CN104592522B - 一种可降解的酸敏型聚天冬酰胺共聚物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可降解的酸敏型聚天冬酰胺共聚物的合成及作为药物和基因共传输纳米粒子的制备方法。本发明的亲疏水段分别由多乙烯亚胺接枝的聚天冬氨酸和缩醛化葡聚糖组成，对应的分子量比为1:1~10。本发明的制备方法是先将葡聚糖经过缩醛化反应，而后与端叠氮的聚天冬氨酸苄酯结合，通过苄酯的胺解反应键接多乙烯亚胺，制备出同时具有酸敏特性与降解性能的缩醛化葡聚糖‑多乙烯亚胺接枝聚天冬氨酸衍生物。本发明的聚合物可以通过双乳化的方式形成粒径均一且稳定的纳米粒子，可联合负载药物和基因并靶向性同时输送到肿瘤细胞，达到肿瘤化疗和基因治疗的协同效果，在肿瘤的治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

一种可降解的酸敏型聚天冬酰胺共聚物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种共聚物，更具体地，涉及一种可降解的酸敏型聚天冬酰胺共聚物及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤的产生是多种原因长期作用的结果，而非瞬时爆发，而最有希望用于临床的基因治疗很大程度只是针对一种变异基因产生效果，远远不能满足现今对肿瘤治疗的需求，因此通过多种治疗方式的协同作用，改进单一治疗的不足，发挥多种治疗的协同作用，有望明显改善肿瘤的治疗效果。目前已经在临床上使用的主要是多种药物的联合治疗，此种方式虽然在一定程度上降低了给药剂量，增加了疗效，但是如果机体产生生理反应，很难准确判定是由于那种药物产生作用，增加了治疗的难度。

将新兴的基因治疗和传统的化学治疗联合，一方面通过给予特定的基因，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，降低化疗药物的剂量，减少毒副作用以及多药耐药的产生；另一方面化疗药物具有增强基因表达的效应，可诱导死亡受体的激活并进一步触发细胞凋亡。因此联合传递治疗基因与药物的肿瘤治疗方法不仅可以提高基因的转染效率而且增强了药物的治疗效果，降低了给药剂量，提高生物利用度，作为新兴的肿瘤治疗理念，被越来越多的人所关注，并以惊人的速度快速发展。但这种新型药物与基因的递送系统，存在着相当的复杂性与挑战性，药物的释放特别缓慢，在体外释放的120h仅有不到20％的药物释放出来，而基因作用的时间一般在72h之内，因此迫切需要将新的材料引入基因和药物的联合传输系统才能获得更好的药物和基因的协同治疗效果。

利用肿瘤部位特殊的生理环境释放药物或者基因的智能型聚合物载体引起了广泛的关注。肿瘤部位特殊的生理环境或者外加的刺激因子可将原先非活化的纳米粒子激活，增强其与细胞的相互作用，从而提高肿瘤细胞对纳米粒子的摄取；进入细胞后，胞内的生理环境(如较强的还原条件或较高的温度或较低的内涵体/溶酶体pH)可进一步促进包覆物从载体中释放以发挥功能。将这种智能型的基团引入到基因与药物联合传输体系，制备出敏感性双载体，有望克服目前双载体体系存在的一些问题。不过，目前都是将药物通过酸敏官能团键接于聚合物载体上，这种化学键接的方式不仅制备繁琐，而且破坏了药物结构，可能会使药效减低，因此如何设计合成高效、低毒的智能型聚合物载体是目前联合传输体系最需要解决的问题之一，由此对材料的革新迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于根据现有单一药物或基因治疗的不足，以及联合传输体系药物释放难以控制的问题，提供一种可联合传输基因与药物的并可促进负载药物定点释放的酸敏感高分子纳米药物载体材料。

首先提供一种可降解的酸敏型聚天冬酰胺共聚物，所述的共聚物的亲水段为多乙烯亚胺接枝的聚天冬氨酸，所述共聚物的疏水段为缩醛化葡聚糖。

所述的多乙烯亚胺接枝的聚天冬氨酸与缩醛化葡聚糖的分子量的比为1:1～10。

所述的多乙烯亚胺为直链型多乙烯亚胺，分子量为100～500g/mol。

所述聚天冬氨基酸为单体单元为带有活性侧基的L型天冬氨酸，所述的聚天冬氨酸的分子量为3602g/moL。

更进一步提供一种权上述的聚天冬酰胺共聚物的制备方法，包括以下步骤：

S1.端醛基葡聚糖与丙炔单反应，制备出端炔基葡聚糖，

S2.根据预期共聚物中疏水端缩醛化葡聚糖的分子量，将端炔基葡聚糖的羟基在规定时间内进行缩醛化反应，得到疏水性的缩醛化葡聚糖；

S3.端叠氮的丙胺引发L型天冬氨酸卞酯的N-羧酸酐开环聚合，制备端叠氮的聚天冬氨酸苄酯；

S4.利用点击化学反应，将S2的得到的疏水性的缩醛化葡聚糖和S3所得的端叠氮的聚天冬氨酸苄酯结合,得到缩醛化葡聚糖-聚天冬氨酸苄酯；

S5.通过胺解反应，将多乙烯亚胺连接到S4所得的缩醛化葡聚糖-聚天冬氨酸苄酯的聚氨基酸侧链，引入亲水基团多乙烯亚胺，得到最终产物缩醛化葡聚糖-多乙烯亚胺接枝聚天冬酰胺共聚物。

S2所述的缩醛化反应为用二甲氧基丙烯在吡啶对甲苯磺酸的作用下对端炔基葡聚糖的羟基进行缩醛化反应。

根据需求提供一种上述的酸敏型聚天冬酰胺共聚物在制备药物载体中的应用。

再提供一种药物载体，包含上述的酸敏型聚天冬酰胺共聚物。

为了进一步的说明本发明，进行以下解释：

一种可降解的酸敏感两亲性嵌段聚合物载体材料，其亲疏水段分别由多乙烯亚胺接枝的聚氨基酸衍生物和酸敏基团——缩醛化葡聚糖组成，对应嵌段比为1:1～10。具有生物可降解性和明显的敏感性；其酸敏基团是由2-甲氧基丙烯与葡聚糖上的羟基反应，将水溶性葡聚糖转变为疏水性缩醛化葡聚糖，该基团在pH为5～6之间又可水解得到原来的水溶性葡聚糖，不仅达到亲疏水性的快速转变，十分符合人体内微酸性环境的pH响应范围，而且具有优异的生物相容性。

本发明所涉及的可生物降解的高分子药物载体材料的疏水段是由葡聚糖的缩醛化反应制备得到。葡聚糖上羟基的缩醛化反应特别的迅速，不同的反应时间，缩醛化反应程度不同，开始反应主要以非成环为主，随着反应时间的延长，非成环结构向稳定的5元环结构转化，直至达到理论最大值。由于5元环结构的稳定性及酸性水解机理，非成环部分水解比较快，成环部分水解较慢。由此，通过简单的控制缩醛化反应时间，即可以控制缩醛化葡聚糖的水解时间，从而控制可降解的两亲性嵌段聚合物载体材料的水解时间，进而控制负载药物的释放时间，实现智能控释的效果。

这里选用直链型的多乙烯亚胺对聚天冬氨酸卞酯进行胺解反应，将端胺基多乙烯亚胺键链到聚天冬氨酸中，作为两亲性嵌段共聚物的亲水段。由于随着多乙烯亚胺分子量的增大，酯交换反应效率会下降，而且毒性也会随着增加，本发明选用分子量在100～500g/mol之间的多乙烯亚胺。而聚天冬氨酸的简单经典合成路线在众多氨基酸合成中具有极大优势，保证了整个体系便于合成制备。

利用点击化学反应，将缩醛化的端炔基的葡聚糖和端叠氮的聚天冬氨酸苄酯结合；通过胺解反应，将多乙烯亚胺连接到聚天冬氨酸酸侧链，引入亲水基团，得到最终产物缩醛化葡聚糖-多乙烯亚胺接枝聚天冬酰胺衍生物。阳离子段多乙烯亚胺可以通过物理的静电吸附作用复合质粒DNA，缩醛化葡聚糖作为疏水端包覆疏水性药物阿霉素，达到将基因和药物联合传输的功能，同时缩醛基团的酸敏响应更能提供对药物分子的智能控制。

作为一种优选方案，所述葡聚糖的分子量小于20000g/mol，且为1→6键连接。

作为一种优选方案，所述酸敏基团为葡聚糖中的羟基发生缩醛化反应得到的缩醛基团。

作为一种优选方案，所述多乙烯亚胺的分子量为100～500g/mol，且为直链型多乙烯亚胺。

作为一种优选方案，所述聚天冬氨基酸为单体单元为带有活性侧基的L型天冬氨酸。

高分子两亲性嵌段共聚物经过超声乳化的方式包覆疏水性药物，制备方法如下：将5～10份的共聚物与1份的疏水性药物共溶于1体积的二氯甲烷和氯仿10:1的混合溶液中，取0.5体积的纯水作为内水相，在水浴超声条件下滴加到此混合溶剂中形成初乳溶液，而后将初乳体系在超声作用下于冰浴中滴加到2.5～10体积的水中，形成水/油/水(W/O/W)复合体系，搅拌挥发除去有机相得到混合液体，然后将该混合液装入MWCO 14KDa的透析袋中在pH为7～8的水中透析1至3天收集得到载药纳米粒子；对于酸敏感药物(例如盐酸阿霉素，可简写为DOX)需在溶解时加1体积三乙胺保证其疏水性。

高分子两亲性嵌段共聚物经过超声乳化形成纳米粒子时可同时负载质粒DNA与药物，制备方法如下：将5～10份共聚物与1份的疏水性药物共溶于1体积的二氯甲烷和氯仿10:1的混合溶液中，取含有质粒DNA为0.01-2g(N/P比从1～70之间，计算得到的DNA质量)的0.5体积的纯水作为内水相，在水浴超声条件下滴加到此混合溶剂中形成初乳溶液，而后将初乳体系在超声作用下于冰浴中滴加到2.5～10体积的水中，形成水/油/水(W/O/W)复合体系，搅拌挥发除去有机相得到混合液体，然后将该混合液装入MWCO14KDa的透析袋中在pH为7～8的水中透析1至3天收集得到载药纳米粒子；对于酸敏感药物需在溶解时加1体积三乙胺保证其疏水性。

本发明的优点在于：

1.本发明高分子两亲性嵌段共聚物可在中性或弱碱性水中通过超声乳化的方式形成纳米粒子，并在此过程中负载药物和质粒DNA。反应性酸敏内核在酸性条件下迅速由疏水性变为亲水性，快速释放药物和DNA，提高药物的生物利用度，达到高效治疗的目的。

2.本发明两亲性嵌段聚合物载体材料是对可生物降解的天然葡聚糖与天冬氨酸进行修饰制得，在酸性条件下的最终水解产物为葡聚糖、微量丙酮及甲醇、氨基酸，无毒且具有优良的生物相容性。

3.本发明可降解的酸敏感两亲性嵌段聚物载体材料的水解时间可随着缩醛化反应时间的长短而定，从而达到对水解时间的控制，进而控制药物的释放时间。

4.本发明可降解的酸敏感两亲性嵌段聚合物载体材料能够通过双乳化的方式在水中形成纳米粒子，既可以单独包载疏水性药物，而且可以联合负载药物和质粒DNA，通过联合传输治疗基因与化疗药物，有望达到基因治疗与肿瘤化疗协同治疗的效果，改进目前单一治疗手段的不足。

5.本发明可降解的酸敏感两亲性嵌段聚合物载体材料是将药物与质粒DNA包覆于载体材料其中，而非化学键衔接，维持了药物与质粒DNA的活性以及疗效。

6.本发明可降解的酸敏感两亲性嵌段聚合物载体材所形成的的纳米结构，在酸性条件下可以发生亲疏水性能的改变，引起酸敏激发的DNA和药物快速释放，实现对药物的智能控释。

7.本发明的可降解的酸敏感高分子两亲性嵌段聚物载体材料还可以通过在胺解过程中引入靶向配体来实现药物与质粒DNA的定点靶向释放。

附图说明

由下面的实施例对于其进行附图说明。

图1为缩醛化葡聚糖-二乙烯三胺接枝聚天冬氨酸共聚物(可简写为AC-DEX-PAsp(DET)-CD)在DMSO-d₆的氢谱图。

图2为AC-DEX-PAsp(DET)-CD在重水中的氢谱图。

图3为实施例2.2中AC-DEX-PAsp(DET)-CD，其中所用葡聚糖分子量为5000g/mol，聚天冬氨酸的分子量约为3602g/mol，17个重复单元中全部接入二乙烯三胺DETA基团)载药纳米粒子在水溶液中的粒径分布图A(即动态光散射柱状图)和透射电子显微镜图片B。

图4为AC-DEX-PAsp(DET)-CD阳离子酸敏感聚合物与质粒DNA在不同N/P下的琼脂糖凝胶图示。

图5为AC-DEX-PAsp(DET)-CD阳离子酸敏感聚合物与质粒DNA在不同N/P下的复合物在马尔文纳米粒度及电位分析仪中的电位与粒径变化趋势图示。

图6为AC-DEX-PAsp(DET)-CD阳离子酸敏感聚合物与质粒DNA在N/P＝42下的复合物在水溶液中的粒径分布图A(即动态光散射柱状图)和透射电子显微镜图片B。

图7为AC-DEX-PAsp(DET)-CD阳离子酸敏感聚合物形成的载药纳米粒子A与双载纳米粒子B在pH5.0和pH7.4两个不同pH值下荧光分光光度计检测DOX的酸敏释放行为。

图8为AC-DEX-PAsp(DET)-CD阳离子酸敏感聚合物形成的载药纳米粒子A与双载纳米粒子B在pH5.0和pH7.4两个不同pH值下DOX的体外释放曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

本发明提供了可生物降解的酸敏感聚合物的制备，以及负载药物与联合负载基因和药物的制备方法。通过1H NMR、GPC和傅里叶红外光谱对该新型聚合物载体的组成和结构进行化学表征。采用双乳化法制备纳米粒子，用马尔文粒度仪及透射电镜对粒子的粒径、表面电位及形貌进行判定。荧光分光光度计与紫外分光光度计测定载有模型药物阿霉素的酸敏释放行为。

实施例1：可生物降解的酸敏感两亲性嵌段共聚物的制备

1.1L-型天冬氨酸苄酯的N-羧酸酐的制备：

将L-天冬氨酸苄酯(5.7g)真空干燥至少2小时后，加入200mL的乙酸乙酯，于90℃下加热回流0.5h。另称取三光气固体(2.93g)用60mL的乙酸乙酯溶解，然后将溶液缓慢滴加至L-天冬氨酸卞酯的溶液中，充分搅拌直至澄清。所有操作均在干燥氩气的保护下进行。停止加热，在500mL的分液漏斗中用饱和的碳酸氢钠溶液洗2～3次以除去过量的三光气，加入饱和的氯化钠破乳，使溶液变得澄清。将反应液倒入装有无水硫酸镁的500mL的锥形瓶中，干燥进行半小时以上除水，干燥完毕，过滤，浓缩至100mL。将得到反应液倒入过量的无水石油醚中，充分摇振至有结晶析出，再于低温下冷冻静置两天，经抽滤和多次洗涤得白色针状结晶。所得产品真空干燥后充干燥氩气冷冻保存。

1.2端叠氮聚天冬氨酸卞酯的制备：

在无水无氧条件下称取天冬氨酸-NCA(12mmol)于Schlenk瓶中，加入40mL的N,N二甲基甲酰胺搅拌使其溶解，10min之后在氩气氛下加入端叠氮的丙胺(0.4mmol)，40℃下搅拌反应，72h之后沉于乙醚，过滤，收集沉淀，真空干燥得到样品。

1.3缩醛化葡聚糖的制备：

称取葡聚糖(3g)于50℃条件下溶于150mL的醋酸缓冲溶液，待反应液变为完全透明之后，依次加入丙炔胺(3.3g)和氰基硼氢化钠(0.946g)。持续搅拌，并每天加入一定量的氰基硼氢化钠。反应进行96h之后，旋转蒸发除去大部分水，透析冻干得白色固体粉末1.98g，制得端炔基葡聚糖，备用。

对反应瓶进行无水无氧处理，而后将0.5g的炔基葡聚糖溶于10mL的二甲基亚砜溶液中，在氮气保护下依次加入吡啶对甲苯磺酸(0.042g)和2-甲氧基丙烯(1.765mL)，室温下搅拌反应一段时间，加入三乙胺终止反应，所的产物沉于pH＝8.0的纯水中并静置一段时间，而后离心，涡旋，收集沉淀冻干即得产物，通过核磁计算分子量及反应程度。

1.4两亲性嵌段共聚物的制备：

在手套箱中称取端炔基缩醛化葡聚糖(0.6492g)和端叠氮的聚天冬氨酸(0.412g)溶于10mL的二甲基亚砜中，而后称取溴化亚铜(0.0154g)于一次性的塑料小管中，并加入其配体五甲基二乙烯三胺(180L)，用二甲基亚砜溶解稀释使其混合均匀，手动摇晃塑料小管2-3min，使溴化亚铜/五甲基二乙烯三胺充分混合形成配体，此时溶液呈现墨绿色，最后将其加入到端炔基的缩醛化葡聚糖和端叠氮的聚天冬氨酸的二甲基亚砜溶液中，室温搅拌反应。72h之后将其拿出手套箱，用透析的方式将二甲基亚砜溶液转换为氯仿，滴入乙醚中沉淀，过滤，收集沉淀抽干即可样品点击产物，称重备用。

1.5胺解脱保护连接二乙烯三胺：

称取点击产物(1.1329g)溶于3mL已干燥好的N,N二甲基甲酰中，而后用冰盐浴冷却至0℃。在另一个圆底烧瓶中，加入11.5mL的二乙烯三胺，而后用23mL干燥好的N,N二甲基甲酰稀释溶解，搅拌，同样用冰盐浴冷却至0℃。待所有的反应瓶内温度达到预定温度之后，用恒压滴定管将点击产物溶液逐滴加入到二乙烯三胺的溶液中，持续搅拌反应一段时间，大约1.5h之后停止反应，用1.4W的透析袋透析过夜，除去未反应的二乙烯三胺。最后冻干得到白色絮状物，得到最终产物缩醛化葡聚糖-二乙烯三胺接枝聚天冬酰胺共聚物(可简写为AC-DEX-PAsp(DET)-CD)。

实施例2：

聚合物纳米载体负载疏水性药物的制备以及基本性能测试

2.1聚合物纳米载体负载疏水性药物的制备：

将AC-DEX-PAsp(DET)-CD聚合物(2.5mg)和盐酸阿霉素(0.45mg)分别用1mL的二氯甲烷和100L的氯仿溶解，而后向盐酸阿霉素的氯仿溶液中加入4L的三乙胺调节成疏水性阿霉素，将两者混合均匀。取41L的纯水作为内水相，在水浴超声条件下滴加到此混合溶剂中，形成乳红色的水/油(W/O)初乳溶液。而后将初乳体系在探头超声条件下逐滴加入至6mL的外水相中，形成水/油/水(W/O/W)复合体系。最后将其转移至恒温磁力搅拌器中，于30℃搅拌3h除去有机相得到蓝紫色液体，用透析袋(MWCO:14KDa)透析24h除去过量的阿霉素，最后收集得到载药纳米粒子，备用。

2.2载药纳米粒子的形态测定

将制备好的载药纳米粒子，用超纯水稀释至1mg/mL，用马尔文电位粒度仪检测其电位和粒径分布，取三次测量值的平均值作为最终结果，所得载药纳米粒子的粒径为134.4±39.1nm，Zeta电位为22.2±2.2mV，而形态通过透射电子显微镜来观察确定，测试结果见图3，其中，从动态光散射柱状图A中可以看出阳离子聚合物载药纳米粒子与复合物纳米粒子的粒径分布均一，大约为134.4nm且无聚集现象及大颗粒产生，可维持纳米粒子在体内较长时间的停留。而载药纳米粒子的透射电镜图示B显示，所有的纳米粒子外观均呈现球形，且形态规整大小均一，在透射电镜下显示出载药纳米粒子的粒径为60nm，其粒径相对于动态光散射结果有相对差异，推断可能是缩醛化葡聚糖表面未反应的羟基提供了一些亲水性，导致结构不致密，在水液中会有一些膨胀，溶液中出现的粒径偏大。

实施例3：

聚合物AC-DEX-PAsp(DET)-CD纳米粒子同时负载疏水性药物和质粒DNA的制备及基本性能测试

3.1聚合物纳米粒子同时负载疏水性药物和质粒DNA的制备

聚合物AC-DEX-PAsp(DET)-CD(2.5mg)和盐酸阿霉素(0.45g)分别用1mL的二氯甲烷和100L的氯仿溶解，而后向盐酸阿霉素的氯仿溶液中加入4L的三乙胺将其调成疏水性阿霉素，最后将两者混合均匀。取一定量的DNA水溶液作为内水相(按照不同的N/P＝1；N/P＝12；N/P＝24；N/P＝42；N/P＝60；N/P＝72确定加入的DNA量)，在水浴超声条件下滴加到此混合溶剂中，形成乳红色的水/油(W/O)初乳溶液。而后将此溶液在探头超声条件下缓慢加入至6mL纯水中，形成水/油/水的复合体系。最后将其转移至恒温磁力搅拌器中于30℃搅拌3h除去有机相，用透析的方式除去过量盐酸阿霉素，得到负载药物与基因的纳米粒子，收集，备用。

3.2聚合物纳米粒子凝聚质粒DNA的能力测试

称取0.375g的琼脂糖加入50mL的1×TAE电泳缓冲液中，配制成0.75％的琼脂糖溶液。微波炉加热90s至完全溶解，并晃动使之分散均匀。待冷却至60℃左右加入5L的GB核酸染料，混匀，倒入到电泳支架中，插入梳子，静置约40min形成凝胶，拔去梳子，浸没于电泳槽的电泳液中，备用。将制备好的N/P＝1；N/P＝12；N/P＝24；N/P＝42；N/P＝60；N/P＝72的载有基因的复合物溶液浓缩至所需浓度，即保证质粒DNA的浓度为0.1g/L的溶液。而后每孔以2L的loading buffer和10g的DNA进样，保证每孔进样量及体积相同。电泳条件：1×TAE缓冲液，电压100mV，电泳时间为30min。在紫外灯下用凝胶成像系统观察拍照，确定纳米粒子与质粒结合。测试结果见图4，图中1代表裸DNA；2代表N/P＝1；3代表N/P＝12；4代表N/P＝24；5代表N/P＝42；6代表N/P＝60；7代表N/P＝72。从图中可以看出，当N/P为12时，聚合物能够完全复合质粒DNA，而不会再有DNA条带的跑出，有力地说明已经成功的将质粒DNA包覆于阳离子聚合物中。

3.3聚合物纳米粒子联合负载药物和质粒DNA的大小及形态的测试

将制备好的同N/P比的复合物纳米粒子，用超纯水稀释至1mg/mL，用马尔文电位粒度仪检测其电位和粒径分布，取三次测量值的平均值作为最终结果，测试结果见图5，从图中可以看出，随着N/P比的增大，粒径从200nm到800nm最后稳定至250nm，电位从-26.3mv逐渐增大到19mv。阳离子聚合物之所以具有较大的毒性，是由于其携带的正电荷易凝聚体内一些蛋白或破坏细胞膜结构而产生，为了降低阳离子毒性，需要在不减弱其疗效下尽量降低阳离子聚合物的电荷。因此本发明选择N/P＝42复合物作为下面测试的探索条件。

载药纳米粒子及N/P比为42的共载纳米粒子的粒径与电位测试结果见图6A，而形态通过透射电子显微镜来观察确定，测试结果见图6B，其中，从动态光散射柱状图A中可以看出阳离子聚合物载药纳米粒子与复合物纳米粒子的粒径分布均一，且无聚集现象及大颗粒产生，大约为308.0±52.0nm。而载药纳米粒子的透射电镜图示B显示，所有的纳米粒子外观均呈现球形，且形态规整大小均一，在透射电镜下显示出载药纳米粒子的粒径为100nm，其粒径相对于DLS结果有相对差异，推断可能是缩醛化葡聚糖表面未反应的羟基提供了一些亲水性，导致结构不致密，在水液中会有一些膨胀，溶液中出现的粒径偏大。

实施例4

聚合物AC-DEX-PAsp(DET)-CD纳米粒子的载药量和酸敏性释药行为的测定(两个分开载药与同时负载讲，载药量及测定数据。荧光分光光度计定性，紫外分光光度计定量)

4.1荧光分光光度计定性测定药物释放行为

以磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)和醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH＝5.0)作为释放介质。步骤为：各取500l，1mg/mL的载药纳米粒子与双载纳米粒子溶液分别与1mL的磷酸缓冲溶液混合均匀，备用。再各取500L，1mg/mL的载药粒子溶液于1mL的醋酸钠缓冲液混合均匀，备用。1h之后，用荧光分光光度计检测载药纳米粒子和双载纳米粒子在pH＝5.0和pH＝7.4缓冲介质中荧光药物的酸敏释放行为，测试结果见图7，从图中可以看出，在释放1h之后，无论是载药纳米粒子还是双纳米粒子，在pH＝7.4与pH＝5.0的条件下，两种介质下的荧光强度几乎都相差4-5倍，说明所设计的纳米载药系统具有优秀的酸敏释药能力。从图中看出联合共载纳米粒子在pH＝5.0下的释放能力要较载药纳米粒子的少些，这可能是由于阿霉素带有部分正电荷，参与了一部分质粒DNA的孵育，使得药物的释放缓慢，同时质粒DNA可能在某种程度上阻碍了药物的释放。

4.2紫外分光光度计测试药物释放行为

对于载药与双载纳米粒子均采用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)和醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH＝5.0)作为释放介质，在37℃的恒温摇床中进行体外药物释放。步骤为：将1mg/mL的聚合物溶液(载药纳米粒子溶液或双载纳米粒子溶液)转移到Mw＝14K的透析袋中，并将透析袋浸入到释放介质分别为pH＝7.4和pH＝5.0的缓冲溶液中，在摇床上以110rpm的转速孵育，每个样三个重复。在选择的时间间隔，于透析袋外取样3mL，取样后立即补加等量介质，使其总体积保持不变。样品中阿霉素的含量用紫外分光光度计测定在480nm波长下的吸收强度，作出药物释放百分含量-释放时间的曲线图，以标准曲线法计算得出结果。由此计算出载药纳米粒子的负载抗肿瘤药物阿霉素的聚合物纳米粒子的载药量和包封率分别为5.2％和36.7％，同时负载抗肿瘤药物阿霉素与质粒DNA的双载纳米粒子的载药量和包封率分贝为5.3％和31.86％,，药物的体外释放曲线见图8，根据DOX标准曲线计算阳离子聚合物载药纳米粒子中DOX的含量，以时间对DOX累积释放量作图进行的分析研究。从谱图中可以看出无论在载药纳米粒子还是联合共载纳米粒子的阿霉素的释放行为表现出很好的pH响应性。在pH值为7.4的缓冲溶液中，药物DOX的释放量比较缓慢，30h小时释放率约为12％，表明聚合物纳米粒子可以很好的保护药物，减少DOX在体内循环过程中的泄露，提高生物利用度，降低毒副作用。而在pH＝5.0的醋酸缓冲介质中，DOX很快地从纳米粒子中释放出来，5小时的释放量就已经达到26％，释放速率明显高于pH＝7.4的磷酸缓冲介质。这是由于由缩醛化葡聚糖组成的疏水性内核在酸性条件下逐渐水解，转变为亲水性物质，阳离子聚合物纳米粒子结构变得松散，从而使得药物快速的释放出来。

以上测试结果表明酸敏型两嵌段聚合物载体材料具有显著的酸敏感性，其反应性酸敏内核在酸性条件下可迅速由疏水性变为亲水性，快速释放药物和DNA，可以达到智能控释的。同时该酸敏型两嵌段聚合物可以通过双乳化的方式同时负载质粒DNA和药物，且有较好的负载率，显示出联合肿瘤化疗和基因治疗产生协同作用的可能性。

Claims (4)

1.一种可降解的酸敏型聚天冬酰胺共聚物，其特征在于，所述的共聚物的亲水段为多乙烯亚胺接枝的聚天冬氨酸，所述共聚物的疏水段为缩醛化葡聚糖；所述的多乙烯亚胺接枝的聚天冬氨酸与缩醛化葡聚糖的分子量的比为1:1～10；所述的多乙烯亚胺为直链型多乙烯亚胺，分子量为100～500g/mol。

2.根据权利要求1所述的聚天冬酰胺共聚物，其特征在于，所述聚天冬氨基酸为单体单元为带有活性侧基的L型天冬氨酸苄酯，该聚天冬氨酸的分子量为3602g/moL。

3.一种权利要求2所述的聚天冬酰胺共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.端醛基葡聚糖与丙炔胺反应，制备出端炔基葡聚糖；

S2.根据预期共聚物中疏水端缩醛化葡聚糖的分子量，将端炔基葡聚糖的羟基在规定时间内进行缩醛化反应，得到疏水性的缩醛化葡聚糖；

S3.端叠氮的丙胺引发L型天冬氨酸卞酯的N-羧酸酐开环聚合，制备端叠氮的聚天冬氨酸苄酯；

S4.利用点击化学反应，将S2的得到的疏水性的缩醛化葡聚糖和S3所得的端叠氮的聚天冬氨酸苄酯结合,得到缩醛化葡聚糖-聚天冬氨酸苄酯；

S5.通过胺解反应，将多乙烯亚胺连接到S4所得的缩醛化葡聚糖-聚天冬氨酸苄酯的聚氨基酸侧链，引入多乙烯亚胺亲水基团，得到最终产物缩醛化葡聚糖-多乙烯亚胺接枝聚天冬酰胺共聚物。

4.根据权利要求3所述的聚天冬酰胺共聚物的制备方法，其特征在于，S2所述的缩醛化反应为用二甲氧基丙烯在吡啶对甲苯磺酸的作用下对端炔基葡聚糖的羟基进行缩醛化反应。