CN106349437B - 一种三嵌段聚合物、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种式I所示的三嵌段聚合物、载药聚合物胶束、化学交联的载药聚合物胶束、其制备方法及其用途，其中，R1为羧基、氨基、氰基、巯基、醛基或C1‑C3烷基，R2为卤素；R3为羟基或胺基化缩水甘油；x为20‑300的整数；y为10‑100的整数；以及z为10‑100的整数。本发明的包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束不仅保持胶束在血液循环过程中的稳定性，而且可在肿瘤或癌细胞中降解，有效释放化疗药物，实现治疗目的。
Description
技术领域
本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种三嵌段聚合物、聚合物载药胶束、化学交联的聚合物载药胶束、其制备方法及其用途。
背景技术
化疗是目前临床治疗恶性肿瘤的主要手段之一，聚合物胶束可将难溶性化疗药物纳米化，改善药物溶解性，提高药物生物利用度，显著降低其毒副作用，已在治疗转移和耐药性肿瘤方面受到了广泛关注。尽管有上述优点，目前文献报道的胶束多通过非共价作用包载化疗药物，在生理条件下，这些自组装胶束易吸附蛋白而解离，从而导致稳定性下降和药物泄露。载药胶束的体内稳定性问题已成为制约纳米药物临床转化的重要瓶颈。
发明内容
基于以上问题，本发明的目的是提供一种包载化疗药物的可逆化学交联的聚合物胶束。化学交联的目的在于防止蛋白吸附导致聚合物胶束解离，保持胶束在血液循环过程中的稳定性。化学交联键可在肿瘤或癌细胞弱酸性、还原或特定的酶环境中降解，降低胶束稳定性，从而有效释放化疗药物，实现治疗目的。
为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的一个方面提供一种式I所示的三嵌段聚合物，
其中，R1为羧基、氨基、氰基、巯基、醛基或C1-C3烷基，优选甲基；R2为卤素，优选Cl或Br；R3为羟基或胺基化缩水甘油；x为20-300的整数，优选45-250的整数，更优选为100-145的整数；y为10-100的整数，优选20-60的整数；以及z为10-100的整数，优选20-60的整数。
所述三嵌段聚合物优选为具有以下式1或式2结构所示的聚合物：
在式1、式2中，R1、R2、x、y和z的定义与式I中的定义相同；n为0-10的整数，优选0-4的整数。
本发明的另一方面是提供一种聚合物胶束，该聚合物胶束包含具有式I所示结构的三嵌段聚合物。优选地，所述胶束包含具有式1或式2所示结构的三嵌段聚合物，其中，所述包含具有式1所示结构的三嵌段聚合物的聚合物胶束包括中性聚乙二醇(PEG)外层、带正电的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层；所述包含具有式2所示结构的三嵌段聚合物的聚合物胶束包括中性聚乙二醇(PEG)外层、带负电的聚甲基丙烯酸中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层；所述疏水内层具有酸敏感性，可在pH<6.3的弱酸性环境中结合质子解离；所述聚合物胶束的平均流体力学粒径优选为20-60纳米。
本发明的另一方面是提供一种包载化疗药物的聚合物胶束的制备方法，所述方法的具体步骤包括：将以上所述包含具有式I所示结构的三嵌段聚合物(优选具有包含式1所示结构的三嵌段聚合物或式2所示的三嵌段聚合物)，以及化疗药物溶解于有机溶剂中(优选地使聚合物浓度为10-200mg/ml)，得到三嵌段聚合物与化疗药物的混合溶液；将该溶液在超声条件下滴入水中，其中水与有机溶剂的体积比值大于1，优选1-20；然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂，得到包载化疗药物的聚合物胶束，其中，所述的有机溶剂优选为选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。
本发明的另一方面是提供一种化学交联的聚合物胶束，其中化学交联的聚合物胶束由以上所述的包含具有式I所示结构的三嵌段聚合物(优选具有包含式1所示结构的三嵌段聚合物或式2所示结构的三嵌段聚合物)的聚合物胶束经化学交联而成；所述化学交联的聚合物胶束具有三层结构，包括中性聚乙二醇外层、化学交联中间层以及疏水内层；所述化学交联的聚合物胶束的平均流体力学粒径优选为20-300纳米。
本发明的另一方面是提供上述化学交联的聚合物胶束的制备方法，该方法具体包括如下步骤：
步骤一：将上述包含具有式I所示结构的三嵌段聚合物(优选具有包含式1所示结构的三嵌段聚合物或式2所示的三嵌段聚合物)溶解于有机溶剂中(优选地使聚合物浓度为10-200mg/ml)，超声条件下加入水中，其中水与有机溶剂的体积比值大于1，优选1-20，透析除去有机溶剂，制备得具有三层结构的聚合物胶束；
步骤二：交联剂溶于有机溶剂中(优选地使其浓度为10-200mg/ml)，同时加入羧基活化剂；在0-40℃之间的任意恒定温度反应0.5-6h后，再以交联剂：聚合物中的胺基或羧基为1:10-1:40(优选1:20)的摩尔比，超声下滴入步骤一所制备的聚合物胶束中，在0-40℃之间的任意恒定温度反应6-48h后，去离子水透析纯化后冷冻干燥，得到化学交联的聚合物胶束；
其中，步骤一和步骤二中所用的有机溶剂相同或不同，各自独立地选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、3,3’-二硫二丙酸、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明的又一方面是提供一种包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束，其包括：由上述包含具有式I所示结构的三嵌段聚合物(优选具有包含式1所示结构的三嵌段聚合物或式2所示的三嵌段聚合物)和交联剂形成的化学交联的聚合物胶束，以及包载于上述化学交联的聚合物胶束中的化疗药物组成，所述包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束包括中性聚乙二醇(PEG)外层、化学交联中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层的多层结构，其中，所包载的化疗药物的重量优选占所述化学交联的聚合物胶束重量的1.0％-20％，所包载的化疗药物和式I所示结构的三嵌段聚合物的重量比优选为1:5-1:20；所述包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束的平均流体力学粒径优选为20-300纳米。
本发明的再一方面是提供一种包载有化疗药物的化学交联的聚合物胶束的制备方法，所述方法的具体步骤包括：
步骤一：将包含具有式I所示结构的三嵌段聚合物(优选具有包含式1或式2所示结构的三嵌段聚合物)和化疗药物以重量比为20:1-5:1的比例同时溶解于有机溶剂中(优选地使聚合物浓度为10-200mg/ml)，得到含有三嵌段聚合物和化疗药物的混合溶液，在超声条件下将该混合溶液与水以体积比为30:70-10:90的比例混合，然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂和未负载的化疗药物，得到包载有化疗药物的聚合物胶束；
步骤二：将交联剂溶于有机溶剂(优选地使其浓度为10-200mg/ml)，同时加入羧基活化剂，在0-40℃之间的任意恒定温度反应0.5-6h后，再以交联剂：聚合物中的胺基或羧基为1:10-40:1的摩尔比，超声下滴入以上制备的包载有化疗药物的聚合物胶束中；在0-40℃之间的任意恒定温度反应0.5-48h后，去离子水透析纯化后冷冻干燥，得到包载有化疗药物的化学交联的聚合物胶束。
其中，步骤一和步骤二中所用的有机溶剂相同或不同，各自独立地选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种；所述羧基活化剂的具体种类与上述制备化学交联的聚合物胶束中的具体种类相同。
上述方法制备的包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束具有多层结构，包括中性聚乙二醇外层、化学交联中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层，所述包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束的平均流体力学粒径优选为20-300纳米。
在本发明中如无特别限定，所述的有机溶剂优选为选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。优选地，制备聚合物胶束、化学交联的聚合物胶束和包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束所用的有机溶剂相同。
在本发明中如无特别限定，所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、3,3’-二硫二丙酸、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或N-羟基琥珀酰亚胺。
在本发明中如无特别限定，所述化学交联的聚合物胶束的中性聚乙二醇外层具有亲水性，可以屏蔽化学交联胶束的部分电荷，提高胶束的稳定性，避免因为蛋白吸附造成的胶束聚集与沉降。化学交联中间层既可以增强胶束在细胞外的稳定性，又可在细胞内部解交联，从而促进药物的释放。聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层具有酸敏感性(pKa＝6.3)，在中性生理条件下具有疏水性，构成化学交联胶束的疏水内核，可用于包载化疗药物；疏水内核在细胞弱酸性环境中解离，快速释放被包载药物。
本发明的另一方面是提供以上所述三嵌段聚合物在制备负载化疗药物的聚合物胶束中的用途。
本发明的另一方面是提供以上所述三嵌段聚合物在制备负载化疗药物的化学交联的聚合物胶束中的用途。
本发明的另一方面是提供一种所述化学交联的聚合物胶束在制备用于治疗癌症的化疗药物中的应用，所述用于治疗癌症的化疗药物主要用于逆转癌症多药耐药或抑制癌症转移。
在本发明中如无特别限定，所述交联剂选自下式3-8所示结构中的一种或多种：
在本发明中如无特别限定，所述的化疗药物，只要出于本发明的目的，可以选自任何化疗药物，包括紫杉醇、多西他赛、阿霉素、SN38等小分子药物，以及小分子药物与聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物的共价键合高分子前药中的一种或多种。优选地，其中，聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物中聚氧乙烯聚合度为4-200的整数，聚氧丙烯嵌聚合度为30-80的整数；优选地，其中小分子药物与聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物通过二硫键、酯键或寡肽共价偶联。只要是在共同包载时不产生对药效有不良影响的物质，也可以是以上小分子药物的组合、高分子键合前药的组合或小分子药物与高分子键合前药的组合。
根据本发明提供的化学交联胶束的用途，所针对的癌症类型主要为耐药性或转移性的乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、头颈部癌、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌及前列腺癌等实体性恶性肿瘤。
本发明提供的包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束能够防止蛋白吸附导致聚合物胶束解离，保持胶束在血液循环过程中的稳定性，其化学交联键可在肿瘤或癌细胞中弱酸性、还原或特定的酶环境中降解，降低胶束稳定性，从而有效释放化疗药物，实现治疗目的。
附图说明
图1为本发明实施例2中所制备的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物胶束的流体力学粒径(A)和表面电位分布图(B)。该聚合物胶束的流体力学直径为20-200纳米,表面电位为20±15毫伏。该聚合物胶束的流体力学粒径和表面电位由MALVERN NANO SIZER型激光粒径测定仪测定。
图2为本发明实施例4中所制备的载药的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物胶束的流体力学粒径(A)和表面电位分布图(B)。该聚合物胶束的流体力学粒径为20-200纳米,表面电位为20±15毫伏。
图3为本发明实施例4中所制备的载药的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物胶束在不同pH条件下的透射电镜图。该载药的聚合物胶束在pH＝7.4中性条件下形成球形胶束(A)，粒径约为30纳米，该载药的聚合物胶束在pH＝6.0酸性条件下解离，呈絮状无规则聚集态(B)(标尺100纳米)。
图4为本发明实施例5中所制备的化学交联的载药聚合物胶束的流体力学粒径(A)和表面电位分布图(B)。该化学交联的载药聚合物胶束的流体力学直径为20-200纳米,表面电位为20±15毫伏。
图5为本发明实施例5中所制备的化学交联的载药聚合物胶束在不同pH条件下的透射电镜图。该化学交联的载药聚合物胶束在中性pH＝7.4条件下形成球形胶束(A)，粒径约为30纳米，该化学交联的载药聚合物胶束在酸性pH＝6.0条件下解离，呈絮状无规则聚集态(B)(标尺100纳米)。
图6为本发明实施例7中所制备的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物胶束的流体力学粒径(A)和表面电位分布图(B)。该聚合物胶束的流体力学粒径为20-200纳米,表面电位为-40±30毫伏。
图7为本发明实施例9中所制备的载药的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物胶束的流体力学粒径(A)和表面电位分布图(B)。该载药的聚合物胶束的流体力学直径为20-200纳米,表面电位为-40±30毫伏。
图8为本发明实施例9中所制备的载药的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物胶束在不同pH条件下的透射电镜图。该载药的聚合物胶束在中性pH＝7.4条件下形成球形胶束(A)，粒径约为30纳米，该载药的聚合物胶束在酸性条件下(pH＝6.0)解离，呈絮状无规则聚集态(B)(标尺100纳米)。
图9为本发明实施例10中所制备的化学交联的载药聚合物胶束的流体力学粒径(A)和表面电位分布图(B)。该化学交联的载药聚合物胶束的流体力学粒径为20-200纳米,表面电位为-40±30毫伏。
图10为本发明实施例10中所制备的化学交联的载药聚合物胶束在不同pH条件下的透射电镜图。该化学交联的载药胶束在pH＝7.4中性条件下形成球形胶束(A)，粒径约为30纳米，该化学交联的载药聚合物胶束在pH＝6.0酸性条件下解离，呈絮状无规则聚集态(B)(标尺100纳米)。
图11为本发明实施例2中所制备的聚合物胶束、实施例3中所制备的化学交联的聚合物胶束、实施例4中所制备的载药的聚合物胶束和实施例5中所制备的化学交联的载阿霉素前药的聚合物胶束对4T1乳腺癌细胞的MTT毒性实验数据。空白胶束处理的细胞存活率为100％左右，表明聚合物胶束无明显细胞毒性。在药物浓度为0.09μg/mL时，载阿霉素前药胶束组的细胞存活率为87％，羧化顺铂交联的载阿霉素大分子前药胶束组的细胞存活率为45％，表明羧化顺铂交联可显著提高载药胶束的药效。
图12为本发明实施例9中所制备的载药的聚合物胶束和实施例10中所制备的短肽交联载阿霉素前药的胶束对4T1乳腺癌细胞的MTT毒性实验数据。在药物浓度为0.045μg/mL时，载阿霉素前药胶束组的细胞存活率为95％，而短肽交联载阿霉素前药胶束组的细胞存活率为50％，表明短肽交联可显著提高载药胶束的细胞毒性。
图13为本发明的具有三层结构的化学交联的载药聚合物胶束的结构示意图，其中，R为化学交联剂。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些具体实施例限定。
实施例中所用的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚合物和聚乙二醇-聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚合物参照专利201310232005.2公开的方法合成。短肽偶联的P85-阿霉素聚合物前药参照专利201410427799.2公开的方法合成。甲基丙烯酸缩水甘油酯、丁二酸酐、羧基活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。羧基活化剂1-羟基苯并三唑、3,3’-二硫二丙酸、N,N-二甲基乙酰胺及二甲基亚砜购自上海百灵威科技有限公司。短肽序列由上海吉尔生化有限公司合成。盐酸阿霉素购自大连美仑生物技术有限公司。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段聚合物购自巴斯夫股份有限公司。顺铂购自山东铂源化学有限公司并参照文献方法(Bioconjugate Chem.2008,19,39–49)进行双羧基化。在本申请中，如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司。4T1乳腺癌细胞购自美国ATCC细胞库，细胞培养用RPIM1640培养基和胎牛血清均购自Gibco公司。
如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法。透射电镜照片由Tecnai G2 F20 S-TWIN型透射电子显微镜获得。胶束纳米粒的流体力学粒径由MALVERN NANO SIZER型激光粒径测定仪测得。
实施例1：聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物的制备
取酰溴修饰的聚乙二醇5000大分子引发剂1.0g溶于1.44ml N,N-二甲基乙酰胺中，搅拌混匀后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯0.525ml、与上述大分子引发剂等摩尔的氯化亚铜催化剂和五甲基二乙烯三胺，40℃反应15小时后得甲氧基封端的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯两嵌段共聚物。
取以上制备的甲氧基封端的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯两嵌段共聚物0.2g溶于0.3ml N,N-二甲基乙酰胺中，搅拌混匀，再加入甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体0.4ml、与上述两嵌段共聚物等摩尔的氯化亚铜催化剂和五甲基二乙烯三胺，40℃反应48小时。真空干燥得产品聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯。
取以上制备的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯100mg，溶于3ml无水N,N’-二甲基乙酰胺中，制成聚合物溶液。取3ml乙二胺溶于2ml无水N,N’-二甲基乙酰胺中，得到乙二胺溶液。将以上制得的聚合物溶液滴加到乙二胺溶液中，60℃搅拌反应6小时后取出，透析纯化24小时，冷冻干燥后得聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物。
实施例2.聚合物胶束的制备
取25mg聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚合物(其中聚乙二醇聚合度为113,胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合度为50，聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合度为60)溶于0.2ml N,N’-二甲基乙酰胺中，超声(200mW)条件下将其滴加到1.8ml去离子水中，涡旋(1000rpm)震荡1分钟,用截留分子量为3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24小时后得到聚合物胶束。
实施例3.化学交联的聚合物胶束的制备
取双端羧基化顺铂(式3化合物)16mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐18mg和1-羟基苯并三唑9.6mg，溶于0.2ml二甲基亚砜中。室温下活化反应2h后，超声条件(200mW)下将其滴加到实施例2所制备的聚合物胶束中，在室温下继续反应12h。用截留分子量3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24h后得到羧基化顺铂交联的聚合物胶束。
实施例4.载药聚合物胶束的制备
取实施例1中所用的三嵌段聚合物22.5mg、阿霉素-Pluronic P85键合前药2.5mg，溶于0.2ml二甲基亚砜中，超声(200mW)条件下将其滴加到1.8ml去离子水中，涡旋(1000rpm)震荡1分钟，用截留分子量3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24小时后得到载药三层聚合物胶束。
实施例5.化学交联载药聚合物胶束的制备
取双端羧基化顺铂(式3化合物)16mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐18mg和1-羟基苯并三唑9.6mg，溶于0.2ml二甲基亚砜中。室温下活化反应2h后，超声条件(200mW)下将其滴加到实施例4所制备的载药的聚合物胶束中，在室温下继续反应12h。用截留分子量3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24h后得到羧基化顺铂交联的载阿霉素前药聚合物胶束。
实施例6：聚乙二醇-聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物的制备
取酰溴修饰的聚乙二醇5000大分子引发剂1.0g溶于1.44mL N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)中，搅拌混匀后加入甲基丙烯酸0.525mL。真空除氧后加入与上述大分子引发剂等摩尔的氯化亚铜铜盐催化剂和五甲基二乙烯三胺，40℃反应15小时后得到甲氧基封端的聚乙二醇-叔丁基聚甲基丙烯酸两嵌段共聚物。
取以上制备的甲氧基封端的聚乙二醇-叔丁基聚甲基丙烯酸两嵌段共聚物0.2g溶于0.3mL N,N-二甲基乙酰胺中，搅拌混匀，再加入甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体0.4mL。除氧后加入与上述两嵌段共聚物等摩尔的氯化亚铜催化剂和五甲基二乙烯三胺，40℃反应48小时，真空干燥得产品聚乙二醇-叔丁基聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯。
取以上制备的聚乙二醇-叔丁基聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯100mg，溶于3ml无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)中。取1ml三氟乙酸(TFA)溶于2ml无水N,N’-二甲基乙酰胺中。将聚合物溶液滴加到TFA中，室温下搅拌反应6小时后取出，用截留量分子量为3500道尔顿的透析袋透析24小时，冷冻干燥后得产品。聚乙二醇-聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合物。
实施例7.聚合物胶束的制备
取25mg聚乙二醇-聚甲基丙烯酸-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚合物(其中聚乙二醇聚合度为113，聚甲基丙烯酸聚合度为50，聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚合度为60)溶于0.2ml N,N’-二甲基乙酰胺中，超声(200mW)条件下将其滴加到1.8ml去离子水中，涡旋(1000rpm)震荡1分钟，用截留分子量为3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24小时后得到聚合物胶束。
实施例8.化学交联的聚合物胶束的制备
取实施例7所制备的聚合物胶束8mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐11.5mg和1-羟基苯并三唑8.1mg，溶于0.2ml二甲基亚砜中，室温下活化反应2h后，超声(200mW)条件下将双端胺基化短肽序列(式7化合物)滴加到其中，在室温下继续反应12h，用截留分子量3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24h后得化学交联的聚合物胶束。
实施例9.载药聚合物胶束的制备
取实施例4中所用的三嵌段聚合物22.5mg、阿霉素-Pluronic P85键合前药2.5mg，溶于0.2ml二甲基亚砜中，超声(200mW)条件下将其滴加到1.8ml去离子水中，涡旋(1000rpm)震荡1分钟，用截留分子量为3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24小时后得到载药三层聚合物胶束。
实施例10.化学交联载药聚合物胶束的制备
取实施例9所制备的载药聚合物胶束8mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐11.5mg和1-羟基苯并三唑8.1mg，溶于0.2ml二甲基亚砜中，室温下活化反应2h后，超声(200mW)条件下将双端胺基化短肽序列(式7化合物)滴加到其中，在室温下继续反应12h，用截留分子量3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24h后得化学交联的载药聚合物胶束。
实施例11.细胞评价
将实施例2中所制备的聚合物胶束、实施例3化学交联的聚合物胶束、实施例4中制备的载药聚合物胶束和实施例5中制备的化学交联的载药聚合物胶束根据图11所示的浓度梯度进行稀释。4T1乳腺癌细胞接种于96孔细胞培养板中(5000细胞/孔)，每孔加入0.2mLRPIM1640培养基(含10％血清)。培养24h后换液，补加培养基(190μl/孔)。在细胞培养板中加入10μL稀释后的胶束悬浮液，与癌细胞共同孵育48h后利用标准MTT法测定细胞代谢活性。如图11所示，在药物浓度为0.36μg/mL时，化学交联的载药聚合物胶束处理组的细胞存活率为20％，表明本发明的化学交联的载药聚合物胶束可显著抑制肿瘤细胞的生长。
将实施例9中制备的载药聚合物胶束和实施例10中制备的化学交联的载药聚合物胶束根据图12所示的浓度梯度进行稀释。4T1乳腺癌细胞接种于96孔细胞培养板中(5000细胞/孔)，每孔加入0.2mL RPIM1640培养基(含10％血清)。培养24h后换液，补加培养基(190μl/孔)。在细胞培养板中加入10μL稀释后的胶束悬浮液，与癌细胞共同孵育48h后利用标准MTT法测定细胞代谢活性。如图12所示，在药物浓度为0.36μg/mL时，化学交联的载药聚合物胶束处理组的细胞存活率为20％，表明本发明的化学交联的载药聚合物胶束可显著抑制肿瘤细胞的生长。
Claims (7)
1.一种化学交联的聚合物胶束，其具有三层结构，包括中性聚乙二醇外层、化学交联中间层以及疏水内层，所述化学交联的聚合物胶束的平均流体力学粒径为20-300纳米；
其中，所述化学交联的聚合物胶束由满足下述1)-3)要求的聚合物胶束经化学交联而成：
1)该聚合物胶束包含以下式1或式2结构所示聚合物，
其中，R1为羧基、氨基、氰基、巯基、醛基或C1-C3烷基；R2为卤素；x为20-300的整数；y为10-100的整数；z为10-100的整数；以及n为0-10的整数；
2)该聚合物胶束包括中性聚乙二醇外层、带正电的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层；或者，包括中性聚乙二醇外层、带负电的聚甲基丙烯酸中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层；
3)该聚合物胶束的平均流体力学粒径为20-60纳米。
2.根据权利要求1所述的化学交联的聚合物胶束，其中，
在式1或式2中，
R1为甲基，
R2为Cl或Br，
x为45-250的整数，y为20-60的整数，z为20-60的整数，以及n为0-4的整数。
3.制备根据权利要求1或2所述的化学交联的聚合物胶束的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将权利要求1或2中所述的聚合物加入到有机溶剂中，超声条件下加入水中，其中，水与有机溶剂的体积比值大于1，透析除去有机溶剂，制备得具有三层结构的聚合物胶束；
步骤二：交联剂溶于有机溶剂中，同时加入羧基活化剂；在0-40℃之间的任意恒定温度反应0.5-6h后，再以交联剂：聚合物中的胺基或羧基为1:10-1:40的摩尔比，超声下滴入步骤一所制备的聚合物胶束中；在0-40℃之间的任意恒定温度反应6-48h后，去离子水透析纯化后冷冻干燥，得到化学交联的聚合物胶束；
其中，步骤一和步骤二中所用的有机溶剂相同或不同，各自独立地选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种；所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、3,3’-二硫二丙酸、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或N-羟基琥珀酰亚胺；
所述交联剂选自下式3-8所示结构中的一种或多种：
4.一种包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束，其由根据权利要求1或2所述的化学交联的聚合物胶束以及包载于所述化学交联的聚合物胶束中的化疗药物组成，所述包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束包括中性聚乙二醇外层、化学交联中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层的多层结构，所述包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束的平均流体力学粒径为20-300纳米；
其中，所包载化疗药物的重量占所述化学交联的聚合物胶束重量的1.0％-20％，所包载的化疗药物和聚合物的重量比为1:5-1:20；所述包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束的平均流体力学粒径为20-300纳米。
5.一种制备如权利要求4所述的包载化疗药物的化学交联的聚合物胶束的方法，所述方法包括：
步骤一：将权利要求1或2中所述的聚合物和化疗药物以重量比为20:1-5:1的比例同时溶解于有机溶剂中，得到含有三嵌段聚合物和化疗药物的混合溶液，在超声条件下将该混合溶液与水以体积比为30:70-10:90的比例混合，然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂和未负载的化疗药物，得到包载有化疗药物的聚合物胶束；
步骤二：将交联剂溶于有机溶剂，同时加入羧基活化剂，在0-40℃之间的任意恒定温度反应0.5-6h后，再以交联剂：聚合物中的胺基或羧基为1:10-40:1的摩尔比，超声下滴入以上制备的包载有化疗药物的聚合物胶束中；在0-40℃之间的任意恒定温度反应0.5-48h后，去离子水透析纯化后冷冻干燥，得到包载有化疗药物的化学交联的聚合物胶束；
其中，步骤一和步骤二中所用的有机溶剂相同或不同，各自独立地选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种；所述交联剂和羧基活化剂的具体种类与权利要求3中的具体种类相同。
6.根据权利要求1或2所述的化学交联的聚合物胶束在制备用于治疗癌症的化疗药物中的应用，其中，所述癌症为耐药性或转移性的癌症。
7.根据权利要求1或2所述的化学交联的聚合物胶束在制备用于治疗癌症的化疗药物中的应用，其中，所述癌症为乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、头颈部癌、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌或前列腺癌。
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