CN106265546B - 肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子及其纳米粒子制备方法 - Google Patents

肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子及其纳米粒子制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子，还提供了该高分子纳米粒子的制备方法，包括二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备、一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc‑PEG‑NH2)的制备、PEG端氨基化的PEG‑PCL共聚物(Boc‑PEG‑PCL)的制备、曲妥珠单抗‑聚乙二醇‑聚己内酯(HER‑PEG‑PCL)的制备、曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备等步骤。该肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子靶向性好、毒副作用小，其制备方法工艺简单、成本低廉、收率高、副反应少。

Description

肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子及其纳米粒子制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物载体，特别涉及一种可以在肿瘤组织局部靶向性投递药物的抗肿瘤的曲妥珠单抗靶向载药高分子及其纳米粒子制备方法。
背景技术
目前肿瘤治疗的主要手段是内科治疗，但是化疗药物存在的毒副作用非常大，使得化疗的应用受到诸多限制。许多和化疗相关的毒副作用是和化疗药物的剂量大小呈正相关关系，降低化疗药物的给药剂量可以减轻毒副作用，但是这又同时会降低抗肿瘤疗效，因此化疗药物的疗效和毒性之间存在着矛盾。
解决这一矛盾的思路是采用靶向性药物载体对药物进行投递，使其在肿瘤局部进行靶向性释放。靶向性药物投递可以使化疗药物在肿瘤局部达到高浓度，但其余正常组织的药物浓度较低，既可以提高药物疗效，又可以避免产生严重的毒副作用。现有技术中，已有许多靶向药物载体被报道：如热靶向，即在肿瘤局部进行热疗，使药物在热疗部位靶向性释放；又如磁靶向，是在肿瘤部位外加磁场，从而磁性载体定向到肿瘤。然而，由于热靶向和磁靶向都需要外界的热疗设施或磁场，在实施时，病灶的部位必须明确，因此对于病灶不明、病灶深在或者广泛转移的病灶，就不能充分发挥作用；从手段来说，也相对较为复杂。
发明内容
技术问题：为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子及其纳米粒子制备方法。
技术方案：本发明提供的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0001128334850000011
本发明还提供了上述肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：
(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：在三乙胺存在下，以PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；
(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾反应，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；
反应式如下：
Figure BDA0001128334850000021
(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)的制备：
(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)的制备：二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼反应，制得两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)；
(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、1,4-二氧六环(1,4-dioxane)反应，制得一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)；
反应式如下：
Figure BDA0001128334850000022
(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：
(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯(ε-CL)开环聚合反应，制得末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)；
(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)的制备：末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)反应，制得聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)；
反应式如下：
Figure BDA0001128334850000031
(4)曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)的制备；
在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)末端的氨基和曲妥珠单抗末端的羧基发生酰胺化反应，制得曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)；
反应式如下：
Figure BDA0001128334850000032
(5)曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：
将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)冷冻干燥，即得。
步骤(1.1)中，反应温度为室温，反应时间为18-30h；PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)的用量比为1:(2-3)，三乙胺在反应溶剂中的质量百分比浓度为0.3-1.0％。
步骤(1.2)中，反应温度为110-130℃，反应时间为8-16h；磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾的用量比为1:(2-3)。
步骤(2.1)中，反应温度为70-90℃，反应时间为8-16h；二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼的用量比为1:(2-3)。
步骤(2.2)中，反应温度为-5℃-5℃，反应时间为18-30h；两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)的用量比为1∶(1-2)；1,4-二氧六环(1,4-dioxane)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5-2.0％；碳酸氢钠(NaHCO3)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5-2.0％，反应体系pH为7.0-7.5。
步骤(3.1)中，反应温度为120-140℃，反应时间为4-8h；一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯(ε-CL)的用量比为1：(1.0-1.5)。
步骤(3.2)中，反应温度为室温，反应时间为0.5-2h；末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)的用量比为1:(4-6)。
步骤(4)中，反应体系pH8.0-9.0，反应温度为室温，反应时间为8-12h；聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)和曲妥珠单抗的用量比为1：(1-2)。
步骤(5)中，冷冻干燥工艺具体为：将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)溶于体积比(1-3)：2的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入20-30倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。
有益效果：本发明提供的肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子靶向性好、毒副作用小，其制备方法通过通过开环聚合法和纳米沉淀法获得负载药物的高分子纳米粒子，工艺简单、成本低廉、收率高、副反应少。
本发明利用HER-PEG-PCL对部分特异性表达HER2的胃癌亚型给药，本发明载体可靶向将药物投递至肿瘤部位并释放，使药物被肿瘤组织靶向摄取；同时，通过SDS-PAGE检测，曲妥珠单抗连接到PEG-PCL上后，其生物学活性没有发生明显的改变。进一步通过体外实验证实，相对于曲妥珠单抗裸药，用含有同等曲妥珠单抗药物浓度的HER-PEG-PCL对HER2阳性的胃癌细胞抑制率相当；然而，该靶向纳米粒子能有效靶向投递到肿瘤组织，可有效降低对不表达人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)的正常组织的毒副作用，同时又能通过曲妥珠单抗的ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)抑制肿瘤细胞的生长，有效解决了抗肿瘤靶向药物载体，药物投递系统各自存在的缺陷。
现有技术中，曲妥珠单抗的药代动力学说明了它是剂量依赖性药物，提高药物剂量可能会增加抗肿瘤疗效，但随着药物剂量的增加，其心脏毒毒副作用也随之增高，对于初次治疗使用过蒽环类药物的患者也会增加心衰的发生率。然而，本发明采用曲妥珠单抗与载体共轭连接给药后，可以通过EPR效应靶向投递到肿瘤组织，避免曲妥珠单抗对正常心肌细胞的毒性，增加了患者的耐受性后，可尝试提高曲妥珠单抗局部给药剂量。
附图说明
图1为曲妥珠单抗靶向纳米粒子合成示意图；
图2为XPS检测曲妥珠单抗连接前后纳米粒子氮原子含量示意图；
图3为曲妥珠单抗和曲妥珠单抗连接PEG-PCL后SDS-PAGE电泳结果示意图。
图4为不同实验组对HER2阳性胃癌细胞株NUGC4(A)和HER2阴性胃癌细胞株SGC7901(B)细胞毒性示意图。
图5为NUGC4和SGC7901胃癌细胞株对负载荧光物质香豆素-6的曲妥珠单抗-NPs和NPs的摄取示意图。
具体实施方式
本发明中，m、n均为正数。
下面对本发明作出进一步说明。
实施例1
肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：
(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：二氯甲烷溶剂中，在三乙胺存在下，以摩尔比1:2.5的PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料，室温反应24h制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；三乙胺在溶剂中的质量百分比浓度为0.5％；
(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：摩尔比1:2.5的磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾120℃反应12h，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；
(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)的制备：
(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)的制备：摩尔比1:2.5的二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼80℃反应12h，制得两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)；
(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，摩尔比1：2.5的两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、1,4-二氧六环(1,4-dioxane)0℃反应24h，制得一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)；1,4-二氧六环(1,4-dioxane)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.8％；碳酸氢钠(NaHCO3)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.8％，反应体系pH为7.2；
(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：
(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，摩尔比1：1.2的一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯(ε-CL)130℃开环聚合反应6h，制得末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)；
(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)的制备：摩尔比1:5的末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)室温反应1h，制得聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)；
(4)曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)的制备；
pH8.5硼酸缓冲液中，在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，摩尔比1：1.5的聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)末端的氨基和曲妥珠单抗末端的羧基室温酰胺化反应10h，制得曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)；
(5)曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：
将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)溶于体积比1：1的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入25倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。
实施例2
肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：
(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：二氯甲烷溶剂中，在三乙胺存在下，以摩尔比1:2的PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料，室温反应30h制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；三乙胺在溶剂中的质量百分比浓度为1.0％；
(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：摩尔比1:2的磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾110℃反应16h，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；
(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)的制备：
(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)的制备：摩尔比1:2的二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼70℃反应16h，制得两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)；
(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，摩尔比1：1的两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、1,4-二氧六环(1,4-dioxane)-5℃反应30h，制得一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)；1,4-二氧六环(1,4-dioxane)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5％；碳酸氢钠(NaHCO3)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5％，反应体系pH为7.0；
(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：
(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，摩尔比1：1.0的一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯(ε-CL)120℃开环聚合反应8h，制得末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)；
(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)的制备：摩尔比1:4的末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)室温反应0.5h，制得聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)；
(4)曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)的制备；
pH8.0硼酸缓冲液中，在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，摩尔比1：1的聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)末端的氨基和曲妥珠单抗末端的羧基室温酰胺化反应8h，制得曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)；
(5)曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：
将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)溶于体积比1：2的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入20倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。
实施例3
肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：
(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：二氯甲烷溶剂中，在三乙胺存在下，以摩尔比1:3的PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料，室温反应18h制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；三乙胺在溶剂中的质量百分比浓度为0.3％；
(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：摩尔比1:3的磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾130℃反应8h，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；
(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)的制备：
(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)的制备：摩尔比1:(2-3)的二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼90℃反应8h，制得两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)；
(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，摩尔比1∶2的两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、1,4-二氧六环(1,4-dioxane)5℃反应18h，制得一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)；1,4-二氧六环(1,4-dioxane)在反应溶剂中的质量百分比浓度为2.0％；碳酸氢钠(NaHCO3)在反应溶剂中的质量百分比浓度为2.0％，反应体系pH为7.5；
(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：
(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，摩尔比1：1.5的一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯(ε-CL)140℃开环聚合反应4h，制得末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)；
(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)的制备：摩尔比1:6的末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)室温反应2h，制得聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)；
(4)曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)的制备；
pH9.0硼酸缓冲液中，在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，摩尔比1：2的聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)末端的氨基和曲妥珠单抗末端的羧基室温酰胺化反应12h，制得曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)；
(5)曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：
将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)溶于体积比3：2的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入30倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。
实施例4
肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备，包括以下步骤：
(1)制备二甲酰亚胺化聚乙二醇：将PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)同溶解在二氯甲烷中的三乙胺常温真空干燥24小时，通过90％乙醚沉淀得合成物对甲苯磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)，溶在二甲基甲酰胺(DMF)的溶液中的苯二甲酰亚胺钾(phthalimidepotassium)，120℃条件下反应12小时后得产物二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；
(2)制备一端氨基被保护的两端氨基化聚乙二醇：PI-PEG-PI和水合肼(hydrazinehydrate)80℃无水乙醇回流反应12小时得两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)，将其溶解在碳酸氢钠(NaHCO3)溶液中25℃搅拌2小时，将等量的溶在1,4-二氧六环(1,4-dioxane)中的,二碳酸二叔丁酯(Boc2O)滴入溶有NH2-PEG-NH2的冰浴中，反应得Boc-PEG-NH2，使NH2-PEG-NH2一端的氨基呈保护状态，另外一端氨基和PCL通过酰胺化反应发生化学连接生成Boc-PEG-PCL；
(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物的合成：Boc-PEG-NH2在氮气保护下以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，经过130℃，6小时对己内酯(ε-CL)进行开环聚合反应得末端氨基保护的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)，将其溶解于二氯甲烷,通过冷石油醚再沉淀。常温真空干燥至恒重。将Boc-PEG-PCL溶解在DCM和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)常温下反应1小时得NH2-PEG-PCL，真空干燥；
(4)将NH2-PEG-PCL和曲妥珠单抗通过酰胺化反应连接：将赫赛汀溶解在pH值为8.4的硼酸溶液中，将NH2-PEG-PCL重悬于其中，在交联剂碳二亚胺(EDAC)和硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的作用下，常温过夜搅拌，发生酰胺化反应生成HER-PEG-PCL，离心收集，并收取上清液检测未被连接的曲妥珠单抗的量；
(5)将HER-PEG-PCL聚合物溶于等体积的乙醇和丙酮中，再将所制得的溶液滴入25倍等体积的冷存水中，减压抽除以有机溶剂，将溶液冷冻干燥得到载体，-20℃保存。
采用本发明制备的药物载体，可输送多种治疗肿瘤的药物(如多西紫杉醇，紫杉醇，阿霉素)，中药单体(如藤黄酸，汉防己甲)和分子靶向药物(C-225)。
比较负载化疗物后得细胞毒作用。
以HER-PEG-PCL和PEG-PCL为载体，通过纳米沉淀法构建了负载化疗药物多西他赛的曲妥珠单抗靶向纳米粒子曲妥珠单抗-NPs-多西他赛，和无靶向作用的载药纳米粒子NPs-多西他赛。
结果显示：曲妥珠单抗-NPs-多西他赛对HER2阳性的胃癌细胞株NUGC4毒性明显高于曲妥珠单抗+NPs-多西他赛和曲妥珠单抗+多西他赛组，见图4A；而对于HER2阴性的胃癌细胞株SGC7901曲妥珠单抗-NPs-多西他赛，曲妥珠单抗+NPs-多西他赛和曲妥珠单抗+多西他赛组细胞毒性无明显区别，和单独应用多西他赛的细胞毒性相当，见图4B。
细胞摄取实验。
通过纳米沉淀法将HER-PEG-PCL和PEG-PCL负载宿舍性荧光染料香豆素-6(模拟多西他赛)进行细胞摄取实验。
结果显示：NUGC4的对香豆素-6-TNPs的摄取明显高于香豆素-6-NPs的摄取，而在SGC7901中的摄取两者相当，且都明显低于香豆素-6-TNPs在NUGC4中的摄取，见图5。这一结果也解释了曲妥珠单抗靶向纳米粒子负载化疗药物后对胃癌细胞的抑制作用最强。
PEG链段上的每个乙二醇单元，都可以紧密结合两个或三个相关联的水分子，形成一层水化层，有效保护了载药颗粒之间的碰撞，增加了颗粒的稳定性；同时该水化层也像保护一样减少了颗粒与血浆蛋白的粘附，避免颗粒被快速清除，有效延长颗粒的血液循环时间，改善颗粒的药代动力学。但是，PEG修饰在一定程度上妨碍纳米载药颗粒与靶细胞膜的相互作用，而且降低了颗粒的内含体逃逸能力，所以设计合理的PEG化修饰的纳米体系，成为非常需要的科学问题。
本发明构建了曲妥珠单抗靶向PEG-PCL纳米载药系统，制得的肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子采用曲妥珠单抗、聚乙二醇、聚己内酯的组合，其在PEG的保护下完成血液循环，通过曲妥珠单抗和胃癌表面HER2受体相互作用，增加颗粒内吞(见图1)。
本发明聚合物纳米粒子具有良好的生物相容性和稳定性。其中，嵌段共聚物PEG-PCL在水溶液中可自发形成胶束，PCL形成疏水“内核”，亲水段PEG为“外壳”；疏水性内核可作为疏水性化疗药物的载体，为其提供一个稳定的内环境，而亲水性外壳可以使胶束稳定存在于水溶液或体液中。亲水片段采用分子量2000的PEG，有利于从人体肾脏中排出体外。疏水片段采用的聚己内酯，为生物可降解材料，水解后对人体无毒性。
曲妥珠单抗含有1726个氮原子，通过X射线光电子能谱学检测到连接上曲妥珠单抗的PEG-PCL其氮原子含量肯定要明显高于单纯的PEG-PCL纳米粒子，见图2：在396(ev)位置，连接曲妥珠单抗后纳米粒子(HER-PEG-PCL)氮原子含量明显要高于未连接状态下的纳米粒子(PEG-PCL)。因为曲妥珠单抗本身对HER2阳性的胃癌细胞具有ADCC作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)抑制肿瘤细胞的生长，我们通过SDS-PAGE检测其通过酰胺化反应和PEG-PCL连接后是否发生变性，电泳结果表明在连接前后曲妥珠单抗并没有发生蛋白变性，见图3。该靶向纳米粒子既有靶向投递药物的能力，同时又具有抑制肿瘤细胞的功能。
本发明载药系统通过载体自身的性质和化学修饰形成被动靶向和主动靶向效应可以一定程度上实现药物的靶向作用，在增加肿瘤局部药物浓度的同时，降低了药物全身其他部位的浓度。

Claims (9)

1.抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：
所述抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子，其结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002946611570000011
其制备方法，包括以下步骤：
(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：
(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：在三乙胺存在下，以PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；
(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾反应，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；
反应式如下：
Figure FDA0002946611570000012
(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)的制备：
(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)的制备：二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼反应，制得两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)；
(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、1,4-二氧六环(1,4-dioxane)反应，制得一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)；
反应式如下：
Figure FDA0002946611570000021
(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：
(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯开环聚合反应，制得末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)；
(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)的制备：末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)反应，制得聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)；
反应式如下：
Figure FDA0002946611570000022
(4)曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)的制备；
在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)末端的氨基和曲妥珠单抗末端的羧基发生酰胺化反应，制得曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)；
反应式如下：
Figure FDA0002946611570000031
(5)曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：
将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(1.1)中，反应温度为室温，反应时间为18-30h；PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)的用量比为1:(2-3)，三乙胺在反应溶剂中的质量百分比浓度为0.3-1.0％。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(1.2)中，反应温度为110-130℃，反应时间为8-16h；磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾的用量比为1:(2-3)。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(2.1)中，反应温度为70-90℃，反应时间为8-16h；二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼的用量比为1:(2-3)。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(2.2)中，反应温度为-5℃-5℃，反应时间为18-30h；两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)的用量比为1：(1-2)；1,4-二氧六环(1,4-dioxane)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5-2.0％；碳酸氢钠(NaHCO3)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5-2.0％，反应体系pH为7.0-7.5。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(3.1)中，反应温度为120-140℃，反应时间为4-8h；一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯的用量比为1：(1.0-1.5)。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(3.2)中，反应温度为室温，反应时间为0.5-2h；末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)的用量比为1:(4-6)。
8.根据权利要求1所述的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，反应体系pH8.0-9.0，反应温度为室温，反应时间为8-12h；聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)和曲妥珠单抗的用量比为1：(1-2)。
9.根据权利要求1所述的抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，冷冻干燥工艺具体为：将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)溶于体积比(1-3)：2的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入20-30倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。
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