WO2023176861A1 - 宿主因子ｄｅｎｎｄ２ａをターゲットとした抗ｂ型肝炎ウイルス剤 - Google Patents

宿主因子ｄｅｎｎｄ２ａをターゲットとした抗ｂ型肝炎ウイルス剤 Download PDF

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弘志 柳川
典子 田畠
真由子 井手
裕子 米村
哲 伊藤
周一 金子
政夫 本多
和寿 村居
敦也 石田
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to an anti-hepatitis B virus agent targeting the host factor DENND2A.
  • HBV hepatitis B virus
  • HBV exists in the nucleus as incompletely double-stranded DNA (relaxed-circular DNA; rcDNA).
  • rcDNA is converted into covalently closed circular DNA (cccDNA) in the nucleus (Non-Patent Document 2).
  • cccDNA covalently closed circular DNA
  • Non-Patent Document 3 HBV utilizes the host's DNA repair mechanism, particularly the ATR signal transduction pathway, when synthesizing cccDNA from rcDNA.
  • HBV can maintain a latent state within cells as stably inactivated cccDNA.
  • the immune system is impaired by chemotherapy or hematopoietic stem cell transplantation, HBV reactivation occurs.
  • HCC advanced hepatocellular carcinoma
  • HBV-infected hepatocytes to HCC cells express reduced amounts of HBV protein and mRNA intracellularly.
  • Cell lines established from HCC usually do not express HBV transcripts, except for cells that contain HBV DNA integrated into the host genome. Cell lines that continue to express HBV transcripts are very useful for identifying host genes required for HBV maintenance. Therefore, Hashimoto et al. established the HC1 cell line, which maintains a very low rate of HBV infection (approximately 1 in 3000 cells), and conducted single-cell transcriptome analysis (Nx1-Seq) to detect HBV infection.
  • Nx1-Seq single-cell transcriptome analysis
  • Non-Patent Document 4 Four host genes, LIPG, DOCK11, DENND2A, and HECW2, that are highly expressed in cells were identified (Non-Patent Document 4, Patent Document 1).
  • DENND2A DENN domain-containing protein 2A
  • Proteins containing DENN domains directly interact with members of the Rab family of low molecular weight GTPases, and DENN domains enzymatically function as Rab-specific guanine nucleotide exchange factors (Non-Patent Document 5).
  • Rho family protein RHOBTB3 was recently shown to be a RAB9 effector protein (Non-Patent Document 6). Rho family proteins are commonly associated with processes that control the actin cytoskeleton. Additionally, members of the DENND2 family have been reported to function as guanine nucleotide exchange factors for RAB9 transport between late endosomes and the trans-Golgi network. Components of the BLOC complex involved in transport to lysosome-like organelles are known to associate with actin filaments (Non-Patent Document 7) and interact with RAB9 (Non-Patent Document 8).
  • Non-Patent Document 9 It has been reported that the DENND2 GDP-GTP exchange factor targets actin filaments and controls RAB9-dependent transport of mannose-6-phosphate receptors to lysosomes.
  • Patent Document 4 Patent Document 1
  • Hashimoto et al. showed that HBV replication was reduced by knocking down DENND2A with lenti-shRNA, but the relationship between DENND2A and HBV DNA and cccDNA was is unknown.
  • the purpose of the present invention is to provide a novel anti-HBV drug targeting DENND2A.
  • the present inventors identified peptides with strong binding activity to DENND2A, and revealed that these peptides have the activity of reducing HBV DNA and cccDNA in host cells. Furthermore, as a means of selectively delivering drugs into hepatocytes, we have newly established an anti-ASGR single chain antibody that can strongly recognize the asialoglycoprotein receptor (ASGR) present on the surface of hepatocytes. Using this method, we created a construct in which a peptide that promotes cell membrane permeation, a nuclear translocation signal, etc.
  • ASGR asialoglycoprotein receptor
  • the present invention which was completed through the above-described intensive research, includes the following aspects.
  • An anti-hepatitis B virus agent that contains as an active ingredient a substance that binds to DENND2A and inhibits DENND2A function.
  • the substance binds to any region within the region of residues 1 to 775 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35, or to any region in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37. , the anti-hepatitis B virus agent described in [1].
  • the inhibition of the function of DENND2A is at least one selected from inhibition of binding of DENND2A to SASH1 and inhibition of suppression of NF- ⁇ B transcriptional activity by DENND2A, according to [1] or [2].
  • Anti-hepatitis B virus agent is at least one selected from inhibition of binding of DENND2A to SASH1 and inhibition of suppression of NF- ⁇ B transcriptional activity by DENND2A, according to [1] or [2].
  • Viral agent (1) A polypeptide with the sequence IHDRCTGCLPVKRGSH (SEQ ID NO: 1). (2) A polypeptide with the sequence of ADKGCLPIGCRYGTSY (SEQ ID NO: 2). (3) A polypeptide with the sequence LPSPDAPCLPVKRGSP (SEQ ID NO: 3). (4) A partial polypeptide of SASH1 containing the region of CLPVKRGS (SEQ ID NO: 84). (5) A polypeptide having sequence identity of 80% or more and less than 100% with any of (1) to (4).
  • the antibody, antibody fragment or single chain antibody is A heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 10, 16 or 22, or an amino acid sequence in which some residues are substituted and which has 80% or more identity with the amino acid sequence;
  • a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 11, 17 or 23, or an amino acid sequence in which some residues are substituted and which has 80% or more identity with the amino acid sequence;
  • a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 12, 18 or 24, or an amino acid sequence in which some residues are substituted and which has 80% or more identity with the amino acid sequence;
  • a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, 13, 19 or 25, or an amino acid sequence in which some residues are substituted and which has 80% or more identity with the amino acid sequence;
  • a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 14, 20 or 26, or an amino acid sequence in which some
  • the anti-hepatitis B virus agent described in [6].
  • the anti-hepatitis B virus agent according to [9], wherein the cell membrane permeation promoting molecule is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29 or 30.
  • polypeptide selected from the following polypeptides (1) to (5) as a DENND2A-binding peptide.
  • a polypeptide with the sequence IHDRCTGCLPVKRGSH SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide with the sequence of ADKGCLPIGCRYGTSY SEQ ID NO: 2.
  • a polypeptide with the sequence LPSPDAPCLPVKRGSP SEQ ID NO: 3.
  • a partial polypeptide of SASH1 containing the region of CLPVKRGS SEQ ID NO: 84).
  • a DENND2A-binding peptide consisting of at least one polypeptide selected from the following polypeptides (1) to (5).
  • a polypeptide with the sequence IHDRCTGCLPVKRGSH (SEQ ID NO: 1).
  • a polypeptide with the sequence of ADKGCLPIGCRYGTSY (SEQ ID NO: 2).
  • a polypeptide with the sequence LPSPDAPCLPVKRGSP SEQ ID NO: 3
  • a partial polypeptide of SASH1 containing the region of CLPVKRGS (SEQ ID NO: 84).
  • a method of preventing hepatitis B virus infection in a patient infected with hepatitis B virus comprising administering an effective amount of the anti-hepatitis B virus agent according to any one of [1] to [11] to said patient.
  • the present invention provides for the first time an anti-HBV agent that binds to DENND2A and has the effect of inhibiting the function of DENND2A.
  • an anti-HBV agent of the present invention intracellular HBV DNA and cccDNA can be reduced, so it is expected that hepatitis B can be completely cured.
  • B-3 Effect of DENND2A-binding peptide on cccDNA copy number.
  • B-4) Effect of DENND2A-binding peptide on pgRNA copy number. Homology search in BLASTP. Anti-HBV activity of DENND2A-binding peptides in Huh7-NTCP-YFP cells.
  • A Assay time schedule.
  • B-Left Effect of nuclear localization signal
  • - DENND2A-binding peptide on HBV-DNA copy number and cccDNA copy number.
  • B-Right Effect of nuclear import signal (+) DENND2A-binding peptide on HBV-DNA copy number and cccDNA copy number.
  • the C-terminus of the VH chain and the N-terminus of VL are connected via a peptide linker.
  • Scheme for creating a mouse single-chain antibody cDNA library Scheme for creating a cDNA library of human single chain antibodies. Selection experiment for single chain antibodies that bind to ASGR using the IVV method. Pulldown assay using ASGR-binding single chain antibody (1) Pull-down assay using ASGR-binding single chain antibody (2) Intracellular mechanism of fusion of DENND2A-binding peptide and anti-asialoglycoprotein receptor antibody. Construct of fusion of DENND2A-binding peptide and anti-asialoglycoprotein receptor antibody. Anti-HBV activity of DENND2A-binding peptides in PXB cells.
  • B-1) Effect of DENND2A-binding peptide 10M-DEN3N on HBV-DNA copy number.
  • B-2) Effect of DENND2A-binding peptide 10M-DEN3N on cccDNA copy number.
  • B-3) Effect of DENND2A-binding peptide 10M-DEN3SN on HBV-DNA copy number.
  • B-4) Effect of DENND2A-binding peptide 10M-DEN3SN on cccDNA copy number.
  • the amount of each mRNA was normalized using the amount of GAPDH mRNA. Data represent mean ⁇ SEM of three independent experiments. *p ⁇ 0.05. 10M-DEN3SN promotes the expression of anti-HBV factors downstream of NF- ⁇ B in HepG2-NFkB-Luc cells. After treating HepG2-NFkB-Luc cells with 100nM 10M-DEN3SN for 6 hours, real-time RT-PCR was performed using RNA extracted from the cells as a template. As a primer set, primers specific for (A) IL-6, (B) IL-1 ⁇ , (C) IFN ⁇ , and (D) IFN ⁇ were used. Each mRNA amount was normalized using the GAPDH mRNA amount. Data represent mean ⁇ SEM of three independent experiments.
  • HepG2-NFkB-Luc cells were transfected with HisBioFLAG-DENND2A using Lipofectamine2000 in the amount of plasmid according to the recommended protocol. After 24 hours, the cells were stimulated with 0-250 ng/ml LPS for 5 hours, and a luciferase assay was performed.
  • (F, G) HepG2-NFkB-Luc cells were transfected with DENND2A siRNA using Lipofectamine3000, and real-time RT-PCR was performed 72 hours later.
  • primers specific for (F) IL-6 and (G) IL-1 ⁇ were used. Each mRNA amount was normalized using the GAPDH mRNA amount. Data represent the mean ⁇ SEM of three (A, C, D, E) or two (B, F, G) independent experiments. *p ⁇ 0.05. Knockdown of SASH1 suppresses NF- ⁇ B activity.
  • Huh7 cells or (B) HepG2-NFkB-Luc cells were transfected with SASH1siRNA using Lipofectamine3000.
  • primers specific for (D) IL-6 and (E) IL-1 ⁇ were used as a primer set. Each mRNA amount was normalized using the GAPDH mRNA amount.
  • F, G HepG2-NFkB-Luc cells were transfected with SASH1 siRNA using Lipofectamine3000, and 72 hours later, they were stimulated with 100 ng/ml for 5 hours and real-time RT-PCR was performed.
  • primers specific for (F) IL-6 and (G) IL-1 ⁇ were used. Each mRNA amount was normalized using the GAPDH mRNA amount. Data represent the mean ⁇ SEM of three (A, C, D, E) or two (B, F, G) independent experiments. *p ⁇ 0.05.
  • NF- ⁇ B activation by 10M-DEN3SN requires SASH1.
  • HepG2-NFkB-Luc cells were transfected with SASH1 siRNA using Lipofectamine3000 and 72 hours later stimulated with 100 nM 10M-DEN3SN for 6 hours, and
  • (A) luciferase assay was performed.
  • (B) Real-time RT-PCR was performed using IFN ⁇ -specific primers. The amount of IFN ⁇ mRNA was normalized using the amount of GAPDH mRNA. Data represent mean ⁇ SEM of two independent experiments. *p ⁇ 0.05. Sample administration schedule in the chimeric mouse experiment of Example 17. Measurement of HBsAg in Example 17. Comparison of 10M-DEN3SN and control (PBS). Measurement of HBeAg in Example 17.
  • anti-hepatitis B virus includes treatment of HBV infection, prevention of HBV infection, inhibition of HBV proliferation, treatment of hepatitis B, and prevention of hepatitis B. Ru.
  • anti-HBV agent of the present invention By administering the anti-HBV agent of the present invention to a hepatitis B patient, it is possible to suppress the proliferation of HBV within the patient's body (in the liver) and treat hepatitis B.
  • an anti-HBV agent to an HBV carrier before the onset of hepatitis B, it is possible to prevent the proliferation of HBV in the carrier and prevent the onset of hepatitis B (prevention of hepatitis B).
  • the anti-HBV agent of the present invention contains as an active ingredient a substance that binds to DENND2A (DENN domain-containing protein 2A) and inhibits the function of DENND2A.
  • Human DENND2A has two isoforms, 1009-residue isoform 1 and 795-residue isoform 2, as shown in Figure 2.
  • the nucleotide sequence of the coding region of human DENND2A mRNA, which is registered in NCBI's GenBank as NM_015689.5, and the amino acid sequence of DENND2A isoform 1 encoded by this are registered as SEQ ID NOs: 34 and 35 in the sequence listing, and as NM_001318053.2.
  • the nucleotide sequence of the human DENND2A mRNA coding region and the amino acid sequence of DENND2A isoform 2 encoded thereby are shown in SEQ ID NOs: 36 and 37, respectively. Residues 1 to 775 of isoform 1 and residues 1 to 775 of isoform 2 have the same sequence.
  • the DENND2A-binding peptide identified in the following example is a peptide obtained by IVV screening using the 795-residue isoform 2 as bait, so the substance used as the active ingredient of the anti-HBV agent is DENND2A isoform 1.
  • Inhibition of the function of DENND2A is, for example, at least one selected from inhibition of binding of DENND2A to SASH1 (SAM and SH3 domain containing 1) and inhibition of suppression of NF- ⁇ B (nuclear factor kappa-B) transcriptional activity by DENND2A. It may be one type (see Example 16 below).
  • Substances that bind to the region of residues 1 to 775 of DENND2A isoform 1 or to isoform 2 and inhibit the function of DENND2A include, for example, An antibody, antibody fragment, single chain variable fragment (scFv), or aptamer that recognizes and binds to the region or isoform 2, and is selective for the region of residues 1 to 775 or isoform 2.
  • Examples include polypeptides that bind to.
  • the term antibody fragment is synonymous with the term antigen-binding fragment of an antibody, and includes Fab, Fab', F(ab') 2 , and the like. There are no particular limitations on the antibody fragment as long as it maintains antigen-binding properties.
  • the anti-HBV agent of the present invention may contain, for example, at least one polypeptide selected from the following polypeptides (1) to (5) as an active ingredient.
  • polypeptides (1) to (5) are the name of each polypeptide used in the following examples. Hereinafter, these polypeptides may be referred to as "DENND2A-binding peptides.”
  • ENP4-3 (2) A polypeptide with the sequence of ADKGCLPIGCRYGTSY (SEQ ID NO: 2).
  • [DENP4-42] (3) A polypeptide with the sequence LPSPDAPCLPVKRGSP (SEQ ID NO: 3).
  • [DENP4-3S] (4) A partial polypeptide of SASH1 containing the region of CLPVKRGS (SEQ ID NO: 84). (5) A polypeptide having sequence identity of 80% or more and less than 100% with any of (1) to (4).
  • Polypeptides (1) and (2) are polypeptides selected from the IVV library in a selection experiment using Biacore for peptides that bind to DENND2A in the following examples, and whose anti-HBV activity was confirmed by pull-down assays, etc. be.
  • (3) is a polypeptide designed based on the homology search results of the sequence of (1) and whose anti-HBV activity was confirmed by pull-down assay etc., and is a polypeptide from No. 1011 to SASH1 (NP_056093.3, SEQ ID NO: 43). It is based on the region of amino acid No. 1026.
  • the test substance prepared using DENP4-3S in (3) was used in an in vivo administration experiment to confirm anti-HBV activity. Similar to DENP4-3S, substances other than 3S are also useful as anti-HBV agents.
  • the partial polypeptide (4) is a partial region of SASH1 (NP_056093.3, SEQ ID NO: 43), and is a region having high homology with the DENND2A-binding peptide DENP4-3, CLPVKRGS (SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 43). It is a polypeptide consisting of a partial region including the region of amino acids 1018 to 1025 in the SASH1 sequence shown in Figure 8; The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 (nucleotide sequence of the coding region of NM_015278.5) is shown in SEQ ID NO: 42.
  • CLPVKRGS is a sequence common to DENP4-3 and DENP4-3S, and as shown in the Examples below, DENP4-3S, which is an example of a SASH1 fragment containing this common sequence, has anti-HBV activity. Therefore, a polypeptide composed of a partial region of SASH1 including this common region also has anti-HBV activity and is useful as an anti-HBV agent.
  • the chain length of the polypeptide (4) is not particularly limited, but for convenience of synthesis and delivery into hepatocytes, for example, within 100 residues, within 80 residues, within 70 residues, within 60 residues, within 50 residues, etc. The size may be within residues, within 40 residues, within 30 residues, within 25 residues, or within 20 residues.
  • the polypeptide in (5) is a polypeptide that has 80% or more sequence identity with the original polypeptide, which is obtained by modifying some of the residues in any of the polypeptides in (1) to (4). . It is well known in the art that even if only a small number of residues are modified, the activity of a polypeptide can be maintained at the same or higher level.
  • the original sequence in which a small number of residues (for example, 1 to 4 residues, 1 to 3 residues, 1 or 2 residues, or 1 residue) of the polypeptides (1) to (4) are modified A polypeptide having an identity of 80% or more, for example 85% or more, or 90% or more with the original polypeptide can also exhibit anti-HBV activity in the same way as the original polypeptide, and is useful as an anti-HBV agent.
  • the modification of a residue here is a substitution, deletion, insertion, or addition, and is typically a substitution.
  • identity of amino acid sequences is defined as aligning two amino acid sequences to be compared so that as many amino acid residues as possible match, and dividing the number of matching amino acid residues by the total number of amino acid residues. It is expressed as a percentage.
  • gaps may be inserted into one or both of the two sequences to be compared, if necessary.
  • sequence alignment can be performed using well-known programs such as BLAST, FASTA, CLUSTAL W, and the like.
  • the total number of amino acid residues mentioned above is the number of residues where one gap is counted as one amino acid residue. If the total number of amino acid residues counted in this way differs between the two sequences being compared, the percent identity is the total number of amino acid residues in the longer sequence, and the number of matched amino acid residues. Calculated by dividing.
  • Amino acids with similar side chains have similar chemical properties.
  • Grouping amino acids by side chain similarity for example, groups of amino acids with aliphatic side chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine), groups of amino acids with aliphatic hydroxyl side chains (serine, threonine) , the group of amino acids with amide-containing side chains (asparagine, glutamine), the group of amino acids with aromatic side chains (phenylalanine, tyrosine, tryptophan), the group of amino acids with basic side chains (arginine, lysine, histidine), It can be classified into the group of amino acids with acidic side chains (aspartic acid, glutamic acid), the group of amino acids with sulfur-containing side chains (cysteine, methionine), etc.
  • a substitution for example, groups of amino acids with aliphatic side chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine), groups of
  • polyethylene glycol (PEG) chains are added to improve the in vivo stability of peptides and increase their half-life in the blood (Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3): 180-90. and Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36):12962-7., etc.), sugar chains are added mainly to the N-terminus or C-terminus (J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126 (43):14013-22 and Angew Chem Int Ed Engl. 2004 Mar 12;43(12):1516-20, etc.), and at least some of the amino acid residues are D-configured (J Pharmacol Exp Ther.
  • polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: X polypeptide represented by SEQ ID NO:
  • polypeptide represented by SEQ ID NO: The term ⁇ sequence'' refers to a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. It includes polypeptides having a structure in which other functional molecules are added or linked, such as polypeptides that have the effect of enhancing delivery to the liver.
  • inventions include embodiments containing a polypeptide having a structure in which another functional molecule is added to polypeptide X as an active ingredient. Any functional molecule may be linked as long as it does not impair the anti-HBV activity of the polypeptide.
  • polypeptides (1) to (3) and the polypeptides (5) polypeptides that have sequence identity of 80% or more and less than 100% with any of (1) to (3) have a chain length of Since it is short, it can be easily prepared by conventional chemical synthesis.
  • polypeptides (4) and (5) polypeptides with sequence identity of 80% or more but less than 100% with (4) can be easily prepared by chemical synthesis if their chain lengths are short. , those with chain lengths that are difficult to prepare by chemical synthesis can be produced by genetic engineering techniques.
  • Polypeptides with a structure in which other functional molecules are linked can also be produced by chemical synthesis if the functional molecules are short polypeptides, or by genetic engineering methods if the functional molecules are long polypeptides. It can be manufactured by
  • chemical synthesis methods include the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), and the like. Moreover, it can also be synthesized by conventional methods using various commercially available peptide synthesizers.
  • a cDNA encoding a long DENND2A-binding peptide or a full-length DENND2A-binding peptide linked to a functional molecule is prepared, and the cDNA is inserted into an appropriate expression vector and introduced into an appropriate host cell.
  • the desired polypeptide can be obtained by introducing the host cell, producing the polypeptide within the host cell, and extracting and purifying the polypeptide.
  • the DENND2A-binding peptide may have a tag sequence such as a Flag tag or a His tag added thereto for convenience of purification and detection.
  • a tag sequence can also be considered as an example of a functional molecule.
  • SEQ ID NO: 83 the "cleavage sequence + DENP4-3S peptide + S28 + nuclear export signal" portion
  • a Flag tag and a His tag are added to the C-terminus of each DENND2A-binding peptide.
  • addition of such a tag sequence is optional, and it is also possible to prepare the anti-HBV agent of the present invention using a DENND2A-binding peptide to which no tag sequence is added.
  • a functional molecule is a carrier molecule for delivery into hepatocytes. That is, the DENND2A-binding peptide may be in a form linked to a carrier molecule for delivery into hepatocytes.
  • DDS that utilizes the asialoglycoprotein receptor (ASGR) and ApoE receptor, which are abundant in hepatic parenchymal cells, are known as carrier molecules for drugs to be delivered into hepatocytes (Yuko Ito, STI Horizon, 2019, Vol.5, No.4, pp.21-25).
  • ASGR asialoglycoprotein receptor
  • ApoE receptor which are abundant in hepatic parenchymal cells
  • carrier molecules that deliver drugs into hepatocytes using ASGR or ApoE receptors can be used.
  • ASGR asialoglycoprotein receptor
  • ASGR asialoglycoprotein receptor
  • CCDs carbohydrate recognition sites
  • ASGR-specific binding molecule used as a carrier for drug delivery may be one that binds to the extracellular domain of ASGR.
  • specific binding molecules that can bind to both ASGR1 and ASGR2 are particularly preferably used, specific binding molecules that bind only to either one can also be used as carriers for drug delivery.
  • a specific binding molecule that binds to only one of them it may be used alone as a carrier for drug delivery, or it may be used in combination of a specific binding molecule that binds to one and a specific binding molecule that binds to the other.
  • a DENND2A-binding peptide linked to an ASGR1-specific binding molecule and a DENND2A-binding peptide linked to an ASGR2-specific binding molecule may be prepared, and the two may be mixed and used as an anti-HBV agent.
  • the nucleotide sequence of the coding region of human ASGR1 mRNA registered as NM_001671.5 in GenBank and the amino acid sequence of ASGR1 encoded by this are shown in SEQ ID NOs: 38 and 39, and the code of human ASGR2 mRNA registered as NM_001181.4.
  • the base sequence of the region and the amino acid sequence of ASGR2 encoded thereby are shown in SEQ ID NOs: 40 and 41, respectively.
  • Amino acids 41 to 61 of SEQ ID NO: 39 (ASGR1) and amino acids 59 to 79 of SEQ ID NO: 41 (ASGR2) are transmembrane domains, and the N-terminus is the intracellular domain, and the C-terminus is the intracellular domain. It is a foreign domain.
  • ASGR extracellular domain includes hetero-oligomerized extracellular domains.
  • Hetero-oligomer refers to the hetero-oligomerized ASGR extracellular domain.
  • Anti-ASGR polyclonal antibodies can be obtained by immunizing a non-human animal using the ASGR extracellular domain as an immunogen, collecting blood, separating serum, and collecting and purifying antibodies that bind to the ASGR extracellular domain from the serum. I can do it.
  • Anti-ASGR monoclonal antibodies are produced by collecting antibody-producing cells such as splenocytes and lymphocytes from non-human animals immunized with the ASGR extracellular domain, fusing them with myeloma cells to prepare hybridomas, and binding them to the ASGR extracellular domain.
  • Anti-ASGR monoclonal antibodies can be obtained from the culture supernatant by selecting hybridomas that produce antibodies against the ASGR and proliferating them.
  • Anti-ASGR antibody fragments can be obtained by treating anti-ASGR antibodies with proteolytic enzymes such as papain or pepsin.
  • proteolytic enzymes such as papain or pepsin.
  • the definition of antibody fragment is as described above, and includes antibody fragments such as Fab, Fab', F(ab') 2 , etc. that maintain binding to the antigen (ASGR extracellular domain).
  • anti-ASGR scFv can be prepared by extracting the mRNA of the hybridoma produced as described above, preparing cDNA, and performing PCR using primers specific for immunoglobulin H chain and L chain. By amplifying the chain genes, connecting them with linkers, adding appropriate restriction enzyme sites, introducing them into a plasmid vector, transforming E. coli with the vector to express scFv, and recovering this from E. coli. Obtainable.
  • anti-ASGR scFv can be obtained from scFv libraries using techniques such as phage display and IVV methods.
  • a library of phages in which scFv is displayed on the phage surface is prepared as an scFv library.
  • a naive scFv phage library may be prepared by the following procedure. Extract mRNA from antibody-producing cells such as splenocytes and lymphocytes collected from healthy humans or non-human animals, synthesize cDNA by reverse transcription reaction, and generate cDNA encoding the region containing the heavy chain variable region (VH). (VH cDNA) and cDNA encoding the region containing the light chain variable region (VL) (VL cDNA) are comprehensively amplified by PCR.
  • the amplified VH cDNA and VL cDNA are randomly ligated via a suitable linker (for example, a linker with 3 repeats of GGGGS units) using a standard assembly PCR or Fusion PCR to create a cDNA encoding the scFv. (scFv cDNA).
  • a suitable linker for example, a linker with 3 repeats of GGGGS units
  • Fusion PCR Fusion PCR
  • Phage plasmid vectors include phage vectors that contain all the phage genes necessary to form phage particles and are capable of forming phage particles alone, and phage vectors that contain the g3p gene but do not contain other phage protein genes. Although there are two types of phagemid vectors that require helper phage for particle formation, phagemid vectors can be preferably used.
  • scFv cDNA library created using a phagemid vector into E. coli and superinfecting E. coli with a helper phage, each vector of the scFv cDNA library is packaged, and the scFv expressed by the vector is placed on the surface.
  • a library of phages can be created for display.
  • a phage library of mutant scFv may be created by randomly introducing mutations into the prepared VH cDNA, VL cDNA, or scFv cDNA.
  • This panning step can be carried out using a solid phase carrier (chip, plate, magnetic beads, etc.) on which the ASGR extracellular domain is immobilized, and a carrier on which a hetero-oligomer is immobilized can be particularly preferably used.
  • a carrier on which a hetero-oligomer is immobilized can be particularly preferably used.
  • the phage library is brought into contact with the ASGR extracellular domain-immobilized carrier, and after washing, the phages bound to the carrier are recovered.
  • the recovered phage is lysed, the packaged vector is recovered and reintroduced into E. coli, and helper phage is superinfected to form phage particles again.
  • These phage particles are again brought into contact with the ASGR extracellular domain immobilized carrier.
  • Phages enriched through multiple rounds of panning can be obtained as anti-ASGR scFv candidate clones, but clones may be selected to further narrow down the candidates.
  • the scFv expression vector is recovered from the enriched phage and introduced into a suitable host cell such as E. coli to prepare a host cell clone that expresses the scFv. examine the sequence and select clones with high specific binding to the ASGR extracellular domain. Reactivity may be confirmed by immunoassay such as ELISA using ASGR extracellular domain, preferably hetero-oligomer, as an antigen.
  • clones may be grouped by confirming clone overlap using the VH and VL nucleotide sequences. Through these clone selection operations, it is possible to select clones with high specific binding to the ASGR extracellular domain and further narrow down the candidates.
  • scFv expression vector from the candidate clone, amplify the scFv cDNA from the scFv expression vector, insert it into an appropriate plasmid expression vector, express the scFv in an appropriate host cell, and collect and purify it. After the scFv is purified, the reactivity with ASGR1ex and ASGR2ex or the reactivity with the hetero-oligomer is finally confirmed, and an scFv that specifically binds to the ASGR extracellular domain can be obtained.
  • IVV method (Nemoto, N. et al., FEBS Lett., 414:405-408, 1997; Miyamoto-Sato, E. et al., Nucleic Acids Res., 28:1176-1182, 2000; WO 03/106675 A1) is a technology developed by Yanagawa, one of the inventors of the present application, and his co-researchers.
  • puromycin a type of antibiotic
  • PEG polyethylene glycol
  • An mRNA-protein linking molecule (in vitro virus; IVV) is formed by covalently bonding the mRNA molecule via puromycin. From the IVV library constructed in this way, IVVs containing proteins that bind to baits (proteins, peptides, antigens, etc.) are retrieved in vitro, and the genes (mRNA) linked thereto are amplified by reverse transcription PCR. However, by decoding the base sequence with a DNA sequencer, interacting proteins, peptides, and antibodies can be easily identified.
  • the general method for elution and recovery of IVV bound to bait is to perform competitive elution with free bait, but if competitive elution is not possible, a PEG spacer incorporating a photocleavable 2-nitrobenzyl linker is used. , the spacer can be irradiated with UV at 365 nm to elute and recover the mRNA portion (Doi, N. et al., J. Biotechnol., 131:231-239, 2007).
  • mRNA is synthesized from the cDNA library by reverse transcription reaction, puromycin is attached to the 3' end of the mRNA via a PEG spacer, and the scFv mRNA-puromycin library.
  • a cell-free translation reaction is performed to construct a library of mRNA-scFv linked molecules (IVV) in which scFv molecules and mRNA molecules encoding them are covalently linked via puromycin.
  • this selection step can also be performed using a solid phase carrier (chip, plate, magnetic beads, etc.) on which the ASGR extracellular domain, preferably a hetero-oligomer, is immobilized as a bait.
  • the scFv IVV library is brought into contact with the ASGR extracellular domain immobilized carrier, and after washing, the IVV bound to the carrier is eluted and collected. IVV can be eluted and recovered by competitive elution using ASGR1ex or ASGR2ex.
  • an IVV library can be prepared again from this cDNA library and a second round of selection can be performed. It is preferable to perform multiple rounds of selection while sequentially increasing the selection pressure (contact time between the IVV library and bait, amount of bait immobilized on the carrier, etc.).
  • the scFv coding region is amplified from each scFv cDNA library obtained in the following rounds and cloned into an appropriate plasmid vector to prepare a library of vectors incorporating the selected scFv cDNA.
  • This vector is introduced into a suitable host cell such as E. coli to obtain a library of scFv clones after selection.
  • the obtained clone library is evaluated for reactivity to the ASGR extracellular domain, analyzed for variable region sequences, and grouped in the same manner as clone selection by phage display method.
  • Vectors are recovered from the selected clones and used as scFv.
  • anti-ASGR antibodies, antibody fragments or scFv include: A heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 10, 16 or 22, A heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 11, 17 or 23, A heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 12, 18 or 24, A light chain CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, 13, 19 or 25, A light chain CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 14, 20 or 26; Antibodies, antibody fragments, or scFv having a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, 15, 21, or 27 can be mentioned.
  • CDR sequences are based on the CDR sequences of anti-ASGR scFv obtained in the Examples below.
  • an anti-ASGR scFv having heavy chain CDRs 1 to 3 having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 and light chain CDRs 1 to 3 having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 and an anti-ASGR scFv having the amino acids shown in SEQ ID NOs: 10 to 12
  • CDR sequences are not limited to those with the specific amino acid sequences mentioned above, but CDRs that include amino acid sequences in which some bases are substituted in the above amino acid sequence and have 80% or more identity with the original amino acid sequence. It may be an antibody, etc. that has For example, heavy chain and light chain CDR1 allow substitution of one residue, heavy chain and light chain CDR2 allow substitution of 1-3, 1-2 or 1 residue, Heavy chain and light chain CDR3s allow substitution of 1-2 or 1 residue.
  • Antibodies, antibody fragments, or scFvs having such modified CDRs can also be used as antibodies, antibody fragments, or scFvs that specifically bind to ASGR.
  • Antibodies having CDRs with a predetermined sequence can be produced by introducing mutations into the CDR regions of the VH and VL genes of any cloned antibody or the scFv gene encoding any scFv to encode the above amino acid sequence. It can be easily prepared by modifying it as follows. Any antibody and any scFv that serve as a base for introducing the above CDR sequence may be an anti-ASGR antibody and anti-ASGR scFv that have a CDR sequence different from the above, or an antibody and scFv against other antigens. There may be.
  • Anti-ASGR antibodies, antibody fragments, or scFvs having CDRs or modified CDRs containing the above-mentioned specific amino acid sequences can be used not only as delivery carriers for the anti-HVB agent of the present invention, but also for various drugs to be delivered into hepatocytes. It is an excellent delivery vehicle for This anti-ASGR antibody, antibody fragment, or scFv can be used as a carrier for drug delivery into hepatocytes, and the drug to be delivered into hepatocytes can be complexed with the carrier using techniques known in the pharmaceutical field and used as a pharmaceutical composition. .
  • the anti-ASGR antibody may be a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody between a human and a non-human animal, or a non-human animal antibody. Preference is given to antibodies, humanized or chimeric antibodies, especially human or humanized antibodies, especially human antibodies.
  • anti-ASGR scFv antibodies may be derived from human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies between human and non-human animals, and non-human animal antibodies, but they can also be used as carriers for the delivery of human drugs. When used, those derived from human antibodies, humanized antibodies or chimeric antibodies, particularly those derived from human antibodies or humanized antibodies, especially those derived from human antibodies are preferred.
  • a carrier molecule for intrahepatocyte delivery such as an anti-ASGR antibody
  • it may be linked to either end of the DENND2A-binding peptide. If one or more other functional molecules are also used, they may be linked to the DENND2A-binding peptide to function properly in conjunction with the other functional molecules.
  • the carrier molecule for intrahepatocyte delivery is preferably linked to the DENND2A-binding peptide via a cleavage sequence that is cleaved by an endogenous enzyme present in the cells of a patient receiving the anti-HBV agent of the present invention.
  • An example of a cleavage sequence is the sequence RVRR (SEQ ID NO: 28), which is recognized and cleaved by Furin, but the cleavage sequence is not limited to this.
  • DENND2A-binding peptide may be in a form linked to a cell membrane permeation-enhancing molecule.
  • a cell membrane permeation-promoting molecule is a molecule that has the effect of promoting the release of a DENND2A-binding peptide taken into cells into the cell through endosomes from within the endosome into the cytoplasm.
  • a specific example of a cell membrane permeation-promoting molecule is S19, a partial peptide of the protein syncytin 1, which is involved in cell fusion in human placenta formation, developed by Doi et al. (Sudo, K. et al., J. Control.
  • S19 is a better membrane permeation promoting peptide than S19.
  • the 28-residue syntisin 1 partial peptide S28 (PFVIGAGVLGALGTGIGGITTSTQFYYK, SEQ ID NO: 29) and the 39-residue scintisin 1 partial peptide S39 (PFVIGAGVLGALGTGIGGITTSTQFYYKLSQELNGDMER, SEQ ID NO: 30) have been developed as peptides that can function more efficiently. can.
  • These peptides, particularly S28 and S39 are cell membrane permeation-enhancing molecules that can be preferably used in the present invention, but usable cell membrane permeation-enhancing molecules are not limited to these.
  • the cell membrane permeation promoting molecule may be linked to either end of the DENND2A-binding peptide, but when linking the carrier molecule for intrahepatocyte delivery and the cleavage sequence to the DENND2A-binding peptide, the side of the DENND2A-binding peptide that is closer to the cleavage sequence is or to the opposite end of the carrier molecule.
  • DENND2A-binding peptide may be in a form linked to a nuclear localization signal.
  • Various nuclear localization signals are known, and any of them may be used.
  • PAAKRVKLD SEQ ID NO: 31
  • the nuclear localization signal may be linked to either end of the DENND2A-binding peptide, but when linking the carrier molecule for intrahepatocyte delivery and the cleavage sequence to the DENND2A-binding peptide, it should be placed closer to the DENND2A-binding peptide than the cleavage sequence.
  • linking a cell membrane permeation promoting molecule and a nuclear localization signal to a DENND2A-binding peptide they may be linked to both ends, or both may be linked to one end. In the latter case, either one may be placed at the extreme end.
  • linking a delivery carrier + cleavage sequence, a cell membrane permeation-enhancing molecule, and a nuclear localization signal to a DENND2A-binding peptide place the delivery carrier + cleavage sequence at one end, and the cell membrane permeation-enhancing molecule and nuclear localization signal at the other end. Link.
  • the main subjects to whom the anti-HBV agent of the present invention is administered are HBV-infected patients, which include hepatitis B patients and HBV-infected patients who have not developed hepatitis B (HBV carriers).
  • the patient is typically a mammal, particularly, but not limited to, a human.
  • the dose of the anti-HBV agent of the present invention may be any amount that provides an anti-HBV effect in the patient to whom it is administered.
  • the effective amount can be appropriately selected depending on the patient's symptoms, viral load, age, weight, etc.
  • the dose of the anti-HBV agent of the present invention may be approximately 1 ⁇ g to 10,000 mg, for example, approximately 100 ⁇ g to 1,000 mg per 1 kg of body weight, as the daily amount of the active ingredient for a subject.
  • the amount of active ingredient here refers to the amount of only the peptide portion in the case of a DENND2A-binding peptide, and when a DENND2A-binding peptide linked to one or more other functional molecules is used as an active ingredient.
  • the amount of the one or more other functional molecules is not included in the above amounts of active ingredient. Furthermore, when multiple types of substances are used as active ingredients, the amount of active ingredients is the total amount thereof.
  • the drug may be administered once a day or may be divided into several doses. Administration may be daily or every few days.
  • the route of administration of the anti-HBV agent of the present invention may be oral or parenteral, but parenteral administration such as intramuscular, subcutaneous, intravenous, and intraarterial administration is generally preferred.
  • the active ingredients of the anti-HBV agent of the present invention include pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients, binders, lubricants, disintegrants, sweeteners, and suspending agents suitable for each administration route. , emulsifiers, colorants, flavoring agents, stabilizers, and other additives as appropriate.
  • Pharmaceutical forms include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral preparations such as inhalants, injections, suppositories, and liquid preparations. Formulation methods and excipients that can be used are well known in the field of pharmaceutical formulation, and any methods and excipients can be used.
  • Anti-HBV agents containing two or more types of substances as active ingredients may be combinations containing all of the two or more active ingredients in the same preparation, or single agents containing each active ingredient individually. It may also include a combination of. In embodiments involving a combination of single agents, the single agents are usually administered simultaneously or sequentially, but each single agent may be administered at appropriate intervals.
  • Example 1 Creation of DNA library (1-1) DNA library design
  • IVV in vitro virus
  • WO 03/106675 A1 was proposed by Yanagawa, one of the inventors of the present application, and his co-researchers, and was the first method in the world to succeed in its construction.
  • puromycin a type of antibiotic
  • a PEG (polyethylene glycol) spacer a cell-free translation reaction is performed using this as a template, so that protein and mRNA can be combined with puromycin.
  • IVV a simple covalently linked mRNA-protein linking molecule, is formed (Miyamoto-Sato, E. et al., Nucleic Acids Res., 31: e78, 2003).
  • IVVs containing proteins that bind to baits are retrieved in vitro, and the genes (mRNA) linked to them are extracted by reverse transcription and PCR.
  • mRNA genes linked to them
  • the general method for elution and recovery of IVV bound to bait is to perform competitive elution with free bait, but if competitive elution is not possible, a PEG spacer incorporating a photocleavable 2-nitrobenzyl linker is used.
  • the mRNA portion can be eluted and recovered by irradiating with 365 nm UV and cleaving the spacer (Doi, N. et al., J.Biotechnol., 131:231-239, 2007).
  • PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 16 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 2 minutes, followed by reaction at 68°C for 5 minutes.
  • DNA was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 50 ⁇ l GSP6-GFP-DNA solution.
  • R Atail
  • TOYOBO KOD plus polymerase
  • PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 16 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 2 minutes, followed by reaction at 68°C for 5 minutes.
  • DNA was purified using Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as 50 ⁇ l of Flag-His Atail-DNA solution.
  • Atail-DNA solution 1 ⁇ l, 10 ⁇ KOD plus buffer (TOYOBO) 10 ⁇ l, 2 mM dNTPs (TOYOBO) 10 ⁇ l, 25 mM MgSO4 4 ⁇ l, forward primer: 16NNS-F or 9NNS-F (10 pmol/ ⁇ l) 3 ⁇ l, Add RNase-free water to 3 ⁇ l of reverse primer: Atail (R) (10 pmol/ ⁇ l) and 2 ⁇ l of KOD plus polymerase (TOYOBO) to make a total volume of 100 ⁇ l, and put this in 1 tube for a total of 300 ⁇ l (tube 3). PCR reaction was carried out.
  • PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 12 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 2 minutes, followed by reaction at 68°C for 5 minutes.
  • the cDNA library was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and recovered as 50 ⁇ l of 16NNS Atail-DNA solution or 9NNS Atail-DNA solution.
  • GSP6-GFP-DNA solution 1 ⁇ l of GSP6-GFP-DNA solution, 1 ⁇ l of 16NNS Atail-DNA solution or 9NNS Atail-DNA solution, 10 ⁇ l of 10 ⁇ KOD plus buffer (TOYOBO), 10 ⁇ l of 2 mM dNTPs (TOYOBO), 4 ⁇ l of 25 mM MgSO4, forward primer: GSP6-GFP Add RNase-free water to 3 ⁇ l of -F (10 pmol/ ⁇ l), 3 ⁇ l of reverse primer: Atail (R) (10 pmol/ ⁇ l), and 2 ⁇ l of KOD plus polymerase (TOYOBO) to make a total volume of 100 ⁇ l.
  • cDNA libraries were purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as 50 ⁇ l of cDNA libraries 16NNSLib and 9NNSLib.
  • Example 2 Preparation of IVV library (2-1) Library transcription 2 pmol each of cDNA libraries 16NNSLib and 9NNSLib, 8 ⁇ l of 5 ⁇ SP6 buffer, 2 ⁇ l of ATP (100 mM), 2 ⁇ l of CTP (100 mM), UTP (100mM) 2 ⁇ l, GTP (10mM) 4 ⁇ l, cap analog (m7G(5')PPP(5')G) (Thermo Fisher Scientific) (40mM) 5 ⁇ l, Enzyme Mix SP6 RNA Polymerase (Promega) 4 ⁇ l, RNase-Free water. The total volume was 40 ⁇ l, and after reaction at 37°C for 3 hours, 10 ⁇ l of RQ1 RNase-Free DNase (Promega) was added, followed by further reaction at 37°C for 1 hour.
  • DENND2A is a molecule that acts as a specific guanine nucleotide exchange factor (GEF) involved in the active and inactive forms of RAB9A and RAB9B. It may also play a role in the trans-Golgi network in late endosomes. There are no reports on the development of antiviral agents targeting this molecule.
  • GEF guanine nucleotide exchange factor
  • DENND2A has two isoforms, 1009 aa isoform 1 (SEQ ID NO: 35) and 795 aa isoform 2 (SEQ ID NO: 37), as shown in Figure 2.
  • Aa1-775 of isoform 1 and aa1-775 of isoform 2 have the same sequence.
  • Isoform 2 (795 aa) was used to create the bait.
  • the tag was placed at the N-terminus as shown in Figure 3, referring to a report on expression with a His tag attached to the N-terminus (S. Yoshimura, et al., J Cell Biology 191, 367-381, 2010). .
  • a His-tag, a biotinylated sequence, and a Flag-tag were constructed in the N-terminal region of the peptide.
  • Bio-tag (Nucleic Acids Research, 2009 , Vol. 37, No. 8, page e64), His-tag and Flag-tag have been added.
  • PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 20 or 25 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 2 minutes, followed by reaction at 68°C for 5 minutes. After confirming the DNA band of the PCR product by agarose gel electrophoresis, it was purified using Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 50 ⁇ l DNA solution to obtain His-Bio-Flag.
  • Plasmid pcDNA3.3 TOPO His-Bio-Flag was purified from the bacterial pellet using the PureYield TM Plasmid Maxiprep System (Promega).
  • DENND2A Vector PF1KE2590 (Kazusa DNA RES.INST.) (1 NG/ ⁇ L) 0.5 ⁇ L, Kapa Hifi HS RM 12.5 ⁇ L, 10 ⁇ m DENND2A-IFFLAG-F 0.75 ⁇ L, and 10 ⁇ m DENND2AI2-IFPC-R 0. 75 ⁇ L RNASE-FREE water was added to make the total volume 25 ⁇ l, and PCR reaction was performed. PCR was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 25 cycles of 98°C for 20 seconds, 60°C for 15 seconds, and 72°C for 1 minute, followed by reaction at 72°C for 1 minute.
  • RNase-free water was added to 1.0 ⁇ l of F-DENND2A-IN, 1.0 ⁇ l of TOPO HisBioFlagINV, and 1.0 ⁇ l of 5x infusion HD Enzyme premix (Takara) to make a total volume of 5 ⁇ l, and the mixture was reacted at 50°C for 15 minutes. 2.5 ⁇ l was transformed into One Shot TOP10 competent cells and cultured overnight at 37°C to obtain clones. As a result of sequence analysis of the clone, it was confirmed that it was a plasmid HisBioFLAG-DENND2A-pcDNA3.3.
  • Cell lysis buffer Tris-HCl pH 7.4 25 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.68 mM, Triton X-100 1%) 800 ⁇ l, protease inhibitor, for animal cell extract (Cat#25955-11) Add 16 ⁇ l of -(2-aminoethyl), benzenesulfonyl hydrochloride (AEBSF), aprotinin, E-64, leupeptin hemisulfate monohydrate, bestatin, pepstatin A) and 8 ⁇ l of 0.1M PMSF to the cells and incubate on ice for 15 minutes.
  • AEBSF benzenesulfonyl hydrochloride
  • the above cell fraction was added to Anti-FLAG M2 Agarose Beads (50% slurry) washed 3 times with 5.0 ml of TBS buffer (Nacalai), and the mixture was stirred for 2 hours at 4°C using a mini disc rotor (Bio craft). .
  • the beads were washed three times with 1.0 ml of TBST (0.1% tween-20). 50 ⁇ l of TBS containing 150 ⁇ g/mL 3x FLAG peptide was added, and the mixture was stirred for 1 hour at 4°C using a mini disk rotor, and then the supernatant was collected. The same operation was repeated three times.
  • Sample buffer LDS (4x) and 6.8 ⁇ l of 0.2 mM DTT were added to 15 ⁇ l of the elution fraction, heated at 70°C for 10 minutes, and then subjected to SDS-PAGE.
  • SDS-PAGE was performed using 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel, MES electrophoresis buffer (Invitrogen) at 200V, 400mA, and electrophoresis for 35 minutes, followed by Mini Format, 0.2 ⁇ m PVDF, Single application (BIORAD) Trans-Blot Turbo. Transcribed.
  • the membrane was blocked with Blocking One Buffer: TBST (1:9) and reacted with anti-Flag-HRP (Sigma: A8592) diluted 2:3000 with Blocking One Buffer: TBST (1:9).
  • Detection was performed using ECL (Enhanced ChemiLuminescence) with ChemiDoc (BIORAD). Biotinylated DENND2A could be confirmed as a band with a molecular weight of 98,715 Da.
  • Example 4 Selection of a peptide that binds to DENND2A
  • An experiment for selecting a peptide that binds to DENND2A was performed according to the procedure shown in FIG. 4.
  • (4-1) Immobilization of DENND2A Biacore used the Biacore 3000 system to immobilize biotinylated DENND2A on the sensor chip SA.
  • Flow was performed at 10 ⁇ l/min in buffer HBS-P (10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% Tween-20).
  • Pretreatment for immobilization was performed by repeatedly injecting 10 ⁇ l of a solution containing 50 mM NaOH and 1 M NaCl into flow cells 1 to 4 three times.
  • Biotinylated DENND2A (1 nM) was used to immobilize on flow cells 1 to 4. Flow was performed using buffer HBS-P at 20 ⁇ l/min. When 18 ⁇ l was manually injected, 698.3 RU (average) was bound to flow cells 1 to 4. In order to wash the sensor chip, an extra wash was performed using buffer HBS-P at 10 ⁇ l/min, 50% Isopropanol, 50 mM NaOH, 1M NaCl.
  • the sensor chip was removed from the machine. 55 ⁇ l of RNase-free water was gently added onto the gold film of the sensor chip, and 365 nm UV was irradiated for 20 minutes to cut the spacer and elute and collect the mRNA portion.
  • Reverse transcription reaction solution 100 ⁇ l, 10x KOD plus buffer (TOYOBO) 100 ⁇ l, 2mM dNTPs (TOYOBO) 100 ⁇ l, 25mM MgSO4 40 ⁇ l, forward primer: GSP6-GFP-F (10 pmol/ ⁇ l) 30 ⁇ l, reverse primer RNase-free water was added to 30 ⁇ l of Atail (R) (10 pmol/ ⁇ l) and 20 ⁇ l of KOD plus polymerase (TOYOBO) to make a total volume of 1000 ⁇ l, and 100 ⁇ l was added to each tube for PCR reaction in a total of 10 tubes. PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 20 to 40 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 2 minutes, followed by reaction at 68°C for 5 minutes.
  • Example 5 Cloning and base sequence determination (5-1) Cloning and base sequence In-fusion cloning from a peptide library that binds to DENND2A Library subjected to 4 rounds of selection experiment 1 ⁇ l, 10X KOD plus buffer solution (TOYOBO) 100 ⁇ l, 2mM dNTPs (TOYOBO) 100 ⁇ l, 25mM MgSO4 40 ⁇ l, GFP-F in (10 pmol/ ⁇ l) 30 ⁇ l, His-S28-R in (10 pmol/ ⁇ l) 30 ⁇ l, and KOD plus polymerase (TOYOBO ) RNase-free water was added to 20 ⁇ l to make a total volume of 1000 ⁇ l, and PCR reaction was performed.
  • TOYOBO 10X KOD plus buffer solution
  • TOYOBO 2mM dNTPs
  • 25mM MgSO4 40 ⁇ l 25mM MgSO4 40 ⁇ l
  • PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 8 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 2 minutes, followed by reaction at 68°C for 5 minutes.
  • the cDNA library was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 50 ⁇ l DNA solution to obtain a library insert (GFP-DENP4 in).
  • PCR was performed at 94°C for 2 minutes, followed by 25 cycles of 98°C for 10 seconds and 68°C for 5 minutes and 11 seconds.
  • the cDNA library was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 40 ⁇ l DNA solution to obtain the KGFP-S28 3.3 vector.
  • CCTGCTGCCAAGAGGGTCAAGTTGGAC SEQ ID NO: 32 upstream of the GFP sequence and include the stop codon 8 ⁇ l of pcDNA 3.3 vector, 80 ⁇ l of 10 ⁇ KOD plus buffer (TOYOBO), 80 ⁇ l of 2 mM dNTPs (TOYOBO), 25 mM MgSO4 Add RNase-free water to 32 ⁇ l, 24 ⁇ l of S28iv-25F (10 pmol/ ⁇ l), 24 ⁇ l of GFPiv-71R (10 pmol/ ⁇ l), and 16 ⁇ l of KOD plus polymerase (TOYOBO) to make a total volume of 800 ⁇ l, and perform PCR reaction. Ta.
  • PCR was performed at 94°C for 2 minutes, followed by 25 cycles of 98°C for 10 seconds and 68°C for 5 minutes and 11 seconds.
  • the cDNA library was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 40 ⁇ l DNA solution to obtain the NLS-GFP-S28 3.3 vector.
  • the cDNA library was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 50 ⁇ l DNA solution to obtain NLS-GFP-DENP4in.
  • NLS-GFP-DENP4 in 0.08 ⁇ l, NLS-GFP-S28 3.3 vector 0.14 ⁇ l, 5x in fusion HD Enzyme premix 1.0 ⁇ l (Takara) and add RNase-free water to make a total volume of 5 ⁇ l at 50°C for 15 minutes. Made it react. After the reaction, 2.5 ⁇ l of the solution was transformed into One Shot TOP10 competent cells and cultured overnight at 37°C to obtain an NLS-GFP-DCS8 clone. Sequence analysis of the obtained clones was performed using Eurofin DNA sequence contract service, ValueRead Premix.
  • DENP4-3S is a DENND2A-binding peptide prepared based on the homology search results for DENP4-3 in Example 7 below.
  • Example 6 Evaluation of clone activity (6-1) Preparation of protein For in-frame clones, colonies were inoculated from a master plate into LB medium containing 20 ⁇ g/ml of carbenicillin and cultured at 37° C. for 16 hours. Plasmids were purified from the bacterial pellet using PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit (Invitrogen).
  • ELISA BSA buffer Nacalai Tesque Co., Ltd. TBS, 0.05%, Tween 20, 1% BSA
  • Figure 6 shows the expression of DENN2A in cultured cells.
  • DENND2A mRNA and expressed protein in HepG2-NTCP-C4, Huh7, and Huh7-LIPG cells.
  • Huh7-LIPG with good expression of DENND2A was used.
  • Example 7 Anti-HBV activity of screened DENND2A-binding peptides (7-1) Anti-HBV activity of DENND2A-binding peptides in Huh7-LIPG cells DENND2A binding in Huh7-LIPG cells for clones that were positive in pull-down experiments against DENND2A The anti-HBV activity of the peptide was evaluated ( Figure 7). As plasmids containing peptides, DENP4-3 (SEQ ID NO: 1) and DENP4-42 (SEQ ID NO: 2), which are expressed in cells, were prepared. The two clones that were positive in the pull-down experiment had significantly reduced cccDNA compared to the control.
  • DENP4-3 was found to have the nucleotide sequence and amino acid sequence of the coding region of SASH1 (SAM And SH3 Domain Containing 1, Gene ID: 23328, GenBank NM_015278.5) with SEQ ID NOs: 42 and 43.
  • DENP4-3S (a peptide consisting of a partial region of SASH1 that showed high homology to DENP4-3, SEQ ID NO: 3), which has a homologous sequence to DENP4-3, was prepared (SEQ ID NO: 3). 8).
  • each clone with a nuclear localization signal was also prepared.
  • asialoglycoprotein receptors that specifically recognize and take in asialoglycoproteins in the blood.
  • Anti-asialoglycoprotein receptor antibodies are also thought to be taken up into liver cells after binding to the receptor.
  • Example 8 Preparation of biotinylated ASGR First, a biotinylated asialoglycoprotein receptor as an antigen was prepared. As shown in Figure 10, the asialoglycoprotein receptor (ASGR) is a type II single-pass transmembrane protein with its N-terminus directed intracellularly and its carbohydrate recognition sites (CRDs) directed externally. In order to display this on a Biacore sensor chip, a construct was created in which the transmembrane domain was removed and a biotinylation sequence was added.
  • ASGR asialoglycoprotein receptor
  • PCR was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 25 cycles of 98°C for 20 seconds, 60°C for 15 seconds, and 72°C for 1 minute, followed by reaction at 72°C for 1 minute. After confirming the DNA band of the PCR product by agarose gel electrophoresis, it was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 30 ⁇ l DNA solution to obtain ASGR1-if or ASGR2-if.
  • M2 agarose beads (ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel, Sigma, A2220) washed with TBS were added to the obtained cell extract and mixed for 16 hours at 4°C. After washing three times with TBST (10x TBS-t 1% Tween-20, Nacalai, 12749-21), competitive elution was performed with 150 ⁇ g/mL 3x FLAG peptide (Sigma, F4799) diluted with TBS.
  • KHisBioFlag-ASGR1ex was detected as a band with a molecular weight of 35,597 Da
  • KHisBioFlag-ASGR2ex was detected as a band with a molecular weight of 35,708 Da. I was able to confirm.
  • EKMax buffer 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM CaCl 2 , 1% Tween-20.
  • EKMax TM Enterokinase (Thermo Fisher Scientific) was added and the mixture was rotated O/N (16.5 h) at 37°C to perform EKMax digestion, and the supernatant was collected by adsorbing SA beads with a magnetic stand.
  • Pretreated EK Away resin was added to the collected supernatant and rotated at rt for 15 min to remove EKMax.
  • the supernatant was collected by centrifugation (5000 rcf 2 min x 2) and detected by SDS-PAGE and Western blotting using Flag antibody, and it was confirmed as an ASGR1ex band with a molecular weight of 26394 Da.
  • Example 9 Creation of single-chain antibody cDNA library (9-1) DNA library design Antigen recognition of antibodies is carried out by the N-terminal domains of the H and L chains. ) is called. On the other hand, other domains are constant for each class and are called constant regions ( Figure 13 left). Both the VH and VL chains are composed of three CDRs (complementarity-determining regions) and four FRs (Framework regions) ( Figure 13, right). CDRs consist of diverse amino acid sequences for each antibody, allowing them to bind to a variety of antigens. As an artificial antibody fragment, there is a single-chain antibody (scFv) in which a VH chain and a VL chain are linked with a peptide linker ( Figure 14).
  • scFv single-chain antibody
  • a peptide linker consisting of 15 amino acids connects the VH and VL chains with a linker consisting of three repeats of GGGGS units containing glycine and hydrophilic serine as a sequence that does not impose secondary structure so as not to interfere with the association between domains (SEQ ID NO: 33). ) are often used.
  • Example 10 Creation of a mouse-derived single-chain antibody cDNA library A mouse-derived single-chain antibody cDNA library was created using mouse spleen Poly A+ RNA as a starting material, as shown in FIG. 15. Preparation of H chain DNA solution, preparation of L chain DNA solution, and unification of H chain and L chain PCR were performed. (Tabata, N., et al., Nucleic Acids Res., 37, e64, 2009).
  • H chain DNA solution To create a single chain antibody cDNA library, we first prepared a H chain DNA solution. 11 ⁇ l of mouse spleen Poly A+ RNA (5 ⁇ g/ ⁇ l) (DEPC-treated water) (CLONTECH) diluted 100 times with RNase-free water, 22 ⁇ l of 5 ⁇ RT buffer (TOYOBO), (10 mM) Mix 11 ⁇ l of dNTPs (TOYOBO), 27.5 ⁇ l of forward primer MulgG1/2 (1 pmol/ ⁇ l), and 27.5 ⁇ l of forward primer MulgG3 (1 pmol/ ⁇ l), react at 65°C for 9 minutes, then immediately cool to 4°C and leave at 4°C for 2 minutes.
  • cDNA-H solution 5 ⁇ l, each HB primer shown in HB primer (1pmol/ ⁇ l) 2.5 ⁇ l each, 10 ⁇ PCR buffer (TOYOBO) 2.5 ⁇ l, forward primer MulgG1/2 (1pmol/ ⁇ l) 1.25 ⁇ l, forward primer 1.25 ⁇ l of MulgG3 (1 pmol/ ⁇ l), 0.25 ⁇ l of KOD DASH polymerase (TOYOBO), and RNase-free water were added to make a total volume of 25 ⁇ l, and each PCR reaction was performed. PCR was performed at 96°C for 5 minutes, followed by 25 cycles of 96°C for 30 seconds, 50°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute, followed by reaction at 72°C for 5 minutes.
  • each DNA (19 types) was dissolved in 20 ⁇ l of RNase-free water.
  • 1 ⁇ l of each synthesized DNA solution (19 types) 2 ⁇ l of each corresponding HB primer (10 pmol/ ⁇ l) shown in HB primer, 10 ⁇ l of 10 ⁇ PCR buffer (TOYOBO), 10 ⁇ l of (2 mM) dNTPs (TOYOBO) , add 2 ⁇ l of VH forward primer HF1:HF2:HF3:HF4 (1:1:1:1) mixture (10 pmol/ ⁇ l) shown in HF primer, 0.5 ⁇ l of KOD DASH polymerase (TOYOBO), and RNase-free water.
  • PCR reaction was performed in a total volume of 100 ⁇ l. PCR was performed at 96°C for 5 minutes, followed by 20 cycles of 96°C for 30 seconds, 50°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute, followed by reaction at 72°C for 5 minutes. Bands of 500-900 bp were confirmed for each amplified gene by 2% agarose gel electrophoresis, followed by phenol/chloroform treatment and ethanol precipitation. Thereafter, after drying by centrifugation for about 15 minutes, each DNA (19 types) was dissolved in 10 ⁇ l of RNase-free water. The resulting 19 types of DNA were subjected to 2% low melting point agarose gel (Sigma) electrophoresis, and each band was cut out.
  • PCR was performed at 96°C for 5 minutes, followed by 25 cycles of 96°C for 30 seconds, 48°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute, followed by reaction at 72°C for 5 minutes.
  • Bands of 500-900 bp were confirmed for each amplified gene by 2% agarose gel electrophoresis, and then treated with phenol/chloroform.
  • the obtained solution was subjected to ethanol precipitation. Thereafter, after drying by centrifugation for about 15 minutes, each DNA (18 types) was dissolved in 20 ⁇ l of RNase-free water.
  • PCR was performed at 96°C for 5 minutes, followed by 20 cycles of 96°C for 30 seconds, 48°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute, followed by reaction at 72°C for 5 minutes.
  • Bands of 500-900 bp were confirmed for each amplified gene by 2% agarose gel electrophoresis, followed by phenol/chloroform treatment and ethanol precipitation. Thereafter, after drying by centrifugation for about 15 minutes, each DNA (18 types) was dissolved in 10 ⁇ l of RNase-free water. The resulting 18 types of DNA were subjected to 2% low melting point agarose gel (Sigma) electrophoresis, and each band was cut out. Each DNA (18 types) was dissolved in 10 ⁇ l of RNase-free water.
  • PCR was performed at 96°C for 5 minutes, then at 96°C for 30 seconds, then at 58°C with a slope of 5 minutes, followed by 10 cycles of 58°C for 30 seconds and 72°C for 1 minute, followed by reaction at 72°C for 5 minutes. Subsequently, 45.75 ⁇ l of PCR reaction solution, 2 ⁇ l of McD-F (1 pmol/ ⁇ l), 2 ⁇ l of McD-R (His Tag) (1 pmol/ ⁇ l), and 0.25 ⁇ l of KOD DASH polymerase (TOYOBO) were added for further PCR reaction.
  • PCR was performed at 96°C for 5 minutes, followed by 15 cycles of 96°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute, followed by reaction at 72°C for 5 minutes.
  • the obtained DNA was subjected to 1% low melting point agarose gel (Sigma) electrophoresis and each band was cut out.
  • the DNA was dissolved in 10 ⁇ l of RNase-free water to obtain mouse-derived single-stranded antibody library DNA.
  • Example 11 Creation of a human-derived single-chain antibody cDNA library
  • a single-chain antibody cDNA library from human bone marrow-derived lymphocytes was created using human bone marrow-derived Poly A+ RNA as the starting material, as shown in Figure 16.
  • I went to As in the case of mice, a single human DNA for IVV selection experiment was prepared by preparing an H chain DNA solution, a L chain DNA solution, and performing PCR to integrate H and L chains using multiple specific primers.
  • a chain antibody cDNA library was created. (J.Mol.Biol., 222,581-597,1991; Nat.Biotechnol.,23,344-348,2005; Antibody Engineering, Springer Lab.Manual,93-108,2001).
  • mouse mutant H chain DNA and mouse mutant L chain DNA we performed H chain and L chain unification PCR to create a cDNA library of mouse mutant single chain antibodies.
  • a cDNA library of human mutant single chain antibodies was created by performing H chain and L chain unification PCR using human mutant H chain DNA and human mutant L chain DNA.
  • Example 12 Selection of a single chain antibody that binds to ASGR was performed according to the procedure shown in FIG. 17.
  • biotinylated extracellular domain ASGR2ex was used to immobilize on flow cells 3 and 4.
  • Flow was performed using buffer HBS-P at 20 ⁇ l/min.
  • the amount of bait immobilized is shown in Table 7.
  • an extra wash was performed using buffer HBS-P at 10 ⁇ l/min, 50% Isopropanol, 50 mM NaOH, 1M NaCl.
  • Reverse transcription reaction solution 100 ⁇ l, 10 ⁇ KOD plus buffer (TOYOBO) 100 ⁇ l, 2mM dNTPs (TOYOBO) 100 ⁇ l, 25mM MgSO 4 40 ⁇ l, forward primer: SP6 Omega (10 pmol/ ⁇ l) 30 ⁇ l, reverse primer: Flag RNase-free water was added to 30 ⁇ l of His tag A02 (10 pmol/ ⁇ l) and 20 ⁇ l of KOD plus polymerase (TOYOBO) to make a total volume of 1000 ⁇ l, and 100 ⁇ l was added to each tube for PCR reaction in a total of 10 tubes. PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 20 to 40 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 2 minutes, followed by reaction at 68°C for 5 minutes.
  • Example 13 Cloning and base sequence determination (13-1) Cloning and base sequence A library insert was created for in-fusion cloning from a single chain antibody library that binds to ASGR.
  • Library subjected to 3 rounds of selection experiment 1 ⁇ l, 10 ⁇ KOD plus buffer (TOYOBO) 100 ⁇ l, 2mM dNTPs (TOYOBO) 100 ⁇ l, 25mM MgSO 4 40 ⁇ l, T7-long-F in (10 pmol/ ⁇ l) 30 ⁇ l, RNase-free water was added to 30 ⁇ l of Flag (Histag) in R (10 pmol/ ⁇ l) and 20 ⁇ l of KOD plus polymerase (TOYOBO) to make a total volume of 1000 ⁇ l, and a PCR reaction was performed.
  • Flag Histag
  • PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 8 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 2 minutes, followed by reaction at 68°C for 5 minutes.
  • the cDNA library was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 50 ⁇ l DNA solution to obtain T7-ASGR3.
  • PCR was performed at 94°C for 2 minutes, followed by 25 cycles of 98°C for 10 seconds and 68°C for 5 minutes and 11 seconds.
  • the cDNA library was purified using the Wizard SV Gel PCR Clean-Up System (Promega) and collected as a 40 ⁇ l DNA solution to obtain the KIgk-stop 3.3 vector.
  • Example 14 Evaluation of clone activity (14-1) Preparation of protein Clones were inoculated from a master plate into an LB medium containing 20 ⁇ g/ml of carbenicillin and cultured at 37° C. for 16 hours. Plasmids were purified from the bacterial pellet using PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit (Invitrogen).
  • the mixture was mixed with 40 ⁇ l of the treated resin, rotated with a mini disc rotor (Bio craft), and bonded at 4° C. for 1 hour and 30 minutes. After removing the solution, washing was performed three times with 500 ⁇ l of TBST (Tween20 0.1%), and the recovered resin was subjected to Western blotting.
  • a pull-down assay ( Figures 18 and 19) was performed using an ASGR-binding single chain antibody.
  • the clones ASGR3-10M and ASGR3-39D that underwent three rounds of selection experiments recognized the antigen more strongly than the control.
  • ASGR3-10M recognized both antigens, and ASGR3-39D particularly recognized ASGR1 antigen.
  • the clones ASGR4-70D and ASGR5-24M that underwent the 4th and 5th rounds of selection experiments recognized the antigen better than the control.
  • ASGR4-70D and ASGR5-24M particularly strongly recognized ASGR1 antigen.
  • Figure 20 shows a schematic diagram of a method for selectively delivering DENND2A-binding peptide to hepatocytes using an anti-asialoglycoprotein receptor single-chain antibody.
  • the DENND2A-binding peptide linked with an anti-asialoglycoprotein receptor antibody is internalized into early endosomes by endocytosis.
  • the peptide is dissociated upon cleavage.
  • a membrane fusion-promoting peptide is added downstream of the DENND2A-binding peptide, thereby releasing the peptide into the cytoplasm. Since the target DENND2A is a protein localized within cells or in the nuclear fraction, a nuclear localization signal is added if it is to be delivered to the nucleus.
  • Example 15 Anti-HBV activity of DENND2A-binding peptide in PXB cells. Hepatocytes are persistently infected with hepatitis B virus (HBV). Therefore, we evaluated the anti-HBV activity of the DENND2A-binding peptide using PXB cells. Since DENND2A-binding peptides were added from outside the cells, single-chain antibody-peptide fusions 10M-DEN3N and 10M-DEN3SN were used for HBV assay in PXB cells.
  • Figure 22 shows the anti-HBV activity of the DENND2A-binding peptide in PXB cells.
  • Both DENND2A-binding peptides 10M-DEN3N and 10M-DEN3SN significantly decreased the copy number of HBV-DNA and cccDNA and exhibited high anti-HBV activity in a concentration-dependent manner. It was revealed that it exhibited very high anti-HBV activity.
  • Example 16 Mechanism of action of DENND2A-binding peptide DENP4-3, a DENND2A-binding peptide obtained as a DENND2A-binding peptide by IVV screening, had sequence homology to SASH1.
  • a peptide-antibody fusion in which this SASH1 sequence was fused to an anti-ASGR single chain antibody was named 10M-DEN3SN and used in subsequent experiments.
  • SASH1 binds to DENND2A.
  • SASH1 is known to function as a scaffold protein in the TLR4 signaling pathway (Dauphinee, S.M., et al., J. Immunol. 191, 892-901, 2013), and the TLR4 signaling pathway activates NF- ⁇ B. This shows antiviral activity (Zhang, E., and Lu, M., Med. Microbiol. Immunol., 204, 11-20, 2015).
  • DENND2A is essential for maintaining HBV infection (Hashimoto, S.
  • DENND2A binds to SASH1 in HBV-infected cells and inhibits its function, potentially maintaining infection by inhibiting immune responses. It is speculated (Figure 23A) that in the presence of the DENND2A-binding peptide, SASH1 separates from DENND2A and returns to function as a scaffolding molecule for assembling a molecular complex containing TRAF6, resulting in the activation of the NF- ⁇ B and AP-1 pathways.
  • a luciferase assay was performed using HepG2-NFkB-Luc cells.
  • the luciferase gene is integrated into the NF- ⁇ B promoter, and the luminescence of luciferase increases in response to increased transcriptional activity of NF- ⁇ B.
  • luciferase activity increased with a peak at 6 hours ( Figure 24A).
  • NF- ⁇ B translocates from the cytoplasm to the nucleus upon activation and acts as a transcription factor
  • Moynagh, P.N., J. Cell Sci., 118, 4589-4592, 2005 HepG2 cells were treated with 100 nM 10M-DEN3SN for 6 hours, and immunostaining was performed using anti-NF- ⁇ B (p65) antibody.
  • p65 anti-NF- ⁇ B
  • IL-6 and IL-1 ⁇ are known to have anti-HBV activity (Hosel, M., et al., Hepatol., 50, 1773-1782, 2009;Palumbo, G.A., et al., PLoS One, 10, e0142599, 2015).
  • interferon IFN ⁇ and IFN ⁇ are used as interferon preparations for the treatment of HBV (Pestka, S. et al., Immunol. Rev., 202:8-32, 2004; Rang et al., J. Hepatol., 31:791-799, 1999).
  • Huh7 cells or HepG2-NFkB-Luc cells were treated with 100 nM 10M-DEN3SN for 6 hours, RNA extracted from the cells was used as a template, and real-time RT-PCR was performed using primers specific to these cytokines and interferon. The production amount of these anti-HBV factors was detected.
  • Figure 26 shows the results in Huh7 cells
  • Figure 27 shows the results in HepG2-NFkB-Luc cells. It was found that 10M-DEN3SN treatment increased the mRNA levels of IL-6 (A), IL-1 ⁇ (B), IFN ⁇ (C), and IFN ⁇ (D) in all cells. The results in Figures 24, 25, 26, and 27 showed that 10M-DEN3SN promoted the transcriptional activity of NF- ⁇ B.
  • phosphorylation of IKK ⁇ / ⁇ promotes the degradation of I ⁇ B, an inhibitory protein of NF- ⁇ B, and promotes the activation of NF- ⁇ B.
  • HisBioFLAG-DENND2A inhibits the phosphorylation of IKK ⁇ / ⁇ and NF- ⁇ B, and suppresses the transcriptional activity of NF- ⁇ B.
  • the TLR4 signaling pathway is initiated when a ligand such as LPS binds to the TLR4 receptor. Therefore, we investigated whether DENND2A suppresses LPS-induced activation of the TLR4 signaling pathway.
  • knockdown of DENND2A also increased the mRNA levels of IL-6 and IL-1 ⁇ in HepG2-NFkB-Luc cells. (Fig. 29F, G).
  • 10M-DEN3SN The effect of 10M-DEN3SN on the transcriptional activity of NF- ⁇ B was investigated in cells in which SASH1 was knocked down. After introducing siRNA targeting SASH1 into HepG2-NFkB-Luc cells, the cells were treated with 10M-DEN3SN, and the transcriptional activity of NF- ⁇ B was evaluated by luciferase assay. As a result, 10M-DEN3SN promoted the transcriptional activity of NF- ⁇ B in cells in which SASH1 was not knocked down, but 10M-DEN3SN had no effect in cells in which SASH1 was knocked down (Figure 31A).
  • Example 17 Drug efficacy test using HBV-infected PXB mice PXB mice were infected with HBV and the drug efficacy of the test substance (anti-ASGR single chain antibody-DENND2A binding peptide fusion 10M-DEN3SN) was confirmed. The following experiment was conducted for the purpose.
  • Virus used was HBV purchased from Phoenix Bio Co., Ltd.
  • Virus name Hepatitis B Virus Strain name: PBB004 (Genotype C)
  • BSL 2 Virus titer: 1.1E+09 copies/mL (2 10 ⁇ L/tubes)
  • Storage Store in an ultra-low temperature freezer
  • Preparation method Thaw one bottle of frozen virus solution and prepare to 1.0E+06 copies/mL using physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.).
  • Animal used Animal species Mouse strain: PXB mouse (cDNA-uPAwild/+/SCID mouse introduced with human hepatocytes, human hepatocyte prediction calculated based on mouse blood h-Alb concentration Mice with a replacement rate of 70% or more)
  • Source Phoenix Bio Co., Ltd.
  • Gender Male Age: 12 weeks or older (at time of arrival) After human hepatocyte transplantation; 9 weeks or more Number of animals used: 10 Animal species Reason for selection: Commonly used as an HBV infection model.
  • Feed ad libitum was a mixture of MF (Oriental Yeast Co., Ltd.) and PS-A (Oriental Yeast Co., Ltd.) at a ratio of 2:1.
  • mice 17-4.6 Grouping (SOP/Test/002) Blood will be collected 6 weeks after virus inoculation, and mice will be assigned to each group based on the amount of HBV DNA in the blood at 8 weeks after virus inoculation (the day of first administration of the test substance).
  • Virus inoculation Inoculate HBV at 1.0E+05 copies/100 ⁇ L/body into the mouse tail vein.
  • test substance From the 8th week after virus inoculation (Day 0) to the day before specimen collection (Day 27), administer 300 ⁇ L/body intraperitoneally to mice once every 2 to 3 days (Monday, Wednesday, Friday).
  • Blood collection Approximately 70 ⁇ L of blood was collected from the subclavian vein at 6 weeks after virus inoculation (2 weeks before the first dose) and once a week from before the first dose (Day 0: 8 weeks after virus inoculation) until Day 21. At the time of autopsy (Day 28), the entire amount of blood that could be collected (400 ⁇ L or more) was collected from the abdominal vena cava or the heart under isoflurane inhalation anesthesia.
  • the remaining blood was centrifuged at 6000 rpm for 15 minutes at 4°C, and serum (at time of blood sampling over time (for measuring HBV-related factors): 30 ⁇ L (5 ⁇ L x 2, 20 ⁇ L x 1), at autopsy: 160 More than ⁇ L was separated (5 ⁇ L x 2 bottles, 20 ⁇ L x 1 bottle, and the remainder 1 bottle) and stored frozen (below -60°C) until sent to the following address.
  • liver is collected and weighed. A portion of the liver is cryopreserved for HBV DNA and cccDNA, and the rest is fixed in formalin for histopathological examination. The lungs, spleen and kidneys are also fixed in formalin.
  • HBsAg, HBeAg and HBcrAg Serum HBsAg concentration measurements were performed by SRL Co., Ltd. (Tokyo). Lumipulse (registered trademark) Presto II (Fujirebio Co., Ltd., Tokyo), which utilizes chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA), was used for the measurement. The measurement range was 0.005 to 150 IU/mL. The dilution rate of the sample to be measured in this test was 30 times, and the measurement range at the same dilution rate was 0.15 to 4500 IU/mL. Serum HBsAg concentration measurements were performed by SRL Co., Ltd. (Tokyo).
  • Lumipulse (registered trademark) Presto II (Fujirebio Co., Ltd., Tokyo), which utilizes chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA), was used for the measurement.
  • the measurement range was from 0.1 to 1590 COI.
  • the dilution rate of the sample to be measured in this test was 30 times, and the measurement range at the same dilution rate was 3 to 47,700 COI.
  • Serum HBc-rAg concentration measurements were performed by SRL Co., Ltd. (Tokyo).
  • LUMIPULSE HBcrAg LUMIPULSE F (Fujirebio Co., Ltd., Tokyo), which utilizes chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA)
  • the lower limit of measurement was 3.0 log U/mL.
  • the dilution rate of the sample to be measured in this test was 300 times, and the lower limit of measurement at the same dilution rate was 5.5 log U/mL.
  • h-Alb concentration was measured using latex agglutination immunoturbidimetry (LZ test 'Eiken' U-ALB, Eiken Kagaku Co., Ltd., Tokyo) using an automatic analyzer BioMajestyTM (JCA-BM6050, JEOL, Tokyo). It was measured with
  • ALT Measurement of ALT Measurement was performed at Phoenix Bio using serum obtained at autopsy. Plasma ALT activity was measured using 10 ⁇ L of collected plasma.
  • the measurement target was diarylimidazole leuco dye (diarylimidazole leuco dye is colored blue by hydrogen peroxide generated by pyruvate oxidase and peroxidase), and a Drychem 7000/NX500sV was used for the measurement.
  • Blood HBV DNA measurement was carried out by Cubix Co., Ltd. via Phoenix Bio Co., Ltd.
  • the serum was mixed with HBV Pre-treatment Solution for HBV DNA in Serum and heated at 98°C for 5 minutes to inactivate HBV and expose HBV DNA.
  • KUBIX HBV qPCR Kit (KUBIX Co., Ltd.) and CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) were used for PCR reaction and analysis. 10 ⁇ L of HBV 2 ⁇ PCR Solution and 10 ⁇ L of heat-treated standard or sample to be measured were mixed.
  • the PCR reaction was performed at 95°C for 2 minutes ⁇ (95°C for 5 seconds ⁇ 54°C for 30 seconds) ⁇ 45 cycles.
  • Blood HBV DNA concentration was calculated as the average of 2 wells. The lower limit of detection using this quantitative method is 4.0E+04 copies/mL.
  • serum obtained from HBV-infected PXB mice was used as the HBV DNA standard. The HBV DNA concentration contained in this serum was quantified by digital PCR.
  • the primer and probe sequences and standards used were the same as those for HBV DNA in the liver.
  • HBV DNA in Liver DNA was extracted from RNAlater-soaked liver samples using DNeasy (registered trademark) Blood & Tissue Kits (Qiagen Co., Ltd., Tokyo), and the DNA was dissolved in nuclease-free water. After measuring the DNA concentration using BioPhotometer (registered trademark) 6131 (Eppendorf Co., Ltd.), the final concentration was adjusted to 20 ng/ ⁇ L using Nuclease-free water.
  • a PCR reaction solution was prepared using 5 ⁇ L of dissolved DNA stock solution or diluted DNA and TaqMan (registered trademark) Fast Advanced Master Mix.
  • CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System was used for PCR reaction and analysis.
  • the PCR reaction was performed in 53 cycles of 50°C for 2 minutes ⁇ 95°C for 20 seconds ⁇ (95°C for 3 seconds ⁇ 60°C for 32 seconds).
  • the HBV DNA concentration in the liver was calculated as the average of 2 wells.
  • the sequences of the primers and probes used are listed in Table 12 below.
  • the lower limit of detection by this quantitative method is 50 copies/100ng DNA.
  • Serum obtained from HBV-infected PXB mice was used as the HBV DNA standard. The HBV DNA concentration contained in this serum was quantified by digital PCR.
  • cccDNA 5 ⁇ L of the DNA stock solution or diluted DNA purified during the measurement of HBV DNA in the liver was prepared using TaqMan (registered trademark) Fast Advanced Master Mix.
  • CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System was used for PCR reaction and analysis. The PCR reaction was performed at 55 cycles of 50°C for 2 minutes ⁇ 95°C for 20 seconds ⁇ (95°C for 3 seconds ⁇ 60°C for 32 seconds).
  • the HBV cccDNA concentration in the liver was calculated as the average of 2 wells.
  • the sequences of the primers (Takara Bio Inc., Shiga) and probes (Takara Bio Inc.) used are shown in Table 13 below. The lower limit of detection by this quantitative method was 1.0 ⁇ 10 2 copies/100 ng DNA.
  • a plasmid containing the entire HBV genome sequence was used as the HBV cccDNA standard.
  • HBsAg immunostaining Liver tissues were fixed in 10% neutral buffered formalin solution and then replaced with 70% ethanol. These samples were sent to the Nara Institute of Pathology (Nara) to prepare paraffin-embedded blocks using standard methods, and then thin-sectioned specimens were prepared. I got it. After paraffin sections were deparaffinized, antigen retrieval was performed using microwaves.
  • Nara Nara Institute of Pathology
  • HBsAg anti-HBsAg antibody, Code: OBT0990, Bio-Rad AbD Serotec Limited, Oxford, UK
  • HBcAg anti-HBcAg antibody, Code: PAB14506, Abnova, Taipei City, Taiwa
  • FIG. 41 A micrograph of HBsAg immunostaining is shown in Figure 41. It was found that the antigen staining image was suppressed in the 10M-DEN3SN administration group compared to the control (PBS) administration group. In addition, a micrograph of histopathological examination and HBcAg immunostaining is shown in FIG. Regarding this antigen, the staining image of the antigen was also found to be suppressed in the 10M-DEN3SN administration group compared to the control (PBS) administration group.
  • the DENND2A-binding peptide (10M-DEN3SN) reduced HBV-DNA and cccDNA in the liver in animal experiments using human hepatocyte chimeric mice infected with HBV, and has a clear anti-HBV effect. This has been proven. As a result, it can be considered that the POC (Proof of Concept) of the DENND2A-binding peptide (10M-DEN3SN) was obtained in animal experiments using human liver chimeric mice.

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Abstract

宿主因子DENND2Aをターゲットとした新規な抗HBV薬が開示されている。本発明の抗HBV剤は、DENND2Aに結合し、DENND2Aの機能を阻害する物質を有効成分として含む。１つの態様において、本発明の抗HBV剤は、特定のアミノ酸配列で構成されるDENND2A結合ペプチドを有効成分とする。DENND2A結合ペプチドは、細胞内への送達のための担体分子（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体に結合する抗体、抗体断片又は一本鎖抗体）や、細胞膜透過促進分子、核移行シグナルと連結した形態であってよい。

Description

宿主因子ＤＥＮＮＤ２Ａをターゲットとした抗Ｂ型肝炎ウイルス剤
　本発明は、宿主因子であるDENND2Aをターゲットとした抗B型肝炎ウイルス剤に関する。
　慢性肝疾患の主な原因であるB型肝炎ウイルス（HBV）の慢性キャリア（キャリアとは病原性のウイルスを体内に保有している人のこと）は、世界で3億5000万人と推定されている。HBVキャリアが人口の8%以上の高頻度国は、アジアとアフリカに集中している。これに対し、日本、ヨーロッパ、北米などは感染頻度2%以下の低頻度国である。毎年、78万人以上の人々が、肝硬変や肝がんなどのB型肝炎感染の合併症により亡くなっている(非特許文献１)。HBVキャリアは、非感染者に比べて肝臓がんを発症する可能性が非常に高いと言われている。HBVは、不完全二重鎖DNA（relaxed-circular DNA; rcDNA）として核内に存在している。HBVが肝細胞に感染すると、rcDNAは、核内で共有結合で閉じた環状DNA（cccDNA）に変換される(非特許文献２)。HBVがrcDNAからcccDNAを合成する際には宿主のDNA修復機構、特にATRシグナル伝達経路を利用することが知られている(非特許文献３)。HBVは、細胞内では、安定的に不活性化されたcccDNAとして潜伏状態を維持することができる。しかし、化学療法や造血幹細胞移植によって免疫系が障害されると、HBVの再活性化が引き起こされる。さらに、宿主の免疫系とウイルスの間の相互作用は、進行した肝細胞癌（HCC）の発症に影響を与える。ウイルスのレプリカを減らすことに成功した治療は、進行した肝疾患や肝細胞癌の発生を遅らせることができる。しかし、潜伏しているHBVを排除するためには、cccDNAを標的とすることが必要である。
　HBVに感染した肝細胞からHCC細胞に形質転換された細胞は、細胞内に減少した量のHBVのタンパク質とmRNAを発現している。宿主ゲノムに組み込まれたHBV DNAを含む細胞を除いて、HCCから樹立された細胞株は通常、HBV転写産物を発現しない。HBVの転写産物を発現し続ける細胞株は、HBVの維持に必要な宿主遺伝子の同定に非常に有用である。そこで、橋本らは、HBV感染が非常に少ない割合（3000個に1個程度）で維持されるHC1細胞株を樹立し、シングルセルトランスクリプトーム解析（Nx1-Seq）を行うことで、HBV感染細胞で高発現するLIPG、DOCK11、DENND2A、HECW2の４つの宿主遺伝子を同定した(非特許文献４、特許文献１)。そのうちの一つであるDENND2A(DENN domain-containing protein 2A)は、1009アミノ酸残基からなり、細胞骨格タンパク質のアクチンフィラメントに局在するDENNドメインファミリーのメンバーである。DENNドメインを含むタンパク質は低分子量GTPアーゼのRabファミリーのメンバーと直接相互作用し、DENNドメインはRab特異的グアニンヌクレオチド交換因子として酵素的に機能する(非特許文献５)。興味深いことに、最近、Rhoファミリータンパク質RHOBTB3がRAB9エフェクタータンパク質であることが示された(非特許文献６)。Rhoファミリータンパク質は通常、アクチン細胞骨格を制御するプロセスに関連している。さらに、DENND2ファミリーのメンバーは、後期エンドソームとトランスゴルジネットワーク間のRAB9輸送のグアニンヌクレオチド交換因子として機能することが報告されている。リソソーム様オルガネラへの輸送に関与するBLOC複合体の成分は、アクチンフィラメントと会合し(非特許文献７)、RAB9と相互作用することがわかっている(非特許文献８)。DENND2 GDP-GTP交換因子は、アクチンフィラメントを標的とし、マンノース-6-リン酸受容体のリソソームへのRAB9依存性輸送を制御することが報告されている(非特許文献９)。橋本らは、上記の報告（非特許文献４、特許文献１）において、レンチshRNAによりDENND2AをノックダウンすることでHBVの複製が低下することを示したが、DENND2AとHBV DNAやcccDNAとの関係は不明である。
WO 2017/082202 A1
Lozano, R. et al., Lancet, 380:2095-2128, 2012 Yang, H.C., Kao,J.H., Emerg. Microbes Infect. 3:e64, 2014 Luo, J. et al. mBio, 11, e03423-19, 2020 Hashimoto, S. et al., PLoS One, 16:e0246313, 2021 Marat, A.L., et al., J. Biol. Chem., 286: 13791-13800, 2011 Espinosa, E.J.E., et al., Cell, 137:938-948, 2009 Falcon-Perez, J.M., et al., J. Biol. Chem., 277:28191-28199, 2002 Kloer, D.P. et al., J. Biol. Chem., 285:7794-7804, 2010 Yoshimura, S., et al., J. Cell. Biol., 191:367-381, 2010
　本願発明は、DENND2Aをターゲットとした新規な抗HBV薬を提供することを目的とする。
　本願発明者らは、鋭意検討の結果、DENND2Aへの結合活性が強いペプチドを同定し、それらのペプチドが宿主細胞内のHBV DNA、cccDNAを低減する活性を有することを明らかにした。さらに、薬物を肝細胞内に選択的に送達する手段として本願発明者らが新たに確立した、肝細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質受容体（ASGR）を強く認識できる抗ASGR一本鎖抗体を利用し、DENND2A結合ペプチドに細胞膜透過を促進するペプチドや核移行シグナル等を付加したコンストラクトを作製し、PXBマウス由来のPXB細胞及びPXBマウス体内でDENND2A結合ペプチドが抗HBV活性を発揮できることを確認した。
　以上の鋭意研究により完成した本願発明は、以下の態様を包含する。
[1]　DENND2Aに結合し、DENND2Aの機能を阻害する物質を有効成分として含む、抗B型肝炎ウイルス剤。
[2]　前記物質は、配列番号35に示すアミノ酸配列の第1番～第775番残基の領域内のいずれかの領域、又は配列番号37に示すアミノ酸配列中のいずれかの領域に結合する、[1]記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[3]　DENND2Aの機能の阻害が、DENND2AのSASH1との結合の阻害、及びDENND2AによるNF-κB転写活性の抑制の阻害から選択される少なくとも１種である、[1]又は[2]記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[4]　前記物質が、下記(1)～(5)のポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリペプチドである、[1]～[3]のいずれか１項に記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
(1)　IHDRCTGCLPVKRGSH（配列番号1）の配列のポリペプチド。
(2)　ADKGCLPIGCRYGTSY（配列番号2）の配列のポリペプチド。
(3)　LPSPDAPCLPVKRGSP（配列番号3）の配列のポリペプチド。
(4)　CLPVKRGS（配列番号84）の領域を含むSASH1の部分ポリペプチド。
(5)　(1)～(4)のいずれかと８０％以上１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド。
[5]　前記ポリペプチドは、肝細胞内への送達のための担体分子と連結した形態にある、[4]記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[6]　前記担体分子が、アシアロ糖タンパク質受容体に結合する抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である、[5]記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[7]　前記抗体、抗体断片又は一本鎖抗体が、
　配列番号４、１０、１６若しくは２２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、
　配列番号５、１１、１７若しくは２３に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、
　配列番号６、１２、１８若しくは２４に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、
　配列番号７、１３、１９若しくは２５に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、
　配列番号８、１４、２０若しくは２６に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、
　配列番号９、１５、２１若しくは２７に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3と
を有する、[6]記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[8]　前記抗体、抗体断片又は一本鎖抗体が、内因性酵素により切断される切断配列を介して前記ポリペプチドと連結する、[6]又は[7]記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[9]　前記ポリペプチドは、細胞膜透過促進分子と連結した形態にある、[4]～[8]のいずれか１項に記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[10]　細胞膜透過促進分子が、配列番号２９又は３０に示すアミノ酸配列のポリペプチドである、[9]記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[11]　前記ポリペプチドは、核移行シグナルと連結した形態にある、[4]～[10]のいずれか１項に記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
[12]　下記(1)～(5)のポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリペプチドの、DENND2A結合ペプチドとしての使用。
(1)　IHDRCTGCLPVKRGSH（配列番号1）の配列のポリペプチド。
(2)　ADKGCLPIGCRYGTSY（配列番号2）の配列のポリペプチド。
(3)　LPSPDAPCLPVKRGSP（配列番号3）の配列のポリペプチド。
(4)　CLPVKRGS（配列番号84）の領域を含むSASH1の部分ポリペプチド。
(5)　(1)～(4)のいずれかと８０％以上１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド。
[13]　下記(1)～(5)のポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリペプチドからなる、DENND2A結合ペプチド。
(1)　IHDRCTGCLPVKRGSH（配列番号1）の配列のポリペプチド。
(2)　ADKGCLPIGCRYGTSY（配列番号2）の配列のポリペプチド。
(3)　LPSPDAPCLPVKRGSP（配列番号3）の配列のポリペプチド。
(4)　CLPVKRGS（配列番号84）の領域を含むSASH1の部分ポリペプチド。
(5)　(1)～(4)のいずれかと８０％以上１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド。
[14]　B型肝炎ウイルス感染患者に[1]～[11]のいずれか１項に記載の抗B型肝炎ウイルス剤の有効量を投与することを含む、前記患者においてB型肝炎ウイルス感染を治療もしくは予防し、B型肝炎ウイルスの増殖を抑制し、又はB型肝炎を治療もしくは予防する方法。
　本発明により、DENND2Aに結合し、DENND2Aの機能を阻害する作用を有する抗HBV剤が初めて提供される。本発明の抗HBV剤によれば、細胞内のHBV DNA及びcccDNAを低減できるので、B型肝炎の根治も期待される。
IVVスクリーニングのためのDNAライブラリーのデザイン。 ヒトDENND2Aのisoformの構造。 ビオチン化DENND2Aの構築。 IVV法によるDENND2Aと結合するペプチドの選択実験。 DENND2A結合ペプチドによるDENND2Aに対するプルダウンアッセイ。 各種培養細胞におけるDENND2Aの発現量の検討。 Huh7-LIPG細胞におけるDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性。（A)アッセイのタイムスケジュール。（B-1）DENND2A結合ペプチドのMTTアッセイ。（B-2）DENND2A結合ペプチドのHBV-DNAのcopy数に対する影響。（B-3）DENND2A結合ペプチドのcccDNAのcopy数に対する影響。（B-4）DENND2A結合ペプチドのpgRNAのcopy数に対する影響。 BLASTPにおけるホモロジー検索。 Huh7-NTCP-YFP細胞におけるDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性。（A)アッセイのタイムスケジュール。（B-左）核移行シグナル(-)DENND2A結合ペプチドのHBV-DNAのcopy数に対する影響とcccDNAのcopy数に対する影響。（B-右）核移行シグナル(+)DENND2A結合ペプチドのHBV-DNAのcopy数に対する影響とcccDNAのcopy数に対する影響。 ビオチン化アシアロ糖タンパク質受容体のデザイン。 ASGR1とASGR2のそれぞれの細胞外ドメインのクローニング配列。 ビオチン化アシアロ糖タンパク質受容体のコンストラクト。 抗体の構造。(左) IgG抗体の基本構造。S-S結合により結合した2本のH鎖と2本のL鎖から構成され、抗原結合部位である可変領域 (VH、VL)と、それ以外の定常領域 (CH、CL)にわかれている。定常領域のFc領域は、Fcレセプター結合部位である。(右) 可変領域に存在する相補性決定領域 (Complementarity determining region : CDR)。それ以外の領域はフレームワーク領域である。 一本鎖抗体 (scFv)の構造。VH鎖のC末端とVLのN末端がペプチドリンカーを介して結合している。 マウス一本鎖抗体のcDNAライブラリーの作成のスキーム。 ヒト一本鎖抗体のcDNAライブラリーの作成のスキーム。 IVV法によるASGRと結合する一本鎖抗体の選択実験。 ASGR結合一本鎖抗体によるプルダウンアッセイ（１） ASGR結合一本鎖抗体によるプルダウンアッセイ（２） DENND2A結合ペプチドと抗アシアロ糖タンパク質受容体抗体との融合体の細胞内での機構。 DENND2A結合ペプチドと抗アシアロ糖タンパク質受容体抗体との融合体のコンストラクト。 PXB細胞におけるDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性。（A)アッセイのタイムスケジュール。（B-1）DENND2A結合ペプチド10M-DEN3NのHBV-DNAのcopy数に対する影響。（B-2）DENND2A結合ペプチド10M-DEN3NのcccDNAのcopy数に対する影響。（B-3）DENND2A結合ペプチド10M-DEN3SNのHBV-DNAのcopy数に対する影響。（B-4）DENND2A結合ペプチド10M-DEN3SNのcccDNAのcopy数に対する影響。 TLR4のシグナル伝達系におけるSASH1の機能とDENND2AおよびDENND2A結合ペプチドの制御機構。 10M-DEN3SNはNF-κBを活性化する。HepG2-NFkB-Luc細胞を（A）100 nM 10M-DEN3SNで0-48hあるいは（B）0-100 nM 10M-DEN3SNで6h処理後、細胞可溶化液を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。データは3回の独立した実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05. 10M-DEN3SNはNF-κBの核移行を促進する。（A）HepG2細胞を100nM 10M-DEN3SNで0-6時間処理し、抗NF-κB(p65)抗体を用いて免疫染色を行った。核染色にはDAPIを用い、蛍光顕微鏡LSM800を用いて観察した。（B）蛍光顕微鏡LSM800を用いてNF-κB (p65) が核に局在している細胞数を計測し、全体の細胞数に対するパーセンテージで示した。データは3回の独立した実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05. 10M-DEN3SNはHuh7細胞においてNF-κB下流の抗HBV因子の発現を促進する。Huh7細胞を100nM 10M-DEN3SNで6時間処理後、細胞から抽出したRNAを鋳型としてリアルタイムRT-PCRを行った。プライマーセットとして、（A）IL-6、（B）IL-1β、（C）IFNα、（D）IFNβに特異的なプライマーを用いた。GAPDH mRNA量を用いて各mRNA量標準化した。データは3回の独立した実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05. 10M-DEN3SNはHepG2-NFkB-Luc細胞においてNF-κB下流の抗HBV因子の発現を促進する。HepG2-NFkB-Luc細胞を100nM 10M-DEN3SNで6時間処理後、細胞から抽出したRNAを鋳型としてリアルタイムRT-PCRを行った。プライマーセットとして、（A）IL-6、（B）IL-1β、（C）IFNα、（D）IFNβに特異的なプライマーを用いた。GAPDH mRNA量を用いて各mRNA量を標準化した。データは3回の独立した実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05. 10M-DEN3SNはDENND2AによるNF-κBの活性阻害をレスキューする。（A）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine2000を用いてHisBioFLAG-DENND2Aをトランスフェクションし、その際のHisBioFLAG-DENND2Aプラスミド量は推奨プロトコルの1.0倍, 0.5倍, 0.25倍, 0倍に調節した。24時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。（B）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine2000を用いてHisBioFLAG-DENND2Aをトランスフェクションし、その際のHisBioFLAG-DENND2Aプラスミド量は推奨プロトコルの1.0倍, 0.5倍, 0.25倍, 0倍に調節した。24時間後に細胞可溶化液を調製してWestern Blottingを行った。１次抗体としてFLAGタグ, NF-κB(p65), pNF-κB(p65), IKKβ, pIKKα/β, GAPDH抗体を用いた。（C）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine2000を用いて、推奨プロトコル通りのプラスミド量でHisBioFLAG-DENND2Aをトランスフェクションした。24時間後に0-250 ng/ml LPSで5時間刺激し、ルシフェラーゼアッセイを行った。（D）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine2000を用いて、推奨プロトコル通りのプラスミド量でHisBioFLAG-DENND2Aをトランスフェクションした。24時間後に100 nM 10M-DEN3SNで6時間刺激し、ルシフェラーゼアッセイを行った。データは2回の独立した実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05. 10M-DEN3SNのノックダウンはNF-κBを活性化する。（A）Huh7細胞あるいは（B）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine3000を用いてDENND2A siRNAをトランスフェクションした。72時間後、DENND2Aに特異的なプライマーを用いてリアルタイムRT-PCRを行い、GAPDH mRNA量を用いてDENND2A mRNA量を標準化した。（C）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine3000を用いてDENND2A siRNAをトランスフェクションし、72時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。（D, E）Huh7細胞にLipofectamine3000を用いてDENND2A siRNAをトランスフェクションし、72時間後にリアルタイムRT-PCRを行った。プライマーセットとして、（D）IL-6、（E）IL-1βに特異的なプライマーを用いた。GAPDH mRNA量を用いて各mRNA量を標準化した。（F, G）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine3000を用いてDENND2A siRNAをトランスフェクションし、72時間後にリアルタイムRT-PCRを行った。プライマーセットとして、（F）IL-6、（G）IL-1βに特異的なプライマーを用いた。GAPDH mRNA量を用いて各mRNA量を標準化した。データは3回（A, C, D, E）あるいは２回（B, F, G）の独立した実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05. SASH1のノックダウンはNF-κBの活性を抑制する。（A）Huh7細胞あるいは（B）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine3000を用いてSASH1siRNAをトランスフェクションした。72時間後に100 ng/mlで5時間刺激し、SASH1に特異的なプライマーを用いてリアルタイムRT-PCRを行った。GAPDH mRNA量を用いてSASH1 mRNA量を標準化した。（C）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine3000を用いてDENND2A siRNAをトランスフェクションし、72時間後に100 ng/mlで5時間刺激してルシフェラーゼアッセイを行った。（D, E）Huh7細胞にLipofectamine3000を用いてSASH1 siRNAをトランスフェクションし、72時間後に100 ng/mlで5時間刺激してリアルタイムRT-PCRを行った。プライマーセットとして、（D）IL-6、（E）IL-1βに特異的なプライマーを用いた。GAPDH mRNA量を用いて各mRNA量を標準化した。（F, G）HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine3000を用いてSASH1 siRNAをトランスフェクションし、72時間後に100 ng/mlで5時間刺激してリアルタイムRT-PCRを行った。プライマーセットとして、（F）IL-6、（G）IL-1βに特異的なプライマーを用いた。GAPDH mRNA量を用いて各mRNA量を標準化した。データは3回（A, C, D, E）あるいは２回（B, F, G）の独立した実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05. 10M-DEN3SNによるNF-κBの活性化にはSASH1が必要である。HepG2-NFkB-Luc細胞にLipofectamine3000を用いてSASH1 siRNAをトランスフェクションし、72時間後に100 nM 10M-DEN3SNで6時間刺激し、（A）ルシフェラーゼアッセイを行った。（B）IFNαに特異的なプライマーを用いてリアルタイムRT-PCRを行った。GAPDH mRNA量を用いてIFNα mRNA量を標準化した。データは2回の独立した実験の平均値±SEMを示す。*p<0.05. 実施例17のキメラマウス実験におけるサンプルの投与スケジュール。 実施例17におけるHBsAgの測定。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。 実施例17におけるHBeAgの測定。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。 実施例17におけるHBcrAgの測定。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。 実施例17における血中HBV DNAの測定。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。 実施例17におけるh-Albの測定。10M-DEN3SNAとcontrol (PBS)の比較。 実施例17におけるALTの測定。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。 実施例17における肝臓中HBV DNAの測定。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。 実施例17における肝臓中cccDNAの測定。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。 実施例17における病理組織学的検査（HBsAg免疫染色）。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。 実施例17における病理組織学的検査（HBcAg免疫染色）。10M-DEN3SNとcontrol (PBS)の比較。
　本発明において、「抗B型肝炎ウイルス（抗HBV）」という語には、HBV感染の治療、HBV感染の予防、HBVの増殖抑制、B型肝炎の治療、及びB型肝炎の予防が包含される。本発明の抗HBV剤は、B型肝炎患者に投与することで、該患者体内（肝臓内）でのHBVの増殖を抑制し、B型肝炎を治療することができる。また、抗HBV剤をB型肝炎発症前のHBVキャリアに投与することで、該キャリアにおけるHBVの増殖を防止し、B型肝炎の発症を防止することができる（B型肝炎の予防）。
　本発明の抗HBV剤は、DENND2A（DENN domain-containing protein 2A）に結合し、DENND2Aの機能を阻害する物質を有効成分として含む。ヒトDENND2Aには、図2に示すように2つのアイソフォーム、1009残基のアイソフォーム1と795残基のアイソフォーム2がある。NCBIのGenBankにNM_015689.5で登録されているヒトDENND2A mRNAのコード領域の塩基配列及びこれにコードされるDENND2Aアイソフォーム1のアミノ酸配列を配列表の配列番号34及び35に、NM_001318053.2で登録されているヒトDENND2A mRNAのコード領域の塩基配列及びこれにコードされるDENND2Aアイソフォーム2のアミノ酸配列を配列番号36、37に、それぞれ示す。アイソフォーム1の第1番～第775番残基とアイソフォーム2の第1番～第775番残基は同一配列である。下記実施例で同定されたDENND2A結合ペプチドは、795残基のアイソフォーム2をベイトとしたIVVスクリーニングにより得られたペプチドであることから、抗HBV剤の有効成分として用いる物質は、DENND2Aアイソフォーム1（配列番号35）の第1番～第775番残基の領域内のいずれかの領域、又は、DENND2Aアイソフォーム2（配列番号37）の全長領域内のいずれかの領域に結合する物質であってよい。
　DENND2Aの機能の阻害は、例えば、DENND2AのSASH1（SAM and SH3 domain containing 1）との結合の阻害、及びDENND2AによるNF-κB（nuclear factor kappa-B）転写活性の抑制の阻害から選択される少なくとも１種であってよい（下記実施例16参照）。
　DENND2Aのアイソフォーム1の第1番～第775番残基の領域内、又はアイソフォーム2に結合し、DENND2Aの機能を阻害する物質としては、例えば、該第1番～第775番残基の領域又はアイソフォーム2を認識して結合する抗体、抗体断片若しくは一本鎖抗体（single chain variable fragment; scFv）又はアプタマー、該第1番～第775番残基の領域又はアイソフォーム2に選択的に結合するポリペプチド等を挙げることができる。本発明において、抗体断片という語は、抗体の抗原結合性断片という語と同義であり、Fab、Fab'、F(ab')2等が包含される。抗原との結合性を維持した抗体断片であれば特に限定されない。
　本発明の抗HBV剤は、例えば、下記(1)～(5)のポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含むものであってよい。[]内は、下記実施例において使用した各ポリペプチドの名称である。以下、これらのポリペプチドを「DENND2A結合ペプチド」ということがある。
(1)　IHDRCTGCLPVKRGSH（配列番号1）の配列のポリペプチド。[DENP4-3]
(2)　ADKGCLPIGCRYGTSY（配列番号2）の配列のポリペプチド。[DENP4-42]
(3)　LPSPDAPCLPVKRGSP（配列番号3）の配列のポリペプチド。[DENP4-3S]
(4)　CLPVKRGS（配列番号84）の領域を含むSASH1の部分ポリペプチド。
(5)　(1)～(4)のいずれかと８０％以上１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド。
　(1)及び(2)のポリペプチドは、下記実施例において、ビアコアを使ったDENND2Aと結合するペプチドの選択実験によりIVVライブラリーから選択され、プルダウンアッセイ等により抗HBV活性を確認したポリペプチドである。(3)は、(1)の配列のホモロジー検索結果に基づいて設計され、プルダウンアッセイ等により抗HBV活性を確認したポリペプチドであり、SASH1（NP_056093.3、配列番号43）の第1011番～第1026番アミノ酸の領域に基づいている。下記実施例では、(3)のDENP4-3Sを用いて調製した被検物質をin vivo投与実験に使用して抗HBV活性を確認しているが、上記したポリペプチドの具体例は、DENP4-3S以外のものもDENP4-3Sと同様に抗HBV剤として有用である。
　(4)の部分ポリペプチドとは、SASH1（NP_056093.3、配列番号43）の部分領域であって、DENND2A結合ペプチドDENP4-3と高いホモロジーを有する領域であるCLPVKRGS（配列番号84; 配列番号43に示すSASH1配列中の第1018番～第1025番アミノ酸の領域; 図8中の枠で囲んだ部分の配列）を含む部分領域で構成されるポリペプチドである。配列番号43のアミノ酸配列をコードする塩基配列（NM_015278.5のコード領域の塩基配列）を配列番号42に示す。CLPVKRGSはDENP4-3とDENP4-3Sで共通する配列であり、この共通配列を含むSASH1断片の一例に該当するDENP4-3Sが抗HBV活性を有することは下記実施例に示した通りである。従って、この共通領域を含むSASH1の部分領域で構成されるポリペプチドも同様に抗HBV活性を有し、抗HBV剤として有用である。(4)のポリペプチドの鎖長は特に限定されないが、合成や肝細胞内への送達などの便宜から、例えば100残基以内、80残基以内、70残基以内、60残基以内、50残基以内、40残基以内、30残基以内、25残基以内、又は20残基以内のサイズとしてもよい。
　(5)のポリペプチドは、(1)～(4)のいずれかのポリペプチドにおいて残基の一部を改変した、もとのポリペプチドと80％以上の配列同一性を有するポリペプチドである。ごく少数の残基を改変しても、ポリペプチドの活性が同等以上に維持されることは、この分野において周知である。従って、(1)～(4)のポリペプチドの少数の残基（例えば１～４残基、１～３残基、１若しくは２残基、又は１残基）を改変した、もとの配列との同一性が８０％以上、例えば８５％以上、又は９０％以上であるポリペプチドも、もとのポリペプチドと同様に抗HBV活性を発揮でき、抗HBV剤として有用である。ここでいう残基の改変は、置換、欠失、挿入又は付加であり、典型的には置換である。
　ここで、アミノ酸配列の同一性とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
　保存的置換、すなわち、化学的性質が類似するアミノ酸への置換であれば、タンパク質の性質・活性を損なわない蓋然性が高い。側鎖が類似するアミノ酸は、化学的性質が類似する。側鎖の類似性でアミノ酸をグループ分けすると、例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群（セリン、トレオニン）、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群（アスパラギン、グルタミン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸の群（アスパラギン酸、グルタミン酸）、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群（システイン、メチオニン）、などに分類することができる。同じ群に属する別のアミノ酸への置換が保存的置換である。
　ペプチド製剤の分野では、ペプチドの生体内での安定性を向上させ、血中半減期を高めるなどの目的で、ポリエチレングリコール（PEG）鎖を付加する（Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90.やProc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36):12962-7.など）、主としてN末端又はC末端に糖鎖を付加する（J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22やAngew Chem Int Ed Engl. 2004 Mar 12;43(12):1516-20など）、アミノ酸残基の少なくとも一部をD体とする（J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7やJ Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1183-9.など）、抗体のFc領域を適宜改変して付加する（例えば、J. Immunol., 154 (10), 5590-5600 (1995)、Nature, 332, 563-564 (1998)、Nature, 332, 738-740 (1998)、BioDrugs. 2008;22:11-26など）、C末端をアミド化する、N末端をアセチル化する等の技術が用いられている。本発明の抗HBV剤に有効成分として用いるポリペプチドは、そのような技術を適用したものであってもよい。
　本発明において、「配列番号Xの配列のポリペプチド」、「配列番号Xで表されるポリペプチド」、「配列番号Xで構成されるポリペプチド」（配列番号Xはアミノ酸残基数Nのアミノ酸配列とする）という語は、配列番号Xに示されるアミノ酸配列を有し、全長がN残基であるポリペプチド（このようなポリペプチドを便宜的にポリペプチドXと呼ぶ）に、Fc領域や肝臓へのデリバリーを高める効果を有するポリペプチドのような他の機能性分子を付加ないし連結した構造を有するポリペプチドを包含する。「配列番号Xの配列のポリペプチド」、「配列番号Xで表されるポリペプチド」又は「配列番号Xで構成されるポリペプチド」を有効成分として含む」という語は、全長がN残基であるポリペプチドXを有効成分として含むという態様の他、ポリペプチドXに他の機能性分子を付加した構造を有するポリペプチドを有効成分として含む態様を包含する。ポリペプチドの抗HBV活性を損なわない限り、いかなる機能性分子が連結されていてもよい。
　(1)～(3)のポリペプチド、及び(5)のポリペプチドのうちで(1)～(3)のいずれかと80％以上100％未満の配列同一性を有するポリペプチドは、鎖長が短いので、常法の化学合成により容易に調製できる。(4)のポリペプチド、及び(5)のポリペプチドのうちで(4)と80％以上100％未満の配列同一性を有するポリペプチドは、鎖長が短いものは化学合成により容易に調製でき、化学合成による調製が難しい鎖長のものは遺伝子工学的手法により製造することができる。他の機能性分子が連結された構造を有するポリペプチドも、機能性分子がサイズの短いポリペプチドである場合は化学合成により、機能性分子がサイズの長いポリペプチドである場合は遺伝子工学的手法により製造することができる。
　化学合成法の具体例としては、例えばFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等を挙げることができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。
　遺伝子工学的手法による製造方法も周知である。簡潔に記載すると、サイズの長いDENND2A結合ペプチドの全長、又は機能性分子に連結されたDENND2A結合ペプチドの全長をコードするcDNAを調製し、該cDNAを適当な発現ベクターに組み込んで適当な宿主細胞に導入し、該宿主細胞内でポリペプチドを生産させて抽出、精製することにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
　また、DENND2A結合ペプチドは、精製や検出の便宜のためにFlagタグやHisタグ等のタグ配列を付加したものであってもよい。このようなタグ配列も、機能性分子の１つの例として捉えることができる。例えば、下記実施例で調製した一本鎖抗体融合体10M-DEN3Nのうちの「切断配列＋DENP4-3ペプチド＋S28＋核移行シグナル」部分（配列番号82）、一本鎖抗体融合体10M-DEN3SNのうちの「切断配列＋DENP4-3Sペプチド＋S28＋核移行シグナル」部分（配列番号83）では、各DENND2A結合ペプチドのC末にFlagタグとHisタグが付加されている。もっとも、このようなタグ配列の付加は任意であり、タグ配列を付加しないDENND2A結合ペプチドにて本発明の抗HBV剤を調製することも可能である。
　機能性分子の1つの例として、肝細胞内への送達のための担体分子を挙げることができる。すなわち、DENND2A結合ペプチドは、肝細胞内への送達のための担体分子と連結した形態にあってよい。肝細胞内に送達すべき薬物のための担体分子としては、肝実質細胞に豊富に存在するアシアロ糖タンパク質受容体（ASGR）やApoE受容体を利用したDDSが知られている（伊藤 裕子、STI Horizon, 2019, Vol.5, No.4, pp.21-25）。本発明においても、ASGRやApoE受容体を利用して肝細胞内に薬物を送達する担体分子を用いることができる。
　ASGRを利用した薬物送達用担体の例として、ASGRに結合する特異結合分子（抗体、抗体断片若しくは一本鎖抗体、又はアプタマーなど）、特にASGRに結合する抗体、抗体断片又は一本鎖抗体（scFv）を挙げることができる。アシアロ糖タンパク質受容体（ASGR）は、図10に示すように、N末端を細胞内、C末端の糖認識部位（CRDs）を細胞外に向けたII型の１回膜貫通タンパク質である。ヒトの肝細胞においては、ASGR1とASGR2のヘテロオリゴマーにより受容体が形成されている。薬物送達用担体として用いるASGR特異結合分子は、ASGRの細胞外ドメインと結合するものであればよい。ASGR1とASGR2の両方に結合できる特異結合分子を特に好ましく用いることができるが、いずれか一方にのみ結合する特異結合分子であっても薬物送達用担体として利用可能である。いずれか一方にのみ結合する特異結合分子の場合、単独で薬物送達用担体として利用してもよいし、一方に結合する特異結合分子と他方に結合する特異結合分子を組み合わせて利用してもよい。組み合わせる場合、ASGR1特異結合分子を連結したDENND2A結合ペプチドと、ASGR2特異結合分子を連結したDENND2A結合ペプチドを調製し、両者を混合して抗HBV剤として利用すればよい。
　GenBankにNM_001671.5で登録されているヒトASGR1 mRNAのコード領域の塩基配列及びこれにコードされるASGR1のアミノ酸配列を配列番号38、39に、NM_001181.4で登録されているヒトASGR2 mRNAのコード領域の塩基配列及びこれにコードされるASGR2のアミノ酸配列を配列番号40、41に、それぞれ示す。配列番号39（ASGR1）の第41番～第61番アミノ酸、配列番号41（ASGR2）の第59番～第79番アミノ酸が膜貫通ドメインであり、そのN末側が細胞内ドメイン、C末側が細胞外ドメインである。抗ASGR抗体、抗体断片又は一本鎖抗体の調製においては、ASGR1の第62番～第291番アミノ酸の領域と、ASGR2の第80番～第331番アミノ酸の領域を抗原ないし免疫原として利用すればよいが、これらの細胞外ドメインをヘテロオリゴマー化して用いることがより好ましい。以下、本明細書において、「ASGR細胞外ドメイン」という語には、ヘテロオリゴマー化した細胞外ドメインが包含される。「ヘテロオリゴマー」といった場合には、ヘテロオリゴマー化したASGR細胞外ドメインを意味する。
　抗ASGRポリクローナル抗体は、ASGR細胞外ドメインを免疫原として非ヒト動物を免役し、血液を採取して血清を分離し、血清からASGR細胞外ドメインに結合する抗体を回収・精製することで得ることができる。抗ASGRモノクローナル抗体は、ASGR細胞外ドメインで免役した非ヒト動物から脾細胞やリンパ球などの抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、ASGR細胞外ドメインと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から抗ASGRモノクローナル抗体を得ることができる。
　抗ASGR抗体断片は、抗ASGR抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。抗体断片の定義は上記した通りであり、Fab、Fab'、F(ab')2等の、抗原（ASGR細胞外ドメイン）との結合性を維持した抗体断片が包含される。
　抗ASGR scFvは、例えば、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出してcDNAを調製し、免疫グロブリンH鎖及びL鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行ない免疫グロブリンH鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、該ベクターで大腸菌を形質転換してscFvを発現させ、これを大腸菌から回収することにより得ることができる。
　また、抗ASGR scFvは、ファージディスプレイ法やIVV法等の技術により、scFvライブラリーから取得することができる。
　ファージディスプレイ法では、scFvライブラリーとして、ファージ表面にscFvが提示されたファージのライブラリーを調製する。例えば次のような手順で、ナイーブscFvファージライブラリーを調製すればよい。健常なヒト又は非ヒト動物から採取された脾細胞やリンパ球などの抗体産生細胞からmRNAを抽出し、逆転写反応によりcDNAを合成し、重鎖可変領域（VH）を含む領域をコードするcDNA（VH cDNA）及び軽鎖可変領域（VL）を含む領域をコードするcDNA（VL cDNA）をPCRにより網羅的に増幅する。次いで、増幅したVH cDNA及びVL cDNAを、常法のアセンブリPCRないしはFusion PCRにより、適当なリンカー（例えば、GGGGSユニットを3回繰り返したリンカー等）を介してランダムに連結し、scFvをコードするcDNA（scFv cDNA）を調製する。scFv cDNAをファージ用プラスミドベクターに組み込んでベクターのライブラリーを調製した後、ファージディスプレイ法により各scFvを表面に提示するファージのライブラリーを作製する。ファージ用プラスミドベクターとしては、ファージ粒子を形成するために必要なファージ遺伝子が全て含まれ、単独でファージ粒子形成が可能なファージベクターと、g3p遺伝子を含むが他のファージタンパク質遺伝子を含まず、ファージ粒子形成のためにヘルパーファージを必要とするファージミドベクターの２種類があるが、ファージミドベクターを好ましく用いることができる。ファージミドベクターを用いて作製したscFv cDNAライブラリーを大腸菌に導入し、大腸菌にヘルパーファージを重感染させることにより、scFv cDNAライブラリーの個々のベクターがパッケージングされ、該ベクターが発現するscFvを表面に提示するファージのライブラリーを作製できる。調製したVH cDNA及びVL cDNAあるいはscFv cDNAにランダムに突然変異を導入し、変異scFvのファージライブラリーを作製してもよい。
　作製したライブラリーより、ASGR細胞外ドメインに結合するscFvを提示したファージを選別する（パニング）。このパニング工程は、ASGR細胞外ドメインを固定化した固相担体（チップ、プレート、磁気ビーズ等）を使用して実施することができ、ヘテロオリゴマーを固定化した担体を特に好ましく使用できる。ASGR1の細胞外ドメイン（ASGR1ex）及びASGR2の細胞外ドメイン（ASGR2ex）をビオチン化し、アビジン類がコートされた担体とビオチン化ASGR1ex及びASGR2exを接触させることで、担体表面上でASGR1ex及びASGR2exをヘテロオリゴマー化させることができる。ファージライブラリーをASGR細胞外ドメイン固定化担体と接触させ、洗浄後、担体上に結合したファージを回収する。回収したファージを溶解し、パッケージングされていたベクターを回収して再度大腸菌に導入し、ヘルパーファージを重感染させてファージ粒子を再度形成させる。これらのファージ粒子を再度、ASGR細胞外ドメイン固定化担体と接触させる。この操作を複数回実施することで、ASGR細胞外ドメインに特異的なscFvを提示したファージクローンを濃縮できる。
　複数ラウンドのパニングを経て濃縮したファージを抗ASGR scFv候補のクローンとして取得できるが、候補をさらに絞り込むためにクローンの選定を行なってもよい。濃縮後のファージよりscFv発現ベクターを回収し、大腸菌等の適当な宿主細胞に導入してscFvを発現する宿主細胞クローンを調製し、これらのクローンについて、ASGR細胞外ドメインへの反応性及び可変領域の配列を調べ、ASGR細胞外ドメインへの特異的結合性が高いクローンを選定する。反応性の確認は、ASGR細胞外ドメイン、好ましくはヘテロオリゴマーを抗原としたELISA等のイムノアッセイにより行なえばよい。可変領域の配列が同一ないし非常に類似したクローンが複数存在している可能性があるため、VH及びVLの塩基配列によりクローンの重複を確認してクローンのグルーピングを行なってもよい。これらのクローン選定作業により、ASGR細胞外ドメインへの特異的結合性が高いクローンを選定し、候補をさらに絞り込むことができる。
　候補クローンよりscFv発現ベクターを回収し、scFv発現ベクターからscFv cDNAを増幅し、適当なプラスミド発現ベクターに組み込んで適当な宿主細胞内でscFvを発現させ、これを回収、精製する。精製後のscFvについて、ASGR1ex及びASGR2exとの反応性又はヘテロオリゴマーとの反応性を最終確認し、ASGR細胞外ドメインに特異的に結合するscFvを得ることができる。
　IVV法（Nemoto, N. et al., FEBS Lett., 414:405-408, 1997; Miyamoto-Sato, E. et al., Nucleic Acids Res., 28:1176-1182, 2000; WO 03/106675 A1）は、本願発明者の一人である柳川及びその共同研究者らが開発した技術である。IVV法では、mRNAの3'末端にPEG（ポリエチレングリコール）スペーサーを介して抗生物質の一種のピューロマイシンを結合させ、それを鋳型として無細胞翻訳反応を行うことにより、タンパク質分子とこれをコードするmRNA分子とがピューロマイシンを介して共有結合したmRNA－タンパク質連結分子（in vitro virus; IVV）が形成される。こうして構築されたIVVライブラリーの中からベイト（タンパク質、ペプチド、抗原など）と結合するタンパク質を含むIVVをin vitroで釣り上げた後、そこに連結している遺伝子（mRNA）を逆転写PCRで増幅し、DNAシーケンサーで塩基配列を解読することによって、相互作用するタンパク質やペプチドや抗体を容易に同定することができる。ベイトに結合したIVVを溶出・回収する方法は、フリーのベイトで競合溶出する方法が一般的であるが、競合溶出できない場合は、光開裂が可能な2-nitrobenzylリンカーを導入したPEGスペーサーを用い、365nmのUVを照射してスペーサーを切断してmRNA部を溶出・回収することができる(Doi, N. et al., J. Biotechnol., 131:231-239, 2007)。
　IVV法による抗ASGR scFvの作製方法の詳細は下記実施例に記載の通りである。以下、簡単に説明する。
　上記のようにしてscFv cDNAライブラリーを調製した後、cDNAライブラリーから逆転写反応にてmRNAを合成し、PEGスペーサーを介してmRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、scFv mRNA-ピューロマイシンのライブラリーとする。これを鋳型として無細胞翻訳反応を行ない、scFv分子とこれをコードするmRNA分子がピューロマイシンを介して共有結合したmRNA－scFv連結分子（IVV）のライブラリーを構築する。
　scFv IVVライブラリーの中から、ASGR細胞外ドメインに結合するscFvを選択する。この選択工程も、ファージディスプレイ法と同様に、ASGR細胞外ドメイン、好ましくはヘテロオリゴマーをベイトとして固定化した固相担体（チップ、プレート、磁気ビーズ等）を使用して実施できる。scFv IVVライブラリーとASGR細胞外ドメイン固定化担体を接触させ、洗浄後、担体上に結合したIVVを溶出・回収する。ASGR1ex若しくはASGR2exを用いた競合溶出によりIVVを溶出・回収できる。PEGスペーサーとして2-nitrobenzylリンカーを導入したPEGスペーサーを使用した場合には、UV照射によりスペーサーを切断してIVVのmRNA部を溶出・回収することも可能である。
　回収したIVV又はmRNA部を鋳型として逆転写PCRを行ない、1stラウンド選択後のscFv cDNAライブラリーを調製する。このcDNAライブラリーから再度IVVライブラリーを調製し、2ndラウンドの選択を実施することができる。選択圧（IVVライブラリーとベイトの接触時間、担体へのベイトの固定量等）を順次上げながら複数ラウンドの選択を実施することが好ましい。
　数回目以降のラウンドで得られた各scFv cDNAライブラリーからscFvコード領域を増幅し、適当なプラスミドベクターにクローニングして、選択後のscFv cDNAを組み込んだベクターのライブラリーを調製する。このベクターを大腸菌等の適当な宿主細胞に導入し、選択後のscFvのクローンのライブラリーを得る。得られたクローンライブラリーについて、ファージディスプレイ法のクローン選定と同様に、ASGR細胞外ドメインへの反応性の評価と可変領域配列の解析、グルーピングを行ない、選定されたクローンよりベクターを回収してscFvを調製し、ASGR1ex及びASGR2exとの反応性又はヘテロオリゴマーとの反応性を最終確認することで、ASGR細胞外ドメインへの特異的結合性が高いscFvを得ることができる。
　抗ASGR抗体、抗体断片又はscFvの特に好ましい例として、
　配列番号４、１０、１６若しくは２２に示すアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、
　配列番号５、１１、１７若しくは２３に示すアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、
　配列番号６、１２、１８若しくは２４に示すアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、
　配列番号７、１３、１９若しくは２５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、
　配列番号８、１４、２０若しくは２６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、
　配列番号９、１５、２１若しくは２７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3と
を有する抗体、抗体断片又はscFvを挙げることができる。これらのCDR配列は、下記実施例で取得された抗ASGR scFvのCDR配列に基づいている。下記実施例では、配列番号4～6に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1～3及び配列番号7～9に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1～3を有する抗ASGR scFv、配列番号10～12に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1～3及び配列番号13～15に示すアミノ酸配列の軽鎖CDR1～3を有する抗ASGR scFv、配列番号16～18に示すアミノ酸配列の重鎖CDR1～3及び配列番号19～21に示す軽鎖CDR1～3を有する抗ASGR scFv、並びに配列番号22～24に示す重鎖CDR1～3及び配列番号25～27に示す軽鎖CDR1～3を有する抗ASGR scFvが得られている。
　また、CDR配列は上記した特定のアミノ酸配列のものに限定されず、上記アミノ酸配列において一部の塩基が置換され、もとのアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むCDRを有した抗体等であってもよい。例えば、重鎖及び軽鎖CDR1は、1個の残基の置換が許容され、重鎖及び軽鎖CDR2は、1～3個、1～2個又は1個の残基の置換が許容され、重鎖及び軽鎖CDR3は、1～2個又は1個の残基の置換が許容される。このような改変型CDRを有する抗体、抗体断片又はscFvも、ASGRに特異的に結合する抗体、抗体断片又はscFvとして利用できる。
　所定の配列のCDRを有する抗体等は、例えば、クローニングされた任意の抗体のVH遺伝子及びVL遺伝子あるいは任意のscFvをコードするscFv遺伝子のCDR領域に変異を導入して上記のアミノ酸配列をコードするように改変することにより容易に調製できる。上記のCDR配列を導入するベースとなる任意の抗体及び任意のscFvは、上記とは異なる配列のCDRを有する抗ASGR抗体及び抗ASGR scFvであってもよいし、他の抗原に対する抗体及びscFvであってもよい。
　上記した特定のアミノ酸配列を含むCDR又は改変型CDRを有する抗ASGR抗体、抗体断片又はscFvは、本発明の抗HVB剤の送達用担体としてのみならず、肝細胞内に送達すべき様々な薬物のための送達用担体として非常に優れている。この抗ASGR抗体、抗体断片又はscFvを肝細胞内への薬物送達用担体とし、肝細胞内に送達すべき薬物を医薬分野で公知の技術により該担体と複合体化して医薬組成物として利用できる。当該抗ASGR抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト－非ヒト動物間のキメラ抗体、非ヒト動物抗体のいずれであってもよいが、ヒト用医薬の送達用担体として利用する場合にはヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、特にヒト抗体又はヒト化抗体、とりわけヒト抗体が好ましい。抗ASGR scFv抗体も同様に、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト－非ヒト動物間のキメラ抗体、非ヒト動物抗体のいずれに由来するものであってもよいが、ヒト用医薬の送達用担体として利用する場合にはヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体に由来するもの、特にヒト抗体又はヒト化抗体に由来するもの、とりわけヒト抗体に由来するものが好ましい。
　DENND2A結合ペプチドに抗ASGR抗体等の肝細胞内送達用担体分子を連結する場合、DENND2A結合ペプチドのどちらの末端に連結してもよい。1種以上の他の機能性分子も使用する場合には、それら他の機能性分子と併せて適切に機能するよう、DENND2A結合ペプチドに連結すればよい。肝細胞内送達用担体分子は、本発明の抗HBV剤の投与を受ける患者の細胞内に存在する内因性酵素によって切断される切断配列を介してDENND2A結合ペプチドと連結することが好ましい。切断配列の一例として、Furinが認識して切断する配列RVRR（配列番号28）を挙げることができるが、切断配列はこれに限定されない。
　機能性分子の他の例として、細胞膜透過促進分子を挙げることができる。すなわち、DENND2A結合ペプチドは、細胞膜透過促進分子と連結した形態にあってよい。細胞膜透過促進分子とは、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたDENND2A結合ペプチドが、エンドソーム内から膜を透過して細胞質内に放出するのを促進する作用を有する分子である。細胞膜透過促進分子の具体例として、土居らが開発した、ヒト胎盤形成における細胞融合に関与するシンシチン１というタンパク質の部分ペプチドであるS19（Sudo, K. et al., J. Control. Release, 255:1-11, 2017、Sudo, K. et al., J. Control. Release, 255:1-11, 2017、WO 2016/199674 A1）や、その後の検討により、膜透過促進ペプチドとしてS19よりもさらに効率的に機能しうるペプチドとして開発された、28残基のシンチシン1部分ペプチドS28（PFVIGAGVLGALGTGIGGITTSTQFYYK、配列番号29）及び39残基のシンチシン1部分ペプチドS39（PFVIGAGVLGALGTGIGGITTSTQFYYKLSQELNGDMER、配列番号30）を挙げることができる。これらのペプチド、特にS28及びS39は、本発明において好ましく使用できる細胞膜透過促進分子であるが、使用可能な細胞膜透過促進分子はこれらに限定されない。
　細胞膜透過促進分子は、DENND2A結合ペプチドのいずれの末端に連結してもよいが、肝細胞内送達用担体分子及び切断配列をDENND2A結合ペプチドに連結する場合には、切断配列よりもDENND2A結合ペプチド側に、あるいは担体分子とは逆の末端に連結する。
　機能性分子のさらなる例として、核移行シグナルを挙げることができる。すなわち、DENND2A結合ペプチドは、核移行シグナルと連結した形態にあってよい。核移行シグナルも種々のものが公知であり、いずれを用いてもよい。下記実施例では核移行シグナルとしてPAAKRVKLD（配列番号31）を利用しているが、この具体例に限定されない。核移行シグナルは、DENND2A結合ペプチドのいずれの末端に連結してもよいが、肝細胞内送達用担体分子及び切断配列をDENND2A結合ペプチドに連結する場合には、切断配列よりもDENND2A結合ペプチド側に、あるいは担体分子とは逆の末端に連結する。細胞膜透過促進分子と核移行シグナルをDENND2A結合ペプチドに連結する場合には、両末端にそれぞれ連結してもよいし、一方の末端に両方を連結してもよい。後者の場合、どちらを最末端に配置してもよい。送達用担体＋切断配列、細胞膜透過促進分子及び核移行シグナルをDENND2A結合ペプチドに連結する場合は、送達用担体＋切断配列を一方の末端に、細胞膜透過促進分子及び核移行シグナルを他方の末端に連結する。
　本発明の抗HBV剤の投与する主たる対象はHBV感染患者であり、B型肝炎患者、及びB型肝炎を発症していないHBV感染患者（HBVキャリア）が包含される。患者は典型的には哺乳動物、特にヒトであるが、これに限定されない。
　本発明の抗HBV剤の投与量は、投与対象の患者において抗HBV効果が得られる量であればよい。有効量は、患者の症状、ウイルス量、年齢、体重等に応じて適宜選択されうる。特に限定されないが、本発明の抗HBV剤の投与量は、対象に対し1日当たりの有効成分量として、体重1kg当たり1μg～10000mg程度、例えば100μg～1000mg程度としてよい。なお、ここでいう有効成分量とは、DENND2A結合ペプチドの場合には該ペプチド部分のみの量であり、DENND2A結合ペプチドに1種以上の他の機能性分子を連結したものを有効成分として用いる場合には、当該1種以上の他の機能性分子の量は上記の有効成分量には含まれていない。また、複数種類の物質を有効成分として用いる場合、有効成分量はその合計量である。1日の投与は1回でもよいし、数回に分けて投与してもよい。投与は毎日でもよいし、数日おきでもよい。
　本発明の抗HBV剤の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、一般には筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。
　本発明の抗HBV剤の有効成分は、各投与経路に適した、薬剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味剤、懸濁化剤、乳化剤、着色剤、矯味剤、安定剤等の添加剤と適宜混合して製剤することができる。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤や、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。
　2種以上の物質を有効成分として含む抗HBV剤は、2種以上の有効成分の全てを同一の製剤中に含む配合剤であってもよいし、各有効成分をそれぞれ単独で含有する単剤の組み合わせを含むものであってもよい。単剤の組み合わせを含む態様では、通常、単剤を同時に又は順次に投与するが、適当な間隔を置いて各単剤を投与しても差し支えない。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
[実施例1]: DNAライブラリーの作成
（1-1）DNAライブラリーデザイン
　IVVスクリーニングのためのDNAライブラリーのデザインを図1に示した。
　In vitro virus(IVV)法（Nemoto, N. et al., FEBS Lett., 414:405-408, 1997; Miyamoto-Sato, E. et al., Nucleic Acids Res., 28:1176-1182, 2000; WO 03/106675 A1）は、本願発明者の一人である柳川及びその共同研究者らが提案し、その構築に世界に先がけて成功した手法である。IVV法では、mRNAの3'末端にPEG（ポリエチレングリコール）スペーサーを介して抗生物質の一種のピューロマイシンを結合させ、それを鋳型として無細胞翻訳反応を行うことにより、タンパク質とmRNAがピューロマイシンを介して共有結合した単純なmRNA-タンパク質連結分子であるIVVが形成される（Miyamoto-Sato,E. et al., Nucleic Acids Res.,31: e78,2003）。こうして構築されたIVVライブラリーの中からベイト（タンパク質、ペプチド、抗原など）と結合するタンパク質を含むIVVをin vitroで釣り上げた後、そこに連結している遺伝子（mRNA）を逆転写・PCRで増幅し、DNAシーケンサーで塩基配列を解読することによって、相互作用するタンパク質やペプチドや抗体を容易に同定することができる。ベイトに結合したIVVを溶出・回収する方法は、フリーのベイトで競合溶出する方法が一般的であるが、競合溶出できない場合は、光開裂が可能な2-nitrobenzylリンカーを導入したPEGスペーサーを用い、365nmのUVを照射してスペーサーを切断することでmRNA部を溶出・回収できる(Doi,N. et al., J.Biotechnol.,131:231-239,2007)。
（1-2）DNAライブラリーの合成
　緑色蛍光タンパク質GFP配列を有するDNA溶液 1μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：GSP6-GFP-F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：GFP-R (10 pmol/μl) 3μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加して全体量を100μlとし、これを1チューブに入れ、合計300μl（チューブ3本）をPCR反応した。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を16サイクル行った後、68℃5分間反応を行った。DNAはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し、50μlのGSP6-GFP-DNA溶液として回収した。
　Atail配列を有するDNA溶液 1μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：Flag-His-F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：Atail (R) (10 pmol/μl) 3μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加して全体量を100μlとし、これを1チューブに入れ、合計300μl（チューブ3本）をPCR反応した。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を16サイクル行った後、68℃5分間反応を行った。DNAはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し50μlのFlag-His Atail-DNA溶液として回収した。
　Flag-His Atail-DNA溶液 1μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：16NNS-Fあるいは9NNS-F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：Atail (R) (10 pmol/μl) 3μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加して全体量を100μlとし、これを1チューブに入れ、合計300μl（チューブ3本）をPCR反応した。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を12サイクル行った後、68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し50μlの16NNS Atail-DNA溶液あるいは9NNS Atail-DNA溶液として回収した。
　GSP6-GFP-DNA溶液1μl、16NNS Atail-DNA溶液あるいは9NNS Atail-DNA溶液 1μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：GSP6-GFP-F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：Atail (R) (10 pmol/μl) 3μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加して全体量を100μlとし、これを1チューブに入れ、合計300μl（チューブ3本）をオーバーラップPCR反応した。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を12サイクル行った後68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し50μlのcDNAライブラリー16NNSLibならびに9NNSLibとして回収した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
[実施例2]: IVVライブラリーの調製
（2-1）ライブラリーの転写
　cDNAライブラリー16NNSLib ならびに9NNSLib をそれぞれ2pmol、5×SP6緩衝液 8μl、ATP (100mM) 2μl、CTP (100mM) 2μl、UTP (100mM) 2μl、GTP (10mM) 4μl、キャップアナログ(m7G(5')PPP(5')G) (Thermo Fisher Scientific) (40mM) 5μl、エンザイムミックスSP6RNA ポリメラーゼ（Promega） 4μl、RNase-Free水を添加し全体量を 40μlとし、37℃、3時間反応後、RQ1 RNase-Free DNase（Promega）10μlを添加し、さらに37℃、1時間反応させた。
　RNAはRNeasy Mini kit (Qiagen)により精製した。すなわち転写反応液に、RNase-Free水を添加し全体量を100μlとし、RLT緩衝液(Qiagen) 350μl、2-メルカプトエタノール 3.5μl、(100%) エタノール 250μl、を加えRNeasy ミニスピンカラムに供し、25℃、12000 rpm、15秒間遠心後排出された溶液を除去し、RPE緩衝液(Qiagen)500μlを同カラムに加え、25℃、12000 rpm、15秒間遠心後排出された溶液を除去し、さらにRPE緩衝液(Qiagen)500μlを同カラムに加え、25℃、12000 rpm、2分間遠心後排出された溶液を除去し、同カラムを新しいチューブに差し替え、25℃、12000 rpm、1分間遠心分離し、再び同カラムを新しいチューブに差し替え同カラムに、RNase-Free水を33μl添加し、10分間室温で放置後25℃、13200 rpm、1分間遠心しRNA溶液として回収した。
（2-2）PEGスペーサーとのライゲーション
　RNA溶液 32μl、T4 ligation 10×緩衝液 5μl、0.1 M DTT 1μl、40 mM ATP 0.5μl、100% DMSO 5μl、0.1% BSA 1μl、RNase inhibitor(TOYOBO) 1μl、ピューロマイシン付きポリエチレングリコール光切断リンカー分子 (10 nmol) 0.5μl、ポリエチレングリコール（PEG） 2000 （日本油脂）(30 nmol) 1μl、T4 RNA リガーゼ (Takara)(40 U/μl) 3μlを混合し、遮光条件下15℃、15時間反応させた。得られたスペーサー分子が結合したPEG-RNAはRNeasy Mini kit (Qiagen)により精製した。
（2-3）IVVライブラリーの調製
　PEG-RNA 10 pmol、小麦胚芽抽出液（ZoeGene）20 μl、クレアチンキナーゼ (40 μg/μl)（ZoeGene） 2μl、RNase inhibitor(TOYOBO) 3.2 μl、及び5×翻訳緩衝液(ZoeGene) 20μlにRNase-Free水を添加し全体量を100μlとし、遮光条件下26℃、1時間反応させ翻訳を行い、IVVライブラリーを調製した。
[実施例3]: ビオチン化DENND2Aの調製
　ウイルスは、細胞に侵入する経路としてアクチン細胞骨格や細胞内において物質輸送の系をハイジャックすることが知られている。その重要な分子であるRhoGTPaseやRabを標的とする薬物の開発が行われている。DENND2AはRAB9AおよびRAB9Bの活性型と不活性型にかかわる特異的なGuanine nucleotide exchange factor(GEF)として働く分子である。また後期エンドソームでトランスゴルジネットワークにおいて役割を果たしている可能性がある。この分子を標的とする抗ウイルス剤開発の報告はない。DENND2Aには図2に示すように2つのisoform、1009 aaのisoform 1（配列番号35）と795 aaのisoform 2（配列番号37）がある。isoform 1のaa1-775とisoform 2のaa1-775は同一配列である。ベイトの作成にはisoform 2 (795 aa)を用いた。N末端にHisタグを付けて発現させている報告(S. Yoshimura, et al., J Cell Biology 191, 367-381, 2010)を参考に、図3に示すようにタグはN末端に配置した。His-tag、ビオチン化配列、Flag-tagをペプチドのN-末領域に構築した。
（3-1）ビオチン化DENND2Aの発現ベクター構築
　図３に示したように、DENND2A遺伝子にHis-tag配列、ビオチン化配列、Flag-tagを付加したHisBioFLAG-DENND2A pcDNA3.3ベクターを作成した。
　BioEaseTM plasmidよりF-Bioプライマー、R-Bioプライマーを用いてPCRにて調製したKlebsiella pneumoniaeのオキサロ酢酸脱炭酸酵素αサブユニットの遺伝子（72アミノ酸）を含むBio-tag（Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 8, page e64）に、His-tagとFlag-tagとを付加させた。Bio-tag 2μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 40μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 40μl、25mM MgSO4 16μl、KstartHisBio-F (10 pmol/μl) 12μl、BioFLAGstop-INV-R (10 pmol/μl) 12μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 8μlにRNase-Free水を添加して全体量を200μlとし、PCR反応させた。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を20あるいは25サイクル行った後68℃5分間反応を行った。PCR産物はアガロースゲル電気泳動でDNAのバンドを確認後、Wizard SV Gel PCR Clean-Up System(Promega)で精製し50μlのDNA溶液として回収しHis-Bio-Flagを得た。
　His-Bio-FlagのpcDNA 3.3ベクターへの導入はTOPO クローニングキット（Invitorogen）で手順に従って行った。得られたクローンが正しい配列であることを確認し、コロニーを植菌し37℃、16時間培養した。菌体ペレットからPureYieldTM Plasmid Maxiprep System (Promega)でプラスミドpcDNA3.3 TOPO His-Bio-Flagを精製した。
　DENND2Aベクター pF1KE2590 (Kazusa DNA Res.Inst.) (1 ng/μl) 0.5μl、KAPA HiFi HS RM 12.5μl、10μM DENND2A-ifFLAG-F　0.75μl、及び10μM DENND2Ai2-ifpc-R　0.75μlにRNase-Free水を添加して全体量を25μlとし、PCR反応を行った。PCRは、95℃5分間反応後、98℃20秒間、60℃15秒間、72℃1分間を25サイクル行った後72℃1分間反応を行った。PCR産物はアガロースゲル電気泳動でDNAのバンドを確認後、Wizard SV Gel PCR Clean-Up System(Promega)で精製し30μlのDNA溶液として回収しF-DENND2A-INを得た。
　pcDNA3.3 TOPO His-Bio-Flag 0.5μl、KAPA HiFi HS RM　10μl、10μM Stoptopo-INV-F　0.6μl、10μM FLAG-R 0.6μlにRNase-Free水を添加して全体量を20μlとし、PCR反応させた。PCRは、95℃3分間反応後、98℃20秒間、60℃15秒間、72℃3分間を25サイクル行った後、72℃1分間反応を行った。PCR産物はアガロースゲル電気泳動で確認後、Wizard SV Gel PCR Clean-Up System(Promega)で精製し30μlのDNA溶液として回収しTOPO HisBioFlagINVを得た。
　F-DENND2A-IN 1.0μl、TOPO HisBioFlagINV 1.0μl、5x in fusion HD Enzyme premix 1.0μl (Takara) にRNase-Free水を添加して全体量を5μlとし、50℃、15分間反応させた。2.5μlをOne Shot TOP10 competent cellにトランスフォーメーションし37℃１晩培養し、クローンを得た。クローンの配列解析の結果、プラスミドHisBioFLAG-DENND2A-pcDNA3.3であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（3-2）ビオチン化全長DENND2Aの発現と精製
　ヒト胎児腎細胞293T細胞は10%FCS(ニチレイ)、DMEM(1.0g/l Glucose) with L-Gln and Sodium Pyruvate, liquid (ナカライ)培地で培養した。トランスフェクションの24時間前に6cmシャーレに(1:2)の割合でプレーティングした。1枚のシャーレに対しプラスミドHisBioFLAG-DENND2A-pcDNA3.3をOpti-MEM I 500μlに入れたものに、Lipofectamine 2000 20μlをOpti-MEM I 500μlに入れ室温で5分間置いたものを穏やかに加えた。混和物は室温で20分間放置後293T細胞のシャーレに加え37℃、5% CO2条件下１日培養した。
　シャーレの培地を除去後、冷PBS 2mlで細胞を洗った。Cell lysis buffer (Tris-HCl pH 7.4　25 mM、NaCl　137 mM、KCl　2.68 mM、Triton X-100　1%) 800μl、プロテアーゼ阻害剤、動物細胞抽出物用(Cat#25955-11) x50（フッ化4-(2-アミノエチル)、ベンゼンスルホニル塩酸塩(AEBSF)、アプロチニン、E-64、ロイペプチンヘミ硫酸塩一水和物、ベスタチン、ペプスタチン A）を16μl、0.1M PMSF 8μlを細胞に加え15分間氷上で放置した。セルスクレーパーで細胞を剥がしチューブに集め21Gの注射針でホモジネート後60分間氷上で放置した。12,300 rpm、30分間 4℃で遠心分離し、上清を新しいチューブに移し細胞画分とした。全部で6cmシャーレ3枚をトランスフェクションし細胞画分を得た。これらを使って固定用のビオチン化DENND2Aを精製した。Anti-FLAG M2 Agarose Beads (50%スラリー)をTBS buffer (ナカライ) 5.0 mlで3回洗浄したものに上記の細胞画分を加え、4℃で2時間ミニディスクローター（Bio craft）で回転攪拌した。ビーズをTBST(0.1% tween-20) 1.0 mlで3回洗浄した。150 μg/mL 3x FLAG peptideを含むTBS 50μlを加え4℃で１時間ミニディスクローターで回転攪拌した後上清を集めた。同様の操作を３回繰り返した。溶出画分15μlにサンプル緩衝液LDS(4x)、0.2mM DTT 6.8μlを加え70℃、10分間加熱後SDS-PAGEに供した。SDS-PAGEは4-12% Bis-Tris NuPAGE ゲル、MES電気泳動緩衝液 (Invitrogen)で200V, 400mA, 35分間電気泳動後、Mini Format, 0.2μm PVDF, Single application (BIORAD) Trans-Blot Turboで転写した。膜はBlocking One Buffer：TBST（1：9）でブロッキングし、Blocking One Buffer：TBST(1：9)で2:3000に希釈したanti-Flag-HRP (Sigma: A8592)を反応させた。検出はECL(Enhanced ChemiLuminescence)を用い、ChemiDoc(BIORAD)で行った。ビオチン化DENND2Aは分子量98,715 Daのバンドとして確認することができた。
[実施例4]: DENND2Aと結合するペプチドの選択
　DENND2Aと結合するペプチドの選択実験を図４に示すような手順で行った。
（4-1）DENND2Aの固定化
　ビアコアはビアコア3000システムを用い、センサーチップSAにビオチン化DENND2Aの固定化を行った。フローは緩衝液HBS-P(10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% Tween-20) で10μl/minで行った。フローセル１～4への50mM NaOH, 1M NaClを含む溶液10μlのインジェクトを3回繰り返し行い、固定化の前処理を行った。ビオチン化DENND2A（1nM）を用いて、フローセル１～４に固定化した。フローは緩衝液HBS-P、20μl/minで行った。18μlをマニュアルインジェクションしたところフローセル１～４に698.3 RU（平均）結合した。センサーチップを洗浄する目的で緩衝液HBS-Pで10μl/min, 50% Isopropanol, 50mM NaOH, 1M NaClを用いてextra washを行った。
（4-2）DENND2Aと結合するペプチドの選択
　調製したIVVライブラリー100 μlにfinal 20mMとなるように0.5M EDTA 4μlを加え、20分間室温で回転攪拌した。HBS-Pで膨潤ならびに平衡化させたSephadex G200 (Amersham Biosciences)ゲル1 mlをカラム（バイオラッド）に充填したものにIVVライブラリー溶液100μlを供し、2滴ずつ96穴プレートに集め１wellから10wellまでを回収した。Multi-detection Microplate Reader POWERSCAN HTで励起波長485nm、蛍光波長528nmで蛍光を検出し、3well目から7well目あたりに溶出したIVV画分を集めた。Strep Magne Sphae Paramagnetic Part (9013-20-1) 100μlをHBS-P 500μlで3回洗浄したものにIVV画分約200μlを加え、20分間室温で回転攪拌し、その上清をビアコアにインジェクトした。ビアコアでのセレクションは緩衝液HBS-Pで40μl/minで行い、160秒結合、10483秒解離させた。その後、センサーチップを機械より抜き取った。センサーチップの金膜の上にRNase-Free水55μlを静かに加え、20分間、365nmのUVを照射してスペーサーを切断してmRNA部を溶出・回収した。
（4-3）RT-PCRによるcDNAライブラリーの回収
　選択実験で回収した溶液55μl、5×RT緩衝液(TOYOBO) 20μl、(10 mM) dNTPs(TOYOBO) 10μl、及びreverseプライマー：Atail (R) (10pmol/μl) 5μlにRNase-Free水を添加し全体量を90μlとして混和させ、65℃で9分間反応後直ちに氷上に冷却し、2分間放置した後、ReverTra Ace(TOYOBO) 5μl及びRNase inhibitor(TOYOBO) 5μlを加え、50℃30分間、99℃、5分間逆転写反応させた。逆転写反応させた反応溶液100μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 100μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 100μl、25mM MgSO4 40μl、forwardプライマー：GSP6-GFP-F (10 pmol/μl) 30μl、reverseプライマー：Atail (R) (10 pmol/μl) 30μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 20μlにRNase-Free水を添加して全体量を1000μlとしチューブ１本につき100μl入れ合計１０本をPCR反応させた。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を20から40サイクル行った後、68℃で5分間反応を行った。
　ビアコアを使って選択実験の選択圧は表3に示すように段階的にラウンドごとに選択圧を順次上げた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
[実施例5]: クローニングと塩基配列の決定
（5-1）クローニングと塩基配列
　DENND2Aと結合するペプチドライブラリーから in-fusionクローニング
　4ラウンドの選択実験を行ったライブラリー　1μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 100μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 100μl、25mM MgSO4 40μl、GFP-F in (10 pmol/μl) 30μl、His-S28-R in (10 pmol/μl) 30μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 20μlにRNase-Free水を添加して全体量を1000μlとし、PCR反応させた。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を8サイクル行った後、68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し、50μlのDNA溶液として回収しライブラリーのinsert (GFP-DENP4 in)を得た。
　kozak-GFP配列とFlagHisS28配列とstopコドンを含む pcDNA 3.3ベクター8μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 80μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 80μl、25mM MgSO4 32μl、S28-F iv (10 pmol/μl) 24μl、3.3K-GFP-Riv (10 pmol/μl) 24μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 16μlにRNase-Free水を添加して全体量を800μlとし、PCR反応させた。PCRは、94℃2分間反応後、98℃10秒間、68℃5分11秒間を25サイクル行った。cDNAライブラリーはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し、40μlのDNA溶液として回収しKGFP-S28 3.3 vectorを得た。
　GFP-DENP4 in 0.08μl、KGFP-S28 3.3 vector 0.14μl、5x in fusion HD Enzyme premix 1.0μl (Takara) を混ぜ、RNase-Free水を添加し全体量を5μlとし50℃、15分間反応させた。反応後の溶液2.5μlをOne Shot TOP10 competent cellにトランスフォーメーションし37℃１晩培養し、KGFP-DENP4クローンを得た。得られたクローンの配列解析はユーロフィンDNAシーケンス受託サービス、ValueReadプレミックスにより行った。
　GFP配列の上流に核移行シグナル配列遺伝子CCTGCTGCCAAGAGGGTCAAGTTGGAC（配列番号32）を導入し、stopコドンを含む pcDNA 3.3ベクター8μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 80μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 80μl、25mM MgSO4 32μl、S28iv-25F (10 pmol/μl) 24μl、GFPiv-71R (10 pmol/μl) 24μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 16μlにRNase-Free水を添加して全体量を800μlとし、PCR反応させた。PCRは、94℃2分間反応後、98℃10秒間、68℃5分11秒間を25サイクル行った。cDNAライブラリーはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し、40μlのDNA溶液として回収しNLS-GFP-S28 3.3 vectorを得た。
　KGFP-DENP4クローンDNA　1μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 100μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 100μl、25mM MgSO4 40μl、GFPin-92F (10 pmol/μl) 30μl、S28in-7R (10 pmol/μl) 30μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 20μlにRNase-Free水を添加して全体量を1000μlとし、PCR反応させた。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を8サイクル行った後、68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し、50μlのDNA溶液として回収しNLS-GFP-DENP4 inを得た。
　NLS-GFP-DENP4 in 0.08μl、NLS-GFP-S28 3.3 vector 0.14μl、5x in fusion HD Enzyme premix 1.0μl (Takara) を混ぜ、RNase-Free水を添加し全体量を5μlとし50℃、15分間反応させた。反応後の溶液2.5μlをOne Shot TOP10 competent cellにトランスフォーメーションし37℃１晩培養し、NLS-GFP-DCS8クローンを得た。得られたクローンの配列解析はユーロフィンDNAシーケンス受託サービス、ValueReadプレミックスにより行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（5-2）ライブラリーの配列解析
　ライブラリーの配列解析の結果、表５に示すように4ラウンドからDENND2A結合ペプチドのクローン（DENP4-3、DENP4-42）が得られた。DENP4-3Sは、下記実施例7でDENP4-3のホモロジー検索結果に基づいて調製したDENND2A結合ペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
[実施例6]: クローンの活性評価
（6-1）蛋白質の調製
　インフレームのクローンはカルベニシリン20μg/mlを含むLB培地にマスタープレートよりコロニーを植菌し37℃、16時間培養した。菌体ペレットからPureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit (インビトロジェン)でプラスミドを精製した。
（6-2）蛋白質の調製
　ヒト胎児腎細胞293T細胞は10%FCS(ニチレイ)、DMEM(1.0g/l Glucose) with L-Gln and Sodium Pyruvate, liquid (ナカライ)培地で培養した。トランスフェクションの24時間前に6cm シャーレに(1:2)の割合でプレーティングした。6cm シャーレに対しプラスミドDNA 8μgをOpti-MEM I 500μlに入れたものに、Lipofectamine 2000 20μlあるいはPEI-MAX 20μlをOpti-MEM I 500μlに入れ室温で5分間置いたものを穏やかに加えた。混和物は室温で20分間放置後293T細胞の6cm シャーレに加え37℃、5% CO2条件下4日～６日培養した。
（6-3）プルダウン実験
　レジン(Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles)(Promega) の洗浄はMagneSphere Technology Magnetic Separation Stand (tweleve-position)を使って行った。レジン40μlを1.5 mlチューブに取り、溶液を除去した後PBS 1 mlで3回洗浄を行った。新しいチューブにレジンを移し、ビオチン化DENND2A あるいはベイトなしは等量のPBSを加え、ミニディスクローター（Bio craft）で回転攪拌し4℃で1時間結合させた。溶液を除去後TBST (Tween20 0.05%) 1 mlで3回洗浄を行った。新しいチューブにレジンを移し、ELISA BSA緩衝液(ナカライテスク株式会社　TBS, 0.05%, Tween 20, 1% BSA) 1 mlで4℃1時間ブロッキングを行い、ELISA BSA緩衝液1 mlで3回洗浄を行った。新しいチューブにレジンを移し、DENP4から得られたクローンを発現させた培養上清を1000μlずつ、ビオチン化DENND2Aあるいはベイトなしで処理したレジン40μlに混和させ、ミニディスクローター（Bio craft）で回転攪拌し、4℃で1時間30分結合させた。溶液を除去後TBST (Tween20 0.1%) 500μlで3回洗浄を行い、回収レジンをウエスタンブロットした。
　各レジンに水とサンプル緩衝液LDS(4x)、0.2mM DTTを加え、70℃、10分間加熱後SDS-PAGEに供した。SDS-PAGEは4-12% Bis-Tris Gel、NuPAGE MES SDS電気泳動緩衝液 (Invitrogen)で200V, 400mA, 35分間電気泳動後、Mini Format, 0.2μm PVDF, Single application (BIORAD) Trans-Blot Turboで転写した。膜はBlocking One Buffer：TBST（1：9）でブロッキングし、Blocking One Buffer：TBST(1：9)で2:3000に希釈したanti-Flag-HRP (Sigma: A8592)を反応させた。検出はECL(Enhanced ChemiLuminescence)を用い、ChemiDoc(BIORAD)で行った。
　DENND2A結合ペプチドによるDENND2Aに対するプルダウンアッセイ（図５）を行った。４ラウンドの選択実験を行なったクローンの内８個を評価した結果、DENP4-3（配列番号1）、DENP4-42（配列番号２）がポジティブだった。15個の同一配列のクローンが取れたDENP4-3は非常に濃縮されていた。
　培養細胞のDENN2Aの発現について図6に示した。HepG2-NTCP-C4、Huh7、Huh7-LIPG細胞におけるDENND2AのmRNA並びに発現タンパク質を調べた。その結果DENND2Aの発現が良好なHuh7-LIPGを使用した。
[実施例7]: スクリーニングしたDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性
（7-1）Huh7-LIPG細胞におけるDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性
　DENND2Aに対するプルダウン実験でポジティブだったクローンについて、Huh7-LIPG細胞におけるDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性を評価した（図7）。ペプチドを含むプラスミドには細胞内に発現するものDENP4-3（配列番号1）とDENP4-42（配列番号２）を調製した。プルダウン実験でポジティブだった２つのクローンはコントロールと比較してcccDNAを有意に減少させた。
　それぞれのクローンについてBLASTPにおいてホモロジー検索を行った結果、DENP4-3はSASH1(SAM And SH3 Domain Containing 1、Gene ID: 23328、GenBank NM_015278.5のコード領域の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号42, 43に示す)と高いホモロジーを示したことから、DENP4-3と相同配列を有するDENP4-3S（DENP4-3と高いホモロジーを示したSASH1の部分領域からなるペプチド、配列番号3）を調製した（図8）。また核移行シグナルを付加したそれぞれのクローンも調製した。図9に示すように１２日間HBVをHuh7-NTCP-YFP細胞に感染させて評価したところ、DENP4-3（配列番号1）、DENP4-42（配列番号２）、DENP4-3S（配列番号3）のいずれもHBV DNAのコピー数とcccDNAのコピー数についても減少させた。また核移行シグナルを付加した方が強い抗HBV活性を示した。
　血中のタンパク質の多くはシアル酸が付加された糖タンパク質であるが、劣化してくるとアシアロ糖タンパク質となり、主として肝臓で分解される。そのために肝臓には，血中のアシアロ糖タンパク質を特異的に認識し、取り込むためのアシアロ糖タンパク質受容体が存在する。抗アシアロ糖タンパク質受容体抗体も同様に受容体に結合した後肝臓細胞内に取り込まれると考えられる。これを利用した抗アシアロ糖タンパク質受容体抗体を用いたDENND2A結合ペプチドの肝細胞選択的送達法を確立するためにアシアロ糖タンパク質受容体に結合する一本鎖抗体の選択実験をIVV法を用いて行なった。
[実施例8]: ビオチン化ASGRの調製
　初めに抗原となるビオチン化アシアロ糖タンパク質受容体を作成した。図10に示すようにアシアロ糖タンパク質受容体（ASGR）はN末端を細胞内、糖認識部位（CRDs）を細胞外に向けたII型の１回膜貫通タンパク質である。これをビアコアのセンサーチップ上に提示するために膜貫通ドメインを除き、ビオチン化配列等を付加したコンストラクトを作成した。ヒトの肝細胞には受容体ASGR1（配列番号39）とASGR2（配列番号41）が存在し、ヘテロオリゴマーを形成していることから、それぞれの細胞外ドメインにビオチンを付加した、ビオチン化ASGR1exとビオチン化ASGR2exを作成した。
（8-1）ビオチンASGRの発現ベクター構築
　ASGRの細胞外ドメインにHis-tag、ビオチン化配列、Flag-tag、配列を付加したpcDNA3.3 TOPO HisBioFLAG-ASGR1exベクターとpcDNA3.3 TOPO HisBioFLAG-ASGR2exベクターを作成した。
　図11に示すようにASGR1とASGR2のそれぞれの細胞外ドメインをクローニングした。
　cDNA Library, Human Liver (1 ng/μl) (タカラハ゛イオ) 1μl、KAPA HiFi HS RM 10μl、10μM ASGR1-ex-if-F1 0.6μlあるいはASGR2-ex-if-F1 0.6μl、及び10μM ASGR1-if-R2 0.6μlあるいはASGR2-if-R2 0.6μlにRNase-Free水を添加して全体量を20μlとし、PCR反応を行った。PCRは、95℃5分間反応後、98℃20秒間、60℃15秒間、72℃1分間を25サイクル行った後72℃1分間反応を行った。PCR産物はアガロースゲル電気泳動でDNAのバンドを確認後、Wizard SV Gel PCR Clean-Up System(Promega)で精製し30μlのDNA溶液として回収しASGR1-ifあるいはASGR2-ifを得た。
　図12に示すようなコンストラクトの発現プラスミドを作成するために、kozak配列-Hisタグ配列-ビオチン化配列-Flagタグ配列を含むベクターpcDNA3.3 TOPO KHisBioFlagを使ってASGR1-ifあるいはASGR2-ifをインフュージョンクローニングした。pcDNA3.3 TOPO KHisBioFlagINV 1.0μl、ASGR1-if 1.0μlあるいはASGR2-if 1.0μl、5x in fusion HD Enzyme premix 1.0μl (Takara) にRNase-Free水を添加して全体量を5μlとし、50℃、15分間反応させた。2.5μlをOne Shot TOP10 competent cellにトランスフォーメーションし37℃１晩培養し、クローンを得た。クローンの配列解析の結果、プラスミドpcDNA3.3 TOPO KHisBioFlag-ASGR1exあるいはpcDNA3.3 TOPO KHisBioFlag-ASGR2exであることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（8-2）ビオチン化細胞外ドメインASGR1exあるいはビオチン化細胞外ドメインASGR2exの発現と精製
　ヒト胎児腎細胞293T細胞を用いてプラスミドpcDNA3.3 TOPO KHisBioFlag-ASGR1exあるいはpcDNA3.3 TOPO KHisBioFlag-ASGR2exをトランスフェクションした。37℃ 5% CO2 48時間培養後得られた細胞をCell lysis buffer (Tris-HCl pH 7.4　25 mM、NaCl　137 mM、KCl　2.68 mM、Triton X-100　1%)で抽出した。得られた細胞抽出液に、TBSで洗浄したM2アガロースビーズ(ANTI-FLAG(登録商標) M2 Affinity Gel, Sigma, A2220)を加え、4℃ 16時間混合した。TBST(10x TBS-t 1%Tween-20, ナカライ, 12749-21)で3回洗浄した後、TBSで希釈した150μg/mL 3x FLAG peptide(Sigma, F4799)で競合溶出した。
　SAビーズ(Streptavidin MagneSphere(登録商標) Paramagnetic Particles, Promega)20μLをTBST(10x TBS-T 1%Tween-20, ナカライ) 200μLで3回洗浄し、FLAG精製済みタンパク質を加えた。1時間室温で回転させて混合した後TBST 200μLで3回洗浄した。ビーズをTBS 10μLに懸濁させて70℃ 10 min処理し、SDS-PAGEとFlag抗体を用いてウエスタンブロットで検出したところ、KHisBioFlag-ASGR1exは分子量35,597Da、KHisBioFlag-ASGR2exは分子量35,708Daのバンドとして確認することができた。
　同様の方法で得たHisBioFLAG-ASGR1exの細胞抽出液をSAビーズに結合し、洗浄した後EKMax buffer (500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM CaCl2, 1% Tween-20)に交換した。EKMaxTM Enterokinase（Thermo Fisher Scientific）を加え37℃ O/N (16.5h) 回転させEKMax digestionを行ない、マグネットスタンドでSAビーズを吸着させて上清回収した。回収した上清に前処理したEK Away resin を加え、r.t. 15min 回転させEKMaxを除去した。遠心して上清を回収 (5000rcf 2min x2)しSDS-PAGEとFlag抗体を用いてウエスタンブロットで検出したところASGR1ex　分子量26394Daのバンドとして確認することができた。
[実施例9]: 一本鎖抗体cDNAライブラリーの作成
（9-1）DNAライブラリーデザイン
　抗体の抗原認識はH鎖、L鎖のN末端側のドメインが担っており、可変領域 (Variable region) と呼ばれる。一方、その他のドメインはクラスごとに一定で、定常領域 (Constant region) と呼ばれる (図13左)。VH鎖、VL鎖はともに3つのCDR (Complementarity-determing regions) と4つのFR (Framework regions) から構成されている (図13右)。CDRは抗体ごとに多様なアミノ酸配列からなり、様々な抗原との結合を可能にしている。人工的な抗体断片としては、VH鎖とVL鎖をペプチドリンカーで連結させた一本鎖抗体 (Single-chain antibody:scFv) がある (図14)。VH鎖、VL鎖を15アミノ酸からなるペプチドリンカーがドメイン間の会合を妨げないよう、二次構造が強制されない配列としてグリシンと親水性のセリンを含むGGGGSユニットを3回繰り返したリンカー（配列番号33）が多く利用されている。
[実施例10]: マウス由来一本鎖抗体cDNAライブラリーの作成
　マウス由来一本鎖抗体cDNAライブラリーの作成は図15示すようにマウス脾臓Poly A+ RNAを出発原料に行った。H鎖DNA溶液の調製、L鎖DNA溶液の調製、H鎖とL鎖の一本化PCRを行なった。(Tabata,N., et al.,Nucleic Acids Res.,37,e64,2009)。
（10-1）H鎖DNA溶液の調製
　一本鎖抗体cDNAライブラリーの作成は、始めにH鎖DNA溶液の調製を行った。マウス脾臓Poly A+ RNA (5 μg/μl)（DEPC-処理水）(CLONTECH社)をRNase-Free水で100倍に希釈したものを 11μl、5×RT緩衝液(TOYOBO) 22μl、(10 mM) dNTPs(TOYOBO) 11μl、forwardプライマー MulgG1/2 (1pmol/μl) 27.5μl、forwardプライマー MulgG3 (1pmol/μl) 27.5μl、を混和させ65℃ 9分間反応後直ちに4℃に冷却し4℃ 2分間放置した後、ReverTra Ace(TOYOBO) 5.5μl、RNase inhibitor(TOYOBO) 5.5μlを加え50℃ 30分間、99℃、5分間反応させcDNA-Hを合成した。cDNA-H溶液 5μlに、HBプライマーに示した各HBプライマー (1pmol/μl) 各2.5μl、10×PCR緩衝液(TOYOBO) 2.5μl、forwardプライマー MulgG1/2 (1pmol/μl) 1.25μl、forwardプライマー MulgG3 (1pmol/μl) 1.25μl、KOD DASH ポリメラーゼ(TOYOBO) 0.25μl、とRNase-Free水を添加し全体量を 25μl、としてそれぞれPCR反応させた。PCRは96℃、5分間反応後96℃、30秒間、50℃ 30秒間、72℃ 1分間を25サイクル行った後72℃ 5分間反応を行った。増幅した遺伝子は2%アガロースゲル電気泳動によりそれぞれ500-900bpのバンドを確認し、フェノール/クロロホルム処理を行った。すなわち同量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール（25:24:1）を加えよく混和し4℃で13,200rpm、5分間遠心し、水層部のみを新しいチューブに移しもう一度同量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール（25:24:1）を加えよく混和し4℃で13,200rpm、5分間遠心し、水層部のみを新しいチューブに移した。得られた溶液についてエタノール沈殿を行った。約15分間遠心乾燥した後、各DNA(19種)をRNase-free水20μlに溶解した。合成した各DNA溶液(19種) 各1μlに、HBプライマーに示した対応する各HBプライマー (10pmol/μl) 各2μl、10×PCR緩衝液(TOYOBO) 10μl、(2 mM) dNTPs(TOYOBO) 10μl、HFプライマーに示したVH forwardプライマー HF1:HF2:HF3:HF4(1:1:1:1)混合液 (10pmol/μl) 2μl、KOD DASH ポリメラーゼ(TOYOBO) 0.5μl、とRNase-Free水を添加し全体量を 100μl、としてそれぞれPCR反応させた。PCRは96℃、5分間反応後96℃、30秒間、50℃ 30秒間、72℃ 1分間を20サイクル行った後72℃ 5分間反応を行った。増幅した遺伝子は2%アガロースゲル電気泳動によりそれぞれ500-900bpのバンドを確認し、フェノール/クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行った。その後、約15分間遠心乾燥した後、各DNA(19種)をRNase-free水10μlに溶解した。得られた19種のDNAを2%低融点アガロースゲル(Sigma)電気泳動しそれぞれのバンドを切り出した。各DNA(19種)はRNase-free水10μlに溶解した。各DNA溶液について260nmの吸収を測定しHB1:HB2:HB3:HB4:HB5:HB6:HB7:HB8:HB9:HB10:HB11:HB12:HB13:HB14:HB15:HB16:HB17:HB18:HB19(8:9:4:4:12:4:1:4:12:4:4:2:2:4:4:8:6:1:1)の比率で混和させ合計0.5pmolのH鎖DNA溶液とした。
（10-2）L鎖DNA溶液の調製
　マウス脾臓Poly A+ RNA (5 μg/μl)（DEPC-処理水）(CLONTECH社)をRNase-Free水で100倍に希釈したものを 10μl、5×RT緩衝液(TOYOBO) 20μl、(10 mM) dNTPs(TOYOBO) 10μl、forwardプライマー MuCK (1pmol/μl) 50μl、を混和させ65℃ 9分間反応後直ちに4℃に冷却し4℃ 2分間放置した後、ReverTra Ace(TOYOBO) 5μl、RNase inhibitor(TOYOBO) 5μl、を加え50℃ 30分間、99℃、5分間反応させcDNA-Lを合成した。cDNA-L溶液 5μlに、LBプライマーに示した各LBプライマー (1pmol/μl) 各2.5μl、10×PCR緩衝液(TOYOBO) 2.5μl、forwardプライマー MuCK (1pmol/μl) 2.5μl、KOD DASH ポリメラーゼ(TOYOBO) 0.25μl、とRNase-Free水を添加し全体量を 25μlとしてそれぞれPCR反応させた。PCRは96℃、5分間反応後96℃、30秒間、48℃ 30秒間、72℃ 1分間を25サイクル行った後72℃ 5分間反応を行った。増幅した遺伝子は2%アガロースゲル電気泳動によりそれぞれ500-900bpのバンドを確認し、フェノール/クロロホルム処理を行った。得られた溶液についてエタノール沈殿を行った。その後、約15分間遠心乾燥した後、各DNA(18種)をRNase-free水20μlに溶解した。合成した各DNA溶液(18種) 各1μlに、LBプライマーに示した対応する各LBプライマー (10pmol/μl) 各2μl、10×PCR緩衝液(TOYOBO) 10μl、(2 mM) dNTPs(TOYOBO) 10μl、LFプライマーに示したLH forwardプライマー LF1:LF2:LF3:LF4:LFλ(1:1:1:1)混合液 (10pmol/μl) 2μl、KOD DASH ポリメラーゼ(TOYOBO) 0.5μl、とRNase-Free水を添加し全体量を 100μl、としてそれぞれPCR反応させた。PCRは96℃、5分間反応後96℃、30秒間、48℃ 30秒間、72℃ 1分間を20サイクル行った後72℃5分間反応を行った。増幅した遺伝子は2%アガロースゲル電気泳動によりそれぞれ500-900bpのバンドを確認し、フェノール/クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行った。その後、約15分間遠心乾燥した後、各DNA(18種)をRNase-free水10μlに溶解した。得られた18種のDNAを2%低融点アガロースゲル(Sigma)電気泳動しそれぞれのバンドを切り出した。各DNA(18種)はRNase-free水10μlに溶解した。各DNA溶液について260nmの吸収を測定しLB1:LB2:LB3:LB4:LB5:LB6:LB7:LB8:LB9:LB10:LB11:LB12:LB13:LB14:LB15:LB16:LB17:LBλ(2:4:8:8:8:16:12:4:4:8:16:16:12:4:4:2:2:1)の比率で混和させ合計0.5pmolのL鎖DNA溶液とした。
（10-3）H鎖とL鎖を一本化するためのPCR
　合成したH鎖DNA溶液 0.5pmol、L鎖DNA溶液 0.5pmol、5'UTR (1pmol/μl) 0.5μl、McD-Linker+ (1pmol/μl) 0.5μl、McD 3'UTR (His Tag) (1pmol/μl) 0.5μl、10×PCR緩衝液(TOYOBO) 5μl、(2 mM) dNTPs(TOYOBO) 5μl、KOD DASH ポリメラーゼ(TOYOBO) 0.25μl、とRNase-Free水を添加し全体量を 45.75μl、としてPCR反応させた。PCRは96℃、5分間反応後96℃、30秒間続いて5分間のスロープで58℃とし58℃30秒間、72℃1分間を10サイクル行った後72℃5分間反応を行った。続いて、PCR反応溶液 45.75μl、McD-F (1pmol/μl) 2μl、McD-R (His Tag) (1pmol/μl) 2μl、KOD DASH ポリメラーゼ(TOYOBO) 0.25μl、を加えさらにPCR反応させた。PCRは96℃、5分間反応後96℃、30秒間、58℃30秒間、72℃ 1分間を15サイクル行った後72℃ 5分間反応を行った。得られたDNAを1%低融点アガロースゲル(Sigma)電気泳動しそれぞれのバンドを切り出した。DNAはRNase-free水10μlに溶解し、マウス由来一本鎖抗体ライブラリーDNAを得た。
[実施例11]: ヒト由来一本鎖抗体cDNAライブラリーの作成
　ヒト骨髄由来のリンパ球からの一本鎖抗体cDNAライブラリーの作成は図16に示すようにヒト骨髄由来Poly A+ RNAを出発原料に行った。マウスの場合と同様に複数の特異的プライマーを用いてH鎖DNA溶液の調製、L鎖DNA溶液の調製、H鎖とL鎖の一本化PCRを行うことでIVV選択実験用のヒト一本鎖抗体cDNAライブラリーを作成した。(J.Mol.Biol., 222,581-597,1991; Nat.Biotechnol.,23,344-348,2005; Antibody Engineering, Springer Lab.Manual,93-108,2001)。
　さらに、調製したマウスH鎖DNAならびにマウスL鎖DNAあるいはヒトH鎖DNAならびにヒトL鎖DNAをそれぞれMutazyme IIを使ってError-prone PCRによりランダムな突然変異導入させた。マウス変異H鎖DNA及びマウス変異L鎖DNAを用いてH鎖とL鎖の一本化PCRを行ない、マウス変異一本鎖抗体のcDNAライブラリーを作成した。ヒト変異H鎖DNA及びヒト変異L鎖DNAを用いてH鎖とL鎖の一本化PCRを行ない、ヒト変異一本鎖抗体のcDNAライブラリーを作成した。
[実施例12]: ASGRと結合する一本鎖抗体の選択
　ASGRと結合する一本鎖抗体の選択実験を図17に示すような手順で行った。
（12-1）ASGRの固定化
　ビアコアはビアコア3000システムを用い、センサーチップSAに固定化を行った。フローは緩衝液HBS-P(10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% Tween-20) で10μl/minで行った。フローセル１～4への50mM NaOH, 1M NaClを含む溶液10μlのインジェクトを3回繰り返し行い、固定化の前処理を行った。初めにビオチン化細胞外ドメインASGR1exを用いて、フローセル１～４にベイトを固定化した。フローは緩衝液HBS-P、20μl/minで行った。ベイトの固定量は表7に示した。続いてビオチン化細胞外ドメインASGR2exを用いて、フローセル3～４に固定化した。フローは緩衝液HBS-P、20μl/minで行った。ベイトの固定量は表7に示した。センサーチップを洗浄する目的で緩衝液HBS-Pで10μl/min, 50% Isopropanol, 50mM NaOH, 1M NaClを用いてextra washを行った。
（12-2）ASGRと結合する一本鎖抗体の選択
　調製した一本鎖抗体IVVライブラリー100 μlにfinal 20mMとなるように0.5M EDTA 4μlを加え、20分間室温で回転攪拌した。HBS-Pで膨潤ならびに平衡化させたSephadex G200 (Amersham Biosciences)ゲル1 mlをカラム（バイオラッド）に充填したものにIVVライブラリー溶液100μlを供し、2滴ずつ96穴プレートに集め１wellから10wellまでを回収した。Multi-detection Microplate Reader POWERSCAN HTで励起波長485nm、蛍光波長528nmで蛍光を検出し、3well目から7well目あたりに溶出したIVV画分を集めた。Strep Magne Sphae Paramagnetic Part (9013-20-1) 100μlをHBS-P 500μlで3回洗浄したものにIVV画分約200μlを加え、20分間室温で回転攪拌し、その上清をビアコアにインジェクトした。ビアコアでのセレクション条件は表7に示した。図17に示すように１ラウンドから３ラウンドの選択実験では洗浄工程の終了後、センサーチップを機械より抜き取り、センサーチップの金膜の上にRNase-Free水55μlを静かに加え、20分間、365nmのUVを照射してスペーサーを切断してmRNA部を溶出・回収した。また４ラウンドから５ラウンドの選択実験では洗浄工程の終了後、ASGR1exを用いて競合溶出を行ないIVV画分を回収した。
（12-3）RT-PCRによるcDNAライブラリーの回収
　選択実験で回収した溶液55μl、5×RT緩衝液(TOYOBO) 20μl、(10 mM) dNTPs(TOYOBO) 10μl、及びreverseプライマー：Flag His tag A02 (10pmol/μl) 5μlにRNase-Free水を添加し全体量を90μlとして混和させ、65℃で9分間反応後直ちに氷上に冷却し、2分間放置した後、ReverTra Ace(TOYOBO) 5μl及びRNase inhibitor(TOYOBO) 5μlを加え、50℃30分間、99℃、5分間逆転写反応させた。逆転写反応させた反応溶液100μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 100μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 100μl、25mM MgSO4 40μl、forwardプライマー：SP6 Omega (10 pmol/μl) 30μl、reverseプライマー：Flag His tag A02 (10 pmol/μl) 30μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 20μlにRNase-Free水を添加して全体量を1000μlとしチューブ１本につき100μl入れ合計１０本をPCR反応させた。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を20から40サイクル行った後、68℃で5分間反応を行った。
　ビアコアを使って選択実験の選択圧は表7に示すように段階的にラウンドごとに選択圧を順次上げた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
[実施例13]: クローニングと塩基配列の決定
（13-1）クローニングと塩基配列
　ASGRと結合する一本鎖抗体ライブラリーからin-fusionクローニングのためにライブラリーのinsertの作成を行なった。3ラウンドの選択実験を行ったライブラリー 1μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 100μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 100μl、25mM MgSO4 40μl、T7-long-F in (10 pmol/μl) 30μl、Flag(Histag) in R (10 pmol/μl) 30μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 20μlにRNase-Free水を添加して全体量を1000μlとし、PCR反応させた。PCRは、94℃5分間反応後、94℃30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を8サイクル行った後、68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し、50μlのDNA溶液として回収しT7-ASGR3を得た。
　kozak-Igk-T7tag配列とHis配列とstopコドンを含む pcDNA 3.3ベクター8μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 80μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 80μl、25mM MgSO4 32μl、His-stop-topo F (10 pmol/μl) 24μl、Igk-T7-R (10 pmol/μl) 24μl、及びKOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 16μlにRNase-Free水を添加して全体量を800μlとし、PCR反応させた。PCRは、94℃2分間反応後、98℃10秒間、68℃5分11秒間を25サイクル行った。cDNAライブラリーはWizard SV Gel PCR Clean-Up System（Promega）で精製し、40μlのDNA溶液として回収しKIgk-stop 3.3 vectorを得た。
　T7-ASGR3 0.08μl、KIgk-stop 3.3 vector 0.14μl、5x in fusion HD Enzyme premix 1.0μl (Takara) を混ぜ、RNase-Free水を添加し全体量を5μlとし50℃、15分間反応させた。反応後の溶液2.5μlをOne Shot TOP10 competent cellにトランスフォーメーションし37℃１晩培養し、KIgk-ASGR3クローンを得た。得られたクローンの配列解析はユーロフィンDNAシーケンス受託サービス、ValueReadプレミックスにより行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（13-2）ライブラリーの配列解析
　ライブラリーの配列解析の結果、表9に示すように3ラウンド4ラウンド5ラウンドからそれぞれASGR結合一本鎖抗体のクローンASGR3-10M、ASGR3-39D、ASGR4-70D、及びASGR5-24Mが得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
[実施例14]: クローンの活性評価
（14-1）蛋白質の調製
　クローンはカルベニシリン20μg/mlを含むLB培地にマスタープレートよりコロニーを植菌し37℃、16時間培養した。菌体ペレットからPureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit (インビトロジェン)でプラスミドを精製した。
（14-2）蛋白質の調製
　ヒト胎児腎細胞293T細胞は10%FCS(ニチレイ)、DMEM(1.0g/l Glucose) with L-Gln and Sodium Pyruvate, liquid (ナカライ)培地で培養した。トランスフェクションの24時間前に6cm シャーレに(1:2)の割合でプレーティングした。6cm シャーレに対しプラスミドDNA 8μgをOpti-MEM I 500μlに入れたものに、Lipofectamine 2000 20μlあるいはPEI-MAX 20μlをOpti-MEM I 500μlに入れ室温で5分間置いたものを穏やかに加えた。混和物は室温で20分間放置後293T細胞の6cm シャーレに加え37℃、5% CO2条件下4日～６日培養した。
（14-3）プルダウン実験
　レジン(Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles)(Promega)の洗浄はMagneSphere Technology Magnetic Separation Stand (tweleve-position)を使って行った。レジン40μlを1.5 mlチューブに取り、溶液を除去した後PBS 1 mlで3回洗浄を行った。新しいチューブにレジンを移し、ビオチン化細胞外ドメインASGR1exあるいはビオチン化細胞外ドメインASGR2ex あるいはベイトなしは等量のPBSを加え、ミニディスクローター（Bio craft）で回転攪拌し4℃で1時間結合させた。溶液を除去後TBST (Tween20 0.05%) 1 mlで3回洗浄を行った。新しいチューブにレジンを移し、ELISA BSA緩衝液(ナカライテスク株式会社　TBS, 0.05%, Tween 20, 1% BSA) 1 mlで4℃1時間ブロッキングを行い、ELISA BSA緩衝液1 mlで3回洗浄を行った。新しいチューブにレジンを移し、ASGR3-10M、ASGR3-39D、ASGR4-70DあるいはASGR5-24Mを発現させた培養上清を1000μlずつ、ビオチン化細胞外ドメインASGR1exあるいはビオチン化細胞外ドメインASGR2exあるいはベイトなしで処理したレジン40μlに混和させ、ミニディスクローター（Bio craft）で回転攪拌し、4℃で1時間30分結合させた。溶液を除去後TBST (Tween20 0.1%) 500μlで3回洗浄を行い、回収レジンをウエスタンブロットした。
　各レジンに水とサンプル緩衝液LDS(4x)、0.2mM DTTを加え、70℃、10分間加熱後SDS-PAGEに供した。SDS-PAGEは4-12% Bis-Tris Gel、NuPAGE MES SDS電気泳動緩衝液 (Invitrogen)で200V, 400mA, 35分間電気泳動後、Mini Format, 0.2μm PVDF, Single application (BIORAD) Trans-Blot Turboで転写した。膜はBlocking One Buffer：TBST（1：9）でブロッキングし、Blocking One Buffer：TBST(1：9)で2:3000に希釈したanti-Flag-HRP (Sigma: A8592)を反応させた。検出はECL(Enhanced ChemiLuminescence)を用い、ChemiDoc(BIORAD)で行った。
　ASGR結合一本鎖抗体によるプルダウンアッセイ（図18、19）を行った。3ラウンドの選択実験を行なったクローン、ASGR3-10M、ASGR3-39Dは、コントロールと比べて抗原を強く認識した。ASGR3-10Mは両方の抗原を認識し、ASGR3-39Dの方はASGR1抗原を特に強く認識した。4ラウンドと５ラウンドの選択実験を行なったクローン、ASGR4-70D、ASGR5-24Mは、コントロールと比べて抗原を認識した。ASGR4-70D、ASGR5-24MはASGR1抗原を特に強く認識した。
　図20に抗アシアロ糖タンパク質受容体一本鎖抗体を用いたDENND2A結合ペプチドの肝細胞選択的送達法の概要図を示した。抗アシアロ糖タンパク質受容体抗体を連結したDENND2A結合ペプチドは受容体に結合後エンドサイトーシスにより初期エンドソームに内包される。DENND2A結合ペプチドの上流にはエンドソーム内の酵素により切断を受ける切断配列を組み込んでおくことでそれが切断を受けペプチドが解離する。DENND2A結合ペプチドの下流には膜融合促進ペプチドを付加し、それにより細胞質にペプチドが放出される。標的であるDENND2Aは細胞内、あるいは核画分に局在するタンパク質であることから核に送達させる場合は核移行シグナルを付加させる。
　IVV法による選択実験の結果、DENND2A結合ペプチドとASGR結合一本鎖抗体はそれぞれ複数個得られた。図21に示すように抗アシアロ糖タンパク質受容体一本鎖抗体はASGR3-10M、DENND2A結合ペプチドはDENP4-3又はDENP4-3Sを使って融合体を作成した。それぞれ発現ベクターに組み込まれた遺伝子に対し必要な機能性ペプチドをインフュージョンクローニングでコンストラクトを作成した。本実施例では、切断配列として内因性プロテアーゼFurinが認識する配列を、膜透過促進ペプチドとして膜融合促進ペプチドS28又はS39を、核移行シグナルとしてPAAKRVKLD（配列番号31）を利用した。作成したこれらのコンストラクトは10M-DEN3N、10M-DEN3SNと呼称した。これらのコンストラクトのうち、切断配列＋DENND2A結合ペプチド＋S28＋核移行シグナルの部分のアミノ酸配列を配列番号82（DENP4-3のコンストラクト）及び配列番号83（DENP4-3Sのコンストラクト）に示す。配列番号82、83のアミノ酸配列中、第21番～第28番アミノ酸はFlagタグ、第29番～第35番アミノ酸はHisタグである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
[実施例15]: PXB細胞におけるDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性
　PXBマウス（ヒト肝細胞キメラマウス）から分離された新鮮ヒト肝細胞であるPXB細胞は、ヒト型の肝機能が高く維持されたヒト肝細胞であり、B型肝炎ウイルス（HBV）が持続感染する。そこで、PXB細胞を使用してDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性を評価した。DENND2A結合ペプチドは細胞の外から加えるため一本鎖抗体-ペプチド融合体10M-DEN3N、10M-DEN3SNとし、PXB細胞でのHBVアッセイに供した。
　図22にPXB細胞におけるDENND2A結合ペプチドの抗HBV活性を示した。DENND2A結合ペプチドの10M-DEN3Nと10M-DEN3SNいずれもHBV-DNAおよびcccDNAのコピー数を顕著に減少させ、濃度依存的に高い抗HBV活性を示した。非常に高い抗HBV活性を示すことが明らかになった。
[実施例16]:DENND2A結合ペプチドの作用機序
　IVVスクリーニングによってDENND2A結合ペプチドとして取得されたDENND2A結合ペプチドのDENP4-3はSASH1の配列に相同性があった。このSASH1の配列と抗ASGR一本鎖抗体を融合させたペプチド-抗体融合体を10M-DEN3SNと名付け、以降の実験に用いた。
　SASH1の配列がDENND2A結合ペプチドとして得られたことから、SASH1はDENND2Aに結合することが示唆される。SASH1はTLR4シグナル伝達経路において足場タンパク質として機能することが知られており(Dauphinee,S.M.,et al.,J.Immunol.191,892-901,2013)、TLR4シグナル伝達経路はNF-κBを活性化することで抗ウイルス活性を示す(Zhang,E.,and Lu,M.,Med.Microbiol.Immunol.,204,11-20,2015]。DENND2AはHBV感染の維持に必須であることから(Hashimoto,S.et al.,PLoS One,16:e0246313,2021)、HBV感染細胞ではDENND2AがSASH1に結合してその機能を阻害し、免疫反応を阻害することで、感染を維持している可能性が推測される(図23A)。DENND2A結合ペプチド存在下では、SASH1がDENND2Aから離れTRAF6を含む分子複合体を組み立てるための足場分子として復活し機能する、その結果、NF-κBやAP-1の経路を活性化し、インターフェロンや炎症性サイトカインなどの抗ウイルスエフェクターの産生を誘導して抗HBV的に働く、ということが推測される(図23B)。そこで、DENND2A結合ペプチド10M-DEN3SNが抗HBV活性を示す際にNF-κBの転写活性を促進するかどうか以下検証してみた。
　まず、DENND2A結合ペプチド10M-DEN3SNがNF-κBの転写活性に与える影響を調べるため、HepG2-NFkB-Luc細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。HepG2-NFkB-Luc細胞ではNF-κBのプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれており、NF-κBの転写活性増加に応じてルシフェラーゼの発光が増加する。HepG2-NFkB-Luc細胞を100 nM 10M-DEN3SNで0-48h処理したところ、6時間をピークにルシフェラーゼ活性が増加した（図24A）。HepG2-NFkB-Luc細胞を0-100 nM 10M-DEN3SNで6時間処理したところ、ルシフェラーゼ活性が濃度依存的に増加した（図24B）。これらの結果は、DENND2A結合ペプチドの10M-DEN3SNによりNF-κBの転写が活性化されたことを示唆している。
　NF-κBは活性化によって細胞質から核へ移行し、転写因子として働くことが知られている(Moynagh,P.N.,J.Cell Sci.,118,4589-4592,2005)。そこで、HepG2細胞を100 nM 10M-DEN3SNで６時間処理し、抗NF-κB(p65)抗体を用いて免疫染色を行った。HepG2細胞を10M-DEN3SNで処理しない場合にはNF-κBが核に局在する細胞の割合は全体のうち10％以下だったが、100 nM 10M-DEN3SNで６時間処理したところ、30％近くまで増加した（図25A, B）。
　NF-κBによって転写が増加するサイトカインのうち、IL-6、IL-1βは抗HBV活性をもつことが知られている(Hosel,M.,et al.,Hepatol.,50,1773-1782,2009;Palumbo,G.A.,et al., PLoS One,10,e0142599,2015)。また、同様にNF-κBによって転写が増加するインターフェロンIFNα,IFNβはインターフェロン製剤としてHBVの治療に用いられている(Pestka,S. et al.,Immunol.Rev.,202:8-32,2004;Rang et al.,J.Hepatol.,31:791-799,1999)。そこで、Huh7細胞あるいはHepG2-NFkB-Luc細胞を100 nM 10M-DEN3SNで６時間処理し、細胞から抽出したRNAを鋳型にして、これらのサイトカインおよびインターフェロンに特異的なプライマーを用いたリアルタイムRT-PCRを行い、これらの抗HBV因子の産生量を検出した。図26にHuh7細胞、図27にHepG2-NFkB-Luc細胞における結果を示す。いずれの細胞においても、10M-DEN3SN処理によってIL-6（A）、IL-1β（B）、IFNα（C）, IFNβ（D）のmRNA量が増加したことがわかった。図24, 25, 26, 27の結果より、10M-DEN3SNはNF-κBの転写活性を促進することが示された。
　次いで、DENND2AがNF-κB転写活性に与える影響を調べた。HepG2-NFkB-Luc細胞にHisBioFLAG-DENND2Aを発現するプラスミドをプロトコルの0-1倍量でトランスフェクションしたところ、プラスミド量に依存してルシフェラーゼの発光が減少し、NF-κBの転写活性が減少した（図28A）。このときHisBioFLAG-DENND2Aはプラスミド量に応じて発現量が増加していた（図28B）。HisBioFLAG-DENND2Aの発現量増加に伴い、NF-κBおよびIKKα/βのリン酸化は減少していた。NF-κBはリン酸化によって活性化する。また、IKKα/βのリン酸化はNF-κBの阻害タンパク質であるIκBの分解を促し、NF-κBの活性化を促進する。以上の結果より、HisBioFLAG-DENND2Aの発現はIKKα/βおよびNF-κBのリン酸化を阻害し、NF-κBの転写活性を抑制することが示唆される。TLR4シグナル伝達経路は、受容体であるTLR4にLPSなどのリガンドが結合することで開始される。そこで、LPSによるTLR4シグナル伝達経路の活性化をDENND2Aが抑制するかどうかを調べた。HepG2-NFkB-Luc細胞にHisBioFLAG-DENND2Aをトランスフェクションし、LPSで刺激したところ、HisBioFLAG-DENND2Aをトランスフェクションしない細胞ではLPSの濃度依存的にルシフェラーゼの発光が増加したのに対し、HisBioFLAG-DENND2Aを過剰発現した細胞ではそれが抑制された（図28C）。また、このHisBioFLAG-DENND2AによるTLR4シグナル伝達経路の阻害は、10M-DEN3SN処理によってレスキューされた（図28D）。
　DENND2AのノックダウンによるNF-κB転写活性への影響を検証した。DENND2Aを標的としたsiRNAをHuh7細胞（図29A）、HepG2-NFkB-Luc細胞（図29B）に導入後、リアルタイムRT-PCRによりDENND2AのmRNAを定量したところ、DENND2Aの発現が減少した。DENND2A siRNAを導入したHepG2-NFkB-Luc細胞をLPSで刺激し、ルシフェラーゼアッセイによりNF-κBの転写活性を検証したところ、DENND2AのノックダウンによりNF-κBの転写活性が増加した（図29C）。また、DENND2AをノックダウンしたHuh7細胞からRNAを抽出し、抗HBV活性を示すサイトカインIL-6、IL-1βに特異的なプライマーを用いてリアルタイムRT-PCRを行ったところ、これらのサイトカインの生産は増加していた（図29D, E）。同様にHepG2-NFkB-Luc細胞におけるこれらのサイトカインのmRNA量を調べたところ、HepG2-NFkB-Luc細胞でもDENND2AのノックダウンによってIL-6、IL-1βのmRNA量が増加した。（図29F, G）。
　以上の結果より、DENND2AのノックダウンによってTLR4シグナル伝達経路が促進され、NF-κBの転写活性が増加したことで、NF-κBが制御するサイトカインの転写が増加したと考えられる。これは10M-DEN3SN処理が細胞に与える影響と同じであり、10M-DEN3SNがTLR4シグナル伝達経路におけるDENND2Aの機能を阻害することが示唆された。DENND2Aのノックダウンあるいは10M-DEN3SNによるDENND2Aの阻害によって、TLR4シグナル伝達経路が活性化したことから、DENND2AはTLR4シグナル伝達経路を抑制しており、その抑制機能は足場タンパク質SASH1の阻害による可能性が考えられる(図23)。
　SASH1のノックダウンによるTLR4シグナル伝達経路の抑制、およびSASH1の過剰発現によるTLR4シグナル伝達経路の活性化はすでに報告されている(Dauphinee,S.M.,et al.,J.Immunol.191,892-901,2013)。10M-DEN3SNがNF-κB転写活性を促進する際にSASH1が寄与するかどうかを検証するにあたり、まずHuh7細胞およびHepG2-NFkB-Luc細胞におけるSASH1のノックダウンを確認した。SASH1を標的としたsiRNAをHuh7細胞（図30A）、HepG2-NFkB-Luc細胞（図30B）に導入後、リアルタイムRT-PCRによりSASH1のmRNAを定量したところ、LPS刺激の有無によらずSASH1の発現が減少した。SASH1をノックダウンしたHepG2-NFkB-Luc細胞を用いてルシフェラーゼアッセイによりNF-κBの転写活性を検出したところ、LPS刺激の有無によらずSASH1のノックダウンによってNF-κBの転写活性が減少した（図30C）。また、SASH1をノックダウンしたHuh7細胞およびHepG2-NFkB-Luc細胞においてIL-6、IL-1βのRNAをリアルタイムRT-PCRによって検出した。その結果、SASH1をノックダウンしない場合にはLPS刺激によってこれらのサイトカインの量は増加したが、SASH1のノックダウンによってその増加は抑制された（図30D-G）。以上の結果より、Huh7細胞およびHepG2-NFkB-Luc細胞においてSASH1がNF-κBを活性化することが確認できた。
　SASH1をノックダウンした細胞において、10M-DEN3SNがNF-κBの転写活性に与える影響を調べた。SASH1を標的としたsiRNAをHepG2-NFkB-Luc細胞に導入後、10M-DEN3SNで処理し、ルシフェラーゼアッセイによってNF-κBの転写活性を評価した。その結果、SASH1をノックダウンしない細胞では10M-DEN3SNがNF-κBの転写活性を促進したが、SASH1をノックダウンした細胞では10M-DEN3SNは影響を与えなかった（図31A）。また、同様にSASH1ノックダウンしたHepG2-NFkB-Luc細胞を10M-DEN3SNで処理し、IFNαを標的としたリアルタイムRT-PCRを行ったところ、SASH1をノックダウンしない細胞では10M-DEN3SN処理によってIFNαの転写が増加したが、SASH1をノックダウンした細胞では10M-DEN3SNは影響を与えなかった（図31B）。これらの結果から、DENND2A結合ペプチド10M-DEN3SNによるNF-κB転写活性の促進には、SASH1が寄与していることが示唆される。
[実施例17]: HBV感染PXBマウスを用いた薬効試験
　PXBマウスにHBVを感染させ、被験物質（抗ASGR一本鎖抗体-DENND2A結合ペプチド融合体10M-DEN3SN）投与による薬効を確認することを目的として下記の実験を行なった。
（17-1） 被験物質、溶媒および調製方法
薬剤 E : 10M-DEN3SN
　性状：PBSに溶解
　量：21.6mL （1800μL x 12本）
　保存：冷蔵
　調製方法：初回投与（Day 0）及び2回目投与（Day 3）は、1倍希釈で300μL/匹に投与した。3回目投与（Day 5）以降は、900μLを分取し、PBS 900μLと混合（2倍希釈）し、300μL/匹に投与した。
溶媒
名称：PBS
　入手先：Thermo Fisher Scientific (Life) 10010049 PBS pH 7.4 
　保存：冷蔵
（17-2）使用ウイルス
　使用ウイルスは株式会社フェニックスバイオから購入したHBVを用いた。
ウイルス名：Hepatitis B Virus
株名：PBB004 (Genotype C)
BSL：2
ウイルス力価：1.1E+09 copies/mL（10μL/tubeを2本）
保存：超低温冷凍庫で保存
調製方法：凍結保存したウイルス液1本を解凍し、生理食塩液（株式会社大塚製薬工場）を用いて1.0E+06 copies/mLに調製する。
（17-3）使用動物
動物種：マウス
系統：PXBマウス（cDNA-uPAwild/+/SCIDマウスにヒト肝細胞を導入したなかで，マウス血中h-Alb濃度に基づいて計算したヒト肝細胞予想置換率が70%以上のマウス）
入手先：株式会社フェニックスバイオ
性別：雄
週齢：12週齢以上（入荷時）
ヒト肝細胞移植後；9週以上
使用匹数：10匹
動物種選択理由：HBV感染モデルとして一般的に使用されている。
（17-4）動物管理条件
17-4.1 飼育条件（SOP/環境/504）
　室温24 ± 3 ℃、湿度50 ± 20 %、換気（10～25回/1時間）、照明12時間（8:00～20:00）
17-4.2 飼料（SOP/飼育/206、SOP/飼育/512）
　MF（オリエンタル酵母工業株式会社）にPS-A（オリエンタル酵母工業株式会社）を2:1で混合した飼料を自由摂取。
17-4.3 飲料水（SOP/飼育/206、SOP/飼育/512）
　オートクレーブ滅菌した市水に次亜塩素酸ナトリウム（終濃度：14.4 ppm）を添加した飲水を自由摂取。
17-4.4 ケージ（SOP/動物/301）
　オートクレーブ滅菌したケージを使用。1～5匹/ケージ飼育とする。
　ケージ交換、給餌（補充）および給水瓶交換は、微生物的汚染のリスク低減のために同時期に実施する。
17-4.5 検疫および馴化（SOP/動物/301）
　動物入荷後から検疫および馴化終了日まで、一般状態を毎日観察する。また、入荷日ならびに検疫および馴化終了日に体重を測定する。
17-4.6 群分け（SOP/試験/002）
　ウイルス接種6週間目に採血を実施し、その血中HBV DNA量をもとにウイルス接種8週目（被験物質初回投与日）に各群にマウスを振り分ける。
17-4.7 動物の識別(SOP/試験/001)
　背側尾部へ油性インクを用いて個体識別を行う。ケージに試験番号、動物番号、試験期間、試験群、試験責任者名等を記載したラベルを付ける。
（16-5）試験群構成および投与スケジュール
　下記表11の通り。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
ウイルス接種
　HBVを1.0E+05 copies/100 μL/bodyでマウス尾静脈より接種する。
被験物質の投与
　ウイルス接種8週間目（Day 0）から標本採取前日（Day 27）まで300 μL/bodyで2～3日（月、水、金）に1回、マウスに腹腔内投与する。
採血
　ウイルス接種6週目（初回投与2週間前）および初回投与前（Day 0：ウイルス接種8週目）からDay 21まで1週間に1回、鎖骨下静脈から約70 μLの血液を採取した。剖検時（Day 28）にはイソフルラン吸入麻酔下で、腹大静脈もしくは心臓より採取可能全量（400 μL以上）の血液を採取した。採血終了後に血中h-Alb濃度測定として2 μLの血液を200 μLの生理食塩液と混合し、390 ×g、室温、10分間の遠心分離を行った後、1.5 mLチューブ（INA・OPTIKA, RC-0150）に上清を入れて、送付するまで凍結保存（-60℃以下）した。残りの血液は6000 rpm、15分間、4℃遠心分離を行い、血清（経時採血時（HBV関連因子測定用）：30 μL（5 μL×2本、20 μL×1本）、剖検時：160 μL以上（5 μL×2本、20 μL×1本、残余1本）を分離し、下記に送付するまで凍結保存（-60℃以下）した。
剖検
　Day28に安楽死後、肝臓を採取し、重量を測定する。肝臓はHBV DNAおよびcccDNAのために、一部を凍結保存し残りを病理組織学的検査用にホルマリン固定する。また肺、脾臓および腎臓はホルマリン固定する。
HBsAg、HBeAgおよびHBcrAgの測定
　血清中HBsAg濃度測定は、株式会社エスアールエル（東京）によって実施された。測定には、化学発光酵素免疫測定法（ChemiLuminescence Enzyme ImmunoAssay，CLEIA）を利用するLumipulse(登録商標) PrestoII（富士レビオ株式会社，東京）を用いた。測定範囲は0.005 から 150 IU/mLであった。当試験での被測定試料の希釈倍率は30倍とし、同希釈倍率での測定範囲は0.15 から 4500 IU/mLとした。血清中HBsAg濃度測定は、株式会社エスアールエル（東京）によって実施された。測定には、化学発光酵素免疫測定法（ChemiLuminescence Enzyme ImmunoAssay，CLEIA）を利用するLumipulse(登録商標) PrestoII（富士レビオ株式会社，東京）を用いた。測定範囲は0.1から1590 C.O.I.であった。当試験での被測定試料の希釈倍率は30倍とし、同希釈倍率での測定範囲は3から47700 C.O.I.とした。血清中HBc-rAg濃度測定は，株式会社エスアールエル（東京）によって実施された。測定には、化学発光酵素免疫測定法（ChemiLuminescence Enzyme ImmunoAssay，CLEIA）を利用するLUMIPULSE HBcrAg, LUMIPULSE F（富士レビオ株式会社，東京）を用いた。測定下限は3.0 log U/mLであった。当試験での被測定試料の希釈倍率は300倍とし、同希釈倍率での測定下限は5.5 log U/mLとした。
h-Albの測定
　株式会社フェニックスバイオにて以下の操作を実施した。2 μLの血液を200 μLの生理食塩液で希釈し、390×g、室温の条件で10分間の遠心分離を行った。血中h-Alb濃度は、ラテックス凝集免疫比濁法（LZテスト‘栄研’U-ALB，栄研化学株式会社，東京）を用いて，自動分析装置BioMajestyTM（JCA-BM6050、JEOL、東京）で測定した。
ALTの測定
　剖検時の血清を用いてフェニックスバイオにて測定した。血漿中ALT活性は、採取した血漿10 μLを利用して測定した。測定対象はジアリールイミダゾールロイコ色素（ピルビン酸オキシダーゼにより発生する過酸化水素とペルオキシダーゼによりジアリールイミダゾールロイコ色素を青色に発色）であり、測定にはドライケム7000/NX500sVを利用した。
血中HBV DNAの測定
　株式会社フェニックスバイオ経由で株式会社キュービクスにて実施した。
　血清はHBV Pre-treatment Solution for HBV DNA in Serumと混合し、98℃、5分間の加熱処理を施してHBVを不活性化し、かつHBV DNAを露出させた。PCR反応と解析にはKUBIX HBV qPCR Kit（株式会社キュービクス）とCFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA）を用いた。10 μLのHBV 2×PCR Solution と10 μLの加熱処理済みスタンダード又は被測定試料を混合した。PCR反応は，95℃ 2分→（95℃ 5秒→54℃ 30秒）×45サイクルで行った。血中HBV DNA濃度は、2ウエルの平均で算出した。なお、当定量方法による検出下限は、4.0E+04 copies/mLである。また、HBV DNAスタンダードにはHBV感染PXBマウスから得られた血清を使用した。この血清中に含まれるHBV DNA濃度はデジタルPCRにより定量した。使用するプライマーおよびプローブの配列ならびにスタンダードは、肝臓中HBV DNAと同じものを使用した。
肝臓中HBV DNAの測定
　RNAlater浸漬肝臓試料からDNeasy(登録商標) Blood & Tissue Kits（株式会社キアゲン，東京）を用いてDNA抽出を行い、DNAをNuclease-free waterに溶解した。DNA濃度をBioPhotometer(登録商標) 6131（エッペンドルフ株式会社）で測定した後、Nuclease-free waterを用いて最終濃度を20 ng/μLに調製した。PCR反応液は，溶解したDNA原液もしくは希釈したDNAを5 μLとTaqMan(登録商標) Fast Advanced Master Mixを用いて調製した。また、PCR反応と解析にはCFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection Systemを用いた。PCR反応は、50℃ 2分→95℃ 20秒→（95℃ 3秒→60℃ 32秒）×53サイクルで行った。肝臓中HBV DNA濃度は，2ウエルの平均で算出した。使用したプライマーおよびプローブの配列は、以下の表12に記した。なお、当定量方法による検出下限は、50 copies/100ng DNAである。HBV DNAスタンダードにはHBV感染PXBマウスから得られた血清を使用した。この血清中に含まれるHBV DNA濃度はデジタルPCRにより定量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
cccDNAの測定
　肝臓中HBV DNAの測定時に精製したDNA原液もしくは希釈したDNAを5 μLとTaqMan(登録商標) Fast Advanced Master Mixを用いて調製した。また、PCR反応と解析にはCFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection Systemを用いた。PCR反応は、50℃ 2分→95℃ 20秒→（95℃ 3秒→60℃ 32秒）×55サイクルで行った。肝臓中HBV cccDNA濃度は、2ウエルの平均で算出した。使用したプライマー（タカラバイオ株式会社，滋賀）及びプローブ（タカラバイオ株式会社）の配列は、以下の表13の通りである。なお、当定量方法による検出下限は、1.0×102 copies/100 ng DNAであった。また、HBV cccDNAスタンダードにはHBVの全ゲノム配列を含むプラスミドを利用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
病理組織学的検査（HBsAg免疫染色、HBcAg免疫染色）
　肝臓組織は、10%中性緩衝ホルマリン液固定後に70%エタノールに置換し、これらの試料を奈良病理研究所（奈良）に依頼して常法によりパラフィン包埋ブロックを作製し、その後薄切標本を得た。
　パラフィン切片を脱パラフィン処理した後にマイクロウェーブにより抗原賦活化を施した。一次抗体（HBsAg (anti-HBsAg antibody, Code: OBT0990, Bio-Rad AbD Serotec Limited, Oxford, UK)もしくはHBcAg (anti-HBcAg antibody, Code: PAB14506, Abnova, Taipei City, Taiwa)）を4℃で一晩反応させた。一次抗体をビオチン-アビジン-ペルオキシダーゼ複合体と反応させた後、DABにより発色させた（茶色）。細胞核をヘマトキシリンにて染色（青色）した後、これらの切片を脱水・透徹し封入した。
　その後、ハムリー株式会社で光学顕微鏡を用いて鏡検を実施した。
（17-6）観察・測定項目
　図32に示すサンプルの投与スケジュールに従った。HBsAg（図33）、HBeAg（図34）およびHBcrAg（図35）を10M-DEN3SNとcontrol (PBS)で比較した結果、いずれの場合も10M-DEN3SNが抑制的に働いていた。血中HBV DNA（図36）についても10M-DEN3SNが抑制的に働いていた。h-Albの測定（図37）の結果キメラマウスにおいて十分なヒトアルブミン量が得られた。本アッセイはヒト肝臓細胞での評価として優れていた。ALT（図38）の測定の結果、10M-DEN3SNはcontrol (PBS)と比較し、肝炎を悪化させることはなかった。
　剖検して得た肝臓より肝臓中のHBV-DNA（図39）の量を測定した結果、10M-DEN3SNはコントロール投与群と比較し、HBV DNAのコピー数を減少させていた。同様に肝臓中のccc DNA（図40）のコピー数を測定した結果、10M-DEN3SNはコントロール投与群と比較し、HBV DNAのコピー数を減少させた。
　病理組織学的検査HBsAg免疫染色の顕微鏡写真を図41に示した。10M-DEN3SN投与群はcontrol (PBS)投与群に比較し抗原の染色像が一眼で抑えられている様子が分かった。また、病理組織学的検査HBcAg免疫染色の顕微鏡写真を図42に示した。こちらの抗原についても10M-DEN3SN投与群はcontrol (PBS)投与群に比較し抗原の染色像が一眼で抑えられている様子が分かった。
　以上の結果から、DENND2A結合ペプチド(10M-DEN3SN)はHBVを感染させたヒト肝細胞キメラマウスを用いた動物実験において、肝臓中のHBV-DNAおよびcccDNAを減少させ、明確な抗HBV作用を有することが証明された。その結果、ヒト肝臓キメラマウスを用いた動物実験でのDENND2A結合ペプチド(10M-DEN3SN)のPOC（Proof of Concept）が取得できたとみなすことができる。

Claims (14)

  1. 　DENND2Aに結合し、DENND2Aの機能を阻害する物質を有効成分として含む、抗B型肝炎ウイルス剤。
  2. 　前記物質は、配列番号35に示すアミノ酸配列の第1番～第775番残基の領域内のいずれかの領域、又は配列番号37に示すアミノ酸配列中のいずれかの領域に結合する、請求項１記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  3. 　DENND2Aの機能の阻害が、DENND2AのSASH1との結合の阻害、及びDENND2AによるNF-κB転写活性の抑制の阻害から選択される少なくとも１種である、請求項１記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  4. 　前記物質が、下記(1)～(5)のポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリペプチドである、請求項１記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
    (1)　IHDRCTGCLPVKRGSH（配列番号1）の配列のポリペプチド。
    (2)　ADKGCLPIGCRYGTSY（配列番号2）の配列のポリペプチド。
    (3)　LPSPDAPCLPVKRGSP（配列番号3）の配列のポリペプチド。
    (4)　CLPVKRGS（配列番号84）の領域を含むSASH1の部分ポリペプチド。
    (5)　(1)～(4)のいずれかと８０％以上１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド。
  5. 　前記ポリペプチドは、肝細胞内への送達のための担体分子と連結した形態にある、請求項４記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  6. 　前記担体分子が、アシアロ糖タンパク質受容体に結合する抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である、請求項５記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  7. 　前記抗体、抗体断片又は一本鎖抗体が、
    　配列番号４、１０、１６若しくは２２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、
    　配列番号５、１１、１７若しくは２３に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、
    　配列番号６、１２、１８若しくは２４に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、
    　配列番号７、１３、１９若しくは２５に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、
    　配列番号８、１４、２０若しくは２６に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、
    　配列番号９、１５、２１若しくは２７に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において一部の残基が置換され、該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3と
    を有する、請求項６記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  8. 　前記抗体、抗体断片又は一本鎖抗体が、内因性酵素により切断される切断配列を介して前記ポリペプチドと連結する、請求項６記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  9. 　前記ポリペプチドは、細胞膜透過促進分子と連結した形態にある、請求項４～８のいずれか１項に記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  10. 　細胞膜透過促進分子が、配列番号２９又は３０に示すアミノ酸配列のポリペプチドである、請求項９記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  11. 　前記ポリペプチドは、核移行シグナルと連結した形態にある、請求項４～８のいずれか１項に記載の抗B型肝炎ウイルス剤。
  12. 　下記(1)～(5)のポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリペプチドの、DENND2A結合ペプチドとしての使用。
    (1)　IHDRCTGCLPVKRGSH（配列番号1）の配列のポリペプチド。
    (2)　ADKGCLPIGCRYGTSY（配列番号2）の配列のポリペプチド。
    (3)　LPSPDAPCLPVKRGSP（配列番号3）の配列のポリペプチド。
    (4)　CLPVKRGS（配列番号84）の領域を含むSASH1の部分ポリペプチド。
    (5)　(1)～(4)のいずれかと８０％以上１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド。
  13. 　下記(1)～(5)のポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリペプチドからなる、DENND2A結合ペプチド。
    (1)　IHDRCTGCLPVKRGSH（配列番号1）の配列のポリペプチド。
    (2)　ADKGCLPIGCRYGTSY（配列番号2）の配列のポリペプチド。
    (3)　LPSPDAPCLPVKRGSP（配列番号3）の配列のポリペプチド。
    (4)　CLPVKRGS（配列番号84）の領域を含むSASH1の部分ポリペプチド。
    (5)　(1)～(4)のいずれかと８０％以上１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド。
  14. 　B型肝炎ウイルス感染患者に請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗B型肝炎ウイルス剤の有効量を投与することを含む、前記患者においてB型肝炎ウイルス感染を治療もしくは予防し、B型肝炎ウイルスの増殖を抑制し、又はB型肝炎を治療もしくは予防する方法。
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