CN105879051A - 一种自组装的核壳结构纳米药物的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自组装的核壳结构纳米药物的制备及应用，以羧甲基纤维素（CMC）为载体，通过羧甲基纤维素的亲水基和疏水基熊果酸自组装形成纳米粒子CMC‑UA·NPs，它可以负载双氢青蒿素疏水药物，制备具有核壳结构的纳米粒子CMC‑UA(DHA)·NPs，核是双氢青蒿素（DHA），壳是载有熊果酸（UA）的自组装层。本发明的核壳结构纳米药物的纳米粒子形貌为球型，粒径较为均一，大小在20nm‑50nm之间，分散性好，载药量高，有稳定的包封率，生物相容性好，毒性小，具有缓释功能的一种新型的水溶性纳米药物，可抑制多种癌细胞的生长，使癌细胞凋亡。本发明属于生物制药和纳米技术领域，核壳结构纳米药物的制备，操作方便，制备技术工艺周期短，成本低，有很大的工业化前景。

Description

一种自组装的核壳结构纳米药物的制备及应用

技术领域

本发明属于生物制药和纳米技术领域，涉及药物递送系统，具体涉及一种自组装的核壳结构纳米药物的制备及应用。

背景技术

羧甲基纤维素钠（Sodium carboxymethylcellulose，简称CMC-Na）是一种天然高分子化合物纤维素羧甲基化的衍生物，又名纤维素胶，是阴离子型线性高分子，由 D-吡喃葡萄糖通过 β-(1→4)-苷键结合而成。CMC-Na无毒无味，具有优良的水溶性、粘胶性、乳化性、扩散性好、抗过酶性和很好的稳定性，适合做药物载体。

熊果酸（Ursolic acid，简称UA）又名乌索酸、乌苏酸，是一种五环三萜类化合物，化学分子式为C₃₀H₄₀O₃，广泛存在于熊果、女贞、白花蛇舌草、山楂、乌梅、夏枯草、接骨木、枇杷和苹果等天然药用植物和果实中，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、抗突变、保肝、调节机体免疫等多种生物活性，经过研究发现，熊果酸对多种肿瘤具有抑制作用，如熊果酸能够诱导子宫内膜癌细胞凋亡，可以通过p53介导诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡，抑制肺癌A549及SPCA1细胞株的增殖，对P-388和L-1210白血病细胞有显著的细胞毒性作用，熊果酸同时对胃癌、卵巢癌、TSCCA人舌鳞癌、食管癌、皮肤癌、胰腺癌、骨髓癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病等具有显著的抑制增殖作用。

双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，简称DHA）是一种青蒿素类药物中活性较强的衍生物，是由青蒿素经四氢硼钠还原而成，具有独特的过氧桥结构、DHA具有良好的吸收性、排泄和代谢迅速、毒性低等优点，它作为一种有效的抗疟疾药被广泛应用于临床，其抗疟疾是青蒿素的4～8倍，近年研究发现，DHA不但可以抗疟疾，还具有抗肿瘤特性，如可诱导前列腺癌PC-3细胞的凋亡，人骨肉瘤143B、U-20S凋亡，抑制人卵巢癌细胞的增殖，诱导人肺腺癌A549细胞凋亡，对人肺鳞癌细胞株YTMLC有抑制作用，抑制神经胶质瘤干细胞侵袭迁移，诱导干癌癌细胞SMMC-7721凋亡，抑制人胃癌细胞SGC-7901增殖，同时对人结肠癌HCT116细胞、肺癌SPC-A-1、乳腺癌、宫颈癌、骨髓瘤、骨髓系白血病细胞系K562和HL60等多种癌细胞具有抑制增殖，诱导癌细胞凋亡作用。

癌症已成为危害人类生命健康的最主要疾病，临床主要通过药物治疗的手段治疗癌症，然而许多抗癌药物如UA多为难溶于水，口服给药体内吸收差，体外释放度小，难于透皮吸收，生物利用度较差，这些都限制了UA在药学领域的广泛应用，因此，解决其水溶性的问题、增加药物稳定性、提高对癌细胞的缓释杀伤能力是UA临床应用的关键。

目前，高分子胶束药物载体一般采用线性高分子胶束，不需要改变药物分子的结构就能实现了药物的递送及缓释功能，使药物可以穿过生物屏障传输至组织细胞，并能输送多种不同性质的药物。但很多高分子胶束纳米药物存在胶束稳定性差，增溶效果不明显，药物释放率低等问题，未能实现药物的大量递送及缓释功能，限制其在临床方面的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种自组装的核壳结构纳米药物的制备方法，CMC-UA在水介质中可自组装形成纳米胶束，以解决UA的水溶相差，生物利用度低等问题，而且避免大量使用化学试剂，造成的试剂回收困难，使用羧甲基纤维素为药物载体，解决高分子胶束纳米药物的稳定性差，药剂包封率不高，不完全释放和突释情况。本发明具有制备工艺简单，抗肿瘤活性强，载药量高，药效显著提高，毒副作用低等优点。

一种自组装的核壳结构纳米药物制备的技术方案如下：

所述的自组装的核壳结构纳米药物的制备，以羧甲基纤维素链段为载体，羧甲基纤维素的羧基与熊果酸的羟基通过酯键相连，所述自组装的核壳结构纳米药物前体具有如下结构：

式中，所述羧甲基纤维素链段的重均分子量为2000～300000。

所述的一种自组装的核壳结构纳米药物的制备方法，其纳米粒子中UA的载药量为0.01%-40%，纳米粒子的质量百分比0.01%-95%，纳米粒子半径10-200nm。

本发明所述的一种自组装的核壳结构纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

（1）取一定量的羧甲基纤维素钠，缓慢加入20%硫酸溶液中，搅拌均匀，出现白色絮状沉淀，反应3h，离心沉淀，去除上清液，去离子水多次洗涤沉淀，反复离心，至pH=7.0，冷冻干燥，获得羧甲基纤维素白色粉末A；

（2）取（1）中羧甲基纤维素，缓慢加入含10ml吡啶的50ml圆底烧瓶中，并超声10-30min，搅拌溶解2h，然后在溶液中加入激活剂 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP），搅拌30min，加入一定量的熊果酸，35℃下水浴反应48h，并通氮气，排出反应生成的水；

（3）对（2）中反应后的药物进行纯化，向反应后的混合物中加入3倍体积的乙醚沉淀，振荡均匀，离心去上清液，再将吡啶加入到沉淀物中，充分溶解，加入3倍体积乙醚沉淀，搅拌均匀，离心去上清液，重复操作三次，将最终的沉淀于乙醚中洗涤多次，离心，收集沉淀，置于8kDa MWCO的半透膜里，在PBS溶液中透析24h，每隔6h换一次PBS液，透析膜内的透析液冷冻干燥，收集固体粉末B；

（4）取一定质量（3）中的冷干物溶于20ml二甲基亚砜，溶解1h，逐滴滴入高速搅拌的PBS溶液中，搅拌，纳米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h换一次透析液，透析膜中的透析液冷冻干燥，得白色粉末C；向（3）中冷干物加入双氢青蒿素，溶于二甲基亚砜，溶解1h，逐滴滴入高速搅拌的PBS溶液中，搅拌，纳米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h换一次透析液，透析膜中的透析液冷冻干燥，得白色粉末D。

优选地，步骤（1）所述的羧甲基纤维素钠与20%硫酸溶液固液比为1:15～1:50（g/ml）；

优选地，步骤（2）所述的羧甲基纤维素与吡啶的固液比为1:20～1:100（g/ml）；

优选地，步骤（2）所述的UA与EDC、DMAP的摩尔比为1:2:0.2；

优选地，步骤（2）所述的CMC与UA的反应温度为20～40℃，反应时间为36～60h；

优选地，步骤（3）所述的反应溶液与乙醚的体积比为1:3（v/v），透析过程每2h换一次PBS液；

优选地，步骤（4）所述的粉末B与双氢青蒿素的摩尔比为1:0.1～1:1；

优选地，步骤（4）所述的粉末B在水介质中进行自组装性能的纳米颗粒体系，即得到所述的抗癌核壳结构的纳米药物；

优选地，（1）-（4）所述的一种自组装的核壳结构纳米药物的制备具有缓释功能。

本发明所述的抗癌高分子胶束的自组装采用本领域熟知的现有技术进行。

本发明将UA与亲水线性聚合物CMC键接，所得的CMC-UA键合物自组装制备纳米粒子，结构比较稳定，制作工艺简单，实现药物的水溶性和缓释功能，并具有较高载药量。

本发明制备的抗癌高分子胶束纳米药物的粒径在10-50nm，粒径较均一，有利于在肿瘤部位的富集，提高药物的缓释功能，减少对正常细胞的毒副作用。

相对现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的自组装的核壳结构纳米药物生物相容性好，毒副作用低，CMC与UA键合的同时，自组装过程还包裹DHA，增大了载药量，联合UA和DHA共同作用于肿瘤部位，在肿瘤部位的弱酸环境中，纳米药物的纳米粒子解聚，暴露出受体结合位点，以达到诱导肿瘤凋亡的目的。本发明的制备方法简单，自组装过程无需大量有机溶剂，只需在水介质中形成纳米粒子，纳米粒子稳定，粒径小，有广阔的应用前景。

附图说明

图1为合成高分子化合物CMC-UA的核磁图

图2为纳米粒子的透射电镜形貌图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明作进一步说明。

实施例1、一种自组装的核壳结构纳米药物的制备方法：

（1）羧甲基纤维素钠酸化

取一定量的羧甲基纤维素钠（分子量10000～30000），缓慢加入20%硫酸溶液中，搅拌均匀，出现白色絮状沉淀，反应3h，离心沉淀，去除上清液，去离子水多次洗涤沉淀，反复离心，至pH=7.0，冷冻干燥，得到羧甲基纤维素。

（2）高分子药物合成

取（1）中羧甲基纤维素0.2g，缓慢加入含10ml吡啶的50ml圆底烧瓶中，并超声10-30min，搅拌溶解2h，然后在溶液中加入0.4g激活剂 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、0.04g催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP），搅拌30min，加入0.4g的熊果酸，35℃下水浴反应48h，并通氮气，排出反应生成的水。

（3）药物的纯化

对（2）中反应后的药物进行纯化，向反应后的混合物中加入3倍体积的乙醚沉淀，振荡均匀，离心去上清液，再将吡啶加入到沉淀物中，充分溶解，加入3倍体积乙醚沉淀，搅拌均匀，离心去上清液，重复操作三次，将最终的沉淀于乙醚中洗涤多次，离心，收集沉淀，置于8kDa MWCO的半透膜里，在PBS溶液中透析24h，每隔6h换一次PBS液，透析膜内的透析液冷冻干燥，收集固体粉末。

（4）药物的自组装

取一定质量（3）中的冷干物溶于20ml二甲基亚砜，溶解1h，逐滴滴入高速搅拌的PBS溶液中，搅拌，纳米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h换一次透析液，透析膜中的透析液冷冻干燥，得白色粉末A；向（3）中冷干物加入双氢青蒿素，溶于二甲基亚砜，溶解1h，逐滴滴入高速搅拌的PBS溶液中，搅拌，纳米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h换一次透析液，透析膜中的透析液冷冻干燥，得白色粉末B。

（5）载药量及粒径大小测定

取7份0.1g CMC于20ml圆底烧瓶中，加入10ml吡啶，分别加入10%、20%、30%、40%、50%、80%、90%的UA于烧瓶中，反应48h，同步骤（2）（3）操作，将纯化后的7个不同样品取等量10mg，溶于0.5ml DMSO，搅拌30min后，逐滴加入5ml PBS溶液中，剧烈搅拌，透析12h，透析液用紫外分光光度计在波长210nm处测得吸光度，计算载药量，剩余纳米溶液超声10min，测得粒径大小为20～40nm，分散指数（PDI）为0.159。

（6）释药量的测定

取10mg CMC-UA，加入0.5ml DMSO，搅拌30min后，逐滴加入5ml PBS溶液中，将溶液转入透析袋中，透析去除DMSO，冷冻干燥，得到白色粉末C，将粉末C溶于PBS液，配成1mg/ml溶液，装入透析袋中，至于装有200ml PBS溶液500ml烧杯中，水浴下轻微搅拌，调节温度为37℃。

（7）TEM检测：取（3）中纯化药物A、B不同质量于5ml二甲基亚砜中，搅拌1h，取0.5ml溶液，缓慢滴入高速搅拌的PBS液中，分别搅拌15、25、35、45、55min，取不同时间、不同浓度的溶液20μl，滴到200目筛网上，得到的纳米粒子最佳分散配比为2:1（mg/ml），搅拌时间为35min。

实施例2、一种自组装的核壳结构纳米药物的制备方法：

在本实例中，通过与实施例1相同的合成方法及步骤，改变羧甲基纤维素钠分子量为30000～90000，测得粒径大小为30～70nm，分散指数（PDI）为0.177。

实施例3、一种自组装的核壳结构纳米药物的制备方法：

在本实例中，通过与实施例1相同的合成方法及步骤，改变羧甲基纤维素钠分子量为90000～150000，测得粒径大小为50～90nm，分散指数（PDI）为0.149。

实施例4、一种自组装的核壳结构纳米药物的制备方法：

在本实例中，通过与实施例1相同的合成方法及步骤，改变羧甲基纤维素钠分子量为150000～250000，测得粒径大小为60～120nm，分散指数（PDI）为0.199。

Claims (6)

1.一种自组装的核壳结构纳米药物的制备及应用，其特征在于，以羧甲基纤维素链段为载体，羧甲基纤维素的羧基与熊果酸的羟基通过酯键相连，所述自组装的核壳结构纳米药物前体具有如式Ⅰ所示的结构：

式中，所述羧甲基纤维素链段的重均分子量为2000～300000。

2.如权利要求1所述的一种自组装的核壳结构纳米药物的制备，其特征在于，步骤如下：

（1）将一定量的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）与20%硫酸溶液以固液比1:15～1:50（g/ml）混合，室温下反应，然后用去离子水洗至中性，冷冻干燥，获得羧甲基纤维素白色粉末A；

（2）取一定量的步骤（1）中的羧甲基纤维素粉末溶于吡啶，羧甲基纤维素与吡啶的固液比1:20～1:100（g/ml），加入激活剂 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP），熊果酸，水浴下反应，反应温度为20～40℃，反应时间为36～60h；

（3）将步骤（2）中得到的反应混合物加乙醚沉淀（1:3，v/v），离心洗涤，洗涤后的沉淀用磷酸盐缓冲溶液（PBS）透析，透析液冷冻干燥，得到淡黄色粉末B；

（4）将步骤（3）中粉末B和双氢青蒿素溶于二甲基亚砜，并滴入PBS溶液中，所得溶液透析，透析过程每2h换一次PBS液，然后冷冻干燥得到所述自组装的核壳结构纳米药物。

3.如权利要求1、2所述的一种自组装的核壳结构纳米药物的制备，其特征在于，步骤（2）所述的UA与EDC、DMAP的摩尔比为1:2:0.2。

4.如权利要求1、2所述的一种自组装的核壳结构纳米药物的制备，其特征在于，步骤（4）所述的粉末B与双氢青蒿素的摩尔比为1:0.1～1:1。

5.如权利要求1、2、3、4所述的一种自组装的核壳结构纳米药物的制备，其特征在于，其纳米粒子中UA的载药量为0.01%-40%，纳米粒子的质量百分比0.01%-95%，纳米粒子半径20-100nm。

6.如权利要求1、2、3、4所述的一种自组装的核壳结构纳米药物的制备具有稳定的粒径大小，缓释功能。