ES2822990T3 - Novedosos polipéptidos de unión a PD-L1 para obtención de imágenes - Google Patents

Novedosos polipéptidos de unión a PD-L1 para obtención de imágenes Download PDF

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David Donnelly
Dasa Lipovsek
Jochem Gokemeijer
Maria Jure-Kunkel
David Fabrizio
Martin Wright
Douglas Dischino
Samuel Bonacorsi
Ralph Smith
Virginie Lafont
Daniel Cohen
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Abstract

Un polipeptido, que comprende un decimo dominio de tipo III de fibronectina (10Fn3), en donde (a) el dominio 10Fn3 comprende los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, (b) los bucles BC, DE y FG comprenden las secuencias de aminoacidos de: (i) los SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente; (ii) los SEQ ID NO: 21, 22 y 23, respectivamente; (iii) los SEQ ID NO: 36, 37 y 38, respectivamente; (iv) los SEQ ID NO: 51, 52 y 53, respectivamente; (v) los SEQ ID NO: 66, 67 y 68, respectivamente; (vi) los SEQ ID NO: 81, 82 y 83, respectivamente; o (vii) los SEQ ID NO: 97, 98 y 99, respectivamente; y (c) el polipeptido se une especificamente a PD-L1 con una KD de 10 nM o menos.

Description

DESCRIPCIÓN
Novedosos polipéptidos de unión a PD-L1 para obtención de imágenes
Antecedentes
El ligando de muerte programada-1 (PD-L1) es un ligando de glicoproteína superficial de PD-1, un receptor del punto de control inmunitario clave expresado por linfocitos T y B activados y media la inmunosupresión, que se ha descubierto tanto en células presentadoras de antígenos como en cánceres humanos, y regula defectivamente la activación de linfocitos T y la secreción de citocinas mediante su unión a PD-1 (Freeman et al., 2000; Latchman et al, 2001). La inhibición de la interacción PD-L1/PD-1 permite una potente actividad antitumoral en modelos preclínicos, y se han iniciado ensayos clínicos con anticuerpos que interrumpen esta interacción para el tratamiento del cáncer (patentes de Estados Unidos números 8.008.449 y 7.943.743; Brahmer et al., 2010; Topalian et al., 2012b; Brahmer et al., 2012; Flies et al., 2011; Pardoll, 2012; Hamid y Carvajal, 2013).
La PET, o tomografía de emisión de positrones, es una técnica de medicina nuclear no invasiva que produce una imagen tridimensional de diversos procesos moleculares del organismo, o la ubicación de proteínas asociadas a una patología. La metodología detecta pares de rayos gamma emitidos indirectamente por un radionucleido emisor de positrones (trazador) introducido en el organismo en una molécula biológicamente activa. Las herramientas de obtención de imágenes PET tienen una gran diversidad de usos en el desarrollo de fármacos, y tienen una ventaja médica única que se traduce, en que la misma herramienta se pude utilizar tanto preclínica como clínicamente. Los ejemplos incluyen visualización directa in vivo de la saturación de dianas; supervisión de la captación en tejidos normales para anticipar toxicidad o una variación entre pacientes; cuantificar tejido enfermo; metástasis tumoral; supervisar la eficacia de un fármaco a lo largo del tiempo, o la resistencia a lo largo del tiempo, y más.
En el presente documento se describen novedosas adnectinas anti-PD-L1 adecuadas para usar como agentes de diagnóstico/obtención de imágenes, por ejemplo, para usar en tomografía de emisión de positrones.
Sumario
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevas adnectinas contra PD-L1 humano que son útiles como agentes de diagnóstico/obtención de imágenes, por ejemplo, para usar en tomografía de emisión de positrones. Estos agentes son útiles en, por ejemplo, la diferenciación de las células que expresan PD-L1 de las que no expresan PD-L1, por ejemplo, células tumorales, y la diferenciación del tejido que expresa PD-L1 del que no expresa PD-L1, por ejemplo, tejido canceroso. En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende un décimo dominio de tipo III de fibronectina (1234567890123456Fn3), en donde (a) el dominio 10Fn3 comprende los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, (b) los bucles BC, DE y FG comprenden las secuencias de aminoácidos de:
(i) los SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente;
(ii) los SEQ ID NO: 21, 22 y 23, respectivamente;
(iii) los SEQ ID NO: 36, 37 y 38, respectivamente;
(iv) los SEQ ID NO: 51, 52 y 53, respectivamente;
(v) los SEQ ID NO: 66, 67 y 68, respectivamente;
(vi) los SEQ ID NO: 81, 82 y 83, respectivamente; o
(vii) los SEQ ID NO: 97, 98 y 99, respectivamente; y (c) el polipéptido se une específicamente a PD-L1 con una Kd de 10 nM o menos.
También se describen en el presente documento dominios 10Fn3 que comprenden los bucles BC, DE y FG que comprenden las secuencias de aminoácidos de:
(1) los SEQ ID NO: 113, 114 y 115, respectivamente;
(2) los SEQ ID NO: 124, 125 y 126, respectivamente;
(3) los SEQ ID NO: 135, 136 y 137, respectivamente;
(4) los SEQ ID NO: 146, 147 y 148, respectivamente;
(5) los SEQ ID NO: 157, 158 y 159, respectivamente;
(6) los SEQ ID NO: 168, 169 y 170, respectivamente;
(7) los SEQ ID NO: 179, 180 y 181, respectivamente;
(8) los SEQ ID NO: 190, 191 y 192, respectivamente;
(9) los SEQ ID NO: 201, 202 y 203, respectivamente;
(10) los SEQ ID NO: 212, 213 y 214, respectivamente;
(11) los SEQ ID NO: 223, 224 y 225, respectivamente;
(12) los SEQ ID NO: 234, 235 y 236, respectivamente;
(13) los SEQ ID NO: 245, 246 y 247, respectivamente;
(14) los SEQ ID NO: 256, 257 y 258, respectivamente;
(15) los SEQ ID NO: 267, 268 y 269, respectivamente;
(16) los SEQ ID NO: 278, 279 y 280, respectivamente;
(17) los SEQ ID NO: 289, 290 y 291, respectivamente;
(18) los SEQ ID NO: 300, 301 y 302, respectivamente;
(19) los SEQ ID NO: 311, 312 y 313, respectivamente;
(20) los SEQ ID NO: 322, 323 y 324, respectivamente;
(21) los SEQ ID NO: 333, 334 y 335, respectivamente;
(22) los SEQ ID NO: 344, 345 y 346, respectivamente;
(23) los SEQ ID NO: 355, 356 y 357, respectivamente;
(24) los SEQ ID NO: 366, 367 y 368, respectivamente;
(25) los SEQ ID NO: 377, 378 y 379, respectivamente;
(26) los SEQ ID NO: 388, 389 y 390 respectivamente;
(27) los SEQ ID NO: 399, 400 y 401, respectivamente;
(28) los SEQ ID NO: 410, 411 y 412, respectivamente;
(29) los SEQ ID NO: 421,422 y 423, respectivamente;
(30) los SEQ ID NO: 432, 433 y 434, respectivamente;
(31) los SEQ ID NO: 443, 444 y 445, respectivamente;
(32) los SEQ ID NO: 454, 455 y 456, respectivamente;
(33) los SEQ ID NO: 465, 466 y 467, respectivamente;
(34) los SEQ ID NO: 476, 477 y 478, respectivamente;
(35) los SEQ ID NO: 487, 488 y 489, respectivamente;
(36) los SEQ ID NO: 498, 499 y 500, respectivamente;
(37) los SEQ ID NO: 509, 510 y 511, respectivamente;
(38) los SEQ ID NO: 520, 521 y 522, respectivamente;
(39) los SEQ ID NO: 531, 530 y 531, respectivamente;
(40) los SEQ ID NO: 542, 543 y 544, respectivamente;
(41) los SEQ ID NO: 553, 554 y 555, respectivamente; o
(42) los SEQ ID NO: 564, 565 y 566, respectivamente.
Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia definida en la Tabla 3, por ejemplo, una cualquiera del SEQ ID NO: 5, 20, 35, 50, 65, 80, 96, 112, 123, 134, 145, 156, 167, 178, 189, 200, 211, 222, 233, 244, 255, 266, 277, 288, 299, 310, 321, 332, 343, 354, 365, 376, 387, 398, 409, 420, 431,442, 453, 464, 475, 486, 497, 508, 519, 530, 541, 552 y 563. En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las de las regiones de bucle no de BC, DE y FG del SEQ ID NO: 5, 20, 35, 50, 65, 80 y 96. También se describen en el presente documento polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las de las regiones de bucle no de BC, DE y FG del SEQ ID NO: 112, 123, 134, 145, 156, 167, 178, 189, 200, 211, 222, 233, 244, 255, 266, 277, 288, 299, 310, 321, 332, 343, 354, 365, 376, 387, 398, 409, 420, 431, 442, 453, 464, 475, 486, 497, 508, 519, 530, 541, 552 o 563. Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 9-15, 24-30, 39-45, 54-60, 69-75, 84-91, 100-107, 116-122, 127-133, 138-144, 150-155, 160-166, 171-177, 182-188, 193-199, 204-210, 215-221,227-232, 237-243, 248-254, 259-265, 271-276, 291-287, 292-298, 303-309, 314-320, 325-331,337-342, 347­ 353, 358-364, 369-375, 380-386, 391-397, 402-408, 413-419, 424-430, 435-441, 446-452, 457-463, 468-474, 479­ 485, 490-496, 501-507, 512-518, 523-529, 534-540, 545-551 y 556-562. En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las de las regiones de bucle no de BC, DE y FG de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 9-15, 24-30, 39-45, 54-60, 69-75, 84-91 y 100-107. También se describen en el presente documento polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las de las regiones de bucle no de BC, DE y FG de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 116-122, 127-133, 138-144, 150-155, 160-166, 171-177, 182­ 188, 193-199, 204-210, 215-221, 227-232, 237-243, 248-254, 259-265, 271-276, 291-287, 292-298, 303-309, 314­ 320, 325-331, 337-342, 347-353, 358-364, 369-375, 380-386, 391-397, 402-408, 413-419, 424-430, 435-441, 446­ 452, 457-463, 468-474, 479-485, 490-496, 501-507, 512-518, 523-529, 534-540, 545-551 y 556-562.
En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia líder en el extremo N seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 574-583, y/o una cola en el extremo C seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 584-618 o PmCn, en donde P es prolina, y en donde m es un número entero que es al menos 0 (por ejemplo, 0, 1 o 2) y n es un número entero de al menos 1 (por ejemplo, 1 o 2).
En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende uno o más restos farmacocinéticos (PK) seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido siálico, Fc, fragmento Fc, transferrina, albúmina sérica, una proteína de unión a la albúmina sérica, y una proteína de unión a la inmunoglobulina sérica. En ciertas realizaciones, el resto PK y el polipéptido están unidos mediante al menos un enlace disulfuro, un enlace peptídico, un polipéptido, un azúcar polimérico o un resto de polietilenglicol. En ciertas realizaciones, el resto PK y el polipéptido están unidos mediante un enlazador que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en los SEQ ID NO: 629­ 678.
Se proporcionan en el presente documento ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, así como los vectores y las células que comprenden los ácidos nucleicos, descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 16­ 19, 31 -34, 46-49, 61 -64, 76-79, 92-95 y 108-111.
Se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden los polipéptidos descritos en el presente documento, y un transportador. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento comprenden un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 5, 9-15, 20, 24-30, 35, 39-45, 50, 54-60, 65, 69-75, 80, 84-91, 96, 100-107, 112, 116-122, 123, 127-133, 134, 138-144, 145, 150-155, 156, 160-166, 167, 171-177, 178, 182-188, 189, 193-199, 200, 204-210, 211, 215-221, 222, 227-232, 233, 237-243, 244, 248-254, 255, 259-265, 266, 271-276, 277, 291-287, 288, 292-298, 299, 303-309, 310, 314-320, 321, 325-331, 332, 337-342, 343, 347-353, 354, 358-364, 365, 369-375, 376, 380-386, 387, 391-397, 398, 402-408, 409, 413-419, 420, 424-430, 431, 435-441,442, 446-452, 453, 457-463, 464, 468-474, 475, 479-485, 486, 490-496, 497, 501-507, 508, 512-518, 519, 523-529, 530, 534-540, 541, 545-551, 552 y 556-562, y un transportador.
Se proporcionan en el presente documento agentes de obtención de imágenes que comprenden los polipéptidos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes comprende un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 5, 9­ 15, 20, 24-30, 35, 39-45, 50, 54-60, 65, 69-75, 80, 84-91, 96 y 100-107. Los agentes de obtención de imágenes descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 112, 116-122, 123, 127-133, 134, 138-144, 145, 150-155, 156, 160-166, 167, 171-177, 178, 182-188, 189, 193-199, 200, 204-210, 211, 215-221,222, 227-232, 233, 237-243, 244, 248-254, 255, 259-265, 266, 271-276, 277, 291-287, 288, 292-298, 299, 303-309, 310, 314-320, 321, 325-331, 332, 337-342, 343, 347-353, 354, 358-364, 365, 369-375, 376, 380-386, 387, 391-397, 398, 402-408, 409, 413-419, 420, 424-430, 431,435-441, 442, 446-452, 453, 457-463, 464, 468-474, 475, 479-485, 486, 490-496, 497, 501-507, 508, 512-518, 519, 523-529, 530, 534-540, 541,545-551, 552 y 556-562.
En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes comprende una marca detectable. En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes comprende un polipéptido divulgado en el presente documento, un agente quelante y un marcador detectable. En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes comprende un polipéptido divulgado en el presente documento, un quelante bifuncional o un resto de conjugación (BFC) y una marca detectable. En ciertas realizaciones, la marca detectable es un grupo prostético que contiene un radionucleido. En ciertas realizaciones, la marca detectable es detectable por tomografía de emisión de positrones.
En ciertas realizaciones, el agente quelante y/o quelante bifuncional o un resto de conjugación (BFC) se selecciona entre el grupo que consiste en Df O, DOTA, CB-DO2A, 3p-C-DEPA, TCMC, DBCO, DIBO, BARAC, DIMAC, Oxo-DO3A, TE2A, CB-TE2A, CB-TE1A1P, CB-TE2P, MM-TE2A, DM-TE2A, diamsar, NODASA, NODAGA, NOTA, NETA, TACN-TM, DTPA, 1B4M-DTPA, CHX-A"-DTPA, TRAP, NOPO, AAZTA, DATA, H2dedpa, H4octapa, gazapa, H5decapa, Hsfospa, HBED, SHBED, BPCA, CP256, PCTA, HEHA, PEPA, EDTA, TETA y TRITA.
En ciertas realizaciones, la marca detectable es un radionucleido, por ejemplo, 64Cu, 124I, 76/77Br, 86Y, 89Zr, 68Ga, 18F, 11C 125j 124j 1311123j 131 j 123j 32Cl 33Cl 34Cl 68Ga 74Br 75Br 76Br 77Br 78Br 88Zr 186Re 188Re 90y 177Lu 99Tc o 153Sm
En ciertas realizaciones, el agente quelante es NODAGA y el radionucleido es 64Cu. En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes comprende un polipéptido dirigido contra PD-L1 (por ejemplo, una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento, por ejemplo, una adnectina contra PD-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos definida en el SEQ ID NO: 80 o 96), el agente quelante NODAGA y el radionucleido 64Cu.
En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes comprende un polipéptido dirigido contra PD-L1 (por ejemplo, una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento, por ejemplo, una adnectina contra PD-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos definida en el SEQ ID NO: 80 o 96), un quelante bifuncional o un resto de conjugación (BFC), y un grupo prostético que comprende el radionucleido 18F. En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000005_0001
En algunas realizaciones, el BFC es un ciclooctino que comprende un grupo reactivo que forma un enlace covalente con un grupo funcional de amina,carboxilo, carbonilo o tiol de la proteína. En algunas realizaciones, el ciclooctino se selecciona entre el grupo que consiste en dibenzociclooctino (DIBO), biarilazaciclooctinona (BARAC), dimetoxiazaciclooctino (DIMAC) y dibenzociclooctino (DBCO). En algunas realizaciones, el ciclooctino es DBCO.
En algunas realizaciones, el BFC es DBCO-PEG4-NHS-éster, DBCO-Su/fo-NHS-éster, DBCO-PEG4-ácido, DB-CO-PEG4-amina o DBCO-PEG4-maleimida. En algunas realizaciones, el BFC es DBCO-PEG4-maleimida.
En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes tiene la estructura:
Figure imgf000005_0002
en donde X es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los SEQ ID NO: 13, 28, 43, 58, 73, 88 y 104. X también puede ser un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los SEQ ID NO: 120, 131, 142, 153, 164, 175, 186, 197, 208, 219, 230, 241, 252, 263, 274, 285, 296, 307, 318, 329, 340, 351, 362, 373, 384, 395, 406, 417, 428, 439, 450, 461, 472, 483, 494, 505, 516, 527, 538, 549, 560 y 571. En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos definida en el SEQ ID NO: 88. En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos definida en el SEQ ID NO: 104.
Se proporcionan en el presente documento kits que comprenden una composición de adnectina contra PD-L1 y/o un agente de obtención de imágenes descrito en el presente documento, e instrucciones para el uso.
Se proporciona en el presente documento un método para detectar PD-L1 en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con una adnectina contra PD-L1, y detectar PD-L1.
Se proporciona en el presente documento un método para detectar células positivas para PD-L1 en un sujeto que comprende administrar al sujeto un agente de obtención de imágenes que comprende una adnectina contra PD-L1, y detectar el agente de obtención de imágenes, definiendo el agente de obtención de imágenes la ubicación de las células positivas para PD-L1 en el sujeto.
Se proporciona en el presente documento un método para detectar tumores que expresan PD-L1 en un sujeto que comprende administrar al sujeto agentes de obtención de imágenes que comprenden una adnectina contra PD-L1, y detectar el agente de obtención de imágenes, definiendo el agente de obtención de imágenes la ubicación del tumor en el sujeto. En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes se detecta por tomografía de emisión de positrones.
Se proporciona en el presente documento un método para obtener una imagen de un agente de obtención de imágenes que comprende una adnectina contra PD-L1, comprendiendo el método,
a) administrar el agente de obtención de imágenes a un sujeto; y
b) obtener imágenes in vivo de la distribución del agente de obtención de imágenes por tomografía de emisión de positrones.
Se proporciona en el presente documento un método para obtener una imagen cuantitativa de tejidos o células que expresan PD-L1, comprendiendo el método poner en contacto las células o el tejido con un agente de obtención de imágenes que comprende una adnectina contra PD-L1, y detectar o cuantificar el tejido que expresa PD-L1 usando tomografía de emisión de positrones.
Se proporciona en el presente documento un método para detectar un tumor que expresa PD-L1 que comprende administrar una cantidad eficaz para obtención de imágenes de un agente de obtención de imágenes que comprende una adnectina contra PD-L1 a un sujeto que tiene un tumor que expresa PD-L1, y detectar las emisiones radiactivas de dicho agente de obtención de imágenes en el tumor usando tomografía de emisión de positrones, en donde las emisiones radioactivas se detectan en el tumor.
Se proporciona en el presente documento el uso de un agente de obtención de imágenes en un método para detectar la presencia de un tumor que expresa PD-L1 en un sujeto, comprendiendo el método
(a) administrar un agente de obtención de imágenes que comprende una adnectina contra PD-L1 al sujeto que lo necesita; y
(b) obtener una radioimagen de al menos una parte del sujeto para detectar la presencia o la ausencia del agente de obtención de imágenes;
en donde la presencia y la ubicación del agente de obtención de imágenes por encima del fondo es indicativa de la presencia y la ubicación de la enfermedad.
Se proporciona en el presente documento el uso de un agente de obtención de imágenes en un método para supervisar el progreso de una terapia antitumoral contra tumores que expresan PD-L1 en un sujeto, que comprende
(a) administrar un agente de obtención de imágenes que comprende una adnectina contra PD-L1 a un sujeto que lo necesita en un primer punto temporal y obtener una imagen de al menos una parte del sujeto para determinar el tamaño del tumor;
(b) administrar una terapia antitumoral al sujeto;
(c) administrar el agente de obtención de imágenes al sujeto en uno o más puntos temporales posteriores y obtener una imagen de al menos una parte del sujeto en cada punto temporal; en donde la dimensión y la ubicación del tumor en cada punto temporal son indicativas del progreso de la enfermedad.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un esquema de las secuencias de aminoácidos principales de las adnectinas dirigidas contra PD-L1 descritas en el presente documento. Los bucles BC, DE y FG están subrayados. Natural (WT) (SEQ ID NO: 2), ATI-968 (SEQ ID NO: 5), ATI-964 (SEQ ID NO: 20), ATI-967 (SEQ ID NO: 65), A02 (SEQ ID NO: 80), E01 (SEQ ID NO: 96), ATI-965 (SEQ ID NO: 35), y ATI-966 (SEQ ID NO: 50).
La Figura 2 es un esquema de la síntesis química de [18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA. La porción E01 de la molécula tiene la secuencia definida en el SEQ ID NO: 104.
La Figura 3 es un gráfico que demuestra la discriminación de células L2987 positivas para hPD-L1 de las células HT-29 negativas para hPD-L1 con la adnectina 64Cu-E01 contra PD-L1 (con un quelante NODAGA). La especificidad se confirmó por la reducción de 64Cu-E01 asociado a células cuando se incubó simultáneamente con un exceso de adnectinaE01 (no marcada) fría.
La Figura 4A es una imagen PET que representa la discriminación de los tumores hPD-L1 (+) de los hPD-L1 (-) en ratones con xenoinjerto bilateral con una A02 marcada con NODAGA-64Cu anti-PD-L1. Se muestra el sumatorio de imágenes de 0 a 2 horas que muestran zonas de residencia de la probeta. Las áreas brillantes son tejido de mayor ocupación durante la exposición.
La Figura 4B es un gráfico que representa la evolución del marcado tumoral en tumores hPD-L1 (+) [L2987]. Los tumores hPD-L1(-) [HT29] y el experimento de pulso y caza en sistemas hPD-L1(+) [con bloqueo de L2987] muestran la especificidad del marcado.
La Figura 5 es un gráfico que representa la distribución en el tejido del radiotrazador de adnectina A02 marcada con 18F anti-PD-LI en ratones con injertos bilaterales de L2987 hPD-L1(+) y HT-29 hPD-L1(-) medidos ex vivo con un contador gamma.
La Figura 6 es una imagen compuesta de la distribución de una adnectina E01 marcada con 18P anti-PD-L1 en macaco.
La Figura 7 es una imagen que representa una autorradiografía in vitro de un xenoinjerto y tejidos de pulmón humano marcados con la adnectina A02 marcada con 18F-DBCO anti-PD-L1 0,25 nM incubada simultáneamente con las concentraciones indicadas de adnectina A02 fría.
La Figura 8 representa gráficamente imágenes inmunohistoquímicas de muestras de xenoinjerto y de tumor de pulmón humano marcados con adnectinas anti-PD-L1 para demostrar la expresión de hPD-L1 en el tumor.
La Figura 9 muestra un sistema de reacción para sintetizar [18F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA. Se usó el mismo esquema de reacción para marcar la adnectina E01.
La Figura 10 es un esquema del Módulo de síntesis GE TRACERlab FX2 N para la síntesis automatizada de [18F]-FPPEGA.
La Figura 11 es un esquema del Módulo de síntesis (IBA) para la síntesis automatizada [18F]-FPPEGA.
La Figura 12 representa gráficamente las curvas de competición ilustrativas de adnectina contra los PD-L1.
Descripción detallada
Definiciones
Salvo que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la técnica entiende habitualmente. Aunque en la práctica o análisis de la invención descrita también se pueden usar cualquier método y composición similar o equivalente a los descritos en el presente documento, en el presente documento se describen los métodos y composiciones preferidos.
El "Ligando de muerte programada 1 (PD-L1)" es uno de los dos ligandos de glucoproteína de la superficie celular para PD-1 (el otro es PD-L2) que regula negativamente la activación de los linfocitos T y la secreción de citocinas al unirse a pD-1. El término "PD-L1" como se utiliza en el presente documento incluye el PD-L1 humano (hPD-L1), variantes, isoformas y homólogos de especies de hPD-L1, y análogos que tienen al menos un epítopo común con hPD-L1. La secuencia completa de hPD-L1 se puede encontrar en el número de registro de GenBank Q9NZQ7. PD-L1 también se denomina como CD274, B7-H, B7H1, PDCD1 l1 y PDCD1 lG1.
"Polipéptido", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier secuencia de dos o más aminoácidos, independientemente de la longitud, modificación posterior a la traducción o función. "Polipéptido", "péptido", y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento. Los polipéptidos pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales tales como los descritos en la patente de Estados Unidos n.° 6.559.126. Los polipéptidos también se pueden modificar mediante cualquiera de varias formas químicas habituales (por ejemplo, se puede modificar un aminoácido con un grupo protector; el aminoácido del extremo carboxi se puede convertir en un grupo amida terminal; el resto del extremo amino se puede modificar con grupos para, por ejemplo, mejorar la lipofilia; o el polipéptido se puede glucosilar químicamente o modificar de otro modo para aumentar la estabilidad o la semivida in vivo). Las modificaciones de polipéptidos pueden incluir la unión de otra estructura tal como un compuesto cíclico u otra molécula al polipéptido y también puede incluir polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos en una configuración alterada (es decir, R o S; o L o D). Los péptidos descritos en el presente documento son proteínas derivadas del décimo dominio de tipo III de fibronectina que se ha modificado para unirse específicamente a PD-L1 y se denominan en el presente documento como, "adnectina anti-PD-LI" o " adnectina de PD-L1".
Una "cadena de polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido en donde cada uno de los dominios del mismo está unido a otro(s) dominio(s) mediante enlace(s) peptídico(s), en oposición a interacciones no covalentes o enlaces disulfuro.
Un polipéptido "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso de polipéptido determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos restos de la secuencia de aminoácidos de extremo N o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ con células recombinantes, ya que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del polipéptido. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Una "región" de un dominio 10Fn3 tal como se usa en el presente documento se refiere bien a un bucle (AB, BC, CD, DE, EF y FG), una cadena p (A, B, C, D, E, F y G), el extremo N (que corresponde a los restos de aminoácidos 1-7 del SEQ ID NO: 1), o el extremo C (que corresponde a los restos de aminoácidos 93-94 del SEQ ID NO: 1) del dominio 10Fn3 humano.
Una "región de estructura base" se refiere a cualquier región sin bucle de un dominio 10Fn3 humano. La región de armazón incluye las cadenas p A, B, C, D, E, F y G p, así como la región del extremo N (aminoácidos correspondientes a los restos 1-7 del SEQ ID NO: 1) y la región del extremo C (restos de aminoácidos correspondientes a los restos 93­ 94 del SEQ ID NO: 1) y opcionalmente comprenden los 7 aminoácidos que constituyen el enlazador natural entre la 10a y la 11a repetición del dominio Fn3 de la fibronectina humana).
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" se define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y no considerar cualquier sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o el programa informático Megalign (DNASTAR™). Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, el % de identidad de secuencia de un aminoácido de una secuencia aminoácidos A dada para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede, como alternativa, citarse como una secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia para, con o frente a una secuencia de aminoácidos B) se calcula del modo siguiente: 100 por la fracción X/Y donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de unión a adnectina" se refiere al sitio o porción de una proteína (por ejemplo, PD-L1) que interactúa o se une a una adnectina en particular. Los sitios de unión a adnectina se puede formar a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los sitios de unión a adnectina formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se mantienen tras exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los sitios de unión a adnectina formados mediante plegamiento terciario generalmente se pierden durante el tratamiento con disolventes desnaturalizantes.
Un sitio de unión a adnectina para una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento se puede determinar mediante la aplicación de técnicas convencionales normalmente usadas para el cartografiado de epítopos e incluyen, aunque no de forma limitativa, cartografiado con proteasa y análisis de mutaciones. Como alternativa, se puede determinar un sitio de unión a adnectina mediante un ensayo de competición usando una adnectina de referencia o un anticuerpo que se une al mismo polipéptido, por ejemplo, PD-L1 (como se describe además posteriormente en la sección "Adnectinas de competencia cruzada y/o adnectinas que se unen al mismo sitio de unión a adnectina". Si la adnectina experimental y la molécula de referencia (por ejemplo, otra adnectina o anticuerpo) compiten, entonces, se une al mismo sitio de unión a adnectina o a sitios de unión a adnectina suficientemente próximos de forma que dicha unión de una molécula interfiere con la otra.
Las expresiones "se une específicamente", "unión específica", "unión selectiva" y "se une selectivamente", se utilizan indistintamente en el contexto de las adnectinas que se unen a PD-L1 que se refiere a una adnectina que presenta afinidad por PD-L1, pero no se une significativamente (por ejemplo, menos de aproximadamente un 10 % de unión) a polipéptidos diferentes como se mide por una técnica disponible en la materia tales como, aunque no de forma limitativa, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva(por ejemplo, ELISA de competición, ensayos BIACORE). El término también es aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de unión de una adnectina descrito en el presente documento es específico de PD-L1.
El término "se une preferentemente" como se usa en el presente documento, en el contexto de las adnectinas que se unen a PD-L1, se refiere a una situación en la que una adnectina descrita en el presente documento se une a PD-L1 al menos aproximadamente un 20 % más de lo que se une a un polipéptido diferente como se mide por una técnica disponible en la materia tales como, aunque no de forma limitativa, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva(por ejemplo, ELISA de competición, ensayos BIACORE).
Como se usa en el presente documento en el contexto de las adnectinas, el término "reactividad cruzada" se refiere a una adnectina que se une a más de una proteína diferente que tiene sitios de unión a adnectina idénticos o muy similares.
El término "Kd", como se usa en el presente documento en el contexto de las adnectinas que se unen a PD-L1, pretende referirse a la constante de del equilibrio de disociación de una interacción adnectina-proteína en particular (por ejemplo, PD-L1) o a la afinidad de una adnectina por una proteína (por ejemplo, PD-L1), como se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial o un ensayo de unión a células. Una "Kd deseada" como se usa en el presente documento, se refiere a una Kd de una adnectina que es suficiente para los fines contemplados. Por ejemplo, una Kd deseada se puede referir a la Kd de una adnectina necesaria para disparar un efecto funcional en un ensayo in vitro, por ejemplo, un ensayo de luciferasa en células.
El término "ka", como se usa en el presente documento en el contexto de las adnectinas que se unen a una proteína, pretende referirse a la constante de la tasa de asociación para la asociación de una adnectina al complejo adnectina/proteína.
El término "kd", como se usa en el presente documento en el contexto de las adnectinas que se unen a una proteína, pretende referirse a la constante de la tasa de disociación para la disociación de una adnectina del complejo adnectina/proteína.
El término "CI50", como se usa en el presente documento en el contexto de las adnectinas, se refiere a la concentración de una adnectina que inhibe una respuesta, en un ensayo tanto in vitro como in vivo, a un nivel que es el 50 % de la respuesta inhibidora máxima, es decir, a medio camino entre la respuesta inhibidora máxima y la respuesta sin tratamiento.
El término "PK" es un acrónimo de "farmacocinética" y abarca las propiedades de un compuesto que incluyen, a modo de ejemplo, absorción, distribución, metabolismo y eliminación por el sujeto. Un "proteína de modulación PK" o "resto PK", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier proteína, péptido o resto que afecte las propiedades farmacocinéticas de una molécula biológicamente activa cuando se fusiona o se administra junto con la molécula biológicamente activa. Los ejemplos de una proteína de modulación PK o resto PK incluyen PEG, ligandos de albúmina sérica humana (HSA) (como se divulga en las publicaciones de Estados Unidos números 2005/0287153 y 2007/0003549, las publicaciones PCT números WO 2009/083804 y WO 2009/133208), albúmina sérica humana y variantes de los mismos, transferrina y variantes de las mismas, Fc o fragmento Fc y variantes de los mismos, y azúcares (por ejemplo, ácido siálico).
La "semivida en suero" de una proteína o compuesto es el tiempo que tarda la concentración sérica del polipéptido en reducirse en un 50 %, in vivo, por ejemplo, debido a la degradación de la secuencia o compuesto y/o al aclaramiento o secuestro de la secuencia o compuesto por mecanismos naturales. La semivida se puede determinar de una manera de por sí conocida, tal como mediante análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas serán evidentes para el experto en la técnica y, por ejemplo, puede implicar generalmente las etapas de administrar adecuadamente a un sujeto una dosis adecuada de la secuencia de aminoácidos o el compuesto descritos en el presente documento; recoger muestras de sangre u otras muestras del sujeto en intervalos regulares; determinar el nivel o concentración de la secuencia de aminoácidos o compuesto descritos en el presente documento en dicha muestra de sangre; y calcular, a partir de (una representación de) los datos así obtenidos, el tiempo hasta que el nivel o concentración de la secuencia de aminoácidos o compuesto descritos en el presente documento se haya reducido en un 50 % en comparación con el nivel inicial tras la dosificación. Se hace referencia, por ejemplo, a los libros de texto habituales, tales como Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2a edición revisada, Marcel Dekker (1982).
La semivida se puede expresar utilizando parámetros tales como ti/2-alfa, ti/2-beta, HL_Lambda_z, y el área bajo la curva (ABC). En la presente memoria descriptiva, un "aumento de la semivida" se refiere a un aumento en una cualquiera de estos parámetros, dos cualesquiera de estos parámetros, tres cualesquiera de estos parámetros o los cuatro parámetros. Un "aumento de la semivida" en particular se refiere a un aumento en la ti/2-beta, y/o HL_Lambda_z, ya sea con o sin un aumento en la ti/2-alfa y/o el ABC o ambos.
El término "detectable" se refiere a la capacidad de detectar una señal respecto de la señal de fondo. La expresión "señal detectable" es una señal derivada de técnicas de obtención de imágenes no invasivas tales como, aunque no de forma limitativa, tomografía de emisión de positrones (PET). La señal detectable es detectable y se puede distinguir de otras señales de fondo que se puedan generar partiendo del sujeto. En otras palabras, hay una diferencia estadísticamente significativa y mensurable (por ejemplo, una diferencia estadísticamente significativa es suficiente en una diferencia para distinguir entre una señal detectable y el fondo, tal como aproximadamente un 0,1 %, 1 %, 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % o 40 % o más diferencia entre la señal detectable y el fondo) entre la señal detectable y el fondo. Se pueden usar patrones y/o curvas de calibración para determinar la intensidad relativa de la señal detectable y/o el fondo.
Una "cantidad eficaz para detección" de una composición que comprende un agente de obtención de imágenes descrito en el presente documento se define como una cantidad suficiente para producir una imagen aceptable usando equipo que está disponibles para uso clínico. Una cantidad eficaz para detección de un agente de obtención de imágenes proporcionado en el presente documento se puede administrar en más de una inyección. La cantidad eficaz para detección puede variar de acuerdo con factores tales como el grado de susceptibilidad del individuo, la edad, el sexo y el peso del individuo, las respuestas idiosincráticas del individuo, y similares. Las cantidades eficaces para la detección de las composiciones de obtención de imágenes también pueden variar de acuerdo con el instrumento y las metodologías utilizadas. La optimización de dichos factores está dentro de las aptitudes de los expertos en la materia. En ciertas realizaciones, un agente para obtención de imágenes de PD-L1, por ejemplo, los descritos en el presente documento, proporciona un factor de diferenciación (es decir, señal específica a señal de fondo) de 2 o más, por ejemplo, 3, 4, 5 o más.
El término "química biortogonal" se refiere a cualquier reacción química que se produce dentro de sistemas vivos sin interferir con procesos bioquímicos naturales. El término incluye reacciones químicas que son reacciones químicas que se producen in vitro a pH fisiológico en, o en presencia de agua. Para considerarse biortogonal, las reacciones son selectivas y evitan reacciones secundarias con otros grupos funcionales que aparecen en los compuestos de partida. Además, el enlace covalente resultante entre los ligandos de la reacción deberá ser fuerte y químicamente inerte para las reacciones biológicas, y no debería afectar a la actividad biológica de la molécula deseada.
El término "química de clic" se refiere a un conjunto de reacciones biortogonales fiables y selectivas para la síntesis rápida de nuevos compuestos y bibliotecas combinatorias. Las propiedades de las reacciones de clic incluyen la modularidad, la amplitud de su alcance, elevado rendimiento, estereoespecificidad y aislamiento de productos sencilla (separación de subproductos inertes por métodos no cromatográficos) para producir compuestos que son estables en condiciones fisiológicas. En radioquímica y radiofarmacia, la química de clic es un término genérico para un conjunto de reacciones de marcado que utilizan bloques de construcción selectivos y modulares, y permite ligaduras quimioselectivas a compuestos radiomarcados biológicamente pertinentes en ausencia de catalizadores. Una "reacción de clic" puede ser con cobre, o puede ser una reacción de clic exenta de cobre.
La expresión "grupo prostético" o "agente de marcado bifuncional" se refiere a una molécula orgánica pequeña que contiene un radionucleido (por ejemplo, 18F) que puede unirse a péptidos o proteínas.
El término "ligando quelante" como se utiliza en el presente documento con respecto a química radiofarmacéutica se refiere a un quelante bifuncional o un resto de conjugación (BFC), que se usan indistintamente en el presente documento, que une covalentemente a un grupo prostético radiomarcado a una molécula de direccionamiento biológicamente activa (por ejemplo, péptido o proteína). Los BFC utilizan grupos funcionales tales como ácidos carboxílicos o ésteres activados para acoplamientos de amida, isotiocianatos para acoplamientos de urea y maleimidas para acoplamientos de tiol.
Los términos "individuo", "sujeto" y "paciente", que se usan de manera indistinta en el presente documento, se refieren a un animal, preferiblemente un mamífero (incluyendo un no primate y un primate), por ejemplo, un ser humano. En ciertas realizaciones, un sujeto tiene una enfermedad o trastorno o dolencia que se beneficiaría de una disminución en el nivel o una disminución en la actividad de PD-L1. En ciertas realizaciones, pero está en riesgo de desarrollar un trastorno, enfermedad o dolencia que se beneficiaría de una disminución en el nivel de PD-L1 o una disminución en la actividad de PD-L1.
Un "cáncer" se refiere a un amplio grupo de diversas enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de células anómalas en el cuerpo. La división y el crecimiento celular no regulados dan como resultado la formación de tumores malignos que invaden los tejidos vecinos y también pueden hacer metástasis a partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o del torrente sanguíneo.
Una "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de una célula del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK), macrófagos, eosinófilos, mastocitos, células dendríticas o neutrófilos) y macromoléculas solubles producidas por cualquiera de estas células o el hígado (que incluyen anticuerpos, citocinas y complemento) que da como resultado el direccionamiento selectivo, unión a, daño de, destrucción de, y/o eliminación del cuerpo de un vertebrado de los patógenos invasores, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas u otras anómalas, o, en los casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.
Un "inmunorregulador" se refiere a una sustancia, un agente, una ruta de señalización o un componente de la misma que regula una respuesta inmunitaria. "Regular", "modificar" o "modular" una respuesta inmunitaria se refiere a cualquier alteración en una célula del sistema inmunitario o en la actividad de dicha célula. Dicha regulación incluye estimulación o supresión del sistema inmunitario que se puede manifestar por un incremento o disminución en el número de diversos tipos celulares, un incremento o disminución en la actividad de estas células, o cualquier otro cambio que puede ocurrir dentro del sistema inmunitario. Se han identificado inmunomoduladores tanto inhibidores como estimuladores, algunos de los cuales pueden aumentar la función en un microambiente de cáncer.
El término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto afectado por, o está en riesgo de contraer o padecer una recurrencia de, una enfermedad mediante un método que comprende inducir, potenciar, suprimir o modificar de otro modo una respuesta inmunitaria.
El "tratamiento" o "terapia" de un sujeto se refiere a cualquier tipo de intervención o proceso realizado en, o la administración de un agente activo para, el sujeto con el objetivo de invertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o prevenir la aparición, progresión, desarrollo, gravedad o recurrencia de un síntoma, complicación, dolencia o indicios bioquímicos asociados a una enfermedad.
"Administración" o "administrar", como se utiliza en el presente documento en el contexto de las adnectinas anti-PD-L1, se refiere a introducir una adnectina de PD-L1 o una sonda basada en adnectina de PD-L1 o una sonda de marcado (también denominada como el "agente de obtención de imágenes") descrito en el presente documento a un sujeto. Es adecuada cualquier vía de administración, tal como intravenosa, oral, tópica, subcutánea, peritoneal, intraarterial, inhalación, vaginal, rectal, nasal, introducción en el líquido cefalorraquídeo, o instilación en los compartimentos del organismo.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a al menos la dosis mínima, pero menos que una dosis tóxica, de un agente que es necesario para transmitir un beneficio terapéutico a un sujeto.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" se refiere a al menos una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado deseado.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad suficiente" se refiere a una cantidad suficiente para conseguir el resultado deseado.
Como se usa en el presente documento, "tomografía de emisión de positrones" o "PET" se refiere a una técnica de medicina nuclear no invasiva que produce una imagen tridimensional de la ubicación de un trazador en el cuerpo. El método detecta pares de rayos gamma emitidos indirectamente por un radionucleido emisor de positrones (trazador), que se introduce en el organismo en una molécula biológicamente activa. Las herramientas de obtención de imágenes PET tienen una gran diversidad de usos y ayudan a desarrollar fármacos tanto preclínica como clínicamente. Las aplicaciones ilustrativas incluyen la visualización directa in vivo de la saturación de dianas; supervisión de la captación en tejidos normales para anticipar toxicidad o una variación entre pacientes; cuantificar tejido enfermo; metástasis tumoral; y supervisar la eficacia de un fármaco a lo largo del tiempo, o la resistencia a lo largo del tiempo, y más.
Visión general
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos que se unen a PD-L1 humano y se pueden acoplar a una o más moléculas heterólogas, tales como una radiomarca. Dichos polipéptidos son útiles, por ejemplo, para detectar PD-L1 en una muestra o tejido (por ejemplo, un tejido, tal como un tejido de cáncer que expresa selectivamente PD-L1) en ensayos de diagnóstico.
La invención se basa en el desarrollo de un agente de obtención de imágenes clínicas no invasivo que permite la visualización en todo el organismo de la expresión de PD-L1 en un paciente. En ciertas realizaciones, se realizan "biopsias virtuales"de todo el cuerpo de un paciente en un solo día para monitorizar y localizar los niveles de expresión de PD-L1. Los agentes de obtención de imágenes de PD-L1 descritos en el presente documento se pueden usar para proporcionar una biopsia virtual de todo el organismo de elevado contraste en un solo día.
I. Estructuras principales de tipo fibronectina
Fn3 se refiere a un dominio de tipo III derivado de fibronectina. Un dominio Fn3 es pequeño, monomérico, soluble y estable. Carece de enlaces disulfuro y, por lo tanto, es estable en condiciones reductoras. La estructura global de Fn3 se parece al pliegue de la inmunoglobulina. Los dominios FN3 comprenden, en orden desde el extremo N al extremo C, una cadena beta o de tipo beta, A; un bucle, AB; una cadena beta o de tipo beta, B; un bucle, BC; una cadena beta o de tipo beta, C; un bucle, CD; una cadena beta o de tipo beta, D; un bucle, DE; una cadena beta o de tipo beta, E; un bucle, EF; una cadena beta o de tipo beta, F; un bucle, FG; y una cadena beta o de tipo beta, G. Las siete cadenas p antiparalelas se disponen como dos láminas beta que forman un núcleo estable, a la vez que crean dos "caras" compuestas de los bucles que conectan las cadenas beta o de tipo beta. Los bucles AB, CD y EF se localizan en una cara ("el polo sur") y los bucles BC, DE y FG se localizan en la cara opuesta ("el polo norte"). Existen al menos 15 módulos de Fn3 diferentes en la fibronectina humana, y aunque la homología de secuencia entre los módulos es baja, todas comparten una elevada similitud en la estructura terciaria.
En el presente documento se describen adnectinas anti-PD-LI que comprenden un dominio Fn3, en el que uno o más de los bucles accesibles a disolventes se han aleatorizado o mutado. El dominio Fn3 puede ser un dominio Fn3 derivado del décimo módulo natural del dominio de tipo III de fibronectina humana (10Fn3):
VSDVPRDLEVV AATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 1) (94 aminoácidos; los bucles AB, CD y EF están subrayados; el núcleo del dominio 10Fn3 comienza en el aminoácido 9 ("E") y finaliza en el aminoácido 94 ("T") y corresponde a un polipéptido de 86 aminoácidos). El núcleo del dominio 10Fn3 natural se define en el SEQ ID NO: 2.
En ciertas realizaciones, las secuencias no de unión al ligando de 10Fn3, es decir, la "estructura principal" de 10Fn3", se puede alterar siempre que el 10Fn3 retenga la función de unión al ligando y/o la estabilidad estructural. Se ha notificado varias estructuras principales de 10Fn3 mutante. En un aspecto, uno o más de Asp 7, Glu 9 y Asp 23 se han sustituido por otro aminoácido, tales como, por ejemplo, un resto de aminoácidos cargado no negativamente (por ejemplo, Asn, Lys, etc.). Se ha divulgado varias alteraciones adicionales en la estructura principal de 10Fn3 que son tanto beneficiosas como neutras. Véanse, por ejemplo, Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (diciembre de 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (28 de agosto de 2001).
Las proteínas 10Fn3 tanto naturales como variantes se caracterizan por la misma estructura, concretamente, siete secuencias de dominio de cadena beta designadas desde A a G y seis regiones de bucle (bucle AB, bucle BC, bucle CD, bucle DE, bucle EF y bucle FG) que conecta las siete secuencias de dominio de cadena beta. Las cadenas beta situadas más cerca de los extremos N y C pueden adoptar una conformación de tipo beta en solución. En el SEQ ID NO: 1, el bucle AB corresponde a los restos 14-17, el bucle BC corresponde a los restos 23-31, el bucle CD corresponde a los restos 37-47, el bucle DE corresponde a los restos 51-56, el bucle EF corresponde a los restos 63­ 67 y el bucle FG corresponde a los restos 76-87.
Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la adnectina dirigida contra PD-L1 descrita en el presente documento es un polipéptido 10Fn3 que es al menos en un 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % idéntica al dominio 10Fn3 humano, mostrado en el SEQ ID NO:1, o su secuencia núcleo, como se muestra en el SEQ ID NO 2. Mucha de la variabilidad se producirá generalmente en uno o más de los bucles o una o más de las cadenas beta o de las regiones del extremo N o del extremo C. Cada una de las cadenas beta o de tipo beta de un polipéptido 10Fn3 puede consistir esencialmente de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad de secuencia con una cadena beta o de tipo beta correspondiente del SEQ ID NO: 1 o 2, siempre que dicha variación no altere la estabilidad del polipéptido en condiciones fisiológicas.
La divulgación proporciona una adnectina dirigida contra PD-L1 humano que comprende un décimo dominio de tipo III (10Fn3) de fibronectina, en donde el dominio 10Fn3 comprende un bucle, AB; un bucle, BC; un bucle, CD; un bucle, DE; un bucle EF; y un bucle FG; y tiene al menos un bucle seleccionado entre el bucle BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la secuencia del correspondiente bucle del dominio 10Fn3 humano. Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento pueden comprender un dominio 10Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las regiones no de bucle del SEQ ID NO: 1 o 2, en donde al menos un bucle seleccionado de BC, DE y FG está alterado. Los bucles BC y FG pueden estar alterados, los bucles BC y DE pueden estar alterados, los bucles DE y FG pueden estar alterados, y los bucles BC, DE y FG pueden estar alterados, es decir, los dominios 10Fn3 pueden comprender bucles de origen no natural. Los bucles AB, Cd y/o EF pueden estar alterados. Por "alterado" se entiende una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de molde (el correspondiente dominio de fibronectina humana) e incluye adiciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. La alteración de una secuencia de aminoácidos se puede llevar a cabo a través de una variación de secuencia intencionada, enmascarada o espontánea, generalmente de una secuencia de codificación de ácido nucleico y se puede llevar a cabo por cualquier técnica, por ejemplo, PCR, PCR propensa a errores, o síntesis química de ADN.
Uno o más bucles seleccionados de BC, DE y FG se puede extender o acortar en longitud respecto al correspondiente bucle de fibronectina humana. La longitud del bucle se puede extender en 2-25 aminoácidos. La longitud del bucle se puede disminuir en 1-11 aminoácidos. Para optimizar la unión al antígeno, por lo tanto, la longitud del bucle FG de 10Fn3 se puede alterar en longitud, así como en la secuencia para obtener la mayor flexibilidad y afinidad posibles en la unión al antígeno.
El polipéptido descrito en el presente documento puede comprender un dominio Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos de las regiones no de bucle que es al menos un 80, 85, 90, 95, 98, 99, o 100 % idéntico a las regiones no de bucle del SEQ ID NO: 1 o 2, en donde al menos un bucle seleccionado de BC, DE y FG está alterado. El bucle BC alterado puede tener hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3 o 4 deleciones de aminoácidos, hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 inserciones de aminoácidos, o una combinación de las mismas.
Uno o más restos del motivo de unión a integrina "arginina-glicina-ácido aspártico" (RGD) (aminoácidos 78-80 del SEQ ID NO: 1) pueden estar sustituidos para alterar la unión a la integrina. El bucle FG de los polipéptidos proporcionados en el presente documento puede no contener un sitio de unión a integrina RGD. La secuencia de RGD se puede sustituir por una secuencia de aminoácido polar-aminoácido neutro-aminoácido ácido (en la dirección de extremo N a extremo C). La secuencia de RGD se puede sustituir por SGE. En una realización, la secuencia de RGD se sustituye por RGE.
En ciertas realizaciones, la estructura principal de tipo fibronectina de la proteína comprende un dominio 10Fn3 que se define generalmente por la siguiente secuencia:
EW A A (Z)aLUSW (Z)xYRITY (Z)bFTV (Z)yAT ISGL(Z)cYT ITVYA (Z)zISINYRT (SEQ ID NO: 3)
en donde el bucle AB se representa mediante (Z)a, el bucle CD se representa mediante (Z)b, el bucle EF se representa mediante (Z)c, el bucle BC se representa mediante (Z)x, el bucle DE se representa mediante (Z)y, y el bucle FG se representa mediante (Z)z. Z representa cualquier aminoácido, y el subíndice tras la Z representa un número entero del número de aminoácidos. En particular, a puede ser cualquiera de 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1­ 3, 2-3, o 1-2 aminoácidos; y b, c, x, y, y z pueden ser cada uno independientemente de 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5­ 15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, o 6-7 aminoácidos. Las secuencias de las cadenas beta pueden tener cualquiera de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones, deleciones o adiciones en las 7 regiones de la cadena principal con respecto a los correspondientes aminoácidos mostrados en el SEQ ID NO: 1 o 2. En ciertas realizaciones, las secuencias de las cadenas beta pueden tener cualquiera de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones conservativas en las 7 regiones de la cadena principal con respecto a los correspondientes aminoácidos mostrados en el SEQ ID NO: 1 o 2. En ciertas realizaciones, los restos de aminoácidos del núcleo están fijos, y cualesquiera sustituciones, sustituciones conservativas, deleciones o adiciones tienen lugar en otros restos que no sean los restos de aminoácidos del núcleo.
En ciertas realizaciones, las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento se basan en una estructura principal de 10Fn3 y están definidas de una forma general por la secuencia:
EWAATPTSLLISW(Z)xYRITYGETGGNSPVQEFTV(Z)yATISGLKPGVDYTITVYA(Z)z ISINYRT (SEQ ID NO: 4).
en donde el bucle BC se representa mediante (Z)x, el bucle DE se representa mediante (Z)y, y el bucle FG se representa mediante (Z)z. Z representa cualquier aminoácido, y el subíndice tras la Z representa un número entero del número de aminoácidos. En particular, x, y, y z pueden ser cada uno independientemente de 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5­ 10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, o 6-7 aminoácidos. En realizaciones preferidas, x es 11 aminoácidos, y es 6 aminoácidos y z es 12 aminoácidos. Las secuencias de las cadenas beta pueden tener cualquiera de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones, deleciones o adiciones en las 7 regiones de la cadena principal con respecto a los correspondientes aminoácidos mostrados en el SEQ ID NO: 1 o 2. En ciertas realizaciones, las secuencias de las cadenas beta pueden tener cualquiera de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones conservativas en las 7 regiones de la cadena principal con respecto a los correspondientes aminoácidos mostrados en el SEQ ID NO: 1 o 2. En ciertas realizaciones, los restos de aminoácidos del núcleo, por ejemplo, fuera de uno o más bucles, son fijos y cualesquiera de las sustituciones, sustituciones conservativas, deleciones o adiciones tienen lugar en otros restos que no sean los restos de aminoácidos del núcleo.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 puede comprender la secuencia que se define en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde al menos uno de los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, están alterados. Como se ha descrito anteriormente, los restos de aminoácidos correspondientes a los restos 23-31, 51-56 y 76-87 del SEQ ID NO: 1 definen los bucles BC, DE y FG, respectivamente. Sin embargo, se debería entender que no todos los restos de una región bucle deben modificarse para lograr un ligando de 10Fn3 que tenga fuerte afinidad por una diana deseada ejemplo, PD-L1).
La adnectina contra PD-L1 puede comprender la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, tienen secuencias de aminoácidos al menos en un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de los bucles BC, DE o FG definidas en los SEQ ID NO: 21,22 y 23, respectivamente.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 comprende la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, comprenden bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 21,22 y 23, respectivamente.
Una adnectina contra PD-L1 puede comprender la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, tienen secuencias de aminoácidos al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de los bucles BC, DE o FG definidas en los SEQ ID NO: 36, 37 y 38, respectivamente.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 comprende la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, comprenden bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 36, 37 y 38, respectivamente.
Una adnectina contra PD-L1 puede comprender la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, tienen secuencias de aminoácidos al menos en un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de los bucles BC, DE o FG definidas en los SEQ ID NO: 51, 52 y 53, respectivamente.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 comprende la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, comprenden bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 51, 52 y 53, respectivamente.
Una adnectina contra PD-L1 puede comprender la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, tienen secuencias de aminoácidos al menos en un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de los bucles BC, DE o FG definidas en los SEQ ID NO: 66, 67 y 68, respectivamente.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 comprende la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, comprenden bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 66, 67 y 68, respectivamente.
Una adnectina contra PD-L1 puede comprender la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, tienen secuencias de aminoácidos al menos en un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de los bucles BC, DE o FG definidas en los SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 comprende la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, comprenden bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 6, 7 y 8, respectivamente.
Una adnectina contra PD-L1 puede comprender la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, tienen secuencias de aminoácidos al menos en un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de los bucles BC, DE o FG definidas en los SEQ ID NO: 81, 82 y 83, respectivamente.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 comprende la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, comprenden bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 81, 82 y 83, respectivamente.
Una adnectina contra PD-L1 puede comprender la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, tienen secuencias de aminoácidos al menos en un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de los bucles BC, DE o FG definidas en los SEQ ID NO: 97, 98 y 99, respectivamente. En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 comprende la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, comprenden bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de aminoácidos de los SEq ID NOS: 97, 98 y 99, respectivamente.
Una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento puede comprender la secuencia definida en el SEQ ID NO: 3 o 4, en donde los bucles BC, DE y Fg representados mediante (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, comprenden bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 113, 114 y 115, respectivamente; SEQ ID NO: 124, 125 y 126, respectivamente; SEQ ID NO: 135, 136 y 137, respectivamente; SEQ ID NO: 146, 147 y 148, respectivamente; SEQ ID NO: 157, 158 y 159, respectivamente; SEQ ID NO: 168, 169 y 170, respectivamente; SEQ ID NO: 179, 180 y 181, respectivamente; SEQ ID NO: 190, 191 y 192, respectivamente; SEQ ID NO: 201,202 y 203, respectivamente; SEQ ID NO: 212, 213 y 214, respectivamente; SEQ ID NO: 223, 224 y 225, respectivamente; SEQ ID NO: 234, 235 y 236, respectivamente; SEQ ID NO: 245, 246 y 247, respectivamente; SEQ ID NO: 256, 257 y 258, respectivamente; SEQ ID NO: 267, 268 y 269, respectivamente; SEQ ID NO: 278, 279 y 280, respectivamente; SEQ ID NO: 289, 290 y 291, respectivamente; SEQ ID NO: 300, 301 y 302, respectivamente; SEQ ID NO: 311, 312 y 313, respectivamente; SEQ ID NO: 322, 323 y 324, respectivamente; SEQ ID NO: 333, 334 y 335, respectivamente; SEQ ID NO: 344, 345 y 346, respectivamente; SEQ ID No: 355, 356 y 357, respectivamente; SEQ ID NO: 366, 367 y 368, respectivamente; SEQ ID NO: 377, 378 y 379, respectivamente; SEQ ID NO: 388, 389 y 390 respectivamente; SEQ ID NO: 399, 400 y 401, respectivamente; SEQ ID NO: 410, 411 y 412, respectivamente; SEQ ID NO: 421,422 y 423, respectivamente; SEQ ID NO: 432, 433 y 434, respectivamente; SEQ ID NO: 443, 444 y 445, respectivamente; SEQ ID NO: 454, 455 y 456, respectivamente; SEQ ID NO: 465, 466 y 467, respectivamente; SEQ ID NO: 476, 477 y 478, respectivamente; SEQ ID NO: 487, 488 y 489, respectivamente; SEQ ID NO: 498, 499 y 500, respectivamente; SEQ ID NO: 509, 510 y 511, respectivamente; SEQ ID NO: 520, 521 y 522, respectivamente; SEQ ID NO: 531, 530 y 531, respectivamente; SEQ ID NO: 542, 543 y 544, respectivamente; SEQ ID NO: 553, 554 y 555, respectivamente; o los SEQ ID NO: 564, 565 y 566, respectivamente. Las regiones de la estructura principal de dichas adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano pueden comprender cualesquiera de 0 a 20, de 0 a 15, de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones, sustituciones conservativas, deleciones o adiciones con respecto a los restos de aminoácidos de la estructura principal del SEQ ID NO: 4. Dichas modificaciones de la estructura principal se pueden realizar, siempre que la adnectina contra PD-L1 puede unirse a PD-L1 con una Kd deseada.
El bucle BC de la adnectina contra PD-L1 de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: 6, 21, 36, 51,66, 81 y 97.
El bucle DE de la adnectina contra PD-L1 de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: 7, 22, 37, 52, 67, 82 y 98.
El bucle FG de la adnectina contra PD-L1 de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: 8, 23, 38, 53, 68, 83 y 99.
La adnectina contra PD-L1 de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos de los bucles BC, DE y FG idéntica a una cualquiera de los SEQ ID NO: 6, 21,36, 51, 66, 81 y 97; 7, 22, 37, 52, 67, 82 y 98; y 8, 23, 38, 53, 68, 83 y 99, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprende una secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 5, 20, 35, 50, 65, 80 y 96. También se describen en el presente documento adnectinas dirigidas contra PD-L1 que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 70 %, 75 %, 80 %, 85%, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una cualquiera de los SEQ ID NO: 112, 123, 134, 145, 156, 167, 178, 189, 200, 211,222, 233, 244, 255, 266, 277, 288, 299, 310, 321, 332, 343, 354, 365, 376, 387, 398, 409, 420, 431,442, 453, 464, 475, 486, 497, 508, 519, 530, 541, 552 y 563.
En ciertas realizaciones, las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las regiones no de bucle BC, DE y FG de los SEQ ID NO: 5, 20, 35, 50, 65, 80 o 96.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprende una secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 9­ 15, 24-30, 39-45, 54-60, 69-75, 84-91 y 100-107. También se describen en el presente documento adnectinas dirigidas contra PD-L1 que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una cualquiera de los SEQ ID NO: 116-122, 127-133, 138-144, 150-155, 160­ 166, 171-177, 182-188, 193-199, 204-210, 215-221, 227-232, 237-243, 248-254, 259-265, 271-276, 291-287, 292­ 298, 303-309, 314-320, 325-331, 337-342, 347-353, 358-364, 369-375, 380-386, 391-397, 402-408, 413-419, 424­ 430, 435-441, 446-452, 457-463, 468-474, 479-485, 490-496, 501-507, 512-518, 523-529, 534-540, 545-551 y 556­ 562. En ciertas realizaciones, las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 80 %, 85%, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las regiones no de bucle BC, DE y FG de una cualquiera de los SEQ ID NO: 9-15, 24-30, 39-45, 54-60, 6975, 84-91 y 100-107.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprenden bucles BC, DE y FG que se definen en los SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprenden bucles BC, DE y FG que se definen en los SEQ ID NO: 21,22 y 23, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprenden bucles BC, DE y FG que se definen en los SEQ ID NO: 36, 37 y 38, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprenden bucles BC, DE y FG que se definen en los SEQ ID NO: 51,52 y 53, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprenden bucles BC, DE y FG que se definen en los SEQ ID NO: 66, 67 y 68, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprenden bucles BC, DE y FG que se definen en los SEQ ID NO: 81,82 y 83, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprenden bucles BC, DE y FG que se definen en los SEQ ID NO: 97, 98 y 99, respectivamente.
En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de los bucles BC, DE y/o FG descritas en el presente documento (por ejemplo, los SEQ ID NO: 6, 21, 36, 51,66, 81 y 97; 7, 22, 37, 52, 67, 82 y 98; y 8, 23, 38, 53, 68, 83 y 99, respectivamente) están injertadas en las estructuras principales de dominios no 10Fn3. Por ejemplo, una o más secuencias de aminoácidos de bucle se intercambia por o se inserta en uno o más bucles de la CDR de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el dominio de la proteína en el que se intercambian o insertan una o más secuencias de aminoácidos de bucle incluye, aunque no de forma limitativa, dominios Fn3 de consenso(Centocor, EE.UU.), proteínas de repetición de anquirina (Molecular Partners AG, Zúrich Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd, Cambridge, MA), nanocuerpos de camélido de dominio único (Ablynx, Bélgica), lipocalinas (por ejemplo, anticalinas; Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), Avimers (Amgen, Ca), aficuerpos (Affibody aG, Suecia), ubiquitina (por ejemplo, afilinas; Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania), miméticos de epítopos de proteínas (Polyphor Ltd, Allschwilo, Suiza), estructuras principales del haz helicoidal (por ejemplo, alfacuerpos, Complix, Bélgica), dominios SH3 de Fyn (Covagen AG, Suiza), o atrímeros (Anaphor, Inc., Ca).
En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de las regiones del extremo N y/o del extremo C de los polipéptidos proporcionados en el presente documento se han modificado mediante deleción, sustitución o inserción con respecto a las secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones del dominio 10Fn3 humano natural (SEQ ID NO 1 o 2). Los dominios 10Fn3 generalmente comienzan con el aminoácido número 1 del SEQ ID NO: 1. Sin embargo, los dominios con deleciones de aminoácidos también están abarcados por la invención. También pueden añadirse secuencias adicionales al extremo N o C de un dominio 10Fn3 que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO 1 o 2. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la extensión del extremo N consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: M, MG y G. En ciertas realizaciones, una secuencia MG se puede situar en el extremo N del 10Fn3 definido por el SEQ ID NO: 1. La M habitualmente se escindirá, dejando una G en el extremo N. Además, una M, G o MG también se puede situar en el extremo N con respecto a cualesquiera de las extensiones del extremo N mostradas en la Tabla 3.
En realizaciones ilustrativas, una región del extremo N alternativa que tiene 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, o 1 aminoácido de longitud se puede añadir a la región del extremo N del SEQ ID NO: 1 o 2 o de cualquier adnectina definida en la Tabla 3. Las regiones del extremo N alternativas ilustrativas incluyen (representadas por el código de aminoácidos de una sola letra) M, MG, G, MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 574) y g Vs d Vp RDL (SEQ ID NO: 575). Otras regiones del extremo N adecuadas alternativas, que se pueden enlazar, por ejemplo, al extremo N de una secuencia del núcleo de adnectina, incluyen, por ejemplo, XnSDVPRDL (SEQ ID NO: 576), XnDVPRDL (SEQ ID NO: 577), XnVPRDL (SEQ ID NO: 578), XnPRDL (SEQ ID NO: 579) XnRDL (SEQ ID NO: 580), XnDL (SEQ ID NO: 581), o XnL, en donde n = 0, 1 o 2 aminoácidos, en donde cuando n = 1, X es Met o Gly, y cuando n = 2, X es Met-Gly. Cuando se añade una secuencia Met-Gly al extremo N de un dominio 10Fn3, la M habitualmente se escindirá, dejando una G en el extremo N. En algunas realizaciones, la región del extremo N alternativa comprende la secuencia de aminoácidos MASTSG (SEQ ID NO: 582).
En realizaciones ilustrativas, una región alternativa del extremo C que tiene 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, o 1 aminoácidos de longitud se puede añadir a la región del extremo C del SEQ ID NO: 1 o 2 o de cualquier adnectina definida en la Tabla 3. Los ejemplos específicos de secuencias alternativas de la región del extremo C incluyen, por ejemplo, polipéptidos que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en, EIEK (SEQ ID NO: 584), EGSGC (SEQ ID NO: 585), EIEKPCQ (SEQ ID NO: 586), EIEKPSQ (SEQ ID NO: 587), EIEKP (SEQ ID NO: 588), EIEKPS (SEQ ID NO: 589), o EIEKPC (SEQ ID NO: 590). En algunas realizaciones, la región del extremo C alternativa comprende EIDK (SEQ ID NO: 591) y, en realizaciones particulares, la región del extremo C alternativa es una cualquiera de EIDKPCQ (SEQ ID NO 592) o EIDKPSQ (SEQ ID NO593). Regiones del extremo C alternativas adicionales adecuadas se definen en los SEQ ID NO: 594-618.
En ciertas realizaciones, una adnectina está unida a una extensión del extremo C que comprende restos E y D, y puede tener entre 8 y 50, 10 y 30, 10 y 20, 5 y 10, y 2 y 4 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, las secuencias de la cola incluyen enlazadores de tipo e D en los que la secuencia comprende repeticiones en tándem de ED. En realizaciones ilustrativas, la secuencia de la cola comprende 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 o 5 repeticiones de ED. En ciertas realizaciones, las secuencias de la cola de tipo ED también pueden incluir restos de aminoácidos adicionales, tales como, por ejemplo: EI, EID, ES, EC, EGS y EGC. Dichas secuencias están basadas, en parte, en secuencias conocidas de la cola de adnectina, tales como EIDKPSQ (SEQ ID NO: 593), de las que se han eliminado los restos D y K. En realizaciones ilustrativas, la cola de tipo ED comprende restos E, I o E1 antes de las repeticiones de ED.
En ciertas realizaciones, las secuencias de extensión de los extremos N o C están unidas a las secuencias de la adnectina contra PD-L1 mediante secuencias líder conocidas (por ejemplo, los SEQ ID NO: 629-678 de la Tabla 3). En algunas realizaciones, las secuencias se pueden situar en el extremo C del dominio 10Fn3 para facilitar la unión de un resto farmacocinético. Por ejemplo, un enlazador que contiene cisteína tal como GSGC (SEQ ID NO: 638) se puede añadir al extremo C para facilitar la PEGilación dirigida al sitio en el resto de cisteína.
En ciertas realizaciones, un resto del extremo C alternativo, que se puede unir a los aminoácidos del extremo C RT (es decir, el aminoácido 94) comprende los aminoácidos PmXn, en donde P es prolina, X es cualquier aminoácido, m es un número entero que es al menos 1, y n es 0 o un número entero que es al menos 1. En ciertas realizaciones, el resto del extremo C alternativo comprende los aminoácidos PC. En ciertas realizaciones, el resto del extremo C alternativo comprende los aminoácidos PI, PC, PID, PIE, PIDK (SEQ ID NO: 605), PIEK (SEQ ID NO: 606), PIDKP (SEQ ID NO: 607), PIEKP (SEQ ID NO: 608), PIDKPS (SEQ ID NO: 609), PIEKPS (SEQ ID NO: 610), PIDKPC (SEQ ID NO: 611), PIEKPC (SEQ ID NO: 612), PIDKPSQ (SEQ ID NO: 613), PIEKPSQ (SEQ ID NO: 614), PIDKPCQ (SEQ ID NO: 615), PIEKPCQ (SEQ ID NO: 616), PHHHHHH (SEQ ID NO: 617) y PCHHHHHH (SEQ ID NO: 618). Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano ilustrativas que tienen PC en su extremo C se proporcionan en los Ejemplos y la Tabla 3.
En ciertas realizaciones, las adnectinas descritas en el presente documento tienen una cola 6X his (SEQ ID NO: 619).
En ciertas realizaciones, las proteínas con una estructura principal de tipo fibronectina comprenden un dominio 10Fn3 que tiene tanto una secuencia de la región del extremo N alternativa como una secuencia de la región del extremo C alternativa y, opcionalmente, una cola 6X his.
II. Propiedades biológicas de las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano
Se proporcionan en el presente documento adnectinas que se unen a PD-L1 humano con una KD de 10 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM o menos, según se determina, por ejemplo, mediante SPR (Biacore) y presentan una o más de las siguientes propiedades:
1. Inhibición de la interacción entre PD-L1 humano y PD-1 humano en al menos un 50%, 70 %, 80 %, 90% o más, según se determina, por ejemplo, mediante citometría de flujo, por ejemplo, usando una proteína PD-1 Fc humana y células positivas para PD-L1 humano, tales como células L2987;
2. Inhibición de la unión entre CD80 humano (B7-1) y PD-l1 humano en al menos un 50%, 70 %, 80 %, 90% o más, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA o según SPR (Biacore);
3. Inhibición de la unión del anticuerpo dirigido contra PD-L1, 12A4 (descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 7.943.743) al PD-L1 humano en al menos un 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA o según SPR (Biacore); y
4. Inhibe la proliferación celular en una reacción de linfocitos mixtos (MLR).
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 se une al PD-L1 humano con una KD de 1 nM o menos y presenta cada una de las propiedades 1-4. En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 se une al PD-L1 humano con una KD de 0,1 nM o menos y presenta cada una de las propiedades 1-4.
Se proporcionan en el presente documento adnectinas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento o una porción de la misma (por ejemplo, los bucles BC, DE y FG), que se une a PD-L1 humano con una KD de 10 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM o menos, según se determina, por ejemplo, mediante SPR (Biacore) y presentan una o más de las siguientes propiedades:
1. Inhibición de la interacción entre PD-L1 humano y PD-L1 humano en al menos un 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, según se determina, por ejemplo, mediante citometría de flujo, por ejemplo, usando una proteína PD-1Fc humana y células positivas para PD-L1 humano, tales como células L2987;
2. Inhibición de la unión entre CD80 humano (B7-1) y PD-L1 humano en al menos un 50%, 70 %, 80 %, 90% o más, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA o según SPR (Biacore);
3. Inhibición de la unión entre el anticuerpo dirigido contra PD-L1, 12A4, y el PD-L1 humano en al menos un 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA o según SPR (Biacore); y
4. Inhibe la proliferación celular en una reacción de linfocitos mixtos (MLR).
Una adnectina contra PD-L1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento o una porción de la misma (por ejemplo, los bucles BC, DE y FG), una adnectina contra PD-L1 se une al PD-L1 humano con una KD de 1 nM o menos y presenta cada una de las propiedades 1-4. Se proporcionan en el presente documento adnectinas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento o una porción de la misma (por ejemplo, los bucles BC, DE y FG), que se une a PD-L1 humano con una KD de 0,1 nM o menos y presenta cada una de las propiedades 1-4.
En ciertas realizaciones, las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano compiten (por ejemplo, compiten de forma cruzada) por la unión a PD-L1 con las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano concretas descritas en el presente documento. Dichas adnectinas competentes se pueden identificar por su capacidad para inhibir competitivamente la unión a PD-L1 de las adnectinas descritas en el presente documento en ensayos de unión a PD-L1 convencionales. Por ejemplo, se pueden usar ensayos ELISA convencionales en los que una proteína de PD-L1 recombinante se inmoviliza sobre la placa, se marca fluorescentemente una de las adnectinas y se evalúa la capacidad de las adnectinas no marcadas para desplazar por competición la adnectina marcada unida.
En ciertas realizaciones, se puede realizar un formato ELISA competitivo para determinar si dos adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano se unen solapando los sitios de unión a adnectina del PD-L1. En un formato, la adnectina n.° 1 se reviste sobre una placa, que después se bloquea y se lava. A esta placa se añade bien PD-L1 solo, o PD-L1 preincubado con una concentración de saturación de la adnectina n.° 2. Después de un período de incubación adecuado, la placa se lava y se sondea con un anticuerpo policlonal dirigido contra PD-L1, tal como un anticuerpo policlonal dirigido contra PD-L1 biotinilado, seguido de detección con un conjugado de estreptavidina-HRP y procedimientos convencionales de revelado con tetrametilbencidina. Si la señal OD es la misma con o sin preincubación la adnectina n.° 2, entonces las dos adnectinas se unen independientemente entre sí, y sus sitios de unión a adnectina no solapan. Si, sin embargo, la señal OD de los pocillos que recibieron mezclas de PD-L1/adnectina n.° 2 es menor que las que recibieron solamente PD-L1, entonces, se confirma que la unión de la adnectina n.° 2 bloquea la unión de la adnectina n.° 1 al PD-L1.
Como alternativa, se realiza un experimento similar mediante resonancia de plasmón superficial (SPR, por ejemplo, BIAcore). La adnectina n.° 1 se inmovilizad sobre la superficie del chip SPR, seguido de inyecciones bien de PD-L1 solo, o PD-L1 preincubado con una concentración de saturación de la adnectina n.° 2. Si la señal de unión de las mezclas de PD-L1/adnectina n.° 2 es igual o superior a la de PD-L1 en solitario, entonces las dos adnectinas se unen independientemente entre sí, y sus sitios de unión a adnectina no solapan. Si, sin embargo, la señal de unión de las mezclas de PD-L1/adnectina n.° 2 es menor que la de PD-L1 en solitario, entonces, se confirma que la unión de la adnectina n.° 2 bloquea la unión de la adnectina n.° 1 al PD-L1. Una característica de estos experimentos es el uso de concentraciones de saturación de la adnectina n.° 2. Si PD-L1 no se satura con la adnectina n.° 2, entonces, las conclusiones anteriores no se mantienen. Se pueden utilizar experimentos similares para determinar si dos proteínas cualesquiera de unión a PD-L1 se unen a sitios de unión a adnectina solapantes.
Ambos ensayos ilustrados anteriormente también se pueden realizar en orden inverso donde la adnectina n.° 2 se inmoviliza y la mezcla PD-L1- adnectina n.° 1 se añade a la placa. Como alternativa, la adnectina n.° 1 o 2 se puede sustituir por un anticuerpo monoclonal y/o una proteína de fusión receptor-Fc soluble.
En ciertas realizaciones, la competición se puede determinar usando un ensayo HTRF en sándwich.
En ciertas realizaciones, la adnectina competente es una adnectina que se une al mismo sitio de unión a adnectina en el PD-L1 análogamente a una adnectina contra PD-L1 concreta descrita en el presente documento. Las técnicas de cartografiado convencionales, tales como cartografiado con proteasas, análisis de mutaciones, HDX-MS, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional, se pueden utilizar para determinar si una adnectina se une al mismo sitio de unión a adnectina o epítopo que una adnectina de referencia (véanse, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)). Un epítopo se define por el método utilizado para localizarlo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una adnectina o anticuerpo de PD-L1 se une al mismo epítopo que el de una de las adnectinas de PD-L1 descritas en el presente documento, según se determina mediante HDX-MS o se determina mediante cristalografía de rayos X.
Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 candidatas como competidoras pueden inhibir la unión de las adnectinas dirigidas contra PD-L1 descritas en el presente documento en al menos un 50%, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % y/o su unión queda inhibida en al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % por las adnectinas dirigidas contra PD-L1. El % de competición se puede determinar utilizando los métodos anteriormente descritos.
Se proporcionan en el presente documento adnectinas que se unen a PD-L1 humano con una KD de 10 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM o menos, según se determina, por ejemplo, mediante SPR (Biacore) y presentan una o más de las siguientes propiedades:
1. Inhibición de la interacción entre PD-L1 humano y PD-1 humano en al menos un 50%, 70 %, 80 %, 90% o más, según se determina, por ejemplo, mediante citometría de flujo, por ejemplo, usando una proteína PD-1 Fc humana y células positivas para PD-L1 humano, tales como células L2987;
2. Inhibición de la unión entre CD80 humano (B7-1) y PD-L1 humano en al menos un 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA o según SPR (Biacore);
3. Inhibición de la unión entre el anticuerpo dirigido contra PD-L1, 12A4, y el PD-L1 humano en al menos un 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA o según SPR (Biacore);
4. Inhibe la proliferación celular en una reacción de linfocitos mixtos (MLR); y
5. Compite con un anticuerpo dirigido contra PD-L1 descrito en el presente documento por la unión a PD-L1 humano.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 se une al PD-L1 humano con una KD de 1 nM o menos y presenta cada una de las propiedades 1-5. En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 se une al PD-L1 humano con una KD de 0,1 nM o menos y presenta cada una de las propiedades 1-5.
Se proporcionan en el presente documento adnectinas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento o una porción de la misma (por ejemplo, los bucles BC, DE y FG), que se une a PD-L1 humano con una KD de 10 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM o menos, según se determina, por ejemplo, mediante SPR (Biacore) y presentan una o más de las siguientes propiedades:
1. Inhibición de la interacción entre PD-L1 humano y PD-1 humano en al menos un 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, según se determina, por ejemplo, mediante citometría de flujo, por ejemplo, usando una proteína PD-1 Fc humana y células positivas para PD-L1 humano, tales como células L2987;
2. Inhibición de la unión entre CD80 humano (B7-1) y PD-L1 humano en al menos un 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA o según SPR (Biacore);
3. Inhibición de la unión entre el anticuerpo dirigido contra PD-L1, 12A4, y el PD-L1 humano en al menos un 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA o según SPR (Biacore);
4. Inhibe la proliferación celular en una reacción de linfocitos mixtos (MLR); y
5. Compite con un anticuerpo dirigido contra PD-L1 descrito en el presente documento por la unión a PD-L1 humano.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento o una porción de la misma (por ejemplo, los bucles BC, DE y FG), que se une a PD-L1 humano con una KD de 1 nM o menos y presenta cada una de las propiedades 1-5. En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento o una porción de la misma (por ejemplo, los bucles BC, DE y FG), que se une a PD-L1 humano con una KD de 0,1 nM o menos y presenta cada una de las propiedades 1-5.
111. Fusiones, incluyendo restos farmacocinéticos
En ciertas realizaciones, las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano tienen deseablemente una semivida corta, por ejemplo, cuando se usan en la obtención de imágenes diagnósticas.
Como alternativa, por ejemplo, para fines terapéuticos, las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento comprenden a resto farmacocinético (PK). se puede evaluar la farmacocinética mejorada de acuerdo con la necesidad terapéutica percibida. A menudo, es deseable aumentar la biodisponibilidad y/o aumentar en tiempo entre las dosis, posiblemente, aumentando el tiempo que una proteína permanece disponible en el suero tras la dosificación. En algunos casos, es deseable mejorar la concentración sérica de la proteína en el tiempo (por ejemplo, disminuye la diferencia en la concentración sérica de la proteína poco después de la administración y un poco antes de la siguiente administración). La adnectina contra PD-L1 puede estar unida a un resto que reduce la tasa de aclaramiento del polipéptido en un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, o ser humano) en más de dos veces, más de tres veces, más de cuatro veces o más de cinco veces con respecto a la adnectina sin modificar contra PD-L1. Otras medidas de farmacocinética mejorada pueden incluir la semivida en suero, que se divide a menudo en una fase alfa y una fase beta. Cualquiera o ambas fases pueden mejorarse significativamente mediante la adición de un resto adecuado. Por ejemplo, el resto PK puede aumentar la semivida en suero del polipéptido en más de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000 % o más con respecto al dominio Fn3 solo.
los restos que retrasan el aclaramiento de una proteína de la sangre, denominados en el presente documento "restos PK", incluyen restos de polioxialquileno (por ejemplo, polietilenglicol), azúcares (por ejemplo, ácido siálico), y restos de proteína bien tolerados (por ejemplo, Fc y sus fragmentos y variantes, transferrina, o albúmina sérica). La adnectina dirigida contra PD-L1 puede también fusionarse a la albúmina o a un fragmento (porción) o variante de la albúmina como se describe en la publicación US n.° 2007/0048282, o puede fusionarse a una o más adnectinas de unión a albúmina sérica, como se describe en el presente documento.
Otros restos PK que se pueden usar en la invención incluyen aquellos descritos en Kontermann et al., (Current Opinion in Biotechnology 2011;22:868-76). Dichos restos PK incluyen, aunque no de forma limitativa, fusiones de albúmina sérica humana, conjugados de albúmina sérica humana, aglutinantes de albúmina sérica humana (por ejemplo, Adnectina PKE, AlbudAb, ABD), fusiones de XTEN, fusiones de PAS (es decir, miméticos de PEG recombinantes basados en los tres aminoácidos, prolina, alanina, y serina), conjugados de carbohidratos (por ejemplo, hidroxietil almidón (HES)), glucosilación, conjugados de ácidos polisiálicos, y conjugados de ácidos grasos.
Por consiguiente, en algunas realizaciones la invención proporciona una adnectina contra PD-L1 fusionada a un resto PK que es un azúcar polimérico. En algunas realizaciones, el resto PK es un resto de polietilenglicol o una región Fc. En algunas realizaciones, el resto PK es una proteína de unión a albúmina sérica tal como las descritas en las publicaciones U.S. números 2007/0178082 y 2007/0269422. En algunas realizaciones el resto PK es una albúmina sérica humana. En algunas realizaciones, el resto PK es transferrina.
En algunas realizaciones, el resto PK está unido a la adnectina contra PD-L1 mediante un enlazador polipeptídico. Los enlazadores polipeptídicos ilustrativos incluyen polipéptidos que tienen entre 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, o 1-2 aminoácidos. Los enlazadores adecuados para la unión de dominios Fn3 son aquellos que permiten a los diferentes dominios plegarse independientemente entre sí formando una estructura tridimensional que permite una unión de alta afinidad a la molécula diana. Los ejemplos específicos de enlazadores adecuados incluyen enlazadores basados en glicina-serina, enlazadores basados en glicina-prolina, enlazadores basados en prolina-alanina, así como cualesquiera otros enlazadores descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador basado en glicina-prolina. Estos enlazadores comprenden restos de glicina y prolina y pueden tener entre 3 y 30, 10 y 30, y 3 y 20 aminoácidos de longitud.
Los ejemplos de dichos enlazadores incluyen GPG, GPGPGPG (SEQ ID NO: 672) y GPGPGPGPGPG (SEQ ID NO: 673). En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador basado en prolina-alanina. Estos enlazadores comprenden restos de prolina y alanina y pueden tener entre 3 y 30, 10 y 30, 3 y 20 y 6 y 18 aminoácidos de longitud. Los ejemplos de dichos enlazadores incluyen PAPAPA (SEQ ID NO: 674), pA p a Pa PAPAPA (SEQ ID NO: 675) y PAPAPAPAPAPAPAPAPA (SEQ ID NO: 676). En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador basado en glicina-serina. Estos enlazadores comprenden restos de glicina y serina y pueden tener entre 8 y 50, 10 y 30, y 10 y 20 aminoácidos de longitud. Los ejemplos de dichos enlazadores incluyen GSGSGSGSGS ((GS)5; SEQ iD NO: 662), GSGSGSGSGSGS ((GS)s; SEQ ID NO: 663), GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS ((GS)io; SEQ ID NO: 677), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ((G4SK SEQ ID NO: 678), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ((G4SK SEQ ID NO: 670), y GGGGSGGGGSGGGs G (SEQ ID NO: 671). En realizaciones ilustrativas, el enlazador no contiene ninguna pareja Asp-Lys (DK). En la Tabla 3 se proporciona una lista de enlazadores adecuados.
La longitud óptima del enlazador y de la composición de aminoácidos se puede determinar mediante experimentación rutinaria a la vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 se une, por ejemplo, a una adnectina contra HSA mediante un enlazador polipeptídico que tiene un sitio de proteasa que es escindible por una proteasa en la sangre del tejido diana. Dichas realizaciones se pueden usar para liberar una adnectina contra PD-L1 para mejorar la administración o las propiedades terapéuticas o para una producción más eficaz.
Se pueden introducir enlazadores o separadores adicionales en el término N o el término C de un dominio Fn3 entre el dominio Fn3 y el enlazador polipeptídico.
Polietilenglicol
En algunas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 comprende polietilenglicol (PEG). PEG es un polímero soluble en agua bien conocido, que está disponible en el mercado o se puede preparar mediante polimerización del etilenglicol con apertura de anillo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, Nueva York, Vol. 3, páginas 138-161). El término "PEG" se usa ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilenglicol, sin considerar el tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y se puede representar por la fórmula: X-O(CH2CH2O)n-iCH2CH2OH, donde n es 20 a 2300 y X es H o una modificación terminal, por ejemplo, un alquilo C1-4. PEG puede contener grupos químicos adicionales que son necesarios para las reacciones de unión, que son resultado de la síntesis química de la molécula; o que actúan como un separador para la distancia óptima de partes de la molécula. Además, dicho PEG puede consistir en una o más cadenas laterales de PEG que se unen entre sí. Los PEG con más de una cadena de PEG se denominan PEG con muchas ramas o ramificados. Los PEG ramificados se describen en, por ejemplo, Solicitud publicada europea n.° 473084A y Patente de EE.UU. n.° 5.932.462.
Una o más moléculas de PEG pueden unirse en diferentes posiciones en la proteína, y se puede conseguir dicha unión mediante reacción con aminas, tioles u otros grupos reactivos adecuados. El resto amina puede ser, por ejemplo, una amina primaria que se encuentra en el extremo N de un polipéptido o un grupo amino presente en un aminoácido, tal como lisina o arginina. En algunas realizaciones, el resto PEG se une en una posición en el polipéptido seleccionada entre el grupo que consiste en: a) el extremo N; b) entre el extremo N y la cadena beta o una cadena de tipo beta más en el extremo N; c) un bucle situado en una cara del polipéptido opuesta al sitio de unión a diana; d) entre el extremo C y la cadena beta o cadena de tipo beta más en el extremo C; y e) en el en el extremo C.
Se puede conseguir la PEGilación mediante PEGilación dirigida a sitio, donde un grupo reactivo adecuado se introduce en la proteína para crear un sitio donde se produce preferentemente la PEGilación. En algunas realizaciones, la proteína se modifica para introducir un resto cisteína en una posición deseada, permitiendo la PEGilación dirigida a sitio sobre la cisteína. Se pueden introducir mutaciones en una secuencia de codificación de la proteína para generar restos de cisteína. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mutando uno o más restos de aminoácidos en la cisteína. Los aminoácidos preferidos para mutar en un resto de cisteína incluyen serina, treonina, alanina y otros restos hidrófilos. Preferentemente, el resto que se va a mutar en la cisteína es un resto expuesto a la superficie. Son bien conocidos los algoritmos en la técnica de predecir la accesibilidad a la superficie de los restos basados en una secuencia primaria o una proteína. Como alternativa, se pueden predecir los restos superficiales comparando las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de unión, dado que se ha resuelto la estructura cristalina del marco, basada en que los polipéptidos de unión se diseñan y evolucionan, (véase Himanen et al., Nature 2001;414:933-8) y por tanto, se han identificado los restos expuestos a la superficie. se puede realizar la PEGilación de los restos de cisteína utilizando, por ejemplo, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-yodoacetamida, o PEG-ortopiridil disulfuro. En ciertas realizaciones, un PEG se une a una cisteína en el extremo C, por ejemplo, una cisteína que se ha añadido a una adnectina contra PD-L1, tal como en forma de una extensión "PC", como se describe además en el presente documento.
El PEG se activa normalmente con un grupo de activación adecuado, apropiado para acoplarse a un sitio deseado en el polipéptido. Son bien conocidos los métodos de PEGilación en la técnica y se describen además en Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenum Press, Nueva York (1992), y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182.
PEG puede variar ampliamente en el peso molecular y puede ser ramificado o linear. Normalmente, el peso molecular promedio en peso de PEG es de aproximadamente 100 Daltons a aproximadamente 150.000 Daltons. Los pesos moleculares promedio en peso ilustrativos para el PEG incluyen aproximadamente 5.000 Daltons, aproximadamente 10.000 Daltons, aproximadamente 20.000 Daltons, aproximadamente 40.000 Daltons, aproximadamente 60.000 Daltons y aproximadamente 80.000 Daltons. En ciertas realizaciones, el peso molecular del PEG es 40.000 Daltons. Se pueden usar también las versiones ramificadas de PEG que tienen un peso molecular total de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, el PEG tiene dos ramas. En algunas realizaciones, el PEG tiene cuatro ramas. En algunas realizaciones, el PEG es un bis-PEG (NOF Corporation, DE-200MA), en que se conjugan dos adnectinas (véase, por ejemplo, Ejemplo 1 y ATI-1341 de la Tabla 5).
Se pueden usar técnicas de separación y purificación convencionales conocidas en la técnica para purificar las adnectinas PEGiladas contra PD-L1, tales como cromatografía de exclusión molecular (por ejemplo, filtración en gel) y cromatografía de intercambio iónico. Se pueden separar también productos usando SDS-PAGE. Los productos que se pueden separar incluyen monoadnectinas, diadnectinas, triadnectinas, poliadnectinas y adnectinas sin PEGilar, así como PEG libres. el porcentaje de conjugados de mono-PEG puede controlarse combinando fracciones más amplias alrededor del pico de elución para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. aproximadamente un de 90 % conjugados de mono-PEG representan un buen equilibrio del rendimiento y la actividad.
En algunas realizaciones, las adnectinas PEGiladas contra PD-L1 retendrán preferentemente al menos aproximadamente un 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de la actividad biológica asociada a la adnectina contra PD-L1 sin modificar. En algunas realizaciones, la actividad biológica se refiere a su capacidad de unirse a PD-L1, como se evaluó mediante Kd, kon, o koff. En algunas realizaciones, la adnectina PEGilada contra PD-L1 muestra un aumento en la unión a PD-L1 con respecto a una adnectina sin PEGilar contra adnectina de PD-L1.
Dominio Fc de la inmunoglobulina (y fragmentos)
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 está condensada con un dominio Fc de la inmunoglobulina, o uno de sus fragmentos o variantes. Como se usa en el presente documento, una "región Fc funcional" es un dominio Fc o uno de sus fragmentos que retiene la capacidad de unirse a FcRn. En algunas realizaciones, una región Fc funcional se une a FcRn, pero no posee función efectora. Se puede determinar la capacidad de la región Fc o de uno de sus fragmentos de unirse a FcRn mediante ensayos de unión convencionales conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, La región Fc o uno de sus fragmentos se une a FcRn y posee al menos una "función efectora" de una región Fc nativa. Las "funciones efectoras" ilustrativas incluyen una unión a Clq; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); la unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por defecto de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras requieren generalmente la región Fc que se va a combinar con un dominio de unión (por ejemplo, una adnectina contra PD-L1) y se pueden evaluar usando varios ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones efectoras de anticuerpos.
Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra en la naturaleza. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de un aminoácido. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido precursor, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido precursor. La región Fc variante en el presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de identidad de la secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido precursor, y lo más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 % de identidad de la secuencia con la anterior, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % de identidad de la secuencia con la anterior.
En una realización a modo de ejemplo, el dominio Fc se derivó de una subclase de IgG1, sin embargo, se pueden usar también otras subclases (por ejemplo, IgG2, IgG3, e IgG4). Se muestra a continuación la secuencia de un dominio FC de la inmunoglobulina IgG1 humana:
d k t h t c p p c p a p e l l g g p s v f l f p p k p k d t l m is r t p e v t c v v v d v s h e d p e v k f n w y v d g v e v h n a k t k p r e e q y n s t y r w s v l t v l h q d w l n g k e y k c k v s n k a l p a p ie k t is k a k g q p r e p q v y t l p p s r d e l t k n q v s l t c l v k g f y p s d ia v e w e s n g q p e n n y k t t p p v l d s d g s f f l y s k l t v d k s r w q q g n v f s c s v m h e a l h n h y t q k s l s l s p GK (SEQ ID NO: 620)
La secuencia bisagra del núcleo está subrayada, y las regiones CH2 y CH3 están en texto regular. Debe entenderse que la lisina en el extremo C es opcional. Se pueden usar también alotipos y mutantes de esta secuencia. Como se conoce en la técnica, se pueden diseñar los mutantes para modular varias propiedades de Fc, por ejemplo, ADCC, CDC o semivida.
En ciertas realizaciones, la región Fc utilizada en la fusión de la adnectina contra PD-L1 comprende una región CH1. En ciertas realizaciones, la región Fc utilizada en la fusión de la adnectina contra-PD-L1 comprende las regiones CH2 y CH3. En ciertas realizaciones, la región Fc utilizada en la fusión dela adnectina contra PD-L1 comprende una región CH2, CH3, y una región bisagra (por ejemplo, como se muestra en el SEQ ID NO: 620).
En ciertas realizaciones, la región "bisagra" comprende los restos bisagra del núcleo que abarcan las posiciones 1-16 del SEQ ID NO: 620 (DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 621) de la región Fc de IgG1 Fc. En ciertas realizaciones, la fusión de la adnectina contra PD-L1-Fc adopta una estructura multimérica (por ejemplo, un dímero) debido, en parte, a los restos de cisteína en las posiciones 6 y 9 del SEQ ID NO: 620 en la región bisagra. Otras regiones bisagra ilustrativas adecuadas se muestran en los SEQ ID NO: 622-626.
Adnectinas
En ciertas realizaciones el resto PK es otra adnectina específica, por ejemplo, de una proteína séríca (por ejemplo, albúmina de suero humano), como se describe en el documento US 2012/0094909. Otros restos PK que se pueden usar con las adnectinas descritas en el presente documento se describen en Kontermann et al. (Current Opinion in Biotechnology 2011 ;22:868-76), como se describe anteriormente.
En algunas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 puede unirse directa o indirectamente, por ejemplo, a una adnectina contra HSA mediante un enlazador polimérico. Los enlazadores poliméricos que se pueden usar varían óptimamente la distancia entre cada componente de la fusión para crear una fusión de proteínas con una o más de las siguientes características: 1) impedimento estérico reducido o aumentado de la unión de uno o más dominios de proteínas cuando se unen a una proteína de interés, 2) estabilidad o solubilidad de la proteína aumentada, 3) agregación de la proteína disminuida, y 4) avidez o afinidad general de la proteína aumentada.
En algunas realizaciones, se une una adnectina contra PD-L1, por ejemplo, a una adnectina contra HSA, mediante un polímero biocompatible tal como un azúcar polimérico. El azúcar polimérico puede incluir un sitio de escisión enzimática que es escindible mediante una enzima en la sangre o el tejido diana. Dichas realizaciones se pueden usar para liberar una adnectina contra PD-L1 para mejorar la administración o las propiedades terapéuticas o para una producción más eficaz.
IV. Tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína
En un aspecto, la invención proporciona una adnectina que comprende dominios de tipo III de fibronectina que se unen a PD-L1. Un medio para preparar rápidamente y ensayar dominio Fn3 con propiedades de unión específicas es la tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína de Adnexus, una Bristol-Myers Squibb R&D Company. Esta divulgación utiliza la expresión in vitro y la tecnología de marcado, denominada 'PROfusion' que aprovecha las fusiones de ácido nucleico-proteína (fusiones de ARN y ADN-proteína) para identificar novedosos polipéptidos y motivos de aminoácidos que son importantes para la unión a las proteínas. La tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína es una tecnología que acopla covalentemente una proteína a su información genética codificante. Para una descripción detallada de la tecnología de fusión de ARN-proteína y de los métodos de cribado de bibliotecas de proteínas de estructuras principales basadas en fibronectinas véase Szostak et al., Pat. de EE.UU. números. 6.258.558, 6.261.804, 6.214.553, 6.281.344, 6.207.446, 6.518.018 y 6.818.418; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997;94:12297-12302; y Kurz et al., Molecules, 2000;5:1259-64.
V. Vectores y polinucleótidos
Se incluyen también en la presente divulgación las secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las proteínas descritas en el presente documento. Como apreciarán los expertos en la técnica, debido a la degeneración de la tercera base, casi cada aminoácido puede representarse por más de un codón triplete en una secuencia de nucleótidos codificantes. Además, los cambios menores de pares de bases pueden dar como resultado una sustitución conservativa en la secuencia de aminoácidos codificada, pero no se espera que alteren sustancialmente la actividad biológica del producto génico. Por tanto, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína descrita en el presente documento puede estar modificada ligeramente en la secuencia y codificar todavía además su producto génico respectivo. Determinados ácidos nucleicos ilustrativos que codifican las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano y sus fusiones descritas en el presente documento incluyen ácidos nucleicos que tienen las secuencias que se muestran en los SEQ ID NO: 16-19, 31-34, 46-49, 61-64, 76-79, 92-95 y 108-111.
Se contemplan también las secuencias de ácidos nucleicos que son al menos un 50 %, tal como al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % idénticas a los SEQ ID NOS: 16-19, 31-34, 46-49, 61-64, 76-79, 92-95, y 108-111, y codifican una proteína que se une a PD-L1. En algunas realizaciones, se introducen sustituciones de nucleótidos de tal manera que no alteran la secuencia de aminoácidos traducidos resultante.
Los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las diversas proteínas o polipéptidos descritos en el presente documento pueden sintetizarse químicamente. Se puede seleccionar la utilización del codón para mejorar la expresión en una célula. Dicho uso de codón dependerá del tipo de célula seleccionada. Se han desarrollado patrones de utilización de codones especializados para E. co liy otras bacterias, así como células de mamíferos, células vegetales, células de levaduras y células de insectos. Véase, por ejemplo: Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (21 de ene de 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (octubre de 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (octubre de 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (septiembre de 1996); y Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (octubre de 1991).
Se describen las técnicas generales para la manipulación de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), o Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York (1987) y las actualizaciones periódicas. En general, el ADN que codifica el polipéptido está unido de manera operativa a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados derivados de genes de mamíferos, virus, o insectos. Dichos elementos reguladores incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. La capacidad de replicarse en un hospedador, conferida normalmente por un origen de replicación, y se incorpora adicionalmente un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes.
Las proteínas descritas en el presente documento pueden producirse de forma recombinante, no solo directamente, pero también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia de señalización u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia de señalización heteróloga seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señalización) por la célula hospedadora. Una secuencia líder en el extremo N ilustrativa de la producción de polipéptidos en un sistema mamífero es: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 583), que se retira por la célula hospedadora tras la expresión.
Para las células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan una secuencia de señalización nativa, la secuencia de señalización se sustituye por una secuencia de señalización procariota seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp, o líderes de la enterotoxina II térmicamente estables.
Para secreción en levaduras, la secuencia de señalización natural puede sustituirse por, por ejemplo, un líder de la invertasa de levadura, un factor líder (incluyendo los líderes del factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans, o la secuencia de señalización descrita en la pat. de EE.UU. n.° 5.631.144. En la expresión en células de mamífero, están disponibles secuencias de señalización de mamíferos así como líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal gD del herpes simple. El ADN de dichas regiones precursora puede ligarse en marco de lectura con el ADN que codifica la proteína.
Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector en una o más células hospedadoras seleccionadas. En general, en vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN hospedador cromosómico, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Dichas secuencias son bien conocidas por varias bacterias, levadura, y virus. El origen de replicación procedente del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram negativas, el origen del plásmido de 2 micrómetros es adecuado para levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, v Sv o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. En general, el componente del origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamífero (el origen del SV40 puede usarse normalmente solo debido a que contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o traciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de bacilos.
Los vectores de expresión y clonación contienen normalmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y que está unido operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína descrita en el presente documento, por ejemplo, una proteína de estructura principal basada en fibronectina. Los promotores adecuados para su uso como hospedadores procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de la beta-lactamasa y la lactosa, la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp), y promotores híbridos tal como el promotor tan. Sin embargo, sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para usar en sistemas bacterianos contendrán también una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica la proteína descrita en el presente documento. Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotas. Virtualmente, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases en la dirección 5' del sitio donde se inició la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en la dirección 5' del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A en el extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertaron adecuadamente en vectores de expresión eucariota.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con hospedadores de levaduras incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa ras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Se puede controlar la transcripción de vectores en células hospedadoras de mamíferos, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B virus y lo más preferentemente el Virus 40 simio (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, de los promotores de choque térmico, con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.
La transcripción de un ADN que codifica la proteína descrita en el presente documento por eucariotas superiores está a menudo aumentada insertando una secuencia potenciadora en el vector. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Normalmente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula erucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) en los elementos potenciadores para la activación de los promotores eucariotas. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia que codifica el péptido, pero preferentemente se localiza en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (por ejemplo, levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles a partir de 5' y, ocasionalmente 3', regiones no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica la proteína descrita en el presente documento. Un componente útil de terminación de la transcripción es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO 94/11026 y el vector de expresión divulgado en el presente documento.
El ADN recombinante puede incluir también cualquier tipo de secuencia marcadora de la proteína que pueda ueda ser útil para purificar la proteína. Los ejemplos de etiquetas de proteínas incluyen, aunque no de forma limitativa, a una etiqueta histidina, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta HA, o una etiqueta GST. Los vectores de clonación y expresión adecuados para usar en hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras, y de mamíferos se pueden encontrar en Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, Nueva York (1985)).
La construcción de expresión se introduce en la célula hospedadora usando un método adecuado para la célula hospedadora, como será evidente para un experto en la materia. Se conocen en la técnica varios métodos para introducir ácidos nucleicos en células hospedadoras, incluyendo, aunque no de forma limitativa, electroporación; transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (donde el vector es un agente infeccioso).
Las células hospedadoras adecuadas incluyen procariotas, levaduras, células de mamíferos, o células bacterianas. Las bacterias adecuadas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacillus spp. Levaduras, preferentemente especies de Saccharomyces, tales como S. cerevisiae, pueden usarse también para la producción de polipéptidos. También se pueden emplear diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos o insectos para expresar proteínas recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas se han revisado por Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988)). Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen células endoteliales, células C0S-7 de riñón de mono, CV-1, células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embriónico humano, HeLa, líneas de células 293, 293T y BHK. Se prepararon polipéptidod purificados cultivando sistemas de hospedadores/vectores adecuados para expresarlas proteínas recombinantes. Para muchas aplicaciones, el tamaño pequeño de muchos de los polipéptidos descritos en el presente documento convertiría la expresión en E. coli como el método preferido de expresión. La proteína se purifica a continuación a partir del medio de cultivo o de los extractos celulares.
VI. Producción de proteínas
Se describen también en el presente documento líneas de células que expresan una adnectina contra PD-L1 o uno de sus polipéptidos de fusión. La creación y el aislamiento de líneas de células productoras de una adnectina contra PD-L1 puede realizarse usando técnicas convencionales conocidas en la materia, tales como las descritas en el presente documento.
Se transformaron células hospedadoras con los vectores de expresión o clonación descritos en el presente documento para la producción de proteínas y se cultivaron en medio nutriente convencional según fue adecuado para inducir los promotores, se seleccionan los transformantes o amplifican los genes que codifican las secuencias deseadas.
Se pueden obtener también adnectinas de la presente invención en una forma aglicosilada produciendo las adnectinas en, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo, E. coli). De forma notable, las formas aglicosiladas de las adnectinas descritas en el presente documento presenta la misma afinidad, la potencia, y el mecanismo de acción como adenectinas glicosiladas cuando se ensayaron in vitro.
Las células hospedadoras para producir las proteínas de la presente invención pueden cultivarse en varios medios. Los medios comercialmente disponibles tales como F10 de Ham (Sigma), Medio esencial mínimo ((MEM),
(Sigma), RPMI-1640 (Sigma), medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma)) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Además, muchos de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), pat. de EE.UU números 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655, 5.122.469, 6.048.728, 5.672.502, o pat. de EE.UU. n.° RE 30.985 se pueden usar como medio de cultivo de las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede completarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como fármaco de gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se puede incluir también cualquier otro complemento necesario a las concentraciones adecuadas que conocería un experto en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para la persona normalmente experta en la materia.
Las proteínas descritas en el presente documento pueden producirse también usando sistemas de traducción exentos de células. Para dichos fines, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido deben modificarse para permitir la transcripción in vitro para producir ARNm y para permitir la traducción exenta de células del ARNm en el sistema exento de células concreto que se está utilizando (eucariota tal como un mamífero o un sistema de traducción exento de células de levaduras o procariota tal como un sistema de traducción exento de células bacterianas).
Se pueden producir también las proteínas descritas en el presente documento mediante síntesis química (por ejemplo, mediante los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edición, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)). Se pueden producir también las modificaciones de la proteína mediante síntesis química.
Las proteínas de la presente invención se pueden purificar mediante métodos de aislamiento/purificación de proteínas conocidos generalmente en el campo de las proteínas. Los ejemplos no limitantes incluyen la extracción, recristalización, salinización (por ejemplo, con sulfato de amonio o sulfato sódico), centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía en fase normal, cromatografía en fase inversa, filtración en gel, cromatografía de permeación en gel, cromatografía de afinidad, electroforesis, distribución contracorriente de cualquier combinación de estas. Después de la purificación, se pueden intercambiar los polipéptidos en diferentes tampones y/o concentrarse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo, aunque no de forma limitativa, filtración y diálisis.
El polipéptido purificado es preferentemente al menos un 85 % puro, o preferentemente al menos un 95 % puro, y lo más preferente al menos un 98 % puro. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza, el polipéptido es suficientemente puro para usar como un producto farmacéutico.
Producción de proteínas de alto rendimiento (HTPP)
Se clonaron aglutinantes seleccionados en el vector PET9d en la dirección 5' de una etiqueta HIS6y se transformaron en células E. coli BL21 DE3 plysS y se inocularon en 5 ml de medio LB que contenía 50 |jg/ml de kanamicina en un formato de 24 pocillos y crecieron a 37 °C durante la noche. Se prepararon cultivos de 5 ml de medio LB reciente (50 jg/m l de kanamicina) para la expresión inducible mediante aspiración de 200 j l del cultivo durante la noche y dispensando este en el pocillo adecuado. Los cultivos se hicieron crecer a 37 °C hasta una A600 de 0,6-0,9. Tras la inducción con isopropil-p-tiogalactósido (IPTG) 1 mM, se expresó el cultivo durante 6 horas a 30 °C y se recogió mediante centrifugación durante 10 minutos a 2750 g a 4 °C.
Los aglomerados celulares (en un formato de 24 pocillos) se lisaron mediante resuspensión en 450 j l de tampón de lisis (NaH2PO450 mM, NaCl 0,5 M, 1x Complete™ Protease Inhibitor Cocktail-exento de EDTA (Roche), PSMF 1 mM, CHAPS 10 mM, imidazol 40 mM, 1 mg/ml de lisozima, 30 jg/m l de ADNasa, 2 jg/m l de aprotonina, pH 8,0) y se agitó a temperatura ambiente durante 1-3 horas. Se clarificaron los lisados y se volvieron a envasar en un formato de 96 pocillos mediante transferencia a un Unifilter GF/D Whatman de 96 pocillos ajustado con una placa de captura de 1,2 ml de 96 pocilios, y se filtraron mediante presión positiva. Los lisados clarificados se transfirieron a una placa quelante de níquel o cobalto de 96 pocillos que se había equilibrado con un tampón de equilibrio (NaH2PO450 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 40 mM, pH 8,0) y se incubaron durante 5 min. el material sin unir se retiró mediante presión positivo. La resina se lavó dos veces con 0.3 ml/pocillo con tampón de lavado n.° 1 (NaH2PO450 mM, NaCl 0,5 M, CHAPS 5 mM, imidazol 40 mM, pH 8,0). Cada lavado se retiró mediante presión positiva. Antes de la elución, cada pocillo se lavó con 50 |jl de tampón de elución (PBS EDTA 20 mM), se incubó durante 5 min, y este lavado se descartó mediante presión positiva. Se eluyó la proteína aplicando 100 j l de tampón de elución adicional a cada pocillo. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron las placas durante 5 minutos a 200 g y se eluyó la proteína recogida en placas de captura de 96 pocillos que contenían 5 j l de MgCl20,5 M añadidos a la parte inferior de la placa de captura de la elución antes de la elución. Se cuantificó la proteína eluída usando un ensayo de proteína total con el dominio 10Fn3 natural como la proteína convencional.
Expresión a escala media y purificación de aglutinantes de proteínas de estructura principal basados en fibronectina
Para la expresión de clones insolubles, los clones, seguidos de la etiqueta HIS6, se clonaron en un vector pET9d (EMD Bioscience, San Diego, CA) y se expresaron en células HMS174 de E. coli. Veinte ml de un cultivo de inóculo (generados a partir de una única colonia sembrada en placa) se usaron para inocular 1 litro de medio LB que contenía 50 jg/m l de carbenicilina y 34 jg/m l de cloranfenicol. El cultivo se hizo crecer a 37 °C hasta una A600 de 0,6-1,0. T ras la inducción con isopropil-p-tiogalactosida 1 mM (IPTG) el cultivo se hizo crecer durante 4 horas a 30 °C y se recogió mediante centrifugación durante 30 minutos a > 10.000 g a 4 °C. Los aglomerados celulares se congelaron a -80 °C. El aglomerado celular se resuspendió en 25 ml de tampón de lisis (aH2P0420 mM, NaCl 0,5 M, Ix Cóctel inhibidor de la proteasa completo-exento de EDTA (Roche), PMSF I mM, pH 7,4) usando un homogeneizador ULTRA-TURRAX® (IKA works) en hielo. Se consiguió la lisis celular mediante homogeneización a alta presión (>18.000 psi) usando un MICROFLUIDIZER® Modelo M-1 10S (Microfluidics). se separó la fracción insoluble mediante centrifugación durante 30 minutos a 23.300 g a 4 °C. el aglomerado insoluble recuperado de la centrifugación del lisado se lavó con fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 mM, pH 7,4. El aglomerado se resolubilizó en clorhidrato de guanidina 6,0 M en fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M pH 7,4 con sonicación seguido por incubación at 37 grados durante 1-2 horas. El aglomerado resolubilizado se filtró a 0,45 jm y se cargó en una columna Histrap equilibrada con fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M /tampón de guanidina 6,0 M pH 7.4. Tras la carga, la columna se lavó durante 25 CV adicionales con el mismo tampón. Se eluyó la proteína unida con Imidazol 50 mM en fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 mM/ guan-HCl 6,0 M pH7,4. La proteína purificada se replegó mediante diálisis frente a acetato sódico 50 mM/NaCl 150 mM pH 4,5.
Expresión a escala media y purificación de aglutinantes de proteínas de estructura principal basadas en fibronectina soluble
Para la expresión de clones solubles, los clones, seguidos de la etiqueta HIS6, se clonaron en un vector pET9d (EMD Bioscience, San Diego, CA) y se expresaron en células de E. coli HMS174. Veinte ml de un cultivo de inóculo (generados a partir de una única colonia sembrada en placa) se usaron para inocular 1 litro de medio LB que contenía 50 jg/m l de carbenicilina y 34 jg/m l de cloranfenicol. El cultivo se hizo crecer a 37 °C hasta una A600 de 0,6-1,0. T ras la inducción con isopropil-p-tiogalactósido (IPTG) 1 mM, se hizo crecer el cultivo durante 4 horas a 30 °C y se recogió mediante centrifugación durante 30 minutos a >10.000 g a 4 °C. se congelaron los aglomerados celulares a -80 °C. El aglomerado celular se resuspendió en 25 ml de tampón de lisis (NaH2P0420 mM, NaCl 0,5 M, Ix Cóctel inhibidor de la proteasa completo-exento de EDTA (Roche), PMSF I mM, pH 7,4) usando un homogeneizador ULTRA-TURRAX® (IKA works) en hielo. Se consiguió la lisis celular mediante homogeneización a alta presión (> 18.000 psi) usando un MICROFLUIDIZER® Modelo M-1 10S (Microfluidics). Se separó la fracción soluble mediante centrifugación durante 30 minutos a 23.300 g a 4 °C. Se clarificó el sobrenadante mediante un filtro de 0,45 jm . El lisado clarificado se cargó sobre una columna Histrap (GE) preequilibrada con el fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M pH 7,4. A continuación se lavó la columna con 25 volúmenes de columna del mismo tampón, seguido de 20 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M/Imidazol 25 mM, pH 7,4 y a continuación 35 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M/Imidazol 40 mM, pH 7,4. Se eluyó la proteína con 15 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M/Imidazol 500 mM Imidazol, pH 7,4, se combinaron las fracciones basándose en la absorbancia a una A2so y se dializó frente a 1XPBS, Tris 50 mM, NaCl 150 mM; pH 8,5 o NaOAc 50 mM; NaCl 150 mM; pH 4,5. se retiró cualquier precipitado filtrando en un filtro de 0,22 jm .
VII. Composiciones
La presente invención también proporciona composiciones, tales como composiciones farmacéuticas y radiocomposiciones farmacéuticas, que comprenden una adnectina contra PD-L1 o sus proteínas de fusión descritas en el presente documento, en donde la composición está esencialmente exenta de endotoxinas, o no contiene al menos más de uno de los niveles aceptables de endotoxinas como se determinó por el organismo regulador adecuado (por ejemplo, FDA).
Las composiciones de la presente invención pueden estar en forma de una píldora, comprimido, cápsula, líquido, o comprimido de liberación sostenida para la administración oral; un líquido para la administración intravenosa, subcutánea o parenteral; o un gel, loción, pomada, crema, o un polímero u otro vehículo de liberación sostenida para la administración local.
Se encuentran métodos bien conocidos en la técnica de preparación de composiciones, por ejemplo, en "Remington: aThe Science and Practice of Pharmacy (20a ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa.). Las composiciones para la administración parenteral pueden, por ejemplo, contener excipientes, agua estéril, solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, o naftalenos hidrogenados. Se pueden usar polímeros láctidos biodegradables biocompatible, copolímeros de láctido/glicólido, o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno para controlar la liberación de los compuestos, composiciones de nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas biodegradables, nanopartículas lípidas sólidas, liposomas) para controlar la biodistribución de los compuestos. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímeros de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. La concentración del compuesto en la composición varía dependiendo de numerosos factores, incluyendo la dosificación del fármaco que se va a administrar, la ruta de administración, y el fin de la composición (por ejemplo, profiláctica, terapéutica, diagnóstica).
Los vehículos, excipientes y/o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa, o dextranos; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; cointraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween, PLURONIC™ o polietilenglicol (PEG).
Los polipéptidos de la presente invención pueden administrarse opcionalmente como una sal farmacéuticamente aceptable, tales como sales de adición de ácido o complejos metálicos que se usan comúnmente en la industria farmacéutica. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen ácidos orgánicos tales como ácidos acético, láctico, pamoico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzoico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metanosulfónico, toluenosulfónico, o trifluoroacético o similares; ácidos poliméricos, tales como ácido tánico, carboximetilcelulosa, o similares; y ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o similares. Los complejos metálicos incluyen cinc, hierro y similares. En un ejemplo, el polipéptido se formuló en presencia de acetato sódi
Los principios activos pueden también atraparse en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, una microcápsula de hidroximetilcelulosa o una microcápsula de gelatina y poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen las proteínas descritas en el presente documento, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol vinílico)), poliláctidos (pat. de Ee .UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poliácido D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Mientras que las proteínas encapsuladas descritas en el presente documento pueden permanecer en el cuerpo durante largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden crear estrategias racionales para la estabilización según el mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando restos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicas.
Las composiciones de la presente invención para uso oral incluyen comprimidos que contienen los principios activos en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o cargas inertes (por ejemplo, sacarosa y sorbitol), agentes lubricantes, agentes deslizantes, y antiadhesivos (por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de cinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados o talco). Se pueden proporcionar también composiciones para uso oral como comprimidos masticables, o como cápsulas de gelatina dura en donde el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, o como cápsulas de gelatina blanda en donde el principio activo se mezcla con agua o un medio de aceite.
La composición farmacéutica que se va a usar para la administración in vivo normalmente debe ser estéril. Esto se puede llevar a cabo por filtración a través de membranas de filtración estériles. donde la composición está liofilizada, la esterilización usando este método se puede llevar a cabo tanto antes como después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles en forma de una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse tanto en formas listas para el uso como en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de la administración.
Las composiciones en el presente documento pueden contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación concreta que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Dichas moléculas están presentes de manera conveniente en combinación en cantidades que son eficaces para el fin que se pretende.
VIM. Caracterización biofísica y bioquímica
La unión de una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento para PD-L1 puede evaluarse en términos de constantes de equilibrio (por ejemplo, disociación, Kd) y en términos de constantes cinéticas (por ejemplo, sobre una tasa constante, kon y una constante de tasa, koff). Una adnectina se unirá generalmente a una molécula diana con una Kd de menos de 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, o 100 pM, aunque se pueden tolerar valores mayores de Kd donde la koff es suficientemente baja o la kon, es suficientemente alta.
Ensayos in vitro para la afinidad de unión
Una adnectina contra PD-L1 que se une a y antagoniza PD-L1 puede identificarse usando varios ensayos in vitro. En ciertas realizaciones, los ensayos son ensayos de alto rendimiento que permiten el cribado de múltiples adnectinas candidatas simultáneamente.
Los ensayos ilustrativos para determinar la afinidad de unión de una adnectina contra PD-L1 incluyen, aunque no de forma limitativa, métodos en fase solución tales como el ensayo de exclusión cinética (KinExA) (Blake et al., JBC 1996; 271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004; 328:35-43), resonancia de plasmón superficial (SPR) con el sistema Biacore (Uppsala, Suecia) (Welford et al., Opt. Quant, Elect 1991; 23:1; Morton y Myszka, Methods in Enzymology 1998; 295:268) y ensayos de fluorescencia resueltos en tiempo homogéneo (HTRF) (Newton et al., J Biomol Screen 2008; 13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008; 6:55-68).
En ciertas realizaciones, las interacciones biomoleculares se pueden controlar en tiempo real con el sistema Biacore, que utiliza SPR para detectar cambios en el ángulo de resonancia de la luz en la superficie de una película fina de oro sobre un soporte de vidrio debido a cambios en el índice de refracción de la superficie hasta 300 nm de distancia. el análisis Biacore genera constantes de tasa de asociación, constantes de tasa de disociación, constantes de disociación de equilibrio, y constantes de afinidad. La afinidad de unión se obtuvo evaluando las constantes de tasa de asociación y tasa de disociación usando un sistema de resonancia de plasmón superficial Biacore (Biacore, Inc.). Se activó un chip biosensor para el acoplamiento covalente de la diana. A continuación, se diluyó la diana y se inyectó sobre el chip para obtener una señal en unidades de respuesta de material inmovilizado. Debido a que la señal en unidades de resonancia (UR) es proporcional a la masa del material inmovilizado, esto representa un intervalo de densidades diana inmovilizadas en la matriz. Los datos de asociación y disociación se ajustan simultáneamente en un análisis global para resolver la expresión de la tasa neta de una interacción bimolecular 1:1, dando como resultado mejores valores de ajuste para kon, koff y Rmax (respuesta máxima a la saturación). Constantes de disociación del equilibrio para la unión, se calcularon las Kd's a partir de mediciones de SPR como koff/kon.
Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento pueden presentar una Kd en el ensayo de afinidad de SPR descrito en el Ejemplo 2 de 500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM 0 menos, 150 nM o menos, 100 nM o menos, 90 nM o menos, 80 nM o menos, 70 nM o menos, 60 nM o menos, 50 nM o menos, 40 nM o menos, 30 nM o menos, 20 nM o menos, 15 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, o 1 nM o menos.
Debe entenderse que los ensayos descritos en el presente documento anteriormente, y que cualquier método conocido en la técnica para determinar la afinidad de unión entre proteínas (por ejemplo, transferencia basada en fluorescencia (FRET), enzimoinmunoanálisis de adsorción, y ensayos de unión competitivos (por ejemplo, radioinmunoensayos)) pueden usarse para evaluar las afinidades de unión de las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento.
IX. Obtención de imágenes In vivo con adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano
Agentes de obtención de imágenes
Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento también son útiles en varias aplicaciones diagnósticas y de obtención de imágenes. En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 está etiquetada con un resto que es detectable in vivo y dichas adnectinas etiquetadas pueden usarse como agentes de obtención de imágenes in vivo, por ejemplo, para la obtención de imágenes de cuerpo completo. Por ejemplo, en una realización, un método para detectar un tumor positivo para PD-L1 en un sujeto comprende administrar al sujeto administrar una adnectina contra PD-L1 unida a una etiqueta detectable, y tras un tiempo adecuado, detectar la etiqueta en el sujeto.
un agente de obtención de imágenes de una adnectina contra PD-L1 puede utilizarse para diagnosticar un trastorno o enfermedad asociado a niveles crecientes de PD-L1, por ejemplo, un cáncer en el que un tumor expresa selectivamente en exceso PD-L1. De manera similar, se puede usar una adnectina contra PD-L1 para controlar los niveles de PD-L1 en un sujeto, por ejemplo, un sujeto que está siendo tratado para reducir los niveles de PD-L1 y/o las células positivas a PD-L1 (por ejemplo, células tumorales). Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano se pueden usar con o sin modificación, y pueden etiquetarse mediante enlace covalente o no covalente de un resto detectable.
Los restos detectables que se pueden usar incluyen agentes radioactivos, tales como: metales pesados radioactivos tales como quelatos de hierro, quelatos radioactivos de gadolinio o manganeso, emisores de positrones del oxígeno, nitrógeno, hierro, carbono, o galio, 18F, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 124I, 86Y, 89Zr, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 44Sc, 47Sc, 11C, 111In, 114mIn 114In 125I 124I 1311 123I 1311123I 32Cl 33Cl 34Q 74gr 75gr 76gr 77gr 78gr 89Zr 186Re 188Re 86Y 90Y 177Lu 99jc 212Bi, 213Bi, 212Pb, 225Ac, o 153Sm. ’
En ciertas realizaciones, el agente radioactivo se conjuga a la adnectina en uno o más restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, uno o más, tal como dos o más, tres o más, cuatro o más, o un número mayor de radionucleidos puede estar presente en la sonda etiquetada. En ciertas realizaciones, el radionucleido se une directamente a ka adnectina mediante un agente quelante (por ejemplo, véase la patente de EE.UU. 8.808.665). En ciertas realizaciones, el radionucleido está presente en un grupo protético conjugado a la adnectina por un quelador bifuncional o resto de conjugación (BFC). En ciertas realizaciones, el agente quelante del radionucleido y/o el resto de conjugación es DFO, DOTA y sus derivados (CB-DO2A, 3p-C-DEPA, TCMC, Oxo-DO3A), DBCO, TE2A, CB-TE2A, CB-TE1A1P, CB-TE2P, MM-TE2A, DM-TE2A, diamsar y los derivados, NODASA, NODAGA, NOTA, NETA, TACN-TM, DTPA, 1B4M-DTPA, CHX-A"-DTPA, TRAP (PRP9), NOPO, AAZTA y los derivados (DATA), H2dedpa, H4octapa, gazapa, H5decapa, Hsfospa, HBED, SHBED, BPCA, CP256, PCTA, HEHA, PEPA, EDTA, TETA, y TRITA basados en los agentes quelantes, y los análogos cercanos y sus derivados.
En ciertas realizaciones, el quelante del radionucleido o el resto de conjugación (BFC) es maleimida-NODAGA o maleimida-DBCO, que se puede unir covalentemente a un polipéptido restos de cisteína próximos al extremo C del polipéptido. En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 está modificada en su extremo C mediante la adición de una cisteína. Por ejemplo, PxCy puede unirse al extremo C en los restos de aminoácidos NYRT, en donde P es prolina, C es cisteína, y X y Y son números enteros que son al menos 1. Las adnectinas contra PD-L1 ilustrativas que tienen los restos de aminoácidos PC en su extremo C se muestran en los Ejemplos. maleimida-NODAGA o maleimida-DBCO puede hacerse reaccionar con la cisteína, para producir adnectina-NODAGA o adnectina-DBCO, respectivamente.
En ciertas realizaciones, el agente quelante del radionucleido es DFO, que puede unirse, por ejemplo, en lisinas aleatorias de la superficie.
En ciertas realizaciones, el quelador de 64Cu es DOTA, NOTA, EDTA, Df, DTPA, o TETA. Las combinaciones adecuadas de agentes quelantes y radionucleido se revisaron extensamente en Price et al., Chem Soc Rev 2014;43:260-90.
En ciertas realizaciones, una adnectina contra PD-L1 se etiqueta con el trazador PET 18F. 18F es un radionucleido PET atractivo con una semivida radioactiva de 1,8 horas, que proporciona una herramienta de obtención de imágenes el mismo día, donde el radionucleido PET corresponde mejor a la semivida biológica de la adnectina, dando como resultado imágenes excelentes con menos exposición a la radiación del paciente. La adnectina APD-L1 puede etiquetarse con un grupo prostético, tal como [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina ([18F]-FFPEGA), como se describe además en los Ejemplos. Como se muestra adicionalmente en los Ejemplos, una adnectina etiquetada con 18F contra PD-L1 etiqueta específica y eficazmente tumores humanos positivos para PD-L1 en ratones y tumores positivos para PD-L1 en macacos. Se proporcionan a continuación detalles específicos del método de etiquetado y en los Ejemplos.
En ciertas realizaciones, un agente de obtención de imágenes de PD-L1 es una adnectina contra PD-L1 que está etiquetada con 64Cu, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos.64Cu puede unirse a una adnectina con un agente quelante, tal como NODAGA. Como se muestra adicionalmente en los Ejemplos, una adnectina etiquetada con 64Cu contra PD-L1 etiquetada específica y eficazmente contra tumores humanos positivos para PD-L1 en ratones y tumores positivos para PD-L1 en macacos.
Se pueden usar también otros métodos reconocidos por la técnica para etiquetar polipéptidos con radionucleidos tales como 64Cu y 18F para sintetizar agentes de obtención de imágenes basados en la adnectina contra PD-L1 descritos en el presente documento. Véanse, por ejemplo, documento US2014/0271467; Gill et al., Nature Protocols 2011;6:1718-25; Berndt et al. Nuclear Medicine and Biology 2007;34:5-15, Inkster et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013;23:3920-6.
En ciertas realizaciones, un agente de obtención de imágenes de PD-L1 comprende una molécula de PEG (por ejemplo, 5KDa PEG, 6KDa PEG, 7KDa PEG, 8KDa PEG, 9KDa PEG, o 10KDa PEG) para aumentar la PK de la sangre del agente de obtención de imágenes mediante pequeños incrementos para potenciar el contraste de la obtención de imágenes o el aumento de la avidez de la adnectina contra PD-L1 basada en el agente de obtención de imágenes.
Administración y obtención de imágenes
En ciertas realizaciones, la adnectina contra PD-L1 etiquetada se puede usar para obtener imágenes de células o tejidos positivos para PD-L1, por ejemplo, tumores que expresan PD-L1. Por ejemplo, la adnectina contra PD-L1 etiquetada se administró a un sujeto en una cantidad suficiente para captar la adnectina etiquetada en el tejido de interés (por ejemplo, el tumor que expresa PD-L1). A continuación, se obtuvieron imágenes del sujeto usando un sistema de obtención de imágenes tal como PET durante un lapso de tiempo adecuado para el radionucleido concreto que se está usando. La adnectina contra PD-L1 etiquetada se unió a células o tejidos que expresaban PD-L1, por ejemplo, tumores que expresaban PD-L1, a continuación, se detectaron mediante el sistema de obtención de imágenes.
Se puede usar la obtención de imágenes de PET con un agente de obtención de imágenes de PD-L1 para detectar cualitativa o cuantitativamente PD-L1. Se puede usar un agente de obtención de imágenes de PD-L1 como un biomarcador, y la presencia o la ausencia de una señal positiva para PD-L1 puede ser indicativa de que, por ejemplo, el sujeto sería sensible a una terapia dada, por ejemplo, una terapia contra el cáncer, o que el sujeto está respondiendo o no a una terapia.
En ciertas realizaciones, la progresión o regresión de la enfermedad (por ejemplo, tumor) puede obtenerse con imágenes como una función del tiempo o el tratamiento. Por ejemplo, se puede controlar el tamaño del tumor en un sujeto que experimenta terapia contra el cáncer (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia) y se puede controlar la extensión o regresión del tumor en tiempo real basándose en la detección de la adnectina contra PD-L1. etiquetada.
La cantidad eficaz para dar como resultado la captación del agente de obtención de imágenes (por ejemplo, agente de obtención de imágenes adnectina 18F, agente de obtención de imágenes adnectina 64Cu) en las células o tejidos de interés (por ejemplo, tumores) puede depender de varios factores, incluyendo, por ejemplo, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, y la dieta del hospedador; el tiempo de administración; la ruta de administración; la tasa de excreción de la sonda específica empleada; la duración del tratamiento; la existencia de otros fármacos usados en combinación o de forma coincidente con la composición específica empleada; y otros factores.
En ciertas realizaciones, la obtención de imágenes de tejidos que expresan PD-L1 se efectúa antes, durante, y después de la administración de la adnectina contra PD-L1 etiquetada.
En ciertas realizaciones, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano, perro, gato, simio, mono, rata o ratón.
En ciertas realizaciones, las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano descritas en el presente documento son útiles para la obtención de imágenes de PET de los pulmones, corazón, riñones, hígado, y piel, y otros órganos, o tumores asociados a estos órganos que expresan PD-L1.
En ciertas realizaciones, los agentes de obtención de imágenes contra PD-L1 proporcionan un contraste de al menos 50 %, 75 %, 2, 3, 4, 5 o más. Los Ejemplos muestran que todas las adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano que se usaron proporcionaron un contraste de PET de 2 o más, y que la afinidad de las adnectinas no era importante.
Cuando se usó para la obtención de imágenes (por ejemplo, PET) con radionucleidos de semivida corta (por ejemplo, 18F), las adnectinas radiomarcadas dirigidas contra PD-L1 humano se administraron preferentemente por vía intravenosa. son también adecuadas otras rutas de administración y dependen de la semivida de los radionucleidos usados.
En ciertas realizaciones, los agentes de obtención de imágenes contra PD-L1 descritos en el presente documento se usaron para detectar células positivas para PD-L1 en un sujeto, administrando al sujeto un agente de obtención de imágenes contra PD-L1 divulgado en el presente documento, y detectar el agente de obtención de imágenes, definiendo el agente de obtención de imágenes la ubicación de las células positivas para PD-L1 en el sujeto. En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes se detecta por tomografía de emisión de positrones.
En ciertas realizaciones, los agentes de obtención de imágenes contra PD-L1 descritos en el presente documento se usaron para detectar los tumores que expresan PD-L1 en un sujeto administrando al sujeto un agente de obtención de imágenes contra PD-L1 divulgado en el presente documento, y detectar el agente de obtención de imágenes, definiendo el agente de obtención de imágenes la ubicación del tumor en el sujeto. En ciertas realizaciones, el agente de obtención de imágenes se detecta por tomografía de emisión de positrones.
En ciertas realizaciones, se obtuvo una imagen del agente de obtención de imágenes contra PD-L1 descrito en el presente documento administrando el agente de obtención de imágenes a un sujeto y obteniendo imágenes in vivo de la distribución del agente de obtención de imágenes por tomografía de emisión de positrones.
Se divulgan en el presente documento métodos de obtener una imagen cuantitativa de tejidos o células que expresan PD-L1, el método comprende poner en contacto las células o el tejido con un agente de obtención de imágenes contra PD-L1 descrito en el presente documento y detectar o cuantificar el tejido que expresa PD-L1 usando tomografía de emisión de positrones.
Se divulgan también en el presente documento los métodos para detectar un tumor que expresa PD-L1 que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de obtención de imágenes descrito en el presente documento a un sujeto que tiene un tumor que expresa PD-L1, y detectar las emisiones radioactivas de dicho agente de obtención de imágenes en el tumor usando tomografía de emisión de positrones, en donde las emisiones radioactivas se detectan en el tumor.
Se divulgan también en el presente documento métodos de diagnóstico de la presencia de un tumor que expresa PD-L1 en un sujeto, comprendiendo el método
(a) administrar a un sujeto que lo necesita un agente de obtención de imágenes contra-PD-L1 descrito en el presente documento; y
(b) obtener una radioimagen de al menos una porción del sujeto para detectar la presencia o la ausencia del agente de obtención de imágenes;
en donde la presencia y la ubicación del agente de obtención de imágenes por encima del fondo es indicativa de la presencia y la ubicación de la enfermedad.
Se divulgan también en el presente documento los métodos para controlar el progreso de una terapia antitumoral contra tumores que expresan PD-L1en un sujeto, comprendiendo el método
(a) administrar a un sujeto que lo necesita un agente de obtención de imágenes contra PD-L1 descrito en el presente documento en un primer punto temporal y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto para determinar el tamaño del tumor;
(b) administrar una terapia antitumoral al sujeto;
(c) administrar al sujeto el agente de obtención de imágenes en uno o más puntos temporales posteriores y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto en cada punto temporal;
en donde la dimensión y la ubicación del tumor en cada punto temporal son indicativas del progreso de la enfermedad.
Obtención de imágenes con PET
Normalmente, para los fines de la obtención de imágenes con PET, es deseable proporcionar al receptor una dosificación de adnectina que esté en el intervalo de aproximadamente 1 mg a 200 mg como una única infusión intravenosa, aunque se puede administrar también una dosificación más baja o más alta según dicten las circunstancias. Normalmente, es deseable proporcionar al receptor una dosificación que esté en el intervalo de aproximadamente 1 mg a 10 mg por metro cuadrado de área de superficie corporal de la proteína o péptido para el adulto típico, aunque se puede administrar también una dosificación más baja o más alta según dicten las circunstancias. Ejemplos de dosificaciones de proteínas o péptidos que se pueden administrar a un sujeto humano para fines de obtención de imágenes son aproximadamente 1 a 200 mg, aproximadamente 1 a 70 mg, aproximadamente 1 a 20 mg, y aproximadamente 1 a 10 mg, aunque se pueden usar dosis mayores o menores.
En ciertas realizaciones, se produce la administración en una cantidad de adnectina radiomarcada de entre aproximadamente 0,005 jg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal por día, normalmente entre 0,02 jg/kg de peso corporal a aproximadamente 3 jg/kg de peso corporal. La masa asociada a un trazador PET está en forma del isótopo natural (por ejemplo, 19F para un trazador PET 18F). Una dosificación analítica concreta para la presente composición incluye de aproximadamente 0,5 |jg a aproximadamente 100 |jg de una proteína radiomarcada. La dosificación será normalmente de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 50 jg de una proteína radiomarcada.
los regímenes de dosificación se ajustaron para proporcionar la cantidad detectable óptima para obtener una imagen clara del tejido o las células que capta la adnectina radiomarcada. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma farmacéutica unitaria, como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a los que se va a administrar la adnectina radiomarcada. La memoria descriptiva de las formas farmacéuticas unitarias descritas en el presente documento, están dictadas por, y son directamente dependientes de (a) las características únicas de la porción directora de la adnectina radiomarcada; (b) el tejido o las células que se van a dirigir; (c) las limitaciones en la tecnología de obtención de imágenes usadas.
Para la administración de la adnectina radiomarcada, la dosificación utilizada dependerá del tipo de enfermedad, del compuesto director utilizado, la edad, la dolencia física, y el género del sujeto, el grado de la enfermedad, el sitio que se va a examinar, y otros. En particular, se ha de tener cuidado suficiente acerca de las dosis de exposición de un sujeto. Preferentemente, una dosis de saturación (por ejemplo, 18F o 64Cu) se administra al paciente. Por ejemplo, la cantidad de adnectina etiquetada con 18F varía usualmente de 3,7 megabecquerelios a 3,7 gigabecquerelios, y preferentemente de 18 megabecquerelios a 740 megabecquerelios. Como alternativa, la dosificación puede medirse en milicurios, por ejemplo. En algunas realizaciones, la cantidad de los estudios de obtención de imágenes para administrar la obtención de imágenes con 18F es de 5 a 10 mCi. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz será la cantidad de compuesto suficiente para producir emisiones en el intervalo de aproximadamente 1-5 mCi.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden variarse con el fin de obtener una cantidad del principio activo que es eficaz para conseguir la adnectina en las células o tejidos de un paciente concreto, una composición y un modo de administración, sin que sea tóxica para el paciente. Se entenderá, sin embargo, la utilización diaria total de la adnectina radiomarcada de la presente divulgación la decidirá el médico a cargo del tratamiento u otro profesional a cargo del tratamiento según el alcance del criterio médico. El nivel de dosis específico eficaz para cualquier sujeto en particular dependerá de diversos factores, incluyendo, por ejemplo, la actividad de la composición específica empleada; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, y la dieta del hospedador; el tiempo de administración; la ruta de administración; la tasa de excreción del compuesto empleado concreto; la duración del tratamiento; otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados junto con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, la dolencia, el estado de salud general y los antecedentes médicos previos del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. En ciertas realizaciones, la cantidad de adnectina radiomarcada administrada en un sujeto humano requerida para la obtención de imágenes lo determinará el médico a cargo del tratamiento variando generalmente la dosificación de acuerdo con la cantidad de emisión procedente del radionucleido.
Una composición descrita en el presente documento se puede administrar a través de una o más vías de administración utilizando uno o más de diversos métodos conocidos en la técnica. Como apreciarán lo expertos en la técnica, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administración preferidas para la adnectina radiomarcada descritas en el presente documento incluyen las rutas intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras rutas parenterales de administración, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, normalmente, mediante inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión.
Como alternativa, se puede administrar una adnectina radiomarcada descrita en el presente documento mediante una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.
En ciertas realizaciones, se puede formular la adnectina radiomarcada descrita en el presente documento asegurar la distribución in w'voadecuada. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHM) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Los agentes pueden cruza la BHM formulándolos, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, los documentos de Patentes de Estados Unidos 4.522.811; 5.374.548 y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más grupos que se transportan de manera selectiva en células u órganos específicos, mejorando de este modo la administración dirigida a fármaco (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los restos dirigidos ilustrativos incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de la proteína A del tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol.
1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994).
Procedimiento PET ilustrativo
El siguiente proceso ilustrativo puede utilizarse cuando se llevan a cabo estudios de obtención de imágenes de PET en pacientes en un escenario clínico. Se insertó un catéter venoso 20 G de dos pulgadas en la vena ulnar contralateral para la administración de un radiotrazador. La administración del trazador PET está a menudo programada para coincidir con el tiempo máximo (T máx) o mínimo (T mín) de la concentración de la adnectina contra PD-L1 en la sangre.
El paciente se coloca en la cámara PET y se administra una dosis de trazador del trazador PET de la adnectina contra PD-L1 radiomarcado tal como [18F]-ADX_5417_E01 (<20 mCi) mediante un catéter i.v. Se toman muestras de sangre tanto arterial como venosa en 15 intervalos de tiempo adecuados mediante el análisis de PET a fin de analizar y cuantificar la fracción de trazador PET sin metabolizar de [18F]-ADX_5417_E01 en plasma. Se adquirieron imágenes hasta 120 min. En los diez minutos de la inyección del radiotrazador y al final de la sesión de obtención de imágenes, se obtuvieron muestras de sangre de 1 ml para determinar la concentración en plasma de cualquier adnectina sin marcar contra PD-L1 que pueden haberse administrado antes que el trazador PET.
Se obtuvieron imágenes tomográficas a través de la reconstrucción de imágenes. Para determinar la distribución del radiotrazador, se extraen las regiones de interés (ROI) de la imagen reconstruida incluyendo, aunque no de forma limitativa, los pulmones, hígado, corazón, riñón, piel, u otros órganos y tejidos (por ejemplo, tejido canceroso). Los radiotrazadores que cantan en el tiempo estas regiones se usan para generar curvas de actividad en el tiempo (TAC) obtenidas en ausencia de cualquier intervención o en presencia de la adnectina sin marcar contra PD-L1 en los diversos paradigmas de dosificación examinados. Se expresan los datos como radioactividad por unidad de tiempo por unidad de volumen (|jci/cc/mCi de dosis inyectada).
X. Detección de PD-L1 con adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano
Además de detectar PD-L1 in vivo, se pueden usar adnectinas contra PDLl, tales como los descritas en el presente documento, para detectar una molécula diana en una muestra. Un método puede comprender poner en contacto la muestra con una adnectina dirigida contra PD-L1 humano descrita en el presente documento, en donde dicha puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la formación del complejo diana de la adnectina contra PD-L1; y detectar dicho complejo, detectando por tanto dicha diana en dicha muestra. La detección puede realizarse usando cualquier técnica reconocida en la materia, tales como, por ejemplo, radiografía, inmunoensayo, detección por fluorescencia, espectroscopía de masas, o resonancia de plasmón superficial. La muestra puede ser de un ser humano u otro mamífero. Para fines diagnósticos, los agentes apropiados son marcadores detectables que incluyen radioisótopos, para la imagen completa, y radioisótopos, enzimas, marcadores fluorescentes y otras etiquetas de anticuerpo adecuadas para el ensayo de la muestra.
Los marcadores detectables pueden ser de los diversos tipos usados actualmente en el campo del diagnóstico in vitro, incluyendo marcadores en forma de partículas que incluyen metal tal como oro coloidal, isótopos tales como I125 o Tc99 presentados por ejemplo con un agente quelante peptídico del tipo N2S2, N3S o N4, cromóforos incluyendo marcadores fluorescentes, biotina, marcadores luminiscentes, marcadores fosforescentes y similares, así como marcadores enzimáticos que convierten un sustrato dado en un marcador detectable, y etiquetas de polinucleótidos que se revelan después de la amplificación tal como por reacción en cadena de la polimerasa. Entonces, un anticuerpo biotinilado será detectable por unión a avidina o estreptavidina. Los marcadores enzimáticos adecuados incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y similares. Por ejemplo, el marcador puede ser la enzima fosfatasa alcalina, detectada midiendo la presencia o la formación de quimioluminiscencia después de la conversión de sustratos de 1,2 dioxetano tal como adamantil metoxi fosforiloxi fenil dioxetano (AMPPD), 3-(4-(metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo{3.3.1.1 3,7}decan}-4-il) fenil fosfato de disodio (CSPd), así como CDP y CDP-star® u otros sustratos luminiscentes bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, los quelatos de lantánidos adecuados tales como Terbio(III) y Europio(III). Otras etiquetas incluyen aquellas que se muestran anteriormente en la sección de obtención de imágenes. los medios de detección se determinan por la marca seleccionada. Se puede conseguir la aparición del marcador o de sus productos de reacción a simple vista, en el caso en el que el marcador está en forma de partículas y se acumule a niveles adecuados o usando instrumentos tales como un espectrofotómetro, un luminómetro, un fluorímetro, y similares, todo de acuerdo con la práctica convencional.
En ciertas realizaciones, los métodos de conjugación dan como resultado enlaces que son sustancialmente (o casi) no inmunógenos, por ejemplo, enlaces peptídicos (es decir, amida-), de sulfuro-, (estéricamente impedido), disulfuro­ , hidrazona-, y éter. Estos enlaces son casi no inmunógenos y muestran estabilidad razonable dentro del suero (véase, Senter, P.D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; documento WO 2009/059278; WO 95/17886).
Dependiendo de la naturaleza bioquímica del resto y la adnectina, se pueden emplear diferentes estrategias de conjugación. En el caso en el que el resto sea un polipéptido de origen natural o recombinante de entre 50 a 500 aminoácidos, existen procedimientos convencionales en los libros de texto que describen la química para la síntesis de los conjugados de proteínas, los cuales pueden ser fácilmente seguidos por los expertos (véase, por ejemplo, Hackenberger, C. P. R., y Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074). En una realización la reacción de un resto maleimido con un resto cisteína en la adnectina o se usa el resto. Como alternativa, se llevó a cabo el acoplamiento al extremo C de la adnectina. Se puede realizar la modificación en el extremo C de una proteína como se describe en, por ejemplo, Sunbul, M. y Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371). Cuando el resto es un péptido o polipéptido, la adnectina y el resto se pueden fusionar mediante fusión genética convencional, opcionalmente con a enlazador divulgado en el presente documento.
En general, la reacción específica de sitio y el acoplamiento covalente se basan en la transformación de un aminoácido natural en un aminoácido con una reactividad que es ortogonal a la reactividad de los otros grupos funcionales presentes. Por ejemplo, una cisteína específica dentro de un contexto de secuencia raro se puede convertir enzimáticamente en un aldehído (véase Frese, M. A., y Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). También es posible obtener una modificación de aminoácidos deseada usando la reactividad enzimática específica de determinadas enzimas con un aminoácido natural en un contexto de secuencia dado (véase, por ejemplo, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136. La formación catalizada por proteasa de enlaces C-N se describe en Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403.
La reacción específica a sitio y el acoplamiento covalente también se puede conseguir mediante la reacción selectiva de los aminoácidos terminales con reactivos modificantes apropiados. La reactividad de una cisteína N-terminal con benzonitrilos (véase, Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662) se puede usar para conseguir un acoplamiento covalente específico a sitio. la ligadura química nativa también puede depender de los restos de cisteína del extremo C ((Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96). El documento EP 1074563 describe un método de conjugación que se basa en la reacción más rápida de una cisteína dentro de un tramo de aminoácidos negativamente cargados que una cisteína localizada en un tramo de aminoácidos positivamente cargados.
El resto también puede ser un péptido sintético o un mimético peptídico. En el caso de que un polipéptido se sintetice químicamente, se pueden incorporar aminoácidos con reactividad química ortogonal durante tal síntesis (véase, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Debido a que está en juego y se puede introducir una gran diversidad de grupos funcionales ortogonales en un péptido sintético, la conjugación de tal péptido a un enlazador es química convencional.
Para obtener un polipéptido monomarcado el conjugado con estequiometría 1:1 se puede separar mediante cromatografía de otra conjugación de productos secundarios. Este procedimiento se puede facilitar usando un miembro del par de unión marcado por colorante y un enlazador cargado. Usando este tipo de miembro del par de unión marcado y cargado de forma altamente negativa, los polipéptidos mono conjugados se separan fácilmente de polipéptidos no marcados y polipéptidos que portan más de un enlazador, puesto que la diferencia en carga y el peso molecular se pueden usar para la separación. El colorante fluorescente puede ser útil para purificar el complejo de componentes no unidos, como un enlazador monovalente marcado.
XI. Síntesis de adnectinas etiquetadas con18F dirigidas contra PD-L1 humano
Se pueden sintetizar adnectinas contra PD-L1 etiquetadas con 18F preparando en primer jugar un grupo prostético radiomarcado con 18F, unión de una adnectina a un agente quelante convencional, y a continuación combinar estos dos reactivos (véase, por ejemplo, Figura 9).
Grupos prostéticos radiomarcados con 18F
En un aspecto, se proporciona en el presente documento un compuesto radiomarcado con 18F que contiene un grupo prostético para su uso en una reacción bioortogonal que implica una cicloadición 1,3-dipolar entre una azida y un ciclooctino que procede selectivamente en condiciones tolerantes de agua. Los grupos prostéticos radiomarcados con 18F divulgados en el presente documento son solubles en un medio acuoso al 100 %, y no existe necesidad para una fase orgánica de unirse en los grupos prostéticos a las adnectinas contra PD-L1 divulgadas en el presente documento. Esta característica es particularmente ventajosa ya que no existe necesidad de que se una la fase orgánica al grupo prostético de las adnectinas contra PD-L1 humano, que no puede soportar ni siquiera pequeñas cantidades de disolventes orgánicos, dados los programas de adición y agregación.
Adicionalmente, a diferencia de los grupos prostéticos alifáticos, la reacción de fluoración de 18F se puede controlar con UV, y los grupos prostéticos radiomarcados con 18F-descritos en el presente documento no son volátiles. Asimismo, los grupos prostéticos radiomarcados con 18F pueden incorporarse en las adnectinas contra PD-L1 usando una química de clic exenta de cobre, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos, evitando por tanto los problemas de estabilidad observados en algunos productos biológicos cuando se usa la química de clic mediada por cobre.
En un aspecto, se proporciona en el presente documente una piridina PEGilada 18F-unida covalentemente a una azida con la siguiente estructura,
Figure imgf000035_0001
en donde x es un número entero de 1 a 8. En ciertas realizaciones, x es un número entero de 2 a 6. En algunas realizaciones x es un número entero de 3 a 5. En ciertas realizaciones, x es 4. En ciertas realizaciones, 18F está unido a la piridina en posición orto respecto del átomo N. En ciertas realizaciones, el resto [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-3 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina. En ciertas realizaciones, el resto [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-2 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina. En ciertas realizaciones, el resto [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-4 con respecto al nitrógeno en el anillo de piridina.
En ciertas realizaciones, el compuesto radiomarcado con 18F tiene la estructura
Figure imgf000035_0002
en donde x es un número entero de 1 a 8. En ciertas realizaciones, x es un número entero de 2 a 6. En algunas realizaciones x es un número entero de 3 a 5. En ciertas realizaciones, x es 4.
En ciertas realizaciones, el compuesto radiomarcado con 18F tiene la estructura
Figure imgf000035_0003
en donde x es un número entero de 1 a 8. En ciertas realizaciones, x es un número entero de 2 a 6. En ciertas realizaciones x es un número entero de 3 a 5. En ciertas realizaciones, x es 4.
En ciertas realizaciones, el compuesto radiomarcado con 18F es [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (18F-FPPEGA) y tiene la estructura
Figure imgf000035_0004
En ciertas realizaciones, el grupo prostético radiomarcado con 18F puede contener grupos adicionales en el anillo de piridina que no interfieren con la reacción de fluoración. En ciertas realizaciones, las adiciones al anillo de piridina incluyen grupos alquilo Ci-6, por ejemplo metilo, etilo y propilo.
En ciertas realizaciones, el grupo prostético radiomarcado con18F es un sistema de anillo fusionado con la siguiente estructura:
Figure imgf000035_0005
en donde "OPEG" es [O(CH2)2]x, y x es un número entero de 1 a 8. En ciertas realizaciones, x es un número entero de 2 a 6. En ciertas realizaciones x es un número entero de 3 a 5. En ciertas realizaciones, x es 4.
Los grupos prostéticos radiomarcados con 18F descritos en el presente documento pueden producirse usando las reacciones químicas descritas en los Ejemplos descritos en el presente documento.
Se proporciona también en el presente documento un método para preparar una 18F-piridina PEGilada unida covalentemente a una azida con la siguiente estructura,
Figure imgf000036_0001
en donde x es un número entero de 1 a 8, comprendiendo el método las etapas de
(a) proporcionar una solución de un compuesto a con la siguiente estructura:
Figure imgf000036_0002
en donde x es un número entero de 1 a 8, y R es NO2, Br, F o
Figure imgf000036_0003
y es orto para el átomo N del anillo de piridina;
(b) proporcionando una mezcla de 18F en agua con 18O agua, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano y una base débil;
c) secar la muestra de la etapa b) para formar un sólido; y
d) hacer reaccionar la solución de la etapa a) con el sólido de la etapa c) para formar el compuesto etiquetado con 18F
En ciertas realizaciones, el método produce un grupo prostético de 18F-piridina con la siguiente estructura b
Figure imgf000036_0004
(donde 18F es orto para el átomo N), e incluye las etapas de
a) proporcionar una solución del compuesto de la estructura
Figure imgf000036_0005
(donde X es orto para el átomo N) donde X es NO2, Br o
Figure imgf000037_0001
b) proporcionar una mezcla de 18F enagua con 18O, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiddo[8.8.8]hexacosano y una base débil, tal como K 2 CO 3 ;
c) secar la muestra de la etapa b) para formar un sólido; y
d) hacer reaccionar la solución de la etapa a) con el sólido de la etapa c) para formar el compuesto etiquetado con 18F
En ciertas realizaciones, el método comprende además la etapa de producir un compuesto con la siguiente estructura a
Figure imgf000037_0002
de acuerdo con el Esquema I que se muestra a continuación:
Figure imgf000037_0003
En ciertas realizaciones, el método comprende producir un grupo prostético de 18F-piridina que es [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (18F-FPPEGA), e, a partir de d de acuerdo con las siguientes condiciones de reacción:
Adnectinas PD-L1 radiomarcadas con 18F
En algunos aspectos, se proporcionan en el presente documento sondas o agentes radiomarcados con 18F con la siguiente estructura,
Figure imgf000038_0001
en donde la proteína es una adnectina de PD-L1 y x es un número entero de 1 a 8. En ciertas realizaciones, x es un número entero de 2 a 6. En ciertas realizaciones x es un número entero de 3 a 5. En algunas realizaciones, x es 4.
BFC
Están disponibles en el mercado los restos quelantes o conjugantes bifuncionales (BFC) que se pueden usar en las composiciones radiomarcadas con 18F divulgadas en el presente documento (por ejemplo, Sigma Aldrich; Click Chemistry Tools), o se pueden sintetizar de acuerdo con reacciones químicas bien conocidas.
En ciertas realizaciones, el BFC se selecciona entre agentes quelantes basados en ciclooctino (por ejemplo, DBCO, DIBO), DFO, DOTA y sus derivados (CB-DO2A, 3p-C-DEPA, TCMC, Oxo-DO3A), TE2A, CB-TE2A, CB-TE1A1P, CB-TE2P, MM-TE2A, DM-TE2A, diamsar y los derivados, NODASA, NODAGA, NOTA, NETA, TACN-TM, DTPA, 1B4M-DTPA, CHX-A"-DTPA, TRAP (PRP9), NOPO, AAZTA y los derivados (DATA), H2dedpa, H4octapa, gazapa, H5decapa, Hsfospa, HBED, SHBED, BPCA, CP256, PCTA, HEHA, PEPA, EDTA, TETA, y TRITA basados en los agentes quelantes, y los análogos cercanos y sus derivados. Las combinaciones adecuadas de agentes quelantes y radionucleidos se describen extensamente en Price et al., Chem Soc Rev 2014;43:260-90.
En ciertas realizaciones, el BFC es un ciclooctino que comprende un grupo reactivo que forma un enlace covalente con una amina, carboxilo, carbonilo o un grupo tiol funcional en la proteína o péptido director. Los grupos reactivos en el ciclooctino incluyen ésteres, ácidos, grupos hidroxilo, grupos aminooxi, maleimidas, a-halogencetonas y ahalogenocetamidas.
En ciertas realizaciones, el BFC es un ciclooctino que es dibenzociclooctino (DIBO), biarilazaciclooctinona (BARAC), dimetoxiazaciclooctino (DIMAC) y dibenzociclooctino (DBCO). En ciertas realizaciones, el ciclooctino es DBCO.
En ciertas realizaciones, el ciclooctino comprende un brazo separador con polietilenglicol (PEG)y, en donde y es un número entero de 1 a 8. En ciertas realizaciones, y es un número entero de 2 a 6. En ciertas realizaciones, y es 4 o 5.
En ciertas realizaciones, el BFC es éster de DBCO-PEG4-NHS o éster de DBCO-Su/fo-NHS que reaccionan específica y eficazmente con una amina primaria (por ejemplo, la cadena lateral de restos de lisina o de superficies revestidas de aminosilano). En ciertas realizaciones, el BFC es DBCO-PEG4-ácido con el extremo de ácido carboxílico (-COOH) que puede hacerse reaccionar con grupos de amina primaria o secundaria en presencia de activadores (por ejemplo, EDC) que forman un enlace amida estable. En ciertas realizaciones, el BFC es DBCO-PEG4-Amina que reacciona con grupos carboxilo en presencia de activadores (por ejemplo, EDC, o DCC) o con ésteres activados (por ejemplo, ésteres NHS) que forman enlaces amida estables.
En ciertas realizaciones, el BFC es DBCO-PEG4-maleimida que reacciona con grupos sulfhidrilo en restos de cisteína, por ejemplo, en o próximos al extremo C del polipéptido.
En ciertas realizaciones, el polipéptido está modificado en su extremo C mediante la adición de una cisteína. Por ejemplo, PmCn se puede unir al resto aminoácido del extremo C del polipéptido, en donde P es prolina, C es cisteína, m es un número entero que es al menos 0, y n es un número entero que es al menos 1. Los métodos para preparar dichas modificaciones son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, la sonda o agente radiomarcado con 18F tiene la siguiente estructura a,
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en donde el BFC se conjuga a la proteína (por ejemplo, una adnectina contra PD-L1) en un resto cisteína.
Los agentes de direccionamiento radiomarcados con 18F descritos en el presente documento se producen usando la química de clic bioortogonal exenta de metales, en un medio adecuado para el uso directo in vivo (por ejemplo, solución salina) de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.
XII. Métodos terapéuticos
Inmunoterapia de pacientes con cáncer usando una adnectina contra PD-L1
PD-L1 es el ligando de PD-1 primario regulado en exceso en tumores sólidos, donde puede inhibir la producción de citoquinas y la actividad citolítica de los linfocitos T CD4+ y CD8+ infiltrantes de tumores positivos para PD-1, respectivamente (Dong et al, 2002; H. et al, 2010; Taube et al, 2012). Estas propiedades convierten a PD-L1 en una diana prometedora para la inmunoterapia contra el cáncer. Por ejemplo, los ensayos clínicos con inmunoterapia contra PD-L1, como se describen en el documento WO2013/173223 demuestran que el bloqueo del mAb del ligando inhibidor inmunitario, PD-L1, produce una regresión del tumor duradera y prolongada (> 24 semanas) y una estabilización de la enfermedad en pacientes con NSCLC, MEL, RCC y OV metastásicos, incluyendo aquellos con una extensa terapia anterior. Por consiguiente, el direccionamiento a PD-L1, por ejemplo, usando las adnectinas de PD-L1, es adecuado para estimular una respuesta contra un tumor.
Basándose en los datos clínicos divulgados en el documento WO2013/173223, se describen en el presente documento métodos para realizar una inmunoterapia de un sujeto que padece cáncer, cuyo método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una adnectina de PD-L1 descrita en el presente documento. La divulgación también proporciona un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una adnectina de PD-L1 descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
Los métodos detallados para tratar a un sujeto con cáncer mediante el direccionamiento de PD-L1 se describen en el documento WO2013/173223.
En ciertas realizaciones, las adnectinas de PD-L1 descritas en el presente documento, que son adecuadas para usar en los métodos descritos en el presente documento, que tiene uno o más de las siguientes características: unión de alta afinidad con PD-L1 humana, aumento de la proliferación de linfocitos T, aumenta la secreción de IL-2, por ejemplo, de linfocitos T, aumenta la producción de interferón-y, por ejemplo, de linfocitos T, inhibe la unión de PD-L1 a PD-1, y revierte el efecto supresor de los linfocitos T reguladores sobre las células efectoras y/o las células dendríticas de los linfocitos T.
Conjugados de fármaco adnectina (Adnectina-DC)
Las adnectinas descritas en el presente documento pueden conjugarse a través de una cisteína, por ejemplo, una cisteína en el extremo C, a un agente terapéutico para formar un inmunoconjugado tal como un conjugado de fármaco adnectina ("Adnectina-DC").
En una Adnectina-DC, la adnectina se conjuga a un fármaco, funcionando el adnectina-DC como un agente dirigido para dirigir la adnectina a una célula diana que expresa su antígeno, tal como una célula cancerosa. Preferentemente, el antígeno es un antígeno asociado a tumor, es decir, uno que se expresa o expresa en exceso de forma única por la célula cancerosa. Una vez allí, el fármaco se libera, o bien dentro de la célula diana o en su vecindad, para actuar como un agente terapéutico. Para una revisión del mecanismo de acción y del uso de conjugados de fármacos que se utilizan con anticuerpos, por ejemplo, en terapia contra el cáncer, véase Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147.
Los agentes terapéuticos adecuados para su uso en conjugados de fármacos incluyen antimetabolitos, agentes alquilantes, aglutinantes de la ranura menor del ADN, intercaladores de ADN, reticulantes de ADN, inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de exportación nuclear, inhibidores del proteosoma, inhibidores de topoisomerasa I o II, inhibidores de la proteína de choque térmico, inhibidores de tirosina quinasa, antibióticos, y agentes anti-mitóticos. En una adnectina-DC, la adnectina y el agente terapéutico se conjugan preferentemente mediante un enlazador escindible tal como un peptidilo, disulfuro o hidrazona. Más preferentemente, el enlazador es un enlazador de peptidilo tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 169), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, o Glu. La Adnectina-DC puede prepararse de acuerdo con métodos similares a los descritos en las pat de EE.UU. números 7.087.600; 6.989.452 y 7.129.261; Los documentos de publicación PCT WO 02/096910; documento WO 07/038658; documento WO 07/051081; documento WO 07/059404; documento WO 08/083312; y WO 08/103693; Los documentos de publicación de patente de Estados Unidos 20060024317; 20060004081 y 20060247295. Un enlazador puede unirse por sí mismo, por ejemplo, unirse covalentemente, por ejemplo, usando química de maleimida, a una cisteína del polipéptido, por ejemplo, una cisteína en o próxima al extremo C del polipéptido, por ejemplo, una cisteína de un resto PmCn que está unida a un resto aminoácido del extremo C del polipéptido, en donde m es un entero que es al menos 0 (por ejemplo, 0, 1 o 2) y n es un entero que es al menos al menos 1 (por ejemplo, 1 o 2). Por ejemplo, un enlazador puede estar unido covalentemente a una cisteína, tal como una cisteína en la región del extremo C de una adnectina, por ejemplo, una cisteína del extremo C en el PC de una adnectina DC-PmCn, en donde m y n son independientemente un entero que es al menos uno. Por ejemplo, un enlazador puede unirse a una adnectina-DC-PmCn, en donde P es una prolina, C es una cisteína, y m y n son números enteros que son al menos 1, por ejemplo, 1-3. En ciertas realizaciones, m es cero, es decir, la cisteína no está precedida por una prolina. Se puede llevar a cabo la ligadura a una cisteína como se conoce en la técnica usando la química de la maleimida (por ejemplo, Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96). Para unir un enlazador a una cisteína sobre una adnectina, el enlazador puede, por ejemplo comprender un resto maleimida, cuyo resto reacciona después con la cisteína para formar un enlace covalente. En ciertas realizaciones, los aminoácidos que rodean la cisteína están optimizados para facilitar la reacción química. Por ejemplo, una cisteína puede estar rodeada por aminoácidos cargados negativamente para una reacción más rápida con respecto a una cisteína que está rodeada por un tramo de aminoácidos cargados positivamente (documento EP 1074563).
Para el tratamiento del cáncer, el fármaco preferentemente es un fármaco citotóxico que causa muerte de la célula cancerosa dirigida. Los fármacos citotóxicos que se pueden usar en adnectinas-DC incluyen los siguientes tipos de compuestos, y sus análogos y derivados:
(a) enediinas tales como caliqueamicina (véase, por ejemplo, Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 y 3466) y uncialmacina (véase, por ejemplo, Davies et al, documento WO 2007/038868 A2 (2007) y Chowdari et al., documento US 8.709.431 B2 (2012));
(b) tubulisinas (véase, por ejemplo, Domling et al., documento US 7.778.814 B2 (2010); Cheng et al., documento US 8.394.922 B2 (2013); y Cong et al., documento US 2014/0227295 A1;
(c) CC-1065 y duocarmicina (véase, por ejemplo, Boger, documento US 6.5458.530 B1 (2003); Sufi et al., documento US 8.461.117 B2 (2013); y Zhang et al., documento US 2012/0301490 A1 (2012));
(d) epotilonas (véase, por ejemplo, Vite et al., documento US 2007/0275904 A1 (2007) y US RE42930 E (2011)); (e) auristatinas (véase, por ejemplo, Senter et al., US 6.844.869 B2 (2005) y Doronina et al., documento US 7.498.298 B2 (2009));
(f) dímeros de pirrolobezodiazepina (PBD) (véase, por ejemplo, Howard et al., documento US 2013/0059800 A1(2013); documento US 2013/0028919 A1 (2013); y documento WO 2013/041606 A1 (2013)); y
(g) maitansinoides tales como DM1 y DM4 (véase, por ejemplo, Chari et al., documento US 5.208.020 (1993) y Amphlett et al., documento US 7.374.762 B2 (2008)).
Cánceres tratables por las adnectinas de PD-L1
Las adnectinas de PD-L1 descritas en el presente documento pueden ser adecuadas para usar en el tratamiento de una amplia gama de cánceres, incluyendo el tratamiento del NSCLC refractario metastásico, que generalmente no se considera que es inmunosensible. Los cánceres ilustrativos que se pueden tratar usando las adnectinas de PD-L1 descritas en el presente documento incluyen MEL (por ejemplo, melanoma metastásico maligno), RCC, NSCLC escamoso, CPNM no escamoso, CRC, cáncer de ovario (OV), cáncer gástrico (GC), cáncer de mama (BC), carcinoma pancreático (PC), y carcinoma de esófago. Adicionalmente, las adnectinas de PD-L1 descritas en el presente documento son adecuadas para su uso en el tratamiento de neoplasias resistentes a tratamiento o recurrentes.
Los ejemplos no limitantes de cánceres que se pueden tratar usando las adnectinas PD-L1, basados en las indicaciones de una aplicabilidad muy ampla de la inmunoterapia contra PD-L1 divulgada en el documento WO2013/173223, incluyen el cáncer de hueso, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer renal, cáncer de útero, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, carcinomas de ovario, tubo digestivo y mama, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas, incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma pituitario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer escamocelular, linfoma de linfocitos T, mieloma múltiple, cánceres inducidos ambientalmente que incluyen aquellos inducidos por asbesto, cánceres metastásicos, y cualquier combinación de dichos cánceres. Las adnectinas de PD-L1 son también aplicables en el tratamiento de cánceres metastásicos.
Terapia combinada con adnectinas de PD-L1
En ciertas realizaciones, las adnectinas de PD-L1 descritas en el presente documento pueden combinarse con un agente inmunógeno, por ejemplo, una preparación de células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas que soportan antígenos asociados a tumores, y células transfectadas con genes que codifican citoquinas inmunoestimuladoras (He et ah, 2004). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF. el bloqueo de PD-L1 puede también combinarse eficazmente con tratamientos contra el cáncer convencionales, incluyendo regímenes quimioterapéuticos, radiación, cirugía, privación de hormonas e inhibidores de la angiogénesis, así como otros anticuerpos inmunoterapéuticos (por ejemplo, uno contra PD-1, contra CTLA-4, y contra LAG-3 Ab).
Medicamentos y usos de adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano
Las adnectinas contra PD-L1 descritas en el presente documento se pueden usar para la preparación de un medicamento para inhibir la señalización de la ruta PD-1/PD-L1 a fin de potenciar por tanto una respuesta inmunoendógena en un sujeto que padece un cáncer. Esta divulgación proporciona también el uso de cualquier adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento para la preparación de un medicamento para la inmunoterapia de un sujeto que padece un cáncer. La divulgación proporciona usos médicos de cualquier adnectina contra PD-L1 descritos en el presente documento que corresponden a todas las realizaciones de los métodos de tratamiento que emplean una adnectina de PD-L1 descrita en el presente documento.
Se describen también en el presente documento adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece un cáncer que comprende potenciar una respuesta inmunoendógena en un sujeto que padece un cáncer inhibiendo la señalización de la ruta PD-1/PD-L1. La divulgación también proporciona adnectinas contra PD-L1 para usar en la inmunoterapia de un sujeto que padece un cáncer que comprende perturbar la interacción entre PD-1 y PD-L1. Estas adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano pueden utilizarse en la potenciación de una respuesta inmunoendógena contra, o en la inmunoterapia de, la gama completa de cánceres descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, los cánceres incluyen MEL (por ejemplo, MEL maligno metastásico), RCC, NSCLC escamoso, CPNM no escamoso, CRC, cáncer de ovario (OV), cáncer gástrico (GC), cáncer de mama (BC), carcinoma pancreático (PC), y carcinoma de esófago.
Enfermedades infecciosas
También descritos en el presente documento se usan para tratar pacientes que han estado expuestos a toxinas o patógenos particulares. Por ejemplo, en determinados aspectos, esta divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento de tal manera que el sujeto se trata de la enfermedad infecciosa.
Similar a su aplicación a los tumores como se ha analizado anteriormente, Se puede usar el bloqueo de PD-L1 mediado por adnectina solo, o como un adyuvante, en combinación con vacunas, para potenciar una respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas, y/o autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los cuales esta estrategia terapéutica puede ser particularmente útil incluyen patógenos para los cuales no existe actualmente vacuna eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente eficaces. Estos incluyen, pero sin limitación, VIH, Hepatitis (A, B, y C), gripe, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. El bloqueo de PD-L1 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como VIH que presentan antígenos alterados durante una infección. Novedosos epítopos en estos antígenos son reconocidos como extraños en el momento de la administración de la adnectina contra PD-L1, provocando por tanto una fuerte respuesta de linfocitos T que no está disminuida por señales negativas a través de la ruta PD-1/PD-L1.
En los anteriores métodos, el bloqueo de PD-L1 puede combinarse con otras formas de inmunoterapia conocidas en la técnica, tales como el tratamiento con citoquinas (por ejemplo, la administración de interferones, GM-CSF, G-CSF o IL-2).
XIII. Kits y artículos de fabricación
Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 descritas en el presente documento pueden proporcionarse en un kit, a una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones de uso en los métodos terapéuticos o diagnósticos descritos en el presente documento.
Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento o prevención de los trastornos o dolencias descritas en el presente documento o para usar en los métodos de detección descritos en el presente documento. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los envases pueden formarse a partir de diversos materiales tales como vidrio o plástico. El envase puede contener una composición descrita en el presente documento para la obtención de imágenes in vivo, y pueden tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El principio activo de la composición es una adnectina contra PD-L1 descrita en el presente documento. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de paquetes con instrucciones de uso.
En ciertas realizaciones, un kit que comprende uno o más reactivos necesarios para formar un agente de obtención de imágenes in vivo de adnectina dirigidas contra PD-L1 marcada con 18F, tal como una Adnectina-PEG4-DBCO-18F de PD-L1, como se describe además en el presente documento. Por ejemplo, un kit puede comprender un primer vial que comprende una Adnectina-PEG4-DBCO anti-PD-L1 y un segundo vial que comprende [18F]FPPEGA. Un kit puede comprender un primer vial que comprende una Adnectina-PEG4-DBCO anti-PD-L1, un segundo vial que comprende 4-PEG-tosilazida y un tercer vial que comprende 18F en O18 agua. Los kits pueden comprender adicionalmente viales, soluciones y, opcionalmente, reactivos adicionales necesarios para la fabricación de la Adnectina-PEG4-DBCO-18F de PD-L1. De forma similar, los kits pueden comprender los reactivos necesarios para formar una adnectina marcada con 64Cu contra PD-L1, tales como los reactivo descritos en el presente documento.
La invención se describe ahora por referencia a los siguientes ejemplos que son meramente ilustrativo. Aunque la invención se ha descrito con detalle y con referencia a las realizaciones específicas de la misma, será evidente para un experto en la materia que se pueden realizar diversas modificaciones y cambios en las anteriores.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación de adnectinas de unión a PD-L1
Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 se asilaron de una biblioteca de adnectinas cribada con una proteína PD-L1 humana, o se maduraron por afinidad mediante PROfusion a partir de clones identificados en la biblioteca. Las secuencias de longitud completa, secuencias de núcleo, secuencias de los bucles BC, DE y FG de estas adnectinas, así como variantes con un extremo C modificado "PC", se presentan en la Figura 1 y en la Tabla 3.
Por ejemplo, la adnectina contra PD-L1 de alta afinidad, ADX_5322_A02 ("A02"), se obtuvo por maduración de afinidad de la adnectina ATI-964. El gen que codifica ATI-964 se rediversificó introduciendo una pequeña fracción de nucleótidos no naturales en cada posición de nucleótido que codificaba un resto del bucle BC, DE o FG. La biblioteca resultante de secuencias de adnectina relacionada con ATI-964 se sometió a continuación a selección in vitro mediante PROfusion (presentación de ARNm) por la unión a PD-L1 humano en condiciones de rigurosidad elevada. Los clones enriquecidos tras completar la selección se secuenciaron, se expresaron en formato HTPP, y se cribaron según su capacidad para unirse a PD-L1 y por su fracción de monomericidad. El clon con la mejor combinación de afinidad por PD-L1 y propiedades biofísicas sólidas se mutó para incluir una cisteína en el extremo C, primero con la secuencia del extremo C NYRTPCH6 (la forma identificada como ADX_5322_A02), y después con la secuencia del extremo C NYRTPC.
Se siguió el mismo proceso para madurar por afinidad ATI-967, dando como resultado la adnectina ADX_5417_E01. De forma similar, se obtuvieron las ATI_1760_C02, ATI_1760_E01 ("E01") y ATI_1760_F01 maduradas mediante madurar por afinidad de ATI_1422_G05.
Se asilaron adnectinas contra PD-L1 humano adicionales. Sus secuencias se definen en la Tabla 3.
Expresión y purificación de adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano marcadas con his
Todas las construcciones de ADN contenían una etiqueta his en el extremo N seguido de una secuencia de reconocimiento TVMV. Los plásmidos de expresión (vector pET-28 NM) de las adnectinas dirigidas contra PD-L1 anteriormente descritas se transformaron en células BL21(DE3) (New England Biolabs). Las células se hicieron crecer en medio de autoinducción Overnight Express Autoinduction (Novagen) en matraces agitados de 1 l a 37 °C durante 6 horas seguido de 20 °C durante 16 horas a 220 RPM. Las células se recogieron mediante centrifugación y se suspendieron en PBS pH 7,2. Las células se lisaron como mecánicamente, después se clarificaron mediante centrifugación. Las fracciones solubles se ligaron mediante alimentación por gravedad a resina agarosa Ni-NTAresin (Qiagen), se lavaron con Tris 20 mM Imidazol 10 mM pH 8,0, seguido de Tris 20 mM Imidazol 40 mM pH 8,0, y se eluyeron con Tris 20 mM Imidazol 400 mM pH 8,0. Los eluatos de níquel se enriquecieron con proteasa TVMV a un exceso molar de 1:23 veces de adnectina. Las mezclas de eluato TVMV-adnectina se dializaron contra T ris 20 mM pH 8,0 a 4 °C durante 16 horas. Para separar la proteasa y escindir sus fragmentos tag, las muestras se cargaron en una columna HisTrap FF de 10 ml (GE Healthcare) y se recogieron las fracciones de flujo pistón.
Ejemplo 2: Evaluación física de las adnectinas de PD-L1
Se evaluaron las propiedades de unión de ATI-1420D05, ATI-1420D05, AT1-1421E04 y ATI-1422G05, ATI_1760_C02, ATI 1760 E01 y ATI 1760 E01.
Tabla 1: Pro iedades de unión de las adnectinas diri idas contra PD-L1 humano
Figure imgf000043_0002
Las propiedades de unión de las adnectinas ATI-964, ATI-967, ATI-968, ADX_5322_A02 y ADX_5417_E01 contra PD-L1 humano o de macaco, como se determina mediante Biacore, se muestran en la Tabla 2. La unión de las células se determinó midiendo la unión a células L2987 positivas para PD-L1 humano.
Tabla 2: Pro iedades biofísicas de las adnectinas diri idas contra PD-L1 humano
Figure imgf000043_0001
continuación
Figure imgf000044_0001
Los datos de unión indican que las adnectinas contra PD-L1 humano maduradas por afinidad se unen a PD-L1 humano con afinidades que son menores de 1 nM o incluso menores de 0,1 nM. En la Figura 12 se muestran las curvas de inhibición ilustrativas.
Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 tienen las siguientes características adicionales:
- Inhiben la unión de PD-1 humano a PD-L1 humano, según se determinó al medir la inhibición de la unión de PD-1Fc humano a las células L2987 positivas para PD-L1 mediante citometría de flujo y se ha comprobado, por ejemplo, para las adnectinas ATI-964, ATI-965, ATI-966, ATI-967, ATI-968, A02 y E01;
- Inhiben la unión de CD80 (B7-1) humano a PD-L1 humano, según se determinó por ELISA. Por ejemplo, ATI-964 inhibe la unión con una CE50 de 41 pM; ATI-965 inhibe la unión con una CE50 de 210 pM; ATI-966 inhibe la unión con una CE50 de 28 pM; y ATI-968 inhibe la unión con una CE50 de 56 pM;
- Inhiben la unión de anticuerpo dirigido contra PD-L1, 12A4, a PD-L1 humano, según se determinó por ELISA. Los anticuerpos dirigidos contra PD-1 se estudiaron también en una reacción de linfocitos mixtos (MLR): ATI-964, ATI-965 y ATI-968 fueron activos en MLR, mientras que ATI-966 y ATI-967 no fueron activos en MLR.
Los siguientes ejemplos se refieren al marcado de las adnectinas dirigidas contra PD-L1 con 18F y 64Cu.
Ejemplo 3: Preparación de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo
Figure imgf000045_0001
Metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo
Una mezcla de bis(4-metilbencenosulfonato) ((oxibis(etano-2,1-diil))bis(oxi))bis(etano-2,1-diilo) (5 g, 9,95 mmol) y azida sódica (0,647 g, 9,95 mmol) se disolvieron en etanol (50 ml) y la reacción se calentó a reflujo a 90 °C durante un periodo de 17 horas. El disolvente se retiró usando vacío parcial y después se cargó en un cartucho de gel de sílice de 40 gramos y se purificó usando cromatografía ultrarrápida (IscoCombiFlash - eluida usando un método de gradiente lineal partiendo de acetato de etilo al 10 % en hexanos hasta acetato de etilo al 90 % en hexanos durante un periodo de 45 minutos). Las fracciones combinadas se comprobaron mediante TLC y se combinaron para dar 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo en forma de un aceite incoloro. Debido a la naturaleza reactiva del 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo, este material se usó "tal cual" sin ninguna caracterización adicional.
Ejemplo 4: Preparación de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina
Figure imgf000045_0002
3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina
Figure imgf000045_0003
A una suspensión de hidruro sódico (0,129 g, 3,21 mmol) en DMF (10 ml) a 0 °C se añadió gota a gota una solución en agitación de 2-fluoropiridin-3-ol (0,363 g, 3,21 mmol) en DMF (5 ml), seguido de la adición gota a gota de la solución de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (1,00 g, 2,68 mmol) en DMF (5 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C durante 10 min, después se llevó a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de calentamiento adicional a 60 °C durante 4 horas. El disolvente se retiró al vacío. Se añadieron 100 ml de acetato de etilo seguido de 3 extracciones de lavado independientes con una solución de salmuera concentrada. La capa orgánica se secó con sulfato sódico, se filtró y se concentró. El material en bruto se purificó usando cromatografía ultrarrápida (IscoCombiFlash - eluyendo con EtOAc 10 - 50 % en Hex) para dar un aceite incoloro. 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (702 mg, 2,233 mmol, rendimiento del 83 %) se aisló en forma de un aceite transparente. RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 57,75 (dt, J = 4,9, 1,6 Hz, 1H), 7,33 (ddd, J = 10,0, 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,10 (ddd, J = 7,9, 4,9, 0,7 Hz, 1H), 4,30 - 4,16 (m, 2h), 3,95 - 3,83 (m, 2H), 3,80 - 3,61 (m, 10H), 3,38 (t, J = 5,1 Hz, 2H) 13C RMN (101 MHz, CLOROFORMO-d) d 142,3, 137,7, 137,5, 123,4, 123,4, 121,7, 121,6, 77,3, 76,7, 70,9, 70,7, 70,6, 70,0, 69,4, 69,0, 50,6 RMN 19F (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 -83,55. HRMS (ESl) Teoría:C13H20FN4O4+ m/z 315,464; encontrado 315,1463.
Ejemplo 5: Preparación de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina
Figure imgf000046_0001
Hidruro de sodio hidruro (0,121 g, 3,01 mmol) (suspensión al 60 % en aceite) se disolvió en DMF (7.0 ml) y la suspensión resultante se enfrió a 0 °C. Una solución de 2-nitropiridin-3-ol (0,384 g, 2,74 mmol) en DMF (1.5 ml) se añadió lentamente, seguido de la adición gota a gota de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (1,023 g, 2,74 mmol) en DMF (1,5 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C durante 10 minutos, después se llevó a temperatura ambiente durante 2 horas seguido de calentamiento a 60 °C durante un periodo de 72 horas. La reacción se interrumpió con 10 ml de agua DI, seguido de extracción con acetato de etilo (3 x 10 ml). Los extractos de EtOAc combinados se lavaron con una solución de salmuera concentrada (10 ml), se secaron con sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para dar un aceite de color amarillo claro. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida. cartucho de sílice de 24 g, 25 ml/min, partiendo de acetato de etilo al 10 % en hexanos, seguido de un cambio lineal a acetato de etilo al 50 % en hexanos durante un periodo de 25 minutos. Después de este tiempo, el gradiente se mantuvo con esta composición de disolvente durante 10 minutos después se cambió acetato de etilo al 100 % durante un periodo de 10 minutos. La 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina se eluyó entre la porción de 30-40 minutos del cromatograma y las fracciones combinadas se evaporaron a presión reducida, después al vacío durante 2 horas para dar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina (687 mg, 1,973 mmol, rendimiento del 72,0 %) en forma de un aceite de color amarillo claro. RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 58,11 (dt, J = 4,9, 1,6 Hz, 1H), 7,60 (ddd, J = 10,0, 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,52 (ddd, J = 7,9, 4,9, 0,7 Hz, 1H), 4,30 - 4,16 (m, 2H), 3,95 - 3,83 (m, 2H), 3,80 - 3,61 (m, 10H), 3,38 (t, J = 5,1 Hz, 2h) RMN 13C (101 MHz, CLOROFORMO-d) d 147,3, 139,5, 128,4, 124,4. 71,1,70,7, 70,6,70,0, 69,9, 69,3, 50,7. HRMS (ESl) Teoría: C13H20N5O6+ m/z 342,1408; encontrado 342,1409
Ejemplo 6: Síntesis de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-bromopiridina
Figure imgf000047_0001
A la suspensión de hidruro sódico (NaH, 25,7 mg, 0,643 mmol) en dimetilformamida (DMF, 5 ml) a 0 °C se añadió gota a gota una solución de 2-bromopiridin-3-ol (112 mg, 0,643 mmol) en DMF (1 ml), seguido de la adición gota a gota de la solución de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (200 mg, 0,536 mmol) en DMF (1 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C durante 10 minutos, después se llevó a temperatura ambiente y se mantuvo durante 1 hora, seguido de calentamiento a 60 °C durante 4 horas. Tras completarse el calentamiento, el disolvente de la mezcla de reacción en bruto se retiró al vacío. La reacción en bruto se reconstituyó en 50 ml de acetato de etilo, se lavó con 2 x 50 ml de una solución acuosa de salmuera, y la capa orgánica se secó con sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. La reacción en bruto se purificó usando HPLC de fase inversa para dar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-bromopiridina, TFA (112 mg, 0,229 mmol, rendimiento del 42,7 %) en forma de un aceite de color amarillo claro. HRMS ESI m/z (M+H), Teoría C13H20BrN4O4 375,0664 encontrado 375,0662; RMN 1H (400 MHz, DMSO-de) 57,97 (dd, J = 4,6, 1,5 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 8,2, 1,6 Hz, 1H), 7,40 (dd, J = 8,1, 4,6 Hz, 1H), 4,24 (dd, J = 5,3, 3,9 Hz,2H), 3,85 - 3,78 (m, 2H), 3,68 - 3,62 (m, 2H), 3,62 - 3,52 (m, 8h ), 3,42 - 3,34 (m, 2H).
Ejemplo 7: Esquema para la síntesis de un compuesto de trimetilanilinio
Figure imgf000047_0002
3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)
W,A/,A/-trimetilpiridin-2-aminio
Ejemplo 8: Síntesis de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina
Figure imgf000048_0001
3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,W-dimetilpiridin-2-amina
Figure imgf000048_0002
3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-W,W-dimetilpiridin-2-amina
Una mezcla de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (160 mg, 0,509 mmol), carbonato potásico (K2CO3, 84 mg, 0,611 mmol), y dimetilamina (40 % en agua, 0,097 ml, 0,764 mmol) en dimetilsulfóxido (DMSO, 2.5 ml) se calentaron en un recipiente a presión precintado a 110 °C durante 14 horas. Tras completarse el calentamiento, el disolvente de la mezcla de reacción en bruto se retiró al vacío. La reacción en bruto se reconstituyó en 50 ml de acetato de etilo, se lavó con 2 x 50 ml de una solución acuosa de salmuera, y la capa orgánica se secó con sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. La reacción en bruto se purificó usando cromatografía de fase normal para dar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina (140 mg, 0,413 mmol, rendimiento del 81 %) en forma de un aceite incoloro. RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 57,86 (dd, J = 4,9, 1,5 Hz, 1H), 7,02 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz, 1H), 6,73 (dd, J = 7,8, 4,9 Hz, 1H), 4,20 - 4,07 (m, 2H), 3,98 - 3,86 (m, 2H), 3,81 - 3,61 (m, 9H), 3,38 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,13 - 2,94 (m, 6H), 1,69 (s, 2H). HRMS (ESI) Teoría: C15H26N5O4+ m/z 340,1980; encontrado 340,1979.
Ejemplo 9: Síntesis de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio
Figure imgf000049_0001
Se añadió trifluorometanosufonato (0,065 ml, 0,589 mmol) a la solución de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina (40 mg, 0,118 mmol) en tolueno (1.5 ml) en un recipiente sellado herméticamente bajo una corriente de continua de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante un periodo de 14 horas. El disolvente se retiró y el residuo resultante se lavó con 2x 10 ml de éter, se secó azeotrópicamente con 2 x 1 ml de diclorometano, y se secó con vacío de alta presión durante una noche para dar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio, sal de trifluorometanosulfonato, con rendimiento cuantitativo, en forma de un aceite espeso incoloro. CLEM m/z 354,33; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 58,24 - 8,17 (m, 1H), 7,98 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,75 (ddd, J = 8,2, 4,6, 3,2 Hz, 1H), 4,44 (s a, 2H), 3,88 (d, J = 3,9 Hz, 2H), 3,69 -3,45 (m, 21H).
Ejemplo 10: Síntesis de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina usando 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio, sal de trifluorometanosulfonato
Figure imgf000049_0002
Una fase acuosa de solución de [18F]-Fluoruro (2,0 ml, 33,3 GBq/ 900 mCi) se adquirió de P.E.T. Net® Pharmaceuticals en West Point PA y se transfirió directamente a un Sep-Pak light Qm A [El cartucho Sep-Pak light QMA se había preacondicionado secuencialmente con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M, 5 ml de agua desionizada, y 5 ml de MeCN antes del uso]. Tras completarse dicha transferencia, la solución acuosa de [18F] fluoruro se liberó del QMA Sep-Pak mediante la adición secuencial de carbonato potásico (15 mg/ml; 1,1 ml) seguido de una mezcla de carbonato potásico (30 mg/ml, 0,1 ml), 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano (15 mg, 0,04 mmol) y 1,2 ml de MeCN. El disolvente se evaporó bajo una suave corriente de nitrógeno a 90 °C y vacío. El secado azeotrópico se repitió dos veces con porciones de 1 ml de acetonitrilo para generar el complejo de K.2.2.2/K[18F]F anhidro. 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio, sal de trifluorometanosulfonato (2 mg, 5,6 |jmol) se disolvió en 500 microlitros de DMSO y se añadió al criptando seco. Esta solución se calentó a 120 °C durante 10 minutos. Después de este tiempo, la mezcla de reacción en bruto se diluyó con 3 ml de agua DI. Después todo el contenido de la mezcla de reacción en bruto se transfirió, se cargó y se purificó usando HPLC de fase inversa en las siguientes condiciones: Columna HPLC: Luna C18250 x 10 Disolvente A: TFA al 0,1 % en agua DI; disolvente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo a un caudal de 4,6 ml/minuto usando un método isocrático 32 % B mientras la UV se controlaba a 280 nm. Se aisló [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina en la marca de 24 min del cromatograma y se recogió durante un periodo de 2 minutos. Este producto se recogió en un matraz de 100 ml que contenía 10 ml de agua DI y todo el contenido se administró a una Sep-Pak Vac tC18 6 cc 1 g de separación empaquetada de Waters. 6,1 GBq/164 mCi de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se aislaron de esta reacción. Esta se liberó de la sep-pak usando 3 ml de etanol y esta solución se redujo con una fuente de calor a 98 °C, una suave corriente de nitrógeno y vacío durante un periodo de 15 minutos hasta que solo quedó una película en el vial. El producto final se reconstituyó en 1x tampón PBS 100 % y fue estable en dicho medio durante 1 hora a 37 °C.
La [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se puede usar para generar productos biológicos marcados con 18F (por ejemplo, adnectinas dirigidas contra PD-L1 marcadas con18F, como se describe a continuación) aprovechando la reacción de "clic" azida-alquino con los productos biológicos que contienen alquinos adecuados.
Ejemplo 11: Producción de una proteína radiomarcada con 18F usando "química de clic"
A. Fluoración del precursor de 4-PEG-tosil-azida para formar [18F]-FPPEGA
Una actividad de 900 mCi de 18F en 18O agua (3 ml) (adquirida de IBA Molecular) se transfirió directamente a un microvial (no QMA) que contenía 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano (2,8 mg, 7,44 |jmol) y carbonato potásico (1,7 mg, 0,012 mmol). Se transfirieron 2,0 ml adicionales de acetonitrilo a esta mezcla de reacción en bruto y la totalidad de la mezcla se secó azeotrópicamente. Esto se completó por evaporación de la solución usando un baño de aceite a 98 °C, y aplicando una suave corriente de N2 y vacío parcial. El volumen de la solución se redujo a aproximadamente 2 ml. Se añadieron 2 ml más de acetonitrilo y el proceso se repitió 3 veces durante un periodo de 40 minutos. Cuando el volumen de líquido se hubo reducido a menos de 0,3 ml, se añadió una alícuota de 0,7 ml de acetonitrilo, y la solución se redujo mediante destilación azeotrópica adicional hasta que el volumen fue ~0,1 ml. Se añadieron 0,9 ml más de acetonitrilo y este proceso se completó hasta formar un sólido de color blanco. Este proceso tardó ~55 minutos. Durante el procedimiento final, el vial se retiró del baño de aceite antes de que la solución haya llegado a sequedad y el residuo del vial se puso a vacío completo (sin flujo de N2) a temperatura ambiente durante 20 minutos. El tiempo total de transferencia y secado del criptando [18F]-FPpEGA fue de 65 min.
A la mezcla de criptando [18F]-FPPEGA seca se añadió 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina (2 mg, 5,86 jmol) disuelta en 500 microlitros de DMSO y esta mezcla se calentó a 120 °C durante 10 minutos. Después de este tiempo, la mezcla de reacción en bruto se diluyó con 3 ml de agua DI y la totalidad del contenido se transfirió y se cargó después en la siguiente columna de HPLC: y condiciones: Columna HPLC: Luna C18 250 x 10 mm; Disolvente A: TFA al 0,1 % en agua DI; Disolvente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo; caudal 4,6 ml/min; presión 1820 PSI; método isocrático 32 % B; UV- 280 nm. El producto de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina ([18F]-FPPEGA) se aisló en la marca del minuto 24 del cromatograma y se recogió durante un periodo de 2 minutos. Este producto se recogió en un matraz de 100 ml que contenía 15 ml de agua DI y todo el contenido se administró a una Sep Pak Vac tC186 cc 1 g de separación empaquetada. PN WAT036795. El [18F]-FPPEGA se liberó del Sep Pak usando 2,5 ml de etanol y esta solución se redujo con N2 a 98 °C y vacío durante un periodo de 15 minutos hasta sequedad. Este compuesto se disolvió en 0,1 ml 1 X PBS (solución salina tamponada con fosfato). Este producto se analizó usando una columna de HPLC Varian Luna C18 (2) 4,6 x 150 mm Disolvente A: TFA al 0,1 % en agua DI; Disolvente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo; caudal 1,0 ml/min; método del gradiente 0 min 90 % A 10 % B; 15 min 30 % A 70 % B; 17 min 30 % A 70 % B; 18 min 90 % A 10 % B; 20 min 90 % A 10 % B; UV- 280 nm. Se aislaron 220 mCi de [18F]-FPPEGA.
B. Preparación de E01-4PEG-DBCO
Este Ejemplo describe la unión de la adnectina dirigida contra PD-L1, E01, a PEG4-DBCO.
Puesto que se utiliza química de maleimida para unir la adnectina a PEG4-DBCO, en primer lugar, la adnectina E01 se modificó añadiendo una prolina seguido de una cisteína en su extremo C. La secuencia de aminoácidos de esta adnectina E01 modificada se proporciona en el SEQ ID NO: 104. La cisteína se usa para unir la adnectina a PEG4-DBCO.
Un exceso molar de 4 veces de maleimida-PEG4-DBCO (Click Chemistry Tools) se disolvió en DMSO y se añadió a la adnectina E01 modificada purificada en presencia de TCEP 1 mM. Las concentraciones finales de DMSO no superaron el 5 % en las mezclas de conjugación. La mezcla de conjugación se dejó a temperatura ambiente durante una hora antes del análisis por espectrometría de masas. Después de la confirmación de la conjugación por EM, la muestra se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna HiLoad 26/60 Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada en PBS pH 7,2.
C. Acoplamiento de [ 18F]-FPPEGA a adnectina
En las Figuras 2 y 9 se muestra un esquema para sintetizar [18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA.
0,2 ml de una solución de 5,4 mg/ml de la solución de la adnectina E01-4PEG-DBCO (preparada como se ha descrito en la Sección B) se incubó con 200 mCi de 0,1 ml de [18F]-FPPEGA (Ejemplo 4) en 1 X tampón PBS. La solución se mezcló suavemente pipeteando arriba y abajo la reacción en bruto varias veces y se incubó conjuntamente durante 45 minutos a 45 °C o temperatura ambiente. El contenido de esta mezcla de reacción en bruto se purificó usando una columna SEC. Superdex 2000,5 ml/min 1 X tampón PBS y el producto de [18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA se aisló en la marca de 37 min del cromatograma durante un periodo de 2 minutos.
[18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA se analizó por SEC con coinyección del patrón no radioactivo, RP HPLC usando una columna PLRPS y electroforesis en gel.
La cromatografía de exclusión molecular (SEC) se realizó con los siguientes parámetros:
Columna Superdex 200; Disolvente 100 % 1 X tampón PBS; 0,5 ml/min UV 280; HPLC de fase invertida Columna: p Lr PS 8 micrómetros 1000 A 4,6 x 250 mm
Disolvente A: ácido fórmico al 0,1 % en agua DI
Disolvente B: Acetonitrilo
Caudal: 1 ml/min
Presión: 1351 PSI
Gradiente:
0 min 90 % A 10 %
B 30 min 45 %A 55 %
B 32 min 25 % A 75 %
B 36 min 25 % A 75 % B
50 min 90 % A 10 % B
Se aisló [18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA 15 mCi con una pureza radioquímica (RCP) de >99 % por cálculos con SEC y RP HPLC, y con una actividad específica de 0,6 mCi/nmol, cuando la reacción se realizó a 45 °C. Cuando la reacción se realizó a temperatura ambiente, se obtuvo 5,72 mCi. La actividad específica de la [18F]-FPPEGA fue 0,512 mCi/nmol y RCP de 85,7 % 3 horas después de final esta síntesis, cuando la reacción se realizó a 45 °C o temperatura ambiente, respectivamente. La actividad específica se midió con Nanodrop (véase www.nanodrop.com). El producto se eluyó simultáneamente con el patrón no radioactivo en SEC y PLRPS. La electroforesis en gel confirmó un producto de 18F consistente con un patrón de peso molecular 11 kDa.
El E01-4PEG-DBCO radiomarcado con 18 se puede usar en varias aplicaciones de obtención de imágenes in vitro y/o in vivo, que incluyen diagnóstico por imagen, investigación básica y aplicaciones radioterapéuticas. Los ejemplos específicos de posibles aplicaciones en imágenes diagnósticas y en radioterapia, incluyen determinar la ubicación, la actividad relativa y/o cuantificar los tumores positivos para PD-L1, radioinmunoensayo de tumores positivos para PD-L1, y autorradiografía para determinar la distribución de los tumores positivos para PD-L1 en un mamífero o muestra de tejido del mismo.
En particular, el E01-4PEG-DBCO radiomarcado con 18F es útil para obtención de imágenes mediante tomografía de emisión de positrones (PET) de tumores positivos para PD-L1 en el pulmón, corazón, riñones, hígado y piel, y otros órganos de seres humanos y animales experimentales. Las obtención de imágenes PET usando el E01-4PEG-DBCO radiomarcado con 18F puede ser útil para obtener la siguiente información: relación entre el nivel de ocupación del tejido de medicamentos candidatos para el tratamiento de tumores PD-L1 y eficacia clínica en pacientes; selección de dosis para ensayos clínicos de medicamentos para tratar tumores PD-L1 antes de iniciar los estudios clínicos a largo plazo; potencias comparativas de medicamentos para tratar tumores PD-L1 estructuralmente novedosos; investigar la influencia de los medicamentos para tratar tumores PD-L1 sobre la afinidad del transportador in vivo y la densidad durante el tratamiento de dianas clínicas en medicamentos para tratar tumores PD-L1; cambios en la densidad y la distribución de tumores positivos para PD-L1 durante tratamientos eficaces e ineficaces.
Ejemplo 12: Unión de las adnectinas de PD-L1 a NODAGA para generar adnectinas NODAGA-PD-L1
Este Ejemplo describe la unión de las adnectinas E01 y A02 dirigidas contra PD-L1 a NODAGA humano. Puesto que se utiliza química de maleimida para unir las adnectinas a NODAGA, ambas adnectinas utilizan una prolina seguido de una cisteína en su extremo C (como se describe anteriormente para E01). Las secuencias de aminoácidos de las adnectinas E01 y A02 modificadas se proporcionan en los SEQ ID NO: 104 y 88, respectivamente. La cisteína se usará para unir las adnectinas a NODAGA. Para marcar las adnectinas con 64Cu, un exceso molar de 50 veces de maleimida-NODAGA (CheMatech) se disolvió en PBS pH 7,4 y se añadió a las adnectinas purificadas en presencia de TCEP 1 mM. Las concentraciones finales de DMSO no superaron el 5 % en las mezclas de conjugación. Las mezclas de conjugación se dejaron a temperatura ambiente durante una hora antes del análisis por espectrometría de masas. Después de la confirmación de la conjugación por EM, las muestras se purificaron por cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna HiLoad 26/ 60 Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada en PBS pH 7,2.
Ejemplo 13: Síntesis de sondas de adnectina anti-PD-L1 basadas en 64Cu
Síntesis de 64Cu-A02-NODAGA
Cloruro de [64Cu]-cobre (64CuCh) en solución de ácido clorhídrico 0,1 N se neutralizó con 0,8 ml de una solución acuosa de acetato sódico (NaOAc) 0,1 N durante 4 minutos a temperatura ambiente. 1 ml de la solución de 64Cu/NaOAc se añadió a A02-NODAGA (30 pl de 1,6 mg/ml) y la reacción en bruto se pipeteó suavemente para permitir el mezclado seguido de reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. El contenido de la mezcla de reacción en bruto se transfirió a una columna de desalación PD-10 que se había preactivado con 20 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS, 7,4) antes de cargar la muestra. Se añadieron 1,5 ml más de 1X PBS a la columna, seguido de 0,8 ml más de solución de 1X PBS y estas fracciones se descartaron. [64Cu]-A02-NODAGA se recogió a continuación después de eluir 1,2 ml de la columna PD-10 para dar 10,79 mCi como producto deseado. El control de calidad se midió con un sistema HPLC de fase inversa usando una columna Agilent PLRP-S HPLC Tamaño: 250 x 4,60 mm, 8 pm, 280 nm y una fase móvil de ácido fórmico al 0,1 % en agua destilada y acetonitrilo. Se usó un método de gradiente, donde el porcentaje de acetonitrilo se aumentó linearmente del 10 % hasta el 45 % durante un marco temporal de 30 minutos. [64Cu]-A02-NODAGA se coeluyó con un patrón de referencia en la marca de 22 minutos del cromatograma de HPLC. La pureza radioquímica se midió en un 96 % usando este método. [64Cu]-A02-NODAGA también se coeluyó con material de referencia en la marca de 20 minutos usando una cromatografía de exclusión molecular, (SEC) Columna: GE Superdex 200 GL Tamaño: 10 x 300 mm, 280 nm. La actividad específica calculada fue de 956,8 mCi/pmol según la concentración de proteína Nanodrop y la radioactividad aislada de la muestra purificada.
Procedimiento para la síntesis de 64Cu-E01-NODAGA
El pH de una solución de cloruro de [64Cu]-cobre ([64Cu]CuCb) en solución de ácido clorhídrico 0,1 N (20 mCi en 0,25 ml) se ajustó con 1,10 ml de tampón acetato de amonio 0,1 N, después se mezcló y se incubó con adnectina E01-NODAGA en una solución acuosa de 1XPBS (40 pl de 1.2 mg/ml, 4,62 nmol) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos de incubación, la mezcla de reacción (~1250 pl) se transfirió a la columna de desalación PD-10 (GE Healthcare Life Science, Sephadex G25 Medium, 14,5 x 50 mm - equilibrada con 40 ml de 1X PBS), y la muestra se dejó entrar completamente en la columna por gravedad y fue seguida de 1,1 ml de 1X PBS. Después de que el líquido hubiera pasado completamente a través de la columna, el producto se recogió por elución en incrementos de 1 ml con 1X PBS por vial de muestra. El 64Cu-E01-NODAGA se aisló en la segunda fracción de 1 ml y se midió en 9,26 mCi en 1 ml de 1XPBS. La muestra se analizó usando un método analítico de exclusión molecular por HPLC usando un sistema HPLC Agilent provisto de un detector UV/vis (A = 280 nm), un detector posi-ram y una columna Superdex 200 10/300 GL de exclusión molecular (GE Healthcare Life Science, tamaño de poro 13 pm). El caudal fue 0,5 ml/min, y la fase móvil acuosa fue isocrática con 1X PBS con NaN3 al 0,02 % durante 60 minutos. La pureza radioquímica fue del 99 % usando este sistema, y el producto se coeluyó con un patrón de referencia no radioactivo. La actividad específica se calculó basándose en la ecuación del cuerpo de calibración de 3 puntos (y = 656978x). Aproximadamente 100 pl de solución de producto del vial 3 se inyectaron en la columna de exclusión molecular Superdex -200. Se recogió el pico del producto, que resultó tener 0,74 mCi, las cuentas UV del pico del producto fueron 156367 unidades, y la actividad específica fue de 3,1 mCi/nmol.
Ejemplo 14: Diferenciación in vitro de células positivas para PD-L1 de células negativas para PD-L1 con un agente de obtención de imágenes de adnectina anti-PD-L1
En este experimento, se analizó la adnectina 64Cu-E01 contra PD-L1 (se usó NODAGA como quelante) para determinar su capacidad para discriminar entre células positivas para hPD-L1 y células negativas para hPD-L1 in vitro. El marcado de las células fue específico, como se pone de manifiesto por la diferente asociación de 64Cu-E01 con células L2987 positivas para hPD-L1 en comparación con las células hT-29 negativas para hPD-L1 (la radiactividad asociada a las células fue 44,6x veces mayor en las células L2987 positivas para hPD-L1). La especificidad se confirmó adicionalmente como se pone de manifiesto por una notable reducción de 64Cu-E01 asociado a células cuando se incubó simultáneamente con un exceso de 450 nM de adnectina E01 fría (no marcada) (reducción del 99,6 %). Las 18F-E01 asociada a células se redujo mínimamente (reducción del 9,9 %, no significativa) cuando las células se incubaron simultáneamente con450 nM de una adnectina de unión no a PD-L1 fría (no marcada) (Figura 3).
1x106 células de carcinoma humano L2987 positivas para hPD-L1 o células de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 negativas para hPD-L1 se introdujeron en tubos de cultivo de 5 ml (n=3 tubos por condición). Se preparó una solución de adnectina 64Cu-E01 en PBS BSA al 0,5 % a una concentración de 300 nCi/200 pl. Porciones de esta solución se suplementaron bien con adnectina E01 fría (no marcada) no de unión a PD-L1 hasta una concentración final de 450 nM. Las muestras de células se centrifugaron durante 5 min a 200xg y después se resuspendieron en 200 pl de la solución de adnectina 64Cu-E01 adecuada y se incubaron sobre hielo durante 1 hora. Después del período de incubación, las muestras de células se centrifugaron a 200xg y el sobrenadante se descartó. Los aglomerados celulares se resuspendieron en 1 ml de PBS BSA al 0,5 % y el procedimiento de lavado se repitió un total de 3 lavados. Después del lavado final, las células se volvieron a centrifugar a 200xg y el sobrenadante se descartó. La radiactividad de los aglomerados celulares remanentes se midió después con un contador gamma.
Considerados en conjunto, estos resultados demuestran la capacidad de la adnectina 64Cu-E01 para diferenciar entre células PD-L1(+) vs. PD-L1(-) in vitro. Específicamente, se demostró además con una notable reducción de radiotrazador asociado a células en muestras incubadas simultáneamente con adnectina E01 anti-PD-L1 no marcada 450 nM (y solamente una reducción no estadísticamente significativa cuando se incubó con una adnectina no de unión a PD-L1 450 nM). Se realizaron experimentos similares usando diferentes variantes de adnectina así como 18F como radionucleido, con resultados similares.
Ejemplo 15: Distinguir entre tumores positivos para PD-L1 de los tumores negativos para PD-L1 con un agente de obtención de imágenes de adnectina anti-PD-L1
Para la obtención de imágenes con PET, las velocidades de aclaramiento en sangre rápidas proporcionan una ventaja sobre las proteínas de aclaramiento lento, tales como anticuerpos, minimizando la cantidad de tiempo necesario para que las señales "de fondo" de las sondas se agoten en el tejido no relevante. En la clínica, los trazadores para PET basados en anticuerpos de semivida prolongada en sangre pueden necesitar varios días de espera después de la inyección para que se puedan recoger las imágenes. Las sondas de aclaramiento rápido abren la puerta a imágenes de alto contraste que se pueden recoger el mismo día en que se inyecta la sonda y, de forma muy importante, también pueden servir para reducir la exposición a la radiación global de los animales o pacientes estudiados.
En este experimento, la adnectina 64Cu-A01 contra PD-L1 (NODAGA se usó como quelante), producida como se describe en los Ejemplos anteriores, se sometió a ensayo para determinar su capacidad para discriminar entre tumores positivos para hPD-L1 y tumores negativos para hPD-L1 en ratones.
Se produjeron ratones que tenían tumores bilaterales por xenoinjerto introduciendo 1x106 células de carcinoma de pulmón humano 2987 hPD-L1(+) y 1,5 x 106células de carcinoma de colon humano HT-29 hPD-L1(-) por vía subcutánea en sitios opuestos del ratón. Una vez que los tumores hubieron alcanzado aproximadamente 300 mm3 (aproximadamente 2-3 semanas después de implantar las células), se seleccionaron los animales para la obtención de imágenes. Para obtener imágenes, los animales se anestesiaron con isoflurano al 2 % y se instalaron catéteres en la vena de la cola. Después, los ratones se introdujeron en un animalario personalizado con capacidad para 4 animales, donde permanecieron anestesiados durante la totalidad del estudio. El animalario se transfirió al escáner microPET® F120™ (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN). El campo de visión axial de este instrumento es de 7,6 cm. Con esta limitación, los animales se colocaron de forma que la región de exploración era de inmediatamente delante de los ojos hasta aproximadamente la base de la cola.
En primer lugar se adquirió una imagen de transmisión de 10 minutos usando una fuente puntual de 57Co para corregir la atenuación de las imágenes con PET finales. Después del barrido de transmisión, se administraron las soluciones de radiotrazador mediante los catéteres de la vena de la cola previamente instalados y se adquirió una imagen de emisión de 2 horas. Las soluciones de radiotrazador inyectadas consistieron en cualquiera de aproximadamente 200 |jCi de 64Cu-A02 (con un quelante de NODAGA) o 200 |jCi de 64Cu-A02 suplementado con una concentración de 3 mg/kg de adnectina A02 fría no marcada (basado en el peso del animal individual). Todas las inyecciones se formularon en 200 j l de solución salina antes de la inyección. Las dosis exactas inyectadas se calcularon tomando mediciones directas de la dosis formulada y restando la radioactividad remanente en la jeringa y el catéter de la vena de la cola.
Se reconstruyeron imágenes usando un algoritmo máximo a posteriori (MAP) con corrección de la atenuación usando las imágenes de transmisión recogidas y corregidas para la descomposición del radioisótopo. En las imágenes finales, se trazaron regiones de interés (ROI) alrededor de los límites del tumor con el programa informático ASIPro software (Siemens Preclinical Solutions). Se calcularon las curvas de tiempo-actividad de cada ROI para producir una vista cuantitativa de radiotrazador dentro del volumen tumoral durante la imagen de emisión de 2 horas. Para la comparación final, las curvas de tiempo-actividad individuales se normalizaron basándose en la dosis de radiotrazador inyectada para cada animal específico. Se comparó la captación de radiotrazador entre tumores usando los 10 minutos finales de cada curva de tiempo-actividad (1 hora 50 minutos - 2 h después de la inyección del radiotrazador). Usando esta metodología, la captación del radiotrazador en xenoinjertos L2987 hPD-L1(+) fue 3,05x veces la observada para xenoinjertos HT-29 hPD-L1(-) en animales que solamente recibieron el radiotrazador 64Cu-A02. Para los animales que recibieron simultáneamente el radiotrazador 64Cu-A02 y 3 mg/kg de adnectina A02 no marcada en los xenoinjertos L2987 hPD-L1 (+) fue solamente 1,04x de la observada en los xenoinjertos HT-29 hPD-L1 (-) (Figuras 4A y 4B).
Para algunos estudios, los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical inmediatamente después de la obtención de imágenes. Después se realizó la necropsia de los animales, y se recogieron tejidos individuales (sangre, corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón, músculo, estómago, hueso, tumor L2987 y tumor HT-29) en tubos previamente pesados. Después, todos los tejidos se volvieron a pesar para determinar el peso de cada tejido. La radioactividad de cada tejido se midió después directamente ex vivo usando un contador gamma Perkin-Elmer Wizard3. Para todos los tejidos, los valores medidos en cuentas por minuto (CPM) se normalizaron a la dosis radioactiva inyectada para los animales individuales y se corrigieron según la descomposición radioactiva. Estos resultados después se representaron gráficamente para comprobar la biodistribución del radiotrazador. Un ejemplo de este análisis para el radiotrazador de adnectina 18F-A02 se muestra en la Figura 5. Estos resultados demuestran una evidente captación diferencial del radiotrazador en xenoinjertos L2987 hPD-L1(+) en comparación con xenoinjertos HT-29 hPD-L1(-). Además, el único tejido con mayor captación de PD-L1 fue el riñón, lo que estaba previsto, ya que se esperaba que el aclaramiento de la adnectina 18F-A02 fuera mediante filtración renal, basándose en el peso molecular de la molécula.
Considerados en conjunto, estos resultados proporcionan una visualización directa de la diferenciación de xenoinjertos tumorales de hPD-L1(+) versus hPD-L1(-) in vivo. La especificidad se demostró adicionalmente mediante inyección simultánea de 3 mg/kg de adnectina A02 anti-PD-L1, dando como resultado una reducción de la captación del radiotrazador en tumores en hPD-L1 (+) hasta el nivel de los xenoinjertos hPD-L1 (-). Esto valida adicionalmente el uso de adnectinas dirigidas contra PD-L1 humano para visualizar la expresión de PD-L1 en el tejido usando obtención de imágenes con PET. Se realizaron experimentos similares usando 18F como radionucleido en ratones, y se obtuvieron resultados similares, alcanzando una relación de captación máxima del radiotrazador de 3,53:1 en xenoinjertos L2987 hPD-L1 (+) vs. xenoinjertos HT-29hPD-L1 (-) el radiotrazador de adnectina 18F-A02.
Los agentes de obtención de imágenes basados en la adnectina anti-PD-L1 también mostraron resultados similares cuando se realizaron en macacos. En estos estudios, la adnectina 18F-E01 anti-PD-L1, producida como se describe en los Ejemplos anteriores, se analizaron para determinar su capacidad para producir imágenes de alto contraste en macaco. Las adnectinas dirigidas contra PD-L1 descritas en este punto mantienen una elevada afinidad por PD-L1 de macaco (pero tienen baja afinidad por PD-L1 de roedor). Además, como los macacos no contienen tumores PD-L1 (+) como en los modelos de ratón, el comportamiento de obtención de imágenes se evaluó principalmente sobre los niveles de fondo medidos en las imágenes en el contexto de la expresión endógena de PD-L1 (donde el fondo bajo permite todo el potencial de la detección de alta sensibilidad en tejidos PD-L1 (+)). En estos estudios, los niveles de fondo en las imágenes PET resultantes fueron muy bajos, con una notable acumulación del radiotrazador indicada principalmente en los riñones, bazo y vejiga urinaria.
Los macacos macho con un puerto de acceso vascular previamente instalado (VAP) se anestesiaron con 0,02 mg/kg de atropina, 5 mg/kg de Telazol y 0,01 mg/kg de buprenorfina 1.M. (todas incluidas en una sola jeringuilla). Después se instaló un catéter i.v en el vaso cefálico para administración de fluido durante el procedimiento de obtención de imágenes para mantener la hidratación. Los animales se intubaron con un tubo endotraqueal - habitualmente de 3,0 mm y se transfirieron al lecho de obtención de imágenes de un instrumento PET microPET® F220™ PET (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN). La anestesia se mantuvo con isoflurano y oxígeno y se administraron fluidos i.v. (LRS) a una velocidad de 6 ml/kg/h durante el procedimiento de obtención de imágenes. Como el campo de visión axial del instrumento microPET® F220™ solo tiene 7,6 cm, se adquirieron imágenes en 5 posiciones del lecho diferentes para crear una imagen compuesta de los animales desde justo encima del corazón hasta aproximadamente la pelvis.
Para cada campo de visión, en primer lugar se adquirió una imagen de transmisión de 10 minutos usando una fuente puntual de 57Co para corregir la atenuación de las imágenes con PET finales. Una vez adquiridas las imágenes de transmisión para todas las posiciones del lecho, se administraron aproximadamente 1,5 mCi (aproximadamente 0,015 mg/kg) del radiotrazador de adnectina 18F-E01 se administró mediante el VAP instalado. Después se adquirieron barridos de emisión de 5 minutos de duración para cada posición de lecho, comenzando en la posición 1 centrada aproximadamente en el corazón y desplazándose hacia la pelvis del animal. Una vez adquiridas las imágenes en cada posición (de 1 hasta 5), el lecho de obtención de imágenes se volvió a desplazar hasta la posición del lecho 1 y el proceso se repitió. Usando este procedimiento, se adquirieron un total de 5 imágenes diferentes para cada posición de lecho para durante la totalidad del estudio de obtención de imágenes.
Las imágenes individuales se reconstruyeron usando un algoritmo de retroproyección filtrada (FBP) con corrección de la atenuación usando las imágenes de transmisión recogidas y corregidas para la descomposición del radioisótopo. Después se produjeron las imágenes compuestas finales alineando imágenes de las 5 posiciones de lecho obtenidas con un solo paso (es decir se produjo una única imagen compuesta a partir de cada conjunto de imágenes secuenciales desde las posiciones de lecho desde la 1 hasta la 5) que cubre la duración del estudio de obtención de imágenes. Las imágenes finales se inspeccionar visualmente para destacar zonas con captación del radiotrazador visible (es decir bazo, riñón, vejiga) y tejido de fondo (músculo) (Figura 6). La acumulación de fondo de la adnectina 18F-E01 fue muy baja, con poca señal visible en tejidos de fondo tales como músculo. Adicionalmente, la captación se verificó en el bazo, que se considera basado PD-L1(+) basada en la expresión del ARNm. Por los tanto, los estudios en macacos demuestran el potencial de la obtención de imágenes de alta sensibilidad de PD-L1 en el contexto del PD-L1 endógeno.
En conjunto, Los estudios de PET en roedores y macacos demuestran que las adnectinas contra PD-L1 humano marcadas con 64Cu y 18F proporcionan sondas intensas y específicas para el marcado in vivo de tejidos positivos para PD-L1 con el potencial de detección de alta sensibilidad para tejidos con bajo nivel de expresión de PD-L1.
Los experimentos de obtención de imágenes in vivo también se realizaron con un anticuerpo dirigido contra PD-L1, y las zonas que este agente detectó fueron las mismas zonas que se detectaron con el agente para obtención de imágenes de PD-L1, confirmando de esta forma que los agentes de obtención de imágenes de adnectina anti-PD-L1 detectan correctamente las células positivas para PD-L1 in vivo.
Ejemplo 16: Autorradiografía in vitro de tejido humano y de xenoinjerto con la adnectina [18F]-E01 anti-PD-LI Tejidos de tumor de pulmón humano se incluyeron en OCT y se enfriaron en 2-metilbutano durante 2-5 minutos hasta que se congelaron. Las muestras se almacenaron en un congelador a -80 °C hasta su uso. También se incluyeron en el ensayo tejidos de xenoinjerto humano. Se produjeron ratones que tenían xenoinjertos bilaterales introduciendo 4x106 células L2987 hPD-L1(+) y 1.5X106 células HT-29 hPD-L1(-) por vía subcutánea en costados opuestos de ratones nu/nu. Una vez que los tumores de xenoinjerto alcanzaron el tamaño apropiado (aprox. 200-300 mm3), los ratones se anestesiaron on isoflurano al 2 % y se sacrificaron mediante dislocación cervical. Los tejidos de tumor fresco se extirparon, se sumergieron en OCT y se enfriaron en 2-metilbutano durante 2-5 minutos hasta que se congelaron. Después, los tejidos se envolvieron en una lámina/bolsa ZIPLOC® y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Para todos los tejidos (tumor de pulmón humano y xenoinjertos), se cortaron secciones de 5 pm de espesor (recogidos como 2 secciones/porta) usando un criostato, se montaron descongelados sobre portaobjetos de vidrio, y se dejaron secar al aire durante aproximadamente 30 minutos.
Se realizaron estudios de bloqueo con adnectina A02 fría (no marcada) con 0,025 nM, 0,25 nM, 2,5 nM y 25 nM respectivamente y adnectina de unión no a PD-L1 25 nM usando las siguientes condiciones. Los portas individuales, 1 porta por concentración, se colocaron en cajitas de portas de plástico y se preincubaron en solución de bloqueo Dako exenta de proteínas durante 30 minutos. A continuación, los portas se transfirieron a cámaras de incubación para portas de vidrio para incubación adicional. Por separado, se preparó una solución madre de adnectina 18F-A02 0,25 nM diluyendo 10,6 pl de la solución madre de radioligando original (7064 nM en el momento del experimento) con 300 ml de PBS BSA al 0,5 %. De esta solución madre, se añadieron 40 ml a cada cámara de incubación. Una de estas cámaras contenía solamente la solución tampón del radioligando, que se denominó como sección de unión total. Otras cámaras de incubación recibieron 40 ml de esta solución madre junto con la correspondiente concentración de compuesto de bloqueo (adnectina A02 no marcada a 0,025 nM, 0,25 nM, 2,5 nM o 25 nM o adnectina de unión no a PD-L1 no marcada a 25 nM). Los portas se incubaron en las soluciones tampón individuales durante 1 hora a temperatura ambiente para alcanzar la unión máxima. Después de la incubación, los portas de cada grupo de tratamiento se retiraron de las soluciones de incubación y se colocaron en un tampón de lavado enfriado en hielo (PBS BSA al 0,5 %) durante 3 minutos y se enjuagaron 4 veces separadas. Después, los portas se secaron bajo una corriente de aire frío durante aproximadamente 30 minutos. Los portas secados al aire se expusieron colocando los portas sobre una placa de obtención de imágenes (BAS-SR 3545S) durante una noche a temperatura ambiente. La placa de obtención de imágenes se exploró usando el analizador de obtención de imágenes biológicas (Fujifilm Fluorescent Image Analyzer, FLA-9000). El tamaño de píxel de las imágenes de autorradiogramas fue de 100 pm. El análisis de imágenes se realizó con el programa informático Multi-Gauge. Se trazaron regiones de interés (ROI) para rodear la totalidad del tejido tumoral en todos los grupos de estudio. La señal de autorradiografía de la radioactividad asociada al tejido se cuantificó para estas ROI.
El desplazamiento aparente del radioligando adnectina 18F-A02 cuando se comparó con las secciones de unión total se determinó para 4 concentraciones diferentes (0.025 nM, 0,25 nM, 2,5 nM y 25 nM) de adnectina A02 no marcada tanto en secciones de tumor de pulmón humano como en secciones de xenoinjerto humano. Se observó un desplazamiento dependiente de la dosis de 18F-A02 en todas las secciones de tejido con la adición de adnectina A02 no marcada, mientras que la adnectina de unión no a PD-L1 25 nM mostró un bloqueo mínimo en todos los tejidos, en comparación con la unión total (Figura 7).
Secciones de tejido seriadas de 5 pm procedentes de cada tejido se sometieron a un procedimiento inmunohistoquímico con anti-human-PD-L1 para comprobar el nivel de expresión de antígeno PD-L1 en las muestras (Figura 8).
Considerados en conjunto, estos resultados proporcionan una visualización directa de PD-L1 tanto en secciones de tumor de pulmón humano como en secciones de xenoinjerto human. El nivel de unión de radioligando en los tejidos individuales se corresponde con la intensidad de la tinción de PD-L1 en secciones congeladas mediante IHC. Además, el bloqueo dependiente de la dosis del receptor con la adnectina A02 anti-PD-L1 (y la falta de bloqueo con la adnectina de unión no a PD-L1 no marcada), valida adicionalmente el uso de 18F-A02 para visualizar la expresión de PD-L1 en el tejido usando obtención de imágenes con PET.
Ejemplo 17: Preparación automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de acuerdo con el procedimiento general de radiosíntesis usando la unidad de síntesis comercial GE TRACERlab FX2 N
Figure imgf000055_0001
10 mín
n 3 n 3
Procedimiento:
La síntesis automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se realizó usando un módulo de síntesis GE TRACERlab FX2 N no de tipo casete. La configuración de la unidad de síntesis se resume en la Tabla 4. La solución acuosa de [18F]-Fluoruro (2,0 ml, 29,6 GBq/ 800 mCi) se suministró a un Sep-Pak light QMA [El cartucho Sep-Pak light QMA se había preacondicionado secuencialmente con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M, 5 ml de agua desionizada, y 5 ml de acetonitrilo antes del uso]. Tras completarse dicha transferencia, la solución acuosa de [18F] fluoruro se liberó del QMA Sep-Pak mediante la adición de la mezcla de elución (desde "V1") al reactor. El disolvente se evaporó con una suave corriente de nitrógeno y vacío. La solución de precursor (desde "V3") se añadió al resto de criptando seco, y esta mezcla de reacción se calentó a 120 °C durante 10 minutos. Después se añadieron 4 ml de agua destilada (desde "V4") a la mezcla de reacción en bruto del reactor, y la mezcla se transfirió al bucle de inyección de 5 ml de muestra de la HPLC semipreparativa mediante un sensor líquido que controla el final de la carga. La mezcla se cargó en la columna de HPLC semipreparativa (Luna C18(2). 250x10 mm, Phenomenex). Una mezcla de 35 % acetonitrilo en una solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0,1 % se purgó a través de la columna a un caudal de 4,6 ml por minuto. El producto se recogió de esta columna de HPLC en el matraz de dilución que contenía 15 ml de agua destilada y todo su contenido se transfirieron a un cartucho de extracción en fase sólida tC18 de 1 gramo. 352 mCi (13 GBq) de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se liberaron de este cartucho (desde "V14") con 3 ml de etanol y se puede usar para generar productos biológicos marcados con 18F aprovechando la reacción de "clic" azida-alquino con los productos biológicos que contienen alquinos adecuados.
Tabla 4
Figure imgf000056_0002
Ejemplo 18 Preparación automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de acuerdo con el procedimiento general de radiosíntesis en la unidad de síntesis IBA Synthera
Figure imgf000056_0001
Procedimiento:
La síntesis automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se realizó usando un módulo cassete de tipo IBA Synthera Synthesis y un kit de procesamiento integrador de fluidos adecuadamente montado. El kit de procesamiento integrador de fluidos (IFP) se cargó con los precursores adecuados para esta síntesis y se resume en la Tabla 5. La purificación se realizó en una unidad Varian HPLC. El llenado del bucle de inyección de la HPLC se controló mediante una corriente de nitrógeno estacionaria en la unidad de HPLC. La configuración de ambos autómatas se resume en la Tabla 2. La solución acuosa de [18F]-Fluoruro (2,0 ml, 29,6 GBq/ 800 mCi) se suministró a un Sep-Pak light QMA [El cartucho Sep-Pak light QMA se había preacondicionado secuencialmente con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M, 5 ml de agua desionizada, y 5 ml de acetonitrilo antes del uso]. Tras completarse dicha transferencia, la solución acuosa de [18F] fluoruro se liberó del QMA Sep-Pak mediante la adición de la mezcla de elución (desde "V1") al reactor. El disolvente se evaporó con una suave corriente de nitrógeno y vacío. La solución de precursor (desde "V2") se añadió al resto de criptando seco, y esta mezcla de reacción se calentó a 120 °C durante 10 minutos. Después se añadieron 3 ml de agua destilada (desde "V4") a la mezcla de reacción en bruto del reactor, y la mezcla se transfirió al bucle de inyección de 5 ml de muestra de la HPLC semipreparativa mediante un sensor líquido que controla el final de la carga. La mezcla se cargó en la columna de HPLC semipreparativa (Luna C18(2).
250x10 mm, Phenomenex). Una mezcla de 35 % acetonitrilo en una solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0,1 % se purgó a través de la columna a un caudal de 4,6 ml por minuto. El producto se recogió de esta columna de HPLC en el matraz de dilución que contenía 15 ml de agua destilada y todo su contenido se transfirieron a un cartucho de extracción en fase sólida tC18 de 1 gramo. 325 mCi (12 GBq) de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se liberaron de este cartucho con 3 ml de etanol y se puede usar para generar productos biológicos marcados con 18F aprovechando la reacción de "clic" azida-alquino con los productos biológicos que contienen alquinos adecuados.
Tabla 5
Figure imgf000057_0002
Ejemplo 19: Síntesis de sondas de adnectina anti-PD-LI basadas en 68Ga
Síntesis de 68Ga-E01-NODAGA
Cloruro de I68 Ga]-galio en solución de ácido clorhídrico 0,1 N se neutralizó con 32 mg de acetato sódico (NaOAc) durante 4 minutos a temperatura ambiente, la solución resultante se agitó para garantizar que todo el volumen estaba bien mezclado. Esta solución se añadió después a una solución de E01-NODAGA (15 |jl de 1,3 mg/ml) y la reacción en bruto se pipeteó suavemente para permitir el mezclado seguido de reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos. El contenido de la mezcla de reacción en bruto se transfirió a una columna de desalación PD-10 que se había preactivado con 20 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS, 7,4) antes de cargar la muestra. Se añadieron 1,5 ml más de 1X PBS a la columna, seguido de 0,8 ml más de solución de 1X PBS y estas fracciones se descartaron. [68 Ga]-E01-NODAGA se recogió a continuación después de eluir 1,4 ml de la columna PD-10 para dar 5,78 mCi (214 Bq) como producto deseado. El control de calidad se midió con un sistema HPLC de fase inversa usando una columna Agilent PLRP-S HPLC Tamaño: 250 x 4,60 mm, 8 jm , 280 nm y una fase móvil de ácido fórmico al 0,1 % en agua destilada y acetonitrilo. Se usó un método de gradiente, donde el porcentaje de acetonitrilo se aumentó linearmente del 10 % hasta el 45 % durante un marco temporal de 30 minutos. [68Ga]-E01-NODAGA se coeluyó con un patrón de referencia en la marca de 22 minutos del cromatograma de HPLC. La pureza radioquímica se midió en un 98 % usando este método. [68Ga]-E01-NODAGA también se coeluyó con material de referencia en la marca de 20 minutos usando una cromatografía de exclusión molecular, (SEC) Columna: GE Superdex 200 GL Tamaño: 10 x 300 mm, 280 nm.
1 MGVSD VPRDL EVVAA TPTSL LISWR AQLSP SFYYR ITYGE
41 TGGNS PVQEF TVPND VMTAT ISGLK PGVDY TITVY AVTTH
81 GVYFY SPISI NYRTP CHHHH HH
Figure imgf000057_0001

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido, que comprende un décimo dominio de tipo III de fibronectina (10Fn3), en donde (a) el dominio 10Fn3 comprende los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, (b) los bucles BC, DE y FG comprenden las secuencias de aminoácidos de:
(i) los SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente;
(ii) los SEQ ID NO: 21, 22 y 23, respectivamente;
(iii) los SEQ ID NO: 36, 37 y 38, respectivamente;
(iv) los SEQ ID NO: 51, 52 y 53, respectivamente;
(v) los SEQ ID NO: 66, 67 y 68, respectivamente;
(vi) los SEQ ID NO: 81, 82 y 83, respectivamente; o
(vii) los SEQ ID NO: 97, 98 y 99, respectivamente; y
(c) el polipéptido se une específicamente a PD-L1 con una Kd de 10 nM o menos.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de las regiones de bucle no de BC, DE y FG del dominio 10Fn3 es al menos en un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las regiones de bucle no de BC, DE y FG de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 5, 20, 35, 50, 65, 80 y 96.
3. El polipéptido de la reivindicación 2, en el que la secuencia de aminoácidos de las regiones de bucle no de BC, DE y FG del dominio 10Fn3 es al menos en un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las regiones de bucle no de BC, DE y FG de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo, que consiste en los SEQ ID NO: 9-15, 24-30, 39-45, 54-60, 69-75, 84-91 y 100-107.
4. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polipéptido comprende uno o más restos farmacocinéticos (PK), seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido siálico, Fc, fragmento Fc, transferrina, albúmina sérica, una proteína de unión a la albúmina sérica y una proteína de unión a la inmunoglobulina sérica.
5. Un ácido nucleico, que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. El ácido nucleico de la reivindicación 5, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos, seleccionada del grupo, que consiste en los SEQ ID NO: 16-19, 31-34, 46-49, 61-64, 76-79, 92-95 y 108-111.
7. Un vector, que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6.
8. Una célula, que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6.
9. Un agente de obtención de imágenes, que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y una marca detectable.
10. El agente de obtención de imágenes de la reivindicación 9, en el que la marca detectable es un radionucleido seleccionado del grupo que consiste en: 64Cu, 86Y 89Zr, 68Ga, 18F, 11C, 125I, 124I, 131I, 123I, 32Cl, 33Cl, 34Cl, 74Br, 75Br, 76Br, 77B r,78Br, 186Re, 188Re, 90Y, 177Lu, 99 Tc o 153 Sm.
11. El agente de obtención de imágenes de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la marca detectable está conjugada con el polipéptido, mediante un resto de conjugación, seleccionado del grupo, que consiste en: DFO, DOTA, CB-DO2A, 3p-C-DEPA, TCMC, DBCO, DIBO, BARAC, DIMAC, Oxo-DO3A, TE2A, CB-TE2A, CB-TE1A1P, CB-TE2P, MM-TE2A, DM-TE2A, diamsar, NODASA, NODAGA, NOTA, NETA, TACN-TM, DTPA, 1B4M-DTPA, CHX-A"-DTPA, TRAP, NOPO, AAZTA, DATA, H2dedpa, H4octapa, gazapa, H5decapa, Hefospa, HBED, SHBED, BPCA, CP256, PCTA, HEHA, PEPA, EDTA, TETA y TRITA.
12. El agente de obtención de imágenes de la reivindicación 11, en el que el resto de conjugación es NODAGA y el radionucleido es 64Cu.
13. El agente de obtención de imágenes de la reivindicación 10, que comprende un grupo prostético radiomarcado con 18F y un resto de conjugación bifuncional (BFC), en donde el agente de obtención de imágenes tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000096_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
(a) el 18F está en orto respecto al átomo de N, x es un número entero de 1 a 8, de 2 a 6, de 3 a 5 o x es 4;
(b) el resto BFC es un ciclooctino, que comprende (i) un grupo reactivo, que forma un enlace covalente con una amina, un carboxilo, un carbonilo o un grupo funcional tiol en la proteína, y (ii) un brazo espaciador de polietilenglicol (PEG)y, en donde y es un número entero de 1 a 8, de 2 a 6, o y es 4 o 5; y
(c) la proteína es un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
14. El agente de obtención de imágenes de la reivindicación 13, en el que el ciclooctino se selecciona entre el grupo que consiste en dibenzociclooctino (DIBO), biarilazaciclooctinona (BARAC), dimetoxiazaciclooctino (DIMAC) y dibenzociclooctino (DBCO).
15. El agente de obtención de imágenes de la reivindicación 13, en el que el BFC es DBCO-PEG4-NHS-éster, DBCO-Su/fo-NHS-éster, DBCO-PEG4-ácido, DBCO-PEG4-amina o DBCO-PEG4-maleimida.
16. El agente de obtención de imágenes de la reivindicación 13, en donde el agente de obtención de imágenes tiene la estructura:
Figure imgf000096_0002
en la que X es un polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los SEQ ID NO: 13, 28, 43, 58, 73, 88 y 104, y en donde el grupo maleimida del BFC está covalentemente unido al grupo tiol de un resto cisteína del polipéptido.
17. El agente de obtención de imágenes de la reivindicación 16, en el que el grupo maleimida del BFC está covalentemente unido al grupo tiol de un resto cisteína del extremo C del polipéptido.
18. El agente de obtención de imágenes de una cualquiera de las reivindicaciones 9-17, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos definida en el SEQ ID NO: 88 o el SEQ ID NO: 104.
19. Una composición farmacéutica, que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o el agente de obtención de imágenes de una cualquiera de las reivindicaciones 9-18.
20. El agente de obtención de imágenes de una cualquiera de las reivindicaciones 10-18, para usar en un método con el fin de detectar la presencia de un tumor que expresa PD-L1 en un sujeto, comprendiendo el método:
(a) administrar el agente de obtención de imágenes al sujeto; y
(b) obtener una radioimagen de al menos una parte del sujeto para detectar la presencia o la ausencia del agente de obtención de imágenes;
en donde la presencia y la ubicación del agente de obtención de imágenes por encima del fondo son indicativas de la presencia y de la ubicación del tumor que expresa PD-L1.
21. El agente de obtención de imágenes de una cualquiera de las reivindicaciones 10-18, para usar en un método con el fin de supervisar el progreso de una terapia antitumoral contra tumores, que expresan PD-L1 en un sujeto, que comprende:
(a) administrar el agente de obtención de imágenes al sujeto en un primer punto temporal y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto para determinar el tamaño del tumor;
(b) administrar una terapia antitumoral al sujeto;
(c) administrar el agente de obtención de imágenes al sujeto en uno o más puntos temporales posteriores y obtener una imagen de al menos una parte del sujeto en cada punto temporal;
en donde la dimensión y la ubicación del tumor en cada punto temporal son indicativas del progreso de la terapia antitumoral contra tumores que expresan PD-L1.
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