KR102568559B1 - Cd8a-결합 섬유결합소 iii형 도메인 - Google Patents

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Abstract

CD8A에 특이적으로 결합하는 섬유결합소 III형 도메인(FN3), CD8A-특이적 FN3 도메인을 인코딩할 수 있는 관련된 폴리뉴클레오티드, FN3 도메인을 발현하는 세포뿐만 아니라 연관된 벡터 및 검출가능하게 표지화된 FN3 도메인은 치료적 및 진단적 적용에서 유용하다.

Description

CD8A-결합 섬유결합소 III형 도메인
서열 목록
본 출원은 서열 목록을 내포하는데, 이것은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다. 2017년 12월 5일자에 창출된 상기 ASCII 사본은 JBI5112WOPCT_SL.txt로 명명되고 크기에서 266,978 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 분화 클러스터 8a(CD8a)에 특이적으로 결합하는 섬유결합소 III형(FN3) 도메인에 관계한다. 이런 FN3 도메인은 예로서, 의학적 영상화, 진단학 및 제약학적 요법에 이용될 수 있다. 이런 분자 및 이들을 포함하는 진단 시약의 생산을 위한 방법 역시 제공된다.
배경
암 면역요법의 분야가 빠르게 발전함에 따라서, 최근에 여러 새로운 면역요법이 FDA 승인을 받았고, 더욱 많은 요법이 현재 다양한 암에 대해 임상 시험 중에 있다. 게다가, 세포, 소형 분자, 항체-기초된 면역요법, 그리고 이들의 조합이 임상적 번역을 위해 전임상에서 엄격하게 검사되고 있다. 동적 종양 미세환경 및 종양 이질성은 전임상 연구 및 임상 연구 둘 모두에서 중요한 주제가 되고 있지만(Hanahan D, Weinberg RA. Cell 2011;144:646-74; M antovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. Nature 2008; 454:436-44; Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ. Science 2011; 331:1565-70.), 일차성 병변 및 전이성 암의 면역 상태에서 변화를 모니터링하는 능력은 제한된다. 전혈로부터 림프구 또는 이질성 종양으로부터 생검을 모니터링하는 현재의 방법은 치료적 개입에 대한 면역 반응을 모니터링하는데 아마도 필요한 동적 및 공간적 정보를 반영하지 못하는데, 이들 중에서 다수는 면역 세포 숫자 및 국부화에서 전신 변화를 유도한다. 이런 이유로, 실험적 요법 동안 면역 세포 숫자 또는 국부화에서 전신 변경 및 종양내 변경 둘 모두를 비침습성으로 모니터링할 수 있는 분자 영상화 방법은 임상적 면역치료적 반응을 예측하고 그리고/또는 사정하기 위한 번역가능한 방법을 제공하는 잠재력과 함께, 면역치료적 기전의 동역학에 관한 이해를 증가시키는 능력을 갖는다.
종양-침윤 림프구(TIL)의 분석은 종양 면역 미세환경의 중요성을 증명하였고, 그리고 세포독성 CD8+ T 세포의 존재가 유방암, 폐암, 난소암, 흑색종 및 결장직장암에서 전체 생존을 예측할 수 있다는 것을 증명하였다(참고문헌 Pages F, et al.. Oncogene 2010;29:1093-102. 및 Gooden MJ, et al. Br J Cancer 2011;105:93-103에서 리뷰됨.). T 세포 수용체(TCR)- 또는 키메라 항원 수용체-형질도입된 세포독성 T 세포의 입양 세포 전달(ACT)(Johnson LA, et al. Blood 2009;114:535-46; Rosenberg SA. Sci Transl Med 2012;4:127ps8.), CD137(4-1BB) 및 CD40을 표적으로 하는 효현성 항체(Melero I, et al. Clin Cancer Res 2013;19:997-1008; Melero I, et al. Nat Rev Cancer 2007;7:95-106; Vinay DS, and Kwon BS. Mol Cancer Ther 2012;11:1062-70.), 그리고 관문 저해제 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1의 항체 차단(Callahan MK, and Wolchok JD. J Leukoc Biol 2013;94:41-53; Shin DS, and Ribas A. Curr Opin Immunol 2015;33C:23-35; Topalian SL, et al. Cancer Cell 2015;27:450-61.)을 비롯한, 종양 면역 미세환경을 변경하는 면역요법의 최근 임상적 성공으로, 요법에 대한 종양 면역 반응을 비침습성으로 모니터링하는 능력이 대단히 중요해졌다.
요약
본 발명은 CD8A-결합 섬유결합소 III형(FN3) 도메인을 포함한다. 제공된 FN3 도메인을 인코딩할 수 있는 관련된 폴리뉴클레오티드, 제공된 FN3 도메인을 발현하는 세포뿐만 아니라 연관된 벡터 또한 설명된다. 이에 더하여, 제공된 FN3 도메인을 이용하는 방법이 설명된다. 예를 들어, 본 발명의 FN3 도메인은 CD8+ T 세포의 존재 및 부재를 비침습성으로 및 정량적으로 모니터링하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 단리된 FN3 도메인을 포함하는데, 여기서 이들 FN3 도메인은 서열 번호: 35를 포함하는 인간 CD8A에 결합한다. 다른 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 인간 CD8A 및 시노몰구스 원숭이 CD8A에 결합한다. 또 다른 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 서열 번호: 1의 텐콘(Tencon) 서열에 기초된다. 추가 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 서열 번호: 4의 텐콘27 서열에 기초된다. 일부 구체예에서, 알부민-특이적 FN3 도메인은 서열 번호: 2, 3, 5, 6, 7 또는 8의 서열을 포함하는 라이브러리로부터 단리된다. 일부 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 효소결합 면역점(ELISPOT) 검정으로 계측했을 때, 시험관내에서 CD8+ T-세포를 활성화시키지 않는다. 일부 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 표면 플라스몬 공명으로 계측된 약 0.02 내지 약 6.6 nM 사이의 친화성(KD)으로 인간 CD8A에 결합한다. 다른 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 서열 번호: 79, 81, 83, 89, 122 및 68의 잔기 위치 54에서 시스테인 치환을 갖는다. 다른 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 서열 번호: 40-269의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 검출가능한 표지에 접합된다.
설명된 CD8A-특이적 FN3 도메인에 더하여, 설명된 FN3 도메인을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열 역시 제공된다. 설명된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 역시 제공되고, CD8A-특이적 FN3 도메인을 발현하는 세포 역시 본원에서 제공된다. 개시된 벡터를 발현할 수 있는 세포 또한 설명된다. 이들 세포는 포유류 세포(예를 들어, 293F 세포, CHO 세포), 곤충 세포(예를 들어, Sf7 세포), 효모 세포, 식물 세포, 또는 세균 세포(예를 들어, 대장균(E. coli))일 수 있다. 설명된 FN3 도메인의 생산을 위한 제법 역시 제공된다.
본 발명은 또한, 설명된 CD8A-특이적 FN3 도메인을 진단 목적을 위해 다양한 분자에 접합하거나 또는 만약 그렇지 않으면 연관시키는 방법을 포함한다. 예를 들어, Zr-89 또는 I-124가 CD8+ T-세포의 존재를 검출할 수 있는 진단 시약의 창출을 위한 이상적인 융합 파트너이다. 따라서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 CD8A를 생물마커로서 이용한 암 진단학에서 유용성을 갖는다.
본 발명의 다른 구체예는 생물학적 표본을 설명된 CD8A-특이적 FN3 도메인을 포함하는 진단 시약으로 처리하는 것을 포함하는, 생물학적 표본에서 CD8A-발현 세포를 검출하는 방법이다. 이들 방법은 실시예에서 제공된다.
개시된 CD8A-특이적 FN3 도메인을 포함하는 키트가 발명의 범위 내에 속한다. 이들 키트는 본원에서 제공된 CD8A-특이적 FN3 도메인을 이용하는 방법, 또는 다른 당업자에게 공지된 방법을 실행하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 설명된 키트는 본원에서 설명된 FN3 도메인 및 생물학적 표본에서 인간 CD8A의 존재를 검출하는데 이용하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 설명된 키트는 본원에서 설명된 FN3 도메인 중에서 한 가지 또는 그 이상 및 이용되지 않을 때 FN3 도메인을 내포하기 위한 용기, 본원에서 설명된 바와 같은, 고체 지지체에 부착된 FN3 도메인 및/또는 FN3 도메인의 검출가능하게 표지화된 형태의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
도 1A-1D. CD8S365-DFO 접합체는 24 시간 INFγ EliSpot 검정에서 T 세포를 데노보에서 활성화시키지 않고, 그리고 T 세포의 항원 의존성 활성화를 조정하지 않는다. CMV 반응성 T 세포는 CMV 펩티드의 부재(A) 또는 존재(B)에서 365-DFO로 처리되었다. 두 번째 M1 반응성 공여자 또한, M1 펩티드의 부재(C) 또는 존재(D)에서 검사되었다.
도 2A 및 2B. CD8S365-DFO 접합체는 6 일 INFγ MSD 검정에서 T 세포를 데노보에서 활성화시키지 않고, 그리고 T 세포의 항원 의존성 활성화를 조정하지 않는다. CMV 반응성 T 세포는 CMV 펩티드의 부재(A) 또는 존재(B)에서 365-DFO로 처리되었다.
도 3. [124I]-IPEM의 미가공 예비 HPLC 추적. 예비 HPLC는 Waters 1525 이원 HPLC 펌프, Waters 2489 이중 파장 UV/가시광선 검출기(λ=214 및 254 nm), Bioscan 유동 계수 무선검파기(B-FC-2000) 및 Atlantis T3, 100 Å, 5 μm, 150 x 4.6 mm HPLC 칼럼을 이용하여 수행되었다. 이용된 용리 프로필은 아래와 같았다: 용매 A=H2O(0.1% AcOH(v/v)), 용매 B=MeCN(0.1% AcOH(v/v)), 유속=1.5 mLmin-1; 초기=80% A, 20 분=0% A(선형 구배). 254 nm(위쪽 그래프) 및 214 nm(중간 그래프)에서 UV-vis 추적에서 복수 소형 분자 흡광도는 미가공 반응 혼합물 내에 불순물 및 부산물의 존재를 지시한다. 방사선추적(아래쪽 그래프)은 또한, 방사성 표지화된 불순물에 기인한 예상된 기준선 피크를 보여준다.
도 4. [124I]-IPEM의 분석용 HPLC 추적. 분석용 HPLC는 Waters 1525 이원 HPLC 펌프, Waters 2707 자동샘플러, Waters 2489 이중 파장 UV/가시광선 검출기(λ=214 및 280 nm), Bioscan 유동 계수 무선검파기(B-FC-2000) 및 Phenomenex Kinetex 5 μm XB-C18 100 Å, 150 x 4.6 mm HPLC 칼럼을 이용하여 수행되었다. 이용된 용리 프로필은 아래와 같았다: 용매 A=H2O(0.1% TFA(v/v)), 용매 B=MeCN(0.1% TFA(v/v)), 유속=1 mLmin-1; 초기=90% A, 15 분=0% A(선형 구배). 분석적으로 순수한 [I-124] IPEM은 성공적인 정제를 확증하는 매끈한 기준선을 갖는 단일 방사선피크(아래쪽 그래프)를 보여준다. [I-124] IPEM이 유기 소형 분자이고; 따라서, 280 nm(위쪽 그래프) 및 214 nm(중간 그래프)에서 흡수를 결여한다는 점에 주목한다.

도 5. 정제된 [124I]-IPEM CD8S365의 방사성 TLC. iTLC-SG 평판(Agilent, 카탈로그 #SGI0001)은 Bioscan AR-2000 방사성 TLC 영상화 스캐너에서 판독되었다. 방사성 TLC 평판(도 3)은 1 μL의 NaI(0.1 M)가 공동 점재되고, 그리고 구연산(0.5 mM, pH=5)을 용리액으로서 이용하여 전개되었다. 기원=20 mm 및 용매 프런트=100 mm. 방사성 TLC 용리액은 96 mg의 구연산(스펙트럼 카탈로그 #CI131)을 25 mL의 추적 선별 H2O에 용해시킴으로써 제조되었고, 그리고 이후, Na2CO3가 첨가되었다(245 μL, 2 M); pH는 스트립(pH=5)에 의해 검사되었다.
도 6. 정제된 [124I]-IPEM CD8S 365의 분석용 HPLC 추적. 분석용 HPLC는 Waters 1525 이원 HPLC 펌프, Waters 2707 자동샘플러, Waters 2489 이중 파장 UV/가시광선 검출기(λ=214 및 280 nm), Bioscan 유동 계수 무선검파기(B-FC-2000) 및 Phenomenex Kinetex 5 μm XB-C18 100 Å, 150 x 4.6 mm HPLC 칼럼을 이용하여 수행되었다. 이용된 용리 프로필은 아래와 같았다: 용매 A=H2O(0.1% TFA(v/v)), 용매 B=MeCN(0.1% TFA(v/v)), 유속=1 mLmin-1; 초기=90% A, 15 분=0% A(선형 구배). 280 nm(위쪽 그래프)에서 생체분자(CD8S) 흡광도 및 214 nm(중간 그래프)에서 소형 분자(I124-IPEM) 흡광도는 성공적인 접합 반응을 확증한다. UV 및 방사선 추적(아래쪽 그래프)은 분석적으로 순수한 표본을 지시한다.
도 7. IPEM CD8S365의 MALDI-MS(이론적 MW=10786.12). MALDI-MS 분석은 양이온 방식에서 Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF(선형 검출기)를 이용하여 Biointerfaces Institute에서 수행되었다. 시나핀산의 포화 용액은 TA30 용매(물에서 30:70(v/v) MeCN:0.1% TFA)에서 제조되었다. 표본(c=0.397 mgmL-1)은 매트릭스 용액과 1:1 비율로 혼합되었고, 그리고 1 μL가 평판 상에 점재되었다. 단백질 용액은 외부 표준으로서 이용되었다.
도 8. 콜드 표준(cold standard)과 함께 [124I]-IPEM CD8S365의 공동 주입. 분석용 HPLC는 Waters 1525 이원 HPLC 펌프, Waters 2707 자동샘플러, Waters 2489 이중 파장 UV/가시광선 검출기(λ=214 및 280 nm), Bioscan 유동 계수 무선검파기(B-FC-2000) 및 Phenomenex Kinetex 5 μm XB-C18 100 Å, 150 x 4.6 mm HPLC 칼럼을 이용하여 수행되었다. 이용된 용리 프로필은 아래와 같았다: 용매 A=H2O(0.1% TFA(v/v)), 용매 B=MeCN(0.1% TFA(v/v)), 유속=1 mLmin-1; 초기=90% A, 15 분=0% A(선형 구배). 콜드 표본과의 공동 주입은 UV 피크의 완전한 겹침을 야기하는데(위쪽 및 중간 그래프), 이것은 산물의 분자 정체를 확증한다(다시 말하면, 콜드 및 방사성표지화된 접합체는 요오드-124에 의한 요오드의 대체를 제외하고 동일하다)
도 9. 주사후 2 시간에서 촬영된, I-124로 방사성표지화된 CD8S365-IPEM5를 보여주는 대표적인 PET 이미지. 상기 이미지는 최대 강도 투사(전방 후방)인데, 비장이 십자선의 중심에 위치한다. 비장 아래에 장기는 신장이고, 그리고 상기 이미지는 위쪽에서 머리를 보여주도록 정향된다. 갑상선에서 흡수는 상기 단백질의 일부 탈요오드화의 증거이다.
도 10. Zr-89 또는 I-124로 표지화된 각 항-CD8A FN3 도메인에 대한 비인간 영장류에서 혈액 방사선의 시간 활성 곡선.
도 11A 및 11B. Zr-89 또는 I-124로 표지화된 각 센티린에 대한 NHP에서 장기 방사선의 시간 활성 곡선. 도 11A는 신장, 간 및 비장을 포함하고, 반면 도 11B는 비장에 집중된다. [124I]-IPEM CD8S365에 대한 24 시간 시점은 기술적인 문제로 인해 누락된다. 동위원소의 잔여화에 기인한 신장에서 Zr-89의 높은 흡수는 I-124 데이터에는 거의 부재한다.
도 12A-12C. 비인간 영장류로부터 채취된 혈액에서 3 일자까지 CD8 T 세포 고갈의 확증(12A). CD4(12B) 및 CD3 T 세포(12C)에서 변화 역시 도시된다.
도 13. CD8-고갈된 동물에서 주사후 2 시간에서 촬영된, I-124로 방사성표지화된 365 항-CD8A FN3 도메인을 보여주는 대표적인 PET 이미지. 상기 이미지는 최대 강도 투사(전방 후방)이다. 이것은 도 9에서 비-고갈된 동물과 대비되는데, 여기서 비장이 신장 위에서 명확하게 보인다.
도 14. [124I]-IPEM CD8S365의 투여 후 고갈된 동물 및 비-고갈된 동물 둘 모두에 대한 시노몰구스 원숭이에서 혈액 방사선의 시간 활성 곡선.
도 15A 및 15B. 고갈된 동물 및 비-고갈된 동물 둘 모두에 대한 시노몰구스 원숭이에서 장기 방사선의 시간 활성 곡선. 15A는 신장, 간 및 비장을 포함하고, 반면 15B는 비장에 집중된다.
도 16. 주사후 3 시간에서 촬영된, I-124로 방사성표지화된 CD8S365-IPEM을 보여주는 2마리의 동일하게 처리된 생쥐의 대표적인 PET 이미지. 상기 이미지는 CT 스캔 상에 덧씌워진 3D 최대 강도 투사이다. 종양(huCD8+을 과다발현하도록 형질감염된 HEK-293-luc로부터 형성됨) 및 다른 장기는 화살표에 의해 표시된다. 갑상선에서 흡수는 상기 단백질의 일부 탈요오드화의 증거이다.
도 17. HEK-293-luc CD8+ 또는 HEK-293 부모 종양을 보유하는 생쥐에서 혈액 방사선의 시간 활성 곡선.
도 18. HEK-293-luc CD8+ 또는 HEK-293 부모 종양을 보유하는 생쥐에서 종양 방사선의 시간 활성 곡선.
도 19. 이식된 세포의 숫자의 함수로서, HEK293 CD8 과다발현 세포에서 I-124 표지화된 CD8S365의 흡수.
정의
설명의 양상에 관련된 다양한 용어가 명세서 및 청구항 전반에서 이용된다. 이런 용어는 달리 지시되지 않으면, 당해 분야에서 그들의 통상적인 의미가 제공된다. 다른 특정하게 규정된 용어는 본원에서 제공된 정의와 합치하는 방식으로 해석된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예로서, "세포"에 대한 언급은 2개 또는 그 이상 세포의 조합 등을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 계측가능한 값, 예를 들면, 양, 시간 지속 기간 등을 지칭할 때 용어 "약"은 특정된 값으로부터 ±10%까지의 변이를 포괄하는 것으로 의미되는데, 그 이유는 이런 변이가 개시된 방법을 수행하는데 적절하기 때문이다. 달리 지시되지 않으면, 명세서 및 청구항 내에서 이용된 성분, 성질, 예를 들면, 분자량, 반응 조건, 기타 등등의 양을 표시하는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해된다. 따라서, 반대로 지시되지 않으면, 다음의 명세서 및 첨부된 청구항에서 진술된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 획득이 추구되는 원하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사이다. 적어도, 그리고 청구항의 범위에 균등론의 적용을 제한하는 시도로서가 아닌 한, 각 수치 파라미터는 최소한, 보고된 유효 숫자 자리수의 숫자에 비추어, 그리고 일상적인 반올림 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다. 본 발명의 광범위한 범위를 진술하는 수치 범위와 파라미터가 근사임에도 불구하고, 특정한 실례에서 진술된 수치 값은 가능한 정확하게 보고된다. 하지만, 일정한 수치 값은 그들의 개별 시험 계측에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 일정한 오차를 생래적으로 내포한다.
"단리된"은 생물학적 성분(예를 들어, 핵산, 펩티드 또는 단백질)이 이러한 성분이 자연적으로 발생하는 생물체의 다른 생물학적 성분, 다시 말하면, 다른 염색체 및 염색체외 DNA와 RNA, 그리고 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 이들과 별개로 생산되거나, 또는 이들로부터 정제되었다는 것을 의미한다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 따라서, 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 조성물의 부분일 수 있고, 그리고 만약 이런 조성물이 상기 핵산, 펩티드, 또는 단백질의 선천적 환경의 일부가 아니면, 여전히 단리될 수 있다. 상기 용어는 또한, 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산을 아우른다. 본원에서 이용된 바와 같이, "단리된" FN3 도메인은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 FN3 도메인이 실제적으로 없는 FN3 도메인을 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인은 인간 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인이 실제적으로 없다). 인간 혈청 알부민의 에피토프, 동종형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인은 하지만, 예로서 다른 종(예를 들어, 혈청 알부민 종 동족체)으로부터 다른 관련된 항원에 교차반응성을 가질 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "섬유결합소 III형(FN3) 도메인"(FN3 도메인)은 섬유결합소, 테나신, 세포내 세포골격 단백질, 사이토킨 수용체 및 원핵 효소를 비롯한 단백질에서 빈번하게 발생하는 도메인을 지칭한다(Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990). 예시적인 FN3 도메인은 인간 테나신 C 내에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 인간 섬유결합소(FN) 내에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 그리고 예로서, U.S. 특허 번호 8,278,419에서 설명된 바와 같은 비자연 합성 FN3 도메인이다. 개별 FN3 도메인은 도메인 번호 및 단백질 명칭, 예를 들면, 테나신의 3번째 FN3 도메인(TN3), 또는 섬유결합소의 10번째 FN3 도메인(FN10)에 의해 지칭된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "센티린"은 인간 테나신 C 내에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인의 공통 서열에 기초되는 FN3 도메인을 지칭한다.
용어 "포획제"는 특정 유형의 세포에 결합하고, 그리고 다른 세포로부터 상기 세포의 단리를 가능하게 하는 물질을 지칭한다. 포획제의 실례는 자성 비드, 자성유체, 캡슐화 시약 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
용어 "생물학적 표본"은 혈액, 조직, 골수, 객담 등을 지칭한다.
용어 "진단 시약"은 물질이 진단 키트 내에서 단일 물질로서 또는 다른 물질과의 조합으로 분포되는 지에 상관없이, 생물학적 표본을 분석하는데 이용될 수 있는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치환하는" 또는 "치환된" 또는 "돌연변이시키는" 또는 "돌연변이된"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 변경하거나, 결실시키거나 또는 삽입하여 상기 서열의 변이체를 산출하는 것을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "무작위화하는" 또는 "무작위화된" 또는 "다양화된" 또는 "다양화하는"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에서 최소한 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 만드는 것을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "변이체"는 하나 또는 그 이상의 변형, 예를 들면, 치환, 삽입 또는 결실에 의해, 참고 폴리펩티드 또는 참고 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 약 1x10-6 M 또는 그 이하, 예를 들면, 약 1x10-7 M 또는 그 이하, 약 1x10-8 M 또는 그 이하, 약 1x10-9 M 또는 그 이하, 약 1x10-10 M 또는 그 이하, 약 1x10-11 M 또는 그 이하, 약 1x10-12 M 또는 그 이하, 또는 약 1x10-13 M 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로, 미리 결정된 항원에 결합하는 본 발명의 FN3 도메인의 능력을 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 FN3 도메인은 예로서, Proteon Instrument(BioRad)를 이용한 표면 플라스몬 공명으로 계측될 때, 비특이적 항원(예를 들어, BSA 또는 카제인)에 대한 이의 KD보다 최소한 10배 적은 KD로 미리 결정된 항원(다시 말하면, 인간 CD8A)에 결합한다. 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단리된 FN3 도메인은 하지만, 다른 관련된 항원, 예를 들면, 다른 종(오르소로그), 예를 들면, 마카카 파스시쿨라리스(Macaca Fascicularis)(시노몰구스 원숭이, cyno) 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)(침팬지)로부터 동일한 미리 결정된 항원에 교차반응성을 가질 수도 있다.
용어 "라이브러리"는 변이체의 수집물을 지칭한다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 변이체로 구성될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "CD8A" 또는 "CD8"은 예로서, NCBI 참고 서열: NP_001139345.1, NP_0011759.3 및 NP_741969.1에서 설명된 바와 같은 인간 CD8 알파 단백질을 특정적으로 포함한다. CD8A는 또한, 과학 문헌에서 CD8A 분자, MAL, p32, Leu2, T-세포 표면 당단백질 CD8 알파 사슬, CD8 항원, 알파 폴리펩티드(p32), Leu2 T-림프구 항원, OKT8 T-세포 항원, T-세포 항원 Leu2, T-림프구 분화 항원 T8/Leu-2, 그리고 T8 T-세포 항원으로서 알려져 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "텐콘"은 서열 번호: 1에서 도시되고 U.S. 특허공개번호 US2010/0216708에서 설명된 서열을 갖는 합성 섬유결합소 III형(FN3) 도메인을 지칭한다.
용어 "벡터"는 생물학적 시스템 내에서 복제될 수 있거나 또는 이런 시스템 사이에서 이동될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 생물학적 시스템 내에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 요소, 예를 들면, 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선별 마커를 내포한다. 이런 생물학적 시스템의 실례는 세포, 바이러스, 동물, 식물, 그리고 벡터를 복제할 수 있는 생물학적 성분을 활용하는 재구성된 생물학적 시스템을 포함할 수 있다. 벡터를 구성하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자, 또는 이들의 하이브리드일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 번역을 주도하기 위해, 생물학적 시스템에서 또는 재구성된 생물학적 시스템에서 활용될 수 있는 벡터를 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 당인산 중추 또는 다른 동등한 공유 화학에 의해 공유 연결된 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 분자를 의미한다. 이중 및 단일 가닥 DNAs와 RNAs는 폴리뉴클레오티드의 전형적인 실례이다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 연결되어 폴리펩티드를 형성하는 최소한 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 약 50개보다 적은 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조합으로"는 2가지 또는 그 이상 치료제가 혼합물에서 함께, 단일 작용제로서 동시에, 또는 임의의 순서로 단일 작용제로서 순차적으로 개체에게 투여될 수 있다는 것을 의미한다.
물질 조성물
본 발명은 인간 CD8A 결합 FN3 도메인 및 검출가능한 표지에 접합된 CD8A 결합 FN3 도메인을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 FN3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보성 핵산, 벡터, 숙주 세포, 그리고 이들을 만들고 이용하는 방법을 제공한다.
CD8A 결합 분자
본 발명은 검출가능한 표지에 임의선택적으로 접합된 CD8A에 특이적으로 결합하는 섬유결합소 III형(FN3) 도메인을 제공한다. 이들 분자는 전임상 적용에서 및 CD8A를 생물마커로서 이용한 암 진단학에서 폭넓게 이용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 FN3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보성 핵산, 벡터, 숙주 세포, 그리고 이들을 만들고 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 FN3 도메인은 CD8A에 높은 친화성으로 결합하고, 그리고 CD8-발현 세포를 국부화하고, 따라서 진단 시약을 종양 미세환경 내로 전달하는 효율적인 방식을 제공할 수 있다.
본 발명의 한 구체예는 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이다.
본원에서 설명된 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 FN3 도메인은 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 갖는 시노몰구스 원숭이 CD8A와 교차반응한다.
본 발명의 FN3 도메인은 당업자에 의해 실시된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명으로 결정될 때 약 1x10-7 M보다 적은, 예를 들면, 약 1x10-8 M보다 적은, 약 1x10-9 M보다 적은, 약 1x10-10 M보다 적은, 약 1x10-11 M보다 적은, 약 1x10-12 M보다 적은, 또는 약 1x10-13 M보다 적은 해리 상수(KD)로 인간, 마카카 파시쿨라리스(Macaca Fascicularis) 및/또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes) CD8A에 결합할 수 있다. 특정 FN3 도메인-항원 상호작용의 계측된 친화성은 상이한 조건(예를 들어, 오스몰농도, pH) 하에 계측되면 변할 수 있다. 따라서, 친화성 및 다른 항원 결합 파라미터(예를 들어, KD, k온, k오프)의 계측은 단백질 골격 및 항원의 표준화된 용액, 그리고 표준화된 완충액, 예를 들면, 본원에서 설명된 완충액으로 수행된다.
일부 구체예에서, CD8A 결합 FN3 도메인은 상기 분자의 N 말단에 연결된 개시자 메티오닌(Met)을 포함한다.
일부 구체예에서, CD8A 결합 FN3 도메인은 FN3 도메인에 연결된 시스테인(Cys)을 포함한다.
N 말단 Met 및/또는 Cys의 부가는 두 번째 분자의 발현 및/또는 접합을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이고, 그리고 여기서 상기 CD8A-특이적 FN3 도메인은 시험관내에서 CD8+ T-세포를 활성화시키지 않는다. CD8+ T 세포 활성화는 표준 방법을 이용하여 계측될 수 있다. 예를 들어, 효소결합 면역점(ELISPOT) 검정이 이용될 수 있다. ELISPOT 검정은 샌드위치 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 기술을 이용한다. 인터페론-감마 항체가 PVDF(폴리비닐리덴 이플루오르화물)-지지된 마이크로평판 위에 피복된다. 적절하게 자극된 세포(세포 + 펩티드, FN3 도메인 등)가 웰 내로 피펫팅되고, 그리고 마이크로평판이 가습된 37℃ CO2 인큐베이터 내로 특정된 기간 동안 배치된다. 이러한 배양 기간 동안, 고정된 인터페론-감마 항체가 분비 세포의 바로 인근에서, 분비된 인터페론 감마에 결합한다. 임의의 세포 및 결합되지 않은 물질을 씻어낸 후, 두 번째 비오틴화된 인터페론-감마 항체가 웰에 첨가된다. 임의의 결합되지 않은 비오틴화된 항체를 제거하기 위한 세척 이후에, 스트렙타비딘에 접합된 알칼리성-포스파타아제가 첨가된다. 결합되지 않은 효소는 차후에, 세척함으로써 제거되고, 그리고 기질 용액(BCIP/NBT)이 첨가된다. 짙은 남빛으로 착색된 침전물이 형성되고, 그리고 인터페론-감마 국부화의 부위에서 스팟으로서 나타나는데, 각 개별 스팟은 개별 인터페론 감마-분비 세포를 나타낸다. 이들 스팟은 자동화된 ELISpot 판독기 시스템으로, 또는 입체현미경을 이용하여 수동으로 계수될 수 있다. 본 발명의 단리된 CD8A 결합 FN3 도메인은 실시예에서 설명된 바와 같이 1 μM 농도에서 시험될 때, 시험관내에서 CD8+ T-세포를 활성화시키지 않는다.
본원에서 설명된 발명의 일부 구체예에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호: 40-269의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 설명된 발명의 일부 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 서열 번호: 79, 81, 83, 89, 122 및 68의 잔기 위치 54에서 시스테인 치환을 갖는다.
단백질 서열 내로 시스테인의 도입을 유발하는 치환은 표준 화학을 이용하여, 소형 분자, 예를 들면, 세포독성 작용제, 검출가능한 표지, 반감기 연장 분자, 킬레이터, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 핵산을 FN3 도메인에 화학적으로 접합하는데 활용될 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 서열 번호: 229-234의 FN3 도메인과 인간 CD8A에 결합에 대해 경쟁한다. FN3 도메인은 널리 알려진 시험관내 방법을 이용하여, 인간 CD8A에 결합에 대한 참고 분자와의 경쟁에 대해 평가될 수 있다. 예시적인 방법에서, 인간 CD8A를 재조합적으로 발현하는 HEK 세포가 표지화되지 않은 참고 분자와 함께 4℃에서 15 분 동안 배양되고, 그 이후에 과잉의 형광 표지화된 검사 FN3 도메인과 함께 4℃에서 45 분 동안 배양될 수 있다. PBS/BSA에서 세척한 후, 형광은 표준 방법을 이용한 유세포분석법에 의해 계측될 수 있다. 다른 예시적인 방법에서, 인간 CD8A의 세포외 부분이 ELISA 평판의 표면상에서 코팅될 수 있다. 과잉의 표지화되지 않은 참고 분자가 약 15 분 동안 첨가될 수 있고, 그리고 차후에, 비오틴화된 검사 FN3 도메인이 첨가될 수 있다. PBS/Tween에서 세척 후, 검사 비오틴화된 FN3 도메인의 결합이 양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합된 스트렙타비딘을 이용하여 검출될 수 있고, 그리고 신호가 표준 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 경쟁 검정에서, 참고 분자가 표지화되고 검사 FN3 도메인이 표지화되지 않을 수도 있다는 것은 너무나 명백하다. 검사 FN3 도메인은 참고 분자가 검사 FN3 도메인의 결합을, 또는 검사 FN3 도메인이 참고 분자의 결합을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 저해할 때, 상기 참고 분자와 경쟁할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인은 방사성 금속에 결합할 수 있고 종양 분포, 종양 내부에 CD8-T 세포의 존재에 대한 진단 및/또는 암 치료의 효력을 평가하기 위한 영상화 작용제로서 이용될 수도 있는 킬레이터에 접합된다.
일부 구체예에서, CD8A-특이적 FN3 도메인은 신장 및/또는 간 청소를 통해 혈액으로부터 제거된다.
텐콘 서열에 기초된 라이브러리로부터 CD8A 결합 FN3 도메인의 단리
텐콘(서열 번호: 1)은 인간 테나신-C로부터 15개의 FN3 도메인의 공통 서열로부터 설계된 비자연발생 섬유결합소 III형(FN3) 도메인이다(Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; U.S. 특허 공개 번호 2010/0216708). 텐콘의 결정 구조는 FN3 도메인에 특징적인 7개의 베타 가닥을 연결하는 6개의 표면-노출된 루프를 보여주는데, 이들 베타 가닥은 A, B, C, D, E, F 및 G로서 지칭되고, 그리고 이들 루프는 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 루프로서 지칭된다(Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992; U.S. 특허번호 6,673,901). 이들 루프, 또는 각 루프 내에 선별된 잔기는 CD8A에 결합하는 신규한 분자를 선별하는데 이용될 수 있는 섬유결합소 III형(FN3) 도메인의 라이브러리를 작제하기 위해 무작위화될 수 있다. 표 1은 텐콘(서열 번호: 1) 내에서 각 루프와 베타 가닥의 위치와 서열을 보여준다.
텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 따라서, 무작위화된 FG 루프, 또는 무작위화된 BC와 FG 루프, 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같은 라이브러리 TCL1 또는 TCL2를 가질 수 있다. 텐콘 BC 루프는 7개 아미노산 길이이고, 따라서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산이 BC 루프에서 다양화되고 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리에서 무작위화될 수 있다. 텐콘 FG 루프는 7개 아미노산 길이이고, 따라서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산이 FG 루프에서 다양화되고 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리에서 무작위화될 수 있다. 텐콘 라이브러리 내에 루프에서 추가 다양성이 루프에서 잔기의 삽입 및/또는 결실에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, FG 및/또는 BC 루프는 1-22개 아미노산이 연장되거나, 또는 1-3개 아미노산이 줄어들 수 있다. 텐콘 내에 FG 루프는 7개 아미노산 길이이고, 반면 항체 중쇄 내에 상응하는 루프는 4-28개 잔기의 범위에서 변한다. 최대 다양성을 제공하기 위해, FG 루프는 4-28개 잔기의 항체 CDR3 길이 범위에 상응하도록 서열에서뿐만 아니라 길이에서 다양화될 수 있다. 예를 들어, FG 루프는 루프를 추가 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산에 의해 연장함으로써 길이에서 더욱 다양화될 수 있다.
텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 또한, FN3 도메인의 한 측면을 형성하고, 그리고 2개 또는 그 이상의 베타 가닥 및 최소한 하나의 루프를 포함하는 무작위화된 대안적 표면을 가질 수도 있다. 이와 같은 한 가지 대안적 표면은 C와 F 베타 가닥 및 CD와 FG 루프 내에 아미노산에 의해 형성된다(C-CD-F-FG 표면). 텐콘 대안적 C-CD-F-FG 표면에 기초된 라이브러리 설계는 U.S. 특허공개번호 US2013/0226834에서 설명된다. 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 또한, 텐콘 변이체, 예를 들면, 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73, 또는 86(서열 번호: 1에 상응하는 잔기 넘버링)에서 치환을 갖는 텐콘 변이체에 기초하여 설계된 라이브러리를 포함하고, 그리고 이들 변이체는 향상된 열 안정성을 전시한다. 예시적인 텐콘 변이체는 US 특허공개번호 2011/0274623에서 설명되고, 그리고 서열 번호: 1의 텐콘과 비교할 때 치환 E11R, L17A, N46V 및 E86I를 갖는 텐콘27(서열 번호: 4)을 포함한다.
표 1. 텐콘 위상
텐콘 및 다른 FN3 서열 기초된 라이브러리는 무작위 또는 규정된 세트의 아미노산을 이용하여, 선택된 잔기 위치에서 무작위화될 수 있다. 예를 들어, 무작위 치환을 갖는 라이브러리에서 변이체는 NNK 코돈을 이용하여 산출될 수 있는데, 이들은 20개의 자연발생 아미노산 모두를 인코딩한다. 다른 다양화 계획에서, DVK 코돈이 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly 및 Cys를 인코딩하는데 이용될 수 있다. 대안으로, NNS 코돈이 20개의 아미노산 잔기 모두를 발생시키고, 그리고 이와 동시에 종결 코돈의 빈도를 감소시키는데 이용될 수 있다. 다양화되는 위치에서 편향된 아미노산 분포를 갖는 FN3 도메인의 라이브러리는 예로서, Slonomics®기술(http:_//www_sloning_com)을 이용하여 합성될 수 있다. 이러한 기술은 수천 번의 유전자 합성 과정을 위해 충분히 보편적인 빌딩 블록으로서 행동하는 미리 만들어진 이중 가닥 삼중항의 라이브러리를 이용한다. 이러한 삼중항 라이브러리는 임의의 원하는 DNA 분자를 구축하는데 필요한 모든 가능한 서열 조합을 나타낸다. 코돈 지정은 널리 공지된 IUB 코드에 따른다.
본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 골격 단백질을 인코딩하는 DNA 단편을 RepA를 인코딩하는 DNA 단편에 결찰하여, 시험관내 번역 후 형성되는 단백질-DNA 복합체의 풀을 산출하기 위한 시스 전시를 이용하여 FN3 라이브러리, 예를 들면, 텐콘 라이브러리를 생산하고, 여기서 각 단백질은 자신을 인코딩하는 DNA와 안정되게 연관되고(U.S. 특허번호 7,842,476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004), 그리고 당해 분야에서 공지되고 실시예에서 설명된 임의의 방법에 의해 CD8A에 특이적 결합에 대해 상기 라이브러리를 검정함으로써 단리될 수 있다. 이용될 수 있는 예시적인 널리 공지된 방법은 ELISA, 샌드위치 면역검정, 그리고 경쟁적 및 비경쟁적 검정이다(예를 들어, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York를 참조한다). CD8A에 특이적으로 결합하는 확인된 FN3 도메인은 CD8A 활성의 저해, 내재화, 안정성, 그리고 다른 원하는 특징에 대해 더욱 특징화된다.
본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 임의의 FN3 도메인을 라이브러리를 산출하기 위한 주형으로서 이용하고, 그리고 본 명세서 내에 제공된 방법을 이용하여 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 분자에 대해 상기 라이브러리를 선별검사함으로써 산출될 수 있다. 이용될 수 있는 예시적인 FN3 도메인은 테나신 C의 3번째 FN3 도메인(TN3)(서열 번호: 145), 피브콘(Fibcon)(서열 번호: 146), 그리고 섬유결합소의 10번째 FN3 도메인(FN10)(서열 번호: 147)이다. 표준 클로닝 및 발현 기술이 라이브러리를 벡터 내로 클로닝하거나 또는 라이브러리의 이중 가닥 cDNA 카세트를 합성하고, 시험관내에서 이들 라이브러리를 발현하거나 또는 번역하는데 이용된다. 예를 들어, 리보솜 전시(Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), mRNA 전시(Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997), 또는 다른 무세포 시스템(U.S. 특허 번호 5,643,768)이 이용될 수 있다. FN3 도메인 변이체의 라이브러리는 예로서, 임의의 적합한 박테리오파지의 표면상에서 전시되는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 박테리오파지의 표면상에서 융합 폴리펩티드를 전시하기 위한 방법은 널리 알려져 있다(U.S. 특허공개번호 2011/0118144; 국제특허공개번호 WO2009/085462; U.S. 특허번호 6,969,108; U.S. 특허번호 6,172,197; U.S. 특허번호 5,223,409; U.S. 특허번호 6,582,915; U.S. 특허번호 6,472,147).
본원에서 설명된 발명의 일부 구체예에서, 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 서열 번호: 1의 텐콘 서열 또는 서열 번호: 4의 텐콘27 서열, 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73 및/또는 86에서 임의선택적으로 치환을 갖는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 4에 근거된다.
본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 그들의 성질을 향상시키기 위해, 예를 들면, 열 접힘 및 중첩풀림의 열 안정성 및 가역성을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 고도로 유사한 열안정성 서열과의 비교에 근거된 합리적인 설계, 이황화 가교를 안정시키는 설계, 알파-나선 성향을 증가시키는 돌연변이, 염 가교의 가공, 단백질의 표면 전하의 변경, 유도 진화, 그리고 공통 서열의 조성을 비롯한 여러 방법이 단백질 및 효소의 겉보기 열 안정성을 증가시키기 위해 적용되었다(Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001). 높은 열 안정성은 발현된 단백질의 수율을 증가시키고, 용해도 또는 활성을 향상시키고, 면역원성을 감소시키고, 그리고 제조 동안 콜드 체인의 요구를 최소화시킬 수 있다. 텐콘(서열 번호: 1)의 열 안정성을 향상시키기 위해 치환될 수 있는 잔기는 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73 또는 86이고, 그리고 US 특허공개번호 2011/0274623에서 설명된다. 이들 잔기에 상응하는 치환이 본 발명의 FN3 도메인 내포 분자에 통합될 수 있다.
단백질 안정성 및 단백질 불안정성의 계측은 단백질 완전성의 동일하거나 또는 상이한 양상으로서 여겨질 수 있다. 단백질은 열, 자외선 또는 전리 방사선, 만약 액체 용액 내에 있으면 주변 오스몰농도 및 pH에서 변화, 작은 구멍-크기 여과에 의해 부과된 기계적 전단력, 자외선 복사, 전리 방사선, 예를 들면, 감마선 조사, 화학적 또는 열 탈수, 또는 단백질 구조 붕괴를 유발할 수 있는 임의의 다른 작용 또는 힘에 의해 유발된 변성에 민감하거나 또는 "불안정"하다. 분자의 안정성은 표준 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 분자의 안정성은 표준 방법을 이용하여, 분자의 절반이 풀어지는 °섭씨(℃) 온도인 열 용융("Tm") 온도를 계측함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로, Tm이 더욱 높을수록, 분자는 더욱 안정된다. 열에 더하여, 화학적 환경 또한, 특정 3차원 구조를 유지하는 단백질의 능력을 변화시킨다.
한 구체예에서, 본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 Tm에서 증가에 의해 계측될 때, 가공에 앞서 동일한 도메인과 비교하여 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상 증가된 안정성을 전시할 수 있다.
화학적 변성은 다양한 방법에 의해 유사하게 계측될 수 있다. 화학적 변성제는 구아니디늄 염산염, 구아니디늄 티오시안산염, 요소, 아세톤, 유기 용매(DMF, 벤젠, 아세토니트릴), 염(황산암모늄, 브롬화리튬, 염화리튬, 브롬화나트륨, 염화칼슘, 염화나트륨); 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨, 베타-메르캅토에탄올, 디니트로티오벤젠, 그리고 수소화물, 예를 들면, 수소화붕소나트륨), 비이온성 및 이온성 세정제, 산(예를 들어, 염화수소산(HCl), 아세트산(CH3COOH), 할로겐화된 아세트산), 소수성 분자(예를 들어, 인지질), 그리고 표적화된 변성제를 포함한다. 변성의 정도의 정량은 기능적 성질, 예를 들면, 표적 분자에 결합하는 능력의 상실, 또는 생리화학적 성질, 예를 들면, 응집의 경향, 이전에는 용매 접근이 불가능했던 잔기의 노출, 또는 이황화 결합의 붕괴 또는 형성에 의존할 수 있다.
본 발명의 FN3 도메인은 예로서, 원자가 및 따라서, 표적 분자 결합의 결합능을 증가시키거나, 또는 2개 또는 그 이상의 상이한 표적 분자에 동시에 결합하는 이중- 또는 다중특이적 골격을 산출하기 위한 수단으로서 단위체, 이합체 또는 다합체로서 산출될 수 있다. 이합체 및 다합체는 예로서, 아미노산 링커, 예를 들면, 폴리-글리신, 글리신 및 세린, 또는 알라닌 및 프롤린을 내포하는 링커의 포함에 의해, 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적 단백질 골격을 연결함으로써 산출될 수 있다. 예시적인 링커는(GS)2(서열 번호: 148), (GGGS)2(서열 번호: 149), (GGGGS)5(서열 번호: 150), (AP)2(서열 번호: 151), (AP)5(서열 번호: 152), (AP)10(서열 번호: 153), (AP)20(서열 번호: 154) 및 A(EAAAK)5AAA(서열 번호: 142)를 포함한다. 이합체 및 다합체는 N-에서 C-방향으로 서로에 연결될 수 있다. 폴리펩티드를 신규한 연결된 융합 폴리펩티드 내로 연결하기 위한 자연발생뿐만 아니라 인공 펩티드 링커의 이용은 기존 문헌에서 널리 알려져 있다(Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; U.S. 특허 번호 5,856,456).
진단 시약
본 발명에 따라서, 본 발명의 CD8A-특이적 FN3 도메인은 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 검출가능한 표지는 FN3 도메인에 접합되는 킬레이트화제와 복합화될 수 있다. 다른 구체예에서, 검출가능한 표지는 FN3 도메인에 접합되는 링커에 접합되는 킬레이트화제와 복합화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 검출가능한 표지는 FN3 도메인에 접합되는 링커에 연계될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 검출가능한 표지는 두 번째 분자에 의해 특이적으로 결합되는 표지의 능력에 의해 본 발명의 펩티드에 간접적으로 부착될 수 있다. 이러한 유형의 간접적으로 부착된 표지의 한 가지 실례는 두 번째 분자, 스트렙타비딘에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 비오틴 표지이다. 단일, 이중 또는 복수 표지화가 유리할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "검출가능한 표지"는 본 발명의 FN3 도메인에 부착될 때, FN3 도메인을 검출가능하게 만드는 임의의 유형의 표지이다. 검출가능한 표지는 또한, 세포에 독성이거나 또는 세포독성일 수 있다. 일반적으로, 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학발광 분자, 플루오로크롬, 형광단, 형광 퀀칭 작용제, 착색된 분자, 방사성동위원소, 방사성 핵종, 신틸란트, 대량 표지, 예를 들면, 금속 원자(질량 변화를 통한 검출을 위해), 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이들의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2+, Flag 태그, myc 태그, 중금속, 효소, 알칼리성 포스파타아제, 페록시다아제, 루시페라아제, 전자 공여자/수용자, 아크리디늄 에스테르, 그리고 비색 기질을 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 검출가능한 표지는 방사성 핵종이다. 당업자는 본 발명의 작업에서 이용될 수 있는, 전술되지 않은 다른 유용한 표지를 쉽게 인식할 것이다.
검출가능한 표지는 신호 변환 기계에 의해 검출될 수 있는 신호를 방출한다. 일부 경우에, 검출가능한 표지는 예로서, 검출가능한 표지가 방사성 핵종일 때 신호를 자연발생적으로 방출할 수 있다. 다른 경우에, 검출가능한 표지는 예로서, 검출가능한 표지가 이완성 금속일 때, 외부장에 의해 자극되는 결과로서 신호를 방출한다. 신호의 실례는 제한 없이, 감마선, X선, 가시광선, 적외선 에너지, 그리고 전파를 포함한다. 신호 변환 기계의 실례는 제한 없이, SPECT/CT 장치를 포함하는 감마 카메라, PET 스캐너, 형광계, 그리고 자기 공명 영상법(MRI) 기계를 포함한다. 따라서, 검출가능한 표지는 자기 공명 영상법, 신티그래피 영상화, 초음파, 또는 형광을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함한다.
적합한 형광단은 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC), 플루오레세인 티오세미카르바지드, 로다민, Texas Red, CyDyes(예를 들어, Cy3, Cy5, Cy5.5), Alexa Fluors(예를 들어, Alexa488, Alexa555, Alexa594; Alexa647), 근적외선(NIR)(700-900 nm) 형광 염료, 그리고 카보시아닌 및 아미노스티릴 염료를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 FN3 도메인은 당해 분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 상기 작용제를 형광단으로 표지화함으로써, 형광 검출을 위해 표지화될 수 있다(예를 들어, Lohse et al., Bioconj Chem 8:503-509(1997)를 참조한다). 예를 들어, 많은 공지된 염료가 NH2-말단 아미노산 잔기에 연계될 수 있다. 대안으로, 플루오로크롬, 예를 들면, 플루오레세인이 펩티드 링커의 리신 잔기에 결합될 수 있다.
방사성 핵종은 γ-방출 방사성 핵종, 오제-방출 방사성 핵종, β-방출 방사성 핵종, 알파-방출 방사성 핵종, 또는 양전자-방출 방사성 핵종일 수 있다. 방사성 핵종은 검출가능한 표지 및/또는 세포독성 작용제일 수 있다. 적합한 방사성 핵종의 무제한적 실례는 탄소-11, 질소-13, 산소-15, 플루오르-18, 플루오로데옥시글루코오스-18, 아인산-32, 스칸듐-47, 구리-64, 65 및 67, 갈륨-67 및 68, 브롬-75, 77 및 80m, 루비듐-82, 스트론튬-89, 지르코늄-89, 이트륨-86 및 90, 루테늄-95, 97, 103 및 105, 레늄-99m, 101, 105, 186 및 188, 테크네튬-99m, 로듐-105, 수은-107, 팔라듐-109, 인듐-111, 은-111, 인듐-113m, 란탄족-114m, 주석-117m, 텔루륨-121 m, 122m 및 125m, 요오드-122, 123, 124, 125, 126, 131 및 133, 프라세오디뮴-142, 프로메튬-149, 사마륨-153, 가돌리늄-159, 툴륨-165, 167 및 168, 디스프로슘-165, 홀뮴-166, 루테튬-177, 레늄-186 및 188, 이리듐-192, 백금-193 및 195m, 금-199, 탈륨-201, 티타늄-201, 아스타틴-211, 비스무트-212 및 213, 납-212, 라듐-223, 악티늄-225, 그리고 이들로부터 유래된 차아질산 또는 산화물 형태를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 방사성 핵종은 구리-64, 지르코늄-89, 이트륨-90, 인듐-111 및 루테튬-177로 구성된 군에서 선택된다. 다른 특정한 구체예에서, 방사성 핵종은 이트륨-90, 인듐-111 및 루테튬-177로 구성된 군에서 선택된다. 한 예시적인 구체예에서, 방사성 핵종은 지르코늄-89이다.
다양한 금속 원자가 검출가능한 표지로서 이용될 수 있다. 금속 원자는 일반적으로, 20 또는 그 이상의 원자 번호를 갖는 금속으로 구성된 금속 원자의 군에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 금속 원자는 칼슘 원자, 스칸듐 원자, 티타늄 원자, 바나듐 원자, 크롬 원자, 망간 원자, 철 원자, 코발트 원자, 니켈 원자, 구리 원자, 아연 원자, 갈륨 원자, 게르마늄 원자, 비소 원자, 셀레늄 원자, 브롬 원자, 크립톤 원자, 루비듐 원자, 스트론튬 원자, 이트륨 원자, 지르코늄 원자, 니오븀 원자, 몰리브덴 원자, 테크네튬 원자, 루테늄 원자, 로듐 원자, 팔라듐 원자, 은 원자, 카드뮴 원자, 인듐 원자, 주석 원자, 안티몬 원자, 텔루륨 원자, 요오드 원자, 크세논 원자, 세슘 원자, 바륨 원자, 란타늄 원자, 하프늄 원자, 탄탈룸 원자, 텅스텐 원자, 레늄 원자, 오스뮴 원자, 이리듐 원자, 백금 원자, 금 원자, 수은 원자, 탈륨 원자, 납 원자, 비스무트 원자, 프란슘 원자, 라듐 원자, 악티늄 원자, 세륨 원자, 프라세오디뮴 원자, 네오디뮴 원자, 프로메튬 원자, 사마륨 원자, 유로퓸 원자, 가돌리늄 원자, 테르븀 원자, 디스프로슘 원자, 홀뮴 원자, 에르븀 원자, 툴륨 원자, 이테르븀 원자, 루테튬 원자, 토륨 원자, 프로트악티늄 원자, 우라늄 원자, 넵투늄 원자, 플루토늄 원자, 아메리슘 원자, 퀴륨 원자, 버클륨 원자, 칼리포르늄 원자, 아인시타이늄 원자, 페르뮴 원자, 멘델레븀 원자, 노벨륨 원자, 또는 로렌슘 원자일 수 있다. 일부 구체예에서, 금속 원자는 20보다 큰 원자 번호를 갖는 알칼리 금속을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 금속 원자는 20보다 큰 원자 번호를 갖는 알칼리성 토류 금속을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 금속 원자는 란탄족을 포함하는 금속의 군에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 금속 원자는 악티니드를 포함하는 금속의 군에서 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 금속 원자는 전이 금속을 포함하는 금속의 군에서 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 금속 원자는 전이후 금속을 포함하는 금속의 군에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 금속 원자는 금 원자, 비스무트 원자, 탄탈룸 원자 및 가돌리늄 원자를 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 금속 원자는 53(다시 말하면, 요오드) 내지 83(다시 말하면, 비스무트)의 원자 번호를 갖는 금속을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 대안적 구체예에서, 금속 원자는 자기 공명 영상법에 적합한 원자일 수 있다. 다른 대안적 구체예에서, 금속 원자는 CT의 X선 에너지 밴드에서 K-엣지를 갖는 금속으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 바람직한 금속 원자는 망간, 철, 가돌리늄, 금 및 요오드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
금속 원자는 +1, +2, 또는 +3 산화 상태의 형태에서 금속 이온일 수 있다. 예를 들어, 무제한적 실례는 Ba2+, Bi3+, Cs+, Ca2+, Cr2+, Cr3+, Cr6+, Co2+, Co3+, Cu+, Cu2+, Cu3+, Ga3+, Gd3+, Au+, Au3+, Fe2+, Fe3+, F3+, Pb2+, Mn2+, Mn3+, Mn4+, Mn7+, Hg2+, Ni2+, Ni3+, Ag+, Sr2+, Sn2+, Sn4+ 및 Zn2+을 포함한다. 금속 원자는 금속 산화물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 금속 산화물의 무제한적 실례는 산화철, 산화망간, 또는 산화가돌리늄을 포함할 수 있다. 추가 실례는 자철석, 자적철석, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서, 킬레이트화제를 포함하는 FN3 도메인은 방사성 핵종 또는 금속 원자를 통합할 수 있다. 방사성 핵종 또는 금속 원자 및 FN3 도메인-킬레이트화 작용제 복합체의 통합은 배위 화학의 분야에서 통상적인 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.
반감기 연장 모이어티
본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 예로서, 공유 상호작용을 통해 다른 아단위를 통합할 수 있다. 본 발명의 한 양상에서, 본 발명의 FN3 도메인은 반감기 연장 모이어티를 더 포함한다. 예시적인 반감기 연장 모이어티는 알부민, 알부민 변이체, 알부민 결합 단백질 및/또는 도메인, 트랜스페린 및 이의 단편과 유사체, 그리고 Fc 영역이다.
원하는 성질을 위해 추가 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 예를 들면, PEG5000 또는 PEG20,000, 상이한 사슬 길이의 지방산 및 지방산 에스테르, 예를 들면, 라우린산염, 미리스트산염, 스테아르산염, 아라키데이트, 베헤네이트, 올레산염, 아라키돈산염, 옥탄디오익산, 테트라데칸디오익산, 옥타데칸디오익산, 도코산디오익산 등, 폴리리신, 옥탄, 탄수화물(덱스트란, 셀룰로오스, 올리고당류 또는 다당류)가 본 발명의 FN3 도메인 내로 통합될 수 있다. 이들 모이어티는 단백질 골격 코딩 서열과의 직접적인 융합일 수 있고, 그리고 표준 클로닝 및 발현 기술에 의해 산출될 수 있다. 대안으로, 널리 공지된 화학적 연계 방법이 이들 모이어티를 본 발명의 재조합적으로 생산된 분자에 부착하는데 이용될 수 있다.
페길 모이어티는 예로서, 시스테인 잔기를 상기 분자의 C 말단에 통합하거나, 또는 시스테인을 상기 분자의 인간 CD8A 결합 표면으로부터 방향이 벗어나는 잔기 위치 내로 가공하고, 그리고 널리 공지된 방법을 이용하여 페길 기를 시스테인에 부착함으로써 본 발명의 FN3 도메인에 부가될 수 있다. 추가 모이어티를 통합하는 본 발명의 FN3 도메인은 여러 널리 공지된 검정에 의해 기능성에 대해 비교될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인 및/또는 Fc 도메인 변이체의 통합에 기인한 변경된 성질은 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 또는 FcRn 수용체와 같은 수용체의 가용성 형태를 이용한 Fc 수용체 결합 검정에서 검정되거나, 또는 예로서, ADCC 또는 CDC를 계측하거나, 또는 생체내 모형에서 본 발명의 분자의 약동학적 성질을 평가하는 널리 공지된 세포-기초된 검정을 이용하여 검정될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포
본 발명은 본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 인코딩하는 핵산을 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 발현 벡터의 일부로서, 또는 시험관내 전사/번역에 이용되는 선형 DNA 서열, 조성물의 원핵, 진핵 또는 실모양 파지 발현, 분비 및/또는 전시와 양립하는 벡터 또는 이들의 유도 돌연변이원을 비롯한 선형 DNA 서열의 일부로서 제공한다. 일정한 예시적인 폴리뉴클레오티드가 본원에서 개시되지만, 소정의 발현 시스템에서 유전자 코드의 축중성 또는 코돈 선호를 고려할 때, 본 발명의 FN3 도메인을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드 역시 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 한 구체예는 서열 번호: 40-269의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 예를 들면, 자동화된 폴리뉴클레오티드 합성장치에서 고체상 폴리뉴클레오티드 합성에 의해 생산되고 완전한 단일 또는 이중 가닥 분자로 조립될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR, 그 이후에 일과적인 클로닝과 같은 다른 기술에 의해 생산될 수 있다. 소정의 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드를 생산하거나 또는 획득하기 위한 기술은 당해 분야에서 널리 공지된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 비코딩 서열, 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서 서열, 인트론, 폴리아데닐화 신호, RepA 결합을 용이하게 하는 시스 서열 등을 포함할 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드 서열은 또한, 예로서 마커 또는 태그 서열, 예를 들면, 단백질의 정제 또는 검출을 용이하게 하는 히스티딘 태그 또는 HA 태그, 신호 서열, 융합 단백질 파트너, 예를 들면, RepA, Fc 또는 박테리오파지 외피 단백질, 예를 들면, pIX 또는 pIII를 인코딩하는 추가 아미노산을 인코딩하는 추가 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 최소한 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 이런 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 발현을 위한 벡터, 트랜스포손 기초된 벡터, 또는 임의의 수단에 의한 소정의 생물체 또는 유전적 배경 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 도입에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 이런 벡터는 이런 벡터에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 제어하거나, 조절하거나, 유발하거나 또는 허용할 수 있는 핵산 서열 요소를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 이런 요소는 전사 인핸서 결합 부위, RNA 중합효소 개시 부위, 리보솜 결합 부위, 그리고 소정의 발현 시스템에서 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하는 다른 부위를 포함할 수 있다. 이런 발현 시스템은 당해 분야에서 널리 공지된 세포-기초된 시스템, 또는 무세포 시스템일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 당해 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 세포주, 혼합된 세포주, 영속화 세포, 또는 영속화 세포의 클론 개체군에 의해 임의선택적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY(1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY(1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY(1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY(1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY,(1997-2001)를 참조한다.
발현을 위해 선택된 숙주 세포는 포유류 기원일 수 있거나, 또는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, He G2, SP2/0, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이들의 임의의 유도된, 영속화된 또는 형질전환된 세포에서 선택될 수 있다. 대안으로, 숙주 세포는 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 생물체, 예를 들면, 원핵 세포 또는 생물체, 예를 들면, BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), 그리고 임의의 자연 또는 가공된 대장균 종(E. coli spp.), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 또는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) 균주에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인을 생산하는 방법인데, 상기 방법은 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이 발현되도록 하는 조건 하에 본 발명의 단리된 숙주 세포를 배양하고, 그리고 FN3 도메인을 정제하는 것을 포함한다.
인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 재조합 세포 배양액으로부터 정제될 수 있다.
인간 CD8A를 검출하기 위한 키트
생물학적 표본에서 CD8A를 검출하기 위한 키트가 본원에서 제공된다. 이들 키트는 본원에서 설명된 CD8A-특이적 FN3 도메인 중에서 한 가지 또는 그 이상 및 상기 키트의 사용설명서를 포함한다.
제공된 CD8A-특이적 FN3 도메인은 용해 상태에 있거나; 동결건조되거나; 기질, 담체 또는 평판에 부착되거나; 또는 검출가능하게 표지화될 수 있다.
설명된 키트는 또한, 본원에서 설명된 방법을 수행하는데 유용한 추가 성분을 포함할 수 있다. 실례로서, 이들 키트는 개체로부터 표본을 획득하기 위한 수단, 대조 또는 참고 표본, 예를 들면, 천천히 진행하는 암을 앓는 개체 및/또는 암을 앓지 않는 개체로부터 표본, 한 가지 또는 그 이상의 표본 구획 및/또는 본 발명의 방법의 성과 및 조직 특이적 대조 또는 표준을 설명하는 교육 자료를 포함할 수 있다.
CD8A의 수준을 결정하기 위한 수단은 예로서, CD8A의 수준을 결정하기 위한 검정에서 이용을 위한 완충액 또는 다른 시약을 더 포함할 수 있다. 사용설명서는 예로서, 검정을 수행하기 위한 인쇄된 사용설명서 및/또는 CD8A의 수준을 평가하기 위한 사용설명서일 수 있다.
설명된 키트는 또한, 개체로부터 표본을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이들 수단은 개체로부터 유체 또는 조직을 획득하는데 이용될 수 있는 설비 또는 시약의 한 가지 또는 그 이상의 품목을 포함할 수 있다. 개체로부터 표본을 획득하기 위한 수단은 또한, 혈액 표본으로부터 혈액 성분, 예를 들면, 혈청을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 가급적이면, 키트는 인간 개체에서 이용 목적으로 설계된다.
본 발명의 인간 CD8A 결합 FN3 도메인의 용도
본 발명의 인간 CD8A에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 CD8A를 생물마커로서 이용하여, 세포, 조직, 장기, 유체, 또는 일반적으로, 숙주에서 인간 질환 또는 특정한 병리를 진단하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자에서 이용될 수 있다. 이런 동물의 실례는 포유동물, 예를 들면, 인간, 설치류, 개, 고양이 및 농장 동물을 포함한다.
구체예
본 발명은 또한, 다음의 무제한적 구체예를 제공한다.
1) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8A 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인.
2) 구체예 1의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD8A 단백질과 교차반응한다.
3) 구체예 2의 단리된 FN3 도메인, 여기서
a) 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 1의 텐콘 서열에 기초되고;
b) 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 4의 텐콘27 서열에 기초되고; 그리고/또는
c) 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 2, 3, 5, 6, 7 또는 8의 서열을 포함하는 라이브러리로부터 단리된다.
4) 구체예 3의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 FN3 도메인은 두 번째 분자에 접합된다.
5) 구체예 4의 단리된 FN3 도메인, 여기서 두 번째 분자는 검출가능한 표지이다.
6) 구체예 5의 단리된 FN3 도메인, 여기서 검출가능한 표지는 방사성동위원소, 자성 비드, 금속성 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염료, 전자 밀도 시약, 효소, 비오틴, 다이곡시제닌, 또는 합텐이다.
7) 구체예 3의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 79, 81, 83, 89, 122 및 68의 잔기 위치 54에서 시스테인 치환을 갖는다.
8) 구체예 3의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 FN3 도메인은 효소결합 면역점(ELISPOT) 검정으로 계측했을 때, 시험관내에서 CD8+ T-세포를 활성화시키지 않는다.
9) 구체예 3의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 229-234 중에서 한 가지의 아미노산 서열을 포함하는 FN3 도메인과 인간 CD8A 단백질에 결합에 대해 경쟁한다.
10) 구체예 3의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 FN3 도메인은 실시예 3에서 설명된 조건에 따라서 수행된 표면 플라스몬 공명으로 계측된 약 0.02 내지 약 6.6 nM 사이의 친화성(KD)으로 인간 CD8A 단백질에 결합한다.
11) 구체예 3의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 40-269의 아미노산 서열 중에서 한 가지를 포함한다.
12) FN3 도메인의 N 말단에서 메티오닌을 더 포함하는, 구체예 11의 단리된 FN3 도메인.
13) 구체예 3의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 FN3 도메인은 반감기 연장 모이어티에 연계된다.
14) 구체예 13의 단리된 FN3 도메인, 여기서 상기 반감기 연장 모이어티는 CD8 결합 분자, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), CD8, CD8 변이체, 또는 최소한 면역글로불린의 Fc 영역의 일부이다.
15) 구체예 3의 FN3 도메인을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
16) 구체예 15의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
17) 구체예 16의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
18) FN3 도메인이 발현되도록 하는 조건 하에 구체예 17의 단리된 숙주 세포를 배양하고, 그리고 FN3 도메인을 정제하는 것을 포함하는, 인간 CD8A 단백질에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 생산하는 방법.
19) 구체예 3의 FN3 도메인을 포함하는 진단 키트.
20) 구체예 3의 FN3 도메인을 포함하는 진단 시약 또는 포획제.
21) 구체예 20의 진단 시약 또는 포획제, 여기서 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 79, 81, 83, 89, 122 및/또는 68의 잔기 위치 54에서 시스테인 치환을 갖는다.
22) 구체예 21의 진단 시약, 여기서 치환된 시스테인은 Zr-89 또는 I-124에 접합된다.
23) 생물학적 표본을 구체예 20의 진단 시약으로 처리하고, 그리고 이런 진단 시약의 FN3 도메인에 생물학적 표본의 결합을 평가하는 것을 포함하는, 생물학적 표본에서 CD8-발현 세포를 검출하는 방법.
24) 구체예 23의 방법, 여기서 진단 시약은 서열 번호: 79, 81, 83, 89, 122 및/또는 68의 잔기 위치 54에서 시스테인 치환을 갖고, 그리고 치환된 시스테인은 Zr-89 또는 I-124에 접합된다.
실시예
다음 실시예는 이전 개시를 보충하고, 그리고 본원에서 설명된 요부에 관한 더욱 우수한 이해를 제공하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 설명된 요부를 한정하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에서 설명된 실시예와 구체예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그리고 이에 비추어, 다양한 변경 또는 변화는 당해 분야의 평균적 기술자에게 명백할 것이고, 범위 내에 포함되고, 그리고 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다.
실시예 1. 무작위화된 루프를 갖는 텐콘 라이브러리의 작제
텐콘(서열 번호: 1)은 인간 테나신-C로부터 15개 FN3 도메인의 공통 서열로부터 설계된 면역글로불린-유사 골격, 섬유결합소 III형(FN3) 도메인이다(Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; U.S. 특허 번호 8,278,419). 텐콘의 결정 구조는 7개의 베타 가닥을 연결하는 6개의 표면-노출된 루프를 보여준다. 이들 루프, 또는 각 루프 내에 선별된 잔기는 특정한 표적에 결합하는 신규한 분자를 선별하는데 이용될 수 있는 섬유결합소 III형(FN3) 도메인의 라이브러리를 작제하기 위해 무작위화될 수 있다.
텐콘:
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(서열 번호: 1):
다양한 라이브러리가 텐콘 골격 및 다양한 설계 전략을 이용하여 산출되었다. 일반적으로, 라이브러리 TCL1 및 TCL2는 우수한 결합제를 생산하였다. TCL1 및 TCL2 라이브러리의 산출은 국제 특허 공개 번호 WO2014081944A2에서 상세하게 설명된다.
TCL1 라이브러리의 작제
텐콘(서열 번호: 1)의 FG 루프만을 무작위화하도록 설계된 라이브러리, TCL1이 시스-전시 시스템용으로 작제되었다(Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012). 이러한 시스템에서, Tac 프로모터에 대한 서열, 텐콘 라이브러리 코딩 서열, RepA 코딩 서열, 시스-요소 및 기원 요소(ori element)를 통합하는 이중 가닥 DNA가 생산된다. 시험관내 전사/번역 시스템에서 발현 시에, 인코딩되는 DNA에 시스로 결합되는 텐콘-RepA 융합 단백질의 복합체가 생산된다. 표적 분자에 결합하는 복합체는 이후, 아래에 설명된 바와 같이 단리되고 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭된다.
시스-전시용으로 TCL1 라이브러리의 작제는 2개의 절반에서 최종 선형, 이중 가닥 DNA 분자를 생산하기 위한 연속적인 라운드의 PCR에 의해 달성되었다; 5' 단편은 프로모터 및 텐콘 서열을 내포하고, 반면 3' 단편은 repA 유전자 및 시스와 기원 요소를 내포한다. 이들 2개의 절반은 전체 구조체를 생산하기 위해 제한 절단에 의해 조합된다. TCL1 라이브러리는 텐콘의 FG 루프, KGGHRSN(서열 번호: 32)에서만 무작위 아미노산을 통합하도록 설계된다. NNS 코돈이 이러한 라이브러리의 작제에서 이용되었고, 20개 아미노산 모두 및 하나의 종결 코돈의 FG 루프 내로의 가능한 통합을 유발하였다. TCL1 라이브러리는 6개의 별개의 서브-라이브러리를 내포하는데, 각각은 다양성을 더욱 증가시키기 위해, 7개부터 12개 잔기까지 상이한 무작위화된 FG 루프 길이를 갖는다.
TCL1 라이브러리(서열 번호: 2)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX7-12PLSAEFTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7은 임의의 아미노산이고; 그리고
X8, X9, X10, X11 및 X12는 임의의 아미노산이거나 또는 결실된다.
TCL2 라이브러리의 작제
TCL2 라이브러리가 작제되었는데, 여기서 텐콘의 BC와 FG 루프 둘 모두 무작위화되었고, 그리고 각 위치에서 아미노산의 분포가 엄격하게 제어되었다. 표 2는 TCL2 라이브러리 내에 원하는 루프 위치에서 아미노산 분포를 보여준다. 설계된 아미노산 분포는 2가지 목적을 가졌다. 첫 번째, 상기 라이브러리는 텐콘 결정 구조의 분석에 근거하여 그리고/또는 상동성 모형화로부터 텐콘 접힘 및 안정성에 구조적으로 중요한 것으로 예측된 잔기를 향해 편향되었다. 예를 들어, 위치 29는 오로지 소수성 아미노산의 부분집합으로만 고정되었는데, 그 이유는 이러한 잔기가 텐콘 접힘의 소수성 코어에 매몰되었기 때문이다. 설계의 두 번째 층은 높은 친화성 결합제를 효율적으로 생산하기 위해, 아미노산 분포를 항체의 중쇄 HCDR3에서 우선적으로 발견되는 잔기의 아미노산 분포 쪽으로 편향시키는 것을 포함하였다(Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007). 이러한 목표를 향해, 표 1에서 "설계된 분포"는 아래와 같은 분포를 지칭한다: 6% 알라닌, 6% 아르기닌, 3.9% 아스파라긴, 7.5% 아스파르트산, 2.5% 글루타민산, 1.5% 글루타민, 15% 글리신, 2.3% 히스티딘, 2.5% 이소류신, 5% 류신, 1.5% 리신, 2.5% 페닐알라닌, 4% 프롤린, 10% 세린, 4.5% 트레오닌, 4% 트립토판, 17.3% 티로신, 그리고 4% 발린. 이러한 분포는 메티오닌, 시스테인 및 종결 코돈을 결여한다.
TCL2 라이브러리(서열 번호: 3)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT; 여기서
X1은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X2는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X3은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X4는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X5는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X6은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X7은 Phe, Ile, Leu, Val 또는 Tyr이고;
X8은 Asp, Glu 또는 Thr이고;
X9는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X10은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X11은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X12는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X13은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X14는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; 그리고
X15는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.
표 1.
잔기 위치* WT 잔기 TCL2 라이브러리에서 분포
22 T 설계된 분포
23 A 설계된 분포
24 P 50% P + 설계된 분포
25 D 설계된 분포
26 A 20% A + 20% G + 설계된 분포
27 A 설계된 분포
28 F 20% F, 20% I, 20% L, 20% V, 20% Y
29 D 33% D, 33% E, 33% T
75 K 설계된 분포
76 G 설계된 분포
77 G 설계된 분포
78 H 설계된 분포
79 R 설계된 분포
80 S 100% S
81 N 설계된 분포
82 P 50% P + 설계된 분포
*잔기 넘버링은 서열 번호: 1의 텐콘 서열에 기초된다
차후에, 이들 라이브러리는 야생형 텐콘과 비교할 때 치환 E11R/L17A/N46V/E86I를 통합하는 안정된 텐콘 프레임워크(U.S. 특허 번호 8,569,227)(텐콘27; 서열 번호: 4)에서 라이브러리의 구축뿐만 아니라 BC와 FG 루프에서 무작위화된 위치의 변경을 비롯한 다양한 방식에 의해 향상되었다. 텐콘27은 국제 특허 출원 번호 WO2013049275에서 설명된다. 이것으로부터, 오로지 텐콘의 FG 루프(라이브러리 TCL9), 또는 BC와 FG 루프의 조합(라이브러리 TCL7)을 무작위화하도록 설계된 새로운 라이브러리가 산출되었다. 이들 라이브러리는 시스-전시 시스템용으로 작제되었다(Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004). 이러한 설계의 상세는 아래에 도시된다:
안정된 텐콘(텐콘27)(서열 번호: 4)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
TCL7(무작위화된 FG와 BC 루프)(서열 번호: 5)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; 그리고
X7, X8, X9, X17, X18 및 X19는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 또는 결실된다.
TCL9(무작위화된 FG 루프)(서열 번호: 6)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10X11X12SNPLSAIFTT;
X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; 그리고
X8, X9, X10, X11 및 X12는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 또는 결실된다.
라이브러리 작제를 위해, 무작위화된 BC 루프(길이 6-9 위치) 또는 FG 루프(길이 7-12 위치)를 인코딩하는 DNA 단편이 라이브러리의 아미노산 분포를 제어하고 종결 코돈을 제거하기 위한 Slonomics 기술(Sloning Biotechnology GmbH)을 이용하여 합성되었다. BC 루프 또는 FG 루프를 무작위화하는 DNA 분자의 2가지 상이한 세트가 독립적으로 합성되고, 그리고 추후에, PCR을 이용하여 조합되어 완전한 라이브러리 산물이 생산되었다.
FG 루프 라이브러리(TCL9)의 작제
5' Tac 프로모터, 그 이후에 FG 루프 내에 무작위화된 코돈을 제외하고 텐콘의 완전한 유전자 서열로 구성되는 한 세트의 합성 DNA 분자가 생산되었다(서열 번호: 26-31). FG 루프 무작위화를 위해, 시스테인 및 메티오닌을 제외하고 모든 아미노산이 동등한 백분율에서 인코딩되었다. 다양화된 부분의 길이는 이들이 FG 루프 내에 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 아미노산을 인코딩하도록 하는 정도이다. 각 길이 변이의 서브-라이브러리가 2ug의 규모에서 개별적으로 합성되었고, 그리고 이후, 올리고 Sloning-FOR(서열 번호: 9) 및 Sloning-Rev(서열 번호: 10)를 이용한 PCR에 의해 증폭되었다.
상기 라이브러리의 3' 단편은 PspOMI 제한 부위, repA 유전자의 코딩 영역, 그리고 시스와 기원 요소를 비롯한, 전시를 위한 요소를 내포하는 일정한 DNA 서열이다. 이러한 단편을 증폭하기 위해, 주형으로서 플라스미드(pCR4Blunt)(Invitrogen)를 M13 전방 및 M13 후방 프라이머와 함께 이용하는 PCR 반응이 수행되었다. 결과의 PCR 산물은 PspOMI에 의해 하룻밤 동안 절단되고 겔-정제되었다. 라이브러리 DNA의 5' 부분을 repA 유전자를 내포하는 3' DNA에 결찰하기 위해, 2 pmol(~540ng 내지 560ng)의 5' DNA가 37℃에서 하룻밤 동안 NotI와 PspOMI 효소 및 T4 리가아제의 존재에서 동등한 몰(~1.25 μg)의 3' repA DNA에 결찰되었다. 결찰된 라이브러리 산물은 올리고 POP2250(서열 번호: 11) 및 DigLigRev(서열 번호: 12)로 12 주기의 PCR을 이용함으로써 증폭되었다. 각 서브-라이브러리에 대해, 12회 PCR 반응으로부터 결과의 DNA가 조합되고 Qiagen 스핀 칼럼에 의해 정제되었다. TCL9의 각 서브-라이브러리에 대한 수율은 32-34 μg의 범위에서 변하였다.
FG/BC 루프 라이브러리(TCL7)의 작제
TCL7 라이브러리는 무작위화된 텐콘 BC와 FG 루프를 갖는 라이브러리를 제공한다. 이러한 라이브러리에서, 길이 6-9개 아미노산의 BC 루프는 길이에서 7-12개 아미노산의 무작위화된 FG 루프와 조합적으로 혼합되었다. BC 루프가 6, 7, 8, 또는 9개의 무작위화된 아미노산으로 대체되도록, 잔기 VX까지의 상기 단백질의 N 말단 부분을 인코딩하는 텐콘 유전자를 포함하는 합성 텐콘 단편 BC6, BC7, BC8 및 BC9(서열 번호: 13-16)가 생산되었다. 이들 단편이 L17A, N46V 및 E83I 돌연변이(CEN5243)의 발견에 앞서 합성되었지만, 이들 돌연변이는 아래에 설명된 분자생물학 단계에서 도입되었다. 이러한 단편을 무작위화된 FG 루프를 인코딩하는 단편과 조합하기 위해, 다음의 단계가 취해졌다.
먼저, Tac 프로모터, 그리고 아미노산 A17을 인코딩하는 뉴클레오티드까지 텐콘의 5' 서열(130mer-L17A, 서열 번호: 17)을 인코딩하는 DNA 단편이 올리고 POP2222ext(서열 번호: 18) 및 LS1114(서열 번호: 19)를 이용한 PCR에 의해 생산되었다. 이것은 상기 라이브러리에서 L17A 돌연변이(CEN5243)를 포함하기 위해 행위되었다. 그 다음, 무작위화된 BC 루프를 포함하는 텐콘 잔기 R18-V75를 인코딩하는 DNA 단편이 주형으로서 BC6, BC7, BC8 또는 BC9, 그리고 올리고 LS1115(서열 번호: 20) 및 LS1117(서열 번호: 21)를 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 이러한 PCR 단계는 3' 단부에서 BsaI 부위를 도입하였다. 이들 DNA 단편은 차후에, 올리고 POP2222ext 및 LS1117을 프라이머로서 이용한 중첩 PCR에 의해 연결되었다. 240bp의 결과의 PCR 산물은 모아지고 Qiagen PCR 정제 키트에 의해 정제되었다. 정제된 DNA는 BsaI-HF로 절단되고 겔 정제되었다.
FG 루프를 인코딩하는 단편은 BsaI 제한 부위 및 N46V와 E86I 변이(CEN5243)를 통합하기 위해, 올리고뉴클레오티드 SDG10(서열 번호: 22) 및 SDG24(서열 번호: 23)와 함께, FG7(서열 번호: 31), FG8(서열 번호: 30), FG9(서열 번호: 29), FG10(서열 번호: 28), FG11(서열 번호: 27) 및 FG12(서열 번호: 26)를 주형으로서 이용한 PCR에 의해 증폭되었다.
절단된 BC 단편 및 FG 단편은 3-웨이 결찰을 이용하여 단일 단계에서 함께 결찰되었다. 16가지의 가능한 조합에서 4가지 결찰 반응이 설정되었는데, 각 결찰 반응은 2개의 BC 루프 길이를 2개의 FG 루프 길이와 조합하였다. 각 결찰은 ~300 ng의 전체 BC 단편 및 300 ng의 FG 단편을 내포하였다. 이들 4가지 결찰 풀은 이후, 올리고 POP2222(서열 번호: 24) 및 SDG28(서열 번호: 25)을 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 7.5 μg의 각 반응 산물은 이후, Not1로 절단되고 Qiagen PCR 정제 칼럼으로 청소되었다. 5.2 μg의 이러한 DNA는 PspOMI로 절단된 동등한 몰 양의 RepA DNA 단편(~14 μg)에 결찰되었고, 그리고 산물은 올리고 POP2222를 이용한 PCR에 의해 증폭되었다.
실시예 2: 대안적 결합 표면을 갖는 텐콘 라이브러리의 산출
특정 라이브러리 설계에서 무작위화되는 잔기의 선택은 창출되는 상호작용 표면의 전체 모양을 지배한다. BC, DE 및 FG 루프가 무작위화된 라이브러리로부터 말토오스 결합 단백질(MBP)에 결합하도록 선별된 FN3 도메인 내포 골격 단백질의 X선 결정학적 분석은 MBP의 활성 부위로 적합되는 주로 곡선 인터페이스를 갖는 것으로 나타났다(Koide et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104: 6632-6637, 2007). 대조적으로, MBP에 결합하도록 선별된 안키린 반복 골격 단백질은 훨씬 평면 상호작용 표면을 갖고, 그리고 활성으로부터 멀리 떨어진 MBP의 외측 표면에 결합하는 것으로 나타났다(Binz et al., Nat Biotechnol 22: 575-582, 2004). 이들 결과는 골격 분자의 결합 표면의 모양(곡선 대 편평)이 어떤 표적 단백질 또는 이들 표적 단백질 상에서 어떤 특정한 에피토프가 상기 골격에 의해 효과적으로 결합될 수 있는 지를 지배할 수 있다는 것을 암시한다. 단백질 결합을 위해 FN3 도메인을 내포하는 단백질 골격을 가공하는 것에 관한 공개된 노력은 표적 결합을 위해 인접한 루프를 가공하고, 따라서 곡선 결합 표면을 산출하는 것에 의존하였다. 이러한 접근법은 이런 골격에 의해 접근가능한 표적 및 에피토프의 숫자를 제한할 수 있다.
텐콘 및 다른 FN3 도메인은 상기 분자의 대향면에 위치하는 CDR-유사 루프의 2개 세트를 내포하는데, 첫 번째 세트는 BC, DE 및 FG 루프에 의해 형성되고, 그리고 두 번째 세트는 AB, CD 및 EF 루프에 의해 형성된다. 루프의 이들 2개 세트는 FN3 구조의 중심을 형성하는 베타 가닥에 의해 분리된다. 만약 텐콘의 이미지가 90도 회전되면, 대안적인 표면이 가시화될 수 있다. 이러한 약간 오목한 표면은 CD와 FG 루프 및 2개의 역평행 베타 가닥, C와 F 베타 가닥에 의해 형성되고, 그리고 본원에서 C-CD-F-FG 표면으로 불린다. C-CD-F-FG 표면은 표면을 형성하는 잔기의 부분집합을 무작위화함으로써 단백질 골격 상호작용 표면의 라이브러리를 설계하기 위한 주형으로서 이용될 수 있다. 베타 가닥은 하나 걸러 잔기의 측쇄가 상기 단백질의 표면에 노출되는 반복 구조를 갖는다. 따라서, 라이브러리는 베타 가닥 내에서 일부 또는 모든 표면 노출된 잔기를 무작위화함으로써 만들어질 수 있다. 베타 가닥 내에서 온당한 잔기를 선택함으로써, 다른 단백질과의 상호작용을 위한 독특한 골격 표면을 제공하면서 텐콘 골격의 생래적 안정성이 최소한으로 훼손될 것이다.
라이브러리 TCL14(서열 번호: 7)가 텐콘27 골격(서열 번호: 4) 내로 설계되었다.
이러한 라이브러리를 작제하는데 이용된 방법에 관한 완전한 설명은 US. 특허 공개 번호 2013/0226834에서 설명된다.
TCL14 라이브러리(서열 번호: 7):
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W,Y, 또는 M이다.
텐콘27에서 C-CD-F-FG 표면을 형성하는 2개의 베타 가닥은 무작위화될 수 있었던 총 9개의 표면 노출된 잔기; C-가닥: S30, L32, Q34, Q36; F-가닥: E66, T68, S70, Y72 및 V74를 갖고, 반면 CD 루프는 6개의 잠재적인 잔기: S38, E39, K40, V41, G42 및 E43을 갖고, 그리고 FG 루프는 7개의 잠재적인 잔기: K75, G76, G77, H78, R79, S80 및 N81을 갖는다. 만약 22개 잔기 모두가 무작위화되면, 상기 라이브러리의 더욱 큰 이론적 크기로 인해 선별 잔기가 TCL14 설계 내에 포함을 위해 선택되었다.
텐콘 내에 13개 위치가 무작위화를 위해 선택되었다: C-가닥에서 L32, Q34 및 Q36, CD-루프에서 S38, E39, K40 및 V41, F-가닥에서 T68, S70 및 Y72, FG-루프에서 H78, R79 및 N81. C와 F 가닥에서 S30 및 E66은 무작위화되지 않았는데, 그 이유는 이들이 CD와 FG 루프 바로 너머에 위치하고, 그리고 겉보기엔 C-CD-F-FG 표면의 일부인 것처럼 보이지 않기 때문이다. CD 루프의 경우에는 G42 및 E43이 무작위화되지 않았는데, 그 이유는 유연성을 제공하는 글리신이 루프 영역에서 귀중할 수 있고, 그리고 E43이 표면의 접합부에 위치하기 때문이다. FG 루프는 K75, G76, G77 및 S80이 제외되었다. 글리신은 상기 이유로 제외되었고, 반면 결정 구조의 면밀한 검사에서 S80은 코어와의 핵심 접촉을 만들어 안정된 FG 루프를 형성하는데 도움을 주는 것으로 드러났다. K75는 C-CD-F-FG 표면의 표면으로부터 방향이 벗어나고 무작위화를 위한 덜 매력적인 후보이다. 비록 전술한 잔기는 본래 TCL14 설계에서는 무작위화되지 않았지만, 이들은 데노보 선별을 위해 또는 예로서, 선별 TCL14 표적 특정한 히트에서 친화성 성숙 라이브러리를 위해 추가 다양성을 제공하기 위한 차후 라이브러리 설계에 포함될 수 있었다.
TCL14의 생산 다음에, 유사한 설계의 3개의 추가 텐콘 라이브러리가 생산되었다. 이들 2개의 라이브러리, TCL19, TCL21 및 TCL23은 TCL14와 동일한 위치에서 무작위화되지만(상기 참조), 이들 위치에서 발생하는 아미노산의 분포가 변경된다(표 2). TCL19 및 TCL21은 단지 시스테인 및 메티오닌만을 제외하고, 모든 위치에서 18가지 자연 아미노산의 동등한 분포(각각 5.55%)를 포함하도록 설계되었다. TCL23은 각 무작위화된 위치가 표 2에서 설명된 바와 같이, 기능적 항체의 HCDR3 루프에서 발견된 아미노산 분포(Birtalan et al., J Mol Biol 377: 1518-1528, 2008)에 가깝도록 설계되었다. TCL21 라이브러리에서처럼, 시스테인 및 메티오닌은 제외되었다.
다른 라이브러리 라이브러리의 잠재적 표적 결합 표면을 확대하기 위해 세 번째 추가 라이브러리가 만들어졌다. 이러한 라이브러리, TCL24에서, 라이브러리 TCL14, TCL19, TCL21 및 TCL23과 비교하여 4개의 추가 텐콘 위치가 무작위화되었다. 이들 위치는 D 가닥으로부터 N46 및 T48, 그리고 G 가닥으로부터 S84 및 I86을 포함한다. 위치 46, 48, 84 및 86은 특히, 이들 잔기의 측쇄가 베타 가닥 D와 G로부터 표면 노출되고 C와 F 가닥의 무작위화된 부분에 구조적으로 인접하게 위치하고, 따라서 표적 단백질에 결합에 대해 접근가능한 표면적을 증가시키기 때문에 선택되었다. TCL24에 대한 각 위치에서 이용된 아미노산 분포는 표 2에서 TCL19 및 TCL21에 대해 설명된 것과 동일하다.
TCL24 라이브러리(서열 번호: 8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W이다.
표 2. TCL21, TCL23 및 TCL24에 대한 각 무작위화된 위치에서 아미노산 빈도(%).
아미노산 TCL19 TCL21 TCL23 TCL24
Ala 5.6 5.6 6.0 5.6
Arg 5.6 5.6 6.0 5.6
Asn 5.6 5.6 3.9 5.6
Asp 5.6 5.6 7.5 5.6
Cys 0.0 0.0 0.0 0.0
Gln 5.6 5.6 1.5 5.6
Glu 5.6 5.6 2.5 5.6
Gly 5.6 5.6 15.0 5.6
His 5.6 5.6 2.3 5.6
Ile 5.6 5.6 2.5 5.6
Leu 5.6 5.6 5.0 5.6
Lys 5.6 5.6 1.5 5.6
Met 0.0 0.0 0.0 0.0
Phe 5.6 5.6 2.5 5.6
Pro 5.6 5.6 4.0 5.6
Ser 5.6 5.6 10.0 5.6
Thr 5.6 5.6 4.5 5.6
Trp 5.6 5.6 4.0 5.6
Tyr 5.6 5.6 17.3 5.6
Val 5.6 5.6 4.0 5.6
TCL21, TCL23 및 TCL24 라이브러리의 산출
TCL21 라이브러리는 아미노산 분포를 제어하기 위해, Colibra 라이브러리 기술(Isogenica)을 이용하여 산출되었다. TCL19, TCL23 및 TCL24 유전자 단편은 아미노산 분포를 제어하기 위해, Slonomics 기술(Morphosys)을 이용하여 산출되었다. 루프 라이브러리에 대해 전술된 바와 같이, CIS-전시 시스템(Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004)을 이용한 선별에서 이용되기 위해, 초기 합성, 그 이후에 RepA에 대한 유전자에 결찰 이후에 각 라이브러리를 증폭하는데 PCR이 이용되었다.
실시예 3: CD8A에 결합하는 섬유결합소 III형(FN3) 도메인의 선별
인간 CD8 알파 항원의 설계 및 생산:
2개의 인간 CD8 알파(Swiss Prot P01732) 구조체가 HEK 세포로부터 발현되고 정제되어, CIS-전시 패닝을 위한 재조합 단백질이 생산되었다(표 3).
표 3: 항원으로서 이용을 위해 산출된 CD8A 구조체
구조체 서열 번호 설명
CD8W7 35 인간 IgG1의 Fc 단편에 융합된 인간 CD8 알파 잔기 22-167
CD8W13 36 인간 IgG1의 Fc 단편에 융합된 인간 CD8 알파 잔기 22-182
각 구조체는 뮤린 IgG 카파 분비 신호(서열 번호: 3)를 포함하도록 설계되었고, 그리고 인간 IgG1의 Fc 단편(서열 번호: 4)에 융합되었다. CD8 알파 및 Fc 단편 서열은 플래그(flag) 및 폴리히스티딘 태그 서열을 내포하는 링커(서열 번호: 5)에 의해 연결되었다.
이들 단백질을 인코딩하는 플라스미드는 일시적인 형질감염에 의해 HEK 293-Expi 세포 내로 형질감염되었고, 그리고 배양 상층액이 6000 x g에서 원심분리에 의해 수확되고 0.2 마이크론 필터로 투명해졌다. 상층액이 HiTrap Mabsure 선별 칼럼(GE Healthcare) 위에 부하되었고, 그리고 CD8A 단백질이 0.1 M Na-아세트산염 pH 3.5에서 용리되고 2M Tris pH 7의 첨가에 의해 중화되었다. 각 표본은 이후, No Weigh EZ-링크-술포-NHS-LC-비오틴 비오티닐화 키트(Thermo Scientific)로 비오티닐화를 위해 PBS pH 7.4 내로 투석되었다.
라이브러리 선별검사
시스-전시가 TCL18, TCL19, TCL21, TCL23 및 TCL24 라이브러리로부터 인간 CD8 알파-결합 도메인을 선별하는데 이용되었다. 비오틴화된 CD8W7 및 CD8W13이 패닝에 이용되었다. 시험관내 전사와 번역(ITT)을 위해, 3 μg의 라이브러리 DNA가 50 μL의 총 부피에서 0.1 mM 완전한 아미노산, 1X S30 예혼합 성분 및 15 μL의 S30 추출물(Promega)과 함께 배양되고 30℃에서 배양되었다. 1 시간 후, 375 μL의 차단 용액((0.1% 카제인(Thermo Fisher, Rockford, IL), 100 mg/ml 청어 정자 DNA(Promega, Madison, WI), 1 mg/mL 헤파린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))이 첨가되었고, 그리고 반응물은 얼음 위에서 15 분 동안 배양되었다. 선별을 위해, 비오틴화된 항원이 400 nM(라운드 1), 200 nM(라운드 2와 3) 및 100 nM(라운드 4와 5)의 농도에서 첨가되었다. 결합된 라이브러리 구성원은 뉴트라비딘 자성 비드(Thermo Fisher, Rockford, IL)(라운드 1, 3과 5) 또는 스트렙타비딘 자성 비드(Promega, Madison, WI)(라운드 2와 4)를 이용하여 회수되었고, 그리고 결합되지 않은 라이브러리 구성원은 비드를 500 μL PBST로 5-14 회 세척하고, 그 이후에 500 μL PBS로 2회 세척함으로써 제거되었다. 향상된 친화성을 갖는 골격 분자를 확인하기 위해 추가 선별 라운드가 수행되었다. 간단히 말하면, 라운드 5로부터 출력이 앞서 설명된 바와 같이 준비되고, 그리고 다음의 변화를 갖는 추가 반복적인 라운드의 선별에 종속되었다: 비오틴화된 목표 농도가 25 nM(라운드 6과 7) 또는 2.5 nM(라운드 8과 9)로 줄어들었고, 그리고 추가 1 시간 세척이 과잉의 비-비오틴화된 표적 단백질의 존재에서 수행되었다. 이들 변화의 목적은 훨씬 낮은 K D를 산출하는 잠재적으로 더욱 빠른 온 레이트 및 더욱 느린 오프 레이트를 갖는 결합제를 동시에 선별하는 것이었다.
패닝 이후에, 선별된 FN3 도메인은 올리고 Tcon6(서열 번호: 33) 및 Tcon5shortE86I(서열 번호: 34)를 이용한 PCR에 의해 증폭되고, pET15-LIC 내로 어닐링에 의해 하위클로닝되고, 그리고 표준 분자생물학 기술을 이용하여 대장균(E. coli)에서 가용성 발현을 위해 BL21-GOLD(DE3) 세포(Agilent, Santa Clara,CA) 내로 형질전환되었다. 단일 클론이 선발되고, 그리고 37℃에서 96 딥웰 평판에서 암피실린을 포함하는 1 mL LB에서 포화까지 성장되었다. 다음 날, 25 uL가 96 딥웰 평판에서 신선한 1 mL LB-Amp 배지로 이전되고 37 ℃에서 2 시간 동안 성장되었다. IPTG가 1 mM 최종 농도에서 첨가되었고, 그리고 단백질 발현이 30℃에서 16 시간 동안 유도되었다. 이들 세포는 원심분리에 의해 수확되고, 그리고 차후에, 0.2 mg/mL 최종 달걀 백색 라이소자임(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 보충된 Bugbuster HT(EMD Chemicals, Gibbstown, NJ)로 용해되었다. 세포는 대략 16 시간 후 원심분리에 의해 수확되고 -20℃에서 동결되었다. 세포 용해는 실온에서 진탕하면서 45 분 동안, 각 펠렛을 0.6 mL의 BugBuster®HT 용해 완충액(Novagen EMD Biosciences)에서 배양함으로써 달성되었다.
CD8A에 결합하는 FN3 도메인의 선별
뉴트라비딘-코팅된 평판은 스타팅 블록 T20(Pierce)에서 1 시간 동안 차단되고, 그리고 이후, 비오틴화된 CD8W7 또는 CD8W13(패닝에서와 동일한 항원) 또는 음성 대조(인간 Fc)로 1 시간 동안 코팅되었다. 평판은 TBST로 헹굼되었고, 그리고 희석된 용해물이 1 시간 동안 평판에 적용되었다. 추가 헹굼 이후에, 웰은 HRP-접합된 항-FN3 도메인 항체(PAB25)로 1 시간 동안 처리되고, 그리고 이후, POD(Roche)로 검정되었다. 배경을 최소한 10배 초과하는 신호를 갖는 FN3 도메인 분자가 추가 분석을 위해 선택되었다.
CD8A에 결합하는 확인된 FN3 도메인의 소규모 발현 및 정제
생화학적 결합 ELISA에 의해 확인된 독특한 히트로부터 단리된 클론은 96-웰 블록 평판에서 성장을 위해 단일 히트 평판 내로 조합되었다; 클론은 진탕하면서, 37℃에서 하룻밤 동안 1 mL 배양액(선별을 위해 카나마이신으로 보충된 LB 배지)에서 성장하였다. 96-블록 평판에서 단백질 발현을 위해, 카나마이신으로 보충된 1 mL TB 배지가 50 uL의 하룻밤 배양액으로 접종되고, 그리고 300rpm에서 끊임없는 진탕하면서 37℃에서 OD600=0.6-1일 때까지 성장되었다. 일단 목표 OD가 도달되면, 1 mM까지 IPTG의 첨가로 단백질 발현이 유도되었다; 평판은 하룻밤 동안 성장을 위해 30℃(300 rpm)로 이전되었다. 하룻밤 배양액은 세포를 수확하기 위해 원심분리되었다; 세균 펠렛은 이용할 준비가 될 때까지 -80℃에서 보관되었다. 펠렛은 BugBuster®HT 용해 완충액(Novagen EMD Biosciences)으로 용해되었고, 그리고 His-태깅된 센티린은 투명해진 용해물로부터 His MultiTrap™ HP 평판(GE Healthcare)으로 정제되고 pH 7.4에서 20 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨 및 250 mM 이미다졸을 내포하는 완충액에서 용리되었다. 정제된 표본은 PD MultiTrap™ G-25 평판(GE Healthcare)을 이용한 분석을 위해 PBS pH 7.4로 교체되었다.
크기 배제 크로마토그래피 분석
크기 배제 크로마토그래피가 항-CD8 알파 FN3 도메인 분자의 응집 상태를 결정하는데 이용되었다. 분취량(10 μL)의 각 정제된 FN3 도메인이 PBS pH 7.4의 이동상에서 0.3 mL/분의 유속에서 Superdex 75 5/150 칼럼(GE Healthcare) 위에 주입되었다. 칼럼으로부터 용리는 280 nm에서 흡광도에 의해 모니터링되었다. 야생형 텐콘은 각 실행에서 대조로서 포함되었다. Agilent ChemStation 소프트웨어가 용리 프로필을 분석하는데 이용되었다. 동일한 실행에서 테나신 공통 단백질의 것과 유사한 용리 프로필을 갖는 단백질만 추가 특성화에 고려되었다. 패닝, ELISA 선별검사 및 크기 배제 크로마토그래피 분석 후, 배경을 10배 이상 초과하여 재조합 인간 CD8 알파에 결합하고 SEC에 의해 응집체가 없는 총 190개의 독특한 항인간 CD8 알파 FN3 도메인이 단리되었다(표 4, 서열 번호: 40-228 및 70).
표 4. ELISA 스크린으로부터 확인된 CD8A-결합 FN3 도메인의 요약
인간 및 시노몰구스 원숭이 공여자로부터 T-세포에 결합에 대한 스크린
인간 및 시노몰로구스 원숭이 일차 CD8 T 세포에 190개 ELISA 히트의 결합은 유세포분석법에 의해 사정되었다. 이들 FN3 도메인 분자는 PBS에서 2 μM 및 0.2 μM로 희석되고, 그리고 96-웰 형식에서 인간 또는 시노몰로구스 원숭이 CD8+ T 세포와 함께 배양되었다. 4℃에서 1 시간 후, 이들 세포는 PBS로 1회 세척되고, 그리고 이후, 항-FN3 도메인 항체(PAB25) 용액으로 재현탁되었다. 이러한 배양 이후에, 이들 세포는 PBS로 2회 세척되고, 그리고 PE 접합된 이차 항체 및 생존력 염료가 첨가되었다. 최종적으로, 세포는 BD Canto 기기를 이용한 유세포 계측 분석을 위해 PBS에서 세척되고 재현탁되었다. 세포는 살아있는 세포에서 게이팅되었고, 그리고 결합된 센티린(PE 통로)의 중앙 형광 강도가 Cytobank 소프트웨어를 이용하여 계산되었다. 결과는 표 4에서 요약된다.
항인간 CD8 알파 센티린의 오프 레이트 분석
정제된 항-CD8A FN3 도메인은 추가 특성화를 위한 가장 느린 오프 레이트를 갖는 클론을 선발하기 위해, Proteon 표면 플라스몬 공명 기기를 이용한 오프 레이트 분석에 종속되었다. 계측된 오프 레이트는 표 4에서 도시된 바와 같이, 2.64E-5 내지 1.07E-2 sec-1의 범위에서 변하였다.
PBST(PBS, 0.005% Tween)에서 30 μl/분의 유속으로 칩 위에 수직 방향으로 6개 리간드 통로 모두에서 아민 연계(pH 5.0)를 통해, 염소 항인간 Fc IgG(Jackson immunoresearch, 카탈로그# 109-005-098)가 10 μg/ml, pH5.0에서 GLC 센서 칩 위에 직접적으로 고정되었다. 고정된 GAH-Fc IgG 밀도는 평균적으로 약 6000 반응 단위(Ru)이었는데, 상이한 통로 사이에 변동은 1%보다 적었다. 인하우스 인간 CD8A-Fc는 30 ul/분 유속에서 5 분 동안 3가지 상이한 리간드 밀도, 10, 5, 2.5 μg/ml에서 수직 방향으로 포획되었다. 모든 FN3 도메인은 3 μM 농도에 대해 정규화되고, 그리고 수평 방향으로 결합에 대해 검사되었다. 6개 피분석물 통로 모두 선별검사 처리량을 최대화하기 위해 FN3 도메인에 이용되었다. 해리 단계는 PBST를 작업 완충액으로서 이용하여 100 μl/분의 유속에서 15 분 동안 모니터링되었다. 표면의 재생은 0.85% 인산의 짧은 펄스(100 uL/분에서 18s 접촉 시간)에 의해 달성되었다. 데이터 분석은 Bio-Rad ProteOn Manager 소프트웨어(버전 3.1.0.6)를 이용하여 수행되었다. 미가공 데이터는 피복된 GAH-Fc IgG 표면에 FN3 도메인의 비특이적 결합을 교정하기 위한 인터스팟(비어 있는 칩 표면, 고정되거나 또는 포획된 단백질 없음) 신호의 감산, 그 이후에 어떤 hCD8A-Fc도 포획되지 않은 비어 있는 통로 L6을 이용한 이중 교정에 의해 이중 참조되었다. 처리된 결합 데이터는 포획된 hCD8A-Fc에 각 FN3 도메인 결합에 대한 k오프를 도출하기 위해, 1:1 단순한 랭뮤어 결합 모형에 국부적으로 적합되었다.
실시예 4: 항-CD8A FN3 도메인의 가공
다수의 돌연변이가 산화(메티오닌 또는 트립토판), 탈아미드화(NS), 이성화(DG) 및 클리핑(DP)의 번역후 변형 위험을 제거하기 위해 상위 항-CD8A 후보 내로 설계되었다. 베타 가닥에서 발견되는 프롤린 잔기 역시 돌연변이되었는데, 그 이유는 프롤린이 베타 가닥을 불안정화시킬 가능성이 있기 때문이다(Chiba T., et al. J Biol Chem. 2003;278:47016-24). FN3 도메인 라이브러리-설계된 위치로부터 유래된 잔기만 돌연변이가 고려되었다. 변이체 서열은 부모 분자의 유사한 화학적 성질을 모의하거나(예를 들어, 트립토판에서 티로신으로), 또는 PTM 위험 아미노산을 상기 위치에서 다른 CD8A FN3 도메인에서 발견되는 아미노산으로 대체하도록 선택되었다. 가공된 서열의 전체 목록은 표 5에서 발견된다. 각 돌연변이체 및 재조합 CD8 알파 사이에 해리율은 상대적 결합 강도를 추정하기 위해 표면 플라스몬 공명으로 계측되었다.
표 5. CD8A 센티린 돌연변이체의 해리율. 돌연변이체는 부모 분자에 따라서 군화된다.
표본 k d (1/s) 돌연변이 서열 번호:
P282DR9P1359_C5 1.47E-04 부모 68
CD8S402 4.84E-05 D40P 266
CD8S396 1.52E-04 W32Y 260
CD8S398 4.43E-04 W32S 262
CD8S397 6.60E-04 W32Q 261
CD8S399 1.34E-03 W38Y 263
CD8S401 1.27E-02 W38I 265
CD8S400 2.26E-02 W38L 264
CD8S404 3.09E-02 P36A 268
P282DR9P1359_F5 5.78E-05 부모 79
CD8S371 1.94E-04 W48Y 235
CD8S377 4.00E-04 W81E 241
CD8S374 4.03E-04 W81Y 238
CD8S372 5.71E-04 W48L 236
CD8S375 8.30E-04 W81L 239
CD8S376 8.46E-04 W81S 240
CD8S373 4.03E-03 W48I 237
P282DR9P1359_G7 1.06E-05 83
CD8S379 4.97E-05 D43S 243
CD8S378 5.80E-05 D43E 242
CD8S388 7.54E-05 N81Q 252
CD8S387 1.25E-04 W83E 251
CD8S381 2.00E-04 W70F 245
CD8S383 7.47E-04 W74Y 247
CD8S380 1.21E-03 W70Y 244
CD8S382 2.47E-01 W70S 246
P282ER9P1360_C8 1.79E-04 부모 89
CD8S390 1.52E-04 W68Y 254
CD8S389 1.84E-04 W68F 253
CD8S391 3.20E-04 W68H 255
CD8S405 1.14E-03 P48T 269
P282DR9P1359_F7 3.39E-04 부모 81
CD8S403 1.33E-04 P36A 267
CD8S392 1.55E-03 W38Y 256
CD8S395 1.89E-03 W38H 259
CD8S393 2.55E-03 W38L 257
CD8S394 3.55E-03 W38I 258
표 5에서 제시된 데이터로부터, 개발가능성 위험을 감소시키는 다수의 돌연변이가 부모 분자의 것과 유사한 해리율을 유지한다는 것은 분명하다. 돌연변이체 CD8S402(DP 부위의 제거), CD8S390(Trp 잔기의 제거) 및 CD8S403(베타 가닥으로부터 Pro의 제거)은 부모 적합 분자보다 더욱 느린 해리율을 유발하는데, 이것은 더욱 단단한 결합을 지시하였다. 다수의 다른 돌연변이가 부모 분자와 유사한 결합을 유지하고, 그리고 따라서, 부모보다 선호될 수도 있는데, 그 이유는 이들 분자가 개발 동안 더욱 적은 CMC 관련된 위험을 야기하기 때문이다.
실시예 5: CD8A-결합 FN3 도메인의 친화성 계측.
재조합 인간 CD8 알파에 결합의 완전 동력학적 분석을 위해 19개의 항-CD8A 후보가 선택되었다. 이들 후보는 1) 인간 T-세포에 강한 상대적 결합, 2) 시아노 T-세포에 강한 상대적 결합, 3) 2 uM와 비교하여 0.2 uM에서 세포 결합에서 최소 감소, 4) SEC를 통해 응집체가 없음, 5) 2.07E-3 sec-1보다 느린 오프 레이트, 6) 서열 패밀리에 대하여 서열 다양성, 그리고 7) 잠재적인 개발가능성 과제(산화, 탈아미드화, 클리핑 및 소수성)을 갖는 서열에 대한 상대적 성향의 규준을 이용하여 상기 양성 히트(표 4)에서 선택되었다.
hCD8A-Fc에 결합하는 상위 19개 후보, 추후 상위 6개 후보의 반복의 친화성이 k오프 선별검사에 대한 것들과 유사한 조건 하에 GLC 센서 칩을 이용하여 ProteOn XPR36 기기(Bio-Rad)에서 계측되었다. 염소 항인간 Fc 항체가 PBST(PBS, 0.005% Tween)에서 30 μl/분의 유속으로 칩 상에서 수직 방향으로 6개 리간드 통로 모두에서 10 μg/ml, pH 5.0에서 표준 아민 연계에 의해 칩 위에 직접적으로 고정되고, 각 리간드 통로에서 6200 Rus의 평균을 달성하였다. 인간 CD8A-Fc가 이후, 200 내지 1200 반응 단위의 범위에서 5가지 표면 밀도에서 포획되었는데, 6번째 통로는 GAH-Fc IgG 표면에 대한 비어 있는 통로 대조로서 남아있었다. 결합은 피분석물로서 5가지 상이한 농도의 항-CD8A FN3 도메인(3-배 희석 계열에서 1 μM 희석됨)을 포획된 hCD8A-Fc 표면 위에 수평 방향으로 동시에 흘러 보냄으로써 계측되었는데, 여섯 번째 피분석물 통로는 작업 완충액 PBST만을 내포하였다. 모든 상호작용은 100 uL/분 유속에서 계측되었는데, 연관 시간 및 해리 시간은 각각 4 분 및 30 분이었다. 리간드 표면 재생은 0.85% 인산의 1회 짧은 펄스(100 uL/분에서 18s 접촉 시간)에 의해 달성되었다. 데이터 분석은 Bio-Rad ProteOn Manager 소프트웨어(버전 3.1.0.6)를 이용하여 수행되었다. 미가공 데이터는 피복된 GAH-Fc IgG 표면에 FN3 도메인의 비특이적 결합을 교정하기 위한 인터스팟(비어 있는 칩 표면, 고정되거나 또는 포획된 단백질 없음) 신호의 감산, 그 이후에 완충액 블랭크 반응(시간의 추이에서 리간드 해리로부터 발생하는 임의의 기준선 드리프트를 교정하기 위한)을 이용한 이중 참조에 의해 이중 참조되었다. 항-CD8A FN3 도메인 결합 데이터가 1:1 단순한 랭뮤어 결합 모형에 잘 합치하지 않는다는 것이 복수 분석에서 일관되게 관찰되었는데, 이것은 시약 문제 및/또는 단순한 1:1 결합 방식을 이용하여 설명될 수 없는 생래적으로 복합적인 결합 기전을 암시하였다. hCD8A-Fc 형식의 GAH-Fc 포획이 잠재적인 실험적 인공물(예를 들어, 리간드 활성 상실 및/또는 아민 연계에 기인한 인공 에피토프/이질성 리간드 개체군)을 도입하는데 있어서 다른 형식에 비하여 최소 교란적이라는 점을 고려하면, 여기에서 보고된 GAH-Fc 포획 실험으로부터 결과는 많은 사례에서 관찰된 비-합치 1:1 랭뮤어 적합(fit)에도 불구하고, 가장 신뢰할 만한 ProteOn SPR 데이터를 나타내는 것으로 고려된다. 이질성 리간드 모형은 리간드 단백질 개체군 내에 이질성으로 인해 또는 Fc 융합 단백질 내에 2개의 hCD8A 단위체에 각 FN3 도메인 결합에 대한 잠재적인 상이한 기전으로 인해, 2개의 상이한 리간드 종을 가정하고 상기 데이터에 적합하도록 선택되었다. 이 경우에 있어서, 각 항-CD8A FN3 도메인이 별개의 친화성을 가질 것이기 때문에, 결과의 센서그램은 각 FN3 도메인 결합에 대해 보고된 2개 세트의 속도 상수를 갖는 2가지 독립된 반응의 합계를 반영한다.
표 6: 상위 6개의 항-CD8A FN3 도메인 후보에 대한 동역학적 친화성의 요약. 주의: 친화성, K D =kd/ka.
표본
(서열 번호:) 		더욱 낮은 친화성 개체군 더욱 높은 친화성 개체군
k a (1/Ms) k d (1/s) K D (nM) k a (1/Ms) k d (1/s) K D (nM)
P282DR9P1359_F5
(79)		 3.48E+04 6.60E-05 6.6 3.80E+05 1.42E-05 0.04
P282DR9P1359_F7(81) 4.03E+04 3.65E-04 12 4.04E+05 7.99E-05 0.5
P282DR9P1359_G7(83) 6.84E+04 5.51E-05 2.1 2.76E+05 1.49E-05 0.05
P282ER9P1360_C8(89) 3.09E+04 9.52E-05 4.1 2.18E+05 4.71E-05 0.2
P283AR9P1362_D6(122) 5.62E+04 3.12E-05 0.98 1.55E+05 1.00E-06 0.03
P282DR9P1359_C5(68) 1.92E+04 1.27E-04 6.5 3.00E+05 5.79E-06 0.02
실시예 6: DFO 및 89ZR로 항-CD8A FN3 도메인의 표지화
항-CD8A FN3 도메인은 말레이미드 내포 킬레이터 또는 PET 표지의 접합을 위한 단일 시스테인 잔기를 포함하도록 변형되었다. 잔기 E54의 시스테인으로의 돌연변이를 갖는 합성 플라스미드 DNA 인코딩 클론 P282DR9P1359_F5, P282DR9P1359_F7, P282DR9P1359_G7, P282ER9P1360_C8, P283AR9P1362_D6 및 P282DR9P1359_C5가 DNA2.0에서 합성되었다(표 7). E54는 이러한 잔기에서 돌연변이된 다른 FN3 도메인에 대한 결합 친화성, 안정성 및 발현 수준의 유지를 증명한 이전 연구에 근거하여 돌연변이를 위한 위치로서 선택되었다(출판에 앞서, Goldberg S. et al. Protein Engineering Design and Selection 2016 Epub).
표 7: 변형된 항-CD8A FN3 도메인 분자
본래 클론 서열 번호 E54C를 갖는 클론 서열 번호
P282DR9P1359_F5 79 CD8S368 229
P282DR9P1359_F7 81 CD8S367 230
P282DR9P1359_G7 83 CD8S370 231
P282ER9P1360_C8 89 CD8S365 232
P283AR9P1362_D6 122 CD8S369 233
P282DR9P1359_C5 68 CD8S366 234
유리 시스테인으로 변형된 항-CD8A FN3 도메인은 방사선금속을 킬레이팅하기 위해 데페록사민(DFO)에 접합되었다. 0.5 mL의 100-500 μM 항-CD8A FN3 도메인 용액은 10 μL의 500 mM TCEP(Sigma, 카탈로그 # 646547)와 조합되고, 질소가 부드럽게 분출되고, 그리고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 얼음 위에서 10 분 동안 배양 및 단백질을 펠렛팅하기 위한 16,000 x g 또는 그 이상에서 원심분리 전, 1.0 mL의 포화된 황산암모늄(4.02 M)이 3.2M의 최종 농도에 도달하도록 각 튜브에 첨가되었다. 결과의 펠렛은 재현탁되고, 그리고 다시 한 번 원심분리하기 전, 100 mM 인산나트륨 pH 7.2 및 1 mM EDTA로 보충된 1.0 mL의 3.2 M 황산암모늄에서 세척되었다. 두 번째 원심분리 단계 후, 결과의 펠렛은 100 mM 인산나트륨 7. 0, 1 mM EDTA에서 용해되고, 그리고 5:1 DFO 대 항-CD8A의 최종 몰 비율을 만들기 위해 10 uL의 50 mM DFO 용액과 조합되었다. 이러한 반응은 5.0 마이크로리터의 베타-메르캅토에탄올로 퀀칭하기 전 30 분 동안 실온에서 진행하도록 허용되었다. 과잉 DFO는 최종적으로, 전술된 바와 같은 두 번째 라운드의 황산암모늄 침전, 탈염 칼럼, 예를 들면, Zeba 7k 칼럼(Pierce 카탈로그#89889)에 통과, 또는 니켈-NTA 수지(Qiagen #30450)로 정제를 비롯한 다양한 방법에 의해 제거되었다. 항-CD8A FN3 도메인-DFO 접합체가 추가 분석을 위해 1X PBS에서 조제되었다.
DFO에 접합 이후에, 재조합 인간 CD8 알파에 각 항-CD8A FN3 도메인의 결합은 전술된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명으로 사정되었다. 모든 표본은 E54의 Cys로의 돌연변이 및 DFO에 접합 이후에, 인간 CD8A에 단단한 결합을 유지하였다(표 8).
표 8. DFO 접합 이후에 결합 친화성
표본 더욱 낮은 친화성 개체군 더욱 높은 친화성 개체군
k a (1/Ms) k d (1/s) K D (nM) k a (1/Ms) k d (1/s) K D (nM)
CD8S365-DFO 4.41E+03 4.29E-05 9.73 6.80E+04 4.18E-05 0.6
CD8S366-DFO 5.85E+03 1.06E-04 18.2 7.95E+04 7.01E-05 0.9
CD8S367-DFO 1.09E+04 9.75E-04 89.1 8.45E+04 1.31E-04 1.55
CD8S368-DFO 7.32E+03 9.98E-05 13.6 1.08E+05 2.53E-05 0.23
CD8S369-DFO 2.87E+03 ≤ 1 E-05 ≤ 3.4 3.73E+04 ≤ 1 E-05 ≤ 0.3
CD8S370-DFO 5.91E+03 7.65E-05 13 4.64E+04 ≤ 2E-05 ≤ 0.3
실시예 7: 인간 및 시아노 T-세포에 항-CD8A FN3 도메인의 결합.
19개의 선별된 항-CD8A FN3 도메인에 대한 완전 용량 반응 결합 곡선이 산출되었다. 각 후보는 11-포인트 또는 18-포인트 용량 반응 곡선을 산출하기 위해, PBS에서 20 μM으로 희석되고, 그 이후에 1:3 희석 계열이 뒤따랐다. 인간 또는 시아노 CD8+ T 세포는 4℃에서 1 시간 동안, 희석된 FN3 도메인과 함께 배양되었다. 이들 세포는 PBS로 1회 세척되고 4℃에서 1 시간 동안 항-센티린 항체(PAB25)와 함께 배양되었다. 이들 세포는 PBS로 2회 세척되고, 그 이후에 PE-이차, 항-CD3- PacB, 항-CD4-APC 및 생존력 염료와 함께 배양되었다. 최종적으로, 세포는 BD Canto 기기를 이용한 유세포 계측 분석을 위해 PBS에서 세척되고 재현탁되었다. CD8 T 세포는 살아있는 CD3+CD4- 세포로서 규정되었다. 결합된 센티린(PE 통로)의 중앙 형광 강도 및 양성 염색을 보여주는 세포의 %는 Cytobank 소프트웨어를 이용하여 계산되었다. 결과는 Prism을 이용하여 도표화되었고, 그리고 EC50 값은 4 파라미터 용량 반응 가변 기울기 방정식을 이용하여 계산되었다.
일차 인간 세포독성 T 세포 표면 CD8A 수용체에 결합하는 상위 6개 항-CD8A 후보의 친화성을 결정하기 위해, 중간규모 발견-세포 친화성 기술(MSD-CAT) 기초된 평형 세포 결합 검정이 수행되었다. 50 pM의 일정한 농도에서 각 항-CD8A FN3 도메인은 10가지 상이한 농도의 일차 세포독성 CD8 T 세포(연이어 칼럼 2-11)와 함께 전배양되었다. 세포 생존력이 결합 계측에 앞서 검사되었고, 그리고 유효한 분석을 위해 >85% 생존력이 요망되었다. 이들 세포가 상이한 공여자로부터 유래되었기 때문에, 공여자-대-공여자 변이의 경우에, 동일한 공여자의 세포만 함께 조합되었다. 각 개별 항-CD8A FN3 도메인 결합은 동일한 공여자로부터 세포를 이용하여 반복 계측되었다. 세포 및 FN3 도메인은 평형에 도달하도록 4℃에서 회전기에서 하룻밤 동안 배양되었다. 배양 이후에, 이들 세포는 세포 결합된 항-CD8A FN3 도메인과 함께 스핀다운되었고, 그리고 상층액 내에 결합되지 않은(유리) 항-CD8A FN3 도메인은 MSD 검정을 이용하여 정량되는데, 여기서 비오틴화된 재조합 hCD8A-Fc 단백질은 4℃에서 하룻밤~16 시간 동안 검정 완충액에서 0.6 ug/mL에서 스트렙타비딘 MSD 평판에 포획되었다. 평판을 차단한 후, 유리 항-CD8A FN3 도메인을 갖는 상층액이 상기 평판에 첨가되고, 1 시간 동안 배양되고, 이후 1.6 ug/m에서 SulfoTag pAb139(인하우스) 검출이 뒤를 이었다. 칼럼 1에서 FN3 도메인 및 hCD8A가 없는 완충액 대조(평판 배경 결합 대조) 및 칼럼 12에서 hCD8A(100% 유리/결합되지 않음)가 없는 FN3 도메인 단독 대조가 포함되었다. 생쥐 항-hCD8A mAb(mIgG1k, BD Biosciences, 카탈로그# 555364, 클론 RPA-T8)가 양성 대조로서 포함되었다. 텐콘27이 초기 검정 검증에서 음성 대조로서 포함되었고, 그리고 유의미한 결합이 관찰되지 않았고, 그리고 이런 이유로, 세포 이용가능성으로 인해 추후 세포 결합에 포함되지 않았다. 평판은 1:4의 스톡을 H2O 내로 희석함으로써 MSD 판독 완충액을 첨가한 후, 발광 수준에 대해 MSD 섹터 영상장치 6000™ 판독기에서 즉시 판독되었다.
미가공 MSD 데이터는 이출되고, 그리고 Bmax 및 사면 값을 도출하기 위해 가변 기울기 함수로 비선형 적합을 이용하여 Prism에서 분석되었다. -1.5~-0.5의 범위 내에(이상적으로는 -1.0) 수렴된 Bmax 값 및 사면을 갖는 것들만 추가 분석에 고려될 것이다. 결합 데이터는 이후, 정규화된 % 유리 FN3 도메인을 계산하기 위해 Bmax 값을 이용하여 정규화되었다. 세포당 50,000개 수용체의 표면 CD8 밀도가 수용체 농도 계산에 이용되었다. 1: 1 결합 모형에 대한 "정규화된 데이터에 대한 용해 친화성 방정식"을 이용하여 친화성을 결정하기 위해, 가장 높은 CD8 세포 농도에서 <20% 유리 센티린의 포화 규준이 필요하였다.
항-CD8A FN3 도메인은 0.167 내지 2.81 nM의 범위에서 변하는 친화성으로 일차 세포에 결합하였다(표 9).
표 9: 상위 6개 항-CD8A FN3 도메인 후보에 대한 EC 50 값의 요약.
클론 ID
(서열 번호:)		 유세포분석법에 의한 인간 T-세포에 EC50 결합(nM) 유세포분석법에 의한 시아노 T-세포에 EC50 결합(nM) MSD-CAT에 의한 인간 T-세포에 대한 친화성(nM)
CD8S365(232) 556.0 123.6 0.167
CD8S366(234) 162.7 69.5 0.123
CD8S367(230) 194.5 50.8 0.225
CD8S368(229) 154.7 70.0 0.459
CD8S369(233) 124.2 72.3 2.81
CD8S370(231) 208.7 67.6 0.869
실시예 8: 인간 T-세포의 활성화
데노보 활성화
항-CD8A FN3 도메인이 T 세포를 활성화시키는 지를 결정하기 위해, T 세포 활성화 마커에서 변화를 모니터링하기 위한 유세포분석법 검정이 수행되었다. 6개의 항-CD8A FN3 도메인이 T-세포 활성화에 대해 평가되었다. 데노보 활성화는 배지에서 4 일 동안 인간 범-T 세포와 함께, FN3 도메인을 1 μM 또는 10 nM에서 이중으로 배양함으로써 사정되었다. 2명의 독립된 공여자가 검사되었다. 평판 결합된 항-CD3이 2가지 용량, 0.1 ug/mL 및 0.01 ug/mL에서 양성 대조로서 이용되었다. PBS가 음성 대조로서 이용되었다. 세포는 이후, 생존력 염료 및 항체의 다음 패널로 염색되었다: CD4-FITC, CD3-PerCP-Cy5.5, CD69-PacB, CD45RA-BV605, CD25-BV650, CD127-PE 및 CD137-PE-Cy7. CD8+ 세포는 살아있는 CD3+CD4- 세포로서 규정되었고, 그리고 각 T-세포 활성화 마커에 대해 프로파일링되었다. 중앙 형광 강도 값이 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 계산되었고, 그리고 반복 값이 평균화되었다. 결과는 표 10A(공여자 022) 및 10B(공여자 146)에서 요약된다. 365, 366, 367, 368 및 370의 경우에, T 세포 활성화 마커에서 작은 변화가 1 μM의 가장 높은 용량 수준에서 검사된 2명의 공여자 중에서 단지 1명에서만 관찰되었다. 이들 변화는 10 nM 용량에서 양쪽 공여자에서 부재하였는데, 이것은 이들 분자가 유관한 농도에서 데노보에서 T 세포를 활성화시키지 않는다는 것을 암시하였다. 369 분자는 가장 높은 용량 수준에서 양쪽 공여자에서 CD137 발현을 유의미하게 활성화시키는 것처럼 보인다.
표 10: 공여자 022(A) 및 공여자 146(B)에 대한 CD8+ T 세포에서 다양한 T 세포 활성화 마커에 대한 중앙 형광 강도(MFI) 값
A
공여자 표본
(서열 번호:) 		항-CD8A FN3 농도 μM 항-CD3 ug/mL CD45RA MFI CD25 MFI CD69 MFI CD127 MFI CD137 MFI
022 PBS 대조 0 0 12856 571 223 651 296
022 PBS 대조 0 0.01 13133 707 403 517 343
022 PBS 대조 0 0.1 11394 1333 1694 158 529
022 CD8S366(234) 1 0 15054 949 477 425 310
022 CD8S366(234) 0.01 0 13336 814 230 586 301
022 CD8S368(229) 1 0 12992 858 698 367 329
022 CD8S368(229) 0.01 0 15262 677 276 489 306
022 CD8S367(230) 1 0 15409 796 401 511 297
022 CD8S367(230) 0.01 0 13666 723 261 502 312
022 CD8S370(231) 1 0 12946 916 572 376 353
022 CD8S370(231) 0.01 0 14973 776 353 435 331
022 CD8S365(232) 1 0 13935 904 562 367 328
022 CD8S365(232) 0.01 0 15156 697 243 504 323
022 CD8S369(233) 1 0 13661 783 440 441 5122
022 CD8S369(233) 0.01 0 16513 717 251 596 416
022 텐콘 1 0 14920 702 284 447 334
B
공여자 표본
(서열 번호:) 		항-CD8A FN3 농도 μM 항-CD3 μg/mL CD45RA MFI CD25 MFI CD69 MFI CD127 MFI CD137 MFI
146 PBS 0 0 7172 627 61 1313 500
146 PBS 0 0.01 8076 681 153 1296 617
146 PBS 0 0.1 5171 1462 1100 139 798
146 CD8S366(234) 1 0 8531 673 95 1368 589
146 CD8S366(234) 0.01 0 9414 623 74 1615 559
146 CD8S368(229) 1 0 8386 691 96 1301 561
146 CD8S368(229) 0.01 0 9147 628 82 1424 586
146 CD8S367(230) 1 0 8167 660 95 1322 581
146 CD8S367(230) 0.01 0 8734 586 77 1479 571
146 CD8S370(231) 1 0 8590 737 86 1362 583
146 CD8S370(231) 0.01 0 7934 635 71 1526 559
146 CD8S365(232) 1 0 8344 813 85 1238 586
146 CD8S365(232) 0.01 0 8460 628 80 1355 605
146 CD8S369(233) 1 0 8778 681 92 1369 5690
146 CD8S369(233) 0.01 0 7862 591 74 1498 784
146 텐콘 1 0 7325 609 78 1198 574
146 텐콘 0.01 0 7764 596 66 1281 530
범 T-세포 활성화
항-CD8A FN3 도메인이 범-활성화된 T 세포에서 T 세포 활성화의 마커에 영향을 줄 수 있는 지를 결정하기 위해, 항-CD8A FN3 도메인은 또한, 저용량의 평판 결합된 CD3과 조합으로 평가되었다. 이러한 검정에서, 준최적 농도(0.01 μg/mL)의 평판 결합된 항-CD3이 1 μM 또는 10 nM 항-CD8A의 존재에서 T 세포를 활성화시키는데 이용되었다. 4 일 후, 이들 세포는 전술된 바와 동일한 패널 및 게이팅 전략을 이용하여 사정되었다. 2명의 독립된 공여자가 검사되었다. 중앙 형광 강도 값이 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 계산되었고, 그리고 반복 값이 평균화되었다. 결과는 표 11A(공여자 022) 및 11B(공여자 146)에서 요약된다.
표 11A와 B: 평판 결합된 CD3의 존재에서 공여자 022(A) 및 공여자 146(B)에 대한 CD8+ T 세포에서 다양한 T 세포 활성화 마커에 대한 중앙 형광 강도(MFI) 값.
A
공여자 표본
(서열 번호:) 		항-CD8A FN3 농도 μM 항-CD3 μg/mL CD45RA MFI CD25 MFI CD69 MFI CD127 MFI CD137 MFI
022 PBS 대조 0 0 12856 571 223 651 296
022 PBS 대조 0 0.01 13133 707 403 517 343
022 PBS 대조 0 0.1 11394 1333 1694 158 529
022 CD8S366(234) 1 0.01 11918 892 1005 369 376
022 CD8S366(234) 0.01 0.01 13417 1068 848 384 399
022 CD8S368(229) 1 0.01 11311 1147 1279 260 428
022 CD8S368(229) 0.01 0.01 13441 760 599 499 348
022 CD8S367(230) 1 0.01 13271 1135 1127 367 385
022 CD8S367(230) 0.01 0.01 14521 960 636 483 362
022 CD8S370(231) 1 0.01 15138 1103 890 407 378
022 CD8S370(231) 0.01 0.01 14230 875 612 431 355
022 CD8S365(232) 1 0.01 14395 1112 907 380 407
022 CD8S365(232) 0.01 0.01 14006 1175 1063 297 430
022 CD8S369(233) 1 0.01 13735 877 759 464 5457
022 CD8S369(233) 0.01 0.01 13864 842 617 450 498
022 텐콘 1 0.01 14687 791 553 408 358
022 텐콘 0.01 0.01 13090 759 630 464 368
B
공여자 표본
(서열 번호:) 		항-CD8A FN3 농도 μM 항-CD3, μg/mL CD45RA MFI CD25 MFI CD69 MFI CD127 MFI CD137 MFI
146 PBS 대조 0 0 12856 571 223 651 296
146 PBS 대조 0 0.01 13133 707 403 517 343
146 PBS 대조 0 0.1 11394 1333 1694 158 529
146 CD8S366(234) 1 0.01 6798 876 163 1095 632
146 CD8S366(234) 0.01 0.01 8589 775 158 1077 637
146 CD8S368(229) 1 0.01 6576 945 175 1105 662
146 CD8S368(229) 0.01 0.01 7608 843 200 950 678
146 CD8S367(230) 1 0.01 6447 897 173 1088 672
146 CD8S367(230) 0.01 0.01 7899 801 175 1031 655
146 CD8S370(231) 1 0.01 7327 992 169 1055 687
146 CD8S370(231) 0.01 0.01 8676 790 183 946 675
146 CD8S365(232) 1 0.01 6624 977 172 1059 670
146 CD8S365(232) 0.01 0.01 7902 843 193 985 659
146 CD8S369(233) 1 0.01 7660 933 165 1149 7114
146 CD8S369(233) 0.01 0.01 7892 854 187 989 842
146 텐콘 1 0.01 8352 829 170 1026 658
146 텐콘 0.01 0.01 7627 761 185 1043 673
사이토킨 반응
활성화 마커에서 관찰된 변화 중에서 어느 것이 사이토킨 생산에서 변화를 유발하는 지를 결정하기 위해, 2개의 항-CD8A FN3 도메인을 이용한 항원-의존성 T 세포 활성화 검정 또한 수행되었다. 한 세트의 검정을 위해, CMV 반응성 또는 M1 반응성 인간 PBMC가 해동되고 37℃에서 하룻밤 동안 6 웰 평판에서 안정되었다. 다음 날, 이들 PBMC는 피펫팅에 의해 수확되고, 계수되고, 그리고 10 μg/mL 펩티드의 존재 또는 부재에서 IFNg Mabtech ELISpot 평판 위에 도말되었다. 1 μM 항-CD8A FN3-DFO 접합체가 웰에 첨가되었고, 그리고 평판은 37℃에서 대략 24 시간 동안 방해받지 않고 배양되도록 허용되었다. 세포는 제거되었고, 그리고 평판은 PBS로 5 회 세척되었다. 공급된 검출 항체가 첨가되었고, 그리고 평판은 2 시간 동안 배양되었다. 이들 평판은 다시 한 번, 세척되었고, 그리고 키트 기질이 각 웰에 첨가되었다. 평판은 대략 5 분 동안 전개되었고, 이후 이들 평판을 물 아래에서 이동시킴으로써 반응이 중지되었다. 평판은 어둠 하에 하룻밤 동안 뒤집어서 건조되었다. 평판은 AID EliSpot 판독기에서 판독되었고, 그리고 스팟 수치가 AID EliSpot 소프트웨어를 이용하여 산출되었다. 결과는 Prism에서 도표화되었다. 결과는 도 1에서 요약된다. 이러한 검정에서, 365-DFO는 배지 단독 또는 펩티드의 부재에서 비-CD8A 결합 텐콘 대조와 비교하여 IFNg 스팟의 숫자를 증가시키지 않는다(도 1A, 1C). 펩티드 및 CD3이 양성 대조로서 포함된다. 펩티드의 존재에서, 365-DFO는 펩티드 단독 또는 비-CD8A 결합 텐콘과 함께 펩티드와 비교하여 IFNg 스팟의 숫자를 변화시키지 않는다(도 1B, 1D). 배지가 음성 대조로서 포함되고, 그리고 CD3이 양성 대조로서 포함된다. 이들 결과는 센티린이 T 세포 활성화에 영향을 주지 않는다는 것을 암시한다.
더욱 긴 기간 검정에서 이들 결과를 확증하기 위해, IFN-감마 수준이 또한, 6-일 활성화 검정에서 계측되었다. 이러한 연구를 위해, CMV 반응성 PBMC가 0.25 μg/mL pp65 펩티드의 존재 또는 부재에서 1uM에서 항-CD8A FN3 도메인과 함께 삼중으로 배양되었다. 세포는 37℃에서 6 일 동안 배양되었다. 각 시점에서, 이들 세포는 원심분리되었고, 그리고 상층액이 수확되었다. 표본은 분석될 때까지 -80℃에서 보관되었다. 해동된 표본은 단일-플렉스 중간규모 발견(MSD) 기초된 ELISA를 이용하여 IFN-감마에 대해 분석되었다. 이러한 검정을 위해, 표준 곡선이 제조업체의 사용설명서에 따라서 준비되었다. 표본 및 표준은 피복된 96 웰 MSD 평판에 첨가되었다. 2 시간 배양 후, 키트 검출 항체가 첨가되었다. 추가 2 시간 배양 후, 평판은 3회 세척되었고, 그 이후에 공급된 판독 완충액의 첨가가 뒤따랐다. 평판은 MSD 섹터 영상장치 6000 평판 판독기에서 판독되었다. 미가공 MSD 데이터 파일은 MSD Discovery Workbench 소프트웨어를 이용하여 산출된 표준 곡선에 대비하여 분석되었다. 분석된 데이터는 Tibco Spotfire 프로그램을 이용하여 도표화되었다. 결과는 도 2에서 요약된다. 이러한 검정에서, 365-DFO는 펩티드의 부재에서 배지 단독과 비교하여 배지 내로 IFNg의 분비를 증가시키지 않는다(도 2A). CMV 펩티드가 양성 대조로서 포함된다. 펩티드의 존재에서, 365-DFO는 또한, 펩티드 단독과 비교하여 IFNg 분비의 양을 변화시키지 않는다(도 2B). 배지가 음성 대조로서 포함된다. 이들 결과는 센티린이 T 세포 활성화에 영향을 주지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 9: I124/I125로 항-CD8A FN3 도메인의 표지화
CD8S365를 요오드-124로 방사성표지화하여 [124I]-IPEM CD8S 365를 생산하는 현재 방법(반응식 1)은 기존 문헌 절차(Bioconjugate Chem. 1991, 2, 435-440; ChemistryOpen 2015, 4, 174-182)로부터 조정되었다.
반응식 1: [ 124 I]-IPEM CD8S 365의 합성
1.5 mL 에펜도르프 바이알에 Na124I 용액(≤13 μL, ≤2.5 mCi), AcOH(상기 용액을 산성화하기 위해 5 μL), 1-(4-(트리부틸스타닐)페네틸)-1H-피롤-2,5-디온(75 μL, MeCN에서 1.00 mg/mL) 및 요오도젠(5 μL, MeCN에서 1.00 mg/mL) 용액이 순서대로 첨가되었다. 반응은 실온에서 5 분 동안 그냥 남겨졌다.
미가공 반응 혼합물은 0.5 mL의 20% EtOH/H2O로 희석되고, 그리고 예비 HPLC, 체류 시간=14.4 분에서 직접적으로 정제되었다(도 3). [124I]-IPEM은 Sigma-CoteTM으로 사전 처리된 1 드램 바이알에서 수집되었다(이후, 3 mL의 70% EtOH, 그 이후에 3 mL의 H2O로 헹굼됨); 예비 HPLC로부터 수집된 총 부피 <750 μL.
정제된 분획물의 분취량(~5-25 μCi)이 이후, 분석용 HPLC에 주입되었다(도 4, 체류 시간=11.7 분).
정제된 [124I]-IPEM은 이후, 진공 하에 주위 온도에서 <100 μL의 부피로 농축되었다.
pH가 ~6.5-7(스트립에 의해 검사됨)이 되도록, 인산나트륨 완충액(1.0 M 인산나트륨, 1 mM EDTA, pH=6.86)이 첨가되었다(≥25 μL). 마지막으로, 갓 환원된 CD8S 365(100 mM 인산나트륨 완충액에서 c ~4.57 mg/mL, 1 mM EDTA, pH=6.86)가 표적화된 특이적 활성을 달성하는데 적절한 양으로 첨가되었다(다시 말하면, 만약 [124I]-IPEM의 25 mCi/mg 및 2.0 mCi의 표적화 특이적 활성이 회수되었다면, 17.5 μL의 센티린을 c ~4.57 mg/mL에서 첨가한다). 접합 반응은 주위 온도에서 60 분 동안 그냥 남겨졌고, 그리고 전환이 iTLC에 의해 90%를 초과했다는 것을 실증하기 위한 반응 진행이 검사되었다.
정제는 반응 용액을 PBS/10% EtOH(1 mL, pH=7)로 희석하고 1 드램 바이알로부터 반응 용액을 Vivaspin 6 5kDa MWCO 원심 필터 내로 이전하는 것으로 구성되었다(예조건화에 대해 부록을 참조한다). 이전 후, 반응 에펜도르프가 PBS/10% EtOH(2 x 1 mL, pH=7)로 헹굼되었고, 그리고 세척액이 필터에 첨가되었다. 미가공 반응 혼합물은 20℃에서 30 분 동안 4000 rpm에서 원심분리되었다. 원심분리 이후에, <500 μL의 용액이 남겨지고, 그리고 방사선 TLC에 의해 방사화학적 순도(RCP) > 95%를 갖는 것으로 나타났다(도 5). 정제된 [124I]-IPEM CD8S 365는 만약 부피가 <500 μL이면 PBS/10% EtOH로 500 μL의 부피로 희석되고, 그리고 이후, Millex-GV 0.22 μm 친수성 Durapore(PVDF) 막을 통해 여과되었다.
상기 프로토콜로부터 방사화학적 수율은 ~50%이고, 방사화학적 순도는 방사선 TLC)에 의해 ≥95% RCP이었다. 분석용 역상 HPLC가 최종 산물의 단백질 농도 및 특이적 활성을 결정하는데 이용되었다. λ=280 nm에서 UV에서 체류 시간=7.3 분에서 피크의 평균 통합이 교정 곡선으로부터 단백질 농도를 추정하는데 이용되었다(대표적인 실례에 대해 도 6). 비방사성 콜드 표준 IPEM CD8S 365와 함께 공동 주입(도 7에서 도시된 MALDI 분석) 또한 수행되었다(도 8을 참조한다). 세균 내독소 농도는 LAL 시약 물로 10X 희석을 이용한 Endosafe® 이동식 검사 시스템을 이용하여 계측되었다.
실시예 10: 시노몰구스 원숭이에서 CD8 발현의 검출
비인간 영장류(NHP)에서 PET 영상화를 위해 2개의 항-CD8A FN3 분자(CD8S365 및 CD8S368)가 선택되었다. 이들 항-CD8A 분자는 Zr-89(Zevacor, Somerset, NJ) 또는 I-124(CPDC, Hamilton, Canada, 그리고 Zevacor, Somerset, NJ)로 방사성표지화되었다. 대략 1-2 mCi의 방사성표지화된 항-CD8A 분자가 산소에서 이소플루란으로 마취되는 동안, 암컷 NHP(시노몰구스 마카크)의 복재 정맥 내로 주사되었다. 각 동물은 라아지 보어 microPET Focus 220 PET 스캐너(Siemens, Knoxville, TN)에서 스캔되었는데, 침상이 동물의 전체 신체(머리에서 하복부까지)를 수용하기 위해 이동되었다. 각 스캔은 거의 1 시간 동안 지속되었고, 그리고 스캔은 주사 후 15 분, 2 시간 및 24 시간에서 획득되었다. PET 이미지는 2D 최대 공산 기대값 최대화(ML-EM) 알고리즘을 이용하여, 복셀 크기 1.898 x 1.898 x 0.796 mm, 치수 128 x 128 x 475의 3D 이미지로 재구성되었다. 혈액 표본은 주사의 반대쪽 다리에서 복재 정맥으로부터 복수 시점에서 획득되었고, 그리고 혈액 방사성이 웰 계수기에서 계수되었다.
PET 이미지는 PMOD v3.7 소프트웨어(PMOD, Zurich, Switzerland)를 이용하여 분석되었다. 관심 영역은 장기, 예를 들면, 비장, 신장 및 간 주변에서 손으로 그려졌다. 수치는 조직의 그램당 주사된 용량 퍼센트의 단위(%ID/g)로 전환되었고, 반면 혈액 방사성은 %ID로서 제시되었다. 대표적인 PET 이미지는 도 9에서 도시된다.
각 NHP 및 각 항-CD8A FN3 도메인 분자(Zr-89 또는 I-124로 표지화됨)에 대한 혈액 동역학은 표 11에서 도시되고, 그리고 도 10에서 요약된다. 동일한 동물 및 항-CD8A 분자에 대해, 장기 생체분포는 표 12에서 도시되고(단위는 %ID/g이다), 그리고 도 11에서 요약된다. Zr-89 표지화된 분자는 배설 장기에서 방사성동위원소의 잔여화를 전시하였는데, 이것은 신장에서 큰 배경 신호를 유발하고, 다른 인근 조직을 잠재적으로 불명료하게 하였다. 이것은 I-124 표지화된 분자에서는 거의 부재하였다. 비장 흡수는 모든 시점에서 이들 2개의 상이한 분자 및 2개의 상이한 방사성동위원소 사이에 매우 유사하였다.
표 11. Zr-89 또는 I-124로 방사성표지화된 각 센티린에 대한 혈액 동역학(엔트리는 % ID이다).
동일한 동물 및 항-CD8A 분자에 대해, 장기 생체분포는 표 12에서 도시되고(단위는 %ID/g이다), 그리고 도 11에서 요약된다.
표 12. Zr-89 또는 I-124로 표지화된 상이한 센티린에 대한 장기 흡수(엔트리는 %ID/g이다).
365 Zr-89
시간(h) 신장 비장 간
0.25 시간 0.641 0.0386 0.0620
2 시간 0.624 0.0218 0.0513
24 시간 0.633 0.0136 0.0354
368 Zr-89
시간(h) 신장 비장 간
0.25 시간 0.575 0.0345 0.0740
2 시간 0.664 0.0307 0.0688
24 시간 0.931 0.0294 0.0508
365 I-124
시간(h) 신장 비장 간
0.25 시간 0.104 0.0324 0.0291
2 시간 0.065 0.0222 0.0142
24 시간 기술적인 문제로 인해 수집되지 않음
368 I-124
시간(h) 신장 비장 간
0.25 시간 0.292 0.0357 0.0439
2 시간 0.140 0.0271 0.0241
24 시간 0.0089 0.0022 0.0029
실시예 11: 시노몰구스 원숭이에서 항-CD8A FN3 도메인의 특이성
항-CD8A 분자의 특이성을 검사하기 위해, 동일한 원숭이들이 영상화에 앞서 CD8+ T 세포를 감소시키기 위해 키메라 CD8-고갈성 항체(CM-T807 생쥐 V/인간 Fc 항-CD8 항체)로 처리되었다. 동물은 영상화 3 일 전에 10 mg/kg CD8 고갈성 항체가 s.c. 투여되었다. CD8 고갈은 고갈 전후에 각 동물로부터 채취된 혈액 표본 내에 CD8 T 세포의 백분율을 계측함으로써 확증되었다(도 12).
대략 1-2 mCi의 방사성표지화된 [I-124]CD8S365 항-CD8 FN3 도메인 분자가 산소에서 이소플루란으로 마취되는 동안, 암컷 NHP(시노몰구스 마카크)의 복재 정맥 내로 주사되었다. 각 동물은 라아지 보어 microPET Focus 220 PET 스캐너(Siemens, Knoxville, TN)에서 스캔되었는데, 침상이 동물의 전체 신체(머리에서 하복부까지)를 수용하기 위해 이동되었다. 각 스캔은 거의 1 시간 동안 지속되었고, 그리고 스캔은 주사 후 15 분, 2 시간 및 24 시간에서 획득되었다. PET 이미지는 2D 최대 공산 기대값 최대화(ML-EM) 알고리즘을 이용하여, 복셀 크기 1.898 x 1.898 x 0.796 mm, 치수 128 x 128 x 475의 3D 이미지로 재구성되었다. 혈액 표본은 주사의 반대쪽 다리에서 복재 정맥으로부터 복수 시점에서 획득되었고, 그리고 혈액 방사성이 웰 계수기에서 계수되었다.
PET 이미지는 PMOD v3.7 소프트웨어(PMOD, Zurich, Switzerland)를 이용하여 분석되었다. 관심 영역은 장기, 예를 들면, 비장, 신장 및 간 주변에서 손으로 그려졌다. 수치는 조직의 그램당 주사된 용량 퍼센트의 단위(%ID/g)로 전환되었고, 반면 혈액 방사성은 %ID로서 제시되었다. 고갈된 동물에 대한 대표적인 PET 이미지는 도 13에서 도시되는데, 이것은 도 9에서 비-고갈된 동물에서 목격되는 비장 신호의 완전한 부재를 보여준다.
각 NHP(고갈된 동물 및 비-고갈된 동물 둘 모두)에 대한 혈액 동역학은 도 14에서 도시되고, 반면 장기 흡수는 도 15에서 도시된다. 고갈된 동물 및 비-고갈된 동물 사이에 혈액 동역학에서는 차이가 거의 없다. 가장 빠른 시점에서 비장 흡수는 고갈된 동물 및 비-고갈된 동물 사이에 유사한데, 그 이유는 이것이 혈류에 의해 지배되기 때문이다. 하지만, 추후 시점(2 시간)에서 고갈된 동물에서 비장 흡수는 비-고갈된 동물에서 목격되는 것의 절반보다 적고, 그리고 본질적으로 배경 수준에 머물러 있는데, 이것은 방사성표지화된 센티린의 CD8A 특이성을 증명한다.
실시예 12: CD8 과다발현 종양에서 PET 영상화의 민감도 및 특이성
항-CD8A FN3 도메인 분자 및 PET로 검출될 수 있는 가장 적은 숫자의 세포를 결정하기 위해, 상이한 숫자의 CD8 과다발현 세포를 이용한 연구가 생쥐에서 수행되었다. 40마리의 4-5 주령 암컷 NOD-scid IL2rγ 널(null) (NSG) 생쥐(JAX Laboratory)가 이용되고, 그리고 7-10 일 동안 순화되었다. 생쥐는 19 내지 22 ℃의 온도에서 12-시간 명암 주기(06시 30분에 점등) 하에 IVC-케이지에서 집단 수용되었다. 생쥐는 표준 고압멸균된 실험실 사료 및 물이 무제한으로 사양되었다. 생쥐는 귀-태깅되었고, 그리고 각 동물을 식별하기 위해 연구의 시작 5-7 일 전에 꼬리에 문신을 새겼다.
HEK-293 부모 및 HEK-293-luc CD8+ 과다발현 세포주는 2D-배양액으로서 유지되었다. 생쥐는 1:1 배지 대 변하는 비율의 HEK-293-Luc CD8+ 발현 세포 및 HEK-293 부모 세포를 내포하는 쿨트렉스 혼합물에서 총 106 종양 세포가 피하 이식되었다. 일단 종양이 촉진가능하고, 대략 10-14 일이고, 크기에서 200-300 mm3이면, [I-124]CD8-S365를 이용하여 인간 CD8+ 세포가 가시화되었다.
HEK-293-Luc CD8+ 세포의 루시페라아제 발현은 IVIS 스펙트럼 광학 영상장치(Perkin Elmer)에서 생물발광 영상화를 이용하여 생체내에서 정량되었다. 피크 광 방출을 확인하기 위해 동적 광학적 영상화가 150 mg/kg D-루시페린의 주사 직후에 수행되었다.
대략 0.2-0.5 mCi의 방사성표지화된 항-CD8A FN3 도메인 분자가 산소에서 이소플루란으로 마취되는 동안, 꼬리 정맥 내로 주사되었다. 각 동물은 20 분 정지 스캔을 위해 Inveon microPET-CT 스캐너(Siemens, Knoxville, TN)에서 스캔되었다. 스캔은 추적자 주입후 2-3 시간에서 획득되었다. PET 이미지는 2D 최대 공산 기대값 최대화(ML-EM) 알고리즘을 이용하여, 복셀 크기 0.776 x 0.776 x 0.796 mm, 치수 128 x 128 x 159의 3D 이미지로 재구성되었다.
PET 이미지는 PMOD v3.7 소프트웨어(PMOD, Zurich, Switzerland)를 이용하여 분석되었다. 관심 영역은 종양 및 다른 장기, 예를 들면, 비장, 신장 및 간 주변에서 손으로 그려졌다. 수치는 조직의 그램당 주사된 용량 퍼센트의 단위로 전환되었다(%ID/g). 대표적인 PET 이미지는 도 16에서 도시된다. 루시페라아제 발현은 Living Image v4.4 소프트웨어(Perkin Elmer)에서 관심 영역을 그림으로써 정량되었다. 광 방출은 광양자/sec/cm2/스테라디안의 단위에서 계측되었다.
CD8+ HEK293 세포 및 부모 세포 둘 모두에 대한 혈액 및 종양에서 방사성표지화된 항-CD8A FN3 도메인 분자의 시간 활성 곡선은 도 17 및 도 18에서 도시된다. CD8-발현 세포에서 부모와 비교하여 항-CD8A FN3-결합에서 유의미한 증가가 있지만, 혈액 활성은 둘 모두에서 동일하다. CD8+ HEK293 세포에 의한 항-CD8A FN3의 흡수는 이식된 세포의 숫자의 함수로서 도 19에서 도시된다. 이들 데이터에 근거하여, 가장 낮은 검출 수준은 대략 7.5x106 세포인 것으로 추정된다.
서열 목록
서열 번호 1= 본래 텐콘 서열
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT
서열 번호 2= TCL1 라이브러리
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV(X)7-12PLSAEFTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7은 임의의 아미노산이고; 그리고
X8, X9, X10, X11 및 X12는 임의의 아미노산이거나 또는 결실된다.
서열 번호 3=TCL2 라이브러리
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;
여기서
X1은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X2는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X3은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X4는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X5는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X6은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X7은 Phe, Ile, Leu, Val 또는 Tyr이고;
X8은 Asp, Glu 또는 Thr이고;
X9는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X10은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X11은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X12는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X13은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;
X14는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; 그리고
X15는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.
서열 번호 4= 안정된 텐콘(텐콘 27)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
서열 번호 5= TCL7(FG 및 BC 루프)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; 그리고
X7, X8, X9, X17, X18 및 X19는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 또는 결실된다.
서열 번호 6= TCL9(FG 루프)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10X11X12SNPLSAIFTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; 그리고
X8, X9, X10, X11 및 X12는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 또는 결실된다.
서열 번호 7= TCL14 라이브러리
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W,Y, 또는 M이다.
서열 번호 8= TCL24 라이브러리
TCL24 라이브러리(서열 번호: 8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT;
여기서
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W이다.
서열 번호 9=Sloning-FOR
GTGACACGGCGGTTAGAAC
서열 번호 10=Sloning-REV
GCCTTTGGGAAGCTTCTAAG
서열 번호 11=POP2250
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC
서열 번호 12=DigLigRev
CATGATTACGCCAAGCTCAGAA
서열 번호 13=BC9
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
서열 번호 14=BC8
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
서열 번호 15=BC7
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
서열 번호 16=BC6
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
서열 번호 17=130mer-L17A
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTG
서열 번호 18=POP222ext
CGG CGG TTA GAA CGC GGC TAC AAT TAA TAC
서열 번호 19=LS1114
CCA AGA CAG ACG GGC AGA GTC TTC GGT AAC GCG AGA AAC AAC CAG GTT TTT CGG CGC CGG CAG CAT GGT AGA TCC TGT TTC
서열 번호 20=LS1115
CCG AAG ACT CTG CCC GTC TGT CTT GG
서열 번호 21=LS1117
CAG TGG TCT CAC GGA TTC CTG GTA CTG GAT CAG GAA AGA GTC GAA
서열 번호 22=SDG10
CATGCGGTCTCTTCCGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTCCTGACCGTTCCGGGT
서열 번호 23=SDG24
GGTGGTGAAGATCGCAGACAGCGGGTTAG
서열 번호 24=POP2222
CGGCGGTTAGAACGCGGCTAC
서열 번호 25=SDG28
AAGATCAGTTGCGGCCGCTAGACTAGAACCGCTGCCACCGCCGGTGGTGAAGATCGCAGAC
서열 번호 26=FG12
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 27=FG11
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 28=FG10
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 29=FG9
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 30=FG8
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 31=FG7
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호: 32 텐콘의 FG 루프
KGGHRSN
서열 번호 33=Tcon 6
AAGAAGGAGAACCGGTATGCTGCCGGCGCCGAAAAAC
서열 번호 34=Tcon5E86Ishort
GAG CCG CCG CCA CCG GTT TAA TGG TGA TGG TGA
TGG TGA CCA CCG GTG GTG AAG ATC GCA GAC AG
> 서열 번호 35: CD8W7
SQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAGSGSGSDYKDDDDKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>서열 번호 36: CD8W13
SQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDGGGGSDYKDDDDKGGGGSHHHHHHDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>서열 번호 37: mIgGK 신호 펩티드
Metdtlllwvlllwvpgstg
>서열 번호 38: 인간 Fc
Dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
>서열 번호 39: 링커 서열
Ggggsdykddddkggggshhhhhh
서열 번호 270 텐콘25
LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
서열 번호: 271 시아노 CD8알파
MRNQAPGRPKGATSPPPLPTGSRAPPVAPELRAEPRPGERVMAPPVTALLLPLVLLLHAARPNQFRVSPLGRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGTAARPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLRDFRQENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTTASQPLSLRPEACRPAAGGSVNTRGLDFACDIYIWAPLAGACGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGGKPSLSDRYV
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. HAWKINS, REBECCA JACOBS, STEVEN SEPULVEDA, MANUEL <120> CD8A-BINDING FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS <130> JBI5112WOPCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2017-12-13 <150> 62/434,017 <151> 2016-12-14 <160> 281 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 2 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(81) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(86) <223> Any amino acid or absent <400> 2 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 90 <210> 3 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Phe, Ile, Leu, Val or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Asp, Glu or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (76)..(76) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(82) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <400> 3 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Xaa Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 4 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 5 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(27) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(30) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(84) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (85)..(87) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or absent <400> 5 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp 20 25 30 Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile 35 40 45 Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr 85 90 95 Thr <210> 6 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(81) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(86) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or absent <400> 6 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 95 <210> 7 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(41) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(79) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, or Met <400> 7 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 8 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(41) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(79) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(86) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Trp <400> 8 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Xaa Leu Xaa 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Pro Leu Xaa Ala Xaa Phe Thr Thr 85 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 gtgacacggc ggttagaac 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 gcctttggga agcttctaag 20 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 cggcggttag aacgcggcta caattaatac 30 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 catgattacg ccaagctcag aa 22 <210> 13 <211> 385 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(224) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 13 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttygac tctttcctga 240 tccagtacca ggaatctgaa aaagttggtg aagcgatcaa cctgaccgtt ccgggttctg 300 aacgttctta cgacctgacc ggtctgaaac cgggtaccga atacaccgtt tctatctacg 360 gtgttcttag aagcttccca aaggc 385 <210> 14 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(221) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 14 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttygactct ttcctgatcc 240 agtaccagga atctgaaaaa gttggtgaag cgatcaacct gaccgttccg ggttctgaac 300 gttcttacga cctgaccggt ctgaaaccgg gtaccgaata caccgtttct atctacggtg 360 ttcttagaag cttcccaaag gc 382 <210> 15 <211> 379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(218) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 15 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt ygactctttc ctgatccagt 240 accaggaatc tgaaaaagtt ggtgaagcga tcaacctgac cgttccgggt tctgaacgtt 300 cttacgacct gaccggtctg aaaccgggta ccgaatacac cgtttctatc tacggtgttc 360 ttagaagctt cccaaaggc 379 <210> 16 <211> 376 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(215) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 16 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnttyga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatca acctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttctta 360 gaagcttccc aaaggc 376 <210> 17 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 cggcggttag aacgcggcta caattaatac ataaccccat ccccctgttg acaattaatc 60 atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacaggat 120 ctaccatgct g 131 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 cggcggttag aacgcggcta caattaatac 30 <210> 19 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ccaagacaga cgggcagagt cttcggtaac gcgagaaaca accaggtttt tcggcgccgg 60 cagcatggta gatcctgttt c 81 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ccgaagactc tgcccgtctg tcttgg 26 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 cagtggtctc acggattcct ggtactggat caggaaagag tcgaa 45 <210> 22 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 catgcggtct cttccgaaaa agttggtgaa gcgatcgtcc 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(383) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 29 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntctaacc cgctgtctgc gatcttcacc accggcggtc 420 accatcacca tcaccatggc agcggttcta gtctagcggc cgcaactgat cttggc 476 <210> 30 <211> 473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(380) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 30 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Trp Pro Arg Lys Tyr Gln Arg Pro Phe Asp Ser 20 25 30 Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Ile Glu Trp 65 70 75 80 Ile Gly Asn Arg Pro Ile Ala Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr 85 90 95 Thr <210> 54 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Pro Ile Ala Ser Gln Ile His Ser Pro Phe Asp 20 25 30 Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile 35 40 45 Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys 65 70 75 80 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Arg 20 25 30 Ile Gly Tyr Pro Glu Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Trp Val Ile Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Glu 65 70 75 80 Asn Ser Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 63 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Arg 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Pro Pro Leu Ser Ala Ile 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala 20 25 30 Ile Ser Tyr Pro Glu Trp Pro Val Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 74 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Gln Gly Val Lys Gly Gly Thr Pro Ser 65 70 75 80 Trp Pro Leu Ser Ala Ile 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 106 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp 20 25 30 Ile Trp Tyr Ala Glu Tyr Gly Tyr Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Asp Val Ala Ile Ser Gly Ala Lys Gly Gly Pro Arg Ser 65 70 75 80 Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 107 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 107 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Pro 20 25 30 Ile Trp Tyr Arg Glu Tyr Ala Thr Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr Val 35 40 45 Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr 50 55 60 Glu Tyr Asp Val Val Ile Thr Gly Val Lys Gly Gly Tyr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 115 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Trp Thr Ser Pro Leu Pro Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Ser Arg Pro Ile Ser Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 95 <210> 116 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 116 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Ala Lys Asn Leu His Ser Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys Tyr Asp 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 134 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Gln Arg His Ser Asp Ala His Pro Leu Phe Asp 20 25 30 Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile 35 40 45 Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys 65 70 75 80 Trp Glu Gly Asn Arg Pro Val Ala Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe 85 90 95 Thr Thr <210> 135 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 135 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Pro Ile Val Asn Thr Pro Leu His Phe Asp Ser 20 25 30 Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Gln Tyr 65 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 146 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Asp Trp Ser 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 147 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 147 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Arg 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Arg Gly Asp Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Ile Ile Gln Gly Val Lys Gly Gly Thr Asp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 157 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asn 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Arg Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Ile Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Asp Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 158 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 158 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ser 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val His Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Val Leu Ser 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 168 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ser 20 25 30 Ile Ser Tyr Ile Glu Tyr Pro Glu Ile Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Trp Val Pro Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Ile 65 70 75 80 Gln Ser Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 169 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 169 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly 20 25 30 Ile Ala Tyr Val Glu Trp Trp His Arg Gly Glu Ala Ile Ser Leu Pro 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Asn Val Ile Ile Thr Gly Val Lys Gly Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 His Pro Leu Gly Ala Ile Phe Thr Thr 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Synthetic polypeptide <400> 179 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Thr Arg Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Ser Pro Ser 65 70 75 80 Pro Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 180 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 180 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asn 20 25 30 Ile Ala Tyr Gly Glu Tyr Pro Gly Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Pro Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 181 <211> 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 192 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Ile Ala Lys Trp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Val His Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 193 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 193 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe His 20 25 30 Ile Phe Tyr Pro Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Asn Ile Ser Gly Val Lys Gly Gly Tyr Glu Ser 65 70 75 80 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 203 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr 20 25 30 Ile Ser Tyr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Ala Val Phe Ile Trp Cys Val Lys Gly Gly Trp Leu Ser 65 70 75 80 Asp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 204 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 204 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Glu 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Asn Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Val Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Val Asn Ser 65 70 75 80 Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 214 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ser 20 25 30 Ile Asn Tyr Trp Glu Glu Asp Pro Ala Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Arg Val Leu Ile Gly Gly Val Lys Gly Gly His Gly Ser 65 70 75 80 Leu Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 215 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 215 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Thr Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Gly Arg Ser 65 70 75 80 Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr 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Synthetic polypeptide <400> 225 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly 20 25 30 Ile Ala Tyr Val Glu Trp Trp His Arg Gly Glu Ala Ile Ser Leu Pro 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Thr Ile Leu Gly Val Lys Gly Gly Ile Ile Ser 65 70 75 80 Thr Pro Leu Gly Ala Ser Phe Thr Thr 85 <210> 226 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 226 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly 20 25 30 Ile Gly Tyr Ala Glu Pro Ala Val Thr Gly Glu Ala Ile Ser Leu Ser 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Val Ile Ile Gly Val Lys Gly Gly Ile Asn Ser 65 70 75 80 Tyr Pro Leu Gly Ala Ser Phe Thr Thr 85 <210> 227 <211> 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 236 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Leu Pro Pro Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Gln Gly Val Lys Gly Gly Val Glu Ser 65 70 75 80 Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 237 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 237 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Ile Pro Pro Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Gln Gly Val Lys Gly Gly Val Glu Ser 65 70 75 80 Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 256 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Tyr Pro Pro Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Ser Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 257 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 257 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala 20 25 30 Ile Ala Tyr Pro Glu Leu Pro Pro Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Ser Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 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Val Lys Gly Gly Ser Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 260 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 260 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr 20 25 30 Ile Thr Tyr Pro Glu Trp Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 261 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 261 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln 20 25 30 Ile Thr Tyr Pro Glu Trp Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 262 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 262 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ser 20 25 30 Ile Thr Tyr Pro Glu Trp Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 263 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 263 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp 20 25 30 Ile Thr Tyr Pro Glu Tyr Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 264 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 264 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp 20 25 30 Ile Thr Tyr Pro Glu Leu Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 265 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 265 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp 20 25 30 Ile Thr Tyr Pro Glu Ile Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 266 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 266 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp 20 25 30 Ile Thr Tyr Pro Glu Trp Pro Pro Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 267 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 267 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala 20 25 30 Ile Ala Tyr Ala Glu Trp Pro Pro Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Ser Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 268 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 268 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp 20 25 30 Ile Thr Tyr Ala Glu Trp Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 269 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 269 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly 20 25 30 Ile Leu Tyr Tyr Glu Pro Val Asp Ser Gly Glu Ala Ile Thr Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Trp Val Val Ile Thr Gly Val Lys Gly Gly Ala Pro Ser 65 70 75 80 Thr Pro Leu Gly Thr Ile Phe Thr Thr 85 <210> 270 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 270 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 271 <211> 276 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 271 Met Arg Asn Gln Ala Pro Gly Arg Pro Lys Gly Ala Thr Ser Pro Pro 1 5 10 15 Pro Leu Pro Thr Gly Ser Arg Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Leu Arg 20 25 30 Ala Glu Pro Arg Pro Gly Glu Arg Val Met Ala Pro Pro Val Thr Ala 35 40 45 Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Gln 50 55 60 Phe Arg Val Ser Pro Leu Gly Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val 65 70 75 80 Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser 85 90 95 Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Thr Ala Ala Arg Pro Thr Phe Leu Leu 100 105 110 Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln 115 120 125 Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr Leu Arg 130 135 140 Asp Phe Arg Gln Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser 145 150 155 160 Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala 165 170 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 279 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala 20 25 <210> 280 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 280 Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 1 5 <210> 281 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 281 Lys Gly Gly His Arg Ser Asn Pro 1 5

Claims (24)

  1. 서열 번호: 40-269의 한 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 68, 79, 81, 83, 89, 또는 122에 상응하는 잔기 위치 54에 하나의 시스테인 치환을 포함하는 인간 CD8A 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD8A 단백질과 교차반응하는 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 제2 분자에 접합되는 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제2 분자는 검출가능한 표지인 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 방사성동위원소, 자성 비드, 금속성 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염료, 전자 밀도 시약, 효소, 비오틴, 다이곡시제닌, 또는 합텐인 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  6. 제1항에 있어서, 효소결합 면역점(ELISPOT) 검정으로 계측했을 때, 상기 FN3 도메인은 시험관내에서 CD8+ T-세포를 활성화시키지 않는 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  7. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 인간 CD8A 단백질에 결합하기 위해 서열 번호: 229-234 중에서 한 가지의 아미노산 서열을 포함하는 FN3 도메인과 경쟁하는 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  8. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 하기에 열거된 조건에 따라서 수행된 표면 플라스몬 공명으로 계측된 0.02 내지 6.6 nM 사이의 친화성(KD)으로 인간 CD8A 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인:
    30 uL/분 유속에서 5분 동안 3가지 상이한 리간드 밀도, 10μg/mL, 5μg/mL, 및 2.5μg/mL에서 수직 방향으로 포획; 3 μM 농도의 정규화에서 수평 방향으로 포획; 6개 피분석물 통로의 사용; PBST를 작업 완충액으로 이용하여 100 μL/분의 유속에서 15분 동안 해리 상태의 모니터링; 및 100 uL/분 유속 및 18초의 접촉 시간에서 0.85% 인산의 짧은 펄스에 의한 표면의 재생.
  9. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인의 N 말단에서 메티오닌을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  10. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 반감기 연장 모이어티에 결합된 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  11. 제10항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 CD8 결합 분자, 알부민, 알부민 변이체, 알부민 결합 분자, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), CD8, CD8 변이체, 또는 최소한 면역글로불린의 Fc 영역의 일부인 것을 특징으로 하는 단리된 FN3 도메인.
  12. 제1항의 FN3 도메인을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  14. 제13항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
  15. 인간 CD8A 단백질에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 생산하는 방법으로서, FN3 도메인이 발현되는 조건 하에 제14항의 단리된 숙주 세포를 배양하고, 그리고 FN3 도메인을 정제하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 FN3 도메인 생산 방법.
  16. 제1항의 FN3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  17. 제1항의 FN3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시약 또는 포획제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 서열 번호: 68, 79, 81, 83, 89, 또는 122에 상응하는 잔기 위치 54에서 시스테인 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 진단 시약 또는 포획제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 치환된 시스테인은 Zr-89 또는 I-124에 접합된 것을 특징으로 하는 진단 시약 또는 포획제.
  20. 생물학적 표본을 제19항의 진단 시약으로 처리하고, 그리고 이런 진단 시약의 FN3 도메인에 생물학적 표본의 결합을 평가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 표본에서 CD8-발현 세포를 검출하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 진단 시약은 서열 번호: 68, 79, 81, 83, 89, 또는 122의 잔기 위치 54에서 시스테인 치환을 갖고, 그리고 치환된 시스테인은 Zr-89 또는 I-124에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
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