CN112480289B - 一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药及其制备方法和应用 - Google Patents

一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药及其制备方法和应用，首先利用Diels‑Alder反应将3,3'‑二硫代二丙酰肼键接到壳聚糖衍生物上得到酰肼化壳聚糖衍生物；同时，阿霉素经腙键与3,3'‑二硫代二丙酰肼连接，得到酰肼化阿霉素；然后，将酰肼化壳聚糖衍生物和酰肼化阿霉素的水溶液与铂类药物溶液混合均匀，经自组装过程形成核壳结构型壳聚糖基纳米前药。该纳米前药粒径在100‑200nm范围内可调节，具有谷胱甘肽和pH双重刺激响应性，其所含的双硫键可清除谷胱甘肽，避免其导致的肿瘤细胞耐受铂类药物现象的发生，可用于多种肿瘤的联合化疗，提高抗肿瘤效果和降低毒副作用。

Description

一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前 药及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是世界上第二大死亡原因。据世界卫生组织2019年9月发布的报告称，全球1/5的男性和1/6的女性在一生中会患上癌症，1/8的男性和1/11的女性将死于癌症。化疗是癌症治疗的重要手段，而铂类抗肿瘤药物在化疗中具有举足轻重的地位。自1978年顺铂作为第一代铂类抗肿瘤药物被美国食品药品管理局批准应用于临床以来，已被证明是最有效的抗肿瘤药物之一。然而，铂类药物在治疗肿瘤中仍然存在一些不足，如耐药性、谷胱甘肽诱导的铂解毒作用以及非特异性靶向肿瘤部位等问题。
为了克服铂类药物的上述缺陷，提高治疗效果，临床上常用阿霉素或紫杉醇或其他小分子化疗药物与铂类药物联用。阿霉素不仅具有插入双链DNA和抑制拓扑异构酶II活性的抗癌作用，还能抑制拓扑异构酶II对铂损伤的DNA的自修复作用，从而提高铂类药物的治疗效果。如申请号为CN201810844377.3的中国专利公开了双药型顺铂/阿霉素－聚多巴胺前药纳米粒子的制备和抗肿瘤应用，用于逆转肿瘤多药耐药性。虽然在逆转肿瘤对阿霉素和顺铂抗癌药多药耐药性方面有明显效果，但是谷胱甘肽诱导铂类药物解毒性仍值得关注。
纳米粒子介导的化疗药物的递送在肿瘤治疗中显示出诸多优势，如能够增强抗癌效果和降低全身毒性。纳米粒子由于其独特的粒径和表面特性使其很容易透过肿瘤组织的血管壁间隙，进入肿瘤组织部位，发挥抗肿瘤作用。另外，纳米载药体系能够避免在血液循环过程中药物的泄露，增强药物在宿主体内的渗透和滞留效应。而纳米粒子载药体系的关键在于纳米材料的选择，在已报道的诸多纳米载药体系中，壳聚糖作为自然界唯一带有正电荷的天然多糖，因其来源广泛、安全无毒、生物相容性和可降解性良好，受到特别关注，尤其是作为基因载体和促进肿瘤细胞摄取纳米药物方面潜力很大。然而，壳聚糖自身难溶于水，极大限制着其应用范围。壳聚糖含有氨基和羟基等基团，可用于化学修饰和功能化改性，可克服上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药及其制备方法和应用，该制备方法制得的纳米前药粒径范围为100～200nm，具有谷胱甘肽和pH双重刺激响应性，并可避免谷胱甘肽导致铂解毒的问题，可有效提高铂类药物化疗效果，并通过阿霉素/铂类药物双药联合化疗克服肿瘤耐药性。
为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法，利用Diels-Alder反应将3,3'-二硫代二丙酰肼键接到壳聚糖衍生物上，得到酰肼化壳聚糖衍生物；
将阿霉素经腙键与3,3'-二硫代二丙酰肼连接，得到酰肼化阿霉素；
将酰肼化壳聚糖衍生物、酰肼化阿霉素和铂类药物的水溶液混合均匀，经自组装过程得到共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药。
本发明进一步的改进在于，酰肼化壳聚糖衍生物具体通过以下过程制得：
将醛基化呋喃溶液滴加于水溶性壳聚糖溶液中，醛基与氨基发生席夫碱反应，经氰基硼氢化钠还原反应，形成呋喃化壳聚糖衍生物；
马来酰亚胺基脂肪酸经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化后，键接3,3'-二硫代二丙酰肼，得到马来酰亚胺基酰肼；
呋喃化壳聚糖衍生物和马来酰亚胺基酰肼经Diels-Alder反应，得到酰肼化壳聚糖衍生物。
本发明进一步的改进在于，醛基化呋喃为3-(2-呋喃基)丙烯醛、2-呋喃甲醛、2-呋喃乙醛、5-甲基-2-呋喃丙烯醛、3-(5-甲基-2-呋喃基)丁醛或5-甲基呋喃-2-丙醛；
水溶性壳聚糖的分子量为2～200kDa，脱乙酰度为60％～90％；
醛基化呋喃与水溶性壳聚糖中的氨基的摩尔比为10:(10～1)。
本发明进一步的改进在于，水溶性壳聚糖为羟烷基壳聚糖，羟烷基壳聚糖为羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖，以及羧基化壳聚糖，羧基化壳聚糖为羧甲基壳聚糖或羧丙基壳聚糖；
马来酰亚胺基脂肪酸为2-马来酰亚胺基乙酸、3-马来酰亚胺基丙酸、4-马来酰亚胺丁酸、5-马来酰亚胺戊酸或6-马来酰亚胺基己酸；
还原反应条件为：N2气氛下，反应温度为20-40℃，时间为1～12h；
氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.1～1.5倍；
马来酰亚胺基脂肪酸与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:(1～10)；
Diels-Alder反应的条件为：35～55℃下保持24～72h。
本发明进一步的改进在于，将阿霉素水溶液和3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.4～6.8，反应2～24h后用截留分子量是500Da的透析袋透析，经冷冻干燥，得到酰肼化阿霉素。
本发明进一步的改进在于，阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为(1～2)：1。
本发明进一步的改进在于，将酰肼化壳聚糖衍生物制成pH值为6.4～6.8的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入酰肼化阿霉素，再加入铂类药物水溶液，混合均匀，经25～50℃摇床中反应0.5～72h后进行透析，得到共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药。
本发明进一步的改进在于，酰肼化阿霉素、酰肼化壳聚糖衍生物和铂类药物的物质的量的比为1:(1～10)：(1～10)；铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂或洛铂。
一种根据上述方法所制备的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药，该前药的粒径范围为100-200nm，具有谷胱甘肽和pH双重刺激响应性。
一种根据上述方法所制备的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明制备的纳米前药粒径范围为100-200nm，粒径分布均匀、呈现出核壳结构形貌，该粒径范围有利于纳米颗粒被动靶向积累于肿瘤处；
(2)本发明提供的纳米前药是自组装形成的，显著增加了化疗药物阿霉素和铂类药物的水溶性，所用载体材料为壳聚糖，生物安全性高，药物通过pH敏感性化学键连接于载体材料上，可有效防止药物提前泄露，有效延长前药的血液循环时间；
(3)本发明制得的纳米前药中药物是通过二硫键与载体材料连接的，并通过pH敏感性腙键和配位键键接药物的，因此该纳米前药具有还原敏感和pH敏感性药物释放行为，可有效增加药物的利用率；
(4)本发明制得的纳米药物中含有的二硫键可有效降低肿瘤细胞内谷胱甘肽含量，从而避免谷胱甘肽造成的铂类药物的耐受性；
(5)本发明制得的纳米前药实现了阿霉素和铂类药物的共同装载，可用于多种肿瘤的联合化疗；
(6)本发明提供的纳米前药具有结构明确、原料易得、稳定性好等优点，制备方法具有药物装载方式简单、纯化方便等优点，适合规模化生产。
附图说明
图1是实施例1合成的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药载体材料的1H-NMR谱图(A：呋喃化羟乙基壳聚糖；B：酰肼化羟乙基壳聚糖)。
图2是实施例1合成的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的粒径分布图。
图3是实施例1合成的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药不同放大倍数的透射电镜图。其中，(a)为透射电镜图，(b)为图(a)中方框处的放大图。
图4是实施例1合成的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药在不同pH和谷胱甘肽环境下的阿霉素和顺铂释放行为。其中，(a)为阿霉素，(b)为顺铂。
图5是实施例1合成的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药处理细胞后还原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽相对含量比率曲线图。
图6是实施例1合成的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药对细胞增殖抑制作用的效果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，但本发明并不限于此。
本发明的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法为：先利用Diels-Alder反应将3,3'-二硫代二丙酰肼键接到壳聚糖衍生物上，得到酰肼化壳聚糖衍生物，同时将阿霉素经腙键与3,3'-二硫代二丙酰肼连接，得到酰肼化阿霉素；接着将酰肼化壳聚糖衍生物、酰肼化阿霉素和铂类药物的水溶液混合均匀，经自组装过程得到核壳结构型壳聚糖基纳米前药，具体包括如下步骤：
(1)酰肼化壳聚糖衍生物的制备：醛基化呋喃溶液滴加于水溶性壳聚糖溶液中，醛基与氨基发生席夫碱反应，经氰基硼氢化钠还原反应，形成呋喃化壳聚糖衍生物；
马来酰亚胺基脂肪酸经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化后，键接3,3'-二硫代二丙酰肼，得到马来酰亚胺基酰肼；
然后，呋喃化壳聚糖衍生物和马来酰亚胺基酰肼经Diels-Alder反应，得到酰肼化壳聚糖衍生物；
(2)酰肼化阿霉素的制备：按一定比例，将阿霉素水溶液和3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.4～6.8，继续反应2～24h后得到酰肼化阿霉素；用截留分子量是500Da的透析袋透析纯化，最后经冷冻干燥收集所制备的酰肼化阿霉素。
(3)共载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备：首先将步骤(1)制备的酰肼化壳聚糖衍生物制成pH值为6.4～6.8的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入步骤(2)制备的酰肼化阿霉素，接着加入铂类药物水溶液并混合均匀，经25～50℃摇床中反应0.5～72h后进行透析纯化，最后经冷冻干燥收集所述的纳米前药。
所述步骤(1)中的水溶性壳聚糖的分子量为2～200kDa，脱乙酰度为60％～90％。
所述步骤(1)中的醛基化呋喃为3-(2-呋喃基)丙烯醛、2-呋喃甲醛、2-呋喃乙醛、5-甲基-2-呋喃丙烯醛、3-(5-甲基-2-呋喃基)丁醛、5-甲基呋喃-2-丙醛等含醛基的脂肪族呋喃。
所述步骤(1)中的醛基化呋喃与水溶性壳聚糖上氨基的摩尔比为10:(10～1)。
所述步骤(1)中的水溶性壳聚糖为羟烷基壳聚糖，如羟乙基壳聚糖和羟丙基壳聚糖，以及羧基化壳聚糖，如羧甲基壳聚糖和羧丙基壳聚糖等。
所述步骤(1)中的马来酰亚胺基脂肪酸为2-马来酰亚胺基乙酸、3-马来酰亚胺基丙酸、4-马来酰亚胺丁酸、5-马来酰亚胺戊酸或6-马来酰亚胺基己酸等。
所述步骤(1)中的还原反应条件为20-40℃、N2气氛、1～12h。
所述步骤(1)中的氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.1～1.5倍。
所述步骤(1)中的马来酰亚胺基脂肪酸与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:(1～10)。
所述步骤(1)中的Diels-Alder反应的条件为：35～55℃下保持24～72h。
所述步骤(2)中的阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为(1～2)：1。
所述步骤(3)中的酰肼化阿霉素、酰肼化壳聚糖衍生物和铂类药物的物质的量的比为1:(1～10)：(1～10)。
所述步骤(3)中放入铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂、洛铂等铂类抗肿瘤药物。
所述步骤(2)和(3)中涉及的阿霉素或铂类药物的操作均在避光条件下进行。
一种采用上述的方法所制备的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的粒径范围为100-200nm，具有谷胱甘肽和pH双重刺激响应性，可避免谷胱甘肽造成的铂类药物耐药问题，可用于多种肿瘤的联合化疗。
一种采用上述的方法所制备的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
下面为具体实施例。
实施例1
(1)酰肼化羟乙基壳聚糖的制备：将质量浓度为0.33％的3-(2-呋喃基)丙烯醛溶液滴加于质量浓度为1.0％的羟乙基壳聚糖(MW＝170kDa)溶液中混合搅拌均匀，3-(2-呋喃基)丙烯醛与羟乙基壳聚糖中氨基的摩尔比为10:8，在30℃和N2气氛下反应12h，然后加入质量浓度为0.6％的氰基硼氢化钠溶液，氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.3倍，在30℃和N2气氛下继续还原反应12h，形成呋喃化羟乙基壳聚糖粗产物，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析72h后冻干得到呋喃化的羟乙基壳聚糖；
将质量浓度为1.0％的马来酰亚胺己酸溶液经0.57mmol的质量浓度为1.09％的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和0.57mmol质量浓度为0.65％的N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行活化后，加入到质量浓度为1.0％的3,3'-二硫代二丙酰肼溶液中，室温下反应12h后，得到马来酰亚胺基酰肼；将质量浓度为0.4％的呋喃化羟乙基壳聚糖溶液与质量浓度为4.0％的马来酰亚胺基酰肼溶液按10:1的体积比混合均匀，磁力搅拌条件下在40℃发生Diels-Alder反应，反应48h后，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析48h后冻干得到酰肼化羟乙基壳聚糖。其中，马来酰亚胺己酸与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:1。
(2)酰肼化阿霉素的制备：按阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1：1，将质量浓度为0.1％的阿霉素水溶液和质量浓度为0.024％的3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.5，室温下搅拌反应12h后得到酰肼化阿霉素；用截留分子量是500Da的透析袋透析纯化，最后经冷冻干燥收集所制备的酰肼化阿霉素。
(3)共载阿霉素和顺铂的壳聚糖基纳米前药的制备：首先将质量浓度为0.2％的酰肼化羟乙基壳聚糖制成pH值为6.5的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入质量浓度为0.08％酰肼化阿霉素溶液，接着加入质量浓度为0.2％的顺铂水溶液并混合均匀，在37℃摇床中反应24h后，通过用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中避光透析36h，冻干收集所述的纳米前药。其中，酰肼化阿霉素、酰肼化羟乙基壳聚糖和顺铂的物质的量的比为1：4：7。
该共载阿霉素和顺铂的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的结构式为：
Figure BDA0002809209930000081
本实施例合成的酰肼化羟乙基壳聚糖，其1H-NMR谱图见图1。从图1可以看出，各个组分质子的化学位移均得到了很好地鉴定，表明合成的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药载体材料--酰肼化羟乙基壳聚糖的合成是成功的。
利用本实施例合成的共载阿霉素和顺铂的核壳结构型壳聚糖基纳米前药能够在水中自组装形成纳米颗粒，动态光散射法测得的粒径分布图见图2。由图2可以看出，合成的共担载阿霉素和铂类药物的壳聚糖基纳米前药在水中自组装形成纳米颗粒，粒径分布集中于130nm附近，粒径分布范围窄，比较理想。
利用本实施例合成的共载阿霉素和顺铂的核壳结构型壳聚糖基纳米前药能够在水中自组装形成纳米颗粒，如图3中(a)和(b)所示，在透射电镜下观察合成的共担载阿霉素和铂类药物的壳聚糖基纳米前药形貌发现纳米颗粒呈现均匀分布的球形，且具有核壳结构。
体外药物释放行为的研究。采用透析法评估本实施例合成的共载阿霉素和顺铂的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的体外药物释放能力。具体操作如下：通过超声分散，配制浓度为1mg/mL的载药纳米粒子分散液，分别取5mL分散液装入四个截留分子量为1000Da的透析袋中，将透析袋分别放入100mL含谷胱甘肽的pH＝5.5和pH＝7.4以及单纯pH＝5.5和pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，置于摇床上振荡。在设定的时间节点，取出2mL透析液，并加入2mL新鲜的PBS缓冲溶液，用紫外及可见光分光光度计测量取出液体在480nm处的吸光度，即阿霉素的吸光值，用电感耦合等离子体质谱测其中铂元素的含量。图4中(a)和(b)表示合成的载阿霉素-铂类药物的壳聚糖基纳米前药在不同pH和谷胱甘肽环境下的体外药物释放曲线图；从图4中(a)和(b)可以看到，在酸性条件下，阿霉素释放更快，这是由于腙键断裂使壳聚糖基前药纳米粒子被破坏，从而使纳米粒子内部的阿霉素快速释放出来。在谷胱甘肽作用下，二硫键断裂使顺铂得到快速释放，说明合成的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药具有pH和还原响应性。
细胞内还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽相对比率。首先把HepG2细胞接种到6孔板(1×106个/孔)上进行培养。将其放置于37℃、5％二氧化碳条件下培养24h后加入不同浓度的本实施例所合成的共载阿霉素和顺铂的核壳结构型壳聚糖基纳米前药和游离顺铂溶液继续培养24h，然后收集细胞，均质化后离心，根据试剂盒说明用上清液来测试还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽相对比率。由图5可以看出，在顺铂当量在0-20μM时，与游离顺铂处理细胞后还原性谷胱甘肽与氧化性谷胱甘肽相对比率明显增加不同(还原性谷胱甘肽明显上调)，共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药处理细胞后成功地抑制了还原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽相对含量比率的增加，这说明纳米前药组所含的双硫键可清除细胞内还原性谷胱甘肽，并产生氧化性谷胱甘肽，进而避免肿瘤细胞耐受铂类药物现象的发生。
共载阿霉素和顺铂的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的细胞毒性测试。采用常规的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)来检测本实施例所合成的共载阿霉素和顺铂的核壳结构型壳聚糖基纳米前药抑制人肝肿瘤细胞(HepG2)增殖的能力。首先把HepG2细胞接种到96孔培养板上。将其放置于37℃、5％二氧化碳条件下培养12h后加入不同浓度的纳米粒子悬液继续培养24h。在培养板的每个小孔中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，培养4h后吸走上清液并加入200μL的二甲基亚砜。采用酶标仪检测每个孔在492nm处的吸光度(OD)。测试结果见图6，可以看到本实施例所合成的共载阿霉素和顺铂的核壳结构型壳聚糖基纳米前药相较游离药物，显示出更好的肿瘤细胞增殖抑制效果，说明该前药具有很好的肿瘤细胞抑制效果。
实施例2
(1)酰肼化羟乙基壳聚糖的制备：将质量浓度为0.33％的3-(2-呋喃基)丙烯醛溶液滴加于质量浓度为1.0％的羟乙基壳聚糖(MW＝200kDa)溶液中混合搅拌均匀，3-(2-呋喃基)丙烯醛与羟乙基壳聚糖中氨基的摩尔比为10:1，在30℃和N2气氛下反应12h，然后加入质量浓度为0.6％的氰基硼氢化钠溶液，氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.1倍，在20℃和N2气氛下继续还原反应1h，形成呋喃化羟乙基壳聚糖粗产物，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析72h后冻干得到呋喃化的羟乙基壳聚糖；
将质量浓度为1.0％的马来酰亚胺己酸溶液经0.57mmol的质量浓度为1.09％的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和0.57mmol的0.65％的N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行活化后，加入到质量浓度为1.0％的3,3'-二硫代二丙酰肼溶液中，室温下反应12h后，得到马来酰亚胺基酰肼；将质量浓度为0.4％的呋喃化羟乙基壳聚糖溶液与质量浓度为4.0％的马来酰亚胺基酰肼溶液按10:1的体积比混合均匀，磁力搅拌条件下在35℃发生Diels-Alder反应，反应24h后，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析48h后冻干得到酰肼化羟乙基壳聚糖。其中，马来酰亚胺己酸与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:5。
(2)酰肼化阿霉素的制备：按阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为2：1，将质量浓度为0.1％的阿霉素水溶液和质量浓度为0.024％的3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.8，室温下搅拌反应12h后得到酰肼化阿霉素；用截留分子量是500Da的透析袋透析纯化，最后经冷冻干燥收集所制备的酰肼化阿霉素。
(3)共载阿霉素和顺铂的壳聚糖基纳米前药的制备：首先将质量浓度为0.2％的酰肼化羟乙基壳聚糖制成pH值为6.5的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入质量浓度为0.1％酰肼化阿霉素溶液，接着加入质量浓度为0.2％的顺铂水溶液并混合均匀，在37℃摇床中反应24h后，通过用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中避光透析36h，冻干收集所述的纳米前药。其中，酰肼化阿霉素、酰肼化羟乙基壳聚糖和顺铂的物质的量的比为1:10:10。
实施例3
(1)酰肼化羟乙基壳聚糖的制备：将质量浓度为0.33％的3-(2-呋喃基)丙烯醛溶液滴加于质量浓度为1.0％的羟乙基壳聚糖(MW＝20kDa)溶液中混合搅拌均匀，3-(2-呋喃基)丙烯醛与羟乙基壳聚糖中氨基的摩尔比为10:5，在30℃和N2气氛下反应12h，然后加入质量浓度为0.6％的氰基硼氢化钠溶液，氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.5倍，在30℃和N2气氛下继续还原反应6h，形成呋喃化羟乙基壳聚糖粗产物，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析72h后冻干得到呋喃化的羟乙基壳聚糖；
将质量浓度为1.0％的马来酰亚胺己酸溶液经0.57mmol的质量浓度为1.09％的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和0.57mmol的质量浓度为0.65％的N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行活化后，加入到质量浓度为1.0％的3,3'-二硫代二丙酰肼溶液中，室温下反应12h后，得到马来酰亚胺基酰肼；将质量浓度为0.4％的呋喃化羟乙基壳聚糖溶液与质量浓度为4.0％的马来酰亚胺基酰肼溶液按10:1的体积比混合均匀，磁力搅拌条件下在55℃发生Diels-Alder反应，反应72h后，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析48h后冻干得到酰肼化羟乙基壳聚糖。其中，马来酰亚胺己酸与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:5。
(2)酰肼化阿霉素的制备：按阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为2：1，将质量浓度为0.1％的阿霉素水溶液和质量浓度为0.024％的3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.6，室温下搅拌反应12h后得到酰肼化阿霉素；用截留分子量是500Da的透析袋透析纯化，最后经冷冻干燥收集所制备的酰肼化阿霉素。
(3)共载阿霉素和顺铂的壳聚糖基纳米前药的制备：首先将质量浓度为0.2％的酰肼化羟乙基壳聚糖制成pH值为6.5的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入质量浓度为0.05％酰肼化阿霉素溶液，接着加入质量浓度为0.2％的顺铂水溶液并混合均匀，在37℃摇床中反应24h后，通过用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中避光透析36h，冻干收集所述的纳米前药。其中，酰肼化阿霉素、酰肼化羟乙基壳聚糖和顺铂的物质的量的比为1:1:10。
实施例4
(1)酰肼化羧甲基壳聚糖的制备：将质量浓度为0.33％的2-呋喃乙醛溶液滴加于质量浓度为1.0％的羧甲基壳聚糖(MW＝2kDa，脱乙酰度为70％)溶液中混合搅拌均匀，2-呋喃乙醛与羧甲基壳聚糖中氨基的摩尔比为10:10，在20℃和N2气氛下反应12h，然后加入质量浓度为0.6％的氰基硼氢化钠溶液，氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.1倍，在20℃和N2气氛下继续还原反应12h，形成呋喃化羧甲基壳聚糖粗产物，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析72h后冻干得到呋喃化的羧甲基壳聚糖；
将质量浓度为1.0％的2-马来酰亚胺基乙酸溶液经质量浓度为1.09％的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和质量浓度为0.65％的N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行活化后，加入到质量浓度为1.0％的3,3'-二硫代二丙酰肼溶液中，室温下反应12h后，得到马来酰亚胺基酰肼；将质量浓度为0.4％的呋喃化的羧甲基壳聚糖溶液与质量浓度为4.0％的马来酰亚胺基酰肼溶液按10：1的体积比混合均匀，磁力搅拌条件下在55℃发生Diels-Alder反应，反应72h后，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析48h后冻干得到酰肼化羧甲基壳聚糖。其中，2-马来酰亚胺基乙酸与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:5。
(2)酰肼化阿霉素的制备：按阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1：1，将质量浓度为0.1％的阿霉素水溶液和质量浓度为0.024％的3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.6，室温下搅拌反应12h后得到酰肼化阿霉素；用截留分子量是500Da的透析袋透析纯化，最后经冷冻干燥收集所制备的酰肼化阿霉素。
(3)共载阿霉素和卡铂的壳聚糖基纳米前药的制备：首先将质量浓度为0.2％的酰肼化羧甲基壳聚糖制成pH值为6.5的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入质量浓度为0.05％酰肼化阿霉素溶液，接着加入质量浓度为0.2％的卡铂水溶液并混合均匀，在25℃摇床中反应72h后，通过用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中避光透析36h，冻干收集所述的纳米前药。其中，酰肼化阿霉素、酰肼化羧甲基壳聚糖和卡铂的物质的量的比为1:5:8。
实施例5
(1)酰肼化羟丙基壳聚糖的制备：将质量浓度为0.33％的5-甲基-2-呋喃丙烯醛溶液滴加于质量浓度为1.0％的羟丙基壳聚糖(MW＝200kDa，脱乙酰度为90％)溶液中混合搅拌均匀，5-甲基-2-呋喃丙烯醛与羟丙基壳聚糖中氨基的摩尔比为10:3，在40℃和N2气氛下反应1h，然后加入质量浓度为0.6％的氰基硼氢化钠溶液，氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.3倍，在40℃和N2气氛下继续还原反应1h，形成呋喃化羟丙基壳聚糖粗产物，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析72h后冻干得到呋喃化的羟丙基壳聚糖；
将质量浓度为1.0％的3-马来酰亚胺基丙酸、溶液经质量浓度为1.09％的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和质量浓度为0.65％的N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行活化后，加入到质量浓度为1.0％的3,3'-二硫代二丙酰肼溶液中，室温下反应12h后，得到马来酰亚胺基酰肼；将质量浓度为0.4％的呋喃化的羟丙基壳聚糖溶液与质量浓度为4.0％的马来酰亚胺基酰肼溶液混按10：1的体积比合均匀，磁力搅拌条件下在35℃发生Diels-Alder反应，反应72h后，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析48h后冻干得到酰肼化羟丙基壳聚糖。其中，3-马来酰亚胺基丙酸、与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:5。
(2)酰肼化阿霉素的制备：按阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为2：1，将质量浓度为0.1％的阿霉素水溶液和质量浓度为0.024％的3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.8，室温下搅拌反应24h后得到酰肼化阿霉素；用截留分子量是500Da的透析袋透析纯化，最后经冷冻干燥收集所制备的酰肼化阿霉素。
(3)共载阿霉素和奈达铂的壳聚糖基纳米前药的制备：首先将质量浓度为0.2％的酰肼化羟丙基壳聚制成pH值为6.4的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入质量浓度为0.05％酰肼化阿霉素溶液，接着加入质量浓度为0.2％的奈达铂水溶液并混合均匀，在50℃摇床中反应0.5h后，通过用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中避光透析36h，冻干收集所述的纳米前药。其中，酰肼化阿霉素、酰肼化羟丙基壳聚糖和奈达铂的物质的量的比为1:10:7。
实施例6
(1)酰肼化羟乙基壳聚糖的制备：将质量浓度为0.33％的3-(5-甲基-2-呋喃基)丁醛溶液滴加于质量浓度为1.0％的羟乙基壳聚糖(MW＝100kDa，脱乙酰度为60％)溶液中混合搅拌均匀，3-(5-甲基-2-呋喃基)丁醛与羟乙基壳聚糖中氨基的摩尔比为10:1，在30℃和N2气氛下反应5h，然后加入质量浓度为0.6％的氰基硼氢化钠溶液，氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.5倍，在20℃和N2气氛下继续还原反应12h，形成呋喃化羟乙基壳聚糖粗产物，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析72h后冻干得到呋喃化的羟乙基壳聚糖；
将质量浓度为1.0％的马来酰亚胺己酸溶液经质量浓度为1.09％的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和质量浓度为0.65％的N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行活化后，加入到质量浓度为1.0％的3,3'-二硫代二丙酰肼溶液中，室温下反应12h后，得到马来酰亚胺基酰肼；将质量浓度为0.4％的呋喃化羟乙基壳聚糖溶液与质量浓度为4.0％的马来酰亚胺基酰肼溶液按10：1的体积比混合均匀，磁力搅拌条件下在55℃发生Diels-Alder反应，反应24h后，用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中透析48h后冻干得到酰肼化羟乙基壳聚糖。其中，马来酰亚胺己酸与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:5。
(2)酰肼化阿霉素的制备：按阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为2：1，将质量浓度为0.1％的阿霉素水溶液和质量浓度为0.024％的3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.4，室温下搅拌反应2h后得到酰肼化阿霉素；用截留分子量是500Da的透析袋透析纯化，最后经冷冻干燥收集所制备的酰肼化阿霉素。
(3)共载阿霉素和洛铂的壳聚糖基纳米前药的制备：首先将质量浓度为0.2％的酰肼化羟乙基壳聚糖制成pH值为6.8的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入质量浓度为0.05％酰肼化阿霉素溶液，接着加入质量浓度为0.2％的洛铂水溶液并混合均匀，在37℃摇床中反应24h后，通过用截留分子量是3500Da的透析袋在去离子水中避光透析36h，冻干收集所述的纳米前药。其中，酰肼化阿霉素、酰肼化羟乙基壳聚糖和洛铂的物质的量的比为1:4:10。

Claims (9)

1.一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，利用Diels-Alder反应将3,3'-二硫代二丙酰肼键接到壳聚糖衍生物上，得到酰肼化壳聚糖衍生物；
将阿霉素经腙键与3,3'-二硫代二丙酰肼连接，得到酰肼化阿霉素；
将酰肼化壳聚糖衍生物、酰肼化阿霉素和铂类药物的水溶液混合均匀，经自组装过程得到共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药；
酰肼化壳聚糖衍生物具体通过以下过程制得：
将醛基化呋喃溶液滴加于水溶性壳聚糖溶液中，醛基与氨基发生席夫碱反应，经氰基硼氢化钠还原反应，形成呋喃化壳聚糖衍生物；
马来酰亚胺基脂肪酸经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化后，键接3,3'-二硫代二丙酰肼，得到马来酰亚胺基酰肼；
呋喃化壳聚糖衍生物和马来酰亚胺基酰肼经Diels-Alder反应，得到酰肼化壳聚糖衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，醛基化呋喃为3-(2-呋喃基)丙烯醛、2-呋喃甲醛、2-呋喃乙醛、5-甲基-2-呋喃丙烯醛、3-(5-甲基-2-呋喃基)丁醛或5-甲基呋喃-2-丙醛；
水溶性壳聚糖的分子量为2~200 kDa，脱乙酰度为60%~90%；
醛基化呋喃与水溶性壳聚糖中的氨基的摩尔比为10:(10~1)。
3.根据权利要求1所述的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，水溶性壳聚糖为羟烷基壳聚糖，羟烷基壳聚糖为羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖，以及羧基化壳聚糖，羧基化壳聚糖为羧甲基壳聚糖或羧丙基壳聚糖；
马来酰亚胺基脂肪酸为2-马来酰亚胺基乙酸、3-马来酰亚胺基丙酸、4-马来酰亚胺丁酸、5-马来酰亚胺戊酸或6-马来酰亚胺基己酸；
还原反应条件为：N2气氛下，反应温度为20-40 oC，时间为1~12 h；
氰基硼氢化钠的物质的量为席夫碱键数量的1.1~1.5倍；
马来酰亚胺基脂肪酸与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为1:(1~10)；
Diels-Alder反应的条件为：35~55oC下保持24~72 h。
4.根据权利要求1所述的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，将阿霉素水溶液和3,3'-二硫代二丙酰肼水溶液在冰浴、超声条件下混合均匀，然后将pH调至6.4 ~ 6.8，反应2 ~ 24 h后用截留分子量是500 Da的透析袋透析，经冷冻干燥，得到酰肼化阿霉素。
5.根据权利要求4所述的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，阿霉素与3,3'-二硫代二丙酰肼的物质的量的比为(1~2)：1。
6.根据权利要求1所述的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，将酰肼化壳聚糖衍生物制成pH值为6.4 ~ 6.8的水溶液，然后在冰浴、超声条件下加入酰肼化阿霉素，再加入铂类药物水溶液，混合均匀，经25~50 ℃摇床中反应0.5~72 h后进行透析，得到共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药。
7.根据权利要求6所述的一种共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，酰肼化阿霉素、酰肼化壳聚糖衍生物和铂类药物的物质的量的比为1:（1~10）：（1~10）；铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂或洛铂。
8.一种根据权利要求1-7中任意一项所述方法所制备的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药，其特征在于，该前药的粒径范围为100-200 nm，具有谷胱甘肽和pH双重刺激响应性。
9.一种如权利要求8所述的共担载阿霉素和铂类药物的核壳结构型壳聚糖基纳米前药在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
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