ES2310122B1 - Nanoparticulas que comprenden una ciclodextrina y una molecula biologicamente activa y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Nanopartículas que comprenden una ciclodextrina
y una molécula biológicamente activa y sus aplicaciones.
Las nanopartículas comprenden un polímero
biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una
molécula biológicamente activa. Dichas nanopartículas pueden asociar
elevadas cantidades de moléculas biológicamente activas,
especialmente, de naturaleza hidrófoba, y liberar la molécula
biológicamente activa proporcionando unos niveles plasmáticos
sostenidos y constantes de la misma cuando son administradas por vía
oral o a través de cualquier otra mucosa del organismo.
Description
Nanopartículas que comprenden una ciclodextrina
y una molécula biológicamente activa y sus aplicaciones.
La invención se relaciona con unas
nanopartículas, con características bioadhesivas, que comprenden un
polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la
misma, y una molécula biológicamente activa. La invención también se
relaciona con un procedimiento para su producción, con
composiciones que contienen dichas nanopartículas y con sus
aplicaciones.
En los últimos años, se ha desarrollado el uso
de nanopartículas poliméricas biodegradables como vehículos para la
administración de fármacos, especialmente, por vía oral. Las
nanopartículas se definen, en general, como sistemas coloidales de
tipo partícula sólida, con un tamaño inferior al micrómetro,
constituidas por polímeros naturales o sintéticos. Dependiendo del
proceso seguido en su elaboración se pueden obtener dos tipos de
estructuras: nanoesferas o nanocápsulas. Las nanoesferas tienen una
estructura de tipo matriz polimérica, en la que se encuentra
dispersado el principio activo, mientras que las nanocápsulas
poseen un núcleo que contiene el principio activo, rodeado de una
cubierta, tal como una cubierta polimérica. Debido a la elevada
superficie específica de estos sistemas el principio activo también
puede ser adsorbido sobre la superficie del sistema
nanoparticular.
La vía oral es la vía más popular y atractiva
para la administración de medicamentos. El uso de esta vía se
asocia con un aumento significativo de la aceptación de la
medicación por parte del paciente y con menores costes sanitarios.
Sin embargo, un importante número de fármacos presenta una eficacia
muy baja cuando se administran por medio de esa vía. Este fenómeno
puede ser debido a uno o varios de los siguientes factores que
condicionan la biodisponibilidad oral de un fármaco: (i) baja
permeabilidad de la molécula activa para atravesar la mucosa
(asociado generalmente a fármacos de naturaleza hidrófila), (ii)
baja estabilidad en el ambiente gastrointestinal (presencia de
valores de pH extremos, enzimas, etc.), (iii) liberación incompleta
del fármaco desde la forma de dosificación, (iv) baja solubilidad
del principio activo en el ambiente gastrointestinal (asociado a
fármacos de naturaleza hidrófoba), y (v) metabolismo
presistémico.
Los sistemas nanoparticulados permiten, en
numerosas ocasiones, aumentar de forma significativa la
biodisponibilidad de la molécula biológicamente activa y, así,
ofrecer nuevas estrategias de administración. La mejora de la
biodisponibilidad obtenida tras utilizar estos vehículos se puede
explicar mediante la habilidad de las nanopartículas poliméricas
para desarrollar interacciones bioadhesivas con el tracto de la
mucosa gastrointestinal. Así, cuando una suspensión de
nanopartículas se administra por la vía oral, estos transportadores
pueden interaccionar y desarrollar interacciones adhesivas con
diversos componentes de la mucosa. Dependiendo de ciertos parámetros
físico-químicos (tales como la naturaleza del
polímero, tamaño, carga superficial o la presencia de ciertos
recubrimientos o ligandos en el vehículo), las características
bioadhesivas de las nanopartículas pueden variar y permitir, en
ciertos casos, alcanzar la superficie del entericito, y,
eventualmente, desarrollar interacciones bioadhesivas en regiones
muy concretas del tracto gastrointestinal. Todos estos fenómenos
conducen a (i) un incremento del tiempo de residencia de la forma
farmacéutica en contacto íntimo con la superficie de la mucosa, o a
(ii) una localización específica del vehículo (con el fármaco) en
una determinada zona. Una vez que las nanopartículas están adheridas
a la mucosa, éstas pueden promover la absorción del fármaco
transportado y su acceso a la circulación sistémica mediante
diversos mecanismos.
Ejemplos ilustrativos de fármacos cuya
biodisponibilidad oral aumenta mediante su encapsulación o
asociación a nanopartículas incluyen calcitonina de salmón,
furosemida, avarol, dicumarol, nifedipina, fluoropirimidinas,
plásmidos, etc.
Como polímeros biodegradables para la
fabricación de sistemas particulados tienen especial importancia
los homo- y co-polímeros de los ácidos láctico y
glicólico (PLGA) ya que presentan una buena compatibilidad tisular,
no son tóxicos y han sido usados durante muchos años como material
de suturas reabsorbibles. Estos (co)polímeros son solubles
en disolventes orgánicos, tales como cloroformo, diclorometano,
acetona y acetato de etilo e insolubles en medios acuosos; sin
embargo, son capaces de captar agua e hincharse en mayor o menor
grado, dependiendo de su peso molecular y de su composición. Entre
los inconvenientes que presentan estos polímeros merece la pena
resaltar que el PLGA puede resultar bastante hidrófobo comparado
con muchos de los antígenos que transporta. Además, tanto la
hidratación como la degradación del PLGA son requisitos
imprescindibles para la liberación del antígeno durante la fase de
erosión. Esta erosión produce un microentorno bastante ácido debido
a la acumulación de los productos de degradación del polímero, los
ácidos láctico y glicólico; el pH puede bajar hasta ser del orden
de 2-3. En estas condiciones, las proteínas
liberadas sufren hidrólisis y agregación en el medio acidificado y
muchos antígenos pierden su capacidad antigénica. Finalmente, su
elevado precio podría limitar su uso y favorecería la búsqueda de
otros materiales menos costosos.
Como alternativa a los poliésteres, las
nanopartículas preparadas con otros polímeros han resultado ser
adecuadas para la administración de fármacos por vía oral. Uno de
los polímeros más utilizados es el quitosano. El quitosano es un
polímero similar a la celulosa que proviene de la desacetilación de
la quitina, componente mayoritario del exoesqueleto de los
crustáceos. El quitosano puede formularse en nanopartículas de
diferentes tamaños donde lleva el fármaco incorporado. Las
partículas de quitosano son capaces de aumentar la absorción de
proteínas en la superficie mucosa, induciendo una apertura
transitoria de las uniones estrechas. Además, el quitosano puede
tener un efecto inmunomodulador, estimulando la producción de
citoquinas in vitro y mejorando el balance natural Th2/Th3 a
nivel de mucosas en ausencia de antígeno.
Recientemente, se ha propuesto el copolímero de
metil vinil eter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez®], como
material biodegradable para producir nanopartículas (Arbos et
al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330).
Estos copolímeros PVM/MA son ampliamente utilizados como
espesantes, estabilizantes de soluciones acuosas, componentes de
adhesivos dentales, parches transdérmicos y en comprimidos bucales.
Entre las principales ventajas de estos polianhídridos merece la
pena destacar su bajo coste, su baja toxicidad oral y la
disponibilidad de grupos funcionales que pueden reaccionar
fácilmente con moléculas que contengan grupos hidroxilo o amino
(Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003)
19-30). De este modo, en un medio acuoso, el grupo
anhídrido se hidroliza dando lugar a dos grupos carboxilos y esta
reacción permite unir ligandos fácilmente a la cadena polimérica o
bien a la superficie de las nanopartículas preparadas.
Las ciclodextrinas (CD) son un grupo de
oligosacáridos cíclicos, obtenidos por degradación enzimática del
almidón. Están compuestas por unidades de
\alpha-1,4-glucopiranosa unidas
entre sí, formando una estructura de tipo cono truncado con una
cavidad interna hidrófoba. Las CD pueden contener más de 15 unidades
de \alpha-1,4-glucopiranosa,
aunque las más abundantes contienen 6 (\alpha-CD),
7 (\beta-CD) ú 8 (\gamma-CD)
unidades de
\alpha-1,4-glucopiranosa. En
aplicaciones farmacéuticas, la \beta-CD y sus
derivados son los más utilizados, en particular, la
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD). Esta CD presenta
una elevada solubilidad acuosa, una toxicidad inferior así como una
cavidad más hidrófoba en comparación con el compuesto de origen
(\beta-CD). Los complejos formados mediante la
utilización de ciclodextrinas pueden proporcionar, a la molécula
huésped, estabilidad y aumento de solubilidad acuosa, lo que puede
llevar a incrementos de la biodisponibilidad de esa molécula (e.g.,
fármaco) y/o la reducción de efectos adversos. Además, se ha
descrito en la literatura la capacidad de aumentar la capacidad de
carga de liposomas y micropartículas. Asimismo, las CD son capaces
de modificar el perfil de liberación del fármaco encapsulado.
Numerosos agentes antitumorales se administran
por vía parenteral, lo que plantea diversos problemas. Entre las
principales ventajas que supondría la administración de agentes
antitumorales por vía oral, merece la pena destacar el aumento de
la calidad de vida de los pacientes así como la reducción de los
costes sanitarios. Esta vía de administración permitiría una
exposición continua de las células cancerosas al fármaco
antitumoral a un nivel de concentración apropiado y sostenido lo
que puede mejorar el índice terapéutico y reducir los efectos
secundarios. Sin embargo, la gran mayoría de estos fármacos (e.g.,
paclitaxel) presentan una baja biodisponibilidad al ser
administrados por vía oral.
El paclitaxel (Taxol®, Bristol Myers Squibb
Company), un producto extraído del árbol Taxus brevifolia,
fue descrito por primera vez en 1.971 y desde 1.993 es el agente
quimioterápico contra el cáncer más empleado en todo el mundo. El
paclitaxel actúa a nivel celular promoviendo la polimerización de
la tubulina. De este modo, los microtúbulos formados en presencia
de paclitaxel son extraordinariamente estables y no funcionales,
causando así la muerte celular por la incapacidad dinámica y
funcional de los microtúbulos para la división celular. En Europa,
este fármaco está indicado tanto como agente individual como en
combinación con otros tratamientos oncológicos para el tratamiento
de cáncer de ovario, de mama y de células pulmonares no pequeñas,
tanto avanzado como metastático.
El principal inconveniente de este fármaco
radica en su escasa biodisponibilidad oral debido a su baja
solubilidad acuosa y al efecto de metabolismo de primer paso
principalmente. Tras la administración oral, el paclitaxel es
sustrato de la glicoproteina-P, así como de otros
miembros de la superfamilia ABC (ATP-binding
cassette), tales como BCRP y MRP2. La superfamilia ABC
transportadora de proteínas juega un papel central en la defensa
del organismo frente a compuestos tóxicos y frente a algunos
agentes anticancerosos. Dichas proteínas
(glicoproteina-P, MRP2 y BCRP) están localizadas en
la zona apical de las membranas intestinal, hepática y renal,
mediando el bombeo de xenobióticos y toxinas a la luz intestinal,
biliar y orina. Además, tanto la glicoproteina-P
como MRP2 se localizan conjuntamente junto con CYP3A4,
glutation-S-transferasas y
UDP-glucuronosiltransferasas lo que supone una
actuación sinérgica en la regulación de la biodisponibilidad oral
de los fármacos administrados.
Por todo ello, actualmente, el paclitaxel está
formulado para su uso en clínica y por vía intravenosa en un
vehículo compuesto por Cremophor EL:etanol (1:1). Con el fin de
prevenir y minimizar los efectos tóxicos del Cremophor EL por vía
intravenosa y mejorar el índice terapéutico del fármaco,
recientemente, se ha comercializado una nueva formulación basada en
la encapsulación del fármaco en nanopartículas de albúmina
denominada Abraxane® (Green et al. Annals of Oncology
17:1263-1268, 2006).
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar
sistemas de administración de fármacos capaces de aumentar la
biodisponibilidad cuando se administran por vía oral de numerosos
principios activos, especialmente, de aquellos fármacos de
naturaleza lipófila y/o que sean sustrato de la
glicoproteína-P (e.g., paclitaxel). Ventajosamente,
dichos sistemas de administración deberían tener propiedades
bioadhesivas, deberían tener la capacidad de incorporar cantidades
variables de fármacos lipófilos, e, idealmente, deberían ser
capaces de evitar el efecto de la glicoproteína-P
sobre el fármaco transportado. Estos objetivos pueden ser
conseguidos mediante las nanopartículas proporcionadas por la
presente invención.
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que
la asociación de las nanopartículas de un polímero biodegradable,
tal como el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico
(PVM/MA), con ciclodextrinas unidas a moléculas biológicamente
activas, permite obtener unas nanopartículas con características
fisicoquímicas y de bioadhesión a la mucosa gastrointestinal que
las convierten en sistemas de gran interés como transportadores de
todo tipo de moléculas biológicamente activas, especialmente,
moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba (lipófila),
tal como el paclitaxel. Dichas nanopartículas pueden prolongar el
tiempo de residencia en la mucosa tras su administración oral.
Además, dichas nanopartículas pueden mejorar la biodisponibilidad
de moléculas biológicamente activas que pudieran ser sustrato de la
glicoproteína-P. Asimismo, dichas nanopartículas
pueden utilizarse como sistemas para la administración de fármacos
con elevada toxicidad (e.g., citostáticos) al ofrecer niveles
plasmáticos sostenidos y constantes de la molécula biológicamente
activa durante periodos de tiempo de hasta 24 horas, lo que
posibilita tratamientos alternativos a la perfusión hospitalaria,
permitiendo un abaratamiento del coste sanitario de los
tratamientos con este tipo de fármacos.
Por tanto, la invención proporciona unas
nanopartículas con capacidad para asociar elevadas cantidades de
moléculas biológicamente activas, especialmente, de naturaleza
hidrófoba, para su administración efectiva a través de mucosas,
especialmente, por vía oral, debido a que presentan unas
características bioadhesivas adecuadas que favorecen la interacción
de las nanopartículas (conteniendo la molécula biológicamente
activa) con la superficie de la mucosa, son capaces de transportar
un amplio rango de moléculas biológicamente activas, especialmente,
de naturaleza lipófila y, sobretodo, de liberar la molécula
biológicamente activa proporcionando unos niveles plasmáticos
sostenidos y constantes del mismo cuando son administradas por vía
oral o a través de cualquier otra mucosa del organismo. Si la
molécula biológicamente activa transportada es sustrato de la
glicoproteína-P, las nanopartículas de la invención
son capaces de evitar la acción de esta proteína sobre la molécula
biológicamente activa en cuestión.
Las nanopartículas proporcionadas por esta
invención comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o
un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa. En
particular, se ha encontrado que nanopartículas formadas por un
copolímero de polivinil metil éter y anhídrido maleico y
\beta-ciclodextrina (\beta-CD),
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD) ó
6-monodeoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
(NH-\beta-CD) son fáciles de
producir, y dan excelentes características de bioadhesión, tamaño y
potencial zeta que las hace adecuadas para la administración de
moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba (e.g.,
paclitaxel). Además, se ha encontrado que la selección del tipo de
ciclodextrina utilizada en su producción permite modular
convenientemente las características de estas nanopartículas lo cual
puede ser aprovechado ventajosamente según el tipo de molécula
biológicamente activa a transportar y/o el modo de administración
de la formulación farmacéutica. Por último, se ha encontrado que la
incorporación del paclitaxel en estas nanopartículas permite
incrementar de forma muy importante la biodisponibilidad oral del
mismo, minimizando el efecto de la glicoproteína-P
a nivel de la mucosa gastrointestinal.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención
se relaciona con nanopartículas que comprenden un polímero
biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una
molécula biológicamente activa, útiles para el transporte de
moléculas biológicamente activas. En una realización particular, el
polímero biodegradable es un copolímero de metil vinil éter y
anhídrido maleico (PVM/MA). En otra realización particular, la
ciclodextrina es \beta-CD,
OH-\beta-CD o
NH-\beta-CD.
En una realización particular, la molécula
biológicamente activa presente en las nanopartículas de la
invención es paclitaxel. En este caso, las nanopartículas permiten
aumentos espectaculares de la biodisponibilidad oral del paclitaxel,
cuya absorción oral es prácticamente nula debido a sus
características físico-químicas (elevada lipofilia)
y a ser sustrato de la glicoproteína-P localizada
en el tracto gastrointestinal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende dichas
nanopartículas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para la producción de dichas nanopartículas.
La Figura 1 es una gráfica que muestra la
variación de la cantidad de ciclodextrina (CD) asociada a las
nanopartículas de PMV/MA en función del tipo de CD utilizada
[\beta-CD: \beta-ciclodextrina;
OH-\beta-CD:
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina;
NH-\beta-CD:
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina]
y del tiempo de incubación de ésta con el copolímero de
metilviniléter y anhídrido maleico (PVM/MA) (100 mg) antes de la
preparación de las nanopartículas. Los resultados muestran la media
\pm desviación típica (n = 8).
La Figura 2 es una fotografía del resultado
obtenido al someter una muestra liofilizada de nanopartículas a
base de PVM/MA con \beta-ciclodextrina
(\beta-CD-NP) a microscopia de
barrido electrónico.
La Figura 3 es una gráfica que muestra la
liberación de RBITC desde nanopartículas que contienen
ciclodextrinas \beta-CD-NP:
nanopartículas a base de PVM/MA con \beta-CD;
OH-\beta-CD-NP:
nanopartículas a base de PVM/MA con
OH-\beta-CD;
NH-\beta-CD-NP:
nanopartículas a base de PVM/MA con
NH-\beta-CD) y de las
nanopartículas control (NP) tras su incubación en medio gástrico
simulado (durante la primera hora: 0-1 h) y en
medio intestinal simulado (1 a 24 h) a 37\pm1ºC. Los datos
muestran la media \pm desviación típica (n=3).
La Figura 4 muestra un diagrama de barras que
representa la distribución de (A) nanopartículas a base de PVM/MA
con hidroxipropil-\beta-CD
(OH-\beta-CD-NP);
(B) nanopartículas a base de PVM/MA con \beta-CD;
y (C) nanopartículas control (NP), en la mucosa del tracto
gastrointestinal tras la administración oral de 10 mg de
nanopartículas marcadas fluorescentemente con RBITC. El eje
x representa los diferentes segmentos de la mucosa; el eje
y representa la fracción de nanopartículas adherida a la
mucosa; y el eje z representa el tiempo después de la
administración.
La Figura 5 es una gráfica que muestra las
curvas de bioadhesión obtenidas al representar la fracción de
nanopartículas adherida en el tracto gastrointestinal entero
respecto al tiempo. Las formulaciones representadas son (\bullet)
OH-\beta-CD-NP;
(\ding{115})\beta-CD-NP;
y (\ding{110}) NP Control. Los valores representan la media \pm
desviación estándar (n=3).
La Figura 6 es un conjunto de fotografias que
muestran la visualización por microscopía de fluorescencia de las
nanopartículas control (A) y
OH-\beta-CD-NP (B,
C) adheridas al íleo de rata tras 2 horas de la administración oral
de una única dosis de 10 mg.
La Figura 7 es una gráfica que muestra la
evolución de la cantidad de paclitaxel (PTX) encapsulado en
diferentes formulaciones en función del tipo de ciclodextrina
utilizada y la cantidad de fármaco añadido inicialmente. Los
resultados muestran media\pmdesviación típica (n = 6).
PTX-NP: nanopartículas convencionales de PVM/MA con
paclitaxel;
PTX-\beta-CD-NP:
nanopartículas de PVM/MA y \beta-CD con
paclitaxel;
PTX-OH-\beta-CD-NP:
nanopartículas de PVM/MA y
OH-\beta-CD con paclitaxel; y
PTX-NH-\beta-CD-NP:
nanopartículas de PVM/MA y
NH-\beta-CD con paclitaxel.
La Figura 8 es un conjunto de gráficas que
representan las concentraciones plasmáticas de paclitaxel (PTX) en
función del tiempo tras la administración en animales de
laboratorio de las distintas formulaciones de PTX. Los resultados
muestran la media \pm desviación típica. (A) Vía intravenosa,
dosis: 10 mg/kg. Taxol®: formulación comercial de paclitaxel. (B)
Vía oral, dosis: 10 mg/kg. Taxol®: formulación comercial de
paclitaxel; PTX-\beta-CD: complejo
\beta-CD con paclitaxel;
PTX-OH-\beta-CD:
complejo OH-\beta-CD con
paclitaxel;
PTX-NH-\beta-CD:
complejo NH-\beta-CD con
paclitaxel. (C) Vía oral, dosis: 10 mg/kg. PTX-NP:
nanopartículas convencionales de PVM/MA con paclitaxel;
PTX-\beta-CD-NP:
nanopartículas de PVM/MA y \beta-CD con
paclitaxel;
PTX-OH-\beta-CD-NP:
nanopartículas de PVM/MA y
OH-\beta-CD con paclitaxel;
PTX-NH-\beta-CD-NP:
nanopartículas de PVM/MA y
NH-\beta-CD con paclitaxel;
Taxol®: formulación comercial con paclitaxel.
En un aspecto, la invención se relaciona con
unas nanopartículas, en adelante nanopartículas de la invención,
que comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un
derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa.
Las nanopartículas de la invención poseen unas
adecuadas características físico-químicas, de
especificidad y de bioadhesión a la mucosa gastrointestinal, lo que
las convierte en sistemas potencialmente útiles para el transporte
de moléculas biológicamente activas, en particular, moléculas
biológicamente activas de naturaleza lipófila (e.g., paclitaxel,
etc.) y/o moléculas biológicamente activas que sean sustrato de la
glicoproteína-P. Las nanopartículas de la invención
pueden mejorar la biodisponibilidad de moléculas biológicamente
activas, en general, y, en particular, de moléculas biológicamente
activas de naturaleza lipófila y/o de moléculas biológicamente
activas que puedan ser sustrato de la
glicoproteína-P. De hecho, las nanopartículas de la
invención pueden prolongar el tiempo de residencia en la mucosa
tras su administración por vía oral. Asimismo, las nanopartículas de
la invención pueden ser utilizados como sistema de transporte de
moléculas biológicamente activas con elevada toxicidad, por
ejemplo, citostáticos, debido a que ofrecen niveles plasmáticos
sostenidos y constantes de tales fármacos durante periodos de tiempo
de hasta 24 horas, lo que permite el diseño de tratamientos
alternativos a la perfusión hospitalaria, redundando en un
abaratamiento del coste sanitario de los tratamientos con este tipo
de fármacos.
El término "nanopartícula", tal como aquí
se utiliza, se refiere a esferas o formas similares con un tamaño
medio inferior a 1,0 micrómetro (\mum). En general, las
nanopartículas de la invención presentan un tamaño medio de
partícula comprendido entre 1 y 999 nanómetros (nm),
preferentemente entre 10 y 900 nm. En una realización particular,
las nanopartículas de la invención presentan un tamaño medio de
partícula comprendido entre 100 y 400 nm.
Por "tamaño medio" se entiende el diámetro
promedio de la población de nanopartículas que se mueve
conjuntamente en un medio acuoso. El tamaño medio de estos sistemas
se puede medir por procedimientos estándar conocidos por los
expertos en la materia y que se describen, a modo ilustrativo, en
la parte experimental que acompaña a los ejemplos descritos más
adelante. El tamaño medio de las partículas puede verse
influenciado principalmente por la cantidad y peso molecular del
polímero biodegradable, por la naturaleza y cantidad de la
ciclodextrina, o derivado de la misma, y por la naturaleza y
cantidad de la molécula biológicamente activa, presentes en las
nanopartículas de la invención (en general, a mayor cantidad o peso
molecular de dichos componentes, el tamaño medio de la
nanopartícula se incrementará), y por algunos parámetros del
procedimiento de producción de dichas nanopartículas, tales como la
velocidad de agitación, etc.
Las nanopartículas de la invención comprenden un
polímero biodegradable. El término "biodegradable", tal como
aquí se utiliza, se refiere a polímeros que se disuelven o degradan
en un periodo de tiempo que es aceptable para la aplicación
deseada, en este caso terapia in vivo, una vez que se exponen
a una solución fisiológica de pH comprendido entre 1 y 9,
típicamente, entre 4 y 9, a una temperatura comprendida entre 25ºC
y 40ºC.
Prácticamente cualquier polímero biodegradable
conocido en el estado de la técnica que dé lugar a la formación de
nanopartículas puede ser utilizado para la puesta en práctica de la
presente invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos
polímeros biodegradables incluyen polihidroxiácidos, tales como
ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., y copolimeros de
éstos, e.g., poli(ácido
láctico-co-glicólico) [PLGA], etc.;
polianhidridos; poliésteres; polisacáridos, e.g., quitosano, etc. El
peso molecular de dicho polímero biodegradable puede variar dentro
de un amplio intervalo siempre y cuando satisfaga las condiciones
establecidas de formar nanopartículas y ser
biodegradable.
biodegradable.
En una realización particular, el polímero
biodegradable utilizado es el copolímero de metil vinil éter y
anhídrido maleico en forma anhídrido (PVM/MA). En una realización
concreta puede utilizarse, por ejemplo, el copolímero PVM/MA
comercializado con la denominación comercial Gantrez® AN. En una
realización particular, dicho copolímero PVM/MA tiene un peso
molecular comprendido entre 100 y 2.400 kDa, preferentemente entre
200 y 2.000 kDa, más preferentemente entre 180 y 250 kDa. Este
polímero biodegradable (PVM/MA) resulta particularmente ventajoso ya
que se utiliza ampliamente en tecnología farmacéutica debido a su
baja toxicidad (DL_{50} = 8-9 g/kg por vía oral)
y excelente biocompatibilidad. Además, es fácil de obtener, tanto
por la cantidad como por su precio. Este polímero biodegradable
(PVM/MA) puede reaccionar con distintas sustancias hidrófilas,
debida a la presencia de sus grupos anhídridos, sin tener que
recurrir a los reactivos orgánicos usuales (glutaraldehído,
derivados de carbodiimida, etc.) que poseen una toxicidad
importante. En un medio acuoso, el copolímero PVM/MA es insoluble,
pero sus grupos anhídrido se hidrolizan dando lugar a unos grupos
carboxílicos. La disolución es lenta y depende de las condiciones
en las que se produce. Debido a la disponibilidad de grupos
funcionales en PVM/MA, la unión covalente de moléculas con grupos
nucleofilicos, tales como hidróxido o amino, tiene lugar por simple
incubación en un medio
acuoso.
acuoso.
La solicitud de patente internacional WO
02/069938, cuyo contenido se incorpora en esta descripción por
referencia, describe nanopartículas de copolímero PVM/MA. A modo
ilustrativo, dichas nanopartículas de copolímero PVM/MA pueden
obtenerse fácilmente por desolvatación del copolímero, mediante la
adición, a una solución orgánica del mismo, de un primer disolvente
polar (miscible con una disolución del copolímero) y posterior
adición de un segundo líquido no disolvente, tal como una solución
hidroalcohólica. Opcionalmente, se puede adicionar un agente
reticulante.
Las nanopartículas de la invención comprenden,
además del polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado
de la misma.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "ciclodextrina" incluye cualquier oligosacárido
cíclico compuesto por unidades de glucosa unidas por enlaces
glicosídicos \alpha-1,4
(\alpha-1,4-glucopiranosa). Estas
unidades se producen como resultado de una reacción de
transglicosilación intramolecular de la degradación del almidón por
la enzima ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa).
La "ciclodextrina" puede contener más de 15
unidades de
\alpha-1,4-glucopiranosa, aunque
las más abundantes contienen 6, 7 ú 8 unidades de
\alpha-1,4-glucopiranosa, que
constituyen las denominadas alfa-ciclodextrinas
(\alpha-CD), beta-ciclodextrinas
(\beta-CD) o gamma-ciclodextrinas
(\gamma-CD), respectivamente. Todas ellas tienen
una estructura de tipo cono truncado, con una cavidad interna
hidrófoba y una cara externa hidrófila. Esto es debido a que los
grupos hidroxilo se encuentran orientados hacia el exterior de la
ciclodextrina mientras que en su cavidad interna, de carácter
hidrófobo, esta cubierta por los hidrógenos del grupo metileno así
como por oxígenos tipo éter. De este modo es capaz de actuar como
hospedador atrapando a la molécula huésped de forma completa o
parcial. En una realización particular, dicha ciclodextrina es una
alfa-ciclodextrina, una
beta-ciclodextrina o una
gamma-ciclodextrina.
El término "derivado de ciclodextrina", tal
como se utiliza en esta descripción, incluye cualquier
ciclodextrina que presenta, al menos, un grupo hidroxilo terminal
modificado. La modificación química de las ciclodextrinas puede
alterar sus propiedades químico-físicas, mejorando
la solubilidad, estabilidad y controlando la actividad química de
las moléculas con las que están unidas (moléculas huésped). Se ha
descrito la incorporación, mediante reacción de los grupos OH de las
ciclodextrinas, de grupos alquilo, arilo, carboxialquilo,
cianoalquilo, hidroxialquilo, sulfoalquilo, amino, azido,
heterociclilos, acetilo, benzoilo, succinilo, y otros grupos que
contienen fósforo, azufre, etc. (Robyt (1998) "Essentials of
carbohidrate chemistry", Ed. Charles R. Cantor, Springer
Advanced Text in Chemistry). En una realización particular, al
menos, uno de dichos grupos hidroxilo terminales está modificado,
reemplazando el hidrógeno por un grupo alquilo
C_{1}-C_{8} lineal o ramificado, e.g., metilo,
etilo, propilo, etc.;
trialquil(C-{1}-C_{8})sililo,
e.g., t-butildimetilsililo, etc.; hidroxialquilo
C_{1}-C_{8}, e.g.,
2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo,
etc.;
alquil(C_{1}-C_{8})carbonilo,
opcionalmente sustituido por un grupo carboxilo, e.g., acetilo,
succinilo, etc.; arilcarbonilo, e.g., benzoilo, etc.;
cianoalquil(C_{1}-C_{2}), e.g.,
cianometilo, cianoetilo; amino, opcionalmente sustituido; azido;
sulfo; sulfoalquilo (C_{1}-C_{4}); o por un
radical de un sacárido, e.g., glucosilo, manosilo, etc. En otra
realización particular, dos o más de los grupos hidroxilo
terminales de una CD, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7 grupos
hidroxilo terminales presentes en una \beta-CD,
están modificados por alguno de dichos grupos.
Las ciclodextrinas madre (es decir, sin
derivatizar), en particular, la \beta-CD, tienen
una solubilidad acuosa limitada comparada con los sacáridos
acíclicos debido, en parte, a las fuertes uniones entre las
moléculas de la ciclodextrina en estado cristalino. Además, la
\beta-CD es capaz de formar enlaces de hidrógeno
intramoleculares entre los grupos hidroxilo secundarios produciendo
de este modo entalpías de solución desfavorables, y, por tanto, una
baja solubilidad acuosa. La sustitución de alguno de los enlaces de
hidrógeno por grupos hidrófobos, tales como metoxi- o etoxi-, tiene
como resultado el aumento de la solubilidad acuosa. Por ejemplo, la
solubilidad acuosa de la \beta-CD es del 1,85%
(p/v) a temperatura ambiente pero ésta puede aumentar hasta 150
veces al aumentar el grado de metilación
(metil-\beta-CD). Otro derivado de
ciclodextrina particularmente importante es la
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD), obtenido tras el
tratamiento de la \beta-CD con óxido de propileno,
que tiene una solubilidad acuosa del 60% (p/v). Igualmente, estos
derivados pueden mejorar el perfil toxicológico, la capacidad para
encapsular moléculas biológicamente activas y modular su perfil de
liberación. El principal problema de las ciclodextrinas madre es la
nefrotoxicidad tras ser administradas por vía parenteral,
principalmente para la \beta-CD, debido a su baja
solubilidad acuosa. Por ello, los derivados más hidrófilos, tales
como la OH-\beta-CD, disminuyen
esos problemas de nefrotoxicidad al poder ser eliminados más
fácilmente. No ocurre lo mismo para los derivados metilados de la
\beta-CD, que, a pesar de ser más soluble que la
\beta-CD, no estarían exentos de provocar
toxicidad sistémica, debido a su mayor capacidad para interaccionar
con lípidos endógenos, lo que limita su uso por vía parenteral. Por
el contrario, los estudios de toxicidad realizados tras la
administración por vía oral muestran que las ciclodextrinas así
como sus derivados no son tóxicas por esta vía.
Las ciclodextrinas son macromoléculas solubles
en agua que han sido aprobadas para la administración de fármacos
por vía oral, parenteral y tópica. Las aplicaciones de las
ciclodextrinas en la administración oral de fármacos se deben,
principalmente, a la mejora en la biodisponibilidad oral del
fármaco, debido al aumento de la solubilidad, aumento de la
estabilidad del fármaco en el tracto gastrointestinal y/o en la
formulación. Además, para determinados fármacos, resulta
interesante el potencial de las ciclodextrinas en la reducción de
la irritación local producida por el propio fármaco, el control de
la liberación del fármaco a lo largo del tracto gastrointestinal o
bien el enmascaramiento de caracteres organolépticos desagradables,
entre otros. Tal es el caso del itraconazol, que está
comercializado en EEUU y Europa asociado a la
OH-\beta-CD para su
administración por vía oral, reduciéndose de manera importante la
irritación que administrado de manera aislada produce en el tracto
gastrointestinal.
Por otro lado, las ciclodextrinas también son
utilizadas por su poder de aumentar la permeabilidad del fármaco a
través de piel y mucosas, lo que produce una mejor absorción y más
uniforme del fármaco. Esto se traduce en un aumento de la actividad
de fármaco tras su administración, tal como, por ejemplo, el
complejo formado entre la flutamida y la
OH-\beta-CD, que mejora
sustancialmente la absorción del fármaco tras su administración por
vía oral.
En una realización particular, dicho derivado de
ciclodextrina, es un derivado de una
alfa-ciclodextrina, o de una
beta-ciclodextrina, o de una
gamma-ciclodextrina. Ejemplos ilustrativos, no
limitativos, de derivados de ciclodextrina que se pueden utilizar
para la puesta en práctica de la presente invención incluyen
etil-\beta-CD,
heptakis(2,3,6-tri-O-etil)-\betaP-CD,
2-hidroxipropil-\beta-CD,
2-O-2-hidroxipropil-\beta-CD,
2-hidroxietil-\beta-CD,
derivados succinilados de \beta-CD, derivados
succinilados de
2-hidroxi-propil-\beta-CD,
butil-\beta-CD,
heptakis(2,6-di-O-n-butil)-\beta-CD,
heptakis(2,6-di-O-n-pentil)-\beta-CD,
metil-\beta-CD,
metil-\beta-CD,
carboximetil-\beta-CD,
carboxietil-\beta-CD,
heptakis(2,6-di-O-metil)-\beta-CD,
heptakis(2,3,6-tri-O-metil)-\beta-CD,
acetil-\beta-CD,
heptakis(3-O-acetil-2,6-di-O-n-pentil)-\beta-CD,
heptakis(3-O-acetil-2,6-di-O-metil)-\beta-CD,
sulfo-\beta-CD,
sulfa-propil-\beta-CD,
n-butil-\beta-CD,
heptakis(3-O-n-butiril-2,6-di-O-pentil)-\beta-CD,
2-cianoetil-\beta-CD,
6-monodeoxi-6-monoazido-\beta-CD,
heptakis(2,3,6-tri-O-bencil)-\beta-CD,
heptakis(2,3,6-tri-O-benzoil)-\beta-CD,
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-CD,
heptakis(2,6-di-O-n-pentil-3-O-trifluoroacetil)-\beta-CD,
heptakis(2,3,6-tri-O-n-octil)-\beta-CD,
heptakis(2,3-di-O-acetil-6-O-terbutildimetilsilil)-\beta-CD,
heptakis(6-O-terbutildimetilsilil)-\beta-CD,
heptakis(6-O-terbutildimetilsilil-2,3-di-O-metil)-\beta-CD,
heptakis(2,6-di-terbutildimetilsilil)-\beta-CD,
heptakis(2,3,6-tri-O-trifluoroacetil)-\beta-CD,
heptakis(2,6-di-O-metil-3-O-n-pentil)-\beta-CD.
La relación en peso entre la ciclodextrina, o
derivado de la misma, y el polímero biodegradable puede variar
dentro de un amplio intervalo, en una realización particular, dicha
relación en peso ciclodextrina (o derivado de la misma): polímero
biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de
1:1-5, más preferentemente alrededor de 1:4. En una
realización particular, dicho polímero biodegradable es PVM/MA.
Como se ha mencionado previamente, en
aplicaciones farmacéuticas, la \beta-CD y sus
derivados son los más utilizados, en particular, la
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD) ya que presenta una
elevada solubilidad acuosa, una baja toxicidad y una cavidad más
hidrófoba que la de la \beta-CD.
En una realización particular, la ciclodextrina
presente en las nanopartículas de la invención no tiene ningún
grupo hidroxilo sustituido. En una realización concreta, dicha
ciclodextrina es la beta-ciclodextrina
(\beta-CD), que contiene 7 unidades de
\alpha-1,4-glucopiranosa. Aunque
la relación, en peso, \beta-CD:polímero
biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de
1:1-5, relaciones 1:4 dan buenos resultados. A modo
ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de
\beta-CD/mg polímero biodegradable da una
asociación eficiente. En este caso, la cantidad de
\beta-CD asociada a las nanopartículas es de
aproximadamente 90 microgramos/mg nanopartícula. Estas
nanopartículas se caracterizan por tener, en general, forma
esférica y un tamaño cercano a los 150 nm.
En otra realización particular, la ciclodextrina
presente en las nanopartículas de la invención es un derivado más
hidrófilo de la \beta-CD, tal como un derivado
hidroxilado de la \beta-CD que comprende uno o
más grupos hidroxialquilo (e.g., hidroxipropilo). En una
realización particular preferida se utiliza la
2-hidroxiprolil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD). La relación, en
peso, OH-\beta-CD:polímero
biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de
1:1-5, aunque una relación 1:4 rinde buenos
resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de
OH-\beta-CD/mg polímero
biodegradable da una asociación eficiente. En este caso, la
cantidad de \beta-CD asociada a las nanopartículas
es de aproximadamente 65 microgramos/mg nanopartícula. Estas
nanopartículas se caracterizan por tener, en general, forma
esférica y un tamaño cercano a los 150 nm.
En otra realización particular, la ciclodextrina
presente en las nanopartículas de la invención es un derivado de
una CD que presenta uno o más grupos funcionales terminales
diferentes al hidroxilo, e.g., uno o más grupos amino, opcionalmente
sustituidos. Los grupos amino, a su vez pueden estar sustituidos y
presentar otros grupos funcionales, e.g., alquilo
C_{1}-C_{4}; ejemplos ilustrativos de dichos
grupos amino sustituidos incluyen metilamina, etilamina,
dietilamina, etc.). En una realización particular preferida, dicho
grupo amino es un grupo amino libre, sin sustituir (-NH_{2}). En
diversos ensayos realizados, se ha observado que con dichos grupos,
las nanopartículas de la invención administradas por vía oral se
acumulan sobre ciertos segmentos del tracto intestinal, lo que
permite una administración específica. En una realización concreta,
el derivado de ciclodextrina presente en las nanopartículas de la
invención es la
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
(NH-\beta-CD). La relación, en
peso, NH-\beta-CD:polímero
biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de
1:1-5, aunque una relación 1:4 rinde buenos
resultados. Estas nanopartículas se caracterizan por tener, en
general, forma esférica y un tamaño cercano a los 150 nm.
En una realización particular, la ciclodextrina,
o derivado de la misma, presente en las nanopartículas de la
invención se selecciona del grupo formado por
\beta-ciclodextrina (\beta-CD),
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD),
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
(NH-\beta-CD) y sus mezclas.
Diversos ensayos realizados por los inventores
han puesto de manifiesto que las nanopartículas a base de un
polímero biodegradable que contienen ciclodextrina permiten la
formación de interacciones bioadhesivas directas entre estos
vehículos (nanopartículas) y componentes de la superficie del
tracto gastrointestinal. Este estrecho contacto es de interés para
aumentar la biodisponibilidad de moléculas biológicamente activas
cuando se administran a través de alguna vía que dé acceso a una
mucosa (e.g., vía oral, rectal, vaginal, ocular o nasal).
Las nanopartículas a base de un polímero
biodegradable (e.g., PVM/MA) que contienen ciclodextrina
(nanopartículas vacías, es decir, sin molécula biológicamente
activa) pueden ser obtenidas por un procedimiento basado en el
método de desplazamiento del disolvente descrito, por ejemplo, en
la solicitud de patente internacional WO 02/069938. A modo
ilustrativo, dichas nanopartículas vacías que comprenden un
polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y una ciclodextrina, o un
derivado de la misma, pueden obtenerse por dos procedimientos
alternativos, concretamente, mediante incubación simultánea de los
dos componentes, polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y
ciclodextrina o derivado de la misma (e.g.,
\beta-CD,
OH-\beta-CD o
NH-\beta-CD) en la fase orgánica
[alternativa 1], o bien mediante incubación de las nanopartículas
de polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) con una solución acuosa de
ciclodextrina, o un derivado de la misma (e.g.,
\beta-CD,
OH-\beta-CD o
NH-\beta-CD) [alternativa 2].
\vskip1.000000\baselineskip
Las nanopartículas de la invención comprenden,
además del polímero biodegradable y de una ciclodextrina o un
derivado de la misma, una molécula biológicamente activa.
El término "molécula biológicamente
activa", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier
sustancia que se administra a un sujeto, preferentemente un ser
humano, con fines profilácticos o terapéuticos; es decir, cualquier
sustancia que puede ser utilizada en el tratamiento, cura,
prevención o diagnosis de una enfermedad o para mejorar el
bienestar físico y mental de humanos y animales. En general, dicho
término "molécula biológicamente activa" incluye tanto
fármacos como antígenos y alergenos.
Las nanopartículas de la invención pueden
incorporar una o más moléculas biológicamente activas
independientemente de las características de solubilidad de las
mismas, aunque, dichas nanopartículas han resultado ser un sistema
particularmente útil para la administración de moléculas
biológicamente activas de naturaleza hidrófoba.
Las nanopartículas de la invención permiten
modificar la distribución de la molécula biológicamente activa que
contienen al ser administradas por una vía que dé acceso a alguna
mucosa del organismo (e.g., oral, rectal, nasal, vaginal, ocular,
etc.).
La naturaleza química de la molécula
biológicamente activa puede variar dentro de un amplio intervalo,
desde moléculas pequeñas hasta compuestos macromoleculares
(péptidos, polinucleótidos, etc.).
En una realización particular, dicha molécula
biológicamente activa es un péptido o una proteína. Tal como aquí
se utiliza, el término "péptido" se refiere a un compuesto
formado por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos e incluye
oligopéptidos (formados por 10 o menos aminoácidos) y polipéptidos
(formados por más de 10 aminoácidos). Asimismo, el término
"proteína" tal como aquí se utiliza se refiere a
macromoléculas de masa molecular elevada formadas por cadenas
lineales de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos; las
proteínas pueden estar formadas por una o varias cadenas
peptídicas.
En otra realización particular, dicha molécula
biológicamente activa es un nucleósido, un nucleótido, un
oligonucleótido, un polinucleótido o un ácido nucleico. Tal como
aquí se utiliza, un "oligonucleótido" es un polímero de
nucleótidos unidos por enlaces 5'-3' fosfodiéster de
longitud igual o inferior a 50 nucleótidos, mientras que un
"polinucleótido" es un polímero de nucleótidos unidos por
enlaces 5'-3' fosfodiéster de longitud superior a
50 unidades. Asimismo, el término "ácido nucleico" se refiere
también a un polímero de nucleótidos unidos por enlaces
5'-3' fosfodiéster; dependiendo de si se trata de
ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos el ácido nucleico será ARN
o ADN, respectivamente. Los ácidos nucleicos desempeñan distintas
funciones en las células de los organismos vivos tales como el
almacenamiento de la información genética y su transferencia a la
generación siguiente (ADN) o la expresión de esa información
durante la síntesis de proteínas (ARNm y ARNt), es componente
estructural de orgánulos celulares, tales como los ribosomas (ARNr),
cataliza ciertas reacciones químicas (ribozimas) y participa en
mecanismos de regulación de la expresión génica (mediante ARN
complementarios de ARNm o de ARNbc en la ribointerferencia).
En otra realización particular, dicha molécula
biológicamente activa es una molécula (orgánica o inorgánica)
pequeña; generalmente, estas moléculas se obtienen por métodos de
síntesis química o semisintéticos o, alternativamente, se aíslan de
sus fuentes. En una realización concreta, dicha molécula (orgánica
o inorgánica) pequeña, tiene un peso molecular relativamente bajo,
generalmente, igual o inferior a 5.000, típicamente, igual o
inferior a 2.500, ventajosamente, igual o inferior a 1.500.
Numerosos principios activos terapéuticos contienen estas
características y, por tanto, pueden ser utilizados en la puesta en
práctica de la presente invención.
Aunque la molécula biológicamente activa
presente en las nanopartículas de la invención puede ser tanto una
sustancia hidrófila como una sustancia hidrófoba, en una
realización particular, las nanopartículas de la invención son
particularmente útiles para administrar moléculas biológicamente
activas de naturaleza hidrófoba. Por tanto, en una realización
particular, la molécula biológicamente activa presente en las
nanopartículas de la invención es una sustancia hidrófoba. Tal como
aquí se utiliza, una "sustancia hidrófoba" es una sustancia
que, por sus propiedades o composición, es poco soluble en medios
acuosos, teniendo típicamente una solubilidad inferior al 1% (1
gramo de principio activo en 100 ml de disolvente acuoso) a 20ºC,
en un pH comprendido entre 1-7,5 y presión
atmosférica.
Prácticamente cualquier molécula biológicamente
activa de naturaleza hidrófoba puede ser utilizada en la puesta en
práctica de la presente invención. Ejemplos ilustrativos, no
limitativos, de moléculas biológicamente activas de naturaleza
hidrófoba que pueden estar presentes en las nanopartículas de la
invención incluyen agentes antiparasitarios (e.g., albendazol,
mebendazol, praziquantel, etc.); antifúngicos (e.g., clotrimazol,
itraconazol, etc.), antibióticos (e.g., sulfametiazol, gentamicina,
griseofulvina, etc.), cardiotónicos (e.g., digoxina, etc.), agentes
antitumorales (e.g., camptotecina, metotrexato, docetaxel,
fluorouracilo, paclitaxel, etc.), inmunosupresores (e.g.,
tacrolimus, ciclosporina), (gluco)corticoides (e.g.,
cortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, triamcinolona,
etc.), etc.
En otra realización particular, la molécula
biológicamente activa presente en las nanopartículas de la
invención es una sustancia que es sustrato de la
glicoproteína-P. De hecho, una importante
aplicación de las nanopartículas de la invención radica en su
capacidad para minimizar el efecto negativo de la
glicoproteína-P sobre la absorción a través de
mucosas de un determinado fármaco.
Como es conocido, la
glicoproteína-P (PGY1; enzima EC 3.6.3.44) es una
proteína que, en los seres humanos, está codificada por el gen
ABCB1, también denominado gen MDRI (multidrug
resistance 1). La glicoproteína-P funciona como
una bomba o transportador transmembrana que transfiere sus
sustratos (generalmente fármacos y otros xenobióticos) desde su
dominio intracelular a su dominio extracelular. Dependiendo de su
localización anatómica, la glicoproteína-P realiza
su función de 3 formas principales: (1) la
glicoproteína-P limita la entrada del fármaco en el
organismo después de su administración oral como resultado de su
expresión en la membrana luminar de los enterocitos; (2) una vez
que el fármaco ha alcanzado la circulación sanguínea, la
glicoproteína-P promueve su eliminación en la bilis
y en la orina, como consecuencia de su expresión en la membrana
canalicular de los hepatocitos y en la membrana luminar de las
células de los túbulos proximales de los riñones; y (3) ya en la
circulación sanguínea sistémica, limita la penetración del fármaco
en los tejidos sensibles.
Por tanto, una sustancia sustrato de la
glicoproteína-P se refiere a una sustancia, e.g.,
un xenobiótico, con afinidad para unirse al dominio intracelular de
la glicoproteína-P de manera que mediante consumo
de ATP puede ser transportada al exterior de la célula según la
siguiente reacción:
ATP + H_{2}O
+ xenobiótico(dentro) = ADP + fosfato +
xenobiótico(fuera)
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
sustratos conocidos de la glicoproteína-P que
pueden estar presentes en las nanopartículas de la invención como
moléculas biológicamente activas incluyen, entre otros (Fromm MF;
Trends 2004; 25: 423-429), agentes
anti-tumorales (e.g., docetaxel, etoposido,
imatinib, paclitaxel, teniposido, vinblastina, vincristina,
antraciclinas (e.g., doxorubicina, daunorubicina, epirubicina,
etc.), etc.); antagonistas de \beta-adrenoceptor
(e.g., bunitrolol, carvedilol, celiprolol, talinolol, etc.);
bloqueantes de canales de Ca^{2+} (e.g., diltiazem, mibefradil,
verapamil, etc.); fármacos cardiotónicos (e.g., digitoxina,
digoxina, quinidina, etc.), agentes antivirales (e.g., amprenavir,
indinavir, nelfinavir, saquinavir, ritonavir, etc.); esteroides
(e.g., dexametasona, metilprednisolona, etc.); inmunosupresores
(e.g., ciclosporina A, sirolimus, tacrolimus, etc.); fármacos
antiheméticos (domperidona, ondansetron, etc.); antibióticos (e.g.,
eritromicina, levofloxacino, etc.); agentes antilipidémicos (e.g.,
atorvastatina, lovastatina, etc.); antagonistas de receptores
H_{1} de la histamina (e.g., fexofenadina, terfenadina, etc.); y
fármacos de otros grupos terapéuticos (e.g., amitriptilina,
colchicina, debrisoquina, itraconazol, losartan, morfina, fenitoina,
rifampina, actinomicina D, topotecan, estradiol, rapamicina, FK506,
etc).
En una realización particular, la molécula
biológicamente activa presente en las nanopartículas de la
invención es paclitaxel.
En una realización particular, la composición
farmacéutica de la invención comprende nanopartículas de la
invención que contienen uno o más fármacos diferentes. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de dichos fármacos incluyen agentes
pertenecientes a distintos grupos terapéuticos, por ejemplo, agentes
anti-tumorales, antagonistas de
\beta-adrenoceptor, agentes analgésicos,
bloqueantes de canales de Ca^{2+}, fármacos cardiotónicos,
agentes antivirales, esteroides, inmunosupresores, fármacos
antiheméticos, antibióticos (e.g., antibacterianos, antifúngicos,
antivirales, antiparasitarios, etc.) agentes antilipidémicos,
antagonistas de receptores H_{1} de la histamina, agentes
antiinflamatorios, neuroprotectores, antialérgicos, antiasmáticos,
antibióticos, surfactantes pulmonares, etc.
Como puede apreciarse, algunas moléculas
biológicamente activas que son sustrato de la
glicoproteína-P tienen naturaleza hidrófoba.
Asimismo, el sistema de administración de moléculas biológicamente
activas proporcionado por la presente invención contempla la
posibilidad de administrar fármacos de numerosos grupos
terapéuticos.
En otra realización particular, la composición
farmacéutica de la invención comprende nanopartículas de la
invención que contienen uno o más antígenos diferentes con fines
vacunales o bien uno o más alergenos diferentes con fines
inmuno-terapéuticos como molécula biológicamente
activa.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "antígeno" se refiere a cualquier sustancia capaz de
ser reconocida por el sistema inmune de un sujeto y/o capaz de
inducir en un sujeto una respuesta inmune humoral o una respuesta
inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T
cuando se introduce en un sujeto; a modo ilustrativo, dicho término
incluye cualquier producto inmunogénico, nativo o recombinante,
obtenido de un organismo superior o de un microorganismo, por
ejemplo, una bacteria, un virus, un parásito, un protozoo, un hongo,
etc., que contiene uno o más determinantes antigénicos, por
ejemplo, componentes estructurales de dichos organismos; toxinas,
por ejemplo, exotoxinas, etc. Prácticamente cualquier antígeno
puede ser utilizado en la elaboración de nanopartículas de la
invención cargadas con antígeno. A modo ilustrativo, no limitativo,
el término "antígeno" incluye:
- -
- antígenos "microbianos", es decir, antígenos de microorganismos, incluyendo, aunque sin limitarse, virus, bacterias, hongos y parásitos infecciosos; dichos antígenos incluyen el microorganismo intacto así como partes, fragmentos y derivados de los mismos, bien de origen natural o artificial, así como productos sintéticos o recombinantes que son idénticos o similares a los antígenos naturales de un microorganismo e inducen una respuesta inmune específica para ese microorganismo; en este sentido, un compuesto es similar a un antígeno natural de un microorganismo si induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) como la del antígeno natural de ese microorganismo; dichos antígenos se utilizan de forma rutinaria por los expertos en la materia; y
- -
- antígenos "tumorales", es decir, sustancias, por ejemplo, péptidos, asociadas a un tumor o a un cáncer ("marcador tumoral"), que es capaz de provocar una respuesta immune, en particular, cuando es presentado en el contexto de una molécula del CMH, e.g., Her2 (cáncer de mama); GD2 (neuroblastoma); EGF-R (glioblastoma maligno); CEA (cáncer de tiroide medular); CD52 (leucemia); proteína gp100 de melanoma humano; proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano; tirosinasa; proteína NA17-A nt; proteína MAGE-3; proteína p53; proteína HPV16E7; fragmentos antigénicos de dichos antígenos; etc.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "alergeno" se refiere a una sustancia a la que un
sujeto es sensible y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo,
extractos alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos,
extractos alergénicos de alimentos o productos alimenticios,
componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que
inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes
presentes en plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un
sujeto, etc., por ejemplo, extractos proteicos de pólenes, tal como
el polen de gramíneas, extractos alergénicos de Lolium
perenne, extractos alergénicos de olea (olivo), etc.; extractos
proteicos de insectos, tal como de ácaros del polvo, etc.; extractos
alergénicos de componentes alimentarios, etc. Prácticamente
cualquier alergeno puede ser utilizado en la elaboración de las
nanopartículas cargadas con alergeno de la composición de la
invención; no obstante, en una realización particular, dicho
alergeno es la ovoalbúmina (OVA), una proteína ampliamente
utilizada como modelo alergénico experimental.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas
moléculas biológicamente activas que pueden contener las
nanopartículas de la invención incluyen antígenos bacterianos:
citoplasmáticos, periplásmicos, de la envoltura celular (e.g.,
proteínas de membrana interna, proteínas de membrana externa,
lipopolisacáridos y complejos mixtos, proteínas asociadas a la
pared celular, etc.), etc.; antígenos de estructuras superficiales
(e.g., fimbriae, glicocálix, flagelares, etc.), incluyendo los de
patógenos intracelulares, como por ejemplo Brucella sp.,
Salmonella sp., etc; antígenos de microorganismos
eucariotas, tanto solubles como superficiales; antígenos virales,
por ejemplo, matriciales, de cápsides, de envol-
turas, internos (incluidos enzimáticos), alergenos de especies animales (ácaros, etc.), de plantas (gramíneas, etc.), etc.
turas, internos (incluidos enzimáticos), alergenos de especies animales (ácaros, etc.), de plantas (gramíneas, etc.), etc.
Las nanopartículas de la invención pueden
obtenerse mediante un procedimiento, basado en el método de
desplazamiento del disolvente descrito, por ejemplo, en la
solicitud de patente internacional WO 02/069938, que comprende (i)
la formación de un complejo (ciclodextrina o derivado de la
misma)-(molécula biológicamente activa), en adelante complejo
[CD:MBA], y (ii) la incorporación de dicho complejo [CD:MBA] a una
solución del polímero biodegradable en un disolvente orgánico antes
de la formación de nanopartículas.
Brevemente, la formación de dicho complejo
[CD:MBA] comprende la adición de una solución de la molécula
biológicamente activa (MBA) en un disolvente orgánico, tal como un
alcohol, por ejemplo, etanol, sobre una solución acuosa de la
ciclodextrina o derivado de la misma (CD). El conjunto se somete a
agitación hasta alcanzar el equilibrio. Posteriormente, se eliminan
el agua y el disolvente orgánico (e.g., etanol) por cualquier
método convencional apropiado, por ejemplo, bajo evaporación
reducida o cualquier otro sistema de eliminación de
disolventes.
La relación molar CD:MBA presente en dicho
complejo [CD:MBA] puede variar dentro de un amplio intervalo
dependiendo, entre otros factores de la ciclodextrina o derivado de
la misma (CD) y de la molécula biológicamente activa (MBA)
presentes en dicho complejo; no obstante, en una realización
particular, la relación molar CD:MBA presente en dicho complejo
[CD:MBA] es 1:1-4, típicamente
1:1-2. En una realización concreta, cuando la
molécula biológicamente activa es paclitaxel, la relación molar
CD:MBA en dicho complejo [CD:MBA] es 1:1.
La incorporación de dicho complejo [CD:MBA] a
una solución del polímero biodegradable en un disolvente orgánico
antes de la formación de nanopartículas puede llevarse a cabo
mediante adición de dicho complejo a la solución de polímero
biodegradable y posterior incubación simultánea de ambos
componentes, polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y complejo
[CD:MBA], en la fase orgánica (e.g., acetona) que comprende el
polímero biodegradable (e.g., PVM/MA), durante un periodo de tiempo
apropiado, típicamente comprendido entre 10 y 60 minutos, a una
temperatura comprendida entre 20ºC y 30ºC aproximadamente (en una
realización particular, cuando la molécula biológicamente activa es
paclitaxel, la incubación se puede realizar durante un periodo de
tiempo de 30 minutos a temperatura ambiente (25ºC)), bajo
agitación, por ejemplo, mediante el empleo de un agitador mecánico,
magnético o ultrasonidos); operando de esta manera, se obtiene, en
general, un alto grado de asociación del complejo[CD:MBA] al
polímero biodegradable. Brevemente, esta etapa comprende la
disolución y/o dispersión simultánea del polímero biodegradable y
el complejo [CD:MBA] en un disolvente orgánico (e.g., acetona). La
incubación de la mezcla se realiza bajo agitación a temperatura
ambiente durante un determinado periodo de tiempo. Preferentemente,
la concentración del polímero biodegradable está comprendida entre
0,001% y 10% p/v y la del complejo [CD:MBA] entre 0,001% y 5% p/v.
Opcionalmente, sobre dicha solución, si se desea, se adiciona un
volumen determinado de un disolvente polar miscible con la
disolución de los polímeros (e.g., etanol). También, opcionalmente,
si se desea, se puede utilizar un agente reticulante para mejorar
la estabilidad de las nanopartículas, tal como se describe en WO
02/069938. Ejemplos ilustrativos de agentes reticulantes que pueden
utilizarse incluyen las moléculas diaminadas (e.g.,
1,3-diaminopropano, etc.), polisacáridos o
sacáridos simples, proteínas, y, en general, cualquier molécula que
presente grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos
presentes en el polímero biodegradable, por ejemplo, con los grupos
anhídrido presentes en PVM/MA. No obstante, en general, no resulta
necesario reticular pues esto tiene lugar de forma simultánea
debido a la presencia de la ciclodextrina o derivado de la misma. En
caso de que se deseara reticular, se debería añadir una cantidad
pequeña de cualquiera de los productos indicados.
A continuación, para formar las nanopartículas
de la invención, sobre la mezcla anterior se añade un volumen
similar de un segundo líquido no disolvente, preferentemente una
solución hidroalcohólica. En una realización particular, se utiliza
agua de calidad farmacéutica (agua purificada o agua para
inyectables (p.i.), según la aplicación). Preferentemente, la
relación fase orgánica:solución hidroalcohólica está incluida
dentro del intervalo comprendido entre 1:1 y 1:10 en volumen. Las
nanopartículas se forman instantáneamente en el medio, bajo
apariencia de una suspensión lechosa. Los disolventes orgánicos
pueden ser eliminados por cualquier procedimiento adecuado tal como
evaporación a presión reducida, quedando las nanopartículas en una
suspensión acuosa estable. Eventualmente, si se desea, las
nanopartículas se pueden purificar por medios convencionales tales
como centrifugación, ultracentrifugación, filtración tangencial, o
evaporación, incluyendo la utilización de vacío. Finalmente, si se
desea, las nanopartículas se pueden liofilizar para su almacenaje y
conservación a largo término. Para facilitar la liofilización se
pueden utilizar agentes crioprotectores habituales tales como
sacarosa, lactosa o manitol, preferentemente en una concentración
comprendida entre el 0,1 y el 10% en peso.
Alternativamente, las nanopartículas de la
invención, a base de un polímero biodegradable pueden ser obtenidas
mediante un procedimiento que comprende la incubación de las
nanopartículas de polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) con una
solución acuosa que comprende el complejo [CD:MBA]. Esta alternativa
comprende, brevemente, la disolución del polímero biodegradable en
un disolvente orgánico, tal como acetona. Posteriormente, sobre esa
solución, se adiciona un volumen determinado de solución
hidroalcohólica, tal como etanol, y, finalmente, un volumen similar
de agua. Las nanopartículas se forman instantáneamente en el medio
bajo la apariencia de una suspensión lechosa. Los disolventes
orgánicos son eliminados de forma similar a como se ha descrito en
el procedimiento anterior, por ejemplo, por evaporación a presión
reducida, quedando las nanopartículas en una suspensión acuosa
estable. Seguidamente, las nanopartículas de polímero biodegradable
se incuban en una solución acuosa que comprende el complejo
[CD:MBA] previamente obtenido. La incubación de las nanopartículas
de polímero biodegradable con el complejo [CD:MBA] puede realizarse
bajo agitación (e.g., mediante el empleo de un agitador mecánico,
magnético o ultrasonidos) durante un periodo determinado de tiempo
a una temperatura apropiada en condiciones similares a las
mencionadas en relación con el procedimiento anterior (e.g.,
durante un periodo de tiempo comprendido, en general, entre 10 y 60
minutos, a una temperatura comprendida entre 20ºC y 30ºC).
Posteriormente, las nanopartículas se purifican por métodos
convencionales, por ejemplo, centrifugación, y, finalmente, se
liofilizan, si se desea, siguiendo los mismos procedimientos
descritos anteriormente.
La relación ponderal MBA:polímero biodegradable
presente en las nanopartículas de la invención puede variar dentro
de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores del
polímero biodegradable (e.g., PVMIMA) y de la molécula
biológicamente activa (MBA) presentes en dichas nanopartículas; no
obstante, en una realización particular, la relación MBA:polímero
biodegradable, en peso, presente en dichas nanopartículas de la
invención es 1:4-20, preferentemente, 1:10.
La relación complejo
[CD-MBA]:polímero biodegradable presente en las
nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio
intervalo dependiendo, entre otros factores del polímero
biodegradable (e.g., PVMIMA), de la ciclodextrina o derivado de la
misma y de la molécula biológicamente activa (MBA) presentes en
dichas nanopartículas; no obstante, en una realización particular,
la relación complejo [CD-MBA]:polímero
biodegradable, en peso, presente en dichas nanopartículas de la
invención es 1:1-20, ventajosamente
1:2-20, preferentemente, 3:10 (aproximadamente
1:3,3), en peso.
En una realización particular, el polímero
biodegradable es PVMIMA.
En otra realización particular, la molécula
biológicamente activa es paclitaxel.
En otra realización particular, el derivado de
ciclodextrina es \beta-ciclodextrina
(\beta-CD),
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD) ó
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
(NH-\beta-CD).
En otra realización particular, la molécula
biológicamente activa es paclitaxel y la relación molar
(ciclodextrina o derivado de la misma):paclitaxel es 1:1.
En una realización concreta, el complejo
[CD:MBA] es un complejo \beta-CD:paclitaxel, en
una relación molar 1:1, y la relación en peso paclitaxel:polímero
biodegradable (e.g., PVM/MA) es de 1:4-20, aunque
relaciones próximas a 1:10 dan buenos resultados. A modo
ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo
\beta-CD:paclitaxel, en una relación molar 1:1,
por mg de polímero da una asociación eficiente. En este caso la
cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es de,
aproximadamente, 40 microgramos de paclitaxel/mg nanoparticula.
Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma esférica y un
tamaño cercano a los 300 nm.
En otra realización concreta, el complejo
[CD:MBA] es un complejo
OH-\beta-CD, en una relación
molar 1:1 y la relación en peso paclitaxel:polímero biodegradable
(e.g., PVM/MA) es de 1:4-20, aunque relaciones
próximas a 1:10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo,
aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo
OH-\beta-CD:paclitaxel, en una
relación molar 1:1, por mg de polímero da una asociación eficiente.
En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es
de, aproximadamente, 170 microgramos de paclitaxel/mg
nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma
esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En otra realización concreta, el complejo
[CD:MBA] es un complejo
NH-\beta-CD, en una relación
molar 1:1 y la relación en peso paclitaxel:polímero biodegradable
(e.g., PVM/MA) es de 1:4-20, aunque relaciones
próximas a 1:10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo,
aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo
OH-\beta-CD:paclitaxel, en una
relación molar 1:1, por mg de polímero da una asociación eficiente.
En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es
de, aproximadamente, 100 microgramos de paclitaxel/mg
nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma
esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En una realización particular, al administrar
por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en
nanopartículas de la invención con \beta-CD, se
obtienen niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante, al
menos, 24 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima
(Cmax) en un tiempo de aproximadamente 5 horas. La concentración
plasmática máxima (Cmax) es similar a la obtenida tras la
administración de la formulación comercial por vía intravenosa. El
área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta
formulación es de, aproximadamente, 5 veces superior a la obtenida
por administración intravenosa del medicamento comercial
administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por
ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo
(MRT) de aproximadamente 4 veces superior al que se obtiene tras la
administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
En otra realización particular, al administrar
por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en
nanopartículas de la invención con
OH-\beta-CD, se obtienen niveles
plasmáticos constantes y sostenidos durante, al menos, 24 horas,
tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un
tiempo de aproximadamente 6 horas. La concentración plasmática
máxima es 2 veces superior a la obtenida tras administración de la
formulación comercial por vía intravenosa. El área bajo la curva
plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es de,
aproximadamente, 5 veces superior a la obtenida por administración
intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma
dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio
de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente
3,5 veces superior al que se obtiene tras la administración de la
formulación comercial por vía intravenosa.
\newpage
En otra realización particular, al administrar
por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en
nanopartículas de la invención con
NH-\beta-CD, se obtienen niveles
plasmáticos constantes y sostenidos durante, al menos, 24 horas,
tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un
tiempo de aproximadamente 4,7 horas. La concentración plasmática
máxima es de aproximadamente la mitad de la obtenida tras
administración de la formulación comercial por vía intravenosa. El
área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta
formulación es, aproximadamente, similar a la obtenida por
administración intravenosa del medicamento comercial administrado a
la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un
tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de
aproximadamente 3 veces superior al que se obtiene tras la
administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende, al menos, una
nanopartícula de la invención, y un excipiente, vehículo o
adyuvante, farmacéuticamente aceptable.
En general, dicha molécula biológicamente activa
estará formando un complejo con la ciclodextrina o derivado de la
misma y dicho complejo, mayoritariamente, estará en el interior de
la nanopartícula de la invención; no obstante, podría suceder que
una proporción relativamente de dicho complejo que contiene la
molécula biológicamente activa estuviera también unida a la
superficie de la nanopartícula si bien la mayor parte del mismo
estará en el interior (e.g., encapsuladas) de las nanopartículas de
la invención.
Las nanopartículas de la invención pueden
utilizarse para modificar la distribución de la molécula
biológicamente activa asociada al ser administradas por una vía que
dé acceso a alguna mucosa del organismo (incluyendo la vía oral,
rectal, nasal, vaginal u ocular). Adicionalmente, también pueden
administrarse por vía parenteral.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen
cualquier composición líquida (suspensión o dispersión de las
nanopartículas) para administración oral, bucal, sublingual,
tópica, ocular, nasal, vaginal, parenteral, subcutánea, rectal o
transdérmica; cualquier composición en forma de gel, pomada, crema
o bálsamo para su administración tópica, ocular, nasal o vaginal; o
cualquier composición sólida (comprimidos, cápsulas) para su
administración oral. En una realización particular, la composición
farmacéutica se administra por vía oral. En otra realización
particular, dicha composición farmacéutica se administra por vía
parenteral.
Las composiciones farmacéuticas descritas
comprenderán los excipientes adecuados para cada formulación. Por
ejemplo, en el caso de formulaciones orales en forma de comprimidos
o cápsulas se incluirán si es necesario agentes aglutinantes,
desintegrantes, lubricantes, agentes de carga, recubrimiento
entérico, etc. Las formulaciones sólidas orales se preparan de
forma convencional por mezclado, granulación en seco o húmedo e
incorporando las nanopartículas de la invención. Las composiciones
farmacéuticas también pueden ser adaptadas para su administración
parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o
productos liofilizados, estériles, en la forma de dosificación
apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas
incluirán los excipientes adecuados, tales como tampones,
tensioactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegirán
en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada.
Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de
administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en
el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo,
10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
En una realización particular de la composición
farmacéutica de la invención, la nanopartícula comprende:
En otra realización particular de la composición
farmacéutica de la invención, la nanopartícula comprende:
\newpage
En otra realización todavía más particular de la
composición farmacéutica de la invención, la nanopartícula
comprende:
La proporción de la molécula biológicamente
activa incorporada en la nanopartícula de la invención puede variar
dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, puede ser de hasta un
25% en peso respecto al peso total de las nanopartículas. No
obstante, la proporción adecuada dependerá en cada caso de la
moléculas biológicamente activa incorporada.
La dosis a administrar de nanopartículas de la
invención puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo,
entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg por kg de peso
corporal, preferentemente, entre 0,1 y 2 mg por kg de peso
corporal.
La invención se describe a continuación mediante
unos ejemplos que no son limitativos de la invención, sino
ilustrativos.
Los siguientes ejemplos describen la producción
y caracterización de nanopartículas a base de un polímero
biodegradable (PVM/MA) que incorporan una ciclodextrina (Ejemplos
1-5) y de nanopartículas a base de un polímero
biodegradable (PVM/MA) que incorporan una ciclodextrina y una
molécula biológicamente activa (Ejemplos 6 y 7) que se encuentra
asociada a la ciclodextrina y/o al polímero biodegradable (PVM/MA)
que constituye la matriz de dichas nanopartículas. Dichos ejemplos
ponen de manifiesto la capacidad de dichas nanopartículas de
desarrollar interacciones bioadhesivas con la mucosa y de promover
la absorción oral de una molécula biológicamente activa, tal como
el paclitaxel. Como puede apreciarse en dichos ejemplos, cuando se
utiliza paclitaxel como molécula biológicamente activa, su
incorporación en dichas nanopartículas a base de PVM/MA que
incorporan una ciclodextrina, en particular,
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina,
permite obtener niveles plasmáticos constantes y sostenidos de
dicho fármaco durante, al menos, 24 horas.
A continuación se describen los métodos
generales utilizados para la producción y caracterización de dichas
nanopartículas.
El procedimiento para la producción de
nanopartículas a base de un polímero biodegradable (PVM/MA) que
incorporan una ciclodextrina, y, opcionalmente, una molécula
biológicamente activa, es una modificación de un procedimiento
general descrito anteriormente y basado en la desolvatación
controlada del polímero [Arbos et al., J. Control. Release,
83 (2002) 321-330]. Para ello, un copolímero de
metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) y una cantidad
determinada de ciclodextrina, o, alternativamente, de un complejo
ciclodextrina:molécula biológicamente activa, obtenido por métodos
convencionales (e.g., Hamada et al., J Biosci Bioeng
102(4):369-71, 2006), en acetona bajo
agitación magnética. Tras la incubación, sobre esta fase y bajo
agitación magnética, se adicionan un disolvente orgánico miscible
(etanol) y un volumen similar de agua desionizada, dando lugar a la
formación de las nanopartículas bajo apariencia de una suspensión
lechosa. A continuación, se retiran los disolventes orgánicos
(etanol y acetona) mediante evaporación bajo presión reducida,
quedando las partículas en una suspensión acuosa estable.
Opcionalmente, las nanopartículas formadas pueden ser recubiertas
con una molécula biológicamente activa hidrosoluble o con un
ligando capaz de conferir a la nanopartícula resultante propiedades
de "targeting" específico. Tras dejar homogeneizar la
suspensión de nanopartículas, ésta se evapora bajo presión
reducida, por ejemplo, mediante el empleo de un rotavapor, tal como
un rotavapor Büchi R-144 (Suiza) hasta eliminar
ambos disolventes orgánicos. Posteriormente, la suspensión se
somete a purificación por ultracentrifugación (Sigma 3k30, rotor
Nº-12150, Alemania) o mediante filtración tangencial, y,
eventualmente, las nanopartículas pueden congelarse a -80ºC para su
posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis
Genesis, Nueva York, EEUU).
La caracterización de las nanopartículas ha
conllevado diversos estudios, que se describen a continuación.
Entre los estudios físico-químicos se determinó el
tamaño de partícula y la carga superficial de las nanopartículas,
ésta última mediante la medida del potencial zeta. Ambos parámetros
fueron obtenidos por espectroscopia de correlación fotónica,
utilizando un Zetasizer nano Z-S (Malvern
Instruments/Optilas, España).
El rendimiento del proceso se calculó por dos
métodos. En el primero se calculó el rendimiento de forma
gravimétrica, utilizando el peso de las muestras liofilizadas sin
agente crioprotector, según la Ecuación 1:
[Ecuación
1]Rendimiento = (Peso del liofilizado/Peso inicial) x
100
donde
peso inicial es el peso del polímero
biodegradable (e.g., PVM/MA) y de la ciclodextrina añadida a las
formulaciones; y
peso del liofilizado es el peso de las
formulaciones tras el proceso de liofilización.
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo método se basó en la cuantificación
mediante cromatografia líquida de alta resolución (HPLC) acoplado a
un detector de tipo ELSD (evaporative light - scatteripg detection)
(Agueros et al., J. Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005)
495-502) mediante el método descrito abajo que
permite la cuantificación de las ciclodextrinas y del copolímero
PVM/MA. El rendimiento, en este caso, se calculó según la Ecuación
2:
[Ecuación
2]Rendimiento = (Q_{inicial} - Q_{PVM/MA}) x
100
donde
Q_{inicial} es la cantidad inicial de PVM/MA
añadida; y
Q_{PVM/MA} es la cantidad de PVM/MA
determinada en los sobrenadantes.
\vskip1.000000\baselineskip
La morfología de las nanopartículas se observó
por microscopia electrónica de barrido (Zeiss, DSM 940A Alemania).
Para ello, las nanopartículas liofilizadas se cubrieron con una
capa de oro molecular de unos 9 nm (Equipo Emitech K550,
Sputter-Coater, Reino Unido) y las fotografias se
realizaron con un microscopio Zeiss DMS 940 A (Estados Unidos).
Para confirmar la presencia de ciclodextrinas
asociadas a las nanopartículas (método de cuantificación descrito
abajo) se procedió al análisis elemental de las diferentes
formulaciones de nanopartículas, utilizando un analizador elemental
modelo LECO CHN-900 (LECO Corporation, Estados
Unidos).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la cantidad de ciclodextrina
no aminada [e.g., \beta-ciclodextrina
(\beta-CD) y
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD)] asociada a las
nanopartículas se utilizó un método de HPLC acoplado a un detector
tipo ELSD. El análisis se realizó en un cromatógrafo modelo 1100
series LC (Agilent, Waldbornn, Alemania) y los datos se analizaron
en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa
Chem-Station G2171 (Agueros et al., J.
Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502).
Para el análisis de las muestras, los
sobrenadantes obtenidos tras el proceso de purificación de las
nanopartículas, se diluyeron hasta 10 ml con agua purificada. Tras
la adición del patrón interno (PEG 6000), se tomaron, como muestra,
alícuotas de 1 ml de sobrenadante. Las muestras se analizaron
utilizando una columna Zorbax Eclipse XDB-Phenyl
(Agilent 150 mm x 2,1 mm) y una mezcla de agua/acetonitrilo en
gradiente (ver tabla 1) como fase móvil a flujo 0,25 ml/min.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las condiciones del detector (ELSD) se
optimizaron hasta conseguir la máxima sensibilidad de acuerdo con
el gradiente utilizado en la fase móvil (Temperatura de
Nebulizador: 115ºC; Flujo de Nitrógeno: 3,2 ml/min). La separación
cromatográfica de las diferentes ciclodextrinas, del PVM/MA y del
patrón interno (PEG 6000) se llevó a cabo en menos de 15 minutos.
Los tiempos de retención fueron de:
1,08 \pm 0,05 minutos para el PVM/MA;
4,58 \pm 0,07 minutos para la
\beta-CD;
10,27 \pm 0,06 para la
OH-\beta-CD; y
13,60 \pm 0,04 minutos para el patrón
interno.
El límite de cuantificación fue de 0,2 mg/ml
para las ciclodextrinas y de 0,05 mg/ml para el polímero (PVM/MA).
La precisión no superó el límite del 7%.
En el caso de la cuantificación de
ciclodextrina aminada [e.g.,
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
(NH-\beta-CD)] asociada a las
nanopartículas se utilizó una variante del método descrito arriba
para evitar el solapamiento de los picos de la ciclodextrina y el
polímero. Por ello, las muestras se analizaron utilizando una
columna NH_{2}-Zorbax (Agilent 4,6 x 150 mm, 5
\mum), calentada a 40ºC y una mezcla de metanol/agua (80/20 v/v)
como fase móvil a un flujo de 1 ml/min. Las condiciones del
detector (ELSD) fueron las siguientes: Temperatura de Nebulizador:
71ºC y Flujo de Nitrógeno: 1,9 ml/min. La separación cromatográfica
de la
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina,
se llevó a cabo en menos de 7 minutos. El tiempo de retención fue de
3,8 \pm 0,07 minutos.
Finalmente, la cantidad de ciclodextrina (CD)
asociada a las nanopartículas se calculó como la diferencia entre
la cantidad de CD añadida inicialmente y la cantidad de CD
cuantificada en los sobrenadantes.
La cantidad de rodamina B isotiocianato (RBITC)
incorporada en las nanopartículas se determinó por colorimetría a
una longitud de onda de 540 nm (Labsystems iEMS Reader MF,
Finlandia). Para esta cuantificación, se utilizaron curvas de
calibrado de RBITC en NaOH 0,1 N en un intervalo de
5-50 \mug/ml; r = 0,999.
La cantidad de RBITC se estimó como la
diferencia entre la cantidad inicial añadida y la cantidad
encontrada después de la hidrólisis total de una determinada
cantidad de nanopartículas en NaOH 0,1N (24 h, 37ºC).
La cinética de liberación de RBITC desde las
nanopartículas se realizó en tubos de diálisis Vivaspin® 100,000
MWCO (VIVASPIN, Hannover, Alemania). Para ello, 10 mg de
nanopartículas se dispersaron en 1 ml de medio gástrico simulado
(0-1 h) o medio intestinal simulado (1 a 24 h) (USP
XXIII) a 37\pm1ºC. A determinados tiempos, las suspensiones de
nanopartículas se centrifugaron (5.000 x g, 15 min) y la cantidad de
RBITC en los filtrados se cuantificó por colorimetría
(\lambda=540 nm).
La cantidad de paclitaxel encapsulado en las
nanopartículas se determinó por HPLC. El análisis se llevo a cabo
en un cromatógrafo modelo 1100 series LC (Agilent, Waldbornn,
Alemania) acoplado a un sistema de detección UV de
diodo-array. Los datos se analizaron en un
ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem-
Station G2171. Para la separación del paclitaxel se utilizó una
columna de fase reversa Phenomenex Gemini C18 (150 mm x 3 mm; 5
\mum) calentada a 30ºC. La fase móvil estaba compuesta por una
mezcla de solución reguladora de fosfatos (pH= 2; 0,01 M) y
acetonitrilo (en proporción 50/50 en volumen), y fue bombeada a un
flujo de 0,5 ml/min. La detección se realizó a 228 nm.
Para el análisis de las muestras en fresco, se
tomaron 100 \mul de suspensión acuosa de nanopartículas y se
rompieron con 100 \mul de acetonitrilo. Los disolventes se
evaporaron (centrifuga-evaporadora) y la muestra se
reconstituyó en la fase móvil utilizada. Se inyectaron alícuotas de
100 \mul se inyectan en la columna HPLC para su análisis.
Los estudios de bioadhesión se llevaron a cabo
utilizando el protocolo descrito previamente [Arbos et al.,
Int. J. Pharm., 242 (2002) 129-136], de acuerdo con
las normas del Comité Ético de la Universidad de Navarra y con
legislación europea en animales de experimentación (86/609/EU).
Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225
g (Harlan, España), se mantuvieron bajo condiciones normales libres
de comida y agua. A los animales se les administró por vía oral 1
ml de suspensión acuosa que contenía 10 mg de nanopartículas
marcadas con RBITC. Los animales se sacrificaron a diferentes
tiempos (0,5, 1, 3 y 8 horas) mediante dislocación cervical. La
cavidad abdominal se abrió y se retiró el tracto gastrointestinal,
que fue dividido en seis regiones anatómicas: estómago (Sto),
intestino delgado (I1, I2, I3 y I4) y ciego (Ce). Cada segmento de
la mucosa fue abierto longitudinalmente y enjuagado con PBS (pH
7,4). A su vez, cada una de estas partes se cortó en cinco
porciones similares y se digirió el tejido con 1 ml de NaOH 3 M
durante 24 horas. Para extraer la rodamina se emplearon 2 ml de
metanol, se agitó durante 1 minuto con el vortex y después se
centrifugó a 2,000 x g durante 10 minutos (Centrífuga 5804R, Rotor
A-4-44, Alemania). Alícuotas de 1 ml
de los sobrenadantes obtenidos se diluyeron con agua (3 ml) y se
analizaron por espectrofluorimetría a X\lambda_{ex} 540 nm y
\lambda_{em} 580 nm (GENios, Austria) para estimar la fracción
de nanopartículas adherida a la mucosa. Las rectas de calibrado se
prepararon mediante adición de soluciones de RBITC en NaOH 3 M
(0,5-10 \mug/ml) a segmentos de tejidos control,
que fueron sometidos a las mismas etapas de extracción
(r>0,996).
Para poder comparar las diferentes
formulaciones, se estudiaron las curvas y cinéticas de bioadhesion.
Para ello, se representó la fracción de nanopartículas adheridas
frente al tiempo obteniéndose así las curvas de bioadhesión. A
partir de éstas, y utilizando la aplicación informática WinNonlin
1.5 (Pharsight Corporation, EEUU), se determinaron los parámetros
cinéticos de bioadhesión: Q_{max}, AUC_{adh}, T_{max},
MRT_{adh} and K_{adh} (Arbos et al., J. Control. Release,
89 (2003) 19-30). Q_{max} (mg), es la capacidad
inicial máxima de nanopartículas adheridas a la mucosa
gastrointestinal y está relacionada con la capacidad de éstas de
desarrollar interacciones bioadhesivas. AUC_{adh} (mg.h), es el
área bajo la curva de la fracción de nanopartículas adheridas, y
representa la intensidad de bioadhesión. MRT_{adh} (h), es el
tiempo medio estimado que las formulaciones permanecen adheridas a
la mucosa. K_{adh} es definida como velocidad de eliminación de
la fracción adherida en la mucosa. Todos estos parámetros fueron
estimados entre 0 y 8 horas. Los cálculos se realizaron utilizando
el programa WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
La visualización de las nanopartículas que
contienen ciclodextrinas y, opcionalmente, una molécula
biológicamente activa, en la mucosa gastrointestinal se observó por
microscopia de fluorescencia. Para ello, se utilizaron las
formulaciones que contenían RBITC. Dichas formulaciones (10 mg de
nanopartículas) se administraron por vía oral a los animales de
laboratorio (ratas macho Wistar) que, dos horas después, fueron
sacrificados. Tras el sacrificio, el tracto gastrointestinal fue
extraído, recogiendo distintas porciones del intestino delgado que
se lavaron con tampón fosfato salino (pH=7,4; 0,15 M), tal como se
ha descrito anteriormente para los estudios de bioadhesión. Las
diferentes secciones intestinales fueron tratadas con O.C.T.^{TM}
(Sakura, Países Bajos) y congeladas en nitrógeno líquido.
Posteriormente las muestras del tejido fueron cortadas en secciones
de 5 \mum de espesor en un criostato (2800 Frigocut E,
Reichert-Jung, Alemania), y fijadas a soportes para
su visualización por microscopia de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios farmacocinéticos se llevaron a cabo
de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de
Navarra así como de la legislación europea en animales de
experimentación (86/609/EU). Para ello, ratas macho Wistar, de peso
medio 225 g (Harlan, España), se aislaron en jaulas metabólicas 12
horas antes de la administración de las formulaciones, sin acceso a
comida, pero permitiéndoles el acceso libre al agua de bebida.
Los animales se dividieron en 8 grupos de
tratamiento (6 animales por grupo) y se trataron con dosis únicas
de 10 mg/kg (2,25 mg) de paclitaxel incorporado en alguna de las
siguientes formulaciones:
- (i)
- solución i.v. de Taxol® (Bristol-Myers Squibb, Madrid, España);
- (ii)
- solución oral de Taxol®;
- (iii)
- complejo paclitaxel (PTX)-2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD) [PTX-OH-\beta-CD];
- (iv)
- complejo paclitaxel (PTX)-\beta-ciclodextrina (\beta-CD) [PTX-\beta-CD];
- (v)
- complejo paclitaxel (PTX)-6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina (NH-\beta-CD) [PTX-NH-\beta-CD];
- (vi)
- complejo paclitaxel (PTX)-2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD)-nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-OH-\beta-CD-NP];
- (vii)
- complejo paclitaxel (PTX)-\beta-ciclodextrina (\beta-CD)-nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-\beta-CD-NP]; y
- (viii)
- complejo paclitaxel (PTX)-6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina-nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-NH-\beta-CD-NP].
A los animales se les administró 1 ml de las
distintas formulaciones, disueltas o dispersas en agua, excepto en
el caso de la solución i.v. (formulación comercial), que se
administró en la vena de la cola (0,3 ml).
Tras la administración se procedió a extraer, a
diferentes tiempos, un volumen de sangre de aproximadamente 300
\mul, utilizando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como
anticoagulante y recuperando la volemia del animal (rata) con un
volumen equivalente de suero fisiológico vía intraperitoneal (i.p.).
La sangre se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos y el
sobrenadante (plasma) se congeló a una temperatura de -80ºC. El
estudio se realizó de acuerdo con los principios recogidos en las
guías internacionales de experimentación animal (WHO Chronicle, 39
(2): 51-56, 1985; A CIOMS Ethical Code for Animal
Experimentation) mediante protocolo aprobado por el Comité Ético de
experimentación animal de la Universidad de Navarra.
La extracción del paclitaxel a partir de plasma
se realizó mediante un procedimiento de extracción
líquido-liquido, utilizando
t-butilmetiléter como disolvente de extracción.
Para ello, se tomaron alícuotas de plasma (0,1 ml), se ajustaron a
un volumen de 1 ml con agua y se les añadió 0,2 \mug de docetaxel
como patrón interno. A continuación, se añadieron 4 ml de
ter-butilmetiléter y se agitó durante 1 minuto.
Después, se centrifugaron las muestras a 10.000 rpm durante 10
minutos y se recogió el sobrenadante (fase orgánica) que se evaporó
en una centrifuga evaporadora (Savant, Barcelona, España). El
extracto así obtenido se reconstituyó en 200 \mul de una mezcla
(50/50 v,/v) de acetonitrilo y solución reguladora de fosfatos
(pH=2; 0,01 M) mediante agitación con vortex durante 1 minuto. La
solución resultante fue transferida a un vial de inyección.
La cuantificación del paclitaxel se realizó por
cromatografia líquida de alta resolución (HPLC) con detección
ultravioleta-visible. Como patrón interno se ha
utilizado docetaxel. El análisis se llevó a cabo en un cromatógrafo
modelo 1100 series LC (Agilent, Waldbornn, Alemania). Los datos se
analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante
el programa Chem-Station G2171. Para la separación
del paclitaxel se utilizó una columna de fase reversa Gemini C18
(Phenomenex) 150 mm x 3 mm; 5 \mum, calentada a 30ºC. La fase
móvil estaba compuesta por una mezcla de solución reguladora de
fosfatos (pH=2; 0,01 M) y acetonitrilo (en proporción 50/50 en
volumen), y fue propulsada a través de la columna a un flujo de 0,5
ml/min. La detección se realizó a 228 nm.
El método analítico utilizado ha sido validado,
comprobándose la relación lineal entre la respuesta del detector y
las concentraciones de paclitaxel en plasma a lo largo del
intervalo de concentraciones comprendido entre 40 y 3.200 ng/ml.
El análisis farmacocinético de los datos de
concentraciones plasmáticas a lo largo del tiempo obtenidos tras la
administración de paclitaxel se realizó utilizando el procedimiento
de ajuste nocompartimental del programa de ajuste farmacocinético
WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, EEUU).
Los parámetros farmacocinéticos calculados
fueron los siguientes: la concentración máxima (C_{max}); el
tiempo en el cual se alcanza la C_{max} (t_{max}); el área bajo
la curva de niveles plasmáticos (AUCO-inf); el
tiempo de residencia media (MRT) y la semivida biológica en la fase
de eliminación terminal (t_{1/2z}), aclaramiento (C1) y el
volumen de distribución en estado de equilibrio estacionario.
El tiempo de residencia media (MRT) se calculó
mediante el cociente entre el valor del AUMC (área bajo la curva en
el primer momento de la concentración plasmática) y el del AUC. El
aclaramiento (C1) como Dosis x Biodisponibilidad/AUC, y el volumen
de distribución en estado de equilibrio estacionario (Vss) como el
cociente entre el aclaramiento y la constante de eliminación
terminal (k), calculada como 1/MRT.
Para el estudio de bioadhesión y
farmacocinética, las formulaciones se analizaron utilizando el test
no paramétrico "Mann-Whitney". Valores de P
< 0,05 se consideraron significativos. Todos los cálculos se
hicieron con el programa estadístico de software SPSS® (SPSS® 10,
Microsoft, Estados Unidos).
Las nanopartículas se prepararon por
desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento
descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Release, 83
(2002) 321-330]. Para ello, el copolímero de metil
vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) y una cantidad determinada
de \beta-ciclodextrina
(\beta-CD),
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(OH-\beta-CD) ó
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
(NH-\beta-CD) se incubaron en
acetona bajo agitación magnética. Tras la incubación, sobre esta
fase y bajo agitación magnética, se adicionaron un disolvente
orgánico miscible (etanol) y un volumen similar de agua
desionizada, dando lugar a la formación de las nanopartículas bajo
apariencia de una suspensión lechosa. Tras dejar homogeneizar la
suspensión de nanopartículas, ésta se evaporó bajo presión reducida
(rotavapor Büchi R-144, Suiza) hasta eliminar ambos
disolventes orgánicos. Posteriormente, la suspensión se purificó
por ultracentrifugación (Sigma 3k30, rotor Nº-12150, Alemania). Una
parte de las nanopartículas obtenidas se congeló a -80ºC para su
posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis
Genesis, Nueva York, EEUU).
La Figura 1 muestra la cantidad de ciclodextrina
asociada a las nanopartículas en función del tiempo de incubación
con el polímero biodegradable (PVM/MA) durante la preparación de
las nanopartículas. En todos los casos, se observó un tiempo óptimo
de incubación entre la CD y el polímero. Este tiempo de incubación
fue de 30 minutos. Por último, es de destacar que la
\beta-CD se asocia de forma más eficaz a las
nanopartículas de PVM/MA que su derivado hidroxilado
(OH-\beta-CD) o aminado
(NH-\beta-CD).
En función de los resultados obtenidos, para
estudios posteriores se seleccionaron las siguientes condiciones
experimentales:
- -
- relación ciclodextrina:copolímero PVM/MA (1:4); y
- -
- tiempo de incubación 30 minutos.
Las nanopartículas se prepararon por
desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento
descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Release, 83
(2002) 321-330]. Para ello, 25 mg de
\beta-CD,
OH-\beta-CD o
NH-\beta-CD se dispersaron en 2 ml
de acetona con ayuda de ultrasonidos (Microson^{TM} o en baño de
ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento). Esta suspensión
se adicionó a una solución de 100 mg del copolímero de metil vinil
éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] en 3 ml de
acetona y se dejó incubar la mezcla durante 30 minutos.
Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se
adicionaron 10 ml de etanol y 10 ml de agua desionizada. La mezcla
resultante se dejó homogeneizar durante 5 minutos. A continuación,
la suspensión de nanopartículas fue evaporada bajo presión reducida
(Büchi R-144, Suiza) hasta eliminar ambos
disolventes orgánicos y el volumen final se ajustó con agua a 10
ml. Posteriormente, la suspensión se sometió a purificación por
ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g) (Sigma 3k30,
rotor Nº-12150, Alemania). Los sobrenadantes se eliminaron y el
residuo se resuspendió en agua o en una solución acuosa de sacarosa
al 5%. Eventualmente, una parte de las nanopartículas obtenidas se
congelaron a -80ºC para su posterior liofilización y conservación a
largo plazo (Virtis Genesis, Nueva York, EEUU).
La determinación de las características
físico-químicas permitió comprobar cómo,
independientemente de la CD utilizada, las nanopartículas
presentaban tamaños y cargas de superficie similares. Además, esta
carga era similar a la de las nanopartículas no tratadas con lo que
se puede estimar que la mayor parte de la CD se encontraba
localizada en el interior de las nanopartículas y no adsorbidas
sobre su superficie. La Tabla 2 resume las características
físico-químicas principales de las nanopartículas
analizadas.
Como puede observarse en la Tabla 2,
independientemente de la ciclodextrina utilizada, las
nanopartículas presentaban tamaños y cargas de superficie similares.
Además, esta carga era similar a la de las partículas no tratadas
con lo que se puede estimar que la mayor parte de la ciclodextrina
se encontraba localizada en el interior de las nanopartículas y no
adsorbidas sobre su superficie. La asociación entre las
ciclodextrinas y las nanopartículas a base de PVM/MA permite obtener
nanopartículas de tamaño más pequeño que las convencionales (NP).
Como se muestra en la Tabla 2, las nanopartículas a base de PVM/MA
que contienen ciclodextrinas muestran un tamaño cercano a los 150
nm. Esta disminución en el tamaño podría estar asociada al alto
rendimiento del proceso de fabricación de las nanopartículas. Estos
rendimientos se obtuvieron mediante la determinación de su peso al
final del proceso y tras su liofilización. Los rendimientos de
fabricación se expresan en porcentaje, calculado respecto a la masa
inicial del copolímero PVM/MA y la ciclodextrina.
La cantidad de ciclodextrina asociada a las
nanopartículas varia en función del tipo de oligosacárido
utilizado, siendo de alrededor de 90 \mug/mg para la
\beta-CD y de 70 \mug/mg para la
OH-\beta-CD y la
NH-\beta-CD. La confirmación de la
presencia de CD asociadas a las nanopartículas a base de PVM/MA se
realizó tras el análisis elemental de las diferentes formulaciones.
Los resultados obtenidos (Tabla 3) confirmaron la presencia de CD
debido a un aumento importante en la proporción de oxígeno en las
formulaciones que llevaban la CD asociada, así como una disminución
del porcentaje de carbono, en comparación con las nanopartículas
control (NP).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La morfología de las nanopartículas se observó
por microscopía electrónica de barrido (Zeiss, Alemania), tras la
cual se observó la típica forma esférica de las nanopartículas,
homogéneas y de un tamaño comprendido entre 80 y 200 nm. La Figura
2 muestra los resultados de someter una muestra liofilizada de
nanopartículas a base de PVM/MA con \beta-CD
(\beta-CD-NP) a microscopía de
barrido electrónico.
Las nanopartículas se prepararon por
desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento
descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Release, 83
(2002) 321-330]. Para ello, 25 mg de
\beta-CD,
OH-\beta-CD o
NH-\beta-CD se dispersaron en 2 ml
de acetona con ayuda de ultrasonidos (Microson^{TM} o en baño de
ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento). Esta suspensión
se adicionó a una solución de 100 mg del copolímero de metil vinil
éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] en 3 ml de
acetona y se dejó incubar la mezcla durante 30 minutos.
Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se
adicionaron 10 ml de etanol y 10 ml de agua desionizada. La mezcla
resultante se dejó homogeneizar durante 5 minutos. A continuación,
la suspensión de nanopartículas fue evaporada bajo presión reducida
(Büchi R-144, Suiza) hasta eliminar ambos
disolventes orgánicos y el volumen final se ajustó con agua a 10
ml. A continuación, se añadió a las nanopartículas una solución
acuosa de rodamina B isotiocianato (RBITC) y se dejó incubar durante
5 minutos, a temperatura ambiente y con agitación magnética.
Posteriormente, la suspensión se sometió a purificación por
ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g) (Sigma 3k30, rotor
Nº-12150, Alemania). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo se
resuspendió en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%.
Eventualmente, una parte de las nanopartículas obtenidas se
congelaron a -80ºC para su posterior liofilización y conservación a
largo plazo (Virtis Genesis, Nueva York, EEUU).
\global\parskip0.900000\baselineskip
La cantidad de RBITC se estimó como diferencia
entre la cantidad inicial añadida y la cantidad encontrada después
de la hidrólisis total de una determinada cantidad de
nanopartículas en NaOH 0,1 N (24 h, 37ºC). La Tabla 4 muestra los
valores de RBITC (\mug RBITC/ mg nanopartícula) para las
diferentes formulaciones ensayadas.
La Figura 3 muestra la cinética de liberación de
RBITC desde las nanopartículas en medio gástrico simulado
(0-1 h) y en medio intestinal simulado (1 a 24 h) a
37\pm1ºC. En todos los casos, se constató que el porcentaje de
RBITC liberado tras 24 horas de incubación, fue siempre inferior al
10% de la cantidad asociada a las nanopartículas. Por ello, se
puede asumir que los resultados obtenidos en los posteriores
estudios de bioadhesión así como en la microscopia de
fluorescencia, la intensidad de fluorescencia corresponde a la
RBITC asociada a las nanopartículas.
La Figura 4 muestra el perfil de bioadhesión de
las formulaciones ensayadas, representando la fracción de
nanopartículas adheridas en los diferentes segmentos del tracto
gastrointestinal (estómago; intestino delgado:
I1-I4; ciego) a 30 minutos, 1 h, 3 h y 8 h tras la
administración oral, de acuerdo con la metodología descrita
previamente. Como puede observarse en dicha figura, las
nanopartículas asociadas a ciclodextrinas mostraron un perfil de
bioadhesión diferente al de las nanopartículas control. En trabajos
recientes, el potencial bioadhesivo del copolímero PVM/MA demostró
ser mucho mayor incorporado a las nanopartículas que cuando se
administró en forma de una solución acuosa simple (Arbos et
al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30). Este
hecho concuerda con trabajos previos que sugerían que la forma de
nanopartícula facilitaría tanto el contacto inicial como las
interacciones adhesivas con los componentes de la mucosa.
Pasados 30 minutos de la administración, todas
las formulaciones ensayadas mostraron un máximo de bioadhesión en
el estómago y en el jejuno (porción I2 en la Figura 4). En
cualquier caso, parece observarse una mayor interacción con las
nanopartículas asociadas a la
OH-\beta-CD. Por lo tanto, 30
minutos después de la administración, se puede decir que alrededor
del 12-20% de la dosis administrada de las
formulaciones se encuentran adheridas al estómago y aproximadamente
entre el 14-22% en el intestino delgado. Dichos
valores son significativamente diferentes a los encontrados para
las nanopartículas convencionales (a base de PVM/MA) sin CD que
menos del 10% y no más del 12% de la dosis administrada se encuentra
adherida al estómago e intestino delgado, respectivamente.
A partir de 1 h tras la administración, se puede
observar cómo la fracción de nanopartículas con ciclodextrinas
adheridas a la mucosa gastrointestinal va disminuyendo y moviéndose
a porciones distales del tracto. En cualquier caso, se puede
observar que dicha distribución es homogénea y ninguna formulación
muestra especificidad por alguna región del tracto
gastrointestinal.
Para poder comparar el potencial adhesivo de las
diferentes formulaciones, se estudiaron las curvas y cinéticas de
bioadhesión. Para ello, se representó la fracción de nanopartículas
adheridas frente al tiempo obteniéndose así las curvas de
bioadhesión. Esas curvas están representadas en la Figura 5. A
partir de éstas, y utilizando la aplicación informática WinNonlin
1.5 (Pharsight Corporation, EEUU), se determinaron los parámetros
cinéticos de bioadhesión: Q_{max}, AUC_{adh}, T_{max},
MRT_{adh} and K_{adh} (Arbos et al., J. Control.
Release, 89 (2003) 19-30). La Tabla 5 recoge estos
parámetros.
Como puede observarse, las nanopartículas
asociadas a OH-\beta-CD están
caracterizadas por una AUC_{adh} (parámetro que mide la intensidad
de las interacciones bioadhesivas) 1,5 veces superior a la
observada para las nanopartículas control (NP). Igualmente, la
fracción adherida de las formulaciones asociadas a ciclodextrinas
mostraban una velocidad de eliminación (K_{adh})
significativamente inferior que la de las NP control (p<0,01) y
un tiempo de residencia medio (MRT_{adh}) de aproximadamente 3,5
horas. Estos resultados permiten suponer que la presencia de
ciclodextrinas (principalmente OH-CD) puede
facilitar la interacción con la mucosa gastrointestinal y
desarrollar interacciones adhesivas con componentes de la mucosa más
fuertes que las NP.
La visualización de la distribución de las
nanopartículas asociadas a ciclodextrinas en la mucosa
gastrointestinal se observó por microscopia de fluorescencia. Para
ello, las diferentes formulaciones marcadas con RBITC se
administraron a animales de laboratorio. Dos horas después de su
administración, los animales fueron sacrificados y se examinaron
diversas porciones del intestino delgado. La Figura 6 muestra unas
fotografiar que permiten observar la distribución de las
nanopartículas en muestras de íleo.
En concordancia con los estudios de bioadhesión
in vivo, las nanopartículas asociadas a
hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
presentan mayor capacidad establecer interacciones bioadhesivas con
la mucosa que las nanopartículas control. Las nanopartículas
convencionales no fueron capaces de alcanzar los enterocitos a pesar
de su habilidad para penetrar en la capa de mucus que tapiza la
mucosa. Por el contrario, las nanopartículas asociadas a
ciclodextrina se adhirieron significativamente en los enterocitos
del intestino.
El procedimiento para la fabricación de
nanopartículas que contienen ciclodextrinas con paclitaxel se
divide en dos etapas diferentes:
- 1)
- Producción del complejo paclitaxel-ciclodextrina, que incluye tanto la formación como la purificación del complejo formado; y
- 2)
- Producción de nanopartículas conteniendo el complejo paclitaxel-ciclodextrina.
Para ello, se preparó una solución acuosa de
ciclodextrina (\beta-CD,
OH-\beta-CD o
NH-\beta-CD) que se añadió sobre
una solución etanólica del fármaco paclitaxel (PTX) en una
proporción 80:20 (v:v), y con una relación molar
fármaco:ciclodextrina (1:1). La mezcla se mantuvo en agitación
magnética (300 rpm), en oscuridad y a temperatura ambiente hasta
alcanzar el equilibrio (al menos, 72 horas). A continuación, se
eliminó el etanol bajo evaporación a presión reducida y se filtró
la suspensión (0,45 \mum) para eliminar los cristales de fármaco
no disuelto. Finalmente, se eliminó completamente el agua de la
solución acuosa final por evaporación bajo presión reducida quedando
el complejo paclitaxel-ciclodextrina bajo la
apariencia de un polvo blanco.
Las nanopartículas se obtuvieron por
desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento
descrito anteriormente (Arbos et al., 2002, citado
supra). Para ello, una cantidad determinada del complejo
formado previamente entre el paclitaxel y la ciclodextrina
(\beta-CD,
OH-\beta-CD o
NH-\beta-CD) se dispersó n 2 ml de
acetona. Esta suspensión se adicionó a una solución de 100 mg del
copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVMIMA)
[Gantrez® AN 119] en 3 ml de acetona y se dejó incubar la mezcla
durante 30 minutos. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación
magnética, se adicionaron 10 ml de etanol y 10 ml de agua
desionizada. La mezcla resultante se dejó homogeneizar durante 5
minutos. A continuación, la suspensión de nanopartículas fue
evaporada bajo presión reducida (Büchi R-144, Suiza)
hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se
ajustó con agua a 10 ml. Posteriormente, la suspensión se sometió a
purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g)
(Sigma 3k30, rotor Nº-12150, Alemania). Los sobrenadantes se
eliminaron y el residuo se resuspendió en agua o en una solución
acuosa de sacarosa al 5%. Una parte de las nanopartículas obtenidas
se congeló a -80ºC para su posterior liofilización y conservación a
largo plazo (Virtis Genesis, Nueva York, EEUU).
La Figura 7 muestra la evolución del contenido
en PTX en las nanopartículas que contienen ciclodextrinas y PTX, en
función de la cantidad y tipo de ciclodextrina utilizada. En primer
lugar, merece la pena destacar que el PTX por sí solo, es decir, sin
formar complejo con las CD, no es capaz de incluirse en las
nanopartículas, siendo eliminado en el proceso de purificación de
las nanopartículas por filtración. Por ello, se hace necesaria la
formación del complejo paclitaxel-ciclodextrina
(PTX-CD). Para las diferentes ciclodextrinas
utilizadas se observó cómo las mejores eficacias de encapsulación
se obtuvieron cuando el PTX forma complejo con la
OH-(3-CD, seguido de la
NH-\beta-CD y de la
\beta-CD sin sustituir.
Asimismo se ensayaron también diferentes
cantidades de PTX (5, 7,5, 10 y 25 mg), siempre guardando la
relación molar 1:1 con la ciclodextrina correspondiente, y se
observó cómo para cantidades superiores a 10 mg de PTX [PTX:PVM/MA
(1:10)], no se obtuvieron mayores cantidades de fármaco
encapsulado, y, por consiguiente se observó una disminución en la
eficacia de encapsulación del complejo PTX-CD en las
NP. Tras estos ensayos, se determinó que, en las condiciones
ensayadas, la cantidad óptima de PTX a incluir en las diferentes
formulaciones era de 10 mg, obteniéndose así los mejores
rendimientos. La Tabla 7 muestra la cantidad de PTX encapsulado
cuando inicialmente se añadía 10 mg en función de las diferentes
ciclodextrinas utilizadas para formar el complejo.
\vskip1.000000\baselineskip
(cantidad inicial de paclitaxel
añadida: 10
mg)
El paclitaxel es un fármaco que se caracteriza
por presentar un perfil farmacocinético
dosis-dependiente. Por tanto, previamente fue
necesario determinar el perfil farmacocinético tras administrar por
vía intravenosa u oral la formulación comercial de paclitaxel a la
dosis seleccionada para su formulación en nanopartículas (10
mg/kg).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los estudios farmacocinéticos se llevaron a cabo
de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de
Navarra así como de la legislación Europea en animales de
experimentación (86/609/EU). Para ello, ratas macho Wistar, de peso
medio 225 g (Harlan, España), se aislaron en jaulas metabólicas 12
horas antes de la administración de las formulaciones, sin acceso a
comida, pero permitiéndoles el acceso libre al agua de bebida.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 8 resume las características
físico-químicas principales de las nanopartículas
ensayadas en el estudio farmacocinético. Las nanopartículas control
(PTX-NP) muestran un tamaño cercano a los 200 nm con
una carga superficial negativa de -38 mV. Por otra parte, las
nanopartículas que contienen encapsulado el complejo
PTX-CD son significativamente mayores (cercanas a
los 300 nm) y muestran un potencial zeta similar en todos los
casos. Por último, es de destacar que la presencia del complejo
PTX-CD no ejerce ningún efecto sobre el rendimiento
de fabricación de las nanopartículas que varía entre el
50-60%.
El estudio farmacocinético se dividió en tres
fases. En el primer estudio se administraron 10 mg/kg de la
formulación comercial de paclitaxel (Taxol®) por vía intravenosa
(i.v.) y oral a dos grupos de ratas macho Wistar (n= 6). El segundo
estudio consistió en administrar por vía oral soluciones de
paclitaxel (10 mg/kg) con (i) \beta-CD, (ii)
OH-\beta-CD, o (iii)
NH-\beta-CD, a grupos de ratas
compuestos de 6 animales. Finalmente, para el estudio
farmacocinético de las diferentes formulaciones se administraron
por vía oral a distintos grupos de animales las diferentes
formulaciones de nanopartículas (i)
PTX-OH-\beta-CD-NP,
(ii)
PTX-\beta-CD-NP,
(iii)
PTX-NH-\beta-CD-NP,
o (iv) PTX-NP a los animales. La dosis de
paclitaxel seleccionada fue de 10 mg/kg.
Tras la administración se procedió a extraer a
diferentes tiempos (0,10, 30, 60, 90, 180, 360, 480 minutos, 24 y
30 horas) un volumen de sangre de aproximadamente 300 \mul,
utilizando EDTA como anticoagulante y recuperando la volemia del
animal (rata) con un volumen equivalente de suero fisiológico vía
intraperitoneal (i.p.). El análisis farmacocinético de los
resultados obtenidos tras la administración de paclitaxel se
realizó utilizando el procedimiento de ajuste nocompartimental del
programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1.5 (Pharsight
Corporation, Mountain View, Estados Unidos).
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 8. Como se puede observar, la administración i.v. de la
formulación convencional (taxol comercial) muestra un pico de
concentración de paclitaxel en plasma en la primera toma de muestra,
seguido de una disminución bifásica a lo largo del tiempo. Dicho
perfil es similar al descrito por otros autores (Yeh et al.,
Pharm Res 22(6): 867-74, 2005). Cuando dicha
formulación comercial se administró por vía oral (Figura 8B), los
niveles plasmáticos de paclitaxel fueron nulos. Resultados
similares se obtuvieron al administrar los complejos PTX:CD,
ninguno de ellos permitió detectar o cuantificar niveles
significativos de paclitaxel en el tiempo. Por el contrario, al
administrar por vía oral las formulaciones de paclitaxel en
nanopartículas conteniendo ciclodextrinas y paclitaxel se pudo
comprobar que estas formulaciones daban lugar a niveles plasmáticos
sostenidos en el tiempo durante, al menos, 24 horas. En el periodo
de tiempo comprendido desde las 4 horas hasta las 24 horas
posterior a la administración de dichas nanopartículas se pudo
observar para las tres formulaciones un "plateau" de
concentración plasmática típico de las formulaciones que liberan el
fármaco con cinéticas de orden 0. En cualquier caso, las
formulaciones
PTX-\beta-CD-NP y
PTX-OH-\beta-CD-NP
permiten obtener niveles plasmáticos sensiblemente superiores
(3-4 veces) a los obtenidos con la formulación
PTX-NH-\beta-CD-NP.
También es interesante resaltar que la administración de paclitaxel
en nanopartículas convencionales no permitió la absorción del
fármaco.
La Tabla 9 recoge los valores de los parámetros
farmacocinéticos obtenidos tras realizar un análisis no
compartimental de los datos experimentales obtenidos tras
administrar las distintas formulaciones de paclitaxel en
nanopartículas. Como puede observarse en dicha tabla, el valor de
AUC y MRT experimenta variaciones significativas en función del
tipo de ciclodextrina empleada en la formulación. En el caso de las
formulaciones orales de
PTX-OH-\beta-CD-NP
y PTX-\beta-CD-NP
se obtuvieron valores de AUC 5 veces superiores a los obtenidos
tras administrar la formulación comercial (Taxol®) intravenoso a la
misma dosis. En ambas formulaciones la concentración máxima
alcanzada resultó ser significativamente mayor que la alcanzada en
el resto de formulaciones en un periodo de tiempo de 6 y 5 horas,
respectivamente. Por el contrario, para la formulación
PTX-NH-\beta-CD-NP
se obtuvieron valores de AUC inferiores a los obtenidos tras
administrar la formulación comercial (Taxol®) por vía intravenosa;
sin embargo, el tiempo medio de residencia del fármaco en el
organismo (MRT) fue similar para las tres formulaciones con
ciclodextrinas. Estos valores fueron entre 3 y 5 veces superiores a
los alcanzados tras administrar la formulación comercial (Taxol®)
por vía intravenosa.
Del mismo modo, la semivida de eliminación del
fármaco en la fase terminal (T_{1/2z}) fue similar para las
formulaciones de nanopartículas que contenía ciclodextrina y
paclitaxel, y, en cualquier caso, inferior a la obtenida para la
formulación comercial administrada por vía intravenosa
(Taxol®).
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (43)
1. Una nanopartícula que comprende un polímero
biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una
molécula biológicamente activa.
2. Nanopartícula según la reivindicación 1, en
la que dicho polímero biodegradable es un copolímero de metil vinil
éter y anhídrido maleico (PVM/MA).
3. Nanopartícula según la reivindicación 2, en
la que dicho polímero biodegradable tiene un peso molecular
comprendido entre 100 y 2.400 kDa, preferentemente entre 200 y
2.000 kDa, en particular, entre 180 y 250 kDa.
4. Nanopartícula según la reivindicación 1, en
la que dicha ciclodextrina, o derivado de la misma, es una
alfa-ciclodextrina, una
beta-ciclodextrina o una
gamma-ciclodextrina.
5. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 4,
en la que dicha ciclodextrina presenta al menos un grupo hidroxilo
terminal modificado.
6. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 4,
en la que dicha ciclodextrina presenta, dos o más grupos hidroxilo
terminales modificados.
7. Nanopartícula según la reivindicación 5 ó 6,
en la que dicho(s) grupo(s) hidroxilo(s)
terminal(es) está(n) modificado(s) reemplazando el
hidrógeno por un grupo alquilo C_{1}-C_{8};
trialquil(C_{1}-C_{8})sililo;
hidroxialquilo C_{1}-C_{8};
alquil(C_{1}-C_{8})carbonilo,
opcionalmente sustituido; arilcarbonilo;
cianoalquil(C_{1}-C_{2}); amino,
opcionalmente sustituido; azido; sulfo; sulfoalquilo
(C_{1}-C_{4}); o por un radical de un
azúcar.
8. Nanopartícula según la reivindicación 1, en
la que dicha ciclodextrina, o derivado de la misma, se selecciona
del grupo formado por \beta-ciclodextrina,
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina,
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
y sus mezclas.
9. Nanopartícula según la reivindicación 1, en
la que dicha molécula biológicamente activa es una molécula química
pequeña, una proteína, un péptido, un nucleósido, un nucleótido, un
oligonucleótido, un polinucleótido o un ácido nucleico.
10. Nanopartícula según la reivindicación 1, en
la que dicha molécula biológicamente activa es un fármaco, un
antígeno o un alergeno.
11. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó
10, en la que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia
hidrófoba.
12. Nanopartícula según la reivindicación 11, en
la que dicha molécula biológicamente activa es albendazol,
mebendazol, praziquantel, clotrimazol, itraconazol, sulfametiazol,
gentamicina, griseofulvina, digoxina, camptotecina, metotrexato,
docetaxel, fluorouracilo, paclitaxel, tacrolimus, ciclosporina,
cortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, o
triamcinolona.
13. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó
10, en la que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia
sustrato de la enzima glicoproteína-P.
14. Nanopartícula según la reivindicación 13, en
la que dicha molécula biológicamente activa es docetaxel,
etoposido, imatinib, paclitaxel, teniposido, vinblastina,
vincristina, doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, bunitrolol,
carvedilol, celiprolol, talinolol, diltiazem, mibefradil,
verapamil, digitoxina, digoxina, quinidina, amprenavir, indinavir,
nelfinavir, saquinavir, ritonavir, dexametasona, metilprednisolona,
ciclosporina A, sirolimus, tacrolimus, domperidona, ondansetron,
eritromicina, levofloxacino, atorvastatina, lovastatina,
fexofenadina, terfenadina, amitriptilina, colchicina, debrisoquina,
itraconazol, losartan, morfina, fenitoina, rifampina, actinomicina
D, topotecan, estradiol, rapamicina o FK506.
15. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó
10, que comprende dos o más moléculas biológicamente activas.
16. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en forma liofilizada.
17. Una composición farmacéutica que comprende,
al menos, una nanopartícula que comprende un polímero
biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una
molécula biológicamente activa, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-16, y un excipiente, vehículo o
adyuvante, farmacéuticamente aceptable.
18. Composición farmacéutica según la
reivindicación 17, en una forma farmacéutica de administración por
vía oral, parenteral, tópica, subcutánea, oftálmica, rectal,
vaginal, nasal (pulmonar), o transdérmica.
19. Composición farmacéutica según la
reivindicación 17, en forma liofilizada.
20. Un procedimiento para la producción de
nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones
1-16 que comprende la etapa de incubar
simultáneamente dicho polímero biodegradable y un complejo
(ciclodextrina o derivado de la misma):(molécula biológicamente
activa) (complejo [CD:MBA]), en un disolvente orgánico, antes de
proceder a la desolvatación de dicho polímero biodegradable con una
solución hidroalcohólica; o, alternativamente, la etapa de incubar
nanopartículas de dicho polímero biodegradable con una solución
acuosa que comprende dicho complejo [CD:MBA].
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicho complejo [CD:MBA] se añade a una disolución que
comprende dicho polímero biodegradable en un disolvente
orgánico.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 20 ó 21, en el que la concentración de dicho
polímero biodegradable está comprendida entre 0,001 y 10% p/v y la
concentración de dicho complejo [CD:MBA] entre 0,001 y 5% p/v.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, en el que la relación entre el complejo
[CD:MBA]:polímero biodegradable está comprendida entre 1:1 y 1:20
en peso.
24. Procedimiento según la reivindicación 20 ó
21, en el que la relación fase orgánica/solución hidroalcohólica
está comprendida entre 1:1-10 en volumen.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 24, que comprende, además, la eliminación de
los disolventes orgánicos y/o la purificación de las nanopartículas
obtenidas.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 25, que comprende, además, liofilizar,
opcionalmente en presencia de un agente crioprotector, las
nanopartículas obtenidas.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 23, en el que dicho polímero biodegradable es
el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA),
preferentemente con un peso molecular comprendido entre 100 y 2.400
kDa.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 23, en el que dicha ciclodextrina se
selecciona entre 3-ciclodextrina,
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina,
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
y sus mezclas.
29. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicha molécula biológicamente activa es un fármaco, un
antígeno o un alergeno.
30. Procedimiento según la reivindicación 20 ó
29, en el que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia
hidrófoba.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en
el que dicha molécula biológicamente activa es albendazol,
mebendazol, praziquantel, clotrimazol, itraconazol, sulfametiazol,
gentamicina, griseofulvina, digoxina, camptotecina, metotrexato,
docetaxel, fluorouracilo, paclitaxel, tacrolimus, ciclosporina,
cortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, o
triamcinolona.
32. Procedimiento según la reivindicación 20 ó
29, en el que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia
sustrato de la enzima glicoproteína-P.
33. Procedimiento según la reivindicación 32, en
el que dicha molécula biológicamente activa es docetaxel,
etoposido, imatinib, paclitaxel, teniposido, vinblastina,
vincristina, doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, bunitrolol,
carvedilol, celiprolol, talinolol, diltiazem, mibefradil,
verapamil, digitoxina, digoxina, quinidina, amprenavir, indinavir,
nelfinavir, saquinavir, ritonavir, dexametasona, metilprednisolona,
ciclosporina A, sirolimus, tacrolimus, domperidona, ondansetron,
eritromicina, levofloxacino, atorvastatina, lovastatina,
fexofenadina, terfenadina, amitriptilina, colchicina, debrisoquina,
itraconazol, losartan, morfina, fenitoina, rifampina, actinomicina
D, topotecan, estradiol, rapamicina o FK506.
34. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicha molécula biológicamente activa es paclitaxel.
35. Una composición farmacéutica que comprende,
al menos, una nanopartícula que comprende un polímero
biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una
molécula biológicamente activa, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-16, y un excipiente, vehículo o
adyuvante, farmacéuticamente aceptable, en la que dicha molécula
biológicamente activa es paclitaxel.
36. Composición farmacéutica según la
reivindicación 35, en la que dicho polímero biodegradable es un
copolímero de PVM/MA.
37. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 35 ó 36, en la que dicha ciclodextrina se
selecciona entre \beta-ciclodextrina,
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina,
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
y sus mezclas.
38. Composición farmacéutica según la
reivindicación 35, 36 ó 37, en la que dicho polímero biodegradable
es un copolímero de PVM/MA y dicha ciclodextrina se selecciona
entre \beta-ciclodextrina,
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina,
6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina
y sus mezclas.
39. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 35 a 38, en una forma farmacéutica de
administración por vía oral, parenteral, tópica, subcutánea,
oftálmica, rectal, vaginal, nasal (pulmonar), o transdérmica.
40. Composición farmacéutica según la
reivindicación 35 a 38, en forma liofilizada.
41. Composición farmacéutica según la
reivindicación 38, en la que dicha nanopartícula comprende:
42. Composición farmacéutica según la
reivindicación 38, en la que dicha nanopartícula comprende:
43. Composición farmacéutica según la
reivindicación 38, en la que dicha nanopartícula comprende:
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