CN106581686A - 一种透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，这类衍生物是在壳聚糖骨架上首先引入亲水基团，然后通过含二硫键的可特异降解的连接臂引入疏水基团，使其具有两亲性，该两亲性衍生物在水性介质中可自组装为纳米胶束，并进一步通过电荷吸附原理修饰以靶分子透明质酸，该纳米胶束可有效荷载抗肿瘤药物，靶向到达肿瘤微环境后，透明质酸被病灶细胞内透明质酸酶降解，连接臂二硫键可被病灶细胞内高浓度还原性物质谷胱甘肽降解，从而导致药物快速从胶束中释放出来，作用于病灶部位，可显著提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度。该载体可以作为带有药学活性或药理活性分子的载体，用于血管内或者肌肉内注射或口服途径给药，显著提高药物的抗肿瘤活性。本发明制备方法简单，工艺成熟，适于大规模生产。

Description

一种透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖 衍生物载体的制备和应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物作为抗肿瘤药物载体，本发明还涉及该载体的制备方法及其应用。
背景技术
癌症自发现之初就一直是威胁人类生命健康的重大疾病，目前临床主要依靠药物化学治疗癌症。目前人们对肿瘤机制的研究不断深入，肿瘤细胞内信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡、血管生成以及细胞转移、浸润等各种基本过程正在被逐步阐明，许多抗肿瘤药物随之研发，这些药物除通过抑制增殖或诱导凋亡等直接杀伤外，还通过免疫调节、抑制转移等间接调节作用于肿瘤细胞。但大多数抗肿瘤药物均为水难溶性化合物，具有口服吸收较差，生物利用度较低，且体内代谢快，维持有效血药浓度的时间较短，难于制备适宜制剂等缺点。目前多使用制成脂质体、表面活性剂、包合物等方法来增加抗肿瘤药物的溶解度，然而有些低分子表面活性剂，例如聚氧乙烯蓖麻油有较强的毒副作用，有些脂质体及包合物也存在靶向分布不好、载药量低、不稳定等问题。因此，建立一种高效负载、稳定转运、肿瘤细胞特异性摄取并能在靶部位定位释药的纳米靶向载体技术，实现抗肿瘤药物的安全、高效细胞内递送，是目前抗肿瘤药物递送系统设计追求的目标之一。
聚合物胶束两亲性高分子材料作为一种近几年来高速发展的药物载体材料，在同一分子中具有亲水链段和疏水链段，能在水中自组装成内部疏水，外部亲水的核壳型纳米胶束，因而大大提高了药物的溶解度。此外，其突出优势还表现在(1)两亲性高分子材料的疏水链段在水中的聚集力较强，疏水内核较稳定，载药制剂稳定性高；(2)纳米制剂具有实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)，能使药物在病变部位富集，实现对病变组织的被动靶向性；(3)通过肿瘤微环境中特定的酶或pH或还原环境等条件，在病灶部位快速释放药物，降低对正常组织的毒副作用，提高生物利用度。
壳聚糖是天然界唯一带有正电荷的多糖，具有来源广泛、性质稳定、无毒、良好的生物相容性和生物可降解性等优点。壳聚糖分子链上带有大量活性氨基和羟基，易于化学修饰而改善其物理化学性质。
低分子量透明质酸是一种带负电荷的线性糖胺聚糖(MW＜10KDa)，具有生物相容、生物可降解、无任何免疫原性的优点，透明质酸对绝大多数肿瘤细胞(如卵巢癌、头颈部癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、结肠癌、白血病等)具有高度亲和性，能与肿瘤细胞表面CD44、RHAMM、HARE和LYVE-1受体特异性结合而被内吞至肿瘤细胞内。
然而由于两亲性壳聚糖形成的胶束独特的多核结构及疏水微区和难溶性药物的高相容性，药物释放速度非常缓慢，肿瘤部位释放的少量药物量不足以起到抗肿瘤效果，严重影响了药物疗效的发挥。因此环境响应性且生物可降解的聚合物胶束用于相应肿瘤特定环境以获得药物的快速释放，在特定行为下产生更高的抗肿瘤效果。近年来，药理学家研究发现，肿瘤组织由于其代谢异常，导致了其细胞质、线粒体及细胞核内具有高浓度的内还原型谷胱甘肽(GSH)(2～10mM)，是正常细胞内环境GSH浓度的4倍以上，是细胞外液及循环系统的100～1000倍(2～20μm)，因此表现为独特的强还原生理特征。因此，可利用该独特的肿瘤微环境设计还原敏感触发释药功能的靶向聚合物纳米胶束，以解决其药物释放过于缓慢的问题。
针对以上问题，本专利在壳聚糖骨架上首先引入亲水基团，然后通过含二硫键的可特异降解的连接臂引入疏水基团，使其具有两亲性，该两亲性衍生物在水性介质中可自组装为纳米胶束，该纳米胶束可有效荷载抗肿瘤药物，并进一步通过电荷吸附原理修饰以靶分子透明质酸，靶向到达肿瘤微环境后，透明质酸被病灶细胞内透明质酸酶降解，连接臂二硫键可被病灶细胞内高浓度还原性物质谷胱甘肽降解，新型透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物作为药物载体具备以下特点：(1)此壳聚糖衍生物具有两亲性质，在水溶液中自组装形成纳米胶束，避免使用大量有机溶剂、表面活性剂、交联剂或加热条件；(2)在疏水键作用下物理包裹抗肿瘤药物，显著提高载药量，增加药物稳定性；(3)由于透明质酸能与肿瘤细胞表面CD44、RHAMM、HARE和LYVE-1受体特异性结合，该纳米胶束物理包裹抗肿瘤药物可被内吞至肿瘤细胞，到达肿瘤微环境后，透明质酸外壳被病灶细胞内透明质酸酶降解；(4)壳聚糖与疏水基团间的连接臂含有二硫键，此二硫键在体循环和细胞外的内环境较稳定，但可被病灶细胞内高浓度的还原性物质谷胱甘肽降解，从而导致药物快速从胶束中释放出来，作用于病灶部位，可显著提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度。通过透明质酸靶向修饰和含二硫键的连接臂引入疏水基团所形成的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物尚未见文献和专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以物理包裹抗肿瘤药物并用透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体。该两亲性衍生物在水性介质中可自组装为纳米胶束，避免使用化学交联剂、大量有机溶剂和加热条件，制备工艺简单，该载体疏水内核可经物理包裹更多的此种抗肿瘤药物或其他难溶性抗肿瘤药物，从而显著提高抗肿瘤药物的溶解性和载药量，并进一步通过电荷吸附原理修饰以靶分子透明质酸，靶向到达肿瘤微环境后，透明质酸被病灶细胞内透明质酸酶降解，连接臂二硫键可被病灶细胞内高浓度还原性物质谷胱甘肽降解，从而导致药物快速从胶束中释放出来，作用于病灶部位，可显著提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度。该载体具有载药量高、稳定性好、药效提高、毒副作用降低的特征。
本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述载体在制药中的应用。
为达到上述目的，本发明提供一种肿瘤微环境特异性释药的透明质酸修饰的两亲性壳聚糖衍生物载体，其结构如下列化学式所示：
其中GC为壳聚糖分子链，所述分子量在1×104～1×106，脱乙酰度＞75％；
R1为亲水基团，所述亲水基团选自羟乙基、羧甲基；
p为壳聚糖骨架上亲水基团R1取代度，所述亲水基团取代度为80～150％；
m+n为二硫键连接臂所含亚烷基个数，连接臂亚烷基个数为2～16；
R2为疏水基团，所述疏水基团选自C2～C18脂肪胺(酸、醇)、精氨酸、聚乙烯亚胺、硬脂酸、脱氧胆酸等；
q为壳聚糖骨架上疏水基团R2取代度，所述疏水基团取代度为0.5～20％；
HA为低分子量透明质酸，所述分子量1×103～1×104；
所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其中选用的壳聚糖是自然界唯一大量存在的高分子碱基多糖，其分子链上带有大量的活性氨基和羟基，易于化学修饰。透明质酸是一种天然聚阴离子多糖，且透明质酸能与能与肿瘤细胞表面CD44、RHAMM、HARE和LYVE-1受体特异性结合而被内吞至肿瘤细胞内，可以实现抗肿瘤药物的靶向递送。
所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于连接臂含有病灶部位特异性降解的二硫键，且两端的反应基团为氨基或羧基或一端反应基团为氨基另一端反应基团为羧基。壳聚糖分子与连接臂通过酰胺键相连，连接臂与疏水基团通过酰胺键或酯键相连。
所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，制备方法包括下列步骤：
(1)两亲性壳聚糖衍生物载体的制备：将壳聚糖溶于反应溶剂中，加入氯乙酸或环氧乙烷，制得亲水基团修饰的羧甲基壳聚糖或羟乙基壳聚糖。将亲水基团修饰的壳聚糖衍生物溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且两端含有羧基的连接臂，以以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂进行酰胺化反应，亲水性壳聚糖衍生物与含二硫键的连接臂的一端羧基反应得到中间体；将中间体和含有氨基(羟基)的疏水化合物溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂，含有氨基(羟基)的疏水化合物和中间体进行酰胺化或酯化反应，即得到具有肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载体。
(2)两亲性壳聚糖衍生物载体的制备：将壳聚糖溶于反应溶剂中，加入氯乙酸或环氧乙烷，制得亲水基团修饰的羧甲基壳聚糖或羟乙基壳聚糖。将亲水基团修饰的壳聚糖衍生物溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且一端含有氨基一端含有羧基的连接臂，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂进行酰胺化反应，亲水性壳聚糖衍生物与含二硫键的连接臂的一端羧基反应得到中间体；将中间体和含有羧基的疏水化合物溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂，含有羧基的疏水化合物和中间体进行酰胺化反应，即得到具有肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载体。
(3)透明质酸修饰的两亲性壳聚糖衍生物载体的制备：将具有肿瘤微环境触发释药的壳聚糖胶束溶于水中，加入一定比例的透明质酸水溶液，静置一段时间，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体。
所述的具有肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，制备过程中反应溶剂为水、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲酰胺、水与甲醇的混合溶剂、水与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、水与甲酰胺的混合溶剂，或N，N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶液。
所述的具有肿瘤微环境触发释药的壳聚糖衍生物载体具有两亲性，在水介质中可自发形成纳米胶束。
所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体制备时反应溶剂为水。
所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，可以用于血管内或者肌肉内注射或口服的带有药学活性或药理活性分子的载体。其中带有药学活性或药理活性分子选自：紫杉烷类、环孢素类、叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、黄酮类、喜树碱类、二氢吡啶类、长春碱类、小檗碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类抗肿瘤药物的任意一项。
所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载药胶束方法步骤如下：肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体与水按重量比为1～50∶1000的比例溶解，得到壳聚糖聚合物纳米胶束，将治疗有效量的带有药学活性或药理活性分子用药学上可接受溶剂溶解后，与所述聚糖聚合物纳米胶束溶液混合，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或离心法除去非水溶剂和小分子，加入一定比例的透明质酸水溶液，静置一段时间，冻干制得粒径为10～1000nm的载药纳米粒。
具体方案如下：
将壳聚糖骨架上引入亲水基团，再通过含二硫键的可特异降解的连接臂引入疏水基团，使其具有两亲性，在水性介质中可自组装为纳米胶束，该纳米胶束可有效荷载抗肿瘤药物，并进一步通过电荷吸附原理修饰以靶分子透明质酸，稳定性和生物相容性增加，并且能有躲避生物体网状内皮系统的捕捉。因此这类透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物是一类优良的药物载体，尤其是对于水难溶性抗肿瘤药物，载药后载药量和包封率高，载药后粒径在10～1000nm可控，均匀度好。该两亲性壳聚糖衍生物载体可用于血管内或肌肉注射、口服途径给药等。
一种透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体的制备方法详细说明如下：
一、肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体的合成
1、与亲水基团的反应
(1)与氯乙酸的反应
壳聚糖分散于醋酸水溶液或异丙醇中，加入浓氢氧化钠水溶液，碱化6～12h，加入适量氯乙酸，升温至35～50℃继续反应24h，浓盐酸调节pH值6～8，丙酮沉淀，抽滤并分离纯化沉淀物得到羧甲基壳聚糖。
合成路线如下：
其中GC为壳聚糖分子链，所述分子量在1×104～1×106，脱乙酰度＞75％；
R1为亲水基团，所述亲水基团为羧甲基；
p为壳聚糖骨架上亲水基团R1取代度，所述亲水基团取代度为80～150％；
(2)与环氧乙烷的反应
壳聚糖分散于醋酸水溶液或异丙醇中，加入浓氢氧化钠水溶液，碱化6～12h，冰浴条件下，分批加入适量环氧乙烷，0℃反应2～4h，升温至35～50℃继续反应24h，浓盐酸调节pH值6～8，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到羟乙基壳聚糖。
合成路线如下：
其中GC为壳聚糖分子链，所述分子量在1×104～1×106，脱乙酰度＞75％；
R1为亲水基团，所述亲水基团为羟乙基；
p为壳聚糖骨架上亲水基团R1取代度，所述亲水基团取代度为80～150％；
2、与疏水基团的反应
2.1含二硫键的反应中间体的合成
(1)将亲水性壳聚糖衍生物溶于反应溶剂中，加入过量的含有二硫键且两端含有羧基的连接臂，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂，与亲水性壳聚糖衍生物上的氨基基团反应12～24h，反应结束后旋蒸除去挥发性有机溶剂，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到中间体I。
合成路线如下：
其中，m+n为二硫键连接臂所含亚烷基个数，连接臂亚烷基个数为2～16；
(2)将亲水性壳聚糖衍生物于反应溶剂中，加入过量的含有二硫键且一端含有氨基一端含有羧基的连接臂，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂，与亲水性壳聚糖衍生物上的氨基基团反应12～24h，反应结束后旋蒸除去挥发性有机溶剂，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到中间体II。
合成路线如下：
其中，m+n为二硫键连接臂所含亚烷基个数，连接臂亚烷基个数为2～16；
2.2含二硫键的反应中间体与疏水基团的反应
(1)将中间体I和含有氨基(羟基)的疏水化合物溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂，与中间体I的羧基基团反应12～24h，反应结束后旋蒸除去挥发性有机溶剂，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到具有肿瘤微环境触发释药的壳聚糖衍生物载体。
合成路线如下：
其中R2为疏水基团，所述疏水基团选自C2～C18脂肪胺(醇)、聚乙烯亚胺等；
q为壳聚糖骨架上疏水基团R2取代度，所述疏水基团取代度为0.5～20％；
(2)将中间体II和含有羧基的疏水化合物溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂，与中间体II的氨基基团反应12～24h，反应结束后旋蒸除去挥发性有机溶剂，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到具有肿瘤微环境触发释药的壳聚糖衍生物载体。
合成路线如下：
其中R2为疏水基团，所述疏水基团选自C2～C18脂肪酸(醇)、精氨酸、硬脂酸、胆酸等；
q为壳聚糖骨架上疏水基团R2取代度，所述疏水基团取代度为0.5～20％；
二、肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载药胶束的制备方法
按每1mL水中溶解2～30mg的两亲性壳聚糖衍生物的比例，将制得的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
三、以肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物作为载体，制备含水难溶药物的药物组合物
两亲性壳聚糖衍生物胶束溶于水，浓度为0.1％～5％(w/w)，将治疗有效量的水难溶药物用适当溶剂溶解后，与所述两亲性壳聚糖衍生物胶束混合，经超声处理，溶液用透析法或离心法除去非水溶剂和小分子，制得粒径为10～1000nm的载药纳米粒。所谓适当溶剂，指药学上可接受的能溶解该药物的溶剂。
四、采用该肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物作为载体制备药物组合物，可对药物有效负载。
可使用该肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物作为载体的药物为具有药学活性或药理活性的分子，包括紫杉烷类、环孢素类、叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、黄酮类、喜树碱类、二氢吡啶类、长春碱类、小檗碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类抗肿瘤药物的任意一项，但并不局限于这些所列药物。
五、透明质酸修饰的肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载药胶束的制备
将具有肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载药胶束溶于水中，涡旋条件下，加入一定比例的透明质酸水溶液，静置一段时间，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载药胶束。
本发明的有益效果：
一、本发明以含二硫键的连接臂在壳聚糖的氨基引入疏水基团，此二硫键在体循环和细胞外内环境中稳定性较高，但易被细胞内高浓度的还原性物质(谷胱甘肽等)降解。该肿瘤微环境触发释药的壳聚糖衍生物在水性介质中可自组装为纳米胶束，该纳米胶束可有效荷载抗肿瘤药物，并进一步通过电荷吸附原理修饰以靶分子透明质酸，靶向到达肿瘤微环境后，透明质酸被病灶细胞内透明质酸酶降解，连接臂二硫键可被病灶细胞内高浓度还原性物质谷胱甘肽降解，透明质酸修饰的肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载药胶束可在细胞内特异性的快速释放药物，避免了包裹在载体中的药物未能释放、未能发挥药效即被清除的缺点，可显著提高生物利用度和药效。
二、本发明提供的透明质酸修饰的肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载体具有良好的生物相容性和稳定性，还具有躲避生物体网状内皮系统的捕捉、可主动靶向肿瘤的优势。
三、本发明提供的肿瘤微环境触发释药的壳聚糖载体水溶性极高，可在水中自发形成纳米胶束，对水难溶性药物具有极高的负载能力，例如，对紫杉醇的负载高达31.8％(w/w)，对藤黄酸的负载高达33.0％(w/w)，对羟基喜树碱的负载高达29.6％(w/w)对环孢素A的负载高达26.4％(w/w)，对水飞蓟素的负载高达25.2％(w/w)对伊曲康唑的负载高达23.8％(w/w)等。
四、本发明提供的透明质酸修饰的肿瘤微环境触发释药的壳聚糖胶束可用于注射、口服途径给药。该胶束具有高度安全性，粒径可控制在10～1000nm。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1：透明质酸修饰的羟乙基壳聚糖-正辛胺还原敏感共聚物的制备
将1.000g壳聚糖溶于2％醋酸水溶液中，分批加入50％的NaOH溶液，40℃碱化12h，冰浴条件下，分批加入适量环氧乙烷，0℃反应2～4h，升温至35～50℃继续反应24h，浓盐酸调节pH值6～8，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到羟乙基壳聚糖。
将0.300g羟乙基壳聚糖溶于水和甲醇(v/v＝1∶1)的混合溶中，将0.600g 3，3′-二硫代二丙酸溶于甲醇溶液中，加入0.547g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.328g羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化0.5～1h后缓慢滴入羟乙基壳聚糖水溶液中，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到游离一端为羧基的壳聚糖中间体。
将0.020g的正辛胺溶于甲醇溶液，将0.100g壳聚糖中间体溶于水和甲醇(v/v＝1∶1)的混合溶中，加入0.030g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.017g羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化0.5～1h后缓慢滴入正辛胺甲醇溶液，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到具有肿瘤微环境触发释药的壳聚糖载药载体。
将30mg壳聚糖衍生物载体溶于水中，两亲性载体会自组装成胶束，涡旋条件下，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体w/w＝3∶1)水溶液，静置一段时间，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
实施例2：透明质酸修饰的羧甲基壳聚糖-正辛酸还原敏感共聚物的制备
将1.000g壳聚糖溶于异丙醇溶液中，分批加入50％的NaOH溶液，40℃碱化12h，加入6.000g氯乙酸，40℃反应24h，倾去上清液，加入适量水，使之成为澄清透明的黄色溶液。浓盐酸调节pH值6～8，甲醇分散，抽滤，滤饼用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到羧甲基壳聚糖。
将0.300g羧甲基壳聚糖溶于水中，将0.500g 3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸溶于甲醇溶液中，加入0.547g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.328g羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化0.5～1h后缓慢滴入羟乙基壳聚糖水溶液中，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到游离一端为氨基的壳聚糖中间体。
将0.100g壳聚糖中间体溶于水和甲醇(v/v＝1∶1)的混合溶中，将0.018g正辛酸溶于甲醇溶液，加入0.030g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.017g羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化0.5～1h后，缓慢滴入到壳聚糖中间体溶液中，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到具有肿瘤微环境触发释药的壳聚糖载药载体。
将30mg壳聚糖衍生物载体溶于水中，两亲性载体会自组装成胶束，涡旋条件下，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体质量比w/w＝3∶1)水溶液，静置一段时间，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
实施例3：透明质酸修饰的羟乙基壳聚糖-胆酸还原敏感共聚物的制备
将1.000g壳聚糖溶于2％醋酸水溶液中，加入适量50％的NaOH溶液，40℃碱化12h，冰浴条件下，分批加入适量环氧乙烷，0℃反应2～4h，升温至35～50℃继续反应24h，浓盐酸调节pH值6～8，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到羟乙基壳聚糖。
将0.300g羟乙基壳聚糖溶于水和甲醇(v/v＝1∶1)的混合溶中，将0.500g 3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸溶于甲醇溶液中，加入0.547g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.328g羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化0.5～1h后缓慢滴入羟乙基壳聚糖水溶液中，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到游离一端为羧基的壳聚糖中间体。
将0.100g壳聚糖中间体溶于水和二甲基亚砜(v/v＝1∶1)的混合溶剂中，将0.060g胆酸溶于二甲基亚砜溶液中，加入0.030g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.017g羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化0.5～1h后，缓慢滴入到壳聚糖水溶液中，常温反应24h，使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析(MWCO＝14000)48～72h，冻干得到具有肿瘤微环境触发释药的壳聚糖载药载体。
将30mg壳聚糖衍生物载体溶于水中，两亲性载体会自组装成胶束，涡旋条件下，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体w/w＝3∶1)水溶液，静置一段时间，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
实施例4：透明质酸修饰的肿瘤微环境触发释药的壳聚糖衍生物胶束的制备和表征
1、壳聚糖衍生物胶束的制备：壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤，即得。
2、自组装胶束临界胶束浓度(CMC)的测定：胶束的临界胶束(CMC)是指两亲性分子在溶剂中发生聚集缔形成胶束的最低浓度。采用最为灵敏的荧光探针法测定CMC。芘是一种疏水性的稠环芳烃类化合物，在水中的溶解度极小，约为1.0×10-7mol/L，对环境极性的变化也非常敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液中不能形成胶束，此时微量的芘溶解在极性的水相中；当两亲性分子的浓度高于CMC时，可形成胶束结构，芘向胶束内核的疏水区域分配，而进入非极性环境，其荧光光谱会呈现一系列变化，如荧光强度增加，放射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure of the emission spectra)发生变化，激发光谱中(0，0)波段红移，从333nm移至338nm。因此，通过以芘的激发光谱中I338/I333比值(激发光谱中波长分别为338nm和333nm对应的荧光强度值)对两亲性物质的对数浓度作图即可得两亲性物质的CMC。
表1壳聚糖衍生物胶束的临界胶束浓度(CMC)的测定
3、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物胶束的制备：将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤，两亲性载体会自组装成胶束，涡旋条件下，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体质量比w/w＝3∶1)水溶液，静置2h，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
4、粒径：Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光测定样品粒径，结果见表1。
表2透明质酸修饰的壳聚糖衍生物胶束的粒径表征
实施例5：包含紫杉醇的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备和表征
1、制备工艺
一、壳聚糖衍生物载药胶束的制备
(1)探头超声法：
将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤。紫杉醇20mg溶解在无水乙醇溶液中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO＝3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心3000rpm 5～10min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(2)高压均质法：
将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤。紫杉醇20mg溶解在无水乙醇溶液中。然后二者溶液混合，高压均质，用透析袋(MWCO＝3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心3000rpm 5～10min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(3)溶剂挥发法
将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤。紫杉醇20mg溶解在无水乙醇溶液中。然后二者溶液混合，搅拌过夜，使无水乙醇挥发，离心3000rpm 5～10min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
二、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备
在上述壳聚糖衍生物载药胶束溶液中，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体质量比w/w＝3∶1)水溶液，静置2h，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
2、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束包载紫杉醇含量的测定。
采用高效液相色谱法-紫外检测法进行含量测定。色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水(70∶30，v/v)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为227nm，进样量为20μL。以公式(1)计算样品的载药量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光测定样品粒径。
实施例1～3载有紫杉醇的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束理化性质见表3。
表3载有紫杉醇的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束表征
实施例6：包含藤黄酸的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备和表征
1、制备工艺
一、壳聚糖衍生物载药胶束的制备
将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤。藤黄酸20mg溶解在无水乙醇溶液中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO＝3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心3000rpm 5～10min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
二、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备
在上述壳聚糖衍生物载药胶束溶液中，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体w/w＝3∶1)水溶液，静置2h，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
2、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束包载藤黄酸含量的测定。
采用高效液相色谱法-紫外检测法进行含量测定。色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水(93∶7，v/v)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为360nm，进样量为20μL。以公式(1)计算样品的载药量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光测定样品粒径。
实施例1～3载有藤黄酸的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束理化性质见表4。
表4载有藤黄酸的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束表征
实施例7：包含羟基喜树碱的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备和表征
1、制备工艺
一、壳聚糖衍生物载药胶束的制备
将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤。羟基喜树碱20mg溶解在二甲基亚砜溶液中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO＝3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心3000rpm 5～10min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
二、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备
在上述壳聚糖衍生物载药胶束溶液中，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体w/w＝3∶1)水溶液，静置2h，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
2、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束包载羟基喜树碱含量的测定。
采用高效液相色谱法-荧光检测法进行含量测定。色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为枸橼酸缓冲液-乙腈-75nmol/L磷酸二氢钾(70∶23∶7，v/v)，流速为1mL/min，柱温为30℃，荧光检测激发波长为360nm，发射波长为530nm，进样量为20μL。以公式(1)计算样品的载药量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光测定样品粒径。
实施例1～3载有羟基喜树碱的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束理化性质见表5。
表5载有羟基喜树碱的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束表征
实施例8：包含环孢素A的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备和表征
1、制备工艺
一、壳聚糖衍生物载药胶束的制备
将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤。环孢素A 20mg溶解在无水乙醇溶液中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO＝3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心3000rpm 5～10min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
二、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备
在上述壳聚糖衍生物载药胶束溶液中，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体w/w＝3∶1)水溶液，静置2h，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
2、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束包载环孢素A含量的测定。
采用高效液相色谱法-紫外检测法进行含量测定。色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-甲醇-水-异丙醇(900∶450∶50∶0.5，v/v)，流速为1mL/min，柱温为60℃，检测波长为225nm，进样量为20μL。以公式(1)计算样品的载药量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光测定样品粒径。
实施例1～3载有环孢素A的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束理化性质见表6。
表6载有环孢素A的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束表征
实施例9：包含水飞蓟素的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备和表征
1、制备工艺
一、壳聚糖衍生物载药胶束的制备
将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤。水飞蓟素20mg溶解在无水乙醇溶液中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO＝3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心3000rpm 5～10min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
二、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备
在上述壳聚糖衍生物载药胶束溶液中，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体w/w＝3∶1)水溶液，静置2h，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
2、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束包载水飞蓟素含量的测定。
采用高效液相色谱法-紫外检测法进行含量测定。色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相甲醇-0.1％甲酸(48∶52，v/v)，流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长为288nm，进样量为20μL。以公式(1)计算样品的载药量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光测定样品粒径。
实施例1～3载有水飞蓟素的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束理化性质见表7。
表7载有水飞蓟素的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束表征
实施例10：包含伊曲康唑的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备和表征
1、制备工艺
一、壳聚糖衍生物载药胶束的制备
将壳聚糖衍生物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤。伊曲康唑20mg溶解在无水乙醇溶液中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO＝3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心3000rpm 5～10min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
二、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束的制备
在上述壳聚糖衍生物载药胶束溶液中，加入透明质酸(透明质酸与壳聚糖衍生物载体w/w＝3∶1)水溶液，静置2h，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的壳聚糖衍生物胶束。
2、透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束包载环孢素A含量的测定。
采用高效液相色谱法-紫外检测法进行含量测定。色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相甲醇-水(75∶25，v/v)，流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长为263nm，进样量为20μL。以公式(1)计算样品的载药量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光测定样品粒径。
实施例1～3载有伊曲康唑的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束理化性质见表8。
表8载有伊曲康唑的透明质酸修饰的壳聚糖衍生物载药胶束表征

Claims (10)

1.一种透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于该载体是在壳聚糖骨架上首先引入亲水基团，然后通过含二硫键的可特异降解的连接臂引入疏水基团，使其具有两亲性，该两亲性衍生物在水性介质中可自组装为纳米胶束，该纳米胶束可有效荷载抗肿瘤药物，并进一步通过电荷吸附原理修饰以靶分子透明质酸，靶向到达肿瘤微环境后，透明质酸被病灶细胞内透明质酸酶降解，连接臂二硫键可被病灶细胞内高浓度还原性物质谷胱甘肽降解，从而导致药物快速从胶束中释放出来，作用于病灶部位，可显著提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度。
2.如权利要求1所述的一种透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体的结构如下列化学式所示：
其中GC为壳聚糖分子链，所述分子量在1×104～1×106，脱乙酰度＞75％；
R1为亲水基团，所述亲水基团选自羟乙基、羧甲基；
p为壳聚糖骨架上亲水基团R1取代度，所述亲水基团取代度为80～150％；
m+n为二硫键连接臂所含亚烷基个数，连接臂亚烷基个数为2～16；
R2为疏水基团，所述疏水基团选自C2～C18脂肪胺(酸、醇)、精氨酸、聚乙烯亚胺、硬脂酸、脱氧胆酸等；
q为壳聚糖骨架上疏水基团R2取代度，所述疏水基团取代度为0.5～20％；
HA为低分子量透明质酸，所述分子量1×103～1×104。
3.如权利要求1所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于壳聚糖是自然界唯一大量存在的高分子碱基多糖，其分子链上带有大量的活性氨基和羟基，易于化学修饰。透明质酸是一种天然聚阴离子多糖，且透明质酸能与能与肿瘤细胞表面CD44、RHAMM、HARE和LYVE-1受体特异性结合而被内吞至肿瘤细胞内，可以实现抗肿瘤药物的靶向递送。
4.如权利要求1所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于连接臂含有病灶部位特异性降解的二硫键，且两端的反应基团为氨基或羧基或一端反应基团为氨基另一端反应基团为羧基。壳聚糖分子与连接臂通过酰胺键相连，连接臂与疏水基团通过酰胺键或酯键相连。
5.如权利要求1所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于制备方法包括下列步骤：
(1)两亲性壳聚糖衍生物载体的制备：将壳聚糖溶于反应溶剂中，加入氯乙酸或环氧乙烷，制得亲水基团修饰的羧甲基壳聚糖或羟乙基壳聚糖。将亲水基团修饰的壳聚糖衍生物溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且两端含有羧基的连接臂，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂进行酰胺化反应，亲水性壳聚糖衍生物与含二硫键的连接臂的一端氨基反应得到中间体；将中间体和含有氨基(羟基)的疏水化合物溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂，含有氨基(羟基)的疏水化合物和中间体进行酰胺化或酯化反应，即得到具有肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载体。
(2)两亲性壳聚糖衍生物载体的制备：将壳聚糖溶于反应溶剂中，加入氯乙酸或环氧乙烷，制得亲水基团修饰的羧甲基壳聚糖或羟乙基壳聚糖。将亲水基团修饰的壳聚糖衍生物溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且一端含有氨基一端含有羧基的连接臂，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂进行酰胺化反应，亲水性壳聚糖衍生物与含二硫键的连接臂的一端氨基反应得到中间体；将中间体和含有羧基的疏水化合物溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为活化剂，含有羧基的疏水化合物和中间体进行酰胺化反应，即得到具有肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载体。
(3)透明质酸修饰的两亲性壳聚糖衍生物载体的制备：将具有肿瘤微环境触发释药的壳聚糖胶束溶于水中，加入一定比例的透明质酸水溶液，静置一段时间，即得到透明质酸修饰的的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体。
6.权利要求5所述的具有肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于所述反应溶剂为水、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲酰胺、水与甲醇的混合溶剂、水与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂、水与甲酰胺的混合溶剂，或N，N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶液。
7.权利要求5所述的具有肿瘤微环境触发释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于具有两亲性，在水介质中可自发形成纳米胶束。
8.权利要求5所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于所述反应溶剂为水。
9.权利要求1或5所述的透明质酸修饰的肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体，其特征在于可以用于血管内或者肌肉内注射或口服的带有药学活性或药理活性分子的载体。其中带有药学活性或药理活性分子选自：紫杉烷类、环孢素类、叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、黄酮类、喜树碱类、二氢吡啶类、长春碱类、小檗碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类抗肿瘤药物的任意一项。
10.权利要求9所述的应用，肿瘤微环境特异性释药的两亲性壳聚糖衍生物载体与水按重量比为1～50∶1000的比例溶解，得到壳聚糖聚合物纳米胶束，将治疗有效量的带有药学活性或药理活性分子用药学上可接受溶剂溶解后，与所述聚糖聚合物纳米胶束溶液混合，经超声或高压均质处理，溶液用透析法除去非水溶剂和小分子，加入一定比例的透明质酸水溶液，静置一段时间，冻干制得粒径为10～1000nm的载药纳米粒。
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