CN114748642A - 一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束及制备方法和应用 - Google Patents

一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种四价铂药‑聚合物偶联物纳米胶束及制备方法和应用，本发明的四价铂药‑聚合物偶联物纳米胶束是采用四价铂药‑聚合物偶联物（Pt(Ⅳ)‑β‑CD‑PEG）为原料制得，Pt(Ⅳ)‑β‑CD‑PEG的制备方法为：首先以奥沙利铂为原料，通过双氧水氧化构建出具有轴向基团的Pt(Ⅳ)‑OH，使用酸酐对Pt(Ⅳ)‑OH进行羧基化反应得到Pt(Ⅳ)‑COOH；其次，将Pt(Ⅳ)‑COOH与脂肪酸连接构建四价铂药的疏水端结构，再与N‑Boc‑乙二胺盐酸盐发生缩合反应，脱掉Boc保护后得到Pt(Ⅳ)‑NH2；最后以游离的氨基作为连接臂，将Pt(Ⅳ)‑NH2与β‑CD‑PEG偶联得到Pt(Ⅳ)‑β‑CD‑PEG。采用Pt(Ⅳ)‑β‑CD‑PEG制得的Pt(Ⅳ)‑β‑CD‑PEG纳米胶束在体外模拟肿瘤组织的高还原环境中该纳米胶束可持续释放出活性二价铂，24h释放率达95.61%，可用于抗恶性肿瘤的药物中。

Description

一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束及制备方法和应用
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及一种四价铂药-聚合物偶联物、纳米胶束、冻干粉及制备方法和应用。
背景技术
以铂类药物为基础的癌症治疗已经被临床应用约50年的时间，奥沙利铂是铂类抗癌药物的第３代衍生物，已在治疗结直肠癌II期和III期临床试验中作为一线和二线疗法进行了广泛研究，目前已成为全球销量最好的铂治疗药物。但奥沙利铂在临床上有严重的副作用，使用奥沙利铂治疗的患者半数以上可能会存在不良反应，并且奥沙利铂往往在短期使用后会出现耐药性，特别是免疫力太低的部分病人，会因为不适反应严重而不得不放弃治疗，最终导致病情恶化。铂类药物的毒性主要为肝毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性和血液毒性等，来源于其与人体内正常分子和蛋白等的结合，其能够严重地影响患者在治疗过程中的生存质量。随着对铂类药物的深入研究，临床认为二价铂Pt(Ⅱ)向四价铂Pt(Ⅳ)的转化可以有效改善铂基抗癌剂的治疗效果和减少毒副作用。作为铂(II)类药物的前药，四价铂具有空间八面体结构，具有较高的化学稳定性和较少的副作用，它们进入癌细胞内部后可以被细胞内的化学还原剂(如抗坏血酸、谷胱甘肽)还原，释放出抗肿瘤物质铂(II)类药物，从而进一步与DNA交联，攻击肿瘤细胞导致细胞凋亡。此外，四价铂很难被含巯基的生物分子如谷胱甘肽和金属硫蛋白等去活化，能克服由于二价铂容易被去活化而导致的耐药。
药物-聚合物偶联物纳米胶束是一种运送小分子抗癌药物的有效形式，高分子材料β-CD-PEG是一种亲水性强、生物相容性高的线性聚合物，β-环糊精是一种经淀粉酶降解形成的环状低聚糖，因其外缘亲水内腔疏水的特殊结构使得它经常被用于改善难溶性药物溶解度及提高生物利用度等方面。将β-环糊精PEG化，可有效增加药物在体内的血液循环时间，延长药物半衰期。如果使用高分子聚合物材料β-CD-PEG对四价铂药进行结构修饰，两亲性的聚合物Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG在水中能自组装成粒径在200nm以下的纳米胶束，静脉注射进入体内后利用EPR效应实现纳米胶束在肿瘤组织中的靶向分布，还原释放出活性二价铂。构建聚合物纳米胶束运送小分子抗癌药物，可以显著提高药物到达肿瘤部位的浓度及生物利用度，降低毒副作用，减少药物的失活等情况的发生，克服现有的奥沙利铂注射剂存在的缺陷和不足，为肿瘤患者提供一个更加安全有效的用药选择，应有不错的临床价值和经济效益。
因此，亟需提供一种四价铂药-聚合物偶联物（Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG）或纳米胶束或冻干粉及制备方法，将其应用于抗癌药物中以克服上述缺陷。
发明内容
针对上述问题，本发明的第一个目的在于：提供一种四价铂药-聚合物偶联物及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明公开了一种四价铂药-聚合物偶联物，其结构式如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，m=20-200，n=2-40，R为碳的数量为2~30之间的脂肪酸链，所述的四价铂药-聚合物偶联物的分子量为10000-200000Da。
优选地，R为亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸中的一种。
本发明公开了一种四价铂药-聚合物偶联物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以奥沙利铂为原料，通过双氧水氧化反应构建出具有轴向基团的Pt(Ⅳ)-OH，使用酸酐对Pt(Ⅳ)-OH进行羧基化反应，得到Pt(Ⅳ)-COOH；
（2）将Pt(Ⅳ)-COOH与脂肪酸链连接构建四价铂药的疏水端结构，再与N-Boc-乙二胺盐酸盐发生缩合反应，脱掉Boc保护后得到Pt(Ⅳ)-NH2；
（3）以游离的氨基作为连接臂，将Pt(Ⅳ)-NH2与高分子聚合物β-CD-PEG偶联，形成两亲性高分子聚合物Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG，即为四价铂药-聚合物偶联物。
优选地，步骤（1）的具体过程如下：将奥沙利铂于25~50℃超声溶解于去离子水中，避光加入30wt%的过氧化氢溶液于50~70℃油浴搅拌下加热回流5.5~6.5h，温度升高至80~110℃反应1~2h，反应结束后，使用旋转蒸发仪除去残存的过氧化氢溶液后，0~4℃下缓慢滴加冰乙醚溶液并快速搅拌，反应液中析出白色沉淀，真空抽滤收集沉淀，沉淀为Pt(Ⅳ)-OH，将Pt(Ⅳ)-OH与丁二酸酐室温溶解于无水二甲基亚砜中，搅拌过夜，反应液收集，进行冷冻干燥得到产物，即Pt(Ⅳ)-COOH；
其中，Pt(Ⅳ)-OH的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Pt(Ⅳ)-COOH的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
优选地，所述的步骤（1）中Pt(Ⅳ)-OH与丁二酸酐的摩尔比为2.32：2.34。
优选地，步骤（2）的具体过程如下：将Pt(Ⅳ)-COOH与脂肪酸链混合溶解于重蒸无水N,N-二甲基甲酰胺中，无水无氧环境下45~80℃油浴搅拌过夜，反应结束后，减压蒸发除去N,N-二甲基甲酰胺，加超纯水溶解产物，用乙酸乙酯萃取，收集合并乙酸乙酯层，旋干收集产物后真空干燥，得到干燥的Pt(Ⅳ)-COOH-R，称取Pt(Ⅳ)-COOH-R溶解于无水二甲基亚砜中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和三乙胺在氩气保护条件下室温搅拌5~15min，加入N-Boc-乙二胺盐酸盐反应23~25h，冷冻干燥得到Pt(Ⅳ)-Boc-胺，用乙酸乙酯溶解Pt(Ⅳ)-Boc-胺，用饱和食盐水洗涤，收集乙酸乙酯层并旋干，将其溶解于10wt%三氟乙酸的二氯甲烷混合溶液，室温反应25~35min，反应结束后加入甲苯保护化合物中的酯键，旋蒸除掉溶剂，加入冰乙醚放置-20℃冰箱中过夜，抽滤收集沉淀，沉淀为Pt(Ⅳ)-NH2；
其中，Pt(Ⅳ)-COOH-R的结构是如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Pt(Ⅳ)-Boc-胺的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
Pt(Ⅳ)-NH2的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
。
优选地，所述的步骤（2）中Pt(Ⅳ)-COOH与脂肪酸链的摩尔比为1.88：2.07；Pt(Ⅳ)-COOH-R、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、三乙胺和N-Boc-乙二胺盐酸盐的摩尔比为1.25：1.88：1.88：2.51：1.36。
优选地，步骤（3）的具体过程如下：称取β-CD-PEG溶解于无水二甲基亚砜中，在氩气保护条件下加入Pt(Ⅳ)-NH2、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N-二异丙基乙胺、N-羟基丁二酰亚胺室温搅拌23~25h后再补充加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺，继续反应21~23h；将反应液透析后冷冻干燥得到Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG，即为四价铂药-聚合物偶联物；
所述的β-CD-PEG的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
其中，m=20-200，n=2-40。
优选地，所述的步骤（3）中β-CD-PEG、Pt(Ⅳ)-NH2、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N-二异丙基乙胺、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为0.44：3.92：6.15：4.04：3.99；
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分两次加入，先加入部分与后补加部分的摩尔比为4.10：2.05；N-羟基丁二酰亚胺分两次加入，先加入部分与后补加部分的摩尔比为2.67：1.32。
本发明的第二个目的在于：提供一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明公开了一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束的制备方法，具体步骤如下：采用上述四价铂药-聚合物偶联物为原料，将四价铂药-聚合物偶联物溶解于有机溶剂作为油相，滴加至搅拌的水相中，继续搅拌使其分散均匀，除去有机溶剂，得到四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束。
优选地，所述的有机溶剂选自无水乙醇、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中任意一种或者多种的混合溶剂。
优选地，所述的油相与水相的体积比为1:1-10。
优选地，所述的四价铂药-聚合物偶联物在油相中的浓度为0.1-10mg/mL。
本发明还公开了一种采用上述制备方法制备得到的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束。
本发明还公开了一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束的应用，用于抗肿瘤药物。
优选地，所述的的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束通过细胞内吞作用进入到细胞内部，所述的的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束在肿瘤细胞内部解离释放出含有二价铂的奥沙利铂，从而发挥药效对抗癌症，诱导癌细胞凋亡使其发挥细胞毒性，抑制肿瘤生长，而在正常的组织环境和血液循环中稳定存在。
优选地，所述的肿瘤细胞为小鼠结肠癌细胞、人结肠癌细胞、人结肠癌耐奥沙利铂细胞、人肝癌细胞和人乳腺癌细胞。
本发明的第三个目的在于：提供一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束冻干粉及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明公开了一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束冻干粉的制备方法，具体步骤如下：采用上述四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束为原料，将四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束在-30℃以下预冻3~5h，然后采用如下程序进行冷冻干燥：-25℃干燥6~8h；-10℃干燥6~8h；-5℃干燥6~10h；0℃干燥5~8h；10℃干燥4~6h；25℃干燥4~6h，得到四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束冻干粉。
本发明还公开了一种采用上述制备方法制得的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束冻干粉。
本发明的有益效果在于：
本发明合成了Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG，将其在水中自组装成大小均一、分散均匀的纳米胶束。Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束探究胶束在10wt%FBS的PBS溶液中具有良好的胶体稳定性，在高还原环境下会迅速发生解离，释放出含有二价铂的奥沙利铂，24h释放率达95.61%。
Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束通过细胞内吞作用进入到细胞内部，诱导癌细胞凋亡使其对CT-26（小鼠结肠癌细胞）、SW480（人结肠癌细胞）、HCT116（人结肠癌细胞）、HCT116/L（人结肠癌耐奥沙利铂细胞）、HepG-2（人肝癌细胞）、MDA-MB-468（人乳腺癌细胞）具有明显的细胞毒性作用。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中Pt(Ⅳ)-COOH的合成路线图；
图2为实施例1中Pt(Ⅳ)-NH2的合成路线图；
图3为实施例1中Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG的合成路线图，其中，EDC是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，DIEA是N,N-二异丙基乙胺，NHS是N-羟基琥珀酰亚胺，又称N-羟基丁二酰亚胺；
图4为实施例4中Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的体外稳定性表征图；
图5为实施例5中Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的在不同介质下的释放行为图；
图6-8为实施例7中不同铂浓度的奥沙利铂和Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束下的细胞存活率图，其中，(a)为CT26细胞的存活率图，(b)为SW480细胞的存活率图，(c)为HCT116细胞的存活率图，(d)为HCT116/L细胞的存活率图，(e)为HepG-2细胞的存活率图，(f)为MDA-MB-468细胞的存活率图；
每个细胞存活率图中，同一浓度下的4个柱状图从左到右依次为Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束下培养24h的存活率图，Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束下培养48h的存活率图，奥沙利铂培养24h的存活率图，奥沙利铂培养48h的存活率图；
图9为实施例8中奥沙利铂和Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束细胞凋亡形态学变化图；
图10为实施例8中不加药物干预的对照组细胞凋亡研究图；
图11为实施例8中奥沙利铂作用24h后细胞凋亡研究图，其中，（a）为铂含量为0.5μM的奥沙利铂作用24h后细胞凋亡研究图；（b）为铂含量为2.5μM的奥沙利铂作用24h后细胞凋亡研究图；（c）为铂含量为25μM的奥沙利铂作用24h后细胞凋亡研究图；
图12为实施例8中Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束作用24h后细胞凋亡研究图；其中，（a）为铂含量为0.5μM的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束作用24h后细胞凋亡研究图；（b）为铂含量为2.5μM的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束作用24h后细胞凋亡研究图；（c）为铂含量为25μM的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束作用24h后细胞凋亡研究图；
图13为实施例9中小鼠活体荧光强度变化图及小鼠处死后的肿瘤、心、肝、脾、肺、肾的荧光强度图；其中a为给药为DiR-Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的小鼠活体荧光强度变化图；b为给药为DiR溶液的小鼠活体荧光强度变化图；c为给药为DiR-Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的小鼠处死后的肿瘤、心、肝、脾、肺、肾的荧光强度图；d为给药为DiR溶液的小鼠处死后的肿瘤、心、肝、脾、肺、肾的荧光强度图；
图14为实施例10中荷瘤小鼠的时间-体重变化曲线；
图15为实施例10中荷瘤小鼠的时间-肿瘤体积生长曲线；
图16为实施例10中不同组别的肿瘤大小示意图。
具体实施例
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG（四价铂药-聚合物偶联物）的合成
第一步：Pt(Ⅳ)-COOH的合成。
称取3.5g奥沙利铂(Pt(Ⅱ))（也可以简写为奥沙利铂）37℃（此处温度控制在25~50℃均可，优选为37℃）超声溶解于500mL去离子水中，避光加入40mL30wt%过氧化氢溶液于60℃（此处温度控制在50~70℃均可，优选为60℃）油浴搅拌下加热回流6h（此处时间控制在5.5~6.5h均可），温度升高至100℃（此处温度控制在80~110℃均可，优选为100℃）反应1.5h（此处时间控制在1~2h均可），注意避光防止过氧化氢见光分解失效。反应结束后，使用旋转蒸发仪低温除去残存的过氧化氢溶液后，0~4℃下缓慢滴加冰乙醚溶液适量并快速搅拌，反应液中析出白色沉淀，真空抽滤收集沉淀，沉淀为Pt(Ⅳ)-OH。将Pt(Ⅳ)-OH（1g，2.32mmol）与丁二酸酐（234.34mg，2.34mmol）室温溶解于30mL无水二甲基亚砜中，搅拌过夜，反应液收集，进行冷冻干燥24h得到产物，即Pt(Ⅳ)-COOH。该步骤的Pt(Ⅳ)-COOH的合成路线图如图1所示。
第二步：Pt(Ⅳ)-NH2的合成。
将Pt(Ⅳ)-COOH（1g，1.88mmol）与脂肪酸链（0.64mL，2.07mmol）混合溶解于100mL重蒸无水N,N-二甲基甲酰胺中，无水无氧环境下65℃（此处温度控制在45~80℃均可，优选为65℃）油浴搅拌过夜。反应结束后，减压蒸发除去N,N-二甲基甲酰胺，加少量超纯水溶解产物，用乙酸乙酯少量多次萃取，收集合并乙酸乙酯层，旋干收集产物后45℃真空干燥，得到干燥的Pt(Ⅳ)-COOH-R。精密称取Pt(Ⅳ)-COOH-R（1g，1.25mmol）溶解于无水二甲基亚砜中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（360.34mg，1.88mmol）、1-羟基苯并三唑（254.06mg，1.88mmol）、三乙胺（0.35mL，2.51mmol）在氩气保护条件下室温搅拌10min（此处时间控制在5~15min均可），加入N-Boc-乙二胺盐酸盐（240.98mg，1.36mmol）反应24h（此处时间控制在23~25h均可），冷冻干燥24~28h，得到Pt(Ⅳ)-Boc-胺。用乙酸乙酯溶解产物，少量多次用饱和食盐水洗涤，收集乙酸乙酯层并旋干，将其溶解于适量10wt%三氟乙酸的二氯甲烷混合溶液，室温反应30min（此处时间控制在25~35min均可），反应结束后加入适量甲苯保护化合物中的酯键，旋蒸除掉溶剂，加入大量冰乙醚放置-20℃冰箱中过夜，抽滤收集沉淀，沉淀为Pt(Ⅳ)-NH2。该步骤的Pt(Ⅳ)-NH2的合成路线图如图2所示。
第三步：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG的合成。
称取β-CD-PEG（2g，0.44mmol）溶解于50mL无水二甲基亚砜中室温搅拌10min，在氩气保护条件下加入Pt(Ⅳ)-NH2（3.3g，3.92mmol）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（786.71mg，4.10mmol）、N,N-二异丙基乙胺（0.67mL，4.04mmol）、N-羟基丁二酰亚胺（306.82mg，2.67mmol）室温搅拌24h（此处时间控制在23~25h均可）后再补充加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（392.20mg，2.05mmol）、N-羟基丁二酰亚胺（152.08mg，1.32mmol），继续反应22h（此处时间控制在21~23h均可）。将反应液转移装入再生纤维素透析袋（25000Da）中在5L超纯水中透析36h，透析过程中要不断更换新的超纯水。透析后水溶液冷冻干燥45h，得到淡黄色固体Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG，即为四价铂药-聚合物偶联物。该步骤的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG的合成路线图如图3所示。四价铂药-聚合物偶联物的结构式如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
其中，m=20-200，n=2-40，R为碳的数量为2~30之间的脂肪酸链，优选地，包括饱和和不饱和的碳链，优选为亚油酸(Linoleicacid,LA)、α-亚麻酸(α-Linolenicacid,ALA)、γ-亚麻酸(γ-Linolenicacid,GLA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid,EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid,DHA)、花生四烯酸(Arachidonicacid,AA)中的一种；所述的四价铂药-聚合物偶联物的分子量为10000-200000Da。
实施例2：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG中铂含量的测定
使用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）定位Pt来测定Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG高分子聚合物中的铂含量，仪器条件：发射功率1000W，等离子气流量15L/min，辅助气流量1.5L/min，雾化器流量0.75L/min，检测模式：轴向观测。通过对铂元素谱线的灵敏度分析，最终确定Pt的最佳测定波长为203.646nm，在该波长下其他元素无干扰，使测得结果准确。
最终测得Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG聚合物中铂含量为13.51wt%，RSD为1.0%。
实施例3：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的制备
精密称取10mg的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG，溶解于有机溶剂（2mL体积比为1：9的无水乙醇和四氢呋喃的混合液）中作为油相。在室温、1000rpm搅拌条件下，将含药溶液缓慢滴加至10mL超纯水（水相）中，自组装纳米胶束随机形成，同温同速继续搅拌1h，使其分散均匀。37℃旋转蒸发除去有机溶剂，用0.22μm微孔滤膜过滤，并用超纯水定容得到浓度为1mg/mL的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束，使用马尔文粒径以测得粒径为160.2±0.5nm，PDI为0.105±0.006。
需要说明的是：此处有机溶剂选自无水乙醇、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中任意一种或者多种的混合溶剂均可；油相与水相的体积比控制为1:1-10均可，四价铂药-聚合物偶联物在油相中的浓度控制为0.1-10mg/mL均可。
实施例4：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束体外稳定性研究
考察纳米胶束在含10wt%FBS的PBS溶液（此处百分数为体积百分数）中的稳定性，具体测定方法如下：连续7天使用马尔文粒度仪测定Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束在含10wt%FBS的PBS溶液中的稳定性，将Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束与含10wt%FBS的PBS溶液等体积混合后，置于37℃恒温振荡器中振荡，以粒径和PDI作为考察指标。
Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的体外稳定性表征图，如图4所示，图4的实验结果表明，Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束与孵育介质（10wt%FBS的PBS溶液）共同孵育7天内其粒径与PDI没有发生明显的波动，表明Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束在模拟生理环境的条件下具备良好的胶体稳定性。
实施例5：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束体外释放行为研究
采用高效液相色谱法，建立奥沙利铂标准曲线，回归方程为：y=2902.3x-2864.3（R2=0.9999），奥沙利铂在3.125μg/mL~100.00μg/mL浓度范围内线性关系良好。
高效液相色谱色谱条件为：流动相：甲醇-0.1wt%TFA水（10:90,v/v）；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL。
选择模拟体内正常环境的PBS（PH7.4）溶液和模拟肿瘤还原环境的5mM抗坏血酸钠溶液两种缓冲溶液来评价Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的体外释放行为。配制浓度为1.25mg/mL的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG自组装纳米胶束装入再生纤维素透析袋（3500Da）中，两端用透析袋夹夹紧，分别将透析袋置于装有50mL缓冲溶液的烧杯中完全浸没，在恒温37℃模拟体内温度下搅拌，在0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、24h时取200μL透析液待测并补充等体积新鲜缓冲液介质，以维持体系浓度不变。取出的透析液用0.22μm微孔滤膜过滤后在HPLC中测得药物释放含量。
Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的在不同介质下的释放行为图，如图5所示，图5的试验结果表明，Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束在抗坏血酸钠还原环境中可持续释放，24h累积释放率为95.61%，接近完全释放，而在PBS缓冲液中纳米胶束呈现缓慢释放状态，24h累积释放率仅有37.57%。Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束在高还原环境下发生解离，四价铂被还原为二价铂，当其进入到体内时会在肿瘤细胞内部的高还原性环境中释放出小分子的二价奥沙利铂，发挥药效对抗癌症，而在正常的组织环境和血液循环中，仅存在缓慢的低量释放，极大限度的提高了药物的生物利用度，降低体内毒副作用。
实施例6：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的冻干粉的制备
Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束在-30℃以下预冻3h，然后可参考如下程序进行冷冻干燥：-25℃（8h）→-10℃（8h）→-5℃（10h）→0℃（8h）→10℃（6h）→25℃（6h），即得到Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束冻干粉。冻干粉复溶前后的粒径大小无明显差异，复溶后无聚集现象产生。
需要说明的是，上述时间可以依据实际情况进行调理，保证在以下操作的范围内即可：将Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束在-30℃以下预冻3~5h，然后采用如下程序进行冷冻干燥：-25℃干燥6~8h；-10℃干燥6~8h；-5℃干燥6~10h；0℃干燥5~8h；10℃干燥4~6h；25℃干燥4~6h，即得到四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束冻干粉，即为Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束冻干粉。
实施例7：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的肿瘤细胞毒性作用
采用CCk8法考察铂类药物对肿瘤细胞（肿瘤细胞包括CT26细胞、SW480细胞、HCT116细胞、HCT116/L细胞、HepG-2细胞、HCT116/L细胞）的细胞毒性。收集处于生长对数期的肿瘤细胞，用胰酶消化并计数，配置成105个/mL的细胞悬液，接种至96孔板上，每孔加100μL细胞悬液。接种后于37℃、5wt%CO2培养箱环境中使细胞充分贴壁，孵育24h后置换如下培养基，分别为空白对照（含1wt%FBS的完全培养基）、含1wt%FBS的奥沙利铂（Pt(Ⅱ)）培养基和含1wt%FBS的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束培养基，Pt含量浓度为50μM、25μM、12.5μM、2.5μM、0.5μM、0.1μM，每孔加入100μL，设三个重复组，观测分别培养24h和48h后的细胞存活率，吸出培养基每孔加入10%CCk8培养基混合液继续培养3h后，酶标仪450nm处检测各孔的吸光值，按如下公式计算得到细胞存活率：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
其中，As为含药物溶液的实验孔吸光度，Ac为不含药物溶液的对照孔吸光度，Ab为只含有CCk8培养基混合液的空白孔吸光度，计算不同浓度奥沙利铂和Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束下的细胞存活率，得到细胞存活率图，如图6、图7、图8所示。IC50值通过SPSS软件进行处理计算，如下表1所示：
表1Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束和奥沙利铂在不同细胞系的IC50值
Figure DEST_PATH_IMAGE017
表1中：CT26为小鼠结肠癌细胞、SW480为人结肠癌细胞、HCT116为人结肠癌细胞、HCT116/L为人结肠癌耐奥沙利铂细胞、HepG-2为人肝癌细胞、MDA-MB-468为人乳腺癌细胞。
实验结果表明，随着铂含量浓度的增加，细胞存活率降低，药物对癌细胞的抑制作用增强。且在控制铂含量浓度相同的条件下，延长药物作用时间可有效抑制细胞的存活率。其中Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束较奥沙利铂（Ⅱ）而言对于癌细胞的毒性杀伤力要大。同时，从HCT116和HCT116/L的实验结果可以看出，Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束在HCT116敏感细胞株、耐药细胞株的IC50值并无明显差异，但奥沙利铂(Pt(Ⅱ))明显对于耐药细胞株作用时不能表现出很好的抑制作用，证明Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束能够显著克服奥沙利铂的耐药性。
实施例8：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的肿瘤细胞凋亡研究
第一步：细胞凋亡形态学观察。
取对数生长期细胞，用胰酶进行消化后计数，将细胞悬液稀释至1×106个/mL，6孔板每孔接种1mL细胞悬液，37℃、5.0wt%CO2培养箱中培养24h，加入铂含量相等的奥沙利铂(Pt(Ⅱ))和Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束孵育24h后弃去含药培养基，PBS轻轻洗涤2次，使用显微镜观察并进行拍照，如图9所示。
实验结果表明，细胞凋亡往往会伴随着细胞形态的变化，如细胞圆球化、体积皱缩、脱落等。细胞凋亡情况与浓度呈正相关，浓度越大，细胞凋亡越多。与奥沙利铂组细胞相比，Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束组细胞在铂含量浓度为2.5μM及25μM时均出现明显的凋亡形态变化，主要特征为细胞数量减少且发生明显皱缩，内部产生了空泡状结构。
第二步：细胞凋亡率测定
AnnexinV-FITC是一种对细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和性经FITC荧光标记的结合蛋白。当细胞发生凋亡或坏死时，PS外翻从膜内转移至膜外，使用该结合蛋白可作为一敏感探针来检测暴露的PS。PI染料在细胞膜受损的情况下能够进入到胞内与DNA结合，使用该染料来检测细胞膜的完整性。因此采用AnnexinV-FITC/PI联用的方法，准确检测肿瘤细胞的几种状态：Q1（机械损伤细胞）-细胞膜破损严重，AnnexinV-FITC阴性，PI阳性；Q2（晚期凋亡/坏死细胞）-细胞膜受损通透性增加，AnnexinV-FITC与PI双阳性；Q3（早期凋亡细胞）-PS外翻但细胞膜完整，AnnexinV-FITC阳性，PI阴性；Q4（活细胞）-AnnexinV-FITC与PI双阴性。
采用AnnexinV-FITC与PI双染的方法，利用流式细胞仪检测药物处理24h后细胞凋亡的情况。取对数生长期细胞，用胰酶进行消化后计数，将细胞悬液稀释至2×105个/mL，12孔板每孔接种1mL细胞悬液，37℃、5.0wt%CO2培养箱中培养24h，加入铂含量相等的奥沙利铂(Pt(Ⅱ))和Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束孵育24h后弃去含药培养基，用不含EDTA的胰酶消化后1000rpm离心5min，收集细胞，用PBS洗涤2次，离心收集细胞，加入500μL1×BindingBuffer结合液将细胞悬液吹打均匀，加入5μLFITC与10μLPI染色，避光保存10min后，用200目尼龙筛网过滤，将细胞悬液转移至流式管中，上机测试。得到细胞凋亡研究图10-12。
实验结果表明，图10为不加药物干预的对照组细胞凋亡研究图，94.2%处于双阴性区，有少量细胞增殖过程中伴随的正常的坏死和凋亡，保障实验结果有较强的说明性。图11为奥沙利铂作用24h后细胞凋亡研究图，从图11中可以看出：在铂含量为0.5μM、2.5μM、25μM时，奥沙利铂作用24h后凋亡率分别为11.08%（5.95%Q2+5.13%Q3）、17.41%（9.81%Q2+7.60%Q3）、27.4%（15.2%Q2+12.2%Q3）；图12为Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束作用24h后细胞凋亡研究图，从图12中可以看出：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束作用24h后早期凋亡率分别为18.69%（7.39%Q2+11.3%Q3）、29.9%（16.8%Q2+13.1%Q3）、44.00%（19.4%Q2+24.6%Q3）。在药物同样作用24h时，Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束能够提高癌细胞的凋亡率，表现出与奥沙利铂相比更优的作用效果，具有很好的应用前景。
实施例9：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的体内分布
第一步：DiR标记Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束
精密称取1mgDiR溶解于1mL无水乙醇中，制得浓度为1mg/mL的DiR-乙醇溶液。将250μLDiR-乙醇溶液缓慢滴加至Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG自组装纳米胶束混合体系中，在室温、1000rpm的转速边搅拌1h，使其充分混匀，在37℃水浴减压旋蒸后，用0.22μm微孔滤膜过滤后冻干，即可得到DiR-Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束。
第二步：小鼠体内药物分布
取处于对数生长期的鼠源结肠癌细胞（CT26），用PBS溶液轻洗两次，加入2ml的0.25wt%胰蛋白酶-EDTA溶液消化30s后加入10wt%FBS的1640培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打将细胞分散均匀并收集至15mL离心管中，离心机1000rpm离心5min，弃去上清液收集细胞，使用PBS溶液充分洗涤细胞2-3次，进行细胞计数，配置成107个/mL的细胞悬液。5周龄BALB/C小鼠（14~17g）适应性饲养一周后进行肿瘤模型的构建，吸取100μL的107个/mL的细胞悬液接种至小鼠右侧腋窝皮下。每天观察肿瘤细胞的生长情况，直至肿瘤体积长至大约200-250mm3时开始实验，随机分为2组，每组3只，分别将DiR溶液和DiR-Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束通过小鼠尾静脉给药，DiR剂量为1mg/kg。给药后分别于1h、4h、6h、24h、48h、72h、120h时用小动物活体成像仪进行测定，处死小鼠取其肿瘤、心、肝、脾、肺、肾，用生理盐水清洗后拍照。DiR的激发波长设为740nm，发射波长设为790nm。
小鼠活体荧光强度变化图及小鼠处死后的肿瘤、心、肝、脾、肺、肾的荧光强度图，如图13所示，图13的实验结果表明，同DiR溶液组相比，DiR-Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束中的四价铂药纳米胶束有效延长了DiR的半衰期，实现了长循环的目的，24h后DiR溶液组表现为严重的肝脏和肺部聚集，对肿瘤部位没有靶向分布。相反，DiR标记的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束在肿瘤位置具有更强的荧光信号，而在正常组织器官中的荧光强度较弱。Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束可以发挥EPR效应，显著提高药物在肿瘤处的蓄积，减少正常组织中的分布，在实现肿瘤处高蓄积的同时也避免了对非肿瘤组织的损伤。
实施例10：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束的减毒增效作用
以接种CT26结肠癌细胞的荷瘤鼠为模型，当实验小鼠的肿瘤体积生长到大约100-150mm3时，随机分为6组，每组7只，通过小鼠尾静脉给药。
其中A组：空白组（5wt%葡萄糖溶液）；
B组：奥沙利铂组（7.5mg/kgPt）；
C组：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束低度组（1.875mg/kgPt）；
D组：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束中浓度组（3.75mg/kgPt）；
E组：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束高浓度组（7.5mg/kgPt）；
F组：Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG溶液组（7.5mg/kgPt）。
以体重、肿瘤体积变化作为评价指标，从第0天起每日测量并记录。于第21天将小鼠处死后剥离肿瘤部位并拍照、称重，以肿瘤平均瘤重来计算药物抑瘤率。荷瘤小鼠的时间-体重变化曲线如图14所示，荷瘤小鼠的时间-肿瘤体积生长曲线如图15所示，不同组别的肿瘤实图如图16所示，不同组别的抑瘤率如下表2所示：
表2不同组别的抑瘤率
Figure DEST_PATH_IMAGE019
以上实验结果表明：奥沙利铂具有严重的毒性，致小鼠体重短时间内波动明显或致死，而其它组别小鼠体重能够正常稳定增长，说明四价铂药纳米胶束能显著降低奥沙利铂带来的毒副作用，具有良好的生物安全性。与空白对照组相比，Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束高、中、低剂量组的抑瘤率分别是63.23%、42.88%、24.15%，且纳米胶束的抑瘤作用优于等效铂含量剂量的奥沙利铂。综上，等效剂量的Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG纳米胶束具有很好的减毒增效作用。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (15)

1.一种四价铂药-聚合物偶联物，其特征在于，其结构式如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，m=20-200，n=2-40，R为碳的数量为2~30之间的脂肪酸链，所述的四价铂药-聚合物偶联物的分子量为10000-200000Da。
2.根据权利要求1所述的一种四价铂药-聚合物偶联物，其特征在于，R为亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸中的一种。
3.一种如权利要求1或2所述的四价铂药-聚合物偶联物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）以奥沙利铂为原料，通过双氧水氧化反应构建出具有轴向基团的Pt(Ⅳ)-OH，使用酸酐对Pt(Ⅳ)-OH进行羧基化反应，得到Pt(Ⅳ)-COOH；
（2）将Pt(Ⅳ)-COOH与脂肪酸链连接构建四价铂药的疏水端结构，再与N-Boc-乙二胺盐酸盐发生缩合反应，脱掉Boc保护后得到Pt(Ⅳ)-NH2；
（3）以游离的氨基作为连接臂，将Pt(Ⅳ)-NH2与高分子聚合物β-CD-PEG偶联，形成两亲性高分子聚合物Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG，即为四价铂药-聚合物偶联物。
4.根据权利要求3所述的四价铂药-聚合物偶联物的制备方法，其特征在于：步骤（1）的具体过程如下：将奥沙利铂于25~50℃超声溶解于去离子水中，避光加入30wt%的过氧化氢溶液于50~70℃油浴搅拌下加热回流5.5~6.5h，温度升高至80~110℃反应1~2h，反应结束后，使用旋转蒸发仪除去残存的过氧化氢溶液后，0~4℃下滴加冰乙醚溶液并搅拌，反应液中析出白色沉淀，真空抽滤收集沉淀，沉淀为Pt(Ⅳ)-OH，将Pt(Ⅳ)-OH与丁二酸酐室温溶解于无水二甲基亚砜中，搅拌过夜，反应液收集，进行冷冻干燥得到产物，即Pt(Ⅳ)-COOH；
其中，Pt(Ⅳ)-OH的结构式如下：
Figure 580944DEST_PATH_IMAGE002
Pt(Ⅳ)-COOH的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
5.根据权利要求4所述的四价铂药-聚合物偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）中Pt(Ⅳ)-OH与丁二酸酐的摩尔比为2.32：2.34。
6.根据权利要求3所述的四价铂药-聚合物偶联物的制备方法，其特征在于：步骤（2）的具体过程如下：将Pt(Ⅳ)-COOH与脂肪酸链混合溶解于重蒸无水N,N-二甲基甲酰胺中，无水无氧环境下45~80℃油浴搅拌过夜，反应结束后，减压蒸发除去N,N-二甲基甲酰胺，加超纯水溶解产物，用乙酸乙酯萃取，收集合并乙酸乙酯层，旋干收集产物后真空干燥，得到干燥的Pt(Ⅳ)-COOH-R，称取Pt(Ⅳ)-COOH-R溶解于无水二甲基亚砜中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和三乙胺在氩气保护条件下室温搅拌5~15min，加入N-Boc-乙二胺盐酸盐反应23~25h，冷冻干燥得到Pt(Ⅳ)-Boc-胺，用乙酸乙酯溶解Pt(Ⅳ)-Boc-胺，用饱和食盐水洗涤，收集乙酸乙酯层并旋干，将其溶解于10wt%三氟乙酸的二氯甲烷混合溶液，室温反应25~35min，反应结束后加入甲苯保护化合物中的酯键，旋蒸除掉溶剂，加入冰乙醚放置-20℃冰箱中过夜，抽滤收集沉淀，沉淀为Pt(Ⅳ)-NH2；
其中，Pt(Ⅳ)-COOH-R的结构是如下：
Figure 153877DEST_PATH_IMAGE004
Pt(Ⅳ)-Boc-胺的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Pt(Ⅳ)-NH2的结构式如下：
Figure 464773DEST_PATH_IMAGE006
。
7.根据权利要求6所述的四价铂药-聚合物偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）中Pt(Ⅳ)-COOH与脂肪酸链的摩尔比为1.88：2.07；Pt(Ⅳ)-COOH-R、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、三乙胺和N-Boc-乙二胺盐酸盐的摩尔比为1.25：1.88：1.88：2.51：1.36。
8.根据权利要求3所述的四价铂药-聚合物偶联物的制备方法，其特征在于：步骤（3）的具体过程如下：称取β-CD-PEG溶解于无水二甲基亚砜中，在氩气保护条件下加入Pt(Ⅳ)-NH2、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N-二异丙基乙胺、N-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌23~25h后再补充加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺，继续反应21~23h；将反应液透析后冷冻干燥得到Pt(Ⅳ)-β-CD-PEG，即为四价铂药-聚合物偶联物；
所述的β-CD-PEG的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
其中，m=20-200，n=2-40。
9.根据权利要求8所述的四价铂药-聚合物偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤（3）中β-CD-PEG、Pt(Ⅳ)-NH2、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N-二异丙基乙胺、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为0.44：3.92：6.15：4.04：3.99；
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分两次加入，先加入部分与后补加部分的摩尔比为4.10：2.05；N-羟基丁二酰亚胺分两次加入，先加入部分与后补加部分的摩尔比为2.67：1.32。
10.一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：采用权利要求1所述的四价铂药-聚合物偶联物为原料，将四价铂药-聚合物偶联物溶解于有机溶剂作为油相，滴加至搅拌的水相中，继续搅拌使其分散均匀，除去有机溶剂，得到四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束。
11.根据权利要求10所述的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自无水乙醇、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中任意一种或者多种的混合溶剂；所述的油相与水相的体积比为1:1-10；所述的四价铂药-聚合物偶联物在油相中的浓度为0.1-10mg/mL。
12.一种如权利要求10-11任意一项所述的制备方法制得的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束。
13.一种如权利要求12所述的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束的应用，其特征在于，用于抗肿瘤药物。
14.一种四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束冻干粉的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：采用权利要求12所述的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束为原料，将四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束在-30℃以下预冻3~5h，然后采用如下程序进行冷冻干燥：-25℃干燥6~8h；-10℃干燥6~8h；-5℃干燥6~10h；0℃干燥5~8h；10℃干燥4~6h；25℃干燥4~6h，得到四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束冻干粉。
15.一种如权利要求14所述的制备方法制得的四价铂药-聚合物偶联物纳米胶束冻干粉。
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