CN109498548B - 一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法，明属于生物医药技术领域。本发明所制备获得pH响应性纳米凝胶是通过单端为胺基的聚乙二醇单甲醚作为大分子引发剂一步引发γ‑苯甲基‑L‑谷氨酸酯‑N‑内羧酸酐或γ‑苯甲基‑L‑天冬氨酸酯‑N‑内羧酸酐开环聚合去制备聚氨基酸主骨架，随后主骨架尾端用于接枝光敏剂，而侧链则用阳离子分子修饰去增加蛋白质的负载能力和溶酶体逃逸能力。最后，通过内核交联反应去构建pH响应性的纳米凝胶体系，从而实现体内安全传送、靶向投放、快速细胞摄取，体内释放蛋白质和激活光敏剂的目的。这将有利于推动蛋白质与光动力联合治疗在医疗领域的发展。

Description

一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶及其 制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应 性聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法。

背景技术

癌症已经成为威胁人类健康和致死率最高的严重疾病之一，并显示逐年递增的趋势。根据国家癌症中心2017年最新公布数据显示，全国每天约一万人确诊癌 症，死亡率高达60％，且癌症患病者逐渐趋于年轻化。因此，开发无毒、高效、安 全的和多种治疗共存的癌症治疗体系对于人类的发展，家庭的幸福甚至社会的和谐 尤为重要。

目前治疗恶性肿瘤常用的方法是化学治疗和放射放疗，尽管它们能快速杀伤繁殖较快的肿瘤细胞，但也能误杀健康的细胞并容易诱发恶性肿瘤细胞产生耐药性， 同时也对人体正常器官和组织造成极大伤害。因此开发新的途径用于治疗恶性肿瘤 已具有划时代意义。蛋白质治疗已经吸引了很多专家的兴趣，由于它能阻断某种特 殊的信号去有效的消除多种恶性肿瘤。然而，蛋白质药物在血液循环中常常容易聚 集和降解，更易被免疫系统清除。因此，很大程度降低治疗效率，并且重复给药也 增加了患者的经济压力。基于裸蛋白质治疗药物使用中存在的严重缺陷和为了有效 抑制非特异性吸收和蛋白质酶解，开发一种生物相容性好、安全性和稳定性高的纳 米载体去有效的传递蛋白质到达肿瘤细胞，对于癌症的治疗具有重大意义。

然而单一的治疗体系已经不能满足目前癌症治疗的要求。基于光动力疗法具有毒副作用小、可重复性、相对成本低和高的抗肿瘤活性的优势。如何通过一种纳米 体系来实现蛋白质和光动力协同治疗，是许多材料和医学者追求的目标。

刺激响应性纳米凝胶作为一种常见的载药体系，如何提高蛋白质的负载效率、 溶酶体逃逸能力、促进蛋白质在肿瘤内聚集、增加细胞摄取和可控制的蛋白质释放 能力，同时又具有光动力治疗和诊断成像的功能，是解决上述问题的重要方法。

本发明利用单端为胺基的聚乙二醇单甲醚作为大分子引发剂，一步引发γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐(BLG-NCA)或γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐(BLA-NCA)开环聚合去制备纳米凝胶主骨架，随后主骨架尾端用光敏剂修饰，而侧链则 用阳离子分子修饰去增加蛋白质的负载能力和溶酶体逃逸能力。最后，通过内核交 联反应去构建pH响应性的纳米凝胶体系，从而实现光动力与蛋白质联合治疗以及 诊断成像的目的。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法，该纳米凝胶能效解决现有技术中蛋 白质负载效率低、蛋白质逃逸能力差，光敏剂传递效率低、诊断敏感性差等问题， 并且实现蛋白质与光敏剂同时治疗的功能。

本发明所述的一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的制备 方法，其步骤如下：

(1)将L-谷氨酸γ-苄酯或L-天冬氨酸α-苄酯与三光气共混于无水四氢呋喃溶剂中，L-谷氨酸γ-苄酯或L-天冬氨酸α-苄酯与三光气的质量用量比例为1：0.62～0.7， 无水四氢呋喃溶剂中L-谷氨酸γ-苄酯或L-天冬氨酸α-苄酯的浓度范围为0.1～0.2 mg/mL；在温度60～80℃条件下反应90～150分钟，之后把溶液倒入大量的正己烷 中，在-30～-15℃条件下重结晶，之后过滤，并用正己烷清洗并抽滤，所得粉末溶解 于无水乙酸乙酯与正己烷体积比1：2～5的共混溶液中，再放入-30～-15℃条件下重 结晶；最后过滤除去溶剂，并在室温条件下，抽真空20～30h，得到纯净的γ-苯甲 基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐(BLG-NCA)或γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐(BLA- NCA)氨基酸单体；

(2)利用单端为胺基的聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH₂)作为大分子引发剂，引 发氨基酸单体BLG-NCA或BLA-NCA一步开环聚合制备聚氨基酸主骨架[聚乙二醇单 甲醚-block-聚(L-谷氨酸)(mPEG-b-PBLG)或聚乙二醇单甲醚-block-聚(L-天冬氨 酸)(mPEG-b-PBLA)]；通过调节大分子引发剂与BLG-NCA或BLA-NCA的摩尔比例 来制备含有不同数量重复单元结构的mPEG-b-PBLG或mPEG-b-PBLA。

具体地：将1～3g的单端为胺基的聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH₂)与BLG-NCA或 BLA-NCA氨基酸单体溶于10～15mL无水三氯甲烷或无水二氯甲烷中，在氮气保护、 25～35℃下反应70～80小时，单端为胺基的聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH₂)与BLG- NCA或BLA-NCA氨基酸单体的摩尔用量比例为1：40～60；反应结束后，溶液倒入于 1～2L乙醚溶液中，通过沉降获得聚氨基酸主骨架(mPEG-b-PBLG或mPEG-b- PBLA)；最后，将反应溶液过滤，所得固体真空干燥得到纯净的mPEG-b-PBLG或 mPEG-b-PBLA聚氨基酸主骨架；

(3)利用聚氨基酸主骨架尾端残余的自由氨基基团与含有羧基基团的光敏剂发生缩合反应，来获得光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版，使其具有光动力治疗的能 力，再利用缩合剂去活化光敏剂中的羧基基团。

具体地：将15～30mg缩合剂与30～50mg含有羧基基团的光敏剂共同溶解于 10～20mL无水二甲基亚砜中，在室温条件下反应2～5小时去活化光敏剂中的自由羧 基基团；随后把含有1～1.5g mPEG-b-PBLG或mPEG-b-PBLA聚氨基酸主骨架的20～30 mL无水二甲基亚砜溶液滴加到上述溶液中，并在室温条件下继续反应20～30h；然 后在去离子水溶液中，采用截留分子量3000～4000的透析膜，透析纯化60～90h；透 析后的溶液在-60～-40℃下冷冻干燥，得到光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版，-30～- 15℃下保存；

(4)光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版侧链上含有的大量苄基基团可以通过一步氨化反应，用含双端氨基基团的侧链阳离子单体所取代，苄基基团的取代率可以通 过反应时间和苄基基团与阳离子单体的摩尔比例来控制，从而获得阳离子聚氨基 酸，使其具有增加蛋白质负载和溶酶体逃逸能力。

具体地：把1～1.2g光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版溶解于10～15mL无水二甲 基亚砜中，随后将含有双端氨基基团的侧链阳离子单体注射到上述溶液中，并在氮 气保护，40～55℃下反应70～80小时；反应后的溶液装入截留分子量为7000～10000 的透析膜中，用过量的0.01～0.05M盐酸水溶液透析纯化48～72小时，透析后的溶 液在-60～-40℃冷冻干燥，得到光敏剂修饰的阳离子聚氨基酸；光敏剂修饰的聚氨基 酸配体模版与含有双氨基基团的侧链阳离子单体的用量摩尔比为1：20～30；

(5)在一定pH值水溶液中，用溶解于四氢呋喃溶剂中的对苯二甲醛分子作为 核内交联剂与阳离子聚氨基酸侧链中阳离子单体剩余的自由氨基基团发生反应去产 生pH敏感性苯甲酰亚胺基团，从而制备pH响应性聚氨基酸纳米凝胶。

具体地：将0.5～1mL含有对苯二甲醛分子的四氢呋喃溶液(浓度为10～20 mg/mL)逐滴加入到含有100mg光敏剂修饰的阳离子聚氨基酸的水溶液(pH 7.4～8.5，通过0.01mol/L氢氧化钠溶液调节pH)中，在室温下强烈搅拌30～40分 钟，随后四氢呋喃溶剂通过旋转蒸发去除，剩余的水溶液置于截留分子量 30000～50000的透析膜，通过大量的去离子水透析纯化60～72h，然后在-60～-40℃ 冷冻干燥，得到pH响应性聚氨基酸纳米凝胶；对苯二甲醛分子与聚氨基酸侧链上 阳离子单体剩余的氨基基团的摩尔比为0.6～1：1；

(6)用带有负电荷的蛋白质作为蛋白质模型，与pH响应性聚氨基酸纳米凝胶 在一定质量比例下，在pH为7.4的水溶液中共混，并且在室温下搅拌1小时，通过 与纳米凝胶电荷之间、氢键和疏水相互作用，来实现pH响应性聚氨基酸纳米凝胶 对于蛋白质的负载。

具体地：把带有负电荷的蛋白质与pH响应性聚氨基酸纳米凝胶混合在pH为 7.4～8.0(通过0.01mol/L氢氧化钠溶液调节)的水溶液中，并且在室温下搅拌40～60 分钟，来实现pH响应性聚氨基酸纳米凝胶对于蛋白质的负载；随后用截留分子量 为300000～500000的透析膜，在大量的PBS溶液中透析24～48小时去除剩余的蛋白 质；透析产物于--60～-40℃下冷冻干燥，得到蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨 基酸纳米凝胶，在-30～-15℃下保存；带有负电荷的蛋白质与pH响应性聚氨基酸纳 米凝胶的质量用量比例为0.2～0.5：1；

步骤(2)所述的作为大分子引发剂单端为胺基的聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH₂) 的平均分子质量为1000～5000；

步骤(3)所述的含有羧基基团的光敏剂为二氢卟吩e6(Ce6)、卟啉、改性四 羧基化卟啉、改性吲哚菁绿或脱镁叶绿中的一种；

步骤(3)所述的活化光敏剂中羧基基团的缩合剂是二环己基碳二亚胺(DCC) 与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组合的复合缩合剂，或N'N-羰基二咪唑缩合剂；

步骤(4)所使用的含有双氨基基团的侧链阳离子单体为二亚乙基三胺(Diethylenetriamine)、三亚乙基四胺(Triethylenetetramine)或四亚乙基五胺(Tetraethylenepentamine)中的一种；

步骤(6)所述的带有负电荷的蛋白质可以是人体血清蛋白、络氨酸酶和卵清 蛋白(Ova)其中的一种。

步骤(6)所述的蛋白质与pH响应性纳米凝胶是通过电荷、氢键和疏水之间相 互做用实现负载的。

与目前技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供一种简单、有效的pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的方法，选用 甲氧基聚乙二醇胺作为大分子引发剂，一步开环聚合制备聚氨基酸主骨架，随后尾 端用光敏剂分子修饰，实现光敏剂负载；通过侧链氨化反应，来制备不同类型的阳 离子聚氨基酸，从而调控纳米凝胶蛋白质的负载能力；最终，通过对苯二甲醛分子 与侧链剩余的氨基基团在核内发生反应，来制备pH响应性纳米凝胶。与传统纳米 粒子相比，该法具有调控方式简单，灵活，重复性强等优点。

(2)制备获得的纳米凝胶展现了良好的生物相容性和生物可降解性。

(3)较小尺寸的纳米凝胶和表面带有的正电荷，促进纳米凝胶在肿瘤部位的 有效聚集以及细胞摄取。

(4)在肿瘤细胞内，低pH环境，可以加速蛋白质从溶酶体逃逸以及促进蛋白 质释放和激活荧光和光动力治疗。

(5)蛋白质与光动力治疗有效的结合，可以提高癌症治疗效率。

附图说明

图1为实施例1中光敏剂修饰的阳离子聚氨基酸的氢核磁谱图；图中标记的每 一个基团特征峰证明了光敏剂修饰的阳离子聚氨基酸合成成功。

图2为实施例1中pH响应性纳米凝胶制备过程示意图，对苯二甲醛分子作为 核内交联剂与阳离子聚氨基酸侧链中阳离子单体剩余的自由氨基基团发生反应去产 生pH敏感性基团，从而制备pH响应性聚氨基酸纳米凝胶；

图3为实施例1中pH响应性纳米凝胶透射电镜图；表示为pH响应性聚氨基酸 纳米凝胶浓度为1mg/mL时高清透射电镜图，标尺尺寸为200nm；

图4为实施例1中在不同pH值条件下，pH响应性纳米凝胶表面电荷和粒径尺 寸变化图；从图中可以看到在pH 7.4的时候，pH响应性纳米凝胶外表面带有很高 的正电荷，平均粒径尺寸在大约40nm，在pH 6.4的时候，pH响应性纳米凝胶外表 面的正电荷稍微增加，粒径尺寸降低到5nm，说明在低pH值下，纳米凝胶被瓦 解。

图5为将Ce6静脉注射到荷瘤裸鼠体内和将实施例1中制备的HSA负载的pH 响应性的纳米凝胶注射到荷瘤裸鼠体内24h后荷瘤裸鼠荧光强度对比图。从图中荷 瘤裸鼠肿瘤部位的荧光强度对比可知，这种蛋白质负载的pH响应性纳米凝胶可以 有效的聚集在肿瘤部位。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对发明详细说明。

实施例1

(1)在制备过程中，10g L-谷氨酸γ-苄酯和6.3g三光气置于250mL带有磁性 转子的三口烧瓶中，并倒入100mL的无水四氢呋喃中使其完全溶解，反应物在60 度油浴锅中在氮气保护的条件下反应1.5小时。随后，反应溶液投入到1L冰冻的正 己烷中，然后放入-20度冰箱内重结晶整晚。第二天，混合溶液被过滤，并用乙酸 乙酯和正己烷(体积比为1：2)混合溶液再重结晶2次在-20度条件下。最终，溶 液被过滤，剩余的固体通过真空干燥，来获得纯净的BLG-NCA单体。

(2)1g单端为胺基的聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH₂,平均分子量为5000)和2.7g BLG-NCA溶于10mL无水氯仿中，反应溶液在氮气保护，室温下反应72小时。反应 结束后，溶液倒入于1L乙醚溶液中，通过沉降获得聚氨基酸主骨架(mPEG-b- PBLG)。最后，溶液被过滤，剩余的固体通过真空干燥，来获得纯净的mPEG-b- PBLG聚氨基酸主骨架。

(3)将18mg二环己基碳二亚胺(DCC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 作为缩合剂与50mg Ce6共同溶解于10mL无水二甲基亚砜中，在室温条件下反应 2小时去活化光敏剂中的自由羧基基团。随后把含有1g mPEG-b-PBLG聚氨基酸主骨 架的20mL无水二甲基亚砜被滴加到上述溶液，并在同样条件下继续反应24小时。 在去离子水溶液中，采用截留分子量3500的透析膜，透析72h。冷冻干燥，得到 光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版mPEG-b-PBLG-Ce6。

(4)把1g光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版溶解于10mL无水二甲基亚砜中， 随后将10mL二亚乙基三胺阳离子单体注射到上述溶液中，并在氮气保护，55℃下 反应72小时；反应后的溶液装入截留分子量为8000的透析膜中，用过量的0.05M 盐酸水溶液透析纯化72小时，然后在-40℃冷冻干燥获得光敏剂修饰的阳离子聚氨 基酸然后通过冷冻干燥获得光敏剂修饰的阳离子聚氨基酸(mPEG-b-P(Deta)LG-Ce6)， 使其具有增加蛋白质负载和溶酶体逃逸能力。通过图2核磁谱图分析证明其结构。

(5)将0.7mL含有对苯二甲醛的四氢呋喃溶液(浓度为1mg/mL)逐滴加入到 含有100mg mPEG-b-P(Deta)LG-Ce6的水溶液(pH 8.0)中，在室温强烈搅拌40分 钟，随后四氢呋喃溶剂通过旋转蒸发去除，剩余的水溶液置于截留分子量30000的 透析膜，通过大量的去离子水透析纯化72小时。在-40℃冷冻干燥，得到pH响应 性纳米凝胶。通过图3中的高清透射电子显微镜可知，得到的纳米凝胶平均尺寸大 约在40nm。并且通过图4中马尔文粒度分析仪以及zeta电势可知在pH 7.4的时 候，pH响应性纳米凝胶外表面带有很高的正电荷，平均粒径尺寸在大约40nm，在 pH 6.4的时候，pH响应性纳米凝胶外表面的正电荷稍微增加，粒径尺寸降低到5 nm，说明在低pH值下，纳米凝胶被瓦解。

(6)用人体血清蛋白作为蛋白质模型，把2mg人体血清蛋白与10mg pH响应 性聚氨基酸纳米凝胶混合在pH为7.4的水溶液，并且在室温下搅拌1小时，来实现 pH响应性聚氨基酸纳米凝胶对于蛋白质的负载。随后多余的蛋白质用截留分子量 为300000的透析膜，在大量的PBS溶液中，透析24h去除，得到蛋白质与光敏剂 共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶。

实施例2

(1)在制备过程中，10g L-天冬氨酸α苄酯和6.5g三光气置于250mL带有磁 性转子的三口烧瓶中，并倒入100mL的无水四氢呋喃中使其完全溶解，反应物在 55度油浴锅中在氮气保护的条件下反应1.5小时。随后，反应溶液投入到1L冰冻 的正己烷中，然后放入-20度冰箱内重结晶整晚。第二天，混合溶液被过滤，并用 乙酸乙酯和正己烷(体积比为1：3)混合溶液再重结晶2次在-20度条件下。最 终，溶液被过滤，剩余的固体通过真空干燥，来获得纯净的BLA-NCA单体。

(2)1g单端为胺基的聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH₂,平均分子量为5000)和2.7g BLA-NCA溶于10mL无水氯仿中，反应溶液在氮气保护，室温下反应72小时。反应 结束后，溶液倒入于1L乙醚溶液中，通过沉降获得聚氨基酸主骨架(mPEG-b- PBLA)。最后，溶液被过滤，剩余的固体通过真空干燥，来获得固体mPEG-b-PBLA 聚氨基酸主骨架。

(3)将18mg二环己基碳二亚胺(DCC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 作为缩合剂与50mg Ce6共同溶解于10mL无水二甲基亚砜中，在室温条件下反应 2小时去活化光敏剂中的自由羧基基团。随后含有1g mPEG-b-PBLA聚氨基酸主骨架 的20mL无水二甲基亚砜被滴加到上述溶液，并在同样条件下继续反应24h。在去 离子水溶液中，采用截留分子量3500的透析膜，透析72h。冷冻干燥，得到光敏 剂修饰的聚氨基酸配体模版mPEG-b-PBLA-Ce6。

(4)1g mPEG-b-PBLA-Ce6完全溶解于含有10mL无水二甲基亚砜的三口烧瓶 中，随后10mL三亚乙基四胺被注射到上述溶液，并在氮气保护，50°下反应72h。 反应后的溶液装入截留分子量为8000的透析膜中，用过量的0.05M盐酸水溶液透 析纯化72小时，然后通过冷冻干燥获得光敏剂修饰的阳离子聚氨基酸(mPEG-b- P(Trie)LG-Ce6)。

(5)将0.7mL对苯二甲醛四氢呋喃溶液(浓度为1mg/mL)逐滴加入到含有 100mgmPEG-b-P(Trie)LG-Ce6的水溶液(pH 8.0)中，在室温强烈搅拌40分钟，随 后四氢呋喃溶剂通过旋转蒸发去除，剩余的水溶液置于截留分子量3500的透析 膜，通过大量的去离子水透析纯化72h。冷冻干燥，得到pH响应性聚氨基酸纳米 凝胶。

(6)用带负电荷的人体血清蛋白作为蛋白质模型，与pH响应性聚氨基酸纳米 凝胶在一定质量比例下，在pH为7.4的水溶液中共混，并且在室温下搅拌1小时， 通过与纳米凝胶表面正电荷的相互作用，来实现pH响应性聚氨基酸纳米凝胶对于 蛋白质的负载。随后剩余的蛋白质用截留分子量为300000的透析膜，在大量的PBS 溶液透析去除，得到蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶。

结果：本实施例得到的产物除了改变了聚氨基酸单体和阳离子分子的种类，其 它性能包括表面电荷性质、粒径尺寸已经负载能力等方面没有发生变化。

Claims (5)

1.一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其步骤如下：

（1）将L-谷氨酸 γ-苄酯或L-天冬氨酸α-苄酯与三光气共混于无水四氢呋喃溶剂中，L-谷氨酸 γ-苄酯或L-天冬氨酸α-苄酯与三光气的质量用量比例为1：0.62~0.7，无水四氢呋喃溶剂中L-谷氨酸 γ-苄酯或L-天冬氨酸α-苄酯的浓度范围为0.1~0.2 mg/mL；在温度60~80℃条件下反应90~150分钟，之后把溶液倒入大量的正己烷中，在-30~-15℃条件下重结晶，之后过滤，并用正己烷清洗并抽滤，所得粉末溶解于无水乙酸乙酯与正己烷体积比1：2~5的共混溶液中，再放入-30~-15℃条件下重结晶；最后过滤除去溶剂，并在室温条件下，抽真空20~30 h，得到纯净的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐或γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐氨基酸单体；

（2）将1~3g的单端为胺基的聚乙二醇单甲醚与γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐或γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐氨基酸单体溶于10~15 mL无水三氯甲烷或无水二氯甲烷中，在氮气保护、25~35℃下反应70~80小时，单端为胺基的聚乙二醇单甲醚与γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐或γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐氨基酸单体的摩尔用量比例为1：40~60；反应结束后，溶液倒入于1~2 L乙醚溶液中，通过沉降获得聚氨基酸主骨架；最后，将反应溶液过滤，所得固体真空干燥得到纯净的聚氨基酸主骨架；

（3）将15~30 mg缩合剂与30~50 mg 含有羧基基团的光敏剂二氢卟吩e6共同溶解于10~20 mL无水二甲基亚砜中，在室温条件下反应2~5小时去活化光敏剂中的自由羧基基团；随后把含有1~1.5 g聚氨基酸主骨架的20~30 mL无水二甲基亚砜溶液滴加到上述溶液中，并在室温条件下继续反应20~30 h；然后在去离子水溶液中，采用截留分子量3000~4000的透析膜，透析纯化60~90h；透析后的溶液在-60~-40℃下冷冻干燥，得到光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版，-30~-15℃下保存；

（4）把1~1.2 g光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版溶解于10~15 mL 无水二甲基亚砜中，随后将含有双氨基基团的侧链阳离子单体注射到上述溶液中，并在氮气保护，40~55℃下反应70~80小时；反应后的溶液装入截留分子量为7000~10000的透析膜中，用过量的0.01~0.05 M盐酸水溶液透析纯化48~72 小时，透析后的溶液在-60~-40℃冷冻干燥，得到光敏剂修饰的阳离子聚氨基酸；光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版与含有双氨基基团的侧链阳离子单体的用量摩尔比为1：20 ~30；

（5）将0.5~1 mL含有对苯二甲醛分子的四氢呋喃溶液逐滴加入到含有100 mg光敏剂修饰、pH＝7.4~8.5的阳离子聚氨基酸的水溶液中，在室温下强烈搅拌30~40分钟，随后四氢呋喃溶剂通过旋转蒸发去除，剩余的水溶液置于截留分子量30000~50000的透析膜，通过大量的去离子水透析纯化60~72 h，然后在-60~-40℃冷冻干燥，得到pH响应性聚氨基酸纳米凝胶；对苯二甲醛分子与聚氨基酸侧链上阳离子单体剩余的氨基基团的摩尔比为0.6~1：1；

（6）把带有负电荷的蛋白质人体血清蛋白与pH响应性聚氨基酸纳米凝胶混合在pH为7.4~8.0的水溶液中，并且在室温下搅拌40~60分钟，来实现pH响应性聚氨基酸纳米凝胶对于蛋白质的负载；随后用截留分子量为300000~500000的透析膜，在大量的PBS溶液中透析24~48小时去除剩余的蛋白质；透析产物于--60~-40℃下冷冻干燥，得到蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶，在-30~-15℃下保存；带有负电荷的蛋白质与pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的质量用量比例为0.2~0.5：1。

2.如权利要求1所述的一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的作为大分子引发剂单端为胺基的聚乙二醇单甲醚的平均分子质量为1000~5000。

3.如权利要求1所述的一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的活化光敏剂中羧基基团的缩合剂是二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺组合的复合缩合剂，或N'N-羰基二咪唑缩合剂。

4.如权利要求1所述的一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（4）所使用的含有双氨基基团的侧链阳离子单体为二亚乙基三胺、三亚乙基四胺或四亚乙基五胺中的一种。

5.一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶，其特征在于：是由权利要求1~4任何一项所述的方法制备得到。

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