CN105899238B - 通过调节微RNAmiR-130a、miR-130b、miR-204或miR-1236治疗肝炎病毒感染 - Google Patents
通过调节微RNAmiR-130a、miR-130b、miR-204或miR-1236治疗肝炎病毒感染 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105899238B CN105899238B CN201480051381.4A CN201480051381A CN105899238B CN 105899238 B CN105899238 B CN 105899238B CN 201480051381 A CN201480051381 A CN 201480051381A CN 105899238 B CN105899238 B CN 105899238B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- hbv
- rna
- ppar
- pgc1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
Abstract
本发明涉及用于调节肝炎病毒复制的方法和医药组合物,其涉及miR‑130a RNA、miR‑130b RNA、miR‑204 RNA、miR‑1236 RNA或其组合。
Description
相关申请
本申请案依据35U.S.C.§119(e)要求2013年9月20日提出的美国临时专利申请案第 61/880,508号的优先权,所述临时专利申请案以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
微RNA(miRNA)在分化和发育中起着重要的调节作用(阿姆博斯,遗传学与发育新见21:511-517(2011)(Ambros,V.Curr Opin Genet Dev 21:511-517(2011)))。细胞微RNA可以正面或负面方式影响病毒复制(斯卡斯基等人,微生物学年评64:123-141(2010)(Skalsky,et al.Annu Rev Microbiol 64:123-141(2010));乔普林等人,科学309:1577-1581 (2005)(Jopling,et al.Science 309:1577-1581(2005)))。
迄今,完全根除慢性B型肝炎患者的B型肝炎病毒(HBV)仍然是一项挑战。HBV 慢性感染导致肝细胞癌(HCC)的发展。已经报导了许多HCC相关微RNA(刘等人,生物化学与生物物理学报1809:678-685(2011)(Liu,et al.Biochimica et biophysica acta 1809:678-685(2011)));但是,HBV相关微RNA领域仍然有待探索和阐明。亲肝性HBV 存在于葡萄糖和脂质代谢作用活跃的肝中。肝富含的转录因子和共活化剂包括HNF1、 HNF4、C/EBPα、PPARα和PGC1α在内對HBV增强子/启动子的作用已经研究多時(奎斯多夫等人,17:527-536(2010)(Quasdorff,et al.17:527-536(2010));巴-伊萨等人,肝国际31:282-290(2011)(Bar-Yishay,et al.Liver International 31:282-290(2011)))。尤其关注 PGC1α,已知其能共活化许多搭配物(弗因克等人,临床调查杂志116:615-622(2006) (Finck,et al.TheJournal of Clinical Investigation 116:615-622(2006)))。除肝葡糖新生外 (尹等人,自然413:131-138(2001)(Yoon,et al.Nature 413:131-138(2001))),已知PGC1α参与棕色脂肪适应性产热(普索维等人,细胞92:829-839(1998)(Puigserver,et al.Cell 92:829-839(1998)))、线粒体生体合成和呼吸作用(霍腾等人,细胞119:5-7(2004)(Houten, etal.Cell 119:5-7(2004)))和神经变性病(圣-皮尔等人,细胞127:397-408(2006) (St-Pierre,et al.,Cell 127:397-408(2006)))。PGC1α可活化肝细胞中HBV转录和复制(休罗麦等人,美国国家科学院院刊103:16003-16008(2006)(Shlomai,et al.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 103:16003-16008(2006));和奥曲克等人,病毒学杂志83:12535-12544(2009)(Ondracek,etal.Journal of Virology 83:12535-12544(2009)))。
近来,微RNA已经显现为代谢的一种重要转录后调节因子(罗替尔等人,自然评论:分子细胞生物学13:239-250(2012)(Rottiers,et al.Nat Rev Mol Cell Biol 13:239-250 (2012)))。仍然要研究代谢相关的微RNA是否可对肝炎病毒复制起作用,并且肝炎病毒感染是否可经由微RNA对肝代谢起作用。
发明内容
本公开是基于四种细胞微RNA,即miR-130a、miR-130b、miR-204和miR-1236展示抗HBV活性的意外发现。更具体来说,miR-1236直接靶向HBV特异性RNA,从而遏制翻译;miR-130a减少HBV RNA转录和DNA复制;并且miR-204通过干扰衣壳装配和前基因组RNA(pgRNA)衣壳化而减少HBV复制。
因此,本公开的一个方面涉及一种调节肝炎病毒(例如B型肝炎病毒)复制的方法,其包含使肝细胞与有效量的(a)miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA、miR-1236 RNA或其组合接触的至少一个步骤。肝炎病毒可为B型肝炎病毒(HBV)。
在一些实施例中,所述方法包含使肝细胞与有效抑制HBV复制的量的miR-130aRNA、miR-130b RNA、miR-204RNA、miR-1236RNA或其组合接触。在一些实例中,所有四种微RNA分子之组合用于此方法。
在一些实施例中,miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA和/或miR-1236 RNA为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。
在一些实例中,miR-130a RNA、miR-130b RNA或两者可包含AGUGCAA的核苷酸序列(例如对于miR-130a RNA,为CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID NO:1)),和/或对于miR-130b RNA,为CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU(SEQ ID NO:2));miR-204RNA可包含UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列;和/或miR-1236RNA可包含CCUCUUCCCCUUGUCUCUCCAG(SEQ ID NO:4) 的核苷酸序列。
在一些实施例中,接触步骤通过向有需要的个体(例如人类个体,例如罹患或怀疑患有HBV感染的人类患者)投与有效量的可为裸露核酸或由质粒编码的miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA、miR-1236RNA或其组合进行。举例来说,个体可投与如本文所述的miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA和miR-1236RNA的组合。在一些实例中,个体投与有效调节PGC1α、PGC1β、PPARγ或其组合的量的miR-130a RNA、miR-130b RNA或其组合。在其它实例中,个体投与有效降低编码HBV的RNA 水平的量的miR-1236RNA。在又其它实例中,个体投与有效抑制HBV前基因组RNA 衣壳化、衣壳装配或两者的量的miR-204RNA。
本文所述之任一微RNA分子可与另一抗HBV药剂共用。
以下也在本公开的范围内:(a)用于调节肝炎病毒复制(例如抑制或增强HBV复制)或用于治疗肝炎病毒感染(例如HBV感染)的医药组合物,所述组合物包含医药学上可接受的载剂和一或多种如本文所述的miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA、 miR-1236RNA;以及(b)任一本文所述的医药组合物或微RNA分子的用途,其用于制造供治疗例如HBV感染等肝炎病毒感染的药剂。任选地,医药组合物可进一步包含另一抗肝炎病毒剂,例如抗HBV剂。
在下文描述中阐述本发明的一或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点自以下图式和若干实施例的详细描述以及所附权利要求书将显而易见。
附图说明
图1为展示人类miR-130a、miR-204和miR-1236各减弱HBV复制和基因表达的图。miR-130a、miR-204和miR-1236的表达水平在稳定产生HBV的细胞系中始终显著减少。 (A)产生感染性HBV的大鼠肝瘤细胞系Qs2、Qs4、Qs5和Qs21。Q7neo为经载体转染的对照细胞系。(B)产生感染性HBV的人类肝瘤细胞系UP7-4和UP7-7。HepG2neo为经载体转染的对照细胞系。*p<0.05。(C)使用DNA印迹分析,通过HBV ayw基因组二聚体质粒与各种miRNA表达载体的共转染(coTf),HepG2细胞中胞内HBV复制减少。此处使用的探针为含有HBV核心基因的2.8kb HBV特异性DNA片段。包括作为阴性对照的空白载体DNA和miR-31。HBV复制中间物∶RC松弛环,DL双股线性、SS单股病毒DNA。(D)通过与miR130a共转染和RNA印迹分析来检测,HBV前核和前基因组RNA(3.5Kb)和包膜特异性mRNA(2.4/2.1Kb)的减少。(E)HBV核心蛋白(HBc)的减少通过与miR-130a和miR-1236共转染,经由蛋白质印迹分析来检测。(F)为展示如通过ELISA测定,HBV DNA与人类miR-130a共转染减少HepG2培养基中HBsAg和HBeAg 分泌的图表。在与HBV DNA和miR-31共转染的细胞中观测到HBsAg和HBeAg分泌未减少。(*P<0.05)。
图2为展示miR-1236直接靶向HBV特异性RNA的图。(A)上图∶通过不同电脑演算法预测在HBV ayw基因组上潜在的微RNA标靶位点。下图∶Huh7细胞与含有HBV nt 1521-2122和各种miRNA表达载体(材料与方法)的荧光素酶报导质粒共转染。仅仅 miR-1236显示荧光素酶活性显著减少(*p<0.05)。(B)通过补偿性突变诱发,展示miR-1236 直接靶向HBV基因组。上图∶野生型与突变miR-1236(分别SEQ ID NO:4和6)的序列比对,其中推定标靶位点在野生型或突变HBV基因组(nt 1724-1755;分别SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:7)上。突变位点带下划线。下图∶Huh7细胞与野生型或突变pGL3-HBV 3′UTR(nt 1521-2122)报导体和野生型或突变miR-1236表现载体共转染。当突变 miR-1236与突变报导体匹配时减少的荧火虫荧光素酶活性可恢复(*p<0.05)。(C)3′UTR 报导体分析中三种推定抗HBV miRNA对HBVDNA、RNA、蛋白质和荧光素酶活性的水平的差异作用的概述。
图3为展示miR-130a通过靶向肝细胞中的两种主要代谢调节因子-PGC1α和PPARγ,减弱HBV DNA复制和蛋白质表达的图。(A)上图∶miR-130a海绵质粒的草图。下图∶通过茎环qPCR测量通过海绵处理的内源性miR-130a的减少。(B)上图:通过共转染的海绵来刺激HBV DNA复制以用HBV特异性探针进行DNA印迹。(C)HBV DNA复制通过可拮抗内源性miR-130a的LNA-miR-130a处理来增强。HepG2细胞与HBV DNA 和LNA-miR-130a或加扰对照在指示浓度下共转染。(D)为展示HepG2细胞中内源性 hsa-miR-130a在不同剂量LNA-miR-130a下的相对表达的图表,所述表达通过茎环实时 PCR测量。U6snRNA用作内部对照。(*p<0.05)。(E)为通过ELISA,展示HBV DNA 与LNA-miR-130a拮抗miR以剂量依赖性方式增强HepG2细胞中HBsAg和HBeAg分泌的图。(*p<0.05)。(F)为通过蛋白质印迹分析,使用抗HBc抗体,展示HBV DNA与 LNA-miR-130a拮抗miR共转染以剂量依赖性方式增加HepG2细胞中HBc蛋白质水平的图。(G)此图假设宿主因子miR-130a和HBV之间两种可能的三元关系。(H)MiR-130a,而非miR-204,可以减少Huh7细胞中HBV强化子II的活性。含HBV强化子II的报导体(pGL3/enhII)与各种miRNA表达载体或载体对照(材料与方法)共转染。pGL3/enhII(-) 为在反义取向上携带HBV强化子II的阴性对照。*p<0.05。(I)在用稳定转染miR-130a 表达载体的HepG2细胞系中,通过RNA印迹分析,检测miR-130a前驱物和其成熟形式的表达。(J)通过RNA印迹分析测量稳定表达miR-130a的细胞系中PGC1α和PPARγ mRNA的同时减少。(K)蛋白质印迹分析检测稳定表达miR-130a的细胞中PGC1α和 PPARγ蛋白质的减少。(L)为如通过RT-qPCR分析测量,展示稳定表达miR-130a的HepG2 细胞系中PGC1α和PPARγmRNA减少的图(上图)。通过蛋白质印迹分析,SP1、PPARα、 CEBPb和HNF4的蛋白质水平无明显差异(下图)。(M)分别通过实时RT-qPCR(L,上图) 和蛋白质印迹分析(L,下图),LNA-miR-130a处理增加PGC1αmRNA和蛋白质。(N)为展示在PGC1α(NM_013261)和PPARγ(NM_005037)的3′UTR而非SP1(NM_003109)的 3′UTR的报导体共转染分析中MiR-130a显著降低荧光素酶活性的图。(O)通过补偿性突变诱发,MiR-130a展示直接靶向PGC1α的3′UTR。(*p<0.05)。在序列比对中突变位点带下划线。SEQ ID NO:1、8、9和10分别从上到下发现。(P)为展示PGC1α3′UTR荧光素酶报导体与递增量的miR-130a共转染以剂量反应方式降低报导体活性的图(上图)。相反,用递增量的LNA-miR-130a质粒处理以剂量反应方式增加报导体活性(下图)。(Q)为展示在稳定表达miR-130a的细胞系中PGC1α以剂量依赖性方式拯救HBV DNA复制的 DNA印迹。(R)为展示在稳定表达miR-130a的细胞系中PGC1α以剂量依赖性方式拯救 HBV蛋白质复制的蛋白质印迹。(S)为展示通过siRNA处理消除内源性PGC1α抑制HBV DNA复制和蛋白质表达并且HepG2细胞与HBV ayw二聚体和siRNA-PGC1α或非标靶对照以递增浓度共转染的图。通过DNA印迹分析,顯示逐渐减少的HBV DNA复制。 (T)为使用抗HBc抗体的蛋白质印迹,展示HBc减少。在转染后48小时,收集培养基并且收获细胞进行总RNA和蛋白质提取。(U)为如通过ELISA证实,展示HBsAg和 HBeAg减少的图。(V)为展示siRNA处理对PGC1α功效的蛋白质印迹。(W)为通过实时 RT-qPCR,展示siRNA处理对PGC1α功效的图。(X)为展示如通过ELISA分析测定,用递增剂量的PGC1α表达载体DNA转染稳定表达miR-130a的HepG2细胞增加HBsAg分泌的图。(Y)Huh7细胞用HBV DNA转染并用PPARγ配体罗格列酮(Rosiglitazone)以递增浓度处理。HBV DNA复制以剂量依赖性方式增加(上图)。相反,当经HBV转染的 Huh7细胞用递增剂量的PPARγ拮抗剂GW9662处理时,其减少HBV DNA的复制(下图)。 (Z)为展示当经HBV转染的Huh7细胞用递增剂量的PPARγ拮抗剂GW9662处理时分泌的HBsAg和HBeAg逐渐减少的图。
图4展示HBV DNA与PGC1α和PPARγ表达载体二者共转染对HBV DNA复制产生高度有效的协同效应。(A)展示共表达PGC1α、PPARγ或两者的细胞中HBV DNA的水平的照片。(B)展示共表达PGC1α、PPARγ或两者的细胞中HBsAg和HBeAg水平的图。(C)图概括HBV、miR-130a和宿主因子PGC1α和PPARγ之间的关系。符号++表示协同效应。(D)展示HBV ayw二聚体与PGC1α和PPARγsiRNA组合的共转染对HBV DNA复制产生最有效抑制作用的照片。(E)展示如通过ELISA分析检测,HBV ayw二聚体与PGC1α和PPARγsiRNA组合的共转染对HBsAg和HBeAg的表达产生最有效抑制作用的图。
图5为展示miR-130a在肝细胞中在能量代谢中起调节作用的图。(A)此图强调葡萄糖代谢中的关键酶。通过RNA印迹分析,G6Pase和PEPCK的mRNA表达在稳定的表达miR-130a的HepG2细胞中减少。(B)通过蛋白质印迹分析也检测到PEPCK和G6Pase 的蛋白质表达减少。注意稳定表达miR-130a的HepG2细胞中葡糖激酶(GCK)的水平增加,并且稳定的表达miR-130a的Huh7细胞中丙酮酸激酶(PKLR)的水平增加。(C)和(D):通过RT-qPCR分析,稳定的表达miR-130a的细胞中PKLR和GCK特异性mRNA的水平增加。(E)通过蛋白质印迹分析,在产生HBV的HepG2细胞(UP7-4和UP7-7)中PGC1α和葡萄糖异生酶PEPCK和G6Pase的蛋白质表达增加。但是,注意到PPARγ无显著改变。(F)HepG2细胞中稳定表达PPARγ會减少葡萄糖输出,并且相反,PGC1α的表达刺激葡萄糖产生。但是,表达miR-130a的细胞与亲本细胞之间葡萄糖水平无显著差异。(G) 稳定HBV可复制HepG2處理PPARγ拮抗剂GW9662(20μM)可增加HepG2细胞中葡萄糖产生。(H)在两种稳定的表达PGC1α的细胞系中miR-130a的表达不受影响。(I)此图概括PGC1α、miR-130a和HBV之间的关系。+/-:既非正面也非阴性负面作用;(J)上图∶在表达PPARγ的HepG2细胞系中,使用茎环qPCR,观测到miR-130a的减少。U6 snRNA用作内部对照。罗格列酮而非GW9662进一步减少miR-130a的表达。下图∶通过蛋白质印迹,检测到稳定表达PPARγ的HepG2细胞系中PPARγ蛋白质的量增加。(K) 为展示用PPARγ与PGC1α的组合处理显示对miR-130a表达有协同效应的图。(L)此三元草图概括PPARγ、PGC1α、miR-130a和HBV之间的关系。HBV和PGC1α和PPARγ中前馈扩增回路可通过miR-130a中间物介导。(M)在HBV转基因小鼠的肝中通过蛋白质印迹,检测HBV DNA复制。各色带中的样品来自各个别小鼠。(N)通过茎环qPCR分析,与亲本对照小鼠相比,HBV转基因小鼠中miR-130a和miR-204的表达减少。(O) 通过葡萄糖测试,HBV转基因小鼠与亲本对照小鼠之间的葡萄糖水平无显著差异(材料与方法)。(*p<0.05,n.s=不显著)。(p)相对于野生型对照小鼠(天然),HBV转基因小鼠显示NF-κB/p65的表达减少并且HBV核心蛋白PGC1α、PEPCK、G6Pase、PPARγ的表达增加。
图6为展示miR-204干扰HBV RNA衣壳化和衣壳装配的图。(A)图2C中的概述暗示miR-204可干扰HBV衣壳装配或反转录。(B)上图∶在与HBV DNA和miR-204表达载体共转染的HepG2细胞中,通过天然琼脂糖凝胶电泳26,检测胞内HBV衣壳粒子的减少,中图:如通过变性SDS-PAGE和蛋白质印迹分析进行分析,衣壳粒子的减少不归因于HBc蛋白质的减少。下图∶微管蛋白充当内部对照。(C)有或无miR-204共转染的 HBV聚合酶突变体Y63D的核心粒子相关RNA(宁等人公共科学图书馆·病原体7, el002255;2011(Ning et al.PLoS pathogens7,el002255;2011))通过核糖核酸酶保护分析(RPA)进行分析(材料与方法)。与miR-204共转染减少HepG2和Huh7细胞中衣壳化HBV RNA的水平。经保护的HBV RNA片段作为330nt物质迁移。
图7展示miR-130a表达的调节。(A)为展示在处于转录起始位点上游(+1)的推定的hsa-miR-130a启动子元件中转录因子的若干潜在结合位点的示意图∶处于-693位置的推定的NF-κB/p65结合位点如先前报导(周等人2010a(Zhou et al.2010a)),并且针对Egr-1 和CREB的处于-625和-421的位点使用在线软件Promo和TRANSFAC(魏叶特等人2000(Wingender et al.2000);麦斯古等人2002(Messeguer et al.2002))预测。(B)展示通过缺失定位和报导体分析,分析miR-130a启动子。HuH-7细胞经含有序列缺失的hsa-miR-130a启动子的各种荧光素酶报导构筑体转染。NF-κB/p65结合位点的缺失显著降低报导体活性。(C)上图:NF-κB/p65与p50可分别刺激miR-130a启动子活性达大约60倍和10倍。 HuH-7细胞与pCMV-小鼠NF-κB/p65或p50的表达载体和由hsa-miR-130a启动子驱动的荧光素酶报导体共转染。下图∶通过使用大鼠pCMV-flag-NF-κB/p65,获得对miR-130a 启动子的30倍刺激作用。与大鼠IκB表达载体共转染抑制荧光素酶活性达约4倍。各转染的相对荧光素酶值用共转染的海肾表达校正。(D)相反,通过茎环PCR分析,通过用siRNA转染阻断内源性NF-κB/p65基因表现减少miR-130a的表达。(E)左图∶通过蛋白质印迹分析,稳定表达PPARγHepG2细胞系显示磷酸化和总NF-κB/p65蛋白质水平降低。右图∶相比之下,miR-130a稳定表达细胞系显示磷酸化和总NF-κB/p65蛋白质的水平增加。(F)通过qPCR,在稳定表达PPARγ的HepG2细胞中NF-κB/p65的相对mRNA 水平不受影响。(G)通过蛋白质印迹分析,在稳定产生HBV的大鼠(左图)或人类(右图) 肝瘤细胞中观测到磷酸化和总NF-κB/p65蛋白质的减少。(H)通过茎环PCR(左图),通过 siRNA处理阻断稳定的产生HBV的人类肝瘤细胞UP7-4和UP7-7中内源性PPARγ的基因表现增加miR-130a的表达,并且通过蛋白质印迹分析(右图),增加NF-κB蛋白质产生。(I)为概述两种正前馈回路的整合的示意性说明。通过NF-κB/p65介导的发炎回路可减弱涉及miR-130a、PGC1α和PPARγ的病毒复制回路。
图8为HBV与miR-130a、NF-κB、PGC1α和PPARγ之间的病毒-宿主相互作用的图。(A)肝发炎可促进病毒清除(左图),因为当NF-κB和miR-130a升高时,PGC1α、PPARγ和HBV复制减少。相比之下,当肝无发炎(右图)时,NF-κB与miR-130a的水平低,并且PGC1α和PPARγ的水平更高,使得病毒复制更活跃。
图9包括展示miR-1236、miR-204和miR-130a的寡核苷酸模拟物的组合抑制HBV 复制和基因表达的图。通过DNA印迹分析(A),HepG2细胞与HBV DNA和模拟 miR-1236、miR-204和miR-130a的寡核苷酸的共转染使得病毒DNA复制水平较低,并且通过ELISA(B),HBsAg和HBeAg减少。*p<0.05。
图10为展示感染HCV的Huh7和Huh7.5细胞中miR-130a表达型态的时程的图。 (A、C)通过蛋白质印迹分析,使用抗HCV NS3和抗HCV核心抗体,Huh7(A)和Huh7.5 (C)(MOI=1)用HCV-2a J6/JFH1体外感染。(B、D)通过茎环qPCR,在感染HCV的Huh7 (B)和Huh7.5细胞(D)中,测量内源性miR-130a的表达。(P<0.05*)
具体实施方式
本公开是基于包括miR-130a、miR-130b、miR-204和miR-1236在内的展示抗HBV 活性的许多细胞微RNA的意外鉴别。更具体来说,miR-1236直接靶向HBV特异性RNA,从而遏制翻译;miR-130a减少HBV RNA转录和DNA复制;并且miR-204通过干扰衣壳装配和前基因组RNA(pgRNA)衣壳化而减少HBV复制。此外,发现miR-130a为潜在的HCV复制调节因子。
因此,调节miR-130a、miR-130b、miR-204和miR-1236中的一或多者将有效治疗感染性疾病(例如由例如HBV、HCV或HDV等肝炎病毒引起的感染)。调节微RNA意谓在微RNA的标靶基因表达中影响微RNA的生物功能的任何方法。在一些实例中,调节微RNA为调节微RNA的细胞水平。在其它实例中,调节微RNA为调节(例如阻断或增强)其与微RNA标靶(例如mRNA或基因)的相互作用。
因此,本文描述了用于使用miR-130a RNA、miR-130b RNA(其含有与miR-130a相同的AGUGCAA序列用于与标靶基因进行碱基配对)、miR-204RNA和miR-1236RNA 与肝炎病毒(例如HBV、HCV或HDV)复制相关联和/或治疗其感染的方法;以及用于治疗本文所述的感染性疾病(例如HBV感染)和用于制造用于达成那些目的的药剂的医药组合物。
微RNA分子
微RNA为在许多物种中发现的小的非编码RNA分子(例如22个核苷酸),其调节基因表达。miR-130a、miR-130b、miR-204和miR-1236为存在于许多物种,例如人类中众所周知的微RNA。这些微RNA(前驱物和成熟)的实例的核苷酸序列提供于MiRBase 的寄存编号MI0000448(人类miR-130a)、MI0000748(人类miR-130b)、MI0000284(人类miR-204)和MI0006326(人类miR-1236)。这些miRNA分子的示例性核苷酸序列提供于下文中∶
人类miR-130a:
人类miR-130b:
人类miR-204:
人类MiR-1236:
如本文所述的miR-130a RNA为具有与野生型miR-130a,例如人类miR-130a相同的生物活性,例如调节PGC1α、PGC1β和/或PPARγ的表达的核酸(例如RNA分子)。此类RNA分子可包含miR-130a的核苷酸序列或其一部分(例如AGUGCAA或 CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQID NO:1))。miR-130a RNA可包括至多150个 (例如100、80、60、50、40、30个或更少个)核苷酸残基。在一些实例中,miR-130a可为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。在其它实例中,其可为发夹分子,所述发夹分子可包括21-23有义序列(例如CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ IDNO:1))、短连接子、与有义序列互补的反义序列和polyT尾。
如本文所述的miR-130b RNA为具有与野生型miR-130b,例如人类miR-130b相同的生物活性的核酸,例如RNA分子。因为miR-130b与miR-130a共享相同的序列用于与标靶基因进行碱基配对,所以miR-130b将具有与miR-130a相同的生物功能,例如调节PGC1α、PGC1β和/或PPARγ的表达。此类RNA分子可包含miR-130b的核苷酸序列或其一部分(例如AGUGCAA或CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU(SEQ ID NO:2))。 miR-130b RNA可包括至多150个(例如100、80、60、50、40、30个或更少个)核苷酸残基。在一些实例中,miR-130b RNA可为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。在其它实例中,其可为发夹分子,所述发夹分子可包括21-23有义序列(例如 CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU(SEQ ID NO:2))、短连接子、与有义序列互补的反义序列和polyT尾。
如本文所述的miR-204RNA为具有与野生型miR-204,例如人类miR-204相同的生物活性,例如干扰衣壳装配和前基因组RNA(pgRNA)衣壳化的核酸,例如RNA分子。此类RNA分子可包含miR-204的核苷酸序列或其一部分(例如 UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(SEQ ID NO:3))。miR-204RNA可包括至多150个(例如100、80、60、50、40、30个或更少个)核苷酸残基。在一些实例中,miR-204RNA 可为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。在其它实例中,其可为发夹分子,所述发夹分子可包括21-23有义序列(例如UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(SEQ ID NO:3))、短连接子、与有义序列互补的反义序列和polyT尾。
如本文所述的miR-1236RNA为具有与野生型miR-1236,例如人类miR-1236相同的生物活性,例如直接靶向HBV特异性RNA,从而遏制翻译的核酸,例如RNA分子。此类RNA分子可包含miR-1236的核苷酸序列或其一部分(例如 CCUCUUCCCCUUGUCUCUCCAG(SEQ ID NO:4))。miR-1236RNA可包括至多150个 (例如100、80、60、50、40、30个或更少个)核苷酸残基。在一些实例中,miR-1236RNA 可为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。在其它实例中,其可为发夹分子,所述发夹分子可包括21-23有义序列(例如CCUCUUCCCCUUGUCUCUCCAG(SEQ ID NO:4))、短连接子、与有义序列互补的反义序列和polyT尾。
必要时,微RNA分子可包括非天然存在的核碱基、糖或共价核苷间键(主链)。此类经修饰的寡核苷酸赋予所希望的特性,例如增强的细胞吸收、提高的对标靶核酸的亲和力和增加的体内稳定性。
在一个实例中,本文所述的寡核苷酸/RNA分子具有经修饰的主链,包括保留磷原子的主链(参见例如美国专利第3,687,808号;第4,469,863号;第5,321,131号;第5,399,676 号;和第5,625,050号)和不具有磷原子的主链(参见例如美国专利第5,034,506号、第5,166,315号和第5,792,608号)。含磷的经修饰的主链的实例包括(但不限于)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和具有3′-5′键或2′-5′键的硼烷磷酸酯。此类主链还包括具有反向极性的主链,即3′至3′、5′至5′或2′至2′键。不包括磷原子的经修饰的主链通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成。此类主链包括具有吗啉基键(部分由核苷的糖部分形成)的主链;硅氧烷主链;硫醚、亚砜和砜主链;甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链;亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链;核糖乙酰基主链;含有烯烃的主链;氨基磺酸酯主链;亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链;磺酸酯和磺酰胺主链;酰胺主链;以及其它具有混合N、O、S和 CH2组成部分的主链。
在另一个实例中,本文所述的微RNA分子包括一或多个经取代的糖部分。此类经取代的糖部分可在其2′位包括以下基团之一∶OH;F;O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基;O-炔基、S-炔基、N-炔基和O-烷基-O-烷基。在此等基团中,烷基、烯基和炔基可为经取代或未经取代的C1到C10烷基或C2到C10烯基和炔基。其还可以在其2′位包括杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷基氨基、经取代的硅烷基、 RNA裂解基团、报导基团、嵌入剂、用于提高寡核苷酸的药物动力学特性的基团或用于提高寡核苷酸的药效学特性的基团。优选的经取代的糖部分包括具有2′-甲氧基乙氧基、 2′-二甲基氨基氧基乙氧基和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基的那些糖部分。参见马丁等人, 瑞士化学学报,1995,78,486-504(Martinet al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504)。
在又一实例中,本文所述的微RNA分子包括一或多个经修饰的天然核碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。经修饰的核碱基包括以下中所述的核碱基:美国专利第3,687,808号;高分子科学与工程科学的简明百科全书,第858-859页,克罗维兹编辑,约翰·威利父子公司,1990(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990);英格利希等人, 应用化学国际版,1991,30,613(Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition, 1991,30,613);和桑维,第15章,反义研究和应用,第289-302页,CRC出版社,1993 (Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289-302,CRC Press,1993)。这些核碱基中的某些尤其适用于增加微RNA分子对其靶向位点的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(例如2-氨基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。参见桑维等人编,反义研究和应用, CRC出版社,波卡拉顿,1993,第276-278页)。
任一本文所述的微RNA可通过常规方法,例如化学合成或体外转录制备。如本文所述的其所期望生物活性可通过常规方法,例如以下实例中所述的方法检验。
医学治疗
单独或组合的miR-130a、miR-130b、miR-204和miR-1236RNA可用于调节(例如抑制)肝炎病毒复制(例如体内或体外)或治疗肝炎病毒感染,包括HBV、HCV或HDV的复制/感染。
如本文所用,术语“治疗”是指向具有肝炎病毒感染(例如HBV感染)、怀疑患有此类感染或处于感染风险下的个体施用或投与包括一或多种活性剂的组合物以治愈、医治、缓解、解除、改变、补救、减轻、改善或影响感染、感染症状或患有感染的倾向性。
为进行本文所述的治疗,一或多种如本文所述的微RNA分子可经由适合的途径投与需要治疗的个体。一或多种微RNA分子可直接或间接(例如经由一或多种适于表达微 RNA分子的表达载体或经由裸RNA分子)投与需要治疗的个体。此类表达载体可通过将微RNA的一或多种核苷酸序列插入适合的表达载体中来构筑,在表达载体中微RNA序列与适合的启动子可操作连接。
miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA和miR-1236RNA中的一或多者或适合于表达其的一或多种表达载体可与医药学上可接受的载剂混合以形成医药组合物。“可接受的载剂”为与组合物的活性成分相容(并且优选使活性成分稳定)并且对待治疗的个体无害的载剂。适合的载剂包括(但不限于)(a)用阳离子(例如钠、钾、铵、镁、钙)和多元胺(例如精胺和亚精胺)形成的盐;(b)用无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸)形成的酸加成盐;(c)用有机酸(例如乙酸、乙二酸、酒石酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、棕榈酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸)形成的盐;以及(d) 由元素阴离子(例如氯、溴和碘)形成的盐。其它适合的载剂包括微晶纤维素、甘露糖醇、葡萄糖、脱脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉和其组合。参见例如雷明顿的药物科学,第 18版,马克出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚州(1995)(Remington′s Pharmaceutical Sciences,Edition 18,Mack Publishing Co.,Easton,Pa(1995));以及古德曼和吉尔曼的“治疗学的药理学基础”,第十版,吉尔曼、哈得曼和利姆伯德编,麦格劳-希尔出版社, 155-173,2001(Goodman and Gilman′s“ThePharmacological Basis of Therapeutics”,Tenth Edition,Gilman,J.Hardman andL.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press,155-173,2001)。
为促进传递,微RNA分子或其表达载体可与伴侣试剂偶联。如本文所用,“偶联”意谓两种实体相关联,优选亲和力足够实现两种实体之间的关联的治疗效益。偶联包括共价或非共价键结以及关联的其它形式,例如一个实体陷于另一实体上或内,或任一或两个实体陷在第三个实体(例如胶束)上或内。
伴侣试剂可为天然存在的物质,例如蛋白质(例如人类血清白蛋白、低密度脂蛋白或球蛋白)、碳水化合物(例如聚葡萄糖、普鲁兰、甲壳素、聚葡萄胺糖、菊塘、环糊精或玻尿酸)或脂质。其也可以为重组或合成分子,例如合成聚合物,例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-顺丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物和聚磷嗪。
在一个实例中,伴侣试剂为胶束、脂质粒、纳米粒子或微球体,其中囊封微RNA 分子或表达载体。用于制备此类胶束、脂质粒、纳米粒子或微球体的方法是本领域中众所周知的。参见例如美国专利第5,108,921号、第5,354,844号、第5,416,016号和第 5,527,5285号。
在另一个实例中,伴侣试剂充当附接融合剂或缩合剂中一或多者的基质。
融合剂对局部pH值起反应。举例来说,在遇到内体内的pH值时,其可引起其紧靠环境的物理改变,例如渗透特性改变,此破坏或增加内体膜渗透性,从而促进本文所述的微RNA释放到宿主细胞的细胞质中。一种优选的融合剂改变电荷,例如在低于生理范围的pH值下(例如在pH 4.5-6.5下)变得质子化。融合剂可为含有能够在暴露于特定 pH值范围时改变电荷(例如质子化)的氨基的分子。此类融合剂包括具有聚氨基链的聚合物(例如聚乙二亚胺)和膜分裂剂(例如蜂毒素)。其它实例包括聚组氨酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亚胺和聚缩醛物质(例如阳离子聚缩醛)。
缩合剂与微RNA或表达载体相互作用,使其缩合(例如减少寡核苷酸尺寸),因此保护其避免降解。优选地,缩合剂包括经由例如离子相互作用与寡核苷酸相互作用的部分(例如带电部分)。缩合剂的实例包括聚赖氨酸、精胺、亚精胺、多元胺或其季盐、伪肽- 多元胺、肽模拟多元胺、树枝状聚合物多元胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉和α螺旋肽。
在一些实施例中,有效量的miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA、miR-1236RNA或其组合经由适合的途径投与罹患、怀疑患有肝炎病毒感染(例如HBV感染)或处于其风险下的个体(例如人类患者)。在其它实施例中,有效量的一或多种用于产生一或多种微RNA分子的表达载体投与此类个体。当使用miR-130a、miR-130b或两者时,此分子或其表达载体的量可有效调节PGC1α、PGC1β、PPARγ或所有三者。当使用miR-204 时,此分子或其表达载体的量可有效调节(例如抑制)HBV前基因组衣壳化、衣壳装配或两者。当使用miR-1236时,此分子或其表达载体的量可有效降低编码HBV的RNA的水平。
任一微RNA分子或其组合可用于体外分析以例如通过接触有效量的一或多种微RNA分子或一或其表达载体,调节(例如抑制)HBV病毒复制,其中肝细胞感染肝炎病毒(例如HBV)。
如本文所用,“有效量”是指单独或与其它剂量或一或多种其它活性剂一起的微RNA 分子或其表达载体产生所需反应,例如抑制HBV复制、干扰HBV前基因组RNA衣壳化和/或衣壳装配和/或降低编码HBV的RNA的水平的量。在治疗HBV感染的情况下,所需反应可抑制疾病的进展。此可包括仅仅暂时减缓疾病的进展,不过更优选地,其包括永久中断疾病的进展。此可通过常规方法,例如体检和适合的实验室测试监测。对 HBV感染治疗的所需反应也可为延迟疾病发作或甚至阻止疾病发作。
如本领域的技术人员所认知,有效量可变化,取决于以下:所治疗的具体病状、病状严重程度、个别患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重)、治疗持续时间、并行疗法(如果存在)的性质、特定投药途径以及健康从业者的知识和专长范围内的类似因素。这些因素为本领域普通技术人员众所周知并且可仅用常规实验便可解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量,即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而本领域普通技术人员应了解,患者因医学原因、心理原因或实际上任何其它原因可坚持较低剂量或可耐受剂量。
本领域中众所周知动物与人类之间的剂量的相互关系(例如基于每平方米身体表面的毫克数或每一体重的毫克数)。参见例如弗赖雷克等人(1966)癌症化学治疗报告50:219(Freireich et al(1966)Cancer Chemother Rep 50:219)。体表面可大致地从患者的身高和体重确定。
需要上述治疗的个体可为罹患、怀疑患有肝炎病毒感染(例如HBV感染)或处于发展其风险下的个体(例如人类)。此类个体可经由常规医疗程序,包括(但不限于)体检和病理分析来鉴别。怀疑患有感染的个体可展示感染的一或多种症状。举例来说,HBV感染的常见症状包括(但不限于)发热、疲乏、肌肉或关节疼痛、食欲不振、轻度恶心和/或呕吐。处于发展肝炎病毒感染(例如HBV感染)的个体具有一或多种与感染关联的风险因子。
医学领域普通技术人员已知的常规方法可用于向需要治疗的个体投与上述医药组合物。举例来说,上述医药组合物可经口或不经肠传递。不经肠投与包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注;或颅内投与(例如鞘内或脑室内)。
含有本文所述的微RNA分子或其表达载体的可注射组合物可含有各种载剂,例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、十四烷酸异丙酯、乙醇和多元醇(丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射来说,可通过滴注方法投与寡核苷酸,由此输注含有寡核苷酸和生理学上可接受的赋形剂的医药调配物。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5%右旋糖、0.9%生理盐水、林格氏溶液或其它适合赋形剂。肌肉内制剂,例如肽的适合可溶性盐形式的无菌调配物,可在例如无菌水、0.9%生理食盐水或5%葡萄糖溶液等医药赋形剂中溶解并且投与。
当经口投与时,优选地,寡核苷酸包括至少一种2′-O-甲氧基乙基修饰。用于经口投与的组合物可为任何口服可接受的剂型,包括(但不限于)胶囊、锭剂、乳液和水性悬浮液、分散液和溶液。在口服使用的片剂的情况下,常用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加如硬脂酸镁等润滑剂。对以胶囊形式经口投与来说,适用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当水性悬浮液或乳液经口投与时,活性成分可悬浮或溶解于与乳化剂或悬浮剂组合的油相中。必要时,可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。经鼻气溶胶或吸入组合物可根据医药调配领域中众所周知的技术来制备。本文所述的医药组合物也可呈用于直肠投药的栓剂形式投与。
任一微RNA分子可与例如抗HBV剂等另一抗感染剂共用。抗HBV剂包括(但不限于)干扰素(干扰素α-2b和聚乙二醇化干扰素α-2a)和核苷逆转录酶抑制剂(NRTI),例如阿德福韦(adefovir)、因提弗(entecavir)、拉米夫定(lamivudine)、替比夫定(telbivudine)和替诺福韦(tenofovir)。
术语“共投与”意谓是指通过任何投与途径的其中两种或两种以上药剂投与患者或个体的组合疗法。药剂共投与也可被称作组合疗法或组合治疗。药剂可在相同给药调配物或分开调配物中。对于使用一种以上活性剂的组合治疗,在活性剂在分开给药调配物中的情况下,活性剂可并行投与或其各自可在分开交错的时间投与。药剂可同时或依序投与(例如一种药剂可在另一药剂投与后立即投与,或药剂可偶然给与,例如一种可在一个时间给与,接着稍后,例如在一周内给与另一种),只要其以足够允许两种药剂在体内实现有效浓度的方式给与即可。药剂还可以通过不同途径投与,例如一种试剂可经静脉内投与,而第二试剂经肌肉内或经口投与。因此,抗癌剂可在周围类鸦片拮抗剂投与之前、同时或之后投与。可共投与的药剂也可以调配为混合物,例如单一调配物或单一片剂中。这些调配物可为不经肠或口服,例如美国专利第6,277,384号、第6,261,599号、第5,958,452号和PCT公开案第WO98/25613号(每一者以引用的方式并入本文中)中描述的调配物。
试剂盒
本公开还提供了用于调节(例如抑制)肝炎病毒复制(例如HBV、HCV或HDV复制) 和治疗例如HBV感染等肝炎病毒感染的试剂盒。此类试剂盒可包括一或多个包含一或多种微RNA分子或其表达载体的容器。
在一些实施例中,试剂盒可包含根据本文所述方法中的任一者的使用说明书。所包括的说明书可包含投与微RNA或其表达载体以治疗所希望的目标疾病的描述。试剂盒可进一步包含基于鉴别个体是否具有目标感染,选择适合于治疗的个体的描述。
与如本文所述的微RNA的使用相关的说明书大体上包括关于所期望治疗的剂量、给药时程和投与途径的信息。容器可为单位剂量、散装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。虽然本发明试剂盒中供应的说明书通常为在标记或药品说明书(例如试剂盒中包括的纸片)上的书面说明书,但机器可读说明书(例如磁盘或光盘存储盘上载有的说明书)也是可接受的。
指示组合物用于抑制HBV、HCV或HDV复制的标记或药品说明书可提供用于实施任一本文所述的方法。
本发明的试剂盒呈适合包装形式。适合的包装包括(但不限于)小瓶、瓶子、罐、可挠性包装(例如密封聚酯薄膜或塑料袋)等等。还涵盖用于与特定装置(例如吸入器、经鼻投药装置(例如雾化器)或输注装置(例如小型泵))组合的包装。试剂盒可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为如本文所述的微RNA分子或其表达载体。
试剂盒可视情况提供额外组分(诸如缓冲剂)和说明性信息。通常,试剂盒包含容器和在容器上或与容器相联的标记或药品说明书。在一些实施例中,本发明提供了包含上述试剂盒的内含物的制品。
在不进一步详细描述的情况下,相信本领域的技术人员可基于以上描述,最大程度地利用本发明。因此,以下特定实施例仅视为说明性的,并且决不以任何方式限制本发明的其余部分。本文中引用的所有公开案以引用的方式并入以达成本文中提及的目的或主题。
实例1∶通过调节微RNA miR-130a、miR-130b、miR-204或miR-1236治疗肝炎病毒感染
材料与方法
miRNA质粒的构筑
如上所述,人类miRNA的序列从Ensembl数据库和miRbase(16版)检索得到。用于克隆全长前驱miRNA的引物序列在以下表1中列出∶
表1.用于本研究的合成寡核苷酸和PCR引物的DNA序列
其它地方详述构筑miRNA表达载体的方法。陈H.L.等人,公共科学图书馆·综合7,e34116(2012)(Chen,H.L.et al.PloS one 7,e34116(2012))。PCR产物通过Hind III消化从TA克隆载体(RBC)亚克隆到pSuper(奥利工程公司(OligoEngine,Inc))。所有质粒都通过测序证实。通过转染和茎环RT-PCR分析检测大约8-400倍更高的微RNA表达水平。 MiR-31用作阴性对照,因为其对HBV复制无作用(图1)。PPARγ和PGC1α表达载体来自复能基因(GeneCopoeia)。
抗体来源
抗HBc(达科公司(Dako))、抗PPARγ(圣克鲁兹(Santa Cruz))、抗GAPDH、抗PKLR、抗G6Pase、抗微管蛋白、抗PGC1α(傲锐基因(Origene))、抗PCK1(亚诺法(Abnova))、抗GCK(生物视野(Biovision)),二级抗体包括小鼠抗兔-HRP、山羊抗小鼠-HRP(台湾基因特斯(GeneTex,Taiwan))和驴抗山羊-HRP(圣克鲁兹)。
合成RNA
用于图8的合成miRNA(吉玛制药(Genepharma))为不具有修饰的RNA双螺旋。有义股与miRNA的成熟形式相同。模拟miR-130a(CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU (SEQ ID NO:1))、模拟miR-204(UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(SEQ ID NO:3))、模拟miR-1236(CCUCUUCCCCUUGUCUCUCCAG(SEQ ID NO:4))、模拟阴性对照 (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQID NO:75))。针对PGC1α的siRNA寡核苷酸来自法玛克恩(Dharmacon)。
MiR-130a海绵
每个有义和反义寡核苷酸(参见以上表1)经设计以含有miR-130a的合成标靶位点的四个拷贝。退火的寡聚产物在PCR扩增前进行凝胶纯化。凝胶纯化的PCR产物在Hind III位点亚克隆到DsRedCl载体中。群落通过PCR筛选并且通过测序证实插入物的取向和标靶位点的拷贝数。
细胞培养
人类肝瘤Huh7和HepG2细胞如以下先前所描述维持:蔡等人,病毒学杂志84,2340-2351(2010)(Chua,P.K.,et al.Journal of virology 84,2340-2351(2010));勒·伯盖姆等人,病毒学杂志79,1871-1887(2005)(Le Pogam,S.,et al.,Journal ofvirology 79, 1871-1887(2005))。一般来说,病毒复制的表现型和微RNA的作用在HepG2中比Huh7 细胞中更强。但是,Huh7细胞易于传代和转染。因此,可互换使用此两个细胞系。
PPARγ促效剂和拮抗剂
罗格列酮和GW9662来自西格马(Sigma)。HepG2和Huh7细胞在6孔组织培养盘中以5×10个细胞/孔接种(奎斯多夫等人,病毒性肝炎杂志17,527-536(2010)(Quasdorff,M. etal.Journal of viral hepatitis 17,527-536(2010)))。在转染24小时后,含罗格列酮或GW9662的0.1%DMSO添加到培养基。在采集前两天不时改变培养基。
测量葡萄糖产生
使用DRI-CHEM SLIDE GLU-PIII试剂盒(日本富士(FUJIFILM,JAPAN))测量HBV 转基因小鼠的葡萄糖含量。十微升小鼠血清沉积在富士DRI-CHEM SLIDE GLU-PIII上。葡萄糖氧化酶(GOD)催化样品葡萄糖氧化,产生过氧化氢,接着过氧化氢与染料前驱物反应并形成红色染料。光学反射密度在505nm下通过富士DRI-CHEM分析器测量并转化为葡萄糖浓度(mg/L)。为测量细胞培养物中的葡萄糖浓度,产生HBV的细胞(HepG2 和Q7细胞)用PPARγ拮抗剂GW9662在指示浓度下处理。在葡萄糖测量前二十四小时,培养基被1ml补充有2mM丙酮酸钠的无葡萄糖的DMEM替换。在培育16小时后,收集50μl培养基且使用葡萄糖比色分析(生物视野(Biovision))测量葡萄糖浓度(mM)。
定量实时PCR
简单来说,在37℃下2μg总RNA使用随机引物和高容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统(Applied Biosystem))逆转录成cDNA,历时120分钟。接着cDNA产物稀释 100倍,使用Power SYBR绿色PCR主混合物(应用生物系统)和默认条件,在20μl反应体积中通过应用生物系统7500实时PCR系统进行实时PCR分析。通过相对定量方法 (ΔΔCt方法)使用7500软件V2.0.1分析数据。
miRNA的茎环qCR
塔克曼(Taqman)RT和茎环实时分析来自应用生物系统公司∶miR-31(分析ID:002279)、miR-130a(分析ID∶000454)、miR-204(分析ID:000508)和miR-1236(分析ID:002752)。简单来说,100ng RNA通过特定茎环引物逆转录并且通过塔克曼实时PCR分析使用默认设置进一步分析。U6snRNA(分析ID∶001973)用作内部内参考物。数据通过应用生物系统公司7500软件V2.0.1分析。
DNA和RNA印迹
HBV核心粒子相关DNA、总细胞质RNA和微RNA通过如先前所描述的RNA印迹分析。蔡等人,病毒学杂志84,2340-2351(2010);勒·伯盖姆等人,病毒学杂志79, 1871-1887(2005)。
荧光素酶报导体分析
3′UTR或增强子/启动子的分析如先前所描述。陈H.L.等人,公共科学图书馆·综合7,e34116(2012)。
天然琼脂糖凝胶电泳和蛋白质印迹
如图5中所示的用于检测HBV核心粒子的天然琼脂糖凝胶电泳和蛋白质印迹如所描述。蔡等人,病毒学杂志84,2340-2351(2010)。
稳定的表达miR-130a的细胞系
大约一百万的Huh7和HepG2细胞经3μg质粒DNA(pSuper和pSuper-miR-130a)与Polyjet(西格纳金(SignaGen))短暂转染,接着进行G418选择,历时三周。将G418抗性群落汇集在一起。
LNA-miR-130a阻断基因表现
HepG2和Huh7细胞与抗嘌呤霉素质粒(pTRE2pur)和LNA-加扰对照或LNA抗 miR-130a(锁核酸,艾斯昆(Exiqon)),使用脂染胺2000(英杰公司(Invitrogen))共转染。转染后十二小时,经转染的培养物用嘌呤霉素(2μg/ml)处理2天,接着降低嘌呤霉素浓度(0.5μg/ml),2天后,采集用于蛋白质印迹分析。陈H.L.等人,公共科学图书馆·综合 7,e34116(2012)。
生物信息学分析
包括Targetscan(http://www.targetscan.org/)、Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)、 Microinspector(http://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/)、RNAhybrid(http://www. bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/)和DIANA(http://diana.cslab.ece.ntua.gr)在内的基于计算机的程序用于预测miR-1236、miR-130a和miR-204的可能标靶。小于-20kcal/mol的最低结合自由能用作截止值。
微RNA塔克曼低密度阵列分析
通过Trizol(英杰公司)提取产生HBV的细胞的总RNA。通过安捷伦(Agilent)2100生物分析仪,使用RNA 6000纳米试剂盒(安捷伦技术公司(Agilent Technologies,Inc.))测定RNA样品的品质和数量。使用塔克曼微RNA反转录试剂盒(应用生物系统)进行反转录反应。miRNA的表达通过啮齿动物微RNA阵列A(应用生物系统公司)检测,并通过含有381个啮齿动物miRNA标靶的应用生物系统公司7900HT快速实时PCR系统分析。
统计数据
使用史都登氏t检验测定统计显著性。在所有图中,值表示为平均值±标准偏差(SD) 并且统计显著性(p<0.05)通过星号指示。数据表示来自至少三个独立实验的结果。
动物
先前已经报导了ICR背景下HBV转基因小鼠的产生。陈等人,基因疗法14,11-19(2007)(Chen,C.C.et al.Gene therapy 14,11-19(2007))。转基因为1.3倍HBV基因组(基因型D,血清型ayw)。Tg[HBV1.3]小鼠品系用于本研究。所有动物都圈养在中央研究院的生物医学科学研究所的动物设施(animal facility of the Institute of BiomedicalSciences, Academia Sinica)中的无特定病原体的环境中。
RNA酶保护分析(RPA)
使用供应商方案(RPA III,安必逊(Ambion))进行RPA。通过使用NotI线性化DNA片段,从含有HBV序列nt 2150-1820的pGEM-T载体体外转录,将392nt反义核糖探针进行放射性标记。经保护的pgRNA片段长330nt。HBV聚合酶突变体Y63D无法进行DNA合成,但能够pgRNA衣壳化。宁等人,公共科学图书馆·病原体7,el002255(2011) (Ning,X.et al.PLoSpathogens 7,el002255(2011))。此突变体因其DNA合成停滞的核苷酸引发,而在核心粒子中积聚更高水平的衣壳化pgRNA。
通过缺失定位分析MiR-130a启动子
通过PCR,从人类HepG2基因组DNA,扩增含有NF-κB/p65、Egr-1和CREB的推定结合位点的miR-130a前驱物的上游片段(-750到-1nt)。PCR引物如表1中列出。PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳分离,并且接着分离的DNA片段克隆到经限制酶消化的含有萤火虫荧光素酶报导体(马萨诸塞州伊普威治的新英格兰生物实验室(New England Biolab,Ipswich,MA))的pGL3基础载体(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格(Promega, Madison,WI))。含有miR-130a前驱物上游的更短片段的各种启动子缺失质粒通过使用各种PCR引物进行PCR扩增和克隆,从全长启动子质粒获得(以上表1)。所有启动子质粒通过测序证实。HuH-7细胞经启动子缺失质粒转染48小时,并且接着测量萤火虫荧光素酶活性并相对于各共转染的海肾荧光素酶水平校正。PPARγ、PGC1α和SP1的全长 3′UTR使用其相应正向引物和反向引物(表1)从HepG2细胞的基因组DNA扩增,并克隆到psiCHECK-2荧光素酶载体(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格)(施等人病毒学179, 871-873(1990)(Shih,C.et al.Virology 179,871-873(1990))。在PGC1α3′UTR含有改变序列的标靶位点突变体和含有改变种子序列的miR-130a突变体通过使用成对的突变引物(表1)和定点突变诱发试剂盒(加利福尼亚州圣克拉拉的斯塔津(Stratagene,Santa Clara, CA))工程化。
结果
三种抗HBV细胞微RNA的鉴别
进行两种不同方法,包括微RNA微阵列(表2)和生物信息学分析(表3),以鉴别潜在的抗HBV细胞miRNA。
表2产生HBV和对照肝瘤细胞系中细胞微RNA的Q-PCR微阵列
#Qs2、Qs4、Qs5和Qs21为产生感染性HBV的大鼠肝瘤细胞系。施等人,美国国家科学院院刊86,6323-6327(1989)(Shih,C.H.,et al.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 86,6323-6327(1989));施等人病毒学179,871-873(1990)(Shih, C,et al.Virology 179,871-873(1990))。
§Qs2、Qs4、Qs5、Qs21中miRNA表达的改变倍数相对于对照细胞系Q7neo校正。
*miR-204和miR-130a的结果通过茎环实时PCR分析,使用产生HBV的人类肝瘤细胞系 UP7-4和UP7-7证实。
表3.具有结合到HBV RNA前基因组的强力潜能的细胞微RNA的计算预测#
#使用Microinspector程序,用HBV(ayw)3′UTR序列(nt 1521-2122)筛选整个miRbase 16.0 版。预测MiR-1236具有最高度的结合自由能。加利博特等人,自然281,646-650(1979) (Galibert,F.,et al.Nature 281,646-650(1979))。
@所处位置是指HBV ayw基因组上微RNA结合位点的第一核苷酸。
先前建立了产生HBV的肝瘤细胞系其會產生在黑猩猩中具有感染性病毒粒子。施等人,美国国家科学院院刊86,6323-6327(1989);施等人,病毒学179,871-873(1990)。通过上述qPCR微阵列比较稳定产生HBV与对照细胞系之间的微RNA表达型态。在产生HBV的细胞中观测到至少多个miRNA显著减少(表2)。来自微阵列研究的这些miRNA 的减少通过茎环qPCR分析证实(图1A)。结果表明这些miRNA可具有抗HBV作用,此可解释在若干独立建立的大鼠和人类产生HBV的细胞系中其表达水平降低。
进行共转染和病毒复制分析以从表2在中列出的微RNA筛选抗HBV微RNA。 miR-204和miR-130鉴别为候选抗HBV微RNA。
在另一方法中,miR-1236通过Microinspector标靶预测算法鉴别为抗HBV微RNA。此miRNA可以最高自由能(-34.9kcal/mol)结合于HBV基因组(表3)。
通过miR-130a、miR-204和miR-1236减弱的病毒复制和基因表达
如图1B中所示,miR-130a、miR-204或miR-1236各抑制人类肝母细胞瘤HepG2 细胞中的HBV DNA复制。使用DNA印迹分析,HepG2细胞中胞内HBV复制通过HBV ayw基因组二聚体质粒与各种miRNA表达载体的共转染(coTf)减少(图1C)。来自共转染的培养物的总细胞质RNA的RNA印迹分析(图1D)揭露了miR-130a降低HBV前基因组RNA(pgRNA)的水平。miR-204与miR-1236对pgRNA都没有任何明显作用。
然后,检验这些微RNA对包括核心蛋白(HBc)、表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)在内的HBV蛋白质表达的作用。发现miR-130a和miR-1236而非miR-204减少HepG2 细胞中HBV蛋白质表达(图1E和F)。
MiR-1236直接靶向HBV
生物信息学分析预测丛集在HBV ayw基因组的nt 1521与nt 2122之间的miR-1236、 miR-204和miR-130a的潜在标靶位点,加利博特等人,自然281,646-650(1979)(图2A)。此区域与HBsAg、HBeAg和HBc特异性RNA的3′UTR以及pgRNA的聚合酶编码区一致。蒂奥莱等人,自然317,489-495(1985)(Tiollais,P.,et al.,Nature 317,489-495(1985))。进行3′UTR荧光素酶报导体分析以测定微RNA经由预测的靶向位点调节基因表达的活性并且发现miR-1236显著降低荧光素酶活性(图2A)。
为进一步测试miR-1236是否可直接结合于其对HBV的单一预测标靶位点,通过引入突变到miR-1236的种子序列和其对HBV的标靶位点中,进行补偿性突变诱发分析(图2B)。miR-1236的此种子序列突变体不降低含有野生型HBV 3′UTR序列的报导体活性。类似地,野生型miR-1236对含有标靶位点突变的HBV 3′UTR无作用。但是,种子突变体miR-1236与标靶位点突变体的组合恢复miR-1236对报导体活性的抑制作用(图2B)。此结果指示miR-1236与HBV之间的直接相互作用。图2C概括miR-1236、miR-130a 和miR-204对HBV DNA、RNA、蛋白质的作用和3′UTR报导体分析。
内源性miR-130a的减少增强HBV DNA复制和蛋白质表达
在DsRed报导基因的3′UTR处含有miR-130a合成标靶位点的8个拷贝的miR-130a海绵质粒经构筑以进一步阐明miR-130a的抗HBV机制。通过茎环qPCR,此海绵质粒可有效阻断Huh7细胞中内源性miR-130a(图3A)。此海绵质粒与HBV基因组的共转染显著增加病毒DNA复制(图3B)和蛋白质合成。当内源性miR-130a通过用LNA-miR-130a 拮抗mir处理而减少时获得类似结果(图3C、3D、3E和3F)。
MiR-130a可间接阻断HBV RNA基因表现
因为报导体分析未检测到miR-130a和miR-204的明显作用(图2A),所以此两种微RNA可能经由间接机制,而非通过直接结合于HBV特异性RNA,如miR-1236,减弱 HBV复制。如图3G中所提出,miR-130a可通过正面或负面靶向第三方宿主因子,所述第三方宿主因子又可负面或正面作用于HBV,来减少HBV复制。宿主因子可为转录因子,其可调节HBV增强子/启动子活性和转录。奎斯多夫等人,病毒性肝炎杂志17, 527-536(2010)(Quasdoiff,M.etal.Journal of viral hepatitis 17,527-536(2010));巴-伊莎等人,国际肝研究学会官方杂志31,282-290(2011)(Bar-Yishay,I.,et al.Liver international:officialjournal of the International Association for the Study of the Liver 31, 282-290(2011))。从有或无miR-130a的HBV增强子/启动子报导体分析获得的结果指示 miR-130a而非miR-204或载体对照降低HBV强化子-II驱动的荧光素酶活性(图3H)。
MiR-130a直接靶向PGC1α与PPARγ二者
四种不同标靶预测算法用于鉴别肝细胞中miR-130a的潜在标靶转录因子。PPARGC1-α(PGC1α)鉴别为通过所有四种程序一致预测3′UTR的此类因子(表4)。
表4.已知影响HBV转录的人类转录因子的3′UTR处miR-130a标靶位点的预测
£在文献5、6、38中已经报导了这些转录因子与HBV RNA合成有关。MiR-130a展示在脂肪细胞中靶向PPARγ的3′UTR。李等人,分子细胞生物学31,626-638(2011)(Lee,E.K.et al. Mol Cell Biol 31,626-638(2011))。
为阐明miR-130a与PGC1α之间的潜在关系,建立稳定表达miR-130a的细胞系(图31)。虽然此处检验的大部分肝转录因子的表达水平在表达miR-130a的细胞系中保持不变,但观测到PPARγ和PGC1αmRNA和蛋白质同时减少(图3J、3K;图3L),此表明 miR-130a可靶向PPARγ和PGC1α二者。在反向实验中,HepG2细胞用LNA-miR-130a 拮抗mir处理,并且观测到PGC1αmRNA和蛋白质增加(图3M)。因此,miR-130a可通过降低其相应mRNA水平(图3J、3M)来降低PPARγ和PGC1α蛋白质水平(图3K)。
为区别miR-130a对降低PGC1αmRNA的直接与间接机制,使用来自PPARγ或 PGC1α的3′UTR进行报导体分析。结果证明miR-130a与PPARγ或PGC1α的3′UTR之间的功能相互作用(图3N)。然后,补偿性突变引入到miR-130a的种子序列和对PGC1α的其进化上保守的标靶位点(图3O)。通过共转染分析,仅仅突变体miR-130a与突变体 PGC1α的组合可成功地恢复miR-130a对荧光素酶活性的抑制作用。以剂量依赖性方式, miR-130a可降低,而LNA-miR-130a可增加,含有PGC1α的3′UTR的报导体的荧光素酶活性(图3P)。综合而言,miR-130a可直接靶向PGC1α和PPARγ二者。
PGC1α促进HBV DNA复制和蛋白质表达
通过HBV基因组与PGC1αsiRNA或PGC1α表达载体共转染,研究HBV与PGC1α之间的关系(图3Q、3R、3S、3T、3U、3V、3W和3X)。结果证实PGC1α可刺激HBV 复制。休洛麦等人,美国国家科学院院刊103,16003-16008(2006)(Shlomai,A.,et al. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 103, 16003-16008(2006));奥曲克等人,病毒学杂志83,12535-12544(2009)。
PPARγ和PGC1α对增强HBV DNA复制的协同效应
PPARγ(或其促效剂)对HBV复制具有正面还是负面作用仍然是有争议的。余等人,病毒学杂志75,11354-11364(2001)(Yu,X.et al.Journal of virology 75,11354-11364(2001));涌井等人,生物化学与生物物理研究通讯396,508-514(2010)(Wakui,Y.et al.Biochemical and biophysical research communications 396,508-514(2010));尹等人,病毒学409,290-298(2011)(Yoon,S.et al.Virology 409,290-298(2011))。通过增加PPARγ促效剂(罗格列酮)的浓度,观测到HBV复制增加(图3Y)。相比之下,当PPARγ拮抗剂(GW9662)浓度增加时,HBV复制和蛋白质表达显著减少(图3Y和3Z)。有趣地,PPARγ与PGC1α的组合在不存在任何外源性配体下对HBV复制(图4A)和HBsAg、HBeAg分泌(图4B)显示显著的协同效应。HBV ayw二聚体与PGC1α和PPARγsiRNA组合的共转染对HBV DNA复制(图4D)和HBsAg和HBeAg的表达(图4E)的表达产生最有效抑制作用。图4C概述HBV、miR-130a、PPARγ和PGC1α之间的基本三元关系。在此图中, miR-130a可通过在PPARγ与PGC1α双重靶向,对HBV复制产生协同正面作用,间接减弱HBV复制和表达。
肝葡糖新生和脂肪生成中的MiR-130a
miR-130a双重靶向PGC1α和PPARγ强烈表明其在能量代谢中的重要作用。使用稳定的表达miR-130a的细胞检验糖酵解、葡糖新生和脂肪生成中若干关键代谢酶(图5A,上图)。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)为已知在PGC1α的正面控制下的速率限制葡萄糖异生酶,尹等人,自然413,131-138(2001)(Yoon,J.C.et al.Nature 413,131-138(2001))。因为PGC1αmRNA和蛋白质在表达miR-130a的细胞中减少(图3J、3K),预期PEPCK和G6Pase也应减少。实际上,在表达miR-130a的肝细胞中观测到PEPCK和G6Pase mRNA(图5A)和蛋白质(图5B)同时减少。虽然此结果提出糖酵解而非葡糖新生途径,但如果其糖分解对应部分、丙酮酸激酶(PKLR)和葡糖激酶 (GCK)不同时减少,那么其将更确定(图5A)。实际上,在HepG2或Huh7细胞中GCK 和PLKR的蛋白质表达不减少,而是增加(图5B)。此外,在表达miR-130a的肝细胞中观测到GCK和PLKR的mRNA表达增加(图5C和5D)。这些结果表明miR-130a不仅可抑制HBV复制,而且也有助于在肝细胞中经由PGC1α下调葡糖新生和上调糖酵解。因此,miR-130a在与糖酵解失调关联的疾病和病症,例如代谢疾病中将是有效的。
代谢三要素
HBV可对PGC1α和PPARγ发挥任何作用。与miR-130a减少(图1A,表2)一致,在产生HBV的UP7-4和UP7-7细胞中PGC1α、PEPCK、G6Pase和PPARγ蛋白质都显著增加(图5E)。类似地,葡萄糖产生在稳定产生PGC1α的细胞中增加,并且在产生PPARγ的细胞中减少(图5F)。在对照与产生miR-130a的细胞之间未检测到葡萄糖水平显著差异。葡萄糖水平在产生HBV的HepG2细胞中增加,并且当HepG2细胞用PPARγ拮抗剂GW9662处理时进一步增加,与其产生HBV的状态无关(图5G)。最终,在稳定表达 PGC1a的细胞系中miR-130a表达无明显改变(图5H)。
HBV、miR-130a和PGC1α之间的三元关系概述在图5I中。与PGC1α对比,miR-130a 的表达在稳定表达PPARγ的细胞系中减少,并且通过罗格列酮处理,进一步减少,但通过GW9662未进一步减少(图5J)。此外,PGC1α和PPARγ组合在不存在任何外源性配位体下显示对降低miR-130a表达比单独PGC1α或PPARγ更强的作用(图5K)。这些结果表明具有正前馈回路的另一三元图(图5L)。通过此回路接收的初级弱信号可扩大成更强的表现型结果。
HBV-转基因小鼠显示减少的miR-130a和miR-204水平
使用HBV转基因小鼠探索miR-130a和miR-204对HBV感染的作用,陈等人,基因疗法14,11-19(2007)(Chen,C.C.et al.Gene therapy14,11-19(2007)),所述小鼠的肝含有活跃HBV复制(图5M)。在此动物模型中,肝miR-130a和miR-204显著减少(图5N)并且HBc强烈表达,而PGC1α、G6Pase、PEPCK和PPARγ都显著增加(图5P)。不同于细胞培养系统(图5G),在野生型与HBV转基因小鼠之间未检测到血清葡萄糖水平显著差异(图5O;参见论述)。在此动物模型中,肝miR-130a(图5N)和NF-κB/p65(图5P)显著减少,而HBc强烈表达。类似地,PGC1α、G6Pase、PEPCK、PPARγ都显著增加(图5P)。
Mir-204可抑制HBV pgRNA包装和衣壳装配
在这一研究中,观测到miR-204可减少HBV DNA复制,HBV特异性RNA和蛋白质无任何明显减少(图1和2C)。此可归因于miR-204干扰HBV衣壳装配、RNA衣壳化或反转录的活性(图6A)。与HBV DNA和miR-204表达载体共转染后,胞内核心粒子的装配功效和稳定性通过天然琼脂糖凝胶电泳检验(图6B,上图)。纽曼等人,病毒学杂志 83,10616-10626(2009)(Newman,M.,et al.Journal of virology 83,10616-10626(2009));蔡等人,病毒学杂志84,2340-2351(2010)(Chua,P.K.,et al.Journal of virology 84, 2340-2351(2010))。核心蛋白水平通过变性SDS-PAGE监测作为对照(图6B,下图)。与 miR-204共转染显著降低HepG2细胞中胞内核心粒子的水平,而核心蛋白单体的总量保持不变。此结果表明miR-204干扰HBV衣壳装配。HBV经由反转录衣壳化RNA前基因组复制,萨姆斯等人细胞29,403-415(1982)(Summers,J.et al.Cell 29,403-415 (1982))。
衣壳化RNA或聚阴离子可诱发衣壳装配,纽曼等人,病毒学杂志83,10616-10626(2009)(Newman,M.,et al.Journal of virology 83,10616-10626(2009)),蔡等人,病毒学杂志84,2340-2351(2010)。有和无miR-204下pgRNA衣壳化的效率通过核心粒子相关的HBV RNA的核糖核酸酶保护分析(RPA)比较(图6C)。与miR-204共转染减少核心粒子相关的RNA,对总细胞质病毒RNA无任何明显作用。结果表明miR-204靶向与衣壳装配或RNA衣壳化有关的宿主因子。
miR-130a的调节
此处有待解决的一个重要问题是可如何调节miR-130a的表达。生物信息学分析揭露了在转录起始位点上游1000nt处,转录因子NF-κB/p65、Egr-1和CREB的三个潜在结合位点(图7A)。使用荧光素酶报导体进行miR-130a的启动子分析(图7B)。当 NF-κB/p65的结合位点缺失时,荧光素酶活性显著减少。此结果强烈表明NF-κB/p65为 miR-130a转录的正面活化剂。实际上,当大鼠或小鼠NF-κB/p65表达载体与miR-130a 启动子质粒共转染时,观测到荧光素酶活性增加30-60倍(图7C)。相反,通过茎环PCR 测量,对NF-κB/p65具有特异性的siRNA处理显著降低经转染HepG2细胞中miR-130a 的水平(图7D)。已经报导PPARγ可充当E3接合酶用于NF-κBp65泛素化和降解(鲁安等人2003(Ruan et al.2003);帕斯夸尔等人2005(Pascual et al.2005);侯等人2012(Hou et al.2012))。实际上,通过蛋白质印迹分析,在稳定的表达PPARγ的HepG2细胞中观测到NF-κB/p65蛋白质水平显著减少(图7E)。有趣地,在稳定的表达miR-130a的HepG2 细胞中NF-κB/p65蛋白质水平显著增加,结果与miR-130a可靶向PPARγ的事实一致(图 3J和3K)。通过qPCR分析,PPARγ对NF-κB/p65的负面作用并非通过在NF-κB/p65的 mRNA水平下靶向(图7F)。在产生HBV的细胞系中研究HBV对NF-κB/p65的蛋白质水平的作用(图7G)。通过蛋白质印迹分析,磷酸化和总NF-κB/p65蛋白质在HBV复制存在下显著减少。再次,这些结果与PPARγ经由蛋白质泛素化和降解对NF-κB/p65的作用一致(侯等人2012)。与此结果一致,当产生HBV的稳定细胞系UP7-4和UP7-7用对PPARγ具有特异性的siRNA处理时,NF-κB/p65和miR-130a二者增加(图7H)。综合而言,提出经由PPARγ的miR-130a与NF-κB/p65之间的另一前馈回路(图7I)。
论述
在这一研究中,许多抗肝炎病毒细胞微RNA鉴别为通过在HBV生命周期中的不同阶段干扰,能够减弱例如HBV复制。如本文中详细描述,miR-1236直接抑制HBV复制,而miR-130a和miR-204间接抑制HBV。在HBV存在下,减少miR-1236、miR-130a 和miR-204的表达,产生亲肝性HBV的更友好小生境。在本文中论述miR-130a在能量代谢中的潜在作用。用这三种微RNA的寡核苷酸模拟物的组合处理显著减少HBV复制 (图9A和9B)。这三种微RNA可抑制不同基因型的HBV的复制,指出其可治疗学上有效治疗HBV感染。佩德森等人自然449,919-922(2007)(Pedersen,I.M.et al.Nature 449, 919-922(2007))。
miR-130a的最突出特征为其双重靶向PPARγ和PGC1α(图3J-3N),导致HBV复制减少(图1B、4A)。相反,HBV可减少miR-130a的表达(表2、图1A),导致PPARγ和 PGC1α的表达增加(PEPCK和G6Pase)。PPARγ的过表达降低miR-130a的水平,并且通过罗格列酮(图5J),或PPARγ与PGC1α组合(图5K)观测到miR-130a进一步减少。综合而言,建立HBV、miR-130a、PGC1α和PPARγ之间的正前馈回路(图5L)。此三元回路可通过经历此回路重复回合,在理论上放大弱的初级信号。
不同于HCV,梅森等人,肝脏病学29,328-333(1999)(Mason,A.L.etal.Hepatology 29,328-333(1999)),梅塔等人,内科年鉴133,592-599(2000)(Mehta,S.H.et al.Ann Intern Med 133,592-599(2000)),慢性B型肝炎患者不具有更高的T2DM流行率,梅塔等人,内科年鉴133,592-599(2000),黄等人,胃肠病学肝脏病学25,1420-1425(2010) (Huang,Z.S.et al.J Gastroenterol Hepatol 25,1420-1425(2010))。在HBV存在下, miR-130a水平降低(表2,图1A),导致PGC1α和葡糖新生增加,并且可能最后,还增加T2DM的风险。但是,产生HBV的肝细胞中减少量的miR-130a也可促进PPARγ的表达。因此,HBV可已经进化下调miR-130a的表达的策略,并且因此通过产生具有更充足PGC1α和PPARγ的小生境,本身受益。
在HBV存在下,miR-130a的水平降低,可能归因于肝细胞中NF-κB/p65的水平降低。因为miR-130a可同时靶向PGC1α和PPARγmRNA二者,所以miR-130a的减少可引起PGC1α和PPARγ的水平升高,此可共活化HBV转录,导致HBV DNA复制增加。先前已报导PPARγ蛋白质可充当NF-κB/p65的E3接合酶,导致NF-κB/p65蛋白质泛素化和降解,减少NF-κB/p65和miR-130a启动子活性。HBV可通过经由正前馈回路降低 miR-130a的水平,为本身产生更友好的小生境。代谢上,已知PGC1α为肝葡糖新生的正面转录共活化剂。PPARγ为脂肪生成的正转录因子,其又可降低血糖水平。通过在 PGC1α和PPARγ双重靶向,miR-130a可在葡萄糖稳态中起关键作用。肝发炎可促进病毒清除(图8A),因为当NF-κB和miR-130a升高时,PGC1α、PPARγ和HBV复制减少。相比之下,当肝无发炎时,NF-κB与miR-130a的水平低,并且PGC1α和PPARγ的水平更高,使得病毒复制更活跃。
实例2:通过miR-130a调节HCV复制
已经充分证明慢性HCV感染与更高发生率的2型糖尿病相关联(T2DM)(黄等人,2007;梅森等人,1999;梅塔等人,2000))。如下探索miR-130a在HCV感染中的调节作用。
HCV基因型2a嵌合构筑体FL-J6/JFH1质粒DNA经XbaI限制酶线性化并通过苯酚 /氯仿提取。使用T7MEGAscript试剂盒(安必逊),根据制造商的说明书,纯化DNA用作HCV RNA体外转录的模板。对于电穿孔,亚汇合的Huh7.5细胞通过胰蛋白酶分离,通过离心收集(1000g,5min)并以1.5×107个细胞/毫升再悬浮在冰冷磷酸盐缓冲盐水中。接着400μL细胞等分试样与10μg HCV RNA混合在4mm间隙比色皿中。电穿孔条件为使用ECM830(BTX)电穿孔仪,300伏脉冲3次,历时500微秒,时间间隔为1.1秒。在10分钟回收时间后,细胞在完全DMEM培养基中稀释以在电穿孔后3-7天收集HCV 上清液。含HCV的上清液通过离心(1,500×g)净化10分钟并通过0.22μM过滤器过滤。病毒通过添加含四分之一体积的无菌40%(w/v)聚乙二醇-8000的PBS(最终,8%(w/v)) 浓缩,并在4℃下培育过夜。通过离心(4,000×g,45min)收集病毒沉淀并再悬浮在DMEM 中。对于更长期存储,HCV等分试样存储在-80℃下。感染2小时后,从细胞去除病毒并用新鲜的完全DMEM培养基替换。感染细胞在不同时间点收集用于蛋白质和RNA提取。对于病毒滴定,培养物上清液在完全DMEM中连续稀释10倍并用于感染96孔盘中每孔4×103个原始Huh.7.5细胞。接种物与细胞一起在37℃下培育2小时并接着补充有新鲜的完全DMEM。感染后2天,通过免疫荧光显微法,使用抗HCV NS5A抗体(9E10) 测定HCV感染水平。病毒滴度以病灶形成单元/毫升上清液(f.f.u./ml)表示,如通过在最高稀释下检测到的HCV阳性病灶的平均数目测定。
检验感染HCV的Huh7和Huh7.5细胞中miR-130a表达型态的时程。如图10A-D 中所示,在人类肝瘤Huh7和Huh7.5细胞中在体外感染HCV后miR-130a减少。在感染 HCV后第1天,miR-130a减少。但是,miR-130a水平随时间推移逐渐恢复到感染前(即未感染)水平。这些数据表明miR-130a对于在建立稳定感染前建立最初(第1天)HCV感染来说是重要的。因此,调节miR-130a或相关miR-130b可有效调节HCV复制和治疗 HCV感染。
其它实施例
本说明书中公开的所有特征可以任何组合形式组合。本说明书中公开的每个特征可经用于达成相同、等效或类似目的的替代性特征置换。因此,除非另外明确陈述,否则所公开的每个特征仅为一系列通用的等效或类似特征的一个实例。
从以上论述中,本领域普通技术人员可容易地确定本发明的基本特征,并且在不背离其精神和范围的情况下,可进行本发明的不同变化和修改以使本发明适于不同用途和条件。因此,其它实施例亦属于权利要求书内。
Claims (15)
1.一种miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA、miR-1236RNA或其组合在制备药剂中的用途,所述药剂用于调节B型肝炎病毒HBV复制,所述调节包含:
使肝细胞与有效量的miR-130a RNA、miR-130b RNA、miR-204RNA、miR-1236RNA或其组合接触;
其中所述肝细胞感染或怀疑感染HBV。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述肝细胞为培养细胞。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述miR-130a RNA、所述miR-130b RNA、所述miR-204RNA或所述miR-1236RNA为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。
4.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述miR-130a RNA、所述miR-130b RNA或两者包含AGUGCAA的核苷酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述miR-130a RNA包含CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
6.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述miR-130b RNA包含CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
7.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述miR-204RNA包含UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
8.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述miR-1236RNA包含CCUCUUCCCCUUGUCUCUCCAG的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。
9.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述接触步骤通过向有需要的个体投与有效量的所述miR-130a RNA、所述miR-130b RNA、所述miR-204RNA、所述miR-1236RNA或其组合进行。
10.根据权利要求9所述的用途,其中投与所述个体所述miR-130a RNA、所述miR-204RNA和所述miR-1236RNA的组合或所述miR-130b RNA、所述miR-204RNA和所述miR-1236RNA的组合。
11.根据权利要求9所述的用途,其中投与所述个体有效减少PGC1α、PGC1β、PPARγ的量的所述miR-130a RNA或所述miR-130b RNA或两者。
12.根据权利要求9所述的用途,其中投与所述个体有效降低编码B型肝炎病毒的RNA水平的量的所述miR-1236。
13.根据权利要求9所述的用途,其中投与所述个体有效抑制HBV前基因组RNA衣壳化、衣壳装配或两者的量的所述miR-204RNA。
14.根据权利要求9所述的用途,其中所述个体为罹患或怀疑患有HBV感染的人类患者。
15.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述调节进一步包含向所述个体投与有效量的另一抗HBV剂。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361880508P | 2013-09-20 | 2013-09-20 | |
US61/880,508 | 2013-09-20 | ||
PCT/US2014/056586 WO2015042420A1 (en) | 2013-09-20 | 2014-09-19 | Treating hepatitis virus infection by modulating micrornas mir-130a, mir-130b, mir-204, or mir-1236 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105899238A CN105899238A (zh) | 2016-08-24 |
CN105899238B true CN105899238B (zh) | 2021-02-26 |
Family
ID=52689454
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480051381.4A Active CN105899238B (zh) | 2013-09-20 | 2014-09-19 | 通过调节微RNAmiR-130a、miR-130b、miR-204或miR-1236治疗肝炎病毒感染 |
CN201480051372.5A Pending CN105873617A (zh) | 2013-09-20 | 2014-09-19 | 通过调节微RNA miR-130a和miR-130b治疗与PGC1-α相关的疾病 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480051372.5A Pending CN105873617A (zh) | 2013-09-20 | 2014-09-19 | 通过调节微RNA miR-130a和miR-130b治疗与PGC1-α相关的疾病 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20160244755A1 (zh) |
CN (2) | CN105899238B (zh) |
WO (2) | WO2015042435A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106177991B (zh) * | 2015-05-05 | 2020-05-26 | 中国科学院上海生命科学研究院 | miR-130b在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途 |
US10709727B2 (en) | 2015-11-09 | 2020-07-14 | Idac Theranostics, Inc. | Antiviral drugs |
WO2020171889A1 (en) * | 2019-02-19 | 2020-08-27 | University Of Rochester | Blocking lipid accumulation or inflammation in thyroid eye disease |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102573856A (zh) * | 2009-09-10 | 2012-07-11 | 弗莱明·韦林 | 用于制备微小rna 的方法及其治疗性应用 |
WO2013088338A1 (en) * | 2011-12-15 | 2013-06-20 | Oncostamen S.R.L. | Micrornas and uses therof |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101368213A (zh) * | 2008-10-13 | 2009-02-18 | 南京大学 | 血清微小核糖核酸试剂盒及其在乙肝早期诊断中的应用 |
US20110190372A1 (en) * | 2009-08-07 | 2011-08-04 | New York University | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
EP2611918A1 (en) * | 2010-05-28 | 2013-07-10 | Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Weten | Mirnas involved in the blood brain barrier function |
EP2691548B1 (en) | 2011-03-31 | 2017-11-22 | University of Houston | Microrna 130a,b as a tumor suppressor and sensitizing agent for chemotherapy |
-
2014
- 2014-09-19 CN CN201480051381.4A patent/CN105899238B/zh active Active
- 2014-09-19 US US15/023,300 patent/US20160244755A1/en not_active Abandoned
- 2014-09-19 WO PCT/US2014/056611 patent/WO2015042435A1/en active Application Filing
- 2014-09-19 WO PCT/US2014/056586 patent/WO2015042420A1/en active Application Filing
- 2014-09-19 US US15/023,284 patent/US9771589B2/en active Active
- 2014-09-19 CN CN201480051372.5A patent/CN105873617A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102573856A (zh) * | 2009-09-10 | 2012-07-11 | 弗莱明·韦林 | 用于制备微小rna 的方法及其治疗性应用 |
WO2013088338A1 (en) * | 2011-12-15 | 2013-06-20 | Oncostamen S.R.L. | Micrornas and uses therof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Liping Tang等.The hepatitis B virus-associated estrogen receptor alpha (ERα) was regulated by microRNA-130a in HepG2.2.15 human hepatocellular carcinoma cells.《Acta Biochim Biophys》.2011,第43卷(第8期),640-646. * |
The hepatitis B virus-associated estrogen receptor alpha (ERα) was regulated by microRNA-130a in HepG2.2.15 human hepatocellular carcinoma cells;Liping Tang等;《Acta Biochim Biophys》;20110628;第43卷(第8期);640-646 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9771589B2 (en) | 2017-09-26 |
WO2015042420A1 (en) | 2015-03-26 |
WO2015042435A1 (en) | 2015-03-26 |
CN105873617A (zh) | 2016-08-17 |
CN105899238A (zh) | 2016-08-24 |
US20160244755A1 (en) | 2016-08-25 |
US20160251661A1 (en) | 2016-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5593279B2 (ja) | 遺伝子サイレンシングに有用な保存されたhbv及びhcv配列 | |
JP4709545B2 (ja) | 修飾された低分子干渉rna分子および使用方法 | |
US8846632B2 (en) | Nucleic acids for targeting multiple regions of the HCV genome | |
Hoffman et al. | Hepatitis C viral protein translation: mechanisms and implications in developing antivirals | |
CN113507920A (zh) | 用于乙型肝炎病毒感染的RNAi剂 | |
CN105899238B (zh) | 通过调节微RNAmiR-130a、miR-130b、miR-204或miR-1236治疗肝炎病毒感染 | |
JP2018515136A (ja) | B型肝炎ウイルス(hbv)感染を治療するための試薬及びその使用 | |
EP3395363B1 (en) | Compounds for use in treating hbv-and hcv-related conditions | |
Pu et al. | Optimized Tandem amLRNA Mediates Stronger Inhibitory Effects on Hepatitis B Virus Infection. | |
US20230119360A1 (en) | Pharmaceutical combination of a therapeutic oligonucleotide targeting hbv and a tlr7 agonist for treatment of hbv | |
US20230123601A1 (en) | Pharmaceutical combination of antiviral agents targeting hbv and/or an immune modulator for treatment of hbv | |
KR100733186B1 (ko) | Hcv 유전자에 특이적인 작은 간섭 rna 및 그를유효성분으로 포함하는 c형 간염 치료제 | |
TWI414301B (zh) | 以微核醣核酸miR-141為標的治療小核醣核酸病毒感染 | |
US10378015B2 (en) | Targeting hepatitis B virus (HBV) host factors | |
US11535851B2 (en) | Reagents for treatment of hepatitis B virus (HBV) infection and use thereof | |
JP7441174B2 (ja) | B型肝炎ウイルスの複製阻害組成物 | |
WO2007052629A1 (ja) | オリゴ二本鎖rna及び医薬組成物 | |
CN106310294B (zh) | 一种治疗慢性乙型肝炎和肝脏的纤维化的小干扰rna药物 | |
TW202342747A (zh) | 具有高穩定性和基因沉默活性的小干擾rna分子的修飾模式 | |
Lupacchini | Regulation of viral expression by the HBV core protein and the characterization HBc as a potential therapeutic target for HBV cure | |
CN116144664A (zh) | 一种抑制奥秘克戎Nsp12基因的siRNA及其应用 | |
Ely et al. | 799. Expressed Long Hairpin RNA Sequences Inhibit HBV Replication In Vivo without Inducing an Interferon Response |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |