CN111184738A - 一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用、药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用、药物组合物，属于药物应用技术领域。本发明提供的二嵌段共聚物为pH敏感材料，其pKa范围为6.0～8.0，可以裂解或破坏病毒外膜，直接作用于病毒而非宿主细胞，通过全新裂解病毒外膜的机理实现体内外灭活病毒的目的；本发明提供的二嵌段共聚物对多种RNA病毒具有体内外广谱疗效，且体内外抗病毒的效果好，明显改善病毒感染小鼠模型的预后。本发明利用二嵌段共聚物裂解或者破坏病毒外膜这一抗病毒感染机制，为抗病毒感染提供了安全且高效的新途径。

Description

一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物 中的应用、药物组合物
技术领域
本发明涉及药物应用技术领域，尤其涉及一种二嵌段共聚物在制备抗病毒药物中的应用、药物组合物。
背景技术
目前，抗病毒感染的途径很多，如直接抑制或杀灭病毒、干扰病毒吸附、阻止病毒穿入细胞、抑制病毒生物合成、抑制病毒释放或增强宿主抗病毒能力等。按照作用对象的不同，抗病毒感染的手段主要包括作用于病毒和作用于宿主细胞两种。前者一方面包括各种外用的杀毒灭菌的消杀剂，如84消毒液、过氧乙酸、新洁尔灭等，同时也包括可直接影响病毒生命周期中各个环节的靶向药物；后者主要通过激活宿主细胞的免疫功能来实现。
根据抗病毒药物的作用机制，可将目前的抗病毒药物分为以下几类：(1).穿入和脱壳抑制剂：比如金刚烷胺、金刚乙胺、恩夫韦地和马拉韦罗；(2)DNA多聚酶抑制剂：比如阿昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦和膦甲酸钠；(3)逆转录酶抑制剂：核苷类：拉米夫定、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦和阿德福韦酯；非核苷类：依法韦仑和奈韦拉平；(4)蛋白质抑制剂：沙奎那韦；(5)神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦、扎那米韦；(6)广谱抗病毒药：利巴韦林、干扰素等。
虽然此类药物名目繁多，但目前这类药物的作用效果仍较为有限。大多数直接作用于病毒的药物均只能针对少数几种病毒，在新型病毒疫情发生时很难及时有效地找到针对性的特效药物。而目前的广谱抗病毒药物主要通过促进宿主自身的免疫功能来发挥作用，这类药物一方面抗病毒效果有限，另一方面也容易导致宿主的自身免疫反应，造成细胞因子风暴，副作用较大。
病毒包膜是病毒表面的磷脂膜，存在于自然界多数病毒中，并在病毒进入宿主细胞的过程中发挥着重要的作用。因此，靶向病毒包膜的药物具有良好的广谱性和有效性。目前，尚未有通过裂解或者破坏病毒外膜，进而进行抗病毒感染的抗病毒药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用、药物组合物，所述二嵌段共聚物能够裂解或者破坏病毒外膜，实现抗病毒感染。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，所述二嵌段共聚物具有式I所示结构：
Figure BDA0002399828720000021
式I中，
R1包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基、C1～C12经取代的环烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
n＝1～500且n为整数；
R2具有式II所示结构：
Figure BDA0002399828720000022
其中，m＝0～10且m为整数；
R2′和R2″独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或氰基、C1～C12经取代的环烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基、C6～C24经取代的芳烷基；
R3具有式III所示结构：
Figure BDA0002399828720000023
其中，nx＝1～10且为整数；
X1、X2和X3独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或C1～C12经取代的环烷基；
X4和X5独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12酰基、C6～C24芳基/芳烷基或这些基团中任一种的经取代形式；
或者X4和X5合并后为C1～C12烷二基、C1～C12烷氧二基、C1～C12烷氨二基或这些基团中任一种的经取代形式；
x＝1～150且为整数；
R4具有式IV所示结构：
Figure BDA0002399828720000031
其中，ny＝1～10且为整数；
X1′、X2′和X3′独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或C1～C12经取代的环烷基；
X4′和X5′独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12酰基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C1～C12经取代的烷基、C1～C12经取代的环烷基、C1～C12经取代的酰基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
或者X4′和X5′合并后为C1～C12烷二基、C1～C12烷氧二基、C1～C12烷氨二基或这些基团中任一种的经取代形式；
y＝0～150且为整数；
R5为氢、卤素、羟基、C1～C24烷基、C1～C24经取代的烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
当R3和R4不同时，R3和R4在所述二嵌段共聚物内的顺序没有限定。
优选的，所述二嵌段共聚物为pH敏感性材料，所述二嵌段共聚物在水中的pKa为6.0～8.0。
优选的，所述二嵌段共聚物以二嵌段共聚物纳米粒混悬液的形式给药；所述二嵌段共聚物形成的纳米粒在低于pKa的pH值下解离。
优选的，所述二嵌段共聚物纳米粒混悬液包括二嵌段共聚物纳米粒PBS溶液或二嵌段共聚物纳米粒生理盐水溶液；所述二嵌段共聚物纳米粒混悬液的浓度为0.01μM～10mM。
优选的，所述给药的途径包括静脉注射、静脉用药、口服给药、舌下给药、腹腔给药、皮下给药、眼内给药、滴眼、滴鼻或喷雾给药。
优选的，所述给药的剂量为0.1～1000mg/kg。
优选的，所述抗病毒药物中的病毒包括疱疹病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、痘病毒科或逆转录病毒科。
本发明提供了一种用于治疗病毒感染的药物组合物，包括上述技术方案所述具有式I所示结构的二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐。
优选的，所述药物组合物还包括抗病毒药物或免疫增强药物。
优选的，所述药物组合物用于局部抗病毒治疗或全身病毒感染引起的局部病变。
优选的，所述药物组合物用于人体抗病毒感染或动物抗病毒感染。
本发明提供了一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用、药物组合物，本发明提供的二嵌段共聚物可以裂解或破坏病毒外膜，直接作用于病毒而非宿主细胞，通过全新裂解病毒外膜的机理实现体内外灭活病毒的目的；
本发明提供的二嵌段共聚物对多种RNA病毒具有体内外广谱疗效，且体内外抗病毒的效果好。
本发明所涉及的二嵌段共聚物为常见的pH敏感材料，其在抗肿瘤药物递送、肿瘤边缘成像等方面具有成熟的应用，其安全性较高，对宿主细胞不会产生危害。本发明利用二嵌段共聚物裂解或者破坏病毒外膜这一抗病毒感染机制，为抗病毒感染提供了安全且高效的新途径。
附图说明
图1为本发明制备例1制备的二嵌段共聚物PEG-PDEA-PDPA的核磁谱图；
图2为本发明制备例1制备的二嵌段共聚物PEG-PDEA-PDPA的结构示意图；
图3为实施例1中VSV病毒、二嵌段共聚物纳米粒混悬液NP-1以及二者孵育后的透射电镜图；
图4为实施例1中不同药物处理对病毒感染能力的影响；其中，a为流式图；b为统计图；
图5为不同药物处理后病毒RNA荧光定量PCR图；
图6为实施例2中不同药物处理对病毒黏附的影响；其中，a为流式图；b为统计图；
图7为实施例2中不同药物处理对病毒穿膜的影响；其中，a为流式图；b为统计图；
图8为实施例3中不同药物处理对多种细胞抗病毒感染能力的影响；
图9为实施例3中药物处理对不同病毒复制效率的影响；其中，a为对HSV病毒复制效率的影响；b为对SEV病毒复制效率的影响；c为对LCMV-Cl13病毒复制效率的影响；d为对LCMV-ARM病毒复制效率的影响；e为对MHV-A59病毒复制效率的影响；
图10为实施例4中不同药物处理对病毒感染小鼠生存率的影响；其中，a为VSV病毒感染小鼠生存率；b为HSV病毒感染小鼠生存率；
图11为实施例4中不同药物处理对VSV病毒在感染小鼠体内复制效率的影响；其中，a为VSV病毒在小鼠肝脏的复制率；b为VSV病毒在小鼠肺脏的复制率；c为VSV病毒在小鼠脾脏的复制率；
图12为实施例4中不同药物处理对HSV病毒在感染小鼠体内复制效率的影响；其中，a为HSV病毒在小鼠脑的复制率；b为HSV病毒在小鼠肺脏的复制率；c为VSV病毒在小鼠脾脏的复制率；
图13为实施例5中不同药物处理对病毒感染细胞干扰素、细胞因子以及干扰素刺激基因表达的影响；其中，a为一型干扰素的表达水平；b为细胞因子CXCL10mRNA的表达水平；c为细胞因子CCL5mRNA的表达水平；d为ISG56mRNA的表达水平；e为USP18mRNA的表达水平；
图14为实施例5中不同药物处理对病毒感染小鼠肺脏干扰素刺激基因表达的影响；其中，a为ISG15mRNA的表达水平；b为IFIT3mRNA的表达水平；c为OASL1mRNA的表达水平；d为IRF7mRNA的表达水平；
图15为实施例5中不同药物处理后病毒感染细胞的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析图；其中，a为GO功能富集分析图；b为KEGG通路富集分析图；
图16为实施例5中不同药物处理细胞，去除或不去除药物后，病毒感染效率图；其中，a为流式图；b为统计图；
图17为实施例5中药物处理细胞不同时间后的病毒感染效率图；其中，a为流式图；b为统计图；
图18为实施例6中不同浓度药物预处理病毒后，进行细胞感染的效率图；其中，a为流式图；b为统计图。
具体实施方式
本发明提供了一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，所述二嵌段共聚物具有式I所示结构：
Figure BDA0002399828720000061
式I中，
R1包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基、C1～C12经取代的环烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
n＝1～500且n为整数；
R2具有式II所示结构：
Figure BDA0002399828720000062
其中，m＝0～10且m为整数；
R2′和R2″独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或氰基、C1～C12经取代的环烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基、C6～C24经取代的芳烷基；
R3具有式III所示结构：
Figure BDA0002399828720000071
其中，nx＝1～10且为整数；
X1、X2和X3独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或C1～C12经取代的环烷基；
X4和X5独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12酰基、C6～C24芳基/芳烷基或这些基团中任一种的经取代形式；
或者X4和X5合并后为C1～C12烷二基、C1～C12烷氧二基、C1～C12烷氨二基或这些基团中任一种的经取代形式；
x＝1～150且为整数；
R4具有式IV所示结构：
Figure BDA0002399828720000072
其中，ny＝1～10且为整数；
X1′、X2′和X3′独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或C1～C12经取代的环烷基；
X4′和X5′独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12酰基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C1～C12经取代的烷基、C1～C12经取代的环烷基、C1～C12经取代的酰基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
或者X4′和X5′合并后为C1～C12烷二基、C1～C12烷氧二基、C1～C12烷氨二基或这些基团中任一种的经取代形式；
y＝0～150且为整数；
R5为氢、卤素、羟基、C1～C24烷基、C1～C24经取代的烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
当R3和R4不同时，R3和R4在所述二嵌段共聚物内的顺序没有限定。
在本发明中，所述二嵌段共聚物即为中国专利(申请号为201780027045.X，公开号为CN109069440A，公开日为2018年12月21日)公开的二嵌段共聚物，本发明参照上述专利公开的方法采用常规的可逆加成-断裂链转移聚合法制备所述二嵌段共聚物，在此不再赘述。
在本发明中，所述二嵌段共聚物为pH敏感性材料，所述二嵌段共聚物在水中的pKa为6.0～8.0。在本发明中，所述二嵌段共聚物优选以二嵌段共聚物纳米粒混悬液的形式给药；所述二嵌段共聚物形成的纳米粒在低于pKa的pH值下解离；所述二嵌段共聚物纳米粒混悬液优选包括二嵌段共聚物纳米粒PBS溶液或二嵌段共聚物纳米粒生理盐水溶液。在本发明中，所述二嵌段共聚物纳米粒混悬液的浓度优选为0.01μM～10mM，更优选为1μM～5mM，进一步优选为10μM～1mM。
在本发明中，所述二嵌段共聚物纳米粒混悬液的制备方法优选包括以下步骤：
将所述二嵌段共聚物、有机溶剂和水相混合，进行分散，将所得分散液中的有机溶剂挥干，定容，得到二嵌段共聚物纳米粒混悬液。
在本发明中，所述二嵌段共聚物、有机溶剂和水相的混合过程优选包括先将所述二嵌段共聚物和有机溶剂混合，向所得溶液中边超声边滴加水相，得到分散液。本发明对所述超声的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程即可。本发明优选通过磁力搅拌将所述有机溶剂挥干，然后用蒸馏水定容，得到二嵌段共聚物纳米粒混悬液。
在本发明中，所述二嵌段共聚物纳米粒子水溶液的制备方法优选包括以下步骤：
将所述二嵌段共聚物、有机溶剂和水相混合，进行分散，将所得分散液进行超滤，然后依次进行洗涤、离心和定容后，得到二嵌段共聚物纳米粒混悬液。
在本发明中，所述二嵌段共聚物、有机溶剂和水相的混合过程优选包括先将所述二嵌段共聚物和有机溶剂混合，向所得溶液中边超声边滴加水相，得到分散液。在本发明中，所述有机溶剂优选为四氢呋喃(THF)。本发明对所述超声的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程即可。本发明优选在分子量100kD的超滤管中进行所述超滤，所述超滤的转速优选为5000rpm，时间优选为20min。
在本发明中，所述洗涤的过程优选为使用蒸馏水洗涤五次，所述离心的转速优选为5000rpm，时间优选为20min；完成所述离心后，本发明优选离心除去沉淀，所述离心的转速优选为10000rpm，时间优选为5min，将所得上清液定容，得到二嵌段共聚物纳米粒混悬液。
在上述两种制备二嵌段共聚物纳米粒混悬液的方法中，所述水相优选包括PBS缓冲液、生理盐水或Tris缓冲液。本发明对所述PBS缓冲液、生理盐水或Tris缓冲液的浓度没有特殊的限定，按照本领域熟知的浓度能够得到所述浓度的二嵌段共聚物纳米粒混悬液即可。
本发明对上述两种方法所用有机溶剂和水的用量没有特殊的限定，能够得到所述浓度的二嵌段共聚物纳米粒混悬液即可。
在本发明中，所述抗病毒药物中的病毒优选包括疱疹病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、痘病毒科或逆转录病毒科；更优选包括冠状病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、牛痘病毒、HIV和HBV。
在本发明中，所述给药的途径优选包括静脉注射、静脉用药、口服给药、舌下给药、腹腔给药、皮下给药、眼内给药、滴眼、滴鼻或喷雾给药。
在本发明中，所述给药的剂量优选为0.1～1000mg/kg，更优选为10～800mg/kg，进一步优选为100～500mg/kg。
本发明提供了一种用于治疗病毒感染的药物组合物，包括上述技术方案所述具有式I所示结构的二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐。
在本发明中，所述药物组合物的剂型优选包括溶液剂。
在本发明中，所述药物组合物优选还包括抗病毒药物或免疫增强药物。
在本发明中，所述药物组合物优选用于局部抗病毒治疗或全身病毒感染引起的局部病变。
在本发明中，所述药物组合物优选用于人体抗病毒感染或动物抗病毒感染。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
制备例1
1)PEG-PDEA-PDPA的合成：
按照本领域常规的可逆加成-断裂链转移聚合法(RAFT)制备二嵌段共聚物，合成路线为：
Figure BDA0002399828720000101
步骤：首先将1.6mmol化合物b用100mL甲苯溶解，110℃回流1h，旋干甲苯以除去水分。将2mmol化合物a溶于二氯甲烷，加入5mmol DCC以及10mmol DMAP室温搅拌2h，以活化羧基；随后加入1mmol利用二氯甲烷溶解的已除去水分的化合物b，室温搅拌3d；反应结束后，抽滤除去渣子，旋干二氯甲烷，用四氢呋喃重新溶解，以纯水透析2d，冻干，得到产物c。
将20μmol产物c，500μmol化合物d，300μmol化合物e以及3μmol AIBN溶于5mL无水DMF，混匀后加入到聚合管当中，用液氮将反应体系冻住，随后拧开阀门，利用真空泵进行抽气约5min，拧上阀门，将反应体系至于水中，使其缓慢溶解，待反应体系完全溶解后，再次利用液氮进行冷冻并抽气，如此循环四次(即冷冻抽换气循环)，结束后拧紧阀门，置于70℃油浴24h；反应结束后，将体系用液氮冻住，拧开阀门通气淬灭反应，利用纯水透析2d，冻干，得到产物f，即二嵌段共聚物，简写为PEG-PDEA-PDPA，记为NP-1。
2)二嵌段共聚物纳米粒混悬液的制备：
称取11mg二嵌段共聚物f，溶于1.5mL THF；边超声边加入9mL蒸馏水进行分散，得到分散液；将所述分散液转移至分子量为100kD的超滤管中，在5000rpm转速下进行超滤20min，然后将所得物料用蒸馏水洗涤五次；在10000rpm转速下进行离心5min，除去沉淀；将上清液定容至1mL，得到二嵌段共聚物纳米粒混悬液，浓度为0.8mM。
本制备例所制备的二嵌段共聚物PEG-PDEA-PDPA的核磁谱图见图1，其结构示意图见图2。
制备例2
1)PEG-nPDPA的合成
按照本领域常规的可逆加成-断裂链转移聚合法(RAFT)制备二嵌段共聚物，合成路线如下：
Figure BDA0002399828720000121
步骤：首先将1.6mmol化合物b用100mL甲苯溶解110℃回流1h，旋干甲苯以除去水分，将2mmol化合物a溶于二氯甲烷，加入5mmol DCC以及10mmol DMAP室温搅拌2h，以活化羧基；随后加入1mmol利用二氯甲烷溶解的已除去水分的化合物b，室温搅拌3d。反应结束后，抽滤除去渣子，旋干二氯甲烷，用四氢呋喃重新溶解，以纯水透析2d，冻干，得到产物c。
将20μmol产物c、2mmol化合物d以及3μmolAIBN溶于10mL无水DMF，混匀后加入到聚合管当中，用液氮将反应体系冻住，随后拧开阀门，利用真空泵进行抽气约5min，拧上阀门，将反应体系至于水中，使其缓慢溶解，待反应体系完全溶解后，再次利用液氮进行冷冻并抽气，如此循环四次(即冷冻抽换气循环)；结束后拧紧阀门，置于70℃油浴24h。反应结束后，将体系用液氮冻住，拧开阀门通气淬灭反应，利用纯水透析2d，冻干，得到产物g，即二嵌段共聚物，简写为PEG-nPDPA，记为NP-2。
2)二嵌段共聚物纳米粒混悬液的制备：称取11mg二嵌段共聚物g，溶于1.5mL THF；边超声边加入9mL蒸馏水进行分散，得到分散液；将所述分散液转移至分子量为100kD的超滤管中，在5000rpm转速下进行超滤20min，然后将所得物料用蒸馏水洗涤五次；在10000rpm转速下进行离心5min，除去沉淀；将上清液定容至1mL，得到二嵌段共聚物纳米粒混悬液，浓度为0.4mM。
制备例3
1)PEG-iPDPA的合成
按照本领域常规的可逆加成-断裂链转移聚合法制备二嵌段共聚物，合成路线如下：
Figure BDA0002399828720000131
步骤：首先将1.6mmol化合物b用100mL甲苯溶解110℃回流1h，旋干甲苯以除去水分，将2mmol化合物a溶于二氯甲烷，加入5mmol DCC以及10mmol DMAP室温搅拌2h，以活化羧基，随后加入1mmol利用二氯甲烷溶解的已除去水分的化合物b，室温搅拌3d；反应结束后，抽滤除去渣子，旋干二氯甲烷，用四氢呋喃重新溶解，以纯水透析2days，冻干，得到产物c；
将20μmol产物c，2mmol化合物h以及3μmolAIBN溶于10mL无水DMF，混匀后加入到聚合管当中。用液氮将反应体系冻住，随后拧开阀门，利用真空泵进行抽气约5min，拧上阀门，将反应体系至于水中，使其缓慢溶解，待反应体系完全溶解后，再次利用液氮进行冷冻并抽气，如此循环四次(即冷冻抽换气循环)；结束后拧紧阀门，置于70℃油浴24h；反应结束后，将体系用液氮冻住，拧开阀门通气淬灭反应，利用纯水透析2d，冻干，得到产物i，即二嵌段共聚物，简写为PEG-iPDPA，记为NP-3。
2)二嵌段共聚物纳米粒混悬液的制备：
称取11mg二嵌段共聚物i，溶于1.5mL THF；边超声边加入9mL蒸馏水进行分散，得到分散液；将所述分散液转移至分子量为100kD的超滤管中，在5000rpm转速下进行超滤20min，然后将所得物料用蒸馏水洗涤五次；在10000rpm转速下进行离心5min，除去沉淀；将上清液定容至1mL，得到二嵌段共聚物纳米粒混悬液，浓度为0.4mM。
实施例1
制备例1的PEG-PDEA-PDPA直接破坏病毒外膜的研究
实验(a)
取3×109PFU/mL的疱疹性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)与等体积的80μM NP-1的水溶液或PBS缓冲液混匀，于4℃条件下进行孵育；孵育1小时后，使用透射电子显微镜对混合液进行观察，结果见图3(标尺：100nm)。图中显示了二嵌段共聚物对VSV病毒包膜的破坏。
实验(b)
向1×105PFU/mL的表达绿色荧光蛋白的疱疹性口炎病毒(VSV-GFP)中加入等体积的80μM NP-1水溶液或DMEM培养基(对照)，同时加入PEG550或PEG2000溶液，于4℃条件下处理1h。1小时后，用处理后的病毒感染HeLa细胞，使MOI为0.01。感染16小时后，使用流式细胞术感染细胞进行检测，并对GFP阳性细胞的比率进行统计；结果见图4。图中UT指不进行任何处理，作为对照。结果表明，二嵌段共聚物对病毒包膜的破坏可被已知的细胞焦亡抑制剂PEG2000所抑制。
实验(c)
取3×109PFU/mL的VSV，向其中加入等体积PBS缓冲液或80μM的NP-1水溶液，同时加入聚乙二醇2000至浓度为1％，于4℃条件下孵育1h。随后，向混合液中加入20μg/mL的RNaseA，于37℃消化30分钟。用病毒RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取病毒RNA，并用实时荧光定量PCR的方法对各组中的病毒滴度进行测量。结果见图5，结果清楚显示了二嵌段共聚物抑制了病毒包膜对病毒核酸的保护作用，证明了二嵌段共聚物对病毒包膜的破坏。
实施例2
二嵌段共聚物抑制病毒的粘附和穿膜过程
实验(a)
将培养于DMEM培养基(添加10％FBS)中的HeLa细胞于4℃预冷1小时。1小时后，用MOI为0.01的VSV-GFP感染细胞，同时向细胞中加入PBS缓冲液(对照)或二嵌段共聚物纳米粒的水溶液(NP-1或NP-2)至浓度为80μM。感染1小时后，弃去培养基，并用4℃预冷的培养基洗细胞三次，之后将细胞放置于37℃，5％CO2的环境中培养。16小时后，用流式细胞术对GFP阳性细胞的比例进行检测，并用阳性细胞百分比进行统计分析。结果见图6，图中UT指不进行任何处理，作为对照。结果表明pKa为6.8的二嵌段共聚物显著抑制了病毒的粘附过程。
实验(b)
为探究二嵌段共聚物对病毒穿膜过程的影响，用MOI为0.01的VSV-GFP于4℃条件下感染4℃预冷的HeLa细胞1小时。1小时后，用4℃预冷的培养基洗细胞三次，并向细胞中加入PBS缓冲液(对照)或二嵌段共聚物纳米粒混悬液(NP-1或NP-2)至浓度为80μM，于37℃，5％CO2的环境中进行培养。培养1小时后，用柠檬酸缓冲液清洗细胞，并重新加入含10％FBS的DMEM培养基培养细胞。16小时后，用流式细胞术检测病毒感染效率，并对GFP阳性细胞百分比进行统计分析。结果见图7，图中UT指不进行任何处理，作为对照。由图可知，二嵌段共聚物对病毒穿膜的抑制作用。
实施例3
二嵌段共聚物具有抗病毒活性
实验(a)
用MOI为0.01的VSV-GFP分别感染小鼠乳腺癌细胞系4T1、小鼠肺癌细胞系LLC、仓鼠肾细胞系BHK21、人类宫颈癌细胞系HeLa、人非小细胞肺癌细胞系H1299及A549、人大细胞肺癌细胞系H460、人结肠癌细胞系SW480、人正常结肠细胞系NCM460及人胚胎肾细胞系HEK293T，同时向细胞培养基中加入二嵌段共聚物纳米粒的水溶液(NP-1)至浓度为80μM。感染16小时后，用荧光显微镜观察并拍照，同时用流式细胞术对各种细胞系中的GFP阳性细胞比率进行检测。结果见图8，由图可知，二嵌段共聚物对多种不同细胞系具有的抗病毒活性。
实验(b)
取培养于DMEM培养基(添加10％FBS)中的HeLa细胞，用MOI为0.1的单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)、仙台病毒(Sendai virus,SEV)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒克隆13(Lymphocytic choriomeningitis virus clone 13，LCMV-Cl13)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒克隆ARM(Lymphocytic choriomeningitis virus clone Armstrong，LCMV-ARM)及小鼠肝炎病毒A-59(mouse hepatitis virusA-59，MHV-A59)进行感染，并于感染的同时在培养基中加入二嵌段共聚物纳米粒混悬液(NP-1)至浓度为80μM进行处理。感染所示时间后，收集细胞并用实时荧光定量PCR的方法分析病毒复制效率。结果见图9，图中Vehicle为常规PBS，作为对照，结果表明，二嵌段共聚物对不同病毒的复制均有抑制作用。
实施例4
静脉内注射二嵌段共聚物可拮抗小鼠病毒感染
实验(a)
取六周龄SPF级实验用C57BL/6小鼠(购自北京维通利华公司)，通过尾静脉注射5×108PFU的VSV或5×106PFU的HSV感染小鼠。12小时后，给小鼠尾静脉注射200μL用DMEM培养基稀释后的NP-1，使小鼠注射剂量为50mg/kg(4μM/kg)，并观察小鼠的存活情况。结果见图10，其中n代表小鼠数量，结果显示，二嵌段共聚物可拮抗病毒导致的小鼠死亡。
实验(b)
如上所述，用5×108PFU的VSV感染小鼠并尾静脉注射200μL用DMEM培养基稀释后的NP-1，使注射剂量为50mg/kg(4μM/kg)小鼠体重，于感染后48小时处死小鼠，并用实时荧光定量PCR的方法检测小鼠肝脏、肺脏及脾脏内的病毒滴度。结果见图11，图中UT为不进行任何处理，作为对照；结果表明二嵌段共聚物可在体内抑制VSV的复制。
实验(c)
如上所述，用5×106PFU的HSV感染小鼠，并尾静脉注射200μL用DMEM培养基稀释后的NP-1，使注射剂量为50mg/kg(4μM/kg)。感染48小时后，取小鼠脑、肺脏及脾脏，用实时荧光定量PCR的方法测量各器官内的病毒滴度。结果如图12所示，图中UT为不进行任何处理，作为对照；由图可知，NP-1可显著抑制HSV在小鼠体内的复制。
实施例5
二嵌段共聚物的抗病毒活性不依赖于宿主细胞
实验(a)
用MOI为0.1的SEV感染HeLa细胞，同时向培养基中加入二嵌段共聚物纳米粒混悬液(NP-1)至浓度为80μM。感染12小时后，收集细胞并用实时荧光定量PCR方法测量一型干扰素(如图13中a所示)及其他细胞因子(如图13中b和c所示)的产生及干扰素刺激基因的表达(如图13中d和e所示)；图中UT为不进行任何处理，作为对照。结果表明，二嵌段共聚物不能促进细胞一型干扰素的产生，即其抗病毒活性不依赖于一型干扰素。
实验(b)
取六周龄SPF级实验用C57BL/6小鼠(购自北京维通利华公司)，通过尾静脉注射5×108PFU的VSV感染小鼠。感染12小时后，从尾静脉注射200μL用DMEM培养基稀释后的NP-1，使小鼠注射剂量为50mg/kg(4μM/kg)小鼠体重。在感染第48小时处死小鼠，用实时荧光定量PCR的方法检测小鼠肺脏组织中干扰素刺激基因ISG15、IFIT3、OASL1及IRF7的表达。结果如图14所示，说明二嵌段共聚物不影响体内病毒感染过程中的干扰素刺激基因表达。
实验(c)
取培养于DMEM培养基(添加10％FBS)中的HeLa细胞，向培养基中加入DMEM培养基(对照)或NP-1至浓度为80μM，同时以MOI为0.01的VSV-GFP感染16小时，收集细胞进行RNA-seq检测，并对数据进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。结果显示(如图15)，病毒感染过程中，二嵌段共聚物主要导致了细胞代谢的变化。
实验(d)
用80μM的二嵌段共聚物纳米粒混悬液(NP-1或NP-2)处理HeLa细胞2小时，随后用培养基清洗细胞，去除高分子聚合物，于37℃5％CO2条件下培养所示时间后，用MOI为0.01的VSV-GFP感染细胞16小时(Meantime组在加入病毒的同时加入二嵌段共聚物，不进行清洗)。用流式细胞术对各组中GFP阳性的细胞比率进行测量，并对测量结果进行统计分析。结果显示(如图16，图中UT为不进行任何处理，作为对照)，二嵌段共聚物的抗病毒活性依赖于其与病毒接触，即其并非通过影响细胞状态起到抗病毒作用。
实验(e)
取80μM的二嵌段共聚物纳米粒混悬液(NP-1或NP-2)处理HeLa细胞所示时间后，用MOI为0.01的VSV-GFP感染细胞。感染16小时后，使用流式细胞术对各组病毒感染效率进行检测，并用GFP阳性细胞百分比进行统计分析。结果如图17所示，图中UT为不进行任何处理，作为对照；由图可知，二嵌段共聚物的处理时间不影响其抗病毒活性。
实验(f)
取800μM的二嵌段共聚物纳米粒混悬液(NP-1或NP-2)，按图18中所示倍数用DMEM培养基进行稀释，并分别与等体积的1×104PFU/mL的VSV-GFP混匀，于4℃条件下孵育1小时。随后，用处理后的病毒感染培养于添加了10％FBS的DMEM培养基中的HeLa细胞，使MOI为0.001。感染24小时后，用流式细胞术对各组病毒感染效率进行测量，并用GFP阳性细胞百分比进行统计分析。结果见图18，图中UT为不进行任何处理，作为对照；ns代表无显著性差异。结果表明，二嵌段共聚物通过直接影响病毒发挥其抗病毒活性。
由以上实施例可知，本发明提供了一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用、药物组合物，本发明提供的二嵌段共聚物可以裂解或破坏病毒外膜，直接作用于病毒而非宿主细胞，通过全新裂解病毒外膜的机理实现体内外灭活病毒的目的；本发明提供的二嵌段共聚物对多种RNA病毒具有体内外广谱疗效，且体内外抗病毒的效果好。本发明利用二嵌段共聚物裂解或者破坏病毒外膜这一抗病毒感染机制，为抗病毒感染提供了安全且高效的途径。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于，所述二嵌段共聚物具有式I所示结构：
Figure FDA0002399828710000011
式I中，
R1包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基、C1～C12经取代的环烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
n＝1～500且n为整数；
R2具有式II所示结构：
Figure FDA0002399828710000012
其中，m＝0～10且m为整数；
R2′和R2″独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或氰基、C1～C12经取代的环烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基、C6～C24经取代的芳烷基；
R3具有式III所示结构：
Figure FDA0002399828710000013
其中，nx＝1～10且为整数；
X1、X2和X3独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或C1～C12经取代的环烷基；
X4和X5独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12酰基、C6～C24芳基/芳烷基或这些基团中任一种的经取代形式；
或者X4和X5合并后为C1～C12烷二基、C1～C12烷氧二基、C1～C12烷氨二基或这些基团中任一种的经取代形式；
x＝1～150且为整数；
R4具有式IV所示结构：
Figure FDA0002399828710000021
其中，ny＝1～10且为整数；
X1′、X2′和X3′独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12经取代的烷基或C1～C12经取代的环烷基；
X4′和X5′独立地包括氢、C1～C12烷基、C1～C12环烷基、C1～C12酰基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C1～C12经取代的烷基、C1～C12经取代的环烷基、C1～C12经取代的酰基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
或者X4′和X5′合并后为C1～C12烷二基、C1～C12烷氧二基、C1～C12烷氨二基或这些基团中任一种的经取代形式；
y＝0～150且为整数；
R5为氢、卤素、羟基、C1～C24烷基、C1～C24经取代的烷基、C6～C24芳基、C6～C24芳烷基、C6～C24经取代的芳基或C6～C24经取代的芳烷基；
当R3和R4不同时，R3和R4在所述二嵌段共聚物内的顺序没有限定。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二嵌段共聚物为pH敏感性材料，所述二嵌段共聚物在水中的pKa为6.0～8.0。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述二嵌段共聚物以二嵌段共聚物纳米粒混悬液的形式给药；所述二嵌段共聚物形成的纳米粒在低于pKa的pH值下解离。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述二嵌段共聚物纳米粒混悬液包括二嵌段共聚物纳米粒PBS溶液或二嵌段共聚物纳米粒生理盐水溶液；所述二嵌段共聚物纳米粒混悬液的浓度为0.01μM～10mM。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述给药的途径包括静脉注射、静脉用药、口服给药、舌下给药、腹腔给药、皮下给药、眼内给药、滴眼、滴鼻或喷雾给药。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述给药的剂量为0.1～1000mg/kg。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗病毒药物中的病毒包括疱疹病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、痘病毒科或逆转录病毒科。
8.一种用于治疗病毒感染的药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述具有式I所示结构的二嵌段共聚物或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括抗病毒药物或免疫增强药物。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于局部抗病毒治疗或全身病毒感染引起的局部病变。
11.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于人体抗病毒感染或动物抗病毒感染。
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