WO2017082202A1 - 抗ウイルス薬 - Google Patents

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cell
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橋本　真一
周一 金子
政夫 本多
尚芳 白崎
山下　太郎
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Ｉｄａｃセラノスティクス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a novel antiviral drug.
  • Hepatitis B virus Hepatitis B virus
  • HBV Hepatitis B virus
  • IFN interferon
  • nucleic acid analogues are used in the treatment of hepatitis B caused by HBV, but it is difficult to completely eliminate the virus even in long-term administration cases.
  • problems such as the emergence of resistant viruses and acute exacerbations, and the seriousness of re-deterioration after administration.
  • HBV cccDNA is a bare closed circular HBV DNA, which is known to exist in the nucleus of hepatocytes and act as a replication intermediate during virus growth (Non-patent Document 1). HBV cccDNA behaves like the human genome in hepatocytes and stays in the nucleus.
  • HBV cccDNA is not directly affected by nucleic acid analogs of antiviral drugs and remains in hepatocytes after nucleic acid analog treatment.
  • existing drugs cannot completely eliminate the HBV viral genome from hepatocytes, and it is considered impossible to completely cure HBV infection (Non-patent Document 2).
  • HBV cccDNA Since HBV cccDNA has the property of staying in cells after HBV infection, it has recently been attracting attention as a marker for antiviral drug long-term prognosis and liver damage. However, the mechanism of HBV maintenance in vivo after infection has not yet been elucidated, and the behavior of HBV cccDNA has not been clarified. As a drug focused on HBV ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ cccDNA, there is a report of an artificial DNA nuclease that targets HBV cccDNA itself (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a novel antiviral drug.
  • DOCK11 gene, LIPG gene, DENND2A gene, and HECW2 gene are specifically expressed in HBVBmRNA positive hepatocytes, and further by inhibiting the expression of these genes.
  • a substance that can suppress the expression or activity of the protein encoded by these genes, focusing on the decrease in the amount of HBV cccDNA in hepatocytes and that these genes may be involved in the infection and proliferation mechanisms of viruses in general. was able to be used as an antiviral agent, and the present invention was achieved.
  • an antiviral agent comprising as an active ingredient a substance capable of suppressing the expression of a target gene or the activity of a protein encoded by the target gene, wherein the target gene is a gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in a host cell
  • An antiviral agent wherein the target gene is one or more genes selected from the group consisting of DOCK11 gene, LIPG gene, DENND2A gene, and HECW2 gene.
  • the substance capable of suppressing the expression of the target gene or the activity of the protein encoded by the target gene is selected from the group consisting of shRNA, siRNA, miRNA, antisense oligonucleotide, and pyrrole-imidazole polyamide for the target gene or its transcript 3.
  • the antiviral agent according to any one of the preceding items 1 to 4, wherein the substance capable of suppressing the expression of the target gene or the activity of the protein encoded by the target gene is an shRNA comprising a base sequence selected from any of the following: ⁇ CCGGCCAACAGGGTGCTTACATATTCTCGAGAATATGTAAGCACCCTGTTGGTTTTTG (SEQ ID NO: 1) ⁇ CCGGGTACTAGACACCATATCATTTCTCGAGAAATGATATGGTGTCTAGTACTTTTTG (SEQ ID NO: 2) ⁇ CCGGACTAAATGAGCGGCTAATTAACTCGAGTTAATTAGCCGCTCATTTAGTTTTTTG (SEQ ID NO: 3) ⁇ CCGGTGATGGCCATAACCCATTAATCTCGAGATTAATGGGTTATGGCCATCATTTTTG (SEQ ID NO: 4) ⁇ CCGGCCAGGCTACTTGAATCTGAATCTCGAGATTCAGATTCAAGTAGCCTGGTTTTTG (SEQ ID NO: 5) ⁇
  • the viruses are hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis A virus, hepatitis E virus, influenza virus, human immunodeficiency virus, RS virus, papilloma virus, adenovirus, poliovirus, echovirus, coxsackie virus, enterovirus, Rhinovirus, rotavirus, norovirus, newcastle disease virus, mumps virus, vesicular stomatitis virus, rabies virus, lassa fever virus, measles virus, rubella virus, filovirus, ebola virus, japanese encephalitis virus, yellow fever virus, dengue virus, 6.
  • the antiviral agent according to any one of 1 to 5 above which is a virus selected from West Nile virus and Zika virus. 7). 7. The antiviral agent according to any one of 1 to 6 above, wherein the virus is a hepatitis virus. 8). 8. The antiviral agent according to any one of 1 to 7 above, wherein the virus is hepatitis B virus. 9. 9. The antiviral agent according to any one of 1 to 8 above, which is used in combination with a virus growth inhibitor. 10. 10.
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease associated with viral infection comprising the antiviral agent according to any one of 1 to 9 above. 11.
  • a gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in a host cell wherein one or two or more genes selected from the group consisting of DOCK11 gene, LIPG gene, DENND2A gene, and HECW2 gene are used as target genes and tested
  • a method for screening an antiviral drug comprising selecting, from among substances, a substance capable of suppressing the expression of a target gene or the activity of a protein encoded by the target gene as an antiviral drug.
  • the method for screening an antiviral agent according to item 11, comprising the following steps (A) to (C): (A) contacting the cell with a test substance in a system in which the cell expresses the target gene; (B) The amount of target gene expression in the cell is measured, and the amount of target gene expression in the cell when the test substance is contacted and the amount of target gene expression in the cell when the test substance is not contacted Comparing steps; (C) A step of screening a test substance that causes a decrease in the expression level of a target gene in a cell as an antiviral drug based on the comparison result of (B) above. 13.
  • the method for screening an antiviral agent comprising the following steps (a) to (c): (A) contacting the protein encoded by the target gene with the protein that interacts with the protein encoded by the target gene in the presence of the test substance; (B) Measure the binding ability of the protein encoded by the target gene and the protein that interacts with the protein encoded by the target gene, and determine the binding ability in the presence of the test substance and the binding ability in the absence of the test substance. Comparing steps; (C) A step of selecting, as an antiviral agent, a test substance that causes a decrease in the binding ability between the protein encoded by the target gene and the protein that interacts with the protein encoded by the target gene based on the comparison result of (b) above. .
  • the method for screening an antiviral agent according to item 11, comprising the following steps (a) to (c): (A) contacting the protein encoded by the target gene with the substrate of the protein encoded by the target gene in the presence of the test substance; (B) measuring the enzyme activity of the protein encoded by the target gene, and comparing the enzyme activity in the presence of the test substance with the enzyme activity in the absence of the test substance; (C) A step of selecting, as an antiviral agent, a test substance that causes a decrease in the enzyme activity of the protein encoded by the target gene based on the comparison result of (b) above. 15. 15. An antiviral drug screened by the screening method for an antiviral drug according to any one of items 11 to 14. 16.
  • a method for detecting a gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in a host cell comprising the following steps: (1) establishing a virus-positive cell line from a virus-positive specimen tissue collected from a single living body; (2) subculturing a virus positive cell line to produce a virus positive cell and a virus negative cell; (3) analyzing the expression patterns of two or more finite number of genes in each single cell for the virus positive cells and virus negative cells obtained in step (2); (4) a step of comparing a gene expression pattern of a virus positive cell with a gene expression pattern of a virus negative cell; (5) A step of selecting a gene whose expression level is higher in a virus-positive cell than a virus-negative cell as a gene having an action of maintaining a virus-derived
  • the virus expresses a transcription product containing poly A at the 3 ′ end from a virus-derived gene, By analyzing the gene expression pattern in step (3), a cell expressing a virus-derived gene is identified as a virus-positive cell, and a cell expressing a virus-derived gene is identified as a virus-negative cell. 18.
  • the virus is hepatitis B virus,
  • the gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in a host cell is a gene having an action of maintaining a hepatitis B virus-derived cccDNA in the host cell. 19.
  • a method for screening an antiviral drug comprising selecting a substance that can be suppressed as an antiviral drug.
  • An antiviral drug whose target ingredient is a gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in a host cell and whose active ingredient is a substance capable of suppressing the expression of the target gene or the activity of the protein encoded by the target gene.
  • An antiviral drug whose target gene is the Cdc42 gene.
  • the antiviral agent according to A) or B) above, wherein the substance capable of suppressing the expression of the target gene or the activity of the protein encoded by the target gene is a shRNA comprising a base sequence selected from any of the following: : ⁇ CCGG CCAAGAACAAACAGAAGCCTA CTCGAGTAGGCTTCTGTTTGTTCTTGGTTTTTG (SEQ ID NO: 55) ⁇ CCGG CGGAATATGTACCGACTGTTT CTCGAGAAACAGTCGGTACATATTCCGTTTTTG (SEQ ID NO: 56) ⁇ CCGG CCCTCTACTATTGAGAAACTT CTCGAGAAGTTTCTCAATAGTAGAGGGTTTTTG (SEQ ID NO: 57) ⁇ CCGG CAGATGTATTTCTAGTCTGTT CTCGAGAACAGACTAGAAATACATCTGTTTTTG (SEQ ID NO: 58) CCGG GACTCTGTAACAGACTAATTG CTCGAGCAATTAGTCTGTTACAGAG
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease associated with a viral infection comprising the antiviral agent according to any one of A) to C) above.
  • a method for screening an antiviral drug comprising selecting a substance capable of suppressing expression or activity of a protein encoded by a target gene as an antiviral drug.
  • the antiviral agent of the present invention has a different mechanism of action from conventional antiviral agents, and is considered to act on the transport pathway until the virus reaches the nucleus after entering from the membrane on the surface of the host cell. Therefore, it is considered that the antiviral agent of the present invention exhibits an antiviral effect on not only HBV but also various viruses. Further, the antiviral agent of the present invention is considered to synergistically exert an antiviral effect when used in combination with a conventional antiviral agent. Furthermore, by using the target gene of the present invention as an index, antiviral drugs based on a novel mechanism can be screened.
  • the antiviral agent of the present invention can significantly reduce the amount of HBV cccDNA in hepatocytes compared to, for example, conventional hepatitis B virus growth inhibitors, and can be completely removed. Furthermore, the antiviral agent of the present invention can synergistically remove HBV cccDNA and prevent reactivation of HBV when used in combination with a conventional hepatitis B virus growth inhibitor. That is, it is considered that the antiviral agent of the present invention can contribute to the cure of HBV infection.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having confirmed the influence on the expression level (A) of a DENND2A gene, the amount of HBV (DNA) (B), and the amount of HBV (cccDNA) (C) when various shRNA of a DENND2A gene is introduce
  • the expression level in (A) is expressed as a relative value when the control is 1.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having confirmed the influence on the expression level (A) of a LIPG gene, the amount of HBV DNA (B), and the amount of HBV cccDNA (C) when various shRNAs of the LIPG gene are introduced into HBV-infected hepatoma cells. .
  • the expression level in (A) is expressed as a relative value when the control is 1.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having confirmed the influence on the expression level (A) of a HECW2 gene, the amount of HBV DNA (B), and the amount of HBV cccDNA (C) when various shRNAs of the HECW2 gene are introduced into HBV-infected hepatoma cells. .
  • the expression level in (A) is expressed as a relative value when the control is 1.
  • Example 2 In the HBV infection system for human hepatocytes, when the shRNA of DOCK11 gene is introduced, the amount of HBV DNA (A), the amount of HBV cccDNA (B), pregenomic RNA (hereinafter simply referred to as “pg RNA”. “Is also referred to as“ preg RNA ”.) Is a diagram showing the results of confirming the effect on the expression level (C).
  • the expression level in (C) is expressed as a relative value when the control is 1.
  • Example 3 Results of confirming the effects of DENND2A gene shRNA on the amount of HBV ⁇ DNA (A), HBV cccDNA (B), and pg RNA expression (C) when shRNA of DENND2A gene is introduced into human hepatocytes
  • FIG. The expression level in (C) is expressed as a relative value when the control is 1.
  • Example 3 In HBV infection system to human hepatocytes, when LIPG gene shRNA was introduced, the results confirmed the effects on HBV DNA level (A), HBV cccDNA level (B), and pg RNA expression level (C) FIG.
  • the expression level in (C) is expressed as a relative value when the control is 1.
  • Example 3 Results of confirming the effects of HECV2 gene shRNA on the amount of HBV DNA DNA (A), HBV cccDNA (B), and pg ⁇ RNA expression (C) when shRNA of the HECW2 gene is introduced into human hepatocytes
  • FIG. The expression level in (C) is expressed as a relative value when the control is 1.
  • Example 3 In the HBV infection system to human hepatocytes, the expression level of DOCK11 gene (A), HBV cccDNA level (B), and pg RNA expression level (C) when DOCK11 gene shRNA is introduced and cultured for a long time It is a figure which shows the result which confirmed the influence.
  • the expression level in (A) and (C) is expressed as a relative value when the value (cont 1) infected with HBV is set to 1.
  • Example 4 In the HBV infection system for human hepatocytes, the expression level of DENND2A gene (A), HBV cccDNA amount (B), and pg RNA expression level (C) when shRNA of DENND2A gene is introduced and cultured for a long time It is a figure which shows the result which confirmed the influence.
  • the expression level in (A) and (C) is expressed as a relative value when the value (cont 1) infected with HBV is set to 1.
  • Example 4 In the HBV infection system to human hepatocytes, the expression level of LIPG gene (A), HBV cccDNA amount (B), pg RNA expression level (C) when shRNA of LIPG gene shRNA is introduced and cultured for a long time It is a figure which shows the result of having confirmed the influence on ().
  • the expression level in (A) and (C) is expressed as a relative value when the value (cont 1) infected with HBV is set to 1.
  • Example 4 In the HBV infection system for human hepatocytes, when HECW2 gene shRNA is introduced and cultured for a long time, the expression level of HECW2 gene (A), HBVHcccDNA amount (B), and pg RNA expression level (C) It is a figure which shows the result which confirmed the influence. In addition, the expression level in (A) and (C) is expressed as a relative value when the value (cont 1) infected with HBV is set to 1.
  • Example 4 It is a figure which shows the result of having measured the amount of HBV cccDNA when the HBV positive hepatocellular carcinoma cell line (KM cell line) is passaged for 10 passages and 32 passages.
  • Example 1 The effects on the amount of HBV (DNA (A), HBV cccDNA (B), and pg RNA expression (C) when the DOCK11 gene is knocked down by genome editing in a human hepatocyte HBV infection system It is a figure which shows the confirmed result.
  • the expression level in (C) is expressed as a relative value when the control is 1.
  • Example 5 In the HBV infection system for human hepatocytes, the expression level of DOCK11 gene (A), HBV cccDNA level (B), and pg RNA expression level when shRNA of DOCK11 gene is introduced after HBV infection and cultured for a long time ( It is a figure which shows the result which confirmed the influence on C).
  • the expression levels in (A) and (C) are expressed as relative values when the control (sh cont) is 1, respectively.
  • Example 6 It is a photograph figure which shows the result of having confirmed the localization of various proteins with the indirect immuno-staining method about the human hepatocellular carcinoma cell line established from the hepatitis B positive hepatocellular carcinoma patient.
  • Example 7 The effect on the expression level of DOCK11 gene (A) and the relative value of HCV amount (B) when culturing with introduction of shRNA of DOCK11 gene in hepatitis C virus (HCV) infection system to human hepatocytes It is a figure which shows the confirmed result.
  • the expression level is expressed as a relative value when the control (Cont shRNA) is 1.
  • Example 8 It is a figure which shows the library of the pyrrole imidazole polyamide which couple
  • Example 10 It is a figure which shows the result of having confirmed the influence on the DNA amount (A) of HBV, and the amount of HBV cccDNA (B) when shRNA of Cdc42 gene is introduced in the HBV infection system to human hepatocytes.
  • Example 11 It is a figure which shows the result of having confirmed the behavior of the nucleoprotein of influenza virus at the time of introduce
  • Example 12 It is a figure which shows the result of having confirmed the behavior of the nucleoprotein of influenza virus at the time of introduce
  • HBV mRNA human hepatocellular carcinoma cell lines (Hepatocellular carcinoma, HCC) established from hepatitis B positive hepatocellular carcinoma patients. It was confirmed. So far, cultured cells that express HBV mRNA have been produced by transiently infecting limited cells that can be infected with HBV, and there is no cell model that can be persistently infected. HBV mRNA is expressed from living organisms. It was not thought that the cell to do could be established as a cell line. In the cell lines confirmed by the present inventors, although HBV mRNA positive cells are reduced by passage, there are still a few cells that are positive for HBV mRNA.
  • HBV mRNA-positive cells may have an HBV mRNA maintenance mechanism, and it was considered that the genes involved in HBV mRNA maintenance could be identified by studying HBV mRNA-positive cells. Then, as a result of analyzing human hepatocellular carcinoma cells established from hepatitis B positive hepatocellular carcinoma patients by the comprehensive 1-cell gene expression analysis method (PCT / JP2015 / 60841) established by the present inventors, Only one cell in the cell expresses HBV mRNA, and in the HBV mRNA positive cell, DENND2A gene, LIPG gene, Dock11 gene, and HECW2 gene are highly expressed compared to other cells. It was confirmed.
  • PCT / JP2015 / 60841 1-cell gene expression analysis method
  • shRNA capable of suppressing the expression of these target genes into HBV-infected cells dramatically reduced the amount of HBV DNA and HBV cccDNA.
  • shRNA of each gene synergistically suppressed the amount of HBV DNA and the amount of cccDNA by combined use with entecavir.
  • DENND2A gene and Dock11 gene shRNA reduced the amount of cccDNA to below the detection limit in short-term culture in combination with entecavir, and in addition, all four genes alone in long-term culture of 3 weeks or longer were cccDNA alone. Is reduced to below the detection limit.
  • the target gene of the present invention encodes a protein that interacts with the Rab family that functions as a protein related to the cytoskeleton or a cell membrane organizer (membrane organizer), it is not limited to HBV but an antiviral against all viruses.
  • a drug target gene For example, HCV and influenza virus shown in the examples can be mentioned. Therefore, a drug that acts on the target gene of the present invention can be screened as an antiviral drug.
  • the drug acting on the target gene is a drug having an action of suppressing the expression of the target gene or the activity of the protein encoded by the target gene. Suppression of the expression of the target gene means that the process of expressing the protein encoded by the target gene is suppressed.
  • the protein encoded by the target gene of the present invention is considered to affect a specific enzyme activity, a drug that acts on the target gene can be easily screened by measuring the enzyme activity.
  • a drug that acts on the target gene can be easily screened by measuring the enzyme activity.
  • LIPG has an enzyme activity, screening for a drug that acts on the LIPG gene can be easily performed by measuring the enzyme activity.
  • the antiviral agent of the present invention uses, as an active ingredient, a substance that can suppress the expression of a target gene or the activity of a protein encoded by the target gene, using a gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in a host cell as a target gene.
  • the target gene is preferably one or more genes selected from the group consisting of DOCK11 gene, LIPG gene, DENND2A gene, and HECW2 gene.
  • a gene having an action of maintaining a nucleic acid derived from a virus in a host cell is not a gene derived from the virus genome but a gene derived from the genome of the host cell. In order to maintain the virus in the host cell, it is considered that not only the activity and function of the virus itself but also some factor in the host cell is involved.
  • the antiviral agent of the present invention targets some factor in such a host cell.
  • the antiviral agent of the present invention has an antiviral action.
  • the antiviral action means an action that suppresses or inhibits viral infection, replication, particle production, reinfection, and the like.
  • the antiviral agent of the present invention is effective in reducing the amount of viral DNA in the host cell.
  • it when used as an anti-HBV drug, it exerts an effect of reducing the amount of HBV DNA in hepatocytes, especially HBV cc cccDNA, so that HBV incomplete circular double-stranded DNA enters the nucleus of hepatocytes. It is thought to affect the uptake of cccDNA and the stability of cccDNA in the nucleus.
  • antiviral drugs that can exert the effect of reducing the amount of viral DNA by targeting a gene in the host cell.
  • an anti-HBV drug capable of exerting an action of reducing the amount of cccDNA in the nucleus by targeting a gene in hepatocytes.
  • the antiviral agent of the present invention exhibits an antiviral action by a novel mechanism. Since the antiviral agent of the present invention is based on a new mechanism, the virus can be removed more effectively by using it together with another virus growth inhibitor.
  • entecavir a conventional hepatitis B virus growth inhibitor, inhibits HBV particle production by inhibiting reverse transcription to minus-strand DNA after mRNA is transcribed from cccDNA and then core particles are formed. Is.
  • HBV can be more effectively removed by using it together with another hepatitis B virus growth inhibitor such as entecavir.
  • HBV In the life cycle of HBV, first, HBV interacts with heparan sulfate proteoglycan (HSPG) on the liver cell surface, binds to the cell surface, and HBV enters the cell by endocytosis.
  • HSPG heparan sulfate proteoglycan
  • NTCP Na-dependent bile acid transporter: sodium taurocholate cotransporting polypeptide
  • HBV membrane When HBV enters cells, as the endosome (vesicle) matures, the HBV membrane fuses with the endosomal membrane, releasing the nucleocapsid consisting of the viral genome and the capsid that wraps the genome into the cytoplasm. Nucleocapsids are thought to be transported inside cells using microtubules, which are cytoskeletons, and enter the nucleus through interaction with motor proteins. The nucleocapsid that has reached the nuclear pore complex sends HBV DNA and HBV polymerase into the nucleus.
  • rcDNA relaxed circular DNA
  • cccDNA cccDNA
  • the mechanism by which the virus genome enters the nucleus after the virus has entered the host cell and then transported inside the cell using the cytoskeleton such as microtubules is thought to be common to all viruses.
  • the protein encoded by the target gene of the present invention is related to the cytoskeleton, the antiviral agent of the present invention acts on the transport of the virus from the cell membrane into the nucleus, and is not limited to HBV. It is thought to be effective against various viruses.
  • the application of the antiviral agent of the present invention includes in vivo and in vitro, and the aspect of use in vivo will be described later as “therapeutic and / or prophylactic pharmaceutical composition”.
  • the antiviral agent of the present invention can be administered to any animal infected with a virus.
  • it can be administered to humans and non-human mammals such as monkeys, mice, rats, dogs, rabbits, cows, horses, etc., but administration to humans is particularly preferred.
  • any virus may be targeted by the antiviral agent of the present invention.
  • Nile virus and Zika virus are Nile virus and Zika virus.
  • hepatitis B virus hepatitis C virus
  • hepatitis A virus hepatitis virus including hepatitis E virus, influenza virus, human immunodeficiency virus, Ebola virus, Zika virus, more preferably hepatitis virus More preferred is hepatitis B virus or hepatitis C virus, and most preferred is hepatitis B virus.
  • the DOCK11 (dedicator of cytokinesis 11) gene has the base sequence shown in GenBank Accession No. NM_144658.
  • the DOCK11 gene belongs to the Dock family and is thought to have a function as a guanylguannucleotide exchange factor that targets the Rho GTPase family.
  • the function of the DOCK11 gene can be confirmed by measuring the activity of the target Rho GTPase.
  • the Rho GTPase family is known to have an effect of controlling the cytoskeleton.
  • the interaction with Cdc42 is known, and the action / expression system of Cdc42 can be Merckmar. (J. Chem. Biol., 281: 35253-35262 (2006) & J. Chem. Biol., 286: 25341-25351 (2011))
  • DENND2A (DENN / MADD domain containing 2A) gene has the base sequence shown in GenBank Accession No. NM_144658.
  • the DENND2A gene is a protein having a DENN / MADD domain on the C-terminal side, and is considered to have a function as a guanyl nucleotide exchange factor that works specifically for Rab.
  • the function of the DENND2A gene can be confirmed using the function of the target Rab as an index.
  • Rab is a low molecular weight G protein belonging to the Ras superfamily. Rab superfamily small G proteins are known to regulate intracellular transport pathways and are involved in, for example, vesicle formation, vesicle and organelle movement, vesicle binding to targets, etc. (Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2, 107-117 (2001)).
  • LIPG lipase, endothelial
  • NM_006033 vascular endothelial lipase encoded by the LIPG gene is an enzyme that hydroxylates HDL and other lipoproteins, and is known to be widely distributed in the body.
  • HECW2 HECT, “C2” and “WW” domain “containing” E3 “ubiquitin” protein “ligase” 2
  • the HECW2 gene is also called NEDL2 gene, and the protein encoded by the HECW2 gene has ligase activity and is considered to act as a ubiquitin transferase.
  • the antiviral agent of the present invention can contain one or more substances that can suppress the expression of the target gene or the activity of the protein encoded by the target gene as an active ingredient.
  • the active ingredient is not particularly limited as long as the expression of the target gene or the activity of the protein encoded by the target gene can be suppressed. “Suppressing the expression of the target gene or the activity of the protein encoded by the target gene” is synonymous with suppressing the expression or activity of the protein encoded by the target gene. “Suppressing the expression or activity of a protein” refers to all aspects of suppressing (or inhibiting) the functional expression of the protein, for example, suppressing the activity (function) of the protein or suppressing the expression of the protein.
  • Examples include, but are not limited to, suppression of transcription of a gene encoding the protein, suppression of gene expression, including suppression of translation of the protein, and the like.
  • Examples of the mode of suppressing the activity of the protein include, for example, inhibiting the binding between a protein receptor and a ligand or an associated molecule, inhibiting the interaction between intracellular proteins, inhibiting the activation of the protein, and the enzymatic activity of the protein.
  • the antiviral agent of the present invention may inhibit an interaction between a protein encoded by a target gene and a molecule such as a specific gene or protein.
  • the specific gene or protein or the like may be one that has been found to interact with the protein encoded by the target gene, or one that will be confirmed in the future.
  • an inhibitor of a protein encoded by a target gene an antibody that specifically binds to the protein encoded by the target gene, a compound that can suppress the expression of the protein encoded by the target gene, and a target protein
  • an enzyme its association inhibitor and the like
  • a target protein In the case of functioning in association with an enzyme, its association inhibitor and the like can be mentioned, but it is not limited thereto.
  • the inhibitor of the protein encoded by the target gene any known and future inhibitor of the protein encoded by the target gene can be used.
  • the inhibitor is a specific inhibitor of the protein encoded by the target gene.
  • any known and future developed antibody that can inhibit the function of the protein encoded by the target gene can be used.
  • an antibody that binds to the active site of the protein encoded by the target gene and inhibits its function is exemplified.
  • Such an antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies can be appropriately prepared by those skilled in the art by known methods.
  • the antibody is a monoclonal antibody, it may be a chimeric antibody, humanized antibody or human antibody prepared by a known method.
  • An antibody may be a complete antibody molecule, even an antibody fragment, a bispecific antibody, a minibody, a domain antibody, a synthetic antibody (also referred to as an “antibody mimetic”), an antibody fusion (an “antibody conjugate”). And the like, but not limited thereto.
  • the antibody fragment include Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, dAb fragment, CDR region, F (ab ′) 2 fragment, single chain Fv (ScFv), minibody, diabody, triabody, tetrabody and the like.
  • Examples of the compound that can suppress the expression of the protein encoded by the target gene include nucleic acids, proteins, polyamides, and the like that can suppress the expression of the protein encoded by the target gene.
  • Such nucleic acids, proteins, polyamides and the like can suppress the expression or activity of the protein encoded by the target gene by recognizing a base sequence selected from any of the following.
  • -CCAACAGGGTGCTTACATATT (SEQ ID NO: 36) ⁇ GTACTAGACACCATATCATTT (SEQ ID NO: 37) ACTAAATGAGCGGCTAATTAA (SEQ ID NO: 38) ⁇ TGATGGCCATAACCCATTAAT (SEQ ID NO: 39) CCAGGCTACTTGAATCTGAAT (SEQ ID NO: 40) CTGAAGGGACTAGGCAATAAA (SEQ ID NO: 41) -CCAATGAAGGAGAACCCTTAT (SEQ ID NO: 42) CCTAGTGCAGCCCTATTCTTT (SEQ ID NO: 43) -CTAGTGCAGCCCTATTCTTTA (SEQ ID NO: 44) ACGATGTCTTGGGATCAATTG (SEQ ID NO: 45) ATGCAGGCAACTTCGTGAAAG (SEQ ID NO: 46) CCGTTGTAATAGCATTGGCTA (SEQ ID NO: 47) CGTCACCCTTTATGGCACTAA (SEQ ID NO: 48) ⁇
  • Nucleic acids that can suppress the expression of the protein encoded by the target gene are those that interfere with the target gene or its transcript, such as antisense oligonucleotides, shRNA, siRNA, and dsRNA (specifically destroying the target gene mRNA). Examples thereof include, but are not limited to, RNA molecules having an action that is considered to be based on) and miRNAs, aptamers, and the like that are thought to be capable of suppressing translation of mRNA of the target gene.
  • Antisense oligonucleotides are single-stranded DNA or RNA molecules that are complementary to a target sequence and inhibit their expression by binding to complementary DNA or RNA.
  • the RNA molecule having the RNA interference action can be appropriately designed by a person skilled in the art based on information on the base sequence of the target gene by a known method.
  • the above RNA molecule can be prepared by a person skilled in the art based on a known method, and a commercially available product can also be obtained and used.
  • the nucleic acid capable of suppressing the expression of the protein encoded by the target gene siRNA, shRNA and miRNA are preferable, and siRNA and shRNA are particularly preferable.
  • the nucleic acid capable of suppressing the expression of the protein encoded by the target gene one having an activity of inhibiting transcription or translation of the gene can be used, but is not limited thereto.
  • RNA molecules or DNA molecules that can bind to a target gene portion can be introduced into cells by a method known per se.
  • the RNA molecule or DNA molecule can be introduced into cells by a DNA molecule such as a vector capable of expressing these molecules, and the vector can be appropriately prepared by a person skilled in the art by a known method.
  • a DNA molecule such as a vector capable of expressing these molecules
  • the vector can be appropriately prepared by a person skilled in the art by a known method.
  • Specific examples of the vector include adenovirus vectors, lentivirus vectors, adeno-associated virus vectors, but are not limited thereto.
  • the vector is a lentiviral vector.
  • nucleic acid capable of suppressing the expression of the protein encoded by the target gene of the present invention one or more nucleic acids selected from nucleic acids having the following base sequences can be used.
  • DOCK11 gene ⁇ CCGG CCAACAGGGTGCTTACATATT CTCGAGAATATGTAAGCACCCTGTTGGTTTTTG (SEQ ID NO: 1) ⁇ CCGG GTACTAGACACCATATCATTT CTCGAGAAATGATATGGTGTCTAGTACTTTTTG (SEQ ID NO: 2) ⁇ CCGG ACTAAATGAGCGGCTAATTAA CTCGAGTTAATTAGCCGCTCATTTAGTTTTTTG (SEQ ID NO: 3) ⁇ CCGG TGATGGCCATAACCCATTAAT CTCGAGATTAATGGGTTATGGCCATCATTTTTG (SEQ ID NO: 4) ⁇ CCGG CCAGGCTACTTGAATCTGAAT CTCGAGATTCAGATTCAAGTAGCCTGGTTTTTG (SEQ ID NO: 5) (DENND2
  • the terminal CCGG and TTTTTG or TTTTT are regions cut by Dicer, and CTCGAG is a hairpin loop structure.
  • the base sequence sandwiched between CCGG and CTCGAG corresponds to the target sense strand, and the base sequence sandwiched between CTCGAG and TTTTTG or TTTTT corresponds to the antisense strand. Therefore, the base sequence of the sense strand indicated by the underlined portion corresponds to the target gene cleavage site, and is the base sequence of the portion of the target gene to which each shRNA can bind or its complementary sequence.
  • the nucleic acid capable of suppressing the expression of the protein encoded by the target gene in the present invention is not limited to the nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 19, but binds to the above underlined base sequence and / or its complementary sequence, Those capable of suppressing the expression of the protein encoded by the gene can be used.
  • it may be a nucleic acid containing a base sequence in which 1 to several (preferably 5 or less, more preferably 2 or less) bases are substituted, deleted, added or inserted, and each gene Any nucleic acid may be used as long as it exhibits RNA interference.
  • a DNA-binding pyrrole-imidazole polyamide is known as a polyamide capable of suppressing the expression of a protein encoded by a target gene.
  • Pyrrole imidazole polyamide is a group of synthetic compounds, N-methylpyrrole units (hereinafter also referred to as “Py”) and N-methylimidazole units (hereinafter also referred to as “Im”), and ⁇ -aminobutyric acid units, which are aromatic rings. (Dervan: Bioorg Med Chem. 2001; 9: 2215-35.).
  • PIP can be synthesized by sequentially coupling Py and Im and can be folded in the presence of ⁇ -aminobutyric acid to adopt a U-shaped conformation.
  • Py, Im, and ⁇ -aminobutyric acid unit are linked to each other by an amide bond (—C ( ⁇ O) —NH—), and its general structure and production method are known (patents) No. 3045706, JP-A-2001-136974, WO03 / 000683A1, JP-A-2009-120531). It can be easily produced by an automatic synthesis method by a solid phase method (solid phase Fmoc method) using known Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl). According to the known Fmoc method or the like, PIP having a carboxyl group at the terminal can be synthesized. Specific examples thereof include PIP having a ⁇ -alanine residue ( ⁇ -aminopropionic acid residue) or a ⁇ -aminobutyric acid residue at the terminal.
  • PIP can bind with high affinity and specificity to a specific base pair in the minor groove of the double helix DNA. Specific recognition of base pairs depends on the one-to-one pairing of Py and Im. That is, in a U-shaped conformation in the minor groove of DNA, Py / Im pairs target CG base pairs, Im / Py targets GC base pairs, and Py / Py targets AT base pairs and TA bases. Target both pairs (Dervan: Bioorg Med Chem. 2001; 9: 2215-35.). Since PIP can specifically suppress gene expression, it has no side effects, and since it is a low molecular weight compound, it does not have the disadvantage of being degraded by ribonuclease. PIP penetrates into the cell nucleus without using an introduction reagent or vector, binds to a specific base pair with high affinity and specificity, and suppresses the expression of a specific gene. Expected as a medicine.
  • a PIP capable of suppressing the transcription of the target gene of the present invention can be selected from the library shown in FIG.
  • the base sequence to which PIP binds include, for example, the base sequence of the gene promoter region necessary for the start of transcription of the target gene, the base sequence shown in the above SEQ ID NOs: 36 to 54, or any of the above SEQ ID NOs: 36 to In the base sequence described in the above 1, a base sequence in which 1 to several bases are substituted, deleted, added or inserted is exemplified. As shown in FIG.
  • the antiviral agent of the present invention may be provided as a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease associated with viral infection containing the antiviral agent.
  • diseases associated with viral infection include hepatitis B, hepatitis C, influenza, AIDS, Ebola hemorrhagic fever, Zika fever and the like.
  • the pharmaceutical composition can be formulated by a known technique. Specific examples of the preparation include, but are not limited to, solid preparations such as tablets, capsules, pills, powders, granules, and liquid preparations such as liquids, suspensions, emulsions, injections, and the like. Depending on the form of the preparation, pharmaceutically acceptable carriers and additives can be added as appropriate.
  • the carriers and additives include, but are not limited to, preservatives, stabilizers, excipients, fillers, binders, moisturizers, fragrances, and coloring agents.
  • a known pharmaceutically acceptable solvent such as physiological saline, a solution having a buffering action, or the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as the antiviral action by the active ingredient can be obtained and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the dose of the active ingredient can be, for example, 0.01 to 1000 mg, preferably 0.05 to 500 mg, more preferably 0.1 to 100 mg per kg of the patient's body weight.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it can provide an antiviral effect and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • a person skilled in the art can select a necessary administration method according to a specific disease state.
  • Specific examples of the administration method include injection administration (intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, injection into the affected area, etc.), oral administration, suppository administration, transdermal administration (application, etc.), etc. This is not a limitation.
  • the present invention provides a method for treating or preventing a disease associated with viral infection, which comprises the step of administering a substance capable of suppressing the expression or activity of a protein encoded by a target gene.
  • the administration subject, administration method, dosage, etc. are as described above.
  • the present invention further provides a substance capable of suppressing the expression or activity of a protein encoded by a target gene for use in the treatment or prevention of symptoms caused by viral infection.
  • the present invention further provides use of a substance capable of suppressing the expression or activity of a protein encoded by a target gene for producing a pharmaceutical composition for treating and / or preventing symptoms caused by viral infection.
  • the antiviral drug of the present invention may be used in combination with other drugs effective against viral infection. These may be administered separately during the course of treatment or in combination with the antiviral agents of the invention in a single dosage form, such as a tablet, intravenous solution, or capsule.
  • other drugs effective against virus infection include virus growth inhibitors.
  • virus growth inhibitors include HBV growth inhibitors such as entecavir and tenofovir, and influenza virus growth inhibitors such as oseltamivir.
  • a reverse transcriptase inhibitor is preferred.
  • the viral growth inhibitor used in combination with the antiviral agent of the present invention is an HBV growth inhibitor, specifically, interferon, peginterferon, lamivudine, adefovir, entecavir, tenofovir, Telbivudine, Clevudine and the like can be mentioned, and entecavir is preferable.
  • the present invention is a screening method for an antiviral drug comprising selecting, as an antiviral drug, a substance capable of suppressing the expression or activity of a protein encoded by a target gene from test substances, wherein the target gene is DOCK11
  • the present invention relates to a screening method, which is one or more genes selected from the group consisting of a gene, a DENND2A gene, a LIPG gene, and a HECW2 gene.
  • the screening method of the present invention includes the following steps.
  • test substance determining whether the test substance is a substance capable of suppressing the expression or activity of the protein encoded by the target gene, and (ii) expressing the protein encoded by the target gene in step (i) or A step of selecting a test substance determined to be a substance capable of suppressing the activity as an active ingredient of an antiviral drug.
  • step (i) it is determined whether the test substance to be screened is a substance that can suppress the expression or activity of the protein encoded by the target gene.
  • the means for determining whether or not the target gene is capable of suppressing the expression or activity of the protein is the test substance to be determined and the protein encoded by the target gene whose suppression is determined.
  • any means known to those skilled in the art and developed in the future can be appropriately selected within the range in which the object is achieved.
  • the expression level of the target gene in a cell capable of expressing the target gene the level of enzyme activity of the protein encoded by the target gene, the activity or function of the protein (associating molecule) with which the protein encoded by the target gene interacts
  • the level and the binding ability or binding amount (association ability or association amount) between the protein encoded by the target gene and the protein (association molecule) with which the relevant protein interacts are used as indicators, and the value of the indicator is determined in the absence of the test substance.
  • the test substance suppresses the expression or activity of the protein encoded by the target gene. It can be determined that the substance is obtained.
  • the target gene is DOCK11 gene and the interacting protein is Rho GTPase This will be described below.
  • a screening method for a substance capable of suppressing the activity of the protein encoded by the DOCK11 gene includes the following steps (a), (b) and (c): (A) contacting Rho GTPase with a protein encoded by DOCK11 gene in the presence of a test substance; (B) The binding ability between Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene is measured in the presence of the test substance, and the binding ability between Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene in the absence of the test substance is measured.
  • the protein encoded by DOCK11 gene and Rho GTPase can be prepared by a known method.
  • a recombinant protein can be prepared by a gene recombination technique.
  • cells expressing these proteins may be used as proteins encoded by DOCK11 gene or Rho GTPase.
  • the cell may be a cell that naturally expresses these proteins, a cell transformed with an expression vector to express these proteins, or the like.
  • Those skilled in the art can easily identify or prepare the cells, and primary cultured cells, cell lines derived from the primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, and the like can be used.
  • step (b) the binding ability between Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene is measured in the presence of the test substance.
  • the “binding ability” to be measured is not particularly limited as long as the binding between Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene can be evaluated, but the binding amount, binding strength (affinity constant, binding rate constant, dissociation rate constant) And the like, and the binding mode (including concentration-dependent binding).
  • the binding ability can be measured, for example, by a known method such as flow cytometry using a protein labeled with a labeling substance.
  • a binding capacity measurement method (Biacore or the like) using surface plasmon resonance is also preferably used.
  • the binding ability between Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene in the presence of the test substance is compared with the binding ability between Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene in the absence of the test substance.
  • the binding ability of Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene in the absence of the test substance was measured in advance for the measurement of the binding ability of Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene in the presence of the test substance.
  • the binding ability or the binding ability measured at the same time may be used, but the binding ability measured at the same time is preferable from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • step (c) a test substance that causes a decrease in the ability to bind Rho GTPase and the protein encoded by DOCK11 gene is selected as an active ingredient of the antiviral drug.
  • Cdc42 a Rho GTPase
  • the protein encoded by the DOCK11 gene is known to mediate Cdc42 positive feedback activation (a positive feedback activation).
  • Activated Cdc42 has been reported to bind to the protein encoded by DOCK11 gene and then enhance its guanyl nucleotide exchange factor (GEF) activity (Lin, Q., Yang, W., Baird, D., Feng , Q., Cerione, RA, 2006. J. Biol. Chem. 281, 35253-35262).
  • GEF guanyl nucleotide exchange factor
  • the binding ability between the protein and Cdc42 can be measured as described in the above step (b).
  • means such as measuring the activity of Cdc42 itself and the GEF activity enhanced by Cdc42 are exemplified.
  • GEF activity can be measured using the GEF assay system described below.
  • Rab particularly Rab9
  • association molecule an interacting protein (association molecule).
  • means for determining a substance capable of suppressing the expression or activity of the protein encoded by the DENND2A gene include measuring the binding ability between the protein and Rab9, or measuring the GEF activity and the activity of Rab9 itself. .
  • GEF activity can be measured by using a GEF assay system (J. Cell. Biol. Vol. 191, 367-381, 2010) described below or a known assay kit. It is known that the protein encoded by the DENND2A gene has a function of releasing GDP from Rab9a or Rab9b.
  • the GEF assay system will be specifically described by exemplifying the case of Rab.
  • nM GEF ie, the protein encoded by the DENND2A gene
  • control buffer ie, the protein encoded by the DENND2A gene
  • assay buffer 100 ⁇ l of the above reaction is mixed with 10 ⁇ l 10 mM Mg-GTP and 10-100 nM GEF (ie, the protein encoded by the DENND2A gene) or control buffer to a final volume of 120 Prepare using assay buffer to make ⁇ l. The GEF reaction is performed for 20 minutes at 30 ° C. to replace GDP with GTP. Thereafter, 2.5 ⁇ l is aliquoted for activity measurement. The remaining solution is divided into two tubes and incubated for 60 minutes at 4 ° C. with 500 ⁇ l of ice-cold assay buffer containing 1 mM MgCl 2 and 20 ⁇ l packed glutathione-sepharose.
  • the sepharose can be transferred to a vial containing 4 ml of scintillation solution, and the amount of GDP released (pmol) can be measured to obtain the GEF activity (nucleotide exchange amount). Instead of GDP release, GTP binding may be measured.
  • the amount of GTP binding was determined by using 0.5 ⁇ l of 10 mM GTP and 1 ⁇ Ci [35S] -GTP ⁇ S instead of Mg-GTP in the GEF reaction using only unlabeled GDP in the above loading solution. (10 mCi / ml; 5,000 Ci / mmol) may be used.
  • the substrate and the enzyme are contacted in the presence of the test substance. What is necessary is just to make it react, measure an enzyme activity instead of a binding ability in the said process (b), and to select the test substance which reduces an enzyme activity in the said process (c).
  • the target gene is a LIPG gene
  • the reaction product can be measured by measuring the lipase activity shown below (see Nature ⁇ genetics, 21,424 (1999)), and the enzyme activity can be confirmed.
  • the target gene is the HECW2 gene.
  • the enzyme activity can be confirmed by measuring the ubiquitin transferase activity shown below (see Biochemical and Biophysical Research Communications 308 (2003) 106-113).
  • the method for measuring lipase activity is specifically exemplified below.
  • the activity of the protein encoded by the LIPG gene can be confirmed by a triglyceride (TG) lipase assay.
  • 9,10-3H (N) -triolein 250 ⁇ Ci; NEN
  • unlabeled triolein 150 mg
  • type IV-Salecithin 9 mg
  • Sigma type IV-Salecithin
  • the mixture was concentrated and emulsified, and the emulsified substrate was mixed with Tris-HCl (0.2 M, pH 8.0) containing 3% (w / v) fatty acid-free BSA and heat-inactivated bovine serum.
  • a reaction substrate is prepared.
  • the reaction substrate and LIPG-expressing cells can be contacted in a medium and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • the reaction can be stopped by adding methanol-chloroform-heptane (1.41: 1.25: 1) and mixing potassium carbonate-borate buffer.
  • the reaction product is centrifuged, and the supernatant is measured with a scintillation counter to measure TG lipase activity.
  • the phospholipase assay can be performed as follows.
  • PC phosphatidylcholine
  • 14C-dipalmitoyl PC 2 ⁇ Ci; NEN
  • lecithin 10 ⁇ l
  • Tris-TCNB 100 ⁇ l; 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Triton X-100, 5 (MmM CaCl2, 200 mM NaCl, 0.1% BSA) are mixed and stirred, and dried by an evaporator.
  • the dried lipid is mixed in TCBN to make a reaction substrate.
  • the reaction can be carried out by mixing a PC emulsion, MEM medium, etc. with the reaction substrate, bringing the LIPG-expressing cells into contact with the substrate and incubating at 37 ° C. for about 2 hours.
  • reaction is stopped by adding HCl. Then, extract with 2-propanol: hexane (1: 1), filter the upper hexane layer through a silica gel column, measure 14C free fatty acid contained in the filtrate with a scintillation counter, and measure phospholipase activity. Can do.
  • the protein encoded by the HECW2 gene is mixed with an appropriate E1 (ubiquitin activating enzyme), a solution containing E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) and bovine ubiquitin (Sigma, Chemical), and incubated at 30 ° C for 2 hours. .
  • E1 ubiquitin activating enzyme
  • a solution containing E2 ubiquitin-conjugating enzyme
  • bovine ubiquitin Sigma, Chemical
  • the reaction is stopped by adding SDS solution (containing 62.5 mM Tris-Cl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.1 M DTT, 0.01% bromophenol blue) and boiling. Thereafter, the solution is electrophoresed on SDS polyacrylamide gel, and the activity of ubiquitin transferase can be measured by detecting ubiquitinated protein by immunoblotting.
  • the present invention includes a screening method for an antiviral agent capable of suppressing the expression of a target gene or the activity of a protein encoded by the target gene, comprising the following steps (a) to (c).
  • C A step of screening a test substance that causes a decrease in the expression level of a target gene in a cell as an antiviral drug based on the comparison result of (b) above.
  • the target gene expression system may be any system in which cells capable of expressing the target gene are present in the presence of a factor that enhances the expression of the target gene.
  • a cell line incorporating a promoter that constitutively expresses the target gene may be used.
  • a screening method for a substance capable of suppressing the expression of a target gene includes the following steps (a ′), (b ′) and (c ′): (A ′) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of the target gene or the protein encoded by the target gene; (B ′) a step of measuring an expression level in a cell contacted with a test substance and comparing the expression level with an expression level in a control cell not contacted with the test substance; (C ′) A step of selecting a test substance having a reduced expression level as an active ingredient of an antiviral drug based on the comparison result of (b ′) above.
  • the test substance is brought into contact with a cell capable of measuring the expression of the target gene or the protein encoded by the target gene.
  • Contact of a test substance with a cell capable of measuring expression of a target gene or a protein encoded by the target gene can be performed in a culture medium.
  • a cell capable of measuring the expression of a target gene or a protein encoded by the target gene refers to a cell capable of evaluating the expression level of a target gene product, for example, a transcription product or a translation product (ie, protein).
  • the cell capable of evaluating the expression level of the target gene product can be a cell that can naturally express the target gene or a cell that enables a reporter assay for the target gene transcription regulatory region.
  • Those skilled in the art can easily identify these cells, and primary cultured cells, cell lines derived from the primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, and the like can be used.
  • the expression level of the target gene or the protein encoded by the target gene in the cell contacted with the test substance is measured.
  • the expression level can be measured by a method known per se in consideration of the type of cells used. For example, total RNA is prepared from cells, and transcripts are measured by RT-PCR, Northern blotting, etc., or an extract is prepared from cells and translation products are measured by immunological techniques. When using a cell that enables reporter assay for the target gene transcription regulatory region, the expression level can be measured based on the signal intensity of the reporter.
  • the expression level of the target gene or the protein encoded by the target gene in the cell contacted with the test substance is compared with the expression level of the target gene or the protein encoded by the target gene in the control cell not contacted with the test substance. Comparison of expression levels is performed based on, for example, the presence or absence of a significant difference.
  • the expression level of the target gene or the protein encoded by the target gene in the control cell not contacted with the test substance is measured in advance with respect to the measurement of the expression level of the target gene or the protein encoded by the target gene in the cell contacted with the test substance.
  • the expression level may be the expression level measured simultaneously, or may be the expression level measured simultaneously, but is preferably the expression level measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • step (c ′) a test substance that reduces the expression level of the target gene or the protein encoded by the target gene is selected as an active ingredient of the antiviral agent.
  • the test substance is not particularly limited as long as it can be a candidate substance for an active ingredient of an antiviral drug.
  • the test substance may be a natural compound (for example, a biological substance) or a synthetic compound.
  • the test substance is a pharmaceutically acceptable substance in humans.
  • Specific examples of the test substance include a low molecular weight compound, a protein such as an antibody, a nucleic acid capable of suppressing protein expression (eg, siRNA, shRNA, dsRNA, miRNA, etc.), a sugar chain or a complex carbohydrate. It is not limited to.
  • the present invention also analyzes the expression pattern of two or more finite number of genes in a host cell after virus infection, and maintains the virus-derived nucleic acid in the host cell from the host cell-derived genes.
  • a method for detecting a gene having the same is also included.
  • the same results can be obtained by conducting a comprehensive 1-cell gene expression analysis (International Publication No. WO2015 / 166768) for human hepatocellular carcinoma cell lines established from hepatitis B positive hepatocellular carcinoma patients as in the present invention.
  • the gene expression patterns can be compared between HBV-positive hepatocellular carcinoma cells and HBV-negative hepatocellular carcinoma cells established from cancer patients.
  • HBV positive hepatocellular carcinoma cells and HBV negative hepatocellular carcinoma cells have the same genome. By comparing the expression patterns of both genes, genes that act on the HBV maintenance mechanism can be detected effectively. It is rare that HBV gene expression is maintained in human hepatocellular carcinoma cell lines established from hepatocellular carcinoma tissues of specific cancer patients. In the present invention, such a rare phenomenon can be used to detect a gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in a host cell.
  • the nucleic acid derived from the virus in the host cell may be either DNA or RNA. Examples of DNA include HBV cccDNA.
  • the method for detecting a gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in the host cell of the present invention comprises the following steps. (1) establishing a virus-positive cell line from a virus-positive specimen tissue collected from a single living body; (2) subculturing a virus positive cell line to produce a virus positive cell and a virus negative cell; (3) analyzing the expression patterns of two or more finite number of genes in each single cell for the virus positive cells and virus negative cells obtained in step (2); (4) a step of comparing a gene expression pattern of a virus positive cell with a gene expression pattern of a virus negative cell; (5) A step of selecting a gene whose expression level is higher in a virus-positive cell than a virus-negative cell as a gene having an action of maintaining a virus-derived nucleic acid in a host cell.
  • Factors that have the effect of maintaining virus-derived nucleic acids in host cells can be efficiently detected by comparing virus-positive cells and virus-negative cells under the same conditions.
  • virus-positive cells and virus-negative cells in which both cells are derived from a single living body are used.
  • a single living body means a single individual, and does not mean obtaining virus positive cells and virus negative cells from two or more individuals. More specifically, a virus-positive specimen tissue is collected from a single living body.
  • Virus positive means that the virus is infected, and when a marker of the virus (for example, a virus-derived antigen, an antibody against the antigen, a virus-derived nucleic acid (DNA, mRNA, etc.), etc. is detected.
  • a marker of the virus for example, a virus-derived antigen, an antibody against the antigen, a virus-derived nucleic acid (DNA, mRNA, etc.), etc.
  • Virus negative means a case where a marker of the virus is not detected.
  • HBV positive means that at least one of cccDNA and HBV DNA is confirmed at a detectable level, and HBV mRNA is expressed.
  • the specimen tissue is obtained by collecting part or all of a virus-positive tissue from various virus-positive organs and tissues in a living body.
  • the virus-positive cell line may be prepared by such a method, or a virus-positive cell line already established from a virus-positive specimen tissue may be prepared and used.
  • the number of passages in the subculture is not particularly limited as long as the object of the present invention is not impaired, and the number of virus positive cells is decreased, but it is necessary that the virus positive cells are not completely eliminated. For example, about 10 to 40 generations are preferable.
  • two types of cells a virus-positive cell derived from a single living body and a virus-negative cell, are generated.
  • the expression pattern of two or more finite number of genes in each single cell may be analyzed by any method.
  • a comprehensive one-cell gene expression analysis disclosed in International Publication No. WO2015 / 166768 is used. Can do. Specifically, it is a method of analyzing the structure of nucleic acid derived from a single cell using a microplate having a plurality of reaction wells. In the microplate, one bead is arranged in one reaction well. On one bead, multiple molecules of single-stranded oligonucleotides are bound, and in the single-stranded oligonucleotide, the nucleic acid capture sequence is exposed at the 3 ′ end, and on the 5 ′ side of the nucleic acid capture sequence.
  • a barcode sequence is included.
  • the barcode sequence is a different base sequence for each bead.
  • Comprehensive one-cell gene expression analysis includes the following steps (i) to (iii).
  • a step of obtaining an amplified fragment by performing a nucleic acid amplification reaction using a nucleic acid captured by a single-stranded oligonucleotide on a bead as a template.
  • the virus acidifies the transcription product (mRNA) containing poly A at the 3 ′ end in the cell, whereby the host-derived mRNA and the virus-derived mRNA are simultaneously converted in the step (i) of the comprehensive one-cell gene. Can be captured and analyzed.
  • a cell expressing a virus-derived gene is identified as a virus-positive cell by analyzing the expression pattern of the gene in step (3), and a cell expressing a virus-derived gene is a virus.
  • Such a virus is preferably hepatitis B virus, and the gene having the action of maintaining the virus-derived nucleic acid in the host cell is a gene having the action of maintaining the hepatitis B virus-derived cccDNA in the host cell. Preferably there is.
  • the prepared beads were placed one by one in the well of the PDMS slide to prepare a PDMS slide for comprehensive 1-cell gene expression analysis.
  • HBV positive human hepatocellular carcinoma cell line used Human hepatocellular carcinoma cell line (Hepatocellular carcinoma) established from a specific hepatitis B positive hepatocellular carcinoma patient , HCC) was obtained from Kanazawa University Hospital First Department of Medicine. Obtain KM cell line from hepatitis B positive hepatocellular carcinoma patient who underwent radical surgery at Kanazawa University Hospital Liver Center, obtain human hepatocellular carcinoma specimen and collect from specimen The collected hepatocellular carcinoma tissue was quickly separated into single cells and established as a suspension.
  • HBV ⁇ cccDNA, HBV DNA, and HBV mRNA were detected from the KM cell line after establishment and the KM cell line that had been subcultured.
  • HBV mRNA ie, pgRNA
  • immunostaining of HBc antigen known as a marker for HBV was performed to confirm HBc positive cells.
  • a specific detection method is as follows.
  • RNA 5'GCTCTGTATCGGGAGGCCTTA3 '(SEQ ID NO: 21), 5'TGAGTGCTGTATGGTGAGGAGAA3' (SEQ ID NO: 22) Probe for pg RNA: 5'FAM-AGTCTCCGGAACATT-MGB3 '(SEQ ID NO: 23) Primers for PreS / S: 5'ACCCCAACAAGGATCATTGG3 '(SEQ ID NO: 24), 5'CGAATGCTCCCGCTCCTA3' (SEQ ID NO: 25) Probe for PreS / S: 5'FAM-CAGAGGCAAATCAG-MGB3 '(SEQ ID NO: 26) Primers for HBx: 5 ′ TGTCAACGACCGACCTTGAG3 ′ (SEQ ID NO: 27), 5 ′ CCCAACTCCTCCCAGTCCTT3 ′ (SEQ ID NO: 28) Probe for HBx: 5'FAM-CATACTTCAAAGACTGTTTGTT
  • HBV DNA amount and HBV cccDNA amount by quantitative PCR Intracellular HBV DNA was performed according to the protocol of the product using DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). The amount of HBV DNA in the medium was determined according to the protocol of the product using SMI TEST EX R & D Kit (MLB). Quantitative PCR method using 5'ACTCACCAACCTCCTGTCCT3 '(SEQ ID NO: 30) and 5'GACAAACGGGCAACATACCT3' (SEQ ID NO: 31) primer set and 5'FAM-TATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT-TAMRA3 '(SEQ ID NO: 32) probe It went by.
  • the extracted DNA (50 ng) was treated with 10 U Plasmid safe DNase1 (Epicentre) at 37 ° C. for 60 minutes and then treated at 70 ° C. for 30 minutes to inactivate DNase.
  • Quantification of cccDNA by quantitative PCR using 5'CGTCTGTGCCTTCTCATCTGC3 '(SEQ ID NO: 33) and 5'GCACAGCTTGGAGGCTTGAA3' (SEQ ID NO: 34) primer set and 5'FAM-CTGTAGGCATAAATTGGT-MGB3 '(SEQ ID NO: 35) probe did.
  • HBV cccDNA and HBV DNA were confirmed at a detectable level, and the expression of HBV mRNA was also confirmed.
  • the passage of the KM cell line decreased the amount of HBV cccDNA and HBV mRNA.
  • the amount of HBV cccDNA was less than half in the KM cell line passaged 32 times compared to the KM cell line passaged 10th (FIG. 13).
  • the number of HBc positive cells was less than 0.1% of the total cells.
  • Lysis buffer 500 mM LiCl in 100 mM TRIS buffer (pH 7.5) with 1% lithium dodecyl sulfate, 10 mM EDTA and 5 mM DTT
  • Lysis buffer 500 mM LiCl in 100 mM TRIS buffer (pH 7.5) with 1% lithium dodecyl sulfate, 10 mM EDTA and 5 mM DTT
  • the upper oligonucleotide was captured.
  • the beads were collected and reverse transcription was performed on the mRNA bound to the beads to synthesize 1st strand cDNA.
  • the 2nd strand was synthesized by PCR to obtain an amplification product.
  • the amplification product was subjected to sequence analysis using a next-generation sequencer HiSeq2500 (Illumina Corporation).
  • Example 2 Confirmation of function of shRNA for each target gene
  • DOCK11 gene specifically expressed in HBV positive human hepatoma cells 5 types of shRNAs were prepared and the effect of suppressing expression of DOCK11 gene by each shRNA was confirmed. did.
  • lentiviruses expressing various shRNAs against DOCK11 gene Sigma-Aldrich Japan KK, Tokyo, Japan, TRCN0000369589, TRCN0000369590, TRCN0000369611, TRCN0000376430, TRCN0000123016, 5 types of shRNA sequences # 1 to 72 hours later, the amount of mRNA of DOCK11 gene, the amount of HBV DNA, and the amount of cccDNA of HBV were confirmed.
  • DOCK11 # 1 CCGGCCAACAGGGTGCTTACATATTCTCGAGAATATGTAAGCACCCTGTTGGTTTTTG (SEQ ID NO: 1)
  • DOCK11 # 2 CCGGGTACTAGACACCATATCATTTCTCGAGAAATGATATGGTGTCTAGTACTTTTTG (SEQ ID NO: 2)
  • DOCK11 # 3 CCGGACTAAATGAGCGGCTAATTAACTCGAGTTAATTAGCCGCTCATTTAGTTTTTTG (SEQ ID NO: 3)
  • DOCK11 # 4 CCGGTGATGGCCATAACCCATTAATCTCGAGATTAATGGGTTATGGCCATCATTTTTG (SEQ ID NO: 4)
  • DOCK11 # 5 CCGGCCAGGCTACTTGAATCTGAATCTCGAGATTCAGATTCAAGTAGCCTGGTTTTTG (SEQ ID NO: 4)
  • DOCK11 # 5 CCGGCCAGGCTACTTGAATCTGAATCTCGAGATTCAGATTCAAGTAGCCTGGTTTTTG (SEQ ID
  • HepG2.2.15 cells are cells obtained by transfecting HepG2 human hepatoma-derived cells with HBV and continuously producing viruses (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84: 1005-1009 (1987 ), Journal of Virology, Aug. 1988, 62, 2836-2844). HepG2.2.15 cells used were maintained in DMEM medium (Life Technologies, Carlsbad, Calif.) Containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 ⁇ U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin.
  • FBS fetal bovine serum
  • lentiviruses expressing the shRNAs shown in SEQ ID NOs: 6 to 19 (Sigma-Aldrich Japan KK, Tokyo, Japan, TRCN0000179931, TRCN0000178923, TRCN0000184030, TRCN0000179932, TRCN0000372782, TRCN000037378899, TRCN0000050893 , TRCN0000050894, TRCN0000372783, TRCN0000004789, TRCN0000004790, TRCN0000004791, TRCN0000004792, TRCN0000004793).
  • DENND2A # 1 CCGGCTGAAGGGACTAGGCAATAAACTCGAGTTTATTGCCTAGTCCCTTCAGTTTTTTG (SEQ ID NO: 6)
  • DENND2A # 2 CCGGCCAATGAAGGAGAACCCTTATCTCGAGATAAGGGTTCTCCTTCATTGGTTTTTTG (SEQ ID NO: 7)
  • DENND2A # 3 CCGGCCTAGTGCAGCCCTATTCTTTCTCGAGAAAGAATAGGGCTGCACTAGGTTTTTTG
  • DENND2A # 4 CCGGCTAGTGCAGCCCTATTCTTTACTCGAGTAAAGAATAGGGCTGCACTAGTTTTTTG (SEQ ID NO: 9)
  • LIPG # 1 CCGGACGATGTCTTGGGATCAATTGCTCGAGCAATTGATCCCAAGACATCGTTTTTTG (SEQ ID NO: 10)
  • LIPG # 2 CCGGATGCAGGCAACTTCGTGAAAGCTCGAGCTTTCACGAAGTTGCCTGC
  • Example 3 Confirmation of function of shRNA against HBV infection Using fresh human hepatocytes (PHH cells) derived from PXB mice (PhoenixBio Co., Ltd., Hiroshima, Japan), HBV infection in human hepatocytes The effect of shRNA on each gene was confirmed. Experiments were performed by culturing PHH cells as follows. First, on day 0 of culture, a lentivirus expressing shRNA against each gene was infected by a conventional method. Sera collected from HBV-infected chimeric mice infected with HBV (Genotype C, 5 HBV DNA copies / cell) was added as the HBV inoculation source on the first day of culture.
  • Example 2 On the second day of culture, the cells were washed three times and entecavir (ETV) (10 nM) was added. On day 7 of culture, cells were collected, and the amount of HBV DNA, the amount of HBV cccDNA, and the amount of mRNA of each gene were confirmed. The amount of HBV DNA, the amount of cccDNA of HBV, and the amount of pg RNA were quantified in the same manner as described in Example 1. The amount of mRNA of each gene was quantified in the same manner as in Example 2.
  • shRNA for each gene those having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 7, 14, 17 (Lentiviruses of Sigma-Aldrich Japan KK, Tokyo, Japan, TRCN0000369590, TRCN0000178923, TRCN0000372783, TRCN0000004791) were used.
  • dHCGM medium Yamasaki C, et al., J Hepatol. 2006, 44: 749-57
  • the results are shown in Figs.
  • the amount of cccDNA was dramatically reduced by shRNA against DOCK11 gene or DENND2A gene, and decreased to below detection sensitivity by combined use with ETV.
  • the amount of cccDNA was reduced by shRNA against LIPG gene or HECW2 gene, and a synergistic reduction effect was confirmed by combined use with ETV.
  • Example 4 Confirmation of function of shRNA against HBV infection 2
  • the effect of shRNA of each gene on the infection of human hepatocytes with HBV when long-term culture was performed using PHH cells was confirmed.
  • Experiments were performed by culturing PHH cells as follows. First, on day 0 of culture, a lentivirus expressing shRNA against each gene was infected by a conventional method. Sera collected from HBV-infected chimeric mice infected with HBV (Genotype C, 5 HBV DNA copies / cell) was added as the HBV inoculation source on the first day of culture. Thereafter, culture was performed according to the following (1) to (4).
  • PHH cells infected with HBV were cultured for 4 weeks.
  • PHB cells infected with HBV were cultured for 2 weeks, after which the cells were washed 3 times, added with ETV (10 nM), and cultured for 2 weeks.
  • ETV (10 nM) added with ETV (10 nM)
  • the cells were washed three times, added with ETV (10 nM), and cultured for 2 weeks. Thereafter, the cells were washed three times to remove ETV, and cultured for 2 weeks.
  • the cells were washed three times, added with ETV (10 nM), and cultured for 4 weeks.
  • the cells were collected, and the mRNA amount of each gene, the amount of HBV cccDNA, and the amount of pg RNA were confirmed in the same manner as in the methods described in Examples 1 and 2. .
  • shRNA for each gene those having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 7, 14, and 17 (Sigma-Aldrich Japan K., Tokyo, Japan, TRCN0000369590, TRCN0000178923, TRCN0000372783, and TRCN0000004791 lentivirus) were used.
  • the last number of each item on the horizontal axis means the culture conditions (1) to (4) above.
  • “sh DOCK11 1” indicates a case where the shRNA of DOCK11 gene is introduced and cultured under the condition (1) above.
  • “Cont” is the result of culturing without introducing shRNA of each gene. It was found that long-term culture for 3 weeks or more reduced the amount of cccDNA alone to below the detection limit for all four genes.
  • Example 5 Confirmation of target gene action by genome editing method
  • the DENND2A gene and Dock11 gene were knocked down using the CRISPR / Cas9 system.
  • the HepG2.2.15 cell which knocked down the target gene it carried out similarly to the method of Example 1, and confirmed the amount of HBV DNA, the amount of cccDNA of HBV, and the amount of pg RNA.
  • Example 6 Confirmation of function of shRNA against HBV infection 3
  • shRNA SEQ ID NO: 2 of the Dock11 gene was introduced, and culture was performed for 3 weeks while changing the culture medium. Thereafter, the expression level of DOCK11 gene mRNA, the amount of cccDNA of HBV, and the amount of pg RNA were confirmed for PHH in the same manner as in Example 1 and Example 2.
  • Example 7 Localization of target genes in cells Localization of various proteins in KM cell lines using the same indirect fluorescent immunostaining as in Example 1 for the proteins expressed by each target gene. It was confirmed.
  • anti-HBcAg antibody anti-HBc monoclonal antibody as an antibody against HBV-core, LIPG, HECW2, DENND2A, DOCK11 (Special Immunology Institute / 2AHC21), Anti-LIPG antibody produced in rabbit (Sigma Aldrich / HPA016966 -100UL), Anti-NEDL2 (HECW2) antibody-N-terminal (Abcam / ab154888), Anti-NEDL2 antibody-N-terminal (Abcam / ab154888), DOCK 11 Antibody (D-17) (SANTA CRUZ / sc-74610 ) Was used.
  • Example 8 Confirmation of function of shRNA against HCV Antiviral activity of shRNA against Dock11 gene was evaluated using a replicon system of JFH1 strain.
  • HCV replication analysis was performed by transfecting Huh 7.5 cells with synthetic JFH1-RNA.
  • DOCK11 constitutive knockdown cells were generated by introducing DOCK11 shRNA # 2 into Huh 7.5 cells. Cells introduced with cont shRNA were used as control.
  • Huh 7.5 cells after introduction of the shRNA the 1 ⁇ g synthetic RNA (JFH1-RNA), were transfected with TransIT (R) -mRNA Transfection Kit ( Mirus Corporation).
  • Results are shown in FIG.
  • the expression level of DOCK11 gene in Huh7.5 cells was reduced by shRNA against DOCK11 gene. It was also found that shRNA against DOCK11 gene suppresses HCV replication in Huh7.5 cells. It was found that replication of HCV RNA was effectively suppressed in 1 to 3 days (24 hours, 48 hours, 72 hours) after introduction of HCV RNA.
  • Example 9 Suppression of target gene expression by pyrrole imidazole polyamide From HepG2 human hepatoma-derived cells transfected with HBV, pyrrole imidazole polyamide that can specifically bind to the target gene at 5 ⁇ M from the start of culture. Add and observe changes over time. Further, the cells are collected after a certain time, and the mRNA expression level of DOCK11 gene, the amount of HBV DNA, the amount of cccDNA of HBV, and the amount of pg RNA are measured by the same method as in Examples 1 and 2.
  • Example 11 Confirmation of function of shRNA against Cdc42 gene As in Example 2, there is no difference in gene expression level for maintaining HBV gene, but it is known to interact with DOCK11. Five types of shRNAs were prepared for the Cdc42 gene encoding Cdc42, and anti-hepatitis B virus action by each shRNA was confirmed.
  • lentiviruses expressing various shRNAs against Cdc42 gene (Sigma-Aldrich Japan KK, Tokyo, Japan, TRCN0000047631, TRCN0000047629, TRCN0000047628, TRCN0000047632, TRCN0000310772, 5 types of shRNA sequences # 1 to # 5 is shown below), and after 1 week, the amount of HBV DNA and the amount of HBV cccDNA were confirmed. The amount of HBV DNA and the amount of HBV cccDNA were measured in the same manner as in Example 1.
  • CDC42 shRNA # 1 CCGGCCAAGAACAAACAGAAGCCTACTCGAGTAGGCTTCTGTTTGTTCTTGGTTTTTG (SEQ ID NO: 55)
  • CDC42 shRNA # 2 CCGGCGGAATATGTACCGACTGTTTCTCGAGAAACAGTCGGTACATATTCCGTTTTTG (SEQ ID NO: 56)
  • CDC42 shRNA # 3 CCGGCCCTCTACTATTGAGAAACTTCTCGAGAAGTTTCTCAATAGTAGAGGGTTTTTG (SEQ ID NO: 57)
  • CDC42 shRNA # 4 CCGGCAGATGTATTTCTAGTCTGTTCTCGAGAACAGACTAGAAATACATCTGTTTTTG (SEQ ID NO: 58)
  • CDC42 shRNA # 5 CCGGGACTCTGTAACAGACTAATTGCTCGAGCAATTAGTCTGTTACAGAGTCTTTTTG (SEQ ID NO: 59)
  • Example 12 Confirmation of function of shRNA against influenza virus infection Behavior of influenza virus nuclear protein when human lung adenocarcinoma cell line A549 cells were infected with influenza virus and shRNA of DOCK11 gene or Cdc42 gene was introduced. confirmed.
  • A549 cells were seeded in a 10 cm dish. After seeding, A549 cells were infected with lentiviruses containing cont shRNA, DOCK11 shRNA # 2, and CDC42 shRNA # 1 to # 5, respectively, in the same manner as in Example 2 and Example 11. 48 hours after infection, puromycin was added at 5 ⁇ g / ml. Thereafter, the cells were cultured for 1 week, and cells into which shRNA was introduced were selected.
  • Influenza virus WSN strain isolated from MDCK cells (obtained from Kanazawa University Dr. Masayoshi Inami) was infected. Cells were fixed with acetone / methanol 24 hours after infection with influenza virus, and influenza nucleoprotein (NP) was immunostained using Influenza A H1N1 HA Antibody (thermofisher PA5-34929) and observed.
  • the amount of HBV cccDNA can be greatly reduced as compared with conventional hepatitis B virus growth inhibitors, and there is a possibility that it can be completely removed.
  • the antiviral agent of the present invention is different in action mechanism from the conventional antiviral agent, and is considered to act on the transport route until the virus reaches the nucleus after entering from the membrane on the surface of the host cell. Therefore, it is considered that the antiviral agent of the present invention exhibits an antiviral effect on not only HBV but also various viruses. Further, the antiviral agent of the present invention is considered to synergistically exert an antiviral effect when used in combination with a conventional antiviral agent.
  • the antiviral agent of the present invention is expected to make a great contribution to the treatment of diseases caused by viral infection, enabling prevention of viral infection, remission or cure of viral infection. Furthermore, by using the target gene of the present invention as an index, antiviral drugs based on a novel mechanism can be screened.

Abstract

本発明は、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を有効成分とする抗ウイルス薬であって、標的遺伝子が、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子からなる群より選択される１又は２以上の遺伝子である、抗ウイルス薬に関する。また本発明は当該抗ウイルス薬のスクリーニング方法に関する。

Description

抗ウイルス薬
　本発明は、新規抗ウイルス薬に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２０１５－２１９１８３号優先権を請求する。
　ウイルス感染に伴う疾患、例えば、ウイルス性肝炎、インフルエンザ感染症、ヘルペスウイルス系感染症、エイズ（ＡＩＤＳ）、ウイルス性出血熱などは、医学的にも社会的にも重要な問題として認識されている。ウイルス感染に伴う疾患に対しては、ワクチンなどによる予防や薬剤を用いた治療法等、幅広く検討されている。しかしながらワクチンや薬剤による効果は十分とは言えず、またウイルスによっては作用メカニズムの解明自体が難しく、薬剤の開発に着手できないものもある。加えて、ウイルスの形質は著しく多様であり生活環に関わる転写因子等も異なることから、薬剤の開発は個々のウイルスを対象として進められているのが現状である。
　ウイルス感染に伴う疾患を引き起こす原因の一つであるＢ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus（以下「HBV」と略す））は、全世界で３億５千万人以上が感染していると考えられている。HBVは感染後、急性あるいは慢性肝炎を引き起こし、その一部がさらに肝硬変や肝癌に移行する。現在、HBVにより引き起こされるＢ型肝炎の治療では、インターフェロン（IFN）や核酸アナログが使用されているが、長期投与例においてもウイルスを完全に排除することは困難であり、また長期投与例での耐性ウイルスや急性増悪例の出現、投与終了後の再悪化による重症化などの問題点がある。
　HBVは肝細胞に侵入すると、ウイルス遺伝子が肝細胞の核内に移動し、不完全環状二本鎖DNAが共有結合性閉環状DNA（Hepatitis B virus covalently closed circular DNA：HBV cccDNA）に転換される。HBV cccDNAはむきだしの閉環状のHBV DNAであり、肝細胞の核内に存在し、ウイルス増殖の際の複製中間体として働くことが知られている（非特許文献１）。HBV cccDNAは、肝細胞内でヒトのゲノムと同様に振る舞い、核内にとどまってしまう。また、HBV cccDNAは、抗ウイルス薬の核酸アナログによる直接の作用を受けず、核酸アナログ治療後も肝細胞中に残存してしまうことが知られている。臨床上、既存の薬剤ではHBVのウイルスゲノムを肝細胞から完全に排除することができないのが実情であり、HBV感染の根治は不可能であると考えられている（非特許文献２）。
　HBV cccDNAはHBV感染後に細胞内にとどまる性質があることから、近年、抗ウイルス薬の長期予後予測や肝障害の程度のマーカーとして注目されている。しかしながら、感染後の生体内におけるHBV維持機構は未だ解明されておらず、HBV cccDNAの挙動も明らかにはなっていない。HBV cccDNAに着目した薬剤として、HBV cccDNA自体を標的とする人工DNAヌクレアーゼの報告がある（特許文献１）。
　HBVを肝細胞から完全に除去し、Ｂ型肝炎を予防又は治療するために、cccDNAの挙動を含めたHBV維持機構を解明し、抗HBV薬の標的となり得る新たな分子を見つけ出すことが切望されている。
特開2015-002723号公報
Christoph Seeger, William S. Mason,　Virology 479-480 (2015) 672.686 石川哲也、「Ｂ型肝炎についての最近の話題」、健康文化　47号（2012年10月発行）（http://www.kenkobunka.jp/kenbun/kb47.html）
　本発明は、新規な抗ウイルス薬を提供することを課題とする。
　本発明者らは鋭意検討した結果、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子がHBV mRNA陽性肝細胞に特異的に発現していること、さらにはこれらの遺伝子の発現を阻害することにより肝細胞内のHBV cccDNA量が減少すること、及び、これらの遺伝子がウイルス全般の感染・増殖メカニズムに関与し得ることに着目し、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質を抗ウイルス薬として使用し得ることを見出し、本発明を達成した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
１．宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を有効成分とする抗ウイルス薬であって、標的遺伝子が、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子からなる群より選択される１又は２以上の遺伝子である、抗ウイルス薬。
２．標的遺伝子が、DOCK11遺伝子である、前項１に記載の抗ウイルス薬。
３．標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質が、標的遺伝子またはその転写産物に対するshRNA、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ピロールイミダゾールポリアミドからなる群より選択される１又は２以上の化合物である、前項１又は２に記載の抗ウイルス薬。
４．標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質が、以下のいずれかから選択される塩基配列を認識する、前項１～３のいずれかに記載の抗ウイルス薬：
・CCAACAGGGTGCTTACATATT（配列番号３６）
・GTACTAGACACCATATCATTT（配列番号３７）
・ACTAAATGAGCGGCTAATTAA（配列番号３８）
・TGATGGCCATAACCCATTAAT（配列番号３９）
・CCAGGCTACTTGAATCTGAAT（配列番号４０）
・CTGAAGGGACTAGGCAATAAA（配列番号４１）
・CCAATGAAGGAGAACCCTTAT（配列番号４２）
・CCTAGTGCAGCCCTATTCTTT（配列番号４３）
・CTAGTGCAGCCCTATTCTTTA（配列番号４４）
・ACGATGTCTTGGGATCAATTG（配列番号４５）
・ATGCAGGCAACTTCGTGAAAG（配列番号４６）
・CCGTTGTAATAGCATTGGCTA（配列番号４７）
・CGTCACCCTTTATGGCACTAA（配列番号４８）
・TTACACGGATGCGGTCAATAA（配列番号４９）
・GCCCAAACATTTCTTTGAGAT（配列番号５０）
・CCAGGGAAGTTAAAGTTAATT（配列番号５１）
・GCACAATACTTGGAGTCAATT（配列番号５２）
・GCTTACAATGACAAGATTGTT（配列番号５３）
・CCCTTATCTTAAGATGTCAAT（配列番号５４）
・上記配列番号３６～５４のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列。
５．標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質が、以下のいずれかから選択される塩基配列を含むshRNAである、前項１～４のいずれかに記載の抗ウイルス薬：
・CCGGCCAACAGGGTGCTTACATATTCTCGAGAATATGTAAGCACCCTGTTGGTTTTTG（配列番号１）
・CCGGGTACTAGACACCATATCATTTCTCGAGAAATGATATGGTGTCTAGTACTTTTTG（配列番号２）
・CCGGACTAAATGAGCGGCTAATTAACTCGAGTTAATTAGCCGCTCATTTAGTTTTTTG（配列番号３）
・CCGGTGATGGCCATAACCCATTAATCTCGAGATTAATGGGTTATGGCCATCATTTTTG（配列番号４）
・CCGGCCAGGCTACTTGAATCTGAATCTCGAGATTCAGATTCAAGTAGCCTGGTTTTTG（配列番号５）
・CCGGCTGAAGGGACTAGGCAATAAACTCGAGTTTATTGCCTAGTCCCTTCAGTTTTTTG（配列番号６）
・CCGGCCAATGAAGGAGAACCCTTATCTCGAGATAAGGGTTCTCCTTCATTGGTTTTTTG（配列番号７）
・CCGGCCTAGTGCAGCCCTATTCTTTCTCGAGAAAGAATAGGGCTGCACTAGGTTTTTTG（配列番号８）
・CCGGCTAGTGCAGCCCTATTCTTTACTCGAGTAAAGAATAGGGCTGCACTAGTTTTTTG（配列番号９）
・CCGGACGATGTCTTGGGATCAATTGCTCGAGCAATTGATCCCAAGACATCGTTTTTTG（配列番号１０）
・CCGGATGCAGGCAACTTCGTGAAAGCTCGAGCTTTCACGAAGTTGCCTGCATTTTTTG（配列番号１１）
・CCGGCCGTTGTAATAGCATTGGCTACTCGAGTAGCCAATGCTATTACAACGGTTTTTG（配列番号１２）
・CCGGCGTCACCCTTTATGGCACTAACTCGAGTTAGTGCCATAAAGGGTGACGTTTTTG（配列番号１３）
・CCGGTTACACGGATGCGGTCAATAACTCGAGTTATTGACCGCATCCGTGTAATTTTTG（配列番号１４）
・CCGGGCCCAAACATTTCTTTGAGATCTCGAGATCTCAAAGAAATGTTTGGGCTTTTT（配列番号１５）
・CCGGCCAGGGAAGTTAAAGTTAATTCTCGAGAATTAACTTTAACTTCCCTGGTTTTT（配列番号１６）
・CCGGGCACAATACTTGGAGTCAATTCTCGAGAATTGACTCCAAGTATTGTGCTTTTT（配列番号１７）
・CCGGGCTTACAATGACAAGATTGTTCTCGAGAACAATCTTGTCATTGTAAGCTTTTT（配列番号１８）
・CCGGCCCTTATCTTAAGATGTCAATCTCGAGATTGACATCTTAAGATAAGGGTTTTT（配列番号１９）
・上記配列番号１～１９のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列。
６．ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサ熱ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、フィロウイルス、エボラウイスル、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルスから選択されるウイルスである、前項１～５のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
７．ウイルスが、肝炎ウイルスである、前項１～６のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
８．ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、前項１～７のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
９．ウイルス増殖抑制剤と併用される、前項１～８のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
１０．前項１～９のいずれかに記載の抗ウイルス薬を含有する、ウイルス感染に伴う疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
１１．宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子であって、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子からなる群より選択される１又は２以上の遺伝子を標的遺伝子とし、被験物質の中から、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を抗ウイルス薬として選択することを含む、抗ウイルス薬のスクリーニング方法。
１２．以下の（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む、前項１１に記載の抗ウイルス薬のスクリーニング方法：
（Ａ）細胞が標的遺伝子を発現する系において、細胞を被験物質に接触させる工程；
（Ｂ）細胞内における標的遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させた場合の細胞内における標的遺伝子の発現量と、被験物質を接触させない場合の細胞内における標的遺伝子の発現量とを比較する工程；
（Ｃ）上記（Ｂ）の比較結果に基づいて、細胞内の標的遺伝子の発現量の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬としてスクリーニングする工程。
１３．以下の（ａ）～（ｃ）の工程を含む、前項１１に記載の抗ウイルス薬のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質の存在下で、標的遺伝子がコードするタンパク質と、標的遺伝子がコードするタンパク質と相互作用するタンパク質とを接触させる工程；
（ｂ）標的遺伝子がコードするタンパク質と、標的遺伝子がコードするタンパク質と相互作用するタンパク質との結合能を測定し、被験物質の存在下における結合能と被験物質の非存在下における結合能とを比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、標的遺伝子がコードするタンパク質と標的遺伝子がコードするタンパク質と相互作用するタンパク質との結合能の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬として選択する工程。
１４．以下の（ａ）～（ｃ）の工程を含む、前項１１に記載の抗ウイルス薬のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質の存在下で、標的遺伝子がコードするタンパク質と、標的遺伝子がコードするタンパク質の基質とを接触させる工程；
（ｂ）標的遺伝子がコードするタンパク質の酵素活性を測定し、被験物質の存在下における酵素活性と被験物質の非存在下における酵素活性とを比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、標的遺伝子がコードするタンパク質の酵素活性の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬として選択する工程。
１５．前項１１～１４のいずれかに記載の抗ウイルス薬のスクリーニング方法によりスクリーニングされた、抗ウイルス薬。
１６．ウイルスが感染した後の宿主細胞について２以上の有限個の遺伝子の発現パターンを解析し、宿主細胞由来の遺伝子の中から、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法。
１７．以下の工程を含む、前項１６に記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法：
（１）単一の生体から採取されたウイルス陽性の検体組織からウイルス陽性細胞株を樹立する工程；
（２）ウイルス陽性細胞株を継代培養し、ウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞を作製する工程；
（３）工程（２）にて得られたウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞について、単一細胞毎における２以上の有限個の遺伝子の発現パターンを解析する工程；
（４）ウイルス陽性細胞の遺伝子の発現パターンと、ウイルス陰性細胞の遺伝子の発現パターンとを比較する工程；
（５）ウイルス陰性細胞に比較して、ウイルス陽性細胞において発現量が高い遺伝子を、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子として選択する工程。
１８．ウイルスが、ウイルス由来の遺伝子から3'末端にポリＡが含まれる転写産物を発現するものであり、
工程（３）の遺伝子の発現パターンの解析により、ウイルス由来の遺伝子を発現している細胞がウイルス陽性細胞と同定され、ウイルス由来の遺伝子を発現している細胞がウイルス陰性細胞と同定される、
前項１７に記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法。
１９．ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスであり、
宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子が、宿主細胞内でＢ型肝炎ウイルス由来のｃｃｃＤＮＡを維持する作用を有する遺伝子である、
前項１８に記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法。
２０．前項１６～１９のいずれかに記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を選択する方法により選択された、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子。
２１．宿主細胞由来の遺伝子であって、宿主細胞内でＢ型肝炎ウイルス由来のｃｃｃＤＮＡを維持する作用を有する遺伝子。
２２．遺伝子が、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子から選択される１又は２以上の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子である、前項２０又は２１に記載の遺伝子。
２３．前項２０～２２のいずれかに記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を有効成分とする抗ウイルス薬。
２４．前項２０～２２のいずれかに記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、被験物質の中から、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を抗ウイルス薬として選択することを含む、抗ウイルス薬のスクリーニング方法。
Ａ）宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を有効成分とする抗ウイルス薬であって、標的遺伝子がCdc42遺伝子である、抗ウイルス薬。
Ｂ）標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質が、以下のいずれかから選択される塩基配列を認識する、上記Ａ）に記載の抗ウイルス薬：
・CCAAGAACAAACAGAAGCCTA（配列番号６０）
・CGGAATATGTACCGACTGTTT（配列番号６１）
・CCCTCTACTATTGAGAAACTT（配列番号６２）
・CAGATGTATTTCTAGTCTGTT（配列番号６３）
・GACTCTGTAACAGACTAATTG（配列番号６４）
・上記配列番号６０～６４のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個（好ましくは５個以下、より好ましくは２個以下）の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列。
Ｃ）標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質が、以下のいずれかから選択される塩基配列を含むshRNAである、上記Ａ）又はＢ）に記載の抗ウイルス薬：
・CCGGCCAAGAACAAACAGAAGCCTACTCGAGTAGGCTTCTGTTTGTTCTTGGTTTTTG（配列番号５５）
・CCGGCGGAATATGTACCGACTGTTTCTCGAGAAACAGTCGGTACATATTCCGTTTTTG（配列番号５６）
・CCGGCCCTCTACTATTGAGAAACTTCTCGAGAAGTTTCTCAATAGTAGAGGGTTTTTG（配列番号５７）
・CCGGCAGATGTATTTCTAGTCTGTTCTCGAGAACAGACTAGAAATACATCTGTTTTTG（配列番号５８）
・CCGGGACTCTGTAACAGACTAATTGCTCGAGCAATTAGTCTGTTACAGAGTCTTTTTG（配列番号５９）
・上記配列番号５５～５９のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個（好ましくは５個以下、より好ましくは２個以下）の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列。
Ｄ）上記Ａ）～Ｃ）のいずれかに記載の抗ウイルス薬を含有する、ウイルス感染に伴う疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
Ｅ）宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子であって、CD42遺伝子からなる群より選択される１又は２以上の遺伝子を標的遺伝子とし、被験物質の中から、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を抗ウイルス薬として選択することを含む、抗ウイルス薬のスクリーニング方法。
　本発明の抗ウイルス薬は、従来の抗ウイルス薬とは作用メカニズムが異なり、ウイルスが宿主細胞の表面の膜から侵入した後、核内に到達するまでの輸送経路に作用すると考えられる。よって本発明の抗ウイルス薬は、HBVのみならず、種々のウイルスに対して抗ウイルス効果を示すと考えられる。また本発明の抗ウイルス薬は、従来の抗ウイルス薬と併用することにより、相乗的に抗ウイルス効果を発揮するものと考えられる。さらには、本発明の標的遺伝子を指標とすることにより、新規なメカニズムによる抗ウイルス薬をスクリーニングすることができる。
　本発明の抗ウイルス薬は、例えば、従来のＢ型肝炎ウイルス増殖抑制剤と比較して、肝細胞内のHBV cccDNA量を大幅に減少させることが可能であり、完全に除去することもできる。さらに、本発明の抗ウイルス薬は、従来のＢ型肝炎ウイルス増殖抑制剤と併用することにより、相乗的にHBV cccDNAを除去し、HBVの再活性化を予防することができる。すなわち、本発明の抗ウイルス薬は、HBV感染の根治に寄与し得ると考えられる。
HBV感染肝癌細胞にDOCK11遺伝子の各種shRNAを導入した場合の、DOCK11遺伝子の発現量（Ａ）、HBV DNA量（Ｂ）、HBV cccDNA量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例２） HBV感染肝癌細胞にDENND2A遺伝子の各種shRNAを導入した場合の、DENND2A遺伝子の発現量（Ａ）、HBV DNA量（Ｂ）、HBV cccDNA量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例２） HBV感染肝癌細胞にLIPG遺伝子の各種shRNAを導入した場合の、LIPG遺伝子の発現量（Ａ）、HBV DNA量（Ｂ）、HBV cccDNA量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例２） HBV感染肝癌細胞にHECW2遺伝子の各種shRNAを導入した場合の、HECW2遺伝子の発現量（Ａ）、HBV DNA量（Ｂ）、HBV cccDNA量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例２） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、DOCK11遺伝子のshRNAを導入した場合の、HBV DNA量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、プレゲノムRNA（以下単に「pg RNA」と称する。なお「pg RNA」は「preg RNA」とも称する。）の発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ｃ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例３） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、DENND2A遺伝子のshRNAを導入した場合の、HBV のDNA量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ｃ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例３） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、LIPG遺伝子のshRNAを導入した場合の、HBV DNA量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ｃ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例３） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、HECW2遺伝子のshRNAを導入した場合の、HBV のDNA量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ｃ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例３） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、DOCK11遺伝子のshRNAを導入して長期培養した場合の、DOCK11遺伝子の発現量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）と（Ｃ）における発現量は、各々HBV感染をさせたもの（cont　1）を１とした時の相対値で表す。（実施例４） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、DENND2A遺伝子のshRNAを導入して長期培養した場合の、DENND2A遺伝子の発現量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）と（Ｃ）における発現量は、各々HBV感染をさせたもの（cont　1）を１とした時の相対値で表す。（実施例４） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、LIPG遺伝子のshRNAをのshRNAを導入して長期培養した場合の、LIPG遺伝子の発現量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）と（Ｃ）における発現量は、各々HBV感染をさせたもの（cont　1）を１とした時の相対値で表す。（実施例４） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、HECW2遺伝子のshRNAを導入して長期培養した場合の、HECW2遺伝子の発現量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）と（Ｃ）における発現量は、各々HBV感染をさせたもの（cont　1）を１とした時の相対値で表す。（実施例４） HBV陽性肝細胞癌細胞株（KM細胞株）を10代継代した場合と32代継代した場合のHBV cccDNA量を測定した結果を示す図である。（実施例１） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、DOCK11遺伝子をゲノム編集法によりノックダウンした場合の、HBV のDNA量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ｃ）における発現量はコントロールを１とした時の相対値で表す。（実施例５） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、HBV感染後にDOCK11遺伝子のshRNAを導入して長期培養をした場合の、DOCK11遺伝子の発現量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）、pg RNAの発現量（Ｃ）への影響を確認した結果を示す図である。なお（Ａ）と（Ｃ）における発現量は、各々コントロール（sh　cont）を１とした時の相対値で表す。（実施例６） Ｂ型肝炎陽性肝細胞がん患者から樹立されたヒト肝細胞癌細胞株について、各種タンパク質の局在を間接免疫染色法にて確認した結果を示す写真図である。（実施例７） ヒト肝細胞へのＣ型肝炎ウイルス（HCV）感染系において、DOCK11遺伝子のshRNAを導入して培養した場合の、DOCK11遺伝子の発現量（Ａ）、HCV量の相対値（Ｂ）への影響を確認した結果を示す図である。発現量は、コントロール（Cont　shRNA）を１とした時の相対値で表す。（実施例８） 塩基配列選択的にDNAに結合するピロールイミダゾールポリアミドのライブラリーを示す図である。 本発明の標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質として作用し得る、ピロールイミダゾールポリアミドを例示する図である。 ヒト肝細胞へのHBV感染系において、LIPG阻害剤で処理した場合のHBVのDNA量、HBV cccDNA量を確認した結果を示す図である。（実施例１０） ヒト肝細胞へのHBV感染系において、Cdc42遺伝子のshRNAを導入した場合の、HBV のDNA量（Ａ）、HBV cccDNA量（Ｂ）への影響を確認した結果を示す図である。（実施例１１） ヒト肺腺癌細胞株A549細胞にインフルエンザウイルスを感染させた系において、DOCK11遺伝子又はCdc42遺伝子のshRNAを導入した場合の、インフルエンザウイルスの核蛋白質の挙動を確認した結果を示す図である。（実施例１２）
　まず本発明の経緯を以下に説明する。
　本発明者らは、Ｂ型肝炎陽性肝細胞がん患者から樹立されたヒト肝細胞癌細胞株（Hepatocellular carcinoma, HCC）について、驚くべきことに一部の細胞がHBV mRNAを発現していることを確認した。これまでHBV mRNAを発現する培養細胞は、HBVが感染できる限られた細胞に一過性にHBVを感染させることにより作製されており、持続感染可能な細胞モデルはなく、生体からHBV mRNAを発現する細胞を細胞株として樹立し得るとは考えられていなかった。本発明者らが確認した細胞株においては、HBV mRNA陽性細胞は継代によって減少するものの、なおHBV mRNA陽性を示す細胞がわずかに残る。これらのHBV mRNA陽性細胞ではHBV mRNA維持機構が働いている可能性があり、HBV mRNA陽性細胞について研究することにより、HBV mRNA維持に関与している遺伝子を同定することができると考えられた。そこで本発明者らが確立した包括的１細胞遺伝子発現解析法（PCT/JP2015/60841）にてＢ型肝炎陽性肝細胞がん患者から樹立されたヒト肝細胞癌細胞を解析した結果、約3,000細胞中、たった1つの細胞がHBV mRNAを発現していること、また当該HBV mRNA陽性細胞では、それ以外の細胞と比較してDENND2A遺伝子、LIPG遺伝子、Dock11遺伝子、HECW2遺伝子が高発現していることが確認された。さらに、これらの標的遺伝子の発現を抑制し得るshRNAをHBV感染細胞に導入することにより、HBV DNA量、HBV cccDNA量が劇的に減少した。さらにエンテカビルとの併用によりそれぞれの遺伝子のshRNAはHBV DNA量、cccDNA量を相乗的に抑制した。特筆すべきは、DENND2A遺伝子とDock11遺伝子のshRNAは、エンテカビルとの併用でcccDNA量を短期培養で検出限界以下まで減少させた点と、さらに３週間以上の長期培養においては4遺伝子とも単独でcccDNAを検出限界以下まで減少させた点である。これらの結果から、LIPG遺伝子、HECW2遺伝子、DENND2A遺伝子、Dock11遺伝子はHBVの細胞内での潜伏維持に重要な機能を持つ可能性が示され、これらの遺伝子並びにタンパク質を抑制する物質は新たな抗HBV薬になり得ると考えられた。
　また本発明の標的遺伝子は、細胞骨格に関連するタンパク質や細胞膜のオーガナイザー（membrane organizer）として機能するRabファミリーと相互作用するタンパク質等をコードしていることから、HBVに限らずウイルス全般に対する抗ウイルス薬の標的遺伝子になることが予測される。例えば、実施例で示すHCVや、インフルエンザウイルスが挙げられる。よって、本発明の標的遺伝子に作用する薬剤を抗ウイルス薬としてスクリーニングすることができる。標的遺伝子に作用する薬剤とは、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制する作用を有する薬剤である。標的遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子がコードするタンパク質を発現する過程を抑制することを意味する。本発明の標的遺伝子がコードするタンパク質は、特定の酵素活性に影響すると考えられることから、当該酵素活性を測定することにより、標的遺伝子に作用する薬剤のスクリーニングを容易に行うことができる。例えばLIPGは酵素活性を有するものであることから、当該酵素活性を測定することにより、LIPG遺伝子に作用する薬剤のスクリーニングを容易に行うことができる。
　本発明の抗ウイルス薬は、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を有効成分として含むものである。標的遺伝子は、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子からなる群より選択される１又は２以上の遺伝子であることが好ましい。宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子とは、ウイルスゲノム由来の遺伝子ではなく、宿主細胞のゲノム由来の遺伝子である。宿主細胞内でウイルスが維持されるためには、ウイルス自体の活性や機能だけではなく、宿主細胞内の何らかの因子が関与しているものと考えられる。本発明の抗ウイルス薬はかかる宿主細胞内の何らかの因子を標的とするものである。
　本発明の抗ウイルス薬は、抗ウイルス作用を有するものである。抗ウイルス作用とは、ウイルスの感染、複製、粒子産生および再感染等を抑制または阻害する作用を意味する。特に本発明の抗ウイルス薬は、宿主細胞内のウイルスのDNA量を減少させるのに効果を発揮する。例えば抗HBV薬として使用する場合は、肝細胞内でのHBV DNA量、特にHBV cccDNAの量を減少させる効果を発揮することから、HBVの不完全環状二本鎖DNAの肝細胞の核内への取り込み、核内におけるcccDNAの安定性に影響を与えるものと考えられる。宿主細胞内の遺伝子を標的とすることにより、ウイルスのDNA量を減少させる作用を発揮しうる抗ウイルス薬についての報告はない。また、肝細胞内の遺伝子を標的とすることにより、核内のcccDNA量を減少させる作用を発揮し得る抗HBV薬についての報告はない。本発明の抗ウイルス薬は新規なメカニズムにより抗ウイルス作用を発揮するものである。本発明の抗ウイルス薬は、新たなメカニズムによることから、他のウイルス増殖抑制剤と併用することによりさらに効果的にウイルスを除去することができる。例えば、従来のＢ型肝炎ウイルス増殖抑制剤のエンテカビルは、cccDNAからmRNAが転写され、その後コア粒子が出来た後のマイナス鎖DNAへの逆転写を阻害することにより、HBVの粒子生産を阻害するものである。本発明の抗ウイルス薬を抗HBV薬として用いるときは、エンテカビル等の他のＢ型肝炎ウイルス増殖抑制剤と併用することにより、さらに効果的にHBVを除去することができる。
　HBVの生活環では、まずHBVが肝臓細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）と相互作用して、細胞表面に結合し、エンドサイトーシスにより、HBVが細胞内に侵入する。また、肝臓細胞の基底膜側に存在するNTCP（Na依存性胆汁酸トランスポーター：sodium taurocholate cotransporting polypeptide）がHBV侵入受容体として作用することが知られている。HBV感染には、NTCPに依存する系と依存しない系がある。HBVが細胞内に侵入するとエンドソーム（小胞）の成熟に伴い、HBVの膜がエンドソームの膜に融合し、細胞質にウイルスゲノムとゲノムを包むカプシドからなるヌクレオカプシドを放出する。ヌクレオカプシドは、細胞骨格である微小管を利用して細胞内を輸送され、モータータンパク質との相互作用を介し核内に入り込むと考えられている。核膜孔複合体に到達したヌクレオカプシドは、HBV　DNAとHBVポリメラーゼを核内に送り込む。核内では、relaxed　circular　DNA（rcDNA）がcccDNAに変換され、転写の鋳型として存在することとなる（Journal of Gastroenterology and Hepatology, 31: 302-309(2016). doi: 10.1111/jgh.13175）。ウイルスが宿主細胞内に侵入した後、微小管等の細胞骨格を利用して細胞内を輸送された後、ウイルスゲノムが核内に入り込むというメカニズムは、ウイルス全般に共通するものと考えられている。本発明の標的遺伝子がコードするタンパク質は、細胞骨格に関連するものであることから、本発明の抗ウイルス薬は、細胞膜から核内へのウイルスの輸送に作用するものであり、HBVに限らず様々なウイルスに対して効果を発揮するものと考えられる。
　本発明の抗ウイルス薬の適用は生体内および生体外が包含されるが、生体内での使用の局面は「治療用及び／又は予防用医薬組成物」として後述する。また本発明の抗ウイルス薬は、ウイルスが感染するあらゆる動物に投与可能である。例えば、ヒトならびにサル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマなどの非ヒト哺乳類に投与可能であるが、ヒトに投与することが特に好ましい。
　本発明の抗ウイルス薬が対象となるウイルスはいかなるものであってもよい。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサ熱ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、フィロウイルス、エボラウイスル、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルスが例示される。好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスを含む肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エボラウイスル、ジカウイルスであり、より好ましくは肝炎ウイルスであり、さらに好ましくはＢ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスであり、最も好ましくはＢ型肝炎ウイルスである。
　DOCK11（dedicator of cytokinesis 11）遺伝子とは、GenBank　Accession　No.　NM_144658に示される塩基配列を有するものである。DOCK11遺伝子は、Dockファミリーに属する遺伝子であり、Rho GTPaseファミリーをターゲットとするguanyl nucleotide exchange factorとしての機能を有すると考えられている。DOCK11遺伝子の機能は、ターゲットであるRho GTPaseの活性を測定することにより確認することが可能である。Rho GTPaseファミリーは細胞骨格を制御する作用を有することが知られている。更にCdc42との相互作用が知られており、Cdc42の作用・表現系をメルクマールとする事も可能である。（J. Chem. Biol., 281: 35253-35262 (2006) & J. Chem. Biol., 286: 25341-25351 (2011)）
　DENND2A（DENN/MADD domain containing 2A）遺伝子とは、GenBank　Accession　No.　NM_144658に示される塩基配列を有するものである。DENND2A遺伝子は、C末端側にDENN/MADD ドメインを有するタンパク質であり、Rab特異的に働くguanyl nucleotide exchange factorとしての機能を有すると考えられている。DENND2A遺伝子の機能は、ターゲットであるRabの機能を指標として確認することも可能である。RabはRasスーパーファミリーに属する低分子量Gタンパク質である。Rabスーパーファミリー低分子Gタンパク質は、細胞内での輸送経路を制御していることが知られており、例えば小胞形成、小胞及びオルガネラの移動、小胞の標的への結合等に関与していると考えられている（Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2, 107-117 (2001)）。
　LIPG（血管内皮リパーゼ：lipase, endothelial）遺伝子とは、GenBank　Accession　No.　NM_006033に示される塩基配列を有するものである。LIPG遺伝子がコードする血管内皮リパーゼは、HDLや他のリポ蛋白を水酸化する酵素であり、体内に広く分布することが知られている。
　HECW2（HECT, C2 and WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2）遺伝子とは、GenBank　Accession　No.　NM_020760に示される塩基配列を有するものである。HECW2遺伝子は、NEDL2遺伝子とも称されており、HECW2遺伝子がコードするタンパク質は、リガーゼ活性を有しており、ユビキチン転移酵素として作用すると考えられている。
　本発明の抗ウイルス薬は、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を１種または２種以上、有効成分として含むことができる。有効成分は、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制できる限度において特に限定されるものではない。「標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制」とは、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制することと同義である。「タンパク質の発現又は活性を抑制」とは、該タンパク質の機能発現を抑制（又は阻害）するあらゆる態様を指し、例えば該タンパク質の活性（機能）を抑制すること、該タンパク質の発現を抑制すること（該タンパク質をコードする遺伝子の転写の抑制、該タンパク質の翻訳の抑制等を含む、遺伝子の発現抑制など）などが例示されるが、これに限定されない。該タンパク質の活性を抑制する態様として、例えば、タンパク質受容体とリガンド又は会合分子との結合を阻害する、細胞内タンパク質同士の相互作用を阻害する、タンパク質の活性化を阻害する、タンパク質の酵素活性を阻害するなどの態様が例示されるが、これに限定されない。本発明の抗ウイルス薬は、標的遺伝子がコードするタンパク質と特定の遺伝子又はタンパク質等の分子との相互作用を阻害するものであってもよい。特定の遺伝子又はタンパク質等は、標的遺伝子がコードするタンパク質と相互作用をすると判明しているものであっても、今後相互作用が確認されるものであってもよい。
　本発明の抗ウイルス薬の有効成分として、標的遺伝子がコードするタンパク質の阻害剤、標的遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる化合物、標的蛋白と会合して機能する場合にはその会合阻害剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　上記標的遺伝子がコードするタンパク質の阻害剤としては、公知のおよび将来開発されるあらゆる標的遺伝子がコードするタンパク質の阻害剤を用いることができる。好ましくは、上記阻害剤は、標的遺伝子がコードするタンパク質の特異的な阻害剤である。
　上記標的遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体は、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を阻害できる、あらゆる公知のおよび将来開発される抗体を用いることができる。例えば、標的遺伝子がコードするタンパク質の活性部位に結合し、その機能を阻害する抗体が例示される。かかる抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、いずれも当業者が公知の方法により適宜作成することができる。上記抗体がモノクローナル抗体である場合は、公知の方法により作成されるキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体であってもよい。また抗体は、完全抗体分子であっても、抗体断片、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（「抗体模倣物」とも称する）、抗体融合物（「抗体結合体（conjugate）」とも称する）、及びそれぞれの断片などであってよいが、これらに限定されない。抗体断片は、Fab断片、Fd断片、Fv断片、dAb断片、CDR領域、F(ab')2断片、単鎖Fv（ScFv）、minibody、diabody、triabody、tetrabody等が挙げられる。
　標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる化合物としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる核酸、タンパク質、ポリアミド等が挙げられる。かかる核酸、タンパク質、ポリアミド等は、以下のいずれかから選択される塩基配列を認識することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得るものである。
・CCAACAGGGTGCTTACATATT（配列番号３６）
・GTACTAGACACCATATCATTT（配列番号３７）
・ACTAAATGAGCGGCTAATTAA（配列番号３８）
・TGATGGCCATAACCCATTAAT（配列番号３９）
・CCAGGCTACTTGAATCTGAAT（配列番号４０）
・CTGAAGGGACTAGGCAATAAA（配列番号４１）
・CCAATGAAGGAGAACCCTTAT（配列番号４２）
・CCTAGTGCAGCCCTATTCTTT（配列番号４３）
・CTAGTGCAGCCCTATTCTTTA（配列番号４４）
・ACGATGTCTTGGGATCAATTG（配列番号４５）
・ATGCAGGCAACTTCGTGAAAG（配列番号４６）
・CCGTTGTAATAGCATTGGCTA（配列番号４７）
・CGTCACCCTTTATGGCACTAA（配列番号４８）
・TTACACGGATGCGGTCAATAA（配列番号４９）
・GCCCAAACATTTCTTTGAGAT（配列番号５０）
・CCAGGGAAGTTAAAGTTAATT（配列番号５１）
・GCACAATACTTGGAGTCAATT（配列番号５２）
・GCTTACAATGACAAGATTGTT（配列番号５３）
・CCCTTATCTTAAGATGTCAAT（配列番号５４）
・上記配列番号３６～５４のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個（好ましくは５個以下、より好ましくは２個以下）の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列。
　上記標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる核酸は、標的遺伝子又はその転写産物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNA、siRNA、dsRNA等のRNA干渉作用（標的遺伝子のmRNAを特異的に破壊することに基づくと考えられる作用）を有するRNA分子、及び標的遺伝子のmRNAの翻訳を抑制することができると考えられるmiRNA、アプタマー等を例示することができるが、これらに限定されない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列に相補的な、一本鎖のDNA分子またはRNA分子であり、相補的なDNAまたはRNAと結合することにより、その発現を阻害する。
　上記RNA干渉作用を有するRNA分子の設計は、標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。また、上記RNA分子は当業者が公知の手法に基づいて作製することができ、市場に流通するものを入手して用いることもできる。上記標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる核酸としては、siRNA、shRNAおよびmiRNAが好ましく、siRNAおよびshRNAが特に好ましい。上記標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる核酸は、上記遺伝子の転写または翻訳を阻害する活性を有するものを用いることができるが、これに限定されるものではない。
　上記標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる核酸は、標的遺伝子の部分に結合して、タンパク質の発現を抑制するものである。また、標的遺伝子の部分に結合し得るRNA分子又はDNA分子は、自体公知の手法により細胞に導入することができる。
　上記RNA分子又はDNA分子は、これらの分子を発現できるベクター等のDNA分子により細胞に導入することができ、当該ベクターは当業者が公知の手法により適宜作製することができる。上記ベクターの具体例として、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが例示されるが、これに限定されるものではない。好ましくは、上記ベクターはレンチウイルスベクターである。
　本発明の標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる核酸として、以下に挙げられる塩基配列を有する核酸から選択される１又は２以上の核酸を用いることができる。
（DOCK11遺伝子）
・CCGGCCAACAGGGTGCTTACATATTCTCGAGAATATGTAAGCACCCTGTTGGTTTTTG（配列番号１）
・CCGGGTACTAGACACCATATCATTTCTCGAGAAATGATATGGTGTCTAGTACTTTTTG（配列番号２）
・CCGGACTAAATGAGCGGCTAATTAACTCGAGTTAATTAGCCGCTCATTTAGTTTTTTG（配列番号３）
・CCGGTGATGGCCATAACCCATTAATCTCGAGATTAATGGGTTATGGCCATCATTTTTG（配列番号４）
・CCGGCCAGGCTACTTGAATCTGAATCTCGAGATTCAGATTCAAGTAGCCTGGTTTTTG（配列番号５）

（DENND2A遺伝子）
・CCGGCTGAAGGGACTAGGCAATAAACTCGAGTTTATTGCCTAGTCCCTTCAGTTTTTTG（配列番号６）
・CCGGCCAATGAAGGAGAACCCTTATCTCGAGATAAGGGTTCTCCTTCATTGGTTTTTTG（配列番号７）
・CCGGCCTAGTGCAGCCCTATTCTTTCTCGAGAAAGAATAGGGCTGCACTAGGTTTTTTG（配列番号８）
・CCGGCTAGTGCAGCCCTATTCTTTACTCGAGTAAAGAATAGGGCTGCACTAGTTTTTTG（配列番号９）

（LIPG遺伝子）
・CCGGACGATGTCTTGGGATCAATTGCTCGAGCAATTGATCCCAAGACATCGTTTTTTG（配列番号１０）
・CCGGATGCAGGCAACTTCGTGAAAGCTCGAGCTTTCACGAAGTTGCCTGCATTTTTTG（配列番号１１）
・CCGGCCGTTGTAATAGCATTGGCTACTCGAGTAGCCAATGCTATTACAACGGTTTTTG（配列番号１２）
・CCGGCGTCACCCTTTATGGCACTAACTCGAGTTAGTGCCATAAAGGGTGACGTTTTTG（配列番号１３）
・CCGGTTACACGGATGCGGTCAATAACTCGAGTTATTGACCGCATCCGTGTAATTTTTG（配列番号１４）

（HECW2遺伝子）
・CCGGGCCCAAACATTTCTTTGAGATCTCGAGATCTCAAAGAAATGTTTGGGCTTTTT（配列番号１５）
・CCGGCCAGGGAAGTTAAAGTTAATTCTCGAGAATTAACTTTAACTTCCCTGGTTTTT（配列番号１６）
・CCGGGCACAATACTTGGAGTCAATTCTCGAGAATTGACTCCAAGTATTGTGCTTTTT（配列番号１７）
・CCGGGCTTACAATGACAAGATTGTTCTCGAGAACAATCTTGTCATTGTAAGCTTTTT（配列番号１８）
・CCGGCCCTTATCTTAAGATGTCAATCTCGAGATTGACATCTTAAGATAAGGGTTTTT（配列番号１９）

・上記配列番号１～１９のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個（好ましくは５個以下、より好ましくは２個以下）の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列であって、各遺伝子に対してRNA干渉作用を発揮する核酸。

　なお各shRNAにおいて末端のCCGGとTTTTTGもしくはTTTTTとは、Dicerで切断される領域であり、CTCGAGはヘアピンのループ構造である。CCGG とCTCGAGに挟まれた塩基配列が、標的となるセンス鎖に該当し、CTCGAGとTTTTTGもしくはTTTTTとに挟まれた塩基配列が、アンチセンス鎖に該当する。従って下線部で示されたセンス鎖の塩基配列が、標的遺伝子の切断箇所に該当し、各shRNAが結合し得る標的遺伝子の部分の塩基配列又はその相補配列である。本発明における標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できる核酸は、配列番号１～１９に示す塩基配列を有する核酸に限らず、上記下線部の塩基配列及び／又はその相補配列に結合し、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制し得るものを用いることができる。下線部において、１～数個（好ましくは５個以下、より好ましくは２個以下）の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列を含む核酸であってもよく、各遺伝子に対してRNA干渉作用を発揮する核酸であればよい。
　標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制できるポリアミドとして、DNA結合性のピロールイミダゾールポリアミド（PIP）が知られている。ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成化合物であり、芳香族環であるN-メチルピロール単位（以下「Py」とも称する）及びN-メチルイミダゾール単位（以下「Im」とも称する）、及びγ-アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドから構成されている（Dervan:Bioorg Med Chem.2001;9:2215-35.）。PIPは、Py及びImを連続してカップリングして合成することができ、γ-アミノ酪酸の存在下で折りたたまれ、U字型のコンフォメーションをとることができる。Py、Im及びγ-アミノ酪酸単位（「γリンカー」とも称する）は互いにアミド結合（-C(=O)-NH-）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許第3045706号、特開2001-136974、WO03/000683A1、特開2009-120531）。 公知のFmoc（9-フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Fmoc法）による自動合成法によって簡便に製造することができる。公知のFmoc法等によれば、末端にカルボキシル基を有するPIPを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ-アラニン残基（β-アミノプロピオン酸残基）やγ-アミノ酪酸残基を有するPIP等が挙げられる。
　PIPは二重らせんDNAの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に、高い親和性と特異性をもって結合することができる。塩基対の特異的認識はPyとImとの１対１の対形成に依存している。即ち、DNAの副溝内でのU字型コンフォメーションにおいて、Py/Im対はC-G塩基対を標的とし、Im/PyはG-C塩基対を標的とし、そしてPy/PyはA-T塩基対及びT-A塩基対の両方を標的とする（Dervan:Bioorg Med Chem.2001;9:2215-35.）。PIPは、遺伝子発現を特異的に抑制することができるため副作用がなく、また低分子化合物であるためリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない。PIPは、導入試薬やベクターを用いることなく細胞核内に浸透し、特定の塩基対に高い親和性と特異性をもって結合し、特定の遺伝子の発現を抑制することができるため、新規な遺伝子転写制御薬として期待されている。
　PIPのライブラリーとして、図１８に示す（Ａ）～（Ｚ）及び（α）～（φ）が知られている（Pandian GN, et al., Sci Rep. 2014 Jan 24;4:3843. doi: 10.1038/srep03843）。図１８に示すPIPのうち、（Ｂ）の構造式（O-ββAc、Chemical Formula:C62H78N24O12、Exact Mass:1350.62、Molecular Weight:1351.46、ChemBioChem 2014, 15, 2647-2651）を以下に例示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　遺伝子制御の重要なポイントは転写であり、転写因子が遺伝子プロモータ領域に結合することにより転写が開始され、転写産物が合成され、合成された転写産物を基にして翻訳が行われる。本発明の標的遺伝子の転写を抑制し得るPIPを、図１８に示すライブラリーから選択することができる。PIPが結合する塩基配列としては、例えば、標的遺伝子の転写の開始に必要な遺伝子プロモータ領域の塩基配列、上記の配列番号３６～５４に示された塩基配列、又は上記配列番号３６～５４のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列が例示される。図１９に示すように、配列番号３７に示す塩基配列に対しては、図１８の（γ）及び（Ｂ）のPIPを使用することが好ましい。配列番号３８に示す塩基配列に対しては、（Ｂ）及び（Ａ）のPIPを使用することが好ましい。配列番号３９に示す塩基配列に対しては、（Ｓ）及び（Ａ）のPIPを使用することが好ましい。図１９中、WはA-T塩基対認識を示す。
　本発明の抗ウイルス薬は、当該抗ウイルス薬を含有するウイルス感染に伴う疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物として提供されてもよい。ウイルス感染に伴う疾患としては、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ＡＩＤＳ、エボラ出血熱、ジカ熱等が例示される。上記医薬組成物は、公知の手法により製剤化することができる。上記製剤の具体例として、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤などの固形製剤、および液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤などの液体製剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤の形態に応じて、適宜薬学的に許容される担体および添加剤を加えることができる。上記担体および添加剤の具体例として、保存剤、安定化剤、賦形剤、充填剤、結合剤、付湿剤、香料、着色剤などが挙げられるが、これらに限定されない。製剤が液体製剤である場合は、公知の薬学的に許容される溶媒、例えば生理食塩水、緩衝作用を有する溶液などを用いることができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分による抗ウイルス作用が得られるものであればよく、当業者が適宜設定することができ、特に制限されるものではない。有効成分の投与量は、例えば、１回の投与量を患者の体重１kgあたり、0.01～1000 mg、好ましくは0.05～500 mg、より好ましくは0.1～100 mgとすることができる。
　本発明の医薬組成物の投与方法は、抗ウイルス作用が得られるものであればよく、当業者が適宜設定することができ、特に制限されるものではない。例えば、当業者が具体的病態に応じて、必要な投与方法を選択することができる。投与方法の具体的態様として、注射投与（静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、患部への注射など）、経口投与、座薬投与、経皮投与（塗布など）などが例示されるが、これに制限される物ではない。
　本発明は、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質を投与する工程を含む、ウイルス感染に伴う疾患の治療方法または予防方法を提供する。投与対象、投与方法、投与量などについては、前述の通りである。
　本発明は、さらに、ウイルス感染に起因する症状の治療または予防に使用するための標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質を提供する。
　本発明は、さらに、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質の、ウイルス感染に起因する症状の治療用及び／又は予防用医薬組成物を製造するための使用を提供する。
　本発明の抗ウイルス薬は、ウイルス感染に対して有効な他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらは、治療の過程において別々に投与されてもよいし、例えば錠剤、静脈用溶液、又はカプセルのような単一の剤形において、本発明の抗ウイルス薬と組み合わせて投与してもよい。ウイルス感染に対して有効な他の薬剤としては、ウイルス増殖抑制剤が例示される。ウイルス増殖抑制剤としては、エンテカビル、テノホビル等のHBV増殖抑制剤、オセルタミビル等のインフルエンザウイルス増殖抑制剤等が例示される。本発明の抗ウイルス薬と併用するウイルス増殖抑制剤としては逆転写酵素阻害剤が好ましい。ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである場合は、本発明の抗ウイルス薬と併用するウイルス増殖抑制剤はHBV増殖抑制剤であり、具体的には、インターフェロン、ペグインターフェロン、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テノホビル、Telbivudine、Clevudine等が挙げられるが、エンテカビルが好ましい。
　本発明は、被験物質の中から、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質を抗ウイルス薬として選択することを含む抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、標的遺伝子が、DOCK11遺伝子、DENND2A遺伝子、LIPG遺伝子、及びHECW2遺伝子からなる群より選択される１又は２以上の遺伝子である、スクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、下記の工程を含むものである。
（ｉ）被験物質が、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）において標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質であると判定された被験物質を、抗ウイルス薬の有効成分として選択する工程。
　上記工程（ｉ）により、スクリーニング対象の被験物質が、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質であるか否かが判定される。標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質であるか否かを判定するための手段は、判定の対象とする被験物質、および、抑制が判定される標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性に応じて、目的が達成される範囲内において、当業者が公知のおよび将来開発されるあらゆる手段の中から、適宜選択することができる。例えば、標的遺伝子を発現し得る細胞の標的遺伝子の発現量や、標的遺伝子がコードするタンパク質の酵素活性のレベル、標的遺伝子がコードするタンパク質が相互作用するタンパク質（会合分子）自体の活性や機能のレベル、標的遺伝子がコードするタンパク質と当該タンパク質が相互作用するタンパク質（会合分子）との結合能や結合量（会合能や会合量）を指標とし、当該指標の値を被験物質の非存在下と存在下で比較し、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下において指標の値が減少している場合に、被験物質を、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質と判定することができる。
　標的遺伝子がコードするタンパク質の活性（酵素活性や、相互作用するタンパク質との結合等）を抑制し得る物質をスクリーニングする方法として、標的遺伝子がDOCK11遺伝子、相互作用するタンパク質がRho　GTPaseの場合を例示して、以下説明する。DOCK11遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質の存在下、Rho　GTPaseをDOCK11遺伝子がコードするタンパク質に接触させる工程；
（ｂ）被験物質の存在下におけるRho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能を測定し、該結合能を被験物質の非存在下におけるRho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、Rho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬の有効成分として選択する工程。
　工程（ａ）におけるDOCK11遺伝子がコードするタンパク質及びRho　GTPase、公知の方法により調製できる。例えば、遺伝子組換え技術により組換えタンパク質を調製することができる。またDOCK11遺伝子がコードするタンパク質又はRho　GTPaseとして、これらのタンパク質を発現する細胞を用いてもよい。当該細胞はこれらのタンパク質を天然で発現する細胞、これらのタンパク質を発現させるよう発現ベクターで形質転換した細胞などであり得る。該細胞は、当業者であれば容易に同定又は調製でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。
　工程（ｂ）では、先ず、被験物質の存在下、Rho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能が測定される。測定される「結合能」としては、Rho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合を評価できるものである限り特に限定されないが、結合量、結合強度（親和定数、結合速度定数、解離速度定数などのパラメーターを含む）、結合様式（濃度依存的結合を含む）が挙げられる。結合能の測定は、例えば、標識用物質で標識されたタンパク質を利用してフローサイトメトリーなどの公知の方法により行われ得る。また、表面プラズモン共鳴を利用した結合能測定法（Biacoreなど）も好適に用いられる。
　次いで、被験物質の存在下におけるRho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能が、被験物質の非存在下におけるRho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能と比較される。被験物質の非存在下におけるRho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能は、被験物質の存在下におけるRho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能の測定に対し、事前に測定した結合能であっても、同時に測定した結合能であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した結合能であることが好ましい。
　工程（ｃ）では、Rho　GTPaseとDOCK11遺伝子がコードするタンパク質との結合能の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬の有効成分として選択される。
　DOCK11遺伝子がコードするタンパク質の会合分子として、Rho GTPaseであるCdc42が知られている。DOCK11遺伝子がコードするタンパク質は、Cdc42の正のフィードバック活性制御（a positive feedback activation）を仲介していることが知られている。活性化Cdc42はDOCK11遺伝子がコードするタンパク質に結合し、その後そのguanyl nucleotide exchange factor（GEF）活性を増強することが報告されている（Lin, Q., Yang, W., Baird, D., Feng, Q., Cerione, R.A., 2006.　J. Biol. Chem. 281, 35253-35262）。よって、DOCK11遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質を判定する手段として、上述の工程（ｂ）にて説明したとおり、当該タンパク質とCdc42との結合能を測定することができる。あるいは、Cdc42自体の活性やCdc42により増強されたGEF活性を測定するといった手段が例示される。GEF活性は、後述するGEFアッセイ系を用いて測定することができる。
　標的遺伝子がDENNDA2A遺伝子の場合は、相互作用するタンパク質（会合分子）としてRab、特にRab9が知られている。DENND2A遺伝子がコードするタンパク質の発現又は活性を抑制し得る物質を判定する手段として、当該タンパク質とRab9との結合能を測定する、またはGEF活性やRab9自体の活性を測定するといった手段が例示される。GEF活性は、後述するGEFアッセイ系（J. Cell. Biol. Vol. 191, 367-381, 2010） や、公知のアッセイキットを利用して測定することができる。DENND2A遺伝子がコードするタンパク質は、特にRab9a又はRab9bからGDPを遊離させる機能を持つことが知られている。
　GEFアッセイ系を、Rabの場合を例示して具体的に説明する。
　10μg　GST-tagged Rabを、 200 μlのローディング溶液（50 mM Hepes-NaOH（pH 6.8）、0.1 mg/ml BSA、125 μM EDTA、10 μM Mg-GDP、及び5 μCi [3H]-GDP (10 mCi/ml;5,000 Ci/mmol）中で 15分間、30℃でインキュベートし、GDPが付加したRabを含む反応液を得る。
　標準的なGEF反応として、 100 μlの上記反応液を、10 μl　10 mM Mg-GTP と10～100 nM GEF（すなわち、DENND2A遺伝子がコードするタンパク質）又はコントロール緩衝液と混合し、最終容量が120 μlになるように、アッセイバッファーを用いて調製する。GEF反応を20分間、30℃で行い、GDPをGTPに置換させる。
　その後、2.5 μlを活性測定のために分取する。残りの溶液を２つのチューブに分け、1 mM MgCl2と20 μlのpacked glutathione-sepharoseを含有する氷冷アッセイバッファー 500 μlとともに60分間、4℃でインキュベートする。sepharoseを、4 mlのシンチレーション溶液を収容したバイアルに移し、GDP放出量（pmol）を測定し、GEF活性（ヌクレオチド交換量）とすることができる。
　GDP放出量の代わりに、GTP結合量を測定してもよい。GTP結合量は、上記ローディング溶液において標識化GDPを用いず未標識のGDPのみを用い、GEF反応において、Mg-GTPの代わりに、0.5 μlの10 mM GTP及び1 μCi [35S]-GTP・S (10 mCi/ml;5,000 Ci/mmol) を用いればよい。
　標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質をスクリーニングする方法として、標的遺伝子が酵素をコードする場合は、上記工程（ａ）において、被験物質の存在下で基質と酵素とを接触させて反応させ、上記工程（ｂ）において結合能の代わりに酵素活性を測定し、上記工程（ｃ）において、酵素活性を低下させる被験物質を選択すればよい。標的遺伝子がLIPG遺伝子である場合は、以下に示すリパーゼ活性の測定（Nature genetics, 21,424 (1999)参照）により、反応物について計測を行い、酵素活性を確認することができ、標的遺伝子がHECW2遺伝子である場合は、以下に示すユビキチン転移酵素活性の測定により酵素活性を確認することができる（Biochemical and Biophysical Research Communications 308 (2003) 106-113参照）。
　リパーゼ活性の測定方法を以下に具体的に例示する。
　LIPG遺伝子のコードするタンパク質について、トリグリセリド（TG）リパーゼのアッセイにより活性を確認することができる。9,10-3H(N)-triolein (250 μCi; NEN) を、未標識のtriolein (150 mg) 、type IV-S-a lecithin (9 mg; Sigma)と、グリセロール中で混合する。混合物を濃縮させて乳化させ、乳化させた基質と、3% (w/v) 脂肪酸不含BSAを含むTris-HCl (0.2 M, pH 8.0)と、加熱不活化ウシ血清とを混合して、反応用基質を作製する。反応用基質とLIPG発現細胞とを培地中で接触させて、37℃で2時間インキュベートすることにより反応させることができる。反応は、メタノール－クロロホルム－ヘプタン（1.41:1.25:1）を添加し、炭酸カリウム-ホウ酸バッファーを混合することにより、停止させることができる。反応物を遠心分離して、上清についてシンチレーションカウンターにより計測を行い、TGリパーゼ活性を測定することができる。
　ホスホリパーゼのアッセイは次のようにして行うことができる。まずホスファチジルコリン（PC）乳化液を、14C-dipalmitoyl PC（2 μCi; NEN）、レシチン（10 μl）、Tris-TCNB (100 μl; 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Triton X-100, 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl, 0.1% BSA)を混合して攪拌し、エバポレーターにより乾燥させる。乾燥させた脂質をTCBN中に混合して反応用基質とする。反応用基質にPC乳化液、MEM培地等を混合し、LIPG発現細胞と基質とを接触させて、37℃で2時間ほどインキュベートすることにより、反応させることができる。反応は、HClを添加して停止させる。その後、2-プロパノール:ヘキサン（1:1）により抽出を行い、上層のヘキサン層をシリカゲルカラムによりろ過し、ろ液中に含まれる14C遊離脂肪酸をシンチレーションカウンターにより測定し、ホスホリパーゼ活性を測定することができる。
　HECW2遺伝子に関するユビキチン転移酵素活性の測定方法を以下に具体的に例示する。
　HECW2遺伝子がコードするタンパク質を、適切なE1（ユビキチン活性化酵素）、E2（ユビキチン結合酵素）を含む溶液およびウシユビキチン（Sigma,　Chemical）と混合し、30℃で2時間インキュベートすることにより反応させる。SDS溶液（62.5 mM Tris-Cl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.1 M DTT, 0.01% bromophenol blueを含有）を添加し、沸騰させることにより、反応を停止させる。その後、溶液についてSDSポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、ユビキチン化タンパク質を免疫ブロッティングにより検出することにより、ユビキチン転移酵素の活性を測定することができる。
　本発明は、以下の（ａ）～（ｃ）の工程を含む、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る抗ウイルス薬のスクリーニング方法を含む。
（ａ）細胞が標的遺伝子を発現する系において、細胞を被験物質に接触させる工程；
（ｂ）細胞内における標的遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させた場合の細胞内における標的遺伝子の発現量と、被験物質を接触させない場合の細胞内における標的遺伝子の発現量とを比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、細胞内の標的遺伝子の発現量の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬としてスクリーニングする工程。
　標的遺伝子を発現する系とは、標的遺伝子を発現し得る細胞が、標的遺伝子の発現を増強する因子の存在下にある系であればよく、当該因子が細胞内にあっても細胞外にあっても特に限定はされない。例えば、標的遺伝子を構成的に発現するプロモータを組み込んだ細胞系であってもよい。
　標的遺伝子の発現を抑制し得る物質のスクリーニング方法は以下の工程（ａ’）、（ｂ’）及び（ｃ’）を含む：
（ａ’）被験物質と、標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ’）被験物質を接触させた細胞における発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における発現量と比較する工程；
（ｃ’）上記（ｂ’）の比較結果に基づいて、発現量を低下させた被験物質を抗ウイルス薬の有効成分として選択する工程。
　上記の工程（ａ’）では、被験物質が標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を測定可能な細胞と接触条件下におかれる。標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を測定可能な細胞に対する被験物質の接触は、培養培地中で行われ得る。
　「標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を測定可能な細胞」とは、標的遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物（即ち、タンパク質）の発現レベルを評価可能な細胞をいう。標的遺伝子産物の発現レベルを評価可能な細胞は、標的遺伝子を天然で発現可能な細胞や標的遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。これらの細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。
　上記工程（ｂ’）では、先ず、被験物質を接触させた細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、細胞からtotal　RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により転写産物の測定を行ったり、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により翻訳産物の測定を行ったりすればよい。標的遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
　次いで、被験物質を接触させた細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、例えば有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
　工程（ｃ’）では、標的遺伝子又は標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を低下させる被験物質が抗ウイルス薬の有効成分として選択される。
　上記被験物質は、抗ウイルス薬の有効成分の候補物質となり得る物質であれば、特に限定されるものではない。上記被験物質は、天然化合物（例えば、生体由来物質）または合成化合物のいずれであってもよい。好ましくは、上記被験物質は、ヒトにおいて薬学的に許容される物質である。上記被験物質の具体例として、低分子化合物、抗体などのタンパク質、タンパク質の発現を抑制できる核酸（例えば、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA等）、糖鎖もしくは複合糖質などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
　また本発明は、ウイルスが感染した後の宿主細胞について２以上の有限個の遺伝子の発現パターンを解析し、宿主細胞由来の遺伝子の中から、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法も包含する。本発明のように、Ｂ型肝炎陽性肝細胞がん患者から樹立されたヒト肝細胞癌細胞株について、包括的１細胞遺伝子発現解析（国際公開公報WO2015/166768号）を行うことにより、同じがん患者から樹立されたHBV陽性肝細胞癌細胞とHBV陰性肝細胞癌細胞とで、遺伝子の発現パターンを比較することができる。本発明においては、HBV陽性肝細胞癌細胞とHBV陰性肝細胞癌細胞とは、同一のゲノムを有しているものである。両者の遺伝子の発現パターンを比較することにより、HBV維持機構に作用する遺伝子を効果的に検出することができる。特定の癌患者の肝細胞癌組織から樹立したヒト肝細胞癌細胞株において、HBV遺伝子の発現を維持していることは稀である。本発明では、かかる稀な現象を利用し、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子の検出を行うことができる。宿主細胞内でウイルス由来の核酸は、DNA、RNAのいずれであってもよい。DNAとしては、例えばHBVのcccDNAが例示される。
　本発明の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法は、以下の工程を含むものである。
（１）単一の生体から採取されたウイルス陽性の検体組織からウイルス陽性細胞株を樹立する工程；
（２）ウイルス陽性細胞株を継代培養し、ウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞を作製する工程；
（３）工程（２）にて得られたウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞について、単一細胞毎における２以上の有限個の遺伝子の発現パターンを解析する工程；
（４）ウイルス陽性細胞の遺伝子の発現パターンと、ウイルス陰性細胞の遺伝子の発現パターンとを比較する工程；
（５）ウイルス陰性細胞に比較して、ウイルス陽性細胞において発現量が高い遺伝子を、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子として選択する工程。
　宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する因子は、同一条件下のウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞を比較することにより効率的に検出することができる。本発明の遺伝子の検出方法においては、同一条件下のウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞を比較するために、両者の細胞が単一の生体に由来するウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞を用いる。単一の生体とは、単一の個体を意味し、２以上の個体からウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞を得ることを意味しない。より具体的には、単一の生体からウイルス陽性の検体組織を採取する。ウイルス陽性とは、各種ウイルスに感染していることを意味し、当該ウイルスのマーカー（例えばウイルス由来の抗原、当該抗原に対する抗体、ウイルス由来の核酸（DNAやmRNA等）等）が検出された場合を意味する。ウイルス陰性とは、当該ウイルスのマーカー等が検出されない場合を意味する。例えば、HBV陽性とはcccDNA、HBVのDNAの少なくとも１つが検出可能なレベルで確認され、HBVのmRNAが発現していることを意味する。また本発明において検体組織とは、生体の各種ウイルス陽性の臓器や組織からウイルス陽性のものを一部又は全部を採取して得れらたものである。検体組織を薬剤等で処理することにより、単一細胞に分離して懸濁液にし、ウイルス陽性の細胞株とすることができる。ウイルス陽性細胞株はかかる方法によって作製されたものであってもよいし、ウイルス陽性の検体組織から既に樹立されたウイルス陽性細胞株を準備して用いてもよい。ウイルス陽性の細胞株を継代培養することにより、ウイルス陽性細胞の割合が減少する。継代培養の継代数は本発明の目的を損なわない範囲であれば特に限定されず、ウイルス陽性細胞が減少しているが、ウイルス陽性細胞が完全に消滅していないことが必要である。例えば、１０～４０代程度が好ましい。これにより、単一の生体由来のウイルス陽性細胞と、ウイルス陰性細胞の２種の細胞が生じる。
　単一細胞毎における２以上の有限個の遺伝子の発現パターンを解析は、いかなる方法により行ってもよいが、例えば国際公開公報WO2015/166768号に開示される包括的１細胞遺伝子発現解析を用いることができる。具体的には、複数個の反応ウェルを有するマイクロプレートを用いて、単一細胞由来の核酸の構成を解析する方法である。当該マイクロプレートにおいては、１個の反応ウェル内に１個のビーズが配置される。１個のビーズ上には、複数分子の一本鎖オリゴヌクレオチドが結合してなり、一本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、核酸捕捉配列が3'末端に露出しており、核酸捕捉配列の5'側にバーコード配列が含まれている。バーコード配列は各ビーズ毎に互いに異なる塩基配列である。包括的１細胞遺伝子発現解析は、以下の（ｉ）～（iii）の工程を含むものである。
（ｉ）マイクロプレートに細胞を播種して反応ウェル１個に細胞１個を配置させ、マイクロプレートの反応ウェル内において細胞から核酸を抽出し、当該細胞由来の核酸をビーズ上の一本鎖オリゴヌクレオチドに捕捉させる工程。
（ii）ビーズ上の一本鎖オリゴヌクレオチドに捕捉された核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い増幅断片を得る工程。
（iii）得られた増幅断片においてバーコード配列を確認し、同一のバーコード配列を有する断片を同一細胞由来の断片として同定する工程。
　本発明の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法においては、ウイルス由来の遺伝子から3'末端にポリＡが含まれる転写産物を発現するウイルスであることが好ましい。ウイルスが3'末端にポリＡが含まれる転写産物（mRNA）を細胞内で酸性することにより、上記の包括的１細胞遺伝子の工程（ｉ）において、宿主由来のmRNAとウイルス由来のmRNAを同時に捕捉し、解析を行うことができる。本発明の検出方法における、工程（３）の遺伝子の発現パターンの解析により、ウイルス由来の遺伝子を発現している細胞がウイルス陽性細胞と同定され、ウイルス由来の遺伝子を発現している細胞がウイルス陰性細胞と同定される。かかるウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスであることが好ましく、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子が、宿主細胞内でＢ型肝炎ウイルス由来のｃｃｃＤＮＡを維持する作用を有する遺伝子であることが好ましい。
　以下の参考例及び実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は参考例及び実施例によって限定されるものではない。なお以下の参考例および実施例は、金沢大学の倫理委員会の承認を得て行なったものである。
（参考例１）包括的１細胞遺伝子発現解析用のpolydimethylsiloxane(PDMS)スライドの作製
　国際公開公報WO2015/166768号に記載の方法に基づき、包括的１細胞遺伝子発現解析用のPDMSスライドの作製を行った。まず、バーコードリンカーを用いてエマルジョンPCR行い、ビーズ上にPCRの増幅産物を結合させたものを作製し、精製した。得られたビーズについて、制限酵素処理、アルカリ処理およびheat shock処理を行った。これにより、ビーズの表面上に、数百万分子の1本鎖DNAからなるオリゴヌクレオチドが接合したものであって、各ビーズ毎にバーコード配列が異なったものを作製した。なお、バーコードリンカーの配列は以下の配列番号２０に示すものである。
バーコードリンカー（配列番号２０）：
5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCAGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNNNNNACATAGGCCGTCTTCAGCCGCTGAGACTGCCAAGGCACACAGGGGATAGG-3'
N = A or T or C or G
　作製したビーズを、PDMSスライドのウエル内に１個ずつ配置させ、包括的１細胞遺伝子発現解析用のPDMSスライドを作製した。
（実施例１）抗HBV薬の標的遺伝子のスクリーニング
（１）用いたHBV陽性ヒト肝細胞癌細胞株
　特定のＢ型肝炎陽性肝細胞がん患者から樹立されたヒト肝細胞癌細胞株（Hepatocellular carcinoma, HCC）であるKM細胞株を、金沢大学付属病院　第一内科より入手した。KM細胞株は、金沢大学付属病院　肝臓センターにて根治手術を受けたＢ型肝炎陽性肝細胞がん患者より、インフォームドコンセントを得た上で、ヒト肝細胞癌検体を入手し、検体から採取した肝細胞癌組織を採取後速やかに単一細胞に分離して懸濁液とし、樹立されたものである。
　樹立後のKM細胞株、樹立後継代を行ったKM細胞株について、HBV cccDNA、HBV DNA、HBV mRNA（すなわち、pgRNA）の検出を行った。また、HBVのマーカーとして知られているHBc抗原の免疫染色を行い、HBc陽性細胞を確認した。具体的な検出方法は以下の通りである。
（ｉ）定量的RTD-PCR法 
　トータルRNAをGenEluteTM Mammalian Total RNA Miniprep Kit（Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokyo, Japan）を用いて単離し、cDNAをHigh Capacity cDNA reverse transcription kit（Applied Biosystems, Carlsbad, CA）を用いて合成した。
　RTD-PCRを、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems, Carlsbad, CA）を用いて、製品の説明書に沿って行った。用いたプライマーとプローブは以下の通りである。
　pg RNAに対するプライマー：5'GCTCTGTATCGGGAGGCCTTA3'（配列番号２１）、5'TGAGTGCTGTATGGTGAGGAGAA3'（配列番号２２）
　pg RNAに対するプローブ：5'FAM-AGTCTCCGGAACATT-MGB3'（配列番号２３）
　PreS/Sに対するプライマー：5'ACCCCAACAAGGATCATTGG3'（配列番号２４）、5'CGAATGCTCCCGCTCCTA3'（配列番号２５）
　PreS/Sに対するプローブ：5'FAM-CAGAGGCAAATCAG-MGB3'（配列番号２６）
　HBxに対するプライマー：5' TGTCAACGACCGACCTTGAG3'（配列番号２７）、5' CCCAACTCCTCCCAGTCCTT3'（配列番号２８）
　HBxに対するプローブ：5'FAM- CATACTTCAAAGACTGTTTGTT-MGB3'（配列番号２９）
（ii）定量的PCR法によるHBV DNA量及びHBV cccDNA量の確認
　細胞内のHBV DNAを、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）を用いて製品のプロトコールに従って行った。培地中のHBV DNA量を、SMI TEST EX R&D Kit（MLB社）を用いて製品のプロトコールに従って行った。HBV DNA量を、5'ACTCACCAACCTCCTGTCCT3'（配列番号３０）と5'GACAAACGGGCAACATACCT3'（配列番号３１）のプライマーセットおよび5'FAM-TATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT-TAMRA3'（配列番号３２）のプローブを用いた定量的PCR法により行った。
　抽出したDNA（50ng）を60分間、37℃で、10U Plasmid safe DNase1（Epicentre）により処理し、その後30分間、70℃で処理することにより、DNaseを失活させた。cccDNAを　5'CGTCTGTGCCTTCTCATCTGC3'（配列番号３３）と5'GCACAGCTTGGAGGCTTGAA3'（配列番号３４）のプライマーセット及び5'FAM-CTGTAGGCATAAATTGGT-MGB3'（配列番号３５）のプローブを用いた定量的PCR法により、定量した。
（iii）間接蛍光免疫染色
　間接免疫蛍光染色には、ウサギポリクローナル抗HBcAg抗体（HBc抗原に対する抗体：Thermo Fisher Scientific株式会社）を用いた。培養細胞を、メタノール-アセトン（１：１）で10分間固定し、10 mmol/L リン酸緩衝生理食塩水中で0.01% Triton X-100（メルク社）により室温にて10分間、透過処理を行った。5% BSA含有リン酸緩衝生理食塩水中で30分間インキュベーションした後、3% BSA含有リン酸緩衝生理食塩水で希釈したウサギポリクローナル抗HBcAg抗体で、4℃で一晩細胞をインキュベートした。Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞を２次抗体のAlexa 488ロバ抗ヤギ抗体及びAlexa 594ロバ抗ウサギ抗体（Life Technologies社）で、１時間室温でインキュベートした。 核はDAPI（株式会社　同仁化学研究所）により染色した。肝臓細胞とHBV陽性肝臓細胞の数を計測し、HBV陽性肝臓細胞の比率を解析した。
　その結果、樹立後の初期のKM細胞株では、HBV cccDNAとHBV DNAが検出可能なレベルで確認され、HBV mRNAの発現も確認された。しかしながら、KM細胞株は継代を行うことによりHBV cccDNA量とHBV mRNA量が減少した。例えば、32代継代したKM細胞株では、10代継代したKM細胞株に対して、HBV cccDNAの量が半分以下になっていることが確認された（図１３）。また、HBVのマーカーとして知られているHBc抗原の免疫染色を行ったところ、HBc陽性細胞は、全細胞中の0.1%にも満たなかった。
（２）HBV　mRNAを用いた包括的１細胞遺伝子発現解析
　参考例１にて作製した包括的１細胞遺伝子発現解析用のPDMSスライドを用いて、Ｂ型肝炎陽性肝細胞がん患者から樹立したヒト肝細胞癌細胞株について、包括的１細胞遺伝子発現解析法を行った。
　まず、上記包括的１細胞遺伝子発現解析用のPDMSスライド上に、細胞を載せた。その後、10～15分放置後に、PBSでスライドを洗浄し、透析膜（12,000～14,000 MWCO 再生セルロース透析チューブ、25-mm flat width、Fisher Scientific）でスライドを覆った。その後、Lysis buffer（500 mM LiCl in 100 mM TRIS buffer (pH 7.5) with 1% lithium dodecyl sulfate, 10 mM EDTA and 5 mM DTT）を透析膜の上から添加し、細胞内のmRNAを抽出し、ビーズ上のオリゴヌクレオチドに捕捉させた。ビーズを回収し、ビーズに結合したmRNAについて逆転写反応を行い、1st strand cDNAを合成した。次に、PCRにて2nd strandを合成して増幅産物を得た。増幅産物について、次世代シークエンサーHiSeq2500（イルミナ株式会社）を用いて、シークエンス解析を行った。
　約9億readについて、次世代シークエンサーにより塩基配列を解読し、バーコード配列を利用して、ヒトmRNAの発現量及びHBVのmRNAの発現量を解析したところ、3,000 細胞中、1つの細胞のみがHBV mRNAを発現していることがわかった。また、HBV　mRNA陽性細胞特異的に発現する遺伝子のうち、高発現を示す遺伝子として、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、DOCK11遺伝子、HECW2遺伝子が確認された（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例２）各標的遺伝子に対するshRNAの機能の確認
　HBV陽性ヒト肝癌細胞において特異的に発現しているDOCK11遺伝子について、５種のshRNAを作製し、各shRNAによるDOCK11遺伝子の発現抑制効果を確認した。
　HepG2.2.15細胞に、常法に従って、DOCK11遺伝子に対する各種shRNAを発現するレンチウイルス（Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokyo, Japan,　TRCN0000369589、TRCN0000369590、TRCN0000369611、TRCN0000376430、TRCN0000123016、５種のshRNAの配列#1～#5を以下に示す）を感染させ、72時間後に、DOCK11遺伝子のmRNA量、HBVのDNA量、HBVのcccDNA量を確認した。HBVのDNA量、HBVのcccDNA量は、実施例１と同様にして測定した。DOCK11遺伝子のmRNAは、常法に従い、real time PCR法により測定した。
　DOCK11#1：CCGGCCAACAGGGTGCTTACATATTCTCGAGAATATGTAAGCACCCTGTTGGTTTTTG（配列番号１）
　DOCK11#2：CCGGGTACTAGACACCATATCATTTCTCGAGAAATGATATGGTGTCTAGTACTTTTTG（配列番号２）
　DOCK11#3：CCGGACTAAATGAGCGGCTAATTAACTCGAGTTAATTAGCCGCTCATTTAGTTTTTTG（配列番号３）
　DOCK11#4：CCGGTGATGGCCATAACCCATTAATCTCGAGATTAATGGGTTATGGCCATCATTTTTG（配列番号４）
　DOCK11#5：CCGGCCAGGCTACTTGAATCTGAATCTCGAGATTCAGATTCAAGTAGCCTGGTTTTTG（配列番号５）
　HepG2.2.15細胞は、HepG2ヒト肝癌由来細胞にHBVをトランスフェクトした細胞であり、持続的にウイルスを産生する細胞である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84: 1005-1009 (1987)、Journal of Virology, Aug. 1988, 62, 2836-2844）。HepG2.2.15細胞は、10%ウシ胎児血清（FBS）、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシンを含有するDMEM培地（Life Technologies, Carlsbad, CA）中で維持したものを用いた。
　同様に、DENND2A遺伝子、LIPG遺伝子、HECW2遺伝子についても配列番号６～１９に示すshRNAを発現するレンチウイルス（Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokyo, Japan,　TRCN0000179931、TRCN0000178923、TRCN0000184030、TRCN0000179932、TRCN0000372782、TRCN0000378899、TRCN0000050893、TRCN0000050894、TRCN0000372783、TRCN0000004789、TRCN0000004790、TRCN0000004791、TRCN0000004792、TRCN0000004793）を用いて機能を確認した。
　DENND2A#1：CCGGCTGAAGGGACTAGGCAATAAACTCGAGTTTATTGCCTAGTCCCTTCAGTTTTTTG（配列番号６）
　DENND2A#2：CCGGCCAATGAAGGAGAACCCTTATCTCGAGATAAGGGTTCTCCTTCATTGGTTTTTTG（配列番号７）
　DENND2A#3：CCGGCCTAGTGCAGCCCTATTCTTTCTCGAGAAAGAATAGGGCTGCACTAGGTTTTTTG（配列番号８）
　DENND2A#4：CCGGCTAGTGCAGCCCTATTCTTTACTCGAGTAAAGAATAGGGCTGCACTAGTTTTTTG（配列番号９）
　LIPG#1：CCGGACGATGTCTTGGGATCAATTGCTCGAGCAATTGATCCCAAGACATCGTTTTTTG（配列番号１０）
　LIPG#2：CCGGATGCAGGCAACTTCGTGAAAGCTCGAGCTTTCACGAAGTTGCCTGCATTTTTTG（配列番号１１）
　LIPG#3：CCGGCCGTTGTAATAGCATTGGCTACTCGAGTAGCCAATGCTATTACAACGGTTTTTG（配列番号１２）
　LIPG#4：CCGGCGTCACCCTTTATGGCACTAACTCGAGTTAGTGCCATAAAGGGTGACGTTTTTG（配列番号１３）
　LIPG#5：CCGGTTACACGGATGCGGTCAATAACTCGAGTTATTGACCGCATCCGTGTAATTTTTG（配列番号１４）
　HECW2#1：CCGGGCCCAAACATTTCTTTGAGATCTCGAGATCTCAAAGAAATGTTTGGGCTTTTT（配列番号１５）
　HECW2#2：CCGGCCAGGGAAGTTAAAGTTAATTCTCGAGAATTAACTTTAACTTCCCTGGTTTTT（配列番号１６）
　HECW2#3：CCGGGCACAATACTTGGAGTCAATTCTCGAGAATTGACTCCAAGTATTGTGCTTTTT（配列番号１７）
　HECW2#4：CCGGGCTTACAATGACAAGATTGTTCTCGAGAACAATCTTGTCATTGTAAGCTTTTT（配列番号１８）
　HECW2#5：CCGGCCCTTATCTTAAGATGTCAATCTCGAGATTGACATCTTAAGATAAGGGTTTTT（配列番号１９）
　結果を図１～４に示す。DOCK11遺伝子、DENND2A遺伝子、LIPG遺伝子、HECW2遺伝子のshRNAにより、HBVのDNA量とcccDNA量を減少させることが可能であることがわかった。
（実施例３）HBV感染に対するshRNAの機能の確認
　PXBマウス（PhoenixBio Co., Ltd., Hiroshima, Japan）由来の新鮮ヒト肝細胞（PHH細胞）を用いて、HBVのヒト肝細胞への感染における、各遺伝子のshRNAの作用を確認した。PHH細胞を、以下のようにして培養することにより、実験を行った。まず、培養0日目に各遺伝子に対するshRNAを発現するレンチウイルスを常法により感染させた。HBV（Genotype C, 5 HBV DNA copies/cell）に感染させたHBV感染キメラマウスから採取した血清を、HBV接種源として、培養1日目に添加した。培養2日目に、細胞を３回洗浄し、エンテカビル（ETV）（10 nM）を添加した。培養7日目に細胞を回収し、HBVのDNA量、HBVのcccDNA量、各遺伝子のmRNA量を確認した。HBVのDNA量、HBVのcccDNA量、pg RNA量は、実施例１に記載の手法と同様にして定量した。各遺伝子のmRNA量は実施例２と同様にして定量した。また各遺伝子に対するshRNAは、各々配列番号２，７，１４，１７に示す塩基配列を有するもの（Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokyo, Japan,　TRCN0000369590、TRCN0000178923、TRCN0000372783、TRCN0000004791のレンチウイルス）を用いた。なお新鮮ヒト肝細胞（PHH細胞）の培養には、dHCGM培地（Yamasaki C, et al., J Hepatol. 2006, 44:749-57）を用いた。
　結果を図５～８に示す。DOCK11遺伝子又はDENND2A遺伝子に対するshRNAにより、cccDNAの量は劇的に減少し、ETV併用により検出感度以下に低下した。LIPG遺伝子又はHECW2遺伝子に対するshRNAにより、cccDNA量は減少し、ETV併用により相乗的な減少効果が確認された。
（実施例４）HBV感染に対するshRNAの機能の確認２
　実施例３と同様にして、PHH細胞を用いて、長期培養を行った場合のHBVのヒト肝細胞への感染における各遺伝子のshRNAの作用を確認した。PHH細胞を、以下のようにして培養することにより、実験を行った。まず、培養0日目に各遺伝子に対するshRNAを発現するレンチウイルスを常法により感染させた。HBV（Genotype C, 5 HBV DNA copies/cell）に感染させたHBV感染キメラマウスから採取した血清を、HBV接種源として、培養1日目に添加した。その後以下の（１）～（４）により培養を行った。
（１）HBVを感染させたPHH細胞を４週間培養した。
（２）HBVを感染させたPHH細胞を２週間培養し、その後に細胞を３回洗浄し、ETV（10 nM）を添加し、２週間培養を行った。
（３）HBVを感染させた後、培養2日目に、細胞を３回洗浄し、ETV（10 nM）を添加し、２週間培養を行った。その後細胞を３回洗浄してETVを除去し、２週間培養を行った。
（４）HBVを感染させた後、培養2日目に、細胞を３回洗浄し、ETV（10 nM）を添加し、４週間培養を行った。
　上記（１）～（４）の培養を行った後、細胞を回収し、各遺伝子のmRNA量、HBVのcccDNA量、pg RNA量を実施例１及び２に記載の手法と同様にして確認した。また各遺伝子に対するshRNAは、各々配列番号２，７，１４，１７に示す塩基配列を有するもの（Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokyo, Japan,　TRCN0000369590、TRCN0000178923、TRCN0000372783、TRCN0000004791のレンチウイルス）を用いた。
　結果を図９～１２に示す。図９～１２中、横軸の各項目の最後の数字は、上記（１）～（４）の培養条件を意味する。例えば、「sh　DOCK11　1」は、DOCK11遺伝子のshRNAを導入し、上記（１）の条件で培養した場合を示す。「cont」は各遺伝子のshRNAの導入を行わずに培養を行った結果である。
　３週間以上の長期培養により、4遺伝子とも単独でcccDNA量を検出限界以下まで減少させることがわかった。
（実施例５）ゲノム編集法による標的遺伝子の作用の確認
　HepG2ヒト肝癌由来細胞にHBVをトランスフェクトしたHepG2.2.15細胞において、CRISPR/Cas9システムを用いて、DENND2A遺伝子及びDock11遺伝子をノックダウンした。標的遺伝子をノックダウンさせたHepG2.2.15細胞について、実施例１の手法と同様にして、HBVのDNA量、HBVのcccDNA量、pg RNA量を確認した。
　結果を、図１４に示す。Dock11遺伝子をノックダウンすることにより、HepG2.2.15細胞において、対照に比較して5%程度にまでHBVのcccDNA量が減少することが確認された。Dock11遺伝子が、宿主細胞内でのHBVのcccDNAの維持に重要な役割を果たすことが示された。
（実施例６）HBV感染に対するshRNAの機能の確認３
　HBVをPHHに感染させた後にshRNAにより処理した場合の、HBVの増殖に対するshRNAの作用を確認した。PHHにHBVを感染させた後、１週間後にDock11遺伝子のshRNA（配列番号２）を導入し、培養液を交換しながら３週間培養を行った。その後、PHHについて実施例１及び実施例２の手法と同様にして、DOCK11遺伝子のmRNA発現量、HBVのcccDNA量、pg RNA量を確認した。
　結果を図１５に示す。Dock11遺伝子のshRNAは、HBVの感染が確立した細胞においても、HBVのcccDNA及びpgRNAを消失させることがわかった。これらの結果から、Dock11遺伝子が宿主細胞内でのHBV維持に貢献することが示唆された。
（実施例７）標的遺伝子の細胞内での局在
　各々の標的遺伝子の発現するタンパク質について、実施例１と同様の間接蛍光免疫染色を用いて、KM細胞株における各種タンパク質の細胞内の局在を確認した。ウサギポリクローナル抗HBcAg抗体に加えて、HBV-core、LIPG、HECW2、DENND2A、DOCK11に対する抗体として抗HBc モノクローナル抗体、（特殊免疫研究所／2AHC21）、Anti-LIPG antibody produced in rabbit(シグマアルドリッヒ/ HPA016966-100UL)、Anti-NEDL2(HECW2) antibody - N-terminal（アブカム/ab154888）、Anti-NEDL2 antibody - N-terminal（アブカム/ab154888）、DOCK 11 Antibody (D-17)(SANTA CRUZ/sc-74610)を用いた。
　結果を、図１６に示す。DOCK11は、HBVのタンパク質と同じ位置に局在することがわかった。
（実施例８）HCVに対するshRNAの機能の確認
　Dock11遺伝子に対するshRNAの抗ウイルス活性を、JFH1株のレプリコンシステムを用いて評価した。HCV複製解析は、Huh 7.5細胞に合成JFH1-RNAをトランスフェクトすることにより行った。Huh 7.5細胞に、DOCK11 shRNA #2を導入することにより、DOCK11恒常的ノックダウン細胞を作製した。controlとしてcont shRNAを導入した細胞を用いた。各shRNAを導入した後のHuh 7.5細胞に、1μg合成RNA（JFH1-RNA）を、TransIT(R)-mRNA Transfection Kit（Mirus社）によりトランスフェクトした。トランスフェクションの24、48、72時間後に、トータルRNAをHigh Pure RNA Isolation Kit（Roche社）を用いて単離し、cDNAをhigh-capacity cDNA reverse transcription kit（Applied Biosystems, Carlsbad, CA）を用いて合成した。HCV RNAを、Shirasaki, T. et al. J Infect Dis 202, 75-85, doi:10.1086/653081 (2010)に記載の方法と同様にして検出した。またDOCK11遺伝子の発現は実施例２と同様の方法により、mRNA量を測定することにより行った。
　結果を図１７に示す。DOCK11遺伝子に対するshRNAにより、Huh7.5細胞内におけるDOCK11遺伝子の発現量が減少していた。また、DOCK11遺伝子に対するshRNAにより、Huh7.5細胞内におけるHCVの複製が抑えられることがわかった。HCVのRNAを導入した後、１～３日間（24時間、48時間、72時間）において、効果的にHCVのRNAの複製が抑制されることがわかった。
（実施例９）ピロールイミダゾールポリアミドによる標的遺伝子の発現抑制
　HepG2ヒト肝癌由来細胞にHBVをトランスフェクトしたHepG2.2.15細胞に、標的遺伝子に特異的に結合し得るピロールイミダゾールポリアミドを5μMで培養開始時から添加して、継時変化を観察する。また、一定時間後に細胞を回収し、実施例１及び２と同様の手法により、DOCK11遺伝子のmRNA発現量、HBVのDNA量、HBVのcccDNA量、pg RNA量を測定する。
（実施例１０）HBVに対するLIPG阻害剤の作用の確認
　Huh7細胞株にHBVを発現するコンストラクト（HBV-C：名古屋市立大学　田中靖人博士より提供）を導入した。導入５日後に、LIPG阻害剤（GSK264220A）を1μM～100μMで添加して培養を行った。LIPG阻害剤を添加した一週間後に、実施例１及び２と同様にして、HBVのDNA量、HBVのcccDNA量を確認した。
　結果を図２０に示す。LIPG阻害剤の濃度依存的に、HBVのDNA量、HBVのcccDNA量が低下しており、HBVの感染が阻害されることが確認された。
（実施例１１）　Cdc42遺伝子に対するshRNAの機能の確認
　実施例２と同様にして、HBV遺伝子維持のための遺伝子発現量には差が認められないが、DOCK11と相互作用することが知られているCdc42をコードするCdc42遺伝子について、５種のshRNAを作製し、各shRNAによる抗Ｂ型肝炎ウイルス作用を確認した。
　HepG2.2.15細胞に、常法に従って、Cdc42遺伝子に対する各種shRNAを発現するレンチウイルス（Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokyo, Japan,　TRCN0000047631、TRCN0000047629、TRCN0000047628、TRCN0000047632、TRCN0000310772、５種のshRNAの配列#1～#5を以下に示す）を感染させ、１週間後に、HBVのDNA量、HBVのcccDNA量を確認した。HBVのDNA量、HBVのcccDNA量は、実施例１と同様にして測定した。
　CDC42 shRNA #1：CCGGCCAAGAACAAACAGAAGCCTACTCGAGTAGGCTTCTGTTTGTTCTTGGTTTTTG（配列番号５５）
　CDC42 shRNA #2：CCGGCGGAATATGTACCGACTGTTTCTCGAGAAACAGTCGGTACATATTCCGTTTTTG（配列番号５６）
　CDC42 shRNA #3：CCGGCCCTCTACTATTGAGAAACTTCTCGAGAAGTTTCTCAATAGTAGAGGGTTTTTG（配列番号５７）
　CDC42 shRNA #4：CCGGCAGATGTATTTCTAGTCTGTTCTCGAGAACAGACTAGAAATACATCTGTTTTTG（配列番号５８）
　CDC42 shRNA #5：CCGGGACTCTGTAACAGACTAATTGCTCGAGCAATTAGTCTGTTACAGAGTCTTTTTG（配列番号５９）
　結果を図２１に示す。Cdc42遺伝子のshRNAにより、HBVのDNA量とcccDNA量を減少させることが可能であることがわかった。
（実施例１２）　インフルエンザウイルス感染に対するshRNAの機能の確認
　ヒト肺腺癌細胞株A549細胞にインフルエンザウイルスを感染させ、DOCK11遺伝子又はCdc42遺伝子のshRNAを導入した場合の、インフルエンザウイルスの核蛋白質の挙動を確認した。
　まず、A549細胞を10cm dishに播種した。播種後、実施例２及び実施例１１と同様にして、cont shRNA、DOCK11 shRNA #2、CDC42 shRNA #1～ #5を含むレンチウイルスをそれぞれ、A549細胞に感染させた。感染48時間後に、puromycin 5μg/ml添加した。その後、１週間細胞を培養し、shRNAを導入した細胞を選択した。選択した細胞を、チャンバースライドに播種した。MDCK細胞から分離したインフルエンザウイルス（WSN株）（金沢大学　榎並正芳博士より入手）を感染させた。インフルエンザウイルスの感染24時間後に、細胞をアセトン・メタノールにより固定し、インフルエンザの核蛋白質（NP）を、免疫染色をInfluenza A H1N1 HA Antibody（thermofisher PA5-34929）を用いて行い、観察した。
　結果を図２２に示す。DOCK11遺伝子又はCdc42遺伝子に対するshRNAを導入した場合は、宿主細胞の核内において、インフルエンザウイルスの核蛋白質の局在が抑制されていることが確認された。このことから、DOCK11がインフルエンザウイルスの複製に関与していることが示唆された。
　本発明の抗ウイルス薬によれば、従来のＢ型肝炎ウイルス増殖抑制剤と比較して、HBV　cccDNA量を大幅に減少させることが可能であり、完全に除去できる可能性がある。本発明の抗ウイルス薬は、従来の抗ウイルス薬とは作用メカニズムが異なり、ウイルスが宿主細胞の表面の膜から侵入した後、核内に到達するまでの輸送経路に作用すると考えられる。よって本発明の抗ウイルス薬は、HBVのみならず、種々のウイルスに対して抗ウイルス効果を示すと考えられる。また本発明の抗ウイルス薬は、従来の抗ウイルス薬と併用することにより、相乗的に抗ウイルス効果を発揮するものと考えられる。本発明の抗ウイルス薬は、ウイルス感染の予防、ウイルス感染の寛解又は根治を可能とし、ウイルス感染による疾病の治療に大きく貢献することが期待される。さらには、本発明の標的遺伝子を指標とすることにより、新規なメカニズムによる抗ウイルス薬をスクリーニングすることができる。

Claims (24)

  1. 宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を有効成分とする抗ウイルス薬であって、標的遺伝子が、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子からなる群より選択される１又は２以上の遺伝子である、抗ウイルス薬。
  2. 標的遺伝子が、DOCK11遺伝子である、請求項１に記載の抗ウイルス薬。
  3. 標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質が、標的遺伝子またはその転写産物に対するshRNA、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ピロールイミダゾールポリアミドからなる群より選択される１又は２以上の化合物である、請求項１又は２に記載の抗ウイルス薬。
  4. 標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質が、以下のいずれかから選択される塩基配列を認識する、請求項１～３のいずれかに記載の抗ウイルス薬：
    ・CCAACAGGGTGCTTACATATT（配列番号３６）
    ・GTACTAGACACCATATCATTT（配列番号３７）
    ・ACTAAATGAGCGGCTAATTAA（配列番号３８）
    ・TGATGGCCATAACCCATTAAT（配列番号３９）
    ・CCAGGCTACTTGAATCTGAAT（配列番号４０）
    ・CTGAAGGGACTAGGCAATAAA（配列番号４１）
    ・CCAATGAAGGAGAACCCTTAT（配列番号４２）
    ・CCTAGTGCAGCCCTATTCTTT（配列番号４３）
    ・CTAGTGCAGCCCTATTCTTTA（配列番号４４）
    ・ACGATGTCTTGGGATCAATTG（配列番号４５）
    ・ATGCAGGCAACTTCGTGAAAG（配列番号４６）
    ・CCGTTGTAATAGCATTGGCTA（配列番号４７）
    ・CGTCACCCTTTATGGCACTAA（配列番号４８）
    ・TTACACGGATGCGGTCAATAA（配列番号４９）
    ・GCCCAAACATTTCTTTGAGAT（配列番号５０）
    ・CCAGGGAAGTTAAAGTTAATT（配列番号５１）
    ・GCACAATACTTGGAGTCAATT（配列番号５２）
    ・GCTTACAATGACAAGATTGTT（配列番号５３）
    ・CCCTTATCTTAAGATGTCAAT（配列番号５４）
    ・上記配列番号３６～５４のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列。
  5. 標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質が、以下のいずれかから選択される塩基配列を含むshRNAである、請求項１～４のいずれかに記載の抗ウイルス薬：
    ・CCGGCCAACAGGGTGCTTACATATTCTCGAGAATATGTAAGCACCCTGTTGGTTTTTG（配列番号１）
    ・CCGGGTACTAGACACCATATCATTTCTCGAGAAATGATATGGTGTCTAGTACTTTTTG（配列番号２）
    ・CCGGACTAAATGAGCGGCTAATTAACTCGAGTTAATTAGCCGCTCATTTAGTTTTTTG（配列番号３）
    ・CCGGTGATGGCCATAACCCATTAATCTCGAGATTAATGGGTTATGGCCATCATTTTTG（配列番号４）
    ・CCGGCCAGGCTACTTGAATCTGAATCTCGAGATTCAGATTCAAGTAGCCTGGTTTTTG（配列番号５）
    ・CCGGCTGAAGGGACTAGGCAATAAACTCGAGTTTATTGCCTAGTCCCTTCAGTTTTTTG（配列番号６）
    ・CCGGCCAATGAAGGAGAACCCTTATCTCGAGATAAGGGTTCTCCTTCATTGGTTTTTTG（配列番号７）
    ・CCGGCCTAGTGCAGCCCTATTCTTTCTCGAGAAAGAATAGGGCTGCACTAGGTTTTTTG（配列番号８）
    ・CCGGCTAGTGCAGCCCTATTCTTTACTCGAGTAAAGAATAGGGCTGCACTAGTTTTTTG（配列番号９）
    ・CCGGACGATGTCTTGGGATCAATTGCTCGAGCAATTGATCCCAAGACATCGTTTTTTG（配列番号１０）
    ・CCGGATGCAGGCAACTTCGTGAAAGCTCGAGCTTTCACGAAGTTGCCTGCATTTTTTG（配列番号１１）
    ・CCGGCCGTTGTAATAGCATTGGCTACTCGAGTAGCCAATGCTATTACAACGGTTTTTG（配列番号１２）
    ・CCGGCGTCACCCTTTATGGCACTAACTCGAGTTAGTGCCATAAAGGGTGACGTTTTTG（配列番号１３）
    ・CCGGTTACACGGATGCGGTCAATAACTCGAGTTATTGACCGCATCCGTGTAATTTTTG（配列番号１４）
    ・CCGGGCCCAAACATTTCTTTGAGATCTCGAGATCTCAAAGAAATGTTTGGGCTTTTT（配列番号１５）
    ・CCGGCCAGGGAAGTTAAAGTTAATTCTCGAGAATTAACTTTAACTTCCCTGGTTTTT（配列番号１６）
    ・CCGGGCACAATACTTGGAGTCAATTCTCGAGAATTGACTCCAAGTATTGTGCTTTTT（配列番号１７）
    ・CCGGGCTTACAATGACAAGATTGTTCTCGAGAACAATCTTGTCATTGTAAGCTTTTT（配列番号１８）
    ・CCGGCCCTTATCTTAAGATGTCAATCTCGAGATTGACATCTTAAGATAAGGGTTTTT（配列番号１９）
    ・上記配列番号１～１９のいずれか１に記載の塩基配列において、１～数個の塩基が、置換、欠失、付加又は挿入されてなる塩基配列。
  6. ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサ熱ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、フィロウイルス、エボラウイスル、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルスから選択されるウイルスである、請求項１～５のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
  7. ウイルスが、肝炎ウイルスである、請求項１～６のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
  8. ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、請求項１～７のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
  9. ウイルス増殖抑制剤と併用される、請求項１～８のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
  10. 請求項１～９のいずれかに記載の抗ウイルス薬を含有する、ウイルス感染に伴う疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
  11. 宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子であって、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子からなる群より選択される１又は２以上の遺伝子を標的遺伝子とし、被験物質の中から、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を抗ウイルス薬として選択することを含む、抗ウイルス薬のスクリーニング方法。
  12. 以下の（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む、請求項１１に記載の抗ウイルス薬のスクリーニング方法：
    （Ａ）細胞が標的遺伝子を発現する系において、細胞を被験物質に接触させる工程；
    （Ｂ）細胞内における標的遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させた場合の細胞内における標的遺伝子の発現量と、被験物質を接触させない場合の細胞内における標的遺伝子の発現量とを比較する工程；
    （Ｃ）上記（Ｂ）の比較結果に基づいて、細胞内の標的遺伝子の発現量の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬としてスクリーニングする工程。
  13. 以下の（ａ）～（ｃ）の工程を含む、請求項１１に記載の抗ウイルス薬のスクリーニング方法：
    （ａ）被験物質の存在下で、標的遺伝子がコードするタンパク質と、標的遺伝子がコードするタンパク質と相互作用するタンパク質とを接触させる工程；
    （ｂ）標的遺伝子がコードするタンパク質と、標的遺伝子がコードするタンパク質と相互作用するタンパク質との結合能を測定し、被験物質の存在下における結合能と被験物質の非存在下における結合能とを比較する工程；
    （ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、標的遺伝子がコードするタンパク質と標的遺伝子がコードするタンパク質と相互作用するタンパク質との結合能の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬として選択する工程。
  14. 以下の（ａ）～（ｃ）の工程を含む、請求項１１に記載の抗ウイルス薬のスクリーニング方法：
    （ａ）被験物質の存在下で、標的遺伝子がコードするタンパク質と、標的遺伝子がコードするタンパク質の基質とを接触させる工程；
    （ｂ）標的遺伝子がコードするタンパク質の酵素活性を測定し、被験物質の存在下における酵素活性と被験物質の非存在下における酵素活性とを比較する工程；
    （ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、標的遺伝子がコードするタンパク質の酵素活性の低下をもたらす被験物質を抗ウイルス薬として選択する工程。
  15. 請求項１１～１４のいずれかに記載の抗ウイルス薬のスクリーニング方法によりスクリーニングされた、抗ウイルス薬。
  16. ウイルスが感染した後の宿主細胞について２以上の有限個の遺伝子の発現パターンを解析し、宿主細胞由来の遺伝子の中から、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法。
  17. 以下の工程を含む、請求項１６に記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法：
    （１）単一の生体から採取されたウイルス陽性の検体組織からウイルス陽性細胞株を樹立する工程；
    （２）ウイルス陽性細胞株を継代培養し、ウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞を作製する工程；
    （３）工程（２）にて得られたウイルス陽性細胞とウイルス陰性細胞について、単一細胞毎における２以上の有限個の遺伝子の発現パターンを解析する工程；
    （４）ウイルス陽性細胞の遺伝子の発現パターンと、ウイルス陰性細胞の遺伝子の発現パターンとを比較する工程；
    （５）ウイルス陰性細胞に比較して、ウイルス陽性細胞において発現量が高い遺伝子を、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子として選択する工程。
  18. ウイルスが、ウイルス由来の遺伝子から3'末端にポリＡが含まれる転写産物を発現するものであり、
    工程（３）の遺伝子の発現パターンの解析により、ウイルス由来の遺伝子を発現している細胞がウイルス陽性細胞と同定され、ウイルス由来の遺伝子を発現している細胞がウイルス陰性細胞と同定される、
    請求項１７に記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法。
  19. ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスであり、
    宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子が、宿主細胞内でＢ型肝炎ウイルス由来のｃｃｃＤＮＡを維持する作用を有する遺伝子である、
    請求項１８に記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を検出する方法。
  20. 請求項１６～１９のいずれかに記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を選択する方法により選択された、宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子。
  21. 宿主細胞由来の遺伝子であって、宿主細胞内でＢ型肝炎ウイルス由来のｃｃｃＤＮＡを維持する作用を有する遺伝子。
  22. 遺伝子が、DOCK11遺伝子、LIPG遺伝子、DENND2A遺伝子、及びHECW2遺伝子から選択される１又は２以上の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子である、請求項２０又は２１に記載の遺伝子。
  23. 請求項２０～２２のいずれかに記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を有効成分とする抗ウイルス薬。
  24. 請求項２０～２２のいずれかに記載の宿主細胞内でウイルス由来の核酸を維持する作用を有する遺伝子を標的遺伝子とし、被験物質の中から、標的遺伝子の発現又は標的遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制し得る物質を抗ウイルス薬として選択することを含む、抗ウイルス薬のスクリーニング方法。
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