CN109998999A - 一种依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂与其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂与其制备方法和应用，该依托泊苷脂质纳米混悬剂包括以下组分：药物依托泊苷、磷脂、辅助稳定剂及水溶液；其中，依托泊苷与磷脂的质量比为1：2‑30，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：3‑20。具有良好稳定性、改善的水溶性、较高的药物含量及载药量，在淋巴瘤治疗中可减小给药体积，实现高剂量给药，增强淋巴瘤治疗效果、减慢清除、延长体内作用时间并降低全身毒副作用，比如经验证可减少对肝肾的损伤。并且本发明制备工艺和方法简单可行，成本低廉，条件温和，重现性好，可控性强，适合工业化生产。

Description

一种依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂与其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂与其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

淋巴瘤是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，淋巴瘤的发病率位居所有肿瘤的第四位，死亡率居第六位。近年来虽然淋巴瘤的总体发病率有所下降，但淋巴瘤发病率和死亡率由于其亚型、患者种族、性别、年龄等因素而呈现不同的发病趋势。目前，对于部分难治性或复发性淋巴瘤患者，高剂量化疗后自体干细胞移植通常是一种标准有效的治疗手段。该疗法相比常规化疗在约30～65％的淋巴瘤患者中显示出更长时间的无进展生存期。

依托泊苷(VP16或EPEG)，是一种表鬼臼毒吡喃葡萄糖，是从鬼臼脂中分离出的木脂体类有效成分。依托泊苷在水中的溶解度较小，根据生物药剂学分类系统(BCS)，其属于BCS IV类的化疗药物，即低溶解性低渗透性的药物。依托泊苷是一种细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于晚S期或G2 期，干扰DNA拓扑异构酶II，形成一种药物-酶-DNA三者之间稳定的可裂性复合物，致使受损DNA不能修复。依托泊苷的抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有效，其临床应用主要是小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、急性白血病、恶性生殖细胞瘤，对神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、胃癌等也有一定疗效。依托泊苷化学名称为9-(4,6-O-(R)-亚乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷)-4'-去甲基表鬼臼毒素，分子式为C₂₉H₃₂O₁₃，分子量为588.56，结构式如下所示：

目前依托泊苷的上市制剂有软胶囊和注射液两种。其中胶囊剂上市商品名为威克、拉司太特、泛必治，辅料中含有聚乙二醇-400、甘油、柠檬酸等，口服每天50mg，一天一次。依托泊苷胶囊剂在临床应用中主要存在以下问题：①口服吸收的效果较差，生物利用度较低；②患者服药后个体差异较大，约为25％～74％；③软胶囊剂不适用于吞咽困难和急症患者；④具有严重的骨髓抑制和消化道毒性等。依托泊苷上市注射液辅料含有聚山梨酯-80、聚乙二醇-300、苯甲醇、柠檬酸和无水乙醇等，其规格有100mg(5mL)；500 mg(25mL)；1g(50mL)三种。依托泊苷注射液在临床应用中主要存在以下问题：①制剂中含有多种有机溶剂作为增溶剂，刺激性较大，患者注射过程中易疼痛，顺应性差；②临床应用前需要用生理盐水稀释，由于依托泊苷较差的水溶性，稀释浓度高于0.25mg/mL时药物容易沉淀析出，大剂量给药较难实现；③用药过程中易引起低血压、过敏、支气管痉挛和骨髓抑制等严重毒副作用。

2017年美国国立综合癌症网络(NCCN)发布的淋巴瘤治疗指南中，依托泊苷被推荐为淋巴瘤高剂量化疗一线治疗药物，在淋巴瘤治疗中表现出良好的治疗效果，尤其是对于部分经初期治疗后复发性或原发难治性的淋巴瘤患者，高剂量依托泊苷化疗后自体干细胞移植通常被认为是一种标准有效的治疗方法，发明人发现由于依托泊苷较高的给药剂量(1.6g/m²)，加之其较差的水溶性，从而导致注射液的给药体积较大，因此在临床淋巴瘤治疗中依托泊苷的大剂量给药通常较难实现。

发明内容

为改善现有技术中存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种依托泊苷脂质纳米混悬剂，其具有良好稳定性、改善的水溶性、较高的药物含量及载药量，在淋巴瘤治疗中可减小给药体积，实现高剂量给药，增强淋巴瘤治疗效果、减慢清除、延长体内作用时间并降低全身毒副作用，比如经验证可减少对肝肾的损伤。

本发明的目的之二在于提供一种制备上述依托泊苷脂质纳米混悬剂制备方法，该方法相较于现有方法工艺简洁、条件不苛刻，比如对pH要求宽松无需严格调控，通过该方法制备得到的依托泊苷脂质纳米混悬剂具有良好的稳定性、改善的水溶性，并且该方法能够提高制剂中的药物含量及载药量，使得制备得到的依托泊苷脂质纳米混悬剂在淋巴瘤治疗中可减小给药体积，实现高剂量给药，增强淋巴瘤治疗效果并降低全身毒副作用。

本发明的目的之三在于提供一种上述依托泊苷脂质纳米混悬剂的冻干制剂。

本发明的目的之四在于提供一种制备上述冻干制剂的方法。

本发明的目的之五在于提供一种纳米给药系统，其含有上述依托泊苷脂质纳米混悬剂或其冻干制剂。

本发明的目的之六在于提供上述依托泊苷脂质纳米混悬剂或上冻干制剂在制备依托泊苷纳米给药系统中的应用。

具体地，本发明的发明目的通过如下所述的技术方案实现：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种依托泊苷脂质纳米混悬剂，其包括以下组分：药物依托泊苷、磷脂、辅助稳定剂及水溶液；其中，依托泊苷浓度为0.5～5.0mg/mL，依托泊苷与磷脂的质量比为1：2-30，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：3-20。

在本发明的一些实施方式中，所述依托泊苷浓度为0.5～1.8mg/mL；在另一些实施方式中，该浓度进一步为为0.8～1.5mg/mL；以及，在又一些较优的实施方式中，该浓度为1～1.2mg/mL。

依托泊苷、磷脂与辅助稳定剂的用量可在本发明上述用量范围、用量比例内组合使用。

比如，在本发明的一些实施方式中，依托泊苷的浓度为0.5-1.8mg/mL，依托泊苷与磷脂的质量比为1：2-30，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1： 3-20；在另一些实施方式中，依托泊苷与磷脂的质量比为1：5-10，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：5-12.5；在又一些实施方式中，依托泊苷的浓度为0.5～1.8mg/mL，依托泊苷与磷脂的质量比为1：5-10，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：8-12.5。

现有的依托泊苷纳米混悬制剂中，为了获得较高的载药量，往往需要加入大量的依托泊苷，比如在以人血清白蛋白作为稳定剂制备依托泊苷白蛋白纳米混悬液冻干制剂的现有技术中，其依托泊苷在混悬液中的浓度往往在 2-3mg/ml，且其依托泊苷与稳定剂人血清白蛋白的质量比通常在30-100：1，即其依托泊苷大量过量于辅料，这样虽然大量减少了辅料的用量，但由此带来的依托泊苷用量的提升对提升载药量的贡献并不明显。经本发明发明人的实验验证，在本发明的技术方案下，依托泊苷在混悬剂中的浓度仅需为 0.5-1.8mg/mL，且依托泊苷无需过量于稳定剂的情况下即可实现上述需要添加大量依托泊苷时实现的载药量(8-9％)，甚至优于现有方案中的载药量。

本发明所述的磷脂可以为天然磷脂或合成磷脂；在本发明的一些实施方式中，所述磷脂可选用天然磷脂如：大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂中的一种或多种；在另一些实施方式中，所述磷脂也可选用合成磷脂如：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油酯(DPPG)、磷脂酰丝氨酸(DOPS)、(2， 3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)中的一种或多种；考虑到安全性，所述磷脂优选为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。

在本发明的一些实施方式中，所述辅助稳定剂为普朗尼克127(F127)、普朗尼克68(F68)、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)和聚乙烯吡咯烷酮K30(PVPK30)中的一种或多种，优选为TPGS。

上述辅助稳定剂均能够起到辅助稳定的作用，当采用TPGS作为辅助稳定剂时，其稳定效果相对更好。并且，TPGS结构中的PEG链能够很好的修饰在本发明的纳米粒表面，在提高稳定性的同时能够有效延长本发明所述混悬剂在体内的循环时间，减慢药物的清除，延长药物半衰期，提高了治疗效果。

较小的颗粒、较高的载药量，能够显著减少给药体积，更好地实现高剂量给药，满足临床用药需求。本发明的依托泊苷脂质纳米混悬剂粒径小且分布均匀，脂质纳米混悬剂粒子的粒径为80～100nm，平均粒径最小可接近 85nm。相较于现有技术粒径显著缩小，比如在如上文中所述的以人血清白蛋白作为稳定剂制备的依托泊苷白蛋白纳米混悬液冻干制剂的现有技术中，其制备得到的混悬液中粒子的粒径范围在150-500nm之间，平均粒径为190.2±7.3nm。

在本发明的一些实施方式中，所述水溶液可选用双蒸水、0.9％氯化钠水溶液、5％葡萄糖水溶液、含0.9％氯化钠和5％葡萄糖的注射用水、含5％葡萄糖的林格氏注射液或磷酸盐缓冲液中的任一种。

本发明的依托泊苷脂质纳米混悬剂可用于制备注射剂，包括注射液和无菌冻干粉针；无菌冻干粉针可用含0.9％氯化钠或5％葡萄糖的注射用水复溶后供临床应用。

本发明所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂粒径小且分布均匀，脂质纳米混悬剂粒子的粒径为80～100nm，平均粒径最小可接近85nm，带有微弱的负电荷，其zeta电位为-3mV～-8mV，将其制备成冻干制剂复溶(比如加入适量蒸馏水、生理盐水比如0.9％氯化钠、5％葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液)均能很快再分散成具有淡蓝色乳光的半透明溶液，再分散性良好，复溶后测得平均粒径约为90-155nm，PDI为0.23-0.25，粒径分布较为均匀，zeta电位为-4mV～12mV。与冻干前相比粒径和zeta电位的变化并不十分显著。本发明的所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂可采用纳米沉淀法、高压均质法中的一种或两种的结合制备得到。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述依托泊苷脂质纳米混悬剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将磷脂和辅助稳定剂超声溶解于水溶液作为水相；

可选地，将依托泊苷溶解于能与水混溶的有机溶剂中作为有机相；

(2)在超声、剪切或搅拌条件下将有机相或将依托泊苷微量注射或分散到水相中；

在本发明的一些实施方式中，采用搅拌方式将有机相或将依托泊苷微量注射或分散到水相中，相较于超声和剪切的方式，搅拌的条件更为温和可控，不易破坏有机相滴入水相后刚刚形成的纳米粒。

可选地，有机相或依托泊苷注射或分散于水相中后继续超声、剪切或搅拌该混合液；

可选地，步骤(2)后旋转蒸发、室温搅拌或透析法除去有机溶剂，为方便表述，该步骤可作为步骤(3)；

旋转蒸发、室温搅拌或透析法均可使用用以除去有机溶剂，在本发明较为优选的一些实施方式中，采用旋转蒸发法除去有机溶剂。室温搅拌可能除不尽有机溶剂或需要的时间很长，而透析法需要根据有机溶剂选择适当的透析液，对纳米粒也可能造成一定损失或破坏；使用低温旋转蒸发法可保证在不破坏纳米粒的同时能更快速的除尽有机溶剂，操作也比较简单可行。

(4)采用高压均质法进一步处理或进行微孔滤膜过滤，即得粒径更小的依托泊苷脂质纳米混悬剂。所述微孔滤膜可选用150nm～220nm。

本发明的制备方法更为简洁、条件不苛刻，比如对pH要求宽松无需严格调控，与现有技术，比如上文中所述的以白蛋白作为稳定剂制备依托泊苷脂质纳米混悬液的现有技术相比，其采用高压乳匀技术，制备过程中对pH 值要求较严格；此外，其制备过程中需要先形成初乳再高压乳匀，制备过程较繁琐。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述依托泊苷脂质纳米混悬剂的制备方法包括依次进行以下步骤：

(1)将磷脂和辅助稳定剂超声溶解于水溶液作为水相；将依托泊苷溶解于能与水混溶的有机溶剂中作为有机相；

在本发明的一些实施方式中，水相和有机相的配制并未特定顺序，在另一些实施方式中，考虑到依托泊苷的溶解性较差而优先配制水相，再配制有机相，防止有机相先配制后因水相的配制可能会需要更长的时间，产生有机相在等待过程中药物可能会沉淀析出的情况。

(2’)在超声、剪切或搅拌条件下将有机相微量注射到水相中；

(3)旋转蒸发、室温搅拌或透析法除去有机溶剂；

(4)采用高压均质法进一步处理或进行微孔滤膜过滤，即得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

或者，在本发明的又一些实施方式中，所述依托泊苷脂质纳米混悬剂的制备方法包括依次进行以下步骤：

(1)将磷脂和辅助稳定剂超声溶解于水溶液作为水相，称为溶液A；

(2”)在超声、剪切或搅拌条件下将依托泊苷分散到溶液A中得到混悬液B，继续超声、剪切或搅拌混悬液B得到混悬液C；

(4)采用高压均质法进一步处理或进行微孔滤膜过滤，即得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

在本发明的一些实施方式中，本发明所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂的制备方法的步骤(1)中，所述有机溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、甘油、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、聚乙二醇300(PEG300)、聚乙二醇400(PEG400)中的一种或多种；在另一些实施方式中，步骤(1)中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇300、聚乙二醇400中的一种或多种；在又一些实施方式中，步骤(1)中所述有机溶剂为甲醇或乙醇，优选为甲醇。

在本发明的某些实施方式中选用二甲基亚砜作为有机溶剂，依托泊苷能够稍溶于二甲基亚砜中，但发明人在实验过程中发现二甲基亚砜相较于其他溶剂不易去除。因此，与甲醇和乙醇相比，二甲基亚砜并不是较优的选择。

本发明的步骤(1)中，依托泊苷与有机溶剂的质量体积比(g/L)为 5:1～20:1，在本发明的一些实施方式中，该比例为5～15：1，优选为9.6～12： 1。

本发明的步骤(1)中，依托泊苷与磷脂的质量比为1：2-30，优选为1： 5-10。

本发明的步骤(1)中，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：3-20，优选为1：5-12.5，更优选为1：8-12.5。

本发明的步骤(1)中，有机相与水相的体积比为1:5～1:20，在本发明的一些实施方式中，该比例可进一步为1：8～10。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)、(2’)或(2”)中，水相和有机相或者依托泊苷和水相以剪切方式混合，剪切速率为3000～10000r/min，优选为10000r/min。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)、(2’)或(2”)中，水相和有机相或者依托泊苷和水相以搅拌方式混合，搅拌速度为500～1500rpm，优选为800～1200rpm。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)或(2’)中，有机相微量注射到水相中，有机相的微量注射速度为2～10mL/h，优选为2～5mL/h。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)、(2’)或(2”)中，室温或0℃冰水浴条件下将有机相或依托泊苷微量注射或分散到水相中。

在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中，所述旋转蒸发方式除去有机溶剂时可选择常温减压条件或40℃真空条件。

在本发明的一些实施方式中，步骤(4)采用高压均质法，所述高压均质条件为200～1000bar、循环10～20次。

在本发明的一些实施方式中，步骤(4)中，所述高压均质条件为200-300 bar循环10-15次、500-600bar循环10-15次、1000bar循环10-20次，该条件进一步为200bar循环10次、500bar循环10次、1000bar循环20次。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种冻干制剂，其含有上述依托泊苷脂质纳米混悬剂和冻干保护剂。

所述冻干制剂可制作为无菌冻干粉针，可通过加入适量蒸馏水、生理盐水比如0.9％氯化钠、5％葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液(优选采用含0.9％氯化钠或5％葡萄糖的注射用水)复溶后供临床应用。

本发明所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂粒径小且分布均匀，脂质纳米混悬剂粒子的粒径为80～100nm，平均粒径最小可接近85nm，带有微弱的负电荷，其zeta电位为-3mV～-8mV，将其制备成冻干制剂复溶(比如加入适量蒸馏水、生理盐水比如0.9％氯化钠、5％葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液)均能很快再分散成具有淡蓝色乳光的半透明溶液，再分散性良好，复溶后测得平均粒径约为90-155nm，PDI为0.23-0.25，粒径分布较为均匀，zeta电位为-4mV～12mV。与冻干前相比粒径和zeta电位的变化并不十分显著。

但冻干条件的不同可能会导致冻干过程在一定程度上降低本发明混悬剂中稳定剂的稳定作用，因此有可能导致部分粒子的聚集变大，再分散后粒子表面的乳化膜厚度变薄等。但该变化也并不十分显著，对本发明的制剂的稳定性、载药量、药物作用时间及疗效等并无明显影响。

但是如果考虑该影响因素，本发明建议的较优冻干保护剂的加入量为 3-10％(w/v)，加入量为6％(w/v)时更优。

冻干保护剂选自：蔗糖、乳糖、果糖、葡糖糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白、甘油、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸钠、L-丝氨酸、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐中的一种或多种，优选为甘露醇时较优。

在本发明的第四方面，本发明提供了上述冻干制剂的制备方法，包括：将依托泊苷脂质纳米混悬剂中加入冻干保护剂进行干燥固化。所述干燥固化的方式比如可以为冷冻干燥法。

在本发明的一些实施方式中，所述冻干制剂的制备方法包括：在上述依托泊苷脂质纳米混悬剂中加入冻干保护剂，过滤除菌，放置于低温冰箱(比如-80℃)预冻(预冻时间比如可以为24h)，取出后迅速放入冷冻干燥机(冷冻干燥条件比如可以为-50℃、0.9mbar)进行冷冻干燥(冷冻干燥时间比如可以为12h)即得依托泊苷脂质纳米混悬剂冻干制剂。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种纳米给药系统，其包含上述依托泊苷脂质纳米混悬剂或上述依托泊苷脂质纳米混悬剂的冻干制剂。

在本发明的第六方面，本发明还提供了上述依托泊苷脂质纳米混悬剂或上述依托泊苷脂质纳米混悬剂的冻干制剂在制备或作为依托泊苷纳米给药系统中的应用。

本发明的技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明所述依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂，可改善依托泊苷的水溶性，提高制剂中药物含量及载药量。载药量高低不仅与药物性质相关，还与处方工艺和制备方法有关。载药量的高低直接影响药物的临床应用剂量，故载药量越高，越易满足临床需求。经试验证实本发明制剂中依托泊苷含量可达1000μg/mL以上，载药量为4％～10％，可显著减小给药体积，实现淋巴瘤治疗高剂量给药。

(2)本发明所述依托泊苷脂质纳米混悬剂是以FDA批准的药用辅料磷脂作为主要稳定剂，安全无毒且生物可降解，具有良好的生物相容性；而且由于依托泊苷较强的亲脂性，以脂质类材料为稳定剂保证了药物与稳定剂良好的相容性，有利于提高制剂中药物含量及载药量。

稳定性是保证药物制剂安全有效的重要因素，物理稳定性问题在纳米混悬剂稳定性问题中比较突出，是制约纳米混悬剂研发的重要因素之一。本发明将两性离子型表面活性剂磷脂和非离子型聚合物联合使用作为稳定剂，可起到协同稳定作用，有利于提高制剂的物理稳定性。

(3)本发明制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂及冻干制剂复溶后外观为淡蓝色半透明溶液，冻干制剂外观为均匀细腻疏松多孔的白色粉末，透射电镜观察微观形态呈球形或类球形，粒径小且分布均匀，脂质纳米混悬剂粒子大小为80～100nm，冻干制剂复溶后粒径在90～150nm，带有微弱的负电荷。

(4)采用TPGS作为辅助稳定剂时，TPGS中的PEG链修饰在纳米粒表面，有效延长了制剂在体内的循环时间，减慢药物的清除，延长药物半衰期，提高了治疗效果。

(5)本发明所述依托泊苷脂质纳米混悬剂由于纳米粒子的增强渗透与滞留(EPR)效应，可实现药物的被动靶向递送，增加药物在肿瘤部位的蓄积，提高肿瘤靶部位药物浓度，增强抗肿瘤效果同时可降低非靶毒副作用。

(6)本发明制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂处方简单、工艺稳定，重现性良好，具有临床开发应用前景。

此外，本发明的脂质纳米混悬剂是以脂质类材料作为主要稳定剂，利用稳定剂的稳定作用将药物颗粒分散在水中，通过粉碎或者控制析晶技术将药物制备成纳米粒子的稳定亚微胶态分散体系。脂质纳米混悬剂结合了脂质材料和纳米混悬剂的优势：(1)应用广泛，适用于水溶性差或既难溶于水又难溶于油的药物，特别适用于生物药剂学分类系统第II类和第IV类药物；(2) 以脂质类材料作为主要稳定剂，保证了制剂良好的生物相容性和安全性；(3) 可显著提高制剂中药物含量及载药量，从而减小给药体积，尤其适合大剂量、难溶性药物的口服和注射给药；(4)脂质纳米混悬剂只含有适量稳定剂，可降低制剂的毒性，提高病人顺应性；(5)处方及制备工艺简单，适合工业化生产，具有良好的临床开发应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为实施例1的依托泊苷脂质纳米混悬剂的透射电镜照片。

图2为实施例1的依托泊苷脂质纳米混悬剂的粒径分布图。

图3为实施例1的依托泊苷脂质纳米混悬剂的电位分布图。

图4为依托泊苷脂质纳米混悬剂(实施例1)在不同介质中的稳定性测定结果；其中柱状图中，每个时间点对应的四个柱形从左至右依次对应pH 7.4PBS、RPMI 1640、20％Plasma、100％Plasma。

图5为依托泊苷脂质纳米混悬剂(实施例1)在小鼠体内的药动学研究结果。

图6为依托泊苷脂质纳米混悬剂(实施例1)对小鼠肝肾指标的影响 (*p<0.05,**p<0.01)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

精密称取大豆卵磷脂60mg、TPGS 100mg超声溶解于10mL双蒸水中作为水相；精密称取依托泊苷12mg超声溶解于1.25mL甲醇中作为有机相，将水相置于0℃冰水浴条件，在1200rpm磁力搅拌下将有机相以5mL/h的速度微量注射到10mL水相中，滴加完毕后在40℃真空条件下用旋转蒸发仪除去甲醇，过220nm的微孔滤膜制得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

取上述制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂滴加到碳涂膜的铜网上，滴加一滴2.0％的磷钨酸钠到铜网上染色约30s，然后放在紫外灯下烤半小时，待铜网干燥后放置于透射电镜下观察粒子形态，如图1所示，粒子形态圆整、大小较为均一、表面无黏连。测得平均粒径为87.50nm，PDI为0.224，粒子大小较为均匀，粒径分布如图2所示，zeta电位为-7.38mV，电位分布如图 3所示。

取上述制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂进行适当稀释，用高效液相色谱法测定制剂中依托泊苷的含量，色谱条件如下：色谱柱：C18 柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-pH 4.0醋酸盐缓冲液(30:70， V/V)；检测波长为254nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：室温；理论板数按依托泊苷峰计算不低于3000。测得依托泊苷在纳米混悬剂中含量为1169.51μg/mL，载药量为6.81％。

将上述制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂分装于灭菌的无色透明西林瓶中，加入6％(w/v)的甘露醇作为冻干保护剂，放于低温冰箱(-80℃)预冻24h，取出后迅速放入冷冻干燥机(-50℃、0.9mbar)进行冷冻干燥12h 即得依托泊苷脂质纳米混悬剂冻干制剂1。

冻干制剂外观为均匀细腻、疏松多孔的白色粉末，分别加入适量蒸馏水、生理盐水、5％葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液振摇后均能很快再分散成具有淡蓝色乳光的半透明溶液，再分散性良好。复溶后测得平均粒径为91.20nm， PDI为0.231，粒径分布较为均匀；zeta电位为-9.01mV。与冻干前相比粒径和zeta电位的变化并不显著。透射电镜观察冻干制剂复溶后纳米粒子形态圆整，大小较为均一。

将上述制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂分装于灭菌的无色透明西林瓶中，加入3％(w/v)的甘露醇作为冻干保护剂，放于低温冰箱(-80℃)预冻24h，取出后迅速放入冷冻干燥机(-40℃、0.5mbar)进行冷冻干燥48h 即得依托泊苷脂质纳米混悬剂冻干制剂2。

冻干制剂外观为均匀细腻、疏松多孔的白色粉末，分别加入适量蒸馏水、生理盐水、5％葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液振摇后均能很快再分散成具有淡蓝色乳光的半透明溶液，再分散性良好。复溶后测得平均粒径为150.17nm， PDI为0.255，粒径分布较为均匀；zeta电位为-11.33mV。与冻干前相比粒径和zeta电位的变化可能是由于冻干过程在一定程度上降低了稳定剂的稳定作用，因此导致了部分粒子聚集变大，再分散后粒子表面的乳化膜厚度变薄等综合作用的结果。透射电镜观察冻干制剂复溶后纳米粒子形态圆整，大小较为均一。

实施例2

分别精密称取F127、大豆卵磷脂各100mg，超声溶解于10mL的双蒸水中作为水相；精密称取依托泊苷10mg超声溶解于1mL甲醇中作为有机相，将水相置于0℃冰水浴条件，在800rpm磁力搅拌下将有机相以2mL/h 的速度微量注射到10mL水相中，滴加完毕后在常温减压条件下用旋转蒸发仪除去甲醇，过220nm的微孔滤膜即得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

测定依托泊苷脂质纳米混悬剂平均粒径为296.7nm，PDI为0.223，zeta 电位为-3.83mV，载药量4.87％。

实施例3

分别精密称取蛋黄卵磷脂、PVPK30各100mg，超声溶解于10mL的双蒸水中作为水相；精密称取依托泊苷10mg超声溶解于1mL甲醇中作为有机相，将水相置于0℃冰水浴条件，在800rpm磁力搅拌下将有机相以2mL/h 的速度微量注射到10mL水相中，滴加完毕后在常温减压条件下用旋转蒸发仪除去甲醇，然后采用高压均质法分别在200bar循环10次、500bar循环 10次、1000bar循环20次，制得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

测定上述制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂平均粒径为129.8nm，PDI为 0.173，zeta电位为-3.39mV，载药量4.32％。

实施例4

精密称取大豆卵磷脂30mg、TPGS 50mg超声溶解于5mL双蒸水中作为水相；精密称取依托泊苷6mg超声溶解于0.5mL甲醇中作为有机相，将水相置于0℃冰水浴条件，在1200rpm磁力搅拌下将有机相以5mL/h的速度微量注射到5mL水相中，滴加完毕后在40℃真空条件下用旋转蒸发仪除去甲醇，过220nm的微孔滤膜制得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

测定依托泊苷在制剂中含量为1046.77μg/mL，载药量为6.14％，平均粒径为90.60nm，PDI为0.092。

实施例5

精密称取蛋黄卵磷脂500mg及吐温-80 250mg超声溶解于50mL双蒸水中形成溶液A；精密称取依托泊苷50mg超声分散于溶液A中得混悬液B，采用高速剪切机将混悬液B在10000r/min高速剪切3min得混悬液C；然后采用高压均质法将混悬液C分别在200bar循环10次、500bar循环10次、 1000bar循环20次，制得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

测定依托泊苷在制剂中含量为917.75μg/mL，载药量为5.59％，平均粒径为95.64nm，PDI为0.162。

实施例6

精密称取大豆卵磷脂40mg、TPGS 75mg超声溶解于5mL双蒸水中作为水相；精密称取依托泊苷6mg超声溶解于0.625mL甲醇中作为有机相，将水相置于0℃冰水浴条件，在1200rpm磁力搅拌下将有机相以5mL/h的速度微量注射到5mL水相中，滴加完毕后在40℃真空条件下用旋转蒸发仪除去甲醇，过220nm的微孔滤膜制得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

测定依托泊苷在制剂中含量为1038.43μg/mL，载药量为4.32％，平均粒径为91.15nm，PDI为0.117。

实施例7

分别精密称取F68、蛋黄卵磷脂各100mg，超声溶解于10mL的双蒸水中作为水相；精密称取依托泊苷10mg超声溶解于1mL甲醇中作为有机相，将水相置于0℃冰水浴条件，在800rpm磁力搅拌下将有机相以2mL/h的速度微量注射到10mL水相中，滴加完毕后在常温减压条件下用旋转蒸发仪除去甲醇，过220nm的微孔滤膜即得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

测定依托泊苷脂质纳米混悬剂平均粒径为264.0nm，PDI为0.273，zeta 电位为-5.91mV。载药量4.59％。

实施例8

精密称取大豆卵磷脂100mg、TPGS 100mg超声溶解于10mL双蒸水中作为水相；精密称取依托泊苷10mg超声溶解于1mL甲醇中作为有机相，将水相置于0℃冰水浴条件，在1000rpm磁力搅拌下将有机相以2mL/h的速度微量注射到10mL水相中，滴加完毕后在常温减压条件下用旋转蒸发仪除去甲醇，过220nm的微孔滤膜制得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

测定上述制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂平均粒径为173.0nm，PDI为 0.259，zeta电位为-6.63mV。载药量4.86％。

实施例9

将12mg依托泊苷溶于4.0ml氯仿和0.5ml无水乙醇的混合溶液中；配置牛血清白蛋白(3％W/V，mg/ml)溶液，用质量分数为10％的柠檬酸溶液将其pH值调为5.4；将45ml上述牛血清白蛋白溶液与依托泊苷的氯仿/乙醇溶液在低速剪切的条件下进行混合，然后将其迅速转移至高压乳匀机中处理直至得到纳米乳剂，旋转蒸发除去溶剂。

测得平均粒径为180.50nm，PDI为0.256，粒子大小较为均匀，zeta电位为-22.15mV，载药量为3.05％。

实施例10

将0.27mg依托泊苷溶于4.0ml氯仿和0.5ml无水乙醇的混合溶液中；配置牛血清白蛋白(3％W/V，mg/ml)溶液，用质量分数为10％的柠檬酸溶液将其pH值调为5.4；将45ml上述牛血清白蛋白溶液与依托泊苷的氯仿/乙醇溶液在低速剪切的条件下进行混合，然后将其迅速转移至高压乳匀机中处理直至得到纳米乳剂，旋转蒸发除去溶剂。

测得平均粒径为179.20nm，PDI为0.241，粒子大小较为均匀，zeta电位为-20.15mV，载药量为2.17％。

试验例1依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂的稳定性

按照实施例1制备依托泊苷脂质纳米混悬剂，分别加入适量pH 7.4磷酸盐缓冲液、细胞培养基PRMI 1640、20％血浆和100％血浆并混合均匀，分别在0h，1h，2h，4h，8h，12h，24h测定依托泊苷脂质纳米混悬剂的粒径及其分布情况，结果如图4所示。

依托泊苷脂质纳米混悬剂与pH 7.4磷酸盐缓冲液和20％血浆孵育24h 内粒径和PDI未出现显著性变化，说明依托泊苷脂质纳米混悬剂在pH 7.4 磷酸盐缓冲液和20％血浆中的稳定性很好。依托泊苷脂质纳米混悬剂与细胞培养基PRMI 1640孵育24h的粒径和PDI在前12h内变化微小，保持了较好的稳定性，在24h的粒径和PDI有轻微增加，粒径在24h增大到94nm，可能是由于部分纳米粒的轻微聚集导致。依托泊苷脂质纳米混悬剂的粒径在100％血浆中出现了前2h先增大之后逐渐减小的趋势，PDI也出现了先增大后减小的趋势，其原因可能是由于100％血浆中含有的大量血浆蛋白等物质可能附着在纳米粒表面并与纳米粒相互作用从而导致了粒径和PDI的变化。

按照实施例1制备依托泊苷脂质纳米混悬剂冻干制剂1和2，将冻干制剂分别在-20℃、4℃和常温条件下放置1个月，观察其外观未出现显著性变化，分别加入适量蒸馏水、生理盐水、5％葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液振摇后均能很快再分散成具有淡蓝色乳光的半透明溶液，无沉淀产生，初步证明冻干制剂贮存稳定性良好。

按照实施例1-10制备依托泊苷脂质纳米混悬剂，将其分别在在-20℃、 4℃和常温条件下放置1个月，观察其外观变化，其中，实施例2、3、5、7、 9、10相较于实施例1、4、6、8，稳定性较差一些，久置(24h内)肉眼观察会有沉淀产生。

试验例2依托泊苷脂质纳米混悬剂在小鼠体内药动学研究

将雌性昆明小鼠随机分为两组，每个时间点每组平行设定4只，分别尾静脉注射某市售依托泊苷注射液(VP16-injection)和按实施例1方法制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂(VP16-LNS)，给药剂量按依托泊苷计算均为20 mg/kg。分别于给药后0.25h，0.5h，0.75h，1h，2h，4h，6h，8h和12h 用肝素化的离心管进行小鼠眼眶静脉丛取血。将离心管在4000rpm条件下离心10min，吸取上清液即得含药血浆。精密吸取一定体积的含药血浆加入等体积的蛋白沉淀剂甲醇，涡旋1min混合均匀并充分沉淀血浆蛋白，置于离心机中10000rpm离心10min，吸取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤后取 20μL进高效液相色谱仪定量分析，记录峰面积并计算各时间点血药浓度。

VP16-injection和VP16-LNS尾静脉注射给药后平均血药浓度-时间曲线如图5所示，结果表明，VP16-LNS组在各个时间点的血药浓度都高于 VP16-injection组，说明VP16-LNS可减慢药物在血液中的清除，显著延长药物在体内的循环时间，有利于提高药物治疗效果，由图5可知，自注射给药后，VP16-LNS组的血药浓度一直高于VP16-injection组，并且VP16-LNS 组在12小时后仍能检测到依托泊苷，而VP16-injection组在6小时后可检出的量已很微弱，至第8小时几乎已经无法检测到依托泊苷，因此，VP16-LNS 组相较于VP16-injection组体内作用时间延长。

试验例3依托泊苷脂质纳米混悬剂对小鼠肝肾指标的影响

以雌性昆明小鼠为动物模型，将小鼠随机分为3组，每组4只，分别尾静脉注射生理盐水、VP16-injection(同试验例2)和VP16-LNS(按实施例 1方法制备的依托泊苷脂质纳米混悬剂)，给药剂量为25mg/kg，给药6次后将生理盐水组、VP16-injection组和VP16-LNS组的小鼠眼眶静脉丛取血后进行肝脏指标谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)、肾脏指标尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)的测定。

测定结果如图6所示，与阴性对照生理盐水组相比，VP16-injection组外周血中AST、BUN和CRE含量都出现了显著性的升高(p<0.05)；而 VP16-LNS组相比阴性对照N.S.组，仅BUN的含量出现了显著性升高(p< 0.01)。结果说明上市注射液制剂VP16-injection对小鼠的肝脏和肾脏均产生了一定程度的损伤，而VP16-LNS仅对肾脏指标产生了较小影响，VP16-LNS 静脉注射给药的安全性优于上市注射液制剂VP16-injection。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种依托泊苷脂质纳米混悬剂，其包括以下组分：药物依托泊苷、磷脂、辅助稳定剂及水溶液；其中，依托泊苷与磷脂的质量比为1：2-30，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：3-20。

2.根据权利要求1所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂，其特征在于，所述依托泊苷浓度为0.5～1.8mg/mL，优选为为0.8～1.5mg/mL，更优选为1～1.2mg/mL；

优选地，依托泊苷与磷脂的质量比为1：2-30，优选为1：5-10；

优选地，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：3-20，优选为1：5-12.5，更优选为1：8-12.5；

优选地，依托泊苷与磷脂的质量比为1：5-10，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：5-12.5；

优选地，依托泊苷的浓度为0.5～1.8mg/mL，依托泊苷与磷脂的质量比为1：5-10，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：8-12.5；

优选地，所述辅助稳定剂选自F127、F68、TPGS和PVPK30中的一种或多种，优选为TPGS；

优选地，所述磷脂选自天然磷脂或合成磷脂；

优选地，所述天然磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂中的一种或多种；

优选地，所述合成磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油酯(DPPG)、磷脂酰丝氨酸(DOPS)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)中的一种或多种；

优选地，所述磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。

3.根据权利要求1或2所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂，其特征在于，所用的水溶液为双蒸水、0.9％氯化钠水溶液、5％葡萄糖水溶液、含0.9％氯化钠和5％葡萄糖的注射用水、含5％葡萄糖的林格氏注射液或磷酸盐缓冲液中的任一种。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂，其特征在于，采用纳米沉淀法、高压均质法中的一种或两种的结合制备依托泊苷脂质纳米混悬剂；

优选地，所述依托泊苷脂质纳米混悬剂的粒径为80～100nm，zeta电位为-3mV～-8mV。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将磷脂和辅助稳定剂超声溶解于水溶液作为水相；

可选地，将依托泊苷溶解于能与水混溶的有机溶剂中作为有机相；

(2)在超声、剪切或搅拌条件下将有机相或依托泊苷微量注射或分散到水相中；

可选地，分散于水相中后继续超声、剪切或搅拌该混合液；

(3)可选地，旋转蒸发、室温搅拌或透析法除去有机溶剂；

(4)采用高压均质法或进行微孔滤膜过滤进一步减小制剂粒径，即得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法依序包括以下步骤：

(1)将磷脂和辅助稳定剂超声溶解于水溶液作为水相；将依托泊苷溶解于能与水混溶的有机溶剂中作为有机相，

(2’)在超声、剪切或搅拌条件下将有机相微量注射到水相中；

(3)旋转蒸发、室温搅拌或透析法除去有机溶剂；

(4)采用高压均质法或过220nm滤膜进一步减小制剂粒径，即得依托泊苷脂质纳米混悬剂；

或者，所述方法依序包括以下步骤：

(1)将磷脂和辅助稳定剂超声溶解于水溶液作为水相；

(2”)在超声、剪切或搅拌条件下将依托泊苷分散到水相中得到混悬液B，继续超声、剪切或搅拌混悬液B得到混悬液C；

(4)采用高压均质法或过220nm滤膜进一步减小制剂粒径，即得依托泊苷脂质纳米混悬剂。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、甘油、乙腈、丙酮、四氢呋喃、DMSO、DMF、PEG300、PEG400中的一种或多种，优选为甲醇；

优选地，步骤(1)中，依托泊苷与有机溶剂的质量体积比(g/L)为5:1～20:1，优选为9.6～12：1；

优选地，步骤(1)中，依托泊苷与磷脂的质量比为1：2-30，优选为1：5-10；

优选地，步骤(1)中，依托泊苷与辅助稳定剂的质量比为1：3-20，优选为1：5-12.5，更优选为1：8-12.5；

优选地，步骤(1)中，有机相与水相的体积比为1:5～1:20，优选为1：8～10；

优选地，步骤(2)、(2’)或(2”)中混合时剪切速率为3000～10000r/min，优选为10000r/min；

优选地，步骤(2)、(2’)或(2”)中，搅拌速度为500～1500rpm，优选为800～1200rpm；

优选地，步骤(2)或(2’)中，有机相的微量注射速度为2～10mL/h，优选为2～5mL/h；

优选地，步骤(2)、(2’)或(2”)中，搅拌温度可选择室温或0℃冰水浴条件；

优选地，步骤(3)中，所述旋转蒸发方式除去有机溶剂时可选择常温减压条件或40℃真空条件；

优选地，步骤(4)中，所述高压均质条件为200～1000bar、循环10～20次；

优选地，步骤(4)中，所述高压均质条件为200-300bar循环10-15次、500-600bar循环10-15次、1000bar循环10-20次；

优选地，步骤(4)中，所述高压均质条件为200bar循环10次、500bar循环10次、1000bar循环20次。

8.冻干制剂，其含有权利要求1至4中任一项所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂和冻干保护剂；

优选地，所述冻干保护剂的加入量为3-10％(w/v)，优选为6％(w/v)；

优选地，所述冻干保护剂选自：蔗糖、乳糖、果糖、葡糖糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白、甘油、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸钠、L-丝氨酸、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐中的一种或多种，优选为甘露醇；

优选地，所述冻干制剂的制备方法包括：将依托泊苷脂质纳米混悬剂中加入冻干保护剂通过冷冻干燥方式进行干燥固化所得。

9.纳米给药系统，其含有权利要求1至4中任一项所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂或权利要求8所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂的冻干制剂。

10.权利要求1至4中任一项所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂或权利要求8所述的依托泊苷脂质纳米混悬剂的冻干制剂在制备依托泊苷纳米给药系统中的应用。