CN102579402B

CN102579402B - 一种负载紫杉醇的囊泡的制备方法

Info

Publication number: CN102579402B
Application number: CN 201210082143
Authority: CN
Inventors: 邢鹏遥; 孙涛; 郝爱友
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: CN102579402A

Abstract

本发明公开了一种负载紫杉醇的囊泡的制备方法，是由β-环糊精为原料经三步反应合成出环糊精蒽醌衍生物单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精，并由该化合物在水溶液中自组装形成囊泡；然后将紫杉醇与环糊精蒽醌衍生物囊泡复合形成囊泡负载的紫杉醇制剂。本发明方法获得的负载紫杉醇的囊泡水溶液对紫杉醇起到增溶，缓释，尤其是提高抗癌效果的作用，并且可以该体系中的环糊精蒽醌衍生物可将癌细胞全部荧光染色，为抗癌药紫杉醇试用于临床提供了一条新的可实施的有效途径。

Description

一种负载紫杉醇的囊泡的制备方法

技术领域

本发明涉及一种负载紫杉醇的囊泡的制备方法。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)结构式如下：

其是1963年美国化学家瓦尼(M.C.Wani)和沃尔(Monre E.Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉(Pacific Yew)树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克(Duke)大学的化学教授姆克法尔(Andre T.McPhail)合作，通过X-射线分析确定了该活性成份的化学结构——即一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇(taxol)。

紫杉醇具有良好的抗癌活性，是第三代抗肿瘤药物。它对有丝分裂纺锤体具有毒性并且是有较强的细胞抑制性。紫杉醇具有很大的应用价值和经济效益。但它的广泛应用存在明显的缺陷：紫杉醇在水中的溶解度非常低(0.25μg/ml)，使用中需要加入助溶剂，但是助溶剂有很大的副作用，并且紫杉醇是非常复杂的天然化合物，前药合成难度很大。作为一种优秀的广谱抗癌药物，紫杉醇的应用受到极大限制。这是由于紫杉醇是一种疏水性很强的分子。目前临床上应用紫杉醇的途径是把紫杉醇溶解到乙醇与蓖麻油1∶1的混合溶液中，通过静脉注射到体内。由于血液是亲水环境，在循环过程中紫杉醇容易在血管内析出来阻塞血管，到不了癌细胞聚集处，造成对机体的伤害且效率较低。

目前对紫杉醇增溶和运输的研究已有所开展，并取得了一定的成果，比如说利用无机物(主要包括铁系的氧化物)纳米颗粒来对紫杉醇进行包裹和运输。但是不可否认的是，仍然存在材料制备麻烦和效率不高等问题。因此，建立一种对机体友好、制备简便和高效率的输运体系是目前紫杉醇临床应用急需突破的课题。

环糊精(cyclodextrin，简称CD)是由D型吡喃葡萄糖单元组成的大环分子，是一种广为人们所知的生物相容性的材料。蒽醌化合物，具有低毒性，在生活中广泛的用于染料制备。因此，环糊精蒽醌衍生物作为β-环糊精和喹啉偶联的化合物，可以作为一种安全低毒的载药体系。此外，由于蒽醌具有良好的荧光性能，在细胞吞噬掉含有蒽醌基团的自组装体后会在其内部产生较强的荧光现象。如果自组装体上负载有药物，我们就可以通过荧光显微镜来观测哪些细胞被“治疗”而哪些细胞未被“治疗”。这在正常细胞与癌变细胞的区别治疗上将有着广阔应用。癌细胞有着非常强的分裂增生能力，体内少量的癌细胞即存在巨大的转移和增殖危险，因此，对全部癌细胞进行彻底杀灭是非常有必要的。

囊泡(vesicle)作为一种重要的自组装纳米结构，是由一些特殊的分子构成的由一个双层膜或多层膜围起来的一种纳米空心球。近年来越来越多的在药物和基因传输，纳米反应器，细胞膜表面修饰等方面应用。基于环糊精的囊泡具有同时结合双层膜和主体大环分子的特性，环糊精分子在构成囊泡的同时能起到独立作用的主体分子识别作用。将紫杉醇负载到超分子囊泡体系上，为目前尚存在应用缺陷的紫杉醇提供了一个新的可实施的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种水溶性抗癌药物新制剂——负载紫杉醇的囊泡的制备方法。

本发明的技术方案是：由β-环糊精三步反应合成出环糊精蒽醌衍生物单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精，并由该化合物在水溶液中自组装形成囊泡；然后将紫杉醇与环糊精蒽醌衍生物囊泡复合形成囊泡负载的紫杉醇制剂。

本发明所述负载紫杉醇的囊泡的制备方法，步骤是：

1)室温下将单[6-(2-胺乙基氨基)-6-脱氧]-β-环糊精加入到二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌至溶解，再加入所述β-环糊精摩尔数1.2～1.5倍量的1-硝基蒽醌，升温至90-140℃反应2-8小时，然后把反应物浸没于丙酮中，抽滤，收集沉淀，即得环糊精蒽醌衍生物粗品单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精；

2)将上述环糊精蒽醌衍生物粗品溶于水，使用凝胶色谱柱分离纯化，得到纯品单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精；

3)将步骤2)的产物按0.1-0.5g∶100mL的比例溶解到三蒸水中，然后超声10-60分钟，得到环糊精蒽醌衍生物囊泡溶液；

4)将紫杉醇按1-5mg∶0.5mL的比例溶于甲醇或乙醇中，搅拌至溶解，然后将紫杉醇甲醇或乙醇溶液在搅拌下滴入步骤3)制得的环糊精蒽醌衍生物囊泡溶液中，25℃下超声平衡10-60分钟，得到负载紫杉醇的囊泡溶液。

上述负载紫杉醇的囊泡的制备方法中：所述负载紫杉醇的囊泡溶液体系中环糊精蒽醌衍生物与紫杉醇包合摩尔比为2∶1。

上述负载紫杉醇的囊泡的制备方法中：所述负载紫杉醇的囊泡溶液体系中囊泡直径平均为340±20nm。

上述负载紫杉醇的囊泡的制备方法中：步骤1)所述反应温度优选110℃，反应时间优选5小时。

上述负载紫杉醇的囊泡的制备方法中：步骤2)所述凝胶色谱柱洗脱剂为异丙醇、蒸馏水与30％氨水，其体积比为8～10∶5～2∶1。

上述负载紫杉醇的囊泡的制备方法中：步骤3)所述纯品单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精优选按0.2g∶100mL的比例溶解到三蒸水中，然后超声30分钟。

上述负载紫杉醇的囊泡的制备方法中：步骤4)所述紫杉醇优选按2mg∶0.5mL的比例溶于甲醇或乙醇中。

上述负载紫杉醇的囊泡的制备方法中：步骤4)所述超声平衡时间优选为20分钟。

上述环糊精蒽醌衍生物合成的方程式如下：

实验证实，本发明制备的负载紫杉醇后的囊泡在20℃时至少可以保持稳定一个月。并且能使紫杉醇在水溶液中的浓度达到0.05mg/ml，在原有溶解度0.25μg/ml的基础上提升了200倍。药理实验显示：负载紫杉醇的囊泡对癌细胞的细胞毒性得到很大的提升，相对紫杉醇来说和囊泡复配的紫杉醇对人类的肝癌细胞HepG2有更大的细胞毒性和抑制分裂的作用。

癌细胞所处的环境为水体系，本发明环糊精蒽醌衍生物囊泡体系也是水体系，因此不存在相变问题，而目前临床上紫杉醇的给药剂型是脂溶性溶剂，溶于有机溶剂的紫杉醇一旦进人体中则不可避免的会出现紫杉醇固体析出现象，大幅度影响其的有效浓度。有资料研究表明，大小在几百纳米左右的颗粒容易被细胞所吞噬，因此负载在囊泡体系上的紫衫醇更容易进入到癌细胞内部。不可忽略的一点是，一般来说环糊精衍生物对其包结的客体分子都有一定的缓释作用，这就在一定程度上避免了紫杉醇药物的迅速释放和消耗，从另一方面提高了药物的持久杀灭性。因此，本发明所述方法制备的囊泡体系可以很好的增溶、负载紫杉醇分子，并且可以大幅度提高其药效。

本发明所得的环糊精衍生物及其在水相中自组装形成的囊泡及负载过紫杉醇的囊泡经过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、X射线粉末衍射(XRD)、傅里叶变换红外波谱仪(FT-IR)等手段也进一步得到了证明，结果见附图。

本发明负载紫杉醇的囊泡对癌细胞的抑制作用经过细胞稳定性试验和细胞凋亡的膜联蛋白V/PI测试也得到了证明。

本发明环糊精蒽醌衍生物在水溶液自组装形成的囊泡作为一种新型的水相低毒药物载体，使紫杉醇对癌细胞的抑制杀伤能力得到显著提升，并提高了紫杉醇的水溶性。进一步的负载癌药紫杉醇的囊泡溶液可对紫杉醇起到增溶缓释作用和增强对癌细胞的抑制分裂增殖的作用，进而增强疗效，为抗癌药紫杉醇试用于临床提供了一条新的可实施的有效途径。

附图说明

图1X射线粉末衍射(XRD)谱图。

其中，1：环糊精蒽醌衍生物，2：单[6-(2-胺乙基氨基)-6-脱氧]-β-环糊精，3：1-硝基蒽醌与单[6-(2-胺乙基氨基)-6-脱氧]-β-环糊精的物理混合物；1-硝基蒽醌的XRD谱图。

图2透射电子显微镜(TEM)图像照片。

其中，a：环糊精蒽醌衍生物在水相中的TEM图像；b：环糊精蒽醌衍生物水溶液的EFM图像；c和d为环糊精蒽醌衍生物的SEM图像。

图3负载紫杉醇的囊泡的TEM(a)和SEM(b)的图像。

图4图1所述的1，2，3和1-硝基蒽醌的FT-IR谱图对照。

图5紫杉醇和负载紫杉醇的囊泡对人的肝癌细胞在不同浓度下抑制能力的测试。

具体实施方式

实施例1：单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精的合成。

1)室温下将2.35g(2mmol)单[6-(2-胺乙基氨基)-6-脱氧]-β-环糊精加入到10ml无水二甲基甲酰胺(DMF)中，然后把0.61g(2.4mmol)1-硝基蒽醌加入到上述溶液；在搅拌的下，混合液在110℃下反应5小时，并用薄层色谱检查反应进度；反应完成后冷却，加入25ml丙酮；抽滤，收集沉淀(沉淀用丙酮洗涤3次)，即得环糊精蒽醌衍生物粗品单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精；

2)将上述环糊精蒽醌衍生物粗品溶于水，使用凝胶色谱柱分离纯化(凝胶色谱柱洗脱剂为异丙醇、蒸馏水与30％氨水，其体积比为8∶3∶1)，得到纯品单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精；

上述产品量重489mg，产率18％，外观为红色粉末，Rf＝0.6。

表征数据如下：

¹H NMR(300MHz，D₂O，300K，TMS，δppm)：8.201-8.073(m，2H，H-6’H-7’)，8.000-7.946(m，2H，H-5’H-8’)，7.760(t，1H，H-3’)，7.253-7.223(m，2H，H-2’H-4’)，4.967-4.924(m，7H，H-1)，3.935-3.479(m，43H，H-2 to H-6)，1.074-1.054(d，4H，(CH2)2).FT-IR(KBr plate，υcm-1)：3408.56(vs，br，υOH)，2930.18(s，υCH2)，1675.32(m，δNH)，1056.14(s，δCH).ESI-MS calcd.for C62H90N2O36H+m/z1383.47，found m/z 1383.26.Anal.Calcd.for C62H90N2O36：C，50.36；H，5.98；N，2.03.Found：C，50.81；H，5.39；N，1.97。

实施例2：环糊精蒽醌衍生物在水相中自组装囊泡的制备。

在300k温度下向100ml三蒸水中加入0.138g环糊精蒽醌衍生物，溶解后得到10^-3mol/L的蒽醌衍生物溶液，然后超声30分钟，得到环糊精蒽醌衍生物囊泡溶液。

实施例3：将紫杉醇负载到环糊精蒽醌衍生物上制成负载紫杉醇的囊泡。

将2.135mg(0.0025mmol)紫杉醇溶解在0.5ml甲醇中，然后将紫杉醇的甲醇溶液逐滴加入实施例2制备好的囊泡溶液(25ml，10^-4mol/L)中，并快速搅拌，在300K的温度下超声20分钟。然后将混合液小心的过滤以除去未溶解的紫杉醇，最后得到负载紫杉醇抗癌药物的囊泡溶液。

实施例4：抗癌活性测试。

为了测试负载有紫杉醇的囊泡的对癌细胞的毒性，利用人肝癌细胞系(HCC cell line)进行了测试。90孔的培养皿，每个孔含有4×10³个细胞。分别利用紫杉醇的DMSO溶液(10^-4mol/L)和负载有紫杉醇的1囊泡溶液处理(用量从12.5到100nM)，处理时间分别为12，24和48小时。利用MTT分解比色法，通过测量可吸附在OD₄₅₀的甲腊染料的酶活性测定细胞生存和增殖情况。

实验显示：负载紫杉醇的囊泡对癌细胞的细胞毒性得到很大的提升，相对紫杉醇来说和囊泡复配的紫杉醇对人类的肝癌细胞HepG2有更大的细胞毒性和抑制分裂的作用。

实施例5：癌细胞培养及凋亡测试

通过annexin V/PI双染色方法处理未固定的细胞，来区分不同时间段内凋亡坏死的细胞。通过300μL的约束缓冲液来解离粘连的细胞，然后加入Annexin V-FITC(5μL)和PI(5μL)，继续在暗处培养15分钟，用流式细胞仪进行分析，结果见图5。

Claims

1.一种负载紫杉醇的囊泡的制备方法，步骤是：

1)室温下将单[6-(2-胺乙基氨基)-6-脱氧]-β-环糊精加入到二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌至溶解，再加入所述单[6-(2-胺乙基氨基)-6-脱氧]-β-环糊精摩尔数1.2～1.5倍量的1-硝基蒽醌，升温至90-140℃反应2-8小时，然后把反应物浸没于丙酮中，抽滤，收集沉淀，即得环糊精蒽醌衍生物粗品单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精；

3)将步骤2)的产物按0.1-0.5g:100mL的比例溶解到三蒸水中，然后超声10-60分钟，得到环糊精蒽醌衍生物囊泡溶液；

4)将紫杉醇按1-5mg:0.5mL的比例溶于甲醇或乙醇中，搅拌至溶解，然后将紫杉醇甲醇或乙醇溶液在搅拌下滴入步骤3)制得的环糊精蒽醌衍生物囊泡溶液中，25℃下超声平衡10-60分钟，得到负载紫杉醇的囊泡溶液；

其中：步骤2）所述凝胶色谱柱洗脱剂为异丙醇、蒸馏水与30%氨水，其体积比为8:3:1。

2.根据权利要求1所述负载紫杉醇的囊泡的制备方法，其特征在于：所述负载紫杉醇的囊泡溶液体系中环糊精蒽醌衍生物与紫杉醇包合摩尔比为2:1。

3.根据权利要求1所述负载紫杉醇的囊泡的制备方法，其特征在于：所述负载紫杉醇的囊泡溶液体系中囊泡直径平均为340±20nm。

4.根据权利要求1所述负载紫杉醇的囊泡的制备方法，其特征在于：步骤1）所述反应温度是110℃，反应时间是5小时。

5.根据权利要求1所述负载紫杉醇的囊泡的制备方法，其特征在于：步骤3）所述纯品单[6-脱氧-N-乙基氨基-(N’-1-蒽醌)]-β-环糊精按0.2g:100mL的比例溶解到三蒸水中，然后超声30分钟。

6.根据权利要求1所述负载紫杉醇的囊泡的制备方法，其特征在于：步骤4）所述紫杉醇按2mg:0.5mL的比例溶于甲醇或乙醇中。

7.根据权利要求1所述负载紫杉醇的囊泡的制备方法，其特征在于：步骤4）所述超声平衡时间为20分钟。