KR20210033435A

KR20210033435A - 아자린 생산이 가능한 신규 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210033435A
Application number: KR1020200120560A
Authority: KR
Inventors: 정재용; 조경연; 현혜숙; 강다운; 이필구; 김영필; 이정주; 최주오
Original assignee: 메콕스큐어메드 주식회사; 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2021-03-26
Also published as: KR102556416B1; KR20220031878A

Abstract

본 발명은 아자린 생산이 가능한 신규 균주인 아르칸기움 게피라 엠이에이치오 001(Archangium gephyra MEHO 001), 아르칸기움 게피라 엠이에이치오 002(Archangium gephyra MEHO 002) 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

아자린 생산이 가능한 신규 균주 및 이의 용도{Novel microorganism capable of producing argyrin and use of the same}

점액세균(myxobacteria)은 다양한 이차대사 생리활성물질을 생산하는 그람음성 세균으로 현재까지 점액세균으로부터 118종류의 물질들이 분리되었으며 유도체들을 포함하여 600개 이상의 신규 물질이 분리되었다(Gerth et al., 2003; Schaberle et al., 2014, Hyun & Cho, 2018). 아자린(Argyrin)은 점액세균 Archangium gephyra와 Cystobacter sp.에서 분리된 cyclic octapeptide 계열의 물질로 항암, 면역억제, 항미생물 활성이 뛰어난 것으로 알려져 있다(Sasse et al., J. Antibiot. 55: 543-551, 2002; Vollbrecht et al., J. Antibiot. 55: 715-721, 2002; Jones et al., Antimicrob. Agents Chemother. 61: e02400-16, 2017; Pogorevc et al., ACS Synth. Biol. 8: 1121-1133, 2019). 야생형 점액세균이 생산하는 아자린으로는 아자린 A~H가 있으며(Sasse et al., J. Antibiot. 55: 543-551, 2002), Cystobacter sp.의 아자린 생합성 유전자를 이종 점액세균인 Myxococcus xanthus에서 발현시켜 생산한 아자린 I~L, A2, F3, G3이 있다(Pogorevc et al., ACS Synth. Biol. 8: 1121-1133, 2019). 아자린 A는 proteasome의 저해를 통해 항암활성을 보이며(Nickeleit et al., Cancer Cell 14: 23-35, 2008), 아자린 B는 면역억제 활성을 보인다(Allardyce et al., Chem. Biol. Drug. Des. 94: 1556-1567, 2019). 아자린 유도체들은 모두 Pseudomonas 속 세균에 항세균 활성을 보인다(Sasse et al., J. Antibiot. 55: 543-551, 2002).

한편, Tubulysin은 튜불린(tubulin) 중합체의 분해를 촉진함으로써 세포골격의 작용을 저해하는 물질로 뛰어난 항암활성을 보여 많은 연구가 이루어지고 있다(Sasse et al., 2000; Steinmetz et al., 2004; Murray et al., 2015; Reddy et al., 2018; Szigetvari et al., 2018).상기와 같은 Argyrin과 Tubulysin은 항암제와 면역억제제로서의 개발 가치가 매우 높지만 현재까지 국내에서 Argyrin 또는 Tubulysin 생산 균주가 확보되지 않았다. 따라서 Argyrin 또는 Tubulysin에 대한 연구 및 개발을 위해서는 Argyrin 또는 Tubulysin 생산 균주의 국내 확보가 절실하다.

한국 공개특허 10-2015-0119086 호

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 일측면은 신규한 아자린 생산 균주를 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면에서, 아자린 생산수율이 우수한, 신규한 균주를 제공하고자 한다.

상기한 과제 해결을 위하여 본 발명은 하기와 같은 과제의 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일측면은 신규한 아르칸기움 게피라 엠이에이치오 001(Archangium gephyra MEHO 001) 균주를 제공한다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC13929BP인, 아르칸기움 게피라 엠이에이치오 001(Archangium gephyra MEHO 001) 균주를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일측면은 아르칸기움 게피라 엠이에이치오 002(Archangium gephyra MEHO 002) 균주를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC14104BP인, 아르칸기움 게피라 엠이에이치오 002(Archangium gephyra MEHO 002) 균주를 제공한다.

본 발명의 일 측면 또는 또 다른 일측면에 있어서, 상기 균주는 아자린(Argyrin) 또는 튜블라이신(Tubulysin)을 생산하는 균주를 제공한다.

본 발명의 일 측면 또는 또 다른 일측면에 있어서, 상기 균주는 아자린을 생산하는 균주를 제공한다.

본 발명의 일 측면 또는 또 다른 일측면에 있어서, 상기 아자린은 아자린 A 및 B 중 선택된 어느 하나 이상인, 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나의 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물인, 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암용 약학 조성물인, 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암(백혈병, 다발성골수종, 골수이형성증후군 포함), 림프종(호치킨병, 비호치킨림프종 포함), 건선, 또는 섬유선종인, 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 중 어느 하나의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 아자린(Argyrin)의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면에 있어서, 상기 방법은 배양 후 추출하는 단계를 추가적으로 포함하는, 아자린(Argyrin)의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 하나의 측면은 상기 중 어느 하나의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 항암용 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 하나의 측면에 있어서, 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 약학 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 항암용 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 균주는 아자린 생산능을 가진다.

본 발명의 일측면에 따른 균주는 아자린 생산 효율이 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주는 튜블라이신 생산능을 가진다.

본 발명의 일측면에 따른 균주는 튜블라이신 생산 효율이 우수하다.

도 1은 MEHO_001 균주의 영양세포 및 자실체 형태이다.
도 2는 MEHO_001 균주와 관련 점액세균들과의 계통수이다.
도 3은 MEHO_001 균주 배양추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 MEHO_001 균주가 생산하는 물질 MT001과 MT002의 질량분석결과이다.
도 5a는 MT001의 ¹H과 ¹³C 핵자기공명(NMR) 스펙트럼 데이터 이며, 도 5b는 MT002의 ¹H과 ¹³C 핵자기공명(NMR) 스펙트럼 데이터이다. 도 5c는 MT001 (Argyrin A)와 MT002 (Argyrin B)의 화학구조이다.
도 6은 MEHO_001와 이의 분산변이주 MEHO_002의 액체배양 결과이다.
도 7은 Archangium gephra MEHO_001, KYC2816, KYC2842 배양추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 8은 MEHO_001과 분산변이주 MEHO_002에 의한 물질생산을 비교한 결과이다.
도 9는 MT001의 세포독성실험 결과로, 11종 암세포에서 정상세포에 비해 세포 유효성이 있음을 확인하였다.
도 10은 MT001의 세포독성실험의 재현설 실험 결과이다.
도 11은 MEHO_002 균주에 의한 tubulysin 생산 확인 결과이다.

달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.

본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 상세히 설명한다.

본 명세서에서 균주 파쇄물이란, 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 배양물이란, 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 모든 물질을 포함하는 물질을 의미할 수 있으며, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물을 의미할 수 있고 균주 자체도 배양물 내에 포함되어 있을 수 있다.

본 명세서에서, 추출물이란, 균주 자체, 균주의 파쇄물, 그 배양물 또는 이들의 혼합물을 추출용매를 이용하여 추출한 산물을 의미할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다

본 발명의 다른 측면에 따른 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1 내지 500 ㎎, 구체적으로 1 내지 100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 드링크제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 피부 외용제, 좌제, 주사제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있으며, 구체적으로 주사제 또는 피부 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 약학 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 약학 조성물은, 통상의 기술자가 용이하게 적용할 수 있는 다양한 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 mg/kg/일 내지 5000 mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다. 상기 외에 본 발명의 다른 측면에 따른 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 다른 측면에 따른 기능성 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 명세서의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20중량부의 범위에서 포함되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

아자린(Argyrin)은 점액세균 Archangium gephyra와 Cystobacter sp.에서 분리된 cyclic octapeptide 계열의 물질로 항미생물, 항암, 면역억제 활성이 뛰어난 것으로 알려져 있다(Sasse et al., J. Antibiot. 55: 543-551, 2002; Vollbrecht et al., J. Antibiot. 55: 715-721, 2002; Jones et al., Antimicrob. Agents Chemother. 61: e02400-16, 2017; Pogorevc et al., ACS Synth. Biol. 8: 1121-1133, 2019). 야생형 점액세균이 생산하는 아자린으로는 아자린 A~H가 있으며(Sasse et al., J. Antibiot. 55: 543-551, 2002), Cystobacter sp.의 아자린 생합성 유전자를 이종 점액세균인 Myxococcus xanthus에서 발현시켜 생산한 아자린 I~L, A2, F3, G3이 있다(Pogorevc et al., ACS Synth. Biol. 8: 1121-1133, 2019). 아자린 A는 proteasome의 저해를 통해 항암활성을 보이며(Nickeleit et al., Cancer Cell 14: 23-35, 2008), 아자린 B는 면역억제 활성을 보인다(Allardyce et al., Chem. Biol. Drug. Des. 94: 1556-1567, 2019). 아자린 유도체들은 모두 Pseudomonas 속 세균에 항세균 활성을 보인다(Sasse et al., J. Antibiot. 55: 543-551, 2002).

Archangium, Cystobacter 속은 Cystobacteraceae 과에 속하는 점액세균이다. 호서대학교 점액세균은행은 국내에서 분리된 약 2,600여 점액세균을 보유하고 있으며, 이중 Cystobacteraceae 과에 속하며 생존이 확인된 점액세균은 81균주이다. 81균주는 박 등에 의해 보고된 방법(박수연 외, 한국미생물생명공학회지 32: 218-223, 2004)을 사용하여 호서대학교 점액세균은행에 의해 분리되었다.

본 발명에서는 호서대학교 점액세균은행 보유한 81균주의 Cystobacteraceae 과 점액세균을 분석하는 과정에서 아자린 A와 B를 생산하는 것으로 확인된 MEHO_001 균주와 MEHO_001의 분산변이주 MEHO_002 균주 개발에 대한 내용이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 균주 선별, 특성 파악, 동정 및 기탁

(1) MEHO_001 균주의 생물학적 특성

MEHO_001 균주의 영양세포는 두께 0.6~1 μm, 길이 5~15 μm의 끝이 뾰족하고 가는 긴 간균 형태로 Cystobacterineae 아목(suborder)에 속하는 점액세균의 형태이었다(도 1). 용균성 점액세균으로 살아있는 대장균이 도말된 WCE 배지(10 mM morpholinepropanesulphonic acid (MOPS, pH 7.6), 0.1% CaCl27H2O, 1.5% agar)에서 잘 성장하였으며, WCE 배지의 영양분이 고갈되었을 때에는 세포들이 집단으로 뭉쳐 Archangium gephyra 특유의 자실체를 형성하였다(도 1).

(2) 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 균주의 동정

균주의 정확한 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 서열에 의한 계통분석을 실시하였다. MEHO_001 균주를 VY/3 배지(0.5% baker's yeast, 0.1% CaCl2·2H2O, 10 mM 3-[N-morpholino] propanesulfonic acid (MOPS) (pH 7.6), 0.5 μg/ml cyanocobalamine)에서 배양한 후, 균체로부터 DNA를 추출하였으며, 이를 주형으로 PCR (primers: 27F, 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 및 1525R, 5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′/30 cycles: 94℃ 30 sec, 55℃ 30 sec, 72℃ 2 min)로 16S rRNA 유전자 부위를 증폭시켜 정제하고, ㈜마크로젠에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과, MEHO_001 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열은 별도로 첨부한 서열번호 1와 같이 1,506 bp가 분석되었다.

관련 세균들과의 계통학적 분석을 실시한 결과, MEHO_001 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열은 Archangium gephyra의 표준균주와 99.79% 유사한 것으로 분석되었다(도 2). 16S rRNA 유전자의 염기서열이 표준균주와 99.79% 유사하였으며 전형적인 Archangium gephyra의 자실체를 형성하였으므로(도 1), 본 발명에서는 MEHO_001 균주를 아칸지움 게피라(Archangium gephyra)라고 최종 동정하였다.

(3) 미생물 기탁

상기 분리된 균주를 Archangium gephra MEHO_001로 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2019년 8월 27일자로 기탁하였다. 기탁번호는 KCTC 13929BP였다.

실시예 2. MEHO_001의 배양추출물 분석

(1) MEHO_001 균주의 배양추출물 제조

Archangium gephra MEHO_001를 CYS 배지에서 배양한 후, 배양추출물을 제조하였다. CYS 배지는 0.5% 카제인분해물(casitone), 0.1% 효모추출물, 0.3% 가용성 녹말, 0.1% MgSO47H2O, 0.05% CaCl22H2O, 50 mM HEPES (pH 7.6), 0.1% 미량원소용액, 0.5 μg/ml 시안노코발라민(비타민 B12)을 함유하고 있었으며, 미량원소용액은 1리터당 100 mg MnCl2·4H2O, 20 mg CoCl2, 10 mg CuSO4, 10 mg Na2MoO4·2H2O, 20 mg ZnCl2, 5 mg LiCl, 5 mg SnCl2·2H2O, 10 mg H3BO3, 20 mg KBr, 20 mg KI, 8 g EDTA Na-Fe3+salt (trihydrate)를 함유하고 있었다. 균주는 30℃에서 배양하였다.

배양추출물은 다음과 같이 제조하였다. 균주들을 1% Amberlite XAD-16 레진(Sigma, USA)을 넣은 50 ㎖ CYS 배지에서 7일 동안 진탕배양한 뒤 레진을 회수하였다. 레진을 10 ml의 멸균 3차 증류수로 3회 세척한 뒤, 3 ml의 100% 메탄올로 3회 추출하고, 회전증발기를 사용하여 건조하였다. 1:1 비율로 섞인 멸균 3차 증류수와 에틸아세테이트 용액을 8 ml을 넣은 후, 에틸아세테이트 층을 회수하여 회전증발기로 건조하고 1 ml의 100% 메탄올에 용해하였다.

(2) MEHO 001 배양추출물의 HPLC 분석

제조한 배양추출물을 Zorbax SB-C18 칼럼(4.6×150 ㎜, 5 ㎛)을 장착한 Agilent 1260 VL Infinity Series HPLC 시스템(Agilent Technologies, USA)을 사용하여 분석하였다. 이동상 A는 0.1% 포름산을 함유한 증류수, 이동상 B는 0.1% 포름산을 함유한 아세토니트릴을 사용하였다. 유속은 0.5 ㎖/min으로 0-5분 간 30% B용매, 5-25분 간 30%에서 60% B용매 기울기, 25-30분 간 60%에서 100% B용매 기울기, 30-35분 간 100% B용매, 35-40분 간 30% B용매로 용리하였다. 용리액은 photo diode array (PAD) 검출기를 사용하여 검출하였다.

MEHO_001 균주의 배양추출물을 HPLC로 분석한 결과, 20.8분, 22.2분 부근의 피크가 다른 피크에 비해 상대적으로 높게 나타났으므로 두 피크를 각각 MT001과 MT002로 명명하였다(도 3).

실시예 3. MEHO_001이 생산하는 물질 MT001과 MT002의 분석

(1) MT001과 MT002의 질량분석

MEHO_001 균주 배양추출물에서 검출된 MT001과 MT002 피크 분획을 분리하여 경기도경제과학진흥원의 경기바이오센터에 UPLC-MS 분석을 의뢰하였다. UPLC-MS 분석은 Waters BEH C18 칼럼(2.1×150 mm, 1.7 μm)을 장착한 UHPLC (Waters, USA)와 Orbitrap Fusion 고분해능 질량분석기(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 이루어졌다. 이동상 A는 0.1% 포름산을 함유한 증류수, 이동상 B는 0.1% 포름산을 함유한 아세토니트릴을 사용하였다. 용매의 유속은 0.4 ml/min이었으며 0-1분간 30% B용매 기울기, 1-15분간 30-60% B용매 기울기, 15-25분간 60-100% B용매 기울기, 25-27분간 100% B용매 조건으로 용리하였다.

분석 결과, MT001은 [M+H]+의 m/z 값이 825.3048로 아자린 A의 이론분자량(825.3137)과 매우 유사하였으며, MT002는 [M+H]+의 m/z 값이 839.3214로 아자린 B의 이론분자양(839.3294)과 매우 유사하였다(도 4).

(2) MT001과 MT002의 핵자기공명(NMR) 분석

MEHO_001 균주가 생산하는 물질 MT001과 MT002를 분리, 정제하여 경기도경제과학진흥원의 경기바이오센터에 핵자기공명(NMR) 분석을 의뢰하였다.

도 5a는 MT001의 ¹H과 ¹³C 핵자기공명(NMR) 스펙트럼 데이터이며, 도 5b는 MT002의 ¹H과 ¹³C 핵자기공명(NMR) 스펙트럼 데이터이다. 도 5c는 MT001 (Argyrin A)와 MT002 (Argyrin B)의 화학구조이다.

그 결과, MT001은 물질의 구조가 아자린 A와 동일하며, MT002는 아자린 B와 동일한 것으로 분석되었다(도 5).

실시예 4. 분산변이주 분리

(1) 배경

점액세균들은 액체배양 시 세포들이 뭉쳐 자라는 특성을 보인다. 이러한 특성은 발효조를 이용한 대량배양에 장애가 되며, 균주 개선을 위한 유전자 조작도 불가능하게 한다. MEHO_001 균주 역시 액체배지에서 응집현상을 보였다(도 6). 따라서 본 발명에서는 Archangium gephra MEHO_001 균주를 대상으로 액체배지에서 분산하여 성장하는 균주를 개발하고자 하였다.

(2) 분산변이주의 선별

점액세균은 S-운동성에 관여하는 유전자가 불활성화될 경우 분산하여 성장하는 것으로 알려져(Shimkets, J. Bacteriol. 166: 837-841, 1986). 본 발명에서는 MEHO_001 균주를 CYS 배지에서 연속적으로 계대배양하여 자발적으로 S-운동성이 상실된 4균주를 선발하였다. 이 중 CYS 액체배지에서 완전히 분산하여 생장하며, 물질 생산도 뛰어난 한 균주를 최종 선발하였다(도 6)

(3) 미생물 기탁

상기 분리된 균주를 Archangium gephra MEHO_002로 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2020년 1월 14일자로 기탁하였다. 기탁번호는 KCTC 14104BP였다.

실험예 1. 다른 Archangium gephra 균주들과의 물질 생산능력 비교

가. 실험 방법

MT001 (아자린 A)과 MT002 (아자린 B)의 생산이 Archangium gephra 균주들에서 발견되는 일반적인 특성인지, 아니면 MEHO_001 균주의 독특한 특성인지 조사하기 위하여 MEHO_001 균주와 국내 토양에서 분리된 Archangium gephra KYC2816와 KYC2842 균주를 CYS 배지에서 배양한 후, 배양추출물을 제조하였다. 그리고 HPLC를 사용하여 상기 분석방법과 동일한 조건으로 분석하였다.

나. 실험 결과

MEHO_001 균주의 배양추출물에서 20.788분에서 MT001 (아자린 A)가 검출되었으며, 22.238분에서는 MT002 (아자린 B)가 검출되었다(도 7).

하지만 Archangium gephra KYC2816와 KYC2842의 배양추출물에서 이러한 피크들이 전혀 검출되지 않았다(도 7). 따라서 KYC2816와 KYC2842 균주는 Archangium gephra이기는 하지만 아자린을 생산하지 않는 것으로 나타났다. 한편, 유전체 서열 분석에 의하면 Archangium gephra의 표준균주인 DSM 2261도 아자린 생합성 유전자를 가지고 있지 않아 아자린을 생산하지 못한다. 따라서 아자린 생산은 Archangium gephra 균주들에서 일반적으로 발견되는 특성이 아니라 MEHO_001 균주가 갖는 독특한 능력인 것으로 판단되었다.

실험예 2. 분산변이주 MEHO_002에 의한 물질 생산

가. 실험 방법

MEHO_001의 분산변이주인 MEHO_002 균주의 물질생산 능력을 조사하기 위하여 MEHO_001 균주와 MEHO_002 균주를 CYS 배지에서 배양한 후, 배양추출물을 제조한 다음, HPLC로 분석하였다.

나. 실험 결과

실험 결과는 도 8과 같았다.

야생형 균주 MEHO_001에 비해 분산변이주인 MEHO_002는 3.22배 많은 MT001 (아자린 A)을 생산하였으며, 3.12배 많은 MT002 (아자린 B)를 생산하는 것으로 분석되었다(도 8). 한편, 질량분석에 의하면 분산변이주 MEHO_002가 생산하는 MT001 (아자린 A)과 MT002 (아자린 B)는 MEHO_001 균주가 생산하는 물질과 동일한 것으로 분석되었다.

실험예 3. MT001의 암세포 저해 효과 확인

MT001의 암세포 저해 효과 확인을 위하여 MTT assay를 진행하였다.

1. 재료 및 장비

1)재료는 Complete media, DPBS, FBS, 1XTrypsin-EDTA, Penicillin-Streptomycin Solution, 96 well plate, 100X20mm cell culture dish, MTT solution(2mg/ml), reservoir, DMSO를 준비하였다.

2) 장비는 Clean bench와 ELISA를 준비하였다.

2. 샘플 제조

(1) Sample: MT001, solvent

(2) Sample Stock : 1.2mM (=1mg/ml, 10% EtOH + 1%Tween + 89% PBS)

(3) Sample stock 제조 방법 : Sample은 treat 직전에 제조하였다.

1) 5ml 유리 vial에 MT001을 측량한다.

2) 1mg/ml 농도가 되게 10% EtOH + 1% Tween80 + 89% 1X PBS비율로 용매를 넣어준다.

3) 단, EtOH과 Tween80을 섞은 용매 1X PBS 순으로 넣어주며 EtOH + Tween80을 넣은 후 1X PBS는 한방울씩 떨어뜨려 vortexing 하며 넣어준다.

4) 제조된 sample stock을 이용하여 연속 희석한다. (희석 용매 : Media)

(4) Sample 농도 : 200nM~20Pm (1/10 serial dilution)

Stock(1.2mM)->200uM->20uM->2uM->200nM-> ,,, ->20pM

3. MTT assay

1) Seeding 후 24시간 배양한다.

2) 기존 media suction 후 제조한 sample을 treat한다.

-> media suction 시 white tip 2개를 겹쳐서 사용

3) 72시간 추가 배양한다.

4) 배양이 끝난 세포는 Sample suction 후 2mg/ml 농도의 MTT solution을 SF media와 2:8로 희석하여 처리 후 2~3시간 배양한다.

-> Powder의 MTT를 DPBS에 2mg/ml에 농도로 녹여 냉장실에 보관

-> MTT : SF = 2 : 8 비율이며, 제조 및 MTT treat 시 clean bench의 형광등을 끄고 진행

5) Formazan이 형성된 것을 현미경으로 확인한다.

6) MTT solution을 제거 후, DMSO(purity 95%)를 100ul 첨가하여 cell lysis하고 microplate를 이용하여 30초동안 shaking 후 570nm에서 측정한다.

-> Cell의 밀집도에 따라 formazan이 고르게 잘 섞이지 않을 수도 있기 때문에 plate 모서리를 손으로 쳐주며 충분한 shaking을 진행함. (정확한 시간, 횟수를 정해 놓지 않음)

-> Microplate의 shaking은 orbital로 30초 진행한다.

4. 실험 결과

실험 결과는 표 1 및 도 9와 같았다.

Cell line		IC50 (pM)	R ²	비고
대장	HCT-116	487	0.98
담도	SNU-308	662	0.87	Xenograft model 제작의 어려움
간	SK-HEP1	1903	0.97	Xenograft model 제작의 어려움
췌장	PANC-1	2122	0.96
폐	NCI-H358	2578	0.79
대장	HCT-8	7425	0.95
신장	SN12PM6	8715	0.91
신장	SN12C	18180	0.92
담도	HuCCT1	26883	0.87
정상	WI-38	327306	0.87
폐	HCC15	20	0.68	강한독성을 가지지만 낮은 R² 값 - 재실험 필요
유방	BT-20	514	0.44	고농도에서 낮은 독성 및 낮은 R² 값

상기와 같이 11종 암세포에서 정상세포에 비해 세포 유효성이 있음을 확인하였다.

한편, 상기 유효성은 하기 재현성 실험을 통해 신뢰성 검증을 완료하였고, 신뢰성 검증 결과는 표 2 및 도 10과 같았다.

	Inhibitory concentration 50 (IC₅₀)
농도	PANC-1 (췌장암)	HCT-116 (대장암)	HCC-15 (폐암)
200~0.00256 (nM)	1.275	1.010	0.804
8~0.00256 (nM)	1.070	0.755(=755pM)	0.577(=577pM)
8~0.0128 (nM)	1.079	0.757	0.600

실험예 4. 분산변이주 MEHO_002에 의한 tubulysin 생산 확인

MEHO_001 균주는 최초 tubulysin 생합성 유전자를 가진 점액세균으로 선발되었다. 따라서 MEHO_001의 분산변이주인 MEHO_002 균주를 대상으로 배양추출물을 제조한 후, tubulysin을 생산 여부를 확인하였다.

대조물질로는 tubulysin A와 B를 생산하는 MEHO_004의 배양추출물을 사용하였다.

실험 결과는 도 11과 같았다.

MEHO_002 균주의 배양추출물을 HPLC로 분석한 결과, tubulysin A와 B가 검출되는 시간과 매우 유사한 17.78분과 18.07분에 물질피크가 검출되었다.

흡광스펙트럼을 분석한 결과 이들 물질피크들은 모두 전형적인 tubulysin의 흡광스펙트럼을 보였다. 따라서 MEHO_002 균주와 모균주인 MEHO_001은 argyrin과 함께 tubulysin도 생산하는 것으로 판단되었다.

이상, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예를 통해 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국생명공학연구원

KCTC13929BP

20190827

한국생명공학연구원

KCTC14104BP

20200114

<110> Mecox curemed hoseo university <120> Novel microorganism capable of producing argyrin and use of the same <130> DP-2020-0423 <150> KR 10-2019-0115047 <151> 2019-09-18 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1506 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of MEHO_001 <400> 1 tggctcagaa cgaacgctgg cggcgtgcct aacacatgca agtcgagcgc gaatggagca 60 atcctagtag agcggcgcac gggtgcgtaa cacgtggata atctgcctgg gtgtctggga 120 taaccagtcg aaagattggc taataccgga taagcccccg ggagcttcgg ctcctgaggg 180 aaaaggtggc ctctgtatac aagctatcac atccagatga gtccgcggcc catcagctag 240 ttggcggggt aatggcccac caaggcaacg acgggtagct ggtctgagag gacgatcagc 300 cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaattttgcg 360 caatgggcga aagcctgacg cagcaacgcc gcgtgtgtga tgaaggtctt cggattgtaa 420 agcactttcg accgggacga aaacccgttg gctaacatcc aacggcttga cggtaccggg 480 agaagaagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt 540 gttcggaatt attgggcgta aagcgcgtgt aggcggcttt gcaagtcggg tgtgaaagcc 600 ctcagctcaa ctgaggaagt gcgcccgaaa ctgcagagct tgagtgccgg agagggtggc 660 ggaattcccc aagtagaggt gaaattcgta gatatgggga ggaacaccgg tggcgaaggc 720 ggccacctgg acggtaactg acgctgagac gcgaaagcgt gggtagcaaa caggattaga 780 taccctggta gtccacgccg taaacgatga gaactaggtg tcgtgggtgt tgacccccgc 840 ggtgccgtag ctaacgcatt aagttctccg cctgggaagt acggtcgcaa gactaaaact 900 caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgacgcaacg 960 cgcagaacct tacctggtct tgacatcctt ggaatccttc agagatgagg gagtgcccgc 1020 aagggaacca agagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080 ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgcc tttagttgcc gcgcaagcgg atctctagag 1140 ggactgccgg tgttaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca tggcctttat 1200 gaccagggct acacacgtgc tacaatggcc ggtacaacgc gtcgccaacc cgcgaggggg 1260 agctaatcgc ataaaaccgg tctcagttca gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag 1320 gcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380 cacaccgccc gtcacaccat gggagtcgat tgctccagaa gtcatcccac caaggggtgc 1440 ccaaggagtg gtcggtaact ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg ggaacctgcg 1500 gctgga 1506

Claims

아르칸기움 게피라 엠이에이치오 001(Archangium gephyra MEHO 001) 균주.
아르칸기움 게피라 엠이에이치오 002(Archangium gephyra MEHO 002) 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 기탁번호가 KCTC13929BP인, 아르칸기움 게피라 엠이에이치오 001(Archangium gephyra MEHO 001) 균주.
제 2 항에 있어서,
상기 균주는 기탁번호가 KCTC14104BP인, 아르칸기움 게피라 엠이에이치오 002(Archangium gephyra MEHO 002) 균주.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 균주는 아자린(Argyrin) 또는 튜블라이신(Tubulysin)을 생산하는 균주.
제 5 항에 있어서,
상기 균주는 아자린을 생산하는 균주.
제 6 항에 있어서,
상기 아자린은 아자린 A 및 B 중 선택된 어느 하나 이상인, 균주.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물인, 조성물.
제 9 항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 항암용 약학 조성물인, 조성물.
제 9 항에 있어서,
상기 암은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암(백혈병, 다발성골수종, 골수이형성증후군 포함), 림프종(호치킨병, 비호치킨림프종 포함), 건선, 또는 섬유선종인, 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 아자린(Argyrin)의 생산 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 방법은 배양 후 추출하는 단계를 추가적으로 포함하는, 아자린(Argyrin)의 생산 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 항암용 약학 조성물의 제조 방법.
제 14 항에 있어서,
균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 약학 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 항암용 약학 조성물의 제조 방법.