CN112057632A - 一种复合型阿霉素脂质体及其制备方法 - Google Patents

一种复合型阿霉素脂质体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种复合型阿霉素脂质体及其制备方法。本发明所述复合型阿霉素脂质体是先将维生素E琥珀酸酯和菊糖反应得到维生素E琥珀酸酯‑菊糖衍生物INVE，随后以薄膜水化法和硫酸铵梯度法结合制备得到阿霉素脂质体后，以INVE对阿霉素脂质体进行修饰，得到INVE修饰的复合型阿霉素脂质体。经相关实验表明，经INVE修饰的阿霉素脂质体可逆转肿瘤对DOX的多药耐药性，减少DOX的毒副作用，并且可以高效靶向于肿瘤部位，增强治疗效果，同时本发明所述复合型阿霉素脂质体的制备方法操作简单，工艺条件比较温和，采用常规设备即可制备得到。

Description

一种复合型阿霉素脂质体及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种复合型阿霉素脂质体及其制备方法。
背景技术
癌症严重威胁着人类的生命健康，如今已成为全世界导致人体死亡的主要原因。化疗是临床上治疗癌症的主要手段之一，但大部分的化疗药物在体内缺乏选择性，无法对肿瘤部位进行靶向，会产生明显的毒副反应，而且肿瘤的多药耐药性也是化疗失败的原因之一，这些因素严重限制了化疗药物在临床上的应用。
阿霉素(Doxorubicin，DOX)作为一种蒽环类抗肿瘤药物，其主要作用机理是嵌入DNA碱基对之间，并紧密结合到DNA上，从而抑制核酸的合成。其抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。尽管阿霉素作为临床上抗癌一线用药，但是会引起脱发、骨髓抑制和心脏毒性等毒副反应。
脂质体作为一种新型纳米载药系统，是以磷脂和胆固醇为主要膜材所组成的微型泡囊。它具有良好的靶向性、细胞亲和性与组织相容性、缓释性、降低药物的毒性以及提高药物稳定性等优点，已广泛应用于抗肿瘤药物、抗寄生虫药物、抗菌药物、激素药物等的载体。
菊糖(Inulin)作为一种天然的果聚糖型多糖，广泛存在于菊科和桔梗科植物中，尤其是在大丽花块茎、菊芋和菊苣等植物中含量丰富。菊糖由β-D-果糖经过(2→1)糖苷键连接聚合而成，其分子末端通常含有以(1→2)键合的α-D-葡萄糖，这些果糖链的长度在2-60个单体之间变化。它具有改善肠道环境、调节血糖平衡、促进矿物质吸收、减少便秘和抑制肿瘤生长等作用。
维生素E琥珀酸酯(Vitamin Esuccinate，VES)是维生素E的一种酯化衍生物，是维生素E的衍生物中最具有抗肿瘤效果的化合物之一，能有效抑制多种肿瘤，但对正常细胞无毒副作用。此外有研究表明VES能够减少肿瘤细胞对DOX的外排，增加DOX在肿瘤细胞内的蓄积。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种复合型阿霉素脂质体及其制备方法。本发明是通过维生素E琥珀酸酯与菊糖进行接枝，得到维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物(INVE)，以INVE作为阿霉素脂质体的修饰材料，能够降低DOX的毒副作用，改善其体内分布，逆转肿瘤的多药耐药性，增强DOX的抗肿瘤效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明的目的之一是提供一种复合型阿霉素脂质体，所述复合型阿霉素脂质体是通过薄膜水化法制备脂质体后，以硫酸铵梯度法主动包封阿霉素得到阿霉素脂质体，再以维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物对阿霉素脂质体进行修饰后获得；其中，维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物INVE是以菊糖和维生素E琥珀酸酯VES为原料，以1-(3-二甲氨基丙基)-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS为催化剂反应得到。
本发明的另一目的是提供一种所述复合型阿霉素脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物INVE的制备：用溶剂将一定量的维生素E琥珀酸酯VES溶解后加入1-(3-二甲氨基丙基)-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温下搅拌活化2h，加入以溶剂溶解的菊糖溶液，继续搅拌反应48h，反应结束后于丙酮中进行沉淀，离心收集固体后经过后处理得到INVE；
(2)复合型阿霉素脂质体的制备：以磷脂和胆固醇为膜材，结合硫酸铵梯度法，经超声、透析得到透析过的脂质体，向其中加入阿霉素溶液进行孵育，再加入步骤(1)制备的维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物INVE溶液继续孵育得到以INVE修饰的阿霉素脂质体INVE-DOX-Lips。
优选的，所述步骤(1)中，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺DMF。
优选的，所述步骤(1)中，VES、EDC和NHS的投料摩尔比为1：(1-3)：(1-3)。
优选的，所述步骤(1)中，菊糖与维生素E琥珀酸酯的投料质量比为1：0.3-1.5。
优选的，所述步骤(1)中，后处理操作为将离心收集到的固体以纯化水进行溶解，然后转移至透析袋中进行透析48h，透析结束后将水溶液冷冻干燥即得到INVE。
优选的，所述步骤(2)中，磷脂为氢化大豆磷脂HSPC。
优选的，所述步骤(2)中，磷脂与胆固醇的质量比为(3～10)：1，更优选的比例为4：1。
优选的，所述步骤(2)中，硫酸铵梯度法中硫酸铵浓度为150～300mmol/L，更优选的浓度为250mmol/L。
优选的，所述步骤(2)中，磷脂与阿霉素的质量比为(5～20)：1，更优选的比例为8：1。
优选的，所述步骤(2)中，孵育温度为40～70℃，孵育时间为20～60min，更优选的孵育温度为60℃，孵育时间为30min。
优选的，所述步骤(2)中，INVE的投料量为磷脂质量的5～20％，更优选为10％。
本发明的另一目的是提供一种所述复合型阿霉素脂质体在抗肿瘤方面的应用。
本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在：
(1)本发明所述复合型阿霉素脂质体INVE-DOX-Lips，制备方法操作简单，工艺条件比较温和，采用常规设备即可制备得到。
(2)本发明所述INVE-DOX-Lips在体外细胞毒性试验中的结果表明，INVE-DOX-Lips对MCF-7/ADR的细胞毒性高于DOX和DOX-Lips，说明INVE-DOX-Lips可逆转肿瘤对DOX的多药耐药性。
(3)本发明所述INVE-DOX-Lips在荷瘤裸鼠体内可以有效聚集于肿瘤部位，除肝脏外其他器官中未检测到DOX荧光，说明该INVE-DOX-Lips可以高效靶向于肿瘤部位。
因此，本发明所述的INVE修饰的阿霉素脂质体具有改变DOX在体内的组织分布、逆转肿瘤对DOX的多药耐药性的作用，从而减少DOX的毒副作用，能够增强治疗效果。
附图说明
图1为INVE的合成路线示意图；
图2为菊糖的红外图谱；
图3为INVE的红外图谱；
图4为菊糖的1H-NMR图谱；
图5为INVE的1H-NMR图谱；
图6为INVE-DOX-Lips的透射电镜图；
图7为DOX-Lips、INVE-DOX-Lips和DOX对4T1的细胞毒性作用；
图8为DOX-Lips、INVE-DOX-Lips和DOX对MCF-7的细胞毒性作用；
图9为DOX-Lips、INVE-DOX-Lips和DOX对MCF-7/ADR的细胞毒性作用。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1 复合型阿霉素脂质体INVE-DOX-Lips的制备
(1)维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物(INVE)的制备
称取1g菊糖溶解于10mL无水DMF中待用。再称取0.655g VES溶解于5mL DMF中，随后加入0.355g EDC和0.213g NHS，室温下搅拌活化2h，然后加入用DMF溶解的菊糖溶液，菊糖与VES投料质量比为1:1.1，继续常温搅拌反应48h。反应结束后将反应液滴加到丙酮中进行沉淀，以5000rpm离心20min收集白色沉淀，溶解于纯化水转移至透析袋(MWCO＝2000D)中进行透析48h，透析结束后将溶液冷冻干燥即得到INVE。
INVE通过红外和核磁进行确证：
菊糖与INVE的红外图谱如图2和图3所示，将二者的红外图谱进行比较发现，INVE的红外图谱在1733cm-1处出现新的吸收峰，说明有酯键的生成，在1568cm-1出现新的吸收峰，可能为VES分子上苯环的吸收峰，说明VES成功连接到菊糖上。
与菊糖的1H-NMR数据(图4)进行对比后，发现合成的INVE的1H-NMR数据(图5)在0.8～3.0ppm新出现的信号峰为VES的特征峰，1H-NMR也表明VES连接到菊糖分子上。
(2)INVE-DOX-Lips的制备
称取60mg氢化大豆磷脂HSPC和15mg胆固醇CHO于100mL圆底烧瓶，加入适量氯仿使其溶解，然后采用旋转蒸发仪减压浓缩除去氯仿，使之在圆底烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜。再加入5mL浓度为250mmol/L的硫酸铵进行水化，水化温度为60℃，待水化完全后于超声波破碎仪下冰水浴超声10min，得到空白脂质体。将空白脂质体转移至透析袋(MWCO＝3000D)中，使用PH＝7.4的PBS溶液为外相进行透析，以除去脂质体外面的硫酸铵，以建立硫酸铵梯度。向透析后的脂质体中加入3mL浓度为2.5mg/mL的DOX溶液(盐酸阿霉素的水溶液)在60℃进行孵育30min，即得载阿霉素的脂质体(DOX-Lips)。向DOX-Lips中加入1mL浓度为6mg/mL的INVE溶液在60℃孵育30min即得到INVE修饰的阿霉素脂质体(INVE-DOX-Lips)。
实施例2 复合型阿霉素脂质体INVE-DOX-Lips的制备
步骤(2)INVE-DOX-Lips的制备中，调整HSPC和CHO的质量分别为60mg和20mg，加入5mL浓度为150mmol/L的硫酸铵，加入3mL浓度为4mg/mL的DOX溶液，在40℃进行孵育60min，加入2mL浓度为6mg/mL的INVE溶液在40℃进行孵育60min，其他操作同实施例1，得到INVE修饰的阿霉素脂质体。
实施例3 复合型阿霉素脂质体INVE-DOX-Lips的制备
步骤(2)INVE-DOX-Lips的制备中，调整HSPC和CHO的质量分别为80mg和8mg，加入5mL浓度为300mmol/L的硫酸铵，加入2mL浓度为2mg/mL的DOX溶液，在70℃进行孵育20min，加入1mL浓度为4mg/mL的INVE溶液在70℃进行孵育20min，其他操作同实施例1，得到INVE修饰的阿霉素脂质体。
试验例1 INVE-DOX-Lips细胞毒性研究
(1)不同制剂药物浓度的配制
将DOX-Lips、INVE-DOX-Lips和DOX原料药配制成0.5mg/mL的溶液(以DOX含量计算)，以0.22μm的无菌微孔滤膜过膜。然后用RPMI-1640培养液稀释至含DOX浓度为40、20、10、2、0.2、0.02μg/mL，用于4T1细胞和MCF-7细胞的毒性实验。另再以RPMI-1640培养液配制成含DOX浓度为80、40、20、4、0.4、0.04μg/mL用于MCF-7/ADR细胞的细胞毒性实验。
(2)MTT试验
取处于对数生长期的4T1细胞、MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞，调整细胞悬液密度为5×104cells/mL，以每孔100μL接种到96孔板中，并在96孔板外围一圈加入200μL的PBS，以减少误差，然后置于培养箱中培养过夜。按照上述设定的浓度每孔加入100μL的含药培养液，每个浓度设定3个复孔，同时设定3个对照孔和3个空白孔，继续培养48h。然后每孔加入20μL的5mg/mL的MTT溶液再培养4h，培养结束后，取出96孔板并吸去上清液，然后每孔加入150μL的DMSO并放置在水平震荡器中震荡10min，使紫色结晶物完全溶解。用酶标仪在490nm波长下测定吸光度，计算细胞存活率。
Figure BDA0002618285740000061
(3)细胞耐药实验
利用GraphPadPrism7.0软件计算各组的IC50值，并通过耐药指数(ResistantIndex，RI)来评价所制备的制剂以及药物多药耐药性。通过逆转耐药因子(Reversalfactor，RF)来评价逆转肿瘤细胞多药耐药的程度。RI和RF的计算公式如下：
RI＝IC50(MCF-7/ADR)/IC50(MCF-7)
RF＝IC50(DOX)/IC50(INVE-DOX-Lips)
考察了DOX-Lips、INVE-DOX-Lips和DOX在不同浓度下与4T1、MCF-7和MCF-7/ADR细胞孵育48h后对细胞的生长抑制作用。MTT试验结果表明，这三种药物对这三种细胞都有一定的细胞毒性，且药物对细胞的抑制作用存在着浓度依赖性。DOX-Lips、INVE-DOX-Lips和DOX在不同浓度下与4T1、MCF-7和MCF-7/ADR细胞孵育48h后的细胞存活率如图7、8、9所示。各组的IC50值如表1所示。
表1 DOX-Lips、INVE-DOX-Lips和DOX对4T1、MCF-7和MCF-7/ADR细胞的IC50
Figure BDA0002618285740000062
Figure BDA0002618285740000071
对于4T1和MCF-7而言，DOX比DOX-Lips和INVE-DOX-Lips两种脂质体制剂表现出更高的细胞抑制作用，可能是由于脂质体释放药物较慢所致。但是在耐药细胞MCF-7/ADR中，对DOX的耐受程度很明显，INVE-DOX-Lips比DOX和DOX-Lips对MCF-7/ADR耐药细胞表现出更高的细胞抑制作用，这说明INVE的加入，在一定程度上有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。
INVE-DOX-Lips对耐药细胞MCF-7/ADR逆转肿瘤细胞多药耐药性结果如表2所示。与DOX进行对比，INVE-DOX-Lips对MCF-7/ADR的逆转耐药因子为1.34，说明INVE-DOX-Lips在一定程度上具有逆转肿瘤多药耐药的作用。
表2 INVE-DOX-Lips对MCF-7/ADR细胞的耐药指数和逆转耐药因子
Figure BDA0002618285740000072
试验例2 INVE-DOX-Lips体内组织分布的研究
脂质体可以利用EPR效应达到被动靶向的作用，本实验主要利用DOX自身具备荧光的特点，采用活体成像技术，对阿霉素脂质体在荷瘤鼠体内的组织分布进一步研究，以此来证明INVE-DOX-Lips靶向性。
(1)荷瘤裸鼠肿瘤模型的建立：取对数生长期的MCF-7/ADR细胞，调整细胞悬液密度为5×107cells/mL。然后每只裸鼠在左前肢腋下皮下注射200μL细胞悬液，定期观察肿瘤变化。
(2)活体成像：待裸鼠肿瘤长至适宜大小，将裸鼠分为两组，即游离阿霉素组(DOX)和维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物修饰的阿霉素脂质体组(DOX-Lips)。DOX组和DOX-Lips组分别通过尾静脉注射200μL的DOX溶液和阿霉素脂质体溶液(DOX浓度均为6mg/kg)，然后分别于1、3、6、9、24h这5个时间点进行活体成像系统。在成像前3min，用异氟烷将裸鼠快速麻醉后上机检测。
(3)组织荧光成像：待活体成像结束后将裸鼠处死，解剖取出心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤，用生理盐水洗净，用滤纸吸干水分，按顺序依次摆放于黑色塑料板上，上机成像。
活体成像结果表明，DOX组在给药1h即出现全身分布，24h内荧光强度随着时间变化表现为无规则变化，阿霉素在肿瘤部位聚集的量并不多，停留的时间也不长，随着血液循环，又分散到其他组织或者被代谢排出体外，证实了阿霉素溶液在体内的组织分布较差。在DOX-Lips组和INVE-DOX-Lips组中，给药1h也出现全身分布，在肿瘤部位可以观察到DOX荧光，在24h内INVE-DOX-Lips组肿瘤部位荧光持续增强，而DOX-Lips组裸鼠肿瘤荧光强度先增强后减弱。以上结果说明INVE-DOX-Lips在裸鼠体内靶向性更强，药物能更有效聚集于肿瘤部位。
在活体成像结束后处死裸鼠，并解剖取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，将这些组织器官用生理盐水洗净，上级成像并拍照记录。组织荧光成像结果表明，DOX组在各组织器官中均有分布，DOX-Lips组中荧光主要集中在肝脏和肿瘤部位，肾脏也有少量聚集，在其他器官未见到荧光信号。然而在INVE-DOX-Lips组中，荧光全部聚集在肝脏和肿瘤部位，其他器官并未检测到荧光信号，并且肿瘤部位聚集较多，这一现象进一步证实了该INVE-DOX-Lips脂质体能高效靶向于肿瘤部位。
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种复合型阿霉素脂质体，其特征在于，所述复合型阿霉素脂质体是通过薄膜水化法制备脂质体后，以硫酸铵梯度法主动包封阿霉素得到阿霉素脂质体，再以维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物对阿霉素脂质体进行修饰后获得；其中，维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物是以菊糖和维生素E琥珀酸酯为原料，以1-(3-二甲氨基丙基)-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为催化剂反应得到。
2.一种权利要求1所述复合型阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物的制备：用溶剂将一定量的维生素E琥珀酸酯溶解后加入1-(3-二甲氨基丙基)-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌活化2h，加入以溶剂溶解的菊糖溶液，继续搅拌反应48h，反应结束后于丙酮中进行沉淀，离心收集固体后经过后处理得到维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物；
(2)复合型阿霉素脂质体的制备：以磷脂和胆固醇为膜材，结合硫酸铵梯度法，经超声、透析得到透析过的脂质体，向其中加入阿霉素溶液进行孵育，再加入步骤(1)制备的维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物溶液继续孵育得到复合型阿霉素脂质体。
3.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺DMF。
4.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，维生素E琥珀酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的投料摩尔比为1：(1-3)：(1-3)，菊糖与维生素E琥珀酸酯的投料质量比为1：0.3-1.5。
5.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，后处理操作为将离心收集到的固体以纯化水进行溶解，然后转移至透析袋中进行透析48h，透析结束后将水溶液冷冻干燥得到维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物。
6.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，磷脂为氢化大豆磷脂，磷脂与胆固醇的质量比为(3～10)：1，磷脂与阿霉素的质量比为(5～20)：1。
7.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，硫酸铵梯度法中硫酸铵浓度为150～300mmol/L。
8.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，孵育温度为40～70℃，孵育时间为20～60min。
9.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，维生素E琥珀酸酯-菊糖衍生物的投料量为磷脂质量的5～20％。
10.一种权利要求1所述复合型阿霉素脂质体在抗肿瘤方面的应用。
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