CN115590815B - 厚朴酚纳米混悬剂及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厚朴酚纳米混悬剂及其制备与应用,本发明提供的厚朴酚纳米混悬剂中厚朴酚和表面活性剂的质量比为1:(4‑14),表面活性剂优选聚醚F68。本发明还进一步提供了上述厚朴酚纳米混悬剂的冻干粉,其制备方法简单易行、质量可控、便于工业化生产。经试验,本发明提供的厚朴酚纳米混悬剂的粒径小且分布均一,既能提高药物制剂在水中的溶解度,又能增加药物的体内生物利用度,增强厚朴酚抗寄生原虫的作用,特别是抗多子小瓜虫的作用,达到高效的治疗目的。
Description
技术领域
本发明属于天然渔药加工技术领域,涉及厚朴酚纳米混悬剂的制备及其在杀灭寄生原虫中的应用。
背景技术
厚朴(Magnolia officinalis Rehder&E.Wilson),为厚朴或凹叶厚朴的根、茎及枝等部位的外皮。从厚朴中分离出来的羟基化联苯化合物厚朴酚(magnolol),具有抗炎、清除自由基、减轻创伤性脑损伤、减轻急性肺损伤等作用。此外,厚朴酚还具有抗变态反应、抗焦虑、抗抑郁、抗表皮细胞紫外线损伤等多重药理活性。厚朴酚虽具有广泛的生理活性,但不溶于水,在临床上直接使用存在障碍,其进一步应用受到限制。
纳米混悬剂是近年来为难溶性药物开发的新型制剂形式,是一种含有适量表面活性剂的亚微米胶体分散体系,不含其他载体材料。纳米混悬剂具有制备方法简单、载药量高等特点。纳米混悬剂不仅具有良好的安全性,而且可以通过控制纳米混悬剂中药物颗粒的粒度范围并进行表面改性,实现药物的靶向给药,在增强药效的同时减小药物的毒副作用。具体地,纳米混悬剂的优势主要表现为:(1)改善药物的溶解度,无论给药途径如何,纳米混悬剂中的固体纳米颗粒必须在药物有效成分发挥局部或全身治疗效果之前作为组分溶解。药物的溶出速率由粒径的大小决定,药物粒径的大小与溶出率呈负相关。因此,分子的形成速率越快,起效也就越快,进而生物利用度也就越高。(2)提高药物制剂安全性,纳米混悬剂处方中辅料用量少,载药量高,可降低或清除辅料对生物体的毒副作用。(3)增强药物粒子的黏附性,由于纳米混悬剂小粒径和大比表面积的特质,纳米混悬剂倾向于粘附到胃肠生物膜的表面,增加药物颗粒在消化道中的停留数量,进而促进吸收,利于提高药物生物利用度。(4)实现靶向给药,通过控制纳米混悬剂中药物颗粒的粒度范围并进行表面改性,可以实现药物的靶向给药,主要涉及脑靶向和肺靶向。
目前,尚无关于厚朴酚纳米混悬剂的制备方法,以及其在杀灭寄生原虫,尤其是鱼类寄生原虫方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种厚朴酚纳米混悬剂,以及厚朴酚纳米混悬剂的制备方法,并给出厚朴酚纳米混悬剂在杀灭鱼类寄生原虫方面的应用。
本发明所述的厚朴酚纳米混悬剂的制备组分包括厚朴酚和表面活性剂,其中厚朴酚和表面活性剂的质量比为1:(4-14),表面活性剂选自聚醚F68、聚醚F127、吐温-80、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠中的一种。
本发明还提供了上述厚朴酚纳米混悬剂的制备方法,具体包括:
1.将厚朴酚溶解于有机溶剂中形成含药有机相;
2.将表面活性剂溶解形成水相;
3.将含药有机相在搅拌条件下注入水相;
4.除去有机溶剂,得到所述厚朴酚纳米混悬剂。
进一步地,本发明分别单因素考察了表面活性剂种类、表面活性剂加入量、厚朴酚浓度、制备温度、有机相注入速度、搅拌速度及搅拌时间对纳米混悬剂粒径的影响。
优选地,本发明中表面活性剂选用聚醚F68,其中厚朴酚和聚醚F68的质量比为1:6.599或1:8。
更优选地,本发明中厚朴酚和聚醚F68的质量比为1:6.599,含药有机相在温度0℃,以120s/mL的速度注入水相,搅拌速度为1000r/min,搅拌时间为9.899min,除去有机溶剂,本发明所制得的厚朴酚纳米混悬剂中厚朴酚浓度为7mg/mL。
本发明还进一步制备了上述厚朴酚纳米混悬剂的冻干粉,其制备方法是向上述厚朴酚纳米混悬剂中添加冻干保护剂,经冷冻干燥制得。其中,冻干保护剂选自甘露醇、葡萄糖、半乳糖中的一种。本发明中优选甘露醇,且甘露醇与厚朴酚的质量比优选为1:1。
基于上述优选方案制备得到的厚朴酚纳米混悬剂冻干粉,本发明对其复溶所得的混悬剂进行了表征试验,具体包括粒径及PDI测量、透射电子显微镜观察、差示扫描量热分析(DSC)与红外光谱(IR)分析。结果显示,纳米混悬剂平均粒径为32.27nm、制备冻干粉复溶后平均粒径为34.79nm,多分散系数PDI均小于0.3,说明所得纳米混悬剂粒径分布均匀。
本发明还进一步对制备得到的厚朴酚纳米混悬剂进行了体外释放试验与稀释稳定性试验,以7mg/mL的厚朴酚溶液作为对照。体外释放试验结果显示本发明所提供的纳米混悬剂和厚朴酚在前60min的累积释放量分别为85.70%和28.13%,纳米混悬剂的释放量始终大于游离厚朴酚的释放量,这是由于纳米混悬剂粒径小,比表面积大,有利于释放;稀释稳定性试验结果显示厚朴酚纳米混悬剂的粒径在稀释后粒径稳定在40nm左右,说明纳米混悬剂的稳定性良好,可以保持颗粒大小恒定。
此外,本发明还给出了厚朴酚纳米混悬剂对金鱼的急性毒性试验,经测试,当厚朴酚浓度小于2mg/L时,96h内没有发现任何金鱼死亡且试验鱼未表现出任何不适;当药物浓度达到2mg/L时,试验鱼呼吸略显急促并且游动频率加快,随着时间进行到96h后所有不适症状逐渐消失,在72h内有1尾金鱼出现死亡;当浓度大于等于6mg/L时,所有金鱼死亡并且绝大部分金鱼死亡时间在24h以内。
进一步地,本发明还通过浸浴、口服两种方式测试了厚朴酚纳米混悬剂对金鱼体内多子小瓜虫的杀灭效果,结果显示本发明所制备的厚朴酚纳米混悬剂能显著增强厚朴酚抗寄生原虫的作用,特别是抗多子小瓜虫的作用。
通过上述技术方案,结合实施例,本发明提供的厚朴酚纳米混悬剂或其冻干粉至少具有下述有益效果或优点:
1.本发明制备的厚朴酚纳米混悬剂的平均粒径为32.27nm、PDI为0.205;本发明制备的厚朴酚纳米混悬剂冻干粉与厚朴酚按质量比例1:1复溶所得的平均粒径为34.79nm、PDI为0.221。其平均粒径小且分布均匀,既能提高药物储存的稳定性,又能增加药物在体内的吸收量,提高药物的生物利用度,达到高效治疗目的。
2.本发明制备的厚朴酚纳米混悬剂更有利于在体外释放,其在前60min的累积释放量为85.70%,可显著提高厚朴酚的溶解度。
3.本发明制备的厚朴酚纳米混悬剂的粒径在稀释后依然稳定在40nm左右,具有良好的稳定性。
4.本发明制备的厚朴酚纳米混悬剂对鱼类毒性小,当其中厚朴酚浓度小于2mg/L时,对金鱼几乎没有毒性。
5.本发明制备的厚朴酚纳米混悬剂能显著增强厚朴酚抗寄生原虫的作用,特别是抗多子小瓜虫的作用。
6.本发明所述的厚朴酚纳米混悬剂的制备方法简单易行、质量可控、便于工业化生产。
附图说明
图1为用不同表面活性剂制备得到的纳米混悬剂,从左至右所用表面活性剂依次为:厚朴酚(H2O,无表面活性剂)、聚醚F68、吐温-80、SDS、聚醚F127、PVPk30、CMC-Na。
图2为平均粒径的三维响应曲线。
图3为所述厚朴酚纳米混悬剂冻干粉复溶后的粒径分布图。
图4为所述厚朴酚纳米混悬剂的透射电镜图。
图5为所述厚朴酚纳米混悬剂的差示扫描量热分析图。
图6为所述厚朴酚纳米混悬剂的红外光谱图。
图7为所述厚朴酚纳米混悬剂的体外释放率曲线图。
图8为1.5mg/mL的厚朴酚纳米混悬剂浸浴对多子小瓜虫繁殖的影响。
图9为2.5mg/mL的厚朴酚纳米混悬剂浸浴对多子小瓜虫繁殖的影响。
图10为口服给药小瓜虫的寄生数量对比图。
图11为口服给药金鱼的存活率对比图。
具体实施方式
下面,结合实施例对本发明的技术方案进行说明,但是,本发明并不限于下述的实施例。
实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场获得的常规产品。
实施例1
本实施例描述制备厚朴酚纳米混悬剂的方法,并介绍厚朴酚纳米混悬剂性能评价指标的测定。
厚朴酚纳米混悬剂制备方法:称取厚朴酚溶解于有机溶剂中形成含药有机相。选用适宜的表面活性剂,以特定比例加入超纯水,待其充分溶胀后,迅速搅拌溶解形成水相。将含药有机相在搅拌条件下注入水相形成初悬液。再除去有机溶剂,得到本发明所述厚朴酚纳米混悬剂。
在本实施例中,有机溶剂优选条件至少包括:1)对厚朴酚具有优良的溶解性;2)对水产动物,尤其是鱼类的毒性要小或无毒性;3)易于通过加热或挥发等方式除去,在厚朴酚纳米混悬剂中的残留量少;4)残留的有机溶剂对水产动物安全,对水产养殖环境安全。
在本实施例中,表面活性剂选自聚醚F68、聚醚F127、吐温-80、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP k30)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中的一种或几种。为获得本发明所要求的性能优良的厚朴酚纳米混悬剂,厚朴酚与表面活性剂的投加量具有适宜的特定比例范围,以质量比计,优选为1:(4-14),并且表面活性剂优选为单一表面活性剂。
本实施例进一步描述出一种制备厚朴酚纳米混悬剂的方法,具体方法如下:
1.精密称取厚朴酚30mg溶解于2mL无水乙醇中形成含药有机相。
2.按照质量比1:(4-14)取单一表面活性剂,加入5mL超纯水待其充分溶胀后,迅速搅拌溶解形成水相。
3.在0℃环境中,将新鲜制备的含药有机相于1000r/min磁力下注入水相形成初悬液。
4.于50℃下旋转蒸发除去乙醇,即得到6mg/mL的纳米混悬剂。
实施例2
本实施例描述厚朴酚纳米混悬剂制备方法所涉及条件的优选。
1.表面活性剂
精密称取厚朴酚30mg溶解于2mL无水乙醇中形成含药有机相。按照1:7的质量比称取210mg的单一表面活性剂(聚醚F68、聚醚F127、吐温-80、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠),加入5mL超纯水待其充分溶胀后迅速搅拌溶解形成水相。随后,在0℃环境中,将新鲜制备的含药有机相于室温1000r/min磁力下60s内注入水相形成初悬液,搅拌15min,再50℃旋转蒸发除去乙醇,即得到6mg/mL的厚朴酚纳米混悬剂。同时,取6mg/mL厚朴酚水溶液作为对比,测定粒径及多分散指数。不同表面活性剂的外面观察见附图1。选用不同表面活性剂的粒径及多分散指数测定结果见表1。
以聚醚F68为表面活性剂的厚朴酚纳米混悬剂粒径最小,为97.29nm,且PDI(0.208)<0.3,粒径分布均一,外观澄清透明,为最佳供选的表面活性剂。
表1,表面活性剂的筛选
2.厚朴酚与表面活性剂的最适配比
同上制备厚朴酚纳米混悬剂,选用聚醚F68为表面活性剂。不同厚朴酚与表面活性剂配比(1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14),测定厚朴酚纳米混悬剂的粒径,确定表面活性剂与厚朴酚的最佳质量配比,测试结果见表2。
表2,厚朴酚与表面活性剂配比筛选
由表2看出,当厚朴酚与表面活性剂聚醚F68质量比为1:8时,所得纳米混悬剂的粒径最小。
3.纳米混悬剂中厚朴酚的最适浓度
固定厚朴酚与表面活性剂聚醚F68质量比为1:8,同上制备不同厚朴酚浓度(4、5、6、7、8mg/mL)的纳米混悬剂。通过测试其粒径变化,确定配方所需最佳药物浓度,测试结果见表3。
表3,厚朴酚浓度筛选
由表3看出,当厚朴酚浓度为7mg/mL时,所得纳米混悬剂的粒径最小。
4.最佳制备温度
固定厚朴酚与表面活性剂聚醚F68质量比为1:8,同上制备7mg/mL的纳米混悬剂。含药有机相在不同温度(0、5、10、15、20、30℃)下注入水相。通过测试其粒径大小,确定制备的最佳温度,测试结果见表4。
表4,制备温度的筛选
由表4看出,制备温度为0℃时,所得纳米混悬剂的粒径最小。
5.有机相的注入速度
将表面活性剂聚醚F68与厚朴酚分别制成水相及有机相,在最佳温度0℃下,利用注射器吸取有机相溶液,在不同时间(0、30、60、90、120、150、180s/mL)下分别注入2mL有机相,其余制备方法及条件与上述纳米混悬剂相同。通过测试其粒径变化,确定最佳注入速度,测试结果见表5。
表5,注入速度的筛选
由表5看出,当注入速度为120s/mL时,所得纳米混悬剂的粒径最小。
6.最适搅拌速度
将表面活性剂聚醚F68与厚朴酚分别制成水相及有机相,在最佳制备温度0℃下,利用注射器吸取有机相溶液,在不同搅拌速度(0、500、1000、1500、2000r/min)下分别用注射器快速注入2mL有机相,其余制备方法及条件与上述纳米混悬剂相同。通过测试其粒径变化,确定最适搅拌速度,测试结果见表6。
表6,搅拌速度的筛选
由表6测定结果得出,当搅拌速度为1000r/min时,所得纳米混悬剂的粒径最小。
7.最佳搅拌时间
将表面活性剂聚醚F68与厚朴酚分别制成水相及有机相,在最佳制备温度0℃下,利用注射器吸取有机相溶液,在不同搅拌时间(0、5、10、15、20、25、30min)下分别用注射器注入2mL有机相,其余制备方法及条件与上述纳米混悬剂相同。通过测试其粒径变化,确定最佳搅拌时间,结果见表7。
表7,搅拌时间的筛选
由表7结果得出,当搅拌时间为10min时,所得纳米混悬剂的粒径最小。
实施例3
本实施例基于实施例2中单因素试验结果,选择温度、聚醚F68与厚朴酚的比例、搅拌速度三项对粒径进行星点设计-效应面法进一步优化配方。
本实施例以单因素试验结果为依据,采用星点设计-效应面法优化工艺。根据星点设计原理,每个因素设5个水平,分别用代码值-1.6818、-1、0、1、1.6818表示,进行模型拟合和方差分析。以粒径(Y)作为因变量,温度(A)、聚醚F68与厚朴酚的比例(B)、搅拌速度(C)为自变量,应用软件进行Design-Expert 12多元线性回归和多项式方程拟合,采用复相关系数(r)对模型好坏进行评价。采用ANOVA分析效应面的回归参数。
本实施例共进行了20个实验,研究了配方和加工因素对粒径分布的影响。实验设计所有实验运行的响应数据见表8和表9。
表8,纳米混悬剂的响应值
表9,粒度分布的拟合摘要
如表9所示,模型通常根据F值和p值(概率)进行选择,在本实施中,最小概率值(p值)为<0.0001,最大F值为28.82的粒度响应,这表明结果具有很高的意义。
表10,从全因子设计中分析因变量的方差表
如表10所示,应用方差分析来确定主要变量及其相互作用的影响的显著性和大小,方差分析表确认线性模型的充分性。对于粒径分布,温度、表面活性剂与药物的比值和搅拌时间均被确定为重要的模型项。响应Y的方程如下:
Y=146.08+161.82A+93.94B-92.74C+59.65AB-60.92AC-59.66BC+58.14A2+29.07B2+198.57C2
平均粒径的三维响应曲线见附图2。根据附图2及响应方程所得的选定变量的最佳值A,B,C分别为的0℃、6.599和9.899min,以获得所需的响应Y=32.275nm。
根据单因素(实施例2)和星点设计-效应面法(实施例3)优化得到厚朴酚纳米混悬剂的制备工艺参数为:选择聚醚F68作为表面活性剂,聚醚F68与厚朴酚比例为1:6.599、厚朴酚浓度7mg/mL、温度0℃、搅拌时间9.899min、有机相加入速度120s/mL、搅拌速度1000r/min。
实施例4
在上述纳米混悬剂优选工艺参数的基础上,进一步制备成纳米混悬剂冻干粉,并对冻干保护剂的种类进行筛选。
1.冻干保护剂的筛选
向纳米混悬剂中添加不同种类的冻干保护剂(甘露醇、葡萄糖、半乳糖),冻干保护剂的投加量为30mg。充分搅拌混匀后于室温环境中静置3-5min。移入同等大小的烧杯,以透气性封口膜覆盖,冷冻干燥24h后制得纳米混悬剂冻干粉。通过复溶后的粒径变化,确定冻干保护剂的种类,测试结果见表11。
表11,冻干保护剂种类的筛选
根据表11的测定结果,当冻干保护剂选用甘露醇时,复溶后纳米混悬剂的粒径最小。据此,可以选用甘露醇作为冻干保护剂。
2.确定甘露醇的最适用量
设定冻干保护剂甘露醇与厚朴酚的质量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1。将纳米混悬剂制成冻干粉,通过复溶后的粒径变化,确定冻干保护剂的最适用量,测试结果见表12。
表12,冻干保护剂甘露醇用量的筛选
根据表12的测定结果得出,当甘露醇与厚朴酚的质量比为1:1时,复溶所得的纳米混悬剂粒径最小。
实施例5
以实施例3得出的优化工艺参数和实施例4优选的冻干保护剂,制备厚朴酚纳米混悬剂及其冻干粉。本实施例对厚朴酚纳米混悬剂性能评价指标进行测定。
1.粒径和PDI
厚朴酚纳米混悬剂冻干粉复溶后,在室温下平衡3分钟后,采用动态光散射技术(ZEN3600,Malvern Instruments Limited,UK)对纳米混悬剂的粒径大小、分布及多分散性指数(PDI)进行测量。测量结果见附图3,厚朴酚纳米混悬剂的平均粒径为32.02nm,多分散系数PDI小于0.3,说明所制得的厚朴酚纳米混悬剂粒径分布均匀。
2.透射电子显微镜观察
取厚朴酚纳米混悬剂冻干粉100mg,用10mL超纯水溶解,稀释不同倍数(5、10、30)后。将稀释样品滴在电镜铜网上,于真空干燥箱中烘干,并将铜网固定在样品插座中,待过渡室真空度达到要求后将样品推至样品室,观察粒径和形态。透射电子显微镜(TECNAI G2SPIRIT BIO,美国FEI公司,放大倍数×70K)观察结果见附图4。如附图4所示,表面活性剂聚醚F68附着于厚朴酚表面,粒径小于50nm,且粒径均一。
3.差示扫描量热分析(DSC)
分别称取厚朴酚、表面活性剂聚醚F68、厚朴酚纳米混悬剂(纳米混悬剂)冻干粉3组样品,每组样品均8mg置于铝钳锅中,以另一个空铝钳锅为空白对照,在氮气环境下升温(速率10℃/min;30~150℃),通过对样品进行DSC分析,研究厚朴酚纳米混悬剂的相变温度变化,判断厚朴酚纳米混悬剂中是否存在结晶性厚朴酚。分析结果见附图5。如附图5所示,厚朴酚的DSC在105℃时显示出单一的尖锐吸热融合峰,对应药物的熔点。聚醚F68和厚朴酚纳米混悬剂的DSC光谱在52.98℃和49.92℃时也分别表现出吸热熔融峰,纳米混悬剂峰向前移动,厚朴酚峰消失。
4.红外光谱(IR)分析
分别称取适量的厚朴酚、表面活性剂F68、厚朴酚与表面活性剂混合物(1:8比例混合)、厚朴酚纳米混悬剂冻干粉,用溴化钾压片法(溴化钾:样品=100:1)进行红外光谱测定,判断红外吸收图谱官能团区和指纹区的变化,对厚朴酚纳米混悬剂进行表征分析。分析结果见附图6,如附图6所示,厚朴酚纳米混悬剂3153cm-1和1225cm-1的吸收峰和酚羟基相关,1728cm-1和1681cm-1的峰分别与乙烯基环和苯环有关。不存在任何其他新峰,并且在厚朴酚纳米混悬剂中吸收带的位置也没有差异,表明厚朴酚和聚醚F68之间缺乏显著的相互作用。
实施例6
以实施例3得出的优化工艺参数和实施例4优选的冻干保护剂,制备厚朴酚纳米混悬剂,并对其进行体外释放试验。
取厚朴酚纳米混悬剂与厚朴酚溶液各5mL,各取三份装入透析袋,在30mLPBS缓冲液中进行透析,透析开始后于5、10、15、20、30、45、60、90、120min各取样0.5mL,用色谱甲醇定容到lmL。依次进样,用HPLC检测并计算厚朴酚及厚朴酚纳米混悬剂的释放率。
释放率曲线见附图7,如附图7所示,厚朴酚纳米混悬剂的释放量始终大于游离厚朴酚的释放量,厚朴酚纳米混悬剂粒径小,比表面积大,利于释放。厚朴酚纳米混悬剂和厚朴酚在前60min的累积释放量分别为85.70%和28.13%。
实施例7
以实施例3得出的优化工艺参数和实施例4优选的冻干保护剂,制备厚朴酚纳米混悬剂,并对其稀释稳定性进行评价。
厚朴酚纳米混悬剂冻干后按照原体积(5mL)进行复溶。同时分别稀释10、50、100、200倍,使用动态光散射技术测定其粒径,测试结果见表13。
表13,不同稀释倍数的粒径测定值
由表13得出,厚朴酚纳米混悬剂的粒径在稀释后粒径稳定在40-50nm范围内,说明厚朴酚纳米混悬剂的稳定性良好,可以保持颗粒大小恒定。
实施例8
以实施例3得出的优化工艺参数和实施例4优选的冻干保护剂,制备厚朴酚纳米混悬剂,并检测其对金鱼的急性毒性。
1.试验动物
本实施例所用金鱼购于陕西省朱雀路花鸟市场,要求体质健壮,规格一致,平均体重4.2g。购回后在实验室水族箱中暂养10d,每天投喂2次,投入的金鱼专用饲料(购于陕西省朱雀路花鸟市场)在10min内吃完为限。待适应实验室环境条件后再进行毒性试验。
2.试验方法
本实施例利用96小时静态换水生物测试测定厚朴酚对金鱼的急性毒性。首先通过预试验确定96小时内导致金鱼100%死亡和不致死的厚朴酚浓度。结果显示,96小时内厚朴酚浓度为6mg/L时导致金鱼100%的死亡,而1.0mg/L时不导致金鱼死亡。
基于预试验的结果,在1.0-7.0mg/L之间按等差关系设置系列浓度,然后将金鱼置于若干10L的水箱中(每箱30尾金鱼),分别浸泡在厚朴酚浓度为1、2、3、4、5、6和7mg/L(厚朴酚纳米混悬剂以厚朴酚的浓度计,下文同)的溶液中96h。此外,还设立一个空白对照组(不添加药物)以及添加56mg/L(导致全部死亡的对应聚醚F68的浓度)聚醚F68组,30条金鱼置于盛有曝气自来水的水箱中。实验期间不进行换水,每隔24小时测定每个水箱中的水质参数(溶氧、pH和温度)。每天观察和记录水箱中的金鱼死亡情况并且及时捞出死鱼避免污染水质。实验期间(96小时)不投喂所有的实验鱼,试验结果见表14。
表14,厚朴酚纳米混悬剂对金鱼的急性毒性
由表14所示,当厚朴酚浓度小于2mg/L时,96h内没有发现任何金鱼死亡且试验鱼未表现出任何不适;当药物浓度达到2mg/L时,试验鱼呼吸略显急促并且游动频率加快,在72h内有1尾金鱼出现死亡,而随着时间进行到96h后所有不适症状逐渐消失;而浓度大于等于6mg/L时,用药物浸泡则会导致所有金鱼死亡并且绝大部分的金鱼死亡时间在浸泡开始的24h以内。同时,56mg/L聚醚F68不会对金鱼产生毒性。
实施例9
以实施例3得出的优化工艺参数制备厚朴酚纳米混悬剂,并测试其对多子小瓜虫的杀灭效果。本实施例所用试验动物为金鱼,饲养金鱼的饲料,同实施例8。
1.小瓜虫的收集与计数
本实施例所用小瓜虫是从患病金鱼分离得到。收集小瓜虫的方法:将若干严重寄生小瓜虫的金鱼置于装有300mL过滤水的烧杯30分钟。由于金鱼不停地游动,成熟的小瓜虫从金鱼体表脱落,用吸管收集脱落的小瓜虫包囊。然后将收集到的包囊在22.5±0.5℃温度中培养18~20h得到小瓜虫幼虫。小瓜虫计数方法:用移液器移取1μL的幼虫悬液置于载玻片上,并在解剖镜下计数,重复十次,取平均值作为小瓜虫幼虫悬液浓度,再据此浓度计数小瓜虫。
2.含药饲料制备
金鱼每天按照鱼体重的3%进行饲喂,厚朴酚纳米混悬剂组及厚朴酚组按照厚朴酚量90mg/kg/d金鱼体重使用药物,表面活性剂聚醚F68对照组饲料600mg/kg/d金鱼体重。将对应药物溶解于5mL溶剂中,厚朴酚组溶剂为乙醇:水=50:50(v/v),厚朴酚纳米混悬剂组、表面活性剂聚醚F68对照组溶剂为蒸馏水。超声充分溶解,继续加入10mL蒸馏水,混合均匀,边搅拌边将药物均匀喷洒于饲料表面,将药物喷洒完全。空白对照组喷洒对应的蒸馏水。喷药饲料室温放置5h,烘箱烘干12h。
3.试验方法
3.1浸浴给药试验
将24尾患小瓜虫病的金鱼平均分配到以厚朴酚计浓度为1.5mg/L的厚朴酚纳米混悬剂溶液中,选择对应量的厚朴酚、聚醚F68及无药物分别作为阴性对照。分别在1h、3h和5h后各收集30个小瓜虫包囊前体放入24孔板中(N=3),终体积为1mL,然后将24孔板置于恒温培养箱(22.5±0.5℃)中孵育22-24h。取出24孔板在显微镜下记录每孔繁殖出小瓜虫掠食体的数量,重复3次。将小瓜虫繁殖力定义为小瓜虫繁殖出掠食体的平均数量。
以上述方法进行2.5mg/L纳米混悬剂的浸浴给药试验,实验重复3次。
浸浴给药试验结果见附图8和附图9。1.5、2.5mg/L的厚朴酚纳米混悬剂均能显著提高厚朴酚浸浴抗多子小瓜虫的效果,影响多子小瓜虫的繁殖力,显著降低掠食体的产生数量。另外,也可以得出,表面活性剂聚醚F68对多子小瓜虫无杀灭效果,不会影响多子小瓜虫的繁殖。
3.2口服给药试验
将48尾健康金鱼平均分配到厚朴酚纳米混悬剂组、厚朴酚组、聚醚F68组和不加药物对照组。厚朴酚纳米混悬剂组通过口服方式给予90mg/kg的厚朴酚纳米混悬剂,厚朴酚组、聚醚F68组和不加药物对照组饲喂相同量对应饲料,每日饲喂3次。连续给药7d后,人工感染小瓜虫,即每组放入相同感染水平的患病金鱼2条,继续饲喂对应饲料,连续观察22天,每日统计各组试验鱼的死亡情况及小瓜虫的感染量,重复3次,评价口服厚朴酚纳米混悬剂对金鱼小瓜虫病的防治效果。
试验结果见附图10和附图11,口服给药90mg/kg厚朴酚纳米混悬剂均能显著降低小瓜虫的感染量,提高金鱼的存活率,显著提高厚朴酚抗多子小瓜虫活性;且表面活性剂聚醚F68对多子小瓜虫的感染及金鱼的存活率无显著影响。
因此,本实施例得出纳米混悬剂能显著增强厚朴酚抗寄生原虫的作用,特别是抗多子小瓜虫的作用。
如上所述,即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进,均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种制备厚朴酚纳米混悬剂的方法,其特征在于,厚朴酚溶解于乙醇中形成含药有机相;表面活性剂聚醚F68溶解形成水相;所述厚朴酚和聚醚F68的质量比为1:6.599;将含药有机相在温度0℃,以120s/mL的速度注入水相,搅拌速度1000r/min,搅拌时间9.899min;除去有机溶剂,制得厚朴酚浓度为7mg/mL的厚朴酚纳米混悬剂。
2.权利要求1制备的厚朴酚纳米混悬剂在制备杀灭鱼类多子小瓜虫的药物中的应用。
3.权利要求1制备的厚朴酚纳米混悬剂在制备通过浸浴、口服方式杀灭鱼类多子小瓜虫药物中的应用。
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