JP6110240B2

JP6110240B2 - 乳酸菌の菌体等、並びにこれらを含有する口腔内疾患の予防材等及び食品

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Publication number: JP6110240B2
Application number: JP2013139722A
Authority: JP
Inventors: 浩樹二川
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2033-07-03
Also published as: JP2014218491A

Description

本発明は、う蝕（虫歯）や歯周病等の口腔内疾患に有効な乳酸菌に関する。

口腔内には、多種多様な微生物によって構成された微生物叢が存在する。そこには、う蝕菌、歯周病菌、カンジダ菌等も存在し、これらは、う蝕、歯周疾患や舌炎、鵞口瘡、口腔カンジダ症等の疾患を引き起こす。

このような口腔内疾患を防ぐために、経口投与する様々な抗菌剤が使用されている。しかし、抗菌剤の場合、口腔内に投与しても、唾液や飲食物によって容易に洗い流されてしまうため、その効果は一過性のものと言わざるを得なかった。

そこで、本発明者は、口腔内疾患に有効な乳酸菌を見出したことから、これを用いた治療剤等を先に提案している（特許文献１）。

更に、本発明者が研究を進めていたところ、先に提案した乳酸菌と同等、あるいはそれ以上に口腔内疾患に有効な乳酸菌株を新たに見出した。

再公表特許２０１１−００７５８４号公報

すなわち、本発明の目的は、口腔内疾患の予防や改善、治療などに有効な乳酸菌の菌体等を提供することにある。

本発明は、新たに見出した乳酸菌に基づくものである。

すなわち、本発明は、ラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ４株（ＮＩＴＥＰ−１５５８）及びラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ５株（ＮＩＴＥＰ−１５５９）の乳酸菌のうち、少なくともいずれか１種の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物である。

これら乳酸菌の菌体等は、単独あるいは混ざった状態で、口腔内疾患の予防材、改善材又は治療材に含有させることができ、また、食品に含有させてもよい。

食品の場合、特に発酵乳又は発酵飲料が好ましい。

本発明によれば、口腔内疾患の予防等を促進できる。

ストレプトコッカス・ミュータンスに対する発育阻害効果を示すグラフである。（ｂ）は、コントロール以外を拡大して示したグラフである。ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する発育阻害効果を示すグラフである。（ｂ）は、コントロール以外を拡大して示したグラフである。カンジダ・アルビカンスに対する発育阻害効果を示すグラフである。（ｂ）は、コントロール以外を拡大して示したグラフである。パルスフィールド電気泳動による泳動結果を示す図である。パルスフィールド電気泳動による解析結果を示す図である。

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。ただし、以下の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物あるいはその用途を制限するものではない。

＜乳酸菌＞
本発明に関する乳酸菌は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）に属する乳酸菌であり、今回新たに見出された２種の菌株である。これら菌株は、本発明者によって、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。

具体的には、ＮＩＴＥＰ−１５５８として寄託されたラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ４株と、ＮＩＴＥＰ−１５５９として寄託されたラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ５株である（それぞれ、ＯＧ４株、ＯＧ５株ともいう）。

ＯＧ４株及びＯＧ５株は、有意に健全な口腔を有する被験者の唾液中から単離された乳酸菌である。ＯＧ４株及びＯＧ５株は、それぞれ別の被験者から単離されている。

ＯＧ４株及びＯＧ５株は、いずれもヒトの口腔内から採取された乳酸菌であるため、安全である。従って、食品や薬品等に容易に適用できる。

ＯＧ４株及びＯＧ５株は、いずれも、16S rRNAの塩基配列がラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）strain IDCC3201の塩基配列と1485/1485の間で100％の相同性を示し、グラム染色後の顕鏡下においてクラム陽性桿菌の様相を呈することから、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）と同定された。

ＯＧ４株及びＯＧ５株は、後述するＫＯ３株とは異なる、いずれもホモ型乳酸発酵を行うカタラーゼ陰性細菌であり、芽胞は形成しない。好気条件下でも培養可能であり、菌体外多糖類を産生する。

ＯＧ４株及びＯＧ５株は、常法によって得られるこれらの菌体のみならず、発酵液や培養上清などのこれらの菌体培養物、菌体や菌体培養物を処理して得られる細胞質や細胞壁画分などの抽出物も用いることができる。また、菌体は、生菌のみならず死菌であってもよい。

ＯＧ４株及びＯＧ５株を培養する培地には、果汁培地、野菜汁培地、牛乳培地、脱脂粉乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地等種々の培地を用いることができる。具体的には、脱脂乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地、酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地等を例示することができる。

ＯＧ４株及びＯＧ５株の培養方法は、静置培養又はｐＨを一定にした中和培養や、回分培養及び連続培養等、菌体が良好に生育する条件であれば、特に制限はない。

菌体や菌体培養物の抽出物としては、菌体や菌体培養物を溶媒抽出して得られる抽出液、その希釈液、その濃縮液、その乾燥末などがある。

その抽出に用いる溶剤は、極性溶剤、非極性溶剤のいずれも使用でき、これらを混合したものであってもよい。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類等が挙げられ、このうち、酢酸エチル等のエステル類、エタノール等のアルコール類が好ましい。

抽出条件は、溶剤によっても異なるが、例えば、培養液１質量部に対して1〜１０質量部の溶剤を用い、０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、０．５時間〜３時間抽出するのが好ましい。

ＯＧ４株及びＯＧ５株は、口腔内疾患の予防等に優れた効果を発揮する。

口腔内疾患とは、う蝕菌、歯周病菌又はカンジダ菌に起因して口腔内で発症する疾患をいい、例えば、う蝕症、歯肉炎、歯周炎等の歯周病、舌炎、鵞口瘡、口角炎等の口腔カンジダ症等が挙げられる。

う蝕菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）等が挙げられる。

歯周病菌としては、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、プレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）、トレポネーマ・デンティコーラ（Treponema denticola）、タンネレラ・フォーサイセンシス（Tannerella forsythensis）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）等が挙げられる。

カンジダ菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等が挙げられる。

＜乳酸菌の発育阻害効果＞
う蝕菌や歯周病菌、カンジダ菌に対するＯＧ４株及びＯＧ５株の発育阻害効果を、特許文献１に開示された乳酸菌と比較しながら詳細に説明する。

比較対象とした乳酸菌は、ＫＯ３株（Lactobacillus rhamnosus，ＮＩＴＥＢＰ−７７１）、ＹＵ３株（Lactobacillus casei，ＮＩＴＥＢＰ−７７２）及びＹＵ４株（Lactobacillus paracasei，ＮＩＴＥＢＰ−７７５）である。

（菌体の調製）
ＭＲＳ培地（Difco社）を１２１℃で２０分間滅菌した後、ＯＧ４株及びＯＧ５株のそれぞれを接種し、３７℃で、４８時間大気下で培養した後、蒸留水等で洗浄し、菌体を得た。なお、比較対象であるＫＯ３株、ＹＵ３株及びＹＵ４株についても、ＯＧ４株等と同じ条件で菌体を調製し、−８０℃で保存した。

（試験方法）
各菌株の菌体を、常温で解凍し、遠沈（3000rpm×5min）にて回収後、滅菌蒸留水で２回洗浄し、ＯＤ６００で０．３とすることにより、所定の菌濃度（約1.0×10⁹cfu/ml）に調整した。

所定の菌濃度にした各菌株の懸濁液５００μlを、１５mlのＭＲＳ液体培地又はブレインハートインフュージョン液体培地（ＢＨＩ液体培地：Difco）に接種した後、３７℃で４８時間、静置培養を行った。その後、３０００rpm、５分間（室温）の遠沈を行い、その上清（培養上清）を回収した。後述する抗菌アッセイでは、この回収した各菌株の培養上清を用いた。

（被験菌株）
被験菌株には、う蝕菌（mutans streptococci）として、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans Ingbritt）を、歯周病菌として、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis 381株）を、そして、カンジダ菌として、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans MYA274）を用いた。

ストレプトコッカス・ミュータンスの場合、５％の酵母エキス（Difco）を添加したTryptic Soy Broth（ＴＳＢＹ液体培地：Difco）を用い、３７℃、２４時間培養を行った。その後、滅菌蒸留水で２回洗浄した後、ＯＤ６００で０．３（約1.0×10⁸cfu/ml）に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。

ポルフィロモナス・ジンジバリスの場合、ＧＡＭ培地（１％ヘミンおよび０．２％ビタミンＫを添加）を用い、３７℃で７日間、アネロパック（MCG）を入れた嫌気ジャー（１０％CO₂）中で前培養を行った。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、ＯＤ６００で０．３（約0.5×10⁷cfu/ml）に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。

カンジダ菌の場合、サブローデキストロース液体培地（Difco）を用いて３７℃で２４時間前培養し、滅菌蒸留水で２回洗浄した後、ＯＤ６００で０．３（約1.0×10⁷cfu/ml）に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。

（抗菌アッセイ）
２４穴プレートを用い、その各ウェルに、ストレプトコッカス・ミュータンスに対してはＴＳＢＹ液体培地、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対してはＧＡＭまたはＢＨＩの液体培地、カンジダに対してはサブロー液体培地のそれぞれを１ml添加した。
対応する各ウェルに、ＯＧ４株、ＯＧ５株、ＫＯ３株、ＹＵ３株及びＹＵ４株の各培養上清１mlを個別に加え、対応する各被験菌株の菌懸濁液を個別に５０μl接種し、テストサンプルとした。

コントロールサンプルとして、ＴＳＢＹ液体培地又はサブロー液体培地の１mlを添加した各ウェルに、ＭＲＳ液体培地又はＢＨＩ液体培地を１ml添加し、対応する各被験菌株の菌懸濁液を個別に５０μl接種した。テストサンプル及びコントロールサンプルは、いずれも同じ操作で４つずつ作製した（Ｎ＝４）。

テストサンプル及びコントロールサンプルは、３７℃で２４時間培養した後、菌量の指標として、ＡＴＰ量を測定した。ＡＴＰ量の測定は、常法により、ルミノメーター（AB2200 ルミネッセンサーPSN、ATTO、東京）を用いて行った。その結果を、グラフにしたものを図１〜図３に示す。

図１は、ストレプトコッカス・ミュータンスの試験結果を示している。図２は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの試験結果を示している。図３は、カンジダの試験結果を示している。各グラフは、各サンプルでのＡＴＰ量（平均値）を表している。

各図の（ａ）から明らかなように、ＯＧ４株、ＯＧ５株、ＫＯ３株、ＹＵ３株、ＹＵ４株は、いずれもコントロールと比べて明らかにＡＴＰ量が少ない。すなわち、菌量が少ないことから、被験菌株の増殖が抑制されていることがわかる。従って、試験に供した各菌株の培養上清は、抗菌スペクトルが広く、各被験菌株に対して優れた発育阻害効果がある。

更に、各図の（ｂ）から明らかなように、ＯＧ４株及びＯＧ５株は、ＫＯ３株、ＹＵ３株及びＹＵ４株の各菌株と比べて、同等か、それ以上の発育阻害効果があることがわかる。

このように、ＯＧ４株及びＯＧ５株の培養上清に、口腔内疾患の主な原因菌に対して優れた発育阻害効果が認められたことから、これら菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物は、う蝕や歯周病等の口腔内疾患の予防、改善又は治療に対して有効である。

＜乳酸菌の利用＞
ＯＧ４株及びＯＧ５株の菌体、菌体培養物又はこれらの抽出物は、経口摂取する医薬品や食品などに利用できる。

ＯＧ４株及びＯＧ５株を医薬品に用いる場合には、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレット等の固形剤、カプセル剤、口腔用スプレー、トローチ等にすることができる。

これら医薬品には、賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜配合してもよい。

医薬品におけるＯＧ４株及びＯＧ５株の菌体、菌体培養物又はこれらの抽出物の含有量は、全組成中の１質量％〜５０質量％が好ましく、１０質量％〜２０質量％がより好ましい。

ＯＧ４株及びＯＧ５株を食品に用いる場合には、例えば、果汁又は野菜汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、発酵乳、発酵果汁、発酵野菜汁、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料に使用できる。ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ジャム、パン、ガム、飴、スープ類、漬物、佃煮等の各種食品の他、サプリメント等の健康食品や特定保健用食品等の機能性食品にも使用できる。

ＯＧ４株及びＯＧ５株は乳酸菌であるため、その培養物は、ヨーグルト、チーズ、味噌、醤油、漬物等の発酵食品に好適である。その発酵乳やチーズを用いてパンやスナック菓子、ケーキ等にしてもよい。

ＯＧ４株及びＯＧ５株の発酵は、予めスターターを用意し、これを発酵用原料物質に接種して行うのが好ましい。スターターとしては、例えば、通常の殺菌処理を行った発酵用原料物質（例えば酵母エキスを添加した１０％脱脂粉乳など）に、ＯＧ４株及びＯＧ５株を接種して培養したものを挙げることができる。

発酵用原料物質には、必要に応じて発酵促進物質、例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フラクトースなどの炭素源、酵母エキス、ペプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類などを加えてもよい。

ＯＧ４株及びＯＧ５株の接種量は、例えば、発酵用原料物質含有液１ｍＬ中に菌体が約１×１０⁶ｃｅｌｌｓ以上、好ましくは１×１０⁷ｃｅｌｌｓ前後である。ＯＧ４株及びＯＧ５株の発酵温度は、例えば、２０℃〜４２℃、好ましくは２５℃〜３７℃である。ＯＧ４株及びＯＧ５株の発酵時間は、例えば５時間〜７２時間である。

ＯＧ４株及びＯＧ５株を発酵して得られる乳酸発酵物は、凝固したカード状（ヨーグルト状）の形態を有しており、そのままで固形食品として利用できる。その乳酸発酵物を粉砕して均質化すれば、飲料として利用できる。

ＯＧ４株及びＯＧ５株の生菌としての添加量は、仕様に応じて適宜調整すればよい。例えば、液状の場合は、その菌体濃度を１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１×１０⁸ｃｅｌｌｓ／ｍｌとするのが好ましい。固形の場合は、１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｇ〜１×１０¹⁰ｃｅｌｌｓ／ｇとするのが好ましい。

ＯＧ４株及びＯＧ５株の成人一人当たりの摂取量（生菌）は、例えば、１×１０⁸〜５×１０¹⁰ｃｅｌｌｓ／日である。

このように、ＯＧ４株及びＯＧ５株の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物を、医薬品や食品などに含ませて経口摂取すれば、う蝕菌等の原因菌の発育を阻害できるので、口腔内疾患の予防、改善又は治療に役立つ。

特に、ヨーグルト等の発酵乳又は発酵飲料のように、生菌を含む形態で摂食するとよい。ＯＧ４株及びＯＧ５株の生菌が口腔内に定着して、口腔内に常在するようになれば、その効果が継続して得られるため、きわめて有効である。

＜ＯＧ４株、ＯＧ５株、及びＫＯ３株の比較＞
ＯＧ４株、ＯＧ５株、及びＫＯ３株が、それぞれ異なる菌株であること確認するために試験を行った。

試験では、ＯＧ４株、ＯＧ５株、及びＫＯ３株の各菌株からＤＮＡを抽出し、抽出した各ＤＮＡを制限酵素（Spel,Smal,Apal）で切断した後、パルスフィールド電気泳動（ＰＦＧＥ）を行った。

その結果を図４及び図５に示す。なお、図４の「Ｍ」はマーカーである。

これら結果より、ＯＧ４株、ＯＧ５株、ＫＯ３株で、それぞれ異なるパターンが認められ、ＯＧ４株、ＯＧ５株、及びＫＯ３株は、それぞれ異なる菌株であることが確認された。

Claims

ラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ４株（ＮＩＴＥＰ−１５５８）及びラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ５株（ＮＩＴＥＰ−１５５９）の乳酸菌のうち、少なくともいずれか１種の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物を含有する、う蝕菌、歯周病菌、又はカンジダ菌に起因して口腔内で発症する口腔内疾患の予防、改善、又は治療用の材料。
ラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ４株（ＮＩＴＥＰ−１５５８）及びラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ５株（ＮＩＴＥＰ−１５５９）の乳酸菌のうち、少なくともいずれか１種の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物を含有する、う蝕菌、歯周病菌、又はカンジダ菌に起因して口腔内で発症する口腔内疾患の予防、改善、又は治療用の医薬品。
ラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ４株（ＮＩＴＥＰ−１５５８）及びラクトバチルス・ラムノーサスＯＧ５株（ＮＩＴＥＰ−１５５９）の乳酸菌のうち、少なくともいずれか１種の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物を含有する、う蝕菌、歯周病菌、又はカンジダ菌に起因して口腔内で発症する口腔内疾患の予防、改善、又は治療用の食品。
請求項３に記載の食品において、
前記食品が、発酵乳又は発酵飲料である食品。