CN105873617A - 通过调节微RNA miR-130a和miR-130b治疗与PGC1-α相关的疾病 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及调节PGC1α和/或PGC1β或治疗与PGC1α和/或PGC1β相关的疾病的方法,其使用miR‑130a RNA、miR‑130b RNA或其组合,或使用可呈微RNA海绵或锁核酸LNA形式的miR‑130a的拮抗miR、miR‑130b的拮抗miR或两者。
Description
相关申请
本申请案依据35U.S.C.§119(e)要求2013年9月20日提出的美国临时专利申请案第61/880,508号的优先权,所述临时专利申请案以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
人类过氧化物酶体增殖剂活化的受体γ共活化剂1-α(PGC-1α)为由PPARGC1A基因编码的蛋白质。PGC-1α为调节与能量代谢有关的基因的转录共活化剂。其还调节线粒体生物合成和功能。除肝葡糖新生外(尹等人,自然413:131-138;2001(Yoon,et al.Nature413:131-138;2001)),已知PGC1α参与棕色脂肪适应性产热(普索维等人,细胞92:829-839;1998(Puigserver,et al.Cell 92:829-839;1998))、线粒体生体合成和呼吸(霍腾等人,细胞119:5-7;2004(Houten,et al.Cell 119:5-7;2004))和神经变性病(圣-皮尔等人,细胞127:397-408;2006(St-Pierre,et al.,Cell 127:397-408;2006))。
微RNA(miRNA)在分化和发育中起着重要的调节作用(阿姆博斯,遗传学与发育新见21:511-517,2011(Ambros,Curr Opin GenetDev 21:511-517,2011))。近来,微RNA已经显现为代谢的一种重要转录后调节因子(罗替尔等人,自然评论:分子细胞生物学13:239-250 2012(Rottiers,et al.Nat Rev Mol Cell Biol 13:239-250 2012))。
发明内容
本公开是基于miR-130a通过直接靶向其mRNA的3′UTR下调PGC1α、PGC1β和PPARγ的意外发现。
因此,本公开的一个方面提供一种调节PGC1α或PGC1β的方法,所述方法包含使细胞接触有效量的以下各物:(a)miR-130a RNA、miR-130b RNA或其组合;或(b)miR-130a RNA的拮抗miR、miR-130b RNA的拮抗miR或其组合。在一些实例中,细胞与有效下调PGC1α或PGC1β的量的miR-130a、miR-130b或其组合接触。在其它实例中,细胞与有效上调PGC1α或PGC1β的量的miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其组合接触。miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或两者可为微RNA海绵或锁核酸(LNA)。
在任一本文所述的方法中,miR-130a RNA、miR-130b RNA中的一或多者为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。miR-130a的拮抗miR和miR-130b的拮抗miR可为双螺旋RNA分子或呈微RNA海绵或LNA形式。在一些实施例中,拮抗miR中的一或多者可为微RNA海绵或LNA。miR-130a RNA、miR-130b RNA或两者可包含AGUGCAA的核苷酸序列。举例来说,miR-130a RNA可包含CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。在另一个实例中,miR-130b RNA可包含CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
在任一本文所述的方法中,有效量的miR-130a RNA、miR-130b RNA或其拮抗miR可投与有需要的个体以治疗与PGC1α或PGC1β相关的疾病。任选地,疾病不与PPARγ相关。
在一些实例中,个体为患有或怀疑患有糖尿病或脂肪变性的人类患者。可投与个体有效量的miR-130a、miR-130b或两者以治疗所述疾病。
在其它实例中,个体为患有或怀疑患有例如肌肉功能障碍、心力衰竭或神经退化性疾病(例如帕金森氏病(Parkinson disease)、亨廷顿氏病(Hungtinton disease)或阿尔茨海默病(Alzheimer disease)等与反应性氧物质(ROS)相关的疾病的人类患者。或者,个体可为患有或怀疑患有糖尿病或发炎的人类患者。可投与此类患者有效量的miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其组合以治疗所述疾病。
以下各物也在本公开的范围内:(a)用于治疗与PGC1α和/或PGC1β相关并且可不与PPARγ相关的疾病的医药组合物,所述组合物包含医药学上可接受的载剂和miR-130aRNA、miR-130b RNA中的一或多者或如本文所述的那些miRNA的拮抗miR中的一或多者;以及(b)任一医药组合物或微RNA分子的用途,其用于制造供治疗任一目标疾病的药剂,所述疾病包括(但不限于)糖尿病、脂肪变性、与反应性氧物质(ROS)相关的疾病(例如肌肉功能障碍、心力衰竭或神经退化性疾病(例如帕金森氏病、亨廷顿氏病或阿尔茨海默病))和发炎。
在下文描述中阐述本发明的一或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点自以下图式和若干实施例的详细描述以及所附权利要求书将显而易见。
附图说明
图1.在用miR-130a表达载体稳定转染的HepG2细胞系中,通过RNA印迹分析,检测miR-130a的表达。
图2.通过RNA印迹分析测量稳定的表达miR-130a的细胞系中PGC1α和PPARγmRNA的同时减少。
图3.蛋白质印迹分析检测稳定的表达miR-130a的细胞中PGC1α、PPARγ和脂肪细胞因子蛋白质的减少。
图4为如通过RT-qPCR分析测量,展示稳定的表达miR-130a的HepG2细胞系中PGC1α和PPARγmRNA的减少的图(上图)。通过蛋白质印迹分析,SP1、PPARαt、CEBPb和HNF4的蛋白质水平无明显差异(下图)。
图5.还通过ELISA检测分泌的脂肪细胞因子的减少。
图6.HepG2细胞经LNA-miR-130a或LNA加扰对照转染。分别通过实时RT-qPCR(上图)和蛋白质印迹分析(下图),LNA-miR-130a处理增加PGC1αmRNA和蛋白质。
图7.转基因小鼠显示在肝中PGC1α、PEPCK、G6Pase、PPARγ和脂肪细胞因子蛋白质的表达增加(左图)和在血清中脂肪细胞因子的表达增加(右图)。
图8.PGC1α和PPARγ表达载体的共转染对脂肪细胞因子分泌产生高度有效的协同效应。
图9.为展示在PGC1α(NM_013261)和PPARγ(NM_005037)的3′UTR而非SP1(NM_003109)的3′UTR的报导体共转染分析中MiR-130a显著降低荧光素酶活性的图。
图10.通过补偿性突变诱发,MiR-130a展示直接靶向PGC1α的3′UTR。(*p<0.05)。在序列比对中突变位点带下划线。hsa-miR-130a WT:SEQ ID NO:1;hsa-PGC1α3′UTRWT:SEQ ID NO:68;hsa-miR-130a种子序列突变体:SEQ ID NO:69;以及hsa-PGC1α3′UTR标靶位点突变体:SEQ ID NO:70。
图11.为展示PGC1α3′UTR荧光素酶报导体与递增量的miR-130a共转染以剂量反应方式降低报导体活性的图(上图)。相反,用递增量的LNA-miR-130a质粒处理以剂量反应方式增加报导体活性(下图)。
图12.此图强调葡萄糖代谢中的关键酶。通过RNA印迹分析,G6Pase和PEPCK的mRNA表达在稳定的表达miR-130a的HepG2细胞中减少。
图13.通过蛋白质印迹分析也检测到PEPCK和G6Pase的蛋白质表达减少。注意稳定的表达miR-130a的HepG2细胞中葡糖激酶(GCK)的水平增加,并且稳定的表达miR-130a的Huh7细胞中丙酮酸激酶(PKLR)的水平增加。
图14.通过RT-qPCR分析,稳定的表达miR-130a的细胞中PKLR和GCK特异性mRNA的水平增加。
图15.通过蛋白质印迹分析,在产生HBV的HepG2细胞(UP7-4和UP7-7)中PGC1α和葡萄糖异生酶PEPCK和G6Pase的蛋白质表达增加。但是,注意到PPARγ无显著改变。
图16.HepG2细胞中PPARγ的稳定表达减少葡萄糖输出,并且相反,PGC1α的表达刺激葡萄糖产生。
图17.稳定的HBV复制和PPARγ拮抗剂GW9662(20μM)可增加HepG2细胞中葡萄糖产生。
图18.在两种稳定的表达PGC1α的细胞系中miR-130a的表达不受影响。
图19.此图概括PGC1α、miR-130a和HBV之间的关系。+/-:既非正面也非阴性负面作用。
图20.上图:在表达PPARγ的HepG2细胞系中,使用茎环qPCR,观测到miR-130a的减少。U6snRNA用作内部对照。罗格列酮而非GW9662进一步减少miR-130a的表达。下图:通过蛋白质印迹,检测到稳定的表达PPARγ的HepG2细胞系中PPARγ蛋白质的量增加。
图21.此三元草图概括PPARγ、PGC1α、miR-130a和HBV之间的关系。HBV和PGC1α和PPARγ中前馈扩增回路可通过miR-130a中间物介导。
图22为展示治疗策略的示意性说明。
具体实施方式
本公开是基于miR-130a通过直接靶向其信使RNA的3′UTR下调PGC1α、PGC1β和PPARγ的意外发现。因而,miR-130微RNA(例如miR-130a和miR-130b)以及其拮抗miR可用于调节这些蛋白质并因此有效治疗与这些蛋白质中的一或多者相关的疾病(例如与ROS相关的疾病或与线粒体功能障碍相关的疾病)。并且,miR-130a对PGC1α(葡糖新生)和PPARγ(抑制葡糖新生)的同时作用可有助于葡萄糖稳态。
miR-130a RNA、miR-130b RNA或其拮抗miR可用于调节对应微RNA的活性并因此调节其标靶基因的表达。调节微RNA意谓在微RNA的标靶基因表达中影响微RNA的生物功能的任何方法。在一些实例中,调节微RNA为调节微RNA的细胞水平。在其它实例中,调节微RNA为调节(例如增强或阻断)其与微RNA标靶(例如mRNA或基因)的相互作用。
因此,本文描述用于与PGC1α、PGC1β或两者相关或治疗与所述蛋白质中的一或多者相关的疾病的方法,其使用miR-130a RNA、miR-130b RNA或两者或miR-130a或miR-130b的拮抗miR;以及用于本文所述的治疗和用于制造达成那些目的的药剂的医药组合物。miR-130b含有与miR-130a相同的AGUGCAA序列用于与标靶基因进行碱基配对。
微RNA分子
微RNA为在许多物种中发现的小的非编码RNA分子(例如22个核苷酸),其调节基因表达。miR-130a和miR-130b在许多物种中,例如人类中发现。例示性miR-130a和miR-130b(前驱物和成熟)的核苷酸序列可见于MiRBase的寄存编号M10000448(人类miR-130a)和MI0000748(人类miR-130b)。这些miRNA分子的示例性核苷酸序列提供于下文中:
人类miR-130a:
ugcugcuggc cagagcucuu uucacauugu gcuacugucu gcaccuguca
cuagcagugc aauguuaaaa gggcauuggc cguguagug(SEQ ID NO:3)
人类miR-130b:
ggccugcccg acacucuuuc ccuguugcac uacuauaggc cgcugggaag
cagugcaaug augaaagggc aucggucagg uc(SEQ ID NO:4)
如本文所述的miR-130a RNA为具有与野生型miR-130a,例如人类miR-130a相同的生物活性,例如调节PGC1α、PGC1β和/或PPARγ的表达的寡核苷酸(例如RNA分子)。此类寡核苷酸可包含miR-130a的核苷酸序列或其一部分(例如AGUGCAA或CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID NO:1))。miR-130a RNA可包括至多150个(例如100、80、60、50、40、30个或更少个)核苷酸残基。在一些实例中,miR-130a可为双螺旋RNA分子。在其它实例中,其可为发夹分子,所述发夹分子可包括21-23有义序列(例如CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID NO:1))、短连接子、与有义序列互补的反义序列和polyT尾。
如本文所述的miR-130b RNA为具有与野生型miR-130b,例如人类miR-130b相同的生物活性的寡核苷酸,例如RNA分子。因为miR-130b与miR-130a共享相同的序列用于与标靶基因进行碱基配对,所以miR-130b将具有与miR-130a相同的生物功能,例如调节PGC1α、PGC1β和/或PPARγ的表达。此类寡核苷酸可包含miR-130b的核苷酸序列或其一部分(例如AGUGCAA或CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU(SEQ IDNO:2))。miR-130b RNA可包括至多150个(例如100、80、60、50、40、30个或更少个)核苷酸残基。在一些实例中,miR-130b可为双螺旋RNA分子。在其它实例中,其可为发夹分子,所述发夹分子可包括21-23有义序列(例如CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU(SEQ ID NO:2))、短连接子、与有义序列互补的反义序列和polyT尾。
miR-130a或miR-130b的拮抗miR可为能够例如经由阻断标靶miRNA与标靶mRNA分子的结合遏制细胞中标靶(例如内源性)miR-130a或miR-130b的活性的工程化寡核苷酸。拮抗miR可为完全或部分与标靶miRNA或其一部分互补,例如在Ago2的裂解位点具有任一错配的小的合成寡核苷酸。其还可以包括一些修饰以抑制Ago裂解。在一些实例中,拮抗miR可包括至多150个(例如100、80、60、50、40、30个或更少)核苷酸残基。在一些实例中,拮抗miR可为微RNA海绵,其可为从强启动子表达并且含有多个与相关微RNA的串联结合位点的转录物。当编码这些海绵的载体短暂转染到培养的细胞时,海绵将至少与化学修饰的反义寡核苷酸同等强烈地遏制微RNA标靶。其特异性地抑制具有互补七聚种子的微RNA,使得单一海绵可用于阻断整个微RNA种子家族。RNA聚合酶II启动子(Pol II)驱动的海绵含有用于鉴别和分选经海绵处理的细胞的荧光报导基因。此类微RNA海绵的稳定表达可用于疾病治疗中。埃伯特等人,自然方法.2007年9月;4(9):721-6.电子版2007年8月12日(Ebert et a1.,Nat Methods.2007Sep;4(9):721-6.Epub 2007Aug 12)。
必要时,微RNA分子或其拮抗miR可包括非天然存在的核碱基、糖或共价核苷间键(主链)。此类经修饰的寡核苷酸赋予所希望的特性,例如增强的细胞吸收、提高的对标靶核酸的亲和力和增加的体内稳定性。
在一个实例中,本文所述的寡核苷酸/RNA分子具有经修饰的主链,包括保留磷原子的主链(参见例如美国专利第3,687,808号;第4,469,863号;第5,321,131号;第5,399,676号;和第5,625,050号)和不具有磷原子的主链(参见例如美国专利第5,034,506号、第5,166,315号和第5,792,608号)。含磷的经修饰的主链的实例包括(但不限于)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和具有3′-5′键或2′-5′键的硼烷磷酸酯。此类主链还包括具有反向极性的主链,即3′至3′、5′至5′或2′至2′键。不包括磷原子的经修饰的主链通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成。此类主链包括具有吗啉基键(部分由核苷的糖部分形成)的主链;硅氧烷主链;硫醚、亚砜和砜主链;甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链;亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链;核糖乙酰基主链;含有烯烃的主链;氨基磺酸酯主链;亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链;磺酸酯和磺酰胺主链;酰胺主链;以及其它具有混合N、O、S和CH2组成部分的主链。
在另一个实例中,本文所述的微RNA分子或拮抗miR分子包括一或多个经取代的糖部分。此类经取代的糖部分可在其2′位包括以下基团中的一者:OH;F;O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基;O-炔基、S-炔基、N-炔基和O-烷基-O-烷基。在这些基团中,烷基、烯基和炔基可为经取代或未经取代的C1到C10烷基或C2到C10烯基和炔基。其还可以在其2′位包括杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷基氨基、经取代的硅烷基、RNA裂解基团、报导基团、嵌入剂、用于提高寡核苷酸的药物动力学特性的基团或用于提高寡核苷酸的药效学特性的基团。优选的经取代的糖部分包括具有2′-甲氧基乙氧基、2′-二甲基氨基氧基乙氧基和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基的那些糖部分。参见马丁等人,瑞士化学学报,1995,78,486-504(Martin et a1.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504)。
在又一实例中,本文所述的微RNA分子或拮抗miR包括一或多个经修饰的天然核碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。经修饰的核碱基包括以下中所述的核碱基:美国专利第3,687,808号;高分子科学与工程科学的简明百科全书,第858-859页,克罗维兹编辑,约翰·威利父子公司,1990(The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.JohnWiley&Sons,1990);英格利希等人,应用化学国际版,1991,30,613(Englisch et al.,AngewandteChemie,International Edition,1991,30,613);和桑维,第15章,反义研究和应用,第289-302页,CRC出版社,1993(Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research andApplications,pages 289-302,CRC Press,1993)。这些核碱基中的某些尤其适用于增加微RNA分子对其靶向位点的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(例如2-氨基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。参见桑维等人编,反义研究和应用,CRC出版社,波卡拉顿,1993,第276-278页)。
在一些实例中,任一拮抗miR分子为锁核酸(LNA)。LNA为含有至少一种经修饰的RNA核苷酸的经修饰的RNA分子,其中核糖部分经连接2′氧和4′碳的额外桥修饰以便将核糖牢牢锁在3′内。参见例如詹森等人,新英格兰医学杂志368(18):1685-94(2013)(Janssen et al.,NEngl J Med.368(18):1685-94(2013));兰福德等人,科学327(5962):198-201(2010)(Lanford et al.,Science 327(5962):198-201(2010));希尔德布兰特-埃里克森等人,核酸治疗学22(3):152-61(2013)(Hildebrandt-Eriksen et al.,Nucleic AcidTher.22(3):152-61(2013));以及奥罗姆等人,基因372:137-41(2006)(Φrom et al.,Gene.372:137-41(2006))。在一些实施例中,如本文所述的LNA为针对miR-130a或miR-130b的经修饰的DNA硫代磷酸酯反义寡核苷酸。
任一本文所述的微RNA和拮抗miR可通过常规方法,例如化学合成或体外转录制备。如本文所述的其所期望生物活性可通过常规方法,例如以下实例中所述的方法检验。
miR-130或其拮抗miR调节PGC1α或PGC1β的用途
单独或组合的miR-130a RNA、miR-130b RNA或如本文所述的miR-130a或miR-130b的拮抗miR可用于调节PGC1α和/或PGC1β并治疗与所述蛋白质中的一者或两者相关的疾病。举例来说,miR-130a和/或miR-130b可用于下调PGC1α和/或PGC1β,因而有效治疗其中需要PGC1α和/或PGC1β下调的疾病。或者,miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或两者可用于上调PGC1α和/或PGC1β,因而有效治疗其中需要PGC1α和/或PGC1β上调的疾病。PGC1α可充当反应性氧物质(ROS)的解毒酶(圣皮尔等人,(2006)细胞127:第397-408页(St Pierre et al.,(2006)Cell 127:page 397-408))。ROS引起大量人类疾病,例如癌症、神经退化性疾病(帕金森氏病或亨廷顿氏病)、心力衰竭、肌肉功能障碍。因此,miR-130a或miR-130b的拮抗miR可用于治疗此类疾病。此类疾病的实例和其与PGC1α的相关展示图23中。
如本文所用,术语“治疗”是指向患有与PGC1α、PGC1β或两者相关的疾病、具有所述疾病的症状或具有患所述疾病的倾向性的个体施用或投与包括一或多种活性剂的组合物以治愈、医治、缓解、解除、改变、补救、减轻、改善或影响所述疾病、所述疾病的症状或患有所述疾病的倾向性。
为进行本文所述的方法,有效量的miR-130a RNA、miR-130b RNA或两者或有效量的miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或两者可接触其中需要PGC1α和/或PGC1β调节的细胞。在一些实施例中,所述方法可在体外,例如在培养的细胞中进行。
在其它实施例中,有效量的一或多种如本文所述的微RNA分子或拮抗miR可经由适合的途径投与需要治疗的个体。此类个体可为患有、怀疑患有与PGC1α、PGC1β或两者失调相关的疾病或处于其风险下的人类患者。在一些实施例中,疾病不与PPARγ相关。一或多种微RNA分子或拮抗miR可直接或间接(例如使用裸寡核苷酸或使用适于表达微RNA分子或拮抗miR的表达载体)投与需要治疗的个体。此类表达载体可通过将微RNA的一或多种核苷酸序列或一或多种拮抗miR插入适合的表达载体中来构筑,在表达载体中微RNA序列与适合的启动子可操作连接。
miR-130a RNA和miR-130b RNA中的一或多者或miR-130a RNA和miR-130b RNA的拮抗miR中的一或多者或适合于表达其的一或多种表达载体可与医药学上可接受的载剂混合以形成医药组合物。“可接受的载剂”为与组合物的活性成分相容(并且优选使活性成分稳定)并且对待治疗的个体无害的载剂。适合的载剂包括(但不限于)(a)用阳离子(例如钠、钾、铵、镁、钙)和多元胺(例如精胺和亚精胺)形成的盐;(b)用无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸)形成的酸加成盐;(c)用有机酸(例如乙酸、乙二酸、酒石酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、棕榈酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸)形成的盐;以及(d)由元素阴离子(例如氯、溴和碘)形成的盐。其它适合的载剂包括微晶纤维素、甘露糖醇、葡萄糖、脱脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉和其组合。参见例如雷明顿的药物科学,第18版,马克出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚州(1995)(Remington′s Pharmaceutical Sciences,Edition 18,Mack Publishing Co.,Easton,Pa(1995));以及古德曼和吉尔曼的“治疗学的药理学基础”,第十版,吉尔曼,哈得曼和利姆伯德编,麦格劳-希尔出版社,155-173,2001(Goodman and Gilman′s“The Pharmacological Basis ofTherapeutics”,Tenth Edition,Gilman,J.Hardman and L.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press,155-173,2001)。
为促进传递,微RNA分子、拮抗miR或其表达载体可与伴侣试剂结合。如本文所用,“结合”意谓两种实体相关联,优选亲和力足够实现两种实体之间的关联的治疗效益。结合包括共价或非共价键结以及关联的其它形式,例如一个实体陷于另一实体上或内,或任一或两个实体陷在第三个实体(例如胶束)上或内。
伴侣试剂可为天然存在的物质,例如蛋白质(例如人类血清白蛋白、低密度脂蛋白或球蛋白)、碳水化合物(例如聚葡萄糖、普鲁兰、甲壳素、聚葡萄胺糖、菊塘、环糊精或玻尿酸)或脂质。其也可以为重组或合成分子,例如合成聚合物,例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-顺丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物和聚磷嗪。
在一个实例中,伴侣试剂为胶束、脂质粒、纳米粒子或微球体,其中囊封微RNA分子或表达载体。用于制备此类胶束、脂质粒、纳米粒子或微球体的方法是本领域中众所周知的。参见例如美国专利第5,108,921号、第5,354,844号、第5,416,016号和第5,527,5285号。
在另一个实例中,伴侣试剂充当附接融合剂或缩合剂中一或多者的基质。
融合剂对局部pH值起反应。举例来说,在遇到内体内的pH值时,其可引起其紧靠环境的物理改变,例如渗透特性改变,此破坏或增加内体膜渗透性,从而促进本文所述的微RNA释放到宿主细胞的细胞质中。一种优选的融合剂改变电荷,例如在低于生理范围的pH值下(例如在pH 4.5-6.5下)变得质子化。融合剂可为含有能够在暴露于特定pH值范围时改变电荷(例如质子化)的氨基的分子。此类融合剂包括具有聚氨基链的聚合物(例如聚乙二亚胺)和膜分裂剂(例如蜂毒素)。其它实例包括聚组氨酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亚胺和聚缩醛物质(例如阳离子聚缩醛)。
缩合剂与任一微RNA、任一拮抗miR或用于表达其的任一表达载体相互作用,使其缩合(例如减少寡核苷酸尺寸),因此保护其避免降解。优选地,缩合剂包括经由例如离子相互作用与寡核苷酸相互作用的部分(例如带电部分)。缩合剂的实例包括聚赖氨酸、精胺、亚精胺、多元胺或其季盐、伪肽-多元胺、肽模拟多元胺、树枝状聚合物多元胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉和α螺旋肽。
在一些实施例中,有效量的miR-130a RNA、miR-130b RNA或其组合投与罹患、怀疑患有与异常上调的PGC1α、PGC1β或两者相关的疾病或处于其风险下的个体(例如人类患者)。此类疾病包括(但不限于)糖尿病和脂肪变性。参见图22。在一些实例中,微RNA或用于产生其的表达载体的量有效下调PGC1α、PGC1β或两者。
在其它实施例中,有效量的miR-130a或miR-130b的拮抗miR或用于产生其的表达载体投与罹患、怀疑患有与异常下调的PGC1α、PGC1β或两者相关的疾病或处于其风险下的个体(例如人类患者)。此类疾病包括(但不限于)与ROS相关的疾病(例如神经退化性疾病,例如帕金森氏病、亨廷顿氏病或阿尔茨海默病)、发炎、肌肉功能障碍、心血管疾病,例如心力衰竭。参见图22。在一些实例中,微RNA或用于产生其的表达载体的量有效上调PGC1α、PGC1β或两者。
如本文所用,“有效量”是指单独或与其它剂量或一或多种其它活性剂一起的微RNA分子、其拮抗miR或用于表达其的表达载体产生所需反应,例如增强或抑制PGC1α、PGC1β或两者和/或缓解目标疾病(例如本文所述的疾病)的一或多种症状的量。此可包括仅仅暂时减缓疾病的进展,不过更优选地,其包括永久中断疾病的进展。此可通过常规方法,例如体检和适合的实验室测试监测。对任一本文公开的目标疾病治疗的所需反应也可为延迟疾病发作或甚至阻止疾病发作。
如本领域的技术人员所认知,有效量可变化,取决于以下:所治疗的具体病状、病状严重程度、个别患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重)、治疗持续时间、并行疗法(如果存在)的性质、特定投药途径以及健康从业者的知识和专长范围内的类似因素。这些因素为本领域普通技术人员众所周知并且可仅用常规实验便可解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量,即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而本领域普通技术人员应了解,患者因医学原因、心理原因或实际上任何其它原因可坚持较低剂量或可耐受剂量。
本领域中众所周知动物与人类之间的剂量的相互关系(例如基于每平方米身体表面的毫克数或每一体重的毫克数)。参见例如弗赖雷克等人(1966)癌症化学治疗报告50:219(Freireich et al(1966)Cancer Chemother Rep 50:219)。体表面可大致地从患者的身高和体重确定。
需要上述治疗的个体可为罹患、怀疑患有任一本文所述的目标疾病或处于出现其风险下的个体(例如人类)。实例包括(但不限于)糖尿病(例如I型糖尿病、II型糖尿病以及例如视网膜病等与糖尿病相关的综合症)、与ROS相关的疾病,例如肌肉功能障碍、心力衰竭和神经退化性疾病(例如帕金森氏病、亨廷顿氏病)。此类个体可经由常规医疗程序,包括(但不限于)体检和病理分析来鉴别。糖尿病的常见症状包括(但不限于)频繁排尿、感觉口渴、感到饥饿、异常重量减轻或重量增加、疲乏和视觉模糊。此类个体可经由常规的医学程序鉴别。处于出现如本文所述的疾病,例如与ROS相关的疾病的风险下的个体具有一或多种与疾病或病症相关的风险因子。
医学领域普通技术人员已知的常规方法可用于向需要治疗的个体投与上述医药组合物。举例来说,上述医药组合物可经口或不经肠传递。不经肠投与包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注;或颅内投与(例如鞘内或脑室内)。
含有本文所述的微RNA分子、本文所述的拮抗miR或其表达载体的可注射组合物可含有各种载剂,例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、十四烷酸异丙酯、乙醇和多元醇(丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射来说,可通过滴注方法投与寡核苷酸,由此输注含有寡核苷酸和生理学上可接受的赋形剂的医药调配物。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5%右旋糖、0.9%生理盐水、林格氏溶液或其它适合赋形剂。肌肉内制剂,例如肽的适合可溶性盐形式的无菌调配物,可在例如无菌水、0.9%生理食盐水或5%葡萄糖溶液等医药赋形剂中溶解并且投与。
当经口投与时,优选地,寡核苷酸包括至少一种2′-O-甲氧基乙基修饰。用于经口投与的组合物可为任何口服可接受的剂型,包括(但不限于)胶囊、锭剂、乳液和水性悬浮液、分散液和溶液。在口服使用的片剂的情况下,常用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加如硬脂酸镁等润滑剂。对以胶囊形式经口投与来说,适用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当水性悬浮液或乳液经口投与时,活性成分可悬浮或溶解于与乳化剂或悬浮剂组合的油相中。必要时,可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。经鼻气溶胶或吸入组合物可根据医药调配领域中众所周知的技术来制备。本文所述的医药组合物也可呈用于直肠投药的栓剂形式投与。
试剂盒
本公开还提供了用于调节(例如抑制或增强)PGC1α、PGC1β和/或PPARγ或治疗如本文所述的疾病的与PGC1α、PGC1β或两者相关的疾病的试剂盒。此类试剂盒可包括一或多个包含一或多种微RNA分子、拮抗miR或其表达载体的容器。
在一些实施例中,试剂盒可包含根据本文所述方法中的任一者的使用说明书。所包括的说明书可包含投与微RNA、拮抗miR或其表达载体以治疗所希望的目标疾病的描述。试剂盒可进一步包含基于鉴别个体是否具有目标疾病,选择适合于治疗的个体的描述。
与如本文所述的微RNA或拮抗miR的使用相关的说明书大体上包括关于所期望治疗的剂量、给药时程和投与途径的信息。容器可为单位剂量、散装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。虽然本发明试剂盒中供应的说明书通常为在标记或药品说明书(例如试剂盒中包括的纸片)上的书面说明书,但机器可读说明书(例如磁盘或光盘存储盘上载有的说明书)也是可接受的。
标记或药品说明书指示组合物用于抑制或增强PGC1α、PGC1β或两者且用于治疗任一本文所述的目标疾病,可提供用于实施任一本文所述的方法。
本发明的试剂盒呈适合包装形式。适合的包装包括(但不限于)小瓶、瓶子、罐、柔性包装(例如密封的迈拉(Mylar)或塑料袋)等等。还涵盖用于与特定装置(例如吸入器、经鼻投药装置(例如雾化器)或输注装置(例如小型泵))组合的包装。试剂盒可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为如本文所述的微RNA分子或其表达载体。
试剂盒可任选地提供额外组分(诸如缓冲剂)和说明性信息。通常,试剂盒包含容器和在容器上或与容器相联的标记或药品说明书。在一些实施例中,本发明提供了包含上述试剂盒的内含物的制品。
在不进一步详细描述的情况下,相信本领域的技术人员可基于以上描述,最大程度地利用本发明。因此,以下特定实施例仅视为说明性的,并且决不以任何方式限制本发明的其余部分。本文中引用的所有公开案以引用的方式并入用于本文中提及的目的或主题。
实例:用MiR-130调节PGC1-α
材料与方法
miRNA质粒的构筑
如上所述,人类miRNA的序列从Ensembl数据库和miRbase(16版)检索得到。用于克隆全长前驱miRNA的引物序列在以下表1中列出:
表1.用于本研究的合成寡核苷酸和PCR引物的DNA序列
其它地方详述构筑miRNA表达载体的方法。陈H.L.等人,公共科学图书馆·综合7,e34116(2012)(Chen,H.L.et al.PloS one 7,e34116(2012))。PCR产物通过Hind III消化从TA克隆载体(RBC)亚克隆到pSuper(奥利工程公司(OligoEngine,Inc))。所有质粒都通过测序证实。通过转染和茎环RT-PCR分析检测大约8-400倍更高的微RNA表达水平。PPARγ和PGC1α表达载体来自复能基因(GeneCopoeia)。
抗体来源
抗HBc(达科公司(Dako))、抗PPARγ(圣克鲁兹(Santa Cruz))、抗GAPDH、抗PKLR、抗G6Pase、抗微管蛋白、抗脂肪细胞因子(台湾基因特斯(GeneTex,Taiwan))、抗PGC1α(傲锐基因(Origene))、抗PCK1(亚诺法(Abnova))、抗GCK(生物视野(Biovision)),二级抗体包括小鼠抗兔-HRP、山羊抗小鼠-HRP(台湾基因特斯(GeneTex,Taiwan))和驴抗山羊-HRP(圣克鲁兹)。
合成RNA
所用的合成miRNA(吉玛制药(Genepharma))为不具有修饰的RNA双螺旋。有义股与miRNA的成熟形式相同。模拟miR-130a(CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ IDNO:1))、模拟miR-204(UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(SEQ ID NO:65))、模拟miR-1236(CCUCUUCCCCUUGUCUCUCCAG(SEQ ID NO:66))、模拟阴性对照(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO:67))。针对PGC1α的siRNA寡核苷酸来自法玛克恩(Dharmacon)。
MiR-130a海绵
每个有义和反义寡核苷酸(参见以上表1)经设计以含有miR-130a的合成标靶位点的四个拷贝。退火的寡聚产物在PCR扩增前进行凝胶纯化。凝胶纯化的PCR产物在HindIII位点亚克隆到DsRedCl载体中。群落通过PCR筛选并且通过测序证实插入物的取向和标靶位点的拷贝数。
细胞培养
人类肝瘤Huh7和HepG2细胞如以下先前所描述维持:蔡等人,病毒学杂志84,2340-2351(2010)(Chua,P.K.,et al.Journal of virology 84,2340-2351(2010));勒·伯盖姆等人,病毒学杂志79,1871-1887(2005)(Le Pogam,S.,et al.,Journal of virology 79,1871-1887(2005))。一般来说,病毒复制的表现型和微RNA的作用在HepG2中比Huh7细胞中更强。但是,Huh7细胞易于传代和转染。因此,可互换使用此两个细胞系。
PPARγ促效剂和拮抗剂
罗格列酮和GW9662来自西格马(Sigma)。HepG2和Huh7细胞在6孔组织培养盘中以5×10个细胞/孔接种(奎斯多夫等人,病毒性肝炎杂志17,527-536(2010)(Quasdorff,M.et al.Journal of viral hepatitis 17,527-536(2010)))。在转染24小时后,含罗格列酮或GW9662的0.1%DMSO添加到培养基。在采集前两天不时改变培养基。
ELISA
分泌的脂肪细胞因子的浓度通过ELISA(生物视野)测量。HBsAg和HBeAg的ELISA来自台湾的通用生物制品有限公司(General Biologicals Co.,Taiwan)。
测量葡萄糖产生
使用DRI-CHEM SLIDE GLU-PIII试剂盒(日本富士(FUJIFILM,JAPAN))测量HBV转基因小鼠的葡萄糖含量。十微升小鼠血清沉积在富士DRI-CHEM SLIDE GLU-PIII上。葡萄糖氧化酶(GOD)催化样品葡萄糖氧化,产生过氧化氢,接着过氧化氢与染料前驱物反应并形成红色染料。光学反射密度在505nm下通过富士DRI-CHEM分析器测量并转化为葡萄糖浓度(mg/L)。为测量细胞培养物中的葡萄糖浓度,产生HBV的细胞(HepG2和Q7细胞)用PPARγ拮抗剂GW9662在指示浓度下处理。在葡萄糖测量前二十四小时,培养基被1ml补充有2mM丙酮酸钠的无葡萄糖的DMEM替换。在培育16小时后,收集50μl培养基且使用葡萄糖比色分析(生物视野(Biovision))测量葡萄糖浓度(mM)。
定量实时PCR
简单来说,在37℃下2μg总RNA使用随机引物和高容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统(Applied Biosystem))逆转录成cDNA,历时120分钟。接着cDNA产物稀释100倍,使用Power SYBR绿色PCR主混合物(应用生物系统)和默认条件,在20μl反应体积中通过应用生物系统7500实时PCR系统进行实时PCR分析。通过相对定量方法(ΔΔCt方法)使用7500软件V2.0.1分析数据。
miRNA的茎环qCR
塔克曼(Taqman)RT和茎环实时分析来自应用生物系统公司:miR-31(分析ID:002279)、miR-130a(分析ID:000454)、miR-204(分析ID:000508)和miR-1236(分析ID:002752)。简单来说,100ng RNA通过特定茎环引物逆转录并且通过塔克曼实时PCR分析使用默认设置进一步分析。U6snRNA(分析ID:001973)用作内部内参考物。数据通过应用生物系统公司7500软件V2.0.1分析。
DNA和RNA印迹
HBV核心粒子相关DNA、总细胞质RNA和微RNA通过如先前所描述的RNA印迹分析。蔡等人,病毒学杂志84,2340-2351(2010);勒·伯盖姆等人,病毒学杂志79,1871-1887(2005)。
荧光素酶报导体分析
3′UTR或增强子/启动子的分析如先前所描述。陈H.L.等人,公共科学图书馆·综合7,e34116(2012)。
天然琼脂糖凝胶电泳和蛋白质印迹
用于检测HBV核心粒子的天然琼脂糖凝胶电泳和蛋白质印迹如所描述。蔡等人,病毒学杂志84,2340-2351(2010)。
稳定的表达miR-130a的细胞系
大约一百万的Huh7和HepG2细胞经3μg质粒DNA(pSuper和pSuper-miR-130a)与Polyjet(西格纳金(SignaGen))短暂转染,接着进行G418选择,历时三周。将G418抗性群落汇集在一起。
LNA-miR-130a阻断基因表现
HepG2和Huh7细胞与抗嘌呤霉素质粒(pTRE2pur)和LNA-加扰对照或LNA抗miR-130a(锁核酸,艾斯昆(Exiqon)),使用脂染胺2000(英杰公司(Invitrogen))共转染。转染后十二小时,经转染的培养物用嘌呤霉素(2μg/ml)处理2天,接着降低嘌呤霉素浓度(0.5μg/ml),2天后,采集用于蛋白质印迹分析。陈H.L.等人,公共科学图书馆·综合7,e34116(2012)。
生物信息学分析
包括Targetscan(http://www.targetscan.org/)、Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)、Microinspector(http://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/)、RNAhybrid(http://www.bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/)和DIANA(http://diana.cslab.ece.ntua.gr)在内的基于计算机的程序用于预测miR-1236、miR-130a和miR-204的可能标靶。小于-20kcal/mol的最低结合自由能用作截止值。
微RNA塔克曼低密度阵列分析
通过Trizol(英杰公司)提取产生HBV的细胞的总RNA。通过安捷伦(Agilent)2100生物分析仪,使用RNA 6000纳米试剂盒(安捷伦技术公司(Agilent Technologies,Inc.))测定RNA样品的品质和数量。使用塔克曼微RNA反转录试剂盒(应用生物系统)进行反转录反应。miRNA的表达通过啮齿动物微RNA阵列A(应用生物系统公司)检测,并通过含有381个啮齿动物miRNA标靶的应用生物系统公司7900HT快速实时PCR系统分析。
统计数据
使用史都登氏t检验测定统计显著性。在所有图中,值表示为平均值±标准偏差(SD)并且统计显著性(p<0.05)通过星号指示。数据表示来自至少三个独立实验的结果。
结果
MiR-130a直接靶向PGC1a与PPARγ二者
四种不同标靶预测算法用于鉴别肝细胞中miR-130a的潜在标靶转录因子。PPARGC1-α(PGC1α)鉴别为通过所有四种程序一致预测3′UTR的此类因子(表2)。
表2.已知影响HBV转录的人类转录因子的3′UTR处miR-130a标靶位点的预测
转录因子£ | 标靶扫描 | PicTar | DIANA | RNAhybrid |
HNF1 | + | - | - | - |
HNF4α | + | - | - | - |
C/EBPα | - | - | - | - |
C/EBPβ | - | - | - | - |
SP1 | + | - | + | - |
RXRα | + | - | + | - |
PPARα | + | - | - | - |
PPARγ | + | - | - | + |
FoxA3(HNF3γ) | - | - | - | - |
FoxO1 | - | - | - | - |
FXRα | - | - | - | - |
PGC1a | + | + | + | + |
ERRα | - | - | - | - |
COUP-TF | - | - | - | - |
LRH | - | - | - | - |
£在文献5、6、38中已经报导了这些转录因子与HBV RNA合成有关。MiR-130a展示在脂肪细胞中靶向PPARγ的3′UTR。李等人,分子细胞生物学31,626-638(2011)(Lee,E.K.et al.Mol Cell Biol31,626-638(2011))。
为阐明miR-130a与PGC1α之间的潜在关系,建立表达miR-130a的稳定细胞系(图1)。虽然此处检验的大部分肝转录因子的表达水平在表达miR-130a的细胞系中保持不变,但观测到PPARγ和PGC1αmRNA和蛋白质同时减少(图2、3和4),此表明miR-130a可靶向PPARγ和PGC1α二者。已知PPARγ刺激脂肪细胞因子产生。余等人生物化学杂志278,498-505(2003)(Yu et al.The Journal of biological chemistry 278,498-505(2003))。如所预期,分泌的脂肪细胞因子在表达miR-130a的细胞系中显著减少(图5)。在反向实验中,HepG2细胞用LNA-miR-130a拮抗mir处理,并且观测到PGC1αmRNA和蛋白质显著增加(图6)。根据此发现,陈等人,基因疗法14,11-19(2007))(Chen,C.C.et al.Genetherapy 14,11-19(2007))中所述,在转基因小鼠中miR-130a显著减少,而PGC1α、G6Pase、PEPCK、PPARγ和血清脂肪细胞因子都显著增加(图7)。因此,miR-130a可通过降低其相应mRNA水平(图2、6)来降低PPARγ和PGC1α蛋白质水平(图3)。有趣地,PPARγ与PGC1α的组合在不存在任何外源性配体下对脂肪细胞因子的分泌显示显著的协同效应(图8)。
为区别miR-130a对降低PGC1αmRNA的直接与间接机制,使用来自PPARγ或PGC1α的3′UTR进行报导体分析。结果证明miR-130a与PPARγ或PGC1α的3′UTR之间的功能相互作用(图9)。然后,补偿性突变引入到miR-130a的种子序列和对PGC1α的其进化上保守的标靶位点(图10)。通过共转染分析,仅仅突变体miR-130a与突变体PGC1α的组合可成功地恢复miR-130a对荧光素酶活性的抑制作用。以剂量依赖性方式,miR-130a可降低,而LNA-miR-130a可增加,含有PGC1α的3′UTR的报导体的荧光素酶活性(图11)。综合而言,miR-130a可直接靶向PGC1α和PPARγ二者。
肝葡糖新生和脂肪生成中的MiR-130a
miR-130a双重靶向PGC1α和PPARγ强烈表明其在能量代谢中的重要作用。使用稳定的表达miR-130a的细胞检验糖酵解、葡糖新生和脂肪生成中若干关键代谢酶(图12,上图)。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)为已知在PGC1α的正面控制下的速率限制葡萄糖异生酶,尹等人,自然413,131-138(2001)(Yoon,J.C.et al.Nature 413,131-138(2001))。因为PGC1αmRNA和蛋白质在表达miR-130a的细胞中减少(图2和3),预期PEPCK和G6Pase也应减少。实际上,在表达miR-130a的肝细胞中观测到PEPCK和G6Pase mRNA(图12)和蛋白质(图13)同时减少。虽然此结果提出糖酵解而非葡糖新生途径,但如果其糖分解对应部分、丙酮酸激酶(PKLR)和葡糖激酶(GCK)不同时减少,那么其将更确定(图14)。实际上,在HepG2或Huh7细胞中GCK和PLKR的蛋白质表达不减少,而是增加(图13)。此外,在表达miR-130a的肝细胞中观测到GCK和PLKR的mRNA表达增加(图14)。这些结果表明miR-130a不仅可抑制HBV复制,而且也有助于在肝细胞中经由PGC1α下调葡糖新生和上调糖酵解。因此,miR-130a在与糖酵解失调关联的疾病和病症,例如代谢疾病中将是有效的。
代谢三要素
HBV可对PGC1α和PPARγ发挥作用。与miR-130a减少一致,在产生HBV的UP7-4和UP7-7细胞中PGC1α、PEPCK、G6Pase、PPARγ和分泌的脂肪细胞因子蛋白质都显著增加(图15)。类似地,葡萄糖产生在稳定的产生PGC1α的细胞中显著增加,并且在产生PPARγ的细胞中减少(图16)。在对照与产生miR-130a的细胞之间未检测到葡萄糖水平显著差异。如所预期,葡萄糖水平在产生HBV的HepG2细胞中增加,并且当HepG2细胞用PPARγ拮抗剂GW9662处理时进一步增加,与其产生HBV的状态无关(图17)。最终,在稳定的表达PGC1a的细胞系中miR-130a表达无明显改变(图18)。
HBV、miR-130a和PGC1α之间的三元关系概述在图19中。与PGC1α对比,miR-130a的表达在稳定的表达PPARγ的细胞系中减少,并且通过罗格列酮处理,进一步减少,但通过GW9662未进一步减少(图20)。这些结果表明具有正前馈回路的另一三元图(图21)。通过此回路接收的初级弱信号可扩大成更强的表现型结果。
论述
miR-130a的最突出特征为其双重靶向PPARγ和PGC1α(图2、3和5、9、10),导致HBV复制减少。相反,HBV可减少miR-130a的表达(表2),导致PPARγ(脂肪细胞因子)和PGC1α(PEPCK和G6Pase)的表达增加(图12、13和15)。PPARγ的过表达降低miR-130a的水平,并且通过罗格列酮(图20),或PPARγ与PGC1α组合观测到miR-130a进一步减少。综合而言,建立HBV、miR-130a、PGC1α和PPARγ之间的正前馈回路(图21)。此三元回路可通过经历此回路重复回合,在理论上放大弱的初级信号。
其它实施例
本说明书中公开的所有特征可以任何组合形式组合。本说明书中公开的每个特征可经用于达成相同、等效或类似目的的替代性特征置换。因此,除非另外明确陈述,否则所公开的每个特征仅为一系列通用的等效或类似特征的一个实例。
从以上论述中,本领域普通技术人员可容易地确定本发明的基本特征,并且在不背离其精神和范围的情况下,可进行本发明的不同变化和修改以使本发明适于不同用途和条件。因此,其它实施例亦属于权利要求书内。
Claims (28)
1.一种用于治疗与PGC1α或PGC1β相关的疾病的医药组合物,所述医药组合物包含有效量的一或多种寡核苷酸和医药学上可接受的,其中所述一或多种寡核苷酸为∶
(a)miR-130a RNA、miR-130b RNA或其组合;或
(b)miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其组合。
2.根据权利要求1所述使用的医药组合物,其中所述一或多种寡核苷酸为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述使用的医药组合物,其中所述寡核苷酸为miR-130a RNA或miR-130b RNA,其包含AGUGCAA的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述使用的医药组合物,其中所述miR-130a RNA包含CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU的核苷酸序列(SEQ ID NO:l)。
5.根据权利要求3所述使用的医药组合物,其中所述miR-130b RNA包含CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述使用的医药组合物,其中所述一或多种寡核苷酸为miR-130a RNA、miR-130b RNA或其组合;并且所述医药组合物用于治疗糖尿病或脂肪变性。
7.根据权利要求1至5中任一权利要求所述使用的医药组合物,其中所述一或多种寡核苷酸为miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其组合;并且所述医药组合物用于治疗与反应性氧物质ROS相关的疾病或糖尿病。
8.根据权利要求7所述使用的医药组合物,其中所述医药组合物用于治疗神经退化性疾病、心血管疾病、发炎或肌肉功能障碍。
9.根据权利要求8所述使用的医药组合物,其中所述神经退化性疾病为帕金森氏病(Parkinson disease)、亨廷顿氏病(Hungtinton disease)或阿尔茨海默病(Alzheimerdisease)。
10.根据权利要求8所述使用的医药组合物,其中所述心血管疾病为心力衰竭。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述使用的医药组合物,其中所述一或多种寡核苷酸为miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其组合,并且其中所述拮抗miR为微RNA海绵或锁核酸。
12.一种用于调节PGC1α或PGC1β的方法,其包含使细胞接触有效量的以下各物∶
(c)miR-130a RNA、miR-130b RNA或其组合;或
(d)miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其组合。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述细胞接触有效下调PGC1α或PGC1β的量的所述miR-130a、所述miR-130b或其组合。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法,其中所述miR-130a RNA、所述miR-130b RNA或两者为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。
15.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法,其中所述miR-130a RNA或所述miR-130b RNA包含AGUGCAA的核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述miR-130a RNA包含CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述miR-130b RNA包含CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
18.根据权利要求12所述的方法,其中所述细胞接触有效上调PGC1α或PGC1β的量的miR-130a的拮抗miR、miR-130b的拮抗miR或其组合。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述miR-130a的拮抗miR、所述miR-130b的拮抗miR或两者为双螺旋RNA分子或单股RNA分子。
20.根据权利要求12至19中任一权利要求所述的方法,其中所述接触步骤通过向有需要的个体投与有效量的所述miRNA中的一者或两者或所述拮抗miR中的一者或两者进行。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述个体投与所述miR-130a、所述miR-130b或其组合。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述个体患有或怀疑患有糖尿病或脂肪变性。
23.根据权利要求20所述的方法,其中所述个体投与所述miR-130a的拮抗miR、所述miR-130b的拮抗miR或其组合。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述个体患有或怀疑患有与反应性氧物质ROS相关的疾病。
25.根据权利要求23所述的方法,其中所述与ROS相关的疾病选自由肌肉功能障碍、心力衰竭和神经退化性疾病组成的群组。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述神经退化性疾病为帕金森氏病、亨廷顿氏病或阿尔茨海默病。
27.根据权利要求23所述的方法,其中所述个体患有或怀疑患有糖尿病或发炎。
28.根据权利要求12至27中任一权利要求所述的方法,其中所述miR-130a的拮抗miR、所述miR-130b的拮抗miR或两者为微RNA海绵或锁核酸LNA。
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