EA030830B1 - Соединения тубулизина, способы их получения и применение - Google Patents

Соединения тубулизина, способы их получения и применение Download PDF

Info

Publication number
EA030830B1
EA030830B1 EA201591317A EA201591317A EA030830B1 EA 030830 B1 EA030830 B1 EA 030830B1 EA 201591317 A EA201591317 A EA 201591317A EA 201591317 A EA201591317 A EA 201591317A EA 030830 B1 EA030830 B1 EA 030830B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
mmol
val
alkyl
antibody
Prior art date
Application number
EA201591317A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591317A1 (ru
Inventor
Хэн Чэн
Цян Цун
Санджив Гангвар
Original Assignee
Бристол-Майерс Сквибб Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бристол-Майерс Сквибб Компани filed Critical Бристол-Майерс Сквибб Компани
Publication of EA201591317A1 publication Critical patent/EA201591317A1/ru
Publication of EA030830B1 publication Critical patent/EA030830B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

Соединения тубулизина формулы (I)где R, R, R, R, R, R, W и n такие, как определено в описании, являются антимитотическими агентами, которые могут быть использованы в лечении рака, особенно когда конъюгированы с нацеливающим фрагментом.

Description

Изобретение относится к соединениям, структурно сходным с тубулизинами, их конъюгатами с лигандом, способам получения и применения таких соединений и конъюгатов и композициям, содержащим такие соединения и конъюгаты.
Уровень техники
Тубулизины представляют собой цитотоксины, первоначально выделенные из культур миксобактерий Archangium gephyra или Angiococcus disciformis, причем каждый организм продуцирует различные смеси тубулизинов (Sasse et al., 2000; Reichenbach et al., 1998). Установлена их кристаллическая структура и биосинтез (Steinmetz et al., 2004), и их гены, отвечающие за их биосинтез, были секвенированы (Hoefle et al., 2006b). Претубулизин, биосинтетический предшественник тубулизинов, также, как было показано, обладает некоторой активностью (Ullrich et al., 2009). (Полный список документов, приведенных в настоящем описании посредством указания первого автора или изобретателя и года, перечислены в конце настоящего описания).
Тубулизины принадлежат к группе природных антимитотических полипептидов и депсипептидов, которая включает фомопсины, доластатины и криптофицины (Hamel 2002). Также существуют отличные от полипептидов или депсипептидов антимитотические агенты, например паклитаксел, майтансины и эпотилоны. Во время митоза микротрубочки клетки реорганизовываются, чтобы сформировать митотическое веретено, процесс, для которого необходима быстрая сборка и разборка микротрубочек, состоящих из белков а- и β-тубулина. Антимитотические агенты блокируют этот процесс и препятствуют прохождению митоза в клетках. На молекулярном уровне точный механизм блокировки может отличаться от одного антимитотического агента к другому. Тубулизины предотвращают сборку микротрубочек тубулина в результате чего пораженные клетки останавливаются в G2/M фазе и подвергаются апоптозау (Khalil et al., 2006). Паклитаксел приводит к тому же конечному результату посредством связывания с микротрубочками и предотвращение их разборки.
Тубулизины имеют тетрапептидильный каркас, построенный из одной протеиногенной и трех непротеиногенных аминокислотных субъединиц, как показано в формуле (А): N-метилпипеколиновой кислоты (Mep), изолейцина (He), тубувалина (Tuv) и либо тубуфенилаланина (Tup, R' обозначает H) или тубутирозина (Tut, R' обозначает OH). Среди наиболее известных природных тубулизинов (обозначаемых А, В и т.д.), сайты структурных вариаций представляют собой остатки R', R и R' в формуле (А), как показано в табл. 1
Таблица 1 - Встречающиеся в природе тубулизины
Ттубулизин R’ R” R”
А ОН ОС(=О)Ме CH2OC(=O)z-Bu
В ОН ОС(=О)Ме CH2OC(=O)zz-Pr
С ОН ОС(=О)Ме CH2OC(=O)Et
D Н ОС(=О)Ме CH2OC(=O)z-Bu
Е н ОС(=О)Ме CH2OC(=O)zz-Pr
F н ОС(=О)Ме CH2OC(=O)Et
G он ОС(=О)Ме CH2OC(=O)CH=CH2
Н н ОС(=О)Ме CH2OC(=O)Me
I он ОС(=О)Ме СН2ОС(=О)Ме
и н ОС(=О)Ме Н
V н ОН Н
Y он ОС(=О)Ме Н
Z он ОН Н
Претубулизин н Н Me
- 1 030830
Кроме того, были идетифицированы другие природные тубулизины (Chai et al., 2010).
Kaur et al., 2006 изучали антипролиферативное свойства тубулизина А и обнаружили, что он был более активен, чем другие антимитотические агенты, такие как паклитаксел и винбластин, и был активен в отношении ксенотрансплантатных анализов против различных линий раковых клеток. Кроме того, тубулизин А индуцировал апоптоз в раковых клетках, но не в нормальных клетках и показал значительные потенциальные антиангиогенные свойства в анализах in vitro. Антимитотические свойства других тубулизинов также были оценены, и в целом было установлено, что они выигрывали в сравнении со свойствами антимитотических агентов, отличных от тубулизина (см, например, Balasubramanian et al., 2009; Steinmetz et al., 2004; Wipf et al., 2004). По этим причинам существует значительный интерес в тубулизинам как противоопухолевым агентам (см., например, Domling et al., 2005c; Hamel 2002).
Многочисленные публикации описывают усилия, направленные на синтез тубулизинов, в том числе: Balasubramanian et al., 2009; Domling et al., 2006; Hoefle et al., 2003; Neri et al., 2006; Peltier et al., 2006; Sani et al., 2007; Sasse et al., 2007; Shankar et al., 2009; Shibue et al., 2009 и 2010; и Wipf et al., 2004. Другие публикации описывают исследования взаимосвязи структура-активность (SAR) с помощью получения и оценки аналогов или производных тубулизина: Balasubramanian et al., 2008 and 2009; Chai et al., 2011; Domling 2006; Domling et al., 2005a; Ellman et al., 2013; Hoefle et al., 2001 & 2006a; Pando et al., 2011; Patterson et al., 2007 & 2008; Richter 2012a, 2012b, and 2012c; Shankar et al., 2013; Shibue et al., 2011; Sreejith et al., 2011; Vlahov et al., 2010a; Wang et al., 2007; Wipf et al., 2007 and 2010; и Zanda et al., 2013. Исследования SAR в основном изучали структурные изменения в кольце Мер, остатков R и R' субъединицы Tuv, и ароматического кольца или алифатической углеродной цепи субъединицы Tup/Tut.
Domling et al., 2005 раскрывают конъюгаты тубулизина с молекулой партнера, в основном описанные как полимер или биомолекула, но с примерами, ограниченными полиэтиленгликолем (ПЭГ) в качестве молекулы-партнера. Cheng et al., 2011 также раскрывают аналоги тубулизина, адаптированные для использования в конъюгатах. Другими документами, раскрывающими конъюгаты тубулизинов, являются Boyd et al., 2008 и 2010; Jackson et al., 2013; Vlahov et al., 2008a, 2008b and 2010b; Leamon et al., 2008 и 2010; Reddy et al., 2009; и Low et al., 2010. Leung et al., 2002 раскрывают полианионные полипептиды, которые могут быть конъюгированы с лекарственными средствами (в том числе тубулизинами), для улучшения их биологической активности и растворимости в воде.
Davis et al., 2008 и Schluep et al., 2009 раскрывают рецептуры на основе циклодекстрина, в которых тубулизины ковалентно присоединены к циклодекстрину с помощью гидразид-дисульфидного линкерного фрагмента, связанного с карбоксильной в группы Tup/Tut.
Сообщается, что дезацетилирование в субъединице Tuv (т.е. R B формуле (А) представляет собой гидроксил вместо ацетила) приводит к потере биологической активности (Domling et al., 2006). В исследовании тубулизинов U и V, которые отличаются тем, что в первый ацетилирован, а последний дезацетилирован, тубулизин V, как сообщается, имеет меньшую активность приблизительно в 200-600 раз в зависимости от анализа (Balasubramanian et al., 2009). Поскольку ацетатная группа является чувствительной к гидролизу, деацетилирование в положении R'' является проблемой, так как возможный центр нестабильности приводит к потере активности, для разработки аналогов тубулизина для фармацевтического применения.
Сущность изобретения
Было обнаружено, что можно защитить против потери биологической активности, связанной с дезацетилированием, которая описана выше, заменив ацетат в положении R'' на карбаматную группу. Карбаматная группа, как описано в данном документе, не вызывает значительную потерю биологической активности, но при этом более стабильна.
Соответственно, в одном аспекте изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру, пред-
R1 представляет собой Me, Et, n-Pr, i-Pr, или
R2 представляет собой С1-С5 алкил, С1-С5 алкенил, С1-С5 алкинил, C^OC^O)^^ алкил, C^OC^O)^^ алкенил, ΟΠ2Θ^=Θ)^^5 алкинил,
- 2 030830
R3a и R3b независимо представляют собой Н, С1-С5 алкил, СН2(С5-С6 циклоалкил), CH2C6H5, C6H5 или СН2СН2ОН;
R4 представляет собой
где R4a представляет собой Н или С1-С3-алкил; и Y представляет собой Н, ОН, Cl, F, CN, Me, Et, NO2, или NH2;
R5 представляет собой Н, С1-С5 алкил, C2-C5 алкенил, C2-C5 алкинил, COfOi-Q алкил), СО(С2-С5 алкенил) или СО(С2-С5 алкинил);
W представляет собой О или S и n равно 0, 1 или 2; или его фармацевтически приемлемая соль.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру, представленную формулой (Ia)
где Y представляет собой Н или NO2; R4a представляет собой Н, Me или Et; и R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру, представленную формулой (Ib)
где R4a представляет собой Н, Me или Et; R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me и Et; и R6 представляет собой С1-С5 алкил, СН2ОС(=О)С1-С5 алкил или (CH2)1-2C6H5.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру, представленную формулой (Ib')
где R4a представляет собой Н, Me или Et, и R6 представляет собой Me или n-Pr.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру, представленную формулой (I-2)
- 3 030830
В другом аспекте изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру, представленную (I-9)
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает конъюгат, содержащий соединение имеющее структуру, представленную формулой (I), ковалентно связанное с антителом или его антигенсвязывающим участком, который специфически или предпочтительно связывается с антигеном опухоли.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает конъюгат, имеющий структуру, представленную формулой (II-1')
где R6 представляет собой Me или n-Pr, и Ab представляет собой антитело, которое предпочтительно представляет собой ан'ги-С1)70, антимезотелиновое или антиглипикан 3 антитело.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает конъюгат, имеющий структуру, представленную формулой (II) [D(XD)aC(XZ)b]mZ (II) где Z представляет собой антитело;
XD является первым спейсерным фрагментом, выбранным из г н г |-N-(CH2)2-6-(NH)q—I
О (CH2)2-6-C-| F(CH2)2-6-(NH)q—
О bc-(CH2)2-6-(NH)q-| Р(СН2СН2О)г-СН2СН24 о ^-(NH)q—(СН2СН2О)Г-СН2СН2-С— а также их комбинации, где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен 1 до 24, XZ является вторым спейсерным фрагментом, выбранным из г н г |-N-(CH2)2.6-(NH)q—|
О (СН2)2.6-С-^ HCH2)2-6-(NH)q—I о
С—(СН2)2.6—(NH)q—(СН2СН2О)Г—СН2СН2 t О :-(NH)q—(сн2сн2о)г-сн2сн2—с—
- 4 030830 а также их комбинации, где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен 1 до 24,
С выбрано из Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, AlaAla-Asn, Lys, Cit, Ser и Glu;
индексы а и b равны независимо 0 или 1;
индекс m равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10; и
D имеет структуру в соответствии с формулой (D-a)
или с формулой (D-b)
где Y представляет собой Н или NO2; R4a представляет собой Н, Me или Et; R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et; и R6 представляет собой С1-С5 алкил, CH^C^O^i^ алкил, или (CH2)1-2C6H5.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение лекарственное средство-линкер, имеющее структуру в соответствии с формулой (III)
где R31 представляет собой представляет собой -NH2, -ОН, -СО2Н, -SH, малеимидо, циклооктин, азидо (-N3), гидроксиламино (-ONH2) или N-гидроксисукцинимидо;
XD является первым спейсерным фрагментом, выбранным из н
- N—(СН2)2.6-(NH)q—
а также их комбинации, где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен 1 до 24;
XZ является вторым спейсерным фрагментом, выбранным из
а также их комбинации, где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен 1 до 24;
С выбрано из Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, AlaAla-Asn, Lys, Cit, Ser и Glu; индексы а и b равны независимо 0 или 1; и D имеет структуру в соответствии с формулой (D-a)
- 5 030830 или формулой (D-b)
где Y представляет собой Н или NO2; R4a представляет собой Н, Me или Et; и R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et; и R6 представляет собой С1-С5 алкил, СН2ОС(=О)С1-С5 алкил, или (СН2)1-2С6Н5.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение лекарственное средство-линкер, имеющее структуру, представленную формулой (III-а)
где R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et;
R6 представляет собой Me, Et или n-Pr;
ААа и каждый ААВ независимо выбираются из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γаминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γ карбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина;
p равно 1, 2, 3 или 4;
q равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
r равно 1, 2, 3, 4 или 5;
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение лекарственное средство-линкер, имеющее структуру, представленную формулой (III-b)
- 6 030830
где R6 представляет собой Me или n-Pr; q равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
r равно 1, 2, 3, 4 или 5;
s равно 0 или 1; и
R31 выбирается из группы, состоящей из
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение лекарственное средство-линкер, имеющее структуру, представленную формулой (III-1)
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение лекарственное средство-линкер, имеющее структуру, представленную формулой (III-8)
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение конъюгата для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака у пациента, страдающего от рака, выбранного из группы, состоящей из рака почек, рака желудка, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карцино мы, колоректального рака, рака яичников, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, лейкоза, рака мозга, множественной миеломы и лимфомы.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение конъюгата, где соединение, конъюгированное с нацеливающим фрагментом, который представляет собой антитело, которое связывается с антигеном, который сверхэкспрессируется или уникально экспрессируется раковыми клетками.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение конъюгата, где рак выбирается из группы, состоящей из рака почек, рака легких, рака желудка и рака яичников.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую соединение имеющее структуру, представленную формулой (I), и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую соединение имеющее структуру, представленную формулой (I), которое конъюгировано с нацеливающим фрагментом, который представляет собой антитело.
- 7 030830
Краткое описание чертежей
Фиг. 1, 2а-2Ь и 3 показывают в комбинации схему синтеза соединения (III-1);
фиг. 4 - схему синтеза соединения (III-2);
фиг. 6а-6с - в комбинации схему синтеза соединений (III-4) и (III-5);
фиг. 7 - схему синтеза соединения (I-1); фиг. 8 - схему синтеза соединения (I-4);
фиг. 9а и 9Ь - в комбинации схему синтеза соединения (III-6);
фиг. 10 и 11 - схемы синтеза промежуточных соединений, используемых для получения соединений по настоящему изобретению;
фиг. 12 - схемы синтеза дополнительных соединений по настоящему изобретению;
фиг. 13a-13d - биологическую активность некоторых соединений по настоящему изобретению;
фиг. 14 - активность in vitro конъюгата по настоящему изобретению; фиг. 15 - активность in vivo конъюгата по настоящему изобретению;
фиг. 16а, 16Ь, 17а, 17Ь, 18а, 18Ь, 19а, 19Ь и 20 представляют дополнительный данные in vivo по активности конъюгатов по настоящему изобретению;
фиг. 21 и 22 показывают схемы синтеза дополнительных соединений по настоящему изобретению, иллюстрирующие структурные вариации при карбаматной группе;
фиг. 23 - схему синтеза соединений по настоящему изобретению, подходящие для конъюгации через клик химию;
фиг. 24 - схему синтеза соединений по настоящему изобретению, подходящие для конъюгации через алифатическую аминогруппу.
Подробное описание изобретения
Определения.
Термин антитело обозначает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антиген-связывающий участок) или их одноцепочечные варианты. Целое антитело представляет собой белок, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и константную область тяжелой цепи, содержащую три области: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (VL или VK) и константную область легкой цепи, содержащую одну единственный домен CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность, (CDR), перемежающиеся с более консервативными каркасными областями (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино- до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Вариабельные области содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области могут опосредовать связывание антитела с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы (активации) комплемента. Говорят, что антитело специфично связывается с антигеном X, если указанное антитело связывается с антигеном X с KD 5х10-8 М или менее, более предпочтительно 1х10-8 М или менее, более предпочтительно 6х10-9 М или менее, более предпочтительно 3х10-9 М или менее, еще более предпочтительно от 2х10-9 М или менее. Антитело может быть химерным, гуманизированным или, что предпочтительно, человеческим. Константная область тяжелой цепи можно сконструировать так, чтобы повлиять на тип или степень гликозилирования, чтобы увеличить период полураспада антител, чтобы увеличить или уменьшить взаимодействие с эффекторными клетками или системой комплемента, или чтобы модулировать некоторые другие свойства. Конструирование может быть достигнуто посредством замены, встаки или делеции одной или более аминокислот или посредством замены домена доменом другого вида иммуноглобулина или комбинации вышеперечисленного.
Антиген-связывающий фрагмент и антиген-связывающий участок антитела (или просто часть антитела или фрагмент антитела) обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины, такими как, (i) фрагментом Fab, одновалентным фрагментом, состоящим из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) c F(ab')2 фрагментом, бивалентным фрагментом, содержащим два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fab'-фрагментом, который является по существу Fab с частью шарнирной области (см, например, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007); (iv) Fd-фрагментом, состоящим из доменов VH и CH1; (v) Fv-фрагментом, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела, (vi) фрагментом dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из VH домена; (vii) изолированной областью, определяющей комплементарность (CDR); и (viii) нанотелом, вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей один вариабельный домен и два константных домена. Предпочтительные антигенсвязывающие фрагменты представляют собой Fab, F(ab')2, Fab', Fv и Fd фрагменты. Кроме того, хотя два домена Fv фрагменты VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных методов с помощью синтетического линкера, кото
- 8 030830 рый позволяет им функционировать в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH составляют пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv или scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антиген-связывающий участок антитела.
Выделенное антитело обозначает антитело, которое, по существу, не содержит других антител, имеющих отличные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывает антиген X, является, по существу, свободным от антител, которые специфически связывают антиген, отличный от X антигена). Выделенное антитело, которое специфически связывает антиген X, может, однако, иметь перекрестную реакционноспособность с другими антигенами, такими как антигенные молекулы X из других видов. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело специфически связывается с антигеном человека X и не реагирует перекрестно с другими (нечеловеческими) X антигенами. Кроме того, выделенное антитело может быть, по существу, свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Моноклональное антитело или композиция моноклональных антител обозначает препарат молекул антитела одного молекулярного состава, который демонстрирует одну специфичность связывания и сродства к конкретному эпитопу.
Человеческое антитело обозначает антитело, имеющее вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR области (и константная область, если она присутствует) являются производными от последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела могут включать последующие модификации, включая природные или синтетические модификации. Человеческие антитела могут включать остатки аминокислот, некодируемые последовательностями иммуноглобулина человека зародышевой линии (например, мутации, введенные посредством случайного или сайтспецифического мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo). Однако человеческое антитело не включает в себя антитела, в которых CDR-последовательности, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мыши, были привиты на каркасные последовательности человека.
Человеческое моноклональное антитело обозначает антитело, демонстрирующее единственную специфичность связывания, которое имеет вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDRобласти получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте осуществления человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного нечеловеческого животного, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и легкой цепи трансгена, слитым с иммортализованными клетками.
Алифатический обозначает прямую или разветвленную цепь, насыщенную или ненасыщенную неароматическую углеводородную часть, имеющую указанное число атомов углерода (например, как в C3 алифатический, С1-С5 алифатический, или С1-С5 алифатический, последние две выражения являются синонимами алифатического остатка, имеющего от 1 до 5 атомов углерода), или где количество атомов углерода явно не указано, от 1 до 4 атомов углерода (от 2 до 4 атомов углерода, например, в ненасыщенных алифатических фрагментах).
Термин алкил обозначает насыщенный алифатический фрагмент, с использованием тех же правил для обозначения количества атомов углерода. В качестве иллюстрации С1-С4 алкильные группы включают, но не ограничиваются этим, метил, этил, пропил, изопропил, изобутил, трет-бутил, 1-бутил, 2-бутил и тому подобное. Алкилен обозначает двухвалентный аналог алкильной группой, такой как СН2СН2, CH2CH2CH2 и СН2СН2СН2СН2.
Термин алкенил обозначает алифатическую группу, имеющую по меньшей мере одну углеродуглеродную двойную связь, с тем же соглашением, применимым для обозначения количества атомов углерода. В качестве иллюстрации С2-С4 алкенильные группы включают, но не ограничиваются этим, этенил (винил), 2-пропенил (аллил или проп-2-енил), цис-1-пропенил, транс-1-пропенил, Е- (или Z-) 2бутенил, 3-бутенил, 1,3-бутадиенил (но-1,3-диенил) и тому подобное.
Термин алкинил обозначает алифатическую группу, имеющую по меньшей мере одну углеродуглеродную тройную связь, с тем же соглашением, применимым для обозначения количества атомов углерода. В качестве иллюстрации С2-С4 алкинильные группы включают этинил (ацетиленил), пропаргил (проп-2-инил), 1-пропинил, бут-2-инил и тому подобное.
Циклоалифатический обозначает насыщенный или ненасыщенный неароматический углеводородный фрагмент, имеющий от 1 до 3 колец, каждое кольцо, имеющее от 3 до 8 (предпочтительно от 3 до 6) атомов углерода. Циклоалкил обозначает циклоалифатический остаток, в котором каждое кольцо является насыщенным. Циклоалкенил обозначает циклоалифатический фрагмент, в котором по меньшей мере одно кольцо имеет по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Циклоалкинил обозначает циклоалифатический остаток, в котором по меньшей мере одно кольцо имеет по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь. В качестве иллюстрации циклоалифатические группы включают, но не ограничиваются этим, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил,
- 9 030830 циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил и адамантил. Предпочтительными циклоалифатическими остатками являются циклоалкильные, особенно такие как, циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил. Циклоалкилен обозначает двухвалентный аналог циклоалкильной группы.
Гетероциклоалифатический обозначает циклоалифатический остаток, в котором по меньшей мере в одном его кольце до трех (предпочтительно от 1 до 2) атомов углерода заменены гетероатомом, независимо выбранным из N, О или S, где N и S необязательно могут быть окислены, и N необязательно может быть кватернизован. Аналогичным образом гетероциклоалкил, гетероциклоалкенил и гетероциклоалкинил обозначает циклоалкильный, циклоалкенильный или циклоалкинильный фрагмент, соответственно, в которых по меньшей мере одно кольцо было таким образом модифицировано. Примерные гетероциклоалифатические фрагменты включают азиридинил, азетидинил, 1,3-диоксанил, оксетанил, тетрагидрофурил, пирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, тетрагидропиранил, тетрагидротиопиранил, тетрагидротиопиранилсульфон, морфолинил, тиоморфолинил, тиоморфолинил, тиоморфолинилсульфоксид, тиоморфолинилсульфон, 1,3-диоксоланил, тетрагидро-1,1-диоксотиенил, 1,4-диоксанил, тиетанил, и тому подобное. Гетероциклоалкилен обозначает двухвалентный аналог гетероциклоалкильной группы.
Термины алкокси, арилокси, алкилтио и арилтио обозначают, -О(алкил),-О(арил), ^(алкил) и ^(арил) соответственно. Примерами являются метокси, фенокси, метилтио и фенилтио соответственно.
Термин галоген или гало обозначает фтор, хлор, бром или йод.
Термин арил обозначает углеводородный остаток, имеющий моно-, би- или трициклическую кольцевую систему, где каждое кольцо имеет от 3 до 7 атомов углерода и по меньшей мере одно кольцо является ароматическим. Кольца в кольцевой системе могут быть слиты друг с другом (как в нафтиле) или соединены друг с другом (как в бифениле) и могут быть слиты или связаны с неароматическими кольцами (как в инданиле или циклогексилфениле). В качестве дополнительной иллюстрации, арильные группы включают, но не ограничиваются этим, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, бифенил, фенантрил, антраценил и аценафтил. Арилен обозначает двухвалентный аналог арильной группы, например 1,2-фенилен, 1,3-фенилен или 1,4-фенилен.
Термин гетероарил обозначает фрагмент, имеющий моно-, би- или трициклическую кольцевую систему, где каждое кольцо содержит от 3 до 7 атомов углерода и по меньшей мере одно кольцо является ароматическим кольцом, содержащим от 1 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из N, О или S, где N и S необязательно могут быть окислены, а N необязательно может быть кватернизован. Такое ароматическое кольцо, содержащее по меньшей мере один гетероатом, может быть конденсировано с другими типами колец (как в бензофураниле или тетрагидроизохинолиле) или непосредственно соединено с другими типами колец (как в фенилпиридиле или 2-циклофенилпиридиле). В качестве дополнительной иллюстрации гетероарильные фрагменты включают пирролил, фуранил, тиофенил (тиенил), имидазолил, пиразолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, триазолил, тетразолил, пиридил, Nоксопиридил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, хинолинил, изохинолинил, хиназолинил, циннолинил, хинозалинил, нафтиридинил, бензофуранил, индолил, бензотиофенил, оксадиазолил, тиадиазолил, фенотиазолил, бензимидазолил, бензотриазолил, дибензофуранил, карбазолил, дибензотиофенил, акридинил и тому подобное. Гетероарилен обозначает двухвалентный аналог арильной группы.
Там, где указывается, что фрагмент может быть замещен, например, посредством использования формулировки незамещенный или замещенный или необязательно замещенный, как в незамещенный или замещенный С1-С5 алкил или необязательно замещенный гетероарил, такой фрагмент может иметь один или несколько, независимо выбранных заместителей, предпочтительно в количестве от одного до пяти, более предпочтительно в количестве одного или двух. Заместители и характер замещения могут быть выбраны специалистом с обычной квалификацией в данной области, с учетом особенностей фрагмента, к которому присоединен заместитель, чтобы обеспечить соединения, которые являются химически стабильными и которые могут быть синтезированы посредством методик, известных в данной области техники, а также способов, изложенных в настоящем документе.
Арилалкил, (гетероциклоалифатический) алкил, арилалкенил, арилалкинил, биарилалкил и т.п. обозначают алкильный, алкенильный или алкинильный фрагмент, в зависимости от обстоятельств может быть замещенным на арильный, гетероциклоалифатический, биарильный и т.д. фрагмент, в зависимости от обстоятельств может быть с открытой (ненасыщенной) валентностью в алкильном, алкенильном или алкинильном фрагменте, например, как в бензиле, фенэтиле, N-имидазоилэтиле, Nморфолиноэтиле и т.п. И наоборот, термины алкиларил, алкенилциклоалкил и т.п. обозначают арильный, циклоалкильный и т. п. фрагменты, в зависимости от обстоятельств могут быть замещены на алкильный, алкенильный и т. п. фрагменты, в зависимости от обстоятельств могут быть, например, как в метилфениле (толиле) или аллилциклогексиле. Гидроксиалкил, галогеналкил, алкиларил, цианарил и т.п. обозначают алкильный, арильный и т.п. фрагменты, в зависимости от обстоятельств могут быть замещены на один или несколько идентифицированных заместителей (гидроксилом, галогеном и т.д. в зависимости от обстоятельств).
Например, возможные заместители включают, но не ограничиваются этим, алкил (особенно метил или этил), алкенил (особенно аллил), алкинил, арил, гетероарил, циклоалифатический, гетероциклоали- 10 030830 фатический, галогено (особенно фтор), галогеналкил (особенно трифторметил), гидроксил, гидроксиалкил (особенно гидроксиэтил), циано, нитро, алкокси, -О(гидроксиалкил), -О(галогеналкил) (особенно OCF3), -О(циклоалкил), О(гетероциклоалкил), -О(арил), алкилтио, арилтио, =О, =NH, =Малкил). =NOH, =NO (алкил), -С(=О)(алкил), -С(=О)Н, -СО2Н, -С(=О)NHOH, -С(=О)О(алкил), -С(=О)О(гидроксиалкил), -С(=O)NH2, -С(=О)NH(алкил), -C(=O)N^km)2, ^^^Халкил), -OC(=О)(гидроксиалкил), -OC(=O)^km), -OC(=О)О(гидроксиалкил), -OC(=О)NH2, -OC(=О)NH(алкил), -ОС(=О)^алкил)2, азидо, -NH2, -Ж(алкил), -Ы(алкил)2, -ИЩарил), -Ж(гидроксиалкил), -^^^Халкил), -NHC(=O)H,
-NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH^km), -NHC(=O)N(алкил)2, -NHC(=NH)NH2, -OSOzCjuk^), -SH, ^(алкил), ^(арил), ^(циклоалкил), -С(=О)алкил, -SO2^km), -SO2NH2, -SO2NH^km), -SO2N(uiao)2 и т.п.
В случае, если фрагмент, будучи замещенным, представляет собой алифатический остаток, предпочтительными заместителями являются арил, гетероарил, циклоалифатический, гетероциклоалифатический, галоген, гидроксил, циано, нитро, алкокси, -О(гидроксиалкил), -О(галогеналкил), -О(циклоалкил), -О(гетероциклоалкил), -О(арил), алкилтио, арилтио, =О, =NH, =^алкил), =NOH, =NO(алкил), -СО2Н, -Q^NHOH, -С(=О)О(алкил), -С(=О)О(гидроксиалкил), -С(=O)NH2, -С(=О)NH(алкил),
-С^О^алкилХ, -OC(=O) (алкил), -OC(=O) (гидроксиалкил), -OC(=O) (алкил), -OC(=O)О(гидроксиалкил), -OC(=О)NH2, -OC(=О)NH(алкил), -OC(=О)N(алкил)2, азидо, -NH2, -Ж^кил), -Ы(алкил)2, -М^арил), -NH(гидроксиалкил), -NHC(=O)^km), -NHC(=O)n, -NHC(=О)NH2, -NHC(=О)NH(алкил), -NHC(=О)N(алкил)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2^km), -SH, ^(алкил), ^(арил), ^(=О)алкил, ^(циклоалкил), -SO2^km), -SO2NH2, -SO2NH(uk^) и SO2N(алкил)2. Более предпочтительными заместителями являются галоген, гидроксил, циано, нитро, алкокси, -О(арил), =О, =NOH, =NO(алкил), -OC(=O)^km), -OC(=O)^km), -OC(=О)NH2, -OC(=О)NH(алкил), -OC(=О)N(алкил)2, азидо, -NH2, -NH (алкил), -Ы(алкил)2, -Б^арил), адЮХалкил), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=О)NH(алкил), -NHC(=О)N(алкил)2 и -NHC(=NH)NH2. Особенно предпочтительными являются фенил, циано, галоген, гидроксил, нитро, С1-С4 алкокси, -О(С2-С4 алкилен)ОН и -О(С2-С4 алкилен)галоген.
В случае, если фрагмент, будучи замещенным, представляет собой циклоалифатический, гетероциклоалифатический, арильный или гетероарильный фрагмент, предпочтительные заместители представляют собой алкил, алкенил, алкинил, галоген, галогеналкил, гидроксил, гидроксиалкил, циано, нитро, алкокси, -О(гидроксиалкил), -О(галогеналкил), -О(арил), -О(циклоалкил), -О(гетероциклоалкил), алкилтио, арилтио, -С(=О)(алкил), -С(=О)Н, -СО2Н, -С(=О)NHOH, -С(=О)(алкил), -С(=О)О(гидроксиалкил), -С(=O)NH2, -С(=О)NH(алкил), -С(=О)К(алкил)2, -ОС(=О)(алкил),
-ОС(=О)(гидроксиалкил), -ОС(=О)(алкил), -ОС(=О)О(гидроксиалкил), -ОС(=О)NH2, -ОС(=О)NH(алкил), -ОС^О^алкилХ, азидо, -NH2, -Ж^кил), -Н(алкил)2, -Н^арил), -NH(гидроксиалкил), -NHC(=O)^km), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=О)NH(алкил), -NHC(=О)N(алкил)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(алкил), -SH, ^(алкил), ^(арил), -S( циклоалкил), -С(=О)алкил, -SO2^km), -SO2NH2, -SO2NH (алкил) и -SO2N^km)2. Более предпочтительные заместители представляют собой алкил, алкенил, галоген, галогеналкил, гидроксил, гидроксиалкил, циано, нитро, алкокси, -О(гидроксиалкил), -С(=О)(алкил), -С(=О)Н, -Со2Н, -С(=О)NHOH, -С(=О)(алкил), -С(=О)О(гидроксиалкил), -G(=O)NH2, -С(=О)NH(алкил), -С(=О)К(алкил)2, -ОС(=О)(алкил), -ОС(=О)(гидроксиалкил), -ОС(=О)(алкил), -ОС(=О)О(гидроксиалкил), -OС(=O)NH2, -OС(=O)NH(алкил), -ОС^О^алкилХ, -NH2, -БН(алкил), -Ы(алкил)2, -NH^ra), -NHC(=O)^™), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH^km), -NHC(=O)NRuiao)2 и -NHC(=NH)NH2. Особенно предпочтительными являются С1-С4 алкил, циано, нитро, галоген и С1-С4 алкокси.
В случае, когда диапазон указывается, как в С1-С5 алкил или от 5 до 10%, такой диапазон включает конечные точки диапазона, как C1, так и C5, в первом примере, и 5 и 10% во втором примере.
Если конкретные стереоизомеры специально не указаны (например, с помощью полужирной или пунктирной связью в соответствующем стереоцентре в структурной формуле, посредством изображении двойной связью как имеющие Е- или Z-конфигурацию в структурной формуле, или посредством использования стереохимической номенклатуры), все стереоизомеры включены в объем по настоящему изобретению как в виде чистых соединений, так и в виде их смесей. Если не указано иное, отдельные энантиомеры, диастереомеры, геометрические изомеры и их комбинации и их смеси все охватываются настоящим изобретением.
Специалистам в данной области техники очевидно, что соединения могут иметь таутомерные формы (например, кето и енольные формы), резонансные формы и цвиттерионные формы, которые эквивалентны тем, что изображены в структурных формулах, используемых в настоящем описании, и что структурные формулы охватывают такие таутомерные, резонансные или цвиттерионные формы.
Выражение фармацевтически приемлемый сложный эфир обозначает сложный эфир, который гидролизуется in vivo (например, в организме человека), образуя исходное соединение или его соль или сам по себе обладает активностью, подобной активности исходного соединения. Подходящие сложные эфиры включают С1-С5 алкильные, С2-С5 алкенильные или C2-C5 алкинильные эфиры, особенно метиловые, этиловые или н-пропиловые.
Выражение фармацевтически приемлемая соль обозначает соль соединения, пригодного для фар
- 11 030830 мацевтической композиции. Когда соединение имеет один или несколько основных групп, соль может быть кислотно-аддитивной солью, такой как сульфат, гидробромид, тартрат, мезилат, малеат, цитрат, фосфат, ацетат, памоат (эмбонат), гидроиодид, нитрат, гидрохлорид, лактат, метилсульфат, фумарат, бензоат, сукцинат, мезилат, лактобионат, суберат, тозилат и подобные. Когда соединение имеет одну или несколько кислотных групп, соль может быть солью, такая как соль кальция, соль калия, соль магния, меглуминая соль, соль аммония, соль цинка, соль пиперазина, соль трометамин, соль лития, соль холина, соль диэтиламина, соль 4-фенилциклогексиламина, соль бензатина, соль натрия, соль тетраметиламмония и тому подобное. Полиморфные кристаллические формы и сольваты также включены в объем по настоящему изобретению.
Композиции.
нее.
Кроме того, в формуле (I), группа R2 предпочтительно обозначает С1-С5 алкил, С1-С5 алкенил, С1-С5 алкинил, СН2ОС(=О)С1-С5 алкил, СН2ОС(=О)С1-С5 алкенил, СН2ОС(=О)С1-С5 алкинил, ’или |-(0Η2)ι.2^ 2 ·
Кроме того, в формуле (I), предпочтительные группы N(R3a)(R3b) представляют собой
НЖ(СН2)2ОН КГС6Н5
особенно предпочтительно, чтобы один из R3a и R3b обозначал бы Н, а другой Me. В других предпочтительных вариантах R3a и R3b оба обозначают Н или Me и, или один из R3a и R3b обозначает Н, а другой C6H5.
В другом предпочтительном варианте осуществления R3a и R3b независимо представляют собой Н, С1-С5 алкил, CH2(С5-С6циклоалкил), CH2C6H5 или СН2СН2ОН.
В определениях R1 и R2 в формуле (I), где группа определяется либо как незамещенная, либо как замещенная, предпочтительно она является незамещенной.
В формулах в настоящем описании связь, пересекающая фенильное кольцо между двумя атомами углерода фенильного кольца, обозначает, что группа, присоединенная к связи, может быть расположена в любом из орто-, мета- или пара-положениях фенильного кольца. В качестве иллюстрации, формула
обозначает
О синтезе партнеров субъединиц тубулизина Tuv и Tup с различными группами R2 и R4 сообщается Cheng et al., 2011, раскрытие которого включено в настоящем описании посредством ссылки.
В предпочтительном варианте осуществления соединения в соответствии с формулой (I) R1 обозна
чает ’
R2 представляет собой С1-С5 алкил (особенно Me или n-Pr) или
- 12 030830 один из R3a и R3b обозначает Н, а другой представляет собой Me; R4 представляет собой
где Y представляет собой Н или NO2 и R4a обозначает Н, Me, Et или;
R5 представляет Me; W представляет собой О, и n равно 1.
В другом предпочтительном варианте осуществления соединения в соответствии с формулой (I) n равно 1, W обозначает О, Y в R4 представляет собой Н или NO2 (предпочтительно Н), и R2 представляет собой
и более предпочтительно
Соединение по этому предпочтительному варианту представлено формулой (Ia)
где Y представляет собой Н или NO2; R4a обозначает Н, Me или Et; a R3a и R3b обозначают независимо Н, C6H5, Me или Et; или его фармацевтически приемлемую соль.
Еще более предпочтительно соединение имеет структуру, представленную формулой (Ia')
где R4a обозначает Н, Me или Et; a R3a и R3b обозначают независимо Н, C6H5, Me или Et; или его фармацевтически приемлемую соль.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления, W представляет собой О, Y = NH2, a n равно 1, и обе группы R2a в R2 отличны от NH2. Соединение по этому варианту осуществления, представленного формулой (Ib)
где R4a обозначает Н, Me или Et; R3a и R3b обозначают независимо Н, C6H5, Me и Et и; R6 представляет собой С1-С5 алкил, СН2ОС(=О)С1-С5 алкил, или (CH2)1-2C6H5; или его фармацевтически приемлемую соль.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления соединение имеет структуру, представленную формулой (Ib')
- 13 030830
где R4a обозначает Н, Me или Et (предпочтительно Н) и R6 обозначает Me или n-Pr; или его фармацевтически приемлемую соль.
Предпочтительно, в формулах (Ia), (Ia') и (Ib), один из R3a и R3b обозначает Н, а другой Me. В других предпочтительных вариантах R3a и R3b оба обозначают Н или оба Me и, или один из R3a и R3b обозначает Н, а другой C6H5. В других предпочтительных вариантах R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et.
Конкретные примеры соединений по настоящему изобретению включают соединения, представленные непосредственно ниже вместе с их фармацевтически приемлемыми солями
- 14 030830
- 15 030830
Соединения (I-2), (I-7), (I-8) и (I-9) являются предпочтительными.
Конъюгаты.
Не обязательно соединения по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с нацеливающим фрагментом, который специфически или предпочтительно связывается с химическим структурным элементом на раковой клетке. Предпочтительно нацеливающий фрагмент является антителом или его антиген-связывающей областью, а химический структурный элемент является антигеном, ассоциированным с опухолью. Предпочтительно, конъюгация осуществляется через химическую связь с функциональной группой в субъединицах Tuv или Tup, такой как аминогруппа.
В другом варианте осуществления обеспечивается конъюгат, содержащий цитотоксическое соединение в соответствии с настоящим изобретением и лиганд, представленным формулой (II)
- 16 030830 [D(XD)aC(XZ)b]mZ (II) где Z представляет собой лиганд; D представляет собой цитотоксическое соединение в соответствии с настоящим изобретением (например, соединение формулы (I), (Ia), (Ia') или (Ib)); и -(XD)aC(XZ)bсовместно именуются как линкерный фрагмент или линкер, потому что он связывает Z и D. Внутри линкера С находится расщепляемая группа, предназначенная для того, чтобы быть расщепленной в или вблизи сайта, который определяет биологическое действие соединения D; XD и XZ называют спейсерными фрагментами (или спейсерами), потому что они отдаляют D и С и С и Z, соответственно; индексы а и b независимо равны 0 или 1 (т.е. присутствие XD и/или XZ являются необязательными); и нижний индекс m равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (предпочтительно 1, 2, 3 или 4). D, XD, С, XZ и Z, более подробно описаны ниже.
Лиганд Z, например антитело, выполняет функцию нацеливания. Посредством связывания с тканью-мишенью или клеткой-мишенью, где расположен его антиген или рецептор, лиганд Z направляет туда конъюгат. Предпочтительно, ткань-мишень или клетка-мишень представляет собой раковую ткань или раковую клетку, и антиген или рецептор представляют собой антиген, ассоциированный с опухолью, который является антигеном, который уникально экспрессируется на раковых клетках или сверхэкспрессируется раковыми клетками, по сравнению с нераковыми клетками. Расщепление группы С на тканимишени или клетках-мишени высвобождает соединение D, которое оказывает свое цитотоксическое действие локально. В некоторых случаях конъюгат интернализуется в клетку-мишень посредством эндоцитоза и расщепление происходит в клетке-мишени. Таким образом, точная доставка соединения D достигается в месте предполагаемого действия, уменьшая необходимую дозировку. Кроме того, соединение D, как правило, является биологически неактивным (или значительно менее активным) в конъюгированном состоянии, тем самым снижая нежелательную токсичность в отношении ткани и клеток, не являющимися мишенями. Так как противоопухолевые препараты часто являются очень токсичными для клеток в целом, это является важным фактором.
Как показано посредством индекса m, каждая молекула лиганда Z может конъюгировать с более чем одним соединением D, в зависимости от количества сайтов, которые доступны в лиганде Z для конъюгации, и используемых экспериментальных условий. Специалистам в данной области техники очевидно, что в то время как каждая отдельная молекула лиганда Z конъюгирована с целым числом соединений D, препарат конъюгата может давать при анализе нецелое отношение соединения D и лиганда Z, что отражает статистическое среднее значение. Это отношение называют коэффициентом замещения (SR), или, альтернативно, в случае конъюгатов антитело-лекарственное средство, соотношением лекарственного средства и антитела (DAR). Лиганд Z и его конъюгация.
Предпочтительно, лиганд Z представляет собой антитело. Для удобства и краткости, но не в качестве ограничения, подробное последующее обсуждение в данном документе о конъюгации лиганда Z записывается в контексте его природы как антитела, но специалистам в данной области техники будет понятно, что другие типы лиганда Z могут быть конъюгированы с соответствующими изменениями. Например, конъюгаты с фолиевой кислотой в качестве лиганда могут нацеливать на клетки, имеющие рецептор фолиевой кислоты на их поверхности (Vlahov et al., 2008; Leamon et al., 2008). По той же причине, подробное обсуждение, приведенное ниже, в первую очередь записано для соотношения 1:1 антитела Z к соединению D (m = 1).
Предпочтительно, лиганд Z представляет собой антитело против опухолевого антигена, что позволяет конъюгату, содержащему такой лиганд Z, селективно нацеливать на раковые клетки. Примеры таких антигенов включают: мезотелин, простатический специфический мембранный антиген (PSMA), CD19, CD22, CD30, CD70, В7Н4 (также известный как О8Е), тирозиновая протеинкиназы 7 (PTK7), глипикан-3, RG1, CTLA 4 и CD44. Антитело может быть животного происхождения (например, мыши), химерные, гуманизированные или, что предпочтительно, человеческие. Антитело предпочтительно является моноклональным, в особенности, моноклональным человеческим антителом. Получение человеческих моноклональных антител против некоторых из вышеупомянутых антигенов описано в Korman et al., US 2009/0074660 A1 (B7H4); Rao-Naik et al., 8097703 B2 (CD19); King et al., US 2010/0143368 A1 (CD22); Keler et al., US 7387776 B2 (2008) (CD30); Terrett et al., US 8124738 B2 (CD70); Korman et al., US 6984720 B1 (2006) (cTLA-4); Korman et al., US 8008449 B2 (2011) (PD-1); Huang et al., US 2009/0297438 A1 и Cardarelli et al., US 7875278 B2 (PSMA); Terrett et al., US 2010/0034826 A1 (PTK7); Terrett et al., US 2010/0209432 (A1) (глипикан-3). Harkins et al., US 7335748 B2(2008) (RG1); Terrett et al., US 8268970 B2 (2012) (мезотелин); и Xu et al., US 2010/0092484 A1 (CD44); раскрытие которых включено в данное описание посредством ссылки.
Лиганд Z также может быть фрагментом антитела или антитело-миметиком, например аффибоди, доменным антителом (dAb), нанотелом, unibody, DARPin, антикалином, versabody, duocalin, липокалином или авимером.
Любая из нескольких различных реакционных групп на лиганде Z может быть сайтом конъюгации, включая ε-аминогруппы лизиновых остатков, углеводные остатки в качестве боковых цепей, карбоксильные группы, дисульфидные группы и тиоловые группы. Каждый тип реакционноспособной группы
- 17 030830 представляет собой компромисс, имея некоторые преимущества и некоторые недостатки. Для обзора о реакционноспособных группах антител, подходящих для конъюгации, например, см. например, Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216 и Dubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123, раскрытие которых включено в настоящем описании посредством ссылки.
В одном варианте осуществления лиганд Z конъюгируется через ε-аминогруппу лизина. Большинство антител имеют несколько экспонированных ε-аминогрупп лизина, которые могут быть конъюгированы через амидные, мочевинные, тиомочевинные или карбаматные связи с использованием способов, известных в данной области техники, включая модификации с помощью гетеробифункциональных агентов (как дополнительно описано ниже). Тем не менее, трудно контролировать, какие и сколько εаминогрупп реагируют, что приводит к потенциальной изменчивости от партии к партии препаратов конъюгатов. Кроме того, конъюгация может привести к нейтрализации протонированной εаминогруппы, важной для поддержания нативной конформации антитела, или может иметь место у лизина вблизи или на антигенсвязывающем участке, что является нежелательным явлением.
В другом варианте осуществления лиганд Z может быть конъюгирован с помощью углеводной боковой цепи, так как многие антитела являются гликозилированными. Углеводная боковая цепь может быть окислена периодатом, что приводит к образованию альдегидных групп, которые, в свою очередь, могут быть подвергнуты взаимодействию с аминами с образованием иминной группы, такие как в семикарбазоне, оксиме или гидразоне. При желании иминная группа может быть превращена в более стабильную аминогруппу посредством восстановления с помощью цианоборгидрида натрия. Для получения дополнительных сведений, касающихся конъюгации через углеводные боковые цепи, см., например, Rodwell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986); раскрытие которого включено в настоящем описании посредством ссылки. Также как с ε-аминогруппами лизина существуют неопределенность в отношении воспроизводимости локализации участка конъюгации(ий) и стехиометрии.
В еще одном варианте осуществления лиганд Z может быть конъюгирован с помощью карбоксильной группы. В одном варианте осуществления концевая карбоксильная группа функционализируется, чтобы образовать карбогидразид, который затем подвергается взаимодействию с фрагментом для конъюгации, несущим альдегид. См. Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153.
В еще одном варианте осуществления антитело Z может быть конъюгировано через дисульфидную группу, образующую мостик между остатком цистеина на антителе Z и серой на другой части конъюгата. Некоторые антитела не имеют свободных тиоловых (сульфгидрильных) групп, но имеют дисульфидные группы, например, в шарнирной области. В таком случае, свободные тиоловые группы могут быть получены восстановлением нативных дисульфидных групп. Тиоловые группы, генерируемые таким образом, затем могут быть использованы для конъюгации. См., например, Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994); и Doronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003); раскрытие которых включено в данное описание посредством ссылки. Опять же, есть опасения по поводу локализации участков конъюгации и стехиометрии, а также возможное нарушение нативной конформации антител.
Известен ряд методов для введения свободных тиоловых групп в антитела без нарушения нативных дисульфидных связей, методов, которые могут быть осуществлены с лигандом Z в соответствии с настоящим изобретением. В зависимости от используемого метода возможно введение предсказуемого количества свободных сульфгидрильных групп в заранее определенные места. В одном подходе получают мутированные антитела, в Eigenbrot et al., US 7521541 В2 (2009); Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Urnovitz et al., US 4698420 (1987); Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam et al., US 7311902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995). В другом подходе дополнительный цистеин добавляется к С-концу. См., например, Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al., Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); и Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004). Предпочтительным способом введения свободных цистеинов является способ, который предложил Liu et al., WO 2009/026274 A1, в котором аминокислотная последовательность, несущая цистеин, присоединяется к С-концу тяжелой цепи антитела. Этот метод вводит известное число цистеиновых остатков (по одному на тяжелой цепи) в известном локализации в отдалении от антигенсвязывающего сайта. Приведенные документы, процитированные в этом параграфе, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
В еще одном варианте осуществления ε-аминогруппы лизина могут быть модифицированы с помощью гетеробифункциональных реагентов, таких как 2-иминотиолан или Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (SPDP), превращая ε-аминогруппу в тиоловую или дисульфидную группу, что создает фактически суррогат цистеина. Однако этот метод страдает от тех же ограничений, свойственных ε-аминогрупп, связанных с локализации конъюгации и стехиометрии.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления лиганд Z конъюгирован через продукт нуклеофильного присоединения тиоловой группы к акцепторному фрагменту. Предпочтительным акцепторным фрагментом является малеимидная группа, чья реакция с тиоловой группой антитела в целом
- 18 030830
иллюстрируется ниже. Тиоловая группа может быть нативной группой, или группой, введенной, как описано выше.
Оч HS-Z
-------► D(X°)aC(Xz)b-N ]
Лиганд Z также может быть конъюгирован с помощью функциональной группы, адаптированной для использования с клик химией, как описано ниже.
Линкер -(XDhQX^b.
Как отмечалось выше, линкерная часть конъюгата по настоящему изобретению содержит до трех элементов: расщепляемая группа С и дополнительные спейсеры XZ и XD.
Расщепляемая группа С представляет собой группу, расщепляемую в физиологических условиях, предпочтительно выбираемую таким образом, чтобы она была относительно стабильной до тех пока конъюгат находится в общей циркуляции в плазме крови, но легко расщеплялась, когда конъюгат достигает сайт предполагаемого действия, т.е. рядом, на или в клетке-мишени. Предпочтительно, конъюгат интернализуется посредством эндоцитоза в клетку-мишень при связывании антитела Z с антигеном, экспонированного на поверхности клетки-мишени. Впоследствии расщепление группы С происходит в везикулярных структурах клетки-мишени (ранней эндосоме, в поздней эндосоме, или в особенности, в лизосоме).
В одном варианте осуществления группа С представляет собой pH чувствительную группу. pH в плазме крови незначительно выше нейтрального, в то время как pH внутри лизосом является кислой, около 5. Таким образом, группа С, расщепление которой катализируется кислотой, расщепляется со скоростью, на несколько порядков быстрее внутри лизосом, чем скорость расщепления в плазме крови. Примеры пригодных кислотно-чувствительных групп включают амиды и гидразоны цис-аконитовой кислоты, как описано в Shen et al., US 4631190 (1986); Shen et al., US 5144011 (1992); Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981) и Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988); раскрытие которых включено в данное описание посредством ссылки.
В другом варианте осуществления группа С является дисульфидом. Дисульфиды могут расщепляться посредством механизма тиол-дисульфидного обмена со скоростью, зависящей от тиоловой концентрации. Так как внутриклеточная концентрация глутатиона и других тиолов выше их концентрации в сыворотке крови, скорость внутриклеточного расщепления дисульфида будет выше. Кроме того, скорость тиол-дисульфидного обмена можно модулировать посредством регулировки стерических и электронных характеристик дисульфида (например, алкил-арил дисульфид по сравнению с алкил-алкил дисульфидом; замещением арильного кольца и т.д.), что позволяет конструировать дисульфидные связи, которые имеют повышенную стабильность в сыворотке или специфическую скорость расщепления. Для дополнительных сведений, относящихся к группам с расщепляемыми дисульфидами в конъюгата, см., например, Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi et al., US 7541530 B2 (2009); Ng et al., US 6989452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 A1; Boyd et al., US 7691962 B2; и Sufi et al., US 2010/0145036 A1; раскрытие которых включено в данное описание посредством ссылки.
Предпочтительная группа С содержит пептидную связь, которая отщепляется преимущественно с помощью протеазы на заданном участке действия, в отличие от протеазы в сыворотке. Как правило, группа С содержит от 1 до 20 аминокислот, предпочтительно от 1 до 6 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 3 аминокислот. Аминокислота(ы) могут быть природными и/или неприродными ааминокислотами. Природные аминокислоты это аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также аминокислоты производные от них, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, цитруллин и О-фосфосерин. Термин аминокислота включает также аналоги аминокислот и миметики. Аналоги являются соединениями, имеющими одинаковую общую структуру H2N(R)CHCO2H природной аминокислоты, за исключением того, что R группа отлична от групп, найденных среди природных аминокислот. Примеры аналогов включают гомосерин, норлейцин, метионин-сульфоксид метионинметилсульфоний. Аминокислота-миметик представляет собой соединение, которое имеет структуру, отличную от общей химической структуры а-аминокислоты, но функционирует аналогично природным аминокислотам. Термин неприродная аминокислота предназначен для представления D стереохимической формы, природные аминокислоты, принадлежат к L форме.
Предпочтительно группа С содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой расщепляемую последовательность, распознаваемую протеазой. Многие последовательности распознавания расщепления известны в данной области техники. См., например, Matayoshi et al., Science 247: 954 (1990); Dunn et al., Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al., Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al., Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al., Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); и Bouvier et al., Meth. Enzymol. 248: 614 (1995); раскрытие которых включено в данное описание посредством ссылки.
- 19 030830
Для конъюгатов, которые не предназначены для интернализации клеткой, группа С может быть выбрана такой, что она расщепляется с помощью протеазы, присутствующей в экстрацеллюлярном матриксе в непосредственной близости от ткани-мишени, например протеаза, высвобождаемая поблизости погибающей клетки или ассоциированные с опухолью протеазы. Примерами экстрацеллюлярных опухолеассоциированных протеаз являются матричные металлопротеиназы (ММР), тимет олигопептидаза (ТОР) и CD10.
Для конъюгатов, которые предназначены для интернализации клеткой, группа С предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную для расщепления с помощью эндосомальных или лизосомальных протеаз, особенно последних. Неограничивающие примеры таких протеаз включают катепсины В, С, D, H, L и S, особенно катепсин В. Катепсин В преимущественно расщепляет пептиды в последовательности -АА2-АА\ где АА1 является основной или сильно связанной водородными связями аминокислотой (например, лизином, аргинином или цитруллином) и АА2 является гидрофобной аминокислотой (например, фенилаланином, валином, аланином, лейцином, изолейцином или), например Val-Cit (где Cit обозначает цитруллин) или Val-Lys. (В настоящем изобретении аминокислотные последовательности написаны в направлении от N-к-С, как в H2N-AA2-AA1-CO2H, если контекст ясно не указывает на иное). Для получения дополнительной информации о катепсин-расщепляемых группах см. Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett, 8 3347-3352 (1998); и Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002); раскрытие которых включены посредством ссылки. Другой фермент, который может быть использован для расщепления пептидиллинкеров, является легумаин, лизосомальная цистеиновая протеаза, которая предпочтительно расщепляет в Ala-Ala-Asn.
В одном варианте осуществления группа С представляет собой пептид, содержащий дипептидную аминокислотную последовательность -АА2-АА1-, где АА1 представляет собой лизин, аргинин или цитруллин, а АА2 представляет собой фенилаланин, валин, аланин, лейцин или изолейцин. В другом варианте осуществления, С состоит из последовательности от одной до пяти аминокислот, выбранной из группы, состоящей из Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, AlaAla-Asn, Lys, Cit, Ser и Glu.
Получение и дизайн расщепляемых групп С, состоящих из одной аминокислоты, раскрыт в Chen et al., US 2010/0113476 A1, описание которого включено в настоящее описание посредством ссылки.
Группа С также может быть группой, расщепляемой действием света, например нитробензиловый эфир, который расщепляется под воздействием света.
Группа С может быть связана непосредственно с антителом Z или соединением D; т.е. спейсеры XZ и XD в зависимости от обстоятельств могут отсутствовать. Например, если группа С представляет собой дисульфид, один из двух атомов серы может быть остатком цистеина или его суррогатом на антителе Z. Или группа С может быть связана с гидразоном альдегида на углеводной боковой цепи антитела. Или группа С может быть пептидной связью, образованной с ε-аминогруппой лизина антител Z. В предпочтительном варианте осуществления соединение D непосредственно связано с группой С через пептидную связь с карбоксильной или аминогруппой в соединении D.
Когда он присутствует, спейсер XZ обеспечивает пространственное разделение между группой С и антителом Z, чтобы первое из упомянутых стерически не мешало связыванию антигена последним, или последний стерически не мешал бы расщеплению первого. Кроме того, спейсер XZ может быть использован для придания повышенной растворимости или для уменьшения агрегационных свойств конъюгатами. Спейсер XZ может содержать один или несколько модульных сегментов, которые могут быть собраны в любом количестве комбинаций. Примеры подходящих для сегментов спейсера XZ являются > н § 5 °
N—(СН2)2_6—(NH)q—| (CH2)2-6-C-| , i-(CH2)2-6-(NH)q—ξ ,
О г 11 г > >
Нc_(CH2)2_6-(NH)q-| ξ—(СН2СН2О)Г'СН2СН2О
F(NH)q—(ΟΗ2ΟΗ20)Γ-ΟΗ2ΟΗ2-θ4 а также их комбинации, где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен 1 до 24, предпочтительно от 2 до 4. Эти сегменты могут быть объединены, например, как показано ниже
Спейсер XD, если он присутствует, обеспечивает пространственное разделение между группой С и
- 20 030830 соединением D, чтобы последний не мешал стерически или в электронным образом расщеплению первого. Спейсер XD также может служить для введения дополнительной молекулярной массы и химической функциональности в конъюгат. Как правило, дополнительная масса и функциональность влияют на период полураспада и другие свойства конъюгата в сыворотке. Таким образом, за счет рационального выбора спейсерных групп может быть модулирован период полураспада конъюгата в сыворотке. Спейсер XD также может быть собран из модульных сегментов, как описано выше в контексте спейсера XZ.
Спейсеры XZ и/или XD, если они присутствуют, предпочтительно обеспечивают линейное расстояние от 4 до 25 атомов углерода, более предпочтительно от 4 до 20 атомов, между Z и С или D и С соответственно.
Либо спейсер XZ, либо XD, либо оба, могут содержать саморасщепляющийся фрагмент. Саморасщепляющийся фрагмент представляет собой фрагмент, который (1) присоединен к группе С и либо к антителу Z, либо к цитотоксину D и (2) имеет структуру такую, что расщепление группы С инициирует последовательность реакций, которая приводит к разрыву связи в саморасщепляющемся фрагменте между антителом Z или цитотоксином D в зависимости от ситуации. Другими словами, реакция на сайте, удаленном от антитела Z или цитотоксина D (отщепление от группы С), приводит к тому, что связи XZ-Z или XD-D также разрываются. Наличие саморасщепляющегося фрагмента желательно в случае спейсера XD, потому что если после расщепления конъюгата, спейсер XD или его часть остаются прикрепленными к цитотоксину D, биологическая активность последнего может быть нарушена. Применение саморасщепляющегося фрагмента особенно желательно, когда расщепляемая группа С представляет собой полипептид.
Примерные саморасщепляющегося фрагменты (I)-(V), связанные пой на партнере молекулы D, показаны ниже с гидроксильной или аминогруп-
Саморасщепляющийся фрагмент представляет собой структуру между пунктирными линиями а и b, со смежными структурными особенностями, показанными, чтобы обеспечить контекст. Саморасщепляющиеся фрагменты (i) и (v) соединены с соединением D-NH2 (т.е. соединение D конъюгировано через аминогруппу), в то время как саморасщепляющиеся фрагменты (ii), (iii) и (iv) связаны к соединением DOH (т.е. соединение D конъюгировано через гидроксильную или карбоксильную группу). Расщепление амидной связи в пунктирной линии b высвобождает амидный азот в виде аминного азота, что инициирует последовательность реакций, которые приводят к расщеплению связи в пунктирной линии а и последующему высвобождению D-OH или NH2-D в зависимости от обстоятельств. Для дополнительных раскрытий в отношении саморасщепляющихся фрагментов, см. Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone et al., US 6214345 B1 (2001); Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941); Boyd et al., US 7691962 B2; Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Sufi et al., WO 2008/083312 A2; Feng, US 7375078 B2; и Senter et al., US 2003/0096743 A1; раскрытие которых включены посредством ссылки.
В другом варианте осуществления нацеливающий фрагмент антитела и цитотоксическое соединение D связаны посредством нерасщепляемого линкера. Деградация антитела в конечном итоге уменьшает линкер до небольшого фрагмента-аппендикса, который не мешает биологической активности цитотоксического соединения D.
Соединение D. Линкерные композиции.
Конъюгаты по настоящему изобретению предпочтительно получают сначала посредством присоединения соединения D к линкеру (XD)aC(XZ)b, (где XD, С, XZ и b такие, как определено для формулы (II)) с образованием композиции лекарственное средство-линкер, представленной формулой (III)
D-(XD)aC(Xz)b-R31 (Ш) где R31 представляет собой функциональную группу, подходящую для реакции с функциональной
- 21 030830 группой антитела Z с образованием конъюгата. Примеры подходящих групп R31 включают аминогруппу, азид, циклооктин
где R32 представляет собой Cl, Br, F, мезилат или тозилат, и R33 обозначает Cl, Br, I, F, ОН, -O-Nсукцинимидил, -О-(4-нитрофенил), -О-пентафторфенил, или -О-тетрафторфенил. Химия, как правило, используемая для приготовления подходящих фрагментов D-(XD)aC(XZ)b-R31 описана в Ng et al., US 7087600 B2 (2006); Ng et al., US 6989452 B2 (2006); Ng et al., US 7129261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1; Boyd et al., US 7691962 B2; Chen et al., US 7517903 B2 (2009); Gangwar et al., US 7714016 B2 (2010); Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Gangwar et al., US 7847105 B2 (2010); Gangwar et al., US 7968586 B2 (2011); Sufi et al., US 2010/0145036 A1; и Chen et al., US 2010/0113476 A1; раскрытие которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
Предпочтительно реакционноспособная функциональная группа -R31 представляет собой -NH2, -ОН, -СО2Н, -SH, малеимидо, циклооктин, азидо (-N3), гидроксиламино (-ONH2) или Nгидроксисукцинимидо. Особенно предпочтительные функциональные группы -R31 выбирают из группы, состоящей из
-ОН-группа может быть этерифицирована карбоксильной группой на антителе, например, принадлежащей боковой цепи аспарагиновой или глутаминовой кислоты.
-СО2Н-группа может быть этерифицирована группой -ОН или амидирована аминогруппой (например, на боковой цепи лизина) на антителе.
N-гидроксисукцинимидная группа является функционально активированной карбоксильной группой и может быть удобно амидирована посредством реакции с аминогруппой (например, от лизина).
Малеимидная группа может быть конъюгирована с -SH-группой на антителе (например, от цистеина или от химической модификации антитела для введения сульфгидрильной функции), по реакции присоединения Михаэля.
-SH-группа особенно полезна для конъюгации, если антитело было модифицировано так, чтобы ввести в него малеимидную группу, по реакции присоединения Михаэля, которая является зеркальным отражением того, что описано выше. Антитела могут быть модифицированы для введения малеимидных групп с помощью №сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (SMCC) или его сульфированного варианта сульфо-SMCC, оба реагенты доступны от Sigma-Aldrich.
Азид и циклооктин являются взаимодополняющими функциональными группами, которые могут эффективно конъюгироваться с помощью так называемой клик-химии без меди, в котором азид присоединяется через напряженную алкиновую связь в циклооктине, чтобы образовать 1,2,3-триазоловое кольцо, см., например, e.g., Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571-6584. Азид может быть реакционноспособной функциональной группой R31 в формуле (III), а циклооктин может быть расположен на антителе или антиген-связывающей его части, или наоборот. Циклооктиновая группа может быть обеспечена посредством DIBO reagent (доступен от Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, Oregon).
Методики введения неприродных аминокислот в антитела могут быть использованы с помощью неприродной аминокислоты, обеспечивающей функциональность для конъюгации с реакционноспособной функциональной группой. Например, неприродная аминокислота п-ацетилфенилаланин может быть включена в антитело или другой полипептид, как описано в Tian et al., WO 2008/030612 A2 (2008). Кетогруппа в п-ацетилфенилаланине может быть сайтом конъюгации посредством образованием оксима с гидроксиламиной реакционноспособной функциональной группой. Альтернативно, неприродная амино- 22 030830 кислота п-азидофенилаланин может быть включена в антитело, чтобы обеспечить азидную функциональную группу для конъюгации через клик-химию. Неприродные аминокислоты могут быть также включены в антитело или другой полипептид с использованием бесклеточных методов, как описано в Goerke et al., US 2010/0093024 A1 (2010) и Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416.
Аминогруппа (NH2) может быть использована для конъюгации с использованием фермента трансглутаминазы, как описано в Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995-9997.
Конъюгация может быть также осуществлена с использованием фермента Сортаза А, как описано в Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10; Ploegh et al., WO 2010/087994 A2 (2010); и Mao et al., WO 2005/051976 A2 (2005). Мотив распознавания сортазы (обычно LPXTG, где X обозначает любую природную аминокислоту) может быть расположен на лиганде Z, а нуклеофильный акцепторный мотив (как правило, GGG) может быть группой R31 в формуле (III), или наоборот.
Группа D в формулах [D(XD)aC(XZ)b]mZ и D-(XD)aC(XZ)b-R31 предпочтительно имеет структуру в соответствии с формулой (D-a)
или формулы (D-b)
где Y представляет собой Н или NO2; R4a обозначает Н, Me или Et; R3a и R3b обозначает независимо
где R7 представляет собой Н, Me или Et.
Примеры композиций в соответствии с формулой D-(XD)aC(XZ)b-R31 включают композиции, пока- 23 030830 занные непосредственно ниже; вместе с их фармацевтически приемлемыми солями
- 24 030830
- 25 030830
и
Предпочтительное лекарственное средство-линкерное соединение имеет структуру, представленную формулой (III-а)
где R3a и R3b независимо обозначают Н, Me или Et;
R6 обозначает Me, Et или n-Pr;
ААа и каждое AAb независимо выбираются из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γаминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γ-карбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина;
р равно 1, 2, 3 или 4;
q равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (предпочтительно 2, 3 или 4);
r равно 1, 2, 3, 4 или 5;
s равно 0 или 1; и
R31 выбирается из группы, состоящей из
- 26 030830
или его фармацевтически приемлемой соли.
В формуле (III-а) -ААа-[AAb]p- представляет собой полипептид, длина которого определяется значением p (например, дипептид, если p равно 1, тетрапептид, если p равно 3, и т.д.). ААа находится на карбоксиконце полипептида и его карбоксильная группа образует пептидную (амидную)связь с анилиновым азотом лекарственного препарата. С другой стороны, последний AAb находится на аминоконце полипептида и его α-аминогруппа образует пептидную связь с если s равно 1 и с
если s равно 0.
Более предпочтительное лекарственное ставленную формулой (III-b) средство-линкерное соединение имеет структуру, пред-
где R6 обозначает Me или n-Pr;
q равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (предпочтительно 2, 3 или 4); r равно 1, 2, 3, 4 или 5;
s равно 0 или 1; и
R31 выбирается из группы, состоящей из
или его фармацевтически приемлемой соли.
Получение конъюгатов.
Ниже следуют иллюстративные процедуры, основанные на введении свободных тиоловых групп в антитело по реакции ε-аминогрупп лизина с 2-иминотиоланом с последующей реакцией с малеимидсодержащим фрагментом лекарственный препарат-линкер, таким как описано выше. Первоначально в антителе буфер заменяли на 0,1М фосфатный буфер (pH 8,0), содержащим 50 мМ NaCl и 2 мМ диэтилентриамин пентауксусной кислоты (DTPA) и концентрировали до 5-10 мг/мл. Тиолирование достигается добавлением 2-иминотиолана к антителу. Количество 2-иминотиолана, которое необходимо было добавить, может быть определено в предварительном эксперименте, и оно варьируется от антитела к антителу. В предварительном эксперименте титрование увеличивающимися количествами 2-иминотиолана приводит к присоединение к антителу, и после инкубации с антителом в течение 1 ч при комнатной температуре (около 25°C) антитело обессоливали в 50 мМ буфере HEPES pH 6,0 с использованием G-25 колонки (SEPHADEX™), и количество введенных тиоловых групп быстро определяли с помощью реакции с дитиодипиридином (DTDP). Реакция тиоловых групп с DTDP приводит к высвобождению тиопиридина, который может контролироваться спектроскопически при 324 нм. Используются, как правило, образцы с концентрацией белка 0,5-1,0 мг/мл. Поглощение при 280 нм может быть использовано для точного определения концентрации белка в образцах, и затем аликвоту каждого образца (0,9 мл) инкубировали с
- 27 030830
0,1 мл DTDP (5 мМ сток-раствора в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Пустые образцы, содержащие только буфер плюс DTDP, также инкубировали вместе. Через 10 мин измеряли оптическую плотность при 324 нм, и количество тиоловых групп количественно определяли с использованием коэффициента экстинкции для тиопиридина равным 19,800 М-1.
Как правило, желательным является уровень тиолирования около трех тиоловых групп на антитело. Например, для некоторых антител это может быть достигнуто посредством добавления 15-кратного молярного избытка 2-иминотиолана с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Антитела инкубировали с 2-иминотиоланом в желаемом молярном соотношении, а затем обессоливали в буфере для конъюгации (50 мМ буфер HEPES, pH 6,0, содержащий 5 мМ глицина и 2 мМ DTPA). Тиолированный материал поддерживается на льду, а число введенных тиолов определяется количественно, как описано выше.
После проверки количества введенных тиолов лекарственное средство-линкерный фрагмент добавляют в 3-кратном молярном избытке, считая на тиол. Реакции конъюгирования дают протекать в буфере для конъюгации, также содержащим 5% конечную концентрацию диметилсульфоксида (ДМСО), или подобного альтернативного растворителя. Обычно сток-раствор лекарственное средство-линкер растворяли в 100% ДМСО. Сток-раствор добавляют непосредственно к тиолированному антителу, которое имеет достаточно ДМСО для доведения конечной концентрации до 10%, или предварительно разбавленному в буфере, содержащем конечную концентрацию в буфере для конъюгации 10% ДМСО, с последующим добавлением к равному объему тиолированного антитела.
Конъюгационную реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании. После инкубации конъюгационную реакционную смесь центрифугировали и фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Очистка конъюгата может быть достигнута посредством хроматографии с использованием ряда способов. В одном способе конъюгат очищают с помощью гель-фильтрации на колонке Sephacryl™ S200, предварительно уравновешенной 50 мМ буфер HEPES pH 7,2, содержащим 5 мМ глицина и 150 мМ NaCl. Хроматография осуществляется при линейной скорости потока 28 см/ч. Фракции, содержащие конъюгат, собирали, объединяли и концентрировали. В альтернативном способе очистка может быть достигнута с помощью ионообменной хроматографии. Условия варьируются от антитела к антителу и должны оптимизироваться в каждом случае. Например, смесь конъюгата антителолекарственное средство наносят на колонку SP-Sepharose™, предварительно уравновешенную в 50 мМ HEPES, pH 5,5, содержащим 5 мМ глицин. Конъюгат антитела элюировали с использованием градиента 0-1М NaCl в равновесном буфере при pH 5,5. Соответствующие фракции, содержащие конъюгат, собирали и диализовали против рецептурного буфере (50 мМ буфер HEPES, pH 7,2, содержащего 5 мМ глицина и 100 мМ NaCl).
Специалисты в данной области техники поймут, что вышеописанные условия и методология являются примерными, а не ограничивающими, и что другие подходы к конъюгации хорошо известны в данной области техники и используемы в настоящем изобретении.
Конъюгат, полученный по методике, описанной выше, представлен формулой (II-1). Он представляет собой конъюгат соединения (III-1) и антимезотелинового антитела 6А4 (Terrett et al., 2012) (П-1)
Специалистам в данной области техники очевидно, что такой препарат конъюгата может иметь фрагменты с разными коэффициентами замещения, как правило, в интервале от 1 до 5 и что такой препарат может быть представлен формулой (II-1')
где R6 обозначает Me или n-Pr, a Ab представляет собой антитело. Антитело предпочтительно пред- 28 030830 ставляет собой анти-CD70, антимезотелиновое или антиглипикан-3 антитело.
Фармацевтические композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению или его конъюгат, находящиеся в составе вместе с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом. Она может необязательно содержать один или несколько дополнительных фармацевтически активных ингредиентов, таких как антитела или другой лекарственный препарат. Фармацевтические композиции можно вводить в комбинированной терапии с другим терапевтическим агентом, особенно другим противоопухолевым агентом.
Фармацевтическая композиция может содержать один или несколько вспомогательных веществ. Вспомогательные вещества, которые могут быть использованы, включают носители, поверхностноактивные вещества, загустители или эмульгаторы, твердые связующие вещества, диспергирующие или суспендирующие добавки, солюбилизаторы, красители, отдушки, покрытия, разрыхлители, смазывающие вещества, подсластители, консерванты, изотонические агенты и их комбинации. Выбор и использование подходящих вспомогательных веществ описывается в книге Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003), раскрытие которой включено в настоящем описании посредством ссылки.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, посредством инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активное соединение может быть покрыто материалом, чтобы защитить его от воздействия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать его. Выражение парентеральное введение обозначает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включает в себя, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, интрадермальную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, внутрикожную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Альтернативно, фармацевтическая композиция может быть введена с помощью непарентерального пути, такого как местного, эпидермального или мукозального пути введения, например интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или наружно.
Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильных водных растворов или дисперсий. Они также могут быть сформулированы в виде микроэмульсии, липосом или другой упорядоченной структуры, подходящей для достижения высокой концентрации лекарственного средства. Композиции могут быть также в форме лиофилизатов для восстановления в воде перед введением.
Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом-носителем для получения разовой лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от пациента, которого лечат, и конкретного способа введения, и обычно будет таким количеством композиции, которое обеспечивает терапевтический эффект. Как правило, из ста процентов, это количество будет варьироваться от приблизительно 0,01 процента до около девяносто девять процентов активного ингредиента, предпочтительно от около 0,1 до около 70%, наиболее предпочтительно от около 1 до около 30% активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Режимы дозирования регулируются так, чтобы обеспечить терапевтический ответ. Например, можно вводить единственный болюс, можно вводить несколькими разделенными дозами в течение долгого времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как указано в конкретной ситуации. Особенно целесообразно составлять парентеральные композиции в единичной дозированной форме для простоты введения и однородности дозирования. Лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов, которые будут лечиться; причем каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное на получение желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем.
Диапазоны доз находятся в интервале от около 0,0001 до 100 мг/кг и более обычно от 0,01 до 5 мг/кг от массы тела пациента. Например дозировки могут быть 0,3 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в пределах 1-10 мг/кг. Примерные схемы лечения могут быть: введение один раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, один раз каждые четыре недели, раз в месяц, раз в 3 месяца или раз в три-шесть месяцев. Предпочтительные режимы дозирования включают 1 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела посредством внутривенного введения с использованием одной из следующих схем введения: (i) каждые четыре недели для шести дозировок, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела один раз с последующим 1 мг/кг массы тела каждые три недели. В некоторых методах дозировка регулируется для достижения концентрации в плазме антител около 1-1000 мкг/мл, а в некоторых методах около 25-300 мкг/мл.
Терапевтически эффективное количество соединения по изобретению предпочтительно приводит к уменьшению выраженности симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности бессимптомных периодов болезни, или предотвращения нарушений или инвалидности вследствие поражения болезнью. Например, для лечения пациентов, несущих опухоли терапевтически эффективное коли
- 29 030830 чество предпочтительно ингибирует рост опухоли по меньшей мере приблизительно на около 20%, более предпочтительно по меньшей мере на около 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на около 60%, и еще более предпочтительно по меньшей мере на около 80% по отношению к нелеченным пациентам. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшить размер опухоли или иным образом облегчить симптомы у пациента, который, как правило, является человеком, но может быть другим млекопитающим.
Фармацевтическая композиция может быть с контролируемым или замедленным высвобождением, включая имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Биоразлагаемые, биосовместимые полимеры могут быть использованы, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, таких как (1) безыгольные устройства для подкожных инъекций (например US 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824; и 4596556); (2) микроинфузионные насосы (US 4487603); (3) трансдермальные устройства (US 4486194); (4) аппараты для инфузии (US 4447233 и 4447224); и (5) осмотические устройства (US 4439196 и 4475196); раскрытие которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть приготовлена так, чтобы обеспечить надлежащее распределение in vivo. Например, чтобы гарантировать, что терапевтические соединения по настоящему изобретению проходят через гематоэнцефалический барьер, они могут быть приготовлены в виде липосом, которые могут дополнительно содержать нацеливающие фрагменты для повышения селективного транспорта к специфическим клеткам или органам. См., например US 4522811; 5374548; 5416016; и 5399331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; и Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273
Применения.
Соединения по настоящему изобретению или их конъюгаты могут быть использованы для лечения заболеваний, таких как, но не ограничиваясь этим, гиперпролиферативные заболевания, включая рак головы и шеи, которые включают опухоли головы, шеи, носовой полости, околоносовых пазух, носоглотки, полости рта, ротоглотки, гортани, гортаноглотки, слюнных желез и параганглиомы; рак печени и желчных протоков, особенно гепатоцеллюлярная карцинома; злокачественные опухоли кишечника, в частности колоректальный рак; рак яичников; мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого (МРЛ и НМРЛ); рак молочной железы саркомы, такие как фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, эмбриональная рабдомиосаркома, лейомиосаркома, нейрофибросаркома, остеосаркома, синовиальная саркома, липосаркома и альвеолярная саркома мягких тканей; лейкозы, такие как острая промиелоцитарная лейкемия (ОПЛ), острый миелобластный лейкоз (ОМЛ), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) и хронический миелолейкоз (ХМЛ); новообразования центральной нервной системы, в частности рак мозга; множественная миелома (ММ), лимфомы, такие как лимфома Ходжкина, лимфоплазмацитоидная лимфома, фолликулярная лимфома, лимфома лимфоидной ткани слизистых оболочек, лимфома мантийных клеток, крупноклеточная В клеточная лимфома, лимфома Беркитта, Т-клеточная анапластическая крупноклеточная лимфома. В клиническом отношении применение способов и использования описанных в настоящем изобретении композиций приводит к уменьшению размера или количества злокачественных опухолей и/или снижению ассоциированных симптомов (где применимо). Что касается патологии, применение способа и использование композиций, описанных в данном документе, приведет к патологически соответствующему ответу, такому как ингибирование пролиферации раковых клеток, снижение размера рака или опухоли, предотвращение дальнейшего метастазирования и ингибирование опухолевого ангиогенеза. Способ лечения таких заболеваний включает введение пациенту терапевтически эффективного количества комбинации согласно изобретению. Способ может быть повторен при необходимости. В частности, рак может быть раком почек, легких, желудка или раком яичника.
Соединения по настоящему изобретению или их конъюгаты могут быть введены в комбинации с другими терапевтическими агентами, включая антитела, алкилирующие агенты, ингибиторы ангиогенеза, антиметаболиты, агенты, расщепляющие ДНК, агенты, сшивающие ДНК, интеркаляторы ДНК, агенты, связывающиеся в малой бороздке ДНК, ендиины, ингибиторы белка теплового шока 90, ингибиторы гистондеацетилазы, иммуномодуляторы, стабилизаторы микротрубочек, аналоги нуклеозидов (пуриновых или пиримидиновых), ингибиторы ядерного экспорта, ингибиторы протеосом, ингибиторы топоизомеразы (I или II), ингибиторы тирозинкиназы и ингибиторы серин/треонин киназы. Конкретные терапевтические агенты включают адалимумаб, ансамитоцин P3, ауристатин, бендамустин, бевацизумаб, бикалутамид, блеомицин, бортезомиб, бусульфан, каллистатин А, камптотецин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, цетуксимаб, цисплатин, кладрибин, цитарабин, криптофицины, дакарбазин дазатиниб, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, дуокармицин, динемицин А, эпотилон, этопозид, флоксуридин,
- 30 030830 флударабин, 5-фторурацил, гефитиниб, гемцитабин, ипилимумаб, гидроксимочевина, иматиниб, инфликсимаб, интерфероны, интерлейкины, β-лапакон, леналидомид, иринотекана, майтансин, мехлорэтамин, мелфалан, 6-меркаптопурин, метотрексат, митомицин С, нилотиниб, оксалиплатин, паклитаксел, прокарбазин, субероиланилид гидроксамовой кислоты (SAHA), 6-тиогуанидин, тиотепа, тенипозид, топотекан, трастузумаб, трихостатин А, винбластин, винкристин и виндезин.
Примеры
Практическое применение по настоящему изобретению может быть более понятно с ссылкой на следующие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации, а не для ограничения.
Пример 1. Соединение (III-1).
В этом примере описан синтез соединения (III-1), соответствующая схема показана в комбинации фиг. 1, 2а-2b и 3.
Соединение 2. Смесь соединения 1 (6 г, 16,6 ммоль; полученное в соответствии с Peltier et al., 2006) и параформальдегида (9,94 г, 331 ммоль) в толуоле (150 мл) нагревали в герметично закрытом сосуде при 70°C в течение 24 ч. Тонкослойная хроматография (ТСХ) показала, что реакция завершена. Реакционную смесь фильтровали через фильтрующий слой CELITE™ и осадок на фильтре тщательно промывали толуолом. После выпаривания растворителя неочищенный продукт очищали с помощью флэшхроматографии, элюируя с силикагеля с градиентом 0-70% этилацетата (EtOAc) в дихлорметане (ДХМ) с получением 4,76 г соединения 2 в виде светло-желтого масла. МС (+) m/z 375,2 (М +1).
Соединение 3. Соляную кислоту (4,0М в 1,4-диоксане, 12,24 мл, 50,8 ммоль) добавляли по каплям к раствору соединения 2 (4,76 г, 12,7 ммоль) в ацетонитриле (62 мл) и метаноле (6,8 мл) в присутствии цианоборгидрида на подложке (MP-BH3CN) смолы (4,85 г, 12,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. ЖХ-МС показала, что реакция пришла к завершению. Смолу отфильтровывали и промывали смесью ацетонитрил-метанол. После выпаривания растворителя неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-10% метанола в ДХМ, содержащего 1% NH4OH, получая неочищенное соединение 3.
Фракции продукта концентрировали, разбавляли EtOAc и промывали один раз насыщенным водным NaHCO3, чтобы удалить избыток соли аммония. Водную фракцию подвергали обратной экстракции один раз этилацетатом. Объединенные органические фазы сушили и концентрировали с получением 2,82 г соединения 3 в виде вспененного твердого вещества. МС (+) m/z 273,2 (М + 1).
Соединение 4. ^Бензил-И-циклогексилкарбодиимид, связанный с полимером (Aldrich, 4,5 г, 5,21 ммоль) добавляли к раствору соединения 3 (1,42 г, 5,21 ммоль), трет.-бутанола (0,72 г, 5,32 ммоль) и Восзащищенного изолейцина 3а (1,27 г, 5,47 ммоль) в ДХМ (48 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смолу отфильтровывали и промывали ДХМ. Фильтрат концентрировали, разбавляли EtOAc и промывали один раз насыщенным водным NaHCO3. Водный раствор дважды экстрагировали EtOAc. Объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-10% метанола в ДХМ, содержащем 1% NH4OH, с получением фракций содержащих промежуточный продукт 3b.
Фракции, содержащие продукт, объединяли, концентрировали, разбавляли EtOAc и промывали насыщенным водным NaHCO3, чтобы удалить избыток соли аммония. Водную фракцию обратно экстрагировали один раз этилацетатом. Объединенные органические фазы сушили и концентрировали с получением промежуточного продукта 3b в виде твердого вещества белого цвета.
Промежуточный продукт 3b в толуоле (50 мл) нагревали до 90°C в герметично закрытом сосуде в течение ночи при перемешивании. ЖХ-МС показал, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-100% EtOAc в гексане с получением 1,3 г соединения 4 в виде светло-желтого твердого вещества. МС (+) m/z 486,3 (М+1).
Соединение 5. Трифторуксусную кислоту (TFA, 26 мл) добавляли к смеси соединения 4 в ДХМ (26 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 мин, ЖХ-МС показала завершение реакции. Раствор концентрировали, разбавляли этилацетатом и промывали один раз насыщенным водным NaHCO3. Водный раствор обратно экстрагировали дважды EtOAc. Объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали с получением 1,03 г соединения 5 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 386,3 (М+1).
Соединение 6. DCC (0,664 г, 3,22 ммоль) добавляли к смеси соединения 5 (1,03 г, 2,68 ммоль), (R)1-метилпиперидин-2-карбоновой кислоты 5а (0,4 г, 2,81 ммоль; полученной в соответствии с Peltier et al., 2006), и трет.-бутанола (0,369 г, 2,73 ммоль) в ДХМ при 0°C. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Твердое вещество отфильтровывали и фильтрат концентрировали. Остаток растворяли в EtOAc и промывали один раз насыщенным водным раствором NaHCO3. Водный раствор обратно экстрагировали дважды EtOAc. Объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-20% метанола в
- 31 030830
ДХМ, с получением 1,23 г соединения 6 в виде светло-желтого твердого вещества. MC(+)m/z 511,4 (М+1).
Соединение 7. Смесь N.N-диизопропилэтиламина (DIEA, также упоминаемый как DIPEA, 0,972 мл, 5,58 ммоль), бис(4-нитрофенил) карбоната (BNPC, 1,698 г, 5,58 ммоль) и соединения 6 (0,57 г, 1,116 ммоль) в ^№диметилформамиде (ДМФА, 10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ЖХ-МС показала, реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью хроматографии на силикагеле с градиентом 0-20% метанола в ДХМ с получением 0,68 г соединения 7 в виде желтого масла. МС (+) m/z 676,4 (М+1).
Соединение 8. Метиламин в метаноле (2,0М, 0,089 мл, 0,178 ммоль) добавляли к соединению 7 (0,1 г, 0,148 ммоль) в метаноле (1 мл). После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, ЖХ-МС показала завершение реакции. Растворитель выпаривали с получением 0,084 г соединения 8. МС (+) m/z 568,4 (М +1)
Соединение 9. Гидроксид лития (7,09 мг, 0,296 ммоль) в воде (0,5 мл) добавляли к раствору соединения 8 (0,084 г, 0,148 ммоль) в 1,4-диоксане (0,5 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, ЖХ-МС показала завершение реакции. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-30% метанола в ДХМ, с получением 0,075 г соединения 9 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 554,4 (М +1).
Соединение 10. Триэтиламин (11,73 мл, 84 ммоль) добавляли к смеси ди-трет.-бутилдикарбоната (BOC2O, 10,57 мл, 46,0 ммоль) и ^)-метил-2-амино-3-(4-нитрофенил) пропаноата гидрохлорида 9а (10 г, 38,4 ммоль) в ацетонитриле (300 мл) при 0°C. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Реакционную смесь концентрировали и продукт повторно растворяли в 200 мл диэтилового эфира. Твердое вещество отфильтровывали и фильтрат концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-50% EtOAc в гексане, с получением 11,3 г Вос-защищенного промежуточного соединения в виде белого твердого вещества.
Катализатор Pd/C (10 мас.%, 0,85 г, 7,99 ммоль) добавляли к раствору Вос-защищенного промежуточного соединения (15 г, 46,2 ммоль) в МеОН (200 мл). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение ночи. Катализатор Pd/C отфильтровывали и фильтрат концентрировали с получением
13,6 г соединения 10 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 195,2 (М+1-Вос).
Соединение 11. Пиридин (5,77 мл, 71,3 ммоль) добавляли к раствору бензилового эфира хлормуравьиной кислоты (10,18 мл, 71,3 ммоль) и соединения 10 (17,5 г, 59,5 ммоль) в ДХМ (185 мл) при 0°C. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию останавливали добавлением насыщенного водн. NaHCO3 и промывали насыщенным раствором соли. Органический слой высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-50% EtOAc в гексане, с получением 22,6 г соединения 11 в виде бесцветного масла. МС (+) m/z 329,2 (М+1-Вос).
Соединение 12. Гидрид диизобутилалюминия (DIBAL-H) в гексане (1М, 26,5 мл, 26,5 ммоль) добавляли к раствору соединения 11 (5,17 г, 12,07 ммоль) в ДХМ (39 мл) при -78°C. Реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 2 ч. Уксусную кислоту (24 мл) и толуола (36 мл) добавляли при -78°C. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры. Винную кислоту (10% водн., 69 мл) добавляли к реакционной смеси. Водный раствор экстрагировали гексаном и EtOAc (объем/объем 1:1) смеси. Объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-50% EtOAc в гексане, с получением 3,12 г соединения 12 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 299,2 (М+1-Вос).
Соединение 13. Дибутил(((трифторметил)сульфонил)окси)боран (Bu2BOTf, 1M в ДХМ, 8,61 мл, 8,61 ммоль) и DIEA (1,637 мл, 9,40 ммоль) добавляли к раствору (Ь)-4-изопропил-3пропионилоксазолидин-2-он 12а (1,450 г, 7,83 ммоль) в ДХМ (7,8 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 45 мин. Раствор соединения 12 (3,12 г, 7,83 ммоль) в ДХМ (7,8 мл) добавляли к реакционной смеси при -78°C. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры в течение ночи. Добавляли натрий-фосфатный буфер (pH 7, 29 мл). Водный раствор экстрагировали ДХМ. Объединенные органические слои промывали рассолом, сушили, фильтровали и концентрировали.
Остаток повторно растворили в метаноле (130 мл) и охлаждали до 0°C. Водный Н2О2 (30%, 39,7 мл) добавляли к реакционной смеси при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 4 ч. Добавляли воду (39 мл). Некоторое количество растворителя (МеОН) выпаривали. Водный раствор экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали 5%-ным раствором NaHCO3 и рассолом, высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-50% EtOAc в гексане с получением 4,23 г соединения 13 в виде бесцветного масла. МС (+) m/z 484,3 (М+1-Вос).
Соединение 14. ди(1Н-Имидазол-1-ил)метантион (1,5 г, 8,42 ммоль) добавляли к раствору соедине
- 32 030830 ния 13 (2,46 г, 4,21 ммоль) в ТГФ (20 мл). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью хроматографии на силикагеле с градиентом 0-50% EtOAc в гексане, с получением 1,25 г соединения 14 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 694,3 (М+1).
Соединение 15. (Е)-2,2'-(Диазен-1,2-диил)бис(2-метилпропаннитрил) (AIBN, 0,016 г, 0,095 ммоль) добавляли к раствору соединения 14 (1,78 г, 2,57 ммоль) и трибутилстаннана (Bu3SnH, 1,380 мл, 5,13 ммоль). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 30 мин (температура масляной бани 142°C). Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэшхроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-33% EtOAc в гексане, с получением 0,84 г соединения 15 в виде светло-желтого масла. МС (+) m/z 468,3 (М+1-Вос).
Соединение 16. LiOH (0,071 г, 2,96 ммоль) в воде (3,7 мл) добавляли к раствору соединения 15 (0,84 г, 1,480 ммоль) в тетрагидрофуране (ТГФ, 11,4 мл), с последующим добавлением 30% водной Н2О2 (0,271 мл, 8,88 ммоль) при 0°C. После того как реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 4 ч, добавляли 20 мл 1,33М водн. Na2SO3, чтобы оставновить реакцию. Добавляли соляную кислоту (1М), чтобы довести pH до 2-3. Полученный водный раствор экстрагировали ДХМ. Объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-75% EtOAc в гексане, с получением 0,53 г соединения 16 в виде бесцветного масла. МС (+) m/z 357,3 (М+1-Вос).
Соединение 17. Концентрированную соляную кислоту (4 капли) добавляли к раствору 2,2диметоксипропана (3,53 мл, 28,7 ммоль) и соединения 16 (0,53 г, 1,161 ммоль) в метаноле (17,7 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. ЖХ-МС также показала образование некоторых побочных продуктов с удаленными защитными группами 16а. Растворитель выпаривали.
Триэтиламин (2,2 экв., 0,36 мл) добавляли к раствору вышеуказанного остатка и Boc2O (1,2 экв., 304,3 мг) в ацетонитриле при комнатной температуре, для повторной защиты побочного продукта 16а. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Добавляли воду (7 мл) и водный раствор экстрагировали EtOAc. Объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-50% EtOAc в гексане, с получением 0,3 г соединения 17 в виде бесцветного масла. МС (+) m/z 371,3 (М+1Вос).
Соединение 18. Смесь соединения 17 (0,223 г, 0,474 ммоль) и Pd/C 10 мас.% (20 мг, 0,474 ммоль) в метаноле (6 мл) перемешивали в атмосфере H2 в течение ночи. Катализатор Pd/C отфильтровывали и фильтрат концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-50% EtOAc в гексане, с получением 0,112 г соединения 18 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 237,2 (М+t-Boc).
Соединение 19. Смесь соединения 18 (0,204 г, 0,606 ммоль), №этил-И'-(3диметиламинопропил)карбодиимида (EDC, 0,174 г, 0,910 ммоль) и Fmoc-защищенного цитруллина 18а (0,361 г, 0,910 ммоль) в ДМФА (12,4 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Насыщенный раствор NH4Cl (20 мл) добавляли, чтобы остановить реакцию. Водный раствор экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью хроматографии на силикагеле с градиентом 0-30% МеОН в ДХМ, с получением 0,25 г соединения 19 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 716,4 (М+1).
Соединение 20. Пиперидин (0,5 мл, 5,06 ммоль) добавляли к раствору соединения 19 (0,25 г, 0,349 ммоль) в ДМФА (5 мл). После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, растворитель выпаривали с получением промежуточного соединения с удаленной Fmoc защитной группой в виде остатка.
DIEA довавляли к раствору ^)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанкарбоновой кислоты 19а (0,142 г, 0,418 ммоль) и N,N,N',N'-тетраметил-O-(7-азабензотриазол-1-ил)урония (HATU, 0,146 г, 0,383 ммоль) в ДМФА (2 мл), доводя pH до 8-9. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, добавляли к реакционной смеси полученный выше остаток в ДМФА (1 мл) и DIEA, доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин, добавляли 20 мл воды, содержащей 8 мл 0,1% водную TFA. Водный раствор экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-20% МеОН в ДХМ, с получением 0,24 г соединения 20 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 815,4 (М+1).
Соединение 21. Пиперидин (0,3 мл) добавляли к раствору соединения 20 в ДМФА (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали.
Гидроксид лития (0,028 г, 1,176 ммоль) в воде (2 мл) добавляли к раствору полученного выше остатка в ТГФ (4 мл). После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в те
- 33 030830 чение 4 ч, добавляли водн. HCl (0,1н.) для подкисления реакционной смеси (pH 2-3). Растворитель частично упаривали и лиофилизировали с получением соединения 21 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 579,4 (М+1).
Соединение 22. DIEA добавляли к смеси N-гидроксисукцинимида ε-малеимидокапроновой кислоты 21а (Tokyo Chemical Industry, 64,7 мг, 0,210 ммоль) и соединения 21 (81 мг, 0,14 ммоль) в ДМФА (3 мл), доводя pH 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, добавляли 10 мл 1:1 (об./об.) смеси ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA. Продукт 22 очищали с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). МС (+) m/z 772,5 (М+1).
Соединение 23. 2,2,2-трифторуксусную кислоту (0,7 мл, 0,013 ммоль) добавляли к смеси соединения 22 (30 мг, 0,039 ммоль) в ДХМ (1 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель упаривали, получая соединение 23. МС (+) m/z 672,4 (М+1).
Соединение (III-1). DIEA добавляли к раствору соединения 9 (23.66 мг, 0,043 ммоль) и HATU (14,77 мг, 0,039 ммоль) в ДМФА (1 мл). Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, соединение 23 (26,1 мг, 0,039 ммоль) в ДМФА (1 мл) и добавляли DIEA. Значение pH реакционного раствора доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, ЖХ-МС показала завершение реакции. Реакцию останавливали добавлением 10 мл 1:1 (об./об.) смеси воды, содержащей 0,1% TFA и ацетонитрила. Продукт соединение (III-1) очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. МС (+) m/z 1207,7 (М+1).
Соединения, такие как (III-1), имеющие малеимидную группу, могут быть использованы для получения конъюгатов с помощью реакции с сульфгидрильной группой на антителе или другом лиганде. Сульфгидрильные группы могут быть одним из остатка цистеина или полученным посредством дериватизации остатка лизина с 2-иминотиоланом.
Пример 2. Соединение (III-2).
В этом примере описан синтез соединения (III-2), соответствующая схема показана в фиг. 4.
Соединение 24. №Этил-№изопропилпропан-2-амин (0,556 мл, 3,19 ммоль) добавляли к раствору гидрохлорида трет.-бутилового эфира глицина 23а (0,209 г, 1,596 ммоль), Fmoc-аминокусусная кислота 23b (0,5 г, 1,596 ммоль) и HATU (0,607 г, 1,596 ммоль) в ДМФА (5 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляли 0,1% водн. TFA (20 мл). Водный раствор экстрагировали этилацетатом и объединенные органические слои высушивали, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэшхроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-70% EtOAc в гексане, с получением 0,45 г соединения 24 в виде бесцветного масла. МС (+) m/z 449,2 (М+23).
Соединение 25. TFA (3 мл, 1,437 ммоль) добавляли к раствору соединения 24 (0,45 г, 1,055 ммоль) в ДХМ (0,5 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэшхроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-30% МеОН в ДХМ, с получением 0,39 г соединения 25 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 371,1 (М+1).
Соединение 26. N.N'-Метандиилидендициклогексанамин (DCC, 0,261 г, 1,267 ммоль) добавляли к раствору соединения 25 и 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (0,146 г, 1,267 ммоль) в ДХМ (6 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, твердое вещество отфильтровывали. Затем фильтрат концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-100% EtOAc в гексане с получением 0,43 г соединения 26 в виде бесцветного масла.
Соединение 27. DIEA добавляли к раствору соединения 21 (50 мг, 0,086 ммоль) и соединения 26 (60,6 мг, 0,130 ммоль) в ДМФА при комнатной температуре, доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, реакцию останавливали добавлением 10 мл 1:1 смеси 0,1% водн. TFA и ацетонитрила. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ давала 55 мг соединения 27 в виде твердого вещества белого цвета, МС (+) m/z 931,4 (М+1).
Соединение 28. TFA (1 мл, 0,059 ммоль) добавляли к раствору соединения 27 (55 мг, 0,059 ммоль) в ДХМ (2 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Растворитель выпаривали.
DIEA добавляли к раствору соединения 9 (32,7 мг, 0,059 ммоль) и HATU (22,47 мг, 0,059 ммоль) в ДМФА (1 мл). Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, добавляли ДМФА (2 мл) и DIEA. Значение pH реакционного раствора доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, ЖХ-МС показала завершение реакции. Реакцию останавливали добавлением 20 мл 1:1 (об./об.) смеси воды, содержащей 0,1% TFA, и ацетонитрила. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ давала 70 мг соединения 28 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 684.1 (М/2+1).
- 34 030830
Соединение (III-2). Пиперидин добавляли к раствору соединения 28 (70 мг, 0,051 ммоль) в ДМФА (4 мл). После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин 1:1 смеси ацетонитрила и 0,1%-ного водного раствора добавляли TFA (40 мл). Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ давала 46 мг соединения (III-2) в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 1144,6 (М+1).
Соединения, такие как (III-2), имеющие гидроксиламинную группу, могут быть использованы для формирования конъюгатов с антителом или другим лигандом, имеющим альдегидную или кетонную функциональную группу, например, посредством включения неприродной аминокислоты, 4ацетилфенилаланина.
Пример 3. Соединения (I-2) и (I-3).
Синтез соединений (I-2) и (I-3) схематически показан на фиг. 5.
Соединение (I-3). DIEA добавляли к раствору соединения 9 (10 мг, 0,018 ммоль) и HATU (6,87 мг, 0,018 ммоль) в ДМФА (0,3 мл), доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, соединение 29 (полученное согласно Cheng et al., 2011, пример 17; 4,56 мг, 0,018 ммоль) в ДМФА (0,5 мл) и добавляли DIEA, доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, реакцию останавливали добавлением 4 мл 1:1 смеси ацетонитрила и 0,1%-ного водного раствора TFA. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ давала 12 мг соединения (I-3) (I-2) в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 788,4 (М+1).
Соединение (I-2). Смесь соединения (I-3) (12 мг, 0,015 ммоль) и Pd/C, 10 мас.% (4 мг, 0,015 ммоль) в метаноле (0,5 мл) перемешивали в атмосфере H2 в течение ночи. Катализатор отфильтровывали и фильтрат концентрировали. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ давала 8,1 мг соединения (I-2) в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 758,4 (М+1).
Соединение (I-1) может быть получено аналогично посредством замены соединения 29 соединением, имеющим смешанную стереохимию при альфа-метильном положении (Cheng et al., 2011).
Пример 4. Соединение (III-4).
Фиг. 6а-6с в комбинации схематически показывают синтез соединения (III-4).
Соединение 32. Соединение 30 (Aldrich, 3,5 г, 13,9 ммоль) растворяли в 50 мл ДХМ. К этому раствору добавляли периодинан Десс-Мартина (11,8 г, 27,9 ммоль) при 5°C. Через 10 мин смесь нагревали до комнатной температуры. После еще одного часа реакцию останавливали насыщенным водным NaHCO3 и насыщенным водным NaSiO3. После экстракции эфиром эфирный экстракт промывали водн. NaHCO3 и затем насыщенным раствором соли, высушивали и упаривали до липкого масла. Масло растворяли в 50 мл ДХМ, к которому добавляли коммерчески доступное соединение 31 (5,05 г, 13,93 ммоль). Через 10 мин реакционную смесь переносили в EtOAc, промывали водным NaHCO3 и затем насыщенным раствором соли и сушили, фильтровали и растворитель выпаривали. После колоночной хроматографии (этилацетат:гексан, градиент 0-20%) получали соединение 32 (2,3 г, 6,90 ммоль, выход 49,5%) в виде белого твердого вещества. Оно имело ЯМР-спектр в соответствии с литературой (Wipf et al. 2004a).
Соединение 33. Соляную кислоту (7,80 мл, 31,2 ммоль, 4M в диоксане) добавляли при 5°C к раствору соединения 32 в ДХМ (5,2 г, 15,60 ммоль). После того как реакция деблоктрования заканчивалась, реакционную смесь упаривали и соединение 33 (4,21 г, выход 15,60 ммоль, 100%, гидрохлорид) получали в виде белого твердого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединение 35. К раствору соединения 34 (полученного согласно Sani et al., 2007, 4,00 г, 11,6 ммоль) в 20 мл ДМФА при 5°C добавляли HATU (4,61 г, 12,12 ммоль) и DIPEA (6 мл, 34,4 ммоль). Через 10 мин добавляли соединение 33 (2,71 г, 11,60 ммоль). Еще через получаса смесь помещали в EtOAc, который промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты, насыщенным водным NaHCO3 и рассолом. После сушки и фильтрации органическую фазу упаривали с получением соединения 35 (6,49 г, 11,60 ммоль, выход 100%, |М+№1|'. вычислено 582,3, найдено 582,3) в виде масла, которое использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.
Соединение 36. NaBHi (4,66 г, 123 ммоль) добавляли порциями раствору соединения 35 (6,49 г, 11,6 ммоль) в 100 мл метанола и NiSO4(H2O)6 (6,48 г, 24,66 ммоль) при 5°C. (Внимание: генерируется водород.) Через 30 мин добавляли насыщенный водный NaHCO3 с последующим добавлением EtOAc. После фильтрации через CELITE™, органическую фазу отделяли от водной фазы, промывали насыщенным рассолом, высушивали, фильтровали и упаривали, получая соединение 36 (5,6 г, 9,97 ммоль, выход 81%, [М+1]+, вычислено 562,3, найдено 562,4), который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединение 37. Соединение 36 (5,6 г, 9,97 ммоль) растворяли в 30 мл пиридина при 5°C. Уксусный ангидрид (4 г, 39,2 ммоль) добавляли к этому раствору. Через 10 мин смесь нагревали до комнатной температуры. Через приблизительно час реакционную смесь концентрировали. Полученный остаток обрабатывали смесью этилацетата, и органическую фазу последовательно промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты, насыщенным водным NaHCO3 и рассолом. Органическую фазу сушили, фильт
- 35 030830 ровали и концентрировали, получая соединение 37 (5,8 г, 9,61 ммоль, выход 100%, [М+1]+, вычислено 604,3, найдено 604,4), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединения 38а и 38b. Соединение 37 (0,8 г, 1,3 ммоль) растворяли в 5 мл метанола при -78°C. К этому раствору добавляли NaOMe (331 мкл, 1,33 ммоль, 4M в МеОН). Смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры в течение 1 ч. Смесь переносили в EtOAc, промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты, насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. Отделенную органическую фазу сушили, фильтровали и упаривали с получением смеси этилового и метилового эфиров (соединения 38а и 38b соответственно). Смесь сложных эфиров не разделяли в течение следующих нескольких стадий, пока оба не гидролизовали до карбоновой кислоты на более поздней стадии.
Соединения 40а и 40b. Смесь соединений 38а и 38b из вышеуказанной реакции растворяли в 20 мл ДХМ. К этому раствору добавили 4-нитрофенилхлорформиат 39 (524 мг, 2,6 ммоль) и пиридин (210 мкл,
2,6 ммоль) при 5°C. Температуру повышали до комнатной температуры через 1 ч и добавляли метиламин (1,950 мл, 3,9 ммоль, 2M в ТГФ). Через 10 мин растворитель выпаривали и остаток пропускали через хроматографическую колонку с получением смеси соединений 40а и 40b (этиловый и метиловый эфир соответственно; 420 мг, отношение 40n/40b 3:1, данные ВЭЖХ, выход около 53% для двух стадий, [М+1]+: вычислено 603,3, найдено 603,4 для 40а, вычислено 589,3, найдено 589,4 для 40b).
Соединения 41а и 41b. Смесь соединений 40а и 49b (420 мг, около 0,68 ммоль) растворяли в 3 мл ДХМ, к которому добавляли HCl (4,8 ммоль, 1,2 мл, 4н. в диоксане). Через 1 ч при 5°C растворитель выпаривали, и смесь соединений 41а (этиловый эфир) и 41b (метиловый эфир), соотношения около 3:1, использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединения 43а и 43b. Смесь соединений 41а и 41b (400 мг, 0.72 ммоль), соединения 42 (коммерчески доступного от Anichem, 170 мг, 0,721 ммоль) и уксусной кислоты (0,041 мл, 0,721 ммоль) смешивали в ДХМ при 5°C. Добавляли триацетоксиборгидрид натрия (306 мг, 1,44 ммоль). Смесь переносили в EtOAc через 30 мин. После промывки 7% водн. K2CO3 и насыщенным раствором соли, органическую фазу высушивали, фильтровали и упаривали с получением остатка. После очистки посредством колоночной хроматографией (МеОН:ДХМ, 0-7% градиент), получали соединения 43а (этиловый эфир) и 43b (метиловый эфир) (310 мг, приблизительно 0,42 ммоль, около 58,3% выход, соотношение 43а:43b около 3:1, [М+1]+, вычислено 738,4, найдено 738 для 43а, вычислено 724,4, найдено 724 для 43b).
Соединения 45а и 45b. Смесь соединений 43а и 43b (310 мг, приблизительно 0,42 ммоль) растворяли в 5 мл ДХМ при комнатной температуре. К этому раствору добавляли 2,6-ди-трет.-бутилпиридин (161 мг, 0,840 ммоль) и 2 мл раствора соединения 44 в ДХМ (полученного согласно Peltier et al., 2006, 73,8 мг, 0,420 ммоль). Через полчаса добавляли Et3N (58,6 мкл, 0,420 ммоль). Затем смесь переносили в EtOAc, который промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты, насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. Органическую фазу сушили, фильтровали и упаривали, получая остаток. После очистки посредством хроматографии получали соединения 45а и 45b (294 мг, приблизительно 0,334 ммоль, выход 80%, соотношение 45а:45b 3:1, [М+1]+, вычислено 877,5, найдено 877 для 45а, вычислено 863,5, найдено 863 Для 45b) в виде липкого масла.
Соединения 46а и 46b. Смесь соединений 45а и 45b (100 мг, приблизительно 0,114 ммоль) добавляли к суспензии Pd/C (65 мг, 10%) в 20 мл МеОН. Добавляли раствор HCl (28,5 мкл, 0,114 ммоль, 4M в диоксане). Колбу вакуумировали и заполняли H2, этот процесс повторяли три раза. Через 2 ч суспензию фильтровали и растворитель выпаривали с получением остатка. Суспензию соединения 5а (19,59 мг, 0,137 ммоль) в 500 мкл ДМФА, HATU (43,4 мг, 0,114 ммоль) и DIPEA (49,8 мкл, 0,285 ммоль) добавляли при 5°C. После того как суспензия стала гомогенной добавляли вышеуказанный остаток в ДМФА (1 мл). Добавляли дополнительно DIPEA, чтобы довести pH до приблизительно 12. Через 10 мин смесь переносили в EtOAc, который промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты, насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. Отделенную органическую фазу высушивали, фильтровали и упаривали. Полученный остаток пропускали через хроматографическую колонку с получением смеси соединений 46а и 46b (этиловый и метиловый эфир, соответственно, 80 мг, около 0,082 ммоль, выход 71,9%, соотношение 46а:46b 3:1, [М+1]+ вычислено 976,5, найдено 976,5 для 46а, вычислено 962,5, найдено 962,5 для 46b).
Соединения 47а и 47b. HCl (256 мкл, 1,024 ммоль, 4M в диоксане) добавляли к раствору соединений 46а и 46b (200 мг, 0,205 ммоль) в 2 мл МеОН при 5°C. Через 1 ч раствор упаривали и высушивали в высоком вакууме в течение ночи с получением липкого масла. Это липкое масло, Fmoc-защищенный цитруллин 18а (81 мг, 0,205 ммоль), и DIPEA (179 мкл, 1,024 ммоль) растворяли в 2 мл ДМФА при комнатной температуре. Добавляли ангидрид пропилфосфоновой кислоты (Т3Р, 178 мкл, 0,410 ммоль, 2,3М в EtOAc). Через 1 ч реакционную смесь переносили в EtOAc и промывали насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. После разделения, сушки и упаривания полученный остаток пропускали через хроматографическую колонку (МеОН:ДХМ 0-10% градиент) с получением смеси соединений 47а и 47b (этиловый и метиловый эфир, соответственно, 150 мг, приблизительно 0,119 ммоль, выход около 58,3%, соотношение 47а:47b равно 3:1, [М+1]+, вычислено 1255,6, найдено 1255,6 для 47а; вычислено 1241,6, найдено 1241,6 для 47b).
Соединение 49. Смесь соединений 47а и 47b (200 мг, около 0,165 ммоль) растворяли в 5 мл ДМФА
- 36 030830 (с 5% пиперидина) при комнатной температуре. Раствор упаривали досуха через 30 мин. Полученный остаток смешивали с Boc-защищенным N-гидроксисукцинимидным эфиром валина (48 61,9 мг, 0,198 ммоль), 5 мл ДМФА и DIPEA (87 мкл, 0,496 ммоль). После выдерживания в течение ночи для продолжения реакции реакционную смесь упаривали досуха. Полученную смесь растворяли в 5 мл смеси МеОН, ТГФ и воды (1:1:1). Добавляли NaOH, и полученная pH конечного раствора была 14. После выдерживания в течение ночи для продолжения реакции при комнатной температуре смесь подкисляли HCl до pH 3 и упаривали под высоким вакуумом. Полученное твердое вещество обрабатывали TFA и смесь упаривали через 10 мин, получая соединение 49 (80 мг, 0,072 ммоль, выход 43,8%, [М+1]+, вычислено 1104,6, найдено 1104,6) после очистки с помощью препаративной ВЭЖХ.
Соединение (III-4). Соединение 49 (80 мг, 0,072 ммоль), коммерчески доступное соединение 21а (Aldrich, 26,6 мг, 0,087 ммоль) и DIPEA (38,0 мкл, 0,217 ммоль) растворяли в 2 мл ДМФА. После выдерживания в течение ночи для продолжения реакции смесь упаривали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением основного изомера (15 мг, выход 16%, 1/2[М+2]2+, вычислено 649,3, найдено 649,5) и минорный изомер (3,7 мг, выход 4%, 1/2[М+2]2+, вычислено 649,3, найдено 649,5)). Основной изомер в порядке рабочей гипотезы определили как (III-4), имеющий природную стереохимию тубулизина при альфа-метиле в субъединице Tup, а минорный изомер был определен как соединение (III-5), имеющую инвертированную стереохимию в этом месте.
Пример 5. Соединения (I-5), (I-6) и (I-7).
Небольшую часть липкого масла, описанного выше, от обработки соединений 46а и 46b с HCl не вводили в реакцию с соединением 18а, но вместо этого растворяли в смеси ТГФ, МеОН и воды (1:1:1). pH реакционной смеси доводили до 14. После выдерживания в течение ночи для продолжения реакции половину реакционной смеси упаривали и очищали с помощью препаративной хроматографии с получением соединения (I-5) (1 мг, М+1, 876,6) (I-6) (1 мг; М+1, 862,5) и (I-7) (1 мг; М+1, 848,5).
Пример 6. Соединение (I-1).
Схема синтеза соединения (I-1) показана на фиг. 7.
Соединение 51. HCl (6н., 0,2 мл) добавляли к раствору соединения 50 (Cheng et al., 2011; 50 мг, 0,198 ммоль) и 2,2-диметоксипропана (0,244 мл, 1,982 ммоль) в МеОН (1 мл). После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, растворитель упаривали, получали 52,8 мг соединения 51. МС: (+) m/z 267,2 (М+1).
Соединение 52. Смесь соединения 51 (52,8 мг, 0,198 ммоль) и палладий на углероде (10 мас.%, 8 мг) в МеОН (1 мл) перемешивали в атмосфере H2 в течение ночи. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель выпаривали с получением 46,9 мг соединения 52. МС (+) m/z 237,3 (М+1).
Соединение (I-1). Смесь пентафторфенола (2,493 мг, 0,014 ммоль), 1,3-дициклогексилкарбо диимида (2,049 мг, 9,93 мкмоль), и соединения 9 (5 мг, 9,03 мкмоль) в ДХМ (0,5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель затем выпаривали.
К раствору полученного остатка (6,50 мг, 9,03 мкмоль) и соединения 52 (4,27 мг, 18,06 мкмоль) в ДМФА (0,2 мл) добавляли DIEA (1 каплю). После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, реакцию останавливали добавлением смеси 1:1 ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA (4 мл). Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ давала 2,5 мг соединения (I-1) в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 772,5 (М+1).
Пример 6. Соединение (I-4).
Схема синтеза соединения (I-4) показана на фиг. 8.
DIEA добавляли к раствору соединения 9 (10,69 мг, 0,019 ммоль) и HATU (7,34 мг, 0,019 ммоль) в ДМФА (0,3 мл), доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, добавляли соединение 53 (4 мг, 0,019 ммоль; полученное в соответствии с Sani et al., 2007) в ДМФА (0,5 мл) и DIEA, доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, реакцию останавливали добавлением смеси 1:1 ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA (4 мл). Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ давала 12,5 мг соединения (I-4) в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 743,4 (М+1).
Пример 7. Тиокарбаматы.
Соединения формулы (I), в которой W обозначает S (т.е. тиокарбаматы) могут быть получены посредством обработки соответствующего предшественника, такого как соединение 6 гидридом натрия и затем тиоизоцианатом, как показано ниже (фиг. 1)
Пример 8. Соединение (III-6).
Схема синтеза соединения 56 показана на фиг. 9а и 9b.
- 37 030830
Соединение 56. 1,3-Дициклогексилкарбодиимид (DCC, 0,160 г, 0,778 ммоль) добавляли к раствору трет.-бутил-1-амино-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оата 54 (Quanta Biosciences, 0,25 г, 0,778 ммоль) и 2-(((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)окси)уксусной кислоты 55 (Chem-Impex, 0,244 г, 0,778 ммоль) в ДХМ (5 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, осадок отфильтровывали. Затем фильтрат концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-10% метанола в ДХМ, с получением 0,30 г соединения 56 в виде бесцветного масла. МС (+) m/z 617,4 (М+1).
Соединение 57. Раствор соединения 56 (0,303 г, 0,491 ммоль) в TFA (2 мл, 0,662 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После того как раствор концентрировали, остаток промывали гексаном с получением 0,28 г соединения 57. МС: (+) m/z 561,3 (М+1).
Соединение 58. DCC (0,199 г, 0,963 ммоль) добавляли к раствору соединения 57 (0,27 г, 0,482 ммоль) и 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (известного также как N-гидроксисукцинимид или NHS, 0,111 г, 0,963 ммоль) в ДХМ (5 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, твердое вещество отфильтровывали. Затем фильтрат концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-100% этилацетата в гексане, с получением 0,12 г соединения 58 в виде бесцветного масла. МС (+) m/z 658,3 (М+1).
Соединение 59. DIEA (2 капли) добавляли к раствору соединения 58 (0,12 г, 0,182 ммоль) и соединения 21 (0,106 г, 0,182 ммоль) в ДМФА (2 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию останавливали добавлением смеси ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 0,12 г в виде твердого бесцветного вещества. MS: (+) m/z 1121,6 (M+1).
Соединение 60. TFA (0,5 мл) добавляли к раствору соединения 59 (20 мг, 0,018 ммоль) в ДХМ (1 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, раствор концентрировали с получением 18,2 мг соединения 60. МС (+) m/z
1021.6 (М + 1).
Соединение 61. DIEA добавляли к раствору соединения 9 (9,87 мг, 0,018 ммоль) и HATU (6,78 мг, 0,018 ммоль) в ДМФА (0,4 мл). Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, добавляли соединение 60 (18,2 мг, 0,018 ммоль) в ДМФА (1 мл) и DIEA. Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, реакцию останавливали добавлением 10 мл 1:1 (об./об.) смеси воды, содержащей 0,1% TFA и ацетонитрила. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 25 мг соединения 61 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 779,0 (М/2+1).
Соединение (III-6). Одну каплю пиперидина добавляли к раствору соединения 61 (25 мг, 0,016 ммоль) в ДМФА (1 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию останавливали добавлением смеси ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 20 мг соединения (III-6) в виде белого твердого. МС (+) m/z 668,0 (М/2+1). Соединение (III-6) имеет гидроксиламинную группу, которая может быть использована для конъюгация с через образование оксима, например с кетогруппой п-ацетилфенилаланинового остатка, который был введен в белок, как описано выше.
Конъюгат соединения (III-6) и антимезотелинового антитела, модифицированного так, чтобы содержать остаток п-ацетилфенилаланина показывают EC5j 0,14 против клеток рака желудка N87, согласно анализу поглощения 3Н тимидина.
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает конъюгат соединения (III-6) и антимезотелинового антитела, модифицированного так, чтобы содержать кетогруппу. Предпочтительно, модификация происходила посредством введения остатка п-ацетилфенилаланина в полипептидную цепь антитела. Также предпочтительно, чтобы антитело, модифицированное таким образом, являлось бы 6А4.
Пример 9. Промежуточное соединение 69.
Фиг. 10 показывает схему синтеза соединения 69, которое может быть использовано в качестве промежуточного соединения для синтеза соединений по настоящему изобретению.
Соединение 63. Соединение 62 (Chem-Impex, 5 г, 23,8 ммоль) добавляли к раствору SOCl2 (3,47 мл,
47.6 ммоль) в 20 мл МеОН при 5°C. После того как реакция проходила в течение ночи, реакционную смесь нагревали в течение получаса при температуре 45°C. Летучие вещества упаривали и остаток растворяли в 20 мл ДХМ. Добавляли Boc2O (7,8 г, 35,7 ммоль). Et3,N использовали для доведения pH раствора до 9 (тестируя увлажненной индикаторной pH бумажкой). Через несколько часов реакционную смесь переносили в EtOAc. Этилацетатный раствор промывали раствором 10% лимонной кислоты, насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. Органическую фазу высушивали, отделяли и упаривали. Конечный остаток после упаривания высушивали, органическую фазу пропускали через колонку, чтобы получить соединение 63 (5 г, выход 65%, [М+1-Вос]+, вычислено 225,1, найдено 225,2).
- 38 030830
Соединение 65. К раствору соединения 63 (2 г, 6,2 ммоль) в 20 мл ДХМ добавляли DIBAL-H (12,4 мл, 12,4 ммоль, 1M в ДХМ) при -78°C. Через полчаса МеОН использовали для остановки реакции. HCl использовали для доведения pH раствора до около 2. Смесь переносили в EtOAc, который промывали 10% лимонной кислотой, насыщенным раствором соли, высушивали, отделяли и выпаривали. Остаток растворяли в 30 мл ДХМ. Добавляли соединение 64 (2,4 г, 6,2 ммоль, US 4894386) при 0°C. Смесь упаривали через 1 ч при комнатной температуре, а остаток пропускали через колонку с получением соединения 65 (2 г, выход 79%, [М+1-Вос]+, вычислено 307,2, найдено 307,1).
Соединение 66. Соединение 65 (600 мг, 1,48 ммоль) растворяли в 75 мл EtOAc при комнатной температуре. Раствор переносили в колбу, заполненную N2 и Pd/C (600 мг, 10%). Колбу вакуумировали и заполняли H2; цикл повторяли три раза. Через 1 ч раствор фильтровали и упаривали, получая соединение 66 (560 мг, выход 100%, [М+1]+, вычислено 379,3, найдено 379,3) в виде смеси эпимеров. Эту смесь не разделяли до последнего времени.
Соединение 67. Соединение 66 (1,30 г, 3,43 ммоль), Fmoc-защищенный цитруллин 18а (1,6 г, 4,12 ммоль) и 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (ЭЭДХ, 1,06 г, 4,3 ммоль) растворяли в смеси ДХМ и МеОН (22 мл, 10:1). После того как реакция продолжалась в течение ночи, смесь упаривали и остаток пропускали через колонку (МеОН:ДХМ, 0-5% градиент) с получением соединения 67 ([М+1]+, вычислено 758,4, найдено 758,4) в виде смеси эпимеров (=4:1 из ВЭЖХ-анализа). Вещество использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединение 68а. Смесь соединения 67 из предыдущей реакции растворяли в 10 мл ДМФА (с 5% пиперидина) при комнатной температуре. Через 30 мин смесь упаривали и высушивали с помощью насоса высокого вакуума в течение ночи. Остаток смешивали с соединением 48 (1,5 г, 3,45 ммоль) в 5 мл ДМФА. Et3N использовали, чтобы довести pH раствора до 12. Через 1 ч реакционную смесь переносили в EtOAc, который промывали 10% лимонной кислотой, насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. Органическую фазу высушивали, фильтровали и упаривали досуха. Остаток подвергали удалению защитной группы с помощью 5% пиперидина в ДМФА таким же способом, как и удаление защиты в соединения 67. Амин, полученный на этой стадии, и соединение 21а (1 г, 3,27 ммоль) смешивали в 10 мл ДМФА. Et3N использовали для доведения pH раствора до 12 при комнатной температуре. После того как реакция продолжалась в течение ночи, смесь помещали в EtOAc, который промывали 10% лимонной кислоты, насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. Органическую фазу сушили, фильтровали и упаривали с получением остатка. Остаток пропускали через стандартную колонку с силикагелем с получением смеси соединений 68а и 68b (1 г, выход 35% от соединения 66, [М+1]+, вычислено 828,5, найдено 828,5). После разделения на препаративной колонке ВЭЖХ получали 600 мг основного эпимера (структура предварительно определена как соединение 68а, с соединением 68b, определенный в качестве минорного эпимера).
Соединение 69. Соединение 68а (600 мг, 0,72 ммоль) растворяли в 5 мл смеси ДХМ и TFA (1: 1). Через 2 ч реакционную смесь упаривали с получением соединения 69 (количественный выход, [М+1], вычислено 672,4, найдено 672,4).
Пример 10. Промежуточное соединение 75.
Фиг. 11 показывает схему синтеза промежуточного соединения 75, которое может быть использовано для синтеза соединений по настоящему изобретению.
Соединение 71. Соединение 70 (Cheng et al., 2011, 25 мг, 0,044 ммоль), N,N'диизопропилкарбодиимид (DIC, 0,014 мл, 0,088 ммоль), 4-(диметиламино)пиридин (DMAP, 10,78 мг, 0,088 ммоль) и МеОН (0,036 мл, 0,882 ммоль) смешивали при комнатной температуре. Через час реакционную смесь упаривали и пропускали через колонку с получением соединения 71 (10 мг, выход 39%, М+1, 581,4).
Соединение 72. Соединение 71 (122 мг, 0,210 ммоль, из другого синтетического набора) растворяли в МеОН (2 мл) при 5°C. Добавляли NaOMe (0,441 мл, 0,221 ммоль). Через 0,5 ч смесь нейтрализовали HCl (4M в диоксане) и упаривали с получением соединения 72 (М+1, 539,4), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединение 73. Соединение 72 (60 мг, 0,111 ммоль) растворяли в ДХМ (1,5 мл) при 5°C. Добавляли медленно пиридин (0,045 мл, 0,557 ммоль), 4-нитрофенилкарбонохлоридат 72а (67,3 мг, 0,334 ммоль, Aldrich) в 0,5 мл ДХМ. После того как реакция продолжалась в течение ночи, смесь упаривали и очищали с помощью колоночной хроматографии с получением соединения 73 (42 мг, 0,060 ммоль, выход 53,6%) (М+1), 704,4.
Соединение 74. Соединение 73 (42 мг, 0,060 ммоль) растворяли в ДХМ (1 мл) при 5°C. Добавляли метиламин (1.853 мг, 0,060 ммоль). Через 0,5 ч смесь упаривали и остаток пропускали через хроматографическую колонку (МеОН:ДХМ 0-15% градиент, элюируя продукт при 7-10%), получая соединение 74 (35 мг, 0,059 ммоль, выход 98%) (М+1, 596,4).
Соединение 75. Соединение 74 (93 мг, 0,156 ммоль) растворяли в ТГФ (1 мл) при 5°C, добавляли LiOH (7,47 мг, 0,94 ммоль) в 0,34 мл воды. После того как реакция завершилась, реакционную смесь нейтрализовали HCl (4M в диоксане) и высушивали в высоком вакууме с получением соединения 75 (М+1, 582,3), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
- 39 030830
Пример 11. Соединения (III-7) и (III-8).
Фиг. 12 показывает схемы синтеза соединений (III-7) и (III-8).
Соединение (III-7). Соединение 75 (11 мг, 0,019 ммоль) активировали в ДМФА (0,5 мл) с HATU (6,83 мг, 0,018 ммоль) и DIEA (14,86 мкл, 0,085 ммоль). Затем добавляли соединение 69 (15,24 мг, 0,023 ммоль). Через 10 мин реакционную смесь переносили в ДМСО и очищали с помощью препаративной хроматографии с получением соединения (III-7) (12 мг, 9,71 мкмоль, выход 51,4%) (М+1, 1235,7).
Соединение (III-8). Соединение 75 (10 мг, 0,017 ммоль) активировали в ДМФА (0,5 мл) с HATU (6,21 мг, 0,016 ммоль) и DIEA (0,014 мл, 0,077 ммоль). Затем добавляли соединение 23 (13,86 мг, 0,021 ммоль). Через 10 мин реакционную смесь переносили в ДМСО и очищали с помощью препаративной хроматографии с получением соединения (III-8) (13 мг, 10,52 мкмоль, выход 61,2%) (М+1, 1235,7).
Пример 12. Соединения (I-8) и (I-9).
В принципе, соединения (I-8) и (I-9) могут быть получены посредством обработки соединений (III7) и (III-8), соответственно, с помощью протеазы катепсин В, для которой дипептид Val-Cit является субстратным мотивом. Соединение (III-7) с его орто-аминогруппой, может быть предметом более серьезных стерических затруднений, препятствующих расщеплению
Пример 13. Биологическая активность соединений.
Фиг. 13а и 13b показывают биологическую активность соединений (I-4) и (I-2) по настоящему изобретению в отношении рака легких Н226 и клеток рака почки 786-O, соответственно, с использованием АТФ-люминесцентного анализа. В качестве контроля были использованы доксорубицин и тубулизиновый аналог - соединение А, которое содержит ацетатную группу вместо карбаматной группу на субъединице Tuv. Соединение может быть получено согласно публикации Cheng et al., 2011.
Соединение А
Против клеток Н226, значения EC50 составляли: доксорубицин, 115,4 нМ; соединение А, 2,4 нМ; и соединение (I-4), 12,1 нМ. Против клеток 786-0, значения EC50 составляли: доксорубицин, 68,9 нМ; соединение А, 1,2 нМ, и соединение (I-4), 7,1 нМ.
Фиг. 13с и 13d представляют подобный тип данных для соединений (I-5), (I-6) и (I-7). Соединениями сравнения были доксорубицин и тубулизин D. EC50 значения против Н226 клеток составляли: доксорубицин, 115,4 нМ; тубулизин D, 0,05 нМ; соединение (I-5), 19,5 нМ; соединение (I-6), 9,9 нМ и соединение (I-7), 15,4 нМ. На клетках 786-0 значения EC50 составляли: доксорубицин, 68,9 нМ; тубулизин D, 0,02 нМ; соединение (I-5), 22,9 нМ; соединение (I-6), 22,8 нМ и соединение (I-7), 12,5 нМ.
Опухолевые клеточные линии получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС), РО Box 1549, Manassas, VA 20108, США, и культивировали в соответствии с инструкциями АТСС. Клетки высевают при 1,0х103 клеток/лунку в 96-луночных планшетах в течение 3 ч для СПС анализов. 1:3 серийные разведения соединений добавляли в лунки. Планшеты инкубировали в течение от 24 до 72 ч.
Уровень АТФ в АТФ планшетах измеряли с помощью набора CELLTITER-GLO® Luminescent Cell Viability, следуя руководству производителя, и считывали результаты на люминометре GLOMAX® 20/20 (оба от Promega, Madison, WI, США). Значения EC50 - концентрация, при которой агент ингибирует или уменьшает пролиферацию клеток на 50% - определяли с использованием программного обеспечения
PRISM™, версия 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).
Пример 14. Активность конъюгата in vitro.
Фиг. 14 показывает активность in vitro конъюгата (II-1) в отношении клеток рака желудка N87 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), РО Box 1549, Manassas, VA 20108, USA).
Клетки высевали при 1,0х104 клеток/лунку в 96-луночных планшетах в течение 3 ч для анализов на
- 40 030830 включение 3Н тимидина соответственно. Серийные разведения (1:3) конъюгата (II-1) добавляли в лунки. Планшеты инкубировали в течение 120 ч. Планшеты импульсно метили 3Н-тимидином 1,0 мкКи на лунку в течение последних 24 ч от общего инкубационного периода, собирали и считывали результаты на сцинтилляционном счетчике Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden, CT). Значение ЕС50 -концентрация, при которой агент ингибирует или уменьшает пролиферацию клеток на 50% от максимального ингибирования - определяли с помощью программного обеспечения PRISM™, версия 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) составляла 0,2 нМ.
Сравнение значений EC50 из фиг. 13a-13d и фиг. 14 иллюстрирует два положения. Первым является повышение эффективности, связанное с адресной доставкой цитотоксина посредством конъюгата и последующего активного механизма интернализации, вызванного связыванием антительного компонента конъюгата со своим антигеном (Schrama et al., 2006). Второе - неконъюгированные токсины являются относительно полярными соединениями и при отсутствии активного механизма интернализации трудно диффундирующими через мембрану клетки, что приводит к более высокой (более низкой активности) измеряемой величине EC50.
Пример 15. Активность конъюгата in vivo.
В этом примере активность in vivo конъюгата (II-1) сравнивали с активностью конъюгата В (Cheng et al., 2011), который структурно идентичен конъюгату (II-1) за исключением того, что он имеет ацетат в субъединице Tuv вместо карбамата
Конъюгат В н
H2N N
Пять миллионов клеток рака яичников OVCAR3, ресуспендированных в 0,1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), плюс 0,1 мл Матригель, имплантировали подкожно в район паха мышей SCID. Измерения опухоли начинали через 28 дней, а мыши были рандомизированы в группы по 7 мышей в каждой со средним размером опухоли в 60 мм3, оцененных посредством LWH/2 опухолей. На 29-й день после имплантации опухоли мышам вводили внутрибрюшинно единоразово исследуемые соединения. Фиг. 15 показывает, что в отношении ксенотрансплантатов OVCAR3 конъюгат (II-1) подавлял рост опухоли более эффективно, чем конъюгат В. Разница особенно заметна через 20 дней.
Фиг. 16а, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b и 20 представляют дополнительные данные об эффективности in vivo для конъюгатов по настоящему изобретению, генерированных в соответствии с протоколом, описанным выше, с соответствующими изменениями.
Фиг. 16а показывает данные для OVCAR3 (рака яичников) об объеме опухоли в зависимости от времени для серии конъюгатов соединения (III-1) с анти-CD70 антителами 1F4 или антимезотелиновыми антителами 6А4. Подпись на чертеже обеспечивает по порядку: DAR (например, 2,7) и дозировку в мкмоль/кг (например, 0,1). В каждом случае способ введения - внутрибрюшинно, в единственной дозе (SD), за исключением последнего набора данных (♦)’ для которых конъюгат вводили Q7Dx3. Фиг. 16b показывает изменение массы тела для того же эксперимента.
Получение и характеристика человеческого моноклонального антитела 6А4 описано в Terrett et al., 2012, раскрытие которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Последовательности VH CDR1, CDR2 и CDR3 и VK CDR1, CDR2 и CDR3 для антитела 6А4 приведены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно. Вариабельные области последовательностей VH и VK антитела 6А4 представлены в SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно.
Получение и характеристика моноклонального антитела человека 1F4 описана в Coccia et al., 2010, раскрытие которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Последовательности VH CDR1, CDR2 и CDR3 и VK CDR1, CDR2 и CDR3 для антител 1F4 приведены в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно. Вариабельные области последовательностей VH и VK антитела 1F4 представлены в SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно.
Фиг. 17а и 17b представляют результаты для подобного эксперимента, но с конъюгатами соединения (III-8) и антимезотелинового антитела 6А4. В каждом случае разовую дозу вводили внутрибрюшинно.
Эффективность конъюгата соединения (III-1) и антимезотелинового антитела 6А4 против опухолей Н226 (рак легких) представлены на фиг. 18а и 18b с информацией о DAR и дозировках снова находящимися в подписи на чертеже. В каждом случае конъюгат вводили внутрибрюшинно в виде однократной
- 41 030830 дозы.
Фиг. 19а и 19b представляют данные Н226 для конъюгата соединения (III-8) и антимезотелинового антитела 6А4. В первом наборе данных (*) введение осуществляли в однократной дозе, в то время как для последних двух наборов данных (▼ и ♦) режим введения был Q7Dx3.
Фиг. 20 показывает данные об эффективности для конъюгатов соединения (III-1) с антимезотелиновым антителом 6А4 или анти-CD70 антителами 1F4 против раковых опухолей желудка N87.
Антитела, особенно при использовании в конъюгатах, могут иметь либо природную константную область, либо сконстуированную (модифицированную) константную область, предназначенную для уменьшения или устранения эффекторных функций, такие как АЗКЦ. Примеры таких модифицированных константных областей антител обеспечиваются полипептидами SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26. Последовательность SEQ ID NO: 25 представляет собой константную область изотипа IgG4, модифицированного с определенными аминокислотными заменами. Последовательность SEQ ID NO: 26 представляет собой гибрид константной области IgG1/IgG4. Как в SEQ ID NO: 25, так и в SEQ ID NO: 26 присутствие С-концевого лизина является необязательным.
Пример 16. Исследования стабильности.
В этом примере сравнивали стабильность конъюгата (II-1) и конъюгата В в мышиной сыворотке с их соответствующими карбаматными и ацетатными группами.
Конъюгат вводили мышам в дозе 0,1 мкмоль/кг. В случае конъюгата (II-1) концентрация вводимого препарата была 3,4 мг/мл, и конъюгат имел отношение замещения (SR) 4,2. В случае конъюгата В концентрация вводимого препарата была 1,2 мг/мл и SR была 2,3. Приблизительно 100 мкл сыворотки от каждого из 3 животных в каждый временной момент отбирали на анализ.
Образцы сыворотки от различных животных объединяли, получая 200-300 мкл в каждый временной момент. Объединенный объем центрифугировали для удаления твердых веществ и супернатант использовали для анализа. Конъюгат выделяли из сыворотки посредством иммуноаффинного захвата с использованием антиидиотипического моноклонального антитела, иммобилизованного на гранулах Sepharose™. После захвата конъюгат элюировали посредством воздействия низких pH с последующей нейтрализацией с помощью Трис-основания. Цитотоксин, присутствовавший на конъюгате, высвобождался при добавлении активированного катепсина В для расщепления пептидного линкера Cit-Val. Расщепление катепсина В проводили при 37°C в течение 3 ч с последующим добавлением 1 объема холодного метанола. Цитотоксин, экстрагированный растворителем, анализировали методом ЖХ-МС с использованием ESI-TOF MS в режиме in-line на СВЭЖХ с обращенной фазой (Acquity HSS Т3 2,1x50 мм).
Для конъюгата (II-1) присутствие гидроксильного соединения в результате гидролиза карбаматной группы не было обнаружено ни в какой момент в течение времени вплоть до 240 ч. Было обнаружено только карбаматное соединение.
С другой стороны, для конъюгата В продукт гидролиза был обнаружен через 6 ч и около 50% гидролиза произошло за 72 ч. Табл. 2 ниже показывает относительные количества ацетата и гидроксильных соединений, основанные на массовых интенсивностях спектра для соответствующих двухзарядных ионов (М[Н2+] 372,2 и 351,2 Да)
Таблица 2
Время (ч) Относительная интенсивность пика Гидроксильный ион (% от общего числа)
Ацетат ион Гидроксильный ион
0,25 360,587 — 0
2 649,982 — 0
6 165,680 11,779 7
24 77,110 14,619 16
48 26,760 16,312 38
72 18,243 17,124 48
168 7,978 18,330 70
240 4,268 15,654 79
- 42 030830
Эти результаты показывают, что в то время как замена ацетатной группы в субъединице Tuv приводит к гораздо более стабильному соединению, которое, однако, все еще сохраняет значительную биологическую активность.
Пример 17. Соединения 72а, 72b и 72с.
В этом примере описано получение и свойства соединений по настоящему изобретению, имеющих структурные вариации при карбаматной группе. На фиг. 21 представлена схема синтеза.
Соединение 70а. Аммиак в метаноле (2М, 0,089 мл, 0,178 ммоль) добавляли к соединению 7 (0,1 г, 0,148 ммоль) в МеОН (2 мл). После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-15% МеОН в ДХМ с получением 55 мг соединения 70а в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 554,3 (М+1).
Соединение 71а LiOH (4,41 мг, 0,184 ммоль) в воде (0,5 мл) добавляли к раствору соединения 70а (51 мг, 0,092 ммоль) в ТГФ (1 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-30% МеОН в ДХМ с получением 47 мг соединения 71а в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 540,3 (М+1).
Соединение 72а. DIEA (6,45 мкл, 0,037 ммоль) добавляли к раствору соединения 71а (20 мг, 0,037 ммоль) и НАТО (14,09 мг, 0,037 ммоль) в ДМФА (0,5 мл). Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли соединение 23 (24,9 мг, 0,037 ммоль) в ДМФА (1 мл) и DIEA (6,45 мкл, 0,037 ммоль). Значение pH реакционного раствора доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 мин, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Реакцию останавливали добавлением 10 мл 1:1 (об./об.) смеси воды, содержащей 0,1% TFA и ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 35,2 мг соединения 72а в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 1193,6 (М+1). Соединение 72а также упоминается в настоящем описании выше как соединение (III-9).
Конъюгат соединения 72а и анти-CD70 антитела 1F4 имел EC50 0,19 нМ против клеток рака почки 786-0. Конъюгат соединения 72а и антимезотелинового антитела 6А4 имел EC50 0,16 нМ против клеток рака желудка N87. В обоих случаях использовали анализ поглощения 3Н-тимидина.
Соединение 70b. Раствор соединения 7 (0,1 г, 0,148 ммоль) и анилина (0,041 мл, 0,444 ммоль) в ДМФА (1,8 мл) нагревали при 50°C в течение ночи. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-15% МеОН в ДХМ, с получением 58 мг соединения 5 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 630,4 (М+1).
Соединение 71b. LiOH (4,03 мг, 0,168 ммоль) в воде (0,5 мл) добавляли к раствору соединения 70b (53 мг, 0,084 ммоль) в ТГФ (1 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-30% МеОН в ДХМ, с получением 43 мг соединения 71b в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 616,3 (М+1).
Соединение 72b. DIEA (5,66 мкл, 0,032 ммоль) добавляли к раствору соединения 71b (20 мг, 0,032 ммоль) и НАТО (12,35 мг, 0,032 ммоль) в ДМФА (0,5 мл). Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли соединение 23 (21,82 мг, 0,032 ммоль) в ДМФА (1 мл) и DIEA (5,66 мкл, 0,032 ммоль). Значение pH реакционного раствора доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 мин, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Реакцию останавливали добавлением 10 мл 1:1 (об./об.) смеси воды, содержащей 0,1% TFA и ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 35 мг соединения 72b в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 1269,7 (М+1). Соединение 72b также упоминается в настоящем описании выше как соединение (III-10).
Конъюгат соединения 72b и анти-CD70 антитела 1F4 имел EC50 0,58 нМ против клеток рака почки 786-0. Конъюгат соединения 72b и антимезотелинового антитела 6А4 имел EC50 0,47 против клеток рака желудка N87. В обоих случаях использовали анализ поглощения 3Н-тимидина.
Соединение 70с. Диметиламин в ДМФА (1 мл, 0,148 ммоль) добавляли по каплям к раствору соединения 7 (0,1 г, 0,148 ммоль) в ДМФА (1 мл) при комнатной температуре пока реакция не завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-15% МеОН в ДХМ, с получением 56 мг соединения 70с в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 582,3 (М+1).
Соединение 71с. LiOH (8,23 мг, 0,344 ммоль) в воде (0,5 мл) добавляли к раствору соединения 70с (0,1 г, 0,172 ммоль) в ТГФ (1 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Рас
- 43 030830 творитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-30% МеОН в ДХМ, с получением 50,8 мг соединения 71с в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 568,3 (М+1).
Соединение 72с. DIEA (6,14 мкл, 0,035 ммоль) добавляли к раствору соединения 71с (20 мг, 0,035 ммоль) и НАТО (13,39 мг, 0,035 ммоль) в ДМФА (0,5 мл). Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли соединение 23 (23,67 мг, 0,035 ммоль) в ДМФА (1 мл) и DIEA (6,14 мкл, 0,035 ммоль). Значение pH реакционного раствора доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 мин, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Реакцию останавливали добавлением 10 мл 1:1 (об./об.) смеси воды, содержащей 0,1% TFA и ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 23,8 мг соединения 72с в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 1221,6 (М+1). Соединение 72с также упоминается в настоящем описании выше как соединение (III-11).
Конъюгат соединения 72с и анти-CD70 антитела 1F4 имел EC50 0,32 нМ против клеток рака почки 786-0. Конъюгат соединения 72С и анти-мезотелинового антитела 6А4 имел EC50 0,34 нМ против клеток рака желудка N87. В обоих случаях использовали анализ поглощения 3Н-тимидина.
Пример 18. Соединения 75а, 75b и 75с.
В этом примере описано получение аналогов тубулизина предыдущего примера, но без линкерных фрагментов присоединения. На фиг. 22 приведена схема синтеза.
Соединение 73. LiOH (0,071 г, 2,97 ммоль) в воде (5 мл) добавляли к раствору соединения 18 (0,25 г, 0,743 ммоль) в ТГФ (5 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-20% МеОН в ДХМ с получением 0,22 г соединения 73 в виде белого твердого вещества. МС: (+) m/z 223,3 (М+1-Вос).
Соединение 74. Смесь соединения 73 (0,2 г, 0,620 ммоль) и 4н. HCl в 1,4-диоксане (4 мл, 0,620 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель выпаривали. Белое твердое вещество соединения 74 промывали гексаном дважды. МС (+) m/z 223,3 (М+1).
Соединение 75а. DIEA (3,23 мкл, 0,019 ммоль) добавляли к раствору соединения 71а (10 мг, 0,019 ммоль) и HATU (7,05 мг, 0,019 ммоль) в ДМФА (0,5 мл), доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли DIEA (3,23 мкл, 0,019 ммоль) и соединение 74 (5,35 мг, 0,024 ммоль) в ДМФА (0,5 мл), доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Реакцию останавливали добавлением 10 мл смеси 1:1 (об./об.) смеси ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 6,0 мг соединения 75а в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 744,4 (М+1). Соединение 75а также упоминается в настоящем описании выше как соединение (I-10).
Соединение 75а имело EC50 75,8 нмоль против клеток рака желудка N87, использовался АТФлюминесцентный анализ.
Соединение 75b. DIEA (2,83 мкл, 0,016 ммоль) добавляли к раствору соединения 71b (10 мг, 0,016 ммоль) и HATU (6,17 мг, 0,016 ммоль) в ДМФА (0,5 мл), доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли DIEA (2,83 мкл, 0,016 ммоль) и соединение 74 (4,69 мг, 0,021 ммоль) в ДМФА (0,5 мл), доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Реакцию останавливали добавлением 10 мл смеси 1:1 (об./об.) смеси ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 7,6 мг соединения 75b в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 820,4 (М+1). Соединение 75b также упоминается в настоящем описании выше в качестве соединения (I-11).
Соединение 75b имело EC50 0,39 нМ против клеток рака желудка N87, использовался АТФ люминесцентный анализ.
Соединение 75с. DIEA (3,07 мкл, 0,018 ммоль) добавляли к раствору соединения 71с (10 мг, 0,018 ммоль) и HATU (6,70 мг, 0,018 ммоль) в ДМФА (0,5 мл), доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли DIEA (3,07 мкл, 0,018 ммоль) и соединение 74 (5,09 мг, 0,023 ммоль) в ДМФА (0,5 мл), доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Реакцию останавливали добавлением 10 мл 1:1 (об./об.) смеси ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 7,6 мг соединения 75с в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 772,5 (М+1). Соединение 75с также упоминается в настоящем описании выше как соединение (I-12).
Соединение 75с имело EC50 5,4 нМ против клеток рака желудка N87, использовался АТФ люминесцентный анализ.
Пример 19. Соединение 80.
В этом примере описан синтез соединения 80, пригодного для конъюгации через клик химию,
- 44 030830 имеющего циклооктиновую группу, которая может реагировать с азидной группой в молекуле партнера. Соответствующие схема синтеза показана на фиг. 23.
Соединение 77. DCC (22,40 мг, 0,109 ммоль) добавляли к раствору DBCO-PEG4-кислоты 76 (50 мг, 0,090 ммоль, приобретены у Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) и N-гидроксисукцинимида (NHS, 20,83 мг, 0,181 ммоль) в ДХМ (1 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Твердое вещество отфильтровывали и фильтрат концентрировали с получением соединения 77. МС: (+) m/z 650,3 (М+1).
Соединение 78. DIEA добавляли к раствору соединения 77 (58,8 мг, 0,091 ммоль) и соединения 21 (57,6 мг, 0,100 ммоль) в ДМФА (1 мл) при комнатной температуре, доводя pH до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 20 мг соединения 78 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 1113,6 (М+1).
Соединение 79. TFA (0,5 мл, 6,53 ммоль) добавляли к смеси соединения 78 (17,2 мг, 0,015 ммоль) в ДХМ (1 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали с получением соединения 79. МС: (+) m/z 1013,5 (М+1).
Соединение 80. DIEA (2,96 мкл, 0,017 ммоль) добавляли к раствору соединения 9 (8,55 мг, 0,015 ммоль) и HATU (5,87 мг, 0,015 ммоль) в ДМФА (0,4 мл). Значение pH реакционной смеси доводили до 89. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли соединение 79 (15,65 мг, 0,015 ммоль) в ДМФА (1 мл) и DIEA (2,96 мкл, 0,017 ммоль). Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 мин, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт снова растворяли в 1 мл ДМСО и очищали препаративной ВЭЖХ с получением соединения 80 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 775,0 (М/2+1). Соединение 80 также упоминается в настоящем описании выше как соединение (III-12).
Конъюгат соединения 80 и семь вариантов антиглипиканового 3 антитела 4А6, модифицированного введением азидной группы с различной локализации демонстрировал ЕС50 1,4, 0,17, 0,13, 0,22, 0,14, 0,064 и 0,25 нМ против клеток рака желудка N87, использовали анализ поглощения 3Н-тимидина.
Получение и характеристика антитела 4А6 описано в Terrette et al., 2010, раскрытие которого включено в настоящем описание посредством ссылки. Последовательности VH CDR1, CDR2 и CDR3 и VK CDR1, CDR2 и CDR3 для антитела 4А6 приведены в SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22 соответственно. Последовательности вариабельных областей VH и VK представлены в SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24 соответственно.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает конъюгат соединения 80 и полипептида, предпочтительно антитела, модифицированного включением азидной группы.
Пример 20. Соединение 88.
В этом примере описан синтез соединения 88, которое имеет функциональность первичного алкиламина, которая может быть использована для конъюгация. Синтетическая схема представлена на фиг. 24.
Соединение 82. Смесь трет.-бутил-1-амино-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оата 54 (0,285 г, 0,888 ммоль, приобретенного у VWR; см. также пример 8) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил 6-((((9Н-флуорен-9ил)метокси)карбонил)амино)гексаноата 81 (0,4 г, 0,888 ммоль, приобретены у Chem-Impex) в ДМФА (3 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-10% МеОН в ДХМ с получением 0,4 г соединения 82 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 657,4 (М+1).
Соединение 83. Смесь соединения 82 (0,258 г, 0,393 ммоль) в TFA (2 мл, 0,393 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель выпаривали. Соединение 83 (белое твердое вещество) дважды промывали гексаном и использовали на следующей стадии реакции без дополнительной очистки.
Соединение 84. DCC (0,162 г, 0,786 ммоль) добавляли к смеси соединения 83 (0,236 г, 0,393 ммоль) и NHS (0,090 г, 0,786 ммоль) в ДХМ (5 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, твердое вещество отфильтровывали и фильтрат концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с элюированием с силикагеля с градиентом 0-100% EtOAc в гексане, с получением 0,195 г соединения 84 в виде бесцветного масла. МС (+) m/z 698,3 (М+1).
Соединение 85. DIEA добавляли к раствору соединения 21 (0,162 г, 0,279 ммоль) и соединения 84 (0,195 г, 0,279 ммоль) в ДМФА (1,5 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию останавливали добавлением 6 мл 1:1 смеси ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 0,292 г соединения 85 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 1161,6 (М+1).
- 45 030830
Соединение 86. TFA (0,5 мл) добавляли к смеси соединения 85 (22,1 мг, 0,019 ммоль) в ДХМ (1 мл) при комнатной температуре. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, растворитель выпаривали с получением соединения 86. МС: (+) m/z 1061,6 (М+1).
Соединение 87. DIEA добавляли к раствору соединения 9 (10,53 мг, 0,019 ммоль) и HATU (7,23 мг, 0,019 ммоль) в ДМФА (0,4 мл). Значение pH реакционной смеси доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, добавляли соединение 86 (20,19 мг, 0,019 ммоль) в ДМФА (1 мл) и DIEA. Значение pH реакционного раствора доводили до 8-9. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, ЖХ-МС показала, что реакция завершилась. Реакцию останавливали добавлением 10 мл 1:1 (об./об.) смеси воды (0,1 % TFA) и ацетонитрила. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 27,3 мг соединения 87 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 799,1 (М/2+1).
Соединение 88. Пиперидин добавляли к раствору соединения 87 (27,3 мг, 0,017 ммоль) в ДМФА (2 мл) при комнатной температуре, доводя pH до 9-10. После того как реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию останавливали добавлением 6 мл 1:1 смеси ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% TFA. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 22,5 мг соединения 88 в виде белого твердого вещества. МС (+) m/z 688,1 (М/2+1). Соединение 88 также упоминается в настоящем описании выше как соединение (III-13).
В одном варианте осуществления обеспечивается конъюгат, в котором соединение 88 конъюгировано с полипептидом, который предпочтительно представляет собой антитело, через образование амида между первичным алкиламином соединения 88 и карбоксильной группой на боковой цепи остатка аминокислоты - предпочтительно глутаминовой кислоты - в полипептиде. Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения такого конъюгата, включающий объединение соединения 88 и полипептида в присутствии фермента трансглутаминазы.
Вышеприведенное подробное описание изобретения включает в себя утверждения, которые в основном или исключительно связаны с отдельными частями или аспектами изобретения. Следует понимать, что это для ясности и удобства, что конкретный признак может иметь отношение к более, чем просто к утверждению, в котором он описан, и что раскрытие в настоящем описании включает все соответствующие комбинации информации, найденные в различных утверждениях. Аналогичным образом, хотя различные рисунки и описания относятся к конкретным вариантам осуществления по настоящему изобретению, следует понимать, что, когда характерная особенность раскрыта в контексте конкретной фигуры или варианта осуществления, такая особенность может быть также использована в соответствующей степени, в контексте другой фигуры или варианта осуществления, в сочетании с другим признаком или в изобретении в целом.
Кроме того, хотя изобретение было описано в терминах некоторых предпочтительных вариантов осуществления, изобретение не ограничивается такими предпочтительными вариантами осуществления. Наоборот, объем по изобретению определяется прилагаемой формулой изобретения.
Ссылки
Полные цитаты для ссылок, приведенные ранее в настоящем описании в сокращенном виде посредством первого автора (или изобретателя) и даты, приведены ниже. Каждая из этих ссылок включена в настоящее описание посредством ссылки во всех смыслах. Цитирование ссылки, представленой ниже или в другом месте в настоящем описании, не является признанием того, что такая ссылка является существенным источником информации.
- 46 030830
Abe etal., WO 97/21712 (1997).
Boyd et al., US 2008/0279868 Al (2008).
Boyd etal., US 7,691,962 B2 (2010).
Balasubramanian et al.,Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 2996-2999.
Balasubramanian et al., J. Med. Chem. 2009, 52 (2), 238-240.
Chai etal., Chem. &Biol. 2010, 17(3), 296-309.
Chai etal., US 2011/0245295 Al (2011).
Cheng et al., US 2011/0027274 Al (2011).
Coccia et al., US 2010/0150950 (2010)
Davis etal., US 2008/0176958 Al (2008).
Domling, DE 10 2004 030 227 Al (2006).
Domling βία/., US 2005/0239713 Al (2005) [2005a],
Domling et al., US 2005/0249740 Al (2005) [2005b],
Domling et al., Mol. Diversity 2005, 9, 141-147 [2005c].
Domling etal.,Ang. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7235-7239.
Ellman etal., US 8,476,451 B2 (2013).
Hamel etal., Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents 2002, 2, 19-53.
Hoefle etal., DE 100 08 089 Al (2001).
Hoefle et al., Pure Appl. Chem. 2003, 75 (2-3), 167-178.
Hoefle etal., US 2006/0128754 Al (2006) [2006a],
Hoefle etal., US 2006/0217360 Al (2006) [2006b],
Jackson etal., US 2013/0224228 Al (2013).
Kaur etal., Biochem. J. 2006, 396, 235-242.
Khalil etal., ChemBioChem 2006, 7, 678-683.
- 47 030830
Leamon etal., Cancer Res. 2008, 68 (23), 9839-9844.
Leamon etal., US 2010/0323973 Al (2010).
Leung etal., US 2002/0169125 Al (2002).
Low etal., US 2010/0324008 Al (2010).
Lundquist et al., Org. Lett. 2001, 3, 781-783.
Neri etal., ChemMedChem 2006, 1, 175-180.
Pando et al., J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 7692-7696.
Patterson et al., Chem. Eur. J. 2007, 13, 9534-9541.
Patterson et al., J. Org. Chem. 2008, 73, 4362-4369.
Peltier et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 16018-16019.
Reddy et al., Mol. Pharmaceutics 2009, 6 (5), 1518-1525.
Reichenbach et al. WO 98/13375 Al (1998).
Richter, US 2012/0129779 Al (2012) [2012a]
Richter, US 2012/0252738 Al (2012) [2012b],
Richter, US 2012/0252739 Al (2012) [2012c],
Sani et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 3526-3529.
Sasse et al., J. Antibiotics 2000, 53 (9), 879-885.
Sasse et al., Nature Chem. Biol. 2007, 3 (2), 87-89.
Schluep etal., Clin. Cancer Res. 2009, 15 (1), 181-189.
Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147-159.
Shankar etal., SYNLETT2009, 8, 1341-1345.
Shankar etal., Org. Biomol. Chem., 2013, 11(14), 2273-2287.
Shibuee/α/., Tetrahedron Lett. 2009, 50, 3845-3848.
Shibuee/α/., Chemistry Eur. J., 2010, 16(38), 11678-11688.
Shibue et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21, 431-434.
Sreejith et al., SYNLETT2011, No. 12, 1673-1676x.
Steinmetz et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4888-4892.
Terrett et al., US 8,268,970 B2 (2012).
Terrette etal., US 2010/0209432 Al (2010).
Ullrich et al., Angew. Chemie Int. Ed. 2009, 48, 4422-4425.
Vlahov et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18 (16), 4558-4561 [2008a].
Vlahov etal., US 2008/0248052 Al (2008) [2008b],
Vlahov etal., US 2010/0240701 Al (2010) [2010a],
Vlahov etal., US 2010/0048490 Al (2010) [2010b],
Wang et al., Chem. Biol. Drug. Des 2007, 70, 75-86.
Wipf etal., Org. Lett. 2004, 6 (22), 4057-4060.
Wipf etal., Org. Lett. 2007, 9 (8), 1605-1607.
Wipf etal., US 2010/0047841 Al (2010).
Zanda c/n/.,US 8,580,820 B2 (2013).
Перечень последовательностей
Включенным в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте является перечень последовательностей под названием SEQT_12026WOPCT.txt, содержащий последовательности с SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 26, которые включают нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем описании. Перечень последовательностей был представлен при этом в текстовом формате ASCII с помощью EFS-Web и, таким образом, представляется как в бумажной, так и их машиночитаемой форме. Перечень последовательностей впервые был создан при помощи PatentIn 3.5 4 января 2014 года и составляет около 15 КБ.
- 48 030830
В следующей табл. 3 приведены описания последовательностей, раскрытых в этом описании. Таблица 3. Информация о последовательностях
SEQ ID NO: Описание последовательности
1 6А4 Vh CDR1 аминокислотная
2 6А4 Vh CDR2 аминокислотная
3 6А4 Vh CDR3 аминокислотная
4 6А4 Vk CDR1 аминокислотная
5 6А4 Vk CDR2 аминокислотная
6 6А4 Vk CDR3 аминокислотная
7 6А4 Vh аминокислотная
8 6А4 Vk аминокислотная
9 1F4 Vh CDR1 аминокислотная
10 1F4 Vh CDR2 аминокислотная
11 1F4 Vh CDR3 аминокислотная
12 1F4 Vk CDR1 аминокислотная
13 1F4 Vk CDR2 аминокислотная
14 1F4 Vk CDR3 аминокислотная
15 1F4 Vh аминокислотная
16 1F4 Vk аминокислотная
17 4А6 Vh CDR1 аминокислотная
18 4А6 Vh CDR2 аминокислотная
19 4А6 Vh CDR3 аминокислотная
20 4А6 Vk CDR1 аминокислотная
21 4А6 Vk CDR2 аминокислотная
22 4А6 Vk CDR3 аминокислотная
23 4А6 Vh аминокислотная
24 4А6 Vk аминокислотная
25 Модифицированная константная область антигена
26 Модифицированная константная область антигена
- 49 030830
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БРИСТОЛ-МАЙЕРС СКВИББ КОМПАНИ
<120> СОЕДИНЕНИЯ ТУБУЛИЗИНА, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
<130> 12026-WO-PCT
<150> US 61/764825
<151> 2013-02-14
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ile Tyr Gly Met His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
- 50 030830
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr <210>7 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>7
Gln Val 1 His Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Val 10 Val Gln Pro Gly 15 Arg
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Arg Ile Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8 <211>107
- 51 030830
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ala Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ile Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
- 52 030830 <400> 11
Val Asp 1 Tyr Ser Asn 5 Tyr Leu Phe Phe Asp 10 Tyr
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Arg Ala . Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Gly
Tyr
Val
Ser
Ala
Ile
Ser
Asp
Ser
Gly
Gly
Arg
Thr
Tyr
Phe
Ala
Asp
Ser
Val
- 53 030830
Arg 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Ser 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ser Tyr Trp Ile Ala
1 5
<210> 18
- 54 030830
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
5 10 15
Gly
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Arg Ala Val Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr
1 5
<210> 23
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapi
- 55 030830 <400> 23
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Glu
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Arg Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Val Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
- 56 030830
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210>25 <211>327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Modified Antibody Constant Region <400> 25
Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5 Pro Ser Val Phe Pro 10 Leu Ala Pro Cys Ser 15 Arg
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
- 57 030830
Trp Leu Asn 195 Gly Lys Glu Tyr Lys 200 Cys Lys Val Ser Asn 205 Lys Gly Leu
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325 <210> 26 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Modified Antibody Constant Region
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
55 60
- 58 030830
Leu 65 Ser Ser Val Val Thr Val 70 Pro Ser Ser Ser 75 Leu Gly Thr Gln Thr 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Asp Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
- 59 030830
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325 330

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение, имеющее структуру, представленную формулой (I)
    R2 представляет собой С1-С5 алкил, С1-С5 алкенил, С1-С5 алкинил, CH^OC^O^-^ алкил,
    I /=\ l_ /^NH2
    Н(СН2)1-2-\ /) или /)
    CH^C^O^-^ алкенил, CH^C^O^-^ алкинил, '—' '—' ’
    R3a и R3b независимо представляют собой Н, С1-С5 алкил, СЩС5-С6 циклоалкил), CH2C6H5, C6H5 или СН2СН2ОН;
    где R4a представляет собой Н или Ci-C3 алкил и
    Y представляет собой Н, ОН, Cl, F, CN, Me, Et, NO2 или NH2;
    R5 представляет собой Н, С1-С5 алкил, C2-C5 алкенил, C2-C5 алкинил, CO^-^ алкил), СО(С2-С5 алкенил) или СО(С2-С5 алкинил);
    W представляет собой О или S и n равно 0, 1 или 2;
    или его фармацевтически приемлемая соль.
    2. Соединение по п.1, имеющее структуру, представленную формулой (Ia) где Y представляет собой Н или NO2;
    R4a представляет собой Н, Me или Et и
    R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et.
    3. Соединение по п.1, имеющее структуру, представленную формулой (Ib)
    - 60 030830 где R4a представляет собой Н, Me или Et;
    R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me и Et и
    R6 представляет собой С1-С5 алкил, СН2ОС(=О)С1-С5 алкил или (CH2)i-2C6H5.
    4. Соединение по п.3, имеющее структуру, представленную формулой (Ib') где R4a представляет собой Н, Me или Et и R6 представляет собой Me или n-Pr.
    5. Соединение по п.1, имеющее структуру, представленную формулой (I-2)
    6. Соединение по п.1, имеющее структуру, представленную формулой (I-9)
    7. Конъюгат, содержащий соединение по п.1, ковалентно связанное с антителом или его антигенсвязывающим участком, который специфически или предпочтительно связывается с антигеном опухоли.
    8. Конъюгат по п.7, имеющий структуру, представленную формулой (II-1') (П-1') где R6 представляет собой Me или n-Pr и
    Ab представляет собой антитело, которое предпочтительно представляет собой анти-CD70, антимезотелиновое или антиглипикан 3 антитело.
    9. Конъюгат по п.7, имеющий структуру, представленную формулой (II) [D(XD)aC(XZ)b]mZ (II) где Z представляет собой антитело;
    XD является первым спейсерным фрагментом, выбранным из bN-(CH2)2.6-(NH)qО (СН2)2-6-сЧ F(CH2)2-6-(NH)q—
    О
    Hc-(CH2)2-6-(NH)q-^ (CH2CH2O)r-CH2CH2-J,
    О ^-(NH)q-(CH2CH2O)r-CH2CH2-Cа также их комбинации, где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен от 1 до 24,
    - 61 030830
    XZ является вторым спейсерным фрагментом, выбранным из а также их комбинации, где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен от 1 до 24,
    С выбрано из Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, AlaAla-Asn, Lys, Cit, Ser и Glu;
    индексы а и b равны независимо 0 или 1; индекс m равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 и D имеет структуру в соответствии с формулой (D-a) или с формулой (D-b) где Y представляет собой Н или NO2;
    R4a представляет собой Н, Me или Et;
    R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et и
    R6 представляет собой С1-С5 алкил, СН2ОС(=О)С1-С5 алкил или (СН2)1-2С6Н5.
    10. Соединение лекарственное средство-линкер, имеющее структуру в соответствии с формулой (III) где R31 представляет собой -NH2, -ОН, -СО2Н, -SH, малеимидо, циклооктин, азидо (-N3), гидроксиламино (-ONH2) или N-гидроксисукцинимидо;
    XD является первым спейсерным фрагментом, выбранным из где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен 1 до 24;
    XZ является вторым спейсерным фрагментом, выбранным из
    - 62 030830 а также их комбинации, где индекс q равен 0 или 1, а индекс r равен от 1 до 24;
    С выбрано из Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, AlaAla-Asn, Lys, Cit, Ser и Glu;
    индексы, а и b равны независимо 0 или 1 и
    D имеет структуру в соответствии с формулой (D-a) или формулой (D-b) где Y представляет собой Н или NO2;
    R4a представляет собой Н, Me или Et; и R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et и R6 представляет собой С1-С5 алкил, C^OC^O^-Q алкил или (CH2)1-2C6H5.
    11. Соединение лекарственное средство-линкер, имеющее структуру, представленную формулой (III-а) где R3a и R3b независимо представляют собой Н, Me или Et;
    R6 представляет собой Me, Et или n-Pr;
    ААа и каждый ААВ независимо выбираются из группы, состоящей из аланина, β-аланина, γаминомасляной кислоты, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, γ карбоксиглутаминовой кислоты, цитруллина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, норлейцина, норвалина, орнитина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина;
    р равно 1, 2, 3 или 4;
    q равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
    r равно 1, 2, 3, 4 или 5;
    s равно 0 или 1 и
    R31 выбирается из группы, состоящей из
    - 63 030830
    12. Соединение лекарственное средство-линкер по п.10, имеющее структуру, представленную формулой (III-b) где R6 представляет собой Me или n-Pr; q равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
    r равно 1, 2, 3, 4 или 5;
    s равно 0 или 1 и
    R31 выбирается из группы, состоящей из
    13. Соединение лекарственное средство-линкер по п.10, имеющее структуру, представленную формулой (III-1)
    14. Соединение лекарственное средство-линкер по п.10, имеющее структуру, представленную формулой (III-8)
    15. Применение конъюгата по п.7 для получения лекарственного средства для лечения рака у пациента, страдающего от рака, выбранного из группы, состоящей из рака почек, рака желудка, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, колоректального рака, рака яичников, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, лейкоза, рака мозга, множественной миеломы и лимфомы.
    16. Применение по п.15, где соединение, конъюгированное с нацеливающим фрагментом, который представляет собой антитело, которое связывается с антигеном, который сверхэкспрессируется или уникально экспрессируется раковыми клетками.
    17. Применение по п.15, где рак выбирается из группы, состоящей из рака почек, рака легких, рака желудка и рака яичников.
    18. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
    19. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение по п.1, где соединение по п.1 конъюгировано с нацеливающим фрагментом, который представляет собой антитело.
    - 64 030830
    Фиг. 1
    - 65 030830
    Фиг. 2а
    - 66 030830
    - 67 030830
    Фиг. 3
    - 68 030830
    Фиг. 4
    Фиг. 5
    - 69 030830 ciAo^-c6h4no2
    i. Ру ii. MeNH2
    40a (R1 = Et) + 40b (R1 = Me), RJ = NHBoc ---1
    41a (R1 = Et) + 41b (R1 = Me), RJ = NH/HCI ’ HC'
    Фиг. 6а
    - 70 030830
    Фиг. 6b
    - 71 030830
    - 72 030830
    Фиг. 7
    Фиг. 8
    - 73 030830
    - 74 030830
    Фиг. 10
    Фиг. 11
    - 75 030830
    Активность соединений против клеток Н226
    5000000т
    Концентрация токсина (нМ)
    Фиг. 13а
    Активность соединений против клеток 786-0
    Концентрация токсина (нМ)
    Фиг. 13b
    Доксорубицин Соединение А
    6000000.0
    4000000.0
    - 76 030830
    Активность соединений против клеток Н226
    Концентрация токсина (нМ)
    Соединение Доксорубицин Тубулизин D (I-5) (I-6) (I-7) ЕС50 (нМ) 115.4 0.05 19.5 9.9 15.4
    Фиг. 13с
    Активность соединений против клеток 786-0
    1.2x1007 η
    Концентрация токсина (нМ)
    Соединение Доксорубицин Тубулизин D (i-5) (I-6) (I-7) ЕС50 (нМ) 68.9 0.02 22.9 22.8 12.5
    Фиг. 13d
    - 77 030830
    Фиг. 15
    Конъюгаты соединения (111-1): ксенотрансплантаты OVCAR3
    Буфер композиции
    Сутки после введения дозы
    Фиг. 16а
    Мезетилин-(П1-1): 2,9; 0,1
    Мезетилин-(ПМ): 2,9; 0,033
    Мезетилин-(1Н-1): 2,9; 0,01
    Мезетилин-(ПМ): 2,9; 0,033
    Конъюгаты соединения (111-1): ксенотрансплантаты OVCAR3
    Буфер композиции
    Мезетилин-(1И-1): 2,9; 0,1
    Мезетилин-(111-1): 2,9; 0,033
    Мезетилин-(1И-1): 2,9; 0,01
    Мезетилин-(1И-1): 2,9; 0,033
    Фиг. 16b
    - 78 030830
    - 79 030830
    Конъюгаты соединения (111-8):
    ксенотрансплантаты Н226
    Сутки после введения дозы
    Фиг. 19а
    Буфер композиции
    Мезетилин-(Ш-8): 3,2; 0,1
    Мезетилин-(Ш-8): 3,2; 0,1
    Мезетилин-(Ш-8): 3,2; 0,03
    Конъюгаты соединения (111-8):
    против ксенотрансплантатов Н226
    Фиг. 20
    Буфер композиции
    Мезетилин-(1Н-8): 3,2; 0,1
    Мезетилин-(Ш-8): 3,2; 0,1
    Мезетилин-(Ш-8): 3,2; 0,03
    Буфер композиции Мезетилин-(НМ): 2,9; 0,1 Мезетилин-(Н1-1): 2,9; 0,03 Мезетилин-(Н1-1): 2,9; 0,3 CD70-(lll-1): 2,7; 0,1
    Фиг. 19b
    Конъюгаты соединения (111-1): ксенотрансплантаты N87
    - 80 030830
    a. NH3 или
    b. C6H5NH2 или
    c. NHMen
    HATU, DIEA
    Соединение 23
    Фиг. 21
    - 81 030830
    Фиг. 23
    - 82 030830
    Фиг. 24
EA201591317A 2013-02-14 2014-02-10 Соединения тубулизина, способы их получения и применение EA030830B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361764825P 2013-02-14 2013-02-14
PCT/US2014/015503 WO2014126836A1 (en) 2013-02-14 2014-02-10 Tubulysin compounds, methods of making and use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591317A1 EA201591317A1 (ru) 2015-12-30
EA030830B1 true EA030830B1 (ru) 2018-10-31

Family

ID=50179943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591317A EA030830B1 (ru) 2013-02-14 2014-02-10 Соединения тубулизина, способы их получения и применение

Country Status (27)

Country Link
US (5) US9109008B2 (ru)
EP (1) EP2956173B1 (ru)
JP (1) JP6302490B2 (ru)
KR (1) KR102215954B1 (ru)
CN (1) CN105073139B (ru)
AR (1) AR094784A1 (ru)
AU (1) AU2014216539B2 (ru)
BR (1) BR112015019432A2 (ru)
CA (1) CA2900854C (ru)
CY (1) CY1119005T1 (ru)
DK (1) DK2956173T3 (ru)
EA (1) EA030830B1 (ru)
ES (1) ES2628156T3 (ru)
HK (1) HK1212209A1 (ru)
HR (1) HRP20170888T1 (ru)
HU (1) HUE033626T2 (ru)
IL (1) IL240475B (ru)
LT (1) LT2956173T (ru)
MX (1) MX356698B (ru)
PL (1) PL2956173T3 (ru)
PT (1) PT2956173T (ru)
RS (1) RS56169B1 (ru)
SG (1) SG11201506243XA (ru)
SI (1) SI2956173T1 (ru)
TW (1) TW201443083A (ru)
UY (1) UY35322A (ru)
WO (1) WO2014126836A1 (ru)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8288557B2 (en) 2004-07-23 2012-10-16 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
EP2481427A1 (en) 2007-03-14 2012-08-01 Endocyte, Inc. Folate-Tubulysin conjugates
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
CN101784565B (zh) 2007-06-25 2014-12-10 恩多塞特公司 含有亲水性间隔区接头的共轭物
ES2670874T3 (es) 2011-03-16 2018-06-01 Argenx Bvba Anticuerpos contra CD70
US10080805B2 (en) 2012-02-24 2018-09-25 Purdue Research Foundation Cholecystokinin B receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
AU2013331440A1 (en) 2012-10-16 2015-04-30 Endocyte, Inc. Drug delivery conjugates containing unnatural amino acids and methods for using
EA030830B1 (ru) * 2013-02-14 2018-10-31 Бристол-Майерс Сквибб Компани Соединения тубулизина, способы их получения и применение
US20160106860A1 (en) 2013-05-02 2016-04-21 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
CA2935064C (en) 2013-12-27 2023-06-27 Zymeworks Inc. Var2csa-drug conjugates
CN106255513B (zh) 2013-12-27 2022-01-14 酵活有限公司 用于药物偶联物的含磺酰胺连接系统
AU2015231210B2 (en) 2014-03-20 2019-09-12 Bristol-Myers Squibb Company Stabilized fibronectin based scaffold molecules
CA2946538A1 (en) 2014-04-04 2015-10-08 Del Mar Pharmaceuticals Use of dianhydrogalactitol and analogs or derivatives thereof to treat non-small-cell carcinoma of the lung and ovarian cancer
AU2015243379B2 (en) 2014-04-11 2018-02-01 Medimmune Llc Tubulysin derivatives
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
GB201416960D0 (en) 2014-09-25 2014-11-12 Antikor Biopharma Ltd Biological materials and uses thereof
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
CN107250157B (zh) 2014-11-21 2021-06-29 百时美施贵宝公司 包含修饰的重链恒定区的抗体
ME03806B (me) 2014-11-21 2021-04-20 Bristol Myers Squibb Co Antitela protiv cd73 i njihova upotreba
ES2822990T3 (es) 2014-11-25 2021-05-05 Bristol Myers Squibb Co Novedosos polipéptidos de unión a PD-L1 para obtención de imágenes
KR20170137725A (ko) * 2015-02-25 2017-12-13 윌리엄 마쉬 라이스 유니버시티 데스아세톡시투불리신 h 및 이의 유사체
US10676773B2 (en) 2015-03-10 2020-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies conjugatable by transglutaminase and conjugates made therefrom
US9644032B2 (en) 2015-05-29 2017-05-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against OX40 and uses thereof
KR20180057657A (ko) 2015-09-23 2018-05-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 글리피칸-3-결합 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
AU2016363013B2 (en) * 2015-12-04 2022-03-10 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
BR112018012524A2 (pt) 2015-12-21 2018-12-11 Bristol Myers Squibb Co anticorpos variantes para conjugação sítio-específica
IL295230A (en) 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
US20170326249A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate of an anti-glypican-3 antibody and a tubulysin analog, preparation and uses
CN109069665A (zh) 2016-05-10 2018-12-21 百时美施贵宝公司 具有增强的稳定性的微管溶素类似物的抗体-药物缀合物
WO2017218724A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Bristol-Myers Squibb Company Process and intermediates for making tubulysin analogs
KR102493853B1 (ko) 2016-08-19 2023-01-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 세코-시클로프로파피롤로인돌 화합물, 그의 항체-약물 접합체, 및 제조 및 사용 방법
WO2018048975A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Use of an anti-pd-1 antibody in combination with an anti-mesothelin antibody in cancer treatment
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
US10398783B2 (en) 2016-10-20 2019-09-03 Bristol-Myers Squibb Company Antiproliferative compounds and conjugates made therefrom
MX2019013132A (es) 2017-05-25 2020-01-27 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos que comprenden regiones constantes pesadas modificadas.
GB2567613A (en) * 2017-06-16 2019-04-24 Argenx Bvba Treatment for acute myeloid leukaemia
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
JP7165193B2 (ja) 2017-11-27 2022-11-02 パーデュー、ファーマ、リミテッド、パートナーシップ ヒト組織因子を標的とするヒト化抗体
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
SG11202011739SA (en) 2018-05-29 2020-12-30 Bristol Myers Squibb Co Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
US11020490B2 (en) 2018-06-22 2021-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate with a tubulysin analog warhead having a stabilized acetate group in the TUV subunit
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
JP2022513653A (ja) 2018-11-28 2022-02-09 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 修飾された重鎖定常領域を含む抗体
EP3886914B1 (en) 2018-11-30 2023-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibody comprising a glutamine-containing light chain c-terminal extension, conjugates thereof, and methods and uses
JP7514836B2 (ja) 2018-12-12 2024-07-11 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー トランスグルタミナーゼによるコンジュゲーションのための改変抗体、ならびにそのコンジュゲート、方法および用途
TWI848030B (zh) 2018-12-18 2024-07-11 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
CN118027137A (zh) * 2018-12-21 2024-05-14 里珍纳龙药品有限公司 微管溶素及蛋白质-微管溶素偶联物
CN109796358A (zh) * 2019-01-17 2019-05-24 深圳市老年医学研究所 一种Tubulysin家族化合物中间体TUP的合成方法
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
KR20210033435A (ko) 2019-09-18 2021-03-26 메콕스큐어메드 주식회사 아자린 생산이 가능한 신규 균주 및 이의 용도
CN111454230B (zh) * 2020-04-26 2021-12-14 深圳市老年医学研究所 一种天然抗癌药物Tubulysins的关键中间体Tuv的合成方法
CN115867563A (zh) * 2020-06-24 2023-03-28 里珍纳龙药品有限公司 微管溶素及蛋白质-微管溶素偶联物
KR20220037729A (ko) 2020-09-18 2022-03-25 메콕스큐어메드 주식회사 튜블라이신 생산이 가능한 신규 균주 및 이의 용도
WO2024008102A1 (en) * 2022-07-05 2024-01-11 Wuxi Xdc (Shanghai) Co., Ltd. Linker for conjugation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2292639A1 (en) * 2009-07-22 2011-03-09 Kemotech S.r.l. Tubulisine derivatives as anticancer drugs
WO2011069116A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Endocyte, Inc. Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
WO2012010287A1 (en) * 2010-07-19 2012-01-26 Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie Tubulysin analogues

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4631190A (en) 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US5144011A (en) 1981-06-26 1992-09-01 Boston University Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4698420A (en) 1985-02-25 1987-10-06 Xoma Corporation Antibody hybrid molecules and process for their preparation
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4894386A (en) 1987-04-15 1990-01-16 Ici Americas Inc. Aliphatic carboxamides
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
TW420681B (en) 1995-12-08 2001-02-01 Lederle Japan Ltd Carbapenem-3-carboxylic acid ester derivatives
DE19638870B4 (de) 1996-09-23 2009-05-14 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Tubulysine, Verfahren zu ihrer Gewinnung und sie enthaltende Mittel
EP3214175A1 (en) 1999-08-24 2017-09-06 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human ctla-4 antibodies and their uses
DE10008089A1 (de) 2000-02-22 2001-10-31 Biotechnolog Forschung Gmbh Syntheseverfahren zur Herstellung von Tubulysinen
US20020169125A1 (en) 2001-03-21 2002-11-14 Cell Therapeutics, Inc. Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof
AU2002303929B9 (en) 2001-05-31 2007-01-25 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Cytotoxins, prodrugs, linkers and stabilizers useful therefor
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
AU2003205055C1 (en) 2002-01-09 2009-04-23 Medarex, L.L.C. Human monoclonal antibodies against CD30
WO2004005326A2 (de) 2002-07-09 2004-01-15 Morphochem Aktiengellschaft Fu Tubulysinkonjugate
DK1523493T3 (da) 2002-07-09 2013-12-02 Alexander Doemling Nye tubulysinanaloge
DE10241152A1 (de) 2002-09-05 2004-03-18 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysin-Biosynthese-Gene
DE10254439A1 (de) 2002-11-21 2004-06-03 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysine, Herstellungsverfahren und Tubulysin-Mittel
ATE459647T1 (de) 2003-04-15 2010-03-15 Glaxosmithkline Llc Humane il-18 substitutionsmutanten und deren konjugate
NZ544911A (en) 2003-07-22 2008-12-24 Schering Ag RG1 antibodies and uses thereof
WO2005051976A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Ansata Therapeutics, Inc. Protein and peptide ligation processes and one-step purification processes
JP5064037B2 (ja) 2004-02-23 2012-10-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 複素環式自壊的リンカーおよび結合体
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
JP4806680B2 (ja) 2004-05-19 2011-11-02 メダレックス インコーポレイテッド 自己犠牲リンカー及び薬剤複合体
DE102004030227A1 (de) 2004-06-23 2006-01-26 Dömling, Alexander, Dr. Wirkstoffe mit antiangiogenetischen Eigenschaften
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
DK1851250T3 (da) 2005-02-18 2012-07-09 Medarex Inc Humant monoklonalt antistof mod prostataspecifikt membranantigen (psma)
BRPI0607796A2 (pt) 2005-02-18 2009-06-13 Medarex Inc composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, processo para preparação e uso do mesmo, e, composição farmacêutica
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
NZ563193A (en) 2005-05-09 2010-05-28 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
EP1899379B1 (en) 2005-06-20 2018-04-11 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Cd19 antibodies and their uses
ES2468240T3 (es) 2005-08-19 2014-06-16 Endocyte, Inc. Conjugados de ligando de múltiples fármacos
AU2006294554B2 (en) 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
NZ566395A (en) 2005-09-26 2012-03-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to CD70
JP5116686B2 (ja) 2005-10-26 2013-01-09 メダレックス インコーポレイテッド Ｃｃ−１０６５類似体の調製方法及び調製用化合物
CA2627190A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
NZ568015A (en) 2005-12-08 2012-03-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to O8E
KR101373464B1 (ko) 2005-12-08 2014-03-14 메다렉스, 엘.엘.시. 단백질 티로신 키나제 7(ｐｔｋ7)에 대한 인간 단일클론항체 및 그의 용도
KR100869414B1 (ko) 2005-12-13 2008-11-21 야마하 가부시키가이샤 건반식 음판 타악기용의 음판 및 그 제조방법, 음판타악기의 음원 유닛 및 건반식 타악기
DK2035554T3 (da) 2006-06-29 2013-06-17 Univ Leland Stanford Junior Celle-fri syntese af proteiner indeholdende ikke-naturlige aminosyrer
CN101528914B (zh) 2006-09-08 2014-12-03 Ambrx公司 通过脊椎动物细胞位点特异性并入非天然氨基酸
EP2097097B1 (en) 2006-12-01 2018-05-30 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibodies, in particular human antibodies, that bind cd22 and uses thereof
JP2010513306A (ja) 2006-12-14 2010-04-30 メダレックス インコーポレーティッド Ｃｄ７０に結合するヒト抗体およびその使用
UY30776A1 (es) 2006-12-21 2008-07-03 Medarex Inc Anticuerpos cd44
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
EP2121667B1 (en) 2007-02-21 2016-06-08 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
WO2008106080A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthesis of desacetoxytubulysin h and analogs thereof
EP2481427A1 (en) 2007-03-14 2012-08-01 Endocyte, Inc. Folate-Tubulysin conjugates
ES2463693T3 (es) 2007-05-10 2014-05-29 R & D Biopharmaceuticals Gmbh Derivados de tubulisina
CN101784565B (zh) 2007-06-25 2014-12-10 恩多塞特公司 含有亲水性间隔区接头的共轭物
EP2178921B1 (en) 2007-07-17 2016-01-06 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Monoclonal antibodies against glypican-3
US8476451B2 (en) 2007-07-20 2013-07-02 The Regents Of The University Of California Tubulysin D analogues
US9193763B2 (en) 2007-08-17 2015-11-24 Purdue Research Foundation PSMA binding ligand-linker conjugates and methods for using
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
MX2010003581A (es) * 2007-10-01 2010-08-02 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos humanos que se adhieren a mesotelina, y usos de los mismos.
CA2703491C (en) 2007-10-25 2017-06-13 Endocyte, Inc. Tubulysins and processes for preparing
EP2174947A1 (en) 2008-09-25 2010-04-14 Universität des Saarlandes Bioactive pre-tubulysins and use thereof
EP2391714B2 (en) 2009-01-30 2019-07-24 Whitehead Institute for Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
EP2322537A1 (en) 2009-11-12 2011-05-18 R & D Biopharmaceuticals Gmbh Tubulin inhibitors
CN102648208B (zh) 2009-11-12 2016-04-27 R&D生技药品有限责任公司 微管蛋白抑制剂
MX2014006739A (es) 2011-12-05 2015-06-05 Igenica Biotherapeutics Inc Conjugados de anticuerpo-farmaco y compuestos relacionados, composiciones , y metodos.
EA030830B1 (ru) * 2013-02-14 2018-10-31 Бристол-Майерс Сквибб Компани Соединения тубулизина, способы их получения и применение

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2292639A1 (en) * 2009-07-22 2011-03-09 Kemotech S.r.l. Tubulisine derivatives as anticancer drugs
WO2011069116A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Endocyte, Inc. Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
WO2012010287A1 (en) * 2010-07-19 2012-01-26 Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie Tubulysin analogues

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IONTCHO R. VLAHOV; YU WANG; MARILYNN VETZEL; SPENCER HAHN; PAUL J. KLEINDL; JOSEPH A. REDDY; CHRISTOPHER P. LEAMON;: "Acid mediated formation of an-acyliminium ion from tubulysins: A new methodology for the synthesis of natural tubulysins and their analogs", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, PERGAMON, AMSTERDAM, NL, vol. 21, no. 22, 12 September 2011 (2011-09-12), AMSTERDAM, NL, pages 6778 - 6781, XP028320736, ISSN: 0960-894X, DOI: 10.1016/j.bmcl.2011.09.041 *
ORLANDO PANDO, SEBASTIAN STARK, ANNIKA DENKERT, ANDREA PORZEL, RAINER PREUSENTANZ, LUDGER A. WESSJOHANN: "The Multiple Multicomponent Approach to Natural Product Mimics: Tubugis, N-Substituted Anticancer Peptides with Picomolar Activity", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, �AMERICAN CHEMICAL SOCIETY|, vol. 133, no. 20, 25 May 2011 (2011-05-25), pages 7692 - 7695, XP055109834, ISSN: 00027863, DOI: 10.1021/ja2022027 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014126836A1 (en) 2014-08-21
ES2628156T3 (es) 2017-08-01
PT2956173T (pt) 2017-06-26
CN105073139A (zh) 2015-11-18
US9382289B2 (en) 2016-07-05
SI2956173T1 (sl) 2017-06-30
US20140227295A1 (en) 2014-08-14
US8980824B2 (en) 2015-03-17
RS56169B1 (sr) 2017-11-30
MX2015010079A (es) 2016-01-25
KR102215954B1 (ko) 2021-02-15
IL240475A0 (en) 2015-09-24
EP2956173A1 (en) 2015-12-23
CA2900854A1 (en) 2014-08-21
JP6302490B2 (ja) 2018-03-28
AU2014216539B2 (en) 2017-03-23
CY1119005T1 (el) 2018-01-10
AR094784A1 (es) 2015-08-26
LT2956173T (lt) 2017-06-26
HK1212209A1 (en) 2016-06-10
CN105073139B (zh) 2019-01-11
PL2956173T3 (pl) 2017-09-29
BR112015019432A2 (pt) 2017-08-22
HUE033626T2 (en) 2017-12-28
US20140227298A1 (en) 2014-08-14
CA2900854C (en) 2017-08-22
US20150132324A1 (en) 2015-05-14
AU2014216539A1 (en) 2015-10-01
US20160264624A1 (en) 2016-09-15
MX356698B (es) 2018-06-11
DK2956173T3 (en) 2017-07-17
IL240475B (en) 2018-03-29
SG11201506243XA (en) 2015-09-29
US20170260232A1 (en) 2017-09-14
US9109008B2 (en) 2015-08-18
KR20150119086A (ko) 2015-10-23
JP2016509021A (ja) 2016-03-24
US9688721B2 (en) 2017-06-27
TW201443083A (zh) 2014-11-16
EP2956173B1 (en) 2017-03-29
EA201591317A1 (ru) 2015-12-30
HRP20170888T1 (hr) 2017-09-22
UY35322A (es) 2014-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9688721B2 (en) Tubulysin compounds, methods of making and use
CA2864420C (en) Enediyne compounds, conjugates thereof, and uses and methods therefor
KR101759359B1 (ko) 항증식성 화합물, 그의 접합체, 그를 위한 방법, 및 그의 용도
CA2973355A1 (en) Heteroarylene-bridged benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
MX2013013402A (es) Inmunoconjugados, composiciones para prepararlos, y metodos prepararlos y uso.
US20160130299A1 (en) Tubulysin analogs and methods of making and use
JP7023933B2 (ja) セコ－シクロプロパピロロインドール化合物、その抗体－薬物コンジュゲート、ならびに製造および使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU