CN111012919B - 聚乙二醇化的icd诱导剂-ido抑制剂纳米缀合物及制备方法与应用 - Google Patents

聚乙二醇化的icd诱导剂-ido抑制剂纳米缀合物及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了聚乙二醇化的ICD诱导剂‑IDO抑制剂纳米缀合物及制备方法与应用，其结构式如下：
Figure DDA0002331637570000011
其中，R为H或
Figure DDA0002331637570000012
重均分子量为1000～5000。本发明提供的聚乙二醇化的ICD诱导剂‑IDO抑制剂纳米缀合物在水性介质中，聚乙二醇化的药物偶联物可以自组装成基于药物的纳米缀合物，不仅可以减少MPS相关器官中的非特异性积累，而且还通过增强的通透性和保留效果提高了对实体瘤的被动靶向能力，从而提高治疗指数。

Description

聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物及制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物及制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乳腺癌是最常被诊断的恶性肿瘤之一，也是导致女性癌症死亡的主要原因。目前，化学疗法仍然是现代癌症治疗的基础。专门的化学疗法，例如奥沙利铂(OXA)可以在癌细胞中诱导真正的免疫原性细胞死亡(ICD)。ICD诱导的免疫原性可以促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的肿瘤间浸润并加速肿瘤消退。但是，被称为一种免疫“冷”肿瘤的乳腺癌具有免疫抑制性肿瘤微环境，淋巴细胞浸润效率低。因此，由于乳腺恶性肿瘤的免疫“冷”性质，化学疗法诱发的ICD的有效性不可避免地受到限制。
作为克服免疫抑制肿瘤微环境和刺激细胞毒性T细胞的最有吸引力的策略之一，癌症免疫疗法的出现，尤其是免疫检查点封锁(ICB)，已经改变了当前的癌症治疗方法。因此，与ICB共同使用ICD可诱导的化学药物可通过同时增加化学疗法引起的免疫原性和通过将免疫“冷”转变为免疫“热”肿瘤位点来消除免疫抵抗，从而协同增强乳腺癌治疗。
作为癌细胞中领先的免疫抵抗检查点，吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)可以将色氨酸(Trp)分解代谢为犬尿氨酸(Kyn)，从而导致免疫无反应和调节性T(Treg)细胞的产生。与其他检查点封锁策略不同，IDO途径可以根据抗原呈递细胞的激活和肿瘤抗原的初始交叉呈递来调节“上游”免疫应答。临床前IDO抑制剂如1-甲基-D-色氨酸(1-MT)已显示出令人信服的潜力，可以提高免疫疗法的疗效。
然而，经过本发明的发明人研究发现，首先，OXA和1-MT采用两药共递送的方式较为繁琐；其次，OXA和1-MT均为疏水性药物，不仅容易造成在MPS相关器官(如肝脏和脾脏)中的非特异性积累，而且治疗效果较差。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物及制备方法与应用，通过将疏水性药物OXA和1-MT与亲水性聚乙二醇(PEG)偶联来合成了一种新型的两亲药物衍生物。在水性介质中，聚乙二醇化的药物偶联物可以自组装成基于药物的纳米缀合物(DNH)，不仅可以减少MPS相关器官(如肝脏和脾脏)中的非特异性积累，而且还通过增强的通透性和保留(EPR)效果提高了对实体瘤的被动靶向能力，从而提高治疗指数。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物，其结构式如下：
Figure BDA0002331637550000021
其中，R为H或
Figure BDA0002331637550000022
重均分子量为1000～5000。
第二方面，本发明提供了一种上述聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，将奥沙利铂氧化为氧化奥沙利铂，采用丁二酸或丁二酸衍生物将聚乙二醇的一端羟基修饰为羧基获得羧基化的聚乙二醇，将氧化奥沙利铂与羧基化的聚乙二醇进行酯化反应获得聚乙二醇化的奥沙利铂，聚乙二醇化的奥沙利铂与1-甲基-D-色氨酸或1-甲基-D-色氨酸的二聚物进行酯化反应；
氧化奥沙利铂的结构式为：
Figure BDA0002331637550000023
羧基化的聚乙二醇的结构式为：
Figure BDA0002331637550000024
聚乙二醇化的奥沙利铂的结构式为：
Figure BDA0002331637550000025
1-甲基-D-色氨酸的二聚物的结构式为：
Figure BDA0002331637550000026
第三方面，本发明提供了一种上述聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂缀合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
第四方面，本发明提供了一种上述聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂缀合物在单药递送系统中的应用。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供了一种用于瘤治疗过程中可实现类似单药递送的聚乙二醇化的免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂-色氨酸代谢阻断剂缀合物，该缀合物包括能够引起强烈效应T细胞免疫反应的ICD诱导化疗药、阻断色氨酸代谢为犬尿氨酸的吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)抑制剂。
2.本发明通过将疏水性药物OXA和1-MT与亲水性聚乙二醇(PEG)偶联来合成了一种新型的两亲药物衍生物。在水性介质中，聚乙二醇化的药物偶联物可以自组装成基于药物的纳米缀合物(DNH)，不仅可以减少MPS相关器官(如肝脏和脾脏)中的非特异性积累，而且还通过增强的通透性和保留(EPR)效果提高了对实体瘤的被动靶向能力，从而提高治疗指数。
3.本发明首次合成了一种从属不同作用机制并可协同抗癌的diMT-OXA(IV)-PEG纳米缀合物，为协同递药带来了极大的便利。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的1-MT-Boc的核磁共振氢谱(1H NMR)图；
图2为本发明实施例1制备的1-MT-Boc的电喷雾质谱(ESI-MS)图；
图3为本发明实施例1制备的diMT-Boc缀合物的核磁共振氢谱(1H NMR)图；
图4为本发明实施例1制备的diMT-Boc缀合物的电喷雾质谱(ESI-MS)图；
图5为本发明实施例1制备的OXA(IV)-PEG2000的核磁共振氢谱(1H NMR)图；
图6为本发明实施例1制备的diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物的核磁共振氢谱(1HNMR)图；
图7为本发明实施例2中diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物抑制体内乳腺肿瘤生长，通过疗程结束时，从实验小鼠身上收集肿瘤块对照图；
图8为本发明实施例2中通过使用游离OXA、游离1-MT、游离1-MT加OXA治、diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物治疗，以及用盐水对照治疗的小鼠肿瘤体积定量图；
图9为本发明实施例2中与用盐水对照治疗比较，用游离OXA、游离1-MT、游离1-MT加OXA、diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物治疗期间小鼠的平均重量；
图10为本发明实施例3中4T1细胞通过用不同浓度的游离OXA、diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物治疗后的存活率。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于利用附加载体进行两药共递送的方式较为繁琐的不足，本发明提出了聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物及制备方法与应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物，其结构式如下：
Figure BDA0002331637550000041
其中，R为H或
Figure BDA0002331637550000042
重均分子量为1000～5000。
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，将奥沙利铂氧化为氧化奥沙利铂，采用丁二酸或丁二酸衍生物将聚乙二醇的一端羟基修饰为羧基获得羧基化的聚乙二醇，将氧化奥沙利铂与羧基化的聚乙二醇进行酯化反应获得聚乙二醇化的奥沙利铂，聚乙二醇化的奥沙利铂与1-甲基-D-色氨酸或1-甲基-D-色氨酸的二聚物进行酯化反应；
氧化奥沙利铂的结构式为：
Figure BDA0002331637550000043
羧基化的聚乙二醇的结构式为：
Figure BDA0002331637550000051
聚乙二醇化的奥沙利铂的结构式为：
Figure BDA0002331637550000052
1-甲基-D-色氨酸的二聚物的结构式为：
Figure BDA0002331637550000053
经过实验发现，1-甲基-D-色氨酸或1-甲基-D-色氨酸的二聚物均能够与聚乙二醇化的奥沙利铂进行反应连接，而当三个或三个以上的1-甲基-D-色氨酸形成多聚物时，无法与聚乙二醇化的奥沙利铂进行反应连接。
而为了增加1-甲基-D-色氨酸的载药量，一般采用1-甲基-D-色氨酸的二聚物的与聚乙二醇化的奥沙利铂反应连接更好。
该实施方式的一种或多种实施例中，采用双氧水将奥沙利铂氧化为氧化奥沙利铂。
该系列实施例中，双氧水中过氧化氢的浓度为25～35％。
该实施方式的一种或多种实施例中，酯化反应的催化剂为HTBU。
该系列实施例中，酯化反应的温度为室温。本发明所述室温是指室内的环境温度，一般为15～30℃。
该实施方式的一种或多种实施例中，酯化反应的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
该实施方式的一种或多种实施例中，聚乙二醇化的奥沙利铂与1-甲基-D-色氨酸或1-甲基-D-色氨酸的二聚物进行酯化反应后，将物料悬浮于三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，然后风干，再滴加冷二乙醚，然后采用二氯甲烷溶解，离心获得沉淀。
该实施方式的一种或多种实施例中，1-甲基-D-色氨酸的二聚物的制备方法为：将1-甲基-D-色氨酸的氨基采用保护基团保护，再添加1-甲基-D-色氨酸进行酰胺化反应获得。
该系列实施例中，保护基团为叔丁氧羰基。
该系列实施例中，采用保护基团保护的过程为：将1-甲基-D-色氨酸与BOC酸酐在碱性条件下进行反应。反应过程中，先在冰浴条件下混合，然后在常温下进行反应。冰浴时间为5～15min，常温反应时间为20～28h。
该系列实施例中，酰胺化反应的催化剂为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和HBTU。
该系列实施例中，酰胺化反应时间为20～28h。
该系列实施例中，酰胺化反应设定时间后，添加盐酸终止反应。
该系列实施例中，酰胺化反应后的物料进行水洗，然后采用硅胶柱层析进行纯化。
该系列实施例中，硅胶柱层析的流动相为二氯甲烷与甲醇的混合液。当二氯甲烷与甲醇的体积比为10:0.9～1.1时，纯化效果更好。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂缀合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明的第四种实施方式，提供了一种上述聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂缀合物在单药递送系统中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)1-MT-Boc的合成：
取一个洁净干燥的5mL磨口圆底烧瓶，精密称定一定量的57.74mg的碳酸氢钠粉末，加入2mL蒸馏水和2mLTHF，混溶，加入搅拌子，搅拌至碳酸氢钠溶解，精密称定一定量的50.9mg NLG8189，60mg BOC粉末，将BOC、NLG8189依次加入5mL磨口圆底烧瓶溶液中，冰浴10min，常温搅拌反应24h。然后旋蒸除去THF，1mol/L HCl调节反应液至PH＝1，加入乙酸乙酯，转移到分液漏斗中。萃取三次后，上层溶液合并，加入适量无水硫酸钠除水，静置过夜后，旋蒸除去乙酸乙酯，制得1-MT-Boc，结构表征如图1～2所示。
(2)diMT-Boc的合成：
取一个洁净干燥的25mL磨口圆底烧瓶，将1-MT-Boc(38.9mg，0.067mmol)，DIPEA(34.98μL，3当量)和HBTU(14.25μL，1.5当量)溶于8.5mL干燥的DMF中，在0℃下搅拌15分钟，然后将1-MT(14.6，0.067mmol)添加至系统中以进行另外24小时反应。然后，加入适量0.1NHCl以终止反应，去除反应液中的水相层，有机相层被水洗2次后，用无水硫酸钠干燥过夜；将干燥产物置于硅胶柱内，干法上样，用配比为二氯甲烷：甲醇＝10:1的流动相洗脱，点板观察以收集产物，合并洗脱下来的产物并做减压蒸干处理，最终得到所制diMT-Boc(产率为69％)缀合物，结构表征如图3～4所示。
(3)OXA-PEG2000缀合物的合成
首先通过30％H2 O2氧化制备OXA(IV)前药。OXA-PEG2000通过在无氧的Schlenk线上通过亚砜基二氯化物(SOCl 2，1mmol)活化羧基使OXA(IV)(52mg，0.12mmol)和PEG2000-COOH(252mg，0.12mmol)结合而合成结构表征如图5所示，。
(4)diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物的制备
将diMT-Boc(64mg，0.12mmol)，HBTU(50mg，0.13mmol)和三乙胺(TEA，1mmol)的OXA(IV)-PEG2000(300mg，0.12mmol)的悬浮液加入3mL DMF中，搅拌24小时后，将所得溶液过滤，然后溶于乙醇中，并用预冷的二乙醚使化合物沉淀。将黄色残余物纯化并干燥以获得具有Boc基团的diMT-OXA(IV)-PEG2000的黄色固体(205mg，收率68％)。将产物(160mg mg，0.117mmol)在室温下悬浮于10％TFA/DCM V/V(1mL)中4小时，将溶液风干，将溶液风干，然后滴加到大体积(40mL)的冷二乙醚中，然后溶解在最小量的DCM(2mL)中。离心收集浅黄色固体，并洗涤3次。然后，我们在1H-NMR(Applied Biosystems，API 4000)中确认了diMT-OXA(IV)-PEG2000的产生，结构表征如图6所示。通过纳米沉淀法制备了基于双重药物的纳米杂化物。然后将DiMT-OXA(IV)-PEG2000溶于乙腈，在10分钟内将其缓慢加入水中。通过在室温下搅拌3小时形成纳米缀合物，然后使用截留分子量为100kDa的Amicon超离心过滤膜洗涤3次，制得diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物。
制备过程的反应式如下所示：
Figure BDA0002331637550000081
实施例2
diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物体内抑制乳腺肿瘤的生长
为了评估diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物在体内抑制肿瘤生长的效力，建立一个乳腺癌的动物模型。在BALB/C小鼠的静脉注射4T1细胞，4T1细胞在BALB/C小鼠体内自发产生肿瘤，且这种肿瘤的特性与人体中的乳腺癌十分相近。将注射过4T1细胞的BALB/c小鼠每三天使用一次游离OXA、游离1-MT、游离1-MT加OXA、diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物治疗，以及用盐水对照治疗。在疗程结束时，从实验小鼠收集肿瘤块测量肿瘤体积以评估一般抗肿瘤作用(图7)。图8显示，使用游离OXA、游离1-MT、游离1-MT加OXA治疗的组的小鼠肿瘤都有所减少，而使用diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物治疗小鼠的肿瘤减少至来自用盐水治疗对照组的肿瘤的约50％以上。这些结果证明了diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物在体内治疗乳腺肿瘤的强效力和功效。
与来自盐水治疗的对照组的那些相比，使用游离OXA、游离1-MT、游离1-MT加OXA、diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物治疗的小鼠的平均重量没有显著降低(小于15％的损失)(图9)，表明diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物在体内具有良好的耐受性。
实验例3
diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物的体外抗肿瘤活性试验
将4T1细胞接种于96孔板上(8000cells/wel1)，每孔体积100μL，接种后，将96孔板于37℃、体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中培养过夜，加入100μL的游离OXA、diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物(浓度范围不同)。于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养2h，用酶联免疫检测仪于450nm处测其吸光度值，计算细胞存活率。结果如图10所示，从测定结果得游离OXA、diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物对4T1细胞的增值均有较好的抑制作用，但diMT-OXA(IV)-PEG2000纳米缀合物对4T1细胞抑制作用比游离的OXA更强，并且进一步表明OXA(IV)前药可以在细胞内氧化还原环境中有效转化为活性OXA。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物，其特征是，结构式如下：
Figure FDA0002975916540000011
其中，R为H或
Figure FDA0002975916540000012
重均分子量为1000～5000。
2.一种权利要求1所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，将奥沙利铂氧化为氧化奥沙利铂，采用丁二酸或丁二酸衍生物将聚乙二醇的一端羟基修饰为羧基获得羧基化的聚乙二醇，将氧化奥沙利铂与羧基化的聚乙二醇进行酯化反应获得聚乙二醇化的奥沙利铂，聚乙二醇化的奥沙利铂与1-甲基-D-色氨酸或1-甲基-D-色氨酸的二聚物进行酯化反应；
氧化奥沙利铂的结构式为：
Figure FDA0002975916540000013
羧基化的聚乙二醇的结构式为：
Figure FDA0002975916540000014
聚乙二醇化的奥沙利铂的结构式为：
Figure FDA0002975916540000021
1-甲基-D-色氨酸的二聚物的结构式为：
Figure FDA0002975916540000022
采用双氧水将奥沙利铂氧化为氧化奥沙利铂；
双氧水中过氧化氢的浓度为25～35％；
酯化反应的催化剂为HTBU；
酯化反应的温度为室温；
酯化反应的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
3.如权利要求2所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，聚乙二醇化的奥沙利铂与1-甲基-D-色氨酸或1-甲基-D-色氨酸的二聚物进行酯化反应后，将物料悬浮于三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，然后风干，再滴加冷二乙醚，然后采用二氯甲烷溶解，离心获得沉淀。
4.如权利要求2所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，1-甲基-D-色氨酸的二聚物的制备方法为：将1-甲基-D-色氨酸的氨基采用保护基团保护，再添加1-甲基-D-色氨酸进行酰胺化反应获得。
5.如权利要求4所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，保护基团为叔丁氧羰基。
6.如权利要求5所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，采用保护基团保护的过程为：将1-甲基-D-色氨酸与BOC酸酐在碱性条件下进行反应。
7.如权利要求4所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，酰胺化反应的催化剂为N,N-二异丙基乙胺和HBTU。
8.如权利要求4所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，酰胺化反应时间为20～28h。
9.如权利要求8所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，酰胺化反应设定时间后，添加盐酸终止反应。
10.如权利要求9所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，酰胺化反应后的物料进行水洗，然后采用硅胶柱层析进行纯化。
11.如权利要求10所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂纳米缀合物的制备方法，其特征是，硅胶柱层析的流动相为二氯甲烷与甲醇的混合液。
12.一种权利要求1所述的聚乙二醇化的ICD诱导剂-IDO抑制剂缀合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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