CN103342788A

CN103342788A - 三嵌段聚阳离子、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN103342788A
Application number: CN2013102320052A
Authority: CN
Inventors: 于海军; 李亚平; 陈宪智; 张志文
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2013-06-09
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2033-06-09
Also published as: CN103342788B

Abstract

本发明公开了一种式1所示的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子及其合成方法，及由上述三嵌段聚阳离子制备的双重酸敏感性的多层阳离子胶束和制备方法。所述阳离子胶束包括中性聚乙二醇PEG外层、胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯PAG中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯PDPA内层，其中，PEG外层可以屏蔽部分正电荷，提高胶束的稳定性，PAG中间层带正电性，可吸附负电性核酸药物，PDPA内层具有疏水性，可包载疏水药物。此外，本发明还公开了一种将所述具有双重酸敏感性的多层阳离子胶束用于核酸和疏水抗癌药物同步共输送的应用，主要用于逆转癌细胞多药耐药或抑制癌细胞转移。

Description

三嵌段聚阳离子、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子及其合成方法，及由上述三嵌段聚阳离子制备的具有双重酸敏感性的多层阳离子胶束和制备方法。本发明还涉及将该具有双重酸敏感性的多层阳离子胶束用于核酸和疏水抗癌药物同步共输送的应用，主要用于逆转癌细胞多药耐药或抑制癌细胞转移。

背景技术

恶性肿瘤（癌症）具有治愈率低、复发率和死亡率双高的特征，已成为威胁人类健康的重大疾病之一。据我国肿瘤年报统计，截止2012年，我国每年新发癌症病例约312万例，发病率2.85‰，每年因癌症死亡病例约270万例，死亡率1.80‰，且男女发病率和死亡率都呈现不断上升趋势。癌症转移和癌症多药耐药为癌症致死的主要原因。纳米技术可提高药物稳定性，增加药物对生物膜的黏附性，提高药物靶向输送能力，控制药物的释放并改变药物途径，已在治疗转移和耐药性癌症方面受到了广泛关注并取得了显著成效。近年来，以癌症分子生物学为基础的核糖核苷酸（RNA）干扰疗法为癌症治疗注入了新的活力。RNA干扰疗法可在分子水平抑制与癌症耐药或转移相关的基因表达，从而逆转癌症耐药或抑制癌症转移。而将RNA干扰疗法与传统化疗结合可发挥协同作用，有效改善治疗效果。例如中国专利文献CN101768276公开了一种聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物，其优势在于它输送小干扰RNA药物进入细胞沉默癌基因的表达的同时，也携载大大低于正常给药剂量的化疗药物进入癌细胞。中国专利文献CN102030898公开了一种ABC型两亲性可生物降解聚酯三嵌段共聚物，该三嵌段共聚物可在水中自组装形成球形纳米粒，用于疏水药物和脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸等核酸药物的共输送。然而，上述载体缺少对细胞内外不同环境的选择性，当用于疏水药物与RNA药物共输送时，难以满足细胞外稳定存在、细胞内快速解离并释放被包载药物的要求，其应用范围和使用效果都受到了严重限制。

发明内容

基于以上背景，本发明的一个方面是提供一种聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子，所述三嵌段聚阳离子具有以下式1所示结构：

其中，R₁来源于聚乙二醇链段的末端结构，并选自羧基、氨基、氰基、巯基、醛基和C1-C3烷基，优选甲基；R₂为卤素，优选Cl或Br；n为0-10的整数、优选0-4的整数；x为23-225、优选45-145的整数；y为10-100、优选20-60的整数；以及z为10-100、优选20-60的整数。

本发明的另一方面是提供一种上述聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子的制备方法，该方法通过原子转移聚合和胺解反应进行，具体包括如下步骤：

步骤一：通过以下反应路线I所示的原子转移聚合方法合成聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段共聚物：

反应路线I

步骤a：聚乙二醇大分子引发剂的合成

将一端为R₁且另一端为羟基的聚乙二醇溶于无水二氯甲烷中以使终浓度为5-20w/v，再以无水三乙胺:聚乙二醇=1-5的摩尔比向溶液中加入无水三乙胺，以2-溴异丁基酰溴:聚乙二醇=1-5的摩尔比称取2-溴异丁基酰溴并将其溶于20倍体积的无水二氯甲烷中，冰浴下将2-溴异丁基酰溴的二氯甲烷溶液滴加到聚乙二醇溶液中，滴加结束后继续反应24-72小时，反应结束后用饱和食盐水洗两次，收集有机相，MgSO₄干燥过夜，收集有机相并浓缩得到溴封端的聚乙二醇大分子引发剂；

步骤b：聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯两嵌段共聚物的合成

将步骤a中得到的溴端基的聚乙二醇大分子引发剂与甲基丙烯酸缩水甘油酯单体以摩尔比=1:30-200的比例混合，然后加入体积比=10:1-1:10的N,N-二甲基乙酰胺-异丙醇混合溶剂，加入与聚乙二醇大分子引发剂等摩尔的催化剂配体五甲基二乙烯三胺及等摩尔的催化剂溴化亚铜，在无氧条件下，30-90℃之间的任意一个恒定温度反应1-24小时，反应产物用四氢呋喃稀释，过中性氧化铝柱后，40℃蒸馏浓缩得到聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯两嵌段共聚物；

步骤c：聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段共聚物的合成

将步骤b中得到的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯两嵌段共聚物与甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯以摩尔比=1:30-1:200的比例混合，加入N,N-二甲基乙酰胺与异丙醇体积比=10:1-1:10的混合溶剂，加入与聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯两嵌段共聚物等摩尔的催化剂配体五甲基二乙烯三胺及等摩尔的催化剂溴化亚铜，无氧条件下在40-90℃间的任意一个恒定温度反应4-12小时，反应完全后，反应产物用四氢呋喃稀释、二次去离子水透析纯化、冷冻干燥后得到聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段共聚物；

步骤二：通过反应路线II合成聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子

反应路线II

取步骤一中得到的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段共聚物固体，溶于无水N,N-二甲基乙酰胺中制得浓度=1.0-20.0w/v的溶液A（例如，三嵌段共聚物与无水N,N-二甲基乙酰胺的比例可为2w/v），取乙二胺或其寡聚物与三嵌段共聚物摩尔比=20-100的比例称取乙二胺或其寡聚物溶于2倍体积的N,N-二甲基乙酰胺中制得溶液B，将溶液A滴加到溶液B中，30-60℃油浴条件下搅拌反应1-12小时，停止反应，用截留量为1000-10000达尔顿的透析袋透析24-48小时后，冷冻干燥后得到目标产物，

其中，R₁、R₂、n、x、y和z如上所述。

本发明的另一方面是提供一种所述聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子用于制备负载核酸和疏水抗癌药物的阳离子胶束的用途。

优选地，所述疏水抗癌药物为选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、5-氨基喜树碱、长春碱、长春新碱、依托泊苷、顺铂、卡铂和奥沙利铂中的一种或多种。

本发明的另一方面是提供一种多层阳离子胶束，所述阳离子胶束包括式1所示的三嵌段聚阳离子，其中，所述阳离子胶束包括中性聚乙二醇亲水外层、胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯阳离子化中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层。

所述阳离子胶束具有双重酸敏感性，可在pH为7.4的中性生理条件下结合质子显正电性，在pH低于6.3的弱酸性环境中结合质子解离，并且其平均流体力学粒径优选为20-60纳米。

本发明的另一方面是提供一种所述多层阳离子胶束的制备方法，其特征是：将式1所示的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子溶解于有机溶剂中，得到含有两亲性三嵌段共聚物的溶液，将该溶液在超声下滴入水中，其中水与有机溶剂的体积比值大于1；然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂，得到所述多层阳离子胶束。

本发明由三嵌段聚阳离子通过溶液自组装方法制备的阳离子胶束具有多层结构，包括聚乙二醇外层、胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯内层，阳离子胶束的平均流体力学粒径优选为20-60纳米；所述的有机溶剂优选为选自四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。

所述三嵌段聚阳离子中的不同嵌段具有不同功能，使相应的阳离子胶束具备多功能性。聚乙二醇嵌段具有亲水性，可以屏蔽阳离子胶束的部分正电荷，提高胶束的稳定性，避免因为蛋白吸附造成的胶束聚集与沉降。聚乙二醇的R₁端可以进行功能化修饰，使阳离子胶束具有靶向的药物输送能力。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯经乙二胺或其寡聚物胺基化后带有一级胺和二级胺，该嵌段具有强质子缓冲能力，在中性生理条件下带正电性，可通过静电作用吸附负电性核酸药物。聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯嵌段具有酸敏感性（pKa6.3），在中性生理条件下具有疏水性，构成阳离子胶束的疏水内核，可用于包载疏水抗癌药物。聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯内核在细胞弱酸性环境中解离，实现被包载药物的快速释放。

本发明的又一方面是提供一种负载有核酸(小干扰核糖核酸(siRNA)和短肝素核糖核酸(shRNA))和疏水抗癌药物的阳离子胶束复合物，其包括：由式1所示的三嵌段聚阳离子构成的阳离子胶束；和负载在上述阳离子胶束上的核酸和疏水抗癌药物，其中，所负载的疏水抗癌药物和核酸的重量优选占所述阳离子胶束复合物重量的1.0-20%，式1所示的三嵌段聚阳离子和疏水抗癌药物的重量比优选为1-10。

本发明的再一方面是提供一种负载有核酸和疏水抗癌药物的阳离子胶束复合物的制备方法，其特征在于，将式1所示的三嵌段聚阳离子和疏水抗癌药物以重量比=1-10的比例同时溶解于有机溶剂中，得到含有聚阳离子和疏水抗癌药物的混合溶液，在超声条件下将该混合溶液与水以体积比=30:70-10:90的比例混合，然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂和未负载的疏水抗癌药物，得到包载有疏水抗癌药物的阳离子胶束，在水溶液中将包载有疏水抗癌药物的阳离子胶束与核酸以重量比=1-30的比例混合，常温静置30分钟得到包载有核酸并负载有疏水抗癌药物的具有双重酸敏感性的多层阳离子胶束复合物；其中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种；所负载的疏水抗癌药物和核酸的重量优选占所述阳离子胶束复合物重量的1.0-20%。

本发明的另一方面是提供一种所述多层阳离子胶束用于核酸和疏水抗癌药物同步共输送的应用，其可用于癌症治疗，主要用于逆转癌症多药耐药或抑制癌症转移。

所述的疏水抗癌药物，只要出于本发明的目的，可以选自任何疏水抗癌药物，包括阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、5-氨基喜树碱、长春碱、长春新碱、依托泊苷、顺铂、卡铂、奥沙利铂等所组成的组中的至少一种，只要是在共同负载时不产生对药效有不良影响的物质，也可以是以上抗癌药物组合。

根据本发明提供的多层阳离子胶束的用途，所针对的癌症类型主要为耐药性或转移性的乳腺癌、肝癌、胃癌、头颈部癌、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌及前列腺癌等。

附图说明

图1为本发明实施例1中溴封端的聚乙二醇（PEG-Br）引发剂、实施例2中聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PEG-b-PGC-Br）两嵌段共聚物、实施例3中聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（PEG-b-PGC-b-PDPA）三嵌段共聚物和实施例4中聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（PEG-b-PAG-b-PDPA）三嵌段聚阳离子的核磁共振氢谱（¹H-NMR，Varian-MERCURY Plus-400型核磁共振氢谱仪）图。其中，A为溴封端的聚乙二醇（PEG-Br）引发剂，B为聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PEG-b-PGC-Br）两嵌段共聚物，C为聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（PEG-b-PGC-b-PDPA）三嵌段共聚物，D为二乙烯三胺修饰的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（PEG-b-PAG-b-PDPA）三嵌段聚阳离子（a为二乙烯三胺中乙基氢磁共振峰，证明缩水甘油酯胺解成功）。

图2为本发明实施例4中所述PEG-b-PAG-b-PDPA三嵌段聚阳离子的酸碱滴定曲线。A为二次去离子水，B为二乙烯三胺修饰的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯两嵌段共聚物（PEG-b-PAG）（其胺基化类似于发明内容的步骤二），C为二乙烯三胺修饰的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（PEG-b-PAG-b-PDPA）三嵌段聚阳离子，D为聚乙二醇-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（PEG-b-PDPA）两嵌段共聚物。PEG-b-PAG-b-PDPA三嵌段聚阳离子具有在4.5-6.0和6.0-9.0两个pH范围内的质子缓冲能力，分别与PEG-b-PAG和PEG-b-PDPA两嵌段共聚物各自的缓冲区间重合，证明该聚阳离子具备双重酸敏感性。实验中pH值由SartoriusPB-10型pH计测定，二次去离子水由Advantage A10型纯水仪制备。

图3为本发明实施例5中所制备PEG-b-PAG-b-PDPA阳离子胶束的（A）流体力学粒径，和（B）表面电位分布图。阳离子胶束的流体力学粒径为20-40纳米,表面电位为30±10毫伏。阳离子胶束的流体力学粒径和表面电位由MALVERN NANO SIZER型粒径测定仪测定。

图4为本发明实施例5中所制备的PEG-b-PAG-b-PDPA阳离子胶束在不同pH条件下的透射电镜图。阳离子胶束在中性pH(7.4)条件下形成球形胶束(A)，粒径约为30纳米，该阳离子胶束在酸性条件下（pH6.0）解离，呈絮状无规则聚集态(B)（标尺100纳米）。透射电镜照片由Tecnai G2F20S-TWIN型透射电子显微镜获得。

图5为本发明实施例5中所制备阳离子胶束结合小干扰核糖核苷酸（siRNA）能力的凝胶电泳图。PEG-b-PAG-b-PDPA阳离子胶束可在与siRNA质量比=2.0时完全压缩siRNA，证明其具有良好的siRNA结合能力。DY-501凝胶电泳仪购自上海万达科技器材有限公司，凝胶照片由BIO RAD ChemiDOCTM MP Imaging System型凝胶成像仪获取。

图6为本发明实施例6中转染绿色荧光蛋白特异的小干扰核糖核苷酸（siRNA-GFP）的荧光显微镜（OLYMPUS1X81型倒置荧光显微镜）（图6B）和流式细胞仪（BD FACSCalibur型流式细胞仪）分析结果。PEG-b-PAG-b-PDPA阳离子胶束在与siRNA的质量比=16时，可抑制绿色荧光稳定表达A549肺癌细胞（A549-GFP）中超过70%的绿色荧光蛋白（GFP）表达，由包载非特异小干扰核糖核苷酸（siRNA-Scr）PEG-b-PAG-b-PDPA阳离子胶束处理的A549细胞为阴性对照（图6A）。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些具体实施例限定。

实施例中所用的甲氧基封端的聚乙二醇2000、2-溴异丁基酰溴、氯化亚铜、溴化亚铜、甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯和五甲基二乙烯三胺购自西格玛奥德里奇（中国）公司。甲基丙烯酸缩水甘油酯购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团（上海）化学试剂有限公司。

siRNA序列由上海吉玛生物制药技术公司合成。A549肺癌细胞购自美国ATCC细胞库，细胞培养用DMEM培养基和胎牛血清均购自Gibco公司。

在本申请中，如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法。

实施例1：聚乙二醇引发剂的制备

称取15.0克甲氧基封端的聚乙二醇2000（mPEG_2k-OH）溶于187.5毫升的二氯甲烷中，再向溶液中加入三乙胺0.825毫升。取1.5毫升2-溴异丁基酰溴溶于45毫升二氯甲烷中，冰浴下将2-溴异丁基酰溴溶液滴加到mPEG_2k-OH溶液中。滴加结束后继续反应48小时，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水各洗两次，收集有机相，加无水硫酸镁干燥过夜，过滤除硫酸镁，旋蒸浓缩，乙醚沉淀两次后得到酰溴修饰的聚乙二醇聚合物产品11.0克，产率73.3%。

实施例2：聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯两嵌段共聚物的制备

取实施例1中制备的聚乙二醇2000大分子引发剂（mPEG_2k-Br）1.0克溶于3.6毫升N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）中，加入0.4毫升异丙醇，搅拌混匀后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯（GC）1.05毫升，五甲基二乙烯三胺42微升。真空除氧后加入催化剂氯化亚铜4.8毫克，40℃反应15小时。待反应结束后，用氧化铝柱纯化，旋蒸浓缩后乙醚沉淀，真空泵抽干，得产品1.44克，产率72%。以氘代氯仿为溶剂，由核磁共振氢谱确定聚合物结构为甲氧基封端的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（mPEG_2k-b-PGC₄₀）。

实施例3：聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段共聚物的制备

取实施例2中制备的甲氧基封端的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（mPEG_2k-b-PGC₄₀）0.2克溶于0.3毫升DMAC中，加入0.2毫升异丙醇，搅拌混匀，再加入甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体0.47毫升，五甲基二乙烯三胺7.5微升。除氧后加入催化剂溴化亚铜5.0毫克，40℃反应48小时。待反应结束后过氧化铝柱除铜盐，40℃旋蒸浓缩后用乙醚沉淀，真空干燥得产品2.0克，产率98%。以氘代氯仿为溶剂，经核磁共振氢谱确认聚合物结构为聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯（mPEG_2k-b-PGC₄₀-b-PDPA₅₀）。

实施例4：聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯聚阳离子的制备

取实施例3中制备的mPEG_2k-b-PGC₄₀-b-PDPA₅₀100毫克，溶于3毫升DMAC中。取3毫升二乙烯三胺（DETA）溶于2毫升无水DMAC中。将聚合物溶液滴加到DETA中，60℃搅拌反应6小时后取出，用截留量分子量为3500道尔顿的透析袋（购自上海绿鸟科技发展有限公司）透析24小时，冷冻干燥后得产品70毫克，产率58.3%，以氘代二甲基亚砜为溶剂，由核磁共振氢谱测得聚阳离子的化学结构为mPEG_2k-b-PAG₄₀-b-PDPA₅₀。

实施例5:双重酸敏感多层阳离子胶束的制备

取实施例4中制备的mPEG_2K-b-PAG₄₀-b-PDPA₅₀三嵌段阳离子40毫克溶于0.5毫升DMAC中，超声（200mW）下再将其滴加到2毫升去离子水中，涡旋（1000rpm）1分钟，制成胶束。用3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析24小时后，用去离子水定容至10毫克/毫升，利用动态光散射仪测定胶束流体力学半径和表面电位，结果如图3所示。

实施例6:阳离子胶束用于siRNA输送

取绿色荧光稳定表达A549肺癌细胞（A549-GFP）接种于6孔细胞培养板中（50000细胞/孔），每孔加入0.5毫升DMEM培养基（含10%血清）。培养24小时后换液，补加培养基（190微升/孔）。在水溶液中将实施例5中制备的mPEG_2K-b-PAG₄₀-b-PDPA₅₀阳离子胶束与siRNA以重量比分别为4.0，8.0，16和32的不同比例混合，常温静置30分钟得到包载有siRNA药物的胶束复合物。在细胞培养板中加入100μL胶束复合物悬浮液（siRNA400纳克/孔），平行2组。将复合物与癌细胞共同孵育12小时，换液，加350微升DMEM培养基（含10%血清），继续孵育48小时后用荧光显微镜观察（图6B）并利用流式细胞仪测定细胞中GFP强度，结果如图6所示。其中，由包载非特异小干扰核糖核苷酸（siRNA-Scr）PEG-b-PAG-b-PDPA阳离子胶束处理的A549细胞为阴性对照（图6A）。

实施例7：阳离子胶束用于紫杉醇与Bcl-2特异siRNA(siRNA-Bcl-2)共输送

称取实施例4中制备的mPEG_2K-b-PAG₄₀-b-PDPA₅₀固体40mg和紫杉醇0.80mg溶于0.5mL DMAC中，超声下再将其滴加到2ml去离子水中，涡旋1min后制成胶束。用3500MD的透析袋在去离子水中透析24h,并用去离子水配成浓度为10mg/mL。取紫杉醇耐药A549肺癌细胞（A549/T）接种于96孔细胞培养板中（10000细胞/孔），每孔加入0.2mL DMEM培养基（含10%血清）。培养24h后换液，补加培养基（190μl/孔）。制备不同紫杉醇包载量的mPEG_2K-b-PAG₄₀-b-PDPA₅₀阳离子胶束，以siRNA-Bcl-2与包载紫杉醇阳离子胶束的质量比=10的比例制备胶束复合物。在细胞培养板中加入10μL/孔胶束复合物悬浮液，固定siRNA浓度为200纳克/孔，紫杉醇浓度分别为6.25，12.5，25.0和50.0nM。将复合物与癌细胞共同孵育12h，换液，加100μL DMEM培养基（含10%血清），继续孵育48h后利用标准MTT法测定细胞代谢活性。与包载非特异小干扰核糖核苷酸（siRNA-Scr）和紫杉醇的PEG-b-PAG-b-PDPA阳离子胶束阴性对照相比，MTT测定结果显示siRNA-Bcl-2处理可有效提高紫杉醇的药效。例如，在紫杉醇浓度为58nM时，siRNA-Bcl-2处理组的细胞存活率为35%，较非特异siRNA处理阴性对照组低20%，显著改善了紫杉醇耐药A549细胞对紫杉醇药物的敏感性。证实阳离子胶束用于siRNA-Bcl-2和紫杉醇共输送时具有协同增效作用。

Claims

1.一种聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子，其中，所述三嵌段聚阳离子具有以下式1所示结构：

其中，R₁选自羧基、氨基、氰基、巯基、醛基和C1-C3烷基；R₂为卤素；n为0-10的整数；x为23-225的整数；y为10-100的整数；以及z为10-100的整数。

2.根据权利要求1所述的三嵌段聚阳离子，其中，R₁为甲基；R₂为Cl或Br；n为0-4的整数；x为45-145的整数；y为20-60的整数；以及z为20-60的整数。

3.一种权利要求1或2所述的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子的制备方法，该方法具体包括如下步骤：

反应路线I

步骤a：聚乙二醇大分子引发剂的合成

将一端为R₁，另一端为羟基的聚乙二醇溶于无水二氯甲烷中以使终浓度为5-20w/v，再以三乙胺:聚乙二醇=1-5的摩尔比向溶液中加入无水三乙胺，以2-溴异丁基酰溴:聚乙二醇=1-5的摩尔比称取2-溴异丁基酰溴并将其溶于20倍体积的无水二氯甲烷中，冰浴下将2-溴异丁基酰溴的二氯甲烷溶液滴加到聚乙二醇溶液中，滴加结束后继续反应24-72小时，反应结束后用饱和食盐水洗两次，收集有机相，MgSO₄干燥过夜，收集有机相并浓缩得到溴封端的聚乙二醇大分子引发剂；

反应路线II

取步骤一中得到的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段共聚物固体，溶于无水N,N-二甲基乙酰胺中制得浓度=1.0-20.0w/v的溶液A，取乙二胺或其寡聚物与三嵌段共聚物摩尔比=20-100的比例称取乙二胺或其寡聚物溶于2倍体积的N,N-二甲基乙酰胺中制得溶液B，将溶液A滴加到溶液B中，30-60℃油浴条件下搅拌反应1-12小时，停止反应，用截留量为1000-10000达尔顿的透析袋透析24-48小时后，冷冻干燥后得到目标产物，

其中，R₁、R₂、n、x、y和z如权利要求1或2所述。

4.权利要求1或2所述的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子用于制备负载核酸和疏水抗癌药物的阳离子胶束的用途。

5.一种多层阳离子胶束，其中，所述阳离子胶束包括权利要求1或2中式1所示的三嵌段聚阳离子，其中，所述阳离子胶束包括中性聚乙二醇亲水外层、胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯阳离子化中间层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层。

6.根据权利要求5所述的所述阳离子胶束，其中，所述多层阳离子胶束的平均流体力学粒径为20-60纳米。

7.根据权利要求5或6所述的多层阳离子胶束的制备方法，其特征是：将权利要求1或2中式1所示的聚乙二醇-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯三嵌段聚阳离子溶解于有机溶剂中，得到含有两亲性三嵌段共聚物的溶液，将该溶液在超声下滴入水中，其中水与有机溶剂的体积比值大于1；然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂，得到所述多层阳离子胶束；其中，所述阳离子胶束的平均流体力学粒径优选为20-60纳米；所述的有机溶剂优选为选自四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。

8.一种负载有核酸和疏水抗癌药物的阳离子胶束复合物，其包括：权利要求5或6所述的阳离子胶束；和负载在所述阳离子胶束上的核酸和疏水抗癌药物，其中，所负载的疏水抗癌药物和核酸的重量占所述阳离子胶束复合物重量的1.0-20%，式1所示的三嵌段聚阳离子和疏水抗癌药物的重量比为1-10。

9.一种负载有核酸和疏水抗癌药物的阳离子胶束复合物的制备方法，其特征在于，将权利要求1或2中式1所示的三嵌段聚阳离子和疏水抗癌药物以重量比=1-10的比例同时溶解于有机溶剂中，得到含有聚阳离子和疏水抗癌药物的混合溶液，在超声条件下将该混合溶液与水以体积比=30:70-10:90的比例混合，然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂和未负载的疏水抗癌药物，得到包载有疏水抗癌药物的阳离子胶束，在水溶液中将包载有疏水抗癌药物的阳离子胶束与核酸以重量比=1-30的比例混合，常温静置30分钟得到包载有核酸并负载有疏水抗癌药物的具有双重酸敏感性的多层阳离子胶束复合物；其中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种；所负载的疏水抗癌药物和核酸的重量占所述阳离子胶束复合物重量的1.0-20%。

10.权利要求5或6所述的多层阳离子胶束用于核酸和疏水抗癌药物同步共输送的应用，其中，所述疏水抗癌药物优选为选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、5-氨基喜树碱、长春碱、长春新碱、依托泊苷、顺铂、卡铂和奥沙利铂中的一种或多种。