CN115645546B - 一种细胞膜修饰阿霉素脂质体的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞膜修饰阿霉素脂质体的制备及其应用，属于生物医药技术领域。本发明先采用硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体，然后将小鼠白血病细胞C1498的细胞膜与阿霉素脂质体结合，制备得到细胞膜修饰的阿霉素脂质体。本发明将小鼠白血病细胞C1498的细胞膜与阿霉素脂质体结合，制备具有骨靶向作用的阿霉素脂质体，可实现通过血液将药物运送到骨髓部位，提高骨髓部位药物浓度，杀伤骨髓部位残存的肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种细胞膜修饰阿霉素脂质体的制备及其应用。
背景技术
急性髓细胞性白血病(AML)是由造血干细胞或造血组细胞变异引起的血液肿瘤疾病，常伴随贫血、中性粒细胞减少、血小板减少等症状，发病机制复杂，易复发，目前认为骨髓内残存的白血病干细胞是AML复发的主要原因。化疗是目前临床治疗AML最常用的方法之一，临床数据证明约有70％-80％的60岁以下患者可通过蒽环类药物联合化疗法完全缓解病情，尽管化疗对肿瘤生长抑制有重要意义，但传统化疗方案靶向性较差，给药后化疗药物在全身各部位均有分布，会损伤正常细胞，副作用较大。而且骨髓部位的血液灌注量远低于其他组织，化疗药物难以到达该部位，对骨髓内肿瘤细胞的杀伤作用非常有限，这些细胞日后可能会造成肿瘤复发。因此骨髓靶向递药系统对AML治疗具有临床应用价值。
阿霉素是临床常用的广谱抗肿瘤药，抗瘤谱广、疗效好，具有强效的抗癌活性，但是传统化疗方案靶向性较差，给药后在全身各部位均有分布，会损伤正常细胞，副作用较大，除骨髓抑制、胃肠道毒性及脱发外，还具有严重的剂量依赖性心脏毒性。而且骨髓部位的血液灌注量远低于其他组织，化疗药物难以到达该部位，因此对骨髓内肿瘤细胞的杀伤作用非常有限，这些细胞日后可能会造成肿瘤复发。
Hu等人(Conjugation of haematopoietic stem cells and plateletsdecorated with anti-PD-1 antibodies augments anti-leukaemia efficacy)公开的文献涉及了一种造血干细胞-血小板联合递药系统，该递药系统利用造血干细胞的骨髓归巢作用提高了骨髓部位药物的浓度、增强疗效。然而造血干细胞来源有限，价格较为昂贵且体外培养较为困难，其应用受到了一定限制。
Hu等人(Erythrocyte membrane-camouflaged polymeric nanoparticles as abiomi-metic delivery platform)公开的文献涉及了一种红细胞膜修饰的纳米粒，研究表明，红细胞膜修饰的纳米粒在小鼠体内有更长的半衰期，可在循环系统中滞留72h以上，与只修饰PEG的纳米粒相比，体内循环时间增加了23.8h。但是红细胞膜表面缺乏某些细胞粘附分子，肿瘤靶向性差。
专利CN114224839A公开了一种细胞膜修饰脂质体的方法，该专利设计一步完成脂质体的制备和细胞膜修饰，但脂质体粒径过大，约150-400nm，对肿瘤组织的靶向性较差。脂质体粒径过大也会影响脂质体储存过程及血浆稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞膜修饰阿霉素脂质体的制备及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种细胞膜修饰阿霉素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，使用有机溶剂溶解脂质材料，旋转蒸发除去有机溶剂，得到均匀油膜，加入硫酸铵溶液进行水化，超声破碎，过滤除杂后得到空白脂质体；
步骤2，将阿霉素溶液与步骤1得到的空白脂质体混合后进行孵育，得到阿霉素脂质体；
步骤3，将步骤2得到的阿霉素脂质体与细胞膜混合后共进出，得到细胞膜修饰阿霉素脂质体。
进一步地，步骤1中脂质材料为磷脂与胆固醇的混合物，磷脂和胆固醇的质量比为4-8：1，优选为6：1。
进一步地，步骤1中硫酸铵梯度法中硫酸铵浓度为150-500mmol/L，优选为300mmol/L。
进一步地，步骤2中阿霉素和磷脂的质量比为1：20-60，优选为1：40。
进一步地，步骤2中孵育温度为60-85℃，孵育时间为20-40min。
进一步地，步骤3中细胞膜为白血病细胞膜。
进一步地，步骤3中细胞膜与磷脂的质量比为1：1-3。
采用上述方法制备得到的细胞膜修饰阿霉素脂质体在制备急性髓细胞性白血病治疗药物中的应用。
本发明将小鼠白血病细胞C1498的细胞膜与阿霉素脂质体结合，制备具有骨靶向作用的细胞膜修饰的阿霉素脂质体。可实现通过血液将药物运送到骨髓部位，提高骨髓部位药物浓度，杀伤骨髓部位残存的肿瘤细胞。
附图说明
图1为CM/DOX-Lip的透射电镜图。
图2为游离DOX、DOX-Lip、CM/DOX-Lip在PBS溶液(pH7.4)的释放曲线。
图3为在37℃条件下，DOX-Lip、CM/DOX-Lip在10％FPS和PBS(pH7.4)的粒径变化。
图4为DOX-Lip(A)和CM/DOX-Lip(B)在4℃条件下粒径变化。
图5为游离DOX、DOX-Lip、CM/DOX-Lip对C1498细胞毒性研究结果。
图6为游离DOX、DOX-Lip、CM/DOX-Lip在各组织的分布荧光图。
图7为生理盐水组(A)、游离DOX组(B)、DOX-Lip组(C)、CM/DOX-Lip组(D)的血液涂片染色结果。箭头所示为白细胞。
具体实施方式
本发明采用硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体，然后将小鼠白血病细胞C1498的细胞膜与阿霉素脂质体结合，制备得到细胞膜修饰的阿霉素脂质体。
一方面，使用硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体，采用单因素法考察处方和制备工艺(磷脂与胆固醇比例为4-8：1、磷脂与药物比例为20-60：1、超声时间为20-40分钟、超声功率为200-400W、硫酸铵浓度为150-500mmol/L、孵育时间为20-40min、孵育温度为60-85℃)。单因素考察得到的最佳处方工艺为：磷脂、胆固醇和阿霉素(Dox)比例为120：20：3(w/w/w)，超声时间为30min，超声功率为300W，硫酸铵浓度为300mmol/L，孵育时间为30min，孵育温度为60℃。
另一方面，物理挤出法制备CM/DOX-Lip。将DOX-Lip与细胞膜(CM)按一定比例混合均匀，利用脂质体挤出器使混合液通过孔径为400nm的聚酯碳酸酯膜，制备得到CM/DOX-Lip。单因素法考察磷脂与CM比例(质量比1-3：1)，脂质体挤出次数(2-5次)。最佳处方工艺确定为磷脂与CM比值为2：1(w/w)，脂质体挤出次数为3。
所述C1498的细胞膜采用低渗裂解法与差速离心法制备得到。首先，将细胞培养瓶中的C1498细胞在1000rpm条件下离心5min，随后弃去上清，加入PBS溶液清洗3次，离心弃去上清，并在下层细胞沉淀中加入适量低渗裂解缓冲液，在4℃环境中裂解12h，使细胞破裂。随后，利用超声细胞破碎仪在400W条件下超声10min。超声结束后，将悬液在3200rpm条件下离心5min，去除沉淀。随后将上清液在4℃、18000rpm条件下离心50min，离心完毕后，去除上清中的细胞器及细胞内含物，沉淀即为细胞膜。为方便保存，将细胞膜放入-20℃冰箱中预冻过夜，而后利用冷冻干燥机将溶液冻干，24h后得到白色细胞膜粉末，保存在4℃环境中。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
1、阿霉素脂质体(DOX-Lip)的制备
准确称取24mg大豆磷脂与4mg胆固醇置于茄形瓶中，加入适量二氯甲烷使溶解，37℃水浴条件下减压旋蒸除去有机溶剂，形成均匀油膜。加入浓度为300mmol/L硫酸铵溶液水化1h后于超声细胞破碎仪以300W功率超声30min，所得乳液依次过0.45μm与0.22μm滤膜除杂后，得到空白脂质体。将空白脂质体放入透析袋(MWCO＝3500D)中并在10％蔗糖溶液透析。向透析后的脂质体中加入3mL浓度为0.2mg/mL的DOX溶液在60℃孵育30min，即得阿霉素脂质体(DOX-Lip)。
按此处方工艺制备得到的DOX-Lip在DOX浓度为0.2mg/mL时，粒径为97.70±0.68nm，PDI值为0.259±0.017，Zeta电位值为3.77±0.72mV，包封率为86.82±1.83％。DOX-Lip悬浮液呈红色，未观察到有粒子沉降聚集等现象，透射电子显微镜(TEM)图像显示脂质体表面光滑，呈均一球体，粒径分布较均匀。DOX-Lip在10％血清及PBS溶液中能保持粒径稳定24h以上，并且可在4℃环境中储存较长时间。
2、细胞膜修饰的阿霉素脂质体(CM/DOX-Lip)制备
采用物理挤出法，磷脂与细胞膜(CM)以2：1(w/w)比例混合制备细胞膜修饰的阿霉素脂质体(CM/DOX-Lip)。将DOX-Lip与CM按比例混合均匀后通过400nm的聚酯碳酸酯膜，挤出次数设置为3次，制备得到CM/DOX-Lip。
当DOX浓度为0.2mg/mL时CM/DOX-Lip粒径为109.81±1.18nm，PDI值为0.277±0.010，Zeta电位值为-21.63±3.70mV，包封率为81.62±2.91％。
如图1所示，在DOX-Lip表面成功包覆了细胞膜。
试验例1
体外释放考察
利用透析法考察DOX溶液(500μg/mL)、实施例1制得的DOX-Lip和CM/DOX-Lip的体外释放。取各制剂1mL，分别置于透析袋(MWCO＝3500D)中，加入30mL PBS缓冲液(pH7.4)作为释放介质，并置于37℃以100rpm转速震荡，在设定好的时间点取2mL释放介质，并补充等体积新鲜预热释放介质。
如图2所示，CM/DOX-Lip与DOX-Lip释放行为相似，细胞膜的修饰不影响脂质体释放药物。
试验例2
PBS及血清稳定性考察
取实施例1制得的DOX-Lip和CM/DOX-Lip，分别与胎牛血清按体积比9：1混合，置于气浴恒温震荡仪中，在37℃下孵育24h，并记录0、6、12、24h脂质体的粒径变化，评价脂质体的血清稳定性。
取实施例1制得的DOX-Lip和CM/DOX-Lip，分布用PBS缓冲液稀释，置于气浴恒温震荡仪中，在37℃下孵育24h，并记录0、6、12、24h脂质体的粒径变化，评价脂质体稳定性。
如图3所示，在10％胎牛血清(10％ FPS)中放置24h后，DOX-Lip粒径从95.61±1.98nm增加至116.45±1.82nm。CM/DOX-Lip粒径从118.56±2.07nm增加至126.93±7.67nm。DOX-Lip和CM/DOX-Lip粒径变化均较小，血清稳定性较好。
在PBS溶液中放置24h后，DOX-Lip粒径从97.14±0.23nm增加至125.24±7.19nm；CM/DOX-Lip PBS粒径从117.07±2.20nm增加至126.03±3.58nm；DOX-Lip和CM/DOX-Lip粒径变化均较小，稳定性较好。
试验例3
长期储存稳定性考察
取实施例1制得的DOX-Lip和CM/DOX-Lip用PBS缓冲液稀释，将溶液置于4℃条件中，分别在第0、1、5、10和15天测定DOX-Lip粒径，评价制剂的长期储存稳定性。
如图4所示，DOX-Lip在4℃条件下保存15天后，粒径从116.15±2.25nm增加至148.18±5.56nm。CM/DOX-Lip在4℃条件下保存15天后，粒径从106.65±2.36nm增加至140.19±7.33nm。DOX-Lip和CM/DOX-Lip粒径变化幅度均较小，粒径都在可静脉注射的范围内，且溶液未见明显沉淀，DOX-Lip和CM/DOX-Lip在低温条件下具有较好的稳定性。
试验例4
对C1498细胞的体外毒性
取实施例1制得的DOX-Lip和CM/DOX-Lip以及Dox溶液(8mg/mL)，采用MTT法考察其对C1498细胞的毒性。取处于对数生长期的C1498细胞，用移液枪轻轻吹打培养瓶底面使细胞完全脱落，将分散均匀的细胞在1000rpm条件下离心5min后弃去上清，加入DMEM完全培养基调整细胞浓度为1×106个/mL，并在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，随后将96孔细胞培养板放入细胞培养箱(培养条件为：37℃，5％CO2与饱和湿度条件)中孵育24h。孵育完成后，弃去上层培养基，加入一系列用不含血清的DMEM培养基稀释的不同浓度DOX溶液、DOX-Lip与CM/DOX-Lip，每组浓度设5个复孔，继续在细胞培养箱中培养。24h后弃去96孔细胞培养板中的培养基，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续在细胞培养箱中孵育4h。随后弃去培养基，每孔分别加入150μL的二甲基亚砜，避光振摇10min使MTT完全溶解。以空白培养基为对照，利用酶标仪在492nm波长处测定各组的吸光度OD，计算不同浓度DOX溶液、DOX-Lip与CM/DOX-Lip对细胞的抑制作用，并用Graphpad prism 8软件计算制剂的半数抑制浓度(IC50)。
如图5所示，DOX溶液及DOX-Lip、CM/DOX-Lip组对C1498细胞均显示出抑制作用，且具有一定的浓度依赖性。在孵育24h后，DOX溶液及DOX-Lip、CM/DOX-Lip对C1498的半数致死浓度(IC50)分别为0.72、1.11和1.04μg/mL。
试验例5
体内靶向性考察
取处于对数生长期的C1498细胞，在1000rpm条件下离心5min后弃去上清，随后加入无菌PBS溶液调整细胞悬液浓度至5×106个/mL，并将细胞悬液置于冰上保存备用。在无菌操作条件下，给C57BL/6小鼠尾静脉注射100μL C1498细胞悬液。待小鼠出现消瘦、毛发稀疏粗糙、活动减少等症状后表明C1498白血病小鼠模型造模成功。
取实施例1制得的DOX-Lip与CM/DOX-Lip以及游离DOX溶液(500μg/mL)，考察其体内分布。具体实施如下：取造模成功小鼠15只，随机分成3组，每组5只。按5mg/kg的剂量分别给每组小鼠尾静脉注射200μL游离DOX、DOX-Lip和CM/DOX-Lip。给药后12h，用水合氯醛麻醉小鼠后脱颈椎处死小鼠，在无菌条件下解剖分离小鼠心、肝、脾、肺、肾和骨等组织，并将分离好的组织用PBS清洗干净，并保存在PBS溶液中。通过小动物活体成像仪采集组织照片，采用Living Image 4.0软件对荧光数据进行半定量分析。
如图6所示，小鼠尾静脉给药12h后，游离DOX、DOX-Lip以及CM/DOX-Lip均在小鼠肝脏部位分布最多。游离DOX药物在骨部位分布较少，DOX-Lip组小鼠骨部位荧光强度较游离DOX组有所增强，CM/DOX-Lip组小鼠骨部位的荧光强度较DOX-Lip组进一步增加。
DOX-Lip组骨组织荧光强度是游离DOX组的1.54倍，CM/DOX-Lip组骨组织荧光强度是游离DOX组的1.90倍，CM/DOX-Lip组对骨组织有更强的靶向能力。具体结果如表1所示。
表1：DOX-Lip、CM/DOX-Lips与游离DOX相比的相对摄取率
与游离DOX相比，CM/DOX-Lip骨组织靶向效率(Te值)从9.19％提高到了14.85％。CM/DOX-Lip给药12h后有效提高药物在骨组织中的蓄积量，靶向性良好，具体结果如表2所示。
表2：DOX-Lip、CM/DOX-Lips、游离DOX对不同组织的靶向效率
试验例6
体内药效学考察
参照实施例6的方法造模，将造模成功小鼠随机分成对照组、游离DOX组、DOX-Lip组和CM/DOX-Lip组。对照组与实验组分别通过小鼠尾静脉注射生理盐水溶液、200μL游离DOX溶液、DOX-Lip、CM/DOX-Lip(DOX，5mg/kg)。分别于第7、10、13、16、19天给药。第22天，从实验组与对照组各取3只小鼠，用75％的乙醇对小鼠眼周毛皮消毒，固定小鼠，用润有肝素钠溶液的毛细管沿小鼠内眦穿刺，将全血收集至润有肝素钠溶液的离心管内，制备小鼠血液涂片。用Wright’s-Giemsa复合染液对小鼠血液涂片进行染色，染色后红细胞呈浅红色，白细胞细胞膜呈紫黑色、细胞核呈紫红色，并利用倒置显微镜观察血液涂片并拍照。
如图7所示。生理盐水组小鼠血液中白细胞数目最多，而治疗组小鼠体内白细胞数目较少，尤其是CM/DOX-Lip组，视野中几乎观察不到白细胞。CM/DOX-Lip能有效增强DOX的治疗作用。
Claims (1)
1.细胞膜修饰阿霉素脂质体在制备急性髓细胞性白血病治疗药物中的应用，其特征在于，所述细胞膜修饰阿霉素脂质体采用以下步骤制备：
步骤1，使用有机溶剂溶解脂质材料，旋转蒸发除去有机溶剂，得到均匀油膜，加入硫酸铵溶液进行水化，超声破碎，过滤除杂后得到空白脂质体；
所述脂质材料为磷脂与胆固醇的混合物，磷脂和胆固醇的质量比为6：1；硫酸铵溶液的浓度为300mmol/L；超声时间为30min，超声功率为300W；
步骤2，将阿霉素溶液与步骤1得到的空白脂质体混合后进行孵育，得到阿霉素脂质体；
阿霉素和磷脂的质量比为1：40；孵育温度为60℃，孵育时间为30min；
步骤3，将步骤2得到的阿霉素脂质体与细胞膜混合后共挤出，得到细胞膜修饰阿霉素脂质体；
细胞膜为白血病细胞膜，细胞膜与磷脂的质量比为1：2，挤出次数为3次。
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