CN114748639A - 一种光敏剂-羟烷基淀粉-多肽偶联的两亲性大分子化合物、纳米载药系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学、药学、医学等多学科交叉技术领域，更具体地，涉及一种光敏剂‑羟烷基淀粉‑多肽偶联的两亲性大分子化合物、纳米载药系统及其制备方法。该大分子化合物亲水端为羟烷基淀粉，疏水端为疏水性有机类花菁染料分子，并修饰了多肽作为肿瘤靶向分子。本发明采用具有光热特性和光显影特性的疏水性有机类花菁染料分子光敏剂作为疏水端，与羟烷基淀粉偶联并进一步修饰肿瘤靶向肽以后，实验发现该两亲性大分子化合物可以利用其亲疏水性自组装包载抗肿瘤药物，并且还能够保持光敏剂的光热以及光显影特性，降低了光敏剂毒性的同时，实现了抗肿瘤药物的靶向联合治疗。

Description

一种光敏剂-羟烷基淀粉-多肽偶联的两亲性大分子化合物、 纳米载药系统及其制备方法
技术领域
本发明属于化学、药学、医学等多学科交叉技术领域，更具体地，涉及一种光敏剂-羟烷基淀粉-多肽偶联的两亲性大分子化合物、纳米载药系统及其制备方法。
背景技术
肿瘤是造成人类死亡的主要原因，也是提高预期寿命的最大障碍。化疗是目前治疗肿瘤最有效的手段之一。许多常见的化疗药物虽然有一定的治疗效果，但由于化学药物没有靶向性，也会对人体正常细胞产生杀伤作用，导致严重的毒副反应。
基于高分子材料的纳米载药系统近年来被广泛的研究用于抗肿瘤药物的输送，两亲性聚合物载药纳米系统是目前研究比较多的纳米载药系统之一。它能够提供一个疏水的核心增溶疏水性药物分子，同时其亲水的外壳能够降低蛋白吸附，减少网状内皮系统的吞噬清除作用，延长药物在体内的半衰期。这些纳米载体静脉注射后，可以通过增强的渗透与滞留效应在肿瘤部位富集，减少在正常组织器官的聚集，从而降低毒副作用。
然而，单一的化疗难以取得较为理想的治疗效果，采用联合治疗的手段可以显著增强肿瘤治疗效果。比如化疗同时配合光敏剂，除了能够对肿瘤部位进行实时成像外，光敏剂带来的光热还能显著增强肿瘤治疗效果。光敏剂一般具有良好的近红外荧光显影特性和光热特性，但其水溶性较差，生物相容性差，限制了其临床应用。因此，如何在降低光敏剂的毒性的同时，提高药物的肿瘤靶向性，提高抗肿瘤疗效，并且实现对肿瘤的成像以及对载药纳米系统的实时监控，是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种光敏剂-羟烷基淀粉-多肽偶联的两亲性大分子化合物、纳米载药系统及其制备方法，以具有光响应治疗特性和光显影特性的光敏剂作为该大分子化合物的疏水端，偶联至亲水端羟烷基淀粉上，并进一步修饰肿瘤靶向肽，解决了现有技术光敏剂本身随抗癌药物单独引入时造成的生物相容性差、抗肿瘤药物靶向性不强导致抗肿瘤疗效不佳等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种光敏剂-羟烷基淀粉-肿瘤靶向肽偶联的两亲性大分子化合物，该大分子化合物为由羟烷基淀粉、光敏剂以及肿瘤靶向肽通过化学键偶联得到；
所述光敏剂为疏水性有机类花菁染料分子，所述疏水性有机类花菁染料分子与所述羟烷基淀粉通过化学键偶联；
该两亲性大分子化合物中所述光敏剂作为疏水端，所述羟烷基淀粉作为亲水端；
所述肿瘤靶向肽含有巯基，所述肿瘤靶向肽与经过二硫基修饰的所述羟烷基淀粉通过所述巯基与所述二硫基的交换反应而实现偶联，实现其在所述两亲性大分子化合物上的修饰。
优选地，所述疏水性有机类花菁染料分子为IR780、IR783、IR808、IR820和IR825中的一种或多种。
优选地，所述肿瘤靶向肽为CREKA多肽、RGD肽、iRGD肽、NGR肽和NGD肽中的一种或多种。
优选地，所述化学键为酰胺键或酯键。
优选地，所述光敏剂为IR780，所述IR780与所述羟烷基淀粉通过酰胺键连接。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的两亲性大分子化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)使光敏剂中含有的氯原子通过取代反应转化为氨基，得到含有氨基的光敏剂；
(2)将所述含有氨基的光敏剂与羧基化羟烷基淀粉的羟基发生酰胺反应生成光敏剂-羧基化羟烷基淀粉偶联物；
(3)使所述光敏剂-羧基化羟烷基淀粉偶联物上的羧基与含有2-吡啶基二硫基的伯胺化合物上的氨基发生酰胺反应，得到光敏剂-含有二硫基的羟烷基淀粉偶联物；
(4)将步骤(3)所述光敏剂-含有二硫基的羟烷基淀粉偶联物经过分离纯化后，使该偶联物与所述肿瘤靶向肽发生巯基-二硫键交换反应，所得产物经分离提纯后得到所述两亲性大分子化合物。
优选地，所述含有2-吡啶基二硫基的伯胺化合物为2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐。
优选地，所述光敏剂为IR780，步骤(1)具体为：使IR780与至少含有两个仲胺基的化合物发生取代反应，得到含有仲胺基的IR780。
优选地，所述至少含有两个仲胺基的化合物为哌嗪、N,N’-二甲基乙二胺、N,N’-二甲基-1,3-丙二胺、2,2-双哌啶、4,4’-二哌啶或3,3’-联哌啶中的一种或多种。
优选地，所述光敏剂为IR780，步骤(1)具体为：使IR780与至少含有两个伯胺基的化合物发生取代反应，得到含有伯胺基的IR780；
优选地，所述至少含有两个伯胺基的化合物为乙二胺、丁二胺、对苯二胺和环己二胺中的一种或多种。
按照本发明的另一个方面，提供了一种基于所述两亲性大分子化合物的纳米载药系统，包含所述两亲性大分子化合物，还包括抗肿瘤药物；且所述抗肿瘤药物与所述两亲性大分子化合物通过亲疏水作用及π-π堆积作用而组装形成纳米胶束。
优选地，所述抗肿瘤药物为DOX、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱或顺铂。
按照本发明的另一个方面，提供了一种抗癌药物，包含所述的纳米载药系统和药学上可接受的添加剂。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种光敏剂-羟烷基淀粉-多肽偶联的两亲性大分子化合物，亲水端为羟烷基淀粉，疏水端为疏水性有机类花菁染料分子，并修饰了多肽作为肿瘤靶向分子。与传统两亲性大分子化合物中引入的仅用于起到疏水作用的聚合物(比如聚己内酯等)相比，避免了这类疏水性聚合物的引入带来的生物毒性。本发明采用具有光响应治疗特性(包括光热特性、光动力治疗特性等)和光显影特性的疏水性有机类花菁染料分子光敏剂作为疏水端，与羟烷基淀粉偶联并进一步修饰肿瘤靶向肽以后，惊喜发现该两亲性大分子化合物可以利用其亲疏水性自组装包载抗肿瘤药物，并且还能够保持光敏剂的光响应治疗特性以及光显影特性，降低了光敏剂毒性的同时，实现了抗肿瘤药物的靶向联合治疗。
(2)本发明优选实施例中在羟乙基淀粉上通过酯键和酰胺键偶联了荧光分子，并修饰了CREKA肽作为肿瘤靶向分子，得到CREKA靶向的羟乙基淀粉偶联物(IR780-HES-CREKA)。该偶联物在超纯水中可以自组装成纳米粒，并可以负载阿霉素。
(3)本发明优选实施例中提供的一种IR780-HES-CREKA大分子，能够保持IR780的光热特性和光显影特性，且显著降低了IR780的毒性，偶联羟乙基淀粉后，显著提高了生物安全性。
(4)本发明优选实施例中提供的一种包载有DOX的基于IR780-HES-CREKA大分子的自组装纳米载药系统具有肿瘤靶向性，通过对该纳米载药系统进行体内外肿瘤靶向性评价，发现其对乳腺癌表现出良好的肿瘤靶向性，其能够更多地将药物递送至肿瘤部位，促进乳腺肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取,负载有阿霉素、CREKA靶向纳米载药系统比负载有阿霉素、没有CREKA靶向的纳米载药系统和游离阿霉素具有更强的肿瘤杀伤效果，而CREKA靶向纳米载药系统本身具有良好的生物安全性。
(5)本发明优选实施例中提供的纳米载药系统，在808nm激光照射下能够快速升温，在体内外均能升至45℃，通过温和光热能够显著提高疏水性小分子化疗药物的抗肿瘤效果，和生理盐水组相比，抑瘤率达72.4％。同时，温和的光热导致的升温能促进化疗药物的释放，实现荧光及光声成像指导的精确肿瘤的热疗和化疗联合治疗。
附图说明
图1为游离IR780、伯氨基取代的IR780与羟乙基淀粉的偶联物以及仲胺基取代的IR780与羟乙基淀粉的偶联物的紫外吸收曲线；
图2A为本发明实施例1化合物IR780-羟乙基淀粉-CREKA肽(IR780-HES-CREKA,CHI)和化合物IR780-羟乙基淀粉(IR780-HES，HI)的制备流程图；图2B，图2C，图2D和图2E分别为羟乙基淀粉-辛二酸(HES-ODA)，IR780-羟乙基淀粉(HI)，IR780-羟乙基淀粉-2-吡啶基二硫基(HIPA)和IR780-羟乙基淀粉-CREKA肽(CHI)的核磁共振H谱(600M)；图2F为HES-ODA，HI，HIPA和CHI的红外光谱图；图2G为CREKA肽标准品和CHI合成中下层滤液的高效液相色谱图；
图3内容A为本发明实施例2制备的DOX@HI及DOX@CHI用动态光散射仪检测的水合粒径；图3内容B和图2内容C为电镜检测DOX@CHI和DOX@HI的形貌；图3内容D为实施例2制备的DOX@HI及DOX@CHI纳米粒的稳定性；图3内容E为本发明实施例3游离DOX，游离IR780，DOX@HI及DOX@CHI的紫外可见光吸收光谱；图3内容F为本发明实施例4中DOX@HI及DOX@CHI在不同溶剂中的DOX荧光发射光谱；图3内容G实施例4中DOX@HI及DOX@CHI在不同溶剂中的IR780荧光发射光谱；图3内容H为实施例5中DOX@CHI在pH＝7.4，pH＝6.5和pH＝5.0条件下的药物释放曲线；图3内容I为实施例5中DOX@CHI在pH＝6.5条件下及添加光照后的药物释放曲线；
图4内容A和图4内容B为本发明实施例6中不同IR780浓度，相同功率下DOX@CHI的升温曲线及图片；图4内容C和图4内容D为本发明实施例6中Free IR780和DOX@CHI在相同浓度，相同激光功率照射下的升温曲线及图片；图4内容E为实施例7中DOX@CHI纳米粒在不同IR780浓度下的光声成像扫描图；图4内容F为DOX@CH纳米粒在不同IR780浓度下的光声信号强度；
图5A为实施例8中利用共聚焦显微镜考察肿瘤细胞对不同纳米粒的细胞摄取情况；图5B和图5C为实施例9中利用流式细胞仪考察肿瘤细胞对不同纳米粒的细胞摄取情况及相对定量；
图6内容A和内容B为实施例10不同药物处理后细胞存活情况；图6内容C为实施例11不同药物处理后，未添加光照和添加光照后细胞存活情况；；图6内容D和图6内容E为实施例12利用流式细胞仪考察经不同药物处理后细胞的周期情况及定量；
图7内容A为实施例13不同纳米粒对小鼠肿瘤部位的活体成像图片；图7内容B为实施例13不同纳米粒在肿瘤部位的相对富集量；图7内容C和图7内容D为不同纳米粒在小鼠各脏器的富集及相对定量；
图8内容A，图8内容B和图8内容C为实施例14不同药物处理小鼠后，小鼠肿瘤部位激光照射收的升温图片及曲线；图8内容D和8内容E为不同药物处理后小鼠肿瘤部位光声成像图；
图9为实施例15小鼠经不同给药处理后瘤体积的变化；
图10为实施例15小鼠经不同给药处理后瘤重的变化；
图11为实施例15小鼠经不同给药处理后肿瘤大小的图片；
图12为实施例15小鼠经不同给药处理后对剥离的肿瘤进行的H&E，Tunel及Ki67染色；
图13内容A为实施例15小鼠经不同给药处理后体重的变化，评价不同药物对小鼠的毒性；图13内容B至图13内容I为实施例15小鼠经不同给药处理后对小鼠血液进行的血常规和血生化检测评价不同药物对小鼠的毒性；图13内容B为血清中谷丙转氨酶的量；图13内容C为血清谷草转氨酶的量；图13内容D为血清中肌酸激酶的量；图13内容E为为血清中尿素氮的量；图13内容F为血液中白细胞的量；图13内容G为血液中红细胞的量；图13内容H为血液中血红蛋白的量；图13内容I为血液中血小板的量。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种光敏剂-羟烷基淀粉-肿瘤靶向肽偶联的两亲性大分子化合物，该大分子化合物为由羟烷基淀粉、光敏剂以及肿瘤靶向肽通过化学键偶联得到；其中，所述光敏剂为疏水性有机类花菁染料分子，所述疏水性有机类花菁染料分子与所述羟烷基淀粉通过化学键偶联；该两亲性大分子化合物中所述光敏剂作为疏水端，所述羟烷基淀粉作为亲水端；所述肿瘤靶向肽含有巯基，所述肿瘤靶向肽与经过二硫基修饰的所述羟烷基淀粉通过所述巯基与所述二硫基的交换反应而实现偶联，实现其在所述两亲性大分子化合物上的修饰。
本发明所述羟烷基淀粉比如羟乙基淀粉作为代血浆在临床上长期使用，具有良好的生物安全性和生物相容性，基于羟乙基淀粉的纳米载药系统具有较强的临床转化能力。本发明通过在羟乙基淀粉上直接偶联光敏剂以及靶向肿瘤的多肽分子，可以显著地提高药物的主动靶向性，增强抗肿瘤疗效；还能利用光敏剂的光响应特性实现联合治疗，以及利用光敏剂的荧光显影特性实现对肿瘤的成像以及对载药纳米系统的实时监控。
本发明设计的两亲性大分子化合物，以疏水性光敏剂作为其疏水端，以羟烷基淀粉作为其亲水端。光敏剂在该大分子化合物中同时充当疏水基团、光响应单元以及荧光显影特性的多重作用，与传统采用疏水性聚合物比如聚己内酯等作为疏水端的两亲性化合物相比，避免了引入这些疏水性聚合物带来的生理毒性。本发明在实验过程中曾尝试利用传统两亲性大分子化合物与抗肿瘤药物和光敏剂的亲疏水作用和π-π堆积作用包载光敏剂制成纳米载药系统，但是实验发现这种方式存在光敏剂泄露的风险，不仅生物毒性较大，而且光热效果不佳。采用本发明作为疏水端偶联至亲水端羟烷基淀粉的方式，巧妙解决了光敏剂泄露的问题。一些实施例中，所述疏水性有机类花菁染料分子为IR780、IR783、IR808、IR820和IR825的一种或多种。作为典型的光敏剂，2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓碘化物(IR780)是一种七甲川花菁荧光小分子，其具有式(Ⅰ)所示的结构式，具有良好的近红外荧光显影特性和光热特性，但其水溶性较差，生物相容性差，限制了其临床应用。本发明通过将以IR780为代表的光敏剂直接偶联至羟烷基淀粉上，并同时在羟烷基淀粉上偶联肿瘤靶向肽，在降低IR780的毒性的同时，显著提高药物的肿瘤靶向性，提高抗肿瘤疗效，并且实现对肿瘤的成像以及对载药纳米系统的实时监控。
Figure BDA0003568018050000051
Figure BDA0003568018050000061
本发明所述肿瘤靶向肽可以为各种能够靶向肿瘤的多肽分子，包括但不限于为CREKA多肽、RGD肽、iRGD肽、NGR肽和NGD肽中的一种或多种。其中CREKA多肽(Cys-Arg-Glu-Lys-Ala)是一种新兴的五肽，可以特异性地与肿瘤基质微环境中丰富纤维蛋白-纤连蛋白复合物结合，本发明通过将CREKA肽偶联到光敏剂与羟烷基淀粉的偶联物上，制成纳米药物，以提高纳米药物在肿瘤部位的蓄积。
本发明将光敏剂与羟烷基淀粉通过化学键偶联，可根据光敏剂分子结构设计相应的合成步骤，一些实施例中，所述化学键为酰胺键或酯键等。
优选实施例中，光敏剂为IR780，所述IR780与所述羟烷基淀粉通过酰胺键连接。
本发明还提供了一种所述的两亲性大分子化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)使光敏剂中含有的氯原子通过取代反应转化为氨基，得到含有氨基的光敏剂；
(2)将所述含有氨基的光敏剂与羧基化羟烷基淀粉的羟基发生酰胺反应生成光敏剂-羧基化羟烷基淀粉偶联物；
(3)使所述光敏剂-羧基化羟烷基淀粉偶联物上的羧基与含有2-吡啶基二硫基的伯胺化合物上的氨基发生酰胺反应，得到光敏剂-含有二硫基的羟烷基淀粉偶联物；
(4)将步骤(3)所述光敏剂-含有二硫基的羟烷基淀粉偶联物经过分离纯化后，使该偶联物与所述肿瘤靶向肽发生巯基-二硫键交换反应，所得产物经分离提纯后得到所述两亲性大分子化合物。
一些实施例中，光敏剂为IR780，步骤(1)具体为：使IR780与至少含有两个仲胺基的化合物发生取代反应，得到含有仲胺基的IR780。至少含有两个仲胺基的化合物包括但不限于为哌嗪、N,N’-二甲基乙二胺、N,N’-二甲基-1,3-丙二胺、2,2-双哌啶、4,4’-二哌啶或3,3’-联哌啶中的一种或多种。至少含有两个亚氨基，其中一个与IR780上的氯反应，另一个与HES上的羧基反应。
一些实施例中，使IR780与哌嗪发生取代反应，得到含有仲胺基的IR780，如式(Ⅲ)所示：
Figure BDA0003568018050000062
一些实施例中，步骤(1)具体为：将IR780溶于有机溶剂中，加入哌嗪，N2保护下在75-85℃搅拌，发生取代反应2-6h，所述IR780与哌嗪的摩尔比为1:3.5-4，以仲胺基取代IR780中的氯原子，所得反应液分离提纯后得到含有仲胺基的IR780。一些实施例中，将所得反应液转移至分液漏斗中，加入到二氯甲烷中，再加入饱和碳酸氢钠溶液，萃取，将油层用饱和碳酸氢钠洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸，再在室温下真空干燥，得到干燥的蓝色沉淀，即为含有仲胺基的IR780。
另一些实施例中，光敏剂为IR780，步骤(1)具体为：使IR780与至少含有两个伯胺基的化合物发生取代反应，得到含有伯胺基的IR780。至少含有两个伯胺基的化合物包括但不限于为乙二胺、丁二胺、对苯二胺和环己二胺中的一种或多种。其中一个伯氨基与IR780上的氯反应，另一个伯氨基与HES上的羧基反应。
一些实施例中，光敏剂为IR780，将其与含有两个伯氨基的化合物比如乙二胺反应，以氨基取代IR780中的氯原子，得到含有伯氨基的IR780时，将该伯氨基取代的IR780与羧基化羟乙基淀粉发生酰胺化反应并进一步修饰肿瘤靶向肽后，实验发现与游离IR780相比，经过伯氨基修饰偶联后的大分子化合物紫外吸收波长蓝移150nm左右，如图1所示。这可能是伯氨基的强给电子作用导致，导致将该大分子化合物应用808nm激光器时光热效果不好，但可以考虑用于606nm激光下的光动力治疗。实际应用时可根据需要选择合适的氨基取代类型。本发明将光敏剂作为疏水端与亲水端羟乙基淀粉偶联，并进一步修饰肿瘤靶向肽，不同光敏剂结构会影响制得的两亲性大分子化合物中光敏剂的光响应特性。
一些实施例中，步骤(2)包括如下步骤：将所述羧基化羟乙基淀粉溶解在二甲亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和步骤(1)所述含有氨基的光敏剂，N2保护下室温搅拌发生酰胺反应12-72h，得到反应液C；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和步骤(1)得到的含有仲胺基的光敏剂的摩尔比为(8-12):(8-12):1，所述羧基化羟乙基淀粉的浓度为10～30mg/mL；反应液C分离提纯得到光敏剂-羟乙基淀粉。一些实施例中，分离提纯具体为：将反应液C倾入至异丙醇/石油醚混合溶剂中得到蓝黑色沉淀，并离心洗涤多次，再在室温下真空干燥，得到干燥的光敏剂-羟乙基淀粉。
一些实施例中，将步骤(1)得到的含有仲胺基的IR780中间产物经过分离纯化后，将该中间产物的仲氨基与羧基化羟乙基淀粉的羧基发生酰胺反应生成式(Ⅳ)所示的IR780-羟乙基淀粉。
一些实施例中，步骤(3)包括如下步骤：将步骤(2)获得的光敏剂-羟乙基淀粉复溶于超纯水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐，在N2保护下室温搅拌，发生酰胺反应24～48h，得到反应液D；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐的摩尔比为(1.5-2.5):(0.5-1.5):1，所述光敏剂-羟乙基淀粉的浓度为30～70mg/mL；反应液D分离提纯得到中间产物，即光敏剂-含有二硫基的羟烷基淀粉；一些实施例中，所述分离提纯具体为：将反应液D用超纯水透析2～4天，冷冻干燥后得到蓝色固体为光敏剂-羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物，即为所述中间产物；其中透析袋的截留分子量优选为3500Da。
Figure BDA0003568018050000081
一些实施例中，使步骤(2)的产物IR780-羧基化羟乙基淀粉的羧基与2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐上的氨基发生酰胺反应，得到式(Ⅴ)所示的中间产物；
Figure BDA0003568018050000082
一些实施例中，步骤(4)具体包括如下步骤：将步骤(3)所述中间产物即光敏剂-羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物溶解于超纯水中，加入肿瘤靶向肽比如CREKA多肽，在N2保护下室温搅拌反应6～24h，所述多肽含有巯基，中间产物含有二硫基，使得其发生巯基和二硫键的交换反应，得到反应液E；所述中间产物的浓度为10～30mg/mL；反应液E分离提纯后得到所述两亲性大分子化合物。一些实施例中，所述分离提纯具体为：将获得的反应液E用超滤管浓缩(截留分子量为10000Da)，后将截留的上层液体冷冻干燥后得到蓝色固体为两亲性大分子化合物。
一些实施例中，光敏剂为IR780，肿瘤靶向肽为CREKA，得到的两亲性大分子化合物结构示意图如式(VI)所示。
本发明一些实施例中在羟乙基淀粉上偶联了一种同时具有成像及治疗作用的荧光分子IR780，并修饰了CREKA肽作为肿瘤靶向分子，结构如图式(VI)所示。该偶联物在去超纯水中可以自组装成纳米粒并负载化疗药阿霉素。实验证明以该纳米载药体系能显著提升肿瘤靶向性，降低荧光分子的毒副作用，具有良好的稳定性，能够实现活体肿瘤部位的光声和荧光成像，同时激光照射可以使肿瘤部位快速升温，局部光热联合化疗治疗，显著增强抗肿瘤活性。
Figure BDA0003568018050000091
一些实施例中，所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉，羟乙基淀粉的分子量为25～480kDa，羟乙基的取代度为0.4～0.6，所述羟乙基淀粉的规格可以为480/0.4，480/0.5，480/0.6，200/0.4，200/0.5，200/0.6，130/0.4，130/0.5，130/0.6，70/0.5，25/0.5，优选130/0.4，其中130表示羟乙基淀粉的分子量，单位为kDa，0.4为羟乙基的取代度。
一些实施例中，使羟乙基淀粉上的羟基与丁二酸的羧基发生酯化反应生成式(Ⅱ)所示的羧基化羟乙基淀粉；
Figure BDA0003568018050000092
一些实施例中，所述羧基化的羟烷基淀粉的制备方法包括如下步骤：将辛二酸溶于二甲亚砜中，加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶活化羧基，室温搅拌0.3-1h，得到反应液A；再向反应液A中加入羟乙基淀粉,室温搅拌反应12-72h，得到反应液B；所述辛二酸、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为(4-6):1:(0.4-0.6)，所述羟乙基淀粉的浓度为30～70mg/mL；反应液B经分离提纯得到羧基化羟乙基淀粉。一些实施例中，所述分离提纯具体为：将所述的反应液B过滤除去沉淀，将滤液倾入至异丙醇/石油醚混合溶剂中得到白色沉淀，离心分离沉淀并用异丙醇/石油醚混合溶剂洗涤沉淀；将获得的白色沉淀复溶于超纯水，用超纯水透析2～4天，冷冻干燥后得到白色固体为羧基化羟乙基淀粉；其中透析袋的截留分子量优选为3500Da。
本发明还提供了一种基于所述两亲性大分子化合物的纳米载药系统，包含所述的两亲性大分子化合物，还包括抗肿瘤药物；所述抗肿瘤药物与所述两亲性大分子化合物通过亲疏水作用及π-π堆积作用而组装形成纳米胶束。
本发明所述抗肿瘤药物包括但不限于为DOX、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、顺铂等。
一些实施例中，本发明提供的纳米载药系统载药纳米粒的尺寸为180-200nm范围，抗肿瘤药物为阿霉素，阿霉素的载药量为4％-5％。
一些实施例中，通过如下方法制备上述纳米载药系统：将纳米药物与所述大分子化合物溶解于有机溶剂中，超纯水透析后将得到的载药纳米粒混悬液进行超滤浓缩，得到载有纳米药物的大分子化合物自组装的纳米载药系统。
一些实施例中，透析采用的透析袋的截留分子量为3500-8000Da；超滤浓缩采用的超滤管的截留分子量为10kDa-100kDa。
本发明提供的一种抗癌药物，包含所述的纳米载药系统和药学上可接受的添加剂。本发明抗癌药物适用的癌症肿瘤包括但不限于为乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或黑色素瘤等。该抗癌药物，其剂型可以为注射剂、粉针剂、口服剂、喷雾剂、胶囊剂或栓剂。
本发明优选实施例中，通过选择羟乙基淀粉为亲水片段，选择IR780为疏水段，同时作为荧光成像和光热治疗的药物，选择CREKA肽作为肿瘤特异性靶向分子，选择DOX作为肿瘤治疗药物，制备得到包载药物DOX的、粒径在190nm左右，且分布均一，结构稳定的载药纳米粒。与无CREKA靶向的纳米粒相比，该纳米粒显著增加了肿瘤部位纳米粒的富集速度和富集量，促进了肿瘤细胞对纳米粒的摄取，在乳腺癌4T1小鼠模型中均显示出了更好的抗肿瘤效果，同时降低了毒副作用。本发明提供的纳米载药体系，通过荧光及光声成像系统能够实时对肿瘤部位进行成像，同时利用激光照射肿瘤部位能够快速升高肿瘤部位的温度，实现光热疗法和化疗的联合治疗，增强抗肿瘤疗效，因此本发明提出的纳米载药体系具有良好的应用前景。
以下为实施例：
实施例1
按照如下步骤制备式(VI)化合物：
(1)将辛二酸469.8mg(2.70mmol)溶于20mL二甲亚砜中，加入二环己基碳二亚胺11.2mg(0.54mmol)和4-二甲氨基吡啶32.9mg(0.27mmol)活化羧基，室温搅拌0.5h，得到反应液A；再向反应液A中加入羟乙基淀粉1.0g,室温搅拌反应48h，得到反应液B；
(2)将步骤(1)所述的反应液B过滤除去沉淀，将滤液倾入至至200mL异丙醇/石油醚混合溶剂中(V/V＝1:1)得到白色沉淀，离心分离沉淀并用异丙醇/石油醚混合溶剂洗涤沉淀三次；
(3)将步骤(2)获得的干燥的白色沉淀复溶于超纯水，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量优选为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为羧基化羟乙基淀粉；
(4)将IR780 32mg(0.048mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入16mg哌嗪(0.184mmol)，N2保护下移至85℃油浴搅拌反应4h；
(5)将步骤(4)所述反应液转移至分液漏斗中，加入到100mL二氯甲烷中，再加入100mL饱和碳酸氢钠溶液，萃取，将油层用饱和碳酸氢钠洗涤三次，再用100mL饱和氯化钠洗涤一次，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸，再在室温下真空干燥，得到干燥的蓝色沉淀；
(6)将步骤(3)所述的羧基化羟乙基淀粉200mg溶解在10mL二甲亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐91.6mg(0.4778mmol)、4-二甲氨基吡啶58.5mg(0.4778mmol)和步骤(5)所述蓝色沉淀28mg(0.04788mmol)，N2保护下室温搅拌反应48h，得到反应液C，所述羧基化羟乙基淀粉的浓度为20mg/mL；
(7)将反应液倾入至异丙醇/石油醚混合溶剂中(V/V＝1:1)得到蓝黑色沉淀，并离心洗涤三次，再在室温下真空干燥，得到干燥的IR780-羟乙基淀粉；
(8)将步骤(7)得到的IR780-羟乙基淀粉500mg复溶于10mL超纯水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐208mg(1.09mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺62.5mg(0.54mmol)和2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐121mg(0.54mmol)，在N2保护下室温搅拌反应24h，得到反应液D，所述偶联有IR780的羟乙基淀粉的浓度为优选为50mg/mL；
(9)将步骤(8)获得的反应液D用超纯水透析3天，冷冻干燥后得到蓝色固体为IR780-羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物；其中透析袋的截留分子量优选为3500Da；
(10)将步骤(9)所述的IR780-羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物(表示为HI)100mg溶解于5mL超纯水中，加入CREKA肽10mg(0.017mmol)，在N2保护下室温搅拌反应24h，得到反应液E；
(11)将步骤(10)获得的反应液E用超滤管超滤(截留分子量为10000Da)，后将截留的上层液体冷冻干燥得到蓝色固体为具有式(VI)结构的目标化合物，实施例中表示为CHI。
以上制备流程示意图参见图2A，目标化合物1H NMR(600MHz)数据如图2B，图2C，图2D和图2E所示。
与HES相比，羧甲基化羟乙基淀粉的核磁共振氢谱(氘代DMSO作为溶剂)在化学位移1.2-2.6ppm之间出现了新的峰，归属于丁二酸中的亚甲基氢；IR780-羟乙基淀粉的核磁谱图在7.2～8.6ppm处出现的峰，对应于IR780中的芳香氢；IR780-羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物在芳香区的峰加深，在2.9ppm出现的峰，分别对应于2-(2-吡啶基二硫基)乙胺中的芳香氢和亚甲基氢；IR780-羟乙基淀粉-CREKA肽中芳香区的峰只剩下IR780中的芳香氢，证明2-(2-吡啶基二硫基)乙胺中吡啶基脱落。
傅里叶红外光谱如图2F显示，羧甲基化羟乙基淀粉在1730cm-1处出现了一个峰，属于形成的酯键的C＝O伸缩振动，这一结果表明羟乙基淀粉和丁二酸通过酯键偶联；与羧甲基化羟乙基淀粉的红外光谱图相比，IR780-羟乙基淀粉在1643cm-1处的吸收峰增强，在1548cm-1处出现一个新的吸收峰，分别归咎于新形成的叔酰胺键中C＝O伸缩振动和IR780中芳环骨架振动；IR780-羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物在1485cm-1处出现了新的峰，归属于吡啶环中的碳氮的伸缩振动；IR780-羟乙基淀粉-CREKA中在1485cm-1的峰消失，在1672cm-1出现新的峰，归咎于2-吡啶基二硫基于CREKA肽之间的交换反应使得吡啶环的掉落，在1672cm-1的峰归属于CREKA肽直链分子上的碳氮伸缩振动。
CREKA修饰量的测定：取10mg CREKA溶解于1mL超纯水中，配置成10mg/mL的标准品母液，用超纯水将母液稀释至一系列浓度：400、200、100、50和25μg/mL。使用高效液相色谱仪分析，记录出峰时间及峰面积，如图2内容G所示。以CREKA标准品的浓度为横坐标，曲线下峰面积为纵坐标，得到标准曲线Y＝5.159X+3.900。取CHI合成步骤中超滤的下层滤液定容至4mL，用高吸液相色谱上述标准品测量方法测量其在210nm波长处的信号值，测量其曲线下峰面积，代入标准曲线得到滤液中CREKA的含量，按如下公式计算CREKA的修饰量为8％。
Figure BDA0003568018050000121
其中CREKA(总)为投入反应的CREKA的总质量，CRAKA(滤液)为未反应的下层滤液中CREKA的质量，W(CHI)为CHI载体的质量。
实施例2
DOX@HI及DOX@CHI的制备及表征
利用透析法制备了DOX@HI及DOX@CHI纳米粒，具体方法如下：
(1)将10mg阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)溶解在3mL水中，加入10μL三乙胺，室温搅拌过夜，将混合物以8000rpm离心15分钟，将沉淀物用水洗涤三次，然后在室温下真空干燥，得到脱盐DOX。
(2)分别称取HI和CHI 9mg，DOX 1mg溶于3mL二甲亚砜中，然后再将样品分别加到截留分子量为3500Da的透析袋中，室温条件下，在超纯水中搅拌透析24h，每隔2h更换一次新鲜超纯水，透析完成后，取反应后的溶液放置于超滤管中(100KDa，3500rpm离心15min)浓缩使最终体积为1mL，收集超滤管中溶液，即得到DOX@HI及DOX@CHI纳米粒溶液。
利用动态光散色粒度仪检测几种样品的粒径分布，结果如图3内容A所示。取DOX@CHI及DOX@HI分散液20μL滴于通网上，用0.1％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用透射电子显微镜(TEM,H-700FA，HITACHI)观察其形貌，加速电压为20KV-125KV。结果如图3内容B和图3内容C所示。连续一周每天利用动态光散色粒度仪检测DOX@HI及DOX@CHI的粒径，结果如图3内容D所示。
实验结果表明，DOX@CHI粒径约190nm，DOX@HI粒径约170nm，分布均一，且上述样品在一周内均能保持稳定，无明显的团聚或解聚现象发生。
实施例3
DOX@HI和DOX@CHI的紫外-可见光吸收光谱
用超纯水和二甲亚砜混合溶液稀释DOX@HI和DOX@CHI溶液，用二甲亚砜和水混合溶液作为参比，利用紫外-可见光分光光度计测定了两种样品的吸收光谱，扫描波长范围为300-900nm，扫描步长为1nm。结果如图3内容E所示。
紫外-可见光光谱结果显示，游离的DOX在482nm处有最大吸收，游离的IR780在794nm处有最大吸收，DOX@HI与DOX@CHI(二甲亚砜中)同样在501与780nm处有最大吸收，这说明DOX的确已经成功共载进纳米粒中，最大吸收波长少量的红移与蓝移可能由DOX和IR780与糖类大分子羟乙基淀粉之间的相互作用有关。
实施例4
实施例3中制备的DOX@HI和DOX@CHI的荧光发射光谱
分别用PBS和二甲亚砜配置DOX@HI与DOX@CHI的PBS溶液和二甲亚砜溶液。利用荧光光谱仪测定了两种样品在DMSO和PBS中的荧光光谱，其中DOX激发波长为501nm，发射光谱扫描范围为510-700nm。IR780激发波长为780nm，发射光谱扫描范围为790-900nm。结果如图3内容F和图3内容G所示。
从荧光光谱来看，DOX@HI与DOX@CHI在PBS中几乎没有荧光，而在DMSO中无论是DOX的荧光还是IR780得荧光都得到了极大的增强，这说明DOX与CHI组装后荧光淬灭，而在二甲亚砜中，DOX@HI与DOX@CHI纳米粒都处于完全溶解状态，DOX与IR780荧光没有发生淬灭。
实施例5
实施例2中制备得到的DOX@CHI在不同条件下药物的释放行为，具体方法如下：
(1)配制释放介质：分别配制含0.5％Tween-80的PBS缓冲液300mL(pH 7.4)；含0.5％Tween-80的PBS缓冲液300mL(pH 6.5)；含0.5％Tween-80的PBS缓冲液300mL(pH5.0)；
(2)配制9mL DOX@CHI纳米粒溶液(DOX：80μg/mL)，取1mL DOX@CHI纳米粒溶液装入截留分子量3500Da的透析袋中，夹子密封，每组设置3个平行，随后将透析袋浸没在装有30mL释放液的50mL离心管中，于摇床中震荡，摇床温度为37℃，转速为180rpm。
(3)在预定时间点(0.5、1、2、4、8、12、24、48、72h)，取1mL释放液，再补充1mL空白释放液。取出的释放液通过多功能酶标仪-FlexS3检测DOX的含量，激发波长为485nm，检测发射波长为560nm。结果如图3内容H所示，DOX@CHI在pH 5.0，pH 6.5和pH 7.4中释放率分别为63.6％，48.8％和31.3％，纳米粒在酸性环境下的大量释放归因于化合物CHI上的酯键在酸性环境下的断裂。由于肿瘤部位的酸性环境，纳米粒的这种释药行为有利于保证药物在储存和血液循环中的相对稳定，而在进入肿瘤细胞后被快速，大量释放出来，从而达到良好的治疗效果。
DOX@CHI在添加光照后药物的释放行为，具体方法如下：
(1)配制释放介质：配制含0.5％Tween-80的PBS缓冲液300mL(pH 6.5)
(2)将1mL DOX@CHI溶液(DOX:80μg/mL)加入到透析袋中，每组3个平行，然后浸入30mL释放液中。30min后，小心取出样品，用808nm激光(1W/cm2)照射5分钟，然后放回透析袋中继续进行以下释放实验，没有激光照射组作为对照组。结果如图3内容I所示，添加光照后，药物释放得到了进一步提升，光照组360min时药物释放率为21.6％，而对照组药物释放率为13.7％。这表明光照引起溶液温度升高，促进了纳米粒解体，从而进一步促进了药物释放率，实现光热促进化疗，进一步增强治疗效果。
实施例6
不同浓度，不同样品的体外升温情况。
取浓缩后的实施例2制备的DOX@CHI纳米粒溶于超纯水，按照IR780的浓度分别稀释为一系列浓度的样品：30，20，10，5μg/mL，超纯水作为对照组。取1mL于1.5mL EP管中，808nm激光器1.0W/cm2进行照射，用热成像仪检测EP管内液体温度变化，每30s记录一次温度，连续记录480s的温度变化。结果如图4内容A,图4内容B所示。
取游离IR780及DOX@CHI纳米粒溶于超纯水，按照IR780的浓度稀释20μg/mL，超纯水作为对照组。取1mL于1.5mL EP管中，808nm激光器1.0W/cm2进行照射，用热成像仪检测EP管内液体温度变化，每30s记录一次温度，连续记录480s的温度变化结果如图4内容C,内容D所示。
结果显示，浓度为30μg/mL，激光功率为1.0W/cm2时，DOX@CHI纳米粒溶液表现出较好的体外升温能力，达到59℃。此外，DOX@CHI比游离IR780的体外升温效果更好，游离IR780的光热转换效率仅有8％，而DOX@CHI的光热转换效率高达36.7％，为游离IR780的4.6倍。
实施例7
不同浓度DOX@CHI纳米粒溶液的体外光声成像
按照实施例2制备的DOX@CHI，超纯水稀释配制了IR780浓度分别为25、50、100、200μg/mL的DOX@CHI纳米粒溶液，利用光声显微成像仪在744nm激光下对纳米粒进行光声扫描。结果如图4内容E和图4内容F所示。随着IR780浓度的升高，体外光声信号强度也随之增强，并且与浓度呈现出正相关。
实施例8
利用共聚焦显微镜研究肿瘤细胞对纳米粒的摄取
将生长状态良好的4T1细胞消化收集后铺到confocal皿中，每皿铺10万细胞，培养箱孵育过夜使之贴壁。然后用1640全培养基配置游离IR780、DOX·HCl、DOX@HI和DOX@CHI溶液，使最终DOX浓度为2μg/mL,IR780浓度为0.5μg/mL。向预先处理好的4T1细胞中分别加入1mL含纳米粒的培养基，然后放在培养箱中孵育4h。孵育完成后每皿加入1mL 4％多聚甲醛固定15min。然后吸去多聚甲醛，加入1mL 10μg/mL DAPI进行染色。15min后吸去DAPI并用PBS洗涤三次。使用激光共聚焦显微镜检测4T1细胞中DOX及IR780的荧光强度。结果如图5A所示。
结果显示，DOX·HCl主要进入细胞核，IR780则分布于胞质中,而DOX@HI和DOX@CHI组中的脱盐DOX少量进入细胞核。
实施例9
利用流式细胞仪研究肿瘤细胞对纳米粒的摄取
预先准备好空白培养基，含有IR780、DOX@HI和DOX@CHI的培养基，使最终IR780浓度为0.5μg/mL。将生长状态良好的4T1细胞消化后收集并计数，然后将其接种到6孔板中，每孔接种10w个细胞，接种12个孔。5％二氧化碳培养箱37℃孵育过夜。向6孔板中分别加入空白1640培养基、Free IR780和两种纳米粒溶液，每孔加1mL，每个样品加三个重复孔。37℃孵育4h后，吸去样品，用PBS冲洗三次，每孔加0.5mL胰酶消化3min。消化完成后加含血清培养基终止消化，1200rpm离心3min收集细胞。收集好的细胞再用PBS洗涤2-3次。最后收集到的细胞加入200μL PBS吹散备用。通过流式细胞仪检测IR780的荧光强度。结果如图5B和图5C所示。
结果显示DOX@HI和DOX@CHI纳米粒组相较于游离IR780具有更高的细胞摄取量，这可能是因为纳米粒带少量正电荷，更容易被细胞摄取。由于CREKA靶向基质微环境，因而在细胞水平DOX@CHI纳米粒相较于DOX@HI纳米粒的摄取相似。
实施例10
利用MTT法检测游离IR780和大分子偶联物CHI(为实施例1制备)的细胞毒性；利用MTT法检测游离DOX，DOX@HI和DOX@CHI(均为实施例2制备)的体外抗肿瘤活性。
将生长状态良好的4T1细胞使用胰酶消化，离心收集后稀释成8万/mL的细胞悬液，然后铺到96孔板中，每孔100μL，培养箱孵育过夜使之贴壁。按照IR780浓度10，5，2，1，0.5，0.2，0.1μg/mL，分别配置含Free IR780和CHI的全培养基溶液。将96孔板中的旧培养基吸去，并加入配置好的含IR780的新培养基100μL，每组加6孔。空白对照及无细胞对照加入新的全培养基。然后放入培养箱孵育24h。孵育完成后每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液(用无菌PBS配置)。再将96孔板放入培养箱孵育。MTT孵育4h后吸去96孔板中培养基并加入150μL二甲亚砜，37℃放置半小时使形成的甲瓒完全溶解。最后利用酶标仪检测吸光度，检测波长为492nm。结果如图6内容A所示。
按照DOX浓度20，10，8，4，2，1，0.5，0.1μg/mL，分别配置Free DOX，DOX@HI和DOX@CHI(均为实施例2制备)的全培养基溶液。向96孔板中的贴壁细胞里加入配置好的含DOX的新培养基100μL，每组加6孔。空白对照及无细胞对照加入新的全培养基。然后放入培养箱孵育24h。利用MTT法检测细胞存活情况。结果如图6内容B所示。
结果显示，游离IR780在5μg/mL的浓度下即能产生较强的细胞毒性，细胞存活率仅为19.5％，而CHI的细胞存活率达53.6％，表明偶联了羟乙基淀粉的IR780具有更好的生物安全性。而DOX@HI，DOX@CHI纳米粒杀伤肿瘤细胞的活性相似，这主要是因为CREKA肽靶向基质中的纤维蛋白及纤连蛋白复合物，而在细胞层面，CREKA肽未发挥较强的作用。
实施例11
利用MTT法检测激光照射对DOX@CHI纳米粒(实施例2制备)体外抗肿瘤活性的影响。
将生长状态良好的4T1细胞使用胰酶消化，离心收集后稀释成8万/mL的细胞悬液，然后铺到96孔板中，每孔100μL，培养箱孵育过夜使之贴壁。按IR780浓度为5，2，1和0.5μg/mL配置DOX@CHI的全培养基溶液。将96孔板中的旧培养基吸去，并加入配置好的含FreeIR780和DOX@CHI的新培养基100μL，每组加6孔，空白对照及无细胞对照加入新的全培养基。共设置两块96孔板，其中一块板在给药4h后给与808nm激光照射，功率为1.0W/cm2，每孔照射5min，另一块未使用808激光照射的作为对照，照射完成后放入培养箱孵育24h。孵育完成后每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液(用无菌PBS配置)。再将96孔板放入培养箱孵育。MTT孵育4h后吸去96孔板中培养基并加入150μL二甲亚砜，37℃放置半小时使形成的甲瓒完全溶解。最后利用酶标仪检测吸光度，检测波长为492nm。结果如图6内容C所示。
结果显示，加了激光光照DOX@CHI+L细胞杀伤要强于未加激光照射的DOX@CHI组，且浓度越高，升温效果越好，杀伤效果越强。
实施例12
利用流式细胞仪研究不同样品处理后肿瘤细胞周期情况。
将生长状态良好的4T1细胞使用胰酶消化，离心收集后稀释成30万/mL的细胞悬液，然后铺到6孔板中，每孔1mL，培养箱孵育过夜使之贴壁。按DOX浓度为4μg/mL，IR780浓度为1μg/mL分别配制Free DOX、Free IR780、DOX@HI、DOX@CHI全培养基溶液，其中，激光照射组在给药2h后使用808nm激光照射5min，照射完成后放入培养箱孵育24h。孵育完成后，用预冷的PBS溶液洗涤3次，然后用Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡试剂盒进行染色，通过流式细胞仪分析细胞周期。结果如图6内容D，图6内容E所示。
结果显示，相较于不加光照的DOX@CHI，DOX@CHI+Laser组肿瘤细胞存活率最低，晚期凋亡率达40.78％，这表明单一化疗细胞毒性不强，但在化疗-光热的综合作用下，肿瘤细胞大量死亡，对肿瘤细胞的杀伤效果最强。
实施例13
纳米粒的体内荧光成像及药物组织分布研究。
购买BALB/c雌鼠，六周龄，体重在15-17g之间。在实验室动物房适应性饲养一周后，将小鼠右后肢周围毛发剃干净。培养4T1细胞，等到细胞数量足够且处于对数期时，消化、离心收集细胞。用PBS洗涤一次后重新用PBS重悬，配置成107/mL的细胞悬液，置于冰盒中待用。使用注射器在每只小鼠右后肢上方皮下注射100μL细胞悬液。注射完成后继续饲养即可。肿瘤体积计算公式为：V＝(L×W^2)/2，其中V表示肿瘤体积，L表示肿瘤的长径，W表示短径。待到肿瘤体积达到200mm3后，将荷瘤小鼠随机分为3组，每组3只。分别尾静脉给与游离IR780，DOX@HI和DOX@CHI纳米粒溶液(用PBS配置)，给药剂量按照IR780计算为1mg/kg。在给药前和给药后第0.5，1，2，4，8，12，24和48h将小鼠麻醉，并通过小动物活体成像仪对小鼠进行荧光成像，荧光通道选择ICG通道，745nm激发，830nm发射。为了进一步研究纳米药物在体内的分布行为，在给药后48h，处死小鼠并取出心，肝，脾，肺，肾和肿瘤，使用小动物活体成像仪进行荧光成像。结果如图7内容A，图7内容B，图7内容C和图7内容D所示。
结果显示，IR780赋予纳米粒活体成像的能力，能够实时对肿瘤进行成像。三组小鼠肿瘤部位的荧光强度都是随给药时间增加而增强，均在12h后就无显著变化。因此在进行光热实验时选取的照射时间是给药后12h。在采集荧光照片的各个时间点上，游离IR780组和DOX@HI组小鼠的荧光相对较弱，这主要是因为游离IR780是小分子，直接注射到体内很容易直接就经过肝脏或是肾脏被清除，血液循环半衰期很短，故只有少量的IR780能到达肿瘤部位产生荧光。相比而言，DOX@CHI组在肿瘤部位富集量最多，48h时的平均荧光强度分别是游离IR780和DOX@HI组的1.59和1.36倍。这主要可能是因为DOX@CHI表面具有亲水的羟乙基淀粉大分子使得纳米粒的血液循环时间增加，并且在EPR效应影响下，纳米粒在肿瘤部位富集增多，此外CREKA的靶向作用使得DOX@CHI纳米粒在肿瘤部位有更多的富集；图7内容C和图7内容D是给药后48h取出的各组小鼠各个器官的荧光照片以及对各个器官荧光半定量的结果。从结果可以看出，较游离IR780和DOX@HI组而言，DOX@CHI组纳米粒在肿瘤部位有更高的富集量，分别是游离IR780和DOX@HI组的2.06倍和1.59倍。以上的结果表明，相较于游离IR780和DOX@HI而言，DOX@CHI纳米粒在肿瘤部位有着更高的富集量，这意味着DOX@CHI纳米粒具有更好的成像和治疗效果。
实施例14
纳米粒的体内光热及光声成像
购买BALB/c雌鼠，六周龄，体重在15-17g之间。在实验室动物房适应性饲养一周后，将小鼠右后肢周围毛发剃干净。培养4T1细胞，等到细胞数量足够且处于对数期时，消化、离心收集细胞。用PBS洗涤一次后重新用PBS重悬，配置成107/mL的细胞悬液，置于冰盒中待用。使用注射器在每只小鼠右后肢上方皮下注射100μL细胞悬液。注射完成后继续饲养即可。肿瘤体积计算公式为：V＝(L×W^2)/2，其中V表示肿瘤体积，L表示肿瘤的长径，W表示短径。待肿瘤长到200mm3左右，随机将小鼠分3组，每组3只。分别尾静脉给与Free IR780,DOX@HI和DOX@CHI，给药剂量按IR780计算为1mg/kg。给药12h后进行808nm激光照射10min，激光功率为1.0W/cm2。结果如图8内容A和图8内容B所示。另外，随机将小鼠分3组，每组3只，分别尾静脉注射DOX@CHI纳米粒，给药剂量按IR780计算分别为1.5mg/kg，1mg/kg和0.5mg/kg，在给药12h后进行808nm激光照射10min，激光功率为1.0W/cm2，每30s记录温度，结果如图8内容C所示。
结果显示，IR780赋予纳米粒产生光热的能力，能够实现对肿瘤进行光热治疗。使用808nm激光器，在1.0W/cm2功率下照射肿瘤部位10min，各组瘤内升温曲线如图8内容B和内容C所示。游离IR780组肿瘤部位温度从37.6℃左右升高到了43.6℃左右，这表明游离IR780组也会有较少一部分富集在肿瘤部位并产生光热效果。由于DOX@HI较DOX@CHI纳米粒在肿瘤部位富集要少，DOX@HI纳米粒的升温效果较DOX@CHI纳米粒差，DOX@HI组肿瘤部位在激光照射10min后温度维持在44.4℃左右，而DOX@CHI则可以维持在46℃左右。纳米粒在肿瘤部位的升温能力强于游离的IR780，有CREKA靶向DOX@CHI在肿瘤部位的升温能力强于无靶向的DOX@HI。同时，在相同激光功率照射下，1mg/kg随着给药浓度增强，升温效果增强，说明即使在体内，IR780的升温也同样具有浓度依赖性。1mg/kg的给药剂量即可使老鼠升温达45℃左右，从而选定实施例15所使用的IR780的给药剂量位1mg/kg，激光功率为1.0W/cm2。
另取1只小鼠，尾静脉注射DOX@CHI纳米粒，给药剂量按IR780计算为1mg/kg，给药12h后进行光声成像，使用光声显微成像仪扫描肿瘤部位的光声信号，激光波长为744nm，扫描面积为8.0mm×8.0mm。瘤内光声信号强度及3D肿瘤光声成像结果如图8内容D和图8内容E所示。
结果显示，DOX@CHI纳米粒在瘤内有较强的光声信号，能较清晰显示出肿瘤的轮廓。
实施例15
购买BALB/c雌鼠，六周龄，体重在15-17g之间。在实验室动物房适应性饲养一周后，将小鼠右后肢周围毛发剃干净。培养4T1细胞，等到细胞数量足够且处于对数期时，消化、离心收集细胞。用PBS洗涤一次后重新用PBS重悬，配置成107/mL的细胞悬液，置于冰盒中待用。使用注射器在每只小鼠右后肢上方皮下注射100μL细胞悬液。注射完成后继续饲养即可。肿瘤体积计算公式为：V＝(L×W^2)/2，其中V表示肿瘤体积，L表示肿瘤的长径，W表示短径。待肿瘤长到80mm3左右，将小鼠随机分为8组，每组6只，分别给与(1)生理盐水，(2)DOX+IR780，(3)DOX+IR780+Laser，(4)DOX@HI，(5)DOX@HI+Laser，(6)DOX@CHI，(7)DOX@CHI+Laser(图中L表示Laser)。通过尾静脉给药，给药剂量为DOX 4mg/kg，IR780 1mg/kg。每三天给一次药，一共给两次药，并在第一次给药后进行光照，光照组在给药后12h进行光照。光照功率为1.0W/cm2，光照时间为10min。在实验过程中，每两天测量一次小鼠体重和肿瘤体积。结果如图9所示。在给药后第14天处死小鼠，每只小鼠需收集两份全血，一份测定血常规(抗凝)指标，另一份检测血生化(不抗凝)指标。小鼠处死后，剥离肿瘤，并对离体肿瘤称重和拍照，结果如图10和图11所示。将肿瘤用4％的多聚甲醛固定，用石蜡包埋切片，进行HE染色，Ki67和TUNEL免疫荧光染色，结果如图12所示。图12中H&E结果显示，DOX@CHI+Laser组肿瘤表现出了更大的肿瘤坏死面积。同时，DOX@CHI+Laser组具有最低的Ki67荧光，表明肿瘤内部细胞增殖最弱。此外，DOX@CHI+Laser具有最高的TUNEL荧光，表明肿瘤内部细胞凋亡最强。上述结果一致表明，DOX@CHI+Laser组具有最好的抗肿瘤效果。
测定血常规的全血可以直接用血细胞分析仪检测，测定血生化指标的全血则要在4℃放置过夜后，3000rpm离心5min，收集血清后，进行检测，结果如图13所示。图13为治疗过程中各组小鼠体重检测以及血生化及血常规指标检测结果。图13内容A为实施例15小鼠经不同给药处理后体重的变化，评价不同药物对小鼠的毒性；图13内容B至内容I为实施例15小鼠经不同给药处理后对小鼠血液进行的血常规和血生化检测评价不同药物对小鼠的毒性；图13内容B为血清中谷丙转氨酶的量；图13内容C为血清谷草转氨酶的量；图13内容D为血清中肌酸激酶的量；图13内容E为为血清中尿素氮的量；图13内容F为血液中白细胞的量；图13内容G为血液中血小板的量；图13内容H为血液中血红蛋白的量；图13内容I为血液中血小板的量。
从结果来看，在DOX+IR组，DOX@HI和DOX@CHI组中，相对于对照组，对肿瘤的生长有较好的抑制作用，这归因于化疗发挥一定的抗肿瘤作用；DOX@CHI组比DOX@HI组具有更好的肿瘤抑制效果，这得益于DOX@CHI更强的稳定性以及CREKA的靶向作用使更多DOX@CHI纳米粒富集到肿瘤部位。而与单纯化疗组相比，由于化疗和光热治疗的协同作用，DOX@HI+Laser组与DOX@CHI+Laser组均表现出更好的肿瘤抑制效果，在激光照射下，肿瘤部位快速升高的温度，不仅可以之间杀死肿瘤细胞，同时促进化疗药的快速释放，有助于化疗药物进入肿瘤细胞，增加化疗药物的细胞毒性。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光敏剂-羟烷基淀粉-肿瘤靶向肽偶联的两亲性大分子化合物，其特征在于，该大分子化合物为由羟烷基淀粉、光敏剂以及肿瘤靶向肽通过化学键偶联得到；
所述光敏剂为疏水性有机类花菁染料分子，所述疏水性有机类花菁染料分子与所述羟烷基淀粉通过化学键偶联；
该两亲性大分子化合物中所述光敏剂作为疏水端，所述羟烷基淀粉作为亲水端；
所述肿瘤靶向肽含有巯基，所述肿瘤靶向肽与经过二硫基修饰的所述羟烷基淀粉通过所述巯基与所述二硫基的交换反应而实现偶联，实现其在所述两亲性大分子化合物上的修饰。
2.如权利要求1所述的大分子化合物，其特征在于，所述疏水性有机类花菁染料分子为IR780、IR783、IR808、IR820和IR825中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的大分子化合物，其特征在于，所述肿瘤靶向肽为CREKA多肽、RGD肽、iRGD肽、NGR肽和NGD肽中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的大分子化合物，其特征在于，所述化学键为酰胺键或酯键。
5.如权利要求1所述的大分子化合物，其特征在于，所述光敏剂为IR780，所述IR780与所述羟烷基淀粉通过酰胺键连接。
6.一种如权利要求1至5任一项所述的两亲性大分子化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使光敏剂中含有的氯原子通过取代反应转化为氨基，得到含有氨基的光敏剂；
(2)将所述含有氨基的光敏剂与羧基化羟烷基淀粉的羟基发生酰胺反应生成光敏剂-羧基化羟烷基淀粉偶联物；
(3)使所述光敏剂-羧基化羟烷基淀粉偶联物上的羧基与含有2-吡啶基二硫基的伯胺化合物上的氨基发生酰胺反应，得到光敏剂-含有二硫基的羟烷基淀粉偶联物；
(4)将步骤(3)所述光敏剂-含有二硫基的羟烷基淀粉偶联物经过分离纯化后，使该偶联物与所述肿瘤靶向肽发生巯基-二硫键交换反应，所得产物经分离提纯后得到所述两亲性大分子化合物。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述光敏剂为IR780，步骤(1)具体为：使IR780与至少含有两个仲胺基的化合物发生取代反应，得到含有仲胺基的IR780。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述至少含有两个仲胺基的化合物为哌嗪、N,N’-二甲基乙二胺、N,N’-二甲基-1,3-丙二胺、2,2-双哌啶、4,4’-二哌啶或3,3’-联哌啶中的一种或多种。
9.一种基于如权利要求1至5任一项所述两亲性大分子化合物的纳米载药系统，其特征在于，包含如权利要求1至5任一项所述两亲性大分子化合物，还包括抗肿瘤药物；且所述抗肿瘤药物与所述两亲性大分子化合物通过亲疏水作用及π-π堆积作用而组装形成纳米胶束。
10.一种抗癌药物，其特征在于，包含如权利要求9所述的纳米载药系统和药学上可接受的添加剂。
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