서 관찰될 수 있다. 상기 혈장은 ELISA(이하 기술됨)에 의해 스크리닝될 수 있으며, 항-PSMA 인간 면역 글로불린 역가가 충분한 마우스는 융합에 사용될 수 있다. 마우스를 안락사시켜 비장을 제거하기 3일 전, 마우스에 항원을 정맥 투여하여 면역 증강(boosting)시킨다. 각 면역화 당 2∼3회의 융합이 이루어질 필요가 있다. 6∼24 마리의 마우스는 통상적으로 각각의 항원에 대해 면역화시킨다. 일반적으로, HCo7 및 HCo12 변종 모두가 사용된다. 뿐만 아니라, HCo7 및 HCo12의 트랜스 유전자 둘 다는 함께 한 마리의 마우스(2개의 상이한 인간 중쇄 트랜스유전자를 가지는 마우스(HCo7/HCo12))에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, KM 마우스™ 변종이 사용될 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조

본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 비장 세포 및/또는 림프 소절 세포를 분리하여 적당한 무한 증식 세포주 예를 들어, 마우스 골수종 세포주에 융합할 수 있다. 결과로 생성된 하이브리도마는 항원-특이적 항체를 생산하는지 여부에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 유래하는 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 1/6 P3X63-Ag8.653 비-분비형 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)에 50% PEG와 함께 융합될 수 있다. 세포를 편평 바닥 미세 역가 평판 중에 약 2 x 10⁵의 농도로 도말한 후, 20% 태아 클론 혈청(fetal Clone Serum), 18% "653" 컨디셔닝 배지(conditioned media), 5% 오리겐(IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캡토에탄올, 50 단위/㎖의 페니실린, 50 ㎎/㎖의 스트렙토마이신, 50 ㎎/㎖의 겐타마이신 및 1X HAT(Sigma; HAT는 융합 후 24시간 경과시 첨가함)를 함유하는 선별 배지 중에서 2주간 항온 처리한다. 약 2주 경과 후, 세포는 HAT를 HT로 교체한 배지 중에서 배양될 수 있다. 이후 각각의 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단, 하이브리도마가 과도 생장하면, 배지는 일반적으로 10∼14일 후에 관찰될 수 있다. 항체 분비 하이브리도마는 다시 도말하여 스크리닝될 수 있으며, 만일 인간 IgG에 대해 여전히 양성 반응을 보이면, 모노클로날 항체는 희석을 제한함으로써 2회 이상 서브 클로닝될 수 있다. 이후, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 소량의 항체를 조직 배양 배지 중에서 생성시켜 특성 규명할 수 있다.

인간 모노클로날 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마를 2 ℓ들이 스피너-플라스크(spinner-flask) 내에서 생육하여 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 상청액을 여과 및 농축한 후, 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 용리된 IgG는 겔 전기 영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 체크하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교체될 수 있으며, 농도는 1.43 소멸 계수를 이용하여 OD₂₈₀에서 측정될 수 있다. 모노클로날 항체는 분취하여 -80℃에 보관할 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 형질 감염체의 제조

본 발명의 항체도 예를 들어, 당 업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술과 유전자 형질 감염법을 조합하여 수행함으로써 숙주 세포 형질 감염체 중에서 생산될 수 있다[예를 들어, Morrison, S. (1985) Science 229:1202].

예를 들어, 항체 또는 이의 항체 단편을 발현시키기 위해서, 일부 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA는 표준적 분자 생물학 기술(예를 들어, 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭법)에 의해 얻어질 수 있으며, DNA는 발현 벡터에 삽입되어 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동 가능하도록 결합할 수 있게 된다. 본 명세서에서, "작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 항체 유전자가 벡터에 결찰되어 벡터 내에 존재하는 전사 및 번역 조절 서열이 이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 기능을 갖게 된다는 의미이다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 혼화 가능한 것으로 선택된다. 항체의 경쇄 유전자와 항체의 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있는데, 이들 두 유전자는 동일한 발현 벡터 내에 삽입되는 것이 더욱 통상적이다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상 상보성 제한 위치의 결찰, 또는 제한 위치가 존재하지 않는 경우에는 블런트 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내에 삽입된다. 본원에 개시된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변부는, 이 가변부를 목적으로 하는 동 기준 표본의 중쇄 불변부 및 경쇄 불변부를 이미 암호화하게 된 발현 벡터에 삽입하여, V_H 절편은 벡터 내 C_H 절편(들)에 작동 가능하도록 결합하게 만들고, Vκ 절편은 벡터 내 C_L 절편에 작동 가능하도록 결합하게 만듦으로써, 임의의 항체 동 기준 표본의 전장 항체 유전자를 제조하는데에 사용될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 제조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 벡터 내에 클로닝되어, 상기 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임 상태로 결합할 수 있도록 만든다. 신호 펩티드는 면역 글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역 글로불린 단백질로부터 유래하는 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. "조절 서열"이란 용어는, 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 이러한 조절 서열에 관하여는 예를 들어, 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다. 발현 벡터 디자인 예를 들어, 조절 서열의 선택은 형질 전환될 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준 등과 같은 요소에 의존할 수 있다는 사실은 당 업자에 의해 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포 내에서 단백질 발현 수준을 높이는 바이러스 요소 예를 들어, 거대 세포 바이러스(cytomegalovirus; CMV), 유인원 바이러스 40(Simian Virus 40; SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter; AdMLP) 및 폴리오마 바이러스로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸섯포함한다. 대안적으로, 비-바이러스 조절 서열 예를 들어, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터도 사용될 수 있다. 또한, 상이한 근원으로부터 유래하는 서열들로 이루어진 조절 요소 예를 들어, SRα 프로모터 계는 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스(제1형)의 장 말단 반복부로부터 유래하는 서열들을 함유한다[Takebe, Y.외 다수(1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472].

항체 사슬 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열 예를 들어, 숙주 세포 내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기원) 및 선별 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 촉진한다[예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 동 제4,634,665호 및 동 제5,179,017호(모두 Axel외 다수)]. 예를 들어, 통상적으로 벡터가 도입된 숙주 세포 상 선별 마커 유전자는 약물 예를 들어, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자로서는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(dhfr- 숙주 세포 내에서 메토트렉세이트 선택/증폭용으로 사용) 및 neo 유전자(G418 선택용으로 사용)를 포함한다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질 감염된다. 용어 "형질 감염"이 다양한 형태로 사용됨은, 외인성 DNA를 원핵 생물 또는 진핵 생물 숙주 세포에 도입하는데에 일반적으로 사용되는 기술 예를 들어, 전기 천공법, 칼슘-인산염 침전법, DEAE-덱스트란 형질 감염법 등의 다양한 기술을 포함하고자 함이다. 비록 이론적으로는 본 발명의 항체를 원핵 생물 또는 진핵 생물 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있지만, 진핵 생물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포 내 항체의 발현이 가장 바람직한데, 그 이유는 이러한 진핵 생물 세포 구체적으로, 포유동물 세포는 원핵 생물 세포보다 적당히 폴딩되어 면역학적으로 활성인 항체를 조립 및 분비하기 쉽기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 생물 내 발현은 활성 항체를 고수율로 생산하기에는 비효율적이라고 보고된 바 있다[Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13].

본 발명의 재조합 항체를 발현하는 데에 바람직한 포유동물 숙주 세포로서는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, dhfr- CHO 세포(Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220); DHFR 선별 마커와 함께 사용됨(예를 들어, R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포를 사용하는 경우, 기타 바람직한 발현계로서는 GS 유전자 발현계(WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841)가 있다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내에 도입될 때, 숙주 세포 내에서 항체를 발현시키기에 충분한 시간 동안, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 생육하는 배양 배지에 항체가 분비되는데에 충분한 시간 동안, 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산한다. 항체는 표준적 단백질 증폭 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

항원에 대한 항체 결합의 특성 규명

본 발명의 항체는 예를 들어, 유동성 혈구 계측법에 의해 PSMA와 결합하는지 여부에 대해 시험될 수 있다. 간단히 말해서, LNCaP 세포는 조직 배양 플라스크 및 제조된 단일 세포 현탁액으로부터 새로 수집된다. LNCaP 세포 현탁액은 1차 항체로 직접 염색되거나, 또는 PBS 중 1% 파라포름알데히드로 고정한 후 염색될 수 있다. 약 백만개의 세포를 0.5% BSA와 50∼200 ㎍/㎖의 1차 항체를 함유하는 PBS 중에 재현탁하고, 이를 30분 동안 얼음 상에서 항온 처리한다. 이 세포를 0.1% BSA, 0.01% NaN3를 함유하는 PBS로 2회 세척한 후, 1:100 희석 FITC-컨쥬게이트화 염소-항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 100 ㎕ 중에 재현탁한 다음, 이를 얼음 상에서 30분 더 항온 처리한다. 이 세포를 다시 2회 세척하고, 세척용 완충액 0.5 ㎖ 중에 재현탁한 다음, FACS칼리버 혈구 계측기(Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 형광 염색 여부에 대해 분석한다.

대안적으로, 본 발명의 항체는 표준 ELISA에 의해 PSMA와의 결합 여부에 대해 시험될 수 있다. 요약하면, 미세 역가 평판을 PBS 중 정제 PSMA(0.25 ㎍/㎖)를 이용하여 코팅한 후, 이를 PBS 중 5% 소 혈청 알부민으로 블로킹한다. 항체 희석액(예를 들어, PSMA-면역화 마우스로부터 유래한 혈장 희석액)을 각 웰에 가한 후, 이를 37℃에서 1∼2 시간 동안 항온 처리한다. 이 평판을 PBS/Tween으로 세척한 다음, 이를 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이트화된 2차 시약(예를 들어, 인간 항체의 경우, 염소-항-인간 IgG Fc-특이 폴리클로날 시약)과 함께 37℃에서 1 시간 동안 항온 처리한다. 세척 후, 평판을 pNPP 기질(1㎎/㎖)로 전개하고, 이를 OD 405∼650에서 분석한다. 바람직하게, 역가가 가장 높은 마우스가 융합용으로 사용될 것이다.

전술한 바와 같이 ELISA 검정법은 또한 PSMA 면역원과의 양성 반응을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝하는데에 사용될 수 있다. PSMA와 높은 친화도로 결합하는 하이브리도마는 서브클로닝되어 추가로 특성 규명된다. 각각의 하이브리도마로부터 유래하는 하나의 클론 즉, 부모 세포의 반응성을 보유하는 클론을 선택하여(ELISA), 5∼10개의 바이알 세포 은행(-140℃ 보관)을 제조하고, 항체를 정제하는데에 사용할 수 있다.

항-PSMA 항체를 정제하기 위해서, 선택된 하이브리도마를 2리터들이 스피너-플라스크 내에서 생육하여 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 상청액을 여과 및 농축한 후, 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, NJ)로 친화성 크로마토그래피를 수행한다. 용리된 IgG는 겔 전기 영동법과 고 성능 액체 크로마토그래피로 체크하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 대체하고, 농도는 1.43 소멸 계수를 이용하여 OD₂₈₀으로 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 이를 -80℃에 보관할 수 있다.

선택된 항-PSMA 모노클로날 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지 여부를 측정하기 위해서, 시판중인 시약(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 각각의 항체를 바이오틴화할 수 있다. 전술한 바와 같이, PSMA 코팅-ELISA 평판을 사용하여 비표지화 모노클로날 항체 및 바이오틴화 모노클로날 항체를 이용하는 경쟁 연구를 수행할 수 있다. 바이오틴화된 mAb의 결합 여부는 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 경쟁 연구는 방사능 표지화된 항체를 이용하여 수행될 수 있으며, 비 표지화된 경쟁 항체는 스캐처드 분석법(이하 실시예에 추가 설명함)으로 확인할 수 있다.

정제된 항체의 동 기준 표본을 측정하기 위해서, 동 기준 표본 ELISA는 특정 동 기준 표본 항체에 특이적인 시약을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체의 동 기준 표본을 측정하기 위해, 미세 역가 평판 웰을 1 ㎍/㎖의 항-인간 면역 글로불린으로 4℃에서 밤새도록 코팅할 수 있다. 1% BSA로 블로킹한 후, 이 평판을 시험 모노클로날 항체(1 ㎍/㎖ 이하) 또는 정제된 동 기준 표본 대조구와 반응시킨다(상온, 1∼2 시간). 이후 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이트화 프로브와 반응시킬 수 있다. 평판을 전술한 바와 같이 전개 및 분석한다.

항-PSMA 인간 IgG는 웨스턴 블럿팅에 의해 PSMA 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간단히 말해서, PSMA를 제조하여 이를 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동시킬 수 있다. 전기 영동 후, 분리된 항원들을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨지고, 이를 10% 소 태아 혈청으로 블로킹한 다음, 시험될 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG의 결합 여부는 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 이용하여 확인할 수 있으며, BCIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo)로써 전개될 수 있다.

면역 컨쥬게이트

다른 측면에서, 본 발명은 치료제 부분 예를 들어, 세포 독소, 약물(예를 들어, 면역 억제제) 또는 방사성 독소에 컨쥬게이트화된 항-PSMA 항체 또는 이의 단편을 특징으로 한다. 이러한 컨쥬게이트를 본원에서는 "면역 컨쥬게이트"라 칭한다. 하나 이상의 세포 독소를 포함하는 면역 컨쥬게이트를 "면역 독소(immunotoxin)"라 칭한다. 세포 독소 또는 세포 독성 제제로서는 세포에 유해한(예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 제제를 포함한다. 그 예로서는, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블래스틴, 콜히친, 독소루비신, 도노루비신, 디하이드록실 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료제로서는 예를 들어, 대사 길항 물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캡토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 디카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜파란, 카머스틴(BSNU) 및 로머스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 cis-디클로로디아민 플래티늄(II)(DDP 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 도노루비신(구 도노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(구 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 항-유사 분열 제제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블래스틴)도 포함한다.

본 발명의 항체에 컨쥬게이트화될 수 있는 치료용 세포 독소에 관한 기타 바람직한 예로서는, 듀오카마이신, 칼리키아마이신, 메이탄신 및 오리스타틴, 그리고 이들의 유도체를 포함한다. 칼리키아마이신 항체 컨쥬게이트의 예는 시판중에 있다((Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).

세포 독소는 당 업계에 공지된 링커 기술에 의해 본 발명의 항체에 컨쥬게이트화될 수 있다. 항체에 세포 독소를 컨쥬게이트화하는데에 사용되는 링커의 종류로서는 예를 들어, 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디설파이드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 링커는 예를 들어, 리소좀 구획 내 낮은 pH에서 분해되기 쉽거나 또는 프로테아제 예를 들어, 종양 조직 내에서 우선적으로 발현되는 프로테아제 예를 들어, 카텝신(예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 분해되기 쉬운 것으로 선택될 수 있다.

세포 독소 및 링커의 종류와, 항체에 치료제를 컨쥬게이트화하는 방법에 관하여는 문헌[Saito, G.외 다수(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A.외 다수(2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, CJ.(2001),Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]에 자세히 기술되어 있다.

본 발명의 항체는 또한 방사성 동위 원소에 컨쥬게이트화되어 세포 독성 방사성 약제(방사성 면역 컨쥬게이트라고도 칭함)를 생산할 수 있다. 진단용 또는 치료용으로 사용되는 항체에 컨쥬게이트화될 수 있는 방사성 동위 원소로서는 요드¹³¹, 요드¹²⁵, 인듐¹¹¹, 이트륨⁹⁰ 및 루테튬¹⁷⁷을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 방사성 면역 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 당 업계에 확립되어 있다. 방사성 면역 컨쥬게이트는 시판중에 있는데, 그 예로서는 제발린(Zevalin)™(IDEC Pharmaceuticals) 및 벡사(Bexxar)™(Corixa Pharmaceuticals)를 포함하고, 또한 본 발명의 항체를 사용하여 방사성 면역 컨쥬게이트를 제조하는데에 유사한 방법이 사용될 수도 있다.

본 발명의 항체 컨쥬게이트는 소정의 생물 반응을 개선시키는데에 사용될 수 있으며, 약물 부분(drug moiety)은 전통적인 화학 치료제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 부분은 목적으로 하는 생물 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로서는 예를 들어, 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 활성 단편 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질 예를 들어, 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물 반응 개선제 예를 들어, 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL--6"), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF") 또는 기타 성장 인자를 포함할 수 있다.

이와 같이 치료 부분을 항체에 컨쥬게이트화하는 기술에 관하여는 널리 공지되어 있다[예를 들어, Arnon외 다수, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld외 다수(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom외 다수"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson외 다수(eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera외 다수(eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin외 다수(eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe외 다수"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982) 참조].

이중 특이적 분자

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-PSMA 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중 특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 다른 기능성 분자 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화되거나 또는 이와 결합하여, 2개 이상의 상이한 결합 위치 또는 표적 분자와 결합하는 이중 특이적 분자를 생성할 수 있다. 실제로, 본 발명의 항체는 하나 이상의 기타 기능성 분자로 유도체화되거나 또는 이와 결합되어, 2개 이상의 상이한 결합 위치 및/또는 표적 분자와 결합하는 다중 특이적 분자를 생성할 수 있으며; 이러한 다중 특이적 분자는 본원에 사용된 "이중 특이적 분자"라는 용어에 포함되기도 한다. 본 발명의 이중 특이적 분자를 생산하기 위하여, 본 발명의 항체는 (예를 들어, 화학 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의해) 기능상으로 하나 이상의 기타 결합 분자 예를 들어, 기타 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모의체에 결합되어, 이중 특이적 분자를 형성할 수 있다.

그러므로, 본 발명은 PSMA에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성과 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 보유하는 이중 특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체 예를 들어, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89)이다. 그러므로, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR 발현 효과기 세포(예를 들어, 단핵구, 대식 세포 또는 다형핵 백혈구(PMN))와, PSMA를 발현하는 표적 세포 둘 다와 결합할 수 있는 이중 특이적 분자를 포함한다. 이와 같은 이중 특이적 분자는 PSMA 발현 세포를 효과기 세포에 표적화하여, Fc 수용체-매개 효과기 세포 활성 예를 들어, PSMA 발현 세포의 식균 작용, 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC), 시토킨 방출 또는 과산화 음이온의 발생을 촉진한다.

이중 특이적 분자가 다중 특이적인 본 발명의 구체예에서, 이 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-PSMA 결합 특이성 이외에 제3의 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 제3의 결합 특이성은 항-강화 인자(anti-enhancement factor; EF) 부분 예를 들어, 세포 독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자의 것이 있다. "항-강화 인자 부분"은 소정의 분자 예를 들어, 항원이나 수용체에 결합하여, Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정기의 효과를 강화하는, 항체, 기능성 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-강화 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항-강화 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성 분자가 결합하는 실체와는 상이한 실체와 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-강화 인자 부분은 세포 독성 T-세포에 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대한 면역 반응을 증강시키는 기타 면역 세포를 통하여) 결합할 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 이중 특이적 분자는 결합 특이성 분자로서 하나 이상의 항체, 이의 항체 단편 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 단일 사슬 Fv를 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체이거나, 또는 이의 임의의 최소 단편 예를 들어, Fv 또는 단일 사슬 구조물일 수도 있다[Ladner외 다수, 미국 특허 제4,946,778호; 내용은 참고용으로 인용되어 있음].

하나의 구체예에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이성은 모노클로날 항체에 의하여 제공되며, 여기서, 이 결합 특성은 인간 면역 글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에 사용된 "IgG 수용체"란 용어는, 1번 염색체 상에 위치하는 8개의 γ-사슬 유전자 중 임의의 것을 의미한다. 이 유전자들은 총 12개의 경막 또는 가용성 수용체 아형을 암호화하는데, 이 아형들은 3개의 Fcγ 수용체 군으로 분류된다: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16). 하나의 바람직한 구체예에서, Fcγ 수용체는 인간의 고 친화성 FcγRI이다. 인간의 FcγRI는 72kDa의 분자로서, 단량체 IgG에 대해서는 높은 친화도를 나타낸다(10⁸∼10⁹ M^-1).

임의의 바람직한 항-Fcγ 모노클로날 항체의 생산 방법 및 특성 규명에 관하여는 문헌에 기술되어 있다[Fanger외 다수의 PCT 공보 WO 88/00052 및 미국 특허 제4,954,617호; 이 문헌에서 교시하는 바는 본원에 전체로서 참고용으로 인용됨]. 이들 항체는 수용체의 Fcγ 결합 위치와 구별되는 위치에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하므로, 이것들의 결합 특성은 생리적 수준의 IgG에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이적 항-FcγRI 항체로서는 mAb22, mAb 32, mAb44, mAb62 및 mAb197이 있다. mAb32를 생산하는 하이브리도마는 미국 모식균 배양 수집소에 ATCC 수탁 번호 HB9469로 기탁되어 있다. 다른 구체예에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 모노클로날 항체 22(H22)의 인간화된 형태이다. H22 항체의 생산 방법 및 특성 규명에 관하여는 문헌[Graziano, R.F.외 다수(1995); J. Immunol 155 (10): 4996-5002 및 PCT 공보 WO 94/10332]에 기술되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 미국 모식균 배양 수집소에 HA022CL1으로서 기탁되어 있으며, 수탁 번호는 CRL 11177이다.

또 다른 바람직한 구체예에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체 예를 들어, Fc-알파 수용체(FcαRI(CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되며, 이의 결합 특성은 인간 면역 글로불린 A(IgA)에 의해 차단되지 않는다. "IgA 수용체"란 용어는 19번 염색체상에 위치하는 하나의 α-유전자(FcαRI)의 유전자 산물을 포함하는 의미이다. 이 유전자는 대안적으로 스플라이싱된 55∼110 kDa의 몇몇 경막 아형 분자를 암호화하는 것으로 알려져 있다. FcαRI(CD89)는 단핵구/대식 세포, 호산성 및 호중성 과립구 상에 구성적으로 발현되지만, 비-효과기 세포 군집 상에는 그러하지 아니하다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2에 대해 중간 정도의 친화도를 가지는데(약 5×10⁷ M^-1), 이 친화도는 시토킨 예를 들어, G-CSF 또는 GM-CSF에 노출될 경우 증가한다[Morton, H.C.외 다수(1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. IgA 리간드 결합 도메인 외에서 FcαRI에 결합하는 4개의 FcαRI-특이적 모노클로날 항체 즉, A3, A59, A62 및 A77에 관하여는 기술된 바 있다[Monteiro, R.C.외 다수(1992) J Immunol. 148:1764)].

FcαRI 및 FcγRI는 본 발명의 이중 특이적 분자에 사용되는데에 바람직한 촉발 수용체(trigger receptor)인데, 그 이유는 이 수용체가 (1) 면역 효과기 세포 예를 들어, 단핵구, PMN, 대식 세포 및 수지상 세포 상에 주로 발현되고; (2) 높은 수준으로(예를 들어, 세포당 5,000∼100,000개) 발현되며; (3) 세포 독성 활성(예를 들어, ADCC, 식균 작용)의 매개 인자이고; (4) 수용체에 표적화된 항원 예를 들어, 자가-항원의 강화된 항원 제시 작용을 매개하기 때문이다.

인간 모노클로날 항체가 바람직하긴 하지만, 본 발명의 이중 특이적 분자에 사용될 수 있는 기타 항체들로서는 쥣과 동물, 키메라 및 인간화된 모노클로날 항체가 있다.

본 발명의 이중 특이적 분자는 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 구성적 결합 특이성 분자 예를 들어, 항-FcR 및 항-PSMA 결합 특이성 분자를 컨쥬게이트화 함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중 특이적 분자의 각 결합 특이성 분자는 개별적으로 형성된 후 상호 간에 컨쥬게이트화 될 수 있다. 결합 특이성 분자가 단백질이나 펩티드인 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제가 공유 결합성 컨쥬게이트화에 사용될 수 있다. 가교제의 예로서는 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(o-PDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)를 포함한다[예를 들어, Karpovsky외 다수(1984) J Exp. Med. 160:1686; Liu, MA외 다수(1985) Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:8648]. 기타 방법으로서는 문헌[Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan외 다수(1985) Science 229:81-83), 및 Glennie외 다수(1987) J Immunol 139: 2367-2375]에 기술된 방법들을 포함한다. 바람직한 컨쥬게이트화 제제로서는 SATA 및 설포-SMCC가 있는데, 이들은 둘 다 피어스 케미컬스 코포레이션(Pierce Chemical Co.; Rockford, IL)으로부터 입수 가능하다.

결합 특이성 분자가 항체일 때, 이는 2개의 중쇄 사이에 존재하는 C-말단 힌지부의 설프히드릴 결합을 통해 컨쥬게이트화될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지부는 홀수개, 바람직하게는 1개의 설프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된 후 컨쥬게이트화된다.

대안적으로, 두 개의 결합 특이성 분자는 동일한 벡터 내에서 암호화되고, 동일한 숙주 세포 내에서 발현 및 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중 특이적 분자가 mAb × mAb, mAb × Fab, Fab × F(ab')₂ 또는 리간드 × Fab 융합 단백질일 경우 특히 유용하다. 본 발명의 이중 특이적 분자는 하나의 단일 사슬 항체와 결합 결정기를 포함하는 단일 사슬 분자이거나, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 사슬 이중 특이적 분자일 수 있다. 이중 특이적 분자들은 2개 이상의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중 특이적 분자를 제조하는 방법에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기술되어 있다.

이중 특이적 분자가 이의 특이적 표적에 결합되었는지 여부는 예를 들어, 효소-결합 면역 흡착 검정법(ELISA), 방사성 면역 검정법(RIA), FACS 분석법, 생물 검정법(예를 들어, 성장 억제법), 또는 웨스턴 블럿 검정법에 의해 확인할 수 있다. 이러한 검정법은 각각 일반적으로 목적 복합체에 특이적인 표지화 시약(예를 들어, 항체)을 사용하여 특정 목적을 가지는 단백질-항체 복합체의 존부를 확인하는 방법이다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어, 항체-FcR 복합체를 인지하여 이에 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 이용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 상기 복합체는 기타 다양한 면역 검정법 중 임의의 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사성 표지화될 수 있으며, 방사성 면역 검정법(RIA)에서 사용될 수 있다[예를 들어, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986; 본원에 참고용으로 인용됨]. 방사성 동위 원소는 이러한 방법 즉, γ 계수기 또는 신틸레이션 계수기를 사용하거나 또는 방사능 사진 촬영 기술에 의해 검출될 수 있다.

약학 조성물

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부 중 어느 하나 또는 이들을 조합하여 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화되는 조성물 예를 들어, 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 발명의 항체(예를 들어, 2개 이상의 상이한 항체), 또는 면역 컨쥬게이트 또는 이중 특이적 분자 중 어느 하나 또는 이들을 조합하여 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 표적 항원 상에 존재하는 상이한 에피토프와 결합하거나 또는 상보성 활성을 가지는 항체(또는 면역 컨쥬게이트 또는 이중 특이적 분자)의 조합체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 치료제 즉, 기타 제제와 배합되어 투여될 수도 있다. 예를 들어, 조합 치료제는 하나 이상의 기타 소염제 또는 면역 억제제와 함께 본 발명의 항-PSMA 항체를 포함할 수 있다. 조합 치료제로서 사용될 수 있는 치료제의 예에 관하여는 이하 본 발명의 항체의 용도에 관한 섹션에 더욱 상세히 기술되어 있다.

본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"는, 생리학적으로 혼화 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항 박테리아 제제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡착 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 상기 담체는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여용으로서 적당하다(예를 들어, 주사 또는 주입). 투여 경로에 따라서, 활성 화합물 즉, 항체, 면역 컨쥬게이트 또는 이중 특이적 분자는 이 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용과 기타 천연 환경으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질 중에 코팅될 수 있다.

본 발명의 약학 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 염"이란, 모 화합물의 원하는 생물 활성을 보유하고, 어떠한 바람직하지 않은 독성학적 효과를 나타내지도 않는 염을 의미한다[예를 들어, Berge, S.M.,외 다수(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 참조]. 이러한 염의 예로서는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산 예를 들어, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아인산 등으로부터 유래하는 것들과, 비독성 유기산 예를 들어, 지방족 모노카복시산 및 디카복시산, 페닐-치환 알카논산, 히드록시 알카논산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래하는 것들을 포함한다. 염기 부가염으로서는 알칼리토금속 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등으로부터 유래하는 것들과, 비독성 유기 아민 예를 들어, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래하는 것들을 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 항산화제를 포함할 수도 있다. 약학적으로 허용 가능한 항산화제의 예로서는 (1) 수용성 항산화제 예를 들어, 아스코르브산, 염화수소산시스테인, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유성 항산화제 예를 들어, 팔미트산아스코르빌, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 몰식자산프로필 및 알파-토코페롤 등; 그리고 (3) 금속 킬레이트화제 예를 들어, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등을 포함한다.

본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적당한 수성 및 비수성 담체의 예로서는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등)과, 이들의 적당한 혼합물, 식물성 오일 예를 들어, 올리브유, 그리고 주사 가능한 유기 에스테르 예를 들어, 올레산에틸을 포함한다. 유동성은 예를 들어, 코팅 물질 예를 들어, 레시틴을 사용하거나, 분산액의 경우에는 필요한 입도를 유지시키거나, 계면활성제를 사용함으로써 적당히 유지될 수 있다.

이러한 조성물은 또한 애쥬반트 예를 들어, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수도 있다. 미생물로부터 보호하기 위해서는 멸균 방법(상동)에 의하거나, 다양한 항 박테리아 제제 및 항진균제 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시키는 방법이 확실하다. 뿐만 아니라, 등장제 예를 들어, 설탕 및 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 뿐만 아니라, 흡수를 지연시키는 제제 예를 들어, 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴을 포함시켜 주사 가능한 약학 제형을 오랜 시간에 걸쳐 흡수시킬 수도 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체로서는, 멸균 주사 용액 또는 분산액을 즉석으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 이와 같이 약학적으로 활성인 매질 및 제제를 사용하는 것은 당 업계에 공지되어 있다. 지금까지 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비 혼화성이라는 점을 제외하면, 이들을 본 발명의 약학 조성물에 사용하는 것도 본 발명에서 고려해볼 수 있다. 부가의 활성 화합물도 본 조성물에 포함될 수 있다.

치료용 조성물은 통상적으로 제조 및 보관 공정 하에서 멸균 및 안정한 것이어야 한다. 본 조성물은 용액, 마이크로에멀젼(microemulsion), 리포좀 또는 기타 고농도 약물로서 적당히 정렬된 구조를 가지는 물질로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 이들의 적당한 혼합물을 함유하는 분산액 또는 용매일 수 있다. 유동성은 예를 들어, 코팅제 예를 들어 레시틴을 사용하거나, 분산액일 경우 필요한 입도로 유지시키거나, 계면활성제를 사용함으로써 적당히 유지될 수 있다. 다수의 경우, 등장제 예를 들어, 설탕, 폴리알콜 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제 예를 들어, 모노스테아르산 염 및 젤라틴을 포함시켜, 주사 가능한 조성물을 오랜 시간에 걸쳐 흡수시킬 수 있다.

멸균 주사 용액은 필요에 따라서, 적당한 용매 중에 전술한 성분들 중 어느 하나 또는 이들을 조합하여 필요량만큼의 활성 화합물과 함께 포함시킨 후, 멸균 미세 여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 멸균 비이클(기본 분산 매질 및 기타 필요로 하는 전술한 성분들을 함유하는 비이클) 중에 혼합시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조용인 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로서는 미리 멸균-여과시킨 활성 성분 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 바람직한 부가 성분들을 만들어내는 진공 건조법 및 냉동-건조법(동결 건조법)이 있다.

단일 투여형을 만들기 위하여 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 개체와 특정 투여 방식에 따라서 달라질 것이다. 담체 물질과 혼합되어 단일 투여형을 만들 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 이 양은 약학적으로 허용 가능한 담체와 활성 성분을 합하여 100이라고 보았을 때, 활성 성분 약 0.01∼약 99%, 바람직하게는 약 0.1∼약 70%, 가장 바람직하게는 약 1∼약 30%일 것이다.

투여 방식은 최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 맞춘다. 예를 들어, 환제로서 1회 투여될 수 있으며, 경시적으로 수회 나누어 투여할 수도 있거나, 또는 치료 경과의 응급도에 비례하여 투여량을 감소 또는 증가시킬 수도 있다. 투여의 용이함과 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 본원에 사용된 투여 단위형이란, 치료할 개체의 단위 투여형으로서 적당하고 물리적으로 별개인 단위를 의미하는데; 여기서, 각 단위는 필요로 하는 약학 담체와 함께 소정량(목적으로 하는 치료 효과를 나타내도록 책정)의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위형의 특징은, (a) 활성 화합물의 독특한 특성과 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 화합물 제조업계에 고질적인 한계점 예를 들어, 활성 화합물에 대한 개체의 치료 민감성 정도에 의해 설명되고, 또한 이에 직접적으로 의존한다.

항체 투여에 있어서, 투여량 범위는 숙주의 체중 1㎏당 약 0.0001∼100 ㎎이고, 더욱 일반적으로는 0.01∼5 ㎎이다. 예를 들어, 투여량은 체중 1㎏당 0.3㎎, 1㎎, 3㎎, 5㎎ 또는 10㎎일 수 있고, 또는 1∼10 ㎎의 범위 내일 수 있다. 대표적인 치료 방식은 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 4주일에 1회, 1개월에 1회, 3개월에 1회 또는 3∼6개월에 1회 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 항-PSMA 항체에 바람직한 투여 방식은 정맥 내 투여를 통하여 체중 1㎏당 1㎎ 또는 3㎎ 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 다음과 같은 투여 스케쥴 중 어느 하나를 적용하여 투여한다:(i) 4주마다 총 6회 투여, 그리고 이후 3개월마다 투여; (ii) 3주마다 투여; (iii) 체중 1㎏당 3㎎ 1회 투여한 후, 3주마다 체중 1㎏당 1㎎ 투여.

몇몇 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가지는 2개 이상의 모노클로날 항체는 동시에 투여되는데, 이 경우 투여된 각 항체의 투여량은 전술한 범위에 포함된다. 항체는 일반적으로 다수의 경우로 투여된다. 매 투여 사이의 간격은 예를 들어, 1주일, 1개월, 3개월 또는 1년일 수 있다. 간격은 또한 환자의 체내 표적 항원에 대한 항체의 혈액 내 수준을 측정함으로써 상기와 같이 일정하지 않을 수 있다. 몇몇 방법에서, 투여량은 혈장 내 항체 농도 약 1∼1000 ㎍/㎖, 그리고 몇몇 방법에서는 약 25∼300 ㎍/㎖가 되도록 맞춘다.

대안적으로, 항체는 지연 방출 제형으로서 투여될 수 있는데, 이 경우 투여 횟수를 줄여야 한다. 투여량과 투여 횟수는 환자 체내 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간 항체의 반감기가 가장 길며, 그 다음은 인간화된 항체, 키메라 항체 그리고 비-인간 항체의 순이다. 투여량 및 투여 횟수는 처치가 예방을 목적으로 하는 것인지 아니면 치료를 목적으로 하는 것인지의 여부에 따라서 달라진다. 예방의 목적으로 처치하는 경우, 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 비교적 낮은 투여량만큼 투여된다. 일부 환자들은 여생 동안 계속해서 처치를 받는다. 치료의 목적으로 처치하는 경우, 병의 진행이 늦춰지거나 또는 멈춰질 때까지, 바람직하게는 환자의 병의 증상이 부분적으로 또는 완전히 완화될 때까지 비교적 단기의 간격으로 비교적 다량 투여된다. 이후, 환자는 예방 차원에서 처치를 받을 수 있다.

환자에게 독성을 미치지 않고서, 특정 환자, 조성물 그리고 투여 방식에 대한 치료 효과를 원하는 바와 같이 이루는데에 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해서, 본 발명의 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준은 다양할 수 있다. 선택된 투여 수준은 다양한 약물 동력학적 요인 예를 들어, 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용될 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용된 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받을 환자의 연령, 성별, 체중, 몸 상태, 전체적인 건강 상태 및 이전 치료 경험과 기타 의료업계에 널리 공지된 요인들에 따라서 달라질 것이다.

본 발명의 항-PSMA 항체의 "치료학적 유효량"이란, 바람직하게는 질병 증상의 중증도를 감소시키거나, 투여 횟수와 질병의 증상이 나타나지 않는 기간을 늘리거나, 또는 질병의 발병으로 인한 손상이나 장애를 예방할 수 있는 양을 의미하는 것이다. 예를 들어, PSMA + 종양 치료시, "치료학적 유효량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 치료받지 않은 개체에 비하여 바람직하게는 약 20% 이상, 더욱 바람직하게는 약 40% 이상, 더더욱 바람직하게는 약 60% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 80% 이상 억제하는 경우를 의미한다. 종양의 성장을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측할 수 있는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 이와 같은 조성물의 특성은 이 화합물의 억제능 즉, 당 업자에게 공지된 시험관 내 검정법에 있어서의 억제능을 관찰함으로써 평가될 수 있다. 치료용 화합물의 치료학적 유효량은 종양의 크기를 감소시킬 수 있거나, 또는 개체의 증상들을 경감시킬 수도 있다. 당 업자는 이러한 요인들 즉, 개체의 크기, 개체 증상의 중증도, 그리고 특정 조성물 또는 선택된 투여 경로를 바탕으로 하여 그 양을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물은 당 업계에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 사용함으로써 하나 이상의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다. 당 업자에게 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 의도로 하는 결과에 따라서 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 투여 경로로서는, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한, 정맥 내, 근육 내, 피 내, 복강 내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 "비경구 투여"란 어구는, 일반적으로 주사에 의한, 장 내 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하는 것으로서, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 초 내, 낭 내(intracapsular), 안와 내(intraorbital), 심장 내, 피 내, 복강 내, 경 기관, 피하, 표피 하, 관절 내, 낭하, 지주막 하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

대안적으로, 본 발명의 항체는 비경구 외(non-parenteral) 경로 예를 들어, 국소, 상피 또는 점막 투여 경로 예를 들어, 비 내, 경구, 질 내, 직장 내, 설하 또는 국소 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다.

활성 화합물은 이 화합물이 급속하게 방출되는 것을 막아주는 담체와 함께 제조될 수 있는데, 예를 들어, 조절 방출형 제형 예를 들어, 임플란트, 경피 패취 및 미세 캡슐화 전달 시스템의 형태로서 제조될 수 있다. 생체 분해성 및 생체 혼화성 중합체 예를 들어, 아세트산 에틸렌 비닐, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법의 대다수는 특허 받았거나 또는 일반적으로 당 업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조하시오.

치료용 조성물은 당 업계에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료용 조성물은 바늘이 없는 피하 주사용 장치 예를 들어, 미국 특허 제5,399,163호; 동 제5,383,851호; 동 제5,312,335호; 동 제5,064,413호; 동 제4,941,880호; 동 제4,790,824호; 또는 동 제4,596,556호에 개시된 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 널리 공지된 임플란트 및 본 발명에 유용한 모듈의 예로서는 미국 특허 제4,487,603호에 개시된 것들(조절된 속도로 약물을 분배하는 이식 가능 미소-주입 펌프에 관하여 개시됨); 미국 특허 제4,486,194호에 개시된 것들(피부를 통하여 약물을 투여하는 치료용 장치에 관하여 개시됨); 미국 특허 제4,447,233호에 개시된 것들(정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프에 관하여 개시됨); 미국 특허 제4,447,224호에 개시된 것들(연속적으로 약물을 전달하기 위한 다양한 유동성 이식 주입 장치에 관하여 개시됨); 미국 특허 제4,439,196호에 개시된 것들(다중 챔버 구획을 가지는 삼투성 약물 전달 시스템에 관하여 개시됨); 및 미국 특허 제4,475,196호에 개시된 것들(삼투성 약물 전달 시스템에 관하여 개시됨)을 포함한다. 상기 특허들은 본원에 참고용으로 인용되어 있다. 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈 이외 다수의 것들은 당 업자에게 공지되어 있다.

임의의 구체예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체 내에서 적당히 분배될 수 있도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈뇌 장벽(BBB)은 친수성이 큰 다수의 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료용 화합물이 상기 BBB(원할 경우)를 통과하게 하기 위해서는, 이 화합물을 예를 들어, 리포좀 내에 제형화시킬 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 동 제5,374,548호; 및 동 제5,399,331호를 참조하시오. 리포좀은 특정 세포 또는 기관에 선택적으로 운반되는 하나 이상의 부분들을 포함하여, 목적으로 하는 약물 전달 효율을 높일 수 있다[예를 들어, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685 참조]. 대표적인 표적화 부분(targeting moiety)으로서는 엽산염 또는 바이오틴(예를 들어, 미국 특허 제5,416,016호(Low외 다수) 참조); 만노시드(Umezawa외 다수(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman외 다수(1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais외 다수(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면 활성 단백질 A 수용체(surfactant protein A receptor) (Briscoe외 다수(1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120(Schreier외 다수(1994) J. Biol. Chem. 269:9090); 그리고 문헌(K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4;273)에 개시된 것을 포함한다.

본 발명의 용도 및 방법

본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 PSMA의 발현과 관계된 질환의 치료 및 진단과 관련된, 시험관 내 및 생체 내 진단 및 치료에 관한 유용성을 다수 갖는다. 예를 들어, 이러한 분자들은 배양액 중 세포에 투여될 수 있거나(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 외), 또는 인간 개체에 투여될 수 있으며(예를 들어, 생체 내), 그 결과 다양한 질환을 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 본원에 사용된 "개체"란 용어는, 인간 및 인간 이외의 동물들을 포함하는 의미이다. 인간 이외의 동물로서는 모든 척추 동물 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물 예를 들어, 인간 이외의 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 닭, 조류, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 개체로서는 PSMA 발현과 관련된 질환이 발병된 인간 환자를 포함한다. PSMA에 대한 항체가 다른 제제와 함께 투여될 때, 상기 항체와 다른 제제는 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명의 항체 조성물(예를 들어, 항체 또는 면역 컨쥬게이트)을 투여하는데에 적당한 경로(생체 내 및 시험관 내 경로)는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이는 당 업자에 의하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사(예를 들어, 정맥 내 또는 피하 주사)에 의해 투여될 수 있다. 사용된 분자의 적당한 투여량은 개체의 연령과 체중, 그리고 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 따라서 달라질 것이다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 처음에는 시험관 내 치료용 또는 진단용으로서 사용되는 것과 관련된 결합 활성에 대하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 ELISA 및 유동성 혈구 계측 검정법을 사용하여 시험될 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 효과기-매개 효과기 세포 활성을 촉진함에 있어서 이 분자의 활성 예를 들어, PSMA를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 활성 및/또는 이 세포를 사멸시키는 활성을 검정할 수 있다. 효과기 세포-매개 ADCC 검정에 대한 프로토콜은 이하 실시예에 기술되어 있다.

A. 검출 방법

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 PSMA 수준, 또는 막 표면에 PSMA를 함유하는 세포의 수준을 검출하는데에 사용될 수 있다[여기서, 상기 수준들은 이후 질병 증상을 확인하는 것과 연계해서 이용될 수 있음].

특정 구체예에서, 본 발명은 시료 중 PSMA가 존재하는지 여부를 확인하는 방법, 또는 세포 표면에 존재하는 PSMA의 양을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법들은 항체 또는 이의 일부와 PSMA 간 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서 시료와 대조구 시료를, 항체 또는 이의 항원 결합부(PSMA와 특이적으로 결합)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이후 복합체가 형성되었는지 여부를 확인하는데, 이때에는 대조구 시료의 경우와 비교하였을 때 시료 간 복합체 형성에서 나타나는 차이점은 시료 중 PSMA가 존재함을 나타내는 지표가 된다. 예를 들어, 당 업계에 널리 공지된 표준 검출 방법 예를 들어, ELISA 및 유동성 혈구 계측법은 본 발명의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.

그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 시료 중 PSMA(예를 들어, 인간 PSMA)의 존재를 확인하는 방법, 또는 PSMA의 양을 측정하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법들은 항체 또는 이의 일부와 PSMA 간 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서 시료와 대조구 시료를, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부(PSMA와 특이적으로 결합)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이후 복합체가 형성되었는지 여부를 확인하는데, 이때에는 대조구 시료의 경우와 비교하였을 때 시료 간 복합체 형성에서 나타나는 차이점은 시료 중 PSMA가 존재함을 나타내는 지표가 된다.

본 발명의 조성물은 또한 예를 들어, PSMA를 발현하는 표적 세포를 표지화시키기 위해 이 PSMA 발현 표적 세포를 사용할 수도 있다. 이러한 경우, 결합 제제는 검출될 수 있는 분자에 결합될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 PSMA를 발현하는 세포의 세포 외 또는 시험관 내 국소화 방법을 제공한다. 검출 가능한 표지는 예를 들어, 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다.

B. PSMA + 세포의 성장 억제

본 발명의 항체는 PSMA 발현과 관련된 임의의 질병 증상들을 예방하거나 또는 경감시키는 것과 관련될 수 있는, PSMA 발현 세포의 성장을 억제하는데에 사용될 수 있다. 발병되지 않은 상태와 비교하였을 때, 발병시 PSMA 발현 상의 차이점은, 항체와 PSMA 사이에 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서, 질병이 발병한 개체로부터 유래하는 시험 시료와 대조구 시료를 항-PSMA 항체와 접촉시킴으로써 측정될 수 있다. 상기 항체와 PSMA 사이에 형성된 임의의 복합체는 시료 및 대조구 중에서 검출 및 비교된다.

예를 들어, 항체는 다음과 같은 생물 활성 중 하나 이상을 생체 내 또는 시험관 내에서 유추하는데에 사용될 수 있다: PSMA 발현 세포의 성장을 억제하는 활성 및/또는 이 세포를 사멸시키는 활성; 인간 효과기 세포의 존재 하에 PSMA 발현 세포의 식균 작용 또는 ADCC를 매개하는 활성; 가용성 PSMA의 발산(shedding)을 억제하는 활성. 본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 푸코실화된 형태의 항체에 비하여 ADCC 활성이 상승하였음을 보여준다.

그러므로, 다른 측면에서, 본 발명은 PSMA⁺ 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 세포의 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 유도하는데에 충분한 조건 하에서 상기 세포를 항-PSMA 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 세포는 예를 들어, 종양 세포일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 항-PSMA 항체는 인간 항체이다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 결합부는 예를 들어, 세포 표면 상에 존재하는 수용체를 캡핑 및 제거함으로써, 표적 세포 상의 PSMA 수준을 조정하는데에 사용될 수 있다. 항-Fc 수용체 항체의 혼합물도 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다.

표적-특이적 효과기 세포 예를 들어, 본 발명의 조성물과 관련된 효과기 세포도 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 표적화용 효과기 세포는 인간 백혈구 예를 들어, 대식 세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 기타 세포로서는 호산구, 자연 살해 세포(natural killer cell) 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포를 포함한다. 원한다면, 효과기 세포는 치료받을 개체로부터 얻을 수도 있다. 표적-특이적 효과기 세포는 생리적으로 허용 가능한 용액 중 세포 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여될 세포의 수는 10⁸∼10⁹개일 수 있으나, 치료 목적에 따라서 달라질 것이다. 일반적으로, 투여량은 표적 세포 예를 들어, PSMA 발현 종양 세포에 국소화되기에 충분한 양, 그리고 예를 들어, 식균 작용에 의해 세포를 사멸시키기에 충분한 양일 것이다. 투여 경로는 다양할 수 있다.

표적-특이적 효과기 세포를 이용하는 치료법은 표적화 세포를 제거하는 기타 기술과 함께 병행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및/또는 이 조성물이 결합된 효과기 세포를 사용하는 항-종양 치료법은 화학 요법과 함께 병행될 수 있다. 뿐만 아니라, 병행 면역 요법은 종양 세포 거부에 대한 2가지의 분명한 세포 독성 효과기 세포 군집을 유도하는데에 사용될 수 있다.

C. 면역 컨쥬게이트 및 병행 요법의 이용

하나의 구체예에서, 본 발명의 면역 컨쥬게이트는 화합물(예를 들어, 치료제, 표지, 세포 독소, 방사능 독소, 면역 억제제 등)을 PSMA 세포 표면 분자를 가지는 세포에 표적화시키는데에(즉, 이 화합물을 항체에 결합시키는데에) 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 생체 외 또는 시험관 내에서 PSMA 발현 세포를 국소화시키는 방법을 제공한다[예를 들어, 검출 가능 표지 예를 들어, 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조 인자 이용]. 대안적으로, 면역 컨쥬게이트는 세포 독소 또는 방사능 독소를 PSMA 예를 들어, PSMA-발현 종양 세포에 표적화하여 종양 세포를 제거함으로써, PSMA 세포 표면 수용체를 가지는 세포를 사멸시키는데에 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 개체는 추가로, Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조정 예를 들어, 강화 또는 억제하는 제제로써 처리(예를 들어, 개체를 시토킨으로 처리)될 수 있다. 치료 동안 투여하기에 바람직한 시토킨으로서는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구-대식 세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ(INF-γ) 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물로 치료되는 환자에 인간 항체의 치료 효과를 강화 또는 증가시키는 다른 치료제 예를 들어, 세포 독성 제제 또는 방사능 독성 제제를 (예를 들어, 본 발명의 항체를 투여하기 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에) 추가로 투여할 수도 있다. 본 발명의 항체는 제제(예를 들어, 면역 복합체)에 결합될 수 있거나, 또는 이 제제와는 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우(즉, 별도 투여의 경우), 항체는 제제를 투여하기 이전, 이후 또는 동시에 투여될 수 있거나, 또는 기타 공지의 치료제 예를 들어, 항암 치료제 예를 들어, 방사선과 함께 공동 투여될 수 있다. 이러한 치료제로서는 예를 들어, 항 종양제 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 설페이트, 카머스틴, 클로람부실 및 사이클로포스파미드 하이드록시우레아(이들 자체는 환자에게 독성이거나 또는 아급성 독성인 수준에서만 효과를 나타냄)를 포함한다. 시스플라틴은 4주마다 한 번씩 100 ㎎/㎖의 투여량으로 정맥 내 투여되고, 아드리아마이신은 21일마다 한 번씩 60∼75 ㎎/㎖의 투여량으로 정맥 내 투여된다. 본 발명의 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 화학 요법 제제와 공동 투여하면, 인간 종양 세포에 세포 독성 효과를 나타내며, 상이한 기작을 통하여 작용하는 2가지의 항암제가 제공된다. 이러한 공동 투여를 통하여, 약물에 대한 내성이 생기거나 또는 종양 세포의 항원성이 변경됨으로 인한 문제점(이 종양 세포가 항체에 무 반응성이 되는 문제점)을 해결할 수 있다.

D. 암의 치료

PSMA는 종양 세포 예를 들어, 전립선암종 종양 세포 상에서 발현되며, 또한 암 세포 예를 들어, 요로 상피 암 세포, 결장 암 세포, 직장 암 세포, 폐암 세포, 유방암 세포 및 간의 전이성 선 암종 암 세포에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포 상에서도 발현되는 것으로 파악된다(미국 특허 제6,136,311호 참조). 그러므로, 본 발명의 항체는 PSMA-발현 종양 세포의 성장을 억제하거나, 또는 종양 세포에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포의 성장을 억제함으로써, 암을 치료하는데에 사용될 수 있다. 그러므로, 다른 구체예에서, 본 발명은 개체 내에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공하는데, 여기서, 종양 세포 또는 이 종양에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA⁺ 즉, 본 발명의 항-PSMA 항체가 개체에 투여되었을 때 종양의 성장이 억제되는 세포이다. 인간 개체에 있어서, 상기 항체는 바람직하게는 인간화된 항체 또는 인간의 항체이다. 바람직한 구체예에서, 종양 세포는 전립선 종양 세포이다. 다른 구체예에서, 종양 세포는 결장암, 신장암, 직장암, 요로 상피암, 유방암, 방광암, 간암, 췌장암 또는 흑색종으로부터 유래하는 것이다.

본 발명의 치료 방법은 개체에 본 발명의 항체 조성물을 질환을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 항체 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나 또는 다른 치료제 예를 들어, 세포 독성 제제 또는 방사능 독성 제제와 함께 투여될 수 있으며(항체에 컨쥬게이트화되어 투여되거나 또는 이 항체와 함께 투여), 이때 상기 제제는 본 발명의 항체 조성물과 공동으로 작용하거나 또는 상승 작용하여, PSMA 발현과 관련된 질병을 치료 또는 예방한다.

본 발명의 치료 방법은 또한 개체에 항-PSMA 항체를 다른 제제 예를 들어, 항 종양제(항체 조성물과 공동 작용하거나 또는 상승 작용하여 PSMA 발현과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 제제)와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 나타낸 바와 같이, 항-PSMA 항체인 7F12를 탁소텔®(도세탁셀)과 병용하면, 동물 모델에 있어서 종양의 성장을 억제하고, 동물의 종양 관련 악액질을 치유할 수도 있다(실시예 8 참조). 기작에 한정시키지 않고, 항 종양제를 사용하면, 종양 덩어리에 손상을 일으켜서, 항체, 효과기 세포 또는 대안적 효과기 성분의 침투 효과를 개선시키고, 그 결과 더욱 효과적인 세포 독성을 유도하는 것으로 생각된다. 하나의 구체예에서, 종양 덩어리를 손상시키는 항 종양제를 사용함으로써, 효과기 세포가 종양에 도달할 수 있게 되며, 그 결과 종양 세포의 더욱 효과적인 항체 의존 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 유도하게 된다. 다른 구체예에서, 항 종양제 예를 들어, 미세 소관 억제제를 사용하면, 종양 세포는 항-PSMA 매개 사멸에 대해 본질적으로 더욱 민감해진다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 항-PSMA 항체 및 항 종양제를 투여함으로 인하여 얻어진 상승 효과 또는 상가 효과는, 기저측 원형질 막에 대한 PSMA 항원의 정점 극성이 역전되는 것과는 독립적이다(즉, 영향을 받지 않는다).

본원에 사용된 "항-PSMA 항체"라는 용어는, 인간 전립선 특이 막 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 포함한다. 이러한 항체의 예로서는 본원에 기술된 항체, 미국 특허 출원 제10/059989호 및 PCT 공보 WO 03064606A3에 개시된 항체, 또는 미국 가명세서 출원 제60/660431호에 개시된 항체를 포함한다. 전술한 각 출원의 전체 내용은 본원에 참고용으로 인용되어 있다.

본원에 사용된 "항 종양제"란 용어는, 종양을 (예를 들어, 부분적으로 또는 전체적으로) 파괴하거나, 또는 종양을 파괴하는 것을 돕는 임의의 제제를 포함한다. 하나의 구체예에서, 항 종양제는 종양 덩어리를 손상시킬 수 있는데, 이로써 효과기 세포가 종양에 더욱 쉽게 접근할 수 있도록 만들어주며, 또한 이 종양 세포의 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 보다 효과적으로 만들어 준다. "항 종양제"란 용어는, 화학 요법 제제, 혈관 신생 억제제, 미세 소관 억제제, 면역 조정제, DNA 개입제/교차 결합제, DNA 합성 억제제, DNA-RNA 전사 조절제, 효소 억제제 및 유전자 조절제를 포함한다.

"화학 요법 제제"란 용어는, 암 예를 들어, 전립선암을 치료하는데에 사용될 수 있는 임의의 제제를 포함한다. 화학 효법 제제로서는 알킬화제, 대사 길항 물질, 식물 알칼로이드, 항 종양 항생제 및 스테로이드 호르몬을 포함한다. 상기 화학 요법 제제의 구체예로서는, 올-트랜스 레티논산(all-trans retinoic acid), 아미노글루테티미드, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신(블레녹산), 부설판(미엘레란), 카보플라틴, 카보플라티늄(파라플라틴), 카머스틴(BCNU), 카페시타빈, CCNU(로머스틴), 클로람부실(루케란), 2-콜로데옥시아데노신(2-CDA; 클라드리빈, 루스타틴), 시스-플라티늄(플라티놀), 시스플라틴(cis-DDP), 시스플라틴 블레오마이신 설페이트, 클로람부실, 사이클로포스파미드(사이톡사늘 CTX), 사이클로포스파미드 하이드록시우레아, 시타라빈((Ara-C; 시토신 아라비노시드), 도노루비신(세루비딘), 다카바진(DTIC; 디메틸트리아제노이미다졸카복사미드), 닥티노마이신(악티노마이신 D), 도노루비신(도노마이신; 루비도마이신), 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀(탁소텔), 독시플루리딘, 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 에티닐 에스트라도일, 에토파시드(VP-16, VePesid), 플루오로우라실(5-Fu; 플록스우리딘, 플루오로데옥시우리딘; FUdR), 플루다라빈(플루다라), 플루타미드, 플루옥시메스테론, 겜시타빈(겜자), 허셉틴(트래스투주맵; 항-HER 2 모노클로날 항체), 하이드록시우레아(하이드레아), 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 이다루비신, 이포스파미드(이펙스), 인테페론 알파, 이리노테칸(CPT-11), L-아스파라기나제, 루프롤리드, 메클로레타민, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜페란(알케란), 머캅토퓨린(6-머캅토퓨린; 6-MP), 메토트렉세이트(MTX; 아메토프테린), 미토마이신(미토마이신 C), 미토탄(o,p'-DDD), 미톡산트론(노반트론), 옥살리플라틴, 파클리탁셀(탁솔), 페메트렉세드, 펜토스타틴(2-데옥시코포르마이신), 플리카마이신(미트라마이신), 프레드니손, 프로카바진(마튤란; N-메틸히드라진, MIH), 리툭신(리툭시맵), 세머스틴(메틸-CCNU), 스트렙토조신, 탁솔, 타목시펜, 테니포시드, 테르티포시드, 테스토스테론 프로피오네이트, 티오구아닌(6-티오구아닌; TG), 티오테파, 토무덱스(랄티트렉세드), 토포테칸(하이캠틴; (S)-1O-[(디메틸아미노)메틸]-4-에틸-4,9-디하이드록시-1H-피라노[(3',4'), 트레오설판(오바스타트), 발루비신, 빈블래스틴(VLB; 벨반), 빈크리스틴(온코빈), 빈데신 및 비노렐빈(나벨빈)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

"미세 소관 차단제"란 용어는, 미세 소관의 정상적인 조직 형성 및 이동을 교란시킬 수 있는 임의의 제제를 포함하는 의미이다. 미세 소관 억제제의 예로서는 탁산(탁솔®(파클리탁셀), 탁소텔®(도세탁셀)), 빙카 알칼로이드(빈블래스틴, 빈크리스틴(온코빈), 빈데신(엘디신, 필데신), 비노렐빈(노벨빈)), 2-메톡시에스트라디올(2ME2), 에스트라머스틴, 에포틸론, 콜히친, 돌라스타틴 15, 노코다졸, 포도필로톡신, 리족신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

"혈관 신생 억제제" 및 "항 혈관 신생 제제"라는 용어는, 본원에서 호환적으로 사용되는 용어로서, 혈관의 형성을 예방 또는 억제할 수 있는 임의의 제제를 포함하는 의미이다. 혈관 신생 억제제에 관한 구체예로서는 안지오스타틴 K1-3, 어레스텐, aaAT, 칸스타틴, DL-α-디플루오로메틸-오르니틴, 엔도스타틴, 푸마길린, 제니스타인, 미노사이클린, 스토로스포린, (±)-탈리도미드 및 텀스타틴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

"면역 조정 제제"란 용어는, 면역 반응을 조정 예를 들어, 촉진하는 임의의 제제를 포함하는 의미이다. 면역 조정 제제의 예로서는 항체 예를 들어, 항-PD1 항체 및 항-CTLA-4 항체 단독 또는 문헌[미국 가명세서 출원 제60/679,466호(2005년 5월 9일 출원); PCT 공보 WO 01/14424; 미국 가명세서 출원 제60/738,434호(2005년 11월 21일 출원); 및 미국 가명세서 출원 (2005년 12월 8일 출원)(Attorney Docket No. MEDEX-0124US2 또는 04280/1203401-US1)(상기 문헌의 전체 내용은 각각 본원에 참고용으로 인용됨]에 개시된 것과 같은 조합체를 포함한다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 추가의 면역 조정 제제로서는, 보조 자극 신호(costimulatory signal)(예를 들어, CD28 또는 ICOS)를 차단하는 항체, CTLA4를 통하여 억제 신호를 활성화하는 항체 및/또는 기타 면역 세포 마커(예를 들어, CD40, CD40 리간드 또는 시토킨)에 대한 항체, 융합 단백질(예를 들어, CTLA4-Fc, PD-1-Fc), 그리고 면역 억제 약물(예를 들어, 라파마이신, 사이클로스포린 A 또는 FK506)을 포함한다. 면역 조정 제제의 기타 예로서는 포스포로티올레이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드(1018 ISS), GVAX(GM-CSF 유전자 백신), 인터루킨(예를 들어, 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7(CYT 99 07), -8, -9, -10, -11, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29 및 -30), 예를 들어, 재조합 인터루킨 항체 예를 들어, IL-2 예를 들어, 알데스루킨 예를 들어, 재조합 인터루킨(예를 들어, 재조합 인터루킨-21(rIL-21)) 예를 들어, IL-11 예를 들어, 오프렐베킨(oprelvekin) 예를 들어, 인터루킨 수용체 길항제 예를 들어, IL-1 수용체 길항제 예를 들어, 아나킨라(anakinra), 글루코세레브로시다제 예를 들어, 이미글루세라제, 대식 세포 활성화 인자, 대식 세포 펩티드, B 세포 인자 및 T 세포 인자를 포함한다.

DNA 개입제/교차 결합제의 예로서는 블레오마이신, 카보플라틴, 카머스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, cis-디아민플레티늄 디클로라이드(시스플라틴), 멜파란, 미토잔트론 및 옥살리플라틴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

DNA 합성 억제제의 예로서는 (±)-아메토프테린(메토트렉세이트), 3-아미노-1,2,4-벤조트리아진, 1,4-디옥사이드, 아미노프테린, 시토신 β-D-아라비노푸라노시드, 5-플루오로-5'-데옥시우리딘, 5-플루오로우라실, 갠사이클로비어, 하이드록시우레아 및 미토마이신 C를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

DNA-RNA 전사 조절제의 예로서는 악티노마이신 D, 도노루비신, 독소루비신, 호모해링토닌 및 이다루비신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

효소 억제제의 예로서는 S(+)-캄프토테신, 커큐민, (-)-디구엘린, 5,6-디클로로벤즈-이미다졸 1-β-D-리보푸라노시드, 에토포시드, 포르메스탄, 포스트리에신, 히스피딘, 2-이미노-1-이미다졸리딘아세트산(사이클로크레아틴), 메비놀린, 트리코스타틴 A, 티르포스틴 AG 34 및 티르포스틴 AG 879를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

유전자 조절제의 예로서는 5-아자-2'-데옥시시티딘, 5-아자시티딘, 콜레칼시페롤(비타민 D3), 4-하이드록시타목시펜, 멜라토닌, 미페프리스톤, 랄록시펜, 올-트랜스 레티날(비타민 A 알데히드), 레티논산, 올-트랜스(비타민 A 산), 9-cis-레티논산, 13-cis-레티논산, 레티놀(비타민 A), 타목시펜 및 트로글리타존을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 또한 PSMA 발현과 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위하여, 개체에 면역 컨쥬게이트(항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부가 치료제 예를 들어, 세포 독소 또는 방사성 동위 원소와 결합되어 있음)를, 항체 조성물과 연합하여 작용하거나 또는 상승 작용하는 항 종양제와 함께 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 또한 PSMA 발현과 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위하여, 개체에 이중 특이적 분자(항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부가, 항체의 결합 특이성과 상이한 결합 특이성을 가지는 제2의 작용부와 결합되어 있음)를, 항체 조성물과 연합하여 작용하거나 또는 상승 작용하는 항 종양제와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 항 종양제는 당 업계에 공지되어 있거나 또는 본원에 기술된 바와 같이 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다("약학 조성물" 참조)

항-PSMA 항체는 하나의 항 종양제와 함께 투여될 수 있다. 항-PSMA 항체는 또한 2개 이상의 항 종양제와 함께 투여될 수도 있다.

항-PSMA 항체 및 항 종양제는 동시에 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-PSMA 항체 및 항 종양제는 단일 약학 제형으로서 함께 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 항-PSMA 항체 및 항 종양제는 2개 이상의 개별 약학 제형으로서 동시에 투여될 수 있다.

항-PSMA 항체 및 항 종양제는 또한 상이한 시기에 투여될 수도 있다. 예를 들어, 항 종양제(들)는 항-PSMA 항체를 투여하기 전에 투여될 수도 있다(예를 들어, 항-PSMA 항체를 투여하기 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 24 또는48 시간 전). 대안적으로, 상기 항-PSMA 항체는 항 종양제(들)를 투여하기 이전에 투여될 수 있다(예를 들어, 항 종양제(들)를 투여하기 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 24 또는 48 시간 전). 하나의 구체예에서, 항-PSMA 항체는 본원의 표 1에 나타낸 바와 같은 투여 스케쥴에 따라서 항 종양제와 함께 투여될 수 있다.

키트

본 발명의 범위 내에는 본 발명의 항체와 사용 지침을 포함하는 키트도 포함된다. 이러한 키트는 또한 하나 이상의 추가 시약 예를 들어, 면역 자극 시약, 세포 독성 제제 또는 방사성 독성 제제, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가 항체(예를 들어, 제1 항체와 구별되는 항체 즉, PSMA 항원 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 가지는 항체)를 함유할 수도 있다. 이 키트는 통상적으로 키트의 내용물에 관한 의도로 하는 용법을 나타내는 표지를 포함한다. "표지"라는 용어는, 키트 상에 제공되어 있거나 또는 이 키트에 부착되어 있는 임의의 지시 사항이나 기록된 사항을 포함하거나, 또는 이 키트에 첨부된 임의의 지시 사항이나 기록된 사항을 포함하는 의미이다.

본 발명은 이하 실시예를 통하여 더욱 자세히 기술되어 있지만, 이하 실시예는 본 발명을 추가로 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 될 것이다. 본원에 전반적으로 인용된 모든 도면과 참고 문헌들, 특허 및 공개된 특허 출원들의 내용은 본원에 참고용으로서 인용되어 있음을 밝힌다.

도 1a는 1C3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 33) 및 아미노산 서열(서열 번호 1)을 나타내는 것이다. CDR1(서열 번호 9), CDR2(서열 번호 13) 및 CDR3(서열 번호 17) 부위는 밑줄쳐서 표시하였으며, V, D 및 J 생식 계열 계통도 표시하였다.

도 1b는 1C3 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변부의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 37) 및 아미노산 서열(서열 번호 5)을 나타내는 것이다. CDR1(서열 번호 21), CDR2(서열 번호 25) 및 CDR3(서열 번호 29) 부위는 밑줄쳐서 표시하였으며, V 및 J 생식 계열 계통도 표시하였다.

도 2a는 2A10 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 34) 및 아미노산 서열(서열 번호 2)을 나타내는 것이다. CDR1(서열 번호 10), CDR2(서열 번호 14) 및 CDR3(서열 번호 18) 부위는 밑줄쳐서 표시하였으며, V 및 J 생식 계열 계통도 표시하였다.

도 2b는 2A10 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변부의 뉴클레오티드 서열(서 열 번호 38) 및 아미노산 서열(서열 번호 6)을 나타내는 것이다. CDR1(서열 번호 22), CDR2(서열 번호 26) 및 CDR3(서열 번호 30) 부위는 밑줄쳐서 표시하였으며, V 및 J 생식 계열 계통도 표시하였다.

도 3a는 2F5 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 35) 및 아미노산 서열(서열 번호 3)을 나타내는 것이다. CDR1(서열 번호 11), CDR2(서열 번호 15) 및 CDR3(서열 번호 19) 부위는 밑줄쳐서 표시하였으며, V 및 J 생식 계열 계통도 표시하였다.

도 3b는 2F5 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변부의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 39) 및 아미노산 서열(서열 번호 7)을 나타내는 것이다. CDR1(서열 번호 23), CDR2(서열 번호 27) 및 CDR3(서열 번호 31) 부위는 밑줄쳐서 표시하였으며, V 및 J 생식 계열 계통도 표시하였다.

도 4a는 2C6 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 36) 및 아미노산 서열(서열 번호 4)을 나타내는 것이다. CDR1(서열 번호 12), CDR2(서열 번호 16) 및 CDR3(서열 번호 20) 부위는 밑줄쳐서 표시하였으며, V 및 J 생식 계열 계통도 표시하였다.

도 4b는 2C6 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변부의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 40) 및 아미노산 서열(서열 번호 8)을 나타내는 것이다. CDR1(서열 번호 24), CDR2(서열 번호 28) 및 CDR3(서열 번호 32) 부위는 밑줄쳐서 표시하였으며, V 및 J 생식 계열 계통도 표시하였다.

도 5는 인간 생식 계열 V_H 3-30.3 아미노산 서열(서열 번호 41) 및 JH6b 생식 계열(서열 번호 45)을 가지는 1C3(서열 번호 1)의 중쇄 가변부의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다.

도 6은 인간 생식 계열 V_H 5-51 아미노산 서열(서열 번호 42)을 가지는 2A10 (서열 번호 2), 2F5(서열 번호 3) 및 2C6(서열 번호 4)의 중쇄 가변부의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다.

도 7은 인간 생식 계열 Vκ L18 아미노산 서열(서열 번호 43) 및 JK4 생식 계열(서열 번호 46)을 가지는 1C3(서열 번호 5), 2A10(서열 번호 6) 및 2F5(서열 번호 7의 1∼107번 잔기)의 경쇄 가변부의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다.

도 8은 인간 생식 계열 Vκ L6 아미노산 서열(서열 번호 44) 및 JK3 생식 계열(서열 번호 47)을 가지는 2C6(서열 번호 8)의 경쇄 가변부의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다.

도 9는 인간 PSMA에 대하여 유도된 인간 모노클로날 항체인 2F5, 2A10 및 2C6이 PSMA-발현 LNCaP 세포의 세포 표면과 결합함을 보여주는 유동성 혈구 계측 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 10은 인간 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체가 LNCaP 세포로부터 정제된 PSMA와 특이적으로 결합함을 보여주는 ELISA 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 11의 A∼B는 인간 PSMA에 대하여 유도된 인간 모노클로날 항체인 2A10 및 7F12가 PSMA-발현 LNCaP 전립선암 세포와의 결합에 대하여 경쟁함을 보여주는 항체 결합 경쟁 연구 결과를 나타내는 것이다. 도 11의 A는 냉각 7F12 항체와 ¹²⁵I-2A10이 경쟁함을 보여주는 것이다. 도 11의 B는 냉각 2A10 항체와 ¹²⁵I-7F12가 경쟁함을 보여주는 것이다.

도 12의 A∼B는 인간 PSMA에 대하여 유도된 인간 모노클로날 항체인 2A10이 PSMA-발현 LNCaP 전립선암 세포에 도입됨을 ³H-티미딘 방출 검정법에 의해 입증하는 내재화 실험(internalization experiment) 결과를 나타내는 것이다. 도 12의 A는 항체를 도입시키기 2시간 전에 접종한 LNCaP 세포에 대한 결과를 나타내는 것이다. 도 12의 B는 항체를 도입시키기 전 밤새도록 접종한 LNCaP 세포에 대한 결과를 나타내는 것이다.

도 13의 A∼B는 다음과 같은 물질들 또는 물질의 조합 중 어느 하나로 처리된 마우스에 대한 LNCaP 종양 이종 이식편의 성장량 평균값 및 중앙값 곡선을 나타내는 그래프이다: 항-PSMA 7F12 항체, 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산(Rituxan), 탁소텔(2 ㎎/㎏), 탁소텔(4 ㎎/㎏), 항-PSMA 7F12 항체 + 탁소텔(2 ㎎/㎏), 항-PSMA 7F12 항체 + 탁소텔(4 ㎎/㎏), 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산 + 탁소텔(2 ㎎/㎏), 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산 + 탁소텔(4 ㎎/㎏), 또는 PBS. 도 13의 C∼D는 다음과 같은 물질들 또는 물질의 조합중 어느 하나로 처리된 LNCaP 종양-보유 마우스의 체중 변화율의 평균값 및 중앙값을 나타내는 그래프이다: 항-PSMA 7F12 항체, 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산(Rituxan), 탁소텔(2 ㎎/㎏), 탁소텔(4 ㎎/㎏), 항-PSMA 7F12 항체 + 탁소텔(2 ㎎/㎏), 항-PSMA 7F12 항체 + 탁소텔(4 ㎎/㎏), 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산 + 탁소텔(2 ㎎/㎏), 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산 + 탁소텔(4 ㎎/㎏), 또는 PBS.

도 14의 A∼B는 다음과 같은 물질들 중 어느 하나로 처리된 마우스에 대한 LNCaP 종양 이종 이식편의 성장량 평균값 및 중앙값 곡선을 나타내는 그래프이다: 항-PSMA 7F12 항체, 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산, 또는 PBS. 도 14의 C∼D는 다음과 같은 물질들 중 어느 하나로 처리된 LNCaP 종양-보유 마우스의 체중 변화율의 평균값 및 중앙값을 나타내는 그래프이다: 항-PSMA 7F12 항체, 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산, 또는 PBS.

도 15의 A∼B는 다음과 같은 물질들 또는 물질의 조합 중 어느 하나로 처리된 마우스에 대한 LNCaP 종양 이종 이식편의 성장량 평균값 및 중앙값 곡선을 나타내는 그래프이다: 탁소텔(4 ㎎/㎏), 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산 + 탁소텔(4 ㎎/㎏), 항-PSMA 7F12 항체 + 탁소텔(4 ㎎/㎏), 또는 PBS. 도 15의 C∼D는 다음과 같은 물질들 또는 물질의 조합 중 어느 하나로 처리된 LNCaP 종양 보유 마우스의 체중 변화율의 평균값 및 중앙값을 나타내는 그래프이다: 탁소텔(4 ㎎/㎏), 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산 + 탁소텔(4 ㎎/㎏), 항-PSMA 7F12 항체 + 탁소텔(4 ㎎/㎏), 또는 PBS.

도 16의 A∼B는 다음과 같은 물질들 또는 물질의 조합 중 어느 하나로 처리된 마우스에 대한 LNCaP 종양 이종 이식편의 성장량 평균값 및 중앙값 곡선을 나타내는 그래프이다: 탁소텔(2 ㎎/㎏), 항-PSMA 7F12 항체 + 탁소텔(2 ㎎/㎏), 동 기 준 표본 대조구 항체인 리툭산 + 탁소텔(2 ㎎/㎏), 또는 PBS. 도 16의 C∼D는 다음과 같은 물질들 또는 물질의 조합 중 어느 하나로 처리된 LNCaP 종양 보유 마우스의 체중 변화율의 평균값 및 중앙값을 나타내는 그래프이다: 탁소텔(2 ㎎/㎏), 항-PSMA 7F12 항체 + 탁소텔(2 ㎎/㎏), 동 기준 표본 대조구 항체인 리툭산 + 탁소텔(2㎎/㎏), 또는 PBS.

도 17의 A∼B는 독소-컨쥬게이트화 인간 모노클로날 항-PSMA 항체를 사용하여 (A) 3시간 동안 세척한 경우 및 (B) 연속적으로 세척한 경우, 전립선암 세포에 대한 세포 독성을 나타냄을 입증하는 세포 증식 검정법의 결과를 나타내는 것이다.

도 18은 동 기준 표본 대조구 항체-약물 컨쥬게이트, αPSMA 항체-약물 컨쥬게이트, 또는 컨쥬게이트화 완충액(단독)(비이클)을 투여한 마우스의 경시적 종양 부피 변화를 나타내는 그래프이다.

도 19는 αPSMA 항체-약물 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트화 완충액(단독)(비이클)을 다양한 양으로 투여한 마우스의 경시적 종양 부피 변화를 나타내는 그래프이다.

도 20은 동 기준 표본 항체-약물 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트화 완충액(단독)(비이클)을 다양한 양으로 투여한 마우스의 경시적 종양 부피 변화를 나타내는 그래프이다.

도 21은 동 기준 표본 대조구 항체-약물 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트화 완충액(단독)(비이클)을 다양한 양으로 투여한 마우스의 경시적 체중 변화를 나타내는 그래프이다.

도 22는 αPSMA 항체-약물 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트화 완충액(단독)(비이클)을 다양한 양으로 투여한 마우스의 경시적 체중 변화를 나타내는 그래프이다.

도 23은 초기 평균 종양 부피가 240 ㎣인 종양, 동 기준 표본 대조구 항체-약물 컨쥬게이트, αPSMA 항체-약물 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트화 완충액(단독)(비이클)이 투여된 마우스에 있어서 경시적 종양 부피 변화를 나타내는 그래프이다.

도 24는 초기 평균 종양 부피가 430 ㎣인 종양, αPSMA 항체-약물 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트화 완충액(단독)(비이클)이 투여된 마우스에 있어서 경시적 종양 부피 변화에 관한 그래프이다.

실시예 1: PSMA 에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성

항원

면역화 과정에서는 항원 세포로서 PSMA 발현 전립선암 세포주 LNCaP(ATCC CRL-1740)를 사용하였다.

트랜스게닉 HuMab 마우스

PSMA에 대한 항체 즉, 완전히 인간의 것인 모노클로날 항체를 HuMab 트랜스게닉 마우스(인간 항체 유전자 발현)의 HCo12 변종을 사용하여 제조하였다. 이 마우스 변종에 있어서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌[Chen외 다수(1993) EMBO J. 12:811-820]에 개시된 바와 같이 한 쌍의 염색체상 동일 위치가 파괴되어 있으며(homozygously disrupted), 내인성 마우스 중쇄 유전자는 문헌[PCT 공보 WO 01/09187의 "실시예 1"]에 개시된 바와 같이 한 쌍의 염색체상 동일 위치가 파괴되어 있다. 뿐만 아니라, 이 마우스 변종은 문헌[Fishwild외 다수(1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기술된 바와 같이 인간 카파 경쇄 트랜스 유전자인 KCo5와, 문헌[PCT 공보 WO 01/09187의 "실시예 2"]에 개시된 바와 같이 인간 중쇄 트랜스 유전자인 HCo12를 보유하고 있다.

HuMab 면역화

PSMA에 대한 항체 즉, 완전히 인간의 것인 모노클로날 항체를 생성하기 위하여, 항원으로서 PSMA를 발현하는 LNCaP 세포를 사용하여 이 HuMab 마우스를 면역화하였다. HuMab 마우스에 대한 일반적 면역화 방법에 관하여는 문헌[Lonberg, N.외 다수(1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.외 다수(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 및 PCT 공보 WO 98/24884]에 기술되어 있다. 이 마우스에 첫 번째 항원을 주입하였을 때의 마우스는 6∼16주령 마우스였다. 5∼10 × 10⁶개의 세포를 복강 내(IP) 주사, 피하(Sc) 주사 또는 풋 패드 주사(footpad injection)하여 HuMab 마우스를 면역화시켰다.

트랜스게닉 마우스를 완전 프룬트 애쥬반트 또는 리비(Ribi) 애쥬반트 중 항원으로 2회 IP 면역화시킨 후, 불완전 프룬트 애쥬반트 또는 리비 애쥬반트 중 항원으로 3∼21일 동안 IP 면역화시켰다(총 11회 이하 면역화 실시). 역 안와 채혈(retroorbital bleed)에 의해 면역 반응을 관찰하였다. 혈장은 ELISA(전술함)에 의해 스크리닝하고, 항-PSMA 인간 면역 글로불린이 충분한 역가를 나타내는 마우스 는 융합(fusion)용으로 사용하였다. 마우스를 안락사시키기 3일 전에 항원을 정맥 내 투여하여 면역 증강시킨 후, 비장을 제거하였다. 통상적으로, 각 항원에 대하여 10∼35회 융합시켰다. 수십 마리의 마우스를 각 항원에 대해 면역화시켰다.

항- PSMA 항체 생산 HuMab 마우스의 선택

PSMA와 결합하는 항체를 생산하는 HuMab 마우스를 선택하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 얻은 혈청이, PSMA 발현 전립선암 세포주 LNCaP와는 결합하되 네거티브 전립선암 세포주와는 결합하지 않는지 여부에 대하여 유동성 혈구 계측법으로 스크리닝하였다. 요약하면, LNCaP 세포를 항-PSMA 항체(20 ㎍/㎎)와 함께 항온 처리하여 항-PSMA 항체의 결합 여부를 평가하였다. 이 세포들을 세척한 다음, FITC-표지화 항-인간 IgG Ab로 결합 여부를 확인하였다. FACScan 유동성 혈구 계측기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 유동성 혈구 계측 분석법을 수행하였다. PSMA 발현 LNCaP 세포와는 결합하되, 비-PSMA 발현 전립선암 세포와는 결합하지 않는 항체를 문헌[Fishwild, D.외 다수(1996)]에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 PSMA와 결합하는지 여부에 대하여 추가로 시험하였다. 요약하면, 미세 역가 평판을 정제 PSMA(PBS 중 1∼2 ㎍/㎖, 100 ㎕/웰)로 코팅한 다음, 이를 4℃에서 밤새도록 항온 처리하고, 다시 PBS/Tween(0.05%) 중 5% 소 태아 혈청(200 ㎕/웰)으로 블로킹하였다. PSMA-면역화 마우스로부터 얻은 혈청을 희석시킨 후, 이를 각 웰에 넣고, 다시 상온에서 1∼2 시간 동안 항온 처리하였다. 상기 평판을 PBS/Tween으로 세척한 다음, 실온에서 1 시간 동안 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 컨쥬게이트화된 염소-항-인간 IgG 폴리클로날 항체와 함께 항온 처리하였다. 세척한 다음, 평판 을 ABTS 기질(Sigma, A-1888, 0.22 ㎎/㎖)을 사용하여 전개시키고, OD 415∼495에서 분광계로 분석하였다. 항-PSMA 항체의 역가가 가장 높게 나타났던 마우스를 융합용으로 사용하였다. 이하에 기술된 바와 같이 융합을 수행하였으며, 하이브리도마 상청액은 항-PSMA 활성에 대해 시험하였다(ELISA 이용).

PSMA 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조

HuMab 마우스로부터 분리된 마우스 비장 세포를 PEG와 함께 표준적인 방법에 따라서 마우스 골수종 세포주에 융합시켰다. 이후, 결과로 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산 여부에 대해 스크리닝하였다. 면역화된 마우스로부터 유래하는 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 1/4 SP2/0인 비-분비형 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 50% PEG(Sigma)와 함께 융합시켰다. 세포를 약 1×10⁵/웰 만큼 편평 바닥 미세 역가 평판에 도말한 후, 10% 소 태아 혈청, 10% P388D1(ATCC, CRL TIB-63) 컨디셔닝 배지, DMEM 중 3∼5% 오리겐(IGEN)(Mediatech, CRL 10013, 고 농도 글루코스, L-글루타민 및 피루브산나트륨 함유) + 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캡토에탄올, 50 ㎎/㎖ 젠타마이신 및 1 × HAT(Sigma, CRL P-7185)를 함유하는 선별 배지 중에서 약 2주 동안 항온 처리하였다. 1∼2주 경과 후, 세포를 배지(HAT를 HT로 대체한 배지) 중에서 배양하였다. 이후, 각 웰을 ELISA(전술함)를 이용하여 인간 항-PSMA 모노클로날 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 일단 하이브리도마가 과도하게 성장하면, 일반적으로 10∼14일 경과후에 배지를 관찰하였다. 만일 인간 IgG에 대해 여전히 양성 반응을 나타내면, 항체-분비 하이브리도마를 다시 도말 하여, 이를 다시 스크리닝하였으며, 항-PSMA 모노클로날 항체는 희석을 제한함으로써 2회 이상 서브클로닝하였다. 이후, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여, 추가 특성 규명용인 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 생성시켰다.

하이브리도마 클론인 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6을 추가 분석용으로 선택하였다.

실시예 2: 인간 모노클로날 항체인 1 C3 , 2A10, 2F5 및 2 C6 의 구조적 특성 규명

표준적인 PCR 기술을 사용하여 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변부를 암호화하는 cDNA 서열을 각각 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6 하이브리도마로부터 얻어서, 이를 표준적인 DNA 서열 결정 기술을 사용하여 서열 결정하였다.

1C3의 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1a에 각각 서열 번호 33 및 서열 번호 1로 나타내었다.

1C3의 경쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1b에 각각 서열 번호 37 및 서열 번호 5로 나타내었다.

1C3 중쇄 면역 글로불린 서열과 공지의 인간 생식 계열 면역 글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 1C3 중쇄는 인간 생식 계열 V_H 3-30.3으로부터 유래하는 V_H 분절, 미결정 D 분절, 그리고 인간 생식 계열 JH 6b로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 1C3 V_H 서열을 생식 계열 V_H3-30.3 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 5에 나타내었다. CDR 부위 결정에 관한 캐벗 시스템(Kabat system)을 사 용하여 1C3 V_H 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 부위를 도 1a 및 5에 각각 서열 번호 9, 13 및 17로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식 계열 면역 글로불린 경쇄 서열과 1C3 경쇄 면역 글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 1C3 경쇄는 인간 생식 계열 VK L18로부터 유래하는 V_L 분절과, 인간 생식 계열 JK4로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 1C3 V_L 서열을 생식 계열 VK L18 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 7에 나타내었다. CDR 부위 결정에 관한 캐벗 시스템을 이용하여 1C3 V_L 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 부위를 도 1b 및 7에 각각 서열 번호 21, 25 및 29로 나타낼 수 있었다.

2A10의 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 2a에 각각 서열 번호 34 및 2로 나타내었다.

2A10의 경쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 2b에 각각 서열 번호 38 및 6으로 나타내었다.

2A10 중쇄 면역 글로불린 서열과 공지의 인간 생식 계열 면역 글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 2A10 중쇄는 인간 생식 계열 V_H 5-51로부터 유래하는 V_H 분절, 인간 생식 계열 7-27로부터 유래하는 D 분절, 그리고 인간 생식 계열 JH2로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 2A10 V_H 서열을 생식 계열 V_H 5-51 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 6에 나타내었다. CDR 부위 결정에 관한 캐벗 시스 템을 사용하여 2A10 V_H 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 부위를 도 2a 및 6에 각각 서열 번호 10, 14 및 18로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식 계열 면역 글로불린 경쇄 서열과 2A10 경쇄 면역 글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 2A10 경쇄는 인간 생식 계열 VK L18로부터 유래하는 V_L 분절과, 인간 생식 계열 JK4로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 2A10 V_L 서열을 생식 계열 VK L18 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 7에 나타내었다. CDR 부위 결정에 관한 캐벗 시스템을 이용하여 2A10 V_L 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 부위를 도 2b 및 7에 각각 서열 번호 22, 26 및 30으로 나타낼 수 있었다.

2F5의 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 3a에 각각 서열 번호 35 및 3으로 나타내었다.

2F5의 경쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 3b에 각각 서열 번호 39 및 7로 나타내었다.

2F5 중쇄 면역 글로불린 서열과 공지의 인간 생식 계열 면역 글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 2F5 중쇄는 인간 생식 계열 V_H 5-51으로부터 유래하는 V_H 분절, 인간 생식 계열 7-27로부터 유래하는 D 분절, 그리고 인간 생식 계열 JH 2로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 2F5 V_H 서열을 생식 계열 V_H 5-51 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 6에 나타내었다. CDR 부위 결정에 관한 캐벗 시스템을 사용하여 2F5 V_H 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 부위를 도 3a 및 6에 각각 서열 번호 11, 15 및 19로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식 계열 면역 글로불린 경쇄 서열과 2F5 경쇄 면역 글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 2F5 경쇄는 인간 생식 계열 VK L18로부터 유래하는 V_L 분절과, 인간 생식 계열 JK4로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 2F5 V_L 서열을 생식 계열 VK L18 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 7에 나타내었다. CDR 부위 결정에 관한 캐벗 시스템을 이용하여 2F5 V_L 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 부위를 도 3b 및 7에 각각 서열 번호 23, 27 및 31로 나타낼 수 있었다.

2C6의 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 4a에 각각 서열 번호 36 및 4로 나타내었다.

2C6의 경쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 4b에 각각 서열 번호 40 및 8로 나타내었다.

2C6 중쇄 면역 글로불린 서열과 공지의 인간 생식 계열 면역 글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 2C6 중쇄는 인간 생식 계열 V_H 5-51으로부터 유래하는 V_H 분절, 인간 생식 계열 6-13으로부터 유래하는 D 분절, 그리고 인간 생식 계열 JH 4b로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 2C6 V_H 서열을 생식 계열 V_H 5-51 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 6에 나타내었다. CDR 부위 결정에 관한 캐 벗 시스템을 사용하여 2C6 V_H 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 부위를 도 4a 및 6에 각각 서열 번호 12, 16 및 20으로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식 계열 면역 글로불린 경쇄 서열과 2C6 경쇄 면역 글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 2C6 경쇄는 인간 생식 계열 VK L6으로부터 유래하는 V_L 분절과, 인간 생식 계열 JK3으로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 2C6 V_L 서열을 생식 계열 VK L6 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 8에 나타내었다. CDR 부위 결정에 관한 캐벗 시스템을 이용하여 2C6 V_L 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 부위를 도 4b 및 8에 각각 서열 번호 24, 28 및 32로 나타낼 수 있었다.

실시예 3: 항- PSMA 인간 모노클로날 항체의 결합 특이성 규명

본 실시예에서는, 결합 특이성을 PSMA 발현 전립선암 세포주 상에서의 유동성 혈구 계측법과, 정제된 PSMA를 이용하는 ELISA에 의해 관찰하였다.

유동성 혈구 계측법에 의한 결합 특이성

인간의 PSMA-발현 전립선암 세포주인 LNCaP를 유동성 혈구 계측법에 의해 항-PSMA 인간 모노클로날 항체의 특이성을 측정하는데에 사용하였다. 2F5, 2A10 및 2C6 항-PSMA 인간 모노클로날 항체의 결합 여부는, LNCaP 세포와 항-PSMA 인간 모노클로날 항체를 농도를 달리하여 항온 처리함으로써 평가하였다. 상기 세포를 세척하고, FITC-표지화된 항-인간 IgG Ab로 결합 여부를 확인하였다. FACScan 유동성 혈구 계측기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 유동성 혈구 계측 분석 법을 수행하였다. 인간의 항-PSMA 모노클로날 항체 7F12(PCT 공보 WO 03/064606에 개시)를 포지티브 대조구로 사용하였고, 비-PSMA 특이 동 기준 표본 대조구 항체는 네거티브 대조구로서 사용하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 항-PSMA 인간 모노클로날 항체인 2F5, 2A10 및 2C6은 PSMA-발현 LNCaP 세포에 특이적으로 결합하였다.

ELISA 에 의한 결합 특이성

표준적 ELISA에 의해 면역 정제된 PSMA과 항-PSMA 항체의 결합 능을 비교함으로써, PSMA에 대한 특이성을 관찰하였다.

PSMA를 LNCaP 세포로부터 면역 정제하고, 이것이 항-PSMA 인간 모노클로날 항체인 1C3, 2A10, 2F5 및 2C6과 결합하는지 여부에 대하여 시험하였다. 표준적인 ELISA 방법을 수행하였다. 항-PSMA 인간 모노클로날 항체를 가하고(5 ㎍/㎖), 이를 1:2로 연속 희석하여 역가를 낮추었다. 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 컨쥬게이트화된, 염소-항-인간 IgG(카파 사슬-특이적) 폴리클로날 항체를 2차 항체로서 사용하였다. 인간 항-PSMA 모노클로날 항체인 7F12를 포지티브 대조구로서 사용하였으며, 블랭크(blank)는 네거티브 대조구로서 사용하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 항-PSMA 인간 모노클로날 항체인 2A10 및 2F5는 PSMA와 고 특이성으로 결합하였다. 항-PSMA 인간 모노클로날 항체인 1C3 및 2C6은 ELISA 검정법에서 검출 가능하였으나, 낮은 수준으로만 PSMA와 결합하였는데, 이는 곧 이 항체가 ELISA 검정법에서 감추어진 에피토프에 결합함을 말해주는 것이다.

실시예 4: 항- PSMA 모노클로날 항체의 결합 친화도에 관한 스캐처드 분석법

스캐쳐드 분석법을 이용하여 PSMA-발현 전립선암 LNCaP 세포주에 대한 2A10 항체의 결합 친화성을 시험하였다.

LNCaP 세포는 ATCC(CRL-1740)로부터 얻었으며, 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 배지 중에서 생육시켰다. 이 세포를 트립신 처리하고 Tris계 결합 완충액[24mM Tris pH 7.2, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 0.1% BSA] 중에서 1회 세척한 다음, 세포 농도를 결합 완충액 중 2×10⁶ 세포/㎖로 맞추었다. 밀리포어(Millipore) 평판(MAFB NOB)을 수중 1% 무지방 분유로 코팅한 후 이를 4℃에서 밤새도록 보관하였다. 이후, 이 평판을 0.2 ㎖의 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 50㎕의 완충액(단독)을 결합이 최대로 일어난 웰에 가하였다(총 결합; total binding). 25㎕의 완충액(단독)을 대조구 웰에 가하였다(비-특이적 결합). 여러 농도의 ¹²⁵I-항-PSMA 항체를 모든 웰에 부피 25㎕로 가하였다. 여러 농도의 비표지화 항체(100배 과량)를 대조구 웰에 가하였으며(부피 25㎕), 결합 완충액 중 LNCaP 세포(2×10⁶ 세포/㎖) 25㎕는 모든 웰에 가하였다. 이후, 이 평판을 4℃의 진탕 배양기(200 rpm)에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리를 종결시키고 나서, 0.2㎖의 냉각 세척 완충액[24mM Tris pH 7.2, 50OmM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 0.1% BSA]으로 밀리포어 평판을 3회 세척하였다. 필터를 제거하고 감마 계측기에서 계수하였다. 프리즘 소프트웨어(San Diego, CA)를 이용하는 단일 위치 결합 매개 변수(single site binding parameter)를 사용하여 평형 결합(equilibrium binding) 평가를 수행하였다.

상기 스캐처드 결합 검정법을 이용하여, LNCaP 세포에 대한 2A10 항체의 K_D를 측정한 결과, 약 0.8 nM이었다.

실시예 5: 에피토프 경쟁 결합 검정법

경쟁 검정법을 이용하여, 항-PSMA 모노클로날 항체인 2A10을 공지의 항-PSMA 항체인 7F12(PCT 공보 WO 03/064606에 개시)와 비교함으로써, 상기 2개의 항체가 동일한 에피토프 부위에 결합하는지 여부를 관찰하였다.

LNCaP 세포는 ATCC(CRL-1740)로부터 입수하였으며, 이를 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 배지 중에서 생육시켰다. 이 세포를 트립신 처리하고 Tris계 결합 완충액[24mM Tris pH 7.2, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 0.1% BSA] 중에서 1회 세척한 다음, 세포 농도를 결합 완충액 중 2×10⁶ 세포/㎖로 맞추었다. 밀리포어(Millipore) 평판(MAFB NOB)을 수중 1% 무지방 분유로 코팅한 후 이를 4℃에서 밤새도록 보관하였다. 이후, 이 평판을 0.2 ㎖의 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 25㎕의 완충액(단독)을 대조구 웰(비-특이적 결합)에 가하였다. 일정 농도의 ¹²⁵I-항-PSMA 항체를 모든 웰에 부피 25㎕로 가하였다. 여러 농도의 비표지화 항체를 상기 웰에 가하였으며(부피 25㎕), 결합 완충액 중 LNCaP 세포(2×10⁶ 세포/㎖) 25㎕는 모든 웰에 가하였다. 이후, 이 평판을 4℃의 진탕 배양기(200 rpm)에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리를 종결시키고 나서, 0.2㎖의 냉각 세척 완충액[24mM Tris pH 7.2, 50OmM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 0.1% BSA]으로 밀리포어 평판을 3회 세척하였다. 필터를 제거하고 감마 계측기에서 계수하였다. 프리즘 소프트웨어(San Diego, CA)를 이용하는 단일 위치 결합 매개 변수를 사용하여 평형 결합 평가를 수행하였다. 동 기준 표본 대조구 항체를 네거티브 대조구로서 사용하였다. ¹²⁵I-2A10에 대한 경쟁 결합 결과를 도 11의 A에 나타내었으며, ¹²⁵I-7F12에 대한 경쟁 결합 결과는 도 11의 B에 나타내었다. 그 결과를 통하여, 비표지화 7F12 항체를 첨가할 경우에는 표지화된 2A10이 LNCaP 세포에 결합하는 것을 억제하고, 비표지화 2A10 항체를 첨가할 경우에는 표지화된 7F12가 LNCaP 세포에 결합하는 것을 억제함을 알 수 있었다. 이를 통하여, 상기 2A10 및 7F12 항-PSMA 항체는 동일하거나 또는 매우 유사한 PSMA 상 에피토프와 결합함을 입증할 수 있다.

실시예 6: 항- PSMA 모노클로날 항체의 내재화

Hum-Zap 내재화 검정법을 이용하여 항-PSMA HuMab이 PSMA-발현 전립선암 세포에 내재화되는 능력에 대해 시험하였다. Hum-Zap은 독소 사포닌에 컨쥬게이트화된 인간 IgG에 대한 친화도를 가지고 2차 항체와 결합함으로 인하여 1차 인간 항체가 내재화되는지 여부를 시험하는 방법이다.

PSMA-발현 전립선암 세포주인 LNCaP를 밤새도록 또는 다음날 2 시간 동안 100㎕의 웰 내에 2.5×10⁴ 세포/웰의 농도가 되도록 접종하였다. 항-PSMA 항체인 2A10 또는 7F12를 이 웰에 가하였다[출발 농도 = 30nM, 1:3으로 연속 희석시켜 역 가를 낮춤]. PSMA에 대해 비-특이적인 동 기준 표본 대조구 항체를 네거티브 대조구로서 사용하였다. Hum-Zap(Advanced Targeting Systems, IT-22-25)을 농도 11nM로 가하고, 평판을 48시간 동안 항온처리하였다. 이후, 상기 평판에 24시간 동안 1.0 μCi의 ³H-티미딘 펄스를 주고, 세포를 수집하여 이를 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Top Count Scintillation Counter; Packard Instruments)로 판독하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 항-PSMA 항체인 2A10의 농도는 PSMA-발현 LNCaP 전립선암 세포에 ³H-티미딘이 통합되는 양이 감소함에 따라서 감소함을 알 수 있었다. 이 데이터를 통하여, 항-PSMA 항체인 2A10은 전립선암 세포주에 내재화됨을 알 수 있다.

실시예 7: 시차 주사 열량 측정법에 의한 항- PSMA 모노클로날 항체의 열 안정성

항체의 용융점을 열량 측정 분석하여 항-PSMA 모노클로날 항체인 2A10의 열 안정성을 7F12 항체의 열 안정성과 비교하였다.

오토샘플러와 합체된 VP-모세관 DSC 시차 주사 미세 열량 측정 플랫폼(MicroCal LLC., Northampton, MA, USA) 상에서 용융점의 열량 측정을 수행하였다. 시료 세포의 부피는 0.144㎖이다. 항체의 글리코실화 및 탈 글리코실화 형태에 대한 변성 데이터는 시료를 가열함으로써 얻을 수 있었다[시료 농도 = 2.3μM, 30℃ → 90℃로 가열, 1℃/분]. 단백질 시료는 인산염-완충 염수(PBS)(pH 7.4) 중에 존재하였다. 동일한 완충액을 참고 셀 내에 담아 두어, 비교함으로써 몰당 열 용량 을 구하였다. 관찰된 온도 기록도의 기준선은 보정하고, 정규화된 데이터는 2-단계 모델을 바탕으로 하여 분석하였다[소프트웨어 오리진(Origin) 7.0 버전 사용]. 클론 7F12의 T_m이 63.05℃이었던 것에 비하여, 클론 2A10의 열 안정성은 높았다[T_m은 71.43℃].

실시예 8: 탁소텔® 및 7F12 항체를 함께 사용하는 생체 내 종양 이종 이식편 처리 방법

수컷 CB17.SCID 마우스 내에서 생육시킨 LNCaP 인간 전립선암종 이종 이식편에 탁소텔®(도세탁셀)와 항-PSMA 7F12 항체를 함께 사용하였을 경우의 항-종양 효능을 시험하였다.

PSMA를 높은 수준으로 발현하는 LNCaP 전립선암 세포는 ATCC(Cat# CRL-1740)으로부터 입수하였으며, 이를 ATCC 지침에 따라서 시험관 내에서 증식시켰다. 타코닉(Taconic)으로부터 입수한 8주령의 수컷 CB17.SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 2.5×10⁶개의 LNCaP 세포[마우스 한 마리당 0.2 ㎖의 PBS/마트리겔(Matrigel)(1:1)]를 피하 주입하였다. 마우스의 체중을 측정하고, 전자 캘리퍼스를 사용하여 종양 부피를 주입 후 3주 경과시를 기점으로 하여 매주 2회씩 측정하였다. 종양 부피는 높이×폭×길이로서 계산하였다. 혈관이 생성된 종양(종양의 겉보기로써 측정, 180㎣)을 가지는 마우스를 처리 군으로 무작위로 나누고, 바로 이 마우스에 투여하였다. 투여 후 약 60일 경과 하였을 때로부터 시작하여 연구 마지막 날까지, 종양 성장 여부에 대해 마우스를 관찰하였다. 종양이 종양 최종 시점(tumor end point; 1500㎣)가 되었을 때 마우스를 안락사시켰다. 투여 정보는 이하 표 1에 요약하였다. 탁소텔®는 Q3Dx3에 꼬리의 정맥을 통해 정맥 내(iv) 투여하였다. 동 기준 표본 항체인 리툭산®과 항-PSMA 7F12 항체는 Q3Dx5 → Q7Dx6에 복강 내(ip) 투여하였다.

투여 정보
처리	그룹당 마리 수	탁소텔®의 정맥 내 투여량 (㎎/㎏)	항체의 복강 내 투여량 (㎎/㎏)	투여 스케쥴
PBS	10			제0,3,7,10,14,21, 28,35,42,49,56일
탁소텔® 2	10	2	0	제0,3,7일
탁소텔® 4	10	4	0	제0,3,7일
동 기준 표본 Ab 리툭산®	10	0	30	제0,3,7,10,14,21, 28,35,42,49,56일
7F12 Ab	10	0	30	제0,3,7,10,14,21, 28,35,42,49,56일
탁소텔® 2 + 7F12 Ab	10	2	30	제0,3,7일 (탁소텔)/ 제0,3,7,10,14,21, 28,35,42,49,56일
탁소텔® 2 + 동 기준 표본 리툭산®	10	2	30	제0,3,7일 (탁소텔)/ 제0,3,7,10,14,21, 28,35,42,49,56일
탁소텔® 4 + 7F12 Ab	10	4	30	제0,3,7일 (탁소텔)/ 제0,3,7,10,14,21, 28,35,42,49,56일
탁소텔® 4 + 동 기준 표본 리툭산®	10	4	30	제0,3,7일 (탁소텔)/ 제0,3,7,10,14,21, 28,35,42,49,56일

상기 실험 결과는 도 13∼16에 나타내었다. 도 13의 A∼B 및 도 14의 A∼B에 나타낸 바와 같이, 항-PSMA 7F12 항체를 단독으로 30 ㎎/㎏ 투여하였을 경우에는, LNCaP 종양의 성장이 약간 감소하였음을 알 수 있었다. 탁소텔®는 시험된 2가지 경우의 투여량(즉, 2 및 4㎎/㎏)에서는 투여량-의존적 항-종양 성장 효능을 나타내었다. 30㎎/㎏의 항-PSMA 7F12 항체와 4㎎/㎏의 탁소텔®를 함께 사용하는 병행 요법의 경우에는, 각 항체를 단독으로 처리하는 경우보다 효능이 뛰어났으며, LNCaP 종양의 성장을 거의 완벽하게 억제하였다(도 13의 A∼B 및 도 15의 A∼B 참조). 도 13의 C∼D 및 도 15의 C∼D에 나타낸 바와 같이, 이와 같은 병행 요법은 LNCaP-종양-관련 악액질 마우스도 치료함을 알 수 있었다.

30㎎/㎏의 항-PSMA 7F12 항체와 2㎎/㎏의 탁소텔®를 함께 사용하는 병행 요법의 경우에는, 각 항체를 단독으로 처리하는 경우보다 효능이 뛰어났다(도 13의 A∼D 및 도 16의 A∼D 참조). 상기 데이터는 종양 예를 들어, 전립선 종양을 치료할 경우 탁소텔® 화학 요법과 함께 항-PSMA 7F12 항체를 사용하면, 상가적이고 또한 가능한 상승 효과를 볼 수 있음을 입증하는 것이다.

실시예 8: 전립선암 세포주 상에서 독소- 컨쥬게이트화 항- PSMA 항체의 세포 사멸 평가

본 실시예에서는, 독소에 컨쥬게이트화된 항-PSMA 모노클로날 항체가 세포 증식 검정법에서 PSMA + 전립선암 세포주를 사멸시키는 능력에 대해 시험하였다.

항-PSMA HuMab 항체인 2A10을 링커 예를 들어, 펩티딜, 히드라존 또는 이황화물 링커를 통하여 독소에 컨쥬게이트화시켰다. 본 발명의 항체에 컨쥬게이트화될 수 있는 독소 화합물의 예는 제출된 출원(Attorney Docket No.04280/100M629US3, 2005년 9월 26일 출원)에 개시되어 있다. PSMA-발현 전립선암 세포주 LNCaP를 3 시간 동안 100㎕ 웰 내에서 웰 당 2.5×10⁴ 세포의 농도로 접종하였다. 항-PSMA 항체-독소 컨쥬게이트를 웰에 가하였다[출발 농도 = 30nM, 1:3으로 연속 희석시켜 역가를 낮춤]. PSMA에 대해 비-특이적인 동 기준 표본 대조구 항체를 네거티브 대조구로서 사용하였다. 평판을 72시간 동안 항온 처리하였는데, 이때 항온 처리 개시후 3시간 경과시에 세척하거나 또는 항온 처리하면서 줄곧 세척해 주었다. 이후, 상기 평판에 24시간 동안 1.0 μCi의 ³H-티미딘 펄스를 주고, 세포를 수집하여 이를 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Packard Instruments, Meriden, CT)로 판독하였다. 그 결과를 도 17의 A(3시간 경과시 세척한 경우) 및 17의 B(연속적으로 세척한 경우)에 나타내었다. 항-PSMA 항체인 2A10의 농도는 PSMA-발현 LNCaP 전립선암 세포에 ³H-티미딘이 통합되는 양이 감소함에 따라서 감소함을 알 수 있었다. 항-PSMA 항체인 2A10에 대한 EC₅₀ 값은 각각 0.157nM(세척 검정법) 및 0.0643nM(연속 세척 검정법)이었다. 이 데이터를 통하여, 항-PSMA는 독소에 컨쥬게이트화될 때 전립선암 세포에 대하여 세포 독성을 나타냄을 알 수 있다.

실시예 9: 생체 내 연구

본 실시예에서는, 독소에 컨쥬게이트화된 항-PSMA 모노클로날 항체가 생체 내에서 PSMA + 전립선암 세포주를 사멸시키는 능력에 관하여 시험하였다.

A. 생체 내 종양 이종 이식편 처리

항-PSMA HuMab 2A10과 동 기준 표본 대조구 항체의 각 완충액을 0.1M 인산염 완충액(pH8.0, 50mM NaCl 및 2mM DTPA 함유)으로 교체하고, 이를 6㎎/㎖로 농축하였다. 이후, 상기 두 항체를 25배 몰 과량의 2-이미노티올란과 함께 실온에서 1 시간 동안 항온 처리한 후, 50mM NaCl과 2mM DTPA 완충액을 함유하는 0.1M 인산염 완충액(pH6.0)에서 탈염화시켜(세파덱스 G-25 컬럼 사용), 티올레이트화하였다. 이후, 티올레이트화된 항체를 얼음에 놓고, 도입된 티올기의 수를 측정하였다. 이 과정은 티올화된 항체 시료와 디티오디피리딘(DTDP)을 반응시킴으로써 수행되었다. 280㎚에서의 흡광도를 측정하여, 시료 중 단백질 농도를 측정하고, 이후 각 시료 분취액(0.9㎖)을 0.1㎖ DTDP(에탄올 중 5mM 스톡 용액)와 함께 실온에서 10분 동안 항온 처리하였다. 완충액 단독 블랭크 시료와 DTDP를 함께 항온 처리하였다. 324㎚에서의 흡광도를 측정하고, 티오피리딘에 대한 소멸 계수(19800M^-1)를 이용하여 항체당 존재하는 티올의 수를 정량하였다. 항-PSMA의 경우에는 항체당 5.3개의 티올이 도입되었으며, 동 기준 표본 대조구의 경우에는 항체당 6.0개의 티올이 도입되었다.

이후, 티올화된 항체를 티올 기의 몰 농도에 비하여 3배 몰 과량인 화합물 A와 함께 항온 처리하였다.

[화합물 A]

화합물 A의 DMSO 중 5mM 스톡 용액을 티올화된 항체에 충분한 양의 DMSO와 함께 가하여, DMSO 최종 농도가 10%(v/v)가 되도록 만들었다. 실온에서 3 시간 동안 항온 처리한 후, 트리에탄올아민을 사용하여 항온 처리 혼합물의 pH를 7.0으로 올렸다. 이후, 항체-화합물 A의 컨쥬게이트를 세파크릴 S200 컬럼(50 mM NaCl 및 5%(v/v) DMSO 함유 0.1M 인산염 완충액(pH7.2)으로 예비 평형화됨)상에서 크기별-배제 크로마토그래피로 정제하였다. 단량체 컨쥬게이트를 함유하는 분획을 수집하여 풀링하였다. 이후, 결과로 정제된 컨쥬게이트를 질소 대기하에 10kDa 컷-오프 막(cut-off membrane)을 이용하는 교반 셀에서 농축하였다. 280㎚ 및 340㎚에서의 흡광도를 이용하여 이 컨쥬게이트의 농도 및 치환 비(항체 분자당 결합된 약물 분자의 수)를 측정하였으며, 이때, 미리 측정해 둔 항체 및 화합물 A의 각 파장에서의 소멸 계수를 참고로 하였다. 본 발명의 항체에 컨쥬게이트화될 수 있는 기타 독소 화합물의 예는 공동 소유 미국 특허 출원(Attorney Docket No. 04280/100M629US3, 2005년 9월 26일 출원)에 개시되어 있다.

화합물 A에 컨쥬게이트화된 항-PSMA(2A10 클론)의 항-종양 효능을 LNCaP(인간의 전립선암종 이종 이식편으로서, 수컷 CB17.SCID 마우스 내에서 생육됨; Taconic, Germantown, NY로부터 입수 가능함)에 대해서 시험하였다. PSMA를 높은 수준으로 발현하는 LNCaP 전립선암 세포를 ATCC(Cat# CRL-1740)로부터 입수하고, 이를 ATCC 지침에 따라서 시험관 내에서 증식시켰다. 타코닉(Taconic)으로부터 입수한 8주령의 수컷 CB17.SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 2.5×10⁶개의 LNCaP 세포[마우스 한 마리당 0.2 ㎖의 PBS/마트리겔(1:1)]를 피하 주입하였다. 마우스의 체중을 측정하고, 주입 후 3주 경과시를 기점으로 하여 매주 2회씩 전자 캘리퍼스를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양 부피는 높이×폭×길이로서 계산하였다. 혈관이 생성된 종양(종양의 겉보기로써 측정, 적당한 크기)을 가지는 마우스를 처리 군으로 무작위로 나누고, 바로 이 마우스에 투여하였다. 투여 후 약 60일 경과하였을 때로부터 시작하여 연구 마지막 날까지, 종양 성장 여부에 대해 마우스를 관찰하였다. 종양이 종양 최종 시점(1500㎣)이 되었을 때 마우스를 안락사시켰다. 이식편 연구에 관한 디자인을 이하 표 2에 요약하였다.

LNCaP 이종 이식편 연구의 개요
처리	투여량 (μmole/ ㎏ 세포 독소)	그룹당 마리 수	투여 경로	투여 1일 전 평균 종양 부피 (㎣)
비이클	-	3	복강내	100
동 기준 표본 Ab-화합물 A 컨쥬게이트	0.3	3	복강내	100
2A10-화합물 A 컨쥬게이트	0.3	3	복강내	100

도 18에 나타낸 바와 같이, 0.3μmole/㎏(세포 독소 화합물 A의 몰을 기준으로 함)의 2A10-화합물 A 컨쥬게이트는 3개의 확립된 작은 LNCaP 종양 모두를 완전히 퇴화시켰음을 알 수 있었다.

B. 투여량-반응 연구

항-PSMA(2A10)의 완충액을 0.1M 인산염 완충액(pH8.0, 50mM NaCl 및 2mM DTPA 함유)로 교체하고, 이를 5.6㎎/㎖로 농축하였다. 이후, 상기 항체를 7.5배 몰 과량의 2-이미노티올란과 함께 실온에서 1 시간 동안 항온 처리한 후, 5mM 글리신, 2mM DTPA 및 3%(v/v) 글리세롤을 함유하는 50mM HEPES 완충액(pH6.0)에서 탈염화시켜(세파덱스 G-25 컬럼 사용), 티올레이트화하였다. 이후, 티올레이트화된 항체를 얼음에 놓고, 도입된 티올기의 수를 측정하였다. 이 과정은 티올화된 항체 시료와 디티오디피리딘(DTDP)을 반응시킴으로써 수행되었다. 280㎚에서의 흡광도를 측정하여, 시료 중 단백질 농도를 측정하고, 이후 각 시료 분취액(0.9㎖)을 0.1㎖ DTDP(에탄올 중 5mM 스톡 용액)와 함께 실온에서 10분 동안 항온 처리하였다. 완충액 단독 블랭크 시료와 DTDP를 함께 항온 처리하였다. 324㎚에서의 흡광도를 측정하고, 티오피리딘에 대한 소멸 계수(19800M^-1)를 이용하여 항체당 존재하는 티올의 수를 정량하였다.

이후, 티올화된 항체를 티올 기의 몰 농도에 비하여 2배 몰 과량인 화합물 A와 함께 항온 처리하였다. 화합물 A, 10%(v/v) DMSO/90% (v/v) 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르 중 5mM 스톡 용액을 충분한 양의 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르와 함께 티올화된 항체에 가하여, 최종 농도 5%(v/v)가 되도록 만들었다. 실온에서 2 시간 동안 항온 처리한 후, 항체-화합물 A 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 반응 혼합물을, 완충액 A(5OmM HEPES, 5mM 글리신, 3%(v/v) 글리세롤, pH 6.0) 중에서 미리 평형화시킨 SP-세파로즈 컬럼에 가하였다. 이 컬럼을 완충액 A로 세척한 후, 다시 95% 완충액 A, 5% 완충액 B(5OmM HEPES, 1M NaCl, 5mM 글리신, 3%(v/v) 글리세롤, pH 7.2)로 세척하였으며, 다시 항체-화합물 A 컨쥬게이트를 10% 완충액 B 및 90% 완충액 A와 함께 용리하였다. 단량체 컨쥬게이트를 함유하는 분획을 수집하고 풀링한 다음, 여기에 모노에탄올아민을 가하여 pH를 7.2로 맞추었다. 이후, 결과로 정제된 컨쥬게이트를 5OmM HEPES, 10OmM NaCl, 5mM 글리신, 3%(v/v) 글리세롤(pH 7.2)로 투석한 다음, 질소 대기하에 10kDa 컷-오프 막을 이용하는 교반 셀에서 농축하였다. 280㎚ 및 340㎚에서의 흡광도를 이용하여 이 컨쥬게이트의 농도 및 치환 비(항체 분자당 결합된 약물 분자의 수)를 측정하였으며, 이때, 미리 측정해 둔 항체 및 화합물 A의 각 파장에서의 소멸 계수를 참고로 하였다. 동일한 방법(단, 이온-교환 컬럼으로부터 컨쥬게이트 용리시 15% 완충액 B 및 85% 완충액 A 사용함)을 사용하여 동 기준 표본 대조구(항-CD70 2H5) 컨쥬게이트를 제조하였다.

전술한 바와 같이, 수컷 CB 17.SCID 마우스 내에서 생육된 LNCaP 인간 전립선암종 이종 이식편을 사용하여 컨쥬게이트의 효능 및 선택성을 측정하였다. 이 이종 이식편 연구에 관한 디자인을 이하 표 3에 요약하였다.

LNCaP 이종 이식편 연구의 개요
처리	투여량 (μmole/ ㎏ 세포 독소)	그룹당 마리 수	투여 경로	투여 1일 전 평균 종양 부피 (㎣)
비이클	-	9	ip	160
동 기준 표본 Ab-화합물 A	0.05, 0.15, 0.30, 0.45, 0.60, 0.90	9	ip	160
2A10-화합물 A	0.05, 0.15, 0.30, 0.45, 0.60, 0.90	9	ip	160

상기 표 3과 도 19∼20에 나타낸 바와 같이, 0.15μmole/㎏의 항-PSMA-화합물 A(도 19)의 항-종양 효능은, 0.90 μmole/㎏의 동 기준 표본 대조구-화합물 A의 경우보다 뛰어났는데, 이는 곧, 선택성이 6배 이상임을 말해주는 것이다(도 20). 0.90μmole/㎏의 항-PSMA-화합물 A의 경우에서만은 일시적으로 독성을 나타내었는데(도 21∼22), 이는 최대 허용 투여량 이하였다. 그러므로, LNCaP-종양-보유 마우스에 있어서 항-PSMA-화합물 A에 대한 치료 지수는 6배 이상이었음을 알 수 있었다.

C. 거대 종양에 대한 효능

항-PSMA(2A10)의 완충액을 0.1M 인산염 완충액(pH8.0, 50mM NaCl 및 2mM DTPA 함유)로 교체하고, 이를 5.6㎎/㎖로 농축하였다. 이후, 상기 항체를 9배 몰 과량의 2-이미노티올란과 함께 실온에서 1 시간 동안 항온 처리한 후, 5mM 글리신, 2mM DTPA 및 3%(v/v) 글리세롤을 함유하는 50mM HEPES 완충액(pH6.0)으로 탈염화시켜(세파덱스 G-25 컬럼 사용), 티올레이트화하였다. 이후, 티올레이트화된 항체를 얼음에 놓고, 도입된 티올기의 수를 측정하였다. 이 과정은 티올화된 항체 시료와 디티오디피리딘(DTDP)을 반응시킴으로써 수행되었다. 280㎚에서의 흡광도를 측정하여, 시료 중 단백질 농도를 측정하고, 이후 각 시료 분취액(0.9㎖)을 0.1㎖ DTDP(에탄올 중 5mM 스톡 용액)와 함께 실온에서 10분 동안 항온 처리하였다. 완충액 단독 블랭크 시료와 DTDP를 함께 항온 처리하였다. 324㎚에서의 흡광도를 측정하고, 티오피리딘에 대한 소멸 계수(19800M^-1)를 이용하여 항체당 존재하는 티올의 수를 정량하였다.

이후, 티올화된 항체를 티올 기의 몰 농도에 비하여 2배 몰 과량인 화합물 A와 함께 항온 처리하였다. 화합물 A, 10%(v/v) DMSO/90% (v/v) 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르 중 5mM 스톡 용액을 충분한 양의 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르와 함께 티올화된 항체에 가하여, 최종 농도 5%(v/v)가 되도록 만들었다. 실온에서 2 시간 동안 항온 처리한 후, 항체-화합물 A 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 반응 혼합물을, 완충액 A(5OmM HEPES, 5mM 글리신, 3%(v/v) 글리세롤, pH 6.0) 중에서 미리 평형화시킨 SP-세파로즈 컬럼에 가하였다. 이 컬럼을 완충액 A로 세척한 후, 다시 95% 완충액 A, 5% 완충액 B(5OmM HEPES, 1M NaCl, 5mM 글리신, 3%(v/v) 글리세롤, pH 7.2)로 세척하였으며, 다시 항체-화합물 A 컨쥬게이트를 10% 완충액 B 및 90% 완충액 A와 함께 용리하였다. 단량체 컨쥬게이트를 함유하는 분획을 수집하고 풀링한 다음, 여기에 모노에탄올아민을 가하여 pH를 7.2로 맞추었다. 이후, 결과로 정제된 컨쥬게이트를 5OmM HEPES, 10OmM NaCl, 5mM 글리신, 3%(v/v) 글리세롤(pH 7.2)로 투석한 다음, 질소 대기하에 10kDa 컷-오프 막을 이용하는 교반 셀에서 농축하였다. 280㎚ 및 340㎚에서의 흡광도를 이용하여 이 컨쥬게이트의 농도 및 치환 비(항체 분자당 결합된 약물 분자의 수)를 측정하였으며, 이때, 미리 측정해 둔 항체 및 화합물 A의 각 파장에서의 소멸 계수를 참고로 하였다. 동일한 방법(단, 이온-교환 컬럼으로부터 컨쥬게이트 용리시 15% 완충액 B 및 85% 완충액 A 사용함)을 사용하여 동 기준 표본 대조구(항-CD70 2H5) 컨쥬게이트를 제조하였다.

전술한 바와 같이, 수컷 CB17.SCID 마우스 내에서 생육된 LNCaP 인간 전립선암종 이종 이식편을 사용하여 컨쥬게이트의 효능 및 선택성을 측정하였다. 이 이종 이식편 연구의 디자인을 이하 표 4 및 5에 요약하였다.

LNCaP 이종 이식편 연구의 개요
처리	투여량 (μmole/ ㎏ 세포 독소)	그룹당 마리 수	투여 경로	투여 1일 전 평균 종양 부피 (㎣)
비이클	-	8	정맥내	240
동 기준 표본 Ab-화합물 A	0.15	8	정맥내	240
2A10-화합물 A	0.15	8	정맥내	240

상기 표 4와 도 23에 나타낸 바와 같이, 낮은 투여량 즉 0.15μmole/㎏의 항-PSMA-화합물 A를 1회 처리하였을 경우, 평균 크기가 240㎣인 확립 거대 LNCaP 종양의 성장을 상당한 정도로 억제하였다. 이와는 대조적으로, 0.15μmole/㎏의 동 기준 표본 대조구-화합물 A는 최소 항-종양 효능을 나타내었다. 표 5 및도 24에 나타낸 바와 같이, 0.30μmole/㎏의 투여량으로 항-PSMA-화합물 A를 1회 처리하였을 경우, 평균 크기가 430㎣인 매우 큰 LNCaP 종양의 성장을 억제하고 또한 이 종양의 퇴화를 유도하였다.

LNCaP 이종 이식편 연구의 개요
처리	투여량 (μmole/ ㎏ 세포 독소)	그룹당 마리 수	투여 경로	투여 1일 전 평균 종양 부피 (㎣)
비이클	-	6	복강내	430
2A10-화합물 A	0.15, 0.30, 0.45	6	복강내	430

본 명세서에 언급되었거나 또는 인용된 특허 출원, 특허, 공보 및 기타 공표된 문헌들은 각각 이들 특허 출원, 특허, 공보 및 기타 공표된 문헌들이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고용으로서 인용되어 있음을 나타내는 정도로 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다.

본 발명은 이의 특정 구체예를 참고로 하여 기술되어 있지만, 당 업자는 이 구체예에 다양한 변화를 줄 수 있으며, 또한 본 발명의 진정한 사상과 범위 그리고 첨부된 청구항에서 벗어나지 않고 등가물로 대체될 수 있음을 알아두어야 할 것이다. 뿐만 아니라, 특정 상황, 물질, 물질의 조성물, 방법, 방법의 과정(들)이 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞도록 다수의 변형이 가하여질 수 있다. 이러한 변형은 모두 본 발명에 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> MEDAREX, INC. <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN (PSMA) <130> MXI-334PC <140> <141> <150> 60/748,417 <151> 2005-12-08 <160> 48 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ser Asn Trp Ile Gly 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ser Asn Trp Ile Gly 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Phe Thr 1 5 10 <210> 33 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 33 cag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tca tat gat gga aac aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gcc gtc ccc tgg gga tcg agg tac tac tac tac ggt atg gac 336 Ala Arg Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 34 gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agt aac 96 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn 20 25 30 tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agg caa act ggt ttc ctc tgg tcc tcc gat ctc tgg ggc cgt ggc 336 Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 acc ctg gtc act gtc tcc tca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 35 gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agt ttt acc agc aac 96 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn 20 25 30 tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg aac agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga caa act ggt ttc ctc tgg tcc ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc 336 Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 acc ctg gtc act gtc tcc tca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 36 gag gtg cag ctg gtg cag tct gga tca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc aac tac 96 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tat 240 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agt ccc ggg tat acc agc agt tgg act tct ttt gac tac tgg ggc 336 Ala Ser Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 37 gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag ggc att agc agt gct 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa tca ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 ttt gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Phe Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aac agt tat cct ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 38 gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag gac att agc agt gct 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 tta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 tat gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc aac agc ctg cag cct 240 Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 39 gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag gac att agc agt gct 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa ccg ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa atc aaa 327 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 40 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc tac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac tgg ccc cta 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 324 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 42 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 43 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 44 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp 85 90 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 1 5 10 15 Thr Val Ser Ser 20 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Gly-Ser linker <400> 48 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (55)

1. 전립선 특이 막 항원(Prostate Specific Membrane Antigen; PSMA)과 특이적으로 결합하는 분리된 인간 모노클로날 항체로서, 이 항체의 용융점은 67℃ 이상인 것인 분리된 인간 모노클로날 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체의 용융점은 69℃ 이상인 것인 항체.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체의 용융점은 71℃ 이상인 것인 항체.
4. 인간 V_H3-30.3 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래하는 중쇄 가변부를 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합하는 것인 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
5. a) 인간 V_H3-30.3 유전자의 중쇄 가변부; 및

   b) 인간 Vκ L18 유전자의 경쇄 가변부

   를 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합하는 것인 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
6. 인간 Vκ L18 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래하는 경쇄 가변부를 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합하는 것인 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
7. a) 인간 V_H5-51 유전자의 중쇄 가변부; 및

   b) 인간 Vκ L18 유전자의 경쇄 가변부

   를 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합하는 것인 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
8. (a) 서열 번호 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

   (b) 서열 번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

   (c) 서열 번호 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

   (d) 서열 번호 21, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

   (e) 서열 번호 25, 26, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

   (f) 서열 번호 29, 30, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3

   을 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합하는 것인 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
9. 제8항에 있어서,

   (a) 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

   (b) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

   (c) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

   (d) 서열 번호 21을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

   (e) 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

   (f) 서열 번호 29를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3

   을 포함하는 것인 항체.
10. 제8항에 있어서,

    (a) 서열 번호 10을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

    (b) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

    (c) 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

    (d) 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

    (e) 서열 번호 26을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

    (f) 서열 번호 30을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3

    을 포함하는 것인 항체.
11. 제8항에 있어서,

    (a) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

    (b) 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

    (c) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

    (d) 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

    (e) 서열 번호 27을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

    (f) 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3

    을 포함하는 것인 항체.
12. 제8항에 있어서,

    (a) 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1;

    (b) 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2;

    (c) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3;

    (d) 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변부 CDR1;

    (e) 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 및

    (f) 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3

    을 포함하는 것인 항체.
13. (a) 서열 번호 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

    (b) 서열 번호 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부

    를 포함하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 이 항체는 PSMA와 특이적으로 결합하는 것인 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
14. 제13항에 있어서,

    (a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

    (b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부

    를 포함하는 것인 항체.
15. 제13항에 있어서,

    (a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

    (b) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부

    를 포함하는 것인 항체
16. 제13항에 있어서,

    (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

    (b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부

    를 포함하는 것인 항체.
17. 제13항에 있어서,

    (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및

    (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부

    를 포함하는 것인 항체.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 항원 결합부와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
19. 치료제와 결합되어 있는 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 면역 컨쥬게이트.
20. 제19항의 면역 컨쥬게이트와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
21. 제19항에 있어서, 상기 치료제는 세포 독소인 것인 면역 컨쥬게이트.
22. 제21항의 면역 컨쥬게이트와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성 물.
23. 제19항에 있어서, 상기 치료제는 방사성 동위 원소인 것인 면역 컨쥬게이트.
24. 제23항의 면역 컨쥬게이트와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
25. 제2 작용부(functional moiety)와 결합되어 있는 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 이중 특이적 분자로서, 이 제2 작용부는 상기 항체 또는 이의 항원 결합부와는 상이한 결합 특이성을 가지는 것인 이중 특이적 분자.
26. 제25항에 의한 이중 특이적 분자와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
27. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
28. 제27항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
29. 제28항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
30. 인간 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스 유전자를 포함하는 트랜스게닉 마우스로서, 이 마우스는 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 의한 항체를 발현하는 것인 트랜스게닉 마우스.
31. 제30항의 마우스로부터 생산되는 하이브리도마로서, 이 하이브리도마는 상기 항체를 생산하는 것인 하이브리도마.
32. 개체 내 종양의 성장을 억제하는 방법으로서, 여기서 상기 종양 세포 또는 이 종양에 근접하여 위치하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현하는 것이고, 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 항원 결합부를 종양의 성장을 억제하는데에 효과적인 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 종양은 전립선 암의 종양인 것인 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 종양은 결장암, 신장암, 직장암, 요로 상피 암, 유방암, 방광암, 간암, 췌장암 또는 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 것인 방법.
35. (a) (i) 서열 번호 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열; 서열 번호 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열; 및 서열 번호 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변부 항체 서열; 또는 (ii) 서열 번호 21, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열; 서열 번호 25, 26, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열; 및 서열 번호 29, 30, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변부 항체 서열을 제공하는 단계;

    (b) 하나 이상의 가변부 항체 서열 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 하나 이상의 변형된 항체 서열을 제조하는 단계로서, 상기 서열은 중쇄 가변부 항체 서열 및 경쇄 가변부 항체 서열로부터 선택되는 것인 단계; 및

    (c) 상기 변형된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계

    를 포함하는 항-PSMA 항체를 생산하는 방법.
36. 개체 내 종양의 성장을 억제 또는 예방하는 방법으로서, 여기서 상기 종양 세포 또는 이 종양에 근접하여 위치하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현하는 것이고, 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 항 종양제와 함께 종양의 성장을 억제 또는 예방하는데에 효과적인 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 상기 항 종양제와 함께 개체에 투여함으로써 상기 종양의 성장을 억제하는데에 있어서 상 승(synergistic) 효과를 가져오게 되는 것인 방법.
38. 제36항에 있어서, 상기 항 종양제는 종양 덩어리를 손상시켜 종양의 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity; ADCC)을 더욱 효과적으로 유도하는 것인 방법.
39. 제36항에 있어서, 상기 항-PSMA 항체는 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 의한 항체인 것인 방법.
40. 제36항에 있어서, 상기 항-PSMA 항체는 7F12 항체인 것인 방법.
41. 제36항에 있어서, 상기 항-PSMA 항체는 2A10 항체인 것인 방법.
42. 제36항에 있어서, 상기 종양은 전립선 암의 종양인 것인 방법.
43. 제36항에 있어서, 상기 종양은 결장암, 신장암, 직장암, 요로 상피 암, 유방암, 방광암, 간암, 췌장암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 것인 방법.
44. 제36항에 있어서, 상기 항 종양제는 화학 요법 제제인 것인 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 화학 요법 제제는 탁소텔(Taxotere)®(도세탁셀)인 것인 방법.
46. 제36항에 있어서, 상기 항 종양제는 항 혈관 신생 제제인 것인 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 항 혈관 신생 제제는 엔지오스타틴 K1-3, 어레스텐(Arresten), aaAT, 칸스타틴(Canstatin), DL-α-디플루오로메틸-오르니틴, 엔도스타틴(Endostatin), 푸마길린(Fumagillin), 제니스테인(Genistein), 미노사이클린(Minocycline), 스토로스포린(Staurosporine), 탈리도미드(Thalidomide) 및 텀스타틴(Tumstatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
48. 제36항에 있어서, 상기 항 종양제는 면역 조정제인 것인 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 면역 조정제는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 포스포로티올레이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드(1018 ISS), GM-CSF 유전자 백신, 인터루킨-2, 인터루킨-7(CYT 99 07), 인터루킨-12 및 인터루킨-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
50. 개체 내 종양의 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 촉진시키는 방법 으로서, 여기서, 상기 종양 세포 또는 이 종양에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현하는 것이고, 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 항 종양제와 함께 종양의 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 촉진하는데에 효과적인 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
51. 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합부를 항 종양제와 함께 개체 내 종양 관련 악액질을 억제하는데에 효과적인 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내 종양 관련 악액질을 억제하는 방법으로서, 여기서, 상기 종양 세포 또는 이 종양에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현하는 것인 방법.
52. 종양의 성장을 억제 또는 예방하는데에 효과적인 양의 항-PSMA 항체와 항 종양제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
53. 종양의 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 촉진하는데에 효과적인 양의 항-PSMA 항체와 항 종양제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
54. 종양의 성장을 억제 또는 예방함에 있어서 항-PSMA 항체와 상승 작용할 수 있는 항 종양제를 동정하는 방법으로서, 여기서, 상기 종양 세포 또는 이 종양에 근접하여 존재하는 혈관 내피 세포는 PSMA를 발현하고, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함하는 것인 방법:

    (i)지표 조성물(indicator composition)을 (a) 시험 항 종양제 단독, (b) 항-PSMA 항체 단독 및 (c) 시험 항 종양제 및 항-PSMA 항체 둘 다와 접촉시키는 단계; 및

    (ii)(a) 시험 항 종양제 단독 및 (b) 항-PSMA 항체 단독이 종양의 성장을 억제 또는 예방하는 능력과, (c) 시험 항 종양제 및 항-PSMA 항체 둘 다가 종양의 성장을 억제 또는 예방하는 능력을 비교하는 단계로서, 여기서 상기 (c)에 의하여 종양 성장을 억제 또는 예방하는 효과는 상기 (a)와 (b)의 상가(additive) 효과보다 커서, 종양의 성장을 억제 또는 예방하는데에 있어서 항-PSMA 항체와 상승 작용할 수 있는 항 종양제를 동정할 수 있는 단계.
55. 제54항에 있어서, 상기 지표 조성물은 종양에 대한 동물 모델인 것인 방법.

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