CN110665009B - 一种促肿瘤血管正常化纳米化吉西他滨及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促肿瘤血管正常化的纳米化吉西他滨。这类药物组合物通过将吉西他滨衍生物共价偶联于多糖骨架形成促肿瘤血管正常化纳米药物，该纳米药物将抗VEGF与节拍化疗两种协同互补的促血管正常化策略统一到单一给药体系中，具有显著增强的促肿瘤血管正常化的效果。该纳米给药系统本身还具有包载疏水性化疗药物的能力，实现了促肿瘤血管正常化治疗药物和化疗药物的同步递送，可最大程度地利用“血管正常化时间窗”，促进所包载化疗药物的瘤内深层递送并规避了临床上促肿瘤血管正常化治疗药物与化疗药物联合给药受到给药方式和药物配伍限制的问题，有利于血管正常化治疗的临床应用。

Description

一种促肿瘤血管正常化纳米化吉西他滨及其应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物制剂领域，涉及一种促肿瘤血管正常化的纳米化吉西他滨的制备方法及其联合化疗药物在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
抗肿瘤血管生成是遏止肿瘤生长的有效策略，目前越来越多抗血管生成药物进入临床前或临床研究(Science 2005，307：58-62)。临床研究显示，抗血管生成药物和化疗药物联合使用能显著提高患者的生存率，治疗效果显著优于单独使用化疗药物。针对这一现象，“肿瘤血管正常化”学说应运而生。该学说认为，抗血管生成药物并不是单纯地破坏肿瘤血管，在肿瘤血管过度退化之前，存在一个肿瘤血管正常化时间窗，在这个时间窗内，抗血管生成药物可以暂时恢复肿瘤微环境中生长因子的平衡状态，使得肿瘤血管在结构和功能上趋于正常化，主要表现为周细胞覆盖率增高，基底膜变薄，组织间隙液压降低，氧含量升高，血流灌注增加，血管通透性降低等。在肿瘤血管正常化时间窗内，氧和药物可以通过血管更有效地输送到肿瘤组织中，从而提高肿瘤对化疗药物的敏感性，因此，抗血管生成药物和化疗药物联用具有协同抑制肿瘤生长的作用。尽管肿瘤血管正常化理论阐述了抗血管生成药物和化疗药物联用的合理性，然而联合给药也暴露出许多问题：首先，联合给药的给药方式繁琐，不利于实际的临床给药；并且，“血管正常化”是一个短暂不可逆的过程，目前在临床上仍然没有可操作性较强的非侵入性检查手段可以精准确定“血管正常化时间窗”，所以促血管正常化药物和化疗药物非同步给药时，难以在“肿瘤血管正常化时间窗”内将大量化疗药物递送至肿瘤组织中。因此，构建具有可靠的促血管正常化功能的新型药物，并且简化促血管正常化的给药方式，实现促血管正常化药物与化疗药物的共递送，对于优化化疗药物的抗肿瘤效果具有重要意义。
在肿瘤组织中，血管受到癌基因、缺氧、高酸性和炎性因子的多重调节，促血管生成因子远多于血管生成抑制因子，这种失衡状态的长期维持，最终导致了肿瘤血管的持续新生和血管异常。因此，如果合理使用抗血管正常化药物，重新恢复促血管生成因子和抑制因子之间的平衡，就可能使肿瘤血管系统正常化。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)是生理和病理性血管中最重要的刺激因子，其主要作用在于维持内皮细胞活性，诱导内皮细胞增殖和迁移，募集骨髓源性造血干细胞诱导血管生成和增强血管通透性等。多项临床前研究证实，特异性阻断VEGF信号通路可以上调血管生成素1(ANG1)，促进内皮细胞紧密连接，募集周细胞，暂时修剪不成熟或渗漏的血管，重构剩余的血管以达到短时的血管正常化治疗效果。
由于随着肿瘤的发展，肿瘤血管的生成模式会发生改变，长期阻断VEGF会造成肿瘤对 VEGF阻断剂的耐受，因此探求新型的促血管正常化策略，弥补单独使用抗VEGF制剂可能引起的耐受问题，也成为目前血管正常化治疗亟待解决的问题。传统化疗通常会使用大剂量给药来确保药物的抗肿瘤效果并克服一些肿瘤细胞的耐药性，然而近年来，有研究显示，以持续性、小剂量、高频率给予细胞毒性药物(通常是10～30％的最大耐受剂量，中间没有停药的间歇期)，可持续性抑制肿瘤血管内皮细胞和循环内皮祖细胞生长，并诱导血管生成抑制因子TSP-1的产生，从而使紊乱的血管系统正常化，改善肿瘤乏氧。这一种治疗手段被称作节拍化疗，是一种新兴的促血管正常化的治疗手段(Nature Reviews Cancer 2004，4：423-436； Journal of Clinical Investigation 2000，105：1045-1047)。吉西他滨是一种广谱的细胞毒药物，作为一种核苷类化合物，吉西他滨的代谢产物可以插入DNA，干扰DNA聚合，使DNA链断裂而发挥作用。有研究显示，使用低剂量吉西他滨频繁给药能够促进肿瘤血管功能正常化，提高肿瘤血管血流灌注，改善肿瘤缺氧微环境等，这是由于吉西他滨的节拍化疗可以作用于肿瘤血管内皮细胞，从而发挥其抗肿瘤血管的作用(Transactions ofthe Chinese Society of Agricultural Engineering 2012，108：1072-1073；International Journal of Cancer 2013，133： 2464-2472)。然而，吉西他滨在使用过程中也存在诸多局限，例如吉西他滨自身极性较大，跨膜能力较差，因此导致体内半衰期较短，生物利用度低；此外，吉西他滨在体内容易被脱氨酶降解失活；易产生耐药，极大地影响了其体内生物活性的发挥。
CN201610051490.7“饱和脂肪酸修饰的抗肿瘤药物偶联物及其自组装纳米系统和制备方法”公开了由抗肿瘤药物与饱和脂肪酸通过共价连接并添加两亲性高分子材料DSPE-PEG在水中形成纳米粒的方法，该法通过饱和脂肪酸修饰吉西他滨等化疗药物可以改善其体内过程。虽然该法解决了吉西他滨体内易失活，产生耐药等诸多弊端，然而为了解决吉西他滨衍生物水溶性、成药性差等问题，需要借助载体(如DSPE-PEG)才能得到稳定且分散均匀的纳米颗粒，而加入的DSPE-PEG等两亲性大分子，没有明确的抗肿瘤作用，许多生理机制不明确。同时，该纳米系统制备工艺和组分更复杂，阻碍其临床应用和发展。
天然多糖作为药用高分子材料具备很多优势：(1)具有良好的生物相容性和生物可降解性；(2)具有广泛的生物学活性，包括调节和控制细胞生长、维持生命有机体正常代谢等，从而具有抗肿瘤、抗血管生成等活性；(3)多糖结构中含有大量的活性基团，如羧基、氨基、羟基、醛基等，因此易于进行化学修饰。例如，肝素或其衍生物是一种具有良好生物相容性的水溶性多糖，具有多种生物学活性，包括抗凝血、抗炎、抗血管生成活性等，几年来，肝素或其衍生物抗血管生成活性受到了人们的关注，研究显示，肝素或其衍生物抗肿瘤血管的主要机制是与促血管生长因子VEGF结合，从而阻止其与相应受体的结合(Apmis 2006，114： 79-102)。不仅如此，有研究显示，肝素或其衍生物还具有促血管正常化的作用(BritJ Cancer 2010，102：837-843)，其机制与VEGF抑制剂类似，通过抑制VEGF等促血管生成细胞因子及其通路，恢复促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡状态，从而使肿瘤血管在结构和功能上正常化。尽管近年来，以肝素或其衍生物为基础的药物传递系统发展迅速，然而基于肝素衍生物的促血管正常化功能而构建的纳米给药系统尚未见报道。
针对以上关于血管正常化联合给药以及吉西他滨为基础的纳米给药系统存在的诸多问题，本发明使用了一种全新的组合方式，将具有促血管正常化作用的肝素或其衍生物与吉西他滨衍生物共价连接制得两亲性吉西他滨偶联物，在适当条件下形成纳米药物，得到新型纳米化吉西他滨，其优势在于：
(1)该纳米药物首次将抗血管生成药物与节拍化疗组合在一个纳米体系中，是一种全新的促血管正常化的治疗策略。在该给药系统中，具有抗VEGF作用的天然多糖肝素或其衍生物为骨架，发挥促肿瘤血管正常化作用，吉西他滨作为化疗药物通过节拍给药机制协同发挥促肿瘤血管正常化作用。
(2)由于肝素或其衍生物的抗VEGF活性持续作用于肿瘤组织，可能会引起肿瘤血管生长模式的改变，从而引起对于抗VEGF的耐受，而节拍化疗直接“修剪”不成熟的内皮细胞的作用可以很好地弥补这一问题，确保了给药体系促血管正常化的效果，也为该纳米药物与其他治疗手段(如放、化疗)联合使用发挥协同抑制肿瘤生长作用打下了坚实的基础。
(3)该药物纳米级别的粒径使其具有良好的体内药动学特征，比如纳米药物普遍具有的 EPR效应使得药物能够通过被动靶向更好地聚集在肿瘤组织周围，这为药物体系中各组分发挥促肿瘤血管正常化和抗肿瘤作用提供了良好的药动学基础。
(4)该纳米药物在化学结构上为两亲性大分子，制备工艺简单，是热力学稳定系统，具有很好的稳定性。并且所有偶联分子在水性介质中均参与自组装，无需添加其他药物载体，规避了添加其他药物载体可能存在的安全性问题。
(5)该纳米药物的合成与构建避免使用化学交联剂、高温条件，制备工艺简单、环保；两亲性吉西他滨偶联物的骨架材料为天然多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性。同时，纳米给药系统能够改善药物的体内分布，减小药物“脱靶效应”，而且节拍给药还可大大减少给药的整体剂量，能够显著降低吉西他滨化疗时可能存在的骨髓抑制等副作用，具有较高的安全性，具有很好的临床应用前景。
(6)该纳米化吉西他滨本身还具有负载疏水性抗癌药物的能力，负载疏水药物后，促肿瘤血管正常化和包载的疏水性抗癌药物的体内递送是同时进行的。一方面可以最大程度地利用短暂而不可逆的“血管正常化时间窗”，促进所负载药物在瘤内的深层递送，增强肿瘤组织对化疗药物敏感性；另一方面，该纳米药物和所负载药物可同步递送，给药方式简便，具有良好的临床应用潜能。
(7)由于大部分实体瘤的生长都具有血管依赖性，在实体瘤周围及内部通常分布有丰富的血管。因此，该纳米药物对各种实体瘤具有普适性，能通过促进肿瘤血管正常化改善不同类型的实体瘤的微环境。不仅如此，该纳米药物可以装载不同类型的抗肿瘤药物，因此具有很强的能动性，可以依据不同类型的实体瘤及其生理特性，装载具有针对性的疏水性化疗药物，最大程度地发挥抗肿瘤的作用。
(8)该纳米化吉西他滨以及载药后的纳米化吉西他滨可与其他药剂学可接受辅料配伍，制备成注射、口服等多途径给药的剂型，具有良好的应用前景。
发明内容：
本发明目的是提供一种具有促肿瘤血管正常化的纳米化吉西他滨。该纳米药物由肝素或其衍生物与吉西他滨衍生物通过化学偶联，在一定条件下形成，制备过程可避免使用化学交联剂和高温条件，制备工艺简单；在该给药系统中，肝素或其衍生物抑制VEGF等促血管生成相关通路发挥促血管正常化作用，吉西他滨依据节拍给药的机制发挥促血管正常化作用，这两种促血管正常化策略机制互补，可以实现多途径协同促进肿瘤血管正常化的效果。该纳米给药系统不仅具有很好的促肿瘤血管正常化的活性并且解决了吉西他滨在应用过程中的诸多局限性，克服了吉西他滨因自身极性较大、跨膜能力较差而导致体内半衰期较短、生物利用度低等问题，同时偶联物中所有组分都参与“自组装”，体系组分单一，所以形成的纳米药物是热力学稳定态，稳定性更好。
本发明的另一个目的是提供一种全新的促血管正常化的策略。目前基于肿瘤血管正常化的治疗手段局限于非同步使用促血管正常化药物和化疗药物，由于目前在临床上仍然没有可操作性较强的非侵入性检查手段可以精准确定“血管正常化时间窗”，这种联合给药的策略不仅给药方式繁琐，不利于实际的临床给药；并且，由于血管正常化本身是一个短暂、不可逆的过程，所以非同步给药极大地限制了“肿瘤血管正常化时间窗”内递送至肿瘤组织中的化疗药物药量。本发明构建的具有可靠的促血管正常化功能的新型药物，简化了促血管正常化的给药方式，结合其载药特性，可以进一步构建载药纳米给药系统，实现促血管正常化药物与化疗药物的共递送，充分地发挥化疗药物的作用。并且，借助纳米级的粒径，该给药体系具有被动靶向等纳米药物特有的体内药动学特性，可以借助其亲水外壳和EPR效应，很好的富集在肿瘤组织周围，进一步保障了药物在肿瘤微环境发挥促血管正常化以及抗肿瘤的效果。
本发明还有一个目的是以上述纳米药物为基础，提供了一种具有普适性和机动性的治疗策略。由于实体瘤的生长具有血管依赖性，因此，针对新生血管的促血管正常化治疗对实体瘤具有普适的治疗意义。本发明中，纳米化吉西他滨具有荷载疏水性药物的能力，因此该药物可以装载不同类型的抗肿瘤药物，具有很强的机动性，从而依据不同类型的实体瘤及其生理特性，装载具有针对性的化疗药物，最大程度地发挥抗肿瘤的作用。
本发明的另一个目的是提供上述纳米化吉西他滨的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述纳米化吉西他滨在促肿瘤血管正常化和抗肿瘤治疗中的应用。
为了实现上述发明的目的，本发明提供了一种新型促血管正常化纳米药物纳米化吉西他滨的制备方法。一方面，可以利用肝素或其衍生物主链上的羧基，与吉西他滨的衍生物的氨基直接相连形成两亲性偶联物，并在一定条件下形成聚合物纳米药物；另一方面，可以使用连接剂修饰吉西他滨衍生物，得到中间体，再利用肝素或其衍生物主链上的羧基或羟基与该中间体偶联，得到两亲性偶联物，并在一定条件下形成聚合物纳米药物，并且该纳米药物含有酸敏感键或氧化还原敏感键，可以响应肿瘤低pH、高谷胱甘肽、高活性氧等微环境，更迅速地断裂并释放出各药物组分；由于该纳米化吉西他滨是两亲性大分子在一定条件下自组装形成的，其疏水内核赋予了纳米化吉西他滨载疏水药物特性，可以装载不同类型水溶性较差的抗肿瘤药物。
本发明所述的亲水性多糖是具有抗血管生成活性的，包括但不限制于未分级肝素、低分子量肝素、N-O-脱硫酸化肝素或N-去硫酸化肝素。本发明所述的吉西他滨衍生物结构中的疏水片段包括但不限于长链脂肪醇(CnH2n+1OH，其中n为整数，优选n为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19)、长链脂肪酸甘油酯(CnH2n-1O，其中 n为整数，优选n为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18， 19)、胆固醇等。
作为优选，所述的连接剂含有敏感键且至少含有两个分别用于共价连接所述肝素或其衍生物和所述吉西他滨衍生物的反应官能团，所述的敏感键是在肿瘤微环境下易断裂的化学键。
作为优选，所述的敏感键为二硫键、二硒键、亚胺键或酰胺键其中的一种。
作为优选，所述的连接剂为3，3’-二硫代二丙酸、4，4’-二硫代二丁酸、3，3’-二硒代二丙酸，丁二酸酐、马来酸酐、二乙醇酸酐或对羟基苯甲醛其中的一种。
本发明所述的疏水性抗癌药物包括但不限于紫杉烷类、喜树碱类、长春碱类、抗生素类和铂类抗肿瘤药物。
所述紫杉烷类抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、三尖衫宁碱、10-去乙酰巴卡亭及7- 差向紫杉醇等。
所述喜树碱类抗肿瘤药物包括喜树碱、SN38、9-二甲胺甲基-10-羟基喜树碱、伊立替康、 9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、GI147211和DX-8951f等。
所述长春碱类抗肿瘤药物包括长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和20’-20’-二氟-3’， 4’-二氢去甲长春花碱等。
所述抗生素类抗肿瘤药物包括阿霉素和表阿霉素等。
所述的铂类抗肿瘤药物包括顺铂、卡铂、奈达铂以及奥沙利铂等。
本发明提供的纳米化吉西他滨制备方法如下：
首先在吉西他滨分子上接入疏水脂肪链，构建吉西他滨衍生物，然后将吉西他滨衍生物与肝素或其衍生物直接偶联得到两亲性偶联物，或将吉西他滨衍生物与连接剂结合得到中间体，再将中间体与肝素或其衍生物偶联得到两亲性吉西他滨偶联物。最后在适当条件下该两亲性吉西他滨偶联物可在水性介质中形成纳米粒，即纳米化吉西他滨。
与CN201610051490.7“饱和脂肪酸修饰的抗肿瘤药物偶联物及其自组装纳米系统和制备方法”相比，本发明使用的肝素或其衍生物具有促血管正常化活性，作用机制明确；且本发明的肝素或其衍生物与吉西他滨衍生物共价连接，在水中能形成稳定的纳米药物，所有结构片段共价结合参与自组装，制备工艺简便，稳定性好。
所述的纳米化吉西他滨的具体制备方法如下：
一、吉西他滨衍生物的合成
(1)将一定量的疏水片段溶于反应溶剂中，加入适当摩尔比的亚磷酸二苯酯，以三乙胺 (TEA)为催化剂，控制反应I条件至反应完全。将适量的吉西他滨溶于反应溶剂中，将吉西他滨溶液加入上步反应体系中，控制反应II至完全，旋蒸除去大部分反应溶剂。使用柱层析法纯化，得到吉西他滨衍生物。
所述的疏水片段为长链脂肪醇(CnH2n+1OH，其中n为整数，优选n为5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19)、长链脂肪酸甘油酯(CnH2n-1O，其中 n为整数，优选n为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18， 19)或胆固醇；所述的制备方法，反应溶剂为吡啶、二氯甲烷、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氧六环或四氢呋喃中的一种或几种混合溶剂；所述的疏水片段、亚磷酸二苯酯和吉西他滨的摩尔比为1∶(1～10)∶(1～10)；所述的反应I条件为50～100℃下反应12～24h；所述的反应II条件为70℃下反应4～8h；所述的柱层析法中固定相为粒度100～200目的硅胶，流动相为二氯甲烷与甲醇的混合液体，二氯甲烷与甲醇的体积比为1∶(10～20)。
合成路线如下：
Figure BSA0000166531090000071
(R1：碳原子数为5～19个的脂肪醇、脂肪酸甘油酯或胆固醇)
(2)在氮气保护下，将适量长链脂肪酸甘油酯和三乙胺溶于反应溶剂中，滴加三氯磷氧，控制反应I条件至反应完全。将适量吉西他滨溶于反应溶剂中，将吉西他滨溶液加入上步反应体系中，控制反应II至完全，旋蒸除去大部分反应溶剂。使用柱层析法纯化，得到吉西他滨衍生物。
所述的疏水片段为长链脂肪醇(CnH2n+1OH，其中n为整数，优选n为5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19)、长链脂肪酸甘油酯(CnH2n-1O，其中 n为整数，优选n为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18， 19)或胆固醇；所述的制备方法，反应溶剂为吡啶、二氯甲烷、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氧六环或四氢呋喃中的一种或几种混合溶剂；所述的反应I条件为在30～60℃条件下反应12～24h。所述的长链脂肪酸甘油酯、三乙胺和三氯磷氧的摩尔比为1∶(1～10)∶ (1～10)；所述的反应II条件为在30～60℃条件下反应12～36h；所述的柱层析法中固定相为粒度100～200目的硅胶，流动相为氯仿与甲醇的混合液体，氯仿与甲醇的体积比为(10～30)∶ 1。
合战路线如下：
Figure BSA0000166531090000072
(R1：碳原子数为5～19个的脂肪醇、脂肪酸甘油酯或胆固醇)
二、中间体的制备
(1)将吉西他滨衍生物加入于溶有4，4’-二硫代二丁酸或3，3’-二硒代二丙酸、连接剂和催化剂的有机溶剂中搅拌反应，控制反应条件至反应完全，得到一端为羧基的中间体。
所述的制备方法，反应溶剂为甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二乙基甲酰胺、二甲亚砜中一种或几种的混合溶剂；所述的催化剂为DCC(N’N-二环己基碳二亚胺)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)或DIC(N’N-二异丙基碳二亚胺；所述的吉西他滨衍生物、催化剂、连接剂三者的摩尔比为1∶(0.2～0.5)∶(1～10)；所述的反应条件指 20～100℃下反应10～24h。
合成路线如下：
Figure BSA0000166531090000081
(R2-NH2：吉西他滨衍生物)
(2)将吉西他滨衍生物加入于溶有丁二酸酐、马来酸酐或二乙醇酸酐连接剂、催化剂、敷酸剂的有机溶剂中搅拌反应，控制反应条件至反应完全，得到一端为羧基的中间体。
所述的制备方法，反应溶剂为甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N二乙基甲酰胺、二甲亚砜、二氯甲烷、四氢呋喃、醋酸、醋酸酐中一种或几种的混合溶剂；所述的催化剂为DCC(N’N-二环己基碳二亚胺)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)；所述的敷酸剂为三乙胺；所述的吉西他滨衍生物、催化剂、敷酸剂、连接剂三者的摩尔比为1∶ (0.2～0.5)∶(0.2～0.5)∶(1～10)；所述的反应条件指室温下反应4～12h。
合成路线如下：
Figure BSA0000166531090000082
(R2-NH2：吉西他滨衍生物)
(3)将吉西他滨衍生物加入于溶有对羟基苯甲醛连接剂和催化剂的有机溶剂中反应，控制反应条件至反应完全，得到一端为羟基的中间体。
所述的制备方法，反应溶剂为苯、甲苯或乙醇；所述的催化剂为对甲基苯磺酸或乙酸；所述的吉西他滨衍生物、连接剂和催化剂的摩尔比为1∶(1～10)∶(0.2～0.5)；所述的反应条件为加入无水硫酸镁干燥，35～60℃下加热回流1～12h。
合成路线如下：
Figure BSA0000166531090000091
(R2-NH2：吉西他滨衍生物)
三、两亲性吉西他滨偶联物的制备
(1)将肝素或其衍生物溶于适当的反应溶剂中，在惰性气体保护下加入活化剂，将肝素或其衍生物主链上的羧基活化；控制反应III条件至完全，将吉西他滨衍生物同样用适当反应溶剂溶解后，缓慢滴加到肝素或其衍生物的溶液中，控制反应IV条件至反应完全，用适当沉淀剂沉淀，抽滤得沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得两亲性吉西他滨偶联物。
所述的制备方法，反应溶剂为水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲酰胺中一种或几种混合溶剂；活化剂包括EDC(1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)；投料比例(摩尔比)为肝素或肝素衍生物∶活化剂＝1∶(1～10)；所述的惰性气体为氮气或氦气；所述的反应III条件为冰浴下反应0.5～4h；所述的反应IV条件为室温反应6～72h；所述的适当沉淀剂为冰丙酮、冰乙醚、冰乙酸乙酯或冰乙醇；所述的超声为探头超声10～60min；所述的透析时间为12～48h。
合成路线如下：
Figure BSA0000166531090000092
(R3-COOH：未分级肝素、低分子量肝素、N-O-脱硫酸化肝素或N-去硫酸化肝素；R2-NH2：吉西他滨衍生物)
(2)将末端含羧基的中间体加入到溶有催化剂的肝素或其衍生物的有机溶剂中反应，控制反应V条件至反应完全，用适当沉淀剂沉淀，抽滤得沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得肝素或其衍生物-吉西他滨衍生物偶联物。
所述的制备方法，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲酰胺、四氢呋喃中一种或几种混合溶剂；催化剂包括EDC(1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)；投料比例(摩尔比)为肝素或肝素衍生物∶催化剂∶末端含羟基的中间体＝1∶ (1～10)∶(1～10)；所述的惰性气体为氮气或氦气；所述的反应III条件为冰浴下反应0.5～4h；所述的反应V条件为室温反应6～72h；所述的适当沉淀剂为冰丙酮、冰乙醚、冰乙酸乙酯或冰乙醇；所述的超声为探头超声10～60min；所述的透析时间为12～48h。
合成路线如下：
Figure BSA0000166531090000101
(R4-OH：未分级肝素、低分子量肝素、N-O-脱硫酸化肝素或N-去硫酸化肝素；R5-COOH：末端含羧基的中间体)
(3)将肝素或其衍生物溶于适当反应溶剂中，在惰性气体保护下，加入活化剂活化羧基，控制反应VI条件至反应完全，再加入用同样反应溶剂溶解的末端含羟基的中间体，控制反应 VII条件至完全，用适当沉淀剂沉淀，抽滤得沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得两亲性吉西他滨偶联物。
所述的制备方法，反应溶剂为水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲酰胺中一种或几种混合溶剂；活化剂包括EDC(1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、NHS(羟基琥珀酰亚胺)、EDC-DMAP(4-二甲基吡啶)、EDC-HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、DCC(二环己基碳二亚胺)；投料比例(摩尔比)为肝素或肝素衍生物∶活化剂＝1∶(1～10)；所述的惰性气体为氮气或氦气；所述的反应VI条件为冰浴下反应0.5～4h；所述的反应VII条件为室温反应12～72h；所述的适当沉淀剂为冰丙酮、冰乙醚、冰乙酸乙酯或冰乙醇；所述的超声为探头超声10～60 min；所述的透析时间为12～48h。
合成路线如下：
Figure BSA0000166531090000102
(R3-COOH：未分级肝素、低分子量肝素、N-O-脱硫酸化肝素或N-去硫酸化肝素；R6-OH：末端含羟基的中间体)
四、纳米化吉西他滨的制备
按每1mL水中溶解3～30mg的两亲性吉西他滨偶联物的比例，将制得的肝素或其衍生物 -吉西他滨衍生物偶联物溶于水中，常温下振摇1～10min，冰水浴超声或高压均质处理，即得粒径为10～1000nm的纳米化吉西他滨。
五、使用纳米化吉西他滨装载化疗药物构建纳米给药系统
工艺I：将两亲性吉西他滨偶联物与水按重量比(mg/mg)2～50∶1000的比例混合制成溶液；将一定比例的疏水性抗癌药物用适量有机溶剂溶解：将药物溶液缓慢滴加到纳米化吉西他滨溶液中，室温搅拌0.5～2h后，冰浴下探头超声10～30min；采用透析法或超滤法除去小分子和有机溶剂，后采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥除去水分，即得；
工艺II：将两亲性吉西他滨偶联物与水按重量比(mg/mg)2～50∶1000的比例混合制成溶液；将一定比例的疏水性抗癌药物用适量有机溶剂溶解：将两者混合，冰浴下探头超声 10～30min，室温下敞口搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，后采用离心法或柱分离法除去小分子，过0.8μm滤膜，后采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥除去水分，即得。
所述的疏水性抗癌药物包括但不限于：紫杉烷类抗肿瘤药物，包括紫杉醇、多西紫杉醇、三尖衫宁碱、10-去乙酰巴卡亭及7-差向紫杉醇等；喜树碱类抗肿瘤药物，包括喜树碱、SN38、 9-二甲胺甲基-10-羟基喜树碱、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、GI147211和DX-8951f 等；长春碱类抗肿瘤药物，包括长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和20’-20’-二氟-3’， 4’-二氢去甲长春花碱等；抗生素类抗肿瘤药物，包括阿霉素和表阿霉素等；铂类抗肿瘤药物包括顺铂、卡铂、奈达铂以及奥沙利铂等。
本发明相对于现有技术具有如下效益：
(1)本发明将吉西他滨的衍生物接枝到肝素或其衍生物的骨架上形成两亲性偶联物，创造性地将具有促肿瘤血管正常化的天然多糖和化疗药物结合起来，依据不同的促肿瘤血管正常化机制，共同发挥作用。肝素或其衍生物的抗VEGF和节拍化疗是两种互补的诱导血管正常化策略，两者相辅相成，确保了纳米药物诱导血管正常化的活性，是一种非常有前途的促肿瘤血管正常化治疗模式。另外，该纳米化吉西他滨制备过程简单，操作容易，具有很好的应用前景。
(2)本发明构建的纳米化吉西他滨一方面解决了吉西他滨体内易失活，产生耐药、成药性差等问题；另一方面，利用了纳米药物普遍具有的EPR效应，良好的体内分布等特性，使得药物能够通过被动靶向更好的聚集在肿瘤组织周围，便于纳米药物中各活性组分在肿瘤血管中发挥作用。
(3)本发明提供的两亲性吉西他滨偶联物中所有组分都发生“自组装”，无需添加其他载体，形成的自组装体纳米化吉西他滨是热力学稳定态，稳定性好。
(4)本发明提供的两亲性吉西他滨偶联物的骨架材料为天然多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性。尽管吉西他滨具有骨髓抑制等毒性，但是本课题设计的纳米给药系统一方面改善了药物分布，减小了“脱靶效应”，另一方面节拍给药大大减少了给药的整体剂量，减小了细胞毒药物可能引起的副作用，具有较高的安全性。
(5)本发明提供的纳米化吉西他滨，不仅可以发挥促血管正常化的作用，还具有载疏水药物的能力。因此给药后，在血管正常化不同时间段，促血管正常化和药物递送同步进行，不仅克服了传统血管正常化为基础的治疗方式繁琐等问题，纳米化吉西他滨诱导的血管正常化还可以充分发挥其促进药物在实体瘤中递送的作用，进一步优化了其治疗效果。
(6)本发明提供的纳米化吉西他滨具有载疏水性药物特性，因此可以装载不同类型的抗肿瘤药物，具有很高的机动性，可以依据不同类型的实体瘤及其生理特性，装载具有针对性的化疗药物，最大程度地发挥抗肿瘤的作用。
(7)本发明得到的纳米化吉西他滨以及载疏水性药物的纳米化吉西他滨可与其他药剂学可接受辅料配伍，制备成注射、口服等多途径给药的剂型，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1：吉西他滨胆固醇衍生物-低分子量肝素偶联物的合成
称取一定量的胆固醇，溶于适量吡啶中，然后加入等摩尔质量的亚磷酸二苯酯和少量三乙胺。70℃条件下反应12h。将吉西他滨溶于吡啶中滴加入上述反应体系中继续在室温下反应6h。柱层析法纯化得中间体1(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝1∶20，v/v)。称取一定量的低分子量肝素于圆底烧瓶中，加入适量甲酰胺，缓慢加热溶解。降温后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺，冰浴条件下搅拌1h，然后将等摩尔质量的中间体1 溶于适量N，N-二甲基甲酰胺中，逐滴滴加至上述反应液中，室温下继续反应24h，低分子量肝素羧基、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、羟基琥珀酰亚胺和中间体1摩尔比为 1∶1∶1∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，并洗涤3次，将滤渣溶于适量蒸馏水，在蒸馏水中透析24h后，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得吉西他滨胆固醇衍生物- 低分子量肝素偶联物。
实施例2：吉西他滨单硬脂酸甘油酯衍生物-脱硫酸化肝素偶联物的合成
在氮气保护下，将适量单硬脂酸甘油酯和三乙胺溶解在二氯甲烷中，滴加三氯磷氧并加热回流2h，单硬脂酸甘油酯、三乙胺和三氯磷氧的摩尔比为1∶3∶1。过滤将滤渣加入到8 倍体积的0.2mol/L碳酸氢钠溶液中，在室温下反应15h后，加入3倍体积的丙酮沉淀，并洗涤3次后过滤取白色沉淀。将沉淀加入氯仿、甲醇和0.1mol/L的盐酸溶液混合液中(1∶2∶1，v/v)，室温下反应1h。使用氯仿萃取，分离有机层，蒸发得到中间体1。将适量吉西他滨和等摩尔量的中间体1溶于适量吡啶中，在38～40℃条件下反应24h。使用柱层析法纯化得中间体2(洗脱剂为三氯甲烷∶甲醇＝24∶1，v/v)。称取适量脱硫酸化肝素溶于甲酰胺，60℃加热溶解，氮气保护、冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑活化，脱硫酸化肝素羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑的摩尔比为1∶4∶4。45min后，将中间体2的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入到上述反应体系中，室温反应24h。中间体2与脱硫酸化肝素的羧基摩尔比为4∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为产物。用适量蒸馏水复溶，在蒸馏水中透析1d，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得硬脂酸单硬脂酸甘油酯衍生物-脱硫酸化肝素偶联物。
实施例3：氧化还原敏感吉西他滨十八醇衍生物-低分子量肝素偶联物的合成
在氮气保护下将适量十八烷醇和三乙胺溶解于二氯甲烷中，滴加三氯磷氧至上述反应体系中并加热回流2h，十八烷醇、三乙胺和三氯磷氧的摩尔比为1∶3∶1。过滤将滤渣加入到 8倍体积的0.2mol/L碳酸氢钠溶液中，在室温下反应15h后，加入3倍体积的丙酮沉淀，并洗涤3次后过滤取白色沉淀。将沉淀溶于氯仿、甲醇和0.1mol/L的盐酸溶液混合液(1∶2∶1，v/v)中，室温下反应1h。氯仿萃取，分离有机层，蒸发得到中间体1。将适量吉西他滨和等摩尔量的中间体1溶于吡啶中，在38～40℃条件下反应24h。使用柱层析法纯化得中间体2(洗脱剂为三氯甲烷∶甲醇＝20∶1，v/v)。称取适量4，4’-二硫代二丁酸溶于甲酰胺中，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺，冰浴条件下搅拌1h，将中间体2的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入到上述反应体系中，室温反应24h。中间体2与4，4’-二硫代二丁酸的摩尔比为1∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为中间体3。称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺，60℃加热溶解1h，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的4-二氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，冰浴下将中间体3的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加入上述反应体系中，室温反应24h。中间体3与低分子量肝素羧基的摩尔比为2∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为产物。用适量蒸馏水复溶，在蒸馏水中透析48h，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得氧化还原敏感吉西他滨十八醇衍生物-低分子量肝素偶联物。
实施例4：氧化还原敏感吉西他滨胆固醇衍生物-低分子量肝素偶联物的合成
称取一定量的胆固醇，溶于适量吡啶中，然后加入等摩尔质量的亚磷酸二苯酯和少量三乙胺。70℃条件下反应12h。将吉西他滨溶于吡啶中滴加入上述反应体系中继续在室温下反应6h。柱层析法纯化得中间体1(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝1∶15，v/v)。称取适量4，4’- 二硒代二丁酸溶于甲酰胺中，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺，冰浴条件下搅拌1h，将中间体1的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入到上述反应体系中，室温反应24h。中间体1与4，4’-二硒代二丁酸的摩尔比为1∶ 1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为中间体2。称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺，60℃加热溶解1h，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的4-二氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，冰浴下将中间体2的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加入上述反应体系中，室温反应24h。中间体2与低分子量肝素羧基的摩尔比为4∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为产物。用适量蒸馏水复溶，在蒸馏水中透析48h，过0.8μm 微孔滤膜，冷冻干燥，即得氧化还原敏感吉西他滨胆固醇衍生物-低分子量肝素偶联物。
实施例5：酸敏感吉西他滨单硬脂酸甘油酯衍生物-低分子量肝素偶联物的合成
在氮气保护下，将适量单硬脂酸甘油酯和三乙胺溶解在二氯甲烷中，滴加三氯磷氧并加热回流2h，单硬脂酸甘油酯、三乙胺和三氯磷氧的摩尔比为1∶3∶1。过滤将滤渣加入到8 倍体积的0.2mol/L碳酸氢钠溶液中，在室温下反应15h后，加入3倍体积的丙酮沉淀，并洗涤3次后过滤取白色沉淀。将沉淀加入氯仿、甲醇和0.1mol/L的盐酸溶液混合液中(1∶2∶1，v/v)，室温下反应1h。使用氯仿萃取，分离有机层，蒸发得到中间体1。将适量吉西他滨和等摩尔量的中间体1溶于适量吡啶中，在38～40℃条件下反应24h。使用柱层析法纯化得中间体2(洗脱剂为三氯甲烷∶甲醇＝20∶1，v/v)。称取适量丁二酸酐溶于甲苯中，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，冰浴条件下搅拌0.5 h，将中间体2的甲苯溶液加入到上述反应体系中，45℃下反应12h。中间体2与4丁二酸酐的摩尔比为1∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为中间体3。称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺，60℃加热溶解1h，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的4-二氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，冰浴下将中间体3的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加入上述反应体系中，室温反应24h。中间体3与低分子量肝素羧基的摩尔比为1∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为产物。用适量蒸馏水复溶，在蒸馏水中透析48h，过0.8μm微孔滤膜，喷雾干燥，即得酸敏感吉西他滨单硬脂酸甘油酯衍生物-低分子量肝素偶联物。
实施例6：酸敏感吉西他滨单硬脂酸甘油酯衍生物-脱硫酸肝素偶联物的合成
在氮气保护下，将适量单硬脂酸甘油酯和三乙胺溶解在二氯甲烷中，滴加三氯磷氧并加热回流2h，单硬脂酸甘油酯、三乙胺和三氯磷氧的摩尔比为1∶3∶1。过滤将滤渣加入到8 倍体积的0.2mol/L碳酸氢钠溶液中，在室温下反应15h后，加入3倍体积的丙酮沉淀，并洗涤3次后过滤取白色沉淀。将沉淀加入氯仿、甲醇和0.1mol/L的盐酸溶液混合液中(1∶2∶1，v/v)，室温下反应1h。使用氯仿萃取，分离有机层，蒸发得到中间体1。将适量吉西他滨和等摩尔量的中间体1溶于适量吡啶中，在38～40℃条件下反应24h。使用柱层析法纯化得中间体2(洗脱剂为三氯甲烷∶甲醇＝19∶1，v/v)。称取适量马来酸酐溶于甲苯中，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，冰浴条件下搅拌0.5 h，将中间体2的甲苯溶液加入到上述反应体系中，45℃下反应12h。中间体2与马来酸酐的摩尔比为1∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为中间体3。称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺，60℃加热溶解1h，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的4-二氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，冰浴下将中间体3的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加入上述反应体系中，室温反应24h。中间体3与低分子量肝素羧基的摩尔比为1∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为产物。用适量蒸馏水复溶，在蒸馏水中透析48h，过0.8μm微孔滤膜，喷雾干燥，即得酸敏感吉西他滨单硬脂酸甘油酯衍生物-脱硫酸肝素偶联物。
实施例7：酸敏感吉西他滨十八醇衍生物未分级肝素偶联物的合成
在氮气保护下，将适量硬脂酸溶解于四氢呋喃中，滴加入一定量三乙胺，冰浴条件下，逐滴加入溶有氯甲酸乙酯的四氢呋喃溶液，室温反应30min，再逐滴加入吉西他滨的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应48h，硬脂酸、三乙胺、氯甲酸乙酯和吉西他滨的摩尔比为 1∶2∶1∶1，减压真空干燥。使用柱层析法纯化得中间体2(洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝1∶ 10，v/v)。称取适量二乙醇酸酐溶于甲苯中，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的1-乙基- (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，冰浴条件下搅拌0.5h，将中间体2的甲苯溶液加入到上述反应体系中，45℃下反应12h。中间体2与二乙醇酸酐的摩尔比为1∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为中间体3。称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺， 60℃加热溶解1h，氮气保护、冰浴条件下加入4-二氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，冰浴下将中间体3的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加入上述反应体系中，室温反应24h。中间体3、未分级羧基、4-二氨基吡啶和二环己基碳二亚胺的摩尔比为2∶1∶2∶2。反应结束后，加入 3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为产物。用适量蒸馏水复溶，在蒸馏水中透析48h，过0.8μm微孔滤膜，喷雾干燥，即得酸敏感吉西他滨十八醇衍生物未分级肝素偶联物。
实施例8：酸敏感吉西他滨十八醇衍生物-低分子量肝素偶联物的合成
在氮气保护下，将适量硬脂酸溶解于四氢呋喃中，滴加入一定量三乙胺，冰浴条件下，逐滴加入溶有氯甲酸乙酯的四氢呋喃溶液，室温反应30min，再逐滴加入吉西他滨的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应48h，硬脂酸、三乙胺、氯甲酸乙酯和吉西他滨的摩尔比为 1∶2∶1∶1，减压真空干燥。使用柱层析法纯化得中间体2(洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝1∶ 10，v/v)。将对羟基苯甲醛溶于适量乙醇中，缓慢滴加入溶有中间体2和对甲基苯磺酸的四氢呋喃溶液中，对羟基苯甲醛与中间体2的摩尔比为1∶1，45℃加热回流6h，加入无水硫酸镁干燥，真空干燥除去溶剂，即为中间体3。称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺，60℃加热溶解1h，氮气保护、冰浴条件下加入等摩尔量的4-二氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，冰浴下将中间体3的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加入上述反应体系中，室温反应24h。中间体3 与低分子量肝素羧基的摩尔比为1∶1。反应结束后，加入3倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤，滤渣即为产物。用适量蒸馏水复溶，在蒸馏水中透析48h，过0.8μm微孔滤膜，喷雾干燥，即得酸敏感吉西他滨十八醇衍生物-低分子量肝素偶联物。
实施例9：纳米化吉西他滨的制备和表征
1.纳米化吉西他滨的制备：精密称取5mg制备的两亲性吉西他滨偶联物溶于5mL超纯水中，冰水浴探头超声或高压均质后，得光学透明体。
2.粒径：将1制备得到的两亲性吉西他滨偶联物溶液，取2mL用马尔文激光粒径仪进行测定，结果见表1。
3.临界胶束浓度(CMC)：采用芘荧光光谱法测定CMC。芘是一种疏水性芳香化合物，对所处化学环境的极性极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，芘溶解在水中；随着两亲性分子浓度增加，当高于CMC时形成胶束，芘向胶束内核的疏水部分分配，从而所处环境的极性变化，继而其荧光光谱发生变化。以芘的激发光谱中的I338/I333比值对两亲性分子的浓度作图即可得到两亲性分子的CMC，结果见表1。
表1 肝素衍生物纳米溶液的制备和表征
Figure BSA0000166531090000161
实施例10：纳米化吉西他滨的放置稳定性
称取实施例1～8制备的纳米化吉西他滨适量，溶于适量蒸馏水，制成浓度为1mg/mL的纳米溶液，室温放置48h，测定不同时间纳米溶液的粒径，PDI变化，评价纳米化吉西他滨的放置稳定性。结果如表2所示，实施例1～8中各组纳米化吉西他滨48h内粒径稳定，PDI变化幅度小，说明纳米化吉西他滨在贮存和使用过程中具有较好的稳定性。
表2 纳米化吉西他滨的放置稳定性
Figure BSA0000166531090000171
实施例11：APTT法检测新型肝素-黄酮衍生聚合物的抗凝活性
采用活化部分凝血活酶时间(APTT)法检测纳米化吉西他滨的抗凝血活性。兔耳缘静脉取血，置于含有1/10体积0.109M的枸橼酸钠抗凝液(1份抗凝液+9份全血)的塑料管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，收集上层液(血浆)。将0.1mL样品溶液(20μg/mL)加入0.4mL 枸橼酸钠血浆中，再加入37℃预温的APTT试剂0.1mL，37℃孵育5min。同时以空白血浆作为对照。然后，加入37℃预温的0.025mol/L氯化钙溶液0.1mL，启动秒表，记录血浆凝固时间，每个样品做3个复管测定，取平均值。结果见表3。结果表明吉西他滨衍生物与肝素类多糖共价连接后，能明显降低后者的抗凝活性，提高了肝素类多糖在血管给药中的安全性。
表3 纳米化吉西他滨的抗凝活性
Figure BSA0000166531090000181
实施例12：纳米化吉西他滨促肿瘤血管正常化的作用
肿瘤血管正常化实验模型是在Heps荷瘤小鼠模型，随机将Heps荷瘤小鼠分成6组：生理盐水组、游离低分子量肝素组、吉西他滨组及3个纳米粒组。每2天给药一次，给药剂量为2mg/kg/天(以Gem给药量计算)，于第2、3、4、5、6、7、8天从各组随机取样，处死小鼠，将各组小鼠的肿瘤组织剥离，对肿瘤组织切片进行CD31免疫染色(标记肿瘤血管内皮细胞)、α-SMA免疫染色(标记肿瘤血管周皮细胞)和collagen IV(标记肿瘤血管基底膜) 并使用image pro plus软件计算肿瘤周细胞覆盖率和基底膜覆盖率。
结果如表4和5所示，纳米粒制剂组在给药后第4、5、6、7天的周细胞覆盖率和基底膜覆盖率显著高于对照组和其他制剂组，初步判断在第4至第7天为“血管正常化时间窗”。并且，与吉西他滨和低分子量肝素单独给药相比，纳米粒促进血管正常化的时间窗更长，吉西他滨和低分子量肝素组仅在给药后第6天相对于对照组显著提高了周细胞覆盖率和基底膜覆盖率，但程度显著低于纳米粒组。
表4 纳米化吉西他滨给药后周细胞覆盖率
Figure BSA0000166531090000191
表5 纳米化吉西他滨给药后基底膜覆盖率
Figure BSA0000166531090000192
实施例13：纳米化吉西他滨在肿瘤组织内的分布
将Heps细胞接种于小鼠皮下，建立肝癌动物模型。给药方案与实施例11相同，在第2天给药后，第6天给药后和第8天给药后剥离瘤组织。取样前最后一次给药使用包载有香豆素-6的纳米化吉西他滨(吉西他滨胆固醇衍生物-低分子量肝素偶联物溶液)，12h后处死小鼠，剥离肿瘤，制备冷冻切片。使用CD31标记肿瘤血管，DAPI标记细胞核，通过观察血管荧光，细胞核荧光和纳米粒荧光的分布情况考察血管正常化前后自身的递送情况。
结果如表6所示，在第2天，纳米粒荧光在肿瘤组织的边缘位置分布较强，在第6天，纳米粒荧光分布较为均一，并且渗透到肿瘤组织内部，而在第8天，整个肿瘤组织中分布的荧光强度较小，说明在肿瘤血管时间窗内，纳米粒自身的递送得到改善，能够渗透到肿瘤组织内部。
表6 肿瘤组织不同区域单位面积内荧光强度
Figure BSA0000166531090000201
实施例14：装载化疗药物的纳米化吉西他滨的制备和表征
1.制备工艺
工艺I：称取一定量的两亲性吉西他滨偶联物溶于适量纯水中搅拌30min，之后将一定量的疏水药物溶于适量乙醇(二氯甲烷、二甲基亚砜)中，逐滴滴加至偶联物的水溶液中，滴速为1-2d/min，两亲性吉西他滨偶联物与紫杉醇的质量比为4∶1。滴加完成后，继续搅拌2 h，探头超声30min。使用3500MW透析袋透析过夜，透析完成后，过0.8μm水膜，-20℃预冻过夜，冻干后得产物。
工艺II：称取一定量两亲性吉西他滨偶联物溶溶于纯水，搅拌30min后，逐滴加入疏水药物的N，N-二甲基甲酰胺(乙醇、二甲基亚砜、二氯甲烷)溶液。滴加速度为2-3d/min。滴加完毕，超声30min，敞口挥干或旋转蒸发除去有机溶剂，0.8μm微孔滤膜过滤，冻干，即得。
2.粒径
将1制备得到的肝素衍生物纳米溶液，取2mL用马尔文激光粒径仪进行测定，结果见表 7。
3.载药量的检测方法
采用高效液相色谱法测定载药量，以药物在其最大吸收波长处峰面积对浓度进行线性分析，得标准曲线，测得载药后的纳米化吉西他滨在上述最大波长处测得的峰面积后，按照按公式(1)计算载药量(DL，％)，结果见表7，制备的载药后的纳米化吉西他滨分散均匀，载药量高，具有制备成注射或口服给药等不同制剂的潜能。
Figure BSA0000166531090000202
表7 装载疏水药物的纳米化吉西他滨的制备和表征
Figure BSA0000166531090000211
实施例15：MTT法检测纳米化吉西他滨对HepG2细胞的抑制作用
取HepG2细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，37℃孵育24h，吸去培养液，分别加入含不同浓度的肿瘤治疗药物的新型黄酮衍生聚合物纳米药物培养基溶液200μL，37℃孵育48h 后，加入40μL四甲基偶氮唑蓝(MTT，2.5mg/mL)，继续孵育4h；吸去各孔培养基，加入150μL二甲基亚砜，振摇10min使结晶充分溶解。于570nm下用酶标仪测定各个纳米药物的吸光度值(实验组OD值)。并以相同方法测定空白组OD值以及对照组OD值，n＝6。按公式(2)计算受试细胞存活率，并以存活率结果计算纳米药物对HepG2细胞的半数抑制率IC50， IC50结果见表8。结果表明，与游离吉西他滨相比，纳米化吉西他滨具有更强的细胞毒性；当载入抗肿瘤药物后，其肿瘤抑制作用更强。
Figure BSA0000166531090000212
表8 纳米化吉西他滨对HepG2细胞的抑制活性
Figure BSA0000166531090000221
实施例16：载紫杉醇纳米化吉西他滨体内抗肿瘤的作用
体内抗肿瘤实验模型是在Heps荷瘤小鼠模型，随机将Heps荷瘤小鼠分成5组：阴性对照组(生理盐水)，游离紫杉醇组，纳米化吉西他滨组(吉西他滨胆固醇衍生物-低分子量肝素偶联物)，纳米化吉西他滨和紫杉醇物理混合组，载紫杉醇纳米化吉西他滨组。每两天给药一次，给药5次。最后一次给药后第2天处死小鼠，解剖小鼠时，分离瘤块并称重，按公式(3)计算抑瘤率(IR)评价疗效。
Figure BSA0000166531090000222
结果如表9所示，与生理盐水组相比，游离紫杉醇、物理混合组和载药纳米粒组具有不同程度的抑制肿瘤生长的效果，然而载药纳米粒组具有最好的抑制肿瘤生长的效果。
表9 载紫杉醇纳米化吉西他滨的抑瘤效果
Figure BSA0000166531090000231

Claims (5)

1.一种促肿瘤血管正常化的纳米化吉西他滨，其特征在于其是将具有抗VEGF作用的肝素与节拍给药可获得促肿瘤血管正常化作用的经修饰的吉西他滨共价连接制得两亲性吉西他滨偶联物，进而通过纳米化工艺制得纳米化吉西他滨，应用于促进肿瘤血管正常化治疗与抗肿瘤联合治疗，所述肝素为未分级肝素、低分子量肝素，N-O-脱硫酸化肝素或N-去硫酸化肝素，所述经修饰的吉西他滨是胆固醇或长链脂肪酸甘油酯或长链脂肪醇或硬脂酸修饰的吉西他滨，所述共价连接是肝素主链羧基与经修饰的吉西他滨的氨基连接成酰胺键，或肝素与经修饰的吉西他滨通过连接剂连接，所述连接剂含有敏感键且至少含有两个分别用于共价连接肝素和经修饰的吉西他滨的反应官能团，所述敏感键是在肿瘤微环境下易断裂的化学键。
2.根据权利要求1所述的纳米化吉西他滨，其特征在于纳米化吉西他滨进一步负载疏水性抗癌药物实现协同抗肿瘤治疗；负载抗癌药物后的纳米化吉西他滨用于促肿瘤血管正常化治疗时给药方式为节拍给药。
3.根据权利要求1所述的纳米化吉西他滨，其特征在于采用下列方法制备：按每1mL水中溶解3～30mg的两亲性吉西他滨偶联物的比例，将制得的两亲性吉西他滨偶联物溶于水中，常温下振摇1～10min，冰水浴超声或高压均质处理，即得粒径为10～1000nm的纳米化吉西他滨。
4.根据权利要求1所述的纳米化吉西他滨，其特征在于可应用于注射、口服和外用，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂、注射剂和软膏剂。
5.根据权利要求2所述的纳米化吉西他滨，其特征在于所述的抗癌药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、三尖衫宁碱、10-去乙酰巴卡亭、7-差向紫杉醇、喜树碱、SN38、9-二甲胺甲基-10-羟基喜树碱、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、GI147211、DX-8951f、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、20’-20’-二氟-3’，4’-二氢去甲长春花碱、阿霉素中的至少一种；负载抗癌药物的纳米化吉西他滨的制备方法包括如下两个工艺：
工艺I：将两亲性吉西他滨偶联物与水按重量比mg/mg2～50∶1000的比例混合制成溶液；将一定比例的抗癌药物用适量有机溶剂溶解：将抗癌药物溶液缓慢滴加到两亲性吉西他滨偶联物溶液中，室温搅拌0.5～2h后，冰浴下探头超声10～30min；采用透析法或超滤法除去小分子和有机溶剂，后采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥除去水分，即得；
工艺II：将两亲性吉西他滨偶联物与水按重量比mg/mg2～50∶1000的比例混合制成溶液；将一定比例的抗癌药物用适量有机溶剂溶解：将两者混合，冰浴下探头超声10～30min，室温下敞口搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，后采用离心法或柱分离法除去小分子，过0.8μm滤膜，后采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥除去水分，即得。
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