KR100943043B1 - 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산복합체 자기-조립 나노입자, 이의 제조방법 및 이를포함하는 간질환 진단용 조영제 - Google Patents

산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산복합체 자기-조립 나노입자, 이의 제조방법 및 이를포함하는 간질환 진단용 조영제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 간질환 진단용 조영제에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체에 상자성 산화철 나노입자를 봉입된 복합체 자기-조립 나노입자를 제조하고, 이를 이용하여 수용성 용매 내에서 분산성이 우수하고, 일정시간 경과 후 체외로 배출되어 체내에 축적되지 않아 안전할 뿐만 아니라 자기공명영상화능이 우수한 간질환 조영제로서 사용될 수 있다.
산화철 나노입자, 키토산, 리놀레산, 복합체, 자기-조립 나노입자, 조영제

Description

산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 간질환 진단용 조영제{A hydrophilic chitosan-hydrophobic linoleic acid nanoparticles loading iron oxide nanoparticles, a preparation method of thereof and a contrast agent for diagnosing liver diseases including the same}
본 발명은 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 간질환 진단용 조영제에 관한 것이다.
소수성 및 친수성을 모두 포함하는 양쪽성 공중합체로 구성되는 나노입자들이 최근 약물 전달, 유전자 치료법 및 진단영상에 매우 유용하게 사용되고 있다. 상기 양쪽성 공중합체는 수용액 내에서 약 10 ~ 100 nm의 크기의 코어-쉘(Core-shell)구조로 자기 조립화(self-assembly)되는 특징을 갖는다. 이러한 특징으로 인해 상기 나노입자들을 자기-조립 나노입자라고 한다. 자기 조립된 나노입자의 쉘 부분은 수용액 내에서 분산성을 향상시킬 수 있는 물질로 이루어지고, 자기-조립된 나노입자의 코어는 소수성 약물, 형광 입자 또는 조영제 등에 효과적인 물질을 봉입(loading 또는 encapsulating)할 수 있다. 상기 자기-조립 나노입자가 합쳐진 약물 및 영상제제는 망상내피세포계에 의한 투석으로부터 보호될 수 있으며 장기간 혈액 내에서 순환될 수 있다.
최근에 자기공명영상(MRI) 제제로서 초상자성 자기-조립 나노입자에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 나아가, 수용성 용매에서 분산된 초상자성 산화철 나노입자는 자기공명영상, 자성 약물전달체, 암진단 및 치료제, 분자생물분리 등의 생명의학분야에 다양하게 적용되고 있다. 상기 영역에 적용되기 위해서는, 수용성 용매에 잘 분산되고 좁은 입자분포도를 갖는 초상자성 자기-조립 나노입자가 요구된다.
초상자성 산화철 나노입자의 표면은 소수성이기 때문에, 수용성 용매에서 쉽게 응집되거나, 침전되는 문제가 있고, 생체 내 정맥주사로 초상자성 산화철 나노입자를 주입하면, 세망내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의해 혈액으로부터 빠르게 제거되고, 단핵식균세포를 통해 간, 비장 및 림프절과 같은 여러 장기에 축적되어 독성을 일으키는 문제가 있다.
이러한 문제들을 해결하기 위해, 초상자성 산화철 나노입자의 표면을 개질시켜 수용성 용매에서의 분산성을 증가시키는 연구가 지속적으로 진행되었으며, 그 결과 표면개질물질로서 주로 덱스트린(Dextrin), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 플루 란(pullulan)등과 같은 고분자들이 초상자성 산화철 나노입자의 개질에 많이 사용되어왔다.
키틴(chitin)으로부터 유도된 양이온 천연 다당류인 키토산은 독성이 없고, 생채적합성 및 생분해성이 우수하여 약물 및 유전자 전달에 유용하게 사용되어오고 있으며, 생체소재로 활용가능성이 우수한 소재로 알려져 있다. 반면, 천연 키토산은 중성 수용액에 용해되기가 어렵고, 산성 용액에서만 용해되어 생체활성물질로 활용되기에 제한되는 문제가 있다.
이에, 중성 수용성 용매에서 용해가능한 수용성 키토산(water-soluble chitosan, WSC)은 상업적으로 이용가능하고 생체의학에 부분적으로 사용되고 있다. 키토산은 D-글루코사민(D-glucosamine) 과 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-glucosamine)이 베타-(1,4)-글루코사이드(β-glucosidic bond) 결합으로 연결된 구조로 이루어져 있고, 자유 아민기 및 히드록시기를 포함한다. 상기 자유 아민기 및 히드록시기는 소수성 잔기를 가진 물질을 결합시킴으로써 분자간 소수성 인력을 증가시킴으로써 자기-조립능을 갖게하는 소수성 부분들로 개질될 수 있다.
리놀레산(Linoleic acid, LA)은 소수성 사슬을 갖는 천연 지방산이므로 자기-조립 나노입자를 제조하는데 적합하다. 리놀레산은 또한 간 지질대사에 영향을 미친다. Noone 그룹은 리놀레산의 기하 및 위치 이성질체의 혼합물인 복합 리놀레산(Conjugaeted Linoleic Acid, CLAS)이 초저밀도 지질단백질(VLDL, Very-low-density lipoprotein) 콜레스테롤 농도를 감소시킨다는 연구를 보고한 바 있다. Yotsumoto 그룹은 복합 리놀레산의 특정부분 이성질체가 HepG2 세포에서 세포 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 합성을 저해함을 증명한 바 있다.
이에, 본 발명자들은 수용성 키토산과 리놀레산을 공중합시켜 양쪽성 고분자를 형성시킴으로써 자기-조립 능력을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 지질 대사에 의해 간 세포 내 축적시킬 수 있을 것으로 기대하고, 자기-조립 공중합체에 산화철 나노입자(Fe3O4)와 같은 자성 입자를 봉입시켜 간 세포를 타겟하는 영상화를 달성 및 개선할 수 있는 조영제 및 이를 제조하는 방법을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체 자기-조립 나노입자의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체 자기-조립 나노입자를 포함하는 간질환 진단용 조영제를 제공하는데 있다.
상기의 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 수용성 용매에서 자기-조립능력이 있는 공중합체를 이용한 나노입자 내부에 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 복합체 자기-조립 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 복합체 자기-조립 나노입자를 포함하는 간질환 진단용 조영제를 제공한다.
본 발명에 따른 복합체 자기-조립 나노입자는 수용성 키토산과 리놀레산을 공중합시켜 양쪽성 고분자를 형성시킴으로써 자기-조립 능력을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 지질 대사에 의해 간 내 축적시킬 수 있을 것으로 기대하고, 수용성 키토산-리놀레산 공중합체 자기-조립 나노입자에 산화철 나노입자(Fe3O4)와 같은 자성 입자를 봉입시켜 간 세포를 표지하는 영상화를 달성 및 개선할 수 있는 조영제로서 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자는 상기 산화철 나노 입자를 코어로 하여 둘러싸여 코어-셀 구조로 이루어진다. 상기 산화철 나노입자는 제조시 표면에 잔존해 있는 올레산 및 올레일 아민으로 둘러싸여 있어 상기 공중합체 중 소수성 리놀레산이 산화철 나노입자를 둘러싸면서 코어를, 수용성 키토산은 쉘을 형성한다. 상기와 같이 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자는 그 표면이 친수성으로 이루어져 있어 수용액 내에서 침전이 일어나지 않고, 소수성의 산화철 나노입자에 혈액 내 단백질이 흡착되는 것을 방지하고, 혈액순환 중 지속될 수 있는 시 간을 증대시킬 수 있다. 뿐만 아니라 수용성 키토산은 천연 추출물로서 인체에 무해하다.
이때, 상기 산화철 나노입자는 통상의 나노입자의 크기면 제한 없이 사용될 수 있으나, 다만 조영제로 사용될 수 있는 범위 내인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 10 ~ 100 nm인 것이 바람직하다.
상기 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 나노입자 역시 통상의 나노입자 크기면 제한 없이 사용될 수 있으나, 조영제로 사용될 수 있는 범위 내인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 수용성 키토산의 분자량은 바람직하게는 1000~ 250,000 Da이다. 상기 수용성 키토산의 분자량이 상기의 범위를 벗어나면 복합체 나노 입자가 형성되지 않는 문제가 있다.
나아가, 본 발명은 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체를 제조하는 단계(단계 1); 산화철 나노입자를 제조하는 단계(단계 2); 및 상기 단계 1에서 제조된 공중합체에 상기 단계 2에서 제조된 산화철 나노입자를 봉입시키는 단계(단계 3)를 포함하여 이루어지는 간질환 진단용 조영제의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 단계 1은 하기 화학식 1로 표시되는 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체를 제조하는 단계이다.
Figure 112008009461237-pat00001
(상기 n 및 m 은 서로 독립적으로 1 ~ 60 이다.)
본 발명에 따른 상기 단계 1은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 수용성 키토산 용액에 리놀레산을 첨가하는 단계(단계 a1); 상기 단계 a1)의 반응용액을 실온에서 교반하여 EDC 용액을 첨가하는 단계(단계 a2); 및 상기 단계 a2)에 의한 반응용액을 투석하여 분리 및 정제하고 동결건조시키는 단계(단계 a3)를 포함하여 이루어진다.
Figure 112008009461237-pat00002
(상기 n 및 m 은 서로 독립적으로 1 ~ 60이다.)
본 발명에 따른 공중합체를 제조하기 위한 상기 단계 a1)은 수용성 키토산 용액에 리놀레산을 첨가하는 단계이다. 상기 리놀레산은 수용성 키토산과 결합하여 소수성을 증가시켜 다음 단계에서 제조되는 산화철 나노입자와 자기 조립체 형성을 가능하게 하는 역할을 한다.
이때, 상기 리놀레산의 첨가량은 수용성 키토산의 용해도를 저하시켜 자기조립 나노입자의 형성을 방해하지 않는 범위 내에서 첨가되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 수용성 키토산의 글루코사민 잔량 0.2 ~ 0.7 몰 배로 첨가하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 공중합체를 제조하기 위한 단계 a2)는 상기 단계 a1)의 반응용액을 실온에서 교반하여 EDC 용액을 첨가하는 단계이다.
상기 공중합체를 제조하기 위해, 상기 단계 a1)의 반응물에 메탄올에 용해된 카르복시기 활성화제인 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(1-ethyl-3-(3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC)을 첨가하여 24 시간 동안 반응시킨 후, 투석을 통해 분리키고, 세척 및 동결건조하여 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체를 얻는다.
본 발명에 따른 상기 단계 2는 산화철 나노입자를 제조하는 단계이다.
상기 단계 2의 산화철 나노입자는 일반적으로 알려져 있는 공침법, 졸-겔법, 열분해법 또는 에멀전법 등을 제한 없이 사용하여 제조할 수 있으나, 바람직하게는 열분해법을 사용할 수 있다. 상기 열분해법은 공침법에 비해 산화철 나노입자의 크기 조절이 용이하고 결정성 및 상자성이 우수한 나노입자를 제조할 수 있다. 나아가, 상기 산화철 나노입자의 성장은 시드 성장법을 재차 적용하여 적정 크기로 성장시킬 수 있다.
본 발명에 따른 단계 3은 상기 단계 1에서 제조된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체를 완충용액에 용해시키고, 클로로포름에 용해된 단계 2에서 제조된 산화철 나노입자를 첨가한 후, 상기 혼합물을 초음파처리하여 수행하는 단계이다(도 1참조).
상기 단계 3은 상기 단계 1에서 제조된 공중합체를 인산염생리식염완충액 완충용액에 용해시키고, 클로로포름에 용해된 단계 2에서 제조된 산화철 나노입자를첨가한 용액을 얼음-물 반응기에서 10분 동안 초음파 처리하여 산화철 나노입자를 공중합체에 봉입시킨 후, 실온에서 12시간 동안 교반시켜 포함되어 있는 유기 용매를 제거하고, 실린지 필터로 여과을 통하여 수행할 수 있다.
나아가, 본 발명은 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체를 포함하는 간질환 진단용 조영제를 제공한다.
본 발명에 따른 조영제는 그 표면이 친수성으로 이루어져 있어 수용액 내에서 침전이 일어나지 않고, 소수성의 산화철 나노입자에 혈액 내 단백질이 흡착되는 것을 방지하고, 혈액순환 중 지속될 수 있는 시간이 증대시킬 수 있다. 뿐만 아니라 수용성 키토산은 천연 추출물로서 인체에 무해하여 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자의 제조 1
단계 1. 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체의 제조
수용성 키토산(WSC) 100 mg을 증류수와 메탄올이 2:8 로 혼합된 용매에 넣어 수용성 키토산 용액을 제조한 후, 상기 제조된 수용성 키토산 용액에 비율 수용성 키토산의 글루코사민 잔량 0.5 mol/mol으로 리놀레산(LA)을 추가하고, 0.07 g/L로 메탄올에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노)-프로필)(EDC, 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)용액을 첨가하고 상온에서 24 시간 동안 교반시켜 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체를 제조하였다. 상기 제조된 공중합체를 투석하여 메탄올과 물의 혼합물로부터 분리시키고 정제하였고, 분리시킨 최종 용액은 감압하여 동결건조하여 최종 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체를 수득하였다.
상기 제조된 수용성 키토산-리놀레산 공중합체를 H1-NMR로 분석하여 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 수용성 키토산-리놀레산 공중합체가 δ1.3 = CH3 (리놀레산의 메틸기); δ2.0 = CH3 (수용성 키토산의 아세틸 그룹); δ3.5 ~ 4.0 = CH (수용성 키토산의 탄소)의 양성자를 갖는 것을 확인하였고, 당의 양성자에 대하여 리놀레산에 존재하는 메틸기 비율을 계산하여 단위 수용성 키토산의 무수글루코오즈(anhydroglucose) 100 개당 43.7개의 리놀레산이 치환되어 있는 것을 확인하였 다.
단계 2. 산화철 나노입자의 제조
Fe(acac)3 2 mmol, 올레익 산(oleic acid) 6 mmol, 올레일 아민(oleylamine) 6 mmol, 헥사데카노익 산(hexadecanoic acid) 10 mmol를 라운드 플라스크에 넣고 유기 용매 페닐에테르(phenyl ether) 20 ㎖을 첨가한 후 질소로 퍼지(purge)하여 상기 플라스크 내의 공기를 제거한다. 다음으로, 초기 100 ℃로 30분간 상기 플라스크를 유지시킨 후, 265 ℃까지 가열시키고 30 분 동안 반응시켰다. 이때, 최종반응중 용액의 색이 검정색으로 바뀌고, 반응종료 후 자석을 이용하여 입자를 수집하였다. 이후, 수집된 산화철 나노입자를 세척과 건조를 통해 4 nm의 산화철 나노입자를 합성하였다.
상기 합성된 산화철 나노입자에 상기 과정을 2번 반복하여 12 nm의 산화철 나노입자로 성장시키고 이를 투과전자현미경(TEM, Transmittane electron microscopy, H-7650, Hitachi-Ltd, JAPAN)과 입도분석기(DLS, diynamic light sacttering, UPA-150, Microtrac Inc. USA)으로 분석하여 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 합성된 산화철 나노입자의 크기는 10 ~ 15 nm로 좁은 크기 분포를 갖고 있는 것을 확인하였다.
단계 3. 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체 내로의 봉입
상기 단계 1에서 제조된 수용성 키토산-리놀레산 공중합체 5 mg을 0.1 M의 농도와 pH 7.4의 산도를 갖는 PBS 완충용액 5 ㎖에 용해시킨 후 4 ℃에서 5분 동안 초음파를 조사하여 수용성 키토산-리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자 용액을 제조하였다. 클로로포름에 상기 단계 2에서 제조된 마그네타이트 나노입자를 용해하여 0.1 ㎖를 제조한 수용성 키토산-리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자 용액에 첨가하고, 4 ℃에서 10분 동안 초음파를 조사하여 코어-쉘 구조를 갖는 조영제를 제조하였다. 제조된 코어-쉘 구조를 갖는 조영제는 상온에서 12시간 교반시켜 포함되어 있는 유기용매를 완전히 증발시켜 제거한 후, 실린지 필터(기공크기: 0.5 ㎛)를 이용하여 여과시켜 조영제를 제조하였다.
상기 제조된 실시예 1을 입도분석(DLS)과 텅스포인산(phosphotungstic acid, PTA)를 음성 염색한 후 투과전자현미경(TEM)을 실시하여 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 내부에 다수의 산화철 나노입자가 존재하는 것을 확인하였고, 상기 실시예 1의 크기는 평균 67±13 nm인 것을 확인하였다.
< 실시예 2> 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합 체 자기-조립 나노입자의 제조 2
상기 실시예 1을 산화철 나노입자의 농도가 0.17 mM가 되도록 농축시켜 제조하였다.
< 실시예 3> 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자의 제조 3
상기 실시예 1을 산화철 나노입자의 농도가 0.26 mM가 되도록 농축시켜 제조하였다.
< 비교예 1> 산화철 나노입자가 봉입하지 않은 수용성 키토산-소수성 리놀레 산 복합체 자기-조립 나노입자의 제조
산화철 나노입자를 봉입하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
<비교예 2>
T2 감쇄효과를 알아보기 위해서, 증류수를 사용하였다.
<실험예 1> 산화철 나노입자의 농도에 따른 감쇄효과
도입되는 산화철 나노입자의 농도에 따른 T2 감쇄효과를 평가하기 위해, 실시예 1 내지 실시예 3 및 비교예 1 내지 2의 T2 세기를 1.5 T 자기공명영상진단기(GE Signa Exite Twin-Speed, GE Health Care, Milwaukee, WI)을 이용하여 ㅂ바반복시간(repetition time, TR)은 2400 ms이고 에코시간(echo time,TE)은 20 ~ 200 ms으로 측정하여 도 5 및 표 1에 나타내었다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예 1 비교예 2
철농도(mM) 0.10 0.17 0.26 0 0
1/T2(S-1) 59.5 81.5 125.7 2.1 2.0
도 5 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 산화철 나노입자가 없는 비교예 1 및 비교예 2의 나노입자에서는 아무런 영상이 나타나지 않았지만, 실시예 1은 59.5 S-1, 실시예 2는 81.5 S-1, 실시예 3은 125.7 S- 1 으로 측정되어 산화철 나노입자를 포함하는 수용성 키토산-리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자의 농도가 증가할수록 조영제의 민감도가 증가하는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 생체 독성 평가
본 발명에 따른 조영제의 독성을 평가하기 위해, XTT 세포 독성 평가를 수행하였다. HepG2 세포는 96-well에서 1×104 의 밀도로 10 ㎕의 배지에서 종균하는데, 상기 배지에는 1 mM, 2.5 mM, 5 mM의 실시예 1을 첨가하였다. 상기 각각의 배지에 종균된 HepG2 세포는 37 ℃에서 각각 24 시간, 48 시간 동안 배양시킨 후, 배지는 아스피레이터(aspirator)를 통해 제거시키고, 인산염생리식염완충액(PBS)으로 세척하고, XTT 용액을 첨가하였다. 생존율은 450 nm의 흡광도를 측정하여 결정하여 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 농도와 배양시간에 관계없이 높은 생존율을 보여, 본 발명에 따른 조영제는 생체에 내에서 독성이 없는 것을 확인하였다.
<실험예 3> MR 영상 촬영
간 실질세포 표적 MR 영상을 촬영하기 위하여, 실시예 1의 시간에 따른 MR영상을 촬영하여 도 7에 나타내었다. 또한 T2 감쇄효과를 정량적으로 평가하기 위해 간 조직 내의 신호세기(signal intensity, SI)를 나노입자 주입 전과 후 동일한 부위를 선택하여 ROI(regions of interest)와 간 조직에 가까운 등 근육의 신호세기를 측정하여 하기 수학식 1에 의해 간 조직 T2 감쇄효과를 계산하여 그래프로 나타내었다.
Figure 112008009461237-pat00003
도 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 후 30분이 경과하면 신호의 세기가 69.2%, 1시간이 경과하면 78.2%로 신호가 감쇄하여 간 질환부위를 정확하게 진단할 수 있다. 또한, 실시예 1주입 후 2시간이 경과하면 13.9 %로 신호 감쇄효과가 급 격히 감소했다. 이는 주입후, 2시간이 경과하면 소변을 통해 상기 실시예 1이 배출되어 신장, 비장 등의 다른 장기에 축적되지 않는 것을 나타낸다. 이로써 본 발명에 따른 조영제는 신호의 세기가 강하여 간질환 부위를 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 체내에 축적되지 않아 안전하게 사용할 수 있음을 확인하였다
<실험예 4> 체내 조영제 검출
체내 주입된 산화철 나노입자의 존재를 확인하기 위하여, 실시예 1을 단독으로 주입한 쥐(A)와 리놀레산과 실시예 1을 동시에 주입한 쥐(B)의 간 조직을 적출하여 고정액으로 처리한 다음 블록을 제조하여 조직 섹션을 프루시안 블루 염색하여 현미경으로 관찰한 사진을 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 1을 단독으로 주입한 쥐의 간에는 조영제가 주로 간 실질 세포의 세포질 내에 축적되어 있는 것을 확인하였으나 리놀레산과 실시예 1을 동시에 주입한 쥐의 간 세포에서는 거의 관찰되지 않아 리놀레산이 실시예 1의 시토졸(cytosol)로의 전위를 저지하는 것을 확인하였다.
이에, 실시예 1의 간 세포질에서 축적되는 것은 본 발명에 따른 공중합체에 의해 유도된다는 것을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태의 제조과정을 나타낸 개략도이고((a)산화철 나노입자, (b)수용성 키토산, (c) 리놀레산);
도 2는 본 발명에 사용된 자기-조립 공중합체를 NMR 분석한 그래프이고;
도 3은 본 발명에 사용된 산화철 나노입자의 투과전자현미경으로 촬영한 사진(inset) 및 입도분석한 그래프이고;
도 4는 본 발명에 따른 일 실시형태를 투과전자현미경으로 촬영한 사진(A) 및 입도분석한 그래프(B)이고;
도 5는 본 발명에 따른 일 실시형태의 주입 농도에 따른 신호강도를 나타낸 그래프(A) 및 자기공명영상(B)이고;
도 6은 본 발명에 따른 일 실시형태의 농도에 따른 독성을 나타낸 그래프이고;
도 7은 본 발명에 따른 일 실시형태의 시간에 따른 자기공명사진이고, 이에 따른 신호강도를 나타낸 그래프(A:주입 30분 후, B:주입 1시간 후, C: 주입 1시간 반 후, D:주입 2시간 후)이고; 및
도 8은 본 발명에 따른 일 실시형태 주입 후, 이를 프러시안 블루(Prussian blue)염색하여 관찰한 현미경 사진이다(A:실시예 1 주입, B:실시예 1 및 리놀레산 주입).

Claims (11)

  1. 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체는 상기 산화철 나노 입자를 코어로 하여 둘러싸여 있는 코어-셀 구조인 것을 특징으로 하는 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 산화철 나노입자는 소수성 분자로 둘러싸여 있는 것을 특징으로 하는 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 소수성 분자는 올레산 및 올레일 아민인 것을 특징으로 하는 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 수용성 키토산의 분자량은 1000 ~ 250,000 Da인 것을 특징으로 하는 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체를 제조하는 단계(단계 1);
    산화철 나노입자를 제조하는 단계(단계 2); 및
    상기 단계 1에서 제조된 공중합체에 상기 단계 2에서 제조된 산화철 나노입자를 봉입시키는 단계(단계 3)를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제1항의 복합체 자기-조립 나노입자의 제조방법.
    <화학식 1>
    Figure 112010002013214-pat00004
    (상기 n 및 m 은 서로 독립적으로 1 ~ 60이다.)
  7. 제6항에 있어서, 상기 단계 1은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이 수용성 키토산 용액에 리놀레산을 첨가하는 단계(단계 a1);
    상기 단계 a1)의 반응용액을 실온에서 교반하여 1-에틸-3(3-디메틸 아미노프로필)-카보디이미드(EDC) 용액을 첨가하는 단계(단계 a2); 및
    상기 단계 a2)에 의한 반응용액을 투석하여 분리 및 정제하고 동결건조시키는 단계(단계 a3)를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제1항의 복합체 자기-조립 나노입자의 제조방법.
    <반응식 1>
    Figure 112010002013214-pat00005
    (상기 n 및 m 은 서로 독립적으로 1 ~ 60이다.)
  8. 제7항에 있어서, 상기 EDC 용액은 메탄올에 EDC를 용해시킨 것을 특징으로 하는 제1항의 복합체 자기-조립 나노입자의 제조방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 단계 2의 산화철 나노입자는 열분해법으로 제조되고, 시드성장법(Seed mediated growth method)에 의해 일정크기로 성장시키는 것을 특징으로하는 제1항의 복합체 자기-조립 나노입자의 제조방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 단계 3은, 상기 단계 1에서 제조된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 공중합체를 용해시킨 완충용액에 클로로포름에 용해된 단계 2에서 제조된 산화철 나노입자를 첨가한 후, 초음파처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제1항의 복합체 자기-조립 나노입자의 제조방법.
  11. 제1항의 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산 복합체 자기-조립 나노입자를 포함하는 간질환 진단용 조영제.
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