CN104666247A

CN104666247A - 肝素修饰的可断键阿霉素脂质体制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN104666247A
Application number: CN201510055455.8A
Authority: CN
Inventors: 柯学; 韩苗苗; 杨淼; 张强
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2015-06-03

Abstract

本发明公开了一种肝素修饰的可断键阿霉素脂质体制剂及其制备方法。所述的阿霉素脂质体包含大豆卵磷脂、胆固醇、十八胺、阿霉素和肝素修饰材料，所述的肝素是通过二硫键修饰在阿霉素脂质体表面。薄膜分散法制备的肝素修饰的可断键阿霉素脂质体，当脂质体到达肿瘤细胞后，肿瘤细胞内高度表达的谷胱甘肽会触发脂质体的二硫键断裂，脱去外层的肝素，更好地释放抗肿瘤药物，并发挥肝素抑制肿瘤转移的作用。

Description

肝素修饰的可断键阿霉素脂质体制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种肝素修饰的可断键阿霉素脂质体(Hep-S-S-DOX-Lip)制剂，本发明还公开了这种Hep-S-S-DOX-Lip制剂的制备方法。

背景技术

肝素(heparin，Hep)是一种酸性的粘多糖，在临床上广泛用于抗凝血和抗血栓。近年来，人们在辅助使用肝素治疗和预防癌症并发的静脉血栓时，发现肝素可以抑制肿瘤转移，延长恶性肿瘤患者的寿命。因此，国内外对肝素抗转移机制进行了大量的基础和临床研究。研究结果表明，肝素的抗肿瘤转移作用涉及到肿瘤形成与生长的各个环节。肝素促进组织因子旁路途径抑制物的释放从而抑制肿瘤血管的新生。肝素可以抑制肝素酶的活性，因此干预肿瘤细胞的侵袭和转移。

相对于开发昂贵的抗肿瘤转移的药物，科学家们一直致力于应用纳米载体治疗肿瘤转移。但将刺激响应型纳米药物载体用于转移瘤的研究报道还很少。该载体是指在体循环时维持原形，到达肿瘤位点时，肿瘤的特有环境将刺激载体发生转变，促进药物在肿瘤部位的释放，进一步提高载体的靶向性和有效性。其中，利用二硫键实现纳米载体在肿瘤细胞内的触发表现出广泛的应用前景。二硫键在体内血液循环过程中可长期稳定存在，但在富含还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)的环境中会发生断键反应，而GSH在肿瘤细胞内的浓度(2～8mmol/L)要比其在血浆中的浓度(1～2μmol/L)高1000倍以上，因此，若通过二硫键负载药物，则可以利用这种浓度差实现药物在肿瘤细胞内的控制释放。

本发明选择的模型药物为阿霉素(Doxorubicin，DOX)。为橙红色结晶粉末，别名多柔比星、羟柔红霉素、14-羟正定霉素，熔点204-205℃，分子量为579.98。其结构中带有羟基，呈弱碱性。阿霉素作为经典的化疗药物，抗肿瘤机制明确，主要是抑制RNA和DNA的合成。1974年即在美国获准临床应用，用于治疗各种恶性肿瘤，如乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、神经细胞瘤等。注射后广泛分布于心、肝、脾、肺、肾中，在血浆中消失迅速，且其不良反应较多，最严重的是剂量依赖性心脏毒性和神经毒性，不仅影响了患者的生存质量，而且使阿霉素的应用受到限制，这也一直是化学结构改造和新剂型研发工作的焦点。

本发明是在构建阿霉素脂质体(DOX-Lip)的基础上，通过共价键结合的方式将肝素修饰材料修饰在脂质体表面。本发明用肝素修饰阿霉素脂质体，发现具有抗肿瘤细胞转移和生长的作用。

发明内容

本发明的目的是制备肝素修饰的可断键阿霉素脂质体(Hep-S-S-DOX-Lip)，延长阿霉素的体内半衰期，提高阿霉素的生物利用度，并发挥肝素抗肿瘤转移的作用。

本发明的目的是通过如下措施来达到：

本发明Hep-S-S-DOX-Lip制剂，含下列组分及重量比：

阿霉素 1

肝素修饰材料 1～4

大豆卵磷脂 10～80

胆固醇 1～8

十八胺 1～4

本发明中肝素修饰材料(Hep-DTSP)的制备方法如下：

利用乙二胺的两端氨基，通过聚合物末端反应，将肝素的羧基和3，3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DTSP)的酯基桥接，获得二硫键修饰的肝素(Hep-DTSP)。

优选地，称取一定量的Hep溶于pH 7.2的PBS溶液中，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，再缓慢滴加乙二胺，室温搅拌反应。透析法除去未反应物质。将透析液冻干得白色粉末。经将白色粉末溶于水中，3，3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DTSP)溶于二甲基甲酰胺(DMF)，将DTSP的DMF溶液缓慢滴加到水溶液中，然后滴加三乙胺室温反应，透析除去未反应物质。旋转蒸发除去溶剂，当溶剂剩余少量时，加乙醇沉淀产物，离心弃上清，将沉淀真空干燥，得白色固体。经¹H NMR鉴定为目标产物Hep-DTSP。

本发明采用薄膜分散法，制备步骤如下：

a.将处方量的大豆卵磷脂、胆固醇、十八胺溶于三氯甲烷中；

b.在水浴30℃～40℃条件下于旋转蒸发仪上旋蒸去除三氯甲烷；待有机溶剂挥干后，继续旋蒸2h；

c.加入PBS缓冲溶液，在水浴30℃～40℃条件下水合1h形成白色的分散乳液；

d.将步骤c中的乳液用探头超声仪进行超声分散，即得空白脂质体；

e.在水浴50℃～60℃条件下，将步骤d得到空白脂质体与阿霉素溶液孵育30min-60min，即得阿霉素脂质体(DOX-Lip)；

f.将步骤e中得到的阿霉素脂质体混悬液与二硫键修饰的肝素在碱性条件下反应，得肝素修饰的阿霉素脂质体。

本发明中，阿霉素与磷脂、胆固醇与磷脂的配比直接影响到脂质体的质量。

当固定处方和制备过程中的其他参数不变，仅考察药物和磷脂的比例时，阿霉素脂质体的平均粒径和包封率如表1所示。

表1.药物和磷脂的比例对脂质体粒径和包封率的影响

从表1中可以看出当药脂比为1∶5时，包封率能够达不到90％；而随着磷脂含量增加药脂比为1∶10～30，包封率提高，达到95％以上，且粒径符合要求，因此本发明中药物和磷脂的比例优先选为1∶10～30。

当固定处方和制备过程中的其他参数不变，仅考察药物和磷脂的比例时，阿霉素脂质体的平均粒径和包封率如表2所示。

表2：胆固醇和磷脂的比例对脂质体粒径和包封率的影响

从表2中可以看出，胆固醇和磷脂的质量比对包封率影响较小，粒径和包封率都较好，在胆固醇和磷脂比为1∶12～15时包封率最高。

一、体外细胞毒性试验

采用MTT法考察空白脂质体的安全性和载药脂质体对B16F10细胞的毒性。取对数生长期的B16F10细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，用RPMI1640完全培养基于37℃，5％CO₂条件的培养箱中培养细胞16h。之后移去培养基，用PBS清洗两次。用不完全培养基将阿霉素水溶液(DOX-sol)、阿霉素脂质体(DOX-Lip)、Hep-S-S-DOX-Lip稀释至DOX浓度为0.005～3.397μg/mL。在细胞中加入各浓度的制剂培养基后于培养箱中孵育48h后，弃去培养基，用PBS洗涤。取20μL四甲基偶氮唑蓝(MTT，5mg/mL)加入各孔内，于培养箱中孵育4h，弃去上清液，加入150μL DMSO溶解甲瓒结晶，用酶标仪于570nm测定吸光值(ODsample)。并以相同方法测定对照组(无样品)的吸光值，以空白培养基为对照，测定结果，记为ODcontrol。按公式计算受试细胞株存活率，并根据结果计算DOX各制剂对B16F10细胞的半数抑制浓度IC₅₀。

表3：各组制剂的IC₅₀值。

为了考察Hep-S-S-DOX-Lip的细胞毒性，我们用制剂DOX-sol、DOX-Lip作为其对照组。首先Hep修饰的和未修饰的空白脂质体对B16F10没有细胞毒性，不干扰细胞毒性试验。细胞毒性实验的结果，从表3中可以看出，细胞杀伤的效果从高到低为DOX-sol，Hep-S-S-DOX-Lip，DOX-Lip。虽然DOX-sol表现出了最好的细胞毒性，但是由于其在体内清除较快，还有心脏毒性等缺点限制了它的应用。Hep-S-S-DOX-Lip的细胞杀伤效果与DOX-Lip组相比显著提高。

二.Hep-S-S-DOX-Lip在C57BL/6小鼠体内的抗肿瘤活性

通过尾部静脉给小鼠(C57BL/6)接种B16F10肿瘤细胞(3×10⁵个，100μL PBS)。每组10只小鼠。在注射肿瘤细胞之前20min，分别给每组小鼠尾静脉注射生理盐水(Saline)、肝素水溶液(Hep-sol)、DOX-sol、DOX-Lip和Hep-S-S-DOX-Lip。之后每隔三天再次尾静脉给相同的制剂，并在21天后处死小鼠。将取得的肺称重，两名观察者双盲独立计数肺表面的转移灶，结果为两次计数结果的平均值(×200)。

表4：C57BL/6小鼠的抗肿瘤活性

*P＜0.01，**P＜0.001，各组制剂与Saline作比较；＃P＜0.01，##P＜0.001，与Hep-S-S-DOX-Lip作比较。

由表4可见，相比于Saline组，Hep-sol、DOX-sol、DOX-Lip、Hep-S-S-DOX-Lip各组都能减少肺表面的转移灶数量，但抑制程度各不相同，以Hep-S-S-DOX-Lip的抑制效果最佳。DOX-sol组表现出一定的治疗效果，脂质体的包载(DOX-Lip)进一步提高了抑制作用，而Hep-S-S-DOX-Lip则更显著地抑制了转移灶的生成。但是Hep-sol却未表现出比DOX-sol更好的抑制作用，这可能是由于虽然Hep可以抑制肿瘤转移，但是Hep的体内半衰期很短，因此需要高剂量和高频率的给药以维持治疗效果。转移瘤模型中，肺的重量正比于转移灶的生成数量。各组小鼠治疗结束后肺重量的平均值为：Hep-S-S-DOX-Lip＜DOX-Lip＜DOX-sol＜Hep-sol＜Saline。说明Hep-S-S-DOX-Lip组小鼠的肺重量增长缓慢，黑色素瘤难于在次级组织器官着床生长。

本发明的优越性表现在：

本项目以肝素修饰的可断键阿霉素脂质体为目的，这一过程一方面成功的将Hep通过二硫键连接到脂质体上，避免其在体内的快速清除，另一方面也对Hep进行了化学修饰，降低了其出血风险。当Hep-S-S-DOX-Lip到达肿瘤细胞后，肿瘤细胞内高表达的GSH会触发脂质体的二硫键断裂，脱去外层的Hep，加速脂质体的降解，更好的释放DOX，来杀伤细胞，实现载体的智能化释药，提高药效。而在肿瘤形成和生长的各个部位，Hep发挥抑制肿瘤新生血管生成、抑制肝素酶等多种活性，实现Hep和DOX协同发挥抗肿瘤转移和生长的作用。

具体实施方式

实施例1

分别称取处方量的大豆卵磷脂80mg、胆固醇8mg、十八胺4mg置于茄形瓶中，加入适量三氯甲烷使之完全溶解；在水浴40℃条件下，旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜，继续减压旋蒸2h。加入300mmol/L的硫酸铵的PBS溶液2mL洗膜，在水浴40℃下水合1h，形成脂质体初乳液。探头超声(200W，100次)，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以PBS溶液为介质透析3h后，加入阿霉素溶液(1mg/mL)，60℃水浴孵育60min，即得DOX-Lip。取DOX-Lip溶液与等体积的Hep-DTSP(4mg/mL)，加入三乙胺反应30min。即得Hep-S-S-DOX-Lip混悬液。

实施例2

分别称取处方量的大豆卵磷脂10mg、胆固醇1mg、十八胺1mg置于茄形瓶中，加入适量三氯甲烷使之完全溶解；在水浴30℃条件下，旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜，继续减压旋蒸2h。加入300mmol/L的硫酸铵的PBS溶液2mL洗膜，在水浴30℃下水合1h，形成脂质体初乳液。探头超声(200W，100次)，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以PBS溶液为介质透析3h后，加入阿霉素溶液(1mg/mL)，50℃水浴孵育30min，即得DOX-Lip。取DOX-Lip溶液与等体积的Hep-DTSP(1mg/mL)，加入三乙胺反应30min。即得Hep-S-S-DOX-Lip混悬液。

实施例3

分别称取处方量的大豆卵磷脂40mg、胆固醇4mg、十八胺2mg置于茄形瓶中，加入适量三氯甲烷使之完全溶解；在水浴37℃条件下，旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜，继续减压旋蒸2h。加入300mmol/L的硫酸铵的PBS溶液2mL洗膜，在水浴37℃下水合1h，形成脂质体初乳液。探头超声(200W，100次)，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以PBS溶液为介质透析3h后，加入阿霉素溶液(1mg/mL)，55℃水浴孵育45min，即得DOX-Lip。取DOX-Lip溶液与等体积的Hep-DTSP(2mg/mL)，加入三乙胺反应30min。即得Hep-S-S-DOX-Lip混悬液。

Claims

1.一种肝素修饰的可断键阿霉素脂质体，其特征在于，主要是含下列组分及重量比：

。

2.根据权利要求1所述的肝素修饰的可断键阿霉素脂质体，其特征在于，所述肝素修饰材料的合成方法为：利用乙二胺的两端氨基，通过聚合物末端反应，将肝素的羧基和3，3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DTSP)的酯基桥接，获得二硫键修饰的肝素(Hep-DTSP)。

3.权利要求1或2所述的阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

c.加入硫酸铵溶液，在水浴30℃～40℃条件下水合1h形成白色的分散乳液；

e.在水浴50℃～60℃条件下，将步骤d得到空白脂质体与阿霉素溶液孵育30min-60min，即得阿霉素脂质体；

f.将步骤e中得到的阿霉素脂质体混悬液与二硫键修饰的肝素在碱性条件下反应，即得肝素修饰的可断键阿霉素脂质体。