CN116496430B - 一种两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米生物医学技术领域，具体是一种两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物及其制备和应用。两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物结构式如式（1）所示，取代基详见说明书。本发明反应高效，操作步骤简单易行，所需设备及原料易得。研究表明以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束具有良好的生物相容性，对抗肿瘤药物呈现较高的包载能力和氧化还原响应性释放行为，是一种应用价值良好的载体。式（1）。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医学技术领域，具体是一种两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物及其制备方法和在纳米载体中的应用。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)是由甲壳素经过脱乙酰化得到的碱性多糖，作为一种可再生、无毒副作用，生物相容性和降解性良好的多糖，具有很多独特的生理、药理功能性质，因此，壳聚糖在自组装纳米给药系统领域有极大地应用潜力。壳聚糖本身具有一定的亲水性，但是缺乏亲脂性结构无法形成核-壳结构的纳米胶束，壳聚糖本身含有可作为化学修饰位点的氨基和羟基基团，可通过高效化学修饰手段引入疏水基团得到两亲性化合物，进而制备成纳米载体。但是目前以低分子量壳聚糖（平均聚合度n取值范围是20-60）为原料制备两亲性化合物的难度较大、效率较低、报道较少，因此本专利申请以低分子量壳聚糖（平均聚合度n取值范围是20-60）为载体兼亲水基团，通过含有二硫键的胱胺基团引入疏水基团（脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺）合成具有氧化还原响应的两亲性化合物，进一步制备氧化还原响应性纳米胶束。
发明内容
本发明目的是提供一种可作为疏水性化疗药物载体的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物，两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物结构式如式（1）所示，式（1），其中R为/>，X为CH2或NH，R1为C1-C22的烷基或/>，b=0~20，平均聚合度n取值范围是20-60。
一种两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备方法：
首先N,N'-羰基二咪唑活化壳聚糖分子上的氨基，而后直接与胱胺二盐酸盐反应得到壳聚糖胱胺接枝衍生物，所得到的壳聚糖胱胺接枝衍生物在N,N'-羰基二咪唑活化下再与脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺反应即得式（1）所示产物两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物。
所述N,N'-羰基二咪唑的摩尔量为壳聚糖摩尔量的2.0-5.0倍；胱胺二盐酸盐的摩尔量为壳聚糖摩尔量的2.0-5.0倍；脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺的摩尔量为壳聚糖胱胺接枝衍生物摩尔量的2.0-5.0倍。
进一步，将N,N'-羰基二咪唑加入到壳聚糖的二甲亚砜或N-甲基吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺溶液中混匀，并于氮气氛围中，40-80℃下反应12-48 h，反应所得溶液备用。胱胺二盐酸盐溶于过量的二甲基亚砜中，然后滴入上述所得的溶液，在40-80℃条件下继续反应12-48 h，反应结束冷却至室温后，用过量的乙醇沉淀，洗涤冷却干燥后，即得到壳聚糖胱胺接枝衍生物，待用。
将所述壳聚糖胱胺接枝衍生物在N,N'-羰基二咪唑活化下再与脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺反应，并于氮气氛围中，40-80℃下反应12-48 h，而后用过量的丙酮沉淀，乙醇洗涤，冷冻干燥，即得式（1）所示的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物。
一种两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的应用，以所述式（1）所示两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束在药物载体中的应用。
本发明所具有的优点：
（1）本发明以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束过程简单高效、所需设备及原料易得、成本较低，而且所制备的纳米胶束安全无毒、生物相容性良好，适合应用于生物医药领域。
（2）本发明以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束具有良好的包载能力。
（3）本发明以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束具氧化还原响应性，可将疏水性化疗药物被动靶向肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽（GSH）环境下解体，可实现化疗药物在肿瘤细胞内的快速释放，提高化疗药物的疗效，是一种应用价值良好的载体。
附图说明
图1为壳聚糖的红外光谱图。
图2为本发明实施例提供的壳聚糖胱胺接枝衍生物的红外光谱图，1708和1661cm-1为羰基的吸收峰，证明壳聚糖胱胺接枝衍生物的成功合成。
图3为本发明实施例提供的含辛烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的红外光谱图，与图2壳聚糖胱胺接枝衍生物相比较可知，2926、2853 cm-1为辛胺烷基链的吸收峰，证明含辛烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的成功合成。
图4为本发明实施例提供的含十二烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物红外光谱图，与图3含辛烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物相比可知，烷基链吸收峰（2925、2854 cm-1）明显增强，证明含十二烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的成功合成。
图5为本发明实施例提供的含十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物红外光谱图，与图4含十二烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物相比可知，烷基链吸收峰（2923、2853 cm-1）进一步增强，进一步证明含十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的成功合成。
图6为以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束溶血实验结果图。
图7为以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备载药纳米胶束体外释放实验，** p<0.01 表示在pH=5.5+GSH条件下，载药胶束Z中阿霉素的累计释放量明显高于载药胶束X中阿霉素的累计释放量，且具有明显统计学差异。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的解释说明。
本发明通过引入胱胺和脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺合成氧化还原响应型两亲性化合物，两亲性化合物同时含有亲水和疏水链，可自组装成氧化还原响应型纳米胶束；本发明制备的两亲性化合物步骤简单易行，以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束具有良好的生物相容性，对抗肿瘤药物呈现较高的包载能力和氧化还原响应性释放行为，是一种应用价值良好的载体。
具体：
首先用N,N'-羰基二咪唑活化壳聚糖分子上的氨基，而后直接与胱胺二盐酸盐反应得到壳聚糖胱胺接枝衍生物，所得到的壳聚糖胱胺接枝衍生物在N,N'-羰基二咪唑活化下再与脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺反应即得式（1）所示产物两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物。
以上所得的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束是一种应用价值良好的药物载体，所制备的载药纳米胶束可被动靶向肿瘤细胞并在肿瘤细胞内快速释放药物，实现高效释药，提高了化疗药物的临床疗效。
两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物合成路线如下：
取代基记载与上述一致。
实施例1
本实施例按以上合成路线合成目标化合物两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物。
1）壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备：称取6.44 g (40 mmol) 壳聚糖（参见图1）加入到40 mL的二甲基亚砜溶液中，而后加入12.96 g (80 mmol)N,N'-羰基二咪唑，搅拌30 min后，在氮气保护下，60℃下反应12 h，得到溶液A。称取18.57 g (80 mmol) 胱胺二盐酸盐溶于60 mL二甲基亚砜中得到溶液B，而后将溶液A缓慢加入到溶液B中，在氮气保护下，60℃条件下搅拌反应24 h。而后用过量乙醇沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到壳聚糖胱胺接枝衍生物6.01 g（参见图2），备用。
2）两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备:取3份2.03 g (6 mmol) 上述获得壳聚糖胱胺接枝衍生物分别溶解到20 mL 二甲基亚砜中，而后分别加入0.972 g (6 mmol)N,N'-羰基二咪唑，并在氮气保护下，60℃下反应12 h，得到溶液A。称取1.57 g (12 mmol) 辛胺、2.28 g (12 mmol) 十二胺和3.22 g (12 mmol) 十六胺分别溶于6 mLN,N'-二甲基甲酰胺中得到溶液B，而后将溶液B缓慢加入到溶液A中，在氮气保护下60℃反应24 h。反应结束后，用丙酮沉淀，乙醇洗涤，真空冷冻干燥，即得含辛烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.23 g；含十二烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.35 g；含十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.49 g（参见图3-5）。
实施例2
1）壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备：称取6.44 g (40 mmol) 壳聚糖（参见图1）加入到40 mL的二甲基亚砜溶液中，而后加入16.2 g (100 mmol)N,N'-羰基二咪唑，搅拌40 min后，在氮气保护下，70℃下反应18 h，得到溶液A。称取23.22 g (100 mmol) 胱胺二盐酸盐溶于60 mL二甲基亚砜中得到溶液B，而后将溶液A缓慢加入到溶液B中，在氮气保护下，70℃条件下搅拌反应36 h。而后用过量乙醇沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到壳聚糖胱胺接枝衍生物6.35 g（参见图2），备用。
2）两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备:取3份2.03 g (6 mmol) 上述获得壳聚糖胱胺接枝衍生物分别溶解到20 mL 二甲基亚砜中，而后分别加入1.458 g (9 mmol)N,N'-羰基二咪唑，并在氮气保护下，70℃下反应18 h，得到溶液A。称取1.95 g (15 mmol) 辛胺、2.84 g (15 mmol) 十二胺和4.02 g (15 mmol) 十六胺分别溶于6 mLN,N'-二甲基甲酰胺中得到溶液B，而后将溶液B缓慢加入到溶液A中，在氮气保护下70℃反应36 h。反应结束后，用丙酮沉淀，乙醇洗涤，真空冷冻干燥，即得含辛烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.34 g；即得含十二烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.45 g；即得含十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.56 g（参见图3-5）。
实施例3
1）壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备：称取6.44 g (40 mmol) 壳聚糖（参见图1）加入到40 mL的二甲基亚砜溶液中，而后加入19.44 g (120 mmol)N,N'-羰基二咪唑，搅拌60min后，在氮气保护下，80℃下反应24 h，得到溶液A。称取27.87 g (120 mmol) 胱胺二盐酸盐溶于60 mL二甲基亚砜中得到溶液B，而后将溶液A缓慢加入到溶液B中，在氮气保护下，80℃条件下搅拌反应48 h。而后用过量乙醇沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到壳聚糖胱胺接枝衍生物7.15 g（参见图2），备用。
2）两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备:取3份2.03 g (6 mmol) 上述获得壳聚糖胱胺接枝衍生物分别溶解到20 mL 二甲基亚砜中，而后分别加入1.944 g (12 mmol)N,N'-羰基二咪唑，并在氮气保护下，80℃下反应24 h，得到溶液A。称取2.34 g (18 mmol) 辛胺、3.41 g (18 mmol) 十二胺和4.83 g (18 mmol) 十六胺分别溶于6 mLN,N'-二甲基甲酰胺中得到溶液B，而后将溶液B缓慢加入到溶液A中，在氮气保护下80℃反应48 h。反应结束后，用丙酮沉淀，乙醇洗涤，真空冷冻干燥，即得含辛烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.49 g；即得含十二烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.62 g；即得含十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物1.78 g（参见图3-5）。
应用例1
以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束
（1）采用透析/超声法制备纳米胶束。将实施例1的含辛烷/十二烷/十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物分别溶于二甲基亚砜中，浓度为2 mg/mL，然后将溶液转入透析袋中(Mwco=100)，室温条件下在水中透析24 h，透析完毕，将透析液置于探头超声仪(135 W)超声(30 min),即得到对应的氧化还原响应型纳米胶束。以含辛烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束为纳米胶束X; 以含十二烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束为纳米胶束Y; 以含十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束为纳米胶束Z。
（2）对两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束进行表征
采用动态光散射法（DLS）对上述（1）所得的氧化还原响应型胶束X、Y和 Z进行表征。分别取1 mL 上述（1）制备纳米胶束X、Y和Z置于比色皿中，在Litesizer 500 纳米粒度测量仪中测量粒径、电位和PDI值；
实验结果：本发明实施例1合成的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束X、Y和Z的表征如表1所示，本发明以两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束X、Y和Z的粒径分别为147.95±1.87nm、118.24± 0.83 nm和 101.47 ± 0.41 nm，其粒径均小于500 nm可避免血液系统的清除，可更好的被病灶区细胞吞噬进而入胞发挥药效；PDI均小于30，说明所制备的纳米胶束分布均匀；电位均为正值，这与壳聚糖正电荷密切相关。
表1，实施例1所制备纳米胶束的粒径、PDI和电位测试结果
（3）对利用实施例1合成的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束进行安全性评价。
步骤如下：首先取健康家兔血液5 mL，2500 rpm离心10 min后弃去上清液血浆，加入生理盐水混匀，再次以相同的条件离心。该操作重复三遍,直至上清液无色，加入生理盐水获取浓度为2%的红细胞悬液。以生理盐水为溶剂，将利用实施例1制备的纳米胶束（X、Y和Z）配制成2.0，1.5，1.0，0.5mg/mL，同时设定蒸馏水和生理盐水分别作为阳性和阴性对照组，将所有加入试剂的试管置于37℃恒温水箱中进行水浴1h，然后样品经4000rpm转速离心10 min，离心结束后取上清液，利用紫外分光光度计于541 nm处测定吸光度（参见图6），按以下公式式计算：
溶血率＝(A样品-A阴)/(A阳-A阴)×100％
其中，A样品，A阳，A阴分别表示待测样品，蒸馏水和生理盐水组的吸光度值。
实验结果：本发明实施例1合成的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束生物安全性评价如图6所示，利用实施例1合成的两亲性化合物所制备纳米胶束X、Y和Z溶血率均低于5%，可以说明纳米胶束X、Y和Z对红细胞无明显干扰，具有良好的体内应用的潜力。
（4）对利用实施例1合成的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束的包封率与载药量的测定。
具体步骤：称取20 mg实施例1的产物（含辛烷/十二烷/十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物）溶于二甲基亚砜中，浓度为2 mg/mL，然后将溶液转入透析袋中(Mwco=100)，室温条件下在水中透析12 h，透析完后备用，即得到对应的氧化还原响应型纳米胶束。以含辛烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束为纳米胶束X; 以含十二烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束为纳米胶束Y; 以含十六烷两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的纳米胶束为纳米胶束Z。将67 uL（15mg/mL）阿霉素/二甲基亚砜溶液缓慢滴加至上述化合物水溶液，在135 W功率条件下用探头超声处理20 min,超声结束后，将所得溶液12000rpm离心30 min，取上清液用紫外分光光度法在484 nm处测定吸收度,按以下公式式计算载药纳米胶束的包封率与载药量。
包封率＝(药物总量-游离药)/药物总量×100％
载药量＝(药物总量-游离药)/(载体+药物总量)×100％
表2，实施例1所制备纳米胶束包封率与载药量测定结果
实验结果：本发明实施例1合成的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备纳米胶束的包封能力如表2所示，可见实施例1合成的两亲性化合物制备纳米胶束X、Y和Z对化疗药物有较好的包载能力。
（5）对利用实施例1合成的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的载药纳米胶束体外释药性能的考察。具体步骤：移取适量上述步骤4所制备的载药纳米粒溶液（约含0.7 mg阿霉素）于透析袋（Mwco=8000-12000 Da，同时取等量阿霉素溶于PBS溶液作为对照组，透析袋两端夹紧后，对照组置于150 mL缓冲液（pH = 5.5），载药纳米粒置于150 mL释放介质中（pH=5.5缓冲液和pH=5.5+10mmolGSH缓冲液），在37℃，100rpm水浴条件下振荡，定时取样3mL，并补充等体积释放介质。测定各样品在484 nm处的吸收度（参见图7）。
实验结果：本发明实施例1合成的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物制备的载药纳米胶束体外释药性能如图7所示，游离阿霉素在释放介质中呈现“突释”现象，24 h基本完全释放；与游离阿霉素相比，将阿霉素包载于利用实施例1制备的纳米胶束X、Y和Z中释放速率明显减低，呈现“缓释”现象；而载药纳米胶束中的阿霉素在10 mM的GSH条件下释放速率明显提高，这说明实施例1制备的纳米胶束X、Y和Z具有“氧化还原响应性”，因而在到达肿瘤组织后能快速的释放阿霉素，以杀死肿瘤细胞。
Claims (5)
1.一种两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物，其特征在于：两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物结构式如式（1）所示，式（1），其中R为/>，X为CH2或NH，R1为C1-C22的烷基或/>，b=0~20，平均聚合度n取值范围是20-60。
2.一种权利要求1所述的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备方法，其特征在于：首先N,N'-羰基二咪唑活化壳聚糖分子上的氨基，而后直接与胱胺二盐酸盐反应得到壳聚糖胱胺接枝衍生物，所得到的壳聚糖胱胺接枝衍生物再经N,N'-羰基二咪唑活化，与脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺反应即得式（1）所示产物两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物；
所述每次活化时N,N'-羰基二咪唑的摩尔量为壳聚糖摩尔量的2.0-5.0倍；胱胺二盐酸盐的摩尔量为壳聚糖摩尔量的2.0-5.0倍；脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺的摩尔量为壳聚糖胱胺接枝衍生物摩尔量的2.0-5.0倍。
3. 按权利要求2所述的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备方法，其特征在于：将N,N'-羰基二咪唑加入到含壳聚糖的二甲亚砜中混匀，并于氮气氛围中，40-80℃下反应12-48h，反应所得溶液备用；胱胺二盐酸盐溶于过量的二甲基亚砜中，然后滴入上述溶液，在40-80℃条件下继续反应12-48 h，反应结束冷却至室温后，用过量的乙醇沉淀，洗涤冷却干燥后，即得到壳聚糖胱胺接枝衍生物，待用。
4. 按权利要求2或3所述的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖胱胺接枝衍生物在N,N'-羰基二咪唑活化下再与脂肪族羧酸或芳香族羧酸或脂肪胺或芳香胺，于氮气氛围中，40-80℃下反应12-48 h，而后用过量的丙酮沉淀，乙醇洗涤，冷冻干燥，即得式（1）所示的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物。
5.一种权利要求1所述的两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物的应用，其特征在于：所述式（1）所示两亲性壳聚糖胱胺接枝衍生物在制备纳米胶束用于制备药物载体中的应用。
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