CN110393700A - F3多肽导向的pamam为核心的肿瘤药物纳米载体的制备与应用 - Google Patents

F3多肽导向的pamam为核心的肿瘤药物纳米载体的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备与应用，以树枝状大分子化合物聚酰胺‑胺(PAMAM)作为纳米药物载体的核，在其表面共价连接疏水链聚乳酸(PLA)作为内壳，再接亲水链聚乙二醇(PEG)作为外壳，在PEG外壳上接F3多肽作为靶配体来实现体系的肿瘤靶向性，疏水性抗肿瘤药物多西紫杉醇(DTX)以物理包埋的方式负载到纳米药物载体的疏水核及内壳中。本发明制备的纳米药物载体生物相容性好，能显著改善DTX的溶解性，具有潜在的临床应用价值。

Description

F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备与 应用
技术领域
本发明属于生物高分子材料与纳米技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向型树枝状两亲性嵌段共聚物作为药物载体的制备方法及应用。
背景技术
由亲水性链段和疏水性链段构成的两亲性嵌段共聚物高分子材料自组装形成的胶束由于其独特的性质在生物医学领域受到了广泛的关注。胶束药物传递系统的优点包括提高疏水性药物的溶解度，提高药物的稳定性，减少网状内皮系统的非特异性摄取，延长药物在血液中的循环时间，以及靶向传递药物。经典的多分子聚合物胶束在体内对周围环境比较敏感，尤其是两亲嵌段共聚物的浓度，所以经典的多分子聚合物胶束在体内的稳定性不高。基于线性两亲性共聚物的传统胶束进入人体后浓度会被血液稀释,当其浓度低于临界胶束浓度时胶束就会分解，因而存在稳定性较差的问题。为了克服传统胶束的这一缺陷，人们开发了具有树形或者超支化结构的两亲性共聚物单分子胶束纳米粒子。由于其独特的结构，单分子胶束不会因浓度下降而分解，具有较高的稳定性。除此以外，其高度支化的结构还能提供大量的可功能化的末端基团,能够进一步官能化，如与配体缀合等优异的化学通用性。
发明内容
基于以上现有技术的不足，本发明所解决的技术问题在于提供一种肿瘤靶向型树枝状两亲性嵌段共聚物作为药物载体的制备方法及运用。该纳米载体生物相容性好，能显著改善疏水药物的溶解度，降低体内消除速度，改善药物在体内的分布等优点。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
以树枝状大分子聚合物聚酰胺-胺(PAMAM)作为纳米药物载体的疏水核心，通过表面羟基引发LA开环聚合在PAMAM表面连接疏水链聚乳酸(PLA) 作为疏水内壳，再通过成酰胺反应连接亲水链聚乙二醇(PEG)作为外壳，通过 F3多肽的巯基与PEG末端的马来酰亚胺基团反应在PEG外壳上接F3多肽作为靶配体来实现体系的肿瘤靶向性。
作为上述技术方案的优选，本发明提供的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：
作为上述技术方案的改进，包含如下步骤：
⑴制备PAMAM-PLA-OH：
PAMAM-OH和L-丙交酯按照(20-32mg):(120-250mg)的比例混合，在催化剂Sn(Oct)2、氮气保护、115-120℃条件下搅拌反应24-30小时，反应产物溶解在THF中，用过量冷乙醇沉淀，过滤收集PAMAM-PLA-OH粉末，在室温真空度为0.08-0.09Mpa条件下真空干燥20-24小时，得到产物即为 PAMAM-PLA-OH；其中，PAMAM-OH作为大分子引发剂，引发L-丙交酯开环聚合制备PAMAM-PLA，Sn(Oct)2作为开环聚合反应的催化剂；
⑵制备PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal：
第一步：PAMAM-PLA-OH与琥珀酸酐反应将PAMAM-PLA-OH羟基转化为羧基；将PAMAM-PLA-OH与琥珀酸酐按照(30-35mg):(6-13mg)的比例在无水二氯甲烷溶剂中混合，添加催化剂4-二甲基吡啶，在室温、氮气保护下，搅拌反应48小时，反应结束后用冷乙醚将产物沉淀出来，在室温真空度为 0.08-0.09Mpa条件下真空干燥12小时，所得产物为PAMAM-PLA-COOH；
第二步：PAMAM-PLA-COOH的羧基与PEG末端氨基反应；将 PAMAM-PLA-COOH、HOOC-PEG-Mal、HOOC-PEG-OCH3、DCC和DMAP溶解于无水DMF中，在室温、氮气保护条件下搅拌反应40-48小时，反应结束后过滤去除副产物二环己基脲，然后将滤液转移至截留分子量为15000Da的透析袋中用去离子水透析48-54小时除去产物中的杂质，产物用冻干法干燥得到产物 PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal；
⑶制备PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3：
将PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal溶解于PBS(pH＝7.4)缓冲液中， AMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal:缓冲液＝(45-55mg):(4-8mL),再加入F3多肽，在室温、氮气保护条件下反应12-18小时，反应结束后反应液转移至截留分子量为15000Da的透析袋中用去离子水透析48-54小时，然后冷冻干燥得产物即为所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3；也就是肿瘤靶向型树枝状两亲性嵌段共聚物 PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(1)中，PAMAM-OH与催化剂Sn(Oct)2按照摩尔比为1000:1-1000:2的比例混合。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)中，PAMAM-PLA-OH与催化剂4-二甲基吡啶的比例为(30-40)mg：(1.5-2.5g)。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)中，第二步里， PAMAM-PLA-COOH：HOOC-PEG/Mal：HOOC-PEG-OCH3：DCC：DMAP：无水DMF＝(10-15mg):(48-52mg):(22-28mg):(1.5-2.5mg)：(0.05-0.15mg)： (5-10mL)。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(3)中，PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal： F3多肽＝(45-55mg):(3-5mg)
一种如前任意方法所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的应用：所述F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体 PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3作为药物载体制备负载DTX(多烯紫杉醇)的载药胶束。
作为上述技术方案的优选，本发明提供的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的应用进一步包括下列技术特征的部分或全部：
作为上述技术方案的改进，所述应用方法具体为：将 PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3和DTX溶解于DMF中，边搅拌边缓慢滴加去离子水，搅拌反应8-12小时，反应结束后反应液转移至截留分子量为15000Da的透析袋中用离子水透析48-54小时，然后冷冻干燥得产物。
作为上述技术方案的改进，所述PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3：DTX：DMF：去离子水＝16mg:5mg:3mL:9mL。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明的纳米药物载体是以PAMAM-OH作为结构主体的两亲单分子纳米胶束。既可以通过改变聚丙交酯嵌段部分重复单元数量，来提高药物载体的载药量。又可以通过改变亲水聚乙二醇(PEG)和疏水嵌段聚丙交酯(PLA) 的比例来控制纳米胶束的大小及其在水中的稳定性。
(2)本发明的纳米药物载体上所用的靶向配体是F3多肽。F3多肽的受体是新生血管内皮细胞和肿瘤细胞表面标志性分子——核仁素，正常细胞的核仁素只能在细胞核内表达，而在肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞中核仁素能够在细胞表面表达。由于F3多肽几乎能与所有的肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞高选择性地结合，可以将其携带的药物分子带到肿瘤细胞内，因此，F3多肽可以作为肿瘤诊断测试以及肿瘤组织靶向给药的良好载体，实现肿瘤的早期诊断和靶向治疗。
(3)本发明的树形状两亲性共聚物单分子纳米胶束的结构独特，不会因浓度下降而分解，具有较高的稳定性。可以克服传统多分子胶束当血液稀释时，多分子聚合物胶束分解，导致药物爆发性地释放和丧失肿瘤靶向能力的缺陷。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例1两亲性嵌段共聚物PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3的核磁共振(1HNMR)图谱；
图2是本发明实施例1载药纳米胶束的动态光散射DLS粒径分析图；
图3是本发明实施例1用1％磷钨酸溶液染色的载药纳米胶束TEM图；
图4是本发明实施例1载药纳米胶束的体外药物释放曲线；
图5是本发明实施例1空白载体的体外细胞毒性研究结果；
图6是本发明实施例1共聚焦荧光显微镜观察的细胞摄取图；图6-a为 MDA-MB-231细胞摄取靶向胶束后的荧光图；图6-b为MDA-MB-231细胞摄取非靶向胶束后的荧光图；图6-c为MDA-MB-231细胞在有F3阻断剂条件下摄取靶向胶束后的荧光图；图6-d为L929细胞摄取靶向胶束后的荧光图；图6-e为 L929细胞摄取非靶向胶束后的荧光图；图6-f为L929细胞在有F3阻断剂条件下摄取靶向胶束后的荧光图。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。
材料与试剂PAMAM-OH购于Sigma-Aldrich公司；L-丙交酯产于东京化成株式会社；四氢呋喃，二氯甲烷，丁二酸酐，二环己基碳二亚胺(DCC)，均购于国药集团化学试剂有限公司；mPEG-NH2，Mal-PEG-NH2(MW5000)均由上海拓旸生物科技有限公司提供；F3多肽购于强耀生物科技有限公司。
【实施例1】树枝状纳米药物载体的制备
⑴PAMAM-PLA-OH的制备：PAMAM-OH(32mg)作为大分子引发剂，引发L-丙交酯(300mg)开环聚合制备PAMAM-PLA，Sn(Oct)2(催化剂:单体＝1:1000)作为开环聚合反应的催化剂。该反应在氮气保护、120℃油浴加热条件下搅拌反应24小时，反应结束后将混合物溶解在THF中，用过量冷乙醇沉淀，过滤收集PAMAM-PLA-OH粉末，真空干燥24小时。
⑵PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal的制备：反应分两步进行，第一步： PAMAM-PLA-OH(35mg)与琥珀酸酐(10mg)反应将PAMAM-PLA-OH羟基转化为羧基，在室温、氮气保护下该反应以4-二甲基吡啶(0.2mg)为催化剂，在无水二氯甲烷(5mL)中搅拌反应48小时。反应结束后用冷乙醚将产物沉淀出来，真空干燥12小时；第二步：PAMAM-PLA-COOH的羧基与PEG末端氨基反应。将PAMAM-PLA-COOH(15mg)、HOOC-PEG-Mal(50mg)、 HOOC-PEG-OCH3(25mg)、DCC(2mg)和DMAP(0.1mg)溶解于5mL无水 DMF中，在室温、氮气保护条件下搅拌反应48小时，反应结束后过滤去除副产物二环己基脲。将滤液转移至透析袋(截留分子量为15000Da)中用去离子水透析48小时除去产物中的杂质，产物用冻干法干燥。
⑶PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3的制备：在药物载体上连接靶向多肽是通过多肽末端的巯基与树枝状药物载体末端的马来酰亚胺基发生迈克尔加成反应得以实现的。将PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal(50mg)溶解于PBS(pH＝7.4)缓冲液中，再加入F3多肽(3.0mg)，在室温、氮气保护条件下反应12小时，反应结束后反应液转移至透析袋(截留分子量为15000Da)中用离子水透析48小时，然后冷冻干燥得产物。
⑷载药纳米胶束的制备。以制备的肿瘤靶向型树枝状两亲性嵌段共聚物 PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3作为药物载体制备负载DTX的载药胶束的制备方法：将16mg PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3和5mg DTX溶解于3mLDMF中，边搅拌边缓慢滴加9mL去离子水，搅拌反应8小时，反应结束后反应液转移至透析袋 (截留分子量为15000Da)中用离子水透析48小时，然后冷冻干燥得产物。
⑸采用MTT法对空白载体进行细胞毒性测试。分别用不同浓度的(50、100、 200、500μg/mL)空白聚合物胶束对MDA-MB-231人乳腺癌细胞进行作用，未作任何处理的MDA-MB-231人乳腺癌细胞作为对照。在570nm波长条件下测定光密度值(OD)，表征细胞的活力变化情况，用以研究纳米药物载体的生物安全性。⑹共聚焦荧光显微镜定性观察细胞对胶束的摄取情况。分别用靶向单分子胶束、非靶向单分子胶束以及加入F3多肽阻断的靶向单分子胶束作MDA-MB-231人乳腺癌细胞和L929正常成纤维细胞，然后置于共聚焦荧光显微镜下观察细胞对胶束的摄取情况，用以研究纳米药物载体的肿瘤靶向性。
图1为药物载体PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3的1H NMR(400MHz，DMSO) 谱图，化学位移落在1.60-1.70ppm(a)和5.15-5.25ppm(b)的两个峰，分别表示聚乳酸(PLA)主链上的甲基峰和次甲基峰。吸收峰化学位移落在2.70-2.75ppm (c)左右的为丁二酸酐的亚甲基峰。吸收峰落在3.60-3.70ppm(g)处，它代表PEG结构中的的亚甲基。
纳米载药胶束载药量的测定：采用高效液相色谱(HPLC)法对纳米载药胶束的载药量进行测定。色谱条件：waters C18(160mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(体积比60:40)；流速:1mL/min；紫外检测波长：230nm；柱温： 25℃；进样量：20μL。将1mg纳米载药胶束溶于4mL乙腈，在室温下搅拌萃取2小时，用HPLC法检测上清液中的多西紫杉醇浓度。测得纳米胶束的载药量为15.5％。
图2是用动态光散射仪(DLS)测得的载药纳米胶束的粒径分布图，图3是用透射电子显微镜(TEM)测得的载药纳米胶束的形貌图。从电镜图上可以看出，纳米颗粒的尺寸在20-50nm左右，近似球形。载药纳米胶束的粒径分布图可以看出纳米胶束的平均粒径为90nm左右。图2和图3进一步证实了所述载药纳米胶束具有良好的分散性。
纳米载药胶束体外药物释放性能研究：采用高效液相色谱法测定纳米载药胶束在不同pH条件下的体外释放性能。分别用pH7.4、pH6.8和pH5.3的缓冲溶液模拟正常生理条件、肿瘤组织细胞外基质以及肿瘤组织细胞内环境。通过测量一定时间内载药胶束在上述三种pH条件下DTX的累积释放量，考察pH 值对负载DTX的纳米载药系统的影响。结果如图4所示，在pH7.4条件下DTX 的累积释放量为38％，在pH6.6条件下DTX的累积释放量为58％，在pH5.3 条件下，DTX的累积释放量为85％。证实了本发明制备的树枝状两亲性嵌段共聚物具有pH响应性。
空白载体的细胞毒性测试：结果如图5显示，用4种不同空白胶束浓度作用后的细胞存活率均达到95％及以上结果说明靶向聚合物 PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal/F3空白胶束对细胞没有毒性，是生物安全性的良好药物纳米载体。
共聚焦荧光显微镜定性观察细胞对胶束的摄取情况：图6是本发明实施例 1共聚焦荧光显微镜观察的细胞摄取图；图6-a为MDA-MB-231细胞摄取靶向胶束后的荧光图；图6-b为MDA-MB-231细胞摄取非靶向胶束后的荧光图；图6-c为MDA-MB-231细胞在有F3阻断剂条件下摄取靶向胶束后的荧光图；图6-d为L929细胞摄取靶向胶束后的荧光图；图6-e为L929细胞摄取非靶向胶束后的荧光图；图6-f为L929细胞在有F3阻断剂条件下摄取靶向胶束后的荧光图。从图6-a可以看出，MDA-MB-231细胞摄取靶向单分子胶束后具有较强的红色荧光；从图6-b可以看出，MDA-MB-231细胞摄取非靶向单分子胶束后的荧光强度很弱；从图6-c可以看出，MDA-MB-231细胞在有F3阻断剂条件下摄取靶向胶束后的荧光强度也很弱。L929细胞的三组实验为对照试验，结果如图6-d、 6-e、6-f所示，细胞荧光强度均很弱，且三组之间没有明显的差异，说明本课题制备的靶向聚合物药物载体具有肿瘤靶向性。
本发明所述的肿瘤靶向型树枝状两亲性嵌段共聚物胶束F3多肽导向的 PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3为药物缓释材料的应用，生物相容性好，对人体无毒副作用，能显著改善疏水药物的溶解度。
本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
以树枝状大分子聚合物聚酰胺-胺PAMAM作为纳米药物载体的疏水核心，通过表面羟基引发LA开环聚合在PAMAM表面连接疏水链聚乳酸PLA作为疏水内壳，再通过成酰胺反应连接亲水链聚乙二醇PEG作为外壳，通过F3多肽的巯基与PEG末端的马来酰亚胺基团反应在PEG外壳上接F3多肽作为靶配体来实现体系的肿瘤靶向性。
2.一种如权利要求1所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
⑴制备PAMAM-PLA-OH：
PAMAM-OH和L-丙交酯按照20-32mg:120-250mg的比例混合，在催化剂Sn(Oct)2、氮气保护、115-122℃条件下搅拌反应24-30小时，反应产物溶解在THF中，用过量冷乙醇沉淀，过滤收集PAMAM-PLA-OH粉末，在室温真空度为0.08-0.09Mpa条件下真空干燥20-24小时，得到产物即为PAMAM-PLA-OH；
⑵制备PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal：
第一步：将PAMAM-PLA-OH与琥珀酸酐按照30-35mg:6-13mg的比例在无水二氯甲烷溶剂中混合，添加催化剂4-二甲基吡啶，在室温、氮气保护下，搅拌反应40-48小时，反应结束后用冷乙醚将产物沉淀出来，在室温真空度为0.08-0.09Mpa条件下真空干燥20-24小时，所得产物为PAMAM-PLA-COOH；
第二步：将PAMAM-PLA-COOH、HOOC-PEG-Mal、HOOC-PEG-OCH3、DCC和DMAP溶解于无水DMF中，在室温、氮气保护条件下搅拌反应40-48小时，反应结束后过滤，然后将滤液转移至截留分子量为15000Da的透析袋中用去离子水透析48-54小时除去产物中的杂质，产物用冻干法干燥得到产物PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal；
⑶制备PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3：
将PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal溶解于pH＝7.4的PBS缓冲液中，AMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal:缓冲液＝45-55mg:4-8mL，再加入F3多肽，在室温、氮气保护条件下反应8-12小时，反应结束后反应液转移至截留分子量为15000Da的透析袋中用去离子水透析48-54小时，然后冷冻干燥得产物即为所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3。
3.如权利要求2所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备与应用，其特征在于：所述步骤(1)中，PAMAM-OH与催化剂Sn(Oct)2按照摩尔比为1000:1-1000:2的比例混合。
4.如权利要求2所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备与应用，其特征在于：所述步骤(2)中，PAMAM-PLA-OH与催化剂4-二甲基吡啶的比例30-40mg:1.5-2.5g。
5.如权利要求2所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备与应用，其特征在于：所述步骤(2)中，第二步里，PAMAM-PLA-COOH：HOOC-PEG/Mal：HOOC-PEG-OCH3：DCC：DMAP：无水DMF＝10-15mg:48-52mg：22-28mg：1.5-2.5mg：0.05-0.15mg：5-10mL。
6.如权利要求2所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的制备与应用，其特征在于：所述步骤(3)中，PAMAM-PLA-PEG-OCH3/Mal：F3多肽＝45-55mg：3-5mg。
7.一种如权利要求1-6所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的应用，其特征在于：所述F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3作为药物载体制备负载疏水性药物的载药胶束。
8.如权利要求7所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的应用，其特征在于，所述应用方法具体为：将PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3和DTX溶解于DMF中，边搅拌边缓慢滴加去离子水，搅拌反应8-12小时，反应结束后反应液转移至截留分子量为15000Da的透析袋中用离子水透析48-54小时，然后冷冻干燥得产物。
9.如权利要求8所述的F3多肽导向的PAMAM为核心的肿瘤药物纳米载体的应用，其特征在于：所述PAMAM-PLA-PEG-OCH3/F3:DTX:DMF:去离子水＝16mg:5mg:3mL:9mL。
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