CN111419900A - 一种基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂及其制备方法 - Google Patents

一种基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂及其制备方法。本发明所解决的技术问题是提供一种同时含有川芎和丹参的难溶性和水溶性成分的口服制剂，解决了改善难溶性成分溶出，提高其口服生物利用度的技术问题。本发明的口服制剂是以中药材川芎和丹参的提取物为原料制成的口服冻干制剂：丹参提取物、川芎提取物的重量配比为8‑12:6‑10；制备方法如下：A、制备纳米混悬液：将丹参提取物、川芎提取物制成100‑1000nm的纳米混悬液；B、将步骤A所得纳米混悬液冷冻干燥制成冻干粉。难溶性成分的表观溶解度较提取物显著提高，在体外模拟胃液和模拟肠液中的释放速率加快，累计释放度也显著增加，为临床应用川芎和丹参提供了一种新的技术思路。

Description

一种基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂及其制备方法。
背景技术
冠心宁是以川芎、丹参为原料药，按照重量配比1:1配伍制成的制剂，已有上市剂型为片剂和注射剂。冠心宁具有活血化瘀、通脉养心的功效，主要用于治疗冠心病、心绞痛。
目前，川芎、丹参单味药成分及药理作用的研究显示：川芎的主生物碱(川芎嗪)具有改善血液流变学、保护冠状动脉等作用，酚酸类成分(川芎酚、阿魏酸等)具有抗血小板聚积、清除氧自由基、扩张血管等诸多作用，挥发油(藁本内酯、洋川芎内酯A、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H等)具有镇痛镇静、改善血管功能、保护神经细胞等药理作用；丹参的化学成分主要为水溶性的酚酸类化合物(丹酚酸类、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸等)和难溶性的丹参酮类化合物(丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮等)，水溶性成分具有较好的抗氧化、抗凝血、抗血栓形成、调血脂和细胞保护作用，而难溶性成分改善血液循环、抗菌和抗炎等作用较强。
但是，冠心宁已有上市剂型的药材处理均采用水提工艺，制剂中所含成分主要为丹参素、原儿茶醛、川芎嗪、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、迷迭香酸、丹酚酸B等，均未检测到有利于临床疗效的洋川芎内酯A、藁本内酯、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等难溶性成分。这类难溶性药效成分的缺失可能在一定程度上降低了冠心宁的临床药效。口服给药是临床最常用的给药途径，因易于给药、较好的患者依从性等优点受到广泛认可。发明人尝试制备同时含难溶性和水溶性成分的冠心宁口服制剂，但是发现按照常规方法制备，其难溶性成分受到溶出限制，口服吸收少，仍无法发挥这些难溶性成分的药效。如活血化瘀常用中药丹参、川芎的各成分中，含量较高的成分丹参酮Ⅰ、藁本内酯、洋川芎内酯A的OB值(Oralbioavailability)分别仅为29.27％、23.50％、26.56％(数据源于TCMSP数据库)，均低于30％，而30％被认为是化合物可发挥药效的筛选阈值。难溶性成分的低口服生物利用度在很大程度上限制了这类中药的临床应用。
在现有报道及应用基础上，本发明的发明人提供了一种全新的思路，以川芎、丹参为主要原料，制成同时含有川芎和丹参的难溶性成分和水溶性成分的口服纳米冻干制剂，解决现有制剂有效成分种类少及难溶性药效成分口服吸收差的不足。现有报道中，利用其单体制备的制剂也有报道，如上市产品注射用丹参多酚酸盐、CN105496973A一种丹参酮ⅡA磺酸钠冻干粉针制剂及其制备方法，CN105078907A注射用盐酸川芎嗪冻干制剂的冷冻干燥方法等，但均是将难溶性药物成盐，溶解于水后制备的冻干粉，未见以提取物制备冻干制剂的相关报道，也未见其难溶性成分纳米混悬冻干粉的相关报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种同时含有川芎和丹参的难溶性和水溶性成分的口服制剂，解决了改善难溶性成分溶出，提高其口服生物利用度的技术问题。
本发明的口服制剂，是以中药材川芎和丹参的提取物为原料制成的口服冻干制剂：丹参提取物、川芎提取物的重量配比为8-12:6-10；优选丹参提取物、川芎提取物的重量配比为10:8。
其制备方法如下：
A、制备纳米混悬液：将丹参提取物、川芎提取物制成100-1000nm的纳米混悬液；
B、将步骤A所得纳米混悬液冷冻干燥制成冻干粉。
上述技术方案中：本发明川芎提取物、丹参提取物的成分含量如下：
Figure BDA0002499568780000021
进一步优选，本发明川芎提取物、丹参提取物的成分含量如下：
Figure BDA0002499568780000022
本发明制备形成纳米微粒的关键是难溶性成分：洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA，以上难溶性成分的含量是影响是否能够得到纳米级微粒的关键：如果难溶性成分含量过大，容易得到微米级的微粒，会影响溶出和生物利用度；而难溶性成分含量过小，虽然容易形成纳米级的微粒，但是无法实现有效载药，影响药效发挥。
上述技术方案中：步骤A制备纳米混悬液的方法为：反溶剂沉淀后探头超声法、水浴超声下反溶剂沉淀法、水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法。优选的采用水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法。
如：采用所述水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法：
1)按重量配比称取丹参提取物、川芎提取物，配制成提取物总浓度为0.03～0.2g·mL-1的85-100％v/v乙醇溶液，超声至少10min后，以3000rpm及以上的速度离心至少10min；
2)水相和离心上清液按体积比称取：水相与离心上清液体积比为5:1～20:1；水相置于温度0～15℃的超声水浴中，在800-2000rpm搅拌、200-500W水浴超声下快速加入离心上清液，离心沉淀用适量纯水溶解后一并加入；
3)继续超声搅拌30-60min后连接减压装置，减压至压力＜-0.09Mpa和水浴超声状态下挥除乙醇至无明显乙醇气味，所得混悬液再在800-2000W的超声功率下探头超声至少3min；
优选的，所述水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法中步骤1)乙醇溶液为90％v/v；
优选的，所述水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法中步骤2)磁力搅拌为1000-1200rpm，水浴超声为300W；
优选的，所述水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法中步骤3)超声功率优选1400-1800W；超声时间优选5-7min。
如：采用水浴超声下反溶剂沉淀法：
1)按重量配比称取丹参提取物、川芎提取物，配制成提取物总浓度为0.03～0.2g·mL-1的85-100％v/v乙醇溶液，超声不少于10min后，以3000rpm及以上的速度离心至少10min；
2)水相和离心上清液按体积比称取：水相与离心上清液体积比为5:1～20:1；水相置于温度0～15℃的超声水浴中；在800-2000rpm搅拌、200-500W水浴超声下快速加入离心上清液，离心沉淀用适量纯水溶解后一并加入；
3)继续超声搅拌30-60min后连接减压装置，减压至压力＜-0.09Mpa和水浴超声状态下挥除乙醇至无明显乙醇气味，即得；
优选的，所述水浴超声下反溶剂沉淀法中步骤1)乙醇溶液为90％v/v；
优选的，所述反溶剂沉淀后探头超声法中步骤2)磁力搅拌为1000-1200rpm，水浴超声为300W。
如：采用反溶剂沉淀后探头超声法：
1)按重量配比称取丹参提取物、川芎提取物，配制成提取物总浓度为0.03～0.2g·mL-1的85-100％v/v乙醇溶液，超声不少于10min后，以3000rpm及以上的速度离心至少10min；
2)水相和离心上清液按体积比称取：水相与离心上清液体积比为5:1～20:1；在800-2000rpm的磁力搅拌下将离心上清液快速加入到水相中，离心沉淀用适量纯水溶解后一并加入；
3)继续超声搅拌30-60min后连接减压装置，减压至压力＜-0.09Mpa和水浴超声状态下挥除乙醇至无明显乙醇气味，所得混悬液再在超声功率800-2000W的条件下探头超声至少3min；
优选的，所述反溶剂沉淀后探头超声法中步骤1)乙醇溶液为90％v/v；
优选的，所述反溶剂沉淀后探头超声法中步骤2)磁力搅拌为1000-1200rpm；
优选的，所述反溶剂沉淀后探头超声法中步骤3)超声功率优选1400-1800W；超声时间优选5-7min。
上述技术方案中：步骤A制备纳米混悬液时，可以在水相中添加稳定剂，以保证纳米混悬剂更长时间维持在较小的粒径范围。
添加稳定剂的方法为：按丹参提取物和川芎提取物总量与稳定剂质量比为1:0.25-1:1称取稳定剂，稳定剂加入到水中，搅拌溶解，即得稳定剂水溶液。
其中，可添加的稳定剂为Poloxamer 188、PVP K30、PVA、SDS、Tween 80中的任意一种；优选稳定剂为SDS或Tween 80；最优选稳定剂为Tween 80。
具体的，稳定剂的添加量为丹参提取物和川芎提取物总量与稳定剂的重量比(简称药辅比)为1:0.25-1:1。其中，采用Tween 80为稳定剂的药辅比为1:0.5-1:1，优选药辅比为1:1。采用SDS为稳定剂的药辅比为1:0.25-1:1，优选药辅比1:1。
上述技术方案中：步骤B是在纳米混悬液中加入冻干保护剂后，再进行冷冻干燥。
其中，所述冻干保护剂为麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖。优选采用冻干保护剂为麦芽糖、甘露醇、葡萄糖。冻干保护剂添加量为4-12g/100ml。
其中，所述冷冻干燥的条件为：-40--20℃预冻2-8h后，再采用-40--80℃预冻12-24h，然后在5-30℃和低于15mTorr压力下升华干燥12-24h。
优选冷冻干燥的条件为：-20℃预冻2h后，再采用-80℃预冻24h，然后在25℃和低于15mTorr压力下升华干燥24h。
本发明方法超越了现有川芎和丹参要么以川芎、丹参原药材采用水提或醇提制备制剂，要么以水溶性单体或难溶性单体的水溶性衍生物制备冻干制剂的应用现状。利用其提取物先制备纳米混悬剂再冷冻干燥的制备方法，得到了同时含有水溶性有效成分和难溶性有效成分的纳米混悬冻干制剂，难溶性成分如洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的表观溶解度较提取物显著提高，在体外模拟胃液和模拟肠液中的释放速率加快，累计释放度也显著增加，为临床应用川芎和丹参提供了一种新的技术思路。
附图说明
图1各冻干保护剂外观图。
其中：A为冻干前样品；B为冻干品；C为再分散样品；1、2、3分别表示冻干保护剂用量为4％、8％、12％。
图2冠心宁原料药和纳米混悬液冻干粉的释药曲线(n＝3)。
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。
为了实现本发明纳米混悬冻干制剂同时含有水溶性有效成分和难溶性有效成分，难溶性成分还能有效释放溶出的目的，本发明的发明人在原料选择时发现，冠心宁无论是口服制剂还是注射制剂，均是采用水提物进行后续工艺处理，制剂中所含成分主要有丹参素、原儿茶醛、川芎嗪、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、迷迭香酸、丹酚酸B等，但是明显缺失了有明确药效报道的洋川芎内酯A、藁本内酯、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等难溶性成分。
针对难溶性成分，目前已有包合技术、固体分散技术、磷脂复合物、微乳等多种制剂技术用于提高难溶性成分或药物的溶解度及口服生物利用度，但以上制剂技术均存在一定不足，如包合技术对被包合物质的结构有一定要求，固体分散技术载药量低，稳定性差，易老化等问题，脂质载体表面活性剂用量较大，有一定安全隐患。
纳米混悬液是一种药物以结晶或无定型状态分散的，其粒径在10～1000nm的多相分散体系。纳米混悬液可显著改善难溶性成分溶解性、提高口服生物利用度，已成功应用于诸多化学药物制剂。目前纳米混悬技术在中药领域的应用仍以中药单体为主，如：已有研究采用反溶剂法、高压均质、介质研磨、各种联合技术等技术成功制备了姜黄素、白藜芦醇、柚皮素、水飞蓟素、大豆异黄酮、厚朴酚、紫杉醇、槲皮素等中药单体的纳米混悬液；也有少量单体组合物和有效部位的应用研究报道，如环丙沙星-儿茶素、姜黄素-多西他赛、银杏内酯、黄芩总黄酮、波棱瓜子总木脂素的纳米混悬液。然而，中医临床用药的特点是组方配伍，1、2个单体或有效部分并不能体现整个复方多成分、多途径、多靶点的综合疗效。相较于结构明确的单体成分，或具有同类化学结构的有效部位，中药复方是一个复杂的多成分体系，通常含有数十种甚至上百种药效成分，各成分的理化性质，如溶解性、pKa、稳定性等差异也很大；同时由于蛋白、多糖、树脂、粘液质等大分子无效成分的存在，复方提取物中药效成分含量很低。有效成分的多样性、复杂性和低含量性使纳米混悬技术在中药复方中的应用困难重重。目前尚无基于中药复方多组分体系的纳米混悬技术的应用研究，正是在这样的应用背景下，本发明人尝试制备同时含有难溶性和水溶性复杂多组分的纳米混悬体系；同时，中药领域制备冻干制剂也多见中药单体，尚未见同时含有难溶性和水溶性复杂多组分的纳米混悬冻干制剂。
欲制备中药复方纳米混悬制剂，发明人遇到了很多问题需要探究：①现有纳米混悬液的制备技术虽然较多，但基本上都是用于单体成分。复方制剂研究一般以浸膏为原料，而浸膏的性质，如溶解性、黏度等都不同于单体，现有制备方法是否适应于中药浸膏原料药？如何将中药复方浸膏中的难溶性成分微粒减小到纳米级？②目前对单体纳米混悬液的工艺评价指标主要是粒径、PDI及Zeta电位。复方成分复杂，即使同是难溶性成分，不同成分形成纳米微粒的难易程度也可能不同，仅以粒径、PDI为指标不能体现这种差别，无法全面反映复方纳米混悬液的质量，并优化制备工艺。如何建立更全面的复方纳米混悬液的制备工艺优化评价体系？③纳米混悬液一般稳定性差，长期放置过程中微粒易聚集，粒径增大，故一般通过喷雾干燥、冷冻干燥等方式将其干燥固化。虽然单体的纳米固体粉末具有良好的再分散性，再分散后粒径等性质一般无显著变化。但鉴于复方的复杂性，其纳米混悬液干燥固化后的粉末再分散后是否仍能保持纳米级，尚未可知。在此背景下，发明人提供了一种全新的丹参川芎纳米混悬冻干口服制剂。
本发明应用的原料药为丹参提取物和川芎提取物。各提取物的成分分析如表1：
表1丹参提取物、川芎提取物和冠心宁片中各成分的含量(n＝3)/mg·g-1
Figure BDA0002499568780000051
-：未检测到。
分析及结论：冠心宁原方的工艺为川芎与丹参1:1配伍煎煮，而本研究中所用丹参和川芎提取物均为80％醇提物，各成分含量不同于水煎的药液，且2种药材分别提取后的浸膏得率也不相同，若仍以1:1配伍可能不妥，鉴于后续的体外溶出、体内生物利用度等研究均以冠心宁片为参比，以冠心宁片可检测组分为基准，采用的市售丹参提取物和川芎提取物以重量配比10:8配伍使用。
以下为本发明纳米混悬冻干制剂的制备方法的研究。
一、方法及工艺选择
1、比较了以下7种制备方法，制备方法如下：
(1)反溶剂沉淀法：取0.1g丹参提取物、0.08g川芎提取物加5mL 90％乙醇，超声15min后5000rpm离心10min。在1000rpm的磁力搅拌下将离心上清液快速加入到50mL纯水中，离心沉淀用1mL纯水溶解后一并加入。继续搅拌30min后连接减压装置，搅拌的同时减压(压力＜-0.09Mpa)除乙醇1h。
(2)高压均质法：称取0.1g丹参提取物、0.08g川芎提取物，加入50mL纯水，水浴超声20min后于高压均质机中200bar均质30s，每30s加150bar直至800bar，最后800bar持续20个循环。
(3)探头超声法：称取0.1g丹参提取物、0.08g川芎提取物，加入50mL纯水，1200W功率下探头超声，工作2s，间歇2s，共3min。
(4)反溶剂沉淀后高压均质法：按方法“(1)”制备混悬液，再于高压均质机中300bar均质10个循环，500bar均质15个循环，800bar均质20个循环。
(5)反溶剂沉淀后探头超声法：按方法“(1)”制备混悬液，再于1200W功率下探头超声，工作2s，间歇2s，共3min。
(6)水浴超声下的反溶剂沉淀法：取0.1g丹参提取物、0.08g川芎提取物加5mL90％乙醇，超声15min后5000rpm离心10min。50mL纯水加入250mL三颈烧瓶中，置于300W功率的超声水浴中，在超声和1000rpm电动搅拌下快速加入上述离心上清液，离心沉淀用1mL纯水溶解后一并加入。继续超声搅拌30min后连接减压装置，减压(压力＜-0.09Mpa)和超声状态下除乙醇30min。
(7)水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法：按“(6)”制备混悬液，再于800W功率下探头超声，工作2s，间歇2s，共3min。
考察以上7种制备方法制备所得的纳米混悬液的粒径及分布。采用粒度分析仪测定，获得D50、PDI、小于1μm的微粒数量百分比等，结果见表2。
表2不同制备方法的纳米混悬液的粒径及分布(n＝3)
Figure BDA0002499568780000061
分析及结论：表2显示，探头超声法不能直接将提取物制备成纳米混悬液，仅有不足3％的微粒粒径在1μm以下；其余各方法获得的粒径顺序从大到小为：高压均质法>反溶剂沉淀法>水浴超声下反溶剂沉淀法、反溶剂沉淀后探头超声法、反溶剂沉淀后高压均质法>水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声。水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声、反溶剂沉淀后高压均质法和反溶剂沉淀后探头超声法有90％以上的微粒为纳米级。PDI以水浴超声下反溶剂沉淀法最大，超过0.3；其余方法均在0.1～0.3之间。可见，水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声制得的纳米混悬液粒径较小，90％以上的微粒均在1μm以下，粒径分布均匀。
在本发明所涉及的反溶剂法过程中均涉及有机相加入到水相中。不同于单体难溶性药物可全部溶解于某一有机溶剂中，中药提取物通常既有水溶性成分，又有难溶性成分。预实验显示，90％v/v乙醇与无水乙醇均能很好的溶解丹参、川芎提取物中的难溶性成分，但水溶性成分在90％v/v乙醇溶解的量多于无水乙醇，故选择了90％v/v乙醇作为反溶剂过程中的有机相。然而，90％v/v乙醇仍不能将丹参、川芎提取物完全溶解，离心后有明显的沉淀出现。鉴于尚未确定沉淀为无效成分，为保证制剂的疗效，研究中将离心后的有机相上清液加入水相后，用纯水将沉淀完全溶解后一并加入，创立了适于川芎提取物和丹参提取物的反溶剂沉淀法。
考察以上7种制备方法制备的混悬液中难溶性成分的总收率及在纳米级(粒径10～1000nm)的分布百分率，结果见表3-1和表3-2。
1)总收率的测定：新制备的样品摇匀后立即取样0.5mL，加适量甲醇超声5min溶解，定容至1mL，0.22μm微孔滤膜过滤，HPLC测定各成分的含量，与投药量比较，计算总收率。
2)混悬液中难溶性成分在纳米级的质量百分率的测定：取10mL纳米混悬液用1000nm径迹蚀刻膜抽滤，滤液再过100nm径迹蚀刻膜；取100nm滤膜，加5mL 80％甲醇超声30min，溶解沉淀，重复1次，合并2次超声液，0.22μm过滤，HPLC测定洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量。与混悬液中各成分总质量比较，计算纳米级(100～1000nm)范围的各成分的百分率。
表3-1不同制备方法的混悬液中难溶性成分的总收率及纳米级微粒收率(n＝3)/％
Figure BDA0002499568780000071
表3-2不同制备方法的混悬液中难溶性成分的总收率及纳米级微粒收率(n＝3)/％
Figure BDA0002499568780000081
分析及结论：通过表3-1、表3-2可见：
1)就总收率而言，高压均质法和反溶剂沉淀后高压均质法制备的混悬液中，各成分的总收率都较低。
2)就各成分分布而言，反溶剂沉淀法、水浴超声下反溶剂沉淀法和水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法制备的混悬液中，洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA这6种难溶性成分在纳米级范围的收率更高。
3)综合考虑考虑粒径、总收率及100～1000nm分布率，最优方法为水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法，其次为反溶剂沉淀后探头超声法和水浴超声下反溶剂沉淀法。
2、筛选优化反溶剂沉淀过程的工艺条件
按最优的水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法制备冠心宁纳米混悬液，进一步选择乙醇溶液中浸膏总浓度(X1)、乙醇和水相的体积比(X2)、水浴温度(X3)为考察因素，用Box-Behnken设计对制备工艺中的反溶剂步骤进行优化，优选工艺条件。
乙醇溶液中浸膏总浓度(X1)、乙醇和水相的体积比(X2)、水浴温度(X3)为考察因素，Box-Behnken设计的因素-水平表见表4，实验设计表见表5。
发明人在研究中发现，药物浓度的高低会影响体系的稳定性，浓度增高可能会使相对饱和浓度的增加，纳米晶核的形成会越多，但同时增加了晶核之间的相互碰撞接触而易引起聚集。乙醇体积越大，药物在乙醇-水混合溶剂中饱和溶解度就越大，过饱和浓度就越小，越不利于纳米晶核的形成。降低有机溶剂注入反溶剂时的析晶温度，药物在反溶剂中溶解度降低从而增加相对过饱和浓度，有利于晶核的形成；且温度越低，晶核生长越慢。以上三个因素可能存在相互交联作用。单因素试验显示，超声强度受超声池中液体体积影响，故固定反溶剂体积为50mL，90％乙醇体积取值为1～5mL；为保证提取物在90％乙醇中的溶解以及制备的纳米混悬液在测定粒径、PDI和过滤时不产生沉淀聚集现象，有机相中的药物浓度取为0.036～0.252g·mL-1；低温有利于纳米晶的晶核形成，且川芎提取物中含有藁本内酯等在高温可能会挥发的成分，因此温度范围设为0～40℃，由此确定了本发明中的Box-Behnken设计的因素、水平。
表4Box-Behnken设计的因素水平表
Figure BDA0002499568780000091
表5Box-Behnken实验安排
Figure BDA0002499568780000092
优化指标如下：
以粒径(Y1)、PDI(Y2)、1μm以下的微粒百分比(Y3)、难溶性成分在100～1000nm的分布百分率归一化值(Y4)为指标。各指标测定方法如下：
粒径(Y1)、PDI(Y2)和1μm以下的微粒百分比(Y3)将制得样品立即用纳米激光粒度仪测定粒径，直接获取D50、PDI和1μm以下的微粒百分比。
6种难溶性成分在100～1000nm的分布百分率归一化值(Y4)测定混悬液中洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA在100～1000nm范围的分布百分率，根据网络药理学结果中各成分的“节点连接度”百分比(见表6)，进行归一化处理。
表6归一化处理的各成分权重百分比设置
Figure BDA0002499568780000093
各成分100～1000nm的分布百分率归一化值(Y4)的公式如下：
Y4＝洋川芎内酯A分布率×0.07+藁本内酯分布率×0.22+丁烯基苯酞分布率×0.26+隐丹参酮分布率×0.13+丹参酮Ⅰ分布率×0.06+丹参酮ⅡA分布率×0.26
制备方法：按照表5配制一定体积的一定浓度的丹参、川芎提取物的90％乙醇溶液(固定丹参提取物：川芎提取物＝10:8)，超声15min后5000rpm离心10min。另取50mL纯水加入到250mL三颈烧瓶中，置一定温度的超声水浴中，1000rpm搅拌、300W超声下快速加入离心上清液，沉淀用1mL纯水溶解后一并加入。继续超声搅拌30min后连接减压装置，减压(压力＜-0.09Mpa)和水浴超声状态下除乙醇30min，所得混悬液再在一定下功率下探头超声一定时间。
数据处理与分析：
采用SPSS软件按照Y＝A0+A1X1+A2X2+A3X3+A4X1X2+A5X1X3+A6X2X3+A7X1 2+A8X2 2+A9X3 2的形式进行二次多元回归拟合，逐一删除P值较大的项，直到回归方程高度显著性。按表5的试验安排表，除待考察的2个因素外，其余变量设为中值(即0水平的取值)，根据二项式方程，计算理论Y值。采用Origin 6.0软件分别绘制各指标与影响较显著的2个自变量的三维效应面和二维等高图，考察了乙醇溶液中浸膏总浓度(X1)、乙醇和水相的体积比(X2)和水浴温度(X3)。
Box-Behnken设计优化结果
按表5制备了17份冠心宁纳米混悬液。各样品中难溶性成分在100～1000nm范围内的分布率结果见表7，各优化评价指标结果见表8。
表7Box-Behnken设计的各样品中6种难溶性成分纳米级微粒的分布率/％
Figure BDA0002499568780000101
表8Box-Behnken设计各样品的评价结果
Figure BDA0002499568780000111
结果：由三维效应面和二维等高图可知：较低的药物浓度、有机相和水相的比例和温度有利于减小纳米混悬液的粒径和PDI；较低的药物浓度、有机相和水相的比例有利于1μm以下的微粒的形成，而温度处于10～25℃有利于1μm以下的微粒的形成；在较高的药物浓度、较低的有机相和水相的比例和温度中100～1000nm分布率归一值更高。反溶剂过程的工艺条件乙醇溶液中浸膏总浓度(X1)、乙醇和水相的体积比(X2)和水浴温度(X3)的筛选结果见表9。
表9反溶剂过程的主要因素
Figure BDA0002499568780000112
3、筛选优化超声工艺条件
按Box-Behnken设计优选的反溶剂沉淀工艺进行冠心宁初混悬液的制备，将获得的初混悬液进行探头超声，优选超声的工艺条件。
(1)超声功率的优选
分别设置探头超声功率为800、1200、1600、2000W，固定超声时间为3min，进行初混悬液的探头超声，测定粒径和难溶性成分在微米级和纳米级的百分率。
探头超声功率的优化：不同超声功率制备的混悬液的粒径、PDI及1μm以下的微粒百分比测试结果见表10，100～1000nm的分布率结果见表11。
表10不同探头超声功率制备的混悬液的粒径、分布及小于1μm的微粒百分比(n＝3)
Figure BDA0002499568780000121
注：SPSS软件单因素方差分析，同一字母表示不同超声功率的同一指标无显著性差异，不同字母表示有显著性差异。
表11不同探头超声功率制备的混悬液中6种难溶性成分纳米级微粒的分布率(n＝3)/％
Figure BDA0002499568780000122
注：SPSS软件单因素方差分析，同一字母表示同一成分在不同功率下的分布率无显著性差异，不同字母表示有显著性差异。
从表10、11可知，在800～1600W的范围内，探头超声功率增加到1600W时，粒径显著减小，1μm以下的微粒显著增多，但继续增加至2000W时，却无显著变化；PDI受探头超声功率的影响很小。各难溶性成分在100～1000nm的分布率变化与粒径相似。综合以上结果以及减小对仪器的耗损，故确定探头超声功率范围可以为800-2000W，优选超声功率为1400-1800W。
(2)超声时间的优选
以确定的最优探头超声功率，设置探头超声时间分别为3min、6min、9min，进行初混悬液的探头超声，同上进行评价。
不同探头超声时间的粒径、PDI、1μm以下的微粒百分比测试结果见表12，100～1000nm的分布率结果见表13。
表12不同探头超声时间制备的纳米混悬液的粒径、分布及微粒百分比(n＝3)
Figure BDA0002499568780000123
注：SPSS软件单因素方差分析，同一字母表示同一指标在不同超声时间结果无显著性差异，不同字母表示有显著性差异。
表13不同探头超声时间制备纳米混悬液中各难溶性成分纳米级微粒的分布率(n＝3)/％
Figure BDA0002499568780000131
注：SPSS软件单因素方差分析，同一字母表示同一成分在不同的超声时间的分布率无显著性差异，不同字母表示有显著性差异。
从表12、13可知，随着探头超声时间增加，粒径减小，但时间增加至9min时，与6min相比无显著性差异；PDI、1μm以下的微粒百分率不受探头超声时间的影响。100～1000nm的总分布率均随着超声时间增加而升高。综合以上结果以及减小对仪器的耗损，确定探头超声时间为3min以上，优选测定超声时间为5-7min。
二、稳定剂的筛选
1、稳定剂品种的筛选
分别以泊洛沙姆188(以下简写为Poloxamer 188)、聚乙烯吡咯烷酮-K30(以下简写为PVP K30)、吐温80(以下简写为Tween 80)、十二烷基硫酸钠(以下简写为SDS)、聚乙烯醇(以下简写为PVA)、羟丙基甲基纤维素K4M(以下简写为HPMC K4M)为备选稳定剂，按药辅比1:1将各稳定剂加入水相中，按“水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法”制备纳米混悬液。将制得样品于室温静置，在0、1、3、7d吸取0.2mL上层液，测定洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量，剩余样品摇匀后测粒径、PDI和电位。
不同稳定剂所制备的纳米混悬液静置不同时间的粒径、PDI、Zeta电位结果分别见表14-16，上层混悬液中难溶性成分的含量变化见表17。
表14不同稳定剂静置不同时间的粒径D50变化(n＝3)
Figure BDA0002499568780000132
注：SPSS软件单因素方差分析，与0时刻相比，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。
根据表14可知，HPMC K4M极显著的增大了粒径；Poloxamer 188、PVP K30 1d时粒径显著增大，PVA在7d时粒径出现了显著增加，Tween 80、SDS、HPMC K4M在静置7d后粒径未出现显著变化。
表15不同稳定剂静置不同时间的PDI变化(n＝3)
Figure BDA0002499568780000141
注：SPSS软件单因素方差分析，与0时刻相比，“*”表示P<0.05。
根据表15可知，PVP K30，SDS和HPMC K4M制得的纳米混悬液PDI小，说明粒径均匀，明显优于Poloxamer 188、Tween 80、PVA；在静置7d后，Poloxamer 188、PVP K30的粒径分布出现了显著增加，其余稳定剂未发生显著改变。
表16不同稳定剂的混悬有静置不同时间的电位Zeta变化(n＝3)/mV
Figure BDA0002499568780000142
注：SPSS软件单因素方差分析，与0时刻相比，“*”表示P<0.05。
根据表16可知，SDS制得的纳米混悬液Zeta电位最低，纳米微粒所带负电荷最多；HPMC K4M制得的纳米混悬液Zeta电位最高，纳米微粒所带负电荷最少，接近于0；其余稳定剂介于两者之间。PVA、HPMC K4M在3d后出现了显著变化，Poloxamer 188、PVP K30在7d后出现了显著变化，Tween 80、SDS在静置7d后电位均未发生显著性变化。
表17不同稳定剂静置不同时间的难溶性成分含量变化(n＝3)/mg·50mL-1
Figure BDA0002499568780000143
Figure BDA0002499568780000151
注：SPSS软件单因素方差分析，与0时刻相比，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。
表17的结果显示，Poloxamer 188、PVP K30、PVA、HPMC K4M不能改善冠心宁纳米晶混悬液的稳定性，洋川芎内酯A、藁本内酯、丹参酮IIA均在静置一定时间后出现显著性的含量减少；Tween 80、SDS组在静置7d后含量未发生显著性改变。
从以上结果可知，不同的稳定剂对粒径、PDI、电位均有有较大的影响，Poloxamer188、PVP K30、PVA所制备的纳米混悬液在静置过程中粒径、分布变化较大，当静置24h后出现肉眼可见的明显沉淀；HPMC K4M的稳定性较好，但粒径较大；Tween 80和SDS所制备的纳米混悬液仍在纳米晶范围内，放置7d后粒径、电荷和难溶性成分含量变化较小。
综合表14-17的结果，优选用SDS、Tween 80为稳定剂。
2、稳定剂用量的筛选
按药辅比1:0.25、1:0.5、1:1将SDS、Tween 80加入水相中，采用不同用量的SDS或Tween80制备的纳米混悬液分别静置0、1、3、7d的粒径、PDI、Zeta电位结果见表18-20，上层液中难溶性成分的含量变化见表21。
表18不同用量的稳定剂制备的纳米混悬液静置不同时间的粒径D50变化(n＝3)
Figure BDA0002499568780000152
注：SPSS软件单因素方差分析，与0时刻相比，“*”表示P<0.05。
从表18可知，不同药辅比的SDS制备的纳米混悬液粒径显著低于Tween 80；在1:0.25～1:1的药辅比范围内，辅料用量对同一稳定剂的新制备的纳米混悬液的粒径均无显著性影响；但Tween 80的药辅比为1:0.25和1:0.5时，样品分别在静置3d和7d后粒径出现显著增加。
表19不同用量稳定剂制备的样品静置不同时间的分布(n＝3)
Figure BDA0002499568780000161
注：SPSS软件单因素方差分析，与0时刻相比，“*”表示P<0.05。
从表19可知，在1:0.25～1:1的药辅比范围内，辅料用量对同一稳定剂的新制纳米混悬液的PDI无显著性影响；Tween 80的药辅比1:0.25、1:0.5分别在静置3d和7d后PDI出现了显著增大；SDS的药辅比1:0.25、1:0.5在静置1d后PDI出现了显著增大。
表20不同用量稳定剂制备的样品静置不同时间的Zeta电位值(n＝3)
Figure BDA0002499568780000162
注：SPSS软件单因素方差分析，与0时刻相比，“**”表示P<0.01。
从表20可知，在1:0.25～1:1的药辅比范围内，辅料用量对同一稳定剂的新制纳米混悬液的电位无显著性影响，静置7d后，药辅比为1:0.25的2个样品zeta电位显著增大。
表21不同用量稳定剂制备的样品难溶性成分含量变化(n＝3)/mg·50mL-1
Figure BDA0002499568780000163
Figure BDA0002499568780000171
注：SPSS软件单因素方差分析，与0时刻相比，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。
从表21可知，稳定剂的用量对纳米混悬液的稳定性具有一定的影响，药辅比为1:0.25、1:0.5的样品在静置7d均出现肉眼可见的沉淀。7d后，2种辅料药辅比为1:0.25和1:0.5时，隐丹参酮的含量下降率在58.33％～89.47％；丹参酮Ⅰ的含量下降了23.08％～44.44％，丹参酮ⅡA的含量下降了25.00％～337.50％。药辅比为1:1时，稳定剂为Tween 80的混悬液中洋川芎内酯A、藁本内酯和丁烯基苯酞的保留率高于SDS，但隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的保留率低于SDS。
通过查询国家药品监督管理局药品评审中心中常用辅料数据库，本研究中最优结果SDS的添加剂量(药辅比1:1)已超过允许的最大给药剂量(0.25％)，但药辅比1:1添加剂量的Tween 80未超过允许的最大给药剂量，且结果较于SDS的其它结果更优。
综合粒径、PDI、电位、静置的含量结果以及安全性，最终确定药辅比为1:0.25-1:1，其中，采用Tween 80为稳定剂药辅比为1:1；采用SDS为稳定剂药辅比为1:0.25-1:1，优选药辅比1:1。
尤其是在研究过程中发现，采用Tween 80作为稳定剂，纳米混悬液中的洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA较未加Tween 80的纳米混悬液减少了在100～400nm的分布，增加了在100nm以下的分布。说明Tween 80具有一定的增溶效果，在制备纳米混悬液的过程中采用Tween 80后使得100nm以下的百分率较未添加的明显增多。故最优选择Tween 80作为本发明的稳定剂。
三、纳米冻干粉的制备
按以上优化结果制备纳米混悬液，分别加入4、8、12％的冻干保护剂(备选品种：甘露醇、乳糖、葡萄糖、右旋糖酐、麦芽糖)，搅拌溶解后分装于西林瓶中(2mL/瓶)，-20℃预冻2h后转入-80℃超低温冰箱预冻24h，然后在真空度为15mTorr以下，温度15℃干燥24h，取出立即密封。各冻干保护剂外观图见图1，冻干样品再分散后粒径见表22-24。
表22不同冻干保护剂样品再分散后粒径
Figure BDA0002499568780000172
注：SPSS软件单因素方差分析，相同字母表示各冻干保护剂浓度为4％时无显著性差异，不同字母表示有显著性差异；同一冻干保护剂与浓度为4％时相比，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。
分析及结论：
图1显示：麦芽糖、甘露醇均能较好的溶解于混悬液中，冻干品表面平整，质地疏松，可以较好的再分散；右旋糖酐在纳米混悬液中溶解度低成浑浊状，浓度为4％的冻干品表面发生皱缩，当增加用量到8％、12％后皱缩现象缓解，但再分散后依然成浑浊状；乳糖和葡萄糖均能较好的溶解于混悬液中，浓度为4％的冻干品表面明显皱缩塌陷，增加用量到8％、12％后，乳糖皱缩现象有所缓解但仍然有皱缩现象，葡萄糖未能减轻皱缩现象反而有喷瓶趋势。
从表22可知，在添加量为4％时，以右旋糖酐为冻干保护剂的冻干粉再分散后的粒径最大，而甘露醇、麦芽糖、乳糖、葡萄糖的没有显著性差异；当添加量增加至8％与12％时，以麦芽糖、甘露醇以及葡萄糖为冻干保护剂的干粉再分散后粒径较4％没有显著性差异，以乳糖为保护剂的冻干粉再分散后粒径均出现显著性差异增大，以右旋糖酐为冻干保护剂的冻干粉分散后粒径出现极显著差异的增大。
表23不同冻干保护剂样品再分散后分布值
Figure BDA0002499568780000181
注：SPSS软件单因素方差分析，相同字母表示各冻干保护剂浓度为4％时无显著性差异，不同字母表示有显著性差异；同一冻干保护剂与浓度为4％时相比，“*”表示P<0.05。
从分布结果表23可知，在添加量为4％时，以麦芽糖、乳糖2种冻干保护剂的冻干粉再分散后PDI较小，而甘露醇、葡萄糖、右旋糖酐的较大；当添加量增加至8％时，以麦芽糖、乳糖为冻干保护剂的冻干粉再分散后的PDI未发生显著性变化，甘露醇、葡萄糖的PDI显著性减小，右旋糖酐的PDI出现显著性增大；添加量增加至12％时，较添加量为4％，麦芽糖、葡萄糖冻干粉再分散后的PDI未发生显著性改变，而右旋糖酐、乳糖冻干粉再分散后的PDI显著性增大，甘露醇冻干粉再分散后的PDI显著性减小。
表24不同冻干保护剂样品再分散后的Zeta电位
Figure BDA0002499568780000182
注：SPSS软件单因素方差分析，相同字母表示各冻干保护剂浓度为4％时无显著性差异，不同字母表示有显著性差异；“*”表示同一冻干保护剂与浓度为4％时相比P<0.05。
从表24可知，用量为4％时，以右旋糖酐为冻干保护剂的冻干粉再分散后的电荷较少，而甘露醇、乳糖、葡萄糖的电荷较多；当添加量增加至8％时，以麦芽糖、甘露醇、右旋糖酐以及葡萄糖为冻干保护剂的冻干粉再分散后的Zeta电位未发生显著性变化，以乳糖为冻干保护剂的冻干粉再分散后的所带电荷显著性减少；当添加量增加至12％时，较添加量为4％时，以麦芽糖、右旋糖酐、葡萄糖为冻干保护剂的冻干粉再分散后的Zeta电位未发生显著性改变，以甘露醇、乳糖冻干保护剂的冻干粉再分散后电荷减少。
故最终优化条件：以麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖为冻干保护剂，用量在4-12％；优选采用甘露醇为冻干保护剂，优选用量在4-12％。
四、效果评价
样品制备：
(1)原料药粗悬液：称取0.14g丹参提取物、0.11g川芎提取物，加入50mL纯水，搅拌，即得。
(2)纳米混悬液：取0.14g丹参提取物、0.11g川芎提取物加1.5mL 90％乙醇，超声15min后5000rpm离心10min。称取0.25g Tween 80分散于50mL纯水后加入250mL三颈烧瓶中，置于12℃、300W功率的超声水浴中，超声、1000rpm电动搅拌下快速加入上述离心上清液，离心沉淀用1mL纯水溶解后一并加入。继续超声搅拌30min后连接减压装置，减压(压力＜-0.09Mpa)和超声状态下除乙醇30min，1600W探头超声6min。
(3)纳米冻干粉：取0.14g丹参提取物、0.11g川芎提取物加1.5mL 90％乙醇，超声15min后5000rpm离心10min。称取0.25g Tween 80分散于50mL纯水后加入250mL三颈烧瓶中，置于12℃、300W功率的超声水浴中，超声、1000rpm电动搅拌下快速加入上述离心上清液，离心沉淀用1mL纯水溶解后一并加入。继续超声搅拌30min后连接减压装置，减压(压力＜-0.09Mpa)和超声状态下除乙醇30min，1600W探头超声6min。中加入8％甘露醇，搅拌溶解后分装于西林瓶中(2mL/瓶)，-20℃预冻2h后转入-80℃超低温冰箱预冻24h，然后在室温和15mTorr压力下冷冻干燥24h，取出立即密封。
1、粒径分布及Zeta电位：取样品(1)(3)再分散混悬液，以及样品(2)于激光粒度分布仪、Zeta电位分析仪测定粒径及Zeta电位。
粗悬液、纳米混悬液以及纳米冻干粉再分散混悬液的粒径分布及Zeta电位测定的结果见表25。
表25不同混悬液的粒径、分布及Zeta电位(n＝3)
Figure BDA0002499568780000191
注：SPSS软件单因素方差分析，相同字母表示同一指标无显著性差异，不同字母表示有显著性差异。
从表25结果可见，纳米混悬技术可将冠心宁原料药粒径减小至纳米级，同时将PDI、Zeta电位也显著性减小，纳米混悬液与粗混悬液相比，有极显著的差异(P<0.01)；纳米冻干粉再分散混悬液和冻干前相比，粒径、PDI、Zeta电位均无显著性变化，说明，冷冻干燥未影响纳米微粒的粒径及电荷性质。
2、不同粒径范围的成分组成及含量的测定：采用分级滤过的方式，测定不同粒径范围的微粒组成。具体操作如下：取10mL粗悬液，纳米混悬液，纳米冻干粉再分散液分别用1μm径迹蚀刻膜抽滤，滤膜加5mL 80％甲醇超声30min，溶解沉淀，重复1次，合并2次甲醇溶液，0.22μm过滤，HPLC测定14种指标成分的含量，得粒径>1μm的微粒的组成及含量；滤液用400nm径迹蚀刻膜抽滤，同上操作，得粒径在400nm～1μm的微粒的组成及含量；滤液再用100nm径迹蚀刻膜抽滤，同上操作，得粒径在100nm～400nm的微粒的组成及含量；测定最终滤液，得粒径<100nm的微粒及分子状态的成分组成及含量。粗悬液、纳米混悬液、纳米冻干粉再分散混悬液的分级滤过后的含量测定结果见表26。
表26显示，粗悬液、纳米混悬液、纳米冻干粉再分散混悬液中的丹参素、原儿茶醛、川芎嗪、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川内酯H、迷迭香酸、丹酚酸B在水中溶解度相对较大，均分布在100nm滤过的滤液中；粗悬液中洋川芎内酯A有(23.11±0.58)％大于1μm，(70.62±11.10)％小于100nm，藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA大于1μm者均超过80％。纳米混悬技术能显著降低粒径大于1μm的洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的质量比：纳米混悬液中，90％以上的这6种成分分布在400nm以下。与冻干前相比，冻干粉再分散后的混悬液中，丹参素等14种成分经分级过滤后的含量测定结果无显著变化，说明冷冻干燥过程没有影响各成分的粒径分布。
表26不同混悬液分级过滤后14种成分在不同粒径范围的含量(n＝3)/mg·50mL-1
Figure BDA0002499568780000201
Figure BDA0002499568780000211
Figure BDA0002499568780000221
注：SPSS软件单因素方差分析，相同字母表示同一指标无显著性差异，不同字母表示有显著性差异；“-”未检测到。
3、表观溶解度的测定：取过量的原料药(丹参提取物和川芎提取物10:8物理混合物)和冻干粉，加入纯水3mL，涡旋混合2min，37℃，100rpm振荡。分别在48和72h取出，15000r·min-1离心15min，取上清液100μL，HPLC测定各成分含量。各成分的表观溶解度见表27。
表27冠心宁原料药和纳米冻干粉中各成分的表观溶解度(n＝3)/μg·mL-1
Figure BDA0002499568780000222
注：-.未检测到；与原料药比较，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。
4、体外溶出：根据2015年版《中国药典》第四部中桨法进行体外溶出研究。取冠心宁片1片、原料药(丹参提取物和川芎提取物10:8物理混合物)、冻干粉适量(各样品量以丹酚酸B计，相当于16.53mg)，投入到900mL释放介质(分别为模拟胃液和模拟肠液)中，37℃，50rpm搅拌，分别在5、10、15、30、45、60、90、120min取样2mL，100nm微孔滤膜过滤，HPLC测定滤液中丹参素、原儿茶醛、川芎嗪、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、迷迭香酸、丹酚酸B、洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ的含量。冠心宁原料药和纳米混悬液冻干粉的释药曲线见图2。
图2显示：原料药、纳米冻干粉中的水溶性成分在模拟胃液与模拟肠液中累积释放率均较高均大于90％。冠心宁片在模拟胃液中前15min几乎没有崩解释放，240min各水溶性成分的累积释放率均较低未超过40％；在模拟肠液的崩解较模拟胃液中快，但各水溶性成分在360min的累积释放率仍低于原料药和纳米冻干粉，未超过60％。原料药中的难溶性成分洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞水在模拟胃液与模拟肠液中累积释放率较低，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的累积释放率均为零；冻干粉中的洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞水难溶性成分在模拟胃液中在120min的累积释放率分别是原料药的1.77、2.26、1.82倍，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的累积释放率分别为(34.55±3.36)％、(38.65±0.83)％、(41.08±2.39)％；冻干粉中的洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞水难溶性成分在模拟肠液中在360min的累积释放率分别是原料药的2.00、4.18、2.62倍，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的累积释放率分别为(72.39±8.29)％、(61.68±6.34)％、(75.43±2.58)％；冠心宁片中未包含洋川芎内酯A等水难溶性成分，在模拟胃肠液中未检测到。
发明人还对纳米冻干粉的稳定性做了测定，发现在4℃放置6个月，粒径、PDI、电位、各成分含量均未出现显著性变化，存放稳定性良好。
综上本发明纳米混悬冻干制剂同时包含了丹参和川芎的水溶性有效成分和难溶性有效成分，巧妙的将丹参提取物和川芎提取物制成纳米混悬体系后冷冻干燥，制成的制剂用水再分散后依旧能保持较原液的粒径及分布、电位等性质，尤其是难溶性成分的表观溶解度显著提高，在模拟胃液试验中能有效溶出，为临床应用川芎和丹参提供了一种新的技术思路。

Claims (10)

1.基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：它是以丹参提取物、川芎提取物为原料制成的口服冻干制剂，川芎提取物、丹参提取物的成分含量如下：
Figure FDA0002499568770000011
所述丹参提取物、川芎提取物的重量配比为8-12:6-10；其制备方法包括如下步骤：
A、制备纳米混悬液：将丹参提取物、川芎提取物制成100-1000nm的纳米混悬液；
B、将步骤A所得纳米混悬液冷冻干燥制成冻干粉。
2.根据权利要求1所述的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：川芎提取物、丹参提取物的成分含量如下：
Figure FDA0002499568770000012
3.根据权利要求1或2所述的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：所述丹参提取物、川芎提取物的重量配比为10:8。
4.根据权利要求1所述的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：步骤A制备纳米混悬液的方法为：反溶剂沉淀后探头超声法、水浴超声下反溶剂沉淀法、水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法；
优选的，步骤A制备纳米混悬液的方法采用水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法。
5.根据权利要求4所述的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：步骤A制备纳米混悬液时，在水相中添加了稳定剂；所述添加稳定剂的方法为：按丹参提取物和川芎提取物总量与稳定剂质量比为1:0.25-1:1称取稳定剂，稳定剂加入到水中，搅拌溶解，即得稳定剂水溶液。
6.根据权利要求5所述的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：所述稳定剂为泊洛沙姆188、聚乙烯吡咯烷酮-K30、吐温80、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇；
优选的，所述稳定剂为吐温80或十二烷基硫酸钠；
最优选的，所述稳定剂为吐温80。
7.根据权利要求5所述的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
所述稳定剂的添加量为丹参提取物和川芎提取物总量与稳定剂的重量比为1:0.25-1:1；
优选的，采用吐温80为稳定剂，丹参提取物和川芎提取物总量与稳定剂的重量比为1:0.5-1:1；
最优选的，采用吐温80为稳定剂，丹参提取物和川芎提取物总量与稳定剂的重量比为1:1；
优选的，采用十二烷基硫酸钠为稳定剂，丹参提取物和川芎提取物总量与稳定剂的重量比为1:0.25-1:1；
最优选的，采用十二烷基硫酸钠为稳定剂，丹参提取物和川芎提取物总量与稳定剂的重量比为1:1。
8.根据权利要求1所述的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
步骤B是在纳米混悬液中加入冻干保护剂后，再进行冷冻干燥；
优选的，所述冻干保护剂为麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖；
最优选的，所述冻干保护剂为麦芽糖、甘露醇、葡萄糖；
优选的，冻干保护剂添加量为4-12g/100ml；
优选的，所述冷冻干燥的条件为：-40--20℃预冻2-8h后，再采用-40--80℃预冻12-24h，然后在5-30℃和低于15mTorr压力下升华干燥12-24h；
最优选，所述冷冻干燥的条件为：-20℃预冻2h后，再采用-80℃预冻24h，然后在25℃和低于15mTorr压力下升华干燥24h。
9.根据权利要求4所述的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
采用所述水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法：
1)按重量配比称取丹参提取物、川芎提取物，配制成提取物总浓度为0.03～0.2g·mL-1的85-100％v/v乙醇溶液，超声至少10min后，以3000rpm及以上的速度离心至少10min；
2)水相和离心上清液按体积比称取：水相与离心上清液体积比为5:1～20:1；水相置于温度0～15℃的超声水浴中，在800-2000rpm搅拌、200-500W水浴超声下快速加入离心上清液，离心沉淀用适量纯水溶解后一并加入；
3)继续超声搅拌30-60min后连接减压装置，减压至压力＜-0.09Mpa和水浴超声状态下挥除乙醇至无明显乙醇气味，所得混悬液再在800-2000W的超声功率下探头超声至少3min；
优选的，所述水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法中步骤1)乙醇溶液为90％v/v；
优选的，所述水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法中步骤2)磁力搅拌为1000-1200rpm，水浴超声为300W；
优选的，所述水浴超声下反溶剂沉淀后再探头超声法中步骤3)超声功率优选1400-1800W；超声时间优选5-7min；
采用水浴超声下反溶剂沉淀法：
1)按重量配比称取丹参提取物、川芎提取物，配制成提取物总浓度为0.03～0.2g·mL-1的85-100％v/v乙醇溶液，超声不少于10min后，以3000rpm及以上的速度离心至少10min；
2)水相和离心上清液按体积比称取：水相与离心上清液体积比为5:1～20:1；水相置于温度0～15℃的超声水浴中；在800-2000rpm搅拌、200-500W水浴超声下快速加入离心上清液，离心沉淀用适量纯水溶解后一并加入；
3)继续超声搅拌30-60min后连接减压装置，减压至压力＜-0.09Mpa和水浴超声状态下挥除乙醇至无明显乙醇气味，即得；
优选的，所述水浴超声下反溶剂沉淀法中步骤1)乙醇溶液为90％v/v；
优选的，所述反溶剂沉淀后探头超声法中步骤2)磁力搅拌为1000-1200rpm，水浴超声为300W；
采用反溶剂沉淀后探头超声法：
1)按重量配比称取丹参提取物、川芎提取物，配制成提取物总浓度为0.03～0.2g·mL-1的85-100％v/v乙醇溶液，超声不少于10min后，以3000rpm及以上的速度离心至少10min；
2)水相和离心上清液按体积比称取：水相与离心上清液体积比为5:1～20:1；在800-2000rpm的磁力搅拌下将离心上清液快速加入到水相中，离心沉淀用适量纯水溶解后一并加入；
3)继续超声搅拌30-60min后连接减压装置，减压至压力＜-0.09Mpa和水浴超声状态下挥除乙醇至无明显乙醇气味，所得混悬液再在超声功率800-2000W的条件下探头超声至少3min；
优选的，所述反溶剂沉淀后探头超声法中步骤1)乙醇溶液为90％v/v；
优选的，所述反溶剂沉淀后探头超声法中步骤2)磁力搅拌为1000-1200rpm；
优选的，所述反溶剂沉淀后探头超声法中步骤3)超声功率优选1400-1800W；超声时间优选5-7min。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法制备而得的基于冠心宁改进的纳米混悬冻干制剂；
优选的，所述纳米混悬液中90％以上的洋川芎内酯A、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA粒径分布为小于400nm。
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