CN107397962A - 一种葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG核酸载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG核酸载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG核酸载体及其制备方法和应用。该核酸载体包括葡聚糖、聚(L‑赖氨酸)以及VAPG靶向多肽；其中，所述的聚赖氨酸由改性的葡聚糖引发ε‑苄氧羰基‑L‑赖氨酸环状酸酐单体开环制备；然后VAPG靶向多肽与葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)通过巯基‑乙烯加成反应得到具有靶向性的核酸载体。本发明简单易得，与核酸药物复合后可以得到粒径均一，水溶性良好的纳米粒子。另外，本发明提供的核酸载体可有效地保护核酸药物进入平滑肌细胞，降低了非特异性接触的毒副作用，提高了转染效率，生物相容性和生物降解性好，在基因治疗领域有潜在的应用前景。

Description

一种葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体及其制备方法和应用，属于生物医学基因治疗领域。
背景技术
近年来，RNA干扰逐渐发展成为一种用于癌症和心血管等疾病治疗的新技术。RNA干扰通过RNA效应分子siRNA和miRNA在体内诱导靶基因mRNA特异性降解或沉默，进而调节目的基因的表达，作用迅速高效，在疾病治疗中有较高的医用价值。然而，裸露的核酸药物pDNA、miRNA和siRNA容易受到核酸酶的降解，而且较高的分子量和表面负电的特性使其难以通过细胞内吞进入细胞中发挥作用，因此安全有效的传递载体成为基因治疗的关键。阳离子聚合物是一类应用广泛的核酸载体，其表面的正电荷可以与带负电的核酸药物通过静电作用形成稳定的复合物，延缓核酸药物的降解，同时可以与带负电的细胞膜相互结合，促进细胞内吞作用。但是，表面过量的正电荷，可与细胞膜以及体内带负电的蛋白血浆之类的活性物质非特异性结合，造成细胞毒性并引发免疫反应，同时降低了转染效率，因此在临床上的进一步推广也受到限制(Jin L,Zeng X,Liu M,Deng Y,He NY.Current progress ingene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.Theranostics,2014,4(3):240-255.)。因此，需要设计和合成一种具有靶向性、低毒和高转染效率的核酸载体辅助核酸药物进入靶细胞。公布号为CN 105153439A的中国专利公开了一种聚乙二醇修饰的含有内皮细胞靶向肽REDV的壳聚糖核酸载体，该核酸载体可以靶向进入目标内皮细胞，促进内皮细胞增殖，避免被其他正常细胞内吞引发免疫反应，但是质子化后的壳聚糖表面带有大量的正电荷，聚乙二醇的屏蔽作用有限，载体体系与胞内血液蛋白非特异性性接触，产生细胞毒性，而且该核酸载体粒径较大，容易被机体清除，降低了转染效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有靶向性，高转染效率，低毒的，稳定并可缓慢释放的核酸载体。
本发明提供的核酸载体，其特征在于包括葡聚糖、聚(L-赖氨酸)和靶向平滑肌细胞的多肽VAPG。其中，葡聚糖是天然中性多糖，高度亲水，生物相容性和生物降解性优异，不同于合成的聚乙二醇，葡聚糖表面含有大量羟基，易于改性。聚赖氨酸是碱性氨基酸，其侧链上的伯胺质子化后，成为结合核酸的位点，可以很好地与核酸药物结合为直径为数十纳米的纳米粒子。而且，赖氨酸是人体的必须氨基酸，因此，与其他核酸载体相比，聚赖氨酸具有更好的生物相容性和较低的细胞毒性。而VAPG多肽来源于缬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(VGVAPG)，可以作为平滑肌细胞的生物特异性粘附配体，引导核酸药物靶向进入平滑肌细胞，提高了基因载体的转染效率，降低了与非特异性细胞接触的毒性(Gobin,A.S.；West,J.L.,Val-ala-pro-gly,an elastin-derived non-integrin ligand:Smooth muscle cell adhesion and specificity.J Biomed Mater Res A 2003,67A(1),255-259)。
本发明的技术方案如下：
一种葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体，包括葡聚糖、聚(L-赖氨酸)和靶向平滑肌细胞的多肽VAPG，结构式如下：
式中，k＝18～24,r＝13～19,n＝1～8,l＝7～22。
所述葡聚糖所采用的分子量为6kDa，所述的VAPG小肽为半胱氨酸-缬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(Cys-VGVAPG,吉尔生化(上海)有限公司)，所述的聚赖氨酸为改性的葡聚糖引发苄氧羰基保护的赖氨酸环状单体(Cbz-lysine NCA)制备而成，聚合度为8～30。
本发明的VAPG改性的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)基因载体制备方法，包括步骤：
(1)制备葡聚糖-g-聚L-赖氨酸聚合物；
(2)制备葡聚糖-g-聚L-赖氨酸-VAPG聚合物；
所述的步骤(1)制备葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)聚合物：将氨基改性的葡聚糖和Cbz-lysine NCA分别溶解在无水二甲基亚砜中，其中改性葡聚糖中氨基与Cbz-lysine NCA单体的摩尔比为1:15～1:100，氮气环境下反应2d～4d，乙醚沉淀洗涤除去未反应的单体，真空干燥；然后，以三氟乙酸为溶剂，加入含33％乙酸的氢溴酸，反应24～48h，丙酮沉淀洗涤多次，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)聚合物。
其中，改性的葡聚糖是根据文献(Song,H.Q.；Dou,X.B.；Li,R.Q.；Yu,B.R.；Zhao,N.N.；Xu,F.J.,A general strategy to prepare different types of polysaccharide-graft-poly(aspartic acid)as degradable gene carriers.Acta Biomater 2015,12,156-65)所述方法由N N’-二羰基咪唑活化，加入无水乙二胺改性得到。而Cbz-lysine NCA单体是根据文献(Li,P.；Zhou,C.；Rayatpisheh,S.；Ye,K.；Poon,Y.F.；Hammond,P.T.；Duan,H.；Chan-Park,M.B.,Cationic peptidopolysaccharides show excellent broad-spectrum antimicrobial activities and high selectivity.Adv Mater 2012,24(30),4130-7)由苄氧羰基保护的L-赖氨酸与三光气反应获得。
所述的步骤(2)制备葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物；将葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)和甲基丙烯酸缩水甘油酯溶解在甲醇与水的混合溶剂中，15～20℃反应15～24h，乙醚沉淀，真空干燥，然后将产物与半胱氨酸-缬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸小肽溶解在甲醇和水的混合溶液中，加入反应物总量5％～10％的光引发剂DMPA，紫外交联15～20min，静置过夜，乙醇沉淀洗涤，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物。
其中甲醇和水的混合溶液混合比例为10:1～2:1。
本发明葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体的应用，在于与核酸药物复合形纳米粒子，可用作靶向平滑肌细胞的心血管疾病的药物载体。
将制备的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物与核酸药物按照一定的质量比溶解在焦炭酸二乙酯处理过的水中，涡旋5～20s，室温静置15～45min；得到的纳米粒子的直径为40～200nm，ζ电位在0.2～30mV之间。所述的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物与核酸的复合质量比为0.5:1～10:1。
本发明提供的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物简单易得，可以与核酸药物复合形成粒径均一小尺寸纳米粒子，并可以保护核酸药物靶向进入平滑肌细胞，提高了转染效率，可高达63.2％，甚至高于商用转染试剂Lipofectamine2000的转染率(32.4％)，降低了对其他细胞的生物毒性，在生物医用基因治疗领域有巨大的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所制备的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物与miRNA复合的纳米粒子的原子力扫描显微镜照片。
图2为实施例1所制备的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物与miRNA复合的纳米粒子分别进入内皮细胞和平滑肌细胞的转染效率对比图。
具体实施方式
下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步阐释，以下实施案例是对本发明的进一步说明，并不限制本发明的适用范围。
实施例1：
按照文献(Song,H.Q.；Dou,X.B.；Li,R.Q.；Yu,B.R.；Zhao,N.N.；Xu,F.J.,Ageneral strategy to prepare different types of polysaccharide-graft-poly(aspartic acid)as degradable gene carriers.Acta Biomater 2015,12,156-65)所述方法，在装有搅拌子的三口瓶中，称取1.41g的葡聚糖和1.14g N N’-二羰基咪唑分别溶解在4mL的无水二甲基亚砜中，接着将N N’-二羰基咪唑溶液逐滴加入到葡聚糖溶液中，氮气环境下反应24h；之后，将3ml的乙二胺溶解在6ml的无水二甲基亚砜中，并逐滴加入上述反应溶液中，氮气环境下继续反应48h。反应结束后，用大量丙酮沉淀洗涤，微量水溶解后置于截留分子量为2kDa的纤维膜透析袋中，去离子水透析，最后冷冻干燥得到氨基改性的葡聚糖。
按照改性葡聚糖中氨基与Cbz-lysine NCA单体的摩尔比为1:15，称取氨基改性的葡聚糖64mg和Cbz-lysine NCA单体0.6g于装有搅拌子的三口瓶中，加入7ml的无水二甲基亚砜，抽换气三次，50℃环境下反应2d，大量乙醚沉淀洗涤除去未反应的单体，真空干燥得到产物；然后，以三氟乙酸为溶剂，加入含33％乙酸的氢溴酸，三氟乙酸与氢溴酸的比例控制为8:1，反应24h，丙酮沉淀洗涤多次，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)聚合物。
在棕色小瓶中，称取0.2g葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)溶解在2mL的甲醇与水的混合溶剂中，甲醇与水的比例为2:1，加入300μL甲基丙烯酸缩水甘油酯，15～20℃反应15h，乙醚沉淀，真空干燥，然后称取产物0.1g与15mg Cys-VGVAPG小肽溶解在2mL甲醇和水的混合溶液中，加入11.5mg DMPA，紫外交联15～20min，静置过夜，乙醇沉淀洗涤，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物。
所制得的聚合物，结构式参数如下：k＝18，r＝19，n＝1，l＝7，即每个链的聚赖氨酸的聚合度为8。使用将上述聚合物配制为5mg/mL的溶液，稀释至0.5mg/mL，按聚合物与核酸的质量比0.5:1～10:1，取1μL～20μL与1.5μL浓度为50μM的miRNA进行复合，涡旋5～20s，室温静置15～45min。所制得的纳米粒子，通过动态光散射测定的粒径为40～200nm,ζ电位在0.2～18mV之间。所制得纳米粒子的原子力显微镜照片如图1所示，其中干态下的纳米粒子的粒径约为50nm。图2为纳米粒子在内皮细胞和平滑肌细胞中的摄入转染效率对比图，葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)可简写为Dex-g-PLL，葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG可简写为Dex-g-PLL-VAPG，从图中可以看出，本发明制备的纳米基因载体由于靶向肽VAPG的存在，可以高效地靶向进入平滑肌细胞，转染效率可达63.2％，相比于商用的lipo2000效果更好(32.4％)。
实施例2:
按照文献(Song,H.Q.；Dou,X.B.；Li,R.Q.；Yu,B.R.；Zhao,N.N.；Xu,F.J.,Ageneral strategy to prepare different types of polysaccharide-graft-poly(aspartic acid)as degradable gene carriers.Acta Biomater 2015,12,156-65)所述方法，在装有搅拌子的三口瓶中，称取1.41g的葡聚糖和1.14g N N’-二羰基咪唑分别溶解在4mL的无水二甲基亚砜中，接着将N N’-二羰基咪唑溶液逐滴加入到葡聚糖溶液中，氮气环境下反应24h；之后，将3.5ml的乙二胺溶解在6ml的无水二甲基亚砜中，并逐滴加入上述反应溶液中，氮气环境下继续反应48h。反应结束后，用大量丙酮沉淀洗涤，微量水溶解后置于截留分子量为2kDa的纤维膜透析袋中，去离子水透析，最后冷冻干燥得到氨基改性的葡聚糖。
按照改性葡聚糖中氨基与Cbz-lysine NCA单体的摩尔比为1:30，称取氨基改性的葡聚糖25.8mg和Cbz-lysine NCA单体0.6g于装有搅拌子的三口瓶中，加入7ml的无水二甲基亚砜，抽换气三次，50℃环境下反应3d，大量乙醚沉淀洗涤除去未反应的单体，真空干燥得到产物；然后，以三氟乙酸为溶剂，加入含33％乙酸的氢溴酸，三氟乙酸与氢溴酸的比例控制为8:1，反应36h，丙酮沉淀洗涤多次，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)聚合物。
在棕色小瓶中，称取0.2g葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)溶解在2mL的甲醇与水的混合溶剂中，甲醇与水的比例为5:1，加入400μL甲基丙烯酸缩水甘油酯，15～20℃反应20h，乙醚沉淀，真空干燥，然后称取产物0.1g与19mg Cys-VGVAPG小肽溶解在2mL甲醇和水的混合溶液中，加入11.9mg DMPA，紫外交联15～20min，静置过夜，乙醇沉淀洗涤，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物。
所制得的聚合物，结构式参数如下：k＝20，r＝17，n＝3，l＝12，即每个链的聚赖氨酸的聚合度为15。使用将上述聚合物配制为5mg/mL的溶液，稀释至0.5mg/mL，按聚合物与核酸的质量比0.5:1～10:1，取1μL～20μL与1.5μL浓度为50μM的miRNA进行复合，涡旋5～20s，室温静置15～45min。所制得的纳米粒子，通过动态光散射测定的粒径为40～200nm,ζ电位在0.3～20mV之间。
实施例3：
按照文献(Song,H.Q.；Dou,X.B.；Li,R.Q.；Yu,B.R.；Zhao,N.N.；Xu,F.J.,Ageneral strategy to prepare different types of polysaccharide-graft-poly(aspartic acid)as degradable gene carriers.Acta Biomater 2015,12,156-65)所述方法，在装有搅拌子的三口瓶中，称取1.41g的葡聚糖和1.14g N N’-二羰基咪唑分别溶解在4mL的无水二甲基亚砜中，接着将N N’-二羰基咪唑溶液逐滴加入到葡聚糖溶液中，氮气环境下反应24h；之后，将4ml的乙二胺溶解在6ml的无水二甲基亚砜中，并逐滴加入上述反应溶液中，氮气环境下继续反应48h。反应结束后，用大量丙酮沉淀洗涤，微量水溶解后置于截留分子量为2kDa的纤维膜透析袋中，去离子水透析，最后冷冻干燥得到氨基改性的葡聚糖。
按照改性葡聚糖中氨基与Cbz-lysine NCA单体的摩尔比为1:50，称取制备的氨基改性的葡聚糖15.8mg和Cbz-lysine NCA单体0.6g于装有搅拌子的三口瓶中，加入7ml的无水二甲基亚砜，抽换气三次，50℃环境下反应4d，大量乙醚沉淀洗涤除去未反应的单体，真空干燥得到产物；然后，以三氟乙酸为溶剂，加入含33％乙酸的氢溴酸，三氟乙酸与氢溴酸的比例控制为6:1，反应48h，丙酮沉淀洗涤多次，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)聚合物。
在棕色小瓶中，称取0.2g葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)溶解在2mL的甲醇与水的混合溶剂中，甲醇与水的比例为8:1，加入550μL甲基丙烯酸缩水甘油酯，15～20℃反应24h，乙醚沉淀，真空干燥，然后称取产物0.1g与32mg Cys-VGVAPG小肽溶解在2mL甲醇和水的混合溶液中，加入6.6mgDMPA，紫外交联15～20min，静置过夜，乙醇沉淀洗涤，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物。
所制得的聚合物，结构式参数如下：k＝22，r＝15，n＝5，l＝17，即每个链的聚赖氨酸的聚合度为22。将上述聚合物配制为5mg/mL的溶液，稀释至0.5mg/mL，按聚合物与核酸的质量比0.5:1～10:1，取1μL～20μL与1.5μL浓度为50μM的miRNA进行复合，涡旋5～20s，室温静置15～45min。所制得的纳米粒子，通过动态光散射测定的粒径为40～200nm,ζ电位在0.5～24mV之间。
实施例4：
按照文献(Song,H.Q.；Dou,X.B.；Li,R.Q.；Yu,B.R.；Zhao,N.N.；Xu,F.J.,Ageneral strategy to prepare different types of polysaccharide-graft-poly(aspartic acid)as degradable gene carriers.Acta Biomater 2015,12,156-65)所述方法，在装有搅拌子的三口瓶中，称取1.41g的葡聚糖和1.14g N N’-二羰基咪唑分别溶解在4mL的无水二甲基亚砜中，接着将N N’-二羰基咪唑溶液逐滴加入到葡聚糖溶液中，氮气环境下反应24h；之后，将5ml的乙二胺溶解在6ml的无水二甲基亚砜中，并逐滴加入上述反应溶液中，氮气环境下继续反应48h。反应结束后，用大量丙酮沉淀洗涤，微量水溶解后置于截留分子量为2kDa的纤维膜透析袋中，去离子水透析，最后冷冻干燥得到氨基改性的葡聚糖。
按照改性葡聚糖中氨基与Cbz-lysine NCA单体的摩尔比为1:100，称取制备的氨基改性的葡聚糖8.5mg和Cbz-lysine NCA单体0.6g于装有搅拌子的三口瓶中，加入7ml的无水二甲基亚砜，抽换气三次，50℃环境下反应4d，大量乙醚沉淀洗涤除去未反应的单体，真空干燥得到产物；然后，以三氟乙酸为溶剂，加入含33％乙酸的氢溴酸，三氟乙酸与氢溴酸的比例控制为6:1，反应48h，丙酮沉淀洗涤多次，透析冻干得到葡聚糖-g-聚L-赖氨酸聚合物。
在棕色小瓶中，称取0.2g葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)溶解在2mL的甲醇与水的混合溶剂中，甲醇与水的比例为10:1，加入700μL甲基丙烯酸缩水甘油酯，15～20℃反应30h，乙醚沉淀，真空干燥，然后称取产物0.1g与38mg Cys-VGVAPG小肽溶解在2mL甲醇和水的混合溶液中，加入10.35mg DMPA，紫外交联15～20min，静置过夜，乙醇沉淀洗涤，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物。
所制得的聚合物，结构式参数如下：k＝24，r＝13，n＝8，l＝22，即每个链的聚赖氨酸的聚合度为30。使用将上述聚合物配制为5mg/mL的溶液，稀释至0.5mg/mL，按聚合物与核酸的质量比0.5:1～10:1，取1μL～20μL与1.5μL浓度为50μM的miRNA进行复合，涡旋5～20s，室温静置15～45min。所制得的纳米粒子，通过动态光散射测定的粒径为40～200nm,ζ电位在1～30mV之间。

Claims (9)

1.一种葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体，其特征是包括葡聚糖、聚(L-赖氨酸)和靶向平滑肌细胞的多肽VAPG，结构式如下：
式中，k＝18～24,r＝13～19,n＝1～8,l＝7～22。
2.如权利要求1所述的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体，其特征是葡聚糖所采用的分子量为6kDa，所述的VAPG小肽序列为半胱氨酸-缬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(Cys-VAVAPG)，所述的聚赖氨酸为改性的葡聚糖引发苄氧羰基保护的赖氨酸环状单体(Cbz-lysine NCA)制备而成，聚合度为8～30。
3.如权利要求1所述的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体的制备方法，其特征是包括步骤：
(1)制备葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)聚合物；
(2)制备葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤(1)制备葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)聚合物：将氨基改性的葡聚糖和Cbz-lysine NCA单体分别溶解在无水二甲基亚砜中，其中改性葡聚糖中氨基与Cbz-lysine NCA单体的摩尔比为1:15～1:100，氮气环境下反应2d～4d，乙醚沉淀洗涤除去未反应的单体，真空干燥；然后，以三氟乙酸为溶剂，加入含33％乙酸的氢溴酸，反应24～48h，丙酮沉淀洗涤多次，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)聚合物。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤(2)制备葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物；将葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)和甲基丙烯酸缩水甘油酯溶解在甲醇与水的混合溶剂中，15～20℃反应15～24h，乙醚沉淀，真空干燥，然后将产物与Cys-VAVAPG小肽溶解在甲醇和水的混合溶液中，加入反应物总量5％～10％的光引发剂DMPA，紫外交联15～20min，静置过夜，乙醇沉淀洗涤，透析冻干得到葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所述甲醇和水的混合溶液比例为10:1～2:1。
7.如权利要求1所述的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体的应用，其特征在于与核酸药物复合形成纳米粒子，可用作靶向平滑肌细胞的心血管疾病的药物载体。
8.如权利要求7所述的应用，其特征是包括过程：将制备的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG聚合物与核酸药物溶解在焦炭酸二乙酯处理过的水中，涡旋5～20s，室温静置15～45min；得到纳米粒子的直径为40～200nm，ζ电位在0.2～30mV。
9.如权利要求7所述的应用，其特征是所述的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG核酸载体与核酸的复合质量比为0.5:1～10:1。
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